Algunas características fisiológicas de plantas de vid variedad Pedro Ximénez en el proceso de aclimatación al exterior tras su propagación in vitro

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica UNIVERSIDAD DE SEVILLA TRABAJO FIN DE GRADO: ALGUNAS CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE PLANTAS DE VID VAR. PEDRO XIMÉNEZ EN EL PROCESO DE ACLIMATACIÓN AL EXTERIOR TRAS SU PROPAGACIÓN IN VITRO. GRADO DE INGENIERÍA AGRÍCOLA José Agustín Tovar Mendoza Fecha de entrega: 12/05/2016 Autor: José Agustín Tovar Mendoza. Grado en Ingeniería Agrícola. Trabajo fin de grado realizado en el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (CSIC). Fdo. Dr. D. Manuel Cantos Barragán. Dpto. Biotecnología Vegetal. Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS) (CSIC). Fdo. Dr. Jesús Cambrollé Silva. Dpto. Biología Vegetal y Ecología. Facultad de Biología. Universidad de Sevilla. Fdo. Dra. Ana María Morales Sillero. Dpto. Ciencias Agroforestales. Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica. Universidad de Sevilla. AGRADECIMIENTOS Al Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología (I.R.N.A.S.), por permitirme realizar este proyecto. Al Dr. D. Manuel Cantos Barragán, Científico Titular del C.S.I.C. (I.R.N.A.S.) por su profesionalidad, por su trato cercano, su ayuda y sus consejos, por su interés y dedicación, pues sin él este trabajo no habría sido posible. Al Dr. D. Jesús Cambrollé Silva por su ayuda en la técnica de determinación de intercambio gaseoso del material vegetal, sus consejos, su interés y dedicación. A la Dra. Dña. Ana Mª Morales Sillero, Profesora Contratada del Departamento de Ciencias Agroforestales, por darme la oportunidad de trabajar en este proyecto y por sus consejos. A Dña. Mª del Mar Parra Alejandre, Ayudante de Investigación del C.S.I.C. (I.R.N.A.S.), por todos sus consejos, su profesionalidad y su inestimable ayuda. Al Dr. D. José Luis García Fernández, Titulado Superior Especializado del C.S.I.C. (I.R.N.A.S.) por su tiempo y su ayuda, que han sido fundamentales en este trabajo. Especialmente a mis padres, Maritza y José, a mi hermana Lisset y a mi amiga Bárbara, por estar presentes en todo momento demostrándome su cariño, ánimo y apoyo incondicional. ÍNDICE 1. Introducción. …............................................................. 1 1.1 Cultivo in vitro. …........................................................... 1 1.1.1. Medio VID. …................................................... 1 1.2 Aclimatación. ….............................................................. 2 1.2.1. Efectos de cultivo in vitro en la planta y estrés en la adaptación al exterior. .............................. 2 a) Eficiencia fotosintética. ….................................. 2 b) Funcionamiento de los estomas. …................... 3 c) La cutícula. …................................................. 3 d) Anatomía. …................................................... 4 e) Hiperhidricidad. ….......................................... 5 f) Desarrollo de compuestos volátiles en el interior del recipiente. ….................................. 6 g) Las hojas persistente. ….................................. 6 h) Las hojas nuevas. …........................................ 7 1.2.2. Proceso de aclimatación. …................................. 9 a) Aclimatación in vitro. ….................................. 9 b) Control ambiental. …...….............................. 10 c) Antitranspirantes. …....................................... 10 1.3. La Vid. …........................................................................ 11 1.3.1. El cultivo in vitro en la vid. …............................. 11 1.4. Variedad Pedro Ximénez. …............................................. 12 1.5. Método de evaluación de los efectos del estrés ambiental. Valoración de tolerancia. ….............................................. 13 2. Objetivos. …............................................................................. 15 3. Material y Métodos. …................................................. 16 3.1. Material Vegetal. …....................................................... 16 3.2. Propagación in vitro del material. …................................. 16 3.2.1. Parámetros a evaluar. …........….......................... 18 3.3. Aclimatación a condiciones externas. ........................... 19 3.4. Parámetros biométricos. …............................................ 21 3.5. Parámetros bioquímicos. ….............................................. 22 3.6. Intercambio gaseoso. ….................................................... 23 3.7. Tratamientos estadísticos. ….......….................................. 24 4. Resultados. …................................................................ 25 4.1. Micropropagación de los individuos. ........................... 25 4.2.Adaptación a condiciones externas. .............................. 28 4.2.1. Respuesta de los individuos tras 45 días de cultivo in vitro. ….............................................. 28 4.3. Evolución de la pérdida del contenido del agua. …...... 29 4.4. Pigmentos fotosintéticos. ….......................................... 34 4.5. Intercambio gaseoso. …................................................. 35 5. Discusión. …........................................................................ 37 6. Conclusiones. …............................................................ 41 7. Bibliografía. ….............................................................. 42 1. INTRODUCCIÓN. 