Clonación y caracterización de las aciltransferasas lpaat y dagat implicadas en la síntesis de triacilglicéridos en semillas de girasol (helianthus annuus l.) y obtención de líneas con composición modificada de lípidos

      CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS ACILTRANSFERASAS LPAAT Y DAGAT IMPLICADAS EN LA SÍNTESIS DE TRIACILGLICÉRIDOS EN SEMILLAS DE GIRASOL ( Helianthus annuus L.) Y OBTENCIÓN DE LÍNEAS CON COMPOSICIÓN MODIFICADA DE LÍPIDOS TESIS DOCTORAL JUAN DIEGO FERNÁNDEZ GARCÍA                                                                           DepartamentodeBioquímica VegetalyBiología Molecular FacultaddeBiología DepartamentodeBioquímicay BiologíaMoleculardeProductos Vegetales InstitutodelaGrasa   CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNDELAS ACILTRANSFERASASLPAATYDAGATIMPLICADASENLA SÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSENSEMILLASDEGIRASOL (HelianthusannuusL.)YBÚSQUEDADENUEVOS MUTANTES  TrabajopresentadoparaoptaralgradodeDoctorpor JuanDiegoFernándezGarcía   Trabajodirigidopor Dr.EnriqueMartínezForceDr.RafaelGarcésMancheño  Sevilla, 2015                            LosDres.EnriqueMartínezForce,InvestigadorCientífico,yRafaelGarcés Mancheño,ProfesordeInvestigacióndelCSIC,emitenelsiguienteinforme:  Elpresentetrabajotitulado“Clonaciónycaracterizacióndelasaciltransferasas LPAATyDAGATimplicadasenlasíntesisdetriacilglicéridosensemillasdegirasol (HelianthusannuusL.)ybúsquedadenuevosmutantes”hasidorealizadobajo nuestradirecciónyasesoramientoenloslaboratoriosdelDepartamentode BioquímicayBiologíaMoleculardeProductosVegetalesdelInstitutodelaGrasa (Sevilla)durantelosañosacadémicos2006‐2015,constituyendolaMemoriaque presentaelLcdo.D.JuanDiegoFernándezGarcíaparaoptaralgradodeDoctor.  Consideramosqueeltrabajorealizadoesoriginalyhadadolugaravarias publicacionesencomunicacionesencongresos.Laexcelentelaborrealizadapor elLcdo.D.JuanDiegoFernándezGarcía,tantoentareasexperimentalescomoen ladiscusióndelosresultados,acreditaunaadecuadaformaciónparala obtencióndeltítulodeDoctor.  ParaqueconsteaefectosdetramitacióndelareferidaTesisDoctoral,firmamos elpresenteinformeenSevilla,a13deOctubrede2015.      Dr.EnriqueMartínezForceDr.RafaelGarcésMancheño   TutordelaTesisDoctoral:     Dr.FranciscoJavierFlorencioBellido CatedráticodelaUniversidaddeSevilla                                       Amispadres, porsucariñoyapoyoincondicional              II 3.3BIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOS(TAGs)………………………………...……………….…….35 3.3.1Lisofosfatidatoaciltransferasas(LPAATs)……………………………….....……37 3.3.2Diacilglicerolaciltransferasas(DAGATs)…………………………………..……..38  4.LÍPIDOSDEPLANTAS:MODIFICACIÓN…………………………………………….………………43 4.1CRITERIOSDESELECCIÓN…………………………………………………...…………………………..…..44 4.2PROBLEMÁTICAACTUAL…………………………………………………………………………………..….47 4.3MODIFICACIÓNDELCONTENIDOGRASODELASSEMILLAS…………………………..…….49 4.4MODIFICACIÓNDELACALIDADDELOSACEITES……………………………...……………..….52 4.4.1Modificaciónenlacomposicióndeácidosgrasos………………………..52 4.4.1.1ModificaciónenelcontenidodePUFAs…………………………52 4.4.1.2ModificaciónenelcontenidodeMUFAs……………………….53 4.4.1.3ModificaciónenelcontenidodeAGssaturados…...........53 4.4.2ModificaciónenladistribucióndeácidosgrasosenTAGs……….…..56 4.4.2.1CoeficientedeasimetríaαSat……………………...………………….59  5.ACEITEDEGIRASOL…………………………………………………………………………………………...61 5.1CARACTERÍSTICASGENERALES……………………………………………....……………………………61 5.2OBTENCIÓNDEMUTANTESCONCOMPOSICIÓNMODIFICADADEACEITE….……..62 5.2.1LíneadegirasolHOHE(CAS‐15)……………………………………………………….66 5.2.1.1HerenciadelcarácterHOHEyenzimasimplicadas…........67 5.2.1.2ComposicióndeAGsydistribuciónenTAGs……………….….70  OBJETIVOS3‐76  MATERIALESYMÉTODOS77‐154  1.MATERIALES…………………………..…………………..………………………………………………………79 1.1APARATOSYMATERIALES……………………………………………....…………………………..….....79 1.2REACTIVOSYQUÍMICOS……………………………………………....…………………………..…........80 1.3ENZIMASYKITS……………………………………………....…………………………..…......................81 1.4MATERIALBIOLÓGICOYCONDICIONESDECULTIVO…………………………………………..81 1.4.1Escherichiacoli……………………………………………....…………………………..……..81 1.4.1.1Condicionesdecultivo…………………....…………………………..……82 1.4.1.2Recogidadematerialbiológico…………………....………………….82  III 1.4.2Agrobacteriumtumefaciens…………………....……………………………………….82 1.4.2.1Condicionesdecultivo…………………....………………………………..83 1.4.2.2Recogidadematerialbiológico…………………....………………….83 1.4.3Saccharomycescerevisiae…………………....…………………………………………..83 1.4.3.1Condicionesdecultivo…………………....………………………………..84 1.4.3.2Recogidadematerialbiológico…………………....………………….84 1.4.4HelianthusannuusL.…………………....…………………………………………………..85 1.4.4.1Condicionesdecultivo…………………....………………………………..86 1.4.4.2Recogidadematerialbiológico…………………....………………….86 1.4.5Arabidopsisthaliana…………………....……………………………………………………88 1.4.5.1Condicionesdecultivo…………………....………………………………..89 1.4.5.2Recogidadematerialbiológico…………………....………………….91 1.5MEDIOSDECULTIVOYSOLUCIONESNUTRITIVAS…………………....…………………………91 1.5.1E.coli…………………....…………………………………………………………………………….91 1.5.2A.tumefaciens…………………....……………..………………………………………………92 1.5.3S.cerevisiae…………………....………………………………………………………………….92 1.5.4A.thaliana…………………....……………………………………………………………………92 1.6ANTIBIÓTICOS…………………....……………………………………………………………………………….93 1.6.1E.coli…………………....…………………………………………………………………………….93 1.6.2A.tumefaciens…………………....……………………………………………………………..94 1.6.3A.thaliana…………………....……………………………………………………………………95 1.7TAMPONESYSOLUCIONES…………………....……………………………………………………………95 1.7.1BiologíaMolecular…………………....………………………………………………………95 1.7.1.1Ácidosnucleicos…………………....…………………………………………..95 1.7.1.2Preparacióndecélulascompetentes……………………………….96 1.7.1.3Transformacióndecélulas…………………....………………………….96 1.7.1.4Transformacióndeplantas…………………....…………………………96 1.7.1.5Microsomasdelevaduras…………………....…………………………..96 1.7.1.6Stockdecélulas…………………....……………………………………………97 1.7.2Bioquímica…………………....……………………………………………………………………97 1.7.2.1Extraccióndelípidosymetilacióndeácidosgrasos……….97 1.7.2.2EnsayosdeactividadHaDAGATinvitro…………………...……..98 1.8OLIGONUCLEÓTIDOS…………………....……………………………………………………………………..98 1.9PLÁSMIDOSYVECTORESDEEXPRESIÓN…………………....……………………………………….99 IV 2.MÉTODOS…………………………..…………………..…………………………………………………….....102 2.1BIOLOGÍAMOLECULAR…………………....………………………………………………………………..102 2.1.1Extraccióndeácidosnucleicos…………………....…………………………………102 2.1.1.1Protocolosdebacterias…………………....…………………………….102 2.1.1.1.1ExtraccióndeDNAplasmídico……….……102 2.1.1.2Protocolosdelevaduras…………………....……………………………102 2.1.1.2.1AislamientodeRNAtotal…………………….102 2.1.1.2.2SíntesisdelaprimeracadenadecDNA103 2.1.1.2.3ExtraccióndeDNAplasmídico…………….103 2.1.1.3Protocolosdeplantas…………………....………………………………..103 2.1.1.3.1AislamientodeRNAtotal…………………….103 2.1.1.3.2AislamientodemRNA………………………….104 2.1.1.3.3SíntesisdelaprimeracadenadecDNA104 2.1.1.3.4ExtraccióndegDNA……………………………..104 2.1.2Cuantificacióndeácidosnucleicos…………………....………………………….106 2.1.3Reacciónencadenadelapolimerasa(PCR)…………………....……………106 2.1.3.1AmplificacióndeDNAmediantePCR…………………....………106 2.1.3.2AmplificaciónrápidadelosextremosdelcDNA(RACE).108 2.1.3.4AnálisisdeexpresióngénicamediantePCRcuantitativa109 2.1.3.4.1Basesteóricas…………………....…………………109 2.1.3.4.2Aplicacióntécnica…………………....………….111 2.1.3.4.3Eficienciadeamplificación………………….112 2.1.3.4.4CuantificacióndelosproductosdePCR112 2.1.4Separaciónypurificacióndeácidosnucleicos…………………....………..113 2.1.4.1ElectroforesisdeDNAengeldeagarosa………………….......113 2.1.4.2PurificacióndefragmentosdeDNAapartirdegelde agarosa…………………………....……………………………………....……..114 2.1.5TratamientosenzimáticosdelDNA…………………....…………………………114 2.1.5.1DigestióndelDNAconnucleasasderestricción……………114 2.1.5.2DesfosforilacióndeextremosdelDNA…………………....……114 2.1.5.3LigacióndefragmentosdelDNA…………………....………………115 2.1.6Construccionesgénicas…………………....…………………………………………….116 2.1.6.1ClonaciónenplásmidosdeclonaciónenE.coli…………….116 2.1.6.2ClonaciónenvectordeexpresiónenS.cerevisiae……….116  V 2.1.6.3ClonaciónenvectordeexpresiónenA.thaliana………….118 2.1.7SecuenciacióndelDNA…………………....……………………………………………..119 2.1.8Transformacióngénica…………………....……………………………………………..119 2.1.8.1TransformacióngénicaenE.coli…………………....……………..119 2.1.8.1.1Preparacióndecélulascompetentes….119 2.1.8.1.2Transformaciónmediantechoque térmico…………………………………….…………..120 2.1.8.1.3Comprobacióndetransformantes………120 2.1.8.2TransformacióngénicaenA.tumefaciens…………………….122 2.1.8.2.1Preparacióndecélulascompetentes….122 2.1.8.2.2Transformaciónmediantechoque térmico………………….…………………………..…..122 2.1.8.2.3Comprobacióndetransformantes………123 2.1.8.3TransformacióngénicaenS.cerevisiae………………………….123 2.1.8.3.1TransformaciónmedianteLiAc‐PEG……123 2.1.8.3.2Comprobacióndetransformantes………124 2.1.8.4TransformacióngénicaenA.thaliana……………………………124 2.1.8.4.1SeleccióndelíneasKOhomocigotas…..124 2.1.8.4.2Transformaciónmediante A.tumefaciens……………………….……………..125 2.1.8.4.3Selecciónycomprobacióndelíneas transgénicas………………………………………….126 2.1.9Expresiónheterólogadeproteínasrecombinantes……………………..128 2.1.9.1AnálisisfuncionalenS.cerevisiae…………………....…………….128 2.1.9.1.1Induccióndeproteínasrecombinantes128 2.1.9.1.2Obtencióndemicrosomas……………………130 2.1.9.1.3Cuantificacióndeproteínas microsomales………………………….…………....131 2.1.9.2AnálisisfuncionalenA.thaliana…………………....………………131 2.1.9.2.1Análisisfenotípico…………………....………….132 2.1.9.2.2Análisisdeexpresióngénica………………..132 2.1.10Medidasdedensidadópticadecultivos…………………....……………….132 2.1.11Cálculodetasadecrecimientoytiempodegeneraciónde cultivos……………………………………………………………………………………………132 VI  2.2BIOQUÍMICA…………………....………………………………………………………………………………..133 2.2.1Análisisdelípidos…………………....………………………………………………………133 2.2.1.1Extraccióndelípidostotales…………………....…………………….134 2.2.1.1.1Protocolodelevaduras…………………....….134 2.2.1.1.2Protocolodeplantas…………………....……..134 2.2.1.2SeparacióndeTAGsmediantecromatografíaencapa fina(TLC)…………………....…………………………………………………….135 2.2.1.3Obtencióndeésteresmetílicosdeácidosgrasos (FAMEs)…………………....……………………………………………………….137 2.2.1.4SeparacióndeTAGsyFAMEsmediantecromatografía degases(GC)…………………....………………………………………………138 2.2.2CaracterizaciónbioquímicadeHaDAGATs…………………....……………..140 2.2.2.1EnsayodeactividadHaDAGATinvitro…………………....…….140 2.2.2.2Cuantificacióndelaradiactividadydeterminaciónde lacantidaddeTAGsformados…………………....…………………141 2.3BIOINFORMÁTICA…………………....………………………………………………………………………..142 2.3.1AnálisisinformáticodesecuenciasdeDNAyproteínas………………142 2.3.2Análisisinformáticodemuestrasydatos…………………....……………….143 2.4BIOESTADÍSTICA…………………....………………………………………………………………………….144 2.4.1Estadísticadescriptiva…………………....………………………………………………144 2.4.1.1Medidasdetendenciacentraloposición………………….....145 2.4.1.2Medidasdedispersión…………………....………………………………146 2.4.1.3Medidasdeformadeladistribución…………………....……….146 2.4.2Estadísticainferencial…………………....……………………………………………….147 2.4.3Genéticacuantitativa…………………....………………………………………………..150 2.5DISEÑOEXPERIMENTALYCRITERIOSDESELECCIÓNLÍNEAHOHE…………....………150  RESULTADOS135‐252  BLOQUEI:CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARYENZIMÁTICADELAS ACILTRANSFERASASIMPLICADASENLABIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSEN GIRASOL…………………....…………………………………....…………………………………....……………….157   VII 1.CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARYENZIMÁTICADELAS ENZIMASLISOFOSFATIDATOACILTRANSFERASAS1Y2(HaLPAAT1YHaLPAAT2)  1.1CLONACIÓNDELOSGENESHaLPAATs…………………....…………………………………….….157 1.1.1ClonacióndefragmentosinternosdeHaLPAATs…………………....…..157 1.1.2ObtencióndelassecuenciascompletasdecDNAdeHaLPAATs…159 1.2CARACTERIZACIÓNMOLECULARDEHaLPAATs…………………....…………………………..161 1.2.1Característicasfisicoquímicasdelassecuenciaspolipeptídicas deducidasapartirdeloscDNAsdeHaLPAATs…………………....….…..161 1.2.2Análisisfilogenéticodelassecuenciasaminoacídicasderivadas deHaLPAATs……………………………………....…………………………....……………..162 1.2.3PrediccióndeestructurasylocalizaciónsubcelulardeHaLPAATs164 1.3ANÁLISISDEEXPRESIÓNDEHaLPAATsENSEMILLASYTEJIDOSVEGETATIVOS..166 1.4CARACTERIZACIÓNENZIMÁTICADEHaLPAATs…………………....…………………………..168 1.4.1ExpresiónheterólogadeproteínasrecombinantesHaLPAATsen S.cerevisiae…………………....…………………………....………………………….........168 1.4.1.1EfectosobrelatasadecrecimientoenS.cerevisiae……169 1.4.1.2AnálisisdeexpresióndeHaLPAATsenS.cerevisiae……..171 1.4.1.3Análisislipídicoinvivo……………………………………………………..172 1.4.2AnálisisfuncionaldeproteínasrecombinantesHaLPAATsen A.thaliana…………………....…………………………....…………………………....……..172 1.4.2.1AnálisisdeexpresióndeHaLPAATsenA.thaliana..……..173 1.4.2.2Análisisfenotípicodesemillas……....……………………………….174 1.4.2.3Análisislipídicodesemillas……………………………………………..174 1.4.2.3.1AnálisisdelacomposicióndeTAGs…..174 1.4.2.3.2AnálisisdelacomposicióndeFAMEs…174  2.CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARYENZIMÁTICADELAS ENZIMASDIACILGLICEROLACILTRANSFERASAS1A,1BY2(HaDAGAT1A, HaDAGAT1BYHaDAGAT2)…………………………………………………………………………………...175  2.1CLONACIÓNDELOSGENESHaDAGATs…………………....…………………………....…………175 2.1.1ClonacióndefragmentosinternosdeHaDAGATs…………………....….175 2.1.2ObtencióndelassecuenciascompletasdecDNAdeHaDAGATs.176 VIII 2.2CARACTERIZACIÓNMOLECULARDEHaDAGATs…………………....………………………....179 2.2.1Característicasfisicoquímicasdelassecuenciaspolipeptídicas deducidasapartirdeloscDNAsdeHaDAGATs…………………....………179 2.2.2Análisisfilogenéticodelassecuenciasaminoacídicasderivadas deHaDAGATs…………………....…………………………....………………………………180 2.2.3PrediccióndeestructurasylocalizaciónsubcelulardeHaDAGATs184 2.3ANÁLISISDEEXPRESIÓNDEHaDAGATsENSEMILLASYTEJIDOSVEGETATIVOS.189 2.4CARACTERIZACIÓNENZIMÁTICADEHaDAGATs…………………....…………………………191 2.4.1ExpresiónheterólogadeproteínasrecombinantesHaDAGATs enS.cerevisiae……..………………………………………………………………………….191 2.4.1.1EfectosobrelatasadecrecimientoenS.cerevisiae……192 2.4.1.2AnálisisdeexpresióndeHaDAGATsenS.cerevisiae…..195 2.4.1.3Análisislipídicoinvivo…..…………………………………………………196 2.4.1.4EnsayosdeactividadHaDAGATinvitro…..…………………….197 2.4.1.4.1EfectodelpHenlaactividad……………….197 2.4.1.4.2Especificidadpordistintossustratos…..199 2.4.2AnálisisfuncionaldeproteínasrecombinantesHaDAGATsen A.thaliana….……………………………………………………..……………………………..200 2.4.2.1AnálisisdeexpresióndeHaDAGATsenA.thaliana………201 2.4.2.2Análisisfenotípicodesemillas…..…………………………………..202 2.4.2.3Análisislipídicodesemillas……………………………………………..202 2.4.2.3.1AnálisisdelacomposicióndeTAGs…….202 2.4.2.3.2AnálisisdelacomposicióndeFAMEs…202  BLOQUEII:ANÁLISISDETRIACILGLICÉRIDOS(TAGs)ENLÍNEAS MUTAGENIZADASDEGIRASOLALTOOLEICOALTOESTEÁRICO(HOHE)Y SELECCIÓNDENUEVOSCANDIDATOS…..………………………………………………………….…203  1.OBJETIVOYCRITERIOSDESELECCIÓN……………………………….………………….…………203  2.ANÁLISISDESCRIPTIVODEPOBLACIONES(M2‐M5)…………………………….….……...204 2.1GENERACIÓNM2…………………………………………………………………………………………………204 2.2GENERACIÓNM3…………………………………………………………………………………………………204 2.3GENERACIÓNM4…………………………………………………………………………………………………204  IX 2.4GENERACIÓNM5…………………………………………………………………………………………………205  3.ANÁLISISESTADÍSTICODEPOBLACIONES(M2‐M5)…………………….…………..……..206 3.1ANÁLISISPORVARIABLESALOLARGODELASGENERACIONES…..……………………206 3.1.1Contenidoesteárico(E)…..…………………………………………………………...…206 3.1.2ContenidoEOE…..……………………………………………………..……………………..216 3.1.3ContenidoSUS…..……………………………………………………..……………………..226 3.1.4ValorαSat…..……………………………………………………..……………………………..235 3.2ANÁLISISDERELACIÓNDEVARIABLESPORGENERACIONES…..………………………..245 3.2.1GeneraciónM2…..……………………………………………………..……………………..245 3.2.2GeneraciónM3…..……………………………………………………..……………………..249 3.2.1GeneraciónM4…..………………………………………………………………………….…249 3.2.2GeneraciónM5…..……………………………………………………..……………………..249  DISCUSIÓN    53‐288  BLOQUEI:CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARYENZIMÁTICADELAS ACILTRANSFERASASIMPLICADASENLABIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSEN GIRASOL…..……………………………………………………..……..……………………………………………….255  1.CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARDELASENZIMASIMPLICADAS ENLABIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL:HaLPAATsYHaDAGATs  1.1CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNFISICOQUÍMICADEHaLPAATsYHaDAGATs..255 1.2ANÁLISISFILOGENÉTICODEHaLPAATsYHaDAGATs…………………………………………256 1.2.1EvolucióndefamiliasgénicasLPATsyDGATs……………………………….257 1.3PREDICCIÓNDEESTRUCTURASDEHaLPAATsYHaDAGATs………………………………258 1.3.1Estudiocomparativodemotivosconservadosyresiduos aminoacídicos…………………………………………………………………………………..259 1.3.1.1HaLPAATs…………………………………………………………………………….260 1.3.1.2HaDAGATs……………………………………………………………………………261 1.3.2Estudiocomparativodedominiostransmembrana(TMDs)……..…265 1.4LOCALIZACIÓNSUBCELULARDEHaLPAATsYHaDAGATs………………………………….266 1.4.1Localizaciónensubdominiosyrelaciónconotroselementos…….268  X 1.5ESTUDIOCOMPARATIVODEMODELOSTOPOLÓGICOSDEHaLPAATs YHaDAGATs……………………………………………………………………………………………….…….270 1.6ANÁLISISCOMPARATIVODELOSNIVELESDEEXPRESIÓNDEHaLPAATs YHaDAGATs………………………………………………………………………………………………………273 1.6.1LPATs…………………………………………………………………………………………………274 1.6.2DGATs……………………………………………………………………………………………….274 1.6.3RegulacióndelaexpresióndeHaLPAATsyHaDAGATsen semillasendesarrollo………………………………………………………………………275  2.CARACTERIZACIÓNBIOQUÍMICADELASENZIMASIMPLICADASENLA BIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL:HaLPAATsYHaDAGATs…..277  2.1HaLPAATs…………………………………………………………………………………………………………277 2.1.1Nivelcantidad…………………………………………………………………………………..278 2.1.2Nivelcalidad……………………………………………………………………………………..278  2.2HaDAGATs……………………………………………………………………………………………………….281 2.2.1Nivelcantidad…………………………………………………………………………………..281 2.2.2Nivelcalidad……………………………………………………………………………………..285  BLOQUEII:ANÁLISISDETRIACILGLICÉRIDOS(TAGs)ENLÍNEAS MUTAGENIZADASDEGIRASOLALTOOLEICOALTOESTEÁRICO(HOHE)Y SELECCIÓNDENUEVOSCANDIDATOS………………………………………………………………..288  CONCLUSIONES289‐294  BIBLIOGRAFÍA295‐326  APÉNDICES327‐332      XI ÍNDICEDEFIGURAS  1. Radiografíadeplantadegirasol 2. Inflorescenciaysemilladegirasol 3. Distribuciónmundialdelcultivodegirasol 4. Evolucióndelaproducción(Mt)ysuperficiecultivada(Mha)desemillasde girasolenlasúltimasdécadasanivelmundial(FAOSTAT,2015) 5. Comparativadelaevolucióndelaproducción(milesdetoneladas,kt)de aceitedegirasolenlasúltimasdécadasanivelmundialyEspaña(FAOSTAT, 2015) 6. Evolucióndelaproducción(Mt)ysuperficiecultivada(Mha)desemillasde girasolenlasúltimasdécadasenEspaña(FAOSTAT,2015) 7. Ejemplosdelasestructurasrepresentativasparacadacategoríadelípidos (LIPIDMAPS‐ICCNL) 8. Esquemacomparativodelasestructurasdevariosácidosgrasos 9. Estructuradelosacilglicéridos 10. Disposiciónestructuraldelospolimorfismosdelostriacilglicéridosensus formasβyβ’ 11. Representacióngráficadelastresposicionesestereoespecíficasdeácidos grasosenlamoléculadeTAG 12. Estructuradelosfosfolípidos 13. Esquemageneraldelarutadebiosíntesisdelípidosenplantas 14. Diagramaesquemáticodelarutadebiosíntesisdelosácidosgrasos principalessaturados,monoinsaturado(MUFA)ypoliinsaturados(PUFAs)en semillasdeoleaginosas,asícomosuspropiedadesnutritivasyfuncionales 15. Representaciónesquemáticadelosplásmidosyvectoresusadoseneste trabajo 16. CurvadeamplificacióndelaqRT‐PCR 17. MétodorápidoparalaidentificacióndetransformantesA.thalianaempleado enestetrabajo 18. SeleccióndetransformantesA.thalianaresistentesahigromicinaB 19. Separacióndelípidosneutrosporcromatografíaencapafina(TLC) 20. Esterificacióndetriacilglicérido(TAG)ensusésteresmetílicosdeácidosgrasos (FAMEs) XVIII B.NOMENCLATURADELOSÁCIDOSGRASOS  NombrecomúnNombresistemáticoAbreviaturaSímbolo  Láurico  Dodecanoico  12:0 MirísricoTetradecanoico14:0 PalmíticoHexadecanoico16:0P PalmitoleicoCis‐9‐hexadecenoico16:1ω7c EsteáricoOctadecanoico18:0E OleicoCis‐9‐octadecenoico18:1ω9cO LinoleicoCis,cis‐9,12‐octadecadienoico18:2ω6c,9cL α‐linolénicoCis,cis,cis‐9,12,15‐octadecatrienoico 18:3ω3c,6c,9cLn γ‐linolénicoCis,cis,cis‐6,9,12‐octadecatrienoico18:3ω6c,9c,12c AráquicoEicosanoico20:0 GadoleicoCis‐11‐icosenoico20:1ω9c AraquidónicoEicosatetraenoico20:4ω6A BehénicoDocosanoico22:0B ErúcicoCis‐13‐docosenoico22:1ω9c LignocéricoTetracosanoico24:0   C.NOMENCLATURADELOSACIL‐COAs  18:0‐CoAEstearil‐CoA 18:1‐CoAOleil‐CoA   D.NOMENCLATURADELOSTRIACILGLICÉRIDOS  SSS  Saturado‐Saturado‐Saturado SISSaturado‐Insaturado‐Saturado SIISaturado‐Insaturado‐Insaturado αSatCoeficientedeasimetría       XIX E.NOMENCLATURADELOSAMINOÁCIDOS  NombrecomúnAbreviaturaSímboloMW ÁcidoAspartico Ácidoglutámico Alanina Arginina Asparragina Cisteina Fenilalanina Glicina Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Prolina Serina Tirosina Treonina Triptofano Valina Asp Glu Ala Arg Asn Cys Phe Gly Gln His Ile Leu Lys Met Pro Ser Try Thr Trp Val D E A R N C F G Q H I L K M P S Y T W V 133 147 89 174 132 121 165 75 146 155 131 131 146 149 115 105 181 119 204 117  F.ORGANISMOS  NombrecientíficoAbreviaturaNombrecientíficoAbreviatura  Agrobacteriumtumefaciens Arabidopsisthaliana Brassica Escherichiacoli Euonymus Glycinemax Helianthusannuus Helianthusciliaris Nicotianatabacum Oleaeuropaea   A.tumefaciens At|A.thaliana B Ec|E.coli E Gm|G.max Ha|H.annuus Hc|H.ciliaris Nt|N.tabacum Oe|O.europaea  Oryzasativa Perillafrutescens Physcomitrellapatens Piceasitchensis Ricinuscommunis Saccharomycescerevisiae Thermusthermophilus Verniciafordii Zeamays  Os|O.sativa Pf|P.frutescens Pp|P.patens Ps|P.sitchensis Rc|R.communis Sc|S.cerevisiae Tt|T.thermophilus Vf|V.fordii Zm|Z.mays   XX G.ENZIMASYSUSTRATOS  AbreviaturaEnzima  ACAT ACC ACP ACS BCCP CPT DAGAT DGTA DH ELO ENR FAD2 FAD3 FAD6 FAD7/8 FAE FAH FASI FASII FASIII FatA FatB GPAT KAS KCS KR LPAAT LPCAT MCAT MAGAT mtKAS ODS OLE PAP PDAT PPasa SAD TE  Acetil‐CoA:ACPtransacilasa Acetil‐CoAcarboxilasa Proteínatransportadoradeacilos Acil‐CoAsintetasa Proteínatransportadoradebiotinacarboxilada Colinafosfotransferasa Diacilglicerolaciltransferasa Diacilglicerol:Diacilgliceroltransacilasa ß‐hidroxiacil‐ACPdehidratasa Elongasadeácidosgrasos(levaduras) Enoil‐ACPreductasa Oleatodesaturasamicrosomal Linoleatodesaturasamicrosomal Oleatodesaturasaplastidial Linoleatodesaturasaplastidial Elongasadeácidosgrasos Oleato‐12‐hidroxilasa(R.communis) ComplejoácidograsosintetasaI ComplejoácidograsosintetasaII ComplejoácidograsosintetasaIII Acil‐ACPtioesterasatipoA Acil‐ACPtioesterasatipoB Glicerol‐3‐fosfatoaciltransferasa ß‐cetoacil‐ACPsintasa ß‐cetoacil‐CoAsintasa ß‐cetoacil‐ACPreductasa Lisofosfatidilaciltransferasa Lisofosfatidilcolinaaciltransferasa Malonil‐CoA:ACPtransacilasa Monoacilglicerolaciltransferasa ß‐cetoacil‐ACPsintasamitocondrial Oleatodesaturasa Δ9desaturasa(levaduras) Fosfatidatofosfatasa Fosfolípido‐diacilglicerolaciltransferasa Fosfatidatofosfatasa Estearatodesaturasaóestearil‐ACPdesaturasa Acil‐ACPtioesterasas  XXI Abreviatura Sustrato                ADP AG AGL AMP ATP CoA CoASH DAG DGDG dNTPs G3P LPA LPC MAG MGDG NAD NADP NADPH PA PC PE PI PSer TAG VLCFA  Adenosina‐5’‐difostato Ácidosgrasos Ácidosgrasoslibres Adenosina‐5’‐monofosfato Adenosina‐5’‐trifosfato CoenzimaA CoenzimaAcongruposulfhidrilo Diacilglicerol Digalactosildiacilglicerol Desoxirribonucleótidostrifosfato Glicerol‐3‐fosfato Ácidolisofosfatídicoólisofosfatidato Lisofosfatidilcolina Monoacilglicerol Monogalactosildiacilglicerol Nicotinamidaadeninadinucleótido Nicotinamidaadeninadinucleótidofosfato Nicotinamidaadeninadinucleótidotrifosfato Ácidofostatídicoófosfatidato Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina Fosfatidilinositol Fosfatidilserina Triacilglicéridosótriglicéridos Ácidosgrasosdecadenamuylarga XXII H.PRODUCTOSQUÍMICOS  AbreviaturaProductoquímico  BHT BrEt DMP DMSO DTT EDTA EGTA EMS HCL IPTG MES MetOH Ni‐NTA PEG SDS TEMED X‐Gal  Butilhidroxitolueno Bromurodeetidio Dimetoxipropano Dimetilsulfóxido Ditiotreitol Ácidoetilendiaminotetraacético Ácidoetilenglicoltetraacétido Etilmetanosulfonato Ácidoclorhídrico Isopropil‐ß‐D‐tiogalactopiranósido Ácido2‐(n‐morfolin)etanosulfónico Metanol Ácidonitrilotriacético‐níquel Polietilenglicol Dodecilsulfatosódico N,N,N’,N’‐tetrametiletilenodiamina 5’‐bromo‐4‐cloro‐3‐indolil‐ß‐D‐galactósido   I.GENOTIPOYMARCADORESGENÉTICOS  GenotipoymarcadoresgenéticosusadosenlascepasdeE.coli  Amp argF  bioA cm,cat cro deoR  endA  F’      Construcciónqueconfiereresistenciaaampicilina Mutaciónenornitinacabamoiltransferasaquebloqueala capacidaddeusararginina Adenosilmetionina‐8‐amino‐7‐oxononanoatoaminotransferasa Construcciónqueconfiereresistenciaacloranfenicol Genquecodificaparaunaproteínadelisistempranaenelfagoλ Genreguladorquepermitelaexpresiónconstitutivadelosgenes desíntesisdedeoxirribosas.Permitelatomadegrandesplásmidos MutaciónenendonucleasanoespecíficaI,eliminandosu actividad,porloquemejoralapreparacióndeplásmidos Plásmidoautotrasmisivoydebajacopiausadoparageneraciónde DNAmonocatenariocuandoseinfectaconelfagoM13;puede contenerunmarcadorderesistenciaquepermitael mantenimientoynormalmentellevalosgenotiposlacIyLacZΔM15   XXIII galK   gyrA96 hsd Kan lacI    lacY1 lacZ  LacZΔM15   mcrA,mcrBComrr   mutS  phoA phoAB  recA relA    supE,F  Tet thi‐1  Tn10  λcI857  Mutaciónengalactoquinasaquebloqueaelcatabolismodela galactosa.LascélulasquesongalKposeenuncrecimientolentoen presenciadegalactosacomoúnicafuentedecarbono MutaciónenDNAgirasaqueproduceresistenciaalácidonalidixico NombregenéricodeendonucleasasdeE.coli Construcciónqueconfiereresistenciaakanamicina Codificaelrepresorlacquecontrolalaexpresióndepromotores quellevanunoperadorlac.ElIPTGseunealrepresorlacylo desplazadelpromotor;frecuentementeusadoalescanearcélulas blancas/azulesoparaelcontroldeexpresióndegenes recombinantes Mutaciónquebloqueaelusodelactosaviaβ‐D‐galactosidasa Gendelaβ‐D‐galactosidasa;mutacionesenestegenproducen coloniassincolorenpresenciadeX‐Gal Elementorequeridoparacomplementacióndelaβ‐D‐ galactosidasacuandoseempleaX‐Gal;usadoenlabúsquedade recombinantesblancos/azules;normalmentellevadoenelprofago lambdaφ80oF’ MutacionesquepermitenlametilacióndelDNAquenohasido reconocidocomoforáneo;estegenotipoesnecesariocuandose clonaDNAgenómicoocDNAmetilado Mutaciónenelmecanismodereparacióncelular.Permitequeel procesoderecombinaciónnoseaeliminadoporlacélula Mutaciónenfosfatasaalcalina Mutaciónqueimpideelcrecimientocelularenmediomínimosin prolina Mutaciónengenresponsableparalarecombinacióngeneralde DNA ElRNAessintetizadoenausenciadesíntesisproteica(fenotipo relajado).EllocusrelAregulaelacoplamientoentrela transcripciónylatraducción.Enelsilvestre,concentraciones limitantesdeaminoácidosresultanenunacaídadelasíntesisde RNA MutaciónensupresordelRNAtransferentedeglutaminade ambar(supE)(UAG)otirosina(supF) Construcciónqueconfiereresistenciaatetraciclina Mutaciónqueimpideelcrecimientocelularenmediomínimosin tiamina Construcciónqueconfiereresistenciaatetraciclinapormediode untransposóncuandonoseindiquelocontrario RepresortermosensibledelosgenesRedbajoeloperónpL  XXIV GenotipoymarcadoresgenéticosusadosenlascepasdeS.cerevisiae  ADE2  ade2‐1  are1‐Δ::HIS3   are2‐Δ::LEU2   can1‐100  dga1‐Δ::KanMX4   his3‐11,15  leu2,3‐112  lro1‐Δ::TRP1   MATα trp1‐1  ura3‐1  Genquecodificalacarboxilasadefosforibosilaminoimidazol implicadaenlasíntesisdeadenina MutaciónenelgenADE2quecodificalacarboxilasade fosforibosilaminoimidazolimplicadaenlasíntesisdeadenina MutaciónenelgenARE1quecodifica,juntoaARE2,laacetil‐CoA aciltransferasaimplicadaenlasíntesisdeésteresdeesterol. MutaciónporinsercióndelgenHIS3 MutaciónenelgenARE2quecodifica,juntoaARE1,laacetil‐CoA aciltransferasaimplicadaenlasíntesisdeésteresdeesterol. MutaciónporinsercióndelgenLEU2 MutaciónenelgenCAN1quecodificaunapermeasaqueconfiere sensibilidadalacanavalina MutaciónenelgenDGA1quecodificaladiacilglicerol aciltransferasaimplicadaenlasíntesisdetriacilglicéridos. MutaciónporinsercióndelgenKanMX4queconfiereresistenciaa kanamicina MutaciónenelgenHIS3quecodificalaimidazolegliceron fosfatasaimplicadaenlasíntesisdehistidina MutaciónenelgenLEU2quecodificalaβ‐Isopropilmalato deshidrogenasaimplicadaenlasíntesisdeleucina MutaciónenelgenLRO1quecodificalafosfolípido:diacilglicerol aciltransferasaimplicadaenlasíntesisdetriacilglicéridos. MutaciónporinsercióndelgenTRP1 TiposexualhaploidedeS.cerevisiae MutaciónenelgenTRP1quecodificalaanthranilatoisomerasa implicadaenlasíntesisdetriptófano MutaciónenelgengenURA3quecodificalaorotidina‐5'‐fosfato descarboxilasaimplicadaenlasíntesisdepirimidina    GenotipoymarcadoresgenéticosusadosenlascepasdeA.tumefaciens  rpoH+ElgenrpoHcodificanparaelgenhomólogodeE.colisigma32 (heatshocksigmafactor) hrcA+RepresordelatranscripcioninducibleportemperturaHrcA. ReguladornegativodegenesdechoquetérmicodeclaseI (operonesgrpE‐dnaK‐dnaJandgroELS).     