Señalización intracelular mediada por sulfuro en arabidopsis thaliana

Señalización intracelular mediada por el sulfuro en Arabidopsis thaliana Tesis Doctoral Ana Mª Laureano Marín Sevilla 2016 Índice i Índice ....................................................................................................................................................... i Abreviaturas ....................................................................................................................................... iii Resumen ................................................................................................................................................. 1 Introducción ............................................................................................................................. 5 1. El azufre en las plantas ......................................................................................................... 7 1.1. Asimilación fotosintética del azufre ............................................................................ 8  Transporte ....................................................................................................... 8  Activación ....................................................................................................... 9  Reducción ..................................................................................................... 10 1.2. Biosíntesis de cisteína ................................................................................................ 10 1.3. DES1: una nueva L-cisteína desulfhidrasa ................................................................ 14 2. El sulfuro de hidrógeno ...................................................................................................... 19 2.1. Definición y propiedades físico-químicas .................................................................. 19 2.2. El H2S como molécula señal ...................................................................................... 20 2.2.1. Producción y catabolismo del H2S ....................................................................... 20  Mamíferos ..................................................................................................... 20  Plantas ........................................................................................................... 22 2.3. Mecanismos de acción del sulfuro ............................................................................. 24 2.3.1. El H2S como antioxidante .................................................................................... 24 2.3.2. S-sulfhidratación de proteínas.............................................................................. 25 2.4. Funciones fisiológicas del H2S .................................................................................. 28 2.4.1. Mamíferos ............................................................................................................ 28 2.4.2. Plantas .................................................................................................................. 29  Metales pesados y otros estreses iónicos ...................................................... 29  Estrés salino .................................................................................................. 30  Sequía............................................................................................................ 30  Estrés por calor ............................................................................................. 31  Estreses bióticos ............................................................................................ 31  Germinación .................................................................................................. 32  Movimiento estomático ................................................................................ 32  Fotosíntesis ................................................................................................... 33  Organogénesis y elongación de la raíz .......................................................... 33  Senescencia y post-cosecha .......................................................................... 33  Autofagia ...................................................................................................... 34 3. Autofagia en plantas ........................................................................................................... 34 3.1. Maquinaria molecular de la autofagia ........................................................................ 36  Iniciación ...................................................................................................... 37  Nucleación .................................................................................................... 37  Expansión del fagóforo y cierre del autofagosoma ....................................... 38 Índice ii  Transporte y fusión con la vacuola ............................................................... 41  Degradación del contenido y reciclaje .......................................................... 41 3.2. Regulación de la autofagia ......................................................................................... 41 3.2.1. Regulación por la vía TOR ................................................................................... 42 3.2.2. Regulación redox .................................................................................................. 43 3.2.3. Regulación por modificaciones post-traduccionales............................................. 45 3.3. Funciones fisiológicas de la autofagia en plantas ...................................................... 47 3.4. Estudio de la autofagia en plantas .............................................................................. 49 3.4.1. Detección de GFP-ATG8 por microscopía ........................................................... 49 3.4.2. Métodos bioquímicos ............................................................................................ 50 Objetivos .................................................................................................................................. 53 Capítulo I: Análisis de la regulación transcripcional de la proteína DES1, responsable de la generación de sulfuro en el citosol ................................................................................................ 57 Capítulo II: La regulación negativa de la autofagia por el sulfuro es independiente de las especies reactivas del oxígeno ................................................................................................................... 71 Anexo: La S-sulfhidratación de la proteína ATG4a regula la autofagia en Arabidopsis thaliana .....121 Discusión .................................................................................................................................137 Conclusiones ...........................................................................................................................151 Bibliografía .............................................................................................................................155 Abreviaturas iii ABREVIATURAS ABA Ácido abscísico ABC Casete de unión a ATP AIM Motivo de interacción con ATG8 AMPK Proteína quinasa activada por 5′-AMP AOA Ácido aminooxiacético APS Adenosin-5´-fosfosulfato APX Ascorbato peroxidasa ATP Adenosin-5´-trifosfato CAS-C1 β-Cianoalanina sintasa CAT Cisteína aminotransferasa CBS Cistationina β-sintasa CoA Coenzima A ConA Concanamicina A cPTIO 2-4-carboxifenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido CSE Cistationina γ-liasa CuZn SOD Superóxido dismutasa de cobre-zinc D-CDES D-cisteína desulfhidrasa DES1 L-cisteína desulfhidrasa 1 DHAR Dehidroascorbato reductasa DTT Ditiotreitol GABARAP/ Proteína asociada al receptor de GABA/ GATE potenciador de la ATPasa asociada al Golgi GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GFP Proteína fluorescente verde GPX Guaiacol peroxidasa GR Glutatión reductasa GS Glutamina sintetasa GSH Glutatión reducido GSSG Glutatión oxidado GSSH Glutatión persulfuro GST Glutatión S-transferasa HR Respuesta hipersensible IAA Ácido indolacético LC3 Cadena ligera 3 L-CDES L-cisteína desulfhidrasa MBSM Método modificado del “Biotin Switch” MDA Malondialdehído MPT Modificación post-traduccional MSBT Metilsulfonil benzotiazol 3-MST 3-Mercapto piruvato sulfurtransferasa MV Metilviológeno OAS O-Acetilserina OASTL O-Acetilserina(tiol)liasa PAPS 3´-Fosfoadenosina-5´-fosfosulfato PAS Estructura pre-autofágica Abreviaturas iv PCD Muerte celular programada PE Fosfatidiletanolamina PI3K Fosfatidilinositol 3- quinasa PI3P Fosfatidilinositol 3-fosfato PKA Proteina quinasa A PLP Piridoxal-5´-fosfato PPi Pirofosfato inorgánico PTP1B Tirosín fosfatasa 1B RCB “RuBisCO containing bodies” ROS Especies reactivas del oxígeno RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real RuBisCO Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa SA Ácido salicílico SAR Resistencia sistémica adquirida SAT Serina acetiltransferasa SAV Vacuola asociada a senescencia SCS Sulfocisteína sintasa SED Defensa potenciada por azufre SiR Sulfato reductasa SIR Resistencia inducida por azufre SOD Superóxido dismutasa TOR “Target of rapamiycin” γ-ECS γ-Glutamilcisteína sintetasa Resumen Introducción 9! ! Los transportadores de sulfato son una familia de proteínas transmembrana que se diferencian según su localización y su afinidad por el sulfato. Arabidopsis thaliana posee 12 genes SULTR que pueden dividirse en cuatro grupos diferentes. Los miembros del grupo SULTR1 son los denominados transportadores de alta afinidad. Dentro de este grupo, SULTR1;1 y SULTR1;2 se localizan en las raíces y son responsables de la incorporación del sulfato desde el exterior al interior de la planta y se inducen en condiciones de deficiencia de azufre (Takahashi et al., 2000; Yoshimoto et al., 2002). SULTR 1;3, por su parte, se localiza en el floema y participa en la redistribución de sulfato desde los tejidos fuente a los sumideros (Yoshimoto et al., 2003). Los transportadores del grupo 2 (SULTR2;1 y SULTR2;2) son los denominados de baja afinidad y participan en el transporte a larga distancia (Takahashi, 2010). El primer transportador caracterizado dentro del tercer grupo fue SULTR3;5 que modula la función de SULTR2;1 pero que no actúa como un transportador per-se (Kataoka et al., 2004). Los otros miembros de este grupo se encargan de internalizar el sulfato dentro de los plastidios donde tiene lugar la reducción hasta sulfuro (Cao et al., 2013). Por último, los transportadores del grupo 4 se localizan en el tonoplasto y facilitan la salida de sulfato almacenado en la vacuola para suplir las necesidades de azufre de la planta (Kataoka et al., 2004). El transporte de sulfato al interior de las células es considerado el paso más regulado de la ruta de asimilación de azufre en la planta (Vauclare et al., 2002) fundamentalmente a nivel transcripcional (Davidian y Kopriva, 2010). • Activación Una vez el sulfato ha entrado en la planta, puede ser almacenado en raíces u hojas en el interior de las vacuolas o ser utilizado en el proceso de asimilación (Bolchi et al., 1999). El sulfato tiene que ser reducido hasta sulfito, pero el potencial de óxido-reducción del par redox sulfato/sulfito a pH 7,0 es extraordinariamente negativo, E´o[SO42-/ SO32-]= -516 mV. Al no existir donadores fisiológicos de electrones con potenciales redox tan negativos, la reducción directa del sulfato no es posible, por lo que, el sulfato inorgánico tiene que ser previamente activado. Las ATP sulfurilasas (EC 2.7.7.4) catalizan la activación del sulfato hidrolizando la unión entre los fosfatos alfa y beta del ATP y añadiendo sulfato al fosfato alfa. La energía almacenada en el enlace anhidro fosfato-sulfato del producto de la reacción, adenosín 5´-fosfosulfato (APS), permite la reducción posterior del sulfato (Figura 1). Existen 4 genes que codifican distintas isoenzimas ATP sulfurilasas en Arabidopsis, de las cuales tres están localizadas en plastidios y una en el citosol (Hatzfeld et al., 2000; Mugford et al., 2011). La reacción de adenilación del sulfato está desplazada hacia la formación de ATP, por ello los productos de la reacción, APS y Introducción 10! ! pirofosfato (PPi), deben ser mantenidos a baja concentración por las enzimas pirofosfatasas, APS reductasas y APS quinasas. Estas últimas metabolizan el APS, catalizando la fosforilación dependiente de ATP del APS en la posición 3´ dando lugar a 3´-fosfo adenosina-5´-fosfosulfato (PAPS). PAPS es la forma activa del sulfato usada para la síntesis de compuestos secundarios sulfatados en plantas. La presencia de actividad ATP sulfurilasa y APS quinasa en el citosol está ligada a la síntesis de PAPS, que es sustrato de sulfotranferasas que catalizan sulfataciones, donando grupos sulfatos a otros metabolitos como sulfolípidos y glucosinolatos. Todas estas enzimas sulfotransferasas que catalizan estas reacciones se encuentran en el citosol (Rotte y Leustek, 2000; Wittstock y Halkier, 2002; Mugford et al., 2011). • Reducción En los plastidios de hojas y raíces, en una primera reacción, el residuo de sulfato del APS es reducido hasta sulfito por la APS reductasa (EC 1.8.99.2) y en una segunda reacción el sulfito es reducido hasta sulfuro por la sulfito reductasa (SiR) (EC 1.8.7.1) (Figura 1). Arabidopsis contiene tres genes que codifican APS reductasas. Estas enzimas poseen un dominio reductasa en su extremo N-terminal y un dominio C-terminal con actividad análoga a las tiorredoxinas y glutarredoxinas que interacciona con el donador de electrones que es glutatión reducido (Gutierrez-Marcos et al., 1996). Además del transporte de sulfato, el paso de la ruta más regulado es el llevado a cabo por las APS reductasas. Las APS reductasas se regulan por el estado nutricional de azufre en las plantas, puesto que se inducen en condiciones de deficiencia de azufre y se inhiben por la presencia de azufre reducido, como sulfuro (H2S), cisteína o GSH (Kopriva y Koprivova, 2004). La SiR de plantas es una proteína formada por dos subunidades de 70kD que contiene un grupo sirohemo y una agrupación sulfo-férrica (4Fe-4S) como grupos prostéticos. La ferredoxina actúa como donador fisiológico de los seis electrones necesarios para la reducción del sulfito por la SiR. En el genoma de Arabidopsis thaliana existe un solo gen que codifica una SiR y se ha demostrado que la disminución de esta actividad se traduce en una respuesta significativa en el metabolismo primario y secundario (Khan et al., 2010). 