1.1 Cultivo in vitro . El término cultivo in vitro de tejidos vegetales, engloba un conjunto de técnicas que permiten el desarrollo del material vegetal (plantas, semillas, embriones, órganos, células y protoplastos) sobre un medio nutritivo, en ambiente aséptico, y en un espacio definido, cerrado y con unas condiciones ambientales controladas (Pierik, 1990). Este proceso es viable gracias a la autonomía y totipotencia de la célula vegetal. Entre las ventajas del cultivo in vitro destacan: El desarrollo del material vegetal en un espacio relativamente pequeño, donde se optimizan los factores físicos, nutricionales y hormonales, con exclusión de gran parte de los microorganismos (hongos y bacterias), así como también de las plagas de las plantas superiores (insectos y nematodos). La obtención de individuos durante todo el año, consiguiéndose elevadas tasas de multiplicación en poco tiempo y con escaso material de partida. En consecuencia, la finalidad de cualquier técnica de cultivo in vitro es controlar el crecimiento y desarrollo del explanto manipulando su entorno. Los factores que determinan el éxito de esta técnica son el material vegetal, el medio de cultivo y las condiciones ambientales asépticas. Por otro lado, la técnica de cultivo in vitro es un buen complemento para los estudios ex vitro, debido a que la planta suele mostrar respuestas similares a las presentadas en condiciones de cultivo en invernadero o campo (Sivritepe y Eris, 1999; Cavagnaro y cols., 2006; Hamrouni y cols., 2008). 1.1.1. Medio VID. Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir in vitro o in vivo. También se deben añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos, también denominados propágulos o explantos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas circunstancias. Un explanto de vid, aislado in vitro y que crece y se desarrolla, necesita muchas sustancias (agua, agar, azúcar, nutrición mineral, reguladores de crecimiento, vitaminas). Se puede observar que algunas de estas sustancias son también necesarias para el desarrollo in 1 vivo. Si no se añade al medio ningún agente gelificante como el agar, se denomina medio líquido, en lugar de solido, que es el medio solidificado con agar. 1.2. Aclimatación. 1.2.1. Efectos del cultivo in vitro e n la planta y estrés en la adaptación al exterior. Las condiciones especiales durante el cultivo in vitro promueven el rápido crecimiento y la multiplicación de los brotes, y a menudo causan efectos en la formación estructural de las plantas haciéndolas fisiológicamente, e incluso morfológicamente anormales. Con frecuencia se caracterizan por una mala eficiencia fotosintética, un mal funcionamiento de los estomas y una marcada disminución en ceras epicuticulares. Además, las ceras presentes en la superficie de las hojas de plantas cultivadas in vitro pueden variar. Las condiciones en las que se realiza el cultivo in vitro comportan una humedad relativa alta y baja irradiancia. Por otro lado, factores como los niveles de CO2, riqueza en sacarosa y nutrientes contenidos en el medio, pueden contribuir a una drástica caída en la supervivencia bajo las nuevas condiciones ambientales una vez las plantas son colocadas directamente en un invernadero o en campo. La comprensión de estas anomalías es un requisito previo para desarrollar protocolos de trasplante eficientes. A continuación se presenta un resumen de las principales anomalías en cultivo in vitro de plantas. a) Eficiencia fotosintética. Para el crecimiento in vitro se requiere un suministro continuo de hidratos de carbono exógenos, generalmente sacarosa (2-3%), como fuente de carbono. Esta situación se debe a que el explanto, de muy pequeño tamaño, no tiene el soporte enzimático suficiente para realizar la fotosíntesis convenientemente (estado de mixotrofia) por lo que hay que suministrarle el producto final de la fotosíntesis para su normal formación de biomasa. Aunque las plántulas pueden parecer normales, es poco probable que la función fotosintética se realice convenientemente. Por lo tanto, in vitro, las plantas son pobres en contenidos de pigmentos fotosintéticos o de las enzimas implicadas en la fotosíntesis. Así, la Ribulosa bifosfato carboxilasa (RuBP) es inactiva o ausente. No obstante, la acumulación de clorofila b y la capacidad fotosintética se ven favorecidos por el suministro de azúcar. La adición de azúcar evita la aparición de fotoinhibición (Hazarika et al., 2000b, 2004; Hazarika, 2003a, 2003b; Wainwright and 2 Scrace, 1989). La capacidad fotosintética es considerablemente mayor en presencia que en ausencia de azúcares y esto podría aumentar la capacidad de utilizar la luz absorbida. Sin embargo, este efecto se contrarresta, en parte, por el alto contenido de clorofila de las plántulas de alto suministro de luz, la cual aumenta la absorción de energía. Un suministro de carbohidratos adecuado en las plántulas con alto régimen lumínico (3%) podría permitirles mantener los múltiples mecanismos de protección y reparación, reduciendo así el riesgo de fotoinhibición. Parte de este efecto podría ser debido a la tasa de crecimiento mejorada, que ayuda a reemplazar fotosistemas deteriorados y consumir un excedente de asimilados (Ticha et al.,1998). b) Funcionamiento de los estomas. La función principal de los estomas es la regulación del contenido de agua dentro de la hoja, por lo que una alteración en la estructura morfológica y/o del funcionamiento de los mismos pueden causar la pérdida excesiva de agua, marchitamiento y muerte de la planta. La estructura de los estomas en las plantas in vitro, difieren notablemente de las desarrolladas en invernadero o campo (Hazarika, 2006). Autores como Brainerd y Fuchigami, (1982) y Wardle