XXV J.OTROS  AbreviaturaNombre  A.C. Aprox BSA CAS C cDNA CO2 Col‐0 Ct C‐terminal DNA DO E.C. EST etal. F F1 F2/M2 FAMEs GC gDNA GLC ICCNL INV IUPAC KM LIPIDMAPS LB MCS Mr mRNA MW Nº/nº N‐terminal ORF PAGE PCR PF  AntesdeCristo Aproximadamente Albúminadesuerobovino ColecciónAndaluzadeGirasoles Carbono DNAcomplementario Dióxidodecarbono Columbia Cicloumbral(RT‐PCR) Carboxiloterminal Ácidodesoxirribonucleico Densidadóptica Númeroenzimático(EnzymeCommissionnumber) Marcadordesecuenciaexpresada Ycolaboradores Forward(oligonucleótidos) Primerageneración Segundageneración Ésteresmetílicosdeácidosgrasos Cromatografíadegases DNAgenómico Cromatografíagas‐líquido ComitéInternacionalparalaClasificaciónyNomenclaturadeLípidos Invernadero UniónInternacionaldeQuímicaPurayAplicada Afinidadporsustrato TheLipidMetabolitesandPathwaysStrategy MedioLuriaBertani Sitiodeclonaciónmúltiple Pesomolecularrelativo RNAmensajero Pesomolecular Número Aminoterminal Pautaabiertadelectura Electroforesisengeldepoliacrilamida Reacciónencadenadelapolimerasa Pesofresco XXVI pH pI qRT‐PCR R RACE RE Rn RNA SC SC‐URA SD SDW sn‐ TM TLC URA UV WT YPD Potencialdehidrógeno Puntoisoeléctrico PCRcuantitativaatiemporeal Reverse(oligonucleótidos) AmplificaciónrápidadelosextremosdelcDNA Retículoendoplásmico Emisióndefluorescencia(RT‐PCR) Ácidoribonucleico Mediomínimo(levaduras) Mediomínimodeselección(levaduras) Desviaciónestándar Aguadestiladaestéril PosiciónestereoespecíficadeacilosenTAG Segmentostransmembranas Cromatografíaencapafina Uracilo Ultravioleta Tiposilvestre Medioenriquecido(levaduras)                    INTRODUCCIÓN|1‐72                    1.GIRASOL 3 1.1HISTORIA,ORIGENYBOTÁNICA3 1.2MORFOLOGÍAYFISIOLOGÍA4 1.3IMPORTANCIAECONÓMICAYDISTRIBUCIÓNDELCULTIVO9 1.4PRODUCCIÓNYCONSUMO10 1.5MEJORADELCULTIVOYPERSPECTIVASDEFUTURO14  2.LÍPIDOSDEPLANTAS:CLASIFICACIÓNYFUNCIÓN16 2.1ÁCIDOSGRASOS(AGs)19 2.2ACILGLICÉRIDOS25 2.3FOSFOLÍPIDOS30  3.LÍPIDOSDEPLANTAS:BIOSÍNTESIS32 3.1SÍNTESISDENOVO DEÁCIDOSGRASOS(AGs)32 3.2FORMACIÓNDELPOOLDEACIL‐CoAs34 3.3BIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOS(TAGs)35  4.LÍPIDOSDEPLANTAS:MODIFICACIÓN43 4.1CRITERIOSDESELECCIÓN44 4.2PROBLEMÁTICAACTUAL47 4.3MODIFICACIÓNDELCONTENIDOGRASODELASSEMILLAS49 4.4MODIFICACIÓNDELACALIDADDELOSACEITES52  5.ACEITEDEGIRASOL61 5.1CARACTERÍSTICASGENERALES61 5.2OBTENCIÓNDEMUTANTESCONCOMPOSICIÓNMODIFICADADEACEITE62 Introducción  8 Laduracióndelciclodelgirasoldependedelavariedadyelmomentodela siembra.Éstesedivideenvariasetapas(AlbayLlanos,1990):  Lagerminaciónyemergenciadiscurrendesdelasiembrahastalaaparicióndelos cotiledones.Enfuncióndelahumedadylatemperaturapuededurarde10‐30 días.Acontinuaciónseproducelaformacióndelasprimerashojas(4‐5pares). Duranteestafaseseproduceunrápidocrecimientodelaraíz,loquecondiciona elposteriorvigordelaplanta.Enestaetapa,ladisponibilidaddeaguaesvital, siendoperjudicialtantolafaltacomoelexcesodeésta.Estafaseduraentre15‐ 25días.Apartirdeestemomentotienelugarlafasedecrecimientomásactivay demáximaabsorcióndemineralesdelsuelo,queseprolongahastaeliniciodela floración.  Lafloracióncomprendetodoelperíodoenelquelasfloressevanabriendoy tieneunaduracióndeentre40‐50días.Enestepunto,laplantaesespecialmente sensiblealestréshídrico,asícomoatemperaturasextremas.Lasprimerasflores enabrirsesonlasdelaparteexteriordelcapítuloycontinúaconlaaperturade losanillosexterioreshaciaelcentro(floracióncentrípeta),arazónde1‐5anillos pordía.Lasfloresliguladasquerodeanelcapítulocomienzanasecarseycaen díasdespuésdeabrirselasúltimasfloresdelcentrodelcapítulo.Elprocesotarda encompletarsede10‐12días.  Lapolinizaciónyfecundación,llevadaacaboporinsectos,esgeneralmente alegama(fecundacióncruzadaentrefloresdistintas).Losóvulos,unavez fecundados,recibensustanciasdereservahastaqueseconviertenensemilla madura.  Lafasedemaduraciónsecompletaunavezalcanzadalamadurezfisiológica,esto es,elmomentoenelquelasemillaalcanzasumáximopesoseco,loque representaelfindelperíododellenado.Estafasesueledurarentre35‐50díasy finalizacuandolasemillatieneaproximadamenteun40%dehumedad, momentoenelque,sisedanlascondicionesadecuadas,vuelveagerminar.   Introducción  9 1.3 IMPORTANCIAECONÓMICAYDISTRIBUCIÓNDELCULTIVO  Actualmente,elgirasolesunadelascincoplantasoleaginosasparaconsumo humanomáscultivadasentodoelmundo.  Lasrazonesdeléxitodeestecultivopuedenresumirseendos:porunlado,el girasolesunaplantarústicadefácilcultivoytieneunabuenaadaptaciónauna granvariedaddesuelos.Dehecho,lasregionesdemayorproducciónselocalizan muyalejadasdesucentrodeorigen.Porotrolado,poseeunaltoporcentajede aceiteensemilla(38‐52%),aceitequehaencontrado,desdeelprimermomento, unaexcelenteacogidaentrelosconsumidores,científicosydietistas,debidoasu calidaddietéticaysuscualidadesfísico‐químicas.Larelativasencillezdelas técnicasindustrialesparasuextracción,asícomosufácilconservaciónybajo costefrenteaotrosaceites,permiten,además,alcanzaraltosrendimientosensu producción,constituyendounaventajaañadidaparasuindustrializacióny comercio(AlbayLlanos,1990).  Elpapelquetieneenlaalimentaciónhumanasecompletatambiénconotros usos,comosonlosforrajerosytécnicos.Latortadegirasol,subproductodela extraccióndelaceitedesemillas,tambiénseempleaenlaproduccióndeharinas proteicasporsualtocontenidoproteico(53‐66%),yaseaparaconsumoanimalo humano(Bauetal.,1983).Recientemente,elaceitedegirasoltambiénseestá utilizandoenlaproduccióndebiolubricantes,permitiendoasíproducir conjuntamenteunalimentoyunproductoindustrial,locualcontribuye decisivamentealarentabilidaddesucultivo.Además,elaceitedegirasol,juntoa otrosaceitesvegetales,seconsideradeparticularinterésparalaindustriade pinturasycosméticos,queconstantementedemandanaceitesconuna composiciónespecíficadeácidosgrasos.  LadistribucióndelgirasolocupacasilatotalidaddeAméricadelNorte,desde CanadáhastaelnortedeMéxico,asícomoArgentina,yestápresenteenla mayoríadelospaíseseuropeos,ademásdeRusia.Losfocosdeproducciónse localizanmayoritariamenteendichasregiones(Figura3).  Introducción  10 Figura3.Distribuciónmundialdelcultivodegirasol. Enverdesemarcanlaszonasdecultivo.  1.4PRODUCCIÓNYCONSUMO  Enelúltimomediosiglo,elcultivodegirasolhaexperimentadounimportante desarrollo,triplicándoselasuperficiemundialdedicadaasucultivodesde1961 hasta2012,pasandode6,6a25,0millonesdehectáreas(Mha)(FAOSTAT,2015). Suproduccióntambiénsehavistoincrementada,habiéndosequintuplicadocon crecesenelmismoperíodoalpasarde6,8a37,0millonesdetoneladas(Mt) (FAOSTAT,2015).Noobstante,latendenciageneralactualsecaracterizapor períodosascendentesconsignificativosdescensospuntualesenambos parámetros(Figura4).  Comoyahemosmencionado,elprincipaldestinodelcultivodegirasolesla elaboracióndeaceiteparaalimentación.Enlaactualidad,elaceitedegirasol representamásdel10%delaproducciónmundialdeaceitesvegetales,loquelo convierteenelcuartoenimportanciadeproducción,tansólosuperadoporlos aceitesdecolza,sojaypalma. Introducción  11 Tabla1.Principalespaísesproductoresdeaceite degirasolenelmundoenelaño2012 (FAOSTAT,2015). Laproduccióndelaceitedegirasolanivelmundial,expresadaenmilesde toneladas(kt),haidoevolucionandodeformairregular,sibiensehaproducido enlaúltimadécadaunincrementomuysignificativo(Figura5).  En2012,laproducciónmundialdeaceitedegirasolsesituóentornoalas15,21 millonesdetoneladas,delosque2,66millonescorrespondíanalconjuntodelos paísesdelaUniónEuropea(UE),cantidadampliamentesuperadaporUcraniay Rusia,principalespaísesproductores(FAOSTAT,2015).EnelsenodelaUE, Alemaniaseerigiócomoprimerproductor,seguidodeFranciayEspaña.Enla Tabla1seresumenlosdoceprincipalespaísesproductoresdeaceitedegirasol enelmundocorrespondienteadichoaño,ordenadosdemayoramenor producción(kt)(FAOSTAT,2015).  PaísProducción(kt) Ucrania3937,2 Rusia3632,0 Argentina1541,6 Turquía819,2 China598,1 Alemania492,0 Francia463,0 Hungría373,7 España268,3 Sudáfrica265,8 Rumanía250,4 Holanda215,0  Rusia,quehastaahoraeraconsideradalaprimerapotenciamundial,sehavisto relegadaalsegundopuestograciasalaugeexperimentadoporUcraniaenlos últimosaños.En2011,Ucraniaproducíayaalgomásde3millonesdetoneladas deaceitedegirasol,habiendoexportadomásdel80%deestacifra, convirtiéndoseasíenelprimerpaísproductordeaceitedegirasolyexportador delmundo(FAOSTAT,2015).Escuriosovercómoestepaís,peseasutamaño, producehoydíamásvolumendeaceitedegirasolquetodalaextintaUnión Introducción  12 Soviética.Estosedebeaquehacemásdeunadécada,Ucraniacomenzóa estimularsuindustriadeproduccióndeaceitepormediodelaintroducciónde losimpuestosdeexportaciónparalassemillas.Además,creóincentivos destacadosparalosproductoresnacionales,queaceleraronlaproducciónde aceitedegirasolanivelnacionalenlugardeexportarelproductoenbrutoalas plantasdeprocesamientodelextranjero.Deestaforma,ydesdeentonces, Ucraniahadescendidodeformagraduallosimpuestosdelasexportaciones.Por otrolado,Indiaseconstituyecomoelprimerpaísimportadordeaceitede girasol,seguidodelejosporTurquíayBélgica,segúndatosobtenidosenelaño 2011(FAOSTAT,2015).  España,porsuparte,haexperimentadoundescensopaulatinodelaproducción deaceitedegirasolenlasúltimasdécadas(Figura5).Sinembargo,desdehace unosaños,seobservaunaincipienterecuperacióndelaproducciónque,peseal bruscodescensode2012,sitúaalpaísenelnovenopuestodelosprincipales paísesproductoresdeesteaceite(Tabla1).Estaprontarecuperaciónybrusco descensotambiénsonvisiblesalcompararlosdatosdeproducciónysuperficie cultivadadesemillasdegirasol(Figura6),apesardequeambosparámetrosno handejadodecrecerdesdeelaño2005(FAOSTAT,2015).Noobstante,este cultivosuponemásdel10%delaproduccióntotaldeoleaginosasennuestro país,tansólosuperadoporelcultivodeaceitunas(80%),siendosuinterés indiscutiblehoydía(FAOSTAT,2015).             Introducción  13 Figura6.Evolucióndelaproducción(Mt)ysuperficiecultivada(Mha)desemillasdegirasol enlasúltimasdécadasenEspaña(FAOSTAT,2015).                              Figura5.Comparativadelaevolucióndelaproducción(milesdetoneladas,kt)deaceitede girasolenlasúltimasdécadasanivelmundialyEspaña(FAOSTAT,2015). Figura4.Evolucióndelaproducción(Mt)ysuperficiecultivada(Mha)desemillasdegirasol enlasúltimasdécadasanivelmundial(FAOSTAT,2015). Introducción  14 Encuantoalconsumodeaceitedegirasol,laAntiguaRepúblicaYugoslavade Macedoniasecolocacomoelmayorpaísconsumidordelmundo,con16,20 kg/persona/año,seguidadeMontenegrocon13,60yHungríayBulgariacon 12,60kg/persona/añocadauno,segúndatosrecogidosenelaño2009 (FAOSTAT,2015).Enesemismoaño,elaceitedegirasolacaparóenEspañael 34%delacuotademercadosdeaceitescomestibles,conunconsumo aproximadode9,40kg/persona/año,cifraqueloconvierteenelundécimo consumidordeaceitedegirasoldelmundo(FAOSTAT,2015).Elaceitedegirasol, sinembargo,noestanpopularenChina,conunconsumodetansólo0,10 kg/persona/añoenelaño2009.AlgoparecidoocurreenEEUUque,apesarde serelmayorconsumidordeaceitesvegetalesdelmundoycontarconuna importanteAsociaciónNacionaldeProductoresdeGirasol,consumióalrededor de0,10kg/persona/añodeesteaceiteenesemismoaño(FAOSTAT,2015).  1.5MEJORADELCULTIVOYPERSPECTIVASDEFUTURO  Enelcultivodegirasolsehaperseguidodesdesusinicioslaobtencióndenuevas variedadesconmejorastalescomounamayorproduccióndesemillasyaceite, unamayorresistenciaaenfermedadesyparásitosyunamayorresistenciaa condicionesdecultivoadversas,comolasequíaolaelevadasalinidaddelos suelos,todasellasencaminadasaincrementarelrendimiento.Paraconseguir estosobjetivossehanestadoutilizandodiversasestrategiasalolargodel tiempo.  Laestrategiatradicionalutilizadahasidolamejoradelcultivoaprovechandola variabilidadgenéticanaturalqueposeeelgirasol.Graciasaestacualidad,desde losiniciosdelamejoraclásicaenRusiaafinalesdelsigloXIX,seconsiguióreducir hastaunoelnúmerodecapítulosporplanta,incrementareltamañodelas semillas(Vrânceanu,1977)ypasardevariedadesconuncontenidodeaceitedel 30%(1912‐1926)avariedadesconunrendimientodeaceitedel45‐50%a principiosdelosaños60.Estasmejorasconfirieronaestaplantalaconsideración eimportanciadecultivooleaginosoqueactualmentetiene(Sharmaetal.,2012).  Introducción  15 Posteriormente,sedesarrollólamejoramediantelaobtencióndehíbridos, aprovechandoelfenómenodelaheterosisovigorhíbridodeprimera generación.LamejoramediantelaheterosisdiosusprimerosfrutosenCanadáa mediadosdelsiglopasado,perodebidoaqueseusabaesterilidadgénicayque sobreelparentalfemeninosucedíatantoautopolinizacióncomopolinización cruzada,losporcentajesdehibridacióneranmenoresdel50%(Röbbelenetal., 1989).Esteproblemasesolucionóaprincipiosdelosaños70conlaintroducción enlalíneaparentalfemeninadelcarácterdeandroesterilidadcitoplásmica (CMS).Estecaráctersetransfieredeunageneraciónaotraporvíamaterna,está relacionadoconlaproduccióndeunaproteínamitocondrialalteradaylas plantasqueloposeensonincapacesdeproducirpolen(Köhleretal.,1991).La líneamasculinautilizadaparaobtenerhíbridos,ademásdeproducirpolen,debe contenerlosgenesrestauradoresdelafertilidad,paraqueloshíbridosde primerageneraciónobtenidospuedanproducirpolendemaneranormaly,por tanto,semillas.Así,ydebidoaquesiempreseusanlíneasCMScomoparental femenino,todosloshíbridoscultivadosestánrelacionados,almenosencuantoa sucitoplasma(Friedt,1992).  Sinembargo,dadoquetantolavariabilidadgenéticanaturaldelgirasolcomola conseguidamediantelahibridaciónsonenocasionesinsuficientesparaconseguir líneasconunascaracterísticasdeterminadas,esnecesariorecurriraotras técnicas,comolamutagénesisolaingenieríagenética.Esteaspectoserá ampliamentetratadoenIntroducción,4y5.  Encuantoalasperspectivasdefuturodelcultivodegirasol,segúnlas estimaciones,laproducciónmundialdesuaceitesemantendrácasisin modificacionesenlaspróximascampañas.Apesardelascondiciones atmosféricasdesfavorablesdelosúltimosañosalasquetuvieronquehacer frentepaísestandestacadoscomoRusiaeIndia,conlaconsecuentepérdidade producción,elaumentodelaproduccióndepaísescomoArgentinayUcrania logrócontrarrestardichaspérdidas,manteniendocasisinmodificacionesla producciónmundialdeaceitedegirasol.Estehecho,juntoalasmedidas adoptadasporlamayoríadelospaísesproductores,encaminadasaampliarlas zonasdecultivoylaproduccióndesemillas,estáfavoreciendolacreacióndeun Introducción  16 potencialparalaaceleracióndelaproduccióndeaceitedegirasolanivelmundial (FAOSTAT2015).  Lospreciosdeunmercadomundialactivo,motivadoporunrápidocrecimiento delconsumogeneralyelaumentodedemandaporpartedenuevospaíses emergentes,tambiénpodríanfavorecerunanotableexpansióndeloscultivosy produccionesmundialeshastanivelessinprecedentes.  Porúltimo,laversatilidaddelaceitedegirasolencuantoasususos,asícomola rentabilidaddesucultivoylaaparicióndenuevosaprovechamientos(aceitede girasolaltooleicoparafrituraybiolubricantes,...),estáhaciendoque, actualmente,elaceitedegirasolganepopularidadendetrimentodeotros aceitestradicionalesyaumentenlasperspectivasdecrecimientoparasucultivo.  Acontinuaciónseexpondránvariosapartadosdedicadosalaclasificación, función,biosíntesisymodificacióndelípidosdeplantasengeneralnecesarios paracomprenderydesarrollaraspectosdelaceitedegirasolrelacionadoscon éstos,dedicándolesunúltimoapartadoenestaIntroducción.  2.LÍPIDOSDEPLANTAS:CLASIFICACIÓNYFUNCIÓN  Entérminosquímicos,loslípidossoncompuestosquesecaracterizanporposeer unaltogradodeinsolubilidadenaguasiendo,encambio,fácilmentesolublesen disolventesorgánicosnopolares(Badui,2006).Aunquequímicamente heterogéneos,todospresentanundenominadorcomúnestructural:latotalidad oalmenosunapartesignificativadesumoléculaesdenaturaleza hidrocarbonaday,portanto,apolar.  Laenormediversidaddeloslípidosexistentesdificultacualquierclasificación sistemática.Loscriteriosdeclasificaciónempleadosvaríandetalformaquese hacenecesariaunacontinuarevisióndelosmismos.   Introducción  17 Históricamente,unadelasclasificacionesmáscomunesdividíaaloslípidosen dosgrandescategorías:lípidossaponificables,quecontienenácidosgrasos unidosaalgúnotrocomponente,generalmentemedianteunenlacetipoéster (acilglicéridos,ceras,fosfoglicéridos,glucolípidosyesfingolípidos),ylípidosno saponificables,quenocontienenácidosgrasos,aunquetambiénincluyenalgunos derivadosimportantesdeéstos(terpenos,esteroideseicosanoides).Asuvez,los lípidossaponificablessepuedendividirenbaseasuestructuramolecularen lípidossimples,deestructuraexclusivamentehidrocarbonada(acilglicéridosy ceras);ylípidoscomplejos,cuyaestructurahidrocarbonadapresentaademás otrosgruposfuncionalesquecontienenátomosdenitrógeno,fósforo,azufre,e inclusoglúcidos(fosfoglicéridos,glucolípidosyesfingolípidos).  Actualmente,loslípidossecataloganbajoelsistemadeclasificaciónideadopor elComitéInternacional“TheLipidMetabolitesandPathwaysStrategy”(LIPID MAPS),enconjuntoconelComitéInternacionalparalaClasificacióny NomenclaturadeLípidos(ICCNL),basadoenprincipiosquímicosybioquímicos, compatibleconlasbasesdedatosynecesidadesinformáticasactuales(Fahyet al.,2005,2009,2011).Deestamanera,loslípidossedistribuyenenochograndes categorías,cadaunadelascualespresentaasuvezsuspropiassubcategorías. Éstasson:i)ácidosgrasos(AG),ii)glicerolípidos(GL),iii)glicerofosfolípidos(GP), iv)esfingolípidos(SP),v)lípidosesteroles(ST),vi)lípidosprenoles(PR),vii) sacarolípidos(SL)yviii)policétidos(PK)(Figura7).             Introducción  24 Tabla2.Ácidos g rasosmáscomunesenloslí p idosdereserva.  Nombre común Nomenclatura Sistemática(IUPAC) Nomenclatura abreviada Fórmula química Punto defusión(ºC)Estructuraquímica  LáuricoDodecanoico12:0C 12 H 24 O 2 43,2  Mirístico  Tetradecanoico  14:0  C 14 H 28 O 2   58,8   Palmítico  Hexadecanoico  16:0  C 16 H 32 O 2   62,8   Palmitoleico  Δ9‐cis‐hexadecaenoico  16:1Δ9c  C 16 H 30 O 2   ‐0,1   Esteárico  Octadecanoico  18:0  C 18 H 36 O 2   68,8   Oleico  Δ9‐cis‐octadecaenoico  18:1Δ9c  C 18 H 34 O 2   15,2   Linoleico  Δ9,12‐cis‐octadecadienoico  18:2Δ9,12c  C 18 H 32 O 2   ‐5,0   α‐linolénico  Δ9,12,15‐cis‐octadecatrienoico  18:3Δ9,12,15c  C 18 H 30 O 2   ‐11,0   γ‐linolénico  Δ6,9,12‐cis‐octadecatrienoico  18:3Δ6,9,12c  C 18 H 30 O 2   ‐11,0   Araquídico  Eicosanoico  20:0  C 20 H 40 O 2   76,0   Gadoleico  Δ9‐cis‐eicosaenoico  20:1Δ9c  C 20 H 38 O 2   23,5   Behénico  Docosanoico  22:0  C 22 H 44 O 2   79,9   Erúcico  Δ9‐cis‐docosenoico  22:1Δ9c  C 22 H 42 O 2   38,0   Lignocérico  Tetracosanoico  24:0  C 24 H 48 O 2   84,2  Introducción  25 Ademásdetodosestosácidosgrasos,existenasuvezotrosconestructuraspoco frecuentes,característicosdedeterminadosgruposoespeciesvegetales.Estos ácidosgrasosinusualespresentandoblesenlacesenposicionespococomunes, triplesenlaces,ramificaciones,sustituyentescomogruposhidroxi,epoxi,anillos deciclopropeno,etc,…yconfierenaloslípidoscaracterísticasdegranvaloren diferentesáreas.Ejemplosdeéstossonlosácidosricinoleico,erúcico, petroselínico,vernólico,etc.(Cahoonetal.,2002;JaworskiyCahoon,2003; KinneyyClemente,2005;Tayloretal.,2011).  Porúltimo,mencionarqueenlasgrasasalimentariasnomodificadas,yenla naturalezaengeneral,losdoblesenlacesdelosácidosgrasosinsaturadosse encuentranmayoritariamenteenconfiguracióncis‐.Encuantoalaisomería posicional,aunqueéstospuedensituarseteóricamenteendiferenteslugaresde lacadena,tambiénexistenposicionesfavorecidasporlanaturaleza.  2.2ACILGLICÉRIDOS  2.2.1Definiciónyclasificación  Losacilglicéridos,dentrodelosglicerolípidos(GL),sonésteresdeácidosgrasos unidosaunamoléculadeglicerol.  Elglicerolpresentatresgruposalcohólicosy,portanto,puedeaparecer esterificadoenuna,dosotresposiciones,dandolugarrespectivamentea monoacilglicéridos,diacilglicéridosytriacilglicéridos(Figura9).   Monoacilglicéridos(MAGs):hayunsoloácidograsoesterificandoala moléculadeglicerolenlaposiciónsn‐1,sn‐2osn‐3.Existen,portanto, tresformasisoméricas:los1(3)‐MAGsy2‐MAGs.   Diacilglicéridos(DAGs):tienenesterificadasdosposiciones(1,2‐DAG,2,3‐ DAGy1,3‐DAG).Los1,2‐DAGsdeconfiguraciónLsonlosmáscomunes, mientrasquelos2,3‐DAGsy1,3‐DAGssóloseencuentranencantidades trazas.  Introducción  26  Triacilglicéridos(TAGs):tienenesterificadaslastresposicionesdel glicerol.Cuandopresentanunsolotipodeácidograsosedenominan TAGssimplesuhomogéneosysicontienendosomásácidosdiferentesse llamanTAGscompuestosomixtos.Puedenexistirmuchasformas isoméricas.               Ensuinmensamayoría,losacilglicéridos,tambiénllamadoslípidosneutros,se presentancomoTAGs,constituyendolaprincipalreservadeenergíaensemillas (OhlroggeyBrowse,1995;OhlroggeyJaworski,1997;AthenstaedtyDaum,2006; Napier,2007;Yenetal.,2008).LosMAGsyDAGs,porsuparte,aparecen ocasionalmentecomointermediariosenlabiosíntesisodegradacióndeTAGso comosegundosmensajeroshormonales(Stobartetal.,1997).       CH 2 OCO-R CHOH CH 2 OH CH 2 OCO-R CHOH CH 2 OH 1(3)-MAG CH 2 OCO-R 1 R 2 -COOCH CH 2 OH CH 2 OCO-R 1 R 2 -COOCH CH 2 OH 1,2 (2,3)-DAG CH 2 OCO-R 1 CHOH CH 2 OCO-R 2 CH 2 OCO-R 1 CHOH CH 2 OCO-R 2 1,3-DAG CH 2 OCO-R 1 R 2 -COOCH CH 2 OCO-R 3 CH 2 OCO-R 1 R 2 -COOCH CH 2 OCO-R 3 TAG 2-MAG CH 2 OH R-COOCH CH 2 OH CH 2 OH R-COOCH CH 2 OH Figura9.Estructuradelosacilglicéridos.MAG:monoacilglicérido|DAG:diacilglicérido| TAG:triacilglicérido|R:ácidograso. Introducción  27 2.2.2Propiedadesfísico‐químicas  Lasdiferenciasenlaspropiedadesfísico‐químicasdelosacilglicéridosvienen determinadasporelnúmeroytiposdeácidosgrasosqueloscomponen,así comoladisposiciónoconfiguraciónestereoespecíficadeéstosenlamoléculade glicerol(RodríguezRiveraySimónMagro,2008).  Así,losTAGssecomportancomomoléculasmuyhidrofóbicas,alencontrarsetres ácidosgrasosesterificandolamoléculadeglicerol,mientrasquelosMAGsy DAGsmuestrancarácteranfipáticodebidoalapresenciadegruposOHno esterificados.Elpapelquejueganlosdistintostiposdeácidosgrasosfue detalladoenIntroducción,2.1.2.Encuantoalaconfiguraciónestereoespecífica delosdistintosácidosgrasosenlamoléculadeglicerol,éstaseconsiderael factormásinfluyenteenlaspropiedadesfísicasdelosTAGs,yaqueincluyeal restodefactoresmencionados.  ElestadocristalinoesunadelaspropiedadesfísicascaracterísticasdelosTAGs. Lostriacilglicéridospresentanpolimorfismo,locualsignificaqueunmismo triacilglicéridopuedetenerdiferentesformascristalinasenfuncióndesu composiciónydelascondicionesdecristalizaciónalasqueestásometido.Las formaspolimórficasmásimportantessonlasβ’,mayormentecompuestaspor unamezcladeAGsdeentreC16‐18,ylasβ,compuestasensutotalidadporAGsde C18(Figura10).Laformaβ’formacristalesenunsistemarómbicoylaformaβlo haceenunsistematriclínico;ambasformaspolimórficassecaracterizanpor formarunbajonúmerodecristalesdegrantamaño.        Figura10.Disposiciónestructuraldelospolimorfismosdelostriacilglicéridosensusformas βyβ’.1,2y3representanlastresposicionesestereoespecíficasdelamoléculadeglicerol. . ..... ββ’ 1 23 3 2 1 . ..... ββ’ 1 23 3 2 1 Introducción  28 sn‐1  sn‐2 Figura11.Representacióngráficadelastresposicionesestereoespecíficasdeácidosgrasos enlamoléculadeTAG. ElpuntodefusiónesotradelaspropiedadescaracterísticasdelosTAGs,como asílofueraenelcasodelosácidosgrasos,yestácondicionadológicamentepor lanaturalezadeéstos(Introducción,2.1.2).Además,lapropiaformapolimórfica enqueseencuentrenlosTAGscristalizadostambiéninfluyeenelpuntode fusión,demaneraqueparaunmismotriacilglicérido,ésteesmayorenlaformaβ ymenorenlaβ’.  2.2.3Nomenclatura  Comoyasehaindicado,lastresposicionesdeesterificacióndelglicerolpueden aparecercontresácidosgrasosiguales,dosigualesyunodistinto,olostres diferentes.Deestamanera,eltriacilglicéridopuedepresentaruncarbono asimétrico(C2delglicerol),dotandoalamoléculadequiralidadyobservándose esteroisómeros.Asípues,desdeunpuntodevistabioquímico,sedistinguentres posicionesestereoespecíficasenlamoléculadeTAG:posicióncentral correspondientealC2delglicerol(sn‐2)yposicionesprimariascorrespondientes alosC1yC3delglicerol(sn‐1ysn‐3)(Figura11).          Paranombrarlosseindicanprimerolosradicalesdeácidosgrasos,seguidode glicerol.Elnombresn‐1estearil,sn‐2oleil,sn‐3palmitilglicerolhacereferencia portantoauntriacilglicéridoconácidoesteárico,ácidooleicoyácidopalmítico enlasposicionessn‐1,sn‐2ysn‐3,respectivamente.  Introducción  29 2.2.4Acilglicéridosmásfrecuentesenlanaturaleza  Lostriacilglicéridossonloscomponentesmayoritariosdeloslípidosdereservay estánpresentestantoeneltejidoadiposoanimalcomoenlassemillasyfrutos delasplantasoleaginosas.LosTAGsdeorigenanimalposeenmayorporcentaje deácidosgrasossaturados,porloquesuelensersólidosatemperaturaambiente (grasas).Porelcontrario,losTAGsdeorigenvegetalyanimalesmarinostienen unaltocontenidodeácidosgrasosinsaturadosysonlíquidosatemperatura ambiente(aceites).Losmonoydiacilglicéridosseconsiderancomponentes minoritarios.  EnlosTAGsdeaceitesdeorigenvegetal,losAGsinsaturadosoleicoylinoleicose encuentranenmayorproporciónyrepresentanalrededordeun60%deltotal; entrelossaturadoselmásabundanteeselpalmítico,seguidodelesteárico.En cuantoasuposición,porlogeneral,losPUFAs(ácidoslinoleicoylinolénico)se encuentranprincipalmenteenlaposicióncentralsn‐2,mientrasquelosAGs saturadosdecadenalarga(ácidopalmíticoyesteárico)ocupanlasposiciones primariassn‐1ysn‐3.LosAGsmonoinsaturadoscomoelácidooleicose distribuyenentrelastresposicionesestereoespecíficas.  EnlasgrasasalimentariasexistentantoTAGshomogéneoscomomixtos,aunque enlasgrasasformadasporunnúmeronomuyelevadodeácidosgrasos(aceites deorigenvegetal)eshabituallapresenciadealtasproporcionesdeTAGs homogéneosquecontienenelácidograsomayoritario(trioleínaenelaceitede oliva,otrilinoleínaenaceitedegirasolomaíz).Sinembargo,engrasascomplejas dondesepresentanunnúmeroelevadodeácidosgrasos(grasalácteayaceites depescado),existeunaltoporcentajedetriacilglicéridosmixtos.         