1.2. Biosíntesis de cisteína La última etapa de la asimilación fotosintética de sulfato, la incorporación del sulfuro a esqueletos carbonados, conlleva la formación de la molécula de cisteína. La biosíntesis de cisteína se produce mediante la reacción secuencial de dos enzimas: la serina acetiltransferasa (SAT, EC 2.3.1.30) que produce el intermediario O-acetilserina (OAS) a partir de acetilcoenzima A (acetil-CoA) y serina, y la O-acetilserina (tiol) liasa (OASTL, EC 2.5.1.47), la cual incorpora el sulfuro a la OAS produciendo cisteína, esta última enzima requiere piridoxal 5´- fosfato (PLP) como cofactor (Figura 2) (Barroso, 1997). Introducción 11! ! Figura 2: Reacciones enzimáticas catalizadas por la Serina acetiltransferasa (SAT) y la O- Acetilserina(tiol)liasa (OASTL). Estas dos enzimas forman el complejo hetero-oligomérico cisteína sintasa, inicialmente descrito en bacterias y más tarde estudiado en plantas. Las interacciones entre las proteínas dentro del complejo modifican sustancialmente las propiedades cinéticas de la SAT, haciéndola más eficiente para la producción de OAS. En cambio, la OASTL es más activa en su forma libre y su actividad se ve drásticamente reducida cuando se encuentra formando parte del complejo junto con la SAT (Droux et al., 1998; Wirtz y Hell, 2006). La formación de este complejo proporciona un mecanismo efectivo para modular la producción de cisteína, y es dependiente de las cantidades relativas de sulfuro y OAS disponibles, por lo que ha sido considerado un sensor del azufre intracelular de la planta (Yi et al., 2010). Las células vegetales contienen diferentes isoformas de ambas enzimas, SAT y OASTL, localizadas en el citosol, cloroplastos y mitocondrias, lo que resulta en la existencia de diferentes conjuntos o “pools” subcelulares de cisteína. Sin embargo, el citosol es el compartimento donde se sintetiza la mayor parte de la cisteína, a pesar de que las moléculas precursoras de ésta, OAS y sulfuro, se sintetizan mayoritariamente en la mitocondria y el cloroplasto, respectivamente (Figura 3). La planta modelo Arabidopsis thaliana es la planta más investigada y en su genoma se han identificado cinco genes SAT (Howarth et al., 2003) y nueve OASTL (Wirtz et al., 2004) (Tabla 1). El hecho de que exista un mayor número de isoformas OASTL que de SAT llevó a cuestionar si todas las OASTL forman complejos con sus respectivas SAT o si algunas OASTL de Arabidopsis tienen funciones diferentes a la de síntesis de cisteína, como ha sido demostrado por nuestro grupo recientemente. En A. thaliana, las isoformas SAT y OASTL más abundantes a nivel transcripcional están codificadas por los genes SAT5 (At5g56760) y OAS-A1 (At4g14880), y se localizan en el citosol. Las mayoritarias en el cloroplasto están codificadas por SAT1 (At1g55920) y OAS-B (At2g43750), y SAT3 (At3g13110) y OAS-C (At3g59760) codifican las isoformas mitocondriales (Barroso et al., 1995; Howarth et al., 2003; Haas et al., 2008; Heeg et al., 2008; López-Martín et al., 2008; Watanabe et al., 2008a; Watanabe et al., 2008b) (Figura 3). Introducción 12! ! Las enzimas SAT de plantas contienen 2 dominios muy conservados: el dominio N- terminal, donde predominan estructuras α-hélices, está involucrado en la interacción proteínaproteína entre las subunidades SAT, mientras que el dominio C-terminal esencial para la catálisis y la interacción de SAT con OASTL posee una estructura de hojas β plegadas (Wirtz y Hell, 2006). Las isoformas mayoritarias SAT5, SAT1 y SAT3 comparten entre ellas una mayor homología de secuencia, a pesar de albergar las dos últimas sus correspondientes péptidos de tránsito. Sin embargo, las secuencias C-terminales de las isoformas minoritarias SAT2 y SAT4, localizadas en el citosol, difieren considerablemente de las anteriores. Éstas presentan una baja afinidad por los sustratos serina y acetil-CoA y se postula que podrían no interaccionar con las OASTLs en el complejo cisteína sintasa, por lo que se cree que pueden desempeñar funciones metabólicas diferentes o adicionales a la de la síntesis de OAS (Kawashima et al., 2005). A pesar de ello, las cinco isoformas SAT presentan una redundancia funcional in vivo, lo que indica que tanto SAT4 como SAT2 son suficientes para la supervivencia de la planta (Watanabe et al., 2008b). El 90% de la actividad SAT reside en la mitocondria mientras que el resto se reparte entre el cloroplasto y el citosol (Droux, 2003), por lo que la mitocondria es el compartimento subcelular donde se sintetiza la mayoría de la OAS a través de la acción de SAT3 (Figura 3). Otra diferencia entre las distintas isoformas SAT de Arabidopsis es la sensibilidad que presentan a la inhibición por cisteína. SAT5 y SAT4 son muy sensibles a la retro-inhibición por cisteína, la isoforma SAT3 exhibe una sensibilidad intermedia mientras que la actividad de SAT1 y SAT2 no se ve afectada por la presencia de cisteína (Noji et al., 1998; Wirtz et al., 2001; Kawashima et al., 2005). La enzima OASTL es un homodímero de 60-70 kDa de peso molecular que contiene como grupo prostético dos moléculas de PLP por dímero (León et al., 1987). Las proteínas pertenecientes a esta familia poseen diferentes grupos de aminoácidos conservados involucrados en la unión al cofactor, en la unión al sustrato OAS , en la incorporación del sulfuro así como en la interacción con SAT (Bonner et al., 2005). Las isoformas OASTL mayoritarias (OAS-A1, OAS-B y OAS-C) son consideradas auténticas OASTL porque catalizan la síntesis de cisteína a partir de OAS y sulfuro, y por su capacidad para interaccionar con SAT, lo que ha sido demostrado en varios trabajos (Bonner et al., 2005; Heeg et al., 2008; Jez y Dey, 2013). En la mitocondria existe además otra isoforma OASTL mayoritaria denominada CAS-C1 (At3g61440), previamente CYS-C1, que posee actividad β-cianoalanina sintasa (CAS) (Hatzfeld et al., 2000; Yamaguchi et al., 2000) (Figura 3). Esta enzima cataliza la conversión de cisteína y cianuro en sulfuro y β-cianoalanina. El sulfuro producido en esta reacción es utilizado como sustrato para la formación de cisteína por la OAS-C. Así, se genera un ciclo donde la OAS-C sintetiza cisteína que es usada a su vez por la CAS-C1 para destoxificar el cianuro y en cuya reacción se forma sulfuro que cierra el ciclo incorporándose a la ruta de síntesis de cisteína por OAS-C (Álvarez et al., 2012c). La actividad CAS mitocondrial es esencial para mantener Introducción 13! ! bajos los niveles de cianuro, permitiendo el correcto desarrollo de los pelos radicales e interviniendo en la respuesta de la planta a la infección por patógenos. Estos estudios proponen a la molécula de cianuro como una nueva molécula señalizadora en plantas (García et al., 2010; García et al., 2013; García et al., 2014). El resto de proteínas OASTL, como CYS-D1 (At3g04940), CYS-D2 (At5g28020) y DES1 (At5g28030) en el citosol y SCS (At3g03630) en el cloroplasto (Figura 3), presenta niveles de expresión inferiores a las isoformas arriba descritas y fueron identificadas por homología de secuencia una vez completado el genoma de A. thaliana. Aunque inicialmente a estas isoformas minoritarias se les atribuyó un papel auxiliar con respecto a las principales isoformas, recientes investigaciones realizadas con SCS y DES1 han aportado información acerca de sus funciones y de las reacciones enzimáticas que catalizan (Gotor et al., 2010). SCS (previamente denominada CS26) es una S-sulfocisteína sintasa localizada en el lumen tilacoidal que cataliza la incorporación de tiosulfato al esqueleto OAS para formar S-sulfocisteína. Esta actividad enzimática presente en bacterias, ha sido descrita por primera vez en plantas y parece ser esencial para el correcto funcionamiento del aparato fotosintético en condiciones de crecimiento de día largo; además, podría actuar como un sensor del estado redox del cloroplasto (Bermúdez et al., 2010; Bermudez et al., 2012; Gotor y Romero, 2013). Figura 3: Representación esquemática de la localización subcelular de las enzimas SAT y OASTL en Arabidopsis thaliana. Las isoformas con actividad SAT se muestran en rojo y las isoformas OASTL en azul. El metabolito más abundante en cada compartimento celular aparece con un formato de letra más grande. Las isoformas OASTL y SAT minoritarias con función por determinar aparecen escritas con un signo de interrogación. Introducción 14! ! Tabla 1: Genes SAT y OASTL presentes en el genoma de A. thaliana. 1.3. DES1: una nueva L-cisteína desulfhidrasa Nuestro grupo ha caracterizado una de las isoformas OASTL minoritarias presentes en el citosol, conocida como CS-like (“cysteine synthase-like”). Mediante la expresión, purificación y caracterización bioquímica de la proteína recombinante se ha determinado que CS-like no es una verdadera OASTL con una función auxiliar como se creía, sino una nueva L-cisteína desulfhidrasa (E.C 4.4.1.1) que cataliza la desulfuración de cisteína produciendo sulfuro, amonio y piruvato, y ha sido nombrada como DES1 (Álvarez et al., 2010) (Figura 3). Esta conclusión proviene principalmente de nuestros estudios enzimáticos llevados a cabo con la proteína recombinante DES1, que durante el proceso de purificación mostró un incremento específico de la actividad desulfhidrasa en comparación con otras actividades enzimáticas que fueron ensayadas. Además, se caracterizaron los productos de la reacción catalizada por DES1, se determinó la estequiometría y se calcularon las constantes cinéticas de la reacción enzimática, mostrándose que la afinidad que presentaba por la L-cisteína como sustrato era 10 veces superior a la que presentaba por la OAS. Una característica fundamental de las OASTL es su capacidad para interaccionar con SAT. A pesar de la alta homología existente entre DES1 y el resto de OASTLs, un alineamiento realizado comparando las secuencias proteicas de DES1 y OAS-A1 ha revelado que la región responsable de la interacción con SAT no se encuentra conservada en la secuencia de DES1. Además, se han observado diferencias en los aminoácidos que forman un lazo implicado en la incorporación de sulfuro para formar Introducción 15! ! cisteína. Sin embargo, DES1 es una enzima PLP-dependiente ya que la región que interacciona con el cofactor se encuentra conservada en su secuencia (Álvarez et al., 2010). Estos resultados apoyan los ensayos enzimáticos anteriores y los realizados por otros investigadores que indicaban que la proteína DES1 no era una verdadera OASTL sino una proteína con una actividad enzimática L-cisteína desulfhidrasa (Riemenschneider et al., 2005a). El estudio de los mutantes de inserción de T-DNA del gen DES1 ha permitido demostrar el impacto y la funcionalidad de DES1 en el metabolismo de la cisteína. La caracterización bioquímica de los mutantes de DES1, des1-1 y des1-2, ha permitido determinar que la actividad L-cisteína desulfhidrasa es menor en los dos mutantes, y como consecuencia, el contenido de cisteína citosólica es entre un 20-25 % superior al que presentan sus respectivos ecotipos silvestres (Figura 4). El contenido en GSH también es superior en los mutantes. Como consecuencia del incremento en el contenido de cisteína citosólica, los mutantes presentan una desregulación de los genes SULTR y APS reductasa implicados en la ruta de asimilación del sulfato, lo que pone de manifiesto la importancia de la mutación de DES1 en el metabolismo de la planta. Los mutantes des1 presentan además una mayor capacidad antioxidante y acumulan menos especies reactivas del oxígeno (ROS) en presencia de metales como el cadmio (Figura 5A) o de compuestos oxidantes como el peróxido de hidrógeno (H2O2) en comparación con las plantas silvestres, lo que se traduce en una menor sensibilidad de los mutantes des1 a estos estreses (Figura 5B) (Álvarez et al., 2010). Por otro lado, la mutación en DES1 produce una aceleración de la senescencia