y Short, (1983) han encontrado que las células guarda u oclusivas en las plantas in vitro se encontraban levantadas y redondeadas en comparación a la forma elíptica normal. Los estomas de las plantas cultivadas in vitro muestran una incapacidad característica para cerrarse al ser transferida la planta al campo o al invernadero. El tamaño de la abertura estomática es controlado por el volumen relativo de las células oclusivas, dependiendo de la turgencia, que a su vez depende de la presión osmótica vascular y el potencial hídrico. La ausencia de control estomático podría deberse a propiedades anormales de la pared celular o a la inadecuada función de los protoplastos. Ziv y cols., (1987) concluyeron que ese fracaso de las células oclusivas al no contraerse en soluciones hipertónicas son debido a los defectos de la pared celular y se correlacionó con la orientación anormal de las microfibrillas de celulosa. c) La cutícula. La cutícula es una capa superficial no celular, secretada por la epidermis y compuesta de una matriz de cutina junto con ceras incrustadas y ceras de superficie que cubren externamente los tejidos aéreos de la planta. La función principal de la cutícula es limitar la pérdida de agua por transpiración. La permeabilidad al agua a través de la cutícula es influida principalmente por la estructura y la cantidad de ceras cuticulares y epicuticulares. La deposición escasa de cera protectora epicuticular en la superficie de las hojas de las plantas cultivadas in vitro, se ha considerado 3 como uno de los factores más importantes responsables de la pérdida excesiva de agua, lo que lleva al fracaso del trasplante (Martin and Juniper, 1970). En diferentes estudios la medición de la cantidad de cera epicuticular en hojas de plantas cultivadas in vitro reveló una falta de estructura cristalina, que se correlacionó significativamente con una menor cantidad de ceras epicuticulares en comparación con las plantas cultivadas en invernadero (Fuchigami et al., 1981; Hazarika et al., 2000a, 2000c, 2001a, 2002a; Wetzstein and Sommer, 1982). La naturaleza química de la cera depositada sobre la superficie de las hojas en condiciones in vitro también se sabe que difiere de la que se forma en condiciones naturales, permitiendo una difusión excesiva de agua a través de las hojas in vitro (Sutter, 1984). Las plantas micropropagadas alcanzan una densidad de cera comparable a las plantas que crecen en el campo, en 6-7 semanas del trasplante (Dhawan y Bhojwani, 1987). Estas observaciones corroboran las realizadas sobre la tasa de pérdida de agua de las hojas en diferentes etapas de la micropropagación y el endurecimiento (Hazarika, 2006). El descenso en la tasa de pérdida de agua coincide con el aumento de la cantidad de cera depositada sobre las hojas (Wardle y cols., 1983; Sutter y Langhans, 1982; Sutter, 1984). d) Anatomía. La pobre diferenciación del mesófilo y el débil sistema vascular de las hojas formadas in vitro, hacen que las plantas sean altamente susceptibles al estrés del trasplante. Las hojas de las plantas cultivadas in vitro son más delgadas y tienen una capa de células en empalizada característicamente poco desarrollada, con una cantidad significativa de espacio aéreo en el mesófilo en comparación con las plantas cultivadas en invernadero. Los cambios en la anatomía de la hoja que se producen durante la aclimatación se observan más en las hojas que se desarrollan después del trasplante (Brained y cols., 1981). Las hojas persistentes se hacen más gruesas debido al agrandamiento de las células de empalizada, pero no suele haber ningún cambio en el número de capas de células de empalizada o en la cantidad de espacio de aire en el mesófilo. Durante la aclimatación se observa como hojas procedentes de in vitro asumen características intermedias entre las hojas cultivadas in vitro y en invernadero o en campo (Fabbri y cols., 1986). Sólo las hojas nuevas que se forman después del trasplante son similares a las hojas de invernadero (Wetzstein and Sommer, 1982; Donnelly et al., 1985). 4 1.3 La Vid. Según la Organización Mundial de la Vid y del Vino (OIV, 2013), el cultivo de la vid se extiende por los cinco continentes ocupando 7,5 millones de ha. A pesar de la pérdida de superficie de viñedo desde el año 2000 (62,5%) hasta 2012 (56 %), Europa cuenta con la mayor superficie a nivel mundial, seguida de Asia (22,7%), América (13%), África (5,2%) y Oceanía (2,7%). Los países europeos con mayor superficie de viñedo son España, Italia y Francia. España posee un lugar destacado como país vitícola; es el primer país en cuanto a superficie, suponiendo aproximadamente el 14 % de todo el viñedo mundial (un 36 % de la viña existente en la Unión Europea) y el tercero en producción. Los rendimientos medios por hectárea han sido tradicionalmente de los más bajos del mundo y esto se debe a que la vid se encuentra en un importante porcentaje sobre terrenos marginales, a lo que hay que sumar la edad avanzada las viñas y que es un cultivo mayoritariamente en secano (O.I.V., 2013). El sector vitivinícola supone aproximadamente el 5,8 % de la producción final agraria española. La mayoría de la superficie cultivada se destina a vinificación, aproximadamente 5.600.000 toneladas de uva que proporcionan en torno a 40 millones de hectolitros (34,8 de vino y 5,1 de mosto). El cultivo de mesa representa en torno al 9 % de su producción total (O.I.V., 213). 