Introducción  30 CH 2 OCO-R 1 R 2 -COOCH CH 2 O P OX OH O Figura12.Estructuradelosfosfolípidos. R:ácidograso|X:alcoholesterificado. 2.3FOSFOLÍPIDOS  2.3.1Definiciónyclasificación  Losfosfolípidos,dentrodelosglicerofosfolípidos(GP),sonésteresdedosácidos grasosyunácidofosfóricounidosaunamoléculadeglicerolenlasposiciones C1‐C2yC3,respectivamente.Además,elácidofosfóricosehallaesterificadopor unalcohol,queconstituyeungrupodecabezapolar,confiriéndolecarácter anfipáticoalamolécula(Figura12).           Losdistintosfosfolípidossediferencianportamaño,formaycargaeléctricade susgruposdecabezaspolares.Sonloscompuestosmásabundantesenlas membranascelulares,mientrasqueenotraslocalizacionescelularesyengrasasy aceitessóloaparecenenpequeñascantidades.Losmásimportantesson:  Ácidofosfatídico(PA):compuestoprimariodelosfosfolípidosquecontieneun grupodecabezanopolar,alnoposeerelalcoholesterificado.Seencuentraen pequeñascantidadesenlascélulas,peroesunintermediarioimportanteenla biosíntesisdelosfosfolípidosyTAGs(Dörmann,2005).PApuedeestar esterificadoaunsegundoalcohol,originandoelrestodefosfolípidos.  Fostatidilcolina(PC),fosfatidiletanolamina(PE)yfosfatidilserina(PSer): presentanunsegundoalcoholnitrogenado,colina,etanolaminaoserina, respectivamente.Estoscompuestoscontienenensucabezapolarun aminoalcoholypuedeninterconvertirseentresímediantevariasreacciones Introducción  31 enzimáticas(Dörmann,2005).LosmásabundantesenplantassonPCyPE, constituyendomásdel50%delosglicerofosfolípidospresentesenlas membranasextraplastidiales.MientrasquePEnoseencuentraenlas membranasplastidiales,PCformaparte,además,delasmembranasdela envueltaexternadelcloroplasto.PSeresunfosfolípidominoritarioenplantas,y, aligualquePE,noseencuentraenmembranascloroplásticas.  Fosfatidilinositol(PI):susegundoalcoholesunpolialcoholcíclico,elinositol.Este fosfolípidoformapartedelasmembranasyjuegaunpapelimportanteenla transduccióndeseñalenlascélulas,yaqueeselprecursordelossegundos mensajerosinositoltrifosfatoyDAG.PIsedetectaenpequeñascantidadesen casitodaslasmembranasdelascélulasvegetales.Sinembargo,mientrasquesu presenciaenlasmembranasextraplastidialesestágeneralmenteaceptada,la identificacióndePIenlasmembranastilacoidalesnohasidoconfirmada (Dörmann,2005).  Fosfatidilglicerol(PG):susegundoalcoholesotramoléculadeglicerol.Eselúnico fosfolípidopresentetantoenlasmembranastilacoidalescomoenlasmembranas extraplastidiales(Dörmann,2005).  Difosfatidilglicerol(DPG)ocardiolipina:enestecaso,elgrupofosfatodelácido fosfatídicoestáesterificadoconotramoléculadefosfatidilglicerol.Suesqueleto contieneasítresmoléculasdeglicerolunidasmediantedospuentesfosfodiéster; losdosgruposhidroxilodelosglicerolesexternossehallanesterificadospor ácidosgrasos.Sulocalizaciónestárestringidaalasmembranasinternas mitocondriales(Dörmann,2005).         Introducción  32 3.LÍPIDOSDEPLANTAS:BIOSÍNTESIS  Labiosíntesisdelípidosenplantasesunprocesocomplejoenelqueestás implicadasvariasrutasinterconectadasentresí(Figura13).Enesteapartadose resumelabiosíntesisdeTAGs,lacualpuededividirseentresfasesbien diferenciadas:i)síntesisdenovodeácidosgrasosenelplastidio,ii)formacióndel pooldeacil‐CoAsenelcitosol,yiii)ensamblajedeTAGsperseenelretículo endoplasmáticodesemillasendesarrollo(OhlroggeyJaworski,1997;Baudy Lepiniec,2010;Batesetal.,2013).  3.1SÍNTESISDENOVODEÁCIDOSGRASOS(AGs)  Enplantas,labiosíntesisdenovodelosácidosgrasossedesarrollaenlos plastidios(OhlroggeyBrowse,1995)mediantelaaccióncombinadadedos sistemasmultienzimáticos:laacetil‐CoAcarboxilasa(ACC)ylasintasadeácidos grasos(FAS)(Harwood,2005)(Figura13).  LaACCcatalizaelprimerpasoenlasíntesisdeácidosgrasos,consistenteenla formacióndemalonil‐CoAapartirdeacetil‐CoA(SasakiyNagano,2004).El malonil‐CoAproducidopasaposteriormenteamalonil‐ACP(AcylCarrierProtein, proteínaportadoradeacilos)mediantelaaccióndelamalonil‐CoA:ACP transacilasa(MAT)(OhlrogeeyBrowse,1995).  ElcomplejoFASrealizalaelongacióndelascadenasdeácidosgrasosemergentes atravésdelaadicióndedosunidadesdecarbono,loscualessondonadosporel malonil‐ACP(Slabasetal.,2001).Enplantas,elcomplejoFASesdetipoII,enel quecadaenzimaquelocomponeescodificadaporungenindependientey catalizaunpasoindividualdelaruta(Slabasetal.,2001).Laelongacióndelas cadenasdeaciloimplicaciclosrepetitivosdecondensación,reducción, deshidrataciónyreducciónenlosqueintervienendistintasenzimas(Ohlroggey Browse,1995).Lacondensacióninicial,catalizadaporlaß‐cetoacil‐ACPsintasaIII (KASIII),tienelugarentremalonil‐ACPyacetil‐CoA.AunqueKASIIIpuedecatalizar másreacciones(González‐Melladoetal.,2010),seconsideraquelaß‐cetoacil‐ ACPsintasaI(KASI)ylaß‐cetoacil‐ACPsintasaII(KASII)catalizanlossiguientes Introducción  33 pasosdecondensacióndesde4:0‐ACPhasta16:0‐ACPy16:0‐ACPa18:0‐ACP, respectivamente(Harwood,2005).Dentrodecadaciclodecondensación,se requierentresreaccionesadicionales(reducción,deshidrataciónyreducción). Estasreaccionesadicionalesestáncatalizadassecuencialmenteporla3‐oxoacil‐ ACPreductasa(KR),hidroxiacil‐ACPdeshidratasa(DH),yenoil‐ACPreductasa(ER) (OhlroggeyJaworski,1997).  Enlamayoríadelasplantas,lasíntesisdenovodeácidosgrasosfinalizacuando lascadenasdeaciloalcanzanunalongituddeC16‐18.Partedel16:0‐ACP sintetizadopuedeentrarenlarutaprocariota,enlacapainternadelos plastidios,dondelosacil‐ACPssonusadosdirectamenteporlasaciltransferasas plastidialesparaproducirglicerolípidosyglicerofosfolípidosapartirdePAyDAG (OhlroggeyBrowse,1995;Dormänn,2005);elrestodel16:0‐ACPeshidrolizado porlasacil‐ACPtioesterasasdetipoAoB(FatAoFatB)(Jonesetal.,1995a),ylos AGslibresresultantessonexportadosfueradelosplastidiosyre‐esterificados paraformaracil‐CoAsatravésdelaaccióncatalíticadelaacil‐CoAsintetasa (LACS)(OhlroggeyBrowse,1995;Li‐Beissonetal.,2010).Aunquepartedel18:0‐ ACPpuedeserliberadofueradelplastidiotraslaaccióndelastioesterasas,la mayoríasoneficientementedesaturadosatravésdelaaccióncatalíticadela estearil‐ACPdesaturasa(SAD)plastidial,queintroduceundobleenlaceenla posiciónΔ9del18:0‐ACPparaformar18:1Δ9c‐ACP(Li‐Beissonetal.,2010).SAD esconsideradaunadesaturasaúnicaenelreinovegetalporsersolubleyestar localizadaenelestromadelplastidio,yaquelamayoríadelasdesaturasasson proteínasdemembrana(OhlroggeyBrowse,1995).Normalmentetienemayor actividadrelativaqueKASII,loqueexplicalamenoracumulaciónde18:0quede 16:0enplantas(Harwood,1996).El18:1‐ACPresultantepuedeasuvezser hidrolizadovíaaccióncatalíticadelastioesterasasyamencionadasparaformar AGslibres,loscuálessonposteriormenteexportadosalcitoplasma,oentrarenla rutaprocariotadesíntesisdeglicerolípidosyglicerofosfolípidos(Li‐Beissonetal., 2010)(Figura13).     Introducción  40 actualmentetambiénenArabidopsisthaliana(Hernándezetal.,2012),árboldel tung(Caoetal.,2013)ylevaduras(Ranietal.,2013),entreotros.Adiferenciade lasdosanteriores,lasproteínasDAGAT3sonsolubles,localizándoseenelcitosol (Sahaetal.,2006).Encuantoalpapelquepudieradesempeñarenlaproducción delípidosdereserva,pareceestarclaroquenoescrucial(Cahoonetal.,2007; Caoetal.,2013),sibienel30%delaactividadDAGATesimputablealafracción citosólica(Sahaetal.,2006),lacualpudieraestarimplicadaenelreciclajedelos AGsinsaturados18:2y18:3enTAGs(Hernándezetal.,2012).  Engeneral,alserresponsabledelúltimopasodelabiosíntesisdeTAGsynoestar implicadoenladelípidosdemembrana,DAGATesconsideradalaenzimaclave enelcontroldelatasadesíntesisdeTAGsensemillas(Ichiharaetal.,1988; Cahoonetal.,2007;Napier,2007;Venegas‐Calerónetal.,2010).Además,las distintasespecificidadesporsustratolaconviertenenresponsabledirectadela distribucióndelosdistintosAGsenTAGs,porloquesucaracterizaciónresulta fundamentalenlamodificacióndedeterminadosaceites.Estosaspectosserán ampliamentedesarrolladosenIntroducción,4.3y4.4.2.          Introducción  41   Introducción  42          Figura13.Esquemageneraldelarutadebiosíntesisdelípidosenplantas. ACC:acetil‐CoAcarboxilasa|ACP:proteínatransportadoradeacilo|AG: ácidograso|CoA:coenzimaA|DAG:diacilglicerol|DAGAT:diacilglicerol aciltransferasa|DAG‐CPT:CDP‐colina:diacilglicerolcolinafosfotransferasa| DGDG:digalactosildiacilglicerol|DGTA:DAG:DAGtransacilasa|DH:hidroaxil‐ ACPdeshidratasa|ER:enoil‐ACPreductasa|FAD2:oleildesaturasa|FAD3: linoleildesaturasa|FAE:complejodelaelongasadeácidosgrasos|FAS: complejodelasintasadeácidosgrasos|FatA/B:acil‐ACPtioesterasastipoA yB|G3PDH:glicerol‐3‐Pdeshidrogenasa|GPAT:glicerol‐3‐fosfato aciltransferasa|HmACC:acetil‐CoAcarboxilasahomomérica|KAS:ßcetoacil‐ACPsintasa|KR:3‐oxoacil‐ACPreductasa|LACS:acil‐CoAsintetasa decadenalarga|LPAAT:lisofosfatidatoaciltransferasa|LPC: lisofosfatidilcolina|LPCAT:lisofosfatidilcolinaaciltransferasa|MAG: monoacilglicerol|MAGAT:monoacilglicerolaciltransferasa|MAT:malonil‐ CoA:ACPtransacilasa|MGDG:monogalactosildiacilglicerol|PA:ácido fostatídico|PAP:fosfatidatofosfatasa|PC:fosfatidilcolina|PDCT: fosfolípido:diacilglicerolcolinafosfotransferasa|PG:fosfatidilglicerol|PLA2: fosfolipasaA2|PDAT:fosfolípido:diacilglicerolaciltransferasa|SAD:estearil‐ ACPdesaturasa|SQDG:sulfoquinovosildiacilglicerol|TAG:triacilglicérido| *:Malonil‐ACP.Enrojosemarcanlasenzimaspertenecientesalarutade Kennedy,mientrasqueenazulsemarcanlasenzimaspertenecientesalas rutasindependientesdeacil‐CoA.Losacil‐CoAssombreadosenverdeestán presentesenexclusividadenlafamiliaBrassicaceae.ModificadodeBaudy Lepiniec,2010. Introducción  43 4.LÍPIDOSDEPLANTAS:MODIFICACIÓN  Losaceitesvegetalesseusantantoparaconsumohumanocomoparausos industrialesnoalimentarios(productosfarmacéuticos,jabones,pinturas, cosméticos,biolubricantes,biodiesel,etc.)(Napier,2007;Durrettetal.,2008; Dyeretal.,2008;DyeryMullen,2008;NapieryGraham,2010;RogalskiyCarrer, 2011;Tayloretal.,2011;Yuetal.,2011;Santorietal.,2012).Delaproducción mundialdeaceitesvegetales,el70‐80%sedestinaalconsumohumano,yasea deformadirecta,atravésdeladieta(aceitescrudosparaaderezar,aceitespara freírycocinar,margarinas,etc…),odeformaindirecta,atravésdeproductos procesadosdestinadosalaindustriaalimentaria(industriapanadera,pastelera, paralaconfeccióndehelados,etc…).Puestoquelasaplicacionesdelosaceites vegetalessonmuydiversas,exigiendocadaunadeellasunascaracterísticas físico‐químicasdiferentes,esobvioquerequierandistintosperfilesóptimos específicosdeácidosgrasos.Noobstante,cualquierintentodemodificaciónde estosaceitesestarálógicamentesometidoalaspropiaslimitacionesnaturalesde lasplantasentérminosdeviabilidadseminalycrecimientovegetal(KnaufyDel Vecchio,2008).  Lamodificacióndelípidosdeplantasoleaginosassecentraendosaspectos fundamentales:lamejoraenelcontenidograsodelasemillaylacalidaddel aceiteproducido.  DadoqueestaTesissehadesarrolladodentrodeproyectosdeinvestigacióndel GrupodeGenéticayBioquímicadeLípidosdeSemillas(GGBLS)encaminadosala obtencióndenuevosaceitessaludablesparaelconsumohumano,esteapartado secentraráenlasmodificacionesdeoleaginosasorientadasalaobtenciónde aceitesdeinterésparalaindustriaalimentaria.       Introducción  44 4.1CRITERIOSDESELECCIÓN  Loscriteriosdeselecciónhacenreferenciaaunaseriederequisitosquedebe cumplirtodoaceitevegetaldestinadoalconsumohumano;éstossepueden dividirentrelosquepersiguenmejorasdesdeunpuntodevistanutricionalo aquéllosquepersiguenmejorastecnológicasdelosaceites.  Elefectoqueejercenlasgrasasconsumidasenladietasobrelasalud cardiovasculardependedelacomposiciónenácidosgrasosdeéstas,locualestá relacionadodirectamenteconlosnivelesdecolesterolplasmático(Mensinket al.,2003).Elcolesterolsetransportaeneltorrentesanguíneoasociado fundamentalmentealipoproteínasdealtaybajadensidad(HDLyLDL, respectivamente).ElcolesterolasociadoaLDLsedepositaenelendoteliodelos vasossanguíneosysuexcesodeterminalaaparicióndeateromasqueobstruyen elflujo.  ExistennumerososestudioscientíficosquedemuestranquelosAGsinsaturados (oleico,linoleicoylinolénico)incrementanlasHDLydisminuyenlasLDL,porlo queseconsideransaludables.Engeneral,grasasconAGssaturadosdecadena menoraC18(láurico,mirísticoypalmítico)aumentanenconjuntotantolasLDL comolasHDL,incrementandolarelaciónLDL/HDL(Mensinketal.,2003).No obstante,alanalizarelefectodeestosácidosgrasosdemaneraindependientese observannotablesdiferencias(Duboisetal.,2007;Steijns,2008),atribuyéndose peoresresultadosalmirísticoquealláurico,aunquelaposicióndeéstosenel triacilglicéridoseestimaimportante(Hunter,2001);encuantoalpalmítico, algunosestudioshandemostradorelativaneutralidad(KhoslaySundram,1996). Elácidoesteárico,sinembargo,esconsideradoneutroopositivodesdela perspectivadelasaludcardiovascular(Kellyetal.,2001;OMS,2003;Mensink, 2005;ThijssenyMensink,2005).Ésteseencuentramayoritariamente esterificadoenlasposicionesprimariassn‐1ysn‐3delTAG,loquecontribuyea suliberaciónporlaaccióndelaslipasasestereoespecíficasdeesosenlaces duranteladigestión.Estosácidosgrasosnoseabsorbenfácilmentedebidoasu altopuntodefusiónyalatendenciadeéstosaformarsalescálcicasinsolubles, porloquesonexcretadosfinalmente(Bracco,1994;Zocketal.,1995;Ramírezet Introducción  45 al.,2001).Otrascontribucionesbasanelefectoneutroopositivodelácido esteáricoasutransformaciónenácidooleico,másqueaunalimitadaabsorción (BonanomeyGrundy,1988;Grundy,1994).Porelcontrario,losácidosgrasos queestánenlaposicióncentralsn‐2delosTAGssonpreferentemente absorbidosatravésdelaparedintestinal(Small,1991).  Asípues,desdeunpuntodevistanutricional,sepretendeincrementarel consumodeaceitesconAGsinsaturadosenlaposicióncentralsn‐2delosTAGs, muchomásbeneficiososparalasaludquelossaturadosenesamismaposición, yaqueéstos,excluyendoalácidoesteárico,estáníntimamenterelacionadoscon enfermedadescardiovasculares.  Porotraparte,desdeunpuntodevistatecnológicosepersigueelaumentodela estabilidadoxidativadelosaceitesylaobtencióndegrasasplásticasdeorigen vegetal.Laoxidacióndelosaceitesseproduceporlareaccióndelosdobles enlacesdelasmoléculaslipídicasconeloxígeno,produciendounavariedadde productosquímicos.Lasconsecuenciasdeestareacciónsonunadisminucióndel valornutricionaldelalimentoylaformacióndesaboresnodeseables acompañadosderancidez.AceitesconaltoscontenidosenAGsesencialesω3y ω6,enprincipiosaludables,tienenunamenorestabilidadoxidativaporelalto contenidoendoblesenlaces,oxidándosemuyrápidamente,porloquesonmás adecuadosparaelconsumodirecto.PorotraparteaceitesmuyricosenAGs saturadospresentanunamayorestabilidadperoestánasociadosaproblemas cardiovasculares.Porello,paraelusoindustrial,enelquelosaceitesygrasasse vensometidosfrecuentementeaaltastemperaturas,sonmásadecuadosaceites ricosenAGsmonoinsaturados,comoelácidooleico,ysaturadossaludables, comoelácidoesteárico.  Laspropiedadesfísicasmásimportantesdelasgrasassonelintervalodefusióny laconsistenciaquepresentan,lascuálesestánestrechamenterelacionadasy proporcionanlatexturaadecuadadealimentosgrasosyelaborados.Comose describióenapartadosanteriores,ambaspropiedadesfísicasdependendelas distintasespeciesdeTAGsquelascomponenyéstas,asuvez,delanaturaleza delosácidosgrasosquelasconforman.LasgrasasnaturalessonmezclasdeTAGs Introducción  46 ypresentan,portanto,intervalosdefusión,loscuálessealcanzana temperaturasmoderadamentebajas,provocandolalicuefacciónoel ablandamientodelasgrasasconcalentamientosmoderados.Asípues,la consistenciadelasgrasasestádirectamenterelacionadaconsusintervalosde fusión:grasassometidasatemperaturaspordebajodelpuntoinicialdeéstos presentaránunaconsistencialíquida,mientrasqueatemperaturasmayoresdel puntofinaldeéstosmostraránunaconsistenciacompletamentesolidificada.Sin embargo,esatemperaturascomprendidasdentrodesuintervalodefusión cuandolasgrasaspresentanlaspropiedadesmásinteresantesparala elaboracióndealimentosgrasosyelaboradoscomomargarinas,productosde bollería,reposteríaogalletería.Lasgrasasensuintervalodefusiónse denominangrasasplásticas.Asípues,laplasticidaddeunagrasaenglobalas característicasdeconsistenciaanteriormentemencionadas(RodríguezRiveray SimónMagro,2008).  Porúltimo,lacapacidaddecristalizacióndeestosaceitestambiénseerigecomo factordeterminanteensuselección.Porejemplo,losaceitesempleadosen friturasy/obiolubricantesnodeberíancontenercristalesoTAGsquecristalizaran fácilmente,mientrasqueparalosuntablesesdeseablequeesténypermanezcan enlaformaβ’(C16‐18),loquelesconfiereunasuperficiebrillanteyunsuave realce,envezdelaformaβ(C18)que,peseaformarcristalespequeños,creceen aglomerados,produciendounatexturagranuladaysiendomenoscapacesde incorporarlíquido(Gunstone,2001).  Asípues,desdeunpuntodevistatecnológico,sepretendedisminuirelusode aceitesconAGspoliinsaturados(PUFAs),yaqueencasosdeconsumoindirectose daprioridadalaestabilidadoxidativaaexpensasdelvalornutritivodeéstos. Además,paraobtenerbuenasgrasasplásticassehacenecesarioestablecerun equilibrioentreAGssaturadosyAGsmonoinsaturados,conespecialatencióna losácidosoleicoyesteárico.LalongituddelosAGsquecomponenestosaceites puedevariarenfuncióndesuusoyelgradodecristalizacióndeseados.   Introducción  47 Figura14.Diagramaesquemáticodelarutadebiosíntesisdelosácidosgrasosprincipales saturados,monoinsaturado(MUFA)ypoliinsaturados(PUFAs)ensemillasdeoleaginosas, asícomosuspropiedadesnutritivasyfuncionales.ModificadodeLiuetal,2002a. sólido SATURADOS 16:0 16:0 18:0 18:0 18:1 18:1 18:2 18:2 18:3 18:3 palmítico esteárico oleico linoleico linolénico MUFA PUFAs KASIII SAD FAD2 FAD3 líquido estable inestable LDLLDL aceites estables y saludables sólido SATURADOS 16:0 16:0 18:0 18:0 18:1 18:1 18:2 18:2 18:3 18:3 palmítico esteárico oleico linoleico linolénico MUFA PUFAs KASIII SAD FAD2 FAD3 líquido estable inestable LDLLDL aceites estables y saludables Acontinuaciónseresumelaidoneidaddeciertosácidosgrasosenfuncióndelos criteriosdeseleccióndescritosanteriormente(Figura14).    Unavezestablecidosloscriteriosdeselección,esprecisoidentificarla variabilidadgenéticadecadaespecieyaplicartécnicaseficientesde modificación.  4.2PROBLEMÁTICAACTUAL  Comosededucedelosapartadosanteriores,lamayoríadelosusosenla industriaalimentariarequierengrasasqueseansólidasatemperaturaambiente y/obastanteresistentesalaoxidación.  Originariamente,yparatalfin,laindustriaalimentariausabagrasasdeorigen animal,comolamantecadecerdoylamantequilla.Sinembargo,ydebidoala riquezadeestasgrasasendeterminadosAGssaturadosenlaposicióncentralsn‐ 2delosTAGs,enlosúltimos30añossehapromovidosusustituciónporaceites deorigenvegetal.LosaceitesvegetalesapenasposeenAGssaturadosendicha posición,porloqueseconsideranmuybeneficiososparaelconsumohumano. Introducción  48 Noobstante,suelevadocontenidoenAGsinsaturadoshacequeseanlíquidosa temperaturaambiente,porloqueestosaceitesnosonapropiadosparala fabricacióndemargarinas.  Paraconseguirquelosaceitesvegetalestenganunaconsistenciamássólidase manipulanquímicamentedemaneraqueselesmodificasucomposiciónde ácidosgrasosy/olaestructuradesusTAGs.Losprincipalesprocesosquese utilizanconestefinsonlahidrogenaciónylatransesterificación.  Lahidrogenación(Patterson,1994;Dijkstra,2007)esunprocesoquímicoquese realizaaaltastemperaturas,utilizandocorrientesdehidrógenoyciertos catalizadoresmetálicos,normalmenteníquel,paraconvertirlosAGsinsaturados presentesenestosaceitesensaturados,mediantelareduccióndelnúmerode susdoblesenlaces.Lahidrogenaciónpermiteasíconvertirlosaceitesvegetales líquidosengrasassólidasy/osemisólidasatemperaturaambiente.Noobstante, duranteesteprocesotambiénseproducenisómerostransdelosácidosgrasos, loscuálespuedenllegararepresentarhastaun40%deltotaldelaceiteycuyo consumoestáestrechamenterelacionadoconlaaparicióndeenfermedades cardiovasculares(StenderyDyerberg,2004;Weggemansetal.,2004; Mozaffarianetal.,2006,2009;PfeufferySchrezenmeir,2006;Tarrago‐Traniet al.,2006;Gebaueretal.,2007;Chardignyetal.,2008;Jakobsenetal.,2008;Khor yEsa,2008;Kummerow,2009;Anadónetal.,2010;EFSA,2010).Estosedebea quesuingestaproduceunaumentodelaconcentraciónplasmáticadeLDLyla disminucióndeladeHDL,enmayorproporciónquelohaceelconsumodegrasas animalessaturadasalasquesustituye.  Latransesterificación(Schuchardtetal.,1998;Dijkstra,2007),porsuparte,esun procesoquímicoporelcualseproduceunaredistribucióndelosácidosgrasosen lamoléculadeTAG,seguidodeunfraccionamientoqueenriquecealaceiteen AGssaturados.Latransesterificaciónpermiteasíconvertirestosaceitesvegetales engrasasmásparecidasalaanimal.Sinembargo,dichareordenaciónfavorecela disposicióndelosAGssaturadosenlaposicióncentralsn‐2delosTAGs,siendo absorbidosatravésdelaparedintestinalycausandolosefectosbiológicos comentadosanteriormente. Introducción  49 Actualmente,ysegúnlosexpertos,elaceiteograsaquedebeusarlaindustria tienequeserdeorigenvegetal,sinmanipulaciónquímicaalgunaquepudiera disminuirsucalidadnutricionalyelevarsucoste,ypudiendotenerunmayor contenidoenAGssaturadosenlasposicionesprimariassn‐(1+3),yaquela estructuranaturaldelosTAGsdeaceitesvegetalespermiteesteincrementosin serperjudicialparalasalud.  Conelpropósitodecubrirestademandasevienendesarrollandonumerosas técnicasdemodificacióngenéticadeplantasoleaginosasyaque,apesardesu granvariabilidadgenéticaydelamejoradesuproducciónconelusodehíbridos, nosecubrencompletamenteestasnecesidades(Cahoonetal.,2007).Entreestas técnicascabedestacarlamutagénesis,tantofísicacomoquímica,asícomola ingenieríagenética,cuyousosehadisparadoenlosúltimosañosgraciasal desarrollodelabiologíamolecularylabiotecnología.Avancesrecientesenla comprensióndemecanismosbioquímicos,molecularesycelularesdela biosíntesisdeaceiteensemillasdeplantasoleaginosas,juntoalaidentificacióny clonacióndegenesimplicadosenesteproceso,hanfacilitadoasuvezla obtencióndeinnumerablesaceitesconcomposicióndeácidosgrasosmodificada.  4.3MODIFICACIÓNDELCONTENIDOGRASODELASSEMILLAS  Lamejoraenelcontenidodeaceitedelassemillasestáencaminadaa incrementarelrendimientodeaceiteporunidaddesuperficie,disminuyendo consigoloscostesdeproducción(Frentzen,1998;ThelenyOhlrogge,2002;Dyer yMullen2005;LungyWeselake,2006).  Engeneral,lamejoraenesteaspectosecentraenelcontroldelflujodecarbono hacialaproduccióndeaceite(Weselakeetal.,2009;BaudyLepiniec,2010). Hastaahora,lascontribucionesalamejoradelcontenidodeaceitesehan producidoprincipalmenteatravésdelastécnicasclásicasdemejoraenplantas oleaginosasdegraninteréscomocolzaysoja(Weselakeetal.,2009)ogirasol (Introducción,1.5).Actualmente,elusodetécnicasdeingenieríagenéticaha permitidoabordarestamejoradesdeotropuntodevista.Inicialmente,los estudiosbasadosenestastécnicassecentraronenlosprimerospasosdelaruta Introducción  56 4.4.2ModificaciónenladistribucióndeácidosgrasosenTAGs  Comosehamencionadoanteriormente,lacomposicióndeácidosgrasos,su disponibilidadysudistribuciónenlasdistintasespeciesdeTAGsdeterminanlas propiedadesfísico‐químicasynutricionalesdelosaceitesydependenenúltima instanciadelaespecificidadporsustratodelasaciltransferasasquelassintetizan, principalmentelasqueformanpartedelarutadeKennedy:GPAT,LPAATy DAGAT.  EnelcasodeGPATdeplantas,nohasidoposibleidentificarhastalafechaningún genparalaisoformamicrosomal.SóloenelcasodeArabidopsisthaliana,lacual presentahastaochoisoformasplastidialesrelacionadasconlasíntesisdecutinay suberina(Li‐Beissonetal.,2010;Yangetal.,2012),secreehaberencontradouna novenaisoformapresumiblementemicrosomaly,porconsiguiente,relacionada directamenteconlabiosíntesisdeTAGs,GPAT9(Giddaetal.,2009).Porcontra, laisoformaplastidialdeGPAThasidobienestudiadaenvariasespeciesvegetales (FrentzenyWolter,1998;Jainetal.,2000).  LasLPAATdeplantas,porsuparte,presentanunamayorpreferenciaporAGs insaturadosdeC18,porloqueunadelasprincipalescaracterísticasdelosaceites vegetales,aexcepcióndealgunostropicalestalescomopalmaycoco(Gunstone yHarwood,2007),eselbajocontenidodeAGssaturadosenlaposicióncentral sn‐2deTAG.Estaespecificidadporsustratosemantieneinclusocuandose elevanloscontenidosdeácidoesteáricoendeterminadaslíneasdegirasolHE, manteniéndoselasproporcionesdeésteentrelasdistintasposicionesdela moléculaTAG(Fernández‐Moyaetal.,2005).Noobstante,losgenesLPAAThan demostradoserútilesparaaumentarlaacumulacióndedeterminadosAGs inusualesenlaposicióncentralsn‐2deTAGsencultivosoleaginosos,comoel ácidoerúcico(Lassneretal,1995;Broughetal.,1996;Lietal,2012)oelácido láurico(Knutzonetal,1999).    Introducción  57 Comoyamencionamos,DAGATejerceasuvezunafuerteinfluenciasobrela cantidadycomposicióndelosTAGssintetizadoseneldesarrollodesemillas (Katavicetal.,1995;Settlageetal.,1998;Routabouletal.,1999;Zouetal.,1999; Bouvier‐Naveetal.,2000;Jakoetal.,2001;Slabasetal.,2001;LungyWeselake, 2006;Lardizabaletal.,2008,2010;Xuetal.,2008;Yenetal.,2008;Zhengetal., 2008;Locketal.,2009;Snyderetal.,2009;Weselakeetal.,2009),presentando unampliorangodeafinidadpordistintosácidosgrasos.  Enlíneasgenerales,lasespeciesdeAGsinsaturadosestánpresentes principalmenteenlaposicióncentralsn‐2delglicerol,mientrasquelasespecies saturadasquedanrelegadasalasposicionesprimariassn‐1ysn‐3(Miquely Browse,1995).Apesardequeunsubconjuntolimitadodeestasespecies molecularesamenudopredomina(Brockerhoff,1971;Fatemietal.,1977;Burgal etal.,2008),lavariedaddeácidosgrasospresentesenundeterminadoaceite vegetalllevaalaproduccióndeunapoblaciónheterogéneademoléculasTAGs difícildecaracterizar.Paratalfinsehanvenidodesarrollandodistintastécnicas analíticasyteoríasmatemáticasque,encombinación,permitenadíadehoy determinarenmayoromenorgradolacalidaddeunaceiteenfuncióndesuuso, asícomolaposibilidaddecompararloconotrosdedistintacomposición.  Entreestastécnicasanalíticascabedestacarelanálisisenlacomposiciónde ácidosgrasos,consideradalamásútilalahoradecaracterizardichapoblaciónde TAGs.Sinembargo,enalgunoscasos,estatécnicanoessuficienteparadistinguir entredosaceitesdiferentesounamezcladeellos.Estoocurre,principalmente, enalgunosaceitesvegetalesquetienenunperfilsimilardeácidosgrasos,por ejemploentreaceitesricosenácidolinoleico(girasol,cártamoymaíz),aceites ricosenácidooleico(oliva,altooleicodegirasol,yaltooleicodecártamo)o entremuchosnuevostiposdeaceitesvegetalesgenéticamentemodificados (Martínez‐ForceyGarcés,1999;Hazebroek,2000).Paracaracterizarmejory discriminarentreestosaceitesesnecesarioanalizarelperfildeTAGspor cromatografíalíquidadealtaresolución(HPLC)oporcromatografíagas‐líquido (GLC)(Reskeetal.1997;Fernández‐Moyaetal.2000a).Alternativamente,en algunoscasos,lacomposiciónenácidosgrasosenlaposicióncentralsn‐2de TAGspuedeseranalizadausandolipasasespecíficas(Luddyetal.1964);este Introducción  58 enfoquehasidoutilizadotambiénparacaracterizarciertosaceitesvegetales (Reskeetal.1997;Álvarez‐Ortegaetal.1997).Másrecientemente,sehanpuesto apuntonuevastécnicasparaelanálisisestereoespecíficodeTAGs,haciendo posibleladeterminacióndelcontenidoenácidosgrasosenlastresposiciones (Laaksoetal,1990;TakagiyAndo,1991).Sinembargo,estastécnicas,pesea permitirdiferenciarnosóloaceitesdediferentescultivos(Santinellietal.1992; Reskeetal.1997;HarpyHammond,1998)sinotambiéndediferentes localizacionesycondicionesmedioambientales(Fatemietal.1977;Damianietal. 1997),resultansercomplejas,difícilesdeutilizardemanerarutinariaycon resultadosavecescontradictorios.  Entrelasteoríaspropuestasparaexplicarladistribuciónestereoquímicadelos ácidosgrasosenTAGs,lateoría1,3‐random‐2‐random(VanderWal,1960)se convirtióenlamásampliamenteaceptada.