y como consecuencia, los mutantes presentan un fenotipo de floración temprana (Figura 5C) y una mayor expresión de genes asociados a senescencia como SAG12 (gen que codifica una cisteín-proteasa inducida específicamente durante la senescencia y poco afectada por factores ambientales), PR1 (gen de respuesta a ácido salicílico) y NAP (miembro de la familia de factores de transcripción NAC) en comparación con las plantas silvestres. Datos obtenidos a partir de la plataforma online Genevestigator muestran que el mayor nivel de expresión de DES1 se alcanza durante la senescencia de la planta, lo que coincide con los resultados obtenidos por nuestro grupo y pone de manifiesto la importancia de DES1 durante esta etapa del desarrollo. La senescencia está asociada con una intensa actividad proteolítica que conlleva la liberación de cisteína, por lo que la desulfuración de este aminoácido debe ser una forma de evitar su acumulación en la célula así como de las especies tóxicas derivadas de esta molécula. Estos resultados demuestran el importante papel de DES1 en el mantenimiento de la homeostasis de cisteína en el citosol de forma coordinada con la OAS-A1 en determinados estadíos del desarrollo o bajo ciertas perturbaciones ambientales. El citosol es el principal compartimento donde se sintetiza cisteína en la célula (Figura 3), y además de las importantes funciones de este aminoácido en el metabolismo primario y secundario de la planta, no hay que olvidar que la cisteína es tóxica cuando alcanza una Introducción 16! ! determinada concentración ya que puede promover la generación de ROS en presencia de hierro mediante la reacción de Fenton (Park y Imlay, 2003). En relación también con los mutantes des1, en nuestro laboratorio se ha estudiado el papel de la cisteína citosólica en la respuesta de la planta a la infección por distintos patógenos. Para ello, se han empleado mutantes des1 y mutantes oas-a1 que presentan un incremento y una disminución del contenido de cisteína citosólica, respectivamente. La alteración del contenido en cisteína en los mutantes afecta a la resistencia basal que presentan frente al ataque de patógenos; por un lado, los mutantes des1 muestran una mayor resistencia a los agentes patógenos, mientras que los mutantes oas-a1 exhiben el fenotipo opuesto, es decir, son más sensibles a las infecciones. Los resultados obtenidos tras el análisis transcriptómico de los genes relacionados con la respuesta inmune y la cuantificación de la expresión por RT-PCR cuantitativa reforzaron la hipótesis de la implicación de la cisteína en la respuesta al estrés biótico en las plantas. En el caso de los mutantes des1, los niveles de ácido salicílico (SA) son superiores a los que presentan las plantas silvestres, así como los niveles de expresión de los genes WRKY54 (factor de transcripción implicado en inmunidad) y PR1, cuya expresión es constitutiva (Álvarez et al., 2012a). Debido a esto, los mutantes des1 exhiben una resistencia sistémica adquirida (SAR) constitutiva, lo que los hace más resistentes a la infección por patógenos biótrofos y necrótrofos (Figura 5D). Figura 4: Situación en el mutante des1. La supresión de DES1 provoca un aumento del contenido en cisteína y una disminución de los niveles de H2S en el citosol de A. thaliana. Debido a la reacción que cataliza DES1, su deficiencia no solo produce un incremento en el contenido de cisteína en el citosol, sino que también provoca una disminución de los niveles de H2S en este mismo compartimento (Figura 4). Los resultados obtenidos mediante el estudio y la caracterización de la proteína DES1 así como de los efectos de su mutación, junto con el creciente número de artículos científicos que describen el papel señalizador de la molécula de H2S en las plantas, nos hizo plantearnos si el sulfuro generado por la acción de la proteína DES1 participa en la regulación de determinados procesos fisiológicos en los sistemas vegetales. Introducción 17! ! Los mutantes des1 presentan una reducción del 30% en el contenido total de H2S en el citosol en comparación con las plantas silvestres y esta variación en la cantidad de H2S presente en la célula tiene importantes consecuencias fisiológicas en los mutantes. El fenotipo de senescencia prematura y la inducción transcripcional de genes asociados a senescencia que presentan los mutantes des1 (Álvarez et al., 2010) fue analizado en mayor profundidad por nuestro grupo de investigación en un trabajo posterior. Durante la senescencia foliar, en las células del mesófilo tiene lugar la formación de novo de unas vesículas denominadas vacuolas asociadas a senescencia (SAVs). Estas SAVs se observan en los protoplastos de los mutantes des1, y no en las plantas silvestres (Álvarez et al., 2012b) (Figura 5E). Las SAVs contienen gran cantidad de proteasas en su interior como SAG12. Como se había demostrado con anterioridad, el mutante des1 presenta una inducción de SAG12 y otros genes implicados en senescencia (Álvarez et al., 2010). El análisis transcripcional realizado en plantas mutantes des1 y plantas silvestres ha revelado una alteración del perfil transcripcional en los mutantes a los 30 días de crecimiento, donde han sido contabilizados un total de 1624 genes desregulados (Figura 5F). En estadíos más tempranos, a los 20 días de cultivo, solo 24 genes se expresan de forma desigual. De los genes desregulados en los estadíos más tardíos de crecimiento (30 días), una gran proporción codifican proteínas relacionadas con la ubiquitinación y se sabe que esta ruta interviene activamente en la degradación de proteínas durante la senescencia (Yoshida, 2003; Lin y Wu, 2004). Está ampliamente aceptada la conexión entre la senescencia y la autofagia y la mayoría de genes implicados en autofagia que han sido descritos inicialmente en levaduras han sido identificados en Arabidopsis y otras plantas (Doelling et al., 2002; Yoshimoto et al., 2009). La deficiencia en DES1 produce también una inducción del proceso autofágico en las plantas mutantes, que se caracteriza por la acumulación de la proteína autofágica ATG8 en su forma libre y en su forma lipidada (ATG8-PE) (Álvarez et al., 2012b) (Figura 5G). Puesto que la mutación de DES1 provoca la disminución de la generación de H2S en el citosol de Arabidopsis, el restablecimiento de la capacidad de generar H2S en este compartimento celular, ya sea mediante la adición exógena de compuestos donadores de sulfuro como el NaSH o el Na2S o por complementación genética, elimina las diferencias fenotípicas observadas entre los mutantes des1 y las plantas silvestres. El sulfuro exógeno revierte el fenotipo de senescencia prematura, la presencia de SAVs, la alteración del perfil transcripcional y la inducción de la autofagia (Álvarez et al., 2012b). El efecto del sulfuro como regulador negativo de la autofagia no se limita a lo observado en los mutantes des1. En plantas silvestres de A. thaliana cultivadas en limitación de carbono (oscuridad), condición conocida por activar el proceso de autofagia, el H2S revierte esta inducción disminuyendo la acumulación tanto de la proteína ATG8 soluble como de su forma lipidada (Álvarez et al., 2012b). Introducción 18! ! Estos resultados indican que el sulfuro generado en el citosol a partir de la degradación de la cisteína por DES1 actúa como un regulador negativo de la autofagia y un modulador del perfil transcripcional de Arabidopsis y estos efectos son independientes del estado nutricional de azufre de la planta. Por lo tanto, DES1 no solo es responsable de mantener la homeostasis de cisteína en el citosol de forma coordinada con OAS-A1, sino que también modula la producción de H2S con fines señalizadores en dicho compartimento celular (Álvarez et al., 2012b; Gotor et al., 2013; Romero et al., 2013). En esta Tesis Doctoral se ha profundizado en el estudio de la proteína DES1. Se ha realizado un análisis in silico de la secuencia promotora de DES1 así como de su expresión espacio-temporal en plantas de A.thaliana (Laureano-Marín et al., 2014). Figura 5: Características fenotípicas del mutante des1. Los mutantes des1 presentan una mayor capacidad antioxidante en presencia de cadmio, A) acumulan menos H2O2 (color verde) en las raíces y B) exhiben una mayor tasa de supervivencia que las plantas silvestres. C) Además los mutantes se caracterizan por su fenotipo de senescencia prematura y D) de resistencia a diferentes tipos de patógenos. E) La deficiencia en DES1 provoca la formación de novo de SAVs (color amarillo) en las células del mesófilo de los mutantes así como F) la alteración del perfil transcripcional a los 30d de cultivo y G) la Introducción 25! ! molécula, lo que permite la reacción del sulfuro con el oxígeno, el H2O2 o el peroxinitrito (ONOO-), actuando de esta forma como un antioxidante (Kabil y Banerjee, 2010). Además de esta reacción directa del sulfuro con compuestos de oxígeno se han sugerido otros mecanismos en los que el H2S actuaría con una función antioxidante, tales como los descritos a continuación. El GSH es el principal antioxidante intracelular y la disminución de sus niveles produce una acumulación de ROS en la célula. El efecto antioxidante del H2S puede ser también consecuencia de su capacidad de incrementar los niveles de GSH mediante la inducción de la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa (γ-ECS), que participa en la síntesis de glutatión, y el transporte de cisteína, como se ha descrito en las neuronas (Kimura y Kimura, 2004). Además, el H2S puede reaccionar directamente con una molécula de GSSG y producir persulfuro de glutatión (GSSH) que presenta un mayor poder reductor que el que posee el GSH o el H2S, tal como se ha demostrado en varias investigaciones (Rohwerder y Sand, 2003; Ida et al., 2014). El H2S inhibe los efectos citotóxicos del ONOO- formado por la reacción entre el NO y el anión superóxido (O2-). El efecto antioxidante del H2S parece deberse a su reacción directa con el ONOO-, con la concomitante formación de sulfinilnitrito (HS(O)NO). Este nuevo producto tiene además el potencial de liberar NO a la vez que neutraliza los efectos apoptóticos y oxidantes del ONOO- (Filipovic 2012). La enzima superóxido dismutasa de Cobre-Zinc (CuZn SOD) contiene un azufre sulfano (S0) formando un enlace entre dos residuos de cisteína presentes en cada uno de los monómeros que forman el dímero. Este enlace puede albergar hasta un total de siete átomos de azufre (You et al., 2010). La estabilidad y actividad de la CuZn SOD aumenta en presencia de NaSH, que promueve la formación de los persulfuros, por lo que las propiedades antioxidantes atribuidas al H2S pueden deberse, en parte, a este efecto (Sun et al., 2012). 2.3.2. S-sulfhidratación de proteínas El segundo mecanismo propuesto por el que la señal generada por H2S es transformada en una respuesta biológica es conocido como S-sulfhidratación. Este mecanismo implica la modificación post-traduccional del grupo tiol (R-SH) de los residuos de cisteína de las proteínas y la generación de grupos persulfuro (R-SSH) (Mustafa et al., 2009; Paul y Snyder, 2012) . El mecanismo químico mediante el cual se produce esta modificación es objeto de controversia y parece que son necesarias diferentes reacciones químicas para que se lleve a cabo. Algunos autores indican que, dependiendo del ambiente que rodee al grupo tiol del residuo de cisteína, éste puede formar un anión tiolato (R-S-) que puede ser posteriormente oxidado por ROS generando de esta forma un residuo sulfénico (R-SO), que en última instancia reacciona con el H2S (como HS- o como H2S) para formar el grupo persulfuro (R-SSH) (Krishnan et al., 2011). Introducción 26! ! Otros autores proponen que la reacción entre el H2S y el oxígeno produce azufre sulfano (S0) que después interacciona con el grupo tiol para producir el persulfuro (Toohey, 2011). La transformación de un grupo R-SH en un grupo R-SSH puede modificar la reactividad química de las enzimas o la función específica de las proteínas no enzimáticas y posiblemente puede influir en su accesibilidad a sus respectivas dianas. En mamíferos, se ha estudiado en detalle los efectos de la S-sulfhidratación sobre determinadas proteínas. La actividad de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se ve incrementada por la S-sulfhidratación de un residuo de cisteína, Cys150, que casualmente es el mismo residuo identificado como diana de la S-nitrosilación. La modificación de un mismo residuo de cisteína por ambos tipos de modificaciones post-traduccionales podría suponer un mecanismo de regulación adicional de la actividad de esta proteína (Mustafa et al., 2009). Los canales de potasio dependientes de ATP (KATP) constituyen otra de las dianas biológicas de la S-sulfhidratación mejor caracterizadas en mamíferos. El H2S provoca la S- sulfhidratación de un residuo de cisteína, Cys43, localizado en la subunidad estructural Kir6.1 de los canales de KATP. Esta S-sulfhidratación provoca una activación del canal, con la consiguiente despolarización de la membrana y cierre de los canales de Ca2+, lo que produce la relajación de la musculatura lisa que envuelve a los vasos sanguíneos disminuyendo con ello la presión arterial (Mustafa et al., 2011). Aunque la S-sulfhidratación normalmente activa a sus