1.3.1. El cultivo in vitro en la vid. El cultivo in vitro, en general y para vid en particular, ofrece una serie de posibilidades que no presenta el cultivo tradicional, entre otras, la obtención de material libre de virus, la rápida propagación del material vegetal (situación especialmente interesante en la multiplicación de nuevos genotipos), la conservación de forma económica y a largo plazo (en frío y oscuridad) de material vegetal seleccionado y mantenimiento del cultivo en condiciones estériles para la protección frente a patógenos. Los últimos estudios apuntan a que el futuro de la vitivinicultura pasa por adaptarse a las nuevas condiciones de crecimiento asociadas a un aumento de la concentración de CO2 atmosférico, de la temperatura y de la sequía, lo que puede provocar la aparición de nuevos patógenos y plagas. En este sentido, son varios los institutos del CSIC que han abierto líneas de investigación para dar respuesta a estos desafíos, mediante técnicas de cultivos in vitro, en invernaderos-cámara, con el objetivo de obtener variedades de vid más resistentes y mejoradas genéticamente y, en consecuencia, afrontar los retos del cambio climático y lograr una producción sostenible en el futuro. 11 1.4 Variedad Pedro Ximénez. Su cultivo está muy extendido por toda España, particularmente en Andalucía y Extremadura. Las cepas son vigorosas, de porte erguido, con buena producción pero con fertilidad limitada al tener tendencia al corrimiento e inadecuado cuajado de desborre y maduración en épocas medias. Esta variedad es la base de vinos dulces con mucho cuerpo y aromas, con capacidad alcohólica muy elevada y baja acidez. Aunque da lugar a vinos de mejor y peor calidad, tienen un alto contenido en azúcares, por lo que son más naturales. Su cultivo se realiza fundamentalmente en las zonas de Montilla-Moriles, Jerez, Málaga y Valencia. Los portainjertos que principalmente se utilizan con este cultivar son: 110 de Richter (Berlandieri x Rupestris-Martin var. Reseguier nº2). 41 B de Millardet (Chaselas x Berlandieri). 161-49 de Couderc (Riparia x Berlandieri). 420 A (Riparia x Berlandieri). Es una variedad con baja resistencia a clorosis férrica, Plasmopara viticola, oidio y mildiu. Sin embargo presenta gran tolerancia a la filoxera gallicola. La uva de esta variedad se pudre más que ninguna otra, lo que proviene principalmente de lo mucho que la pican las avispas y abejas, atraídas por su alto contenido en azúcar y a la apertura del racimo con las lluvias. Respecto a la ampelografía según la O.I.V. el pámpano joven tiene la extremidad de forma abierta, ésta carece de pelos, como la planta en general, y de pigmentación antociánica. Presenta porte semierguido, tanto los entrenudos como los nudos tienen color verde con rayas rojas, siendo los zarcillos de longitud media. La hoja joven es de color amarillo, siendo la adulta de tamaño mediano, corta longitud, forma del limbo pentagonal de color verde claro sin pigmentación antociánica con una ondulación generalizada del limbo entre los nervios principales. El perfil del limbo es de bordes hacia el haz, la longitud de los dientes es mediana y la relación de ésta respecto a la anchura de la base es también mediana, el seno peciolar es poco abierto en forma de V, siendo los senos laterales superiores cerrados en forma de U. La longitud del pecíolo es corta lo que lo hace muy corto en relación al nervio central. Presenta de uno a dos racimos florales por pámpano, de tamaño mediano y compacidad media, teniendo un número muy elevado de bayas. La longitud del pedúnculo es corta y de lignificación media. La baya de forma elíptica corta presenta una sección transversal circular, con color de la epidermis verde-amarillento (Figura 1), valores medios de pruína, de grosor de la piel medio y pulpa no coloreada, dura y suculenta, siendo la longitud de pedicelo corto y difícil de separar. La longitud de las pepitas es media al igual que su peso y carecen de estrías transversales en la cara dorsal. 12 Figura 1. Racimo y hojas de la variedad Pedro Ximénez. El peso de uva/cepa es bajo, pero la concentración de azúcar es alto en el mosto. La época de brotación puede verse afectada por periodo de heladas, mermándose la producción de ese año. El envero se produce a finales de julio, y la maduración del fruto a mediados de septiembre. 1.5. Método de evaluación de los efectos del estrés ambiental. Valoración de tolerancia. La tasa fotosintética o fotosíntesis neta se expresa como la cantidad de CO2 por unidad de área foliar y de tiempo, y se puede definir como la cantidad neta de carbono que se incorpora al vegetal en un momento dado. El CO2 atmosférico es insuficiente para alcanzar el máximo de fotosíntesis en la hoja. Además, la difusión del anhídrido carbónico hasta el interior de la hoja y desde aquí a los cloroplastos encuentra resistencias como la apertura de los estomas, por lo que la conductancia estomática (Gs) es de gran importancia. La luz y las bajas concentraciones de CO2 intercelular estimulan la apertura estomática. La pérdida de agua por transpiración a través de los estomas es la consecuencia inevitable de la apertura estomática para permitir la entrada de CO2, de ahí que exista una estrecha correlación entre fotosíntesis y transpiración, ambas dependientes de la conductancia estomática. La planta debe regular la apertura de los estomas de tal modo que maximice la entrada de CO2 a la vez que minimice la pérdida de agua. En consecuencia, conocer los valores de cada uno de los factores que interaccionan en este delicado equilibrio permite conocer el estado fisiológico de la planta y su capacidad de aclimatación ex vitro. Pocos resultados se han publicado sobre la actividad fotosintética en el proceso de aclimatación in vitro-ex vitro de la vid. Casi exclusivamente Fila y colaboradores, han estudiado en