Éstasebasaenunadistribuciónal azarysimétricadelosAGssaturadosenlasposicionesestereoquímicassn‐1ysn‐ 3deTAG.Aplicandoestateoríaesposiblecalcularconbastanteprecisiónlas especiesdeTAGspresentesenunaceiteapartirdeloscontenidosdeTAGsyde ácidosgrasosenlaposicióncentralsn‐2.Noobstante,ygraciasalusodeanálisis estereoespecíficosdelastresposicionessn‐,sehavueltoevidentequeenla mayoríadelosaceitesdeorigenvegetaldichadistribucióndeAGsnoesalazarni totalmentesimétrica,porloquenoesposibleaplicardichateoría.Porejemplo, elcontenidoenácidooleicoenlamantecadecacaoesmayorenlaposiciónsn‐1 queenlasn‐3delosTAGs(TakagiyAndo,1995;GunstoneyHarwood,2007)yes prácticamenteelmismoenelaceitedeoliva(Santinellietal.1992;Damianietal. 1997).Además,elácidoesteáricoseencuentrapredominantementeenla posiciónsn‐3delosTAGsenelaceitedegirasol(Reskeetal.,1997)yenelaceite deoliva(Santinellietal.,1992;Damianietal.1997),peroestádistribuido uniformementeenambasposicionesenlamantecadecacao(TakagiyAndo, 1995).Efectivamente,tambiénexistendiferenciasentreloscontenidosdeácidos grasosenlasposicionessn‐1ysn‐3entrediferentesvariedadesdeunmismo cultivooenaquellascultivadasbajodiferentescondicionesmedioambientales. Sinembargo,lasasimetríascaracterísticassonsiempremantenidas,esdecir,se mantienelatendenciaporunácidograsoespecíficoaserencontradoenuna posiciónsn‐enparticular(Fatemietal.1977;Damianietal.1997). Introducción  59 4.4.2.1CoeficientedeasimetríaαSat  ElcoeficientedeasimetríaαSatsurgedelanecesidaddepoderintegrartodala informaciónprovenientedelanálisisdelasdistintasespeciesTAGspresentesen aceitesvegetales.Estecoeficientepermitecalcularladistribuciónrelativadelos AGssaturadosentrelasposicionesprimariassn‐1ysn‐3enlosTAGsapartirdel contenidototaldeAGssaturados(S)delosTAGs,asícomoelcontenidodelos AGssaturadosenlaposiciónsn‐2(S2)ylasdiferentesespeciesmolecularesde TAGs:(αSUS/SUU)(Martínez‐Forceetal.,2004).  ElvalordeαSatoscilaentre0,cuandounadelasposicionesprimariascontieneel 100%delosAGssaturados,y0,5,cuandolasdosposicionestienenelmismo contenidoenAGssaturados,oloqueeslomismo,unadistribuciónsimétricaen consonanciaconlateoríadeVanderWal(VanderWal,1960).Valoresinferiores a0,5implicaquehaymásAGssaturadosenlaposiciónsn‐1queensn‐3,o viceversa.Así,unvalordeαSat=0,33representaríaqueel33%delosAGs saturadosseencuentranenunaposiciónyel67%enlaotra,sindistinguirentre éstas.IgualmentenoesdeextrañarquecuandoelcontenidodeAGssaturados delaceiteesmuyalto,αSattiendeaserpróximoa0,5debidoaquetodoel sistemaenzimáticoestácompletamenteocupadodeAGssaturados(Fernández‐ Moyaetal.,2005).  Comohemosvistohastaahora,ladistribucióndeestosAGssaturadosentrelas posicionessn‐1ysn‐3delosTAGsdeunaceiteesparticularmenterelevantede caraasusposiblesusosindustriales.Cuandolaasimetríaaumenta,lacantidadde TAGsdisaturados(SUS)sereducey,enconsecuencia,elvalorαSattambiénseve disminuido.Estoesexactamenteloqueseobservaenlosaceitesdegirasol, concretamenteenaquéllosconmásdeun12%deácidoesteárico(Fernández‐ Moyaetal.2000b).Aefectosprácticos,cuantomásbajoseaelvalorαSat,peor seránlaspropiedadesplásticasdeeseaceite.ElmáximodeespeciesSUS, aquéllasquetienenbuenaspropiedadesplásticasparalaelaboraciónde margarinas,pastelería,panadería,etc,seobtendríancuandoαSatalcanzaseel valorde0,5.Deestaforma,estecoeficientepermiteatribuiracadaaceiteun valorαSatespecíficoenfuncióndesucomposición,porloquesepuedeemplear Introducción  60 comométododeselecciónañadidoaloscriteriosyamencionadosalahorade considerarundeterminadoaceitecomoaptoonoparaundeterminadouso, diferenciándolodelrestodeaceites.  Noobstante,esimportanteseñalarquelosdatosobtenidosutilizandoel coeficientedeasimetríaαSat,nosontotalmentecomparablesconunanálisis estereoespecífico.Porejemplo,elcontenidoenAGssaturadosenlasposiciones sn‐1ysn‐3ensojafuemuysimilarcuandosedeterminóencadaposición estereoquímicadelTAG(Reskeetal.1997;HarpyHammond,1998).Sin embargo,elcoeficienteαSatdelaceitefue0,29,indicandoquelosAGssaturados sedistribuíanasimétricamente.Estasdiscrepanciassurgenporque,adiferencia delcoeficienteαSat,queescalculadoapartirdelacomposicióndeTAGs,el análisisestereoquímicoconsideralastresposicionescomoindependientes. Comoconsecuenciadeestaasimetría,elcontenidodelasubclaseSUSesmenor delesperadoyhaymásSUUpresente.ElcoeficienteαSatportantonodistingue entrelasposicionessn‐1ysn‐3.Comosehaindicadoanteriormente,ésteesun coeficientedeasimetría,nounanálisisestereoquímico.Sinembargo,enla mayoríadeaceitesconunadistribuciónasimétricayasehaidentificado,por análisisestereoquímicostradicionales,laposiciónsn‐conlamenorproporciónde unácidograsoenconcretoyessiemprelamisma.Porello,ysiasífuera necesario,sepodríaasumirquéposicióntieneelmenorvalorparaeseácido grasoenparticular.             Introducción  61 5.ACEITEDEGIRASOL  5.1CARACTERÍSTICASGENERALES  Elaceitedegirasolesunexcelenteaceitecomestiblequeposeeunalto contenidoenAGsinsaturados(85‐91%),representadosensumayorparteporlos ácidosoleicoylinoleico.Enlamayoríadeloscasos,elaceitedegirasolesricoen ácidolinoleico,yaquerepresentadel50%al70%deltotal,mientrasqueelácido oleicosuelesuponerdel15al45%detodoslosácidosgrasosdelaceite(Tabla5); elhechodequeprácticamentenotengaácidolinolénicoleproporcionauna razonableestabilidadoxidativa(Murphy,1993;Fernández‐Moyaetal.,2005).  El98‐99%deesteaceiteestáformadoporacilglicéridos,siendoel95%TAGs;el restosonsustanciasquesepuedenagruparconeltérminogenéricode “insaponificable”(ceras,mucílagos,carbohidratos,esterolesytocoferoles).Los fosfolípidosmayoritarios,quesuponenun2%delaceitetotal,sonPC(48,7%),PI (27,9%),PE(21,2%)yPA(2,2%)(Chapman,1980;Salasetal.,2006).Porúltimo,el contenidodeAGslibresseestimaenun0,5%,aligualqueenotrassemillas oleaginosas(Campbell,1983),porloquelacomposicióndeácidosgrasosdelos TAGsesprácticamenteigualaladelaceite.  EnlaTabla6serepresentanlosporcentajesdelasdistintasespeciesdeTAGs mayoritariosenunaceitedegirasolestándar(RHA‐274),conaproximadamente un87%conteniendoalmenosunácidolinoleico.LosTAGsrestantesnollegana representarun20%(Fernández‐Moyaetal.,2005).Engeneral,el97%delas especiesTAGspresentesenelaceitedegirasolestándar(RHA‐274)están formadasporlassubclasesUUUySUU,siendocasiel3%restanteSUS;nohay presenciadeespeciesdelasubclaseSSSyelvalorαSatde0,27alcanzadosealeja delvalor0,5deseado(Tabla7).  Elaceitedegirasolpresentaunaseriedecaracterísticasfísico‐químicasquelo sitúaentrelosmejoresaceitesvegetales,aloquesesumalapresenciade vitaminasliposolubles,esteroles(α‐tocoferol,β‐tocoferolyγ‐tocoferol),lecitinas, yotroscomponentesquecontribuyedemaneranotableaaumentarsuvalor Introducción  62 nutritivo(Vrânceanu,1977;Gunstoneetal.,2007;Grompone,2011).No obstante,yenlíneaatodoloanteriormentedescrito,elaceitedegirasolhasido tambiénsusceptibledesermodificadoconvistasaaumentarsucalidaden funcióndesuuso(Garcésetal.,2009).  5.2OBTENCIÓNDEMUTANTESCONCOMPOSICIÓNMODIFICADADEACEITE  Enelcasodelgirasolsonvarioslosmutantesobtenidosconmodificacionesen loslípidosdesemilla.ElprimermutantedegirasolseobtuvoenRusiautilizando comoagentemutagénicoeldimetilsulfato(DMS),queoriginólaprimera variedadaltooleico(70‐75%)(Soldatov,1976).Apartirdeestalínea,llamada Pervenets,derivantodaslaslíneasaltooleicoqueexistenenlaactualidad, algunosconhastael90%deesteácidograso(Garcésetal.,1989;Pleiteetal., 2006a;Garcésetal.,2009).Laintroducciónenelmercadoycomercializacióndel aceitedegirasolaltooleicosupusoungranavanceencuantoalamejoradela calidaddelosaceitescomestiblesymuestraconquéfacilidadsepueden modificarlascaracterísticasdeestosaceites.  Posteriormente,enrespuestaalademandadegrasasqueseadecuenalos requerimientostécnicosparalaelaboracióndelosalimentos,sehaobtenidoen elInstitutodelaGrasa(CSIC)unacoleccióndelíneasdegirasolconcomposición deácidosgrasosmodificada,lallamadaCollectionAndalusianSunflower(CAS). Algunasdeestaslíneasmásimportantes,juntoasufenotipo,origen, composiciónmodificadadeAGsydistribuciónenTAGs,asícomoelcontenidode lasdistintasespeciesdeTAGs,contenidototaldeAGssaturados(Sat)ysus coeficientesdeasimetríaαSat,seresumenenlasTablas5,6y7.  Entérminosgenerales,lamodificacióndelacomposicióndeácidosgrasosen estosaceitesdegirasolvienemarcadaporlosmismoscriteriosdeselección planteadosenIntroducción,apartado4.1.Igualmente,lasconsecuenciasdela modificacióndeunouotroácidograso,asícomola/sposible/senzima/s implicada/sendichasmodificacionessonlasmismasquelascitadasen Introducción,4.4.1,segúnelcaso.Deestaslíneasdegirasolcabríandestacar Introducción  63 aquéllasconfenotipoaltoesteárico(HE),muyaltoesteárico(VHE)yaltooleico (HO),asícomolalíneaCAS‐15altooleicoaltoesteárico(HOHE)(Tabla5).  Porotrolado,losperfilesdeTAGsdeestosaceitesdegirasol(Tabla6)se asemejanaalgunosaceitestropicalesconaltocontenidoenTAGdisaturados (SUS),enloscuálesestasubclasedeTAGrepresentael34%delcontenidototal (GunstoneyHarwood,2007).Aunasí,nolleganaigualarseaaceitescomolosde cacao,convaloresdel70‐80%.  LosvaloresdeloscoeficientesdeasimetríaαSatdeestosaceites,asícomolos datosusadosparacalcularlos,TAGsdisaturados(SUS),monosaturados(SUU)y triinsaturados(UUU),yelcontenidototaldeácidosgrasossaturados(Sat)se muestranenlaTabla7.Comosepuedeobservar,nohayunarelaciónlógica entreSatylasespeciesSUSySUU;estosedebealcoeficienteαSatdecada aceite.Cuandolaasimetríaaumenta,Satsereduce,produciendovaloresbajos deαSat.Porejemplo,CAS‐19yCAS‐15tienencontenidossimilaresdeAGs saturadosperovaloresαSatmuydiferentes,0,36y0,28,respectivamente. Además,elcontenidodeSUSesmayorenCAS‐19inclusoteniendouncontenido deAGssaturadosligeramenteinferior.EstecoeficientedeasimetríaαSatseha calculadoenotrosaceitesconaltoSatyesnormalmentepequeño,sugiriendo unafuertedistribuciónasimétricadelosAGssaturadosenlasmoléculasdeTAGs (Martínez‐Forceetal.,2004).Hayqueremarcarquelaslíneasconmásácido oleicotienenlosvaloresαSatmáspequeños(CAS‐9,CAS‐33yCAS‐15), probablementeporquelaselectividadporsustratoenlabiosíntesisdeTAGses diferenteenelcasodelosácidosoleicoylinolénico.          Introducción  64 Tabla5.Composiciónmodificadadeácidosgrasosdeaceitesdelíneasdegirasolestándaresymutantes,algunasdelascuales pertenecenalaColeccióndelInstitutodelaGrasa.SD<10%. ModificadodeMartínez‐ForceyGarcés,1999;Fernández‐Moyaetal.,2005yTarrago‐Tranietal.,2006.   Fenotipo:ST:estándar|HO:altooleico|HE:altoesteárico|VHE:muyaltoesteárico|ME:medioesteárico|HOME:altooleicomedio esteárico|HOHE:altooleicoaltoesteárico. Origenlalínea:IG:InstitutodelaGrasa|M:mutagénesis|USDA:DepartamentodeAgriculturadeEEUU|_x_:cruzamiento. Ácidosgrasos:16:0:ácidopalmítico|18:0:ácidoesteárico|18:1:ácidooleico|18:2:ácidolinoleico|20:0:ácidoaraquídico|22:0:ácido behénico.  ComposiciónAG(mol%) FenotipoOrigen16:018:018:118:220:022:0Referencia   RHA‐274STUSDA7,45,837,348,30,30,9Martínez‐Forceetal.,2004 HA89STUSDA6,95,218,169,8‐ ‐ Schuppertetal.,2006 RHA‐345HORHA‐274xPervenets3,54,489,130,6‐ ‐ Schuppertetal.,2006 PervenetsHOM3,95,488,91,8‐ ‐Schuppertetal.,2006 HA‐OL9HOHA89xPervenets5,23,788,11,50,31,1Álvarez‐Ortegaetal.,1997 CAS‐3HEM7,2 26,318,645,11,41,4Osorioetal.,1995 CAS‐6 STIG5,7 7,528,856,70,40,8Fernández‐Moyaetal.,2002 CAS‐19MECAS‐3xRHA‐2747,2 21,519,948,01,81,6Pérez‐Vichetal.,2004b CAS‐20MECAS‐3xRHA‐2746,010,038,343,70,41,6Pérez‐Vichetal.,2004b CAS‐29VHECAS‐3xCAS‐47,2 34,513,041,71,81,8Fernández‐Moyaetal.,2005 CAS‐30VHECAS‐36,6 30,310,249,61,51,8Fernández‐Moyaetal.,2005 CAS‐9HOHA‐OL9xRHA‐2743,15,286,23,30,71,5Fernández‐Moyaetal.,2005 CAS‐33HOMECAS‐3xRHA‐3456,1 17,464,19,71,11,7Fernández‐Moyaetal.,2005 CAS‐15HOHECAS‐3xRHA‐3455,4 24,957,88,21,81,9Fernández‐Moyaetal.,2005   Introducción  65 Tabla6.ComposiciónenTAGsmodificadadeaceitesdelíneasdegirasolpertenecientesalaColeccióndelInstitutodelaGrasa. SD<10%. ModificadodeMartínez‐Forceetal.,2004;Fernández‐Moyaetal.,2005.  a:EstaespeciedeTAGnoseseparóyseincluyóenlaespeciedeTAGsuperior. Ácidosgrasos:P:ácidopalmítico|E:ácidoesteárico|O:ácidooleico|L:ácidolinoleico|A:ácidoaraquídico|B:ácidobehénico. TAG(mol%) TAGsRHA‐274CAS‐3CAS‐6CAS‐19CAS‐20CAS‐29CAS‐30CAS‐9CAS‐33CAS‐15    POP0,3‐‐ ‐ ‐ ‐ ‐‐0,50,5 PLP0,70,80,90,5‐0,60,5‐ ‐ ‐ POE0,52,0‐ 1,51,22,01,00,43,04,5 POO3,0‐‐0,72,8‐ ‐6,48,76,2 PLE1,26,81,14,81,46,85,8‐0,90,6 POL7,43,413,03,14,91,71,4‐0,81,4 PLL6,15,19,14,43,03,74,4‐0,4‐ EOE‐ 3,3‐ 3,11,35,62,90,54,310,4 EOO2,23,91,23,26,82,11,811,729,537,7 ELE‐ 11,0‐ 10,21,220,517,0‐ 1,4a OOO6,4‐5,1‐ 8,3‐ ‐70,932,514,3 EOL5,214,06,414,711,813,511,5a5,17,7 OOL18,92,815,63,818,6‐ ‐6,62,84,0 ELL5,225,0‐ 23,37,828,934,0‐ 3,01,2 OLL26,96,728,010,118,83,14,4‐1,10,8 LLL14,88,319,011,09,45,39,4‐ ‐ ‐ EOA‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,41,5 ELA‐ 1,2‐ 1,2‐2,01,2‐ ‐ ‐ OOA‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,91,52,8 OLA‐ 0,8‐ 0,80,70,70,8‐ ‐ 0,5 LLA‐ 1,3‐ 1,1‐1,11,4‐ ‐ ‐ EOB‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,71,4 OOB‐ ‐ ‐ ‐ 0,8‐ ‐2,52,83,7 ELB‐ 0,8‐ 0,7a1,00,6‐ ‐ ‐ OLB0,50,8‐ 0,81,20,40,5‐ ‐ 0,7 LLB0,60,9‐ 1,1‐0,81,2‐ ‐ ‐                      OBJETIVOS|73‐76                   BLOQUEI:CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARYENZIMÁTICA DELASACILTRANSFERASASIMPLICADASENLABIOSÍNTESISDE TRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL  75 BLOQUEII:ANÁLISISDETRIACILGLICÉRIDOS(TAGs)ENLÍNEAS MUTAGENIZADASDEGIRASOLALTOOLEICOALTOESTEÁRICO(HOHE) YSELECCIÓNDENUEVOSCANDIDATOS  76                                 Objetivos  75 EstaTesisDoctoralseenmarcadentrodelacaracterizacióndelaruta biosintéticadetriacilglicéridosensemillasdegirasolqueelGrupodeGenéticay BioquímicadeLípidosdeSemillas(GGBLS)delDepartamentodeBioquímicay BiologíaMoleculardeProductosVegetalesdelInstitutodelaGrasa(CSIC)está llevandoacabodesdeelaño1995.  Estetrabajosedivideendosbloquesprincipales,dosestrategias complementariasquepersiguenlaobtencióndenuevosaceitesdegirasolcon composiciónmodificadadelípidosrequeridasporlaindustria.  Elprimerbloqueconsisteenelestudiogenéticoybioquímicodedosdelastres aciltransferasasimplicadasenlarutadebiosíntesisdeTAGsensemillasen desarrollodegirasol.Losresultadosdeestosestudiosnosproporcionaránla informaciónnecesariaparaenunfuturodesarrollarnuevasestrategiasde ingenieríagenéticabasadasenlasafinidadesporsustratodeestasenzimasque permitanmodificarladistribucióndeácidosgrasosenTAGsyasíobtenernuevos aceitesdegirasol.Esteprimerbloqueseresumeenlossiguientesobjetivos específicos:  1. Clonaciónycaracterizacióndelosgenesquecodificanparalas actividadeslisofosfatidatoaciltransferasa(LPAAT)ensemillasen desarrollodegirasol.  2. Clonaciónycaracterizacióndelosgenesquecodificanparalas actividadesdiacilglicerolaciltransferasa(DAGAT)ensemillasen desarrollodegirasol.         Objetivos  76 Elsegundobloqueseenmarcadentrodelestudiodemutantesconcomposición modificadadeácidosgrasosobtenidosmediantetécnicasdemutagénesise hibridaciónconvencionales.Medianteunaseriedecriteriosdeselección,este estudionospermitiráobtenerlíneasdegirasolconunacomposiciónmejorada deTAGs.Estesegundobloqueseresumeenelsiguienteobjetivoespecífico:  3. Obtenciónyseleccióndenuevosmutantesapartirdeunapoblación segregantealtooleicoaltoesteárico(HOHE)quecontenganuna mayorproporcióndeTAGsdeltipoSUS,yaseadebidoaun incrementoenelcontenidodeácidoesteáricoounamejor distribucióndelosAGssaturadosenlosTAGsy,enconsecuencia, valoresαSatpróximosal0.5óptimo.       MATERIALESYMÉTODOS|77‐154         1.MATERIALES 79 1.1APARATOSYMATERIALES 79 1.2REACTIVOSYQUÍMICOS80 1.3ENZIMASYKITS81 1.4MATERIALBIOLÓGICOYCONDICIONESDECULTIVO81 1.5MEDIOSDECULTIVOYSOLUCIONESNUTRITIVAS91 1.6ANTIBIÓTICOS93 1.7TAMPONESYSOLUCIONES95 1.8OLIGONUCLEÓTIDOS98 1.9PLÁSMIDOSYVECTORESDEEXPRESIÓN99  2.MÉTODOS102 2.1BIOLOGÍAMOLECULAR102 2.2 BIOQUÍMICA133 2.3BIOINFORMÁTICA142 2.4BIOESTADÍSTICA144 2.5DISEÑOEXPERIMENTALYCRITERIOSDESELECCIÓNLÍNEAHOHE150                          MaterialesyMétodos  79 1.MATERIALES 1.1 APARATOSYMATERIALES  AparatoModeloCompañía    AgitadormagnéticoconcalefacciónAG‐2Raypa,España AgitadortipovórtexMS2 IKA ® ,Alemania AutoclavesPresoclave75LJPSelecta ® ,España 2540MLTuttnauer,Holanda BalanzaanalíticaTE313SSartorius,Alemania BalanzaanalíticadeprecisiónAL54MettlerToledo,España BañostermostáticosBiocold JPSelecta ® ,España SWB Stuart Scientific ® ,ReinoUnido SW22 Julabo,Alemania Unitronic320ORJPSelecta ® ,España BañosonicadorultrasonidoUltrasonsJPSelecta ® ,España CabinaflujolaminarverticalFASTERTWO30Cultek,España Cámaracultivo APT.lineTMKBWBinder,Alemania CentrífugaSorvallRC5CThermoScientific,EEUU ConcentradordemuestrasDB‐3DTechne,ReinoUnido ContadorlíquidodecentelleoLS‐6500BeckmanCoulterTM,EEUU Cromatógrafosdegases(GC)Clarus500PerkinElmer,EEUU 6890Agilent,EEUU DesionizadorS8000PStation,EEUU EspectrofotómetroUltrospec3300proAmersham‐Biosciences,EEUU IncubadoresorbitalesEcotronInforsHT,Suiza SI50Stuart Scientific ® ,ReinoUnido LupabinocularestéreoST‐30‐2LFOptika,Italia Microcentrífugas5415REppendorf,Alemania 5810REppendorf,Alemania HeraeusPicoThermoScientific,EEUU Spectrafuge24DLabnet,EEUU MicroscopioópticoSZM‐2Optika,Italia Mini‐BeadBeater8Biospec,EEUU NanoDrop2000ThermoScientific,EEUU pH‐metroInolab720WTW,Alemania RotavaporVWRIKA ® ,Alemania RotoresA‐4‐62Eppendorf,Alemania SorvallGSAThermoScientific,EEUU SorvallSS‐34ThermoScientific,EEUU 70iTiBeckmanCoulterTM,EEUU SistemasdeelectroforesishorizontalPower‐PacBasicBio‐Rad,EEUU Power‐Pac300Bio‐Rad,EEUU Sub‐Cell ® GTBio‐Rad,EEUU TermobloqueDigitalHeatblockVWRTM,EEUU TermocicladoresMJMiniTMGradientBio‐Rad,EEUU MiniOpticonTMRT‐PCRBio‐Rad,EEUU TGradientBiometra ® ,Alemania TransiluminadorChemiGenius2Syngene,ReinoUnido TFX‐20MVilberLourmat,Alemania UltracentrífugaL8‐70MBeckmanCoulterTM,EEUU    Tabla8.Aparatosusadosenestetrabajo. MaterialesyMétodos  80  1.2 REACTIVOSYQUÍMICOS   Reactivo/QuímicoCompañía  BromurodeetidioSigma‐Aldrich,EEUU ComponentesmedioscultivoyagarosaPronadisa,España Compuestosradiactivos GEHealthcare,EEUU Disolventesorgánicos,ácidosybases Panreac,España Ficoll400,PEG4000 Fluka,EEUU FungicidasistémicoPrevicur®NBayer,Alemania GasesyN2líquidoCarburosMetálicosyAirLiquide,España IPTG,X‐Gal,tampóndecarga,RNasaA,marcadores detamañoypesomolecularparaDNAydNTPs Fermentas,EEUU LíquidodecentelleoEcoscintTMHNationalDiagnostics,EEUU MedioMurashige‐Skoog(MS) Duchefa,Holanda PMSFycóctelinhibidordeproteasasdelevaduras Sigma‐Aldrich,EEUU ReactivodeBradford Bio‐Rad,EEUU SalesinorgánicasyDPM MerckMillipore,Alemania SilwetL‐77Momentive,EEUU SYBR®GreenQiagen,Alemania Tamponesorgánicos,salesorgánicas,metabolitos, enzimas,detergentes,compuestosorgánicos, aminoácidosyantibióticos Sigma‐Aldrich,EEUU YNBsinaminoácidosBDDifco™,EEUU  MaterialModelo Compañía  CámarasdeplacasTLC CAMAG,Alemania Cintaporosa3M Micropore,EEUU Cubetaselectroforesis Bio‐Rad,EEUU Glassbeads0.5mm Sigma‐Aldrich,EEUU Filtrosdejeringa(acetatodecelulosa)Minisart®16534‐KSartorius,Alemania MaterialdevidrioPyrex,ReinoUnido Microcubetasdensidadóptica HellmaAnalytics,Alemania PipetasP10,20,200,1000,5000 Eppendorf,Alemania PipetasPasteur 150mm VWRTM,EEUU PlacasdegeldesíliceTLC20x20cm MerckMillipore,Alemania Placasdepolipropileno Stratagene®,Alemania PlacasdePetri Tubosdemetilaryvialesdecentelleo  Tabla10.Reactivosyquímicosusadosenestetrabajo. Tabla9.Materialesusadosenestetrabajo. MaterialesyMétodos  81 Tabla11.EstirpesdeE.coli usadasenestetrabajo. Parabiologíamolecular,asícomoparalapreparacióndemediosdecultivo,se utilizóaguadegradoMilli‐Q,purificadamedianteunsistemadecartuchosde purificacióndeaguaMillipore.Elaguaempleadaenlosexperimentosde bioquímicaestabapurificadamedianteósmosisinversayposteriormente desionizadamedianteundesionizadormodeloS8000P(Station,EEUU).  1.3 ENZIMASYKITS  Lasdistintasenzimasykitsutilizadosenestetrabajo,denoespecificarselo contrario,fueronadquiridasalassiguientescompañías: Ambion(EEUU),Amersham‐Biosciences(EEUU),Amersham‐Pharmacia(EEUU), Bio‐Rad(EEUU),BoehringerIngelheim(Alemania),Clontech(Japón),Ecogen (España),Invitrogen(EEUU),Macherey‐Nagel(Alemania),Mbiotech(EEUU),New EnglandBiolabs(ReinoUnido),Qiagen(Alemania).Stratagene®(Alemania).  1.4 MATERIALBIOLÓGICOYCONDICIONESDECULTIVO  1.4.1 Escherichiacoli  DuranteeldesarrollodeestetrabajosehanutilizadodiferentesestirpesdeE. coli,empleadasenlosprocesosdeclonación(MaterialesyMétodos,2.1.8.1) (Tabla11).  EstirpeGenotipoaCompañía Referencia    XL1‐Blue Δ(mcrA)183Δ(mcrCB‐hsdSMR‐mrr)173 endA1supE44thi‐1recA1gyrA96relA1 lac[F´proAB,lacIqZΔM15,Tn10(tetr)] Invitrogen,EEUU Bullocketal.,1987 DH5‐α F ‐,deoRrecA1endA1hsdR17(r k ‐mk+) supE44lamda‐thi‐1gyrA96relA1 Invitrogen,EEUU Hanahan,1983  aLadescripcióndecadagenotiposeencuentraenlatablaI,secciónabreviaturas. MaterialesyMétodos  88 Tabla15.LíneasdeA.thaliana usadasenestetrabajo. 1.4.5 Arabidopsisthaliana  DuranteeldesarrollodeestetrabajoseusótantoelecotiposilvestreColumbia‐0 (Col‐0)comolíneasknockout(KO)dedeterminadosgenesdeinterés(Tabla15).   LíneaNASC Gen CódigoAt Referencia   Col‐0N22681  N504681 AtLPAT2At3g57650 N546680 AtLPAT3At1g51260 tag1‐1(AS11)N3861 AtDGAT1At2g19450 Katavicetal.,1995;Zouetal.,1999   LaslíneasKON504681yN546680fuerondonadasporelDr.JosephR.Ecker(The SalkInstituteforBiologicalStudies,California),obtenidamedianteinsercióndeT‐ DNAutilizandoparaelloelvectordetransformaciónpROK2(Baulcombeetal., 1986).LalíneaKON3861(AS11),porsuparte,fuedonadaporelDr.LjerkaKunst (UniversityofBritishColumbia,UBC),obtenidamedianteduplicacióngénica utilizandoetilmetanosulfonato(EMS)comoagentemutagénico.  DelastreslíneasKO,tansóloN3861(AS11)estádescrita.Encomparaciónconla líneasilvestreCol‐0,éstasecaracterizaporteneralteradalacomposiciónde ácidosgrasos:mayoresnivelesdeácidoα‐linolénicofrenteaunmenorcontenido deácidoeicosenoico(20:1Δ11c)yácidooleico.Además,presentamenor actividadDGAT,porloqueelcontenidoenTAGsyaceiteensemillaseve reducidoy,enconsecuencia,poseemenortasadegerminación(Katavicetal., 1995;Zouetal.,1999).  TodaslaslíneasKOfuerondistribuidasatravésdelEuropeanArabidopsisStock Center(NASC)(Scholletal.,2000)comolíneassegregantesenfondogenético Col‐0.   MaterialesyMétodos  89 1.4.5.1 Condicionesdecultivo  Lassemillas,previagerminación,sesometieronauntratamientodeesterilización consistenteenunaprimerasolucióndelejíaal10%(v/v),seguidodeunasolución deetanolal70%(v/v)yunaseriedelavadossucesivosconabundanteagua.A continuación,lassemillaspudieronseguirdosmétodosdesiembra:  1. Cultivoentierra.‐Lassemillassesembrarondirectamenteensemilleros contierrahúmedapreviamentedesinfectadaconfungicidasistémico Previcur®N(Bayer,Alemania)paraevitarplagas,dispuestosenbandejas.  2. Cultivoinvitro.‐Lassemillasseresuspendieronenunasoluciónde agarosa0,8%(p/v)previamentecalentadaysesembraronsobreplacasde Petride9cmØselladasconcintaporosa(Micropore,3M,EEUU)en mediosólidoMS(MaterialesyMétodos,1.5.4).  Indistintamentedelmediodecultivousado,lassemillassesometieronaun procesodeestratificacióndurante3díasa4°Cencondicionesdeoscuridady humedad,permitiendoasíunaóptimasincronizaciónenlagerminación. Finalmente,lagerminacióndelassemillasyelcrecimientodelasplantas tuvieronlugarencámarasdecultivoAPT.lineTMKBW(Binder,Alemania),bajo condicionesdetemperaturayfotoperiodocontroladas.  Engeneral,latemperaturadecrecimientofuede20‐22°C(luz/oscuridad)yla intensidaddeluzde200μmolm‐2s‐1,confotoperiododeciclolargode16h/8h (luz/oscuridad)yhumedadde40‐50%.Lasplántulascrecidasapartirdecultivos invitrosetrasplantaronasemilleroscontierrahúmedadispuestosenbandejas dondecontinuósucrecimiento.Elriegoserealizódeformamanualdosvecespor semanamedianteinundacióndelabandeja,suplementadoconsoluciónnutritiva (MaterialesyMétodos,1.5.4);éstesedetuvounasemanaantesdelarecolección desemillasparapotenciarsudesecación.Elciclobiológicodelaplantaesde2‐3 meses.  MaterialesyMétodos  90 Enfuncióndelusoparaelquefuesensembradas,lasplantasysemillassufrieron modificacionespuntualesenlascondicionesdecultivo:  1. Lasplantasdestinadasacompletarsuciclobiológicoyproducirsemillas fueroncrecidasdirectamenteencultivosdetierrahúmeda. Excepcionalmente,lassemillasdelalíneaKON3861(AS11)fueron germinadasinvitrodebidoasunulagerminaciónentierra.Las condicionesdecrecimientofueronlasdescritasanteriormente.  2. LasplantasdestinadasasertransformadasconAgrobacteriummediante infiltración(MaterialesyMétodos,2.1.8.4.2)fuerontrasplantadasa macetascontierrahúmedaengruposdecincoporconstrucción,por triplicado,dispuestasenbandejas.Elcrecimientoserealizóigualmentea 20‐22°C(luz/oscuridad),peroestavezsesometieronprimeroa fotoperiododeciclocortode8h/16h(luz/oscuridad)parapotenciarel crecimientovegetativo,ydespuésafotoperiododeciclolargode16h/8h (luz/oscuridad),parainducirlafasereproductiva.Lasplantas,unavez transformadas,semantuvieronundíaenoscuridadyhumedad,para posteriormentevolverasertransformadasytraspasadasnuevamenteala cámaradecultivo,procurandoelaislamientodeunasconotraspara evitarcruzamientosnodeseadosyfavoreciendolaalternanciaposicional deéstas.  3. Lassemillasprocedentesdeplantastransformadasfuerongerminadasin vitroenplacasdePetride14cmØenmediosólidoMSsuplementadocon higromicina(15g/ml)parasuposterioridentificación.Elmétodo empleadoparatalfin,basadoencambiosenelfotoperiodo,asícomoel criteriodeselección,seespecificaenMaterialesyMétodos,2.1.8.4.3.        MaterialesyMétodos  91 1.4.5.2Recogidadematerialbiológico  Lasmuestrasrecogidasvariaronenfuncióndelametodologíaseguida:  1. SeleccióndelíneasKOhomocigotas.‐Setomaronhojasbasalesdelíneas KOenlosestadíosinicialesdecrecimiento,tras15díasdespuésde siembra(DDS).TodasellassecongelarondirectamenteenN2líquidoyse almacenarona‐80°Chastasuposterioruso(MaterialesyMétodos, 2.1.1.3.4).  2. Análisisdegenotipoenhojas.‐ Setomaronigualmentehojasbasalesde líneastransgénicasT3enlosestadíosinicialesdecrecimiento,tras15días despuésdesiembra(DDS).Seprocediódeigualmodoqueenelpunto anterior(MaterialesyMétodos,2.1.1.3.4).  3. Análisisfenotípicodesemillas.‐Serecogieronsemillasmaduras,tantode líneassilvestrecomodelíneasKO(S0),ysemillasT3delíneastransgénicas. Lassemillasseguardaronenunlugaroscuroysecoatemperatura ambientehastasuvisualizaciónenlupa(MaterialesyMétodos,2.1.9.2.1).  4. Análisislipídicodesemillas.‐ Serecogieronsemillas,tantodelíneas silvestrecomodelíneasKO(S0)ydelíneastransgénicas(T3).Lassemillas seguardaronenunlugaroscuroysecoatemperaturaambientehastasu posterioranálisis(MaterialesyMétodos,2.2.1.1.2).  1.5 MEDIOSDECULTIVOYSOLUCIONESNUTRITIVAS  Paraelcrecimientodelosdistintosorganismosobjetosdeestudioseemplearon lossiguientesmediosysoluciones:  1.5.1E.coli   MedioLuria‐Bertani(LB)(Sambrooketal.,1989):Bactotriptonaal1%(p/v), extractodelevaduraal0,5%(p/v)yNaClal1%(p/v). MaterialesyMétodos  92 1.5.2A.tumefaciens   MedioLuria‐Bertani(LB)(Sambrooketal.,1989):Bactotriptonaal1%(p/v), extractodelevaduraal0,5%(p/v)yNaClal1%(p/v).  1.5.3S.cerevisiae   MedioricoYPD:Extractodelevaduraal1%(p/v),peptonabacteriológicaal 2%(p/v),glucosaal2%(p/v).   MediomínimoSC:YeastNitrogenBase(YNB)sinaminoácidosal0,67%(p/v), fuentedecarbono*al2%(p/v)yunamezclaenpolvodeaminoácidosy nucleósidosal0,13%(p/v)conteniendo:0,04g/Ladeninasulfato,0,02g/LL‐ arginina,0,1g/LácidoL‐aspártico,0,1g/LácidoL‐glutámico,0,02g/LL‐ histidina,0,06g/LL‐leucina,0,03g/LL‐lisina,0,02g/LL‐metionina,0,05g/LL‐ fenilalanina,0,375g/LL‐serina,0,2g/LL‐treonina,0,04g/LL‐triptófano,0,03 g/LL‐tirosina,0,15g/LL‐valinay0,15g/Luracilo;pH5,6ajustadoconNaOH.   