proteínas diana, la actividad de la proteína tirosín fosfatasa 1B (PTP1B) disminuye como consecuencia de esta modificación post-traduccional sobre el residuo de cisteína catalítico, Cys215. Esta cisteína se localiza en un entorno químico que hace que el grupo tiol se encuentre en forma de tiolato (R-S-) lo que incrementa su reactividad y la hace más susceptible a posibles modificaciones (Krishnan et al., 2011). Además de modular la actividad de algunas proteínas, también se ha demostrado que la S-sulfhidratación modifica la interacción entre proteínas, como ocurre con la interacción entre Keap1 y Nrf2 implicada en la respuesta antioxidante en ratones (Yang et al., 2013). De forma similar a lo descrito en mamíferos, la investigación desarrollada por nuestro grupo ha demostrado que la S-sulfhidratación también se produce de forma fisiológica en plantas de Arabidopsis cultivadas en ausencia de estrés (Aroca et al., 2015). Un total de 106 proteínas sulfhidratadas fueron identificadas, algunas de las cuales habían sido previamente descritas en sistemas animales como la actina, la catalasa, la glutamina sintetasa (GS), la GAPDH y la β-tubulina, entre otras (Aroca et al., 2015). La S-sulfhidratación de la proteína GS produce una disminución de su actividad, en cambio, la GAPDH y la ascorbato peroxidasa (APX) ven incrementadas sus actividades cuando son sulfhidratadas. El tratamiento con ditiotreitol (DTT) revierte estos efectos en las tres proteínas, lo que significa que la modificación llevada a cabo por el H2S en estas enzimas es reversible y por tanto puede tener una función fisiológica (Aroca et al., 2015). Hemos demostrado además que la Cys32 de la Introducción 27! ! proteína APX citosólica es el residuo específico que sufre la modificación por S-sulfhidratación. Este residuo, que se localiza en el sitio activo, sufre otras modificaciones post-traduccionales como S-nitrosilación, glutationilación y oxidación, lo que sugiere que esta enzima debe estar finamente regulada en condiciones ambientales específicas (Aroca et al., 2015). La detección selectiva de proteínas modificadas mediante S-sulfhidratación en mamíferos y en Arabidopsis thaliana se ha realizado empleando una versión modificada del “Biotin Switch Metod” (MBSM) utilizado para la detección de proteínas modificadas por S-nitrosilación (Sell et al., 2008; Mustafa et al., 2009). Sin embargo, debido a la controversia que ha surgido en relación con la especificidad del MSBM, se ha establecido un nuevo método para la detección de proteínas modificadas post-traduccionalmente por S-sulfhidratación, el denominado “Tag- Switch Assay” (Zhang et al., 2014) (Figura 9). Figura 9: Representación esquemática del “Tag-Switch Assay” empleado para la detección de proteínas S-sulfhidratadas en esta Tesis. En un primer paso, el agente bloqueante metilsulfonil benzotiazol (MSBT) reacciona con los grupos tioles y los grupos persulfuros, formando los correspondientes aductos bloqueados, que a su vez presentan diferentes reactividades. Los aductos formados a partir de grupos tiólicos son éteres de tioles, y los resultantes de la reacción con un grupo persulfuro son disulfuros, siendo estos últimos muy reactivos con determinadas moléculas nucleófilas derivadas del carbono, como el reactivo CN-biotina, que contiene un grupo cianoacetato. La CN-biotina no reacciona ni con puentes disulfuro establecidos entre dos cisteínas (R-S-S-R) ni con residuos S- nitrosotiol (R-SNO). Además, solo las proteínas con residuos persulfuros bloqueados por MSBT son posteriormente marcadas por la CN-biotina (Zhang et al., 2014). Una vez que las proteínas sulfhidratadas están unidas a la biotina, pueden llevarse a cabo dos procedimientos distintos para identificar dichas proteínas. Por un lado, mediante la realización de western-blot y detección inmunológica empleando anticuerpos frente a la biotina, puede determinarse el patrón de S-sulfhidratación en una condición específica o un fondo genético determinado. Por otro lado, las proteínas marcadas con biotina pueden ser purificadas empleando la técnica de Introducción 28! ! cromatografía de afinidad con estreptavidina y analizadas posteriormente mediante espectrometría de masas. 2.4. Funciones fisiológicas del H2S 2.4.1. Mamíferos Casi una década de estudio de la biología del H2S en animales ha permitido conocer su implicación en la regulación de la homeostasis vascular y de la función neurológica principalmente; aunque también se ha relacionado a este nuevo gasotransmisor con otras funciones fisológicas y ciertas patologías como la diabetes o la ateroesclerosis. En el sistema cardiovascular, la administración de concentraciones fisiologicas de H2S protege a los vasos sanguíneos, disminuye el daño miocárdico, regula la presión sanguínea y limita la inflamación (Polhemus y Lefer, 2014). El H2S actúa sobre las células del músculo liso que recubren los vasos sanguíneos produciendo un efecto vasodilatador (Kabil et al., 2014), y también sobre componentes celulares sanguíneos como las plaquetas y proteínas como el fibrinógeno, mostrando propiedades antiagregantes, antiadhesión y anticoagulantes (Nishikawa et al., 2013; Morel et al., 2014; Olas y Kontek, 2014). Los mecanismos de acción propuestos en la mediación de estos efectos son la S-sulfhidratación de determinadas proteínas presentes en las plaquetas o la disminución del anión superóxido y del calcio en estas mismas células. En el sistema nervioso central, el H2S está involucrado en la neuroprotección (Deng et al., 2014) y la neurotransmisión (Abe y Kimura, 1996). La aplicación de H2S inhalado en ratones produce un efecto neuroprotector frente a la enfermedad de Parkinson (Kida et al., 2011). El H2S protege a las neuronas de los procesos apoptóticos y degenerativos (White, 2012). Los mecanismos responsables parecen deberse a su función como antioxidante (Deng et al., 2014). Otros efectos del sulfuro se han observado en las células β de los islotes pancreáticos, donde se ha identificado la expresión de la CSE, lo que sugiere que el H2S desempeña un importante papel en la regulación de la secreción de insulina. La aplicación exógena de concentraciones fisiológicas de H2S (Yang et al., 2005), así como del sustrato, L-cisteína (Kaneko et al., 2006), inhiben la liberación de insulina, vía activación de canales KATP de las células β. Los efectos del H2S en las células pancreáticas podrían representar una herramienta terapéutica para la regulación del metabolismo de la insulina, así como para la homeostasis de la glucosa (Wang, 2012). Otra función destacada del H2S es su papel protector frente a la ateroesclerosis, gracias a la atenuación del estrés oxidativo, a la reducción de la actividad plaquetaria y a su efecto antiinflamatorio (Qiao et al., 2010; Mani et al., 2013; Olas y Kontek, 2014). Introducción 29! ! 2.4.2. Plantas La función que ejerce el sulfuro sobre los sistemas biológicos no es exclusiva de mamíferos y era cuestión de tiempo que fuera descrita la importancia de esta molécula señalizadora en otros organismos, como ha ocurrido en plantas. Así, en los últimos años se ha demostrado que el H2S también regula procesos fisiológicos en el reino vegetal. Por un lado, multitud de trabajos han descrito la participación del sulfuro en la protección de las plantas frente a diferentes estreses abióticos y bióticos, y por otro, se ha demostrado que es una importante molécula señal que participa en la regulación de procesos esenciales para la planta. Las plantas están expuestas constantemente a una gran variedad de estreses abióticos y bióticos y debido a su naturaleza sésil necesitan disponer de unos mecanismos muy precisos de mantenimiento de la homeostasis celular. Los estreses abióticos responsables de la baja productividad de los cultivos y de la mayor parte de las pérdidas en las cosechas son la presencia de metales pesados, la salinidad, la sequía y las temperaturas extremas. Así mismo, la productividad de los cultivos también se ve afectada por la presencia y el establecimiento de infecciones y plagas producidas por diferentes organismos biológicos, lo que se conoce como estrés biótico. El sulfuro participa en los mecanismos adaptativos de las plantas frente a estos tipos de estreses. • Metales pesados y otros estreses iónicos Los metales pesados ejercen un efecto negativo sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas (Schutzendubel y Polle, 2002). Diversos estudios han demostrado que el H2S alivia los efectos tóxicos derivados de la exposición a estos metales no esenciales. La exposición a cadmio (Cd) produce una acumulación excesiva de ROS en plantas de chopo (Populus euphratica), lo que genera un importante daño que culmina con la muerte celular programada. El pretratamiento con NaSH alivia la toxicidad producida por Cd mediante el incremento de la actividad de enzimas antioxidantes como la catalasa y la glutatión reductasa (GR) y mediante la reducción de la acumulación de Cd en el citoplasma, limitando su entrada en la célula y promoviendo su ingreso en las vacuolas (Sun et al., 2013). Aunque es esencial para las plantas, el boro en exceso produce una inhibición significativa del desarrollo de la raíz en plantas de pepino (Cucumis sativus). El pretratamiento con NaSH suprime este efecto negativo a través de la regulación de genes implicados en la biosíntesis de la pared celular (Wang et al., 2010). El estrés oxidativo generado por la presencia de cobre en plantas de trigo (Triticum sativum) afecta a la germinación de las semillas. Un estudio llevado a cabo por Zhang et al. ha revelado que de forma análoga a lo descrito en el caso del Cd, el pretratamiento con NaHS incrementa la actividad de enzimas antioxidantes como la catalasa y la SOD, mejorando de esta forma la germinación de las semillas (Zhang et al., 2008). Introducción 30! ! Recientemente han sido descritos los efectos positivos del H2S en el ápice radicular de plantas de mijo (Setaria italica) sometidas a estrés por cromo. El sulfuro disminuye la acumulación de este metal en las plantas reprimiendo los genes que codifican proteínas responsables de la internalización del cromo en las células e induciendo aquellos genes responsables de la expulsión del metal (Huihui et al., 2014). Singh et al. ha demostrado que el H2S y el NO están implicados en la mitigación de los efectos negativos derivados de la exposición a arsénico en plantas de guisante (Pea sativum) (Singh et al., 2015). • Estrés salino La salinidad de los suelos es un factor limitante que repercute en la germinación de las semillas, el crecimiento de las plantas y en definitiva en la productividad de los cultivos (Ferreira-Silva et al., 2011). La elevada salinidad del terreno produce un desequilibrio iónico y de la homeostasis redox en las plantas, lo que se traduce en un incremento en el contenido de ROS y en la generación de daño oxidativo. La aplicación exógena de H2S en plantas de maíz (Zea mays) alivia el estrés oxidativo provocado por la sal mediante el aumento de la actividad de las enzimas dehidroascorbato reductasa (DHAR) y GR, implicadas en el metabolismo del ácido ascórbico y del GSH (Shan et al., 2013). En plantas de alfalfa (Medicago sativa), el pretratamiento con NaHS produce una inducción de la expresión de enzimas antioxidantes como la SOD, la catalasa y la guaiacol peroxidasa (GPX). Este aumento de la tolerancia a sal provocado por el H2S requiere además de la presencia de NO, ya que el tratamiento simultáneo con agentes neutralizantes (“scavengers”) del NO, como el cPTIO, bloquean el efecto beneficioso observado (Wang et al., 2011). Además de inducir los sistemas antioxidantes de la planta, el sulfuro mejora la resistencia a la sequía mediante el restablecimiento del equilibrio iónico celular. En raíces de A. thaliana el NaHS regula el sistema de antiporte Na+/K+ de la membrana plasmática restituyendo la homeostasis iónica alterada por el estrés salino (Li et al., 2013). • Sequía La sequía es uno de los estreses más importantes a los que se enfrentan las plantas a lo largo de su ciclo de vida. La distribución mundial de las distintas especies vegetales y la productividad de la mayoría de los cultivos dependen de la disponibilidad de agua. Las plantas de Arabidopsis expuestas a limitación de agua presentan una inducción de genes asociados a la respuesta a sequía como DREB2A, DREB2B, CBF4 y RD29A, así como del transcrito del gen L-CDES (At3g62130), que codifica una proteína con actividad L-cisteína desulfhidrasa. La fumigación de plantas con NaHS revierte esta inducción y provoca un aumento en la tasa de supervivencia de las plantas y una disminución de la apertura de los estomas (Jin et al., 2011). Además, se sabe que el sulfuro modula la expresión de microRNAs que intervienen en la respuesta adaptativa de la planta frente a la sequía, lo que se traduce en una mayor tolerancia al estrés (Shen et al., 2013). Introducción 31! ! Un estudio más reciente pone de manifiesto los efectos beneficiosos del H2S y otras moléculas sobre plantas de césped (Cynodon dactylon) expuestas a diferentes estreses abióticos, incluida la sequía. Estos efectos se atribuyen a una mayor acumulación de moléculas osmoprotectoras y antioxidantes, así como a la inducción de factores de transcripción y