profundidad este proceso en plantas micropropagadas de la variedad de vid 41B (Fila y cols., 1998 y 2006). En estos trabajos estos autores concluyen que la caracterización de la actividad fotosintética en las plantas aclimatadas ex vitro desde in vitro podría ganar precisión estudiando algunas variables, generalmente no consideradas, como el proceso de 13 difusión del CO2. Hasta ese momento, el objetivo de las investigaciones ha procurado la mejora de la relación eficiencia fotoquímica/eficiencia bioquímica. En consecuencia, el estudio del intercambio gaseoso podrían mejorar los protocolos de aclimatación. Los pigmentos fotosintéticos presentes en los cloroplastos son los responsables de captar la energía de la radiación fotosintéticamente activa (PAR) que incide sobre la hoja. Las moléculas de clorofila se organizan en grupos funcionales que actúan como antenas captadoras. Además de las clorofilas a y b, los carotenoides, constituidos por carotenos y xantofilas, se hallan presentes en las hojas de las plantas superiores y en todos los organismos fotositéticos. La energía captada por los carotenos es transferida a las moléculas de clorofila. 14 2. OBJETIVOS. El presente proyecto de investigación pretende evaluar fisiológicamente el proceso de aclimatación a condiciones ex vitro de plantas propagadas mediante cultivo in vitro de ápices axilares y apicales de la variedad de vid Pedro Ximénez. Para ello se valorará la pérdida de agua de los tejidos, la evolución de los niveles de pigmentos fotosintéticos (clorofilas a y b y carotenoides) y el intercambio gaseoso (fotosíntesis neta, conductancia estomática y niveles de CO2 intercelular) en el proceso de aclimatación desde el tubo de ensayo a condiciones de invernadero de dichas plantas micropropagadas. 15 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 3.1 Material Vegetal. Se usa la variedad comercial Pedro Ximénez. El material vegetal (Figura 2) procede del banco de germoplasma in vitro existente en los laboratorios del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS-CSIC). El medio de cultivo empleado ha sido el denominado VID (Troncoso y cols., 1990) con las concentraciones de reguladores de crecimiento, azúcar y vitaminas indicadas en la Figura 6. Las condiciones de la cámara de cultivo han sido 24±1 ºC de temperatura, 30 µEm‾²s‾¹ de intensidad lumínica y 16 horas de fotoperiodo. Figura 2. Planta de variedad comercial Pedro Ximénez en cámara de cultivo. 3.2. Propagación in vitro del material. Al objeto de obtener el material suficiente para las pruebas, se micropropagaron individuos de Pedro Ximénez, 35 tubos de ensayo, el 21 de Diciembre del 2015 (1º siembra), 15 tubos de ensayo el 20 de Enero del 2016 (2º siembra) y 22 tubos de ensayo el 15 de Febrero del 2016 (3º siembra). Se tomaron explantos homogéneos (1 cm y 1 yema) de plantas existente en el banco de germoplasma in vitro del IRNAS (CSIC), los cuales fueron llevados bajo cabina de flujo laminar (TELSTAR AH-100) (Figura 3) a tubos de vidrio (150 x 25 mm) con 10 cc de medio VID, cerrados con tapón de polipropileno transparentes y autoclavados previamente a 120ºC y 1 atm de presión durante 20 minutos. Una vez efectuada la siembra de los explantos, los tubos se sellaron con parafilm (Figura 4). La incubación se realizó en cámara de cultivo en las condiciones anteriormente citadas (Figura 5). 16 Figura 3. Cabina de flujo laminar. Figura 4. Siembra de explantos en tubo de ensayo. De las plantas obtenidas in vitro se fueron realizando sucesivos subcultivos de explantos de 1 cm de longitud y con una yema, en el mismo medio de cultivo citado anteriormente, hasta alcanzar un número suficiente para establecer el ensayo. Figura 5. Tubos en la cámara de cultivo. 17 La composición del medio de cultivo VD (medio vid) para un volumen de 1000 ml se indica (Figura 6) a continuación: Figura 6. Composición del medio VID (Troncoso y cols., 1990). 3.2.1. Parámetros a evaluar. a) Supervivencia. Transcurridos 45 días de incubación in vitro en la cámara de cultivo se contabilizaron los explantos que habían desarrollado raíz y/o tallo; en el caso de desarrollo de ambos órganos se considera el término planta. b) Biometría. A los 15, 30 y 45 días en cámara de cultivo, de cada uno de los explantos, se realizaron las siguientes medidas: Longitud del tallo, número de yemas, número de ramificaciones, número de raíces y longitud de la raíz principal. 18 KNO3 800 Ca(NO3)2 4H2O 300 NH4NO3 800 KH2PO4 170 FeSO4 7H2O 27,1 MgSO4 7H2O 370 37,3 MnSO4 H2O 0,85 H3BO3 6,2 ZnSO4 7H2O 8,6 Na2MoO4 2H2O 0,25 CuSO4 5H2O 0,025 CoCl2 6H2O 0,025 1 100 BAP 0,072 ANA 0,024 COMPOSITION OF THE VID CULTURE MEDIUM. (Troncoso et al., 1990) Macronutrients mg/L Potassium nitrate Calcium nitrate Ammonium nitrate Potassium dihydrogen ortho phospate Ferrous sulphate Magnesium sulphate Ferric sodium EDTA Micronutrients mg/L Manganous sulphate Boric acid Zinc sulphate Sodium molybdate Cupric sulphate Cobalt chloride Vitamints mg/L Tiamina Mioinositol Growth Regulators mg/L Agar : 0,6% pH: 5,7 Sucrose: 3% Longitud tallo o parte aérea, expresado en centímetros (cm). Es la parte nueva que ha crecido a partir del explanto inicial. Número de yemas. Se tuvieron en cuenta el número de yemas nacidas sin contar la inicial. Número de ramificaciones. Para este parámetro se tomó como criterio que 5 yemas o más, constituyen una ramificación. Número de raíces. Se contaron todas las raíces desarrolladas por la planta. Longitud raíz. expresado en centímetros (cm), se midió la longitud de la raíz mayor de todas (raíz principal). 3.3. Aclimatación a condiciones externas. Se usaron 63 plantas (de las que se utilizaron 12 para análisis de pigmentos y otras 20 se reservaron para conocer los pesos fresco y seco iniciales) procedentes de la micropropagación in vitro. Estas plantas se sometieron a un periodo de aclimatación al exterior. Para ello, los individuos obtenidos se trasplantaron a vasos de propileno de 330cc de capacidad, que contenían previamente turba de SPHAGNUM regada a saturación. La turba contenía además arcilla (10 g/l), carbonato cálcico (8 g/l), fertilizante NPK 14:10:18 (1,5 kg/m3) y microelementos (1,5 g/l). En primer lugar se extrajo la planta del tubo de cristal, eliminando todo posible resto de medio de las raíces. Una vez fuera, se introdujo la planta por su sistema radicular en el sustrato. Seguidamente el conjunto se cubrió con una bolsa de polipropileno transparente y pulverizada con agua para evitar el marchitamiento inmediato de la planta (Figura 7). 19 Figura 7. Conjunto de imágenes que muestran el proceso de trasplante. Tras el trasplante, el conjunto de plantas depositadas en bandejas se llevaron a invernadero, con una temperatura controlada de entre 21 y 25 ºC, una humedad relativa de entre 40 y 60 % y luz natural (flujo mínimo y máximo de luz: 200 y 1000 μmol m-2 s-1, respectivamente) (Figura 8). Después de 10 días en estas condiciones, se realizaron gradualmente cortes de los picos de la bolsa que recubría la maceta (Figura 9), con el fin de que la adaptación a las condiciones externas fuera progresiva y total (Cantos y cols., 1993). Figura 8. Plantas en el invernadero. 20 Figura 13. Primera siembra de la variedad Pedro Ximénez. Figura 14. Tercera siembra de la variedad Pedro Ximénez. Respecto al número medio de yemas por planta, en la primera medida, 15 días, ya se vuelven a observar diferencias para este parámetro en los explantos de las tres siembras, ya que los de la tercera siembra muestran una media de 0.36, mientras que los de la segunda no desarrollan ninguna nueva yema (Tabla 1). Conforme transcurre el tiempo, la diferencia va haciéndose cada vez mayor a favor de las plantas de la tercera siembra que, tras 45 días de cultivo in vitro, llegan a mostrar de media 4.20 yemas por planta. Las de la segunda siembra superan con 3.85 cm, a las de la primera (2.97 cm). No obstante, no se encuentran diferencias estadísticas entre ambos valores. En relación a la capacidad de emitir ramificaciones laterales por parte de los explantos de Pedro Ximénéz, en la tabla 1 se observa que en la tercera siembra no se desarrolla ninguna ramificación lateral durante los 45 días de crecimiento de los explantos. 27 A los 30 únicamente en los explantos de la primera siembra se encuentran ramificaciones laterales y con un valor medio muy bajo, 0.04. Transcurridos 45 días los sembrados en la segunda siembra son los que desarrollan un número relativamente bajo de ramificaciones laterales, 0.69, aunque suficiente para ser estadísticamente superior (p≤0.05) al valor medio de 0.20 alcanzado por los explantos de la primera siembra. Los explantos de la tercera siembra son los más precoces en emitir raíces ya que son los únicos en enraizar a los 15 días con un 22,73% de explantos con raíz, por lo que ya podrían denominarse plantas. Transcurrido un mes se destacan los de la tercera y primera siembra con porcentajes superiores al 65%. Esta tendencia para estas siembras se mantiene a los 45 días, superando el 74% de plantas enraizadas, quedando las plantas de la segunda siembra en el 66.7%. El número medio de raíces por planta a los 15 días de la siembra es elevado (p≤0.05) en las plantas de la tercera siembra, 1.40. Como se puede observar en la tabla, a los 30 y 45 días, el número medio de raíces es muy similar en las plantas de las tres siembras alcanzando valores superiores a los 4.5 raíces por planta, sin diferencias entre ellos. La tabla 1 indica también las longitudes medias de raíces (cm) por planta de cada una de las siembras, tras los 45 días de duración del periodo de desarrollo in vitro. Las raíces de la tercera siembra, únicas que se desarrollan a los 15 días, alcanzan 0.62 cm de longitud media. Estas diferencias se mantienen durante los 45 días (p≤0.05) respecto a las plantas de la siembra primera, ya que las plantas de esta tercera siembra alcanzan los 11.1 cm de longitud media de raíz. Un valor muy próximo, al final del periodo de crecimiento, se registra en las plantas de la segunda siembra, 9.18, y ya menor (p≤0.05), 6.0, en las de la primera. 4.2. Adaptación a condiciones externas. 4.2.1 Respuesta de los individuos tras 45 días de cultivo in vitro . Para homogeneizar los datos, en el caso de la TRC se toma como peso seco inicial el del explanto en el momento de su establecimiento in vitro. En la tabla 2 se comparan los diferentes parámetros relacionados con los pesos fresco y seco del material vegetal en las diferentes fases de aclimatación consideradas después de 45 días de desarrollo in vitro. 28 Tabla 2. Comparación pesos fresco y seco, porcentajes de hidratación y tasa relativa de crecimiento (TRC) en cada una de las fases de adaptación consideradas tras 45 días de cultivo in vitro. Fase de adaptación Días desde inicio de adaptación Pf,T (g) Ps,T (g) HT (%) TRC (g/g-1/día) Directamente de tubo 00.43 a 0.19 b 58.1 a 0.079 b Corte 1er pico 8 0.51 a 0.07 a 86.31 c 0.059 a Corte 2º pico 11 0.61 a 0.12 ab 79.69 bc 0.072 ab Eliminación de la bolsa 15 0.38 a 0.09 ab 75.28 b 0.065 ab 7 días después de la eliminación de la bolsa 22 0.59 a 0.16 ab 74.88 b 0.077 b Letras distintas leídas en columna indican diferencias estadísticamente significativas (Test t Student; p≤0,05) para cada uno de los parámetros considerados en las diferentes fases de aclimatación Se observa en dicha tabla que el peso fresco del tallo en cada una de las fases de adaptación oscila entre los 0.38 y 0.61 gramos, sin diferencias estadísticas entre ellos. Los pesos secos del tallo están comprendidos entre los 0.07 gramos de las plantas en el momento de cortarle el primer pico a la bolsa y los 0.19 cuando salen directamente del tubo, diferentes (p≤0,05) entre sí. El resto de pesos secos se encuentran comprendidos entre ambos valores. En lo que se refiere a la humedad relativa de las plantas en cada una de las fases de adaptación, la más elevada se encuentra en las que se eliminó el primer pico de la bolsa, 86.31%, seguida de las plantas a las que se les cortó el segundo pico de la bolsa, 79.69%, que son similares estadísticamente. Las plantas con menor porcentaje de humedad y, por consiguiente, las que pierden más agua, son las que no tuvieron ninguna protección tras ser extraídas del tubo de ensayo, que conservan solamente un 58.1% de humedad. La tasa relativa de crecimiento (TRC) también varía dependiendo de la fase que se considere, así las que más crecen (p≤0,05) son las que se sacan inmediatamente del tubo y las que llevan 7 días sin protección con 0.079 y 0.077 gramos por gramo diario respectivamente, respecto a las obtenidas tras cortar el primer pico, 0.059, aunque similares estadísticamente a la TRC de las plantas de las macetas a las que se les cortó el segundo pico de la bolsa, 0.072 y a las medidas inmediatamente después de la retirada de la bolsa. 4.3. Evolución de la pérdida del contenido de agua. En este apartado se estudia la evolución cada 10 minutos, hasta alcanzar los 90, de la pérdida media de agua. Esta media se obtiene de la pesada de cada una de cinco plantas elegidas al azar, inmediatamente después del primer y segundo corte de pico de la bolsa, inmediatamente después de la retirada de la bolsa y tras 7 días en el invernadero carentes de bolsa. 29 En un control inicial donde se contabiliza los pesos frescos de raíz y tallo por separado de dos plantas tras sacarlas del tubo de ensayo, se observa que transcurridos 10 y 20 minutos, las pérdidas de agua de la raíz son mínimas (Figura 15), pérdidas de peso fresco de 0.004 y 0.02 gramos respectivamente, por lo que se asume que la raíz no incide de manera relevante en la pérdida de agua en la aclimatación de las plantas al exterior y el ensayo se lleva a cabo controlando las variaciones de peso fresco solamente en la parte aérea. Figura 15. Cuantificación de la pérdida de peso, contenido de agua, en la planta fuera del tubo de ensayo. En la figura 16 se observa la evolución del peso fresco del tallo de las plantas durante los 90 minutos inmediatamente después de extraídas del tubo de ensayo después de 45 días de cultivo in vitro. 30 En esta gráfica se observa una pérdida de peso fresco continuada desde la extracción de la planta del tubo, 0.43 gramos, hasta los 0.18 que se registran transcurridos 90 minutos, sin diferencias estadísticas entre ninguno de los pesos parciales incluidos el inicial y final a pesar de perderse 0.25 gramos entre ambos tiempos (Figura 17), lo que significa un 58.14%. Figura 17. Comparación del estado de turgencia de la planta tras 90 minutos sin protección. En la figura 18 se observa la evolución del peso fresco del tallo de las plantas durante los 90 minutos inmediatamente después de eliminarle un pico a la bolsa con la que se protegieron las planta tras el trasplante después de 45 días de cultivo in vitro. 31 Figura 16 Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas (Test t Student; p≤0,05) para cada uno de los controles parciales (cada 10 minutos) considerados. En este caso, como se observa en la figura 18, sí hay diferencias estadísticas (p≤0,05) entre los pesos secos parciales. Tras eliminar el primer pico de la bolsa el peso fresco medio es 0.51 gramos, similar estadísticamente a los registrados hasta los 50 minutos. A partir de los 60 minutos el peso fresco contabilizado es de aproximadamente 0.29 gramos ya diferente (p≤0,05) al inicial. También resultan estadísticamente inferiores los pesos frescos medidos a los 80 y 90 minutos respecto al inicial y al registrado a los 10 minutos. Se cuantifica una pérdida de peso fresco a los 90 minutos de 0.276 gramos respecto al inicial lo que representa una pérdida de agua del 54.12%. En la figura 19 se indica la evolución del peso fresco del tallo de las plantas inmediatamente después de eliminarle el segundo pico a la bolsa. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas (Test t Student; p≤0,05) para cada uno de los controles parciales (cada 10 minutos) considerados. 32 A A AB AB ABC BC C ABC ABC ABC A A A AB ABC EF F BCD CD DE Figura 19 Figura 18 Al igual que ocurriera tras el corte del primer pico, cuando se elimina el segundo se observa una diferencia importante en los pesos frescos de los controles parciales efectuados cada 10 minutos. En este caso, como se observa en la figura 16, el peso medio de las cinco plantas tomadas inicialmente, tiempo cero, es de 0.61 gramos, superior estadísticamente al registrado a los 20 minutos, que a su vez es significativamente mayor al cuantificado a los 50 minutos. Al final del periodo de mediciones el peso se reduce a 0.302 gramos, lo que significa un 50.5% de pérdida de agua. En la figura 20 se representa la evolución del peso fresco del tallo de las plantas de Pedro Ximénéz inmediatamente después de eliminar completamente la bolsa. En este caso, aunque se repite el descenso continuado del peso fresco, las diferencias entre los diferentes muestreos son mucho menores lo que se traduce en una ausencia de diferencias estadísticas entre los registros parciales. La diferencia entre los pesos inicial y final es de 0.1 gramos, lo que representa una pérdida de agua del 24.6%. Para finalizar con la última fase considerada en el proceso de aclimatación desde in vitro a ex vitro, en la figura 21 se indica la evolución de los pesos frescos medios de las plantas transcurrida una semana desde la desaparición de la bolsa. 33 Figura 20 Según se observa en la figura, la pendiente es mucho más suave que en las fases anteriores con diferencias mínimas entre el peso fresco inicial, 0.59, y final, 0.54 gramos, también sin diferencias estadísticas entre los diferentes controles intermedios. En consecuencia, la pérdida de peso es de sólo 0.05 gramos y, por consiguiente, la pérdida de agua es de sólo 8.5%. 4.4. Pigmentos fotosintéticos. En la tabla 3 se indican los contenidos de clorofila a, b y carotenoides (carotenos + xantofilas) en cada una de las fases de aclimatación consideradas. Tabla 3.- Comparación de los niveles medios de pigmentos fotosintéticos (µgg-1) en las hojas de Pedro Ximénéz cultivadas in vitro sobre medio VID, en las diferentes fases de aclimatación. Situación y días desde el trasplante entre paréntesis Cla µgg-1 Clb µgg-1 c+x µgg-1 Trasplante directamente de tubo (0) 2.06 b 0.64 b 0.54 b Corte 1er pico (8) 1.44 ab 0.43 ab 0.47 ab Corte 2º pico (11) 0.91 a 0.28 a 0.29 a Eliminación de la bolsa (15) 1.08 a 0.29 a 0.37 ab 7 días después de la eliminación de la bolsa (22) 1.05 a 0.23 a 0.37 ab Letras distintas leídas en columna indican diferencias estadísticamente significativas (Test t Student; p≤0,05) para cada uno de los parámetros considerados en las diferentes fases de aclimatación 34 Figura 21 Se observa en la tabla un descenso en la concentración de pigmentos. Los contenidos medios de clorofilas a y b son significativamente menores (p≤0,05) tras cortar el segundo pico de la bolsa. En el caso de los carotenoides, aunque también se observa una tendencia descendente, solamente hay diferencias significativas entre los contenidos medidos en el momento del trasplante y tras realizar el segundo corte de la bolsa. 4.5. Intercambio gaseoso. Tras medir la tasa de fotosíntesis neta, la tasa de conductancia estomática y la concentración de CO2 intercelular de las plantas consideradas, tanto inmediatamente después de eliminar completamente la bolsa, como a los 3 y 5 días tras dicha eliminación a tres intensidades lumínicas diferentes, se observa una ausencia total de función fotosintética por parte de la plantas en todas las medidas efectuadas. En las tablas 4 y 5 se indican respectivamente los valores medios de conductancia estomática y concentración de CO2 intercelular medidas simultáneamente con la tasa de fotosíntesis neta. Tabla 4.- Evolución de los valores medios de conductancia estomática (mmol m-2 s-1) en las hojas de Pedro Ximénéz en la fase de adaptación desde in vitro a condiciones externas medidos a diferentes intensidades luminosas. Intensidad lumínica (µmol fotones m-2 s-1) 0 días 3 días 5 días 200 -0.48 a A -0.11 b B -0.17 b A 600 -0.70 a A -0.15 b A -0.14 b B 1000 -0.78 a A -0.16 b A -0.15 b B Letras minúsculas distintas leídas en fila indican diferencias significativas (p≤0,05) entre días. Letras mayúsculas leídas en columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre intensidades lumínicas. En la tabla 4 se observa que en todos los casos la tasa de conductancia estomática presenta valores negativos. En todas las intensidades lumínicas ensayadas se observa un aumento de la conductancia estomática (p≤0,05) a los tres días de eliminada la bolsa. No obstante, este aumento no se mantiene a los cinco días presentando valores similares a los registrados tras 3 días sin bolsa. El efecto de la intensidad lumínica no es claro ya que, aunque la tasa de conductancia estomática muestra una tendencia a disminuir a medida que se incrementa la intensidad lumínica inmediatamente después de eliminar la bolsa, en ningún caso el descenso es significativo estadísticamente. Por otro lado, transcurridos tres días desde la eliminación de la bolsa, la conductancia estomática es mayor (p≤0,05) con 200 µmol fotones m-2 s-1 que con 600 y 1000, pero posteriormente, cuando han transcurrido 5 días la tendencia se invierte y la tasa de conductancia estomática es mayor con 600 y 1000 µmol fotones m-2 s-1. 35 Tabla 5.- Evolución de los valores medios del contenido de CO2 intercelular (µmol mol-1) en las hojas de Pedro Ximénéz en la fase de adaptación desde in vitro a condiciones externas medidos a diferentes intensidades luminosas. CO2 intecelular (µmol mol -1) 0 días 3 días 5 días 200 666.4 b A 406.6 ab A 386.6 a A 600 679.6 b A 400.0 a A 381.6 a A 1000 726.0 b A 396.8 a A 387.4 a A Letras minúsculas distintas leídas en fila indican diferencias significativas (p≤0,05) entre días. Letras mayúsculas leídas en columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre intensidades lumínicas. En la tabla 5 se advierte la ausencia de efecto de la intensidad luminosa sobre la concentración de CO2 intercelular en los tejidos de las hojas en todo el periodo muestreado posterior a la desaparición de la bolsa. Sí se observa en dicha tabla que a medida que las plantas se van adaptado tras eliminar la bolsa el CO2 intercelular va disminuyendo, sobre todo en los primeros 3 días de adaptación, ya que no se encuentran diferencias en este parámetro transcurridos dos días más sin protección. 36 Cañal, M.J.; Rodríguez, R.; Fernández, B.; Sánchez, R.; y Majada, J.P. (2001). Fisiología del cultivo in vitro. 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