MediomínimoSC‐URA:MediomínimoSCsinuraciloparalaselecciónde auxotrofías.  *Lasfuentesdecarbonoempleadasfueron:2%(p/v)glucosa,2%(p/v)rafinosao 2%(p/v)galactosa,segúnlafinalidaddelcultivo.Éstasseesterilizaronporfiltración atravésdeunamembranadefiltrodejeringadeacetatodecelulosade0,2µmde poroy25mmdediámetroMinisart®16534‐K(Sartorius,Alemania).  1.5.4A.thaliana   MedioMurashige‐Skoog(MS):SalesMS(Sigma‐Aldrich,EEUU)al0,44%(p/v), sacarosaal1‐3%(p/v)yMESal0,05%(p/v);pH5,7ajustadoconKOH.   Soluciónnutritiva:0,005MKNO3,0,0025MKH2PO4,0,004MMgSO4×7H2Oy 0,002MCa(NO3)2×4H2O.  MaterialesyMétodos  93 Entodosloscasos,losmediosysolucionessehicieronconaguadealtacalidadMilli‐Q (Millipore,ReinoUnido)yseesterilizaronenautoclavea120°Cy1atmdepresión durante20min.Engeneral,paralapreparacióndelosmediossólidosseañadióagaral 1,5%(p/v)previaesterilizaciónyserealizaronenplacasdePetri.Enlapreparaciónde mediosólidoparasemillasdeA.thalianaseusóencambiofitoagaral0,8%(p/v).  Lassustanciastermolábilescomolosantibióticosseadicionaronenlasconcentraciones indicadas(MaterialesyMétodos,1.6)almediodecultivoyaestérilyenfriadopordebajo delos50°C,aligualquelasfuentesdecarbono(MaterialesyMétodos,1.5.3).  ParalaseleccióndecoloniasdeE.colitransformadasconplásmidosquecontienen insertoyposeenelgenlacZ(MaterialesyMétodos,2.1.8.1.3)seañadieronisopropil‐ß‐ D‐tiogalactopiranósido(IPTG)0,5mMesterilizadoporfiltraciónatravésdeuna membranadefiltrodejeringadeacetatodecelulosade0,2µmdeporoy25mmde diámetroMinisart®16534‐K(Sartorius,Alemania)y5‐bromo‐4‐cloro‐3‐indolil‐β‐D‐ galactopiranósido(X‐Gal)80µg/mLalmediodecultivosólidoLByaestérilyenfriadopor debajodelos50°C.  Losmediossólidosseconservarona4°Cylosmedioslíquidosatemperaturaambiente.  1.6 ANTIBIÓTICOS  Paralaseleccióndelaspropiasestirpesylosdistintostransformantes,enfunción delorganismoobjetodeestudio,seutilizaronlossiguientesantibióticos:  1.6.1E.coli   Ampicilina:Antibióticobactericidaqueinhibelasíntesisdelaparedcelular, actuandosobrelasenzimasresponsablesdedichasíntesis.Elgende resistenciaamppresenteenlosplásmidospGEM®‐TEasy,pMBL‐TypYES2 (MaterialesyMétodos,1.9)codificaparaunaenzimaperiplásmicaque rompeelanilloβ‐lactámicodelantibiótico.Laampicilina(salsódica)se preparóa100mg/mLenagua,diluyéndoseyadicionándoseposteriormente aunaconcentraciónfinalde100g/ml.  MaterialesyMétodos  94  Kanamicina:Antibióticobactericidaqueseunealasubunidad70Sdelos ribosomasycausalalecturaerróneadelRNA.Elgenderesistenciakan presenteenelplásmidopCAMBIA‐1300EC(MaterialesyMétodos,1.9) codificaparaunaenzimafosfotransferasaaminoglicidaquemodificael antibióticoyprevienesuinteracciónconelribosoma.Lakanamicinase preparóa50mg/mLenagua,diluyéndoseyadicionándoseposteriormentea unaconcentraciónfinalde50g/ml.  1.6.2A.tumefaciens   Rifampicina:AntibióticobactericidaqueseunealasubunidadßdelaRNA polimerasa,inhibiendoasílasíntesisdeRNA.Laresistenciarifpresenteenla propiaestirpeGV3101(MaterialesyMétodos,1.4.2)comomarcador cromosomalevitalainteracciónantibiótico‐enzimamedianteunaseriede mutacionesdevariosaminoácidospresentesendichasubunidad.La rifampicinasepreparóa25mg/mLenmetanol,diluyéndoseyadicionándose posteriormenteaunaconcentraciónfinalde100g/ml.   Gentamicina:Antibióticobactericidaqueseunealasubunidad30Sdelos ribosomas,interfiriendoenlaelongacióndelacadenapeptídica.Elgende resistenciagempresenteenelplásmidopMP90(MaterialesyMétodos,1.9) codificaparaunaenzimaadenililtransferasaaminoglicidaqueevitala interacciónantibiótico‐ribosonamediantelamodificacióndeunaminoácido presenteendichasubunidad.Lagentamicinasepreparóa50mg/mLen agua,diluyéndoseyadicionándoseposteriormenteaunaconcentraciónfinal de50g/ml.   Kanamicina:Antibióticobactericidaqueseunealasubunidad70Sdelos ribosomasycausalalecturaerróneadelRNA.Elgenderesistenciakan presenteenelplásmidopCAMBIA‐1300EC(MaterialesyMétodos,1.9) codificaparaunaenzimafosfotransferasaaminoglicidaquemodificael antibióticoyprevienesuinteracciónconelribosoma.Lakanamicinase preparóa50mg/mLenagua,diluyéndoseyadicionándoseposteriormentea unaconcentraciónfinalde50g/ml. MaterialesyMétodos  95 1.6.3A.thaliana   HigromicinaB:Antibióticoquematatantoabacteriascomohongosycélulas eucariotassuperioresalinhibirlasíntesisproteica.Elgenderesistenciahyg presenteenelplásmidopCAMBIA‐1300EC(MaterialesyMétodos,1.9) codificaparaunaquinasaqueinactivaalantibióticoatravésdela fosforilacióndelmismo.Lahigromicinasepreparóa15mg/mLenagua, diluyéndoseyadicionándoseposteriormenteaunaconcentraciónfinalde15 g/ml.   Todoslosantibióticospreparadosenaguafueronposteriormenteesterilizadospor filtraciónatravésdeunamembranadefiltrodejeringadeacetatodecelulosade0,2µm deporoy25mmdediámetroMinisart®16534‐K(Sartorius,Alemania)ysealmacenaron a‐20°Chastasuposterioruso.Aquellosantibióticosquefueronpreparadosenmetanol noprecisaronesterilizaciónalguna.  1.7 TAMPONESYSOLUCIONES  1.7.1BiologíaMolecular  1.7.1.1Ácidosnucleicos   TAE:40mMTris‐acetatoy1mMEDTApH8,0.   TE:10mMTris–HCl,1mMEDTA,pH8,0.   Soluciónparalosgelesdeagarosa:0,8‐2%agarosa(p/v),suplementandocon TAE.   Solucióndeextracción2xCTAB:0,1MTrispH8,0,2%CTAB(bromurode hexadeciltrimetilamonio‐C19H42NBr)(Sigma‐Aldrich,EEUU),1,4MNaCly20 mMEDTApH8,0.Añadirenelmomentodeusar50µg/mLdeRNAasa.  MaterialesyMétodos  96  Tampóndeextracción:0,2MTris‐HClpH7,5,0,25MNaCl,25mMEDTApH 8,0ySDS0,5%(p/v).  1.7.1.2Preparacióndecélulascompetentes   MedioψBroth:bactotriptona2%(p/v),extractodelevadura0,5%(p/v), MgSO40,4%(p/v),10mMKCl.   SoluciónTjBI:100mMRbCl,50mMMnCl2∙4H2O,30mMacetatopotásico,10 mMCaCl2,glicerol15%(p/v);pH5,8ajustadoconacético0,2Myesterilizado porfiltración.   SoluciónTjBII:10mMMOPS,10mMRbCl,75mMCaCl2,glicerol15%(p/v); pH7ajustadoconNaOHyesterilizadoporfiltración.   SoluciónCaCl2:20mMdeCaCl2.  1.7.1.3Transformacióndecélulas   SolucióndeCaCl2:10mMPipespH7,0,60mMCaCl2yglicerol15%(p/v).   Tampón“Plate”:PEG400040%(p/v),0,1Macetatodelitio,10mMTris‐HCl pH7.5y1mMEDTA.  1.7.1.4Transformacióndeplantas   Solucióndetransformación:sacarosa5%(p/v)ySilwetL‐770,05%(p/v) (Momentive,EEUU).  1.7.1.5Microsomasdelevaduras   Tampóndeextracción:0,2MHEPES‐NaOH,pH7,4,0,5Msacarosa.Añadir1 mMPMSF(Sigma‐Aldrich,EEUU)justoantesdeusar.  MaterialesyMétodos  97  Tampónderesuspensión:10mMHEPES‐NaOH,pH7,4.   TampónSCEM:1Msorbitol,citratosódico2,94%(p/v),10mMEGTA;pH6,5‐ 7,0.   Tampónderotura“breakagebuffer”:10mMMESpH6,9ajustadoconTris‐ HCl,Ficoll40012%(p/p)y0,2mMEDTA.Añadir1mMPMSFycóctel inhibidordeproteasasdelevaduras0,6%(v/v)(Sigma‐Aldrich,EEUU)justo antesdeusar.   TampónTEGM:50mMTrispH7,5,1mMEGTA,1mMβ‐mercaptoetanol,1 mMPMSF.   TampónTEGM/33:TEGMenglicerol33%(p/v).  1.7.1.6Stockdecélulas   Solucióndeglicerol:25mMTris‐HCl,pH7,5,glicerol70%(p/v).   Todaslassolucionesutilizadasparabiologíamolecularfueronesterilizadasmedianteun procesodeautoclavea120°Cy1atmdepresióndurante20min.Lassolucionesqueno podíanresistiresascondicionesfueronesterilizadasporfiltraciónatravésdeuna membranadefiltrodejeringadeacetatodecelulosade0,2µmdeporoy25mmde diámetroMinisart®16534‐K(Sartorius,Alemania).Elmaterialdevidrioyotrosequipos eranesterilizadosa200°Cdurante1h.  1.7.2Bioquímica  1.7.2.1Extraccióndelípidosymetilacióndeácidosgrasos   Mezclademetilaciónyextracción:metanol/tolueno/dimetoxipropano/H2SO4 (39:20:5:2,v/v/v/v).   Mezclademetilar:metanol/tolueno/H2SO4(88:10:2,v/v/v).  MaterialesyMétodos  104 2.1.1.3.2AislamientodemRNA  PartiendodelamuestradeRNAtotaldelapartadoanterior,serealizóelpasode purificacióndelRNAmensajeroutilizandoelkitcomercialGenElutemRNA Miniprepkit(Sigma‐Aldrich,EEUU),siguiendolasinstruccionesdelfabricante.El precipitadodeRNAmensajerofueresuspendidoen33µLdesoluciónTElibrede RNAasa(MaterialesyMétodos,1.7.1.1).  2.1.1.3.3SíntesisdelaprimeracadenadecDNA  LasíntesisdecDNAapartirdelmRNAextraídoserealizóigualmenteutilizandoel kitReady‐To‐GoTMT‐PrimedFirst‐StrandKit(Amersham‐Biosciences,EEUU), siguiendolasinstruccionesdelfabricante.Despuésdelaprimerasíntesisde cDNA,lareacciónestuvolistaparalaclonacióngénicamediantereaccionesde PCRestándar(MaterialesyMétodos,2.1.3.1.a)yelanálisisdeexpresióngénica mediantePCRcuantitativa(MaterialesyMétodos,2.1.3.4)oPCRcualitativa (MaterialesyMétodos,2.1.9.2.2).  2.1.1.3.4ExtraccióndegDNA  DependiendodelacantidaddeDNAgenómicoquesepretendióaislar,se siguierontresprotocolosdiferentes:  a) Aislamientoconkitcomercial.‐ Serecogieron0,1gdehojasfrescasdela plantaestudio.RápidamentesecongelaronconN2líquidoysemachacaron conmorteroymazaestérilhastalaobtencióndeunpolvofino.ElgDNAfue posteriormenteextraídodelmaterialusandoelkitcomercialGenElutePlant GenomicDNAMiniprepkit(Sigma‐Aldrich,EEUU),siguiendolasinstrucciones delfabricante.Unavezextraído,elgDNAfueresuspendidoen100µLdeTEy almacenadoa‐20°Chastasuposterioruso.Lacantidadobtenidaconeste métodofue,comomáximo,de20µgporpreparación.   MaterialesyMétodos  105 b) AislamientoconprotocoloCTAB.‐Sesiguióelmétododescritoenelartículo deMurrayyThompson(1980).Setomaron2,5gdehojasfrescasdelaplanta aestudio.RápidamentesecongelaronconN2líquidoysemachacaroncon morteroymazaestérilhastalaobtencióndeunpolvofino.Altejidose añadieron5mLdelasolución2xCTABconRNAasa(MaterialesyMétodos, 1.7.1.1),mezclandoporinversión.Lamezclaseincubóa65°Cdurante20min, añadiendoposteriormente5mLdeCHCl3(MerckMillipore,Alemania)y mezclandovigorosamenteporinversión.Tras2mindecentrifugacióna 15.000gseañadieron5mLdeisopropanolpuro,mezclandoinmediatamente eincubando1‐2minatemperaturaambiente.Trasunanuevacentrifugación de5mina15.000gseaprecióunprecipitadoligeramenteamarilloporel precipitadodelgDNA.Acontinuación,selavóelprecipitadoconetanol70% (v/v),seprecipitótras5mina15.000gysedejósecarencampanatras retirarelsobrenadante.Unavezseco,seresuspendióen875µLdeaguayse almacenóa‐20°Chastasuposterioruso.Lacantidadobtenidaconeste métodofue,comomáximo,de2mgporpreparación.  c)AislamientoconprotocolomodificadoCTAB.‐Sesiguióunmétodomodificado delanteriorquenorequeríaelusodefenolnicloroformoy,enconsecuencia, másrápido.Setomaronhojasfrescasindividualesdelaplantaaestudio. RápidamentesecongelaronconN2líquidoentubosEppendorfyse machacaronconpuntaestérilde1mLhastalaobtencióndeunamasa compacta.Estamasasemaceróatemperaturaambientedurante15sya continuaciónseañadieron400µLdetampóndeextracción(Materialesy Métodos,1.7.1.1),mezclandovigorosamentedurante5s.Tras1minde centrifugacióna13000rpm,setransfirieron300µLdelsobrenadanteaun nuevotuboyseañadieron300µLdeisopropanolpuro,mezclando inmediatamenteeincubando2minatemperaturaambiente.Trasunanueva centrifugaciónde5mina13000rpmseobtuvoelprecipitadodegDNA,el cuálfuesecadoyresuspendidoen100µLdetampónTE(Materialesy Métodos,1.7.1.1)ysealmacenóa‐20°Chastasuposterioruso.Lacantidad obtenidaconestemétodofuesuficientepararealizaranálisisporPCR screening(MaterialesyMétodos,2.1.3.1c).  MaterialesyMétodos  106 2.1.2Cuantificacióndeácidosnucleicos  Laconcentraciónypurezadelosácidosnucleicossedeterminóindistintamente midiendolaabsorbanciaa260y280nmenunespectrofotómetroUltrospec 3300pro(Amersham‐Biosciences,EEUU)oenunNanodrop2000(Thermo Scientific,EEUU).Larelaciónentrelaabsorbanciamedidaa260nmya280nm (260/280)indicalapurezadelosácidosnucleicos,mientrasquelaabsorbancia medidaa260nmpermiteestimarlaconcentracióndeácidosnucleicospresentes enlapreparación.  Así,unarelación260/280próximaa1,8indicaqueelDNAespuro, correspondiéndoseunaunidaddeabsorbanciaa260nmaunaconcentraciónde 50µg/mLdeDNAdedoblecadena.ParaelcasodelRNA,larelación260/280 debeaproximarsea2,correspondiéndoseunaunidaddeabsorbanciaa260nma unaconcentraciónde40µg/mLdeRNA(Sambrooketal.,1989).  2.1.3Reacciónencadenadelapolimerasa(PCR)  2.1.3.1AmplificacióndeDNAmediantePCR  TodaslasamplificacionessellevaronacaboenuntermocicladorTGradient (Biometra®,Alemania)oenunMJMiniTMGradient(Bio‐Rad,EEUU).Dependiendo delafinalidadyelmoldeaamplificar,sellevaronacabocuatrotiposde reacciones:  a)Reacciónestándar.‐Lasreaccionessedesarrollaronenunvolumenfinalde50 μLconteniendo:tampóncomercialdelapolimerasa(10x),2mMdeMgCl2, 0,25mMdeunamezclaqueconteníatodoslosdesoxinucleótidostrifosfato (dNTPs),0,5μMdecadaoligonucleótido,0,1‐1μgdeDNAmoldey0,05Ude EcoTaqDNApolimerasa(Ecogen,España).Deformarutinaria,lamezclade reacciónsesometióaunaactivacióndelaenzimayprimera desnaturalizacióna94°Cdurante3min.Posteriormente,seefectuaron30 ciclosqueconsistíanenunaprimeraetapadedesnaturalizacióna94°C durante30s,unafasedealineamientodeoligonucleótidosde30saun MaterialesyMétodos  107 temperatura2°pordebajodelaTmmenordelpardeoligonucleótidos,yuna etapadeextensióna72°Cconunaduraciónquevariabaenfuncióndela longituddelfragmentoaamplificar,siendolarelaciónde1min/kb. Finalmente,traslos30ciclos,lamezclasesometióa72°Cdurante10minen losqueseprodujounaextensiónfinaldelosfragmentosobtenidos.La temperaturadealineamientosemodificóhastaencontrarelpuntoóptimo paracadareacción.  b)Reaccióndealtafidelidad.‐EnestetipodereacciónseempleólaiProofDNA polimerasa(Bio‐Rad,EEUU),enzimaconactividadcorrectora(3´‐ 5´exonucleasa)capazdeaumentarenseisveceslafidelidadenlasíntesisde DNAencomparaciónconlaTaqpolimerasa.Alnoposeeractividad transferasaterminal,losfragmentossintetizadosconlaiProofposeen extremosromos.Enestecaso,lasreaccionessellevaronacaboenun volumenfinalde50μLquecontenía:1XiProofHFbuffer,0,25mMdela mezcladedNTPs,0,5μMdecadaoligonucleótido,0,1‐1μgdeDNAmoldey 0,02UdeiProofDNApolimerasa(Bio‐Rad,EEUU).Lamezclasesometióauna activacióndelaenzimayprimeradesnaturalizacióna98°Cdurante30s. Posteriormente,seefectuaronde25‐30ciclosenlosquelamezclasesometía aunaprimeraetapadedesnaturalizacióna98°Cdurante10s,seguidadeuna etapadealineamientodesecuenciasenlaquelatemperaturaensayadafue nuevamentelaTmmásbajadelosdosoligonucleótidosmenos2°Cdurante 10‐30s,yunaterceraetapadeextensióna72°Cconunduraciónquevariaba enfuncióndelalongituddelfragmentoaamplificar,siendoestavezla relaciónde15‐30s/kb.Finalmente,lamezclasesometióa72°Cdurante5‐10 minutosenlosqueseprodujounaextensiónfinaldelascadenas.La temperaturadealineamientosemodificóhastaencontrarelpuntoóptimo paracadareacción.  c)PCRdiagnósticaoscreening.‐ Medianteestatécnicaseobtienela amplificacióndirectadesecuenciasgénicasapartirdecoloniasdebacteriaso levadurassinnecesidaddelaislamientopreviodelDNAusadocomomoldede lareacción.Suusoenestetrabajotuvocomofinlaidentificacióndeclones portadoresdelassecuenciasdeinterés,ensucorrectaorientación,porlo MaterialesyMétodos  108 quelamezcladereacciónyamplificaciónseasemejaronalasdelapartadoa). Noobstante,existenpequeñasvariaciones:elDNAmoldesesustituyópor0,5 µLdeunadiluciónpreviaen20µLdelacoloniaaprobaryelpasoinicialde 95°C/98°Cserealizódurante5minutosparafavorecerlaroturadelapared celular.  ExisteademásotrousodePCRscreening,idénticoenmetodologíaal apartadoa),enlaseleccióndelíneasKOhomocigotas(genotipado)como pasoprevioalatransformacióngénicadeA.thaliana(MaterialesyMétodos, 2.1.8.4.1).  d)Análisisdeexpresióngénica.‐ enestetipodereacción,deidéntica metodologíaalapartadoa),loscDNAsusadoscomomoldefueronobtenidosa partirdelasestirpestransformantesdelevadura(MaterialesyMétodos, 2.1.9.1.1a)ydelasplantastransgénicasT2deArabidopsis(Materialesy Métodos,2.1.9.2.2).Lasparejasdeoligonucleótidosespecíficosusados estabandiseñadosapartirdelaregióncodificantedecadagen.Enestecaso, lafinalidadfuedeterminarcualitativamentelaexpresiónonodelosgenesa estudio.  2.1.3.2AmplificaciónrápidadelosextremosdelcDNA(RACE)  SegúnelextremodeloscDNAsquesequisoamplificar,sellevaronacabo distintosmétodos:  a) Extremo3´.‐ Paralaamplificacióndeesteextremoseutilizóelkitde optimizacióndePCR(Invitrogen,EEUU),medianteelusodeun oligonucleótidointernodelfragmentoobtenidoconlosoligosdegeneradosy otrodiseñadoapartirdelacoladepoliadeninadelmRNA(FA2Z)(ApéndiceI). Elprocedimientoseguidofueeldescritoparaelusodeestekit.  b) Extremo5´.‐ParalaamplificacióndeesteextremoseutilizóelSmartTM‐RACE cDNAamplificationkit(Clontech,Japón).Traslasíntesisdelaprimeracadena decDNAserealizóunareaccióndePCRquecontenía:tampónBDAdvantage MaterialesyMétodos  109 2PCR(10X),unamezcladedNTPsenunaconcentraciónfinalde0,2mMpara cadauno,1µLdeBDAdvantage2PolimerasaMix(50X)y5µLdelamezcla deloligonucleótidouniversal(UPM,UniversalPrimerMix)(10X)(ApéndiceI), suministradotodoelloporelkit.Aestamezclaseañadióunoligonucleótido reversoespecíficomásalejadodelextremo5´aunaconcentraciónfinalde 0,2µM.LascondicionesdePCRvariaronconrespectoalasestándar (MaterialesyMétodos,2.1.3.1a)yconsistieronen25ciclosconunprimer pasodedesnaturalizacióna94°Cdurante30s,unaetapadealineamientoa 68°Cdurante30syunaúltimaetapadeextensióna72°Cdurante3min.Con elproductodeestareacciónserealizóunasegundaPCRde20ciclos utilizandolascondicionesanteriores,peroenlaquelosoligonucleótidos utilizadosfueronNUP(NestedUniversalPrimer)(10X)(ApéndiceI),delpropio kit,yunsegundooligonucleótidoreversoespecífico.Posteriormente,aeste productoselerealizóunanuevaPCRconunterceroligonucleótidoespecífico yNUP,siguiendolasmismascondicionesqueenlasegundareacción.  2.1.3.4AnálisisdeexpresióngénicamediantePCRcuantitativa  2.1.3.4.1Basesteóricas  Mediantelacombinacióndetécnicasdefluorescenciaylacapacidadde detección,laPCRcuantitativaatiemporeal(qRT‐PCR)permitemonitorizarel procesodereacciónsiguiendosudesarrollocicloaciclo(Heidetal.,1996;Bustin, 2002).  EnelprocesodelareaccióndePCRsepuedendistinguirdosfasesbien diferenciadas:unaprimerafase,dondetienelugarunincrementoexponencialde lasmoléculasdeDNA,enlaqueunamayorcantidaddeDNAdepartidaimplica mayorproductodereacción,yunasegundafase,enlaquelareacciónalcanza unafaseestacionariadondeloscomponentesdelamezcladereacción comienzanaserlimitantes,losinhibidoresdelareacciónseacumulanyla polimerasapierdeactividad.   MaterialesyMétodos  110 Fluorescencia(ΔRn) 10.000 20.000 30.000 246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Ciclos Ct línea base 10.000 20.000 30.000 246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 10.000 20.000 30.000 246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Ct Elincrementoenlaemisióndefluorescencia(ΔRn)quetienelugarduranteel transcursodelareacciónestádirectamenterelacionadoconelincrementoenla amplificacióndelasecuenciadiana.Cuandoesteincrementoesexpresadofrente alnúmerodeciclosseobtieneunacurvadeamplificación(Figura16).El parámetroCt(cicloumbral)sedefinecomoelcicloenelcuallaseñalde fluorescenciacruzaelumbralsuperandolalíneabase.Enestepuntoenelcualla curvadefluorescenciacruzaelumbral,lareacciónseencuentraenfase exponencial,existiendorelaciónlinealentreellogaritmodecambiode fluorescenciayelnúmerodeciclos.CuantomayoreslacantidaddeDNAmolde departida,menosciclossonnecesariosparaqueelproductodereacciónse acumuleypuedaserdetectadoy,portanto,másrápidosealcanzaelCt.ElCt permitecuantificarelDNApresenteenlamuestrayasí,laexpresióndelgen.               ComométododegeneracióndefluorescenciaseempleóSYBR®Green(Qiagen, Alemania),cuyafluorescenciaseveincrementadacuandoseunealsurcomenor delDNAdedoblecadenageneradoenlaPCR.Ladiscriminaciónentreproductos específicosynoespecíficosselogramediantelarepresentacióndela fluorescenciacomounafuncióndelatemperatura,generandounacurvade desnaturalización(meltingcurve)paracadaproductodeamplificación.Así,cada productoposeeunpicodedesnaturalización(meltingpeak)característicoen funcióndesucomposiciónnucleotídica,quepermitedistinguirlodeposibles artefactosgeneradosdurantelaamplificación. Figura 16.CurvadeamplificacióndelaqRT‐PCR. MaterialesyMétodos  111 ParalacuantificacióndelproductodePCR,laseñaldefluorescencia,medida duranteeltranscursodelareacción,esdigitalizadaytransformadaenunvalor numéricoquecorrespondealvalordeCtparacadaunodelosproductos amplificados.  2.1.3.4.2Aplicacióntécnica  ElmRNAaisladodelasmuestrasdematerialvegetal(MaterialesyMétodos, 2.1.1.3.2)fueretrotranscritoacDNA(MaterialesyMétodos,2.1.1.3.3).Éste últimofuecuantificadosegúnelprocedimientopreviamentedescrito(Materiales yMétodos,2.1.2)yseutilizódemoldeparalarealizacióndePCRcuantitativas.  Elestudiodelaexpresióndecadaunodelosgenesfuerealizadomediantela amplificacióndeunaregiónconcretadelosmismos,deunas100pb,medianteel diseñoyusodeoligonucleótidosespecíficos(ApéndiceI).  ComoreactivoparalaemisióndefluorescenciaseempleóSYBR®Green(Qiagen, Alemania).Lasreaccionesdeamplificaciónatiemporealserealizaronenun volumenfinalde25µL,conteniendo:12μLdeQuantiTectSYBR®GreenPCR Mastermix(2x),con2,5mMdeMgCl2,0,3μMdecadaoligonucleótido,2μLde cDNAyagualibredeRNasa.Lasreacciones,incluyendoloscontrolesnegativos, sellevaronacaboportriplicadoenplacasdepolipropilenode48pocillos (Stratagene®,Alemania)cubiertascontiras“Opticalcap”(Stratagene®,Alemania).  ParallevaracabolasreaccionesdeamplificaciónseutilizóelsistemaMJMini PersonalThermalCycler(Bio‐Rad,EEUU)acopladoauncabezalMiniOpticon RealTimePCRSystem(Bio‐Rad,EEUU),mediantesoftwareespecífico, monitorizandoasílareacciónatiemporeal.Elprogramaseguidoconsistióenuna incubacióninicialdelamezcladereaccióna50°Cdurante2min,seguidadeuna etapadeactivacióndelaenzimayprimeradesnaturalizacióna95°Cdurante15 min.Posteriormente,seefectuaron40ciclosqueconsistíanenunaprimera etapadedesnaturalizacióna94°Cdurante15s,unafasedealineamientode oligonucleótidosde30sa62°C,yunaetapadeextensióna72°Cde15s. Finalmente,traslos40ciclos,lamezclasesometióaunacurvade MaterialesyMétodos  112 desnaturalizaciónquecomenzabaa70°Cyterminabaa90°C,conunincremento de0,2°C/s,enlosqueseprodujounaextensiónfinaldelosfragmentos obtenidos.Latemperaturadealineamientosemodificóligeramentehasta encontrarelpuntoóptimoparacadareacción.  Trasfinalizarlasreaccionessecomprobólaausenciadedímerosde oligonucleótidosmedianteelanálisisdelascurvasdedisociación.Esteanálisis consistióenunaprimeraetapadedesnaturalizacióndurante1mina95°C, seguidadeunaetapadehibridacióna55°Cyotradeunincrementode temperaturade0,2°C/shasta95°C.Además,sepudoconstatarlaespecificidad deproductosdePCRobtenidosmedianteelectroforesisengeldeagarosaal2% (MaterialesyMétodos,2.1.4.1).  2.1.3.4.2Eficienciadeamplificación  Paradeterminarlaeficienciadeamplificacióndecadaparejadeoligonucleótidos serealizóunacurvaestándarportriplicado,preparandodilucionesseriadasde lasmuestrasdecDNA(1:2,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160y1:320)y representandolosvaloresdeCtfrenteallogaritmodelasdiferentesdiluciones decDNA.Entodosloscasos,elvalordelapendientedelarectaestaba comprendidoentre‐3,1y‐3,6,loquesignificabaquelareacciónteníauna eficienciadeamplificación(E=[10(‐1/pendiente)]‐1)de90‐110%.Asimismo,el coeficientederegresiónobtenidoera≥0,985,locualindicabaquelas condicionesdelensayoeranaceptablesencuantoaprecisión,reproducibilidady sensibilidad.  2.1.3.4.3CuantificacióndelosproductosdePCR  Lacuantificacióndelnúmerodecopiasdelostranscritosgénicossellevóacabo mediantecuantificaciónabsoluta,enlaquelosvaloresdeCtdeterminanel númerodecopiasdelostranscritosdelosgenesenestudio,trasrelacionarla señaldePCRconunacurvadecalibración(Bustin,2000).Lascurvasde calibraciónserealizarondeterminandolasCtdediferentesdilucionesde concentraciónconocida,utilizándosecomomoldeconstruccionesdelplásmido MaterialesyMétodos  113 pMBL‐Tqueconteníanelgenaestudio.Lasrectasdecalibraciónserealizaron conociendoelnúmerodecopiasdemoléculasdeplásmido/µlDNAysuCt. Finalmente,losresultadosobtenidosseexpresaroncomolamedia±SD.  2.1.4Separaciónypurificacióndeácidosnucleicos  2.1.4.1ElectroforesisdeDNAengeldeagarosa  LaseparacióndelosfragmentosdeDNAsellevóacabomedianteelectroforesis engeldeagarosa,segúnSambrooketal.(1989).ElgelsepreparaentampónTAE (MaterialyMétodos,1.7.1.1).Laconcentracióndeagarosa(p/v)enlosgeles puedevariarentre0,8%,paralaseparacióndebandasdetamañosmayoreso igualesa1kb,y2%,parabandasdepequeñotamaño.Antesdesersometidasa electroforesis,lasmuestrassesuplementancon1/6delvolumendetampónde carga6x(sacarosa40%(p/v),0,1MEDTAyazuldebromofenol0,25%(p/v)) (Fermentas,EEUU).ParadeterminareltamañodelosfragmentosdeDNAse emplearonlosmarcadoresdepesomolecular:GeneRulerTM1kbDNALadder,y MassRulerTMDNALadderMix(Fermentas,EEUU).Laselectroforesissellevarona caboenunacubetahorizontalalimentadaporlafuentePowerPac(Bio‐Rad, EEUU),aplicandodiferenciasdepotencialentre80y120V.  ParaladeteccióndelDNAenlosgelesysuvisualización,seañadierondurantela preparacióndelgel0,5ng/mLdebromurodeetidio(Sigma‐Aldrich,EEUU).La visualizacióndelosgelesyelalmacenamientodelasimágenesserealizó medianteuntransiluminadordeluzultravioletaChemiGenius2(Syngene,Reino Unido),elcualincluyeunacámaraFIREWIRECCDdealtaresolución,yestá acopladoaunordenadorpersonalqueincluyeelsoftwareGeneSnap(Syngene, ReinoUnido).       Resultados  216 Asípues,todosestosdatosnospermitieronobtenerunaaproximaciónmás exactadeladistribucióndelavariable“contenidodeesteárico(E)”enlas poblacionesanalizadas.  3.1.2ContenidodeEOE  Paralavariable“contenidodeEOE”secreónuevamenteunatablade distribucióndefrecuencias(MaterialesyMétodos,2.4.1),lacualresumela contribucióndelassemillasanalizadasadichavariable,generacióntras generación(Tabla27).  GeneraciónM2:Prácticamenteel100%delcontenidodeEOEacumulado pertenecienteaestageneracióninicialsecorrespondeconlasumadelas frecuenciashalladasenlasdosprimerasdelasseisclasesestablecidasparaesta variable[0‐8].Enconcreto,laclase1[0‐4]aportaun59%deltotalalencontrarse enella1109semillasdelas1869acumuladasenestosintervalos,loquela convierteenlaclasemásfrecuente,nosóloaestenivel,sinotambiéndel cómputoglobal,contribuyendoconun57%deltotalanalizado.Laclase2[4‐8], porsuparte,aportaalgomásdeun40%altotalpertenecientealintervalo[0‐8], hallándoseenésta760semillas.Laclase3[8‐12]aglutinatansólo67delas semillasanalizadas,loquesuponeaproximadamenteun3%deltotalanalizado, mientrasquelaaportacióndelaclase4[12‐16]noalcanzael1%deltotal,con tansólo2semillas.Asípues,lasumadelosporcentajesdeestasdosúltimas clasescoincideconelporcentajedesemillasanalizadasquecumplieronel criteriodeselecciónestablecidoparaestavariable(EOE≥8),yaquelasclases5y 6[16‐24],alnoreunirningunadelasfrecuenciasanalizadas,notuvieron aportaciónalguna.       Resultados  217     GENERACIÓNCLASELILSFAFAAFRFRA M2 104110911090,570,57 24876018690,390,96 38126719360,031,00 41216219380,001,00 51620019380,001,00 62024019380,001,00 M3 10427270,140,14 24860870,310,44 3812851720,430,88 41216221940,110,99 5162021960,011,00 6202401960,001,00 M4 104880,080,08 24845530,430,51 3812481010,460,97 4121631040,031,00 5162001040,001,00 6202401040,001,00 M5 104000,000,00 24846460,630,63 381223690,320,95 412162710,030,97 516201720,010,99 620241730,011,00   Tabla27.Distribucióndefrecuenciasdelavariable“contenidodeEOE”enlasdistintas generacionespoblacionales(M2‐M5).Lasfrecuenciassedividieronenclasesointervalos, consuscorrespondienteslímiteinferior(LI)ylímitesuperior(LS).FA:frecuenciaabsoluta| FAA:frecuenciaabsolutaacumulada|FR:frecuenciarelativa|FRA:frecuenciarelativa acumulada. Resultados  218 GeneraciónM3:Ladistribucióndelasfrecuenciasenestageneración,a diferenciadelaanterior,fueligeramentemásdispersa.Enestaocasión,casila mitaddelcontenidodeEOEacumulado(44%)sedebióalasumadelas frecuenciashalladasenlasdosprimerasclases[0‐8],siendolaclase2[4‐8]laque mayoraportaciónhizoadichointervalo,conunas60semillasdelas87 acumuladas(69%).Noobstante,laclasemásfrecuenteenestapoblaciónfuela3 [8‐12],contribuyendoconun43%altotalanalizado.Laclase4[12‐16]volvióa acumularfrecuencias,estavezcon22delassemillasanalizadas,loquesupone un11%deltotalanalizado.Laclase5[16‐20],adiferenciadelaclase6[16‐24],sí obtuvorepresentaciónenestageneración,aportando2semillasalcómputo global,loquesuponeaproximadamenteun1%deltotalacumulado.Deeste modo,elporcentajedesemillasquecumplieronelcriteriodeselección(EOE≥8) coincidióconlasumadelosporcentajesobtenidosenlasclases3,4y5,loque suponemásdelamitaddelassemillasanalizadas,concretamenteun55%. GeneraciónM4:Enestecaso,lamitaddelcontenidodeEOEacumuladodeesta generaciónsecorrespondeconlasumadelasfrecuenciashalladasenlasdos primerasclases[0‐8],un7%másdelobservadoenlageneraciónanterior.De nuevo,laclasequemayoraportaciónhizoaesteintervalofuela2[4‐8],conunas 45semillasdelas53acumuladas(85%).Laclase3[8‐12],con48semillasdel totalanalizadovuelveaconvertirseenlaclasemásfrecuentedelapoblación (46%).Laclase4[12‐16]volvióaacumularfrecuencias,sibiensuaportaciónal cómputoglobaldisminuyóhastael3%;lasclases5y6[16‐24]noacumularon frecuenciasenestaocasión.Finalmente,elporcentajedesemillasque cumplieronelcriteriodeselección(EOE≥8)paraestageneraciónsecorrespondió conlasumadelosporcentajesobtenidosenlasclases3y4,un49%deltotal analizado,nuevamentealrededordelamitaddelassemillasanalizadas. GeneraciónM5:Enestageneración,laaportacióndelaclase1[0‐4]alcontenido deEOEacumuladoesnula.Estavez,laclase2[4‐8]aparececomolaclasemás frecuentedelapoblación,conunas46semillasdelas73analizadas(63%).La clase3[8‐12],porsuparte,supusoun32%deltotalanalizado,mientrasquela clase4seviorepresentadaenun3%.Lasclases5y6[16‐24]acumularontan sólo1semillacadauna,loquesuponeunescaso2%deltotalacumulado.El porcentajedesemillasquecumplieronelcriteriodeselección(EOE≥8)enesta Resultados  219 generaciónfuedel37%analizado(27semillas),frutodelasumadefrecuencias observadasenlasclases3,4,5y6. Engeneral,elaltoporcentajedelcontenidoEOEacumuladoenlaclase1[0‐4]de lageneracióninicialM2severeducidodrásticamenteenfavordelrestodeclases alolargodelassiguientesgeneraciones.Lasclases2y3[4‐12]tiendena acumularelmayorporcentajedefrecuencias,llegandoasuponermásdel75%en lageneraciónM3ymásdel90%enM4yM5.Noobstante,elrepartodeestas frecuenciasvarióenfuncióndelageneración,demaneraquelaclase3enM3 comenzósiendosuperioryterminósiendosuperadaporlaclase2,lacualllegóa representarhastaun63%deltotalacumuladoenM5.Lasclases4y5[16‐20],por suparte,apenasquedanrepresentadas,apesardelbuendatoobtenidoparala primeraenM3(11%),mientrasquelaclase6[20‐24]apareceexclusivamenteen laúltimageneraciónanalizada. Estamismaevoluciónsepuedeconstatargráficamentealcompararlos histogramasygráficosdesectoresgeneradosapartirdedichatablaparacada generación(Figura50).Enellosquedapatenteelfenómenodecribaalquese sometióalasdiferentespoblacionesgeneracionalesbajoelcriteriodeselección correspondiente(EOE≥8).        Figura50.Distribuciónentérminosabsolutosyporcentuales delavariable“contenidode EOE”enlasdistintasgeneracionespoblacionales(M2‐M5).Lalínearojadiscontinuapresente enloshistogramasdelimitaelcriteriodeselecciónestablecidoparadichavariable(EOE≥8). Resultados  220  Resultados  221 Acontinuaciónseextrajeronycalcularonlosestadísticosdescriptivos(Materiales yMétodos,2.4.1.1y2.4.1.2).EnlaTabla28seresumenlosestadísticosde posiciónydispersiónrelativosalcontenidodeEOEobservadoencadaunadelas poblacionesestudiadas,antes(P)ydespués(S)deaplicarelcriteriodeselección establecidoparaestavariable(EOE≥8).Posteriormente,seevaluarálaformayel tipodedistribuciónenbasealapoblacióninicialM2.        Apartirdelasmedidasresumenrecogidasenlatablaanterior,seobservólo siguiente:  GeneraciónM2:ElcontenidomediodeEOEdelapoblacióninicialanalizada pertenecienteaestageneración,conuntamañomuestralde1938semillas,fue del3,77±2,11%.SibienseobservaroncontenidosdeEOEentre0,00y12,24%,la mayoríadeéstossesituóentre1,09y6,51%,conun10%delosvalores inferioresal1,09%(P10)yun10%mayoresal6,51%(P90).Estamisma poblaciónsecaracterizóporposeerunaaltavariaciónrelativaparaestavariable, comoponeenevidenciaelaltocoeficientedevariación.Unavezaplicadoel criteriodeselección(EOE≥8),lapoblaciónquecumplíadichocriterioseredujoa 69semillas,un3,5%delapoblacióninicial.ElcontenidomediodeEOEaumentó hastael9,23±1,06%,convaloresmínimosymáximosde8,00y12,24%, Estadísticosdescriptivos Medidasdeposición Medidasdedispersión nMediaMedianaP10P90SDMinMaxRangoVarianzaCV M2P19383,77 3,631,09 6,51 2,11 0,00 12,24 12,244,440,56 S699,23 8,948,17 10,84 1,06 8,00 12,24 4,241,130,12 M3P1968,31 8,383,39 12,35 3,59 0,27 16,83 16,5612,890,43 S10910,86 10,668,38 13,96 1,95 8,09 16,83 8,733,800,18 M4P1047,68 7,834,72 10,71 2,51 0,53 13,81 13,286,300,33 S519,60 9,218,22 11,00 1,33 8,08 13,81 5,721,770,14 M5P738,13 7,516,46 9,62 2,35 5,67 20,86 15,195,500,29 S2710,05 8,858,29 13,61 2,94 8,08 20,86 12,788,620,29 Tabla28.Estadísticosdescriptivosrelativosalavariable“contenidodeEOE”enlasdistintas generacionespoblacionales(M2‐M5).Lasgeneracionessedividieronenpoblacionesantes(P) ydespués(S)deaplicarelcriteriodeselección(EOE≥8).CV:coeficientedevariación|Max: valormáximo|Min:valormínimo|n:tamañomuestral|P10:percentil10|P90:percentil 90|SD:desviaciónestándar. Resultados  222 respectivamente,situándoselamayoríaentre8,17y10,84%.Lavariación relativadeestapoblaciónsevioreducidaconsiderablemente.  GeneraciónM3:ElcontenidomediodeEOEdelapoblaciónanalizada pertenecienteaestageneración,conuntamañomuestralde196semillas,fue del8,31±3,59%.SibienseobservaroncontenidosdeEOEentre0,27y16,83%,la mayoríadeéstossesituóentre3,39y12,35%,conun10%delosvalores inferioresal3,39%(P10)yun10%mayoresal12,35%(P90).Estamisma poblaciónsecaracterizónuevamenteporposeerunaaltavariaciónrelativapara estavariable.Unavezaplicadoelcriteriodeselección(EOE≥8),lapoblaciónque cumplíadichocriterioseredujoa109semillas,un55,6%delapoblacióntotal.El contenidomediodeEOEaumentóhastael10,86±1,95%,convaloresmínimosy máximosde8,09y16,83%,respectivamente,situándoselamayoríaentre8,38y 13,96%.Lavariaciónrelativadeestapoblaciónsevioreducidanuevamente.  GeneraciónM4:ElcontenidomediodeEOEdelapoblaciónanalizada pertenecienteaestageneración,conuntamañomuestralde104semillas,fue del7,68±2,51%.SibienseobservaroncontenidosdeEOEentre0,53y13,81%,la mayoríadeéstossesituóentre4,72y10,71%,conun10%delosvalores inferioresal4,72%(P10)yun10%mayoresal10,71%(P90).Estamisma poblaciónsecaracterizóporposeeraúnunaaltavariaciónrelativaparaesta variable.Unavezaplicadoelcriteriodeselección(EOE≥8),lapoblaciónque cumplíadichocriterioseredujoa51semillas,un49,0%delapoblacióntotal.El contenidomediodeEOEaumentóhastael9,60±1,33%,convaloresmínimosy máximosde8,08y13,81%,respectivamente,situándoselamayoríaentre8,22y 11,00%.Lavariaciónrelativadeestapoblaciónfuemenorquelaanterior.  GeneraciónM5:ElcontenidomediodeEOEdelapoblaciónanalizada pertenecienteaestageneración,conuntamañomuestralde73semillas,fuedel 8,13±2,35%.SibienseobservaroncontenidosdeEOEentre5,67y20,86%,la mayoríadeéstossesituóentre6,46y9,62%,conun10%delosvalores inferioresal6,46%(P10)yun10%mayoresal9,62%(P90).Estamisma poblaciónsecaracterizónuevamenteporposeerunaaltavariaciónrelativapara estavariable.Unavezaplicadoelcriteriodeselección(EOE≥8),lapoblaciónque Resultados  223 cumplíadichocriterioseredujoa27semillas,un36,9%delapoblacióntotal.El contenidomediodeEOEaumentóhastael10,05±2,94%,convaloresmínimosy máximosde8,08y20,86%,respectivamente,situándoselamayoríaentre8,29y 13,61%.Lavariaciónrelativadeestapoblaciónfueigualquelaanterior.  Encuantoalaevolucióndelasmedidasresumenalolargodelasgeneraciones, sepudodeterminarque:  Tamañomuestral(n):eltamañomuestraldelapoblacióninicialpertenecientea lageneraciónM2sevioreducidoun96%trasaplicarelcriteriodeselección.A partirdelasiguientegeneración(M3),elporcentajedesemillascribadassuperó el50%conrespectoaltotalanalizadoporgeneración,conexcepcióndelaúltima generación(M5),cuyaporcióncribadasupusoun37%desupoblacióndeorigen.  Media±SD:elcontenidodeEOEmedioenlageneracióninicialM2pasódeun 3.77%presenteenlapoblaciónorigen(P)aun9.23%trasaplicarelcriteriode selección(S),locualsuponeundiferencialaproximadode5.5%.Apartirdela generaciónM3,lasmediasestimadasdelaspoblacionescribadas(S)se mantuvieronentornoalos2puntosporencimadelasmediasestimadasparalas poblacionesdeorigen(P),sinunatendenciadeterminada,conpequeñas fluctuaciones.LasdesviacionesestándarparacadapoblaciónS,porsuparte,se mantuvieronsiempreinferioresalasdelaspoblacionesdelasqueprocedían, salvoenlageneraciónM5,dondefueligeramentesuperior.  Mediana:lamedianacalculadaenlageneracióninicialM2pasódeun3.63% presenteenlapoblaciónorigen(P)aun8.94%traslaaplicacióndelcriteriode selección(S),locualsuponeundiferencialaproximadode5.3%.Apartirdela generaciónM3,elcomportamientoobservadofuemuysimilaralanalizado anteriormenteparalasmediaspoblacionales.  Percentiles10/90(P10/P90):losvaloresP10alcanzadosencadageneración previoalaaplicacióndelcriteriodeselección(EOE≥8)fueronaumentando progresivamente,detectándoseunimportantesaltocuantitativoentrelas generacionesM2yM3,ysiemprefueronmenoresalosalcanzadosporlas Resultados  224 poblacionescribadas(S)encadageneración.Porelcontrario,losvaloresP90 tantoenlaspoblacionesdeorigen(P)comoenlaspoblacionescribadas(S), aumentaroninicialmenteparaposteriormenteirdisminuyendoencada generación,conlaexcepcióndelapoblacióncribada(S)pertenecienteala generaciónM5queaumentó.Teniendoencuentaambasmedidasseobservó cómolosdatosrelativosaestavariablesefueronconcentrandoalolargodelas generaciones.  Valoresmáximo(Max)ymínimo(Min):losvaloresmáximosalcanzadosenestas poblacionesoscilanentrelos12.24%registradosenlageneraciónM2ylos 20.86%delageneraciónM5,loquenospermitecalcularun diferencial/incrementodel8.62%enelcontenidodeEOE,sibienlaevoluciónno essiemprealalza,convaloresparaelrestodegeneracionesde16.83%(M3)y 13.81%(M4).Elvalormínimoalcanzadoencadageneracióndelaspoblaciones origen(P)vaaumentandoprogresivamente,detectándoseunimportantesalto cuantitativoentrelasgeneracionesM4yM5;losvaloresmínimosparatodaslas poblacionescribadas(S),comocabríaesperar,sesituaronentornoal8%, superandoasíelvalorestablecidoenlapropiacriba(EOE≥8).  AmplitudoRango:elrangoobservadoenlassucesivaspoblacionescribadas(S), generacióntrasgeneración,adquirióvaloressiempreinferioresalosobtenidos porsuspoblacionesdeorigen(P).  Varianza:Seobservaunaumentoconsiderabledeéstasalpasodelageneración M2alaM3,tantoenlapoblacióndeorigen(P)comoenlacribada(S),seguidode undescensoenlageneraciónM4yunaumentoenlageneraciónM5,paraambas poblaciones.Losvaloresdelavarianzaenlapoblacióncribadafueronsiempre menoresalosdelapoblacióndeorigen,siendoestehechounaconstantealo largodelasgeneraciones,conexcepcióndeloocurridoenlageneraciónM5.Para elestudioenprofundidaddelasvarianzascalculadasserealizaronanálisisde varianzas(ANOVA),paralocualfuenecesarioconocerladistribucióndelas poblaciones.  Resultados  225 CoeficientedeVariación(CV):Alanalizarloscoeficientesdevariación(CV)se observacómolavariacióndelcontenidodeEOEenlaspoblacionesorigen(P)va disminuyendoamedidaqueseobtienennuevasgeneraciones.Noobstante,las variacionesdetectadasenlaspoblacionescribadas(S)fluctúanconstantemente. Losvaloresdelcoeficientedevariaciónenlapoblacióncribadafueronsiempre menoresalosdelapoblacióndeorigen,siendoestehechounaconstantealo largodelasgeneraciones,conexcepcióndelageneraciónM5,enlaqueestos valoresfueroniguales.  Enresumen,eltamañomuestralfuedisminuyendoprogresivamenteamedida queseavanzóenelprocesodecribageneracional.Duranteesteproceso,el contenidomediodeEOEfluctuóentornoal9‐10%,condesviacionesestándar (SD)enligeroaumento.Encuantoalasvarianzasycoeficientesdevariación(CV), éstosexperimentaronciertasfluctuacionesamedidaqueseavanzóenla obtencióndenuevasgeneraciones.  Finalmente,seevaluólaformaytipodedistribucióncorrespondienteala poblacióninicialM2(MaterialesyMétodos,2.4.1.3).Unaprimeravisióndel histograma(Figura50)yposterioranálisisdelamediaymedianacalculadaspara dichapoblación(Tabla19),convaloresmuysimilaresentornoal3,7%, sugirieronunaciertanormalidadyasimetríadeladistribucióndelosdatos obtenidosparadichapoblación.EltestdeKolmogorov‐Smirnovrecalcóesta apreciaciónrevelandoquelosdatosnoseasemejabanaunadistribuciónnormal (p=0,5).Elcoeficientedeasimetríaestimado,conunvalorde0,56,determinó quelanonormalidadtestadasedebíaaunaasimetríadesplazadahaciala derecha.Porotrolado,elcoeficientedecurtosis,conunvalorde0,39,hizo referenciaaunamayorconcentracióndedatosalrededordelamedia,esdecir, unadistribuciónmásapuntadayconcolasmásanchasquelanormal.  Asípues,todosestosdatosnospermitieronobtenerunaaproximaciónmás exactadeladistribucióndelavariable“contenidodeEOE”enlaspoblaciones analizadas.   Resultados  232 mayoríadeéstossesituóentre12,55y20,35%,conun10%delosvalores inferioresal12,55%(P10)yun10%mayoresal20,35%(P90).Estamisma poblaciónsecaracterizónuevamenteporposeerunaaltavariaciónrelativapara estavariable.Unavezaplicadoelcriteriodeselección(SUS≥20),lapoblaciónque cumplíadichocriterioseredujoatansólo8semillas,un10,9%delapoblación total.ElcontenidomediodeSUSaumentóhastael26,41±8,39%,convalores mínimosymáximosde20,36y39,93%,respectivamente,situándoselamayoría enestemismointervalo.Lavariaciónrelativadeestapoblaciónfueligeramente superiorquelaanterior.  Encuantoalaevolucióndelasmedidasresumenalolargodelasgeneraciones, sepudodeterminarque:  Tamañomuestral(n):eltamañomuestraldelapoblacióninicialpertenecientea lageneraciónM2sevioreducidoun93%trasaplicarelcriteriodeselección.A partirdelasiguientegeneración(M3),elporcentajedesemillascribadassuperó el20%conrespectoaltotalanalizadoporgeneración,conexcepcióndelaúltima generación(M5),cuyaporcióncribadasupusotansóloun11%desupoblaciónde origen.  Media±SD:ElcontenidodeSUSmedioenlageneracióninicialM2pasódeun 12.30%presenteenlapoblaciónorigen(P)aun22.73%trasaplicarelcriteriode selección(S),locualsuponeundiferencialaproximadode10.4%.Apartirdela generaciónM3,lasmediasestimadasdelaspoblacionescribadas(S)fueronen continuoaumento,alcanzandolos26.41%enlageneraciónM5.Estamisma evoluciónseobservóalcompararlasmediasestimadasdelaspoblacionesde origen(P),sibienlamediaenlageneraciónM5disminuyócasien2puntosen relaciónalvalordelageneraciónanterior.Lasdesviacionesestándarparacada poblaciónS,porsuparte,semantuvieronsiempreinferioresalasdelas poblacionesdelasqueprocedían,salvoenlageneraciónM5,dondefue notablementesuperior.   Resultados  233 Mediana:lamedianacalculadaenlageneracióninicialM2pasódeun12.13% presenteenlapoblaciónorigen(P)aun21.81%trasaplicarelcriteriode selección(S),locualsuponeundiferencialaproximadode9.7%.Apartirdela generaciónM3,elcomportamientoobservadofuemuysimilaralanalizado anteriormenteparalasmediaspoblacionales,sibienelvalorobservadoenla poblacióncribada(S)enlageneraciónM5fuemenorqueelobservadoenésta mismaenlageneraciónanterior.  Percentiles10/90(P10/P90):losvaloresP10alcanzadosencadageneración previoalaaplicacióndelcriteriodeselección(SUS≥20)fueronaumentando progresivamenteysiemprefueronmenoresalosalcanzadosporlaspoblaciones cribadas(S)encadageneración.Igualmente,losvaloresP90tantodelas poblacionesdeorigen(P)comodelaspoblacionescribadas(S)fueron aumentando,sibienelvalorobtenidoenlageneraciónM5delapoblaciónde origendisminuyóconrespectoalaobtenidaenlageneraciónanterior.Teniendo encuentaambasmedidasseobservócómolosdatosrelativosaestavariableen laspoblacionesdeorigen(P)sefuerondesplazandomientrasquelosdatosenlas poblacionescribadas(S)sefuerondispersandoalolargodelasgeneraciones.  Valoresmáximo(Max)ymínimo(Min):losvaloresmáximosalcanzadosenestas poblacionesoscilanentrelos33.29%registradosenlageneraciónM3ylos 40.50%delageneraciónM2.Noobstante,enlageneraciónM5seregistróun máximode39.93%,próximoalobservadoenlageneracióninicialM2.Porcontra, elvalormínimoalcanzadoencadageneraciónpreviaalacribavaaumentando progresivamente,detectándoseunimportantesaltocuantitativoentrelas generacionesM4yM5.Losvaloresmínimosparatodaslaspoblacionescribadas (S),comocabríaesperar,sesituaronentornoal20%,superandoasíelvalor establecidoenlapropiaselección(SUS≥20).  AmplitudoRango:elrangoobservadoenlassucesivaspoblacionescribadas(S), generacióntrasgeneración,adquirióvaloressiempreinferioresalosobtenidos porsuspoblacionesdeorigen(P).  Resultados  234 Varianza:Seobservaunaumentoconsiderabledeéstasalpasodelageneración M2alaM3,tantoenlapoblacióndeorigen(P)comoenlacribada(S).Apartirde estemomento,lasvarianzasdelaspoblacionesdeorigen(P)experimentaronun descensopaulatino,mientrasquelaspoblacionescribadas(S)vieronaumentada suvarianza,destacandoelincrementodel53%observadoentrelasgeneraciones M4yM5.Losvaloresdelavarianzaenlapoblacióncribadafueronsiempre menoresalosdelapoblacióndeorigen,siendoestehechounaconstantealo largodelasgeneraciones,conexcepcióndeloocurridoenlageneraciónM5.Para elestudioenprofundidaddelasvarianzascalculadasserealizaronanálisisde varianzas(ANOVA),paralocualfuenecesarioconocerladistribucióndelas poblaciones.  CoeficientedeVariación(CV):loscoeficientesdevariación(CV)experimentaron lamismatendenciaobservadaalanalizarlasvarianzas,estoes,undescenso paulatinoenlaspoblacionesdeorigen(P)yunaumentogradualenlas poblacionescribadas(S).Losvaloresdelcoeficientedevariaciónenlapoblación cribadafueronsiempremenoresalosdelapoblacióndeorigen,siendoeste hechounaconstantealolargodelasgeneraciones,conexcepcióndela generaciónM5,enlaqueestatendenciaseinvirtió.  Enresumen,eltamañomuestralfuedisminuyendoprogresivamenteamedida queseavanzóenelprocesodecribageneracional.Duranteesteproceso,el contenidomediodeSUSsemantuvoentornoal22‐26%,condesviaciones estándar(SD)relativamentebajas.Encuantoalasvarianzasycoeficientesde variación(CV),éstosexperimentaronunaumentoconstanteamedidaquese avanzóenlaobtencióndenuevasgeneraciones.  Finalmente,seevaluólaformaytipodedistribucióncorrespondienteala poblacióninicialM2(MaterialesyMétodos,2.4.1.3).Unaprimeravisióndel histograma(Figura51)yposterioranálisisdelamediaymedianacalculadaspara dichapoblación(Tabla21),convaloresmuysimilaresentornoal12,2%, sugirieronunaciertanormalidadysimetríadeladistribucióndelosdatos obtenidosparadichapoblación.Noobstante,eltestdeKolmogorov‐Smirnov revelóquelosdatosnoseasemejabanaunadistribuciónnormal(p=0,5).El Resultados  235 coeficientedeasimetríaestimado,conunvalorde0,39,determinóquelano normalidadtestadasedebíaaunaasimetríadesplazadahacialaderecha.Por otrolado,elcoeficientedecurtosis,conunvalorde0,61,hizoreferenciaauna mayorconcentracióndedatosalrededordelamedia,esdecir,unadistribución másapuntadayconcolasmásanchasquelanormal.  Asípues,todosestosdatosnospermitieronobtenerunaaproximaciónmás exactadeladistribucióndelavariable“contenidodeSUS”enlaspoblaciones analizadas.  3.1.4ValorαSat  Paralavariable“valorαSat”secreónuevamenteunatabladedistribuciónde frecuencias(MaterialesyMétodos,2.4.1),lacualresumelacontribucióndelas semillasanalizadasadichavariable,generacióntrasgeneración(Tabla31).  GeneraciónM2:El68%delvalorαSatacumuladopertenecienteaesta generacióninicialsecorrespondeconlasumadelasfrecuenciashalladasenlas tresprimerasdelascuatroseisestablecidasparaestavariable[0.0‐0.3].En concreto,laclase1[0.0‐0.1]nollegóaaportarniel1%deltotalalencontrarseen ellatansólo4semillasdelas1328queacumulanestosintervalos.Lasclases2 [0.1‐0.2]y3[0.2‐0.3],porsuparte,aportaronalrededordeun7y93%aeste total,respectivamente.Laclase3[0.2‐0.3],asuvez,seconvierteenlaclasemás frecuentedeltotalanalizado,contribuyendoconun64%,seguidadelaclase4 [20‐30],lacualsupusoun24%deestetotal.Lasclases5[0.4‐0.5]y6[0.5‐0.6] sumaronentrelasdos140delassemillasanalizadas,loquesupuso aproximadamenteun7%deltotalanalizado.Elporcentajedesemillasque cumplieronelcriteriodeselecciónestablecidoparaestavariable(αSat≥0.30) resultódelasumadelosporcentajesdelasclases4,5y6,untotalde31%.     Resultados  236 Tabla31.Distribucióndefrecuenciasdelavariable“valorαSat”enlasdistintas generacionespoblacionales(M2‐M5).Lasfrecuenciassedividieronenclasesointervalos,con suscorrespondienteslímiteinferior(LI)ylímitesuperior(LS).FA:frecuenciaabsoluta|FAA: frecuenciaabsolutaacumulada|FR:frecuenciarelativa|FRA:frecuenciarelativa acumulada.  GENERACIÓNCLASELILSFAFAAFRFRA M2 10,00,1440,000,00 20,10,291950,050,05 30,20,3123313280,640,68 40,30,447017980,240,93 50,40,56418620,030,96 60,50,67619380,041,00 M3 10,00,1110,010,01 20,10,249500,250,26 30,20,31351850,690,94 40,30,451900,030,97 50,40,501900,000,97 60,50,661960,031,00 M4 10,00,1000,000,00 20,10,2440,040,04 30,20,383870,800,84 40,30,4131000,130,96 50,40,511010,010,97 60,50,631040,031,00 M5 10,00,1000,000,00 20,10,2330,040,04 30,20,365680,890,93 40,30,43710,040,97 50,40,51720,010,99 60,50,61730,011,00    Resultados  237 GeneraciónM3:Enestaocasión,elvalorαSatacumuladoenlastresprimeras clases[0.0‐0.3]sumóun94%.Concretamente,laclasequemayoraportaciónhizo adichointervalofuelaclase3[0.2‐0.3],conunas135semillasdelas185 acumuladas(73%),seguidadelaclase2[0.1‐0.2]con49semillas(26%)ylaclase 1[0.0‐0.1],contansólo1semilla,menosdel1%deestetotal.Laclase3[0.2‐0.3], porsuparte,volvióaserlaclasemásrepresentadaenlapoblación,conun69% deltotalanalizado.Laclase4[0.3‐0.4]obtuvounescasarepresentaciónenesta generaciónaligualquelaclase6[0.5‐0.6],aportandoun3%cadauna.Laclase5 [0.4‐0.5]noobtuvorepresentaciónalgunaestavez,porloqueelporcentajede semillasquecumplieronelcriteriodeselección(αSat≥0.30)enestageneración secalculósumandolosporcentajesrelativosdelasclases5y6,un6%deltotal analizado.  GeneraciónM4:El84%delvalorαSatacumuladodeestageneraciónse correspondeconlasumadelasfrecuenciashalladasenlasclases2y3[0.1‐0.3], yaquenoseobservaronfrecuenciasreferentesalaclase1[0.0‐0.1].Denuevo,la clasequemayoraportaciónhizoaesteintervalofuela3[0.2‐0.3],conunas83 semillasdelas87acumuladas(95%),convirtiéndoseasuvezenlaclasemás representadaenlapoblaciónconun80%deltotalanalizado.Laclase4[0.3‐0.4] volvióaestarrepresentada,estavezaportando13deltotaldesemillas analizadas(13%).Lasclases5[0.4‐0.5]y6[0.5‐0.6],porsuparte,sumaronentre ambas4semillas,loquesecorrespondióconun4%deltotalanalizado.Asípues, elporcentajedesemillasquecumplieronelcriteriodeselección(αSat≥0.30)en estageneraciónfuedel17%,sumadelosporcentajescalculadosdelasclases4,5 y6.  GeneraciónM5:Prácticamenteel100%delvalorαSatacumuladoenestaocasión secorrespondeconlasumadelasfrecuenciashalladasenlasclases2y3[0.1‐ 0.3],yaque,aligualqueocurrieseenlageneraciónanterior,laaportacióndela clase1[0.0‐0.1]fuenula.Laclasequemayoraportaciónhizoaesteintervalofue la3[0.2‐0.3],conunas65semillasdelas68acumuladas(96%),convirtiéndosede nuevoenlaclasemásrepresentadaenlapoblaciónconun89%deltotal analizado.Laclase4[0.3‐0.4],porsuparte,acumulótansólo3semillas,loque supusounescaso4%.Lasclases5[0.4‐0.5]y6[0.5‐0.6],con1semillacadauna, Resultados  238 aportaronel2%restante.Finalmente,elporcentajedesemillasquecumplieron elcriteriodeselección(αSat≥0.30)enestageneraciónfuetansólodel6%del totalanalizado(5semillas),frutodelasumadefrecuenciasobservadasenlas clases4,5y6.  Engeneral,elmayorporcentajedevalorαSatacumuladosesituóentornoalas clases3y4[0.2‐0.4]paralasgeneracionesM2,M4yM5yentornoalasclases2y 3[0.1‐0.3]paralageneraciónM3.Noobstante,entodasellas,laclasemás representadafuela3[0.2‐0.3],aumentandosuporcentajealolargodelas generaciones.Elrestodelasclasesquedanensegundoplano,yaquenosuperan el7%observadoenlageneracióninicialM2.Apesardeesto,lasclases5[0.4‐0.5] y6[0.5‐0.6]fueronimportantesdecaraalacriballevadaacaboencada generación.  Estamismaevoluciónsepuedeconstatargráficamentealcompararlos histogramasygráficosdesectoresgeneradosapartirdedichatablaparacada generación(Figura52).Enellosquedapatenteelfenómenodecribaalquese sometióalasdiferentespoblacionesgeneracionalesbajoelcriteriodeselección correspondiente(αSat≥0.30).            Figura52.Distribuciónentérminosabsolutosyporcentuales delavariable“valorαSat”en lasdistintasgeneracionespoblacionales(M2‐M5).Lalínearojadiscontinuapresenteenlos histogramasdelimitaelcriteriodeselecciónestablecidoparadichavariable(αSat≥0,30). Resultados  239  Resultados  240 Acontinuaciónseextrajeronycalcularonlosestadísticosdescriptivos(Materiales yMétodos,2.4.1.1y2.4.1.2).EnlaTabla32seresumenlosestadísticosde posiciónydispersiónrelativosalvalorαSatobservadoencadaunadelas poblacionesestudiadas,antes(P)ydespués(S)deaplicarelcriteriodeselección establecidoparaestavariable(αSat≥0,30).Posteriormente,seevaluarálaforma yeltipodedistribuciónenbasealapoblacióninicialM2.         Apartirdelasmedidasresumenrecogidasenlatablaanterior,seobservólo siguiente:  GeneraciónM2:ElvalormediodeαSatdelapoblacióninicialanalizada pertenecienteaestageneración,conuntamañomuestralde1938semillas,fue de0,29±0,07.SibienseobservaronvaloresdeαSatentre0,10y0,50,lamayoría deéstossesituóentre0,22y0,36,conun10%delosvaloresinferioresa0,22 (P10)yun10%mayoresa0,36(P90).Estamismapoblaciónsecaracterizópor poseerunavariaciónrelativamoderadaparaestavariable,comoponeen evidenciaelcoeficientedevariaciónmedido.Unavezaplicadoelcriteriode selección(αSat≥0,30),lapoblaciónquecumplíadichocriterioseredujoa610 Estadísticosdescriptivos MedidasdeposiciónMedidasdedispersión nMediaMedianaP10P90SDMinMaxRangoVarianzaCV M2P19380,29 0,280,220,36 0,07 0,10 0,50 0,40 0,000,23 S6100,36 0,330,300,50 0,07 0,30 0,50 0,20 0,000,19 M3P1960,23 0,230,180,27 0,06 0,05 0,50 0,45 0,000,27 S110,43 0,500,320,50 0,08 0,32 0,50 0,18 0,010,19 M4P1040,26 0,240,210,32 0,06 0,12 0,50 0,38 0,000,23 S170,36 0,340,300,50 0,07 0,30 0,50 0,20 0,010,20 M5P730,24 0,230,200,26 0,05 0,20 0,50 0,30 0,000,22 S50,40 0,380,300,50 0,09 0,30 0,50 0,20 0,010,23 Tabla32.Estadísticosdescriptivosrelativosalavariable“valorαSat”enlasdistintas generacionespoblacionales(M2‐M5).Lasgeneracionessedividieronenpoblacionesantes(P) ydespués(S)deaplicarelcriteriodeselección(αSat≥0,30).CV:coeficientedevariación| Max:valormáximo|Min:valormínimo|n:tamañomuestral|P10:percentil10|P90: percentil90|SD:desviaciónestándar. Resultados  241 semillas,un31,4%delapoblacióninicial.ElvalormediodeαSataumentóhasta 0,36±0,07,convaloresmínimosymáximosde0,30y0,50,respectivamente, situándoselamayoríaenestemismointervalo.Lavariaciónrelativadeesta poblaciónsevioreducidaligeramente.  GeneraciónM3:ElvalormediodeαSatdelapoblaciónanalizadapertenecientea estageneración,conuntamañomuestralde196semillas,fuede0,23±0,06.Si bienseobservaronvaloresdeαSatentre0,05y0,50,lamayoríadeéstossesituó entre0,18y0,27,conun10%delosvaloresinferioresa0,18(P10)yun10% mayoresa0,27(P90).Estamismapoblaciónsecaracterizóporposeerunaalta variaciónrelativaparaestavariable.Unavezaplicadoelcriteriodeselección (αSat≥0,30),lapoblaciónquecumplíadichocriterioseredujoatansólo11 semillas,un5,6%delapoblacióntotal.ElvalormediodeαSataumentóhasta 0,43±0,08,convaloresmínimosymáximosde0,32y0,50,respectivamente, situándoselamayoríaenestemismointervalo.Lavariaciónrelativadeesta poblaciónsevioreducidanuevamente.  GeneraciónM4:ElvalormediodeαSatdelapoblaciónanalizadapertenecientea estageneración,conuntamañomuestralde104semillas,fuede0,26±0,06.Si bienseobservaronvaloresdeαSatentre0,12y0,50,lamayoríadeéstossesituó entre0,21y0,32,conun10%delosvaloresinferioresa0,21(P10)yun10% mayoresa0,32(P90).Estamismapoblaciónsecaracterizóporposeeraúnuna variaciónrelativamoderadaparaestavariable.Unavezaplicadoelcriteriode selección(αSat≥0,30),lapoblaciónquecumplíadichocriterioseredujoa17 semillas,un16,3%delapoblacióntotal.ElvalormediodeαSataumentóhasta 0,36±0,07,convaloresmínimosymáximosde0,30y0,50,respectivamente, situándoselamayoríaenestemismointervalo.Lavariaciónrelativadeesta poblaciónfuemenorquelaanterior.  GeneraciónM5:ElvalormediodeαSatdelapoblaciónanalizadapertenecientea estageneración,conuntamañomuestralde73semillas,fuede0,24±0,05.Si bienseobservaronvaloresdeαSatentre0,20y0,50,lamayoríadeéstossesituó entre0,20y0,26,conun10%delosvaloresinferioresa0,20(P10)yun10% mayoresa0,50(P90).Estamismapoblaciónsecaracterizónuevamentepor Resultados  248 Figura54.Relaciones entrelasvariablesestudiadasenlapoblacióninicialpertenecientea lageneraciónM2medianteAnálisisdeComponentesPrincipales(ACP).CP:Componente Principal.   - Existeunaaltacorrelaciónentrelasvariables“contenidodeE”y“EOE”.  - Existeunaciertacorrelaciónentrelasdosvariablesanteriormentecitadas ylavariable“contenidodeSUS”.  - Existeunalevecorrelaciónentrelasvariables“valorαSat”y“SUS”.  - Noexistecorrelaciónalgunaentrelasvariables“valorαSat”y“contenidos deE”y“EOE”.  Resultados  249 Acontinuación,serepresentaronentresdimensioneslasfrecuenciasabsolutas delascuatrovariablesestudiadasdelapoblacióninicialpertenecienteala generaciónM2(MaterialesyMétodos,2.4.2)(Figura55).  Finalmente,semuestralatabladefrecuenciasabsolutasyrelativas(%)desólo aquellosdatosquecumplíanalmenosunodeloscriteriosdeselección, estableciéndoserelacionesentrelasdistintasvariablesenlapoblacióninicial pertenecientealageneraciónM2(Tabla26).  3.2.2GeneraciónM3  Aligualqueenelcasoanterior,serepresentaronentresdimensioneslas frecuenciasabsolutasdelascuatrovariablesestudiadas,estavezdelapoblación pertenecientealageneraciónM3(MaterialesyMétodos,2.4.2)(Figura55).  Delmismomodo,semuestraenlaTabla26lasfrecuenciasabsolutasyrelativas (%)desóloaquellosdatosquecumplíanalmenosunodeloscriteriosde seleccióndelapoblaciónpertenecientealageneraciónM3.  3.2.3GeneraciónM4  EnlaFigura55serepresentanlasfrecuenciasabsolutasdelascuatrovariables estudiadascorrespondientesalageneraciónM4.Igualmente,enlaTabla26 aparecenlasfrecuenciasabsolutasyrelativas(%)desóloaquellosdatosque cumplíanalmenosunodeloscriteriosdeseleccióndelapoblación pertenecientealageneraciónM4.  3.2.4GeneraciónM5  Aligualqueparalasanterioresgeneraciones,enlaFigura55yTabla35se puedenobservarlasfrecuenciasabsolutasyrelativas(%)desóloaquellosdatos quecumplíanalmenosunodeloscriteriosdeseleccióndelapoblación pertenecientealageneraciónM5.  Resultados  250   Figura55.Distribucióndelasfrecuenciasabsolutasdelas variablesestudiadasenlas poblacionespertenecientesalasgeneracionesM2‐M5.Encadaplanogeneradoseproyectan lasrelaciones“dosados”entrelasfrecuenciasabsolutasdelasvariablesestudiadas.Engris semarcanaquellasfrecuenciasquenocumplieronloscriteriosdeselecciónmarcadospara cadavariableyenazulsemarcanaquéllasquesílohicieron.Lavariable“valorαSat”queda representadaporeltamañodelospuntos. M2M3 M4M5 Resultados  251 EEOESUSαSatE+EOEE+SUSE+αSatEOE+SUSEOE+αSatSUS+αSatTODOS M2 EFA166679886   51357133 FR0.08*0.400.590.52    0.300.210.420.20 EOEFA67695237  5135   3533 FR0.970.03*0.750.53  0.740.50   0.500.48 SUSFA98521289751  71  35  33 FR0.760.400.06*0.750.40  0.55  0.27  0.25 αSatFA8637976103571  35   33 FR0.140.060.160.31*0.050.11  0.05   0.05 M3 EFA151108416   36454 FR0.76*0.710.270.04    0.240.020.030.02 EOEFA108109375  364   44 FR0.990.55*0.340.04  0.330.03   0.030.03 SUSFA4137426365  4  4 FR0.970.880.21*0.140.86  0.12  0.10  0.10 αSatFA65611454   4 FR0.540.450.540.05*0.360.45  0.36   0.36 M4 EFA87512814   206126 FR0.83*0.580.320.16    0.230.070.140.07 EOEFA5151206  206   66 FR1.000.48*0.390.11  0.390.11   0.110.11 SUSFA2820281220  12  6  6 FR1.000.710.26*0.430.71  0.43  0.21  0.21 αSatFA1461217612  6   6 FR0.820.350.700.16*0.350.70  0.35   0.35 M5 EFA712684   7444 FR0.91*0.360.110.05    0.100.050.050.05 EOEFA262775  74   44 FR0.960.34*0.260.18  0.260.15   0.150.15 SUSFA878474  4  4 FR1.000.870.10*0.500.87  0.50  0.50  0.50 αSatFA4545444   4 FR0.801.000.800.06*0.800.80  0.80   0.80 Tabla35.Distribucióndefrecuenciasentre lasvariablesestudiadasenlasdistintas p oblacionesestudiadas ( M 2 ‐M 5 ) .                 DISCUSIÓN|253‐288    BLOQUEI:CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARYENZIMÁTICADELAS ACILTRANSFERASASIMPLICADASENLABIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL  255 1.CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARDELASENZIMASIMPLICADAS ENLABIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL: HaLPAATsYHaDAGATs 255  1.1CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNFISICOQUÍMICADEHaLPAATsYHaDAGATs255 1.2ANÁLISISFILOGENÉTICODE HaLPAATsYHaDAGATs256 1.3PREDICCIÓNDEESTRUCTURASDEHaLPAATsYHaDAGATs258 1.4LOCALIZACIÓNSUBCELULARDE HaLPAATsYHaDAGATs266 1.5ESTUDIOCOMPARATIVODEMODELOSTOPOLÓGICOSDE HaLPAATsYHaDAGATs270 1.6ANÁLISISCOMPARATIVODELOSNIVELESDEEXPRESIÓNDEHaLPAATsYHaDAGATs273  2.CARACTERIZACIÓNBIOQUÍMICADELASENZIMASIMPLICADAS ENLABIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL: HaLPAATsYHaDAGATs 277  2.1HaLPAATs277 2.2HaDAGATs280  BLOQUEII:ANÁLISISDETRIACILGLICÉRIDOS(TAGs)ENLÍNEASMUTAGENIZADASDE GIRASOLALTOOLEICOALTOESTEÁRICO(HOHE)YSELECCIÓNDENUEVOSCANDIDATOS  288                                      Discusión  255 BLOQUEI:CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARYENZIMÁTICADE LASACILTRANSFERASASIMPLICADASENLABIOSÍNTESISDE TRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL  1.CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNMOLECULARDELASENZIMASIMPLICADAS ENLABIOSÍNTESISDETRIACILGLICÉRIDOSENGIRASOL:HaLPAATsYHaDAGATs  1.1CLONACIÓNYCARACTERIZACIÓNFISICOQUÍMICADEHaLPAATsYHaDAGATs  DuranteeldesarrollodelapresenteTesisDoctoralsehanclonadodosLPAATde Helianthusannuus,HaLPAAT1[gi|145692846]yHaLPAAT2[gi|156122739],así comotresDAGATs,HaDAGAT1A[gi|188998307],HaDAGAT1B[gi|161334748] yHaDAGAT2[gi|156122741](Resultados,1.1y2.1).Lasclonacionesse realizaronusandocDNAdesemillasdegirasolde15DDF,estadíodondela expresióndeestasaciltransferasasfuemáxima(Resultados,1.3Figura30y2.3 Figural43).  MientrasquelasdosisoformasHaLPAATspresentancaracterísticas fisicoquímicassemejantes,lasHaDAGATsdifierenunasdeotras,diferenciándose lasdosisoformasHaDAGAT1sdeHaDAGAT2.  HaLPAAT1yHaLPAAT2presentanuntamañode385y382aminoácidos, respectivamente,conpesosmolecularesestimadosentornoa43kDaypuntos isoeléctricosprácticamenteidénticos,delordende10(Resultados,1.2.1,Tabla 17).Estaspropiedadesfisicoquímicasestánenconsonanciaconlashalladaspara lamayoríadeLPATsmicrosomalesdeplantasdescritashastalafecha(Brownet al.1994;Brownetal.1995;Knutzonetal.,1995;Kimetal.,2005;Chenetal., 2012;Arroyo‐Caroetal.,2013).  HaDAGAT1AyHaDAGAT1B,porsuparte,presentanuntamañode479y506 aminoácidos,respectivamente,conpesosmolecularesestimadosentornoa56 kDaypuntosisoeléctricosdelordende9.HaDAGAT2,sinembargo,presentaun tamañode336aminoácidos,menorenrelaciónaHaDAGAT1s,conpeso molecularestimadode38.09kDaypuntoisoeléctricode10(Resultados,2.2.1 Discusión  262 Apesardeestasdiferencias,existenresiduosaltamenteconservadosenla mayoríadeDGATsdescritasquesecreenseresencialesparalaactividad catalíticadeéstas(Cao,2011).Porunladoseobservanunresiduodeprolina(P) quesecorresponderíaconP250,P276yP165enHaDAGAT1A,HaDAGAT1By HaDAGAT2,respectivamente,yunresiduodefenilalanina(F)seguidodeun residuodeglicina(G)altamenteconservadoquesecorresponderíaconF345, F371yF239enHaDAGAT1A,HaDAGAT1ByHaDAGAT2(Resultados,2.2.3,Figuras 39y40).Existeademásotroresiduodeprolina(P),conexcepcióndeDGAT2de Ostreococcustauri,quesecorresponderíaconP412,P438yP290en HaDAGAT1A,HaDAGAT1ByHaDAGAT2(Resultados,2.2.3,Figuras39y40).  ElalineamientoaminoacídicodeHaDAGAT1sconotrasDGAT1s(Resultados, 2.2.3,Figura39)muestraungrandominioconservadopertenecienteala superfamiliadelasO‐aciltransferasasdeuniónamembrana(MBOAT)delaque formanparte(Casesetal.,1998;Hofmann,2000;Turkishetal.,2005;Wagnery Daum,2005;Yenetal.,2005;Marchler‐Bauereta.,2015).Igualmentese encuentranhastasieteregionesaltamenteconservadas(I‐VII)halladasen diversosorganismos(Cao,2011),delascualesseis,I‐VI,quedanembebidasenel dominioMBOAT(Resultados,2.2.3,Figura39).Encuantoalosmotivos funcionales,quedanperfectamentedefinidosalgunoscomunesaestafamiliay otrosexclusivosdeDGAT(Bouvier‐Navéetal.,2000;Guoetal.,2001;Ilaiyarajaet al.,2008;Yenetal.,2008;Shindouetal.,2009;Turchetto‐Zoletetal.,2011;Liuet al.,2012).Enconcreto,losmotivosRXXXE(I),HXXXD(II)yHXXXXD(IV‐V)estarían implicadosenelsitioactivodelaenzima,mientrasquelosmotivosFYXDWWN (V)yHXXXXRHXXXP(V)loestaríanenlaunióndesustratosacil‐CoAsy DAG/forbol,respectivamente(Resultados,2.2.3,Figura39).Porotrolado,existen datosqueapuntanaquelassecuenciasaminoacídicasKESPLSSDAIFKQSHAGLF(II) ySRLIIEN(III)(Resultados,2.2.3,Figura39),pudierandesempeñarpapelesclaveen launiónaacil‐CoAsysitioactivodelaenzima,respectivamente.Inclusoseha postuladounmecanismodeacciónsimilaralosresiduosdehistidina(H)yácido aspártico(D)encontradosenGPATsyLPATsparalosresiduosdearginina(R)y ácidoglutámico(E)presentesenSRLIIEN(III)(Jakoetal.,2001;Milcampsetal., 2005).  Discusión  263 Destacaasuvezlapresenciadeunacremalleradeleucinaformadapor5 residuosdeleucina(L)consecutivos,separadosentresíporseisaminoácidos (LX6LX6LX6LX6L)(I‐II)(Resultados,2.2.3,Figura39),ademásdemúltiplessitiosde fosforilaciónalolargodelassecuencias,aunquenoestádeltodoclarosiestas regionessonimportantesenlafunción,estructuraoregulacióndeestasenzimas invivo.EstacremalleradeleucinaestápresenteenungrannúmerodeDGAT1s deplantasperonodeanimales(Hobbsetal.,1999;Bouvier‐Navéetal.,2000; Nykiforuketal.,2002;LungyWeselake,2006).Estaregióncoincideademáscon unmotivodeuniónaproteínasimplicadaseneltransporteatravésde membrana,habiéndosepropuestoqueestaregióndelaenzimapodría interaccionarconproteínastransportadorasdesustratosacil‐CoAs(ACBPs,acil‐ CoAsbindingproteins)(Heetal.,2004a).Encuantoalossitiosdefosforilación, éstosestánigualmentepresentesenDGAT1sysondemuyvariadanaturaleza, encontrándosesitiosdelaproteínquinasaC,caseínquinasaIIytirosínquinasa (Hobbetal.,1999;Nykiforuketal.,2002;Heetal.,2004a;Guihéneufetal., 2011),solapandoesteúltimositioconelmotivoFYXDWWN(V)previamente discutidocomosupuestositiodeuniónacil‐CoA.Algunosestudioshanprobadola funcionalidaddeestossitiosmediantesustitucionesaminoacídicas,conla consecuentedisminucióndelaafinidadporsustratos(Guoetal.,2001;Thuilleet al.,2005).Recientemente,Lopesetal.,2014handadounpasomáshaciael entendimientodelasinteraccionesdeestosmotivosconsussupuestossustratos: usandopéptidossintéticoscorrespondientesalossitiosdeunióndeDGAT1shan probadocomounodeellos,aquelqueincluíaelmotivoFYXDWWN,cambiabasu conformaciónenpresenciadeacil‐CoAs,loquesugieresucapacidaddeunióna estossustratos.LaregulacióndelaactividadDGAT1atravésdefosforilaciónes convincentenosóloporserésteunmecanismocomúndecontroldeactividad enzimáticaeneucariotassinotambiénporqueDGATpuede“secuestrar”DAG, unamoléculaimportanteimplicadaencascadasdeseñalizacióndefosforilación (CarrascoyMerida,2007).  Porúltimo,seobservaenelextremoN‐terminaldeDGAT1sunclústerde argininasaltamenteconservado(RRR)ylasecuenciaYYHD(L/V)MN(VII)cercana alextremoC‐terminaldelasmismas(Resultados,2.2.3,Figura39),loscuálesserán Discusión  264 objetodediscusiónmásadelante,debidoasusposiblesimplicacionesenla localizaciónsubcelulardeestasenzimas.  ElalineamientoaminoacídicodeHaDAGAT2conotrasDGAT2s(Resultados,2.2.3, Figura40)muestraungrandominioconservadocaracterísticodelafamiliade lisofosfolípidoaciltransferasas(LPLATs)deltipoMGAT,implicadasenla biosíntesisdeglicerofosfolípidos(Yenetal.,2002;Kroonetal.,2006;Lungy Weselake,2006;Marchler‐Bauereta.,2015).Englobadasenestedominiose encuentranhastaseisregionesaltamenteconservadas(I‐VI)(Resultados,2.2.3, Figura40)halladasendiversosorganismos(Stoneetal.,2006;Cao,2011; Turchetto‐Zoletetal.,2011),entredosdelascuales,IyIII,aparecendiversos residuosaminoacídicosqueconformaríanunsupuestobolsillodeuniónaacilos (Cao,2011).Encuantoalosmotivosfuncionales,quedanperfectamente definidosalgunosdeelloscomoFFP,EPHS(I)yRKGFVRLAMETNSPLVPVFGFGQ (IV‐V),implicadosdealgunamaneraenlaactividadenzimáticadeDGAT2s(Liuet al.,2011).Enestecasopocoseconocesobreelpapelespecíficoquepudieran desempeñarestosmotivos.ElmotivoFFPrepresentaunavariacióndela secuenciaconsensoYFP,conservadaenanimales,plantas,algasylevaduras(Cao, 2011;ChenySmith,2012),mientrasquelasecuenciaEPHS(I),conservadaen DGAT2deplantas(Turchetto‐Zoletetal.,2011),equivaldríaalasecuencia consensoHPHGdeDGAT2sdeanimalesyhongos,lacualesreconocidacomo dominiodeuniónalípidoneutro(Stoneetal.,2006).Estosdosmotivosaparecen igualmenteenalgas,peseamostrarciertasvariaciones(ChenySmith,2012).  Finalmente,lasecuenciaLQLRIMpresenteenelextremoC‐terminalde HaDAGAT2(Resultados,2.2.3,Figura40),seráobjetodediscusiónmásadelante, debidoasuposibleimplicaciónenlalocalizaciónsubcelulardeestaenzima.  Enresumen,yapesardelasdiferenciasanteriormentediscutidas,hoydíase asumequeeldominiocatalíticodeDGATssesitúaenelextremoC‐terminal, mientrasqueeldominioreguladordescansasobreelextremoN‐terminal,elcuál pudieraigualmenteserresponsabledelasdistintasespecificidadesporsustrato deestasenzimasdebidoasufaltadehomologíaentresussecuencias aminoacídicas. Discusión  265 Porúltimo,comocuriosidad,ningunodelosmotivosoresiduosaltamente conservadosenlasfamiliasDGAT1syDGAT2sestánpresentesenDGAT3sy DGAT4s.Estadivergenciadesecuenciasescontrariaalacreenciageneraldeque lossitiosactivosdelasenzimasquecatalizanlasmismasosimilaresreacciones bioquímicasdeberíanposeerciertogradodeconservacióndurantelaevolución (Cahoonetal.,2007).  1.3.2Estudiocomparativodedominiostransmembrana(TMDs)  Losdominiostransmembrana(TMDs)deHaLPAATsyHaDAGATssedeterminaron enbasealosresultadosobtenidosporelprogramabioinformáticodepredicción TMHMM2.0.  Deestamanerasepudoestimarlapresenciadealmenostresdominios transmembranaparaambasHaLPAATs(Resultados,1.2.3,Figura28),en consonanciaconLPATsdeE.coli,levadurasyBrassicanapus(Bourgisetal., 1999).Noobstante,otrosprogramasdeprediccióndeTMDsdeterminanhasta cuatrodominiostransmembranaparaHaLPAATs,aligualqueparaLPATs mitocondrialesdehumanos,ovejasyvacas(MistryyMedrano,2002;Yamashita etal.,2007),AtLPAT2yAtLPAT3deA.thaliana(KimyHuang,2004;Kimetal., 2005)ycacahuete(Chenetal.,2012).Porelcontrario,LPATmicrosomaldecoco presentatansólodosdominiostransmembrana(Knutzonetal.,1995),aligual queLPAT3dehumanos(Schmidtetal.,2010),loquehacenecesariorevisary compararconmayorexactitudlosprogramasdeprediccióndeestosdominios.  EnelcasodelasHaDAGATs,hubodisparidadenelnúmerodeTMDs. HaDAGAT1Apresentaochodominios,nueveparaHaDAGAT1Bytansólodos paraHaDAGAT2(Resultados,2.2.3Figura41).Estudiosenplantashanmostrado queDGAT1sdeBrassicajuncea(Illaiyarajaetal.,2008),Echium(Manas‐ Fernándezetal.,2009)yHelianthusannuus(Sunetal.,2011)poseennueve dominiostransmembrana,aligualqueDGAT1sdeArabidopsisthaliana,ricino (Ricinuscomunis),soja(Glycinemax)yarroz(Oryzasativa),entreotras (Turchetto‐Zoletetal.,2011).Noobstante,otrosautoreshacenreferenciaadiez deestosdominioscuandoestudianalgunasdelasDGAT1syacitadas,DGAT1del Discusión  266 árboldetung(Verniciafordii)incluida(Shockeyetal.,2006).DGAT2sdeestas plantas,sinembargo,coincidenenposeertansólodosdominiostransmembrana (Shockeyetal.,2006;Turchetto‐Zoletetal.,2011),aligualqueDGAT2de Brassicajuncea(Illaiyarajaetal.,2008),sibienDga1pdeS.cerevisiaeposee cuatroTMDs(Liuetal.,2011).Engeneral,DGAT1spresentanmayorvariaciónen elnúmerodedominiostransmembrana(6‐10)mientrasqueDGAT2spresentan másconsenso(1‐2)(Liuetal.,2012).Lasdiferenciashalladasenelnúmerode TMDsentreDGAT1syDGAT2sindicaríanasuvezdiferenciasencuantoasus topologíasy,enconsecuencia,condiferentespapelesfisiológicos(Yenetal., 2008;Holmes,2010).  1.4LOCALIZACIÓNSUBCELULARDEHaLPAATsYHaDAGATs  Ennuestrotrabajo,lalocalizaciónsubcelulardeHaLPAATsyHaDAGATsse determinóenbasealosresultadosobtenidosporlosprogramasbioinformáticos depredicciónProtComp9.0yWoLFPSORT.  Todasestasprediccionescoincidieronenseñalaralasaciltransferasasestudiadas comoproteínasintegralesdemembrana,formandopartedelRE(Resultados, 1.2.3y2.2.3).Además,losaltosporcentajesdehidrofobicidadeinsolubilidad característicosdeestasaciltransferasas(Discusión,1.1),asícomolapresenciade dominiostransmembranas(Discusión,1.3.2)refutanaúnmáslalocalizaciónde estasenzimasendichocompartimento.  Porotrolado,aligualquelamayoríadelasaciltransferasasmicrosomales previamenteidentificadas,HaLPAATsyHaDAGATsnopresentanpéptidosseñales detránsitoalretículoendoplásmico(RE),sibienpresentanotrassecuencias relacionadasconesteorgánulo.  HaLPAATspresentanunprimerdominiotransmembranalocalizado aproximadamenteenlaposición4‐27desusextremosN‐terminalquepudieran serconsideradossupuestassecuenciashidrofóbicasdeanclajedetipoII (Resultados,1.2.3,Figura28).Estassecuenciasactuaríaninsertandoalasenzimas demaneracotranslacional,ynopost‐translacional,alasmembranasdelRE Discusión  267 medianteunmecanismodependientedelapartículadereconocimientodeseñal, SRP(McCartneyetal.,2004).Estemecanismodeinserciónpareceocurrir tambiénenloscasosdeFAD2yFAD3,dosenzimaslocalizadasexclusivamenteen elretículoendoplasmático,hechorefutadoatravésdeanálisisbioquímicosy estudiosdeinmunolocalización(DyeryMullen,2001,2008).  HaDAGATsnoparecenposeerestassecuenciashidrofóbicasdeanclaje,sibiense asumequesoninsertadasalREtambiénmedianteestemecanismodependiente deSRP.Noobstante,sehapodidoconstatarlapresenciadeciertassecuencias aminoacídicasconservadasensusextremos.Porunlado,seobservalapresencia delyacitadoclústerdeargininasaltamenteconservado(RRR)enlosextremosN‐ terminaldeHaDAGAT1s,posiblementeimplicadonosóloenlalocalización subcelulardeéstasenREsinotambiénensuretenciónendichocompartimento (Michelsenetal.,2005;Boulaflousetal.,2009;Liuetal.,2012).Porotrolado, aparecenensusextremosC‐terminalsecuenciasquepudieranreconocersecomo señalderetornoalRE(McCartneyetal.,2004):YYHDV(L/V)MN(VII)enelcasode HaDAGAT1s(Resultados,2.2.3,Figura39)yLQLRIMenelcasodeHaDAGAT2 (Resultados,2.2.3,Figura40),porhomologíaconlasencontradasenDGAT1y DGAT2deotrasplantas(Kroonetal.,2006;Shockeyetal.,2006).Estas secuenciasderetornonoaparecenconservadasenDGATsdeanimalesyhongos pesealocalizarsetambiénenelRE(Cao,2011).  Bajoestossupuestos,HaLPAATsseríaninicialmentedirigidasalretículo endoplasmáticoporinsercióncotranslacionalenlasmembranasdelretículo,sin señalesderetornoalREensuextremoC‐terminalquelodevuelvanaeste orgánulodesdeelaparatodeGolgi.Encambio,HaDAGATsnopresentarían insercióncotranslacionalaparenteperosíseñalesderetornoalREensuextremo C‐terminal.       Discusión  268 1.4.1Localizaciónensubdominiosyrelaciónconotroselementos  Engeneral,existennumerosasevidenciasquerelacionanestasenzimasconla fracciónmicrosomal,indicativodesurelaciónconmembranas.Lamayoríade estasevidenciassebasanenelusodeestetipodefraccionesenensayosde actividadinvitro.Igualmente,lainmunolocalizaciónpermiteconfirmarla asociacióndeestasenzimasalretículoendoplasmático,comoasíocurrieseen algunoscasosdeLPATsdeplantas(Brownetal.,2002;Kimetal.,2005)yDGATs (BrowseandSomerville,1991;Shockeyetal.,2006;Stoneetal.,2006;Hernández etal.,2012).  Ennumerososestudios,lalocalizaciónsubcelulardeestasenzimashasidoobjeto dediscrepanciaencuantoasiestáasociadaexclusivamentealretículo endoplasmáticoositambiénloestáacuerposlipídicosuoleosomas(Hsiehy Huang,2004;LungyWeselake,2006;Silotoetal.,2006).Hoydíaexisten evidenciasqueestablecennosólounaasociaciónestrechaentrelabiosíntesisde TAGsylaformacióndecuerposlipídicos(Murphy,2001;Oelkersetal.,2002; Sandageretal.,2002;Czabanyetal.,2008;Guoetal.,2009;Athenstaedty Daum,2011;Wilflingetal.,2013;KlugyDaum,2014;Kochetal.,2014),sino tambiénunalocalizaciónespacio‐temporaldeestasenzimasendiferentes subdominiosespecializadosenestafuncióndentrodelRE(DyeryMullen,2008). Estefenómenodecompartimentaciónesentendidocomounmecanismo adicionalmásadoptadoporlascélulasvegetalesparacontrolarlaproducciónde aceitedeentretodoslosmecanismosdescritoshastalafechaquerelacionan diferentessubdominioscondistintasfuncionesbioquímicasdentrodeeste compartimento(Staehelin,1997;LevineyRabouille,2005).Ejemplosdeesta compartimentaciónlosencontramosenLPATsdeArabidopsis(Kimetal.,2005)y DGATsdeVerniciafordii(Shockeyetal.,2006).Enesteúltimocaso,cabe destacarqueVfDGAT1selocalizaenregionesdistintasaVfDGAT2,loquesugiere queestasdosenzimasproducendiferentespoolsdeTAGsdentrodelRE.Sin embargo,losmecanismosmolecularesqueconducenaestacompartimentación yasociaciónnoseconocenconexactitud.Dehecho,losmotivosderetornoaRE presentesenVfDGTAssonnecesariosysuficientesparasupermanenciaenelRE, peroinsuficientesparalocalizarlasenestossubdominios(McCartneyetal.,2004; Discusión  269 Shockeyetal.,2006),porloquedebehaberotrasregionesensussecuenciasy/o mecanismosimplicadosparatalfin.Elreclutamientodeotrasproteínas adicionalestalescomooleosinaspudieraaportaresamaquinariaadicionalque permitalaproducciónespecializadadeTAGsasociadaaoleosomas.Enrelacióna esto,sehacomprobadocomolapresenciadetresprolinas(P)conservadasen DGAT2deratónlocalizadasenlapequeñaregiónflanqueadaporlosdos dominiostransmembranacaracterísticosdeestasenzimas,asícomola disposicióndesusextremosN‐yC‐terminalhaciaelladocitoplasmáticodelRE, estánrelacionadosconlaformacióndecuerposlipídicosmediadaporestas proteínas(Stoneetal.,2009).Enplantas,sehaverificadoigualmentela asociacióndirectaentreDGAT1yDGAT2deArabidopsisylaformaciónde oleosomas(Bouvier‐Naveetal.,2000;Kwiatkowskaetal.,2012;Ayméetal., 2014).Otromecanismoporelcualestasenzimassepudieranagruparen regionesespecíficasdelRE,ademásdeserunprerrequisitoparallevaracabosu actividadenzimática,seríasuoligomerizaciónhomotópica.Ejemplosdeestolo encontramosenratón(McFieetal.,2010),humanos(Chengetal.,2001;Yenet al.,2008)yBrassicanapus(Wesealkeetal.,2006;Caldoetal.,2015),cuyas DGAT1spuedenllegaraformarhomodímerosy/ohomotetrámeros.Deeste modo,laoligomerizacióndeDGATsdeplantasestaríatambiénimplicadaenla regulacióndesusactividades,comosedemuestraenlosexperimentosllevadosa caboporMcFieetal.,2010enDGAT1deratón.Porúltimo,elreclutamientode otrasaciltransferasaspudieracontribuiradichacompartimentacióneinclusoala formacióndeheterooligómerosentreéstas,posibilidadqueestásiendo investigadaenlaactualidad.Noobstante,laaparenteincapacidaddeinteractuar entreDGAT1yDGAT2resultaríaensímismounmecanismodesegregación espacialdeestasenzimas,favoreciendoasílaproduccióndelosdiferentespools deTAGscomentadosanteriormente(Thaminyetal.,2004).  Finalmente,mencionarquetodosestosmecanismosqueparecenocurriral mismotiempoestánrelacionadosconsecuenciaslocalizadasenelextremoN‐ terminaldeestasenzimas,elcualfuepropuestonosólocomoclaveenla especificidaddesustrato,sinotambiénenlapropiaconformacióny/oregulación desusactividadesenzimáticas(Discusión,1.3.1).  Discusión  270 1.5ESTUDIOCOMPARATIVODEMODELOSTOPOLÓGICOSDEHaLPAATsYHaDAGATs  Enesteestudio,sehanpostuladounaseriedemodelostopológicospara HaLPAATsyHaDAGATsbasadosenlarecopilacióndelosdatosobtenidosenlos apartadosanteriores:presenciademotivosconservadosydominios transmembrana(TMDs),asícomolalocalizaciónsubcelulardeestasenzimasen elretículoendoplasmático.  Enbaseaesto,losmodelostopológicospropuestosparaambasHaLPAATs presentaríanalmenostresdominiostransmembranas,loquesituaríalos extremosN‐terminalenelladocitosólico,mientrasqueprácticamenteelresto delasenzimassehallaríanenellumendelRE,incluyendolosextremosC‐ terminal.Noobstante,comoyacomentamos,otrosprogramasdepredicciónde TMDsproponenuncuartodominiotransmembranaparalasHaLPAATs, localizadoaproximadamenteenlaposición46‐73conrespectoalextremoN‐ terminalparaHaLPAAT1yenlaposición45‐71paraHaLPAAT2.Deestamanera, lascuatroregionesaltamenteconservadas(I‐IV)consupuestasfunciones catalíticasestaríanexpuestashaciaelcitosol,aligualquelosextremosN‐ yC‐ terminal(Figura58).EstosmodelospropuestosparaHaLPAATscoincidenen númerodeTMDsconlosplanteadosparaLPATsmitocondrialesdehumanos, ovejasyvacas(MistryyMedrano,2002;Yamashitaetal.,2007),asícomoconlos propuestosparaAtLPAT2yAtLPAT3deA.thaliana(KimyHuang,2004;Kimetal., 2005),cacahuete(Chenetal.,2012).Porelcontrario,LPATsdeE.coli,levaduras yBrassicanapuscontendríanalmenostresdeestosdominios(Bourgisetal., 1999;Pagacetal.,2011),mientrasqueLPATdecocotansólotendríados (Knutzonetal.,1995),aligualqueLPAT3dehumanos(Schmidtetal.,2010).  EnelcasodelosmodelospropuestosparaHaDAGAT1s,éstosdifieren básicamenteenelnúmerodedominiostransmembrana,ochoparaHaDAGAT1A ynueveparaHaDAGAT1B.Deestamanera,losextremosN‐terminalestarían situadosenelcitosol,aligualqueprácticamenteelrestodelasenzimas,con excepcióndelextremoC‐terminaldeHaDAGAT1B,quesesituaríahaciaellumen delRE;algunasdelassieteregionesaltamenteconservadas(I‐VII)aparecerían solapándoseconalgunosTMDs(Figura58).Estosmodelospropuestospara Discusión  271 HaDAGAT1sdifierensustancialmentedelospropuestosparaDGAT1sdeVernicia fordii(Shockeyetal.,2006)yderatón(McFieetal.,2010),sibientodos coincidenensituarelextremoN‐terminalhaciaelladocitosólicodelRE,hecho probadoexperimentalmenteenDGAT1deBrassicanapus(Weselakeetal., 2006).  Porúltimo,elmodelopropuestoparaHaDAGAT2presentaríadosdominios transmembranasituadosenelextremoN‐terminal,loquesituaríaaambos extremosenelladocitosólicodelRE.Deestamanera,lascuatroregiones altamenteconservadas(I‐IV)consupuestasfuncionescatalíticasestarían igualmenteexpuestashaciaelcitosol(Figura58).Estemodelopropuestopara HaDAGAT2seasemejaalpropuestoparaDGAT2deVerniciafordii(Shockeyet al.,2006).EnelcasodeDGAT2deratón,aúnnosehadeterminadoconexactitud sidichaenzimapresentadosdominiostransmembranaestrechamenteasociados ounasolaregiónhidrofóbicaembebidaenlamembranadelRE(Stoneetal., 2006),mientrasqueelmodelotopológicopropuestoparaDGAT2delevaduras presentaríahastacuatroTMDs(Liuetal.,2011).Noobstante,todoslos anterioresmodelospropuestoscoincidenensituarambosextremosdeDGAT2s haciaelcitosol.  Engeneral,laincapacidaddepurificardebidamenteestasenzimas,hecho discutidoaliniciodeDiscusión,1.3,hacequelastécnicasempleadassean insuficientesparadeterminarconexactitudlosmodelostopológicosdeestas enzimasintegralesdemembranay,endefinitiva,elentendimientodesu contextometabólico. Discusión  278 2.1.1Nivelcantidad  2.1.2Nivelcalidad  Encuantoalaespecificidadporsustrato,lasLPAATshanmostradounagran variabilidad(Knutzonetal.,1995;Lassneretal.,1995;Brownetal.,2002a, 2002b).Engeneral,LPAATpresentamayorespecificidadporoleil‐CoAylinoleil‐ CoAynoincorporaAGssaturados;losVLCFAssongeneralmenteexcluidosdela posicióncentralsn‐2(Frentzen,1993;Voelkeretal.,1996).Noobstante,en aquellasespeciesvegetalescuyosaceitesposeenciertascantidadesdeAGs inusualesenlaposiciónsn‐2,existenLPAATsadicionalesconpreferenciapor estossustratos(Caoetal.,1990;LaurentyHuang,1992;Brownetal.,1995; Frentzen,1998).  LosestudiospreviosalaislamientodeLPAATsehabíanconcentradoenla purificaciónproteicayenlosensayosenzimáticos.Estoesmuchomásdifícilpara enzimasunidasamembranaporqueimplicalasolubilización,enlacual,la actividadenzimáticapuedeserperdidarápidamente,ylareconstituciónen vesículasdemembranaparaensayarbiológicamentelaactividad.Conla clonaciónporcomplementación,estosobstáculosfueroneliminadosyla actividadpudoserdirectamenteensayadaenlasmembranasdeE.coli,que contienenpocaactividadendógena.  LaLPAATdelendospermoinmadurodecoco(Cocosnucífera)fuepurificaday tuvocomosustratosacilosdecadenamedia(Daviesetal.1995).Utilizandolas secuenciasparcialesdeaminoácidosdelaproteínapurificada,seobtuvieronlos clonesdecDNArespectivos(Knutzonetal.1995).Porotrolado,losclonesde cDNAdelaLPAATespecíficade22:1‐CoAdeL.douglasii(Brownetal.1995; Hankeetal.1995)hansidoaisladosmediantecomplementaciónconelmutante deE.coli.    Discusión  279 Losestudiosenzimológicosinicialesconsistieronenladeterminacióndela especificidadporsustratodelaLPAATdemicrosomasdediferentesespeciesde plantas,usandodiferentescombinacionesdedonadoresydeaceptores.Enla mayoríadeloscultivostradicionalesdesemillasoleaginosas,comolassemillas decolza,esteenzimamanifiestaespecificidadesporsustratotípicasdelasLPAAT microsomalesimplicadasenlasíntesisdelípidosdemembrana:preferentemente dirigeinsaturadosC18alaposiciónsn‐2,yexcluyealosácidosgrasosinusuales como22:1y12:0deestaposición(Frentzen,1993;Voelkeretal.1996).Como consecuencia,debidoalaspropiedadesdeestasLPAAT,seprevienelaformación detriacilglicéridosconunacomposiciónhomogéneadeácidosgrasoscomola trierucinaolatrilaurina.  Encontrasteconlaenzimadecolza,lasLPAATsmicrosomalesexpresadas específicamenteensemillasdeciertasespeciesdeplantaspuedenincorporarde unamaneraefectivagruposaciloinusualesenlaposiciónsn‐2delTAG.Porlo tanto,losgenesquecodificanparaLPAATsespecíficasdesemillasparecenserlos apropiadosparamejorarlasaplicacionesindustrialesdelaceitedesemillasa partirdecultivosdesemillasoleaginosastradicionalesporingenieríagenética. Porello,variosgrupos,utilizandodiferentesestrategiasymétodos,hanhecho grandesesfuerzosparaclonarlaLPAAT.  VariosgruposhanestadointeresadosenclonarlaLPAATdeLimnanthessp.con elpropósitodetransformarlaenB.napus,alterandoasílaproporcióndeácido erúcicoenlaposiciónsn‐2delamoléculadeTAGeincrementandoel rendimientodeácidoerúcico.SehanaisladodoscDNAsdiferentesquecodifican paraLPAATsapartirdeunalibreríadecDNAdeL.douglasii,llamadasLAT1 (Limnanthesaciltransferasa1)yLTA2(Brownetal.1995).ElcDNAdeLAT2fue aisladodemaneraindependienteporHankeetal.(1995)yporLassneretal. (1995).Esteenzimaescapazdeincorporarácidoerúcicoenlaposiciónsn‐2de LPAaaltavelocidad.Brownetal.,2002caracterizaronestasdosLPATs..ElcDNA aisladodecoco(Knutzonetal.1995)tuvounafuertehomologíaconlasecuencia delaLAT2.   Discusión  280 2.2HaDAGATs  ParaHaDAGAT1ssehatestadosuactividaddirectaenlaformacióndeTAGsenel casodeexpresiónheterólogaenestirpecuádruplemutanteH1246deS. cerevisiaeysuefectoindirectoenlaformacióndeTAGsenelcasodeexpresión funcionalenlíneamutanteAS11(dgat1)deA.thaliana,quenodejadetener DGAT2funcional,porloqueseríacomplementariedad.  ParaHaDAGAT2sehatestadosuactividaddirectaenlaformacióndeTAGsenel casodeexpresiónheterólogaenestirpecuádruplemutanteH1246deS. cerevisiaeysusobreexpresiónenlaformacióndeTAGsenelcasodeexpresión funcionalenlíneamutanteAS11(dgat1)deA.thaliana,quenodejadetener DGAT2funcionalapesardetenermutadaDGAT1.  NosedetectaactividadensayadainvitroHaDAGAT2;posiblesrazones:  1. AligualqueocurreconotrasDGAT2s,nosepuededetectarinvitro porquenoseestáexpresandoonoseestáconfigurandobienlaenzima activa.Estopuedeserdebidoaquelaenzimanecesitedeotrasproteínas parallevaracabosuactividad,ACPs,porejemplo.Sinembargo, HaDAGAT2seexpresaenH1246,curvadecrecimientocercanaaWT, aumentanlosTAGsydisminuyenlosDAGsenrelaciónaestirpeH1246 conysinplásmidopYES2vacío(controles)invivo,locualnosllevaauna segundahipótesis.  2. RealmenteHaDAGAT2estáactiva,peronohemosensayadoconlos sustratospertinentesparalosqueHaDAGAT2presentaactividad.DGAT2s deplantaspudierandesempeñarpapelenincorporacióndeAGsinusuales enTAGsenaquellasplantasqueacumulanestetipodeAGsensusTAGsy quepudieraserquegirasolseaunadeestasespecies,acumulando linoleico,50‐70%deltotal.Dehecho,algoasíocurreconVgDGAT2,muy relacionadafilogenéticamenteconHelianthusannuus,perteneciendoa mismafamiliaAsteráceas.  Discusión  281 3. LaactividadDGAT2seestádesviandoacuerposlipídicos,comoyaocurre conDga1p:Dga1pactivityinS.cerevisiaelocalizestotheERandlipid droplets(SorgeryDaum,2002).  HaDAGAT2parecejugarpapelimportanteenbiosíntesisdeTAGsengirasol,a raízdeloobservadoalestudiarsuexpresiónensemillasendesarrollo(RT‐PCR,la quemás).Sinembargo,ypeseatenerunaaltaexpresiónyaumentarlatasade crecimientoenS.cerevisiae(curvacrecimiento,laquemáspordebajodeH1246‐ SC‐ALL),nosehanobtenidomedidasdeactividadalguna…Hayqueteneren cuentaquesucurvadepHnoreflejaningúnpHóptimooque,almenos,elpH elegidoparalosensayosdeactividadnolofavorecían.Puedequetambiénsea porquenotieneafinidadalgunaporlossustratosadministrados,dioleínay/o oleico/esteárico…Recordarqueaceitedegirasolnosecaracterizaprecisamente porestaespeciedeTAGyquesuácidograsomásrepresentativoesellinoleico… Igualmenteesimportantelosresultadosobtenidosapartirdelanálisisfuncional detransgénicosA.thaliana.  Ennuestroestudio,sehacomprobadoqueHaDAGATstienenactividaden formacióndeTAGsapartirdeDAGsyacil‐CoAscomodonadordeacilos.Hay DGATsquesonmultifuncionales,másquenadaenmicroorganismosy mamíferos,conactividadACATyMGAT..SedescartaactividadMGATalanalizar losDAGs,quedisminuyencuandorealizamosanálisisinvivoynoaumentan comopudieraesperarsedeunasupuestaactividadMGAT.Sedescartatambién actividadACATpuesnoseobservasíntesisdeesteroles(SE)enplacasdeTLC..La simplehomologíasecuencialnoessuficienteparasostenerlafuncionalidadreal delproductodeungen(Kroonetal.,2006).  2.2.1Nivelcantidad  Enlamayoríadelasespeciesdeplantas,DAGAT1parecejugarunpapelmás importanteenlaacumulacióndeaceitedesemillas(Lietal.,2010a).Enlas plantas,laacumulacióndeácidosgrasosinusuales,DAGAT2parecetenerun papelmásimportanteenlaincorporacióndeestosácidosgrasosinusualesen TAG(Lietal.,2010a). Discusión  282 Comohemoscomentadoanteriormente,existeunconsensoencuantoalpapel clavequetieneDGATenlabiosíntesisdeTAG,especialmenteensemillas.Sin embargo,noseconoceconexactitudelpesoqueunouotrotipodeDGATejerce sobredichabiosíntesis.  Haydatosquesostienenque,enmamíferos(ratas,ratonesyhumanos),elgrueso delabiosíntesisdeTAG,especialmenteenlosórganosespecializadoshígadoy tejidoadiposo,lollevaacaboDAGAT2(Turkishetal.,2005;Yenetal.,2005).Más aún,ratonesmutantescarentesdeactividadDGAT1sedesarrollancontotal normalidadypresentannivelesséricosdeTAGcompletamentenormales, mientrasqueratonescarentesdeactividadDGAT2muerenprematuramente (Turkishetal.,2005).  Enlevadura,Dga1p,laproteínahomólogaaDGAT2,estambiénlaquecontribuye enmayormedidaalabiosíntesisdeTAGentantoquelasproteínasAre1py Are2p,homólogasaDAGAT1,sonresponsablesdelabiosíntesisdeésteresde esteroles,conunaintervenciónleveenlabiosíntesisdeTAG(Oelkersetal.,2002; Sandageretal.,2002;SorgeryDaum,2003;Turkishetal.,2005;WagneryDaum, 2005;Yenetal.,2005).  Enplantaslasituaciónesalgodistintaymenosclara.EnArabidopsisseha observadoquelamutacióndga1(mutanteAS11)produceunareducción significativadeTAGsensemillasyunaalteracióndelperfildeácidosgrasosdelos TAGs(Katavicetal.,1995;Zouetal.,1999;Routabouletal.,1999;Jakoetal., 2001;Mhaskeetal.,2005),acumulandosóloel55‐75%deTAGsensemillascon respectoalalíneasilvestre(Katavicetal.,1995;Routabouletal.,1999).No obstante,elhechodequeelmutantepuedasintetizarlamitadomásdesu contenidonormaldeTAGssugierelaexistenciadeotrosmecanismosimplicados enlabiosíntesisdeTAGs(LuyHills,2002).Análogamente,entabaco,el silenciamientopostranscripcionaldeDAGAT1provocaunareduccióndeTAGsen semillasyenotrotejidos(Zhangetal.,2005).Porsuparte,lasobreexpresiónde DGAT1enArabidopsishizoqueaumentaseladeposicióndeaceiteensemillay, enconsecuencia,supeso(Jakoetal.,2001).ElpatróndeexpresióndeDGAT1en Arabidopsisesrelativamenteubicuo,peroconunmáximodeactividaden Discusión  283 semillasendesarrollo,dondetambiénesmáximalapresenciadelaproteína DGAT1(Luetal.,2003).Enconcretoseestimaquealmenosel50%dela biosíntesisdeTAGensemillasesatribuibleaDGAT1(Katavicetal.,1995; Routabouletal.,1999;Luetal.,2003).Finalmente,sehaobservadoquela abundanciadeDGAT1estácorrelacionadaconlacantidaddeTAGensemillasen desarrollo(Nykiforuketal.,2002;Luetal.,2003).Estudiosdecomplementación génicadeAtDGAT1yAtDGAT2enlaestirpemutanteH1246deS.cerevisiae revelóqueAtDGAT1fuecapazderestablecerlasíntesisdeTAGsmientrasque AtDGAT2no(Zhangetal.,2009).  Porotraparte,enárboldetung(Verniciafordii),DGAT2pareceserla responsabledelaproduccióndelaceitetípicodeV.fordiiricoenácido eleoesteárico(Shockeyetal.,2006).Sinembargo,curiosamente,invitro, VfDGAT2esmenosactivaqueVfDGAT1y,enlevadurastransformadas,se observaquelascepastransformadasconVfDGAT1producemásTAGsquelas transformadasconVfDGAT2(Shockeyetal.,2006).  Enricino,sehanhechoestudiossimilaresquesugierencomoprobablemente DGAT2sealacontribuyenteprincipalalabiosíntesisdeTAGensemillas(Kroonet al.,2006).Sinembargo,estudiosdecomplementacióngénicadeRcDGAT2enla estirpemutanteH1246deS.cerevisiaenofuecapazderestablecerlasíntesisde TAGs,mientrasqueRcDGAT1sí(Turchetto‐Zoletetal.,2011).  TantoDAGAT1yDAGAT2sehansobreexpresadoconéxitoencultivosconidea deaumentarelcontenidodeaceitedelasemilla.ElmutantedeArabidopsisAS11 tieneunamutacióninducidaporetilmetanosulfonato(EMS),loqueproducela modificaciónenlacomposicióndeácidosgrasosydisminucióndelaactividad DGATycontenidodeTAGenelaceitedelasemilla(Katavicetal.,1995).En comparaciónconeltiposilvestre(WT)deArabidopsis(ecotipoColumbia),el aceitedesemilladeArabidopsisAS11hareducidolacantidaddeácido eicosenoico(20:01cisΔ11)yácidooleico,yelaumentodelosnivelesdeαlinolénico(Katavicetal.,1995).LasobreexpresióndelcDNAdeDAGAT1de ArabidopsisenelmutanteAS11diocomoresultadounaumentoenelcontenido deaceitedesemillasyenelpesomediodelasemilla(Jakoetal.,2001).B.napus, Discusión  284 expresandoDAGAT1deArabidopsisWToBrassicanapusL.cvJetNeuf, mostraronunaumentoenelcontenidodeaceitedesemillacuandoseprueba bajoinvernaderoocondicionesdecampo(Tayloretal,2009;Weselakeetal, 2008).LaexpresióndeDAGAT2delhongodelsuelo(Umbelopsisramanniana)en lasoja(Glycinemax)resultóenunincrementodel1,5%(enpeso)enelcontenido deaceitedesemillasymayorformacióncuerposlipídicosencondicionesde campo(Lardizábaletal.,2008).  Enlamayoríadelasespeciesdeplantas,DAGAT1parecejugarunpapelmás importanteenlaacumulacióndeaceitedesemillas(Lietal.,2010a).Enlas plantas,laacumulacióndeácidosgrasosinusuales,talescomohidroxiyepoxi ácidosgrasos,DAGAT2parecetenerunpapelmásimportanteenla incorporacióndeestosácidosgrasosinusualesenTAG(Lietal.,2010a).Los diferentespatronesdeexpresióndeDAGAT1yDAGAT2enlassemillasen desarrollotambiénpodríantenerunpapelenladeterminacióndelacomposición finaldeácidosgrasosdelaceitedelasemillaenlamadurez.Duranteeldesarrollo desemillasdeárboldetung,laexpresiónDAGAT1seincrementóligeramente, mientrasquelaexpresióndeDAGAT2fuefuertementeinducidaantesdelinicio delaacumulacióndeTAG(Shockeyetal.,2006).LaexpresióndeDAGAT1se correspondeconlabiosíntesisdeTAGendiversostejidos,yDAGAT2pareceestar másdirectamenteimplicadaenlasíntesisdeTAGenlassemillas(Shockeyetal., 2006).Esdifícil,sinembargo,paraextrapolarelpapelreguladordeDAGATde unasespeciesdecultivoaotras.Porejemplo,laactividaddeDAGATtieneuna graninfluenciaenlaformacióndeTAGenelolivo(Oleaeuropaea)yB.napus (Weselakeetal.,2008),perolaactividadDAGATejercesólouncontrolmenor sobrelaformacióndeTAGenlapalma(Elaeisguineensis)(Ramlietal.,2005).Por lotanto,esnecesariaunamejorcomprensióndelaexpresiónylaacciónenzima DAGAT.  Asípues,DGATesconsideradalaenzimaclaveenelcontroldelatasadesíntesis deTAGsensemillasalserresponsabledelúltimopasodelabiosíntesisdeTAGsy noestarimplicadaenladelípidosdemembrana(Ichiharaetal.,1988;Cahoonet al.,2007;Napier,2007;Venegas‐Calerónetal.,2010).Esdifícil,sinembargo, extrapolarelpapelreguladordeDAGATdeunasespeciesdecultivoaotras.Por Discusión  285 ejemplo,laactividaddeDAGATtieneunagraninfluenciaenlaformacióndeTAG enelolivo(Oleaeuropaea)yB.napus(Weselakeetal.,2008),perolaactividad DAGATejercesólouncontrolmenorsobrelaformacióndeTAGenlapalma (Elaeisguineensis)(Ramlietal.,2005).Porlotanto,esnecesariaunamejor comprensióndelaexpresiónylaacciónenzimaDAGAT.  Asípues,lacontribuciónrelativadeestasenzimasalaformacióndelípidosde reservaensemillasvaríaentreespecieseinclusoentretejidosdeunmismo organismo(Casesetal.,1998,2001;Shockeyetal.,2006;Chenetal.,2007;Liet al.,2010). Enresumen,laimportanciarelativadeDAGAT1vs.DAGAT2encuantoala biosíntesisdeTAGestodavíamateriadedebate(LungyWeselake,2006;Cahoon etal.,2007).Lasevidenciasacumuladastransmitenunaimagenmudable,enla quedependiendodelorganismo,yaseaanimal,planta,levadura,etc,..esunau otraDAGATlaquellevaelpesodelabiosíntesisdeTAG.Actualmentesepuede afirmarqueDAGAT1tieneunpapelclaveenplantas(LungyWeselake,2006), peroque,inclusodentrodelreinovegetal,yaniveldeespecie,lacontribuciónde cadaDAGATpuedevariarconsiderablemente(Shockeyetal.,2006;Chenetal., 2007).  2.2.2Nivelcalidad  Comoyahemosdiscutido,DAGAT1yDAGAT2,enconjunto,jueganunpapel importanteenlabiosíntesisdeTAGs,perovaríantantoensuspatronesde expresióncomoenlaspreferenciasrelativasdesustrato.  LaspropiedadesbioquímicasdeDAGAThansidoampliamenteinvestigadaspor complementacióndeestudiosinvitroeinvivo.Losprimerosestudiosinvitrode especificidady/oselectividadporelsustratoDAGATnoreconocenlasdiferencias entreDAGAT1yDAGAT2.Eldescubrimientodelosgenesquecodificanestosdos polipéptidosDAGAThapermitidounanálisismásdetalladodelabiosíntesisde TAG.Ahora,lasobreexpresióndecDNAsDAGATenorganismosdeficientesen Discusión  286 DAGATendógenoylabiosíntesisdeTAGofreceunaherramientaeficazpara caracterizarlaespecificidadylaselectividadporelsustratodeDAGATs.  UnanálisiscomparativodelasDAGAT1yDAGAT2deplantasseharealizadoenel tungárbol(Verniciafordii),Vernoniagalamensisyelricino(Ricinuscommunis). ExpresióndeDAGATsdeltungárbol(VfDAGATs)encélulasdelevadura,seguida deensayodelasenzimasinvitro,revelóqueVfDAGAT1yVfDAGAT2mostraban sólopequeñasdiferenciasenlapreferenciadesustrato,yVfDAGAT2tenían menoresnivelesdeactividadqueVfDAGAT1(Shockeyetal.,2006).Sinembargo, envivo,VfDAGAT2mostraroncincovecesmayoractividadparalaincorporación deácidoα‐eleosteáricoenTAGqueVfDAGAT1(Shockeyetal.,2006).Delmismo modo,laexpresiónespecíficadeVgDAGAT1yVgDAGAT2ensemillasdesoja mostraronqueVgDAGAT2eramásselectivoqueVgDAGAT1parasustratoscon ácidovernólico(12,13‐epoxi,ácido9‐cis‐octadecenoico),unácidograsoinusual quecontieneunenlaceepoxy(Lietal.,2010b).Porotraparte,DAGAT2delricino (RcDAGAT2)tambiénseencontróqueprefiereácidosgrasosinusualescomoel ácidoricinoleico(Burgaletal,2008;.Kroonetal,2006).Engeneral,estos estudiosseñalaronlapreferenciadeDAGAT2paracatalizarlaproducciónde especiesdeTAGconunacomposicióndeácidosgrasosmásbiendefinida.  LasobreexpresióndeDAGATsquecodificanenzimasconlaspreferencias específicasdelossustratospuedeaumentarelcontenidodeácidosgrasos inusualesenlasplantastransgénicas.Burgaletal.(2008)observóqueDAGAT2 delricino(Ricinuscommunis),designadoRcDAGAT2,prefiereacil‐CoAyDAGque contieneácidoricinoleico(12‐hidroxi‐9‐cis‐octadecenoicoácido).Lacoexpresión delahidroxilasadeácidosgrasosdericino(RcFAH)yDAGAT2diolugaraun aumentodel30%enácidoricinoleico,nivelquefuedosvecesmásquela expresióndeRcFAHsolo(Burgaletal.,2008).Porotraparte,elcDNAque codificatungárbol(Verniciafordii)DAGAT2(VfDAGAT2)fueclonadoy sobreexpresadoencélulasdelevadura,ymostróaltapreferenciaparalasíntesis deTAGquecontieneácidoeleosteárico(18:03cisΔ9,transΔ11,transΔ13) (Shockeyetal.,2006).Estosestudiosdemostraronlaimportanciadelaactividad DAGATenafectaralacomposicióndeácidosgrasos,ademásdelaacumulación deTAG. Discusión  287 Encuantoalaespecificidadporsustrato,DAGAT1poseeunampliorangode afinidadpordistintosAGs,jugandounpapelprincipalenlabiosíntesisdeTAGs duranteeldesarrollodelasemilla(LungyWeselake,2006;Liuetal.,2012), mientrasqueDAGAT2,relegadaenocasionesaunsegundoplano,parecetener unpapelclaveenlaincorporacióndeAGsinusualesaTAGsenaquellasplantas quelosacumulan(Kroonetal.,2006;Shockeyetal.,2006;Burgaletal.,2008;Xu etal.,2008;Yenetal.,2008;Cagliarietal.,2010;Lietal.,2010;Liuetal.,2012).  Generalmente,sehadescritolaactividadDAGATcomodeampliaespecificidad porsustrato(Frentzen,1998),refiriéndosealaciloincorporado,sinhacer hincapiéenelotrosustratoimplicadoenlareacción,DAG,lamoléculareceptora delacilo.  Respectoalacilo,losdatosmostradoshastaelmomentosonmuydiferentes,a vecesdependiendodelaespecie.Enazafrán,lacomposiciónsn‐3depende exclusivamentedeladisponibilidaddeacil‐CoAs(Ichiharaetal.,1988);algo similarsucedeenelcasodelcacahuete.Sinembargo,enespinaca,ricinoymaíz, síexisteunapreferenciaespecífica:losdosprimerosprefieren16:0‐CoA,en tantoqueelmaízesel18:0‐CoAelpreferido(Ichiaharaetal.,1988).Enun estudioposterior,laDAGATdericinoexhibepreferenciaporelácidoricinoleico, 18:1‐OH(VogelyBrowse,1996).Porsuparte,laDAGATdeArabidopsistiene preferenciapor20:1‐CoA(Katavicetal.,1995)yladeGarciniaindicaporel18:0‐ CoA(Danieletal.,2003).TrabajosrecientesconVernoniagalamensisyStokesia laevis,dosespeciescaracterizadasporacumularácidovernólico,demuestranque DAGATtienepreferenciaporelvernoloil‐CoA(Yuetal.,2006).  LostrabajoscentradosenlaespecificidadporDAG,asuvez,ponendemanifiesto unapreferenciadesustratoenfuncióndelaespecie(MiégeyMarechal,1999). EnazafrányCuphealanceolada,DAGATprefiereespeciesdeDAGdeltipo 10:0/10:0,mientrasqueenricinoes18:1‐OH/18:1‐OHlaespeciepreferida(Vogel yBrowse,1996;Heetal.,2004a).EnV.galamensisyS.laevis,DAGATprefiere DAGaciladoconácidovernólico(Yuetal.,2006). Conclusiones  294 14. Engeneral,losresultadosobtenidosdelanálisisdelasdistintaspoblaciones desemillasprovenientesdelalíneasegregantealtooleicoaltoesteárico (HOHE)degirasolalolargodecuatrogeneracionessugierenqueelmétodo deselecciónhasidoefectivoparamejorarlosparámetrosrelativosal contenidoenesteárico(E),EOEySUS,conincrementosconsiderablessobre todoenelprimerodeellos.Lafaltaderespuestaobservadaenrelaciónal parámetrovalorαSatfuecontrariaalasestimacionesquesehicieron inicialmente,loquesugierelaconvenienciadeincorporaryconsiderar nuevosparámetrosalestudio.  15. Elanálisisbidimensionalmediantematricesdedispersiónyelanálisisde componentesprincipalesllevadosacaboentrelasvariablesestudiadas permitierondeterminarlaexistenciaderelacionesentreéstas.Así,existeuna altacorrelaciónentrelasvariablescontenidodeesteárico(E)yEOE,una menorcorrelaciónentreestasvariableyelcontenidoSUSylafaltade correlaciónentretodasellasyelvalorαSat.                   BIBLIOGRAFÍA|295‐326                                       Bibliografía  297 AghoramK.,WilsonR.F.,BurtonJ.W.yDeweyR.E.(2006)Amutationina3‐keto‐acyl‐ ACPsynthaseIIgeneisassociatedwithelevatedpalmiticacidlevelsinsoybean seeds.CropScience46,2453‐2459.  AlbaA.yLlanosM.(1990)Elcultivodelgirasol.Colecciónagroguiasmundi‐prensa.158.  Álvarez‐OrtegaR.,CantisanS.,Martínez‐ForceE.yGarcés,R.(1997)Characterizationof 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SchuchardtU.,SercheliR.yMatheus‐VargasR.(1998)TransesterificationofVegetable Oils:aReview.JournaloftheBrazilianChemicalSociety9,199‐210.  SchuppertG.F.,TangS.,SlabaughM.B.yKnappS.J.(2006)TheSunflowerHigh‐oleic MutantOlCarriesVariableTandemRepeatsofFAD2‐1,aSeed‐specificOleoylphosphatidylCholineDesaturase.MolecularBreeding17,241–256. Bibliografía  326 ZhengP.,AllenW.B.,RoeslerK.,WilliamsM.E.,ZhangS.,LiJ.,GlassmanK.,RanchJ., NubelD.,SolawetzW.BhattramakkiD.,LlacaV.,DeschampsS.,ZhongG.Y., TarczynskiM.C.yShenB.(2008)AphenyalanineinDGATisakeydeterminantof oilcontentandcompositioninmaize.NatureGenetics40,367–372.  ZhouX.R.,ShresthaP.,YinF.,PetrieJ.R.ySinghS.P.(2013)AtDGAT2isafunctionalacyl‐ CoA:diacylglycerolacyltransferaseanddisplaysdifferentacyl‐CoAsubstrate preferencesthanAtDGAT1.FebsLetters587,2371‐2376.  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LPATf1aFMGRWSNGAYATTGAYTGG25652.6HaLPAAT1Clonación LPATf1spFTGTCATAGGTTGGTCAATGTGG‐58.4HaLPAAT1Clonación LPATf2spFAAGGGACTCGATTTACTAATGC‐56.5HaLPAAT1Clonación LPATr1RACRAANCCYTTNGTDCKDGG115257.6HaLPAAT1Clonación LPATr2spRACATTGACCAACCTATGACAGG‐58.4HaLPAAT1Clonación LPATr3spRAAGATGCATATTCTTGAGCTGC‐56.5HaLPAAT1Clonación qHaLPAT1f1spFGTCTCACATTCACTGCAGCC‐59.4HaLPAAT1qRT‐PCR qHaLPAT1r1spRTCTTGTACACTGCCGTTACC‐57.3HaLPAAT1qRT‐PCR KpnILPAT1FFAAGGTACCATGGCAATCTCAGCAGCAGC‐ 69.0HaLPAAT1ClonaciónpYES2 XbaILPAT1RRCGGTCTAGATCAATGCAGTTTTTCTTGTACACTGC‐69.0HaLPAAT1ClonaciónpYES2 BamHILPAT1FFAAGGATCCATGGCAATCTCAGCAGCAGC‐68.0HaLPAAT1ClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC XmaILPAT1RRACCCGGGTCAATGCAGTTTTTCTTGTACAC‐66.8HaLPAAT1ClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC     LPATf1spFTGTCATAGGTTGGTCAATGTGG‐58.4HaLPAAT2Clonación LPATf2spFAAGGGACTCGATTTACTAATGC‐56.5HaLPAAT2Clonación HaLPAT2f1spFTGTACACAGATGCCGAGACCC‐61.8HaLPAAT2Clonación LPATr2spRACATTGACCAACCTATGACAGG‐58.4HaLPAAT2Clonación LPATr3spRAAGATGCATATTCTTGAGCTGC‐56.5HaLPAAT2Clonación HaLPAT2r1spRACTTTAACGTGAATCACAGACG‐56.5HaLPAAT2Clonación qHaLPAT2f2spFGCTCACATTCACTGCAATTGGG‐60.3HaLPAAT2qRT‐PCR qHaLPAT2r1spRCTCTTGTACATTACCATTGC‐53.2HaLPAAT2qRT‐PCR KpnILPAT2FFAAAGGTACCATGGCTATCGCAGCAGCAGC‐ 69.5HaLPAAT2ClonaciónpYES2 XbaILPAT2RRCGGTCTAGATCAGTGCAGTTTCTCTTGTACATTACC‐69.5HaLPAAT2ClonaciónpYES2 BamHILPAT2FFAAGGATCCATGGCTATCGCAGCAGC‐66.3HaLPAAT2ClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC XmaILPAT2RRACCCGGGTCAGTGCAGTTTCTCTTGTACATTACC‐70.7HaLPAAT2ClonaciónpCAMBIA‐ Apéndices 330 DGAT1ABf3FTGGCCACTTCTWATGTGC253.7HaDAGAT1AClonación DGAT1f2spFTGCATAGTGGTGCTTGTTGC‐57.3HaDAGAT1AClonación DGAT1Af2spFACGTATAGCCGACTCTGCTGC‐61.8HaDAGAT1AClonación DGAT1AATGFGATCATAGGATGTCATCC‐51.4HaDAGAT1AClonación DGAT1r1RAYARCATCARTGWMACRCC6453.4HaDAGAT1AClonación DGAT1Ar1spRTGCAGCAAGTGGGAATACTGG ‐ 59.8HaDAGAT1AClonación qHaDGAT1Af1spFGTCTGTCACTTCCAGTCTTCC‐59.8HaDAGAT1AqRT‐PCR qHaDGAT1Ar1spRAAGAGTGATAGCAGCAGAGTCG‐60.3HaDAGAT1AqRT‐PCR KpnIDGAT1AFFAAGGTACCATGGCATCCGACGTACGTAGG‐ 69.5HaDAGAT1AClonaciónpYES2 XbaIDGAT1ARRGCGGTCTAGATTATTTGGTGTTGACTTTTCTATTC‐66.0HaDAGAT1AClonaciónpYES2 BamHIDGAT1AFFAAGGATCCATGTCATCCGACGTACGTAGG‐68.1HaDAGAT1AClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC XmaIDGAT1ARRAAGGACCCGGGTTATTTGGTGTTGACTTTTCTATTC‐68.3HaDAGAT1AClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC     DGAT1ATGFTAATGGCGTTAYTAGATMCG453.2HaDAGAT1BClonación DGAT1ABf3FTGGCCACTTCTWATGTGC253.7HaDAGAT1BClonación DGAT1f2spFTGCATAGTGGTGCTTGTTGC‐57.3HaDAGAT1BClonación DGAT1Bf3spFGTTACGACAATTGATCAAGC‐53.2HaDAGAT1BClonación DGAT1r1RAYARCATCARTGWMACRCC6453.4HaDAGAT1BClonación DGAT1ABr1RGATTYTCAATGATGAGCC250.3HaDAGAT1BClonación DGAT1BSTOPRGTCTTGTTTAAAATTCACTTGCC‐55.3HaDAGAT1BClonación qHaDGAT1Bf1spFTGTGCTGCCTCTCTCTTCTGC‐61.8HaDAGAT1BqRT‐PCR qHaDGAT1Br1spRCATGTAGAGCGATTACAATAGGG‐58.9HaDAGAT1BqRT‐PCR BamHIDGAT1BFFAAGGATCCACCATGGCGTTATTAGATCCGCC‐ 69.5HaDAGAT1BClonaciónpYES2 XbaIDGAT1BRRCGGTCTAGATCACTTGCCATTATTCACC‐65.1HaDAGAT1BClonaciónpYES2 BamHIDGAT1BF2FAAGGATCCATGGCGTTATTAGATCCGCC‐66.6HaDAGAT1BClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC XmaIDGAT1BRRGAACCCGGGTCACTTGCCATTATTCACC‐68.0HaDAGAT1BClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC     DGAT2f1spFAGGCATATATGGACATGG‐51.4HaDAGAT2Clonación DGAT2r1spRGTTGCAGCCGTTAGTCCAAGC‐61.8HaDAGAT2Clonación DGAT2r2spRCTCTCGAATAGATCTTCAACC‐58.4HaDAGAT2Clonación qHaDGAT2f1spFCTGAGGCATATATGGACATGG‐57.9HaDAGAT2qRT‐PCR Apéndices  331 qHaDGAT2r1spRAACGTCTCCTGAACGCCACC‐61.4HaDAGAT2qRT‐PCR KpnIDGAT2F2FAAGGTACCATGGCCACGACGACGGAGAACAC‐ 69.5HaDAGAT2ClonaciónpYES2 XbaIDGAT2RRCGGTCTAGATCACATAATTCTTAACTGAAGATTAGG‐66.1HaDAGAT2ClonaciónpYES2 BamHIDGAT2F3FAGGATCCATGTCCACGACGACGGAGAACACA‐70.8HaDAGAT2ClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC XmaIDGAT2R3RACCCTCCCGGGTCACATAATTCTTAACTGAAGATTAGGA TAACC‐ 71.3HaDAGAT2ClonaciónpCAMBIA‐ 1300EC     N504681LPFACCACCCGGTTAATTTTTCTG‐55.9AtLPAT2AtGenotipado N504681RPRCTTTTTACCACATGCAAAGGG‐55.9AtLPAT2AtGenotipado N546680LPFGAAAGCCATTGCAGTAGCTTG‐57.9AtLPAT3AtGenotipado N546680RPRCGTGTAGGTTGTCTTGGAAGC‐59.8AtLPAT3AtGenotipado LBb1.3FCGGGTACCATGGAGGTTAAGATATCGG ‐ 61.3AtLPAT2/AtLPAT3AtGenotipado N3861LAFCGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGG‐69.6AtDGAT1AtGenotipado N3861LCFTAAACAGTAGACTCATCATCG‐54.0AtDGAT1AtGenotipado N3861RBRGCGGCCAATCTCGCAGCGATCTTG‐67.8AtDGAT1AtGenotipado   N852633LP FCCAACTCGAACAAAAGAAACG‐55.9AtFatA1AtControlgenómico N852633RPRCAATGGTTTCAACAGTAGCGG‐57.9AtFatA1AtControlgenómico   AtActin‐FFGGAAGGATCTGTACGGTAAC‐57.3AtActinaAtAnálisisexpresión AtActin‐RRTGTGAACGATTCCTGGACCT‐57.3AtActinaAtAnálisisexpresión   Sc18Sf1spFTTGGCCGAGAGGTCTTGGTA‐59.4ScSubunidad18SScAnálisisexpresión Sc18Sr1spRGGGACGTAATCAACGCAAGC‐59.4ScSubunidad18SScAnálisisexpresión     M13forwardFTGTAAAACGACGGCCAGTG‐56.7pMBL‐TPCRscreening M13reverseRCAGGAAACAGCTATGACCATG‐57.9pMBL‐TPCRscreening GAL1forFGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATC‐62.7pYES2PCRscreening CYCrevRGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG‐61.9pYES2PCRscreening CaMV35SF1FCGTAAGGGATGACGCACAAT‐57.3pCAMBIA‐1300ECPCRscreening nosTRACGTCATGCATTACATGTTAATTA‐54.2pCAMBIA‐1300ECPCRscreening     Apéndices 332   Enverdesemarcadianaderestricción,enazulcodóndeiniciodetranscripción(ATG),enrojocodóndestopdetranscripción. SubrayadosemarcalasecuenciaKozak(ANNATGG).  CódigonucleotídicoIUPAC.‐M:A/C;R:A/G;W:A/T;Y:C/T;S:G/C;K:G/T;H:A/C/T;D:A/G/T;N:A/C/G/T.  *Seindicanlasfuncionesparalosquefuerondiseñadosinicialmente,sibienalgunosoligonucleótidosseusaronademáspara comprobar,mediantePCRscreening,lapresenciaycorrectaorientacióndelosfragmentosoclonesinsertadosenlosdiferentes plásmidosdeclonaciónovectoresdeexpresión,asícomoelanálisisdelaexpresióndelasproteínasrecombinantes.       Oligonucleótidoscomerciales   NombreSecuencia(5’>3’)Nº degs. TM (ºC)CompañíaFunción   FA2ZRAACTGGAAGAATTCGCGG‐53.7 Clonaciónextremo3´ UPMLongFCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACG CAGAGT‐ 74.0RACE,Clontech(Japón)Clonaciónextremo5´ UPMShortFCTAATACGACTCACTATAGGGC‐58.4RACE,Clontech(Japón)Clonaciónextremo5´ NUPFAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT‐54.7RACE,Clontech(Japón)Clonaciónextremo5´                                      