la activación de vías de traducción de señales que conducen al incremento de la tolerancia de la planta (Chan y Shi, 2015). • Estrés por calor Las altas temperaturas es otro factor que limita el rendimiento y la productividad de las cosechas. El H2S interviene en la tolerancia al estrés por calor, tal como ha sido demostrado en varias investigaciones. En cultivos celulares de tabaco (Nicotiana tabacum L.) sometidos a estrés térmico, el pretratamiento con NaHS aumenta el porcentaje de supervivencia de las células y este efecto está mediado por calcio (Li et al., 2012). El aumento de la tolerancia al estrés térmico por H2S en plantas de maíz (Zea mays L.) se produce por una disminución en el contenido de malondialdehído (MDA), indicador del daño oxidativo en las células, como consecuencia de una acumulación de prolina. Estos efectos se traducen en un mayor porcentaje de germinación de las semillas y una mayor supervivencia de las plantas expuestas al estrés (Li et al., 2013). • Estreses bióticos La resistencia de las plantas frente a determinados patógenos y enfermedades está relacionada con el estado nutricional de azufre de las mismas. A este fenómeno se le conoce como resistencia inducida por azufre (SIR: “sulfur-induced resistance”) o defensa potenciada por azufre (SED: “sulfur-enhanced defense”) (Bloem et al., 2007). Existen múltiples mecanismos que contribuyen al efecto positivo del azufre en la salud de las plantas, que incluyen la síntesis de GSH y de otros compuestos azufrados importantes en la defensa de las plantas, como los glucosinolatos en las Brasicáceas y las aliinas en la cebolla y el ajo. Además de estas moléculas, en la SIR interviene también el H2S. Las emisiones de H2S por diferentes especies de plantas se correlacionan inversamente con la infección por hongos. Además, la actividad L-cisteína desulfhidrasa, y con ello la producción de H2S, se induce en plantas infectadas y es mayor en aquellas plantas cultivadas con un aporte suficiente de azufre (Bloem et al., 2004; Bloem et al., 2011; Bloem et al., 2012). Como se ha descrito anteriormente, se ha demostrado que el sulfuro es una importante molécula señal que participa en la regulación de otros procesos esenciales para las plantas además de las respuestas a estrés, tal como se describen a continuación. Introducción 32! ! • Germinación Conseguir una germinación rápida y uniforme es uno de los retos de la agricultura. El H2S mejora la germinación de las semillas no solo bajo condiciones de estrés, sino también en condiciones fisiológicas. El tratamiento de las semillas de Jartropha curcas con H2O2 mejora el porcentaje de germinación e incrementa la actividad L-cisteína desulfhidrasa, que a su vez induce la producción de H2S. Por el contrario, el pretratamiento con ácido aminooxiacético (AOA), un inhibidor de la biosíntesis de H2S, revierte estos efectos producidos por el H2O2. La aplicación exógena de H2S también aumenta el porcentaje de germinación de las semillas de J.curcas (Li et al., 2012). Dooely et al. describen un efecto similar del H2S en la germinación de las semillas de diferentes especies vegetales. La exposición de semillas de judía (Phaseolus vulgaris), guisante (Pisum sativum), trigo!(Triticum aestivum L.) y maíz (Zea mays L.) a bajas concentraciones de H2S en solución, aumenta el porcentaje de germinación y disminuye el tiempo necesario para que este proceso tenga lugar, y además de esto, produce un incremento de la biomasa de estos cultivos (Dooley et al., 2013). • Movimiento estomático Otro proceso clave en el desarrollo de la planta donde participa el sulfuro es el movimiento estomático. Los estomas son pequeños poros presentes en la superficie de las hojas que permiten el intercambio gaseoso entre la planta y la atmósfera. Gracias al movimiento de las dos células guarda que lo forman, el estoma puede abrirse o cerrarse en respuesta a determinados estímulos. Los estomas juegan un papel crucial durante la fotosíntesis, la transpiración y la tolerancia a la sequía (Hetherington y Woodward, 2003; Chaerle et al., 2005). El efecto del sulfuro sobre el movimiento estomático ha generado cierta controversia debido a la obtención de resultados opuestos en los estudios realizados. Uno de estos estudios concluye que el pretratamiento con moléculas donadoras de sulfuro produce la apertura estomática en plantas de A. thaliana y Capsicum annuum (Lisjak et al., 2010; Lisjak et al., 2011). Sin embargo, otros grupos de investigación han demostrado el efecto opuesto, el cierre estomático. Los trabajos, realizados con diferentes especies vegetales como Vicia faba, A. thaliana e Impatiens walleriana, demuestra la implicación del H2S en el cierre estomático. Además, en presencia de hipotaurina, un agente neutralizante del sulfuro, el cierre estomático mediado por ácido abscísico (ABA) se ve reducido, lo que indica que el H2S participa en la ruta de señalización por ABA, presumiblemente mediante la regulación de los transportadores ABC (“ATP-binding cassette”) presente en las células guarda (Garcia-Mata y Lamattina, 2010). Muy recientemente, el uso de los mutantes des1 ha permitido profundizar en el estudio de la participación del sulfuro generado por DES1 y su relación con el NO en la ruta de señalización por ABA en células guarda. Los mutantes des1 son incapaces de cerrar sus estomas en presencia de ABA, pero la aplicación exógena de sulfuro o la complementación genética Introducción 33! ! revierten este fenotipo. Mediante el empleo de diferentes mutantes afectados en la percepción y señalización por ABA, se concluyó que el sulfuro actúa aguas abajo del receptor de ABA y que DES1 es necesaria para la producción de NO dependiente de ABA. DES1 es por tanto un nuevo componente en la cascada de señalización por ABA en células guarda, en la cual el NO interviene aguas abajo del sulfuro en el cierre estomático (Scuffi et al., 2014). • Fotosíntesis Como se ha descrito en el apartado anterior, el sulfuro promueve la apertura estomática en varias especies de plantas, lo que indirectamente tiene un efecto positivo sobre la fotosíntesis (Wang, 2012). Otros autores han puesto de manifiesto el papel del sulfuro en la modulación de la fotosíntesis en plantas de espinaca (Spinacia oleracea). Los resultados de este trabajo concluyen que el tratamiento con NaHS produce un incremento en el contenido de clorofila de las hojas así como un mayor número de granas en los cloroplastos. Las plantas tratadas presentan también una mejora de determinados parámetros fotosintéticos, alcanzándose en algunos casos sus niveles máximos; y exhiben una mayor expresión y actividad de la ribulosa- 1,5-bifosfato carboxilasa (RuBisCO) y de enzimas relacionadas con la modificación redox (Chen et al., 2011). • Organogénesis y elongación de la raíz La organogénesis está regulada por la interacción de diferentes factores genéticos y hormonales. La aplicación de NaHS a plántulas cortadas de boniato (Ipomoea batatas L.) produce un aumento del número y la longitud de las raíces adventicias generadas y este efecto es dependiente de la dosis. Estos resultados ponen de manifiesto la implicación del sulfuro en este importante proceso y la interconexión existente entre esta molécula y otras moléculas señalizadoras como la auxina ácido indolacético (IAA) y el NO (Zhang et al., 2009). En otro estudio se describe un aumento en la formación de raíces adventicias en plantas de pepino (Cucumber sativus) tratadas con NaHS (Lin et al., 2012). Este efecto es el resultado de un incremento tanto de la expresión génica como de los niveles de la proteína hemo oxigenasa- 1(HO), un componente de la ruta de señalización por auxinas implicado en dicho proceso (Xuan et al., 2008). • Senescencia y post-cosecha El H2S provoca un retraso de la senescencia en las plantas, y de nuevo, la disminución del estrés oxidativo a través de la inducción de los sistemas antioxidantes parece ser el mecanismo de acción. El pretratamiento con NaHS retrasa la senescencia, la abscisión y el oscurecimiento de flores de diferentes especies como Erigeron annus, Hibiscus syriacus L. o Rosa chinensis Jacq, entre otras (Zhang et al., 2011). Este estudio también determina que el contenido en MDA se correlaciona de forma opuesta con la concentración endógena de H2S en los explantos. Otro trabajo posterior ha demostrado un efecto similar del NaHS en frutos de fresa (Fragaria x ananassa) recolectados. La fumigación con sulfuro prolonga la vida útil y retrasa la senescencia Introducción 34! ! de los frutos mediante la mejora de las defensas antioxidantes y la regulación de diferentes actividades enzimáticas que influyen en la calidad del fruto una vez cosechado (Hu et al., 2012). • Autofagia Un proceso común en animales y plantas donde el sulfuro juega un importante papel regulador es la autofagia. La autofagia es un proceso catabólico en el cual se degradan los componentes celulares para garantizar el reciclaje eficiente de los nutrientes, especialmente durante situaciones de limitación nutricional. Este proceso se detalla en mayor profundidad en el siguiente capítulo de la Introducción de esta Tesis Doctoral. Nuestro grupo de investigación ha demostrado por primera vez que el sulfuro actúa como un regulador negativo del proceso de autofagia en plantas (Gotor et al., 2013). Las mutaciones en el gen DES1 disminuyen la producción de sulfuro en el citosol y dan lugar a la acumulación y lipidación de las isoformas ATG8 en Arabidopsis, un rasgo característico de la inducción de la autofagia. La aplicación exógena de sulfuro o la complementación genética de la mutación, eliminan las diferencias fenotípicas observadas entre los mutantes y las plantas silvestres, eliminando de esta manera la activación de la autofagia. La adición de sulfuro de forma exógena también suprime la inducción de la autofagia causada por privación de carbono en plantas silvestres (Álvarez et al., 2012b). En mamíferos, un estudio con células de colon ha demostrado, por el contrario, que el H2S produce una inducción de la autofagia con fines protectores a través de la regulación de la ruta AMPK/mTOR (Wu et al., 2012). Sin embargo, otras dos investigaciones describen un efecto opuesto, la inhibición de la autofagia por el H2S (Wang et al., 2012; Talaei et al., 2013). Los tres estudios han sido llevados a cabo analizando diferentes tejidos y enfermedades, y puede que el efecto de sulfuro sobre la autofagia sea específico de cada tipo celular. Durante esta Tesis Doctoral se ha profundizado en el estudio del papel del sulfuro como regulador negativo de la autofagia. Para ello, se ha establecido un nuevo sistema experimental en el cual la autofagia se induce por una condición diferente, en un tejido diferente y es analizada empleando distintas herramientas moleculares de las utilizadas hasta entonces en nuestro laboratorio (Laureano-Marín et al., 2016). Además, se ha propuesto un mecanismo para dicha regulación. 3. Autofagia en plantas La autofagia (del griego auto-a uno mismo; phagein-comer) es un mecanismo universal presente en células eucariotas que consiste en la digestión del contenido celular para la eliminación de componentes celulares dañados o tóxicos así como para el reciclaje de nutrientes. Es un proceso constitutivo, lo que significa que tienen lugar a nivel basal en las células en condiciones normales y cuyo fin es el mantenimiento de la homeostasis celular. Sin Introducción 41! ! subfamilia interviene en una fase de la formación del autofagosoma, y así, la subfamilia LC3 está implicada en la elongación del fagóforo mientras que los miembros de la subfamilia GABARAP/GATE-16 intervienen en la fase de maduración del autofagosoma (Weidberg et al., 2010). Aunque en A. thaliana las nueve isoformas de ATG8 se expresan en todos los tejidos de la planta y a lo largo de todo el desarrollo, existen diferencias en dicha expresión dependiendo del órgano o tejido estudiado. Las raíces, flores y silicuas son los órganos que presentan un mayor nivel de expresión de los genes ATG8 y una mayor acumulación de sus proteínas, aunque la presencia relativa de las diferentes ATG8 observada difiere entre ellos. En un mismo tejido, también se observan diferencias en la expresión dependiendo de la zona, como ocurre en las raíces. La expresión de la mayoría de ATG8s alcanza el nivel máximo a las 4 semanas de crecimiento, etapa que precede a la floración, y disminuye progresivamente a partir de este momento. Por otro lado, en condiciones de limitación nutricional, todos los genes ATG8 se inducen, pero esta inducción varía en función de la isoforma en cuestión y del tipo de limitación nutricional a la que se enfrenta la planta (Yoshimoto et al., 2004; Slavikova et al., 2005; Thompson et al., 2005b). También se ha descrito que algunas de las proteínas ATG8 pueden estar implicadas en procesos no relacionados directamente con la autofagia, como el tráfico intracelular o la unión al citoesqueleto (Mann y Hammarback, 1994; Wang et al., 1999; Ketelaar et al., 2004). • Transporte y fusión con la vacuola: recientemente se ha demostrado que EXO70B1, una proteína que participa en el proceso de exocitosis en plantas, interviene también en el transporte de los autofagosomas hasta la vacuola (Kulich et al., 2013). Por otro lado, la proteína SNARE VTI12 podría participar en la fusión del autofagosoma con el tonoplasto (Surpin et al., 2003). • Degradación del contenido y reciclaje: en el lumen de la vacuola, lipasas como ATG15 en levadura degradan las membranas autofágicas y posteriormente el contenido es catabolizado por enzimas líticas. La enzima de-ubiquitinadora AMSH1 y la subunidad VPS2.1 del complejo ESCRT-III participan también en esta última etapa del proceso autofágico en Arabidopsis (Katsiarimpa et al., 2013). Los productos de degradación obtenidos en la vacuola pasan al citosol para ser reutilizados (Kim et al., 2007). 3.2. Regulación de la autofagia Debido a la importancia fisiológica de la autofagia para la supervivencia celular, es necesaria la existencia de mecanismos que regulen la activación del proceso y que permitan a los organismos adaptarse al estrés y a las señales extracelulares. Los niveles de autofagia deben ser por tanto controlados con precisión para evitar ciclos fútiles y con ello la disfunción celular (He y Klionsky, 2009). Introducción 42! ! 3.2.1. Regulación por la vía TOR En levaduras y mamíferos, el estado nutricional es detectado y transducido a través de dos rutas de señalización bien caracterizadas, la de TOR y la de la proteína kinasa A (PKA), que regulan negativamente el proceso de autofagia (He y Klionsky, 2009). El regulador central de la autofagia en estos organismos es TOR, una serín/treonín quinasa que pertenece a la familia de las fosfatidilinositol quinasas y que se encuentra conservada en los eucariotas (Díaz-Troya et al., 2008). TOR integra la información procedente de diferentes rutas de señalización situadas aguas arriba. En S.cerevisiae y mamíferos, forma dos complejos señalizadores física y funcionalmente distintos, el complejo TOR1 (TORC1) y el complejo TOR2 (TORC2). Mientras que TORC2 regula los aspectos espaciales del crecimiento celular a través de la regulación de la polarización de los filamentos de actina del citoesqueleto, TORC1 promueve el crecimiento celular mediante la regulación de la síntesis de proteínas y la inhibición de la autofagia. TORC1 es regulado por una gran variedad de señales intra- y extracelulares, como factores de crecimiento, la disponibilidad de nutrientes y los niveles de ATP. Estudios iniciales en levaduras identificaron a la rapamicina, un compuesto antifúngico e inmunosupresor, como inhibidor de TOR. La inhibición de TOR por rapamicina conduce a una inducción del proceso autofágico, incluso en condiciones nutricionales óptimas. Esto ha permitido profundizar en el estudio y comprensión del mecanismo regulador que ejerce TOR sobre este proceso catabólico en condiciones de escasez de nutrientes. La inactivación de TORC1 induce la autofagia mediante la regulación negativa de la asociación entre las proteínas autofágicas ATG1y ATG13. El papel específico de TORC1 es mantener a ATG13 en un estado fosforilado, lo que disminuye la afinidad de ATG13 por ATG1 inhibiendo de esta forma la actividad de ATG1. La inactivación de TORC1 por rapamicina o por limitación de nutrientes causa una rápida defosforilación de ATG13 que incrementa su afinidad por ATG1 estimulando la actividad quinasa de ésta, que en última instancia inicia el proceso de formación de los autofagosomas. La inactivación de TOR también produce una inducción de la autofagia a nivel transcripcional. El tratamiento con rapamicina o la depleción de nitrógeno en el medio produce la translocación de GLN3 al núcleo donde induce la transcripción de genes regulados por nitrógeno, algunos de los cuales son componentes de la maquinaria autofágica, como por ejemplo ATG14 y ATG8 (Kirisako et al., 1999; Chan et al., 2001). La realización de microarrays en células tratadas con rapamicina ha revelado que estos y otros genes como ATG1, ATG3, ATG4, ATG5, ATG7, ATG12 y ATG13 son regulados transcripcionalmente por TOR (Cardenas et al., 1999; Natarajan et al., 2001). Introducción 43! ! TOR actúa como un regulador de la autofagia también en organismos fotosintéticos. El alga verde Chlamydomonas reinhardtii es sensible a rapamicina y el tratamiento con este inhibidor produce una vacuolización característica de las células cuando se induce el proceso de autofagia (Pérez-Pérez et al., 2010a; Pérez-Pérez y Crespo, 2010b). En A. thaliana se ha identificado un homólogo de TOR (Menand et al., 2002), pero el estudio de la funcionalidad e implicación de esta proteína en autofagia no ha sido posible por dos razones: la primera es que la disrupción del gen AtTOR es letal, lo que dificulta el estudio de sus funciones post-embrionarias; la segunda razón es que la proteína TOR de Arabidopsis es insensible al inhibidor rapamicina, por lo que no puede ser empleado para el estudio de la ruta de señalización por TOR en esta especie (Mahfouz et al., 2006). Para producir el efecto inhibidor, la rapamicina debe primero unirse y formar un complejo con la inmunofilina FKBP12, y es el complejo FKBP12-rapamicina el que inhibe la actividad de TOR. La proteína FKBP12 de plantas es incapaz de unirse a la rapamicina y por tanto de inhibir a TOR. Para superar estas limitaciones se han desarrollado varias estrategias. Se han generado líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan la proteína FKBP12 funcional de levaduras que reconoce e interacciona con la rapamicina. La modificación de los niveles de expresión de AtTOR mediante la generación de plantas sobre-expresoras y plantas silenciadas por RNAi ha sido otra de las aproximaciones experimentales llevadas a cabo (Deprost et al., 2007; Sormani et al., 2007). A través del estudio de plantas de A. thaliana que expresan el RNAi-AtTOR se ha demostrado que TOR interviene como un regulador negativo de la autofagia también en plantas superiores. Sin embargo, se desconocen las señales que controlan a TOR aguas arriba y los componentes regulados por TOR aguas abajo (Liu y Bassham, 2010). Existen, además, otras proteínas quinasas aparte de TOR que han sido identificadas como reguladores del proceso autofágico en levaduras y animales. La proteína quinasa dependiente de AMPc (AMPK) presente en mamíferos y su homólogo en levaduras SNF1 regulan la inducción de la autofagia. En plantas, han sido identificados homólogos de SNF1/AMPK. En concreto, en Arabidopsis, AKIN10, induce varios genes implicados en autofagia (Harding et al., 1995), lo que sugiere que las proteínas AMPK poseen una función reguladora de la autofagia conservada en plantas, aunque es necesario un estudio más detallado para confirmar esta hipótesis. 3.2.2. Regulación redox Una consecuencia inevitable del metabolismo aerobio es la producción de ROS. Estas especies reactivas incluyen radicales libres tales como el anión superóxido (O2-), el radical hidroxilo (OH-), así como especies sin carga como el H2O2. En los organismos fotosintéticos, el cloroplasto es el principal productor de ROS aunque la mitocondria, los peroxisomas y la enzima NADPH oxidasa de la membrana plasmática (NOX) son también una fuente de estas especies altamente reactivas. De entre los diferentes tipos de ROS generados en la célula, el Introducción 44! ! H2O2 es la molécula más estable capaz además de difundir a través de las membranas, a diferencia del anión superóxido (O2-) y el radical hidroxilo (OH-), que no pueden abandonar el cloroplasto y son rápidamente transformados en otras ROS. La producción celular de ROS tiene lugar durante determinadas etapas del desarrollo actuando como mensajero en la señalización de diferentes procesos celulares (Foyer y Noctor, 2009). Sin embargo, bajo ciertas condiciones de estrés ambiental, la producción de ROS excede a los sistemas antioxidantes de la célula, lo que lleva a una acumulación de estas especies y a la generación de un estrés oxidativo (Han et al., 2011). Numerosos estudios han puesto de manifiesto el papel de las ROS en la activación de la autofagia no sólo en levaduras y mamíferos, sino también en algas y en plantas (Kiššová et al., 2006; Scherz-Shouval et al., 2007a; Xiong et al., 2007a; Liu et al., 2009; Pérez-Pérez et al., 2010a; Pérez-Pérez et al., 2012a). En levaduras, la activación de la autofagia por rapamicina va acompañada de la producción de ROS y de la oxidación de los lípidos presentes en la mitocondria (Kiššová et al., 2006). En mamíferos, la carencia de aminoácidos estimula la producción de ROS, especialmente de H2O2 en la mitocondria, con la consiguiente activación del proceso autofágico (Scherz-Shouval et al., 2007a) y la privación de glucosa media la activación de la autofagia a través de la señalización por O2- (Chen et al., 2009). Investigaciones realizadas en C. reinhardtii han puesto de manifiesto la implicación de las ROS en la activación del proceso autofágico en respuesta a diferentes condiciones de estrés. La inhibición de la biosíntesis de carotenoides, el estrés producido en el retículo endoplasmático por la acumulación de proteínas mal plegadas, el tratamiento con agentes oxidantes como el H2O2 o la exposición a metales son condiciones que activan la autofagia de forma dependiente de ROS en C.reinhardtii (Pérez-Pérez et al., 2010a; Pérez-Pérez et al., 2012a; Pérez-Pérez et al., 2012b; Pérez-Martín et al., 2014; Pérez-Martín et al., 2015). En plantas, la autofagia se induce también por la presencia incontrolada de ROS ya que una de las finalidades de este proceso es la degradación de componentes celulares dañados por estas especies altamente reactivas. En Arabidopsis, la aplicación exógena de H2O2 o el tratamiento con el inductor de la producción de ROS, metilviológeno (MV), causan una inducción de la autofagia. El silenciamiento del gen ATG18a en plantas RNAi-AtATG18a produce una mayor sensibilidad al estrés oxidativo y una mayor acumulación de proteínas oxidadas en comparación con plantas silvestres (Xiong et al., 2007a; Xiong et al., 2007b). Plantas mutantes para los genes ATG2 y ATG5 acumulan grandes cantidades de H2O2 (Yoshimoto et al., 2009). Otro trabajo ha demostrado que la inducción de la autofagia provocada por salinidad o por carencia de nitrógeno en Arabidopsis es dependiente de la producción de ROS mediada por la NADPH oxidasa, mientras que la activación del proceso autofágico por estrés osmótico es independiente de ROS (Liu et al., 2009). El mecanismo por el que se produce la inducción de la autofagia por ROS podría ser consecuencia de la modificación redox de una o varias proteínas implicadas en este proceso. Introducción 45! ! Se ha demostrado que la proteína ATG4 es diana de esta regulación redox, siendo hasta la fecha la única proteína ATG a la que se le ha descrito este tipo de regulación (Scherz-Shouval et al., 2007a; Pérez-Pérez et al., 2014; Woo et al., 2014). ATG4 es una cisteín proteasa muy importante en el proceso de autofagia, ya que tiene un papel dual en la formación del autofagosoma. Por un lado, ATG4 procesa a la proteína ATG8 por su extremo carboxilo antes de ser conjugada con el lípido PE, evento fundamental en la formación del autofagosoma; y, por otro lado, ATG4 es responsable también de la delipidación de ATG8 con la consiguiente separación de esta proteína de la membrana del autofagosoma (Kirisako et al., 2000). Debido a la dualidad e importancia de la función de ATG4, su actividad debe estar muy regulada. Se desconoce si ambas actividades de ATG4 se regulan de forma diferente o simplemente están separadas en el tiempo y el espacio, ya que el procesamiento de ATG8 tiene lugar sobre la proteína recién sintetizada y es necesaria para la formación del autofagosoma mientras que la delipidación debe producirse cuando la autofagia ya no es necesaria y ATG8 debe ser reciclado. En mamíferos, la limitación de nutrientes produce un incremento en la acumulación de H2O2 cerca de la mitocondria, lo que provoca la oxidación e inactivación de la actividad delipidante de ATG4, promoviendo con ello la progresión de la autofagia. Se ha identificado un residuo de cisteína, Cys81, localizado muy cerca del residuo de cisteína catalítico (Cys77) como la diana de esta regulación redox y cuya mutación impide la acumulación de ATG8-PE y con ello, la formación de los autofagosomas (Scherz-Shouval et al., 2007a). Por otra parte, se ha demostrado que la proteína Atg4 de levaduras se regula mediante la oxido-reducción de un puente disulfuro específico, establecido entre los residuos de cisteína, Cys 338 y Cys394 que se encuentran conservados en hongos, plantas y algas. La oxidorreductasa tiorredoxina es responsable de la reducción de este puente disulfuro de forma muy eficiente y con ello de la activación de ATG4 (Pérez-Pérez et al., 2014). De forma análoga a lo que ha sido descrito en humanos y levaduras, las dos isoformas de ATG4 presentes en Arabidopsis son inhibidas bajo condiciones oxidantes y su actividad es restaurada en presencia de DTT, lo que pone de manifiesto la reversibilidad de esta regulación (Woo et al., 2014). 3.2.3. Regulación por modificaciones post-traduccionales Las modificaciones post-traduccionales (MPTs) implican la modificación química de una proteína después de ser traducida, resultando en la inhibición o la potenciación de su actividad. Las MPTs juegan un papel fundamental en casi todos los aspectos funcionales y estructurales de la célula. Los principales tipos de MPTs incluyen la fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, metilación, acetilación y lipidación. A continuación se presentan varios tipos de MPTs que tienen lugar sobre proteínas ATG y que influyen por tanto en el proceso autofágico. Introducción 46! ! La fosforilación es la MPT más estudiada en la regulación de la autofagia en levaduras y mamíferos. La iniciación del proceso autofágico depende del estado de fosoforilación del complejo ATG1 que repercute tanto en el ensamblaje del complejo como en la activación del mismo. Como se describe anteriormente, la fosoforilación-defosforilación de las proteínas ATG13 y ATG1 por parte de TOR es fundamental para la inducción de la autofagia (Codogno, 2004). La autofosforilación de ATG1 es importante también para mantener su actividad quinasa durante la inducción de la autofagia (Yeh et al., 2010). La regulación de la autofagia por parte de PKA también se basa en los eventos de fosforilación y defosforilación. La inactivación de la vía de señalización por PKA es suficiente para inducir la autofagia en levaduras mediante la defosforilación de ATG13 y ATG1 lo que a su vez influye en la localización de estas proteínas en el PAS (Stephan et al., 2009). La localización de la proteína transmembrana ATG9 en el PAS también depende de su fosforilación por parte de ATG1 (Reggiori et al., 2004). La actividad del complejo VPS34/ATG6/VPS15 es controlada, positiva o negativamente, mediante la fosforilación de sus componentes. VPS15 fosforila a VPS34 y esta MPT es necesaria para la formación del complejo (Stack et al., 1993). Se ha demostrado que una de las isoformas de ATG9 presente en humanos posee cuatro posibles sitios de N-glicosilación, aunque solo se ha identificado dicha modificación en uno de ellos. La implicación de ATG9 en la coordinación del transporte de membrana entre zonas donadoras hasta el PAS se debe en parte a la glicosilación (Young et al., 2006; Ohashi y Munro, 2010). Además de los dos sistemas análogos a los de ubiquitinación descritos anteriormente, las proteínas ULK1 y BECN1, los ortólogos humanos de ATG1 y ATG6 de levaduras, respectivamente, son modificadas mediante ubiquitinación y esto regula la respuesta autofágica (Shi y Kehrl, 2010; Nazio et al., 2013). En levaduras, la acetilación de ATG3 por la acetiltransferasa Esa1 potencia la autofagia, mientras que su deacetilación por parte de Rpd3 ejerce el efecto contrario (Yi et al., 2012). En mamíferos, son varias las proteínas ATG que sufren este tipo de MPT. Así, la acetilación de ATG5, ATG7, ATG8 y ATG12 por EP300 producen una disminución de los niveles de autofagia, mientras que la deacetilación de esas proteínas mediada por SIRT1, produce una regulación positiva de dicho proceso (Lee et al., 2008; Lee y Finkel, 2009). Otro tipo de MPT con una gran relevancia en la progresión del proceso autofágico es la lipidación de la proteína ATG8. La unión covalente entre ATG8 y el lípido PE es crucial para la formación de los autofagosomas así como para el estudio y seguimiento de este proceso en muchos organismos, como se ha detallado anteriormente (Kirisako et al., 2000). En esta Tesis Doctoral se ha estudiado otro tipo de MPT que podría tener una importante repercusión en la regulación de la autofagia. La S-sulfhidratación de residuos de cisteína ha sido propuesto como un nuevo tipo de MPT análogo a la S-nitrosilación en diferentes organismos Introducción 47! ! (Mustafa et al., 2009; Aroca et al., 2015). Proponemos que la S-sulfhidratación de la proteína ATG4 de A. thaliana puede modular su actividad regulando de esta forma la autofagia. 3.3. Funciones fisiológicas de la autofagia en plantas A pesar de que el proceso de autofagia ha sido más estudiado bajo condiciones de estrés, en las plantas existe un nivel basal de autofagia en condiciones óptimas de crecimiento (Figura 14). Esta autofagia basal participa en la eliminación de proteínas y orgánulos dañados producidos continuamente bajo condiciones normales de crecimiento y participa también en la biogénesis de la vacuola, y en general en el mantenimiento de la homeostasis celular (Bassham et al., 2006; Yano et al., 2007). La mayoría de las plantas mutantes de autofagia (atg) cultivadas en condiciones óptimas de crecimiento son capaces de completar sus ciclos de vida, presentando un fenotipo similar al de plantas silvestres en lo que se refiere a desarrollo embrionario, germinación, formación de los diferentes tejidos, floración y producción de semillas. Sin embargo, ante condiciones de limitación nutricional (nitrógeno o carbono) exhiben una acelerada clorosis, una inducción de la senescencia y una disminución en el desarrollo de las raíces. Esto significa que ante situaciones de escasez, la autofagia es necesaria para una correcta movilización y distribución de los nutrientes en las células (Hanaoka et al., 2002; Thompson et al., 2005b). De hecho, la inducción de la autofagia por limitación nutricional es una de las condiciones más estudiadas (Figura14). Este papel en el reciclaje de nutrientes hace de la autofagia un proceso importante durante la senescencia y la germinación de las semillas, las dos grandes etapas de movilización de nutrientes a lo largo del ciclo de vida de la planta. Alrededor del 80% del nitrógeno total de las hojas se encuentra en los cloroplastos y durante la senescencia las plantas reciclan los nutrientes presentes en los cloroplastos para proveer a los nuevos órganos en desarrollo, como las semillas (Guiboileau et al., 2010). En este contexto, se sabe que la autofagia participa en la degradación de los RCBs (“RuBisCO containing bodies”), unas pequeñas vesículas que transportan componentes estromáticos procedentes de los cloroplastos (Ishida et al., 2008). Como se ha descrito anteriormente, la presencia excesiva de ROS o estrés oxidativo es otra condición que induce la autofagia en diferentes organismos, incluidas las plantas (Figura 14). La capacidad de la autofagia de eliminar proteínas oxidadas y de regular los niveles de ROS hace que sea un proceso importante ante situaciones que generan estrés oxidativo como la sequía, la salinidad, la carencia nutricional y la infección por patógenos, entre otras (Xiong et al., 2007a; Hayward et al., 2009; Liu et al., 2009; Yoshimoto et al., 2009). La forma en la que la autofagia contribuye a la respuesta inmune en plantas es muy diversa y su efecto puede suponer la supervivencia o la muerte celular, dependiendo del tipo de patógeno, del tipo de receptor inmune involucrado o de la edad de la planta (Figura 14). Introducción 48! ! En Arabidopsis, la infección por el hongo necrótrofo Botrytis cinerea induce la autofagia tanto en las células infectadas como en células sanas adyacentes. Las plantas mutantes atg son más sensibles a la infección por el hongo en comparación con las plantas silvestres y presentan una mayor propagación de la necrosis y una aceleración en la degradación de ciertas proteínas. El factor de transcripción WRKY33, implicado en la resistencia de la planta a patógenos necrótrofos, interacciona con la proteína autofágica ATG18a en el núcleo (Lai et al., 2011). Por tanto, durante la infección por patógenos necrótrofos la autofagia actúa promoviendo la supervivencia de la planta. La susceptibilidad de los mutantes atg a patógenos necrótrofos podría explicarse por la supresión de la vía de señalización por ácido jasmónico, la cual es necesaria para la resistencia frente a este tipo de patógenos, debido a una excesiva señalización o acumulación de SA (Koornneef et al., 2008; Lenz et al., 2011). En cambio, el papel de la autofagia durante la infección por patógenos biótrofos es más complejo. Las plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) silenciadas en el gen ATG6 e infectadas con el virus del mosaico del tabaco exhiben una propagación del virus a otras zonas de la planta. Estos resultados indican que ATG6 o procesos regulados por ATG6 limitan la muerte celular asociada a la respuesta hipersensible (HR) a la zona de infección (Liu et al., 2005). Se han obtenido resultados similares en plantas de Arabidopsis silenciadas también en el gen ATG6 y en mutantes atg5, donde tras la infección con la bacteria avirulenta Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000 avrRpm1, la HR se propaga al tejido sano adyacente (Patel y Dinesh-Kumar, 2008; Yoshimoto et al., 2009). Estos resultados sugieren que la autofagia actúa restringiendo la HR, posiblemente a través de la degradación de señales celulares que promueven la muerte celular (Lenz et al., 2011). Sin embargo, otros estudios llevados a cabo con mutantes atg7 y atg9 de Arabidopsis han descrito una reducción de la muerte celular y un incremento de la resistencia frente a la cepa avirulenta de la bacteria Pst DC3000 avrRps4 (Hofius et al., 2009). Esto sugiere, por el contrario, que la autofagia funciona potenciando la muerte celular durante la HR. Estos resultados contradictorios observados durante la infección por patógenos biótrofos pueden deberse a las diferencias de edad de las plantas utilizadas en los experimentos, lo que a su vez está relacionado con los niveles endógenos de SA o al tipo de receptor involucrado en el reconocimiento del efector. Introducción 49! ! Figura 14: Condiciones fisiológicas y ambientales en las que participa la autofagia en Arabidopsis. 3.4. Estudio de la autofagia en plantas Debido al gran número de procesos que regula en la planta, la autofagia ha despertado un gran interés entre la comunidad científica. Esto ha permitido el desarrollo de nuevas técnicas de estudio y la mejora de las ya existentes. A continuación se detallan las técnicas de detección de la autofagia que han sido utilizadas en esta Tesis Doctoral. 3.4.1. Detección de GFP-ATG8 por microscopía ATG8 es un componente central de la maquinaria de la autofagia y además es la única proteína que permanece unida al autofagosoma a lo largo de todo el proceso autofágico, como se ha descrito previamente. Su unión covalente al lípido PE produce una asociación estable con la membrana. Así, ATG8 está presente en el fagóforo y se localiza tanto en la membrana interna como en la externa del autofagosoma en formación. Una vez fusionado con el tonoplasto, el cuerpo autofágico localizado en el interior de la vacuola también contiene ATG8 en su membrana. Estas características hacen de ATG8 un marcador ideal del proceso de autofagia desde etapas tempranas hasta etapas más tardías. El marcaje de la proteína ATG8 se realiza mediante la fusión N-terminal con la proteína fluorescente verde (GFP) u otras variantes de diferente color. La expresión de esta proteína recombinante puede realizarse de forma transitoria (Contento et al., 2005) o de forma estable en plantas transgénicas de Arabidopsis para ser monitorizadas posteriormente mediante microscopía confocal (Thompson et al., 2005b; Xiong et al., 2007a). Introducción 50! ! En ausencia de estrés, la proteína recombinante GFP-ATG8 se localiza en el citoplasma como fluorescencia difusa y a veces puede apreciarse formando parte de estructuras punteadas. Estos puntos corresponden a los autofagosomas formados en respuesta a la autofagia basal presente en las células. Una vez expuesta la planta a una determinada condición de estrés, el número de puntos o estructuras puntiformes aumenta rápidamente, a menudo de forma proporcional a la severidad del estrés. Sin embargo, la acumulación de cuerpos autofágicos dentro de la vacuola y por tanto la visualización de los mismos es más fácil en células que carecen de actividad hidrolasa dentro de este compartimento. Para ello, es común el uso de inhibidores de la H+-ATPasa vacuolar como la concanamicina A (ConA). El pretratamiento de las células con este compuesto produce un aumento del pH del lumen de la vacuola lo que inhibe la actividad de las hidrolasas y produce la acumulación de los cuerpos autofágicos dentro de la vacuola. La cuantificación de la autofagia puede realizarse contabilizando el número de estructuras marcadas con GFP-ATG8 por célula o midiendo la intensidad de fluorescencia por área, utilizando para ello un software adecuado. Aunque no han sido empleadas en este trabajo de Tesis, existen otras proteínas ATG marcadas, además de ATG8, que han demostrado co-localizar con los autofagosomas y con estructuras relacionadas y que han sido utilizadas en varios estudios. Las fusiones fluorescentes de ATG1, ATG13 y ATG11 coinciden con estructuras puntiformes en el citoplasma en situaciones que inducen la autofagia, además son liberadas a la vacuola y se acumulan en presencia de ConA (Suttangkakul et al., 2011; Li et al., 2014). GFP-ATG6 es otra de las proteínas marcadoras que co-localiza con ATG8 durante el proceso de autofagia (Fujiki et al., 2007), sin embargo, esta construcción ha de usarse con precaución ya que ATG6 interviene en otras rutas de transporte no relacionadas con la autofagia (Harrison-Lowe y Olsen, 2008). Por su parte, GFP-ATG5 ha sido empleada en el marcaje de estructuras presentes en etapas tempranas del proceso de formación del autofagosoma ya que una vez completado éste, GFPATG5 se disocia de dicha estructura (Le Bars et al., 2014). 3.4.2. Métodos bioquímicos La aproximación bioquímica más utilizada es el análisis de perfiles proteicos obtenidos mediante análisis de western, de gran utilidad a la hora de analizar y cuantificar el proceso de autofagia, y que puede utilizarse como una alternativa a la microscopía o incluso en combinación con ésta. Sin embargo, se ha demostrado que los ensayos de western son más difíciles de aplicar y de interpretar en células vegetales en comparación con las animales. Algunos ensayos pueden ser fiables si se compara el proceso de autofagia entre mutantes y plantas silvestres, pero determinar el grado de activación del proceso autofágico en diferentes condiciones sigue siendo complicado. Capítulo I Análisis de la regulación transcripcional de la proteína DES1, responsable de la generación de sulfuro en el citosol ORIGINAL RESEARCH ARTICLE published: 04 December 2014 doi: 10.3389/fpls.2014.00683 Assessing the transcriptional regulation of L-cysteine desulfhydrase 1 in Arabidopsis thaliana Ana M. Laureano-Marín , Irene García, Luis C. Romero and Cecilia Gotor* Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Consejo Superior de Investigaciones Científicas and Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain Edited by: Stanislav Kopriva, University of Cologne, Germany Reviewed by: Anna Wawrzynska, Institute of Biochemistry and Biophysics Polish Academy of Sciences, Poland Min-jie Cao, Chinese Academy of Sciences, China *Correspondence: Cecilia Gotor, Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Avenida Américo Vespucio, 49, 41092 Sevilla, Spain e-mail: [email protected] Hydrogen sulfide is an important signaling molecule that functions as a physiological gasotransmitter of comparable importance to NO and CO in mammalian systems. In plants, numerous studies have shown that sulfide increases tolerance/resistance to stress conditions and regulates essential processes. The endogenous production of hydrogen sulfide in the cytosol of Arabidopsis thaliana occurs by the enzymatic desulfuration of L-cysteine, which is catalyzed by the L-cysteine desulfhydrase enzyme DES1. To define the functional role of DES1 and the role that the sulfide molecule may play in the regulation of physiological processes in plants, we studied the localization of the expression of this gene at the tissue level. Transcriptional data reveal that DES1 is expressed at all developmental stages and is more abundant at the seedling stage and in mature plants. At the tissue level, we analyzed the expression of a GFP reporter gene fused to promoter of DES1. The GFP fluorescent signal was detected in the cytosol of both epidermal and mesophyll cells, including the guard cells. GFP fluorescence was highly abundant around the hydathode pores and inside the trichomes. In mature plants, fluorescence was detected in floral tissues; a strong GFP signal was detected in sepals, petals, and pistils. When siliques were examined, the highest GFP fluorescence was observed at the bases of the siliques and the seeds. The location of GFP expression, together with the identification of regulatory elements within the DES1 promoter, suggests that DES1 is hormonally regulated. An increase in DES1 expression in response to ABA was recently demonstrated; in the present work, we observe that in vitro auxin treatment significantly repressed the expression of DES1. Keywords: abscission zone, auxin, DES1 promoter, hydathode, floral tissues, promoter-GFP construct INTRODUCTION Hydrogen sulfide, a known toxic molecule, is considered to be an important signaling molecule. In animal systems, hydrogen sulfide functions as physiological gasotransmitter; this molecule is recognized to be of equal importance to NO and CO and has been the subject of many reviews (Gadalla and Snyder, 2010; Kimura, 2011; Wang, 2012). H2S is mostly catalyzed via the enzymatic reactions of cystathionine β-synthase (CBS) and cystathionine γlyase (CSE) (Wang, 2012) in mammals. Both enzymes are known for their participation in the transsulfuration pathway, which is critical for the synthesis of cysteine from methionine. Both CBS and CSE use pyridoxal 5 -phosphate as a cofactor and are exclusively located in the cytosol (Gadalla and Snyder, 2010; Wang, 2012). In recent years, hydrogen sulfide has been also shown to be a signaling molecule in plants similar to NO and H2O2. Numerous studies have demonstrated the role of sulfide in protection against numerous stress conditions. Additional studies have demonstrated that this molecule is involved in regulating essential processes such as photosynthesis, stomatal movement, senescence, and autophagy. Consequently, several reviews in plant systems have been recently released (Garcia-Mata and Lamattina, 2013; Lisjak et al., 2013; Calderwood and Kopriva, 2014; Gotor et al., 2014; Hancock and Whiteman, 2014). Hydrogen sulfide is biosynthesized in plant chloroplasts during the photosynthetic sulfate assimilatory process by the sulfite reductase that reduces sulfite to sulfide. Due to the high toxicity of hydrogen sulfide, it is rapidly incorporated into carbon skeletons to form cysteine by the O-acetylserine(thiol)lyase (OASTL) enzymes. OASTL enzymes are found in the cytosol, plastids and mitochondria and are encoded in Arabidopsis thaliana by the OAS-A1, OAS-B, and OAS-C genes, respectively (Takahashi et al., 2011; Romero et al., 2014). In mitochondria, H2S is also produced during the detoxification of cyanide by β-cyanoalanine synthase; this enzyme catalyzes the conversion of cysteine and cyanide to hydrogen sulfide and β-cyanoalanine. Like cyanide, sulfide is a potent inhibitor of mitochondrial cytochrome c oxidase. Sulfide in the mitochondria must be detoxified by OAS-C to produce cysteine, thus generating a cyclic pathway for cyanide/sulfide detoxification (Garcia et al., 2010; Alvarez et al., 2012b). H2S is also produced in plants by cysteine-degrading enzymes, such as D- and L-cysteine desulfhydrases; these enzymes also produce pyruvate and ammonium (Riemenschneider et al., 2005; Alvarez et al., 2010). We have recently shown that the www.frontiersin.org December 2014 | Volume 5 | Article 683 |1 59 Capítulo I Laureano-Marín et al. Tissue-specific expression of DES1 protein DES1 is a pyridoxal-5 -phosphate-dependent L-cysteine desulfhydrase located in the cytosol of Arabidopsis (Alvarez et al., 2010). Therefore, the H2S levels in the cytosol are determined via the coordinated enzymatic activities of OAS-A1 and DES1 (Gotor et al., 2014; Romero et al., 2014). Hydrogen sulfide is weakly acidic and dissociates in aqueous solutionsintoH +and HS−.Inthisionizedform,hydrogensulfide cannot permeate membranes (Kabil and Banerjee, 2010). In the basic pH of the chloroplast stroma under illumination, and in the mitochondrial stroma in metabolically active cells, sulfide is predominantly found in the charged HS−form. Therefore, hydrogen sulfide is unable to cross out the chloroplast and mitochondrial membranes. Accordingly, DES1 is the responsible for the production of sulfide in the plant cytosol (Romero et al., 2013), with an estimated steady-state concentration of 50 μM (Krueger et al., 2009). Recent studies have concluded that DES1 modulates the generation of sulfide for signaling in important plant processes, such as the progression of autophagy and the stomatal movement. Irrespective of nutrient conditions, it was demonstrated that sulfide exerts a general effect on autophagy in plants through negative regulation of this process (Alvarez et al., 2012a; Gotor et al., 2013). It has been recently demonstrated that sulfide generated by DES1 acts upstream of nitric oxide in the ABA signaling network in stomatal guard cells (Scuffi et al., 2014). To gain insight into the regulation of DES1, we analyzed the tissue and cellular localization of DES1 using a DES1 promoter- GFP construct. We found maximum levels of gene expression in the seedling and mature stages of plant development. We were able to further localize the GFP signal to vegetative and reproductive tissues in correlation with the hormonal regulation of DES1. MATERIALS AND METHODS PLANT MATERIAL, GROWTH CONDITIONS AND TREATMENTS Arabidopsis thaliana wild type ecotype Col-0 and the transgenic PromDES1-GFP line were used in this work. Plants were grown in soil for 6 weeks with a photoperiod of 16 h of white light (120 μE m−2s−1)at20 ◦C and 8 h of dark at 18◦C. Alternatively, surface sterilized seeds were germinated and grown in agar-supplemented MurashigeandSkoog(MS)mediumfor1–2weeks.Fortheauxin treatments, wild type Col-0 seeds were germinated and grown for 7daysonMSplatesinthepresenceof0.1or1μM of indoleacetic acid (IAA). DNA CLONING AND PLASMID CONSTRUCTION To clone the DES1 promoter, a 3 kb of the genomic sequence upstream from the DES1 gene start codon was amplified using specific primers. Total DNA was isolated from young Arabidopsis leaves using the Qiagen DNeasy Plant Minikit. The 3kb sequence containing the DES1 promoter was amplified by PCR using the primers proDES1-F: CACCCATTTTATTTTACACCACG and proDES1-R: GTGGTTTGTCTTTGGAAAACT and the Invitrogen proofreading Platinum Pfx DNA polymerase. PCR conditions were as follows: a denaturation cycle of 2min at 94◦C, followed by 35 amplification cycles of 15s at 94◦C, 30 s at 55◦C, and 1 min at 68◦C. The amplified region was then ligated into the Invitrogen pENTR/D-TOPO vector using the Invitrogen Directional TOPO Cloning Kit following the manufacturer’s instructions. Positive clones were identified by PCR and chosen for plasmid DNA isolation. Using Invitrogen Gateway® technology, the DES1 promoter was then cloned into the pMDC110 vector (Curtis and Grossniklaus, 2003), a plant expression vector for the construction of promoter-reporter GFP vectors. The final construct for used for plant transformation was identified by colony PCR and plasmid PCR. The construction was named PromDES1-GFP. TRANSFORMATION OF ARABIDOPSIS For plant transformation, the construct PromDES1-GFP was transformed into an Agrobacterium tumefaciens strain and then introduced into A. thaliana plants by dipping the developing floral tissues into a solution containing the A. tumefaciens strain, 5% sucrose, and 0.005% (v/v) of the surfactant Silwet L-77 (Clough and Bent, 1998). Transgenic plants were recovered by selecting seeds on solid MS medium containing 50mg/l of hygromycin. REAL-TIME RT-PCR Quantitative real-time RT-PCR was used to analyze the expression of DES1 and OAS-A1 genes. Total RNA was extracted from different tissues of Arabidopsis plants or the aerial parts of Arabidopsis seedlings using the Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. RNA was reverse transcribed using an oligo(dT) primer and the Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR following manufacturer’s instructions. Gene-specific primers for each gene were designed using the Invitrogen Vector NTI Advance 10 software. Primer sequences were as follows: qDES1-F, 5 -TCGAGTCAGTCAGATATGAAGCT-3 and qDES1-R, 5 -TGTAACCTTGGTACCAACATCTCT-3 for the DES1 gene; qOASA-F, 5 -CACGAGCGATTTTCTCCATT-3and qOASA-R, 5 -CAATTCTCGAGGCCATGATT-3 for the OAS-A1 gene; qUBQ-F, 5 -GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG-3  and qUBQ-R, 5 -AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT- 3for the constitutive UBQ10 gene. The PCR efficiency of all primer pairs was determined to be close to 100%. Real-time PCR was performed using the Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix. Signals were detected on a Bio-Rad iCYCLER according to the manufacturer’s instructions. The cycling profile consisted of 95◦C for 10 min followed by 45 cycles of 95◦C for 15s and 60◦Cfor 1 min. A melting curve from 60◦Cto90 ◦C was run following the PCR cycling. The expression levels of the genes of interest were normalized to that of the constitutive UBQ10 gene by subtracting the cycle threshold (CT) value of UBQ10 from the CT value of the gene (CT). The results shown are means ±SD of at least three independent RNA samples. GFP LOCALIZATION BY CONFOCAL MICROSCOPY Tissues from Arabidopsis at different developmental stages were visualized using a Leica TCS SP2 spectral confocal microscope. Samples were excited using the 488nm line of an argon ion laser; emission was detected between 510 and 580 nm for GFP imaging (pseudocolored green) and between 620 and 680 nm for chloroplast autofluorescence (pseudocolored red). The microscopy images were processed using the Leica Confocal Software. Frontiers in Plant Science | Plant Physiology December 2014 | Volume 5 | Article 683 |2 60 Capítulo I Laureano-Marín et al. Tissue-specific expression of DES1 RESULTS ISOLATION OF THE DES1 PROMOTER REGION AND PRODUCTION OF PROMOTER-REPORTER TRANSGENIC PLANTS Recent work has suggested that DES1 modulates the generation of sulfide in the cytosol for signaling purposes (Gotor et al., 2013; Romero et al., 2013). Mutations in DES1 result in premature leaf senescence in mature plants, which can be observed at transcriptional and cellular levels; and at the seedling stage, an increased tolerance to abiotic stress is observed (Alvarez et al., 2010, 2012a). To determine the role of DES1 in plant growth and development, we examined the spatial and temporal regulation of DES1 gene expression. For this purpose, promoter-GFP transgenic plants were constructed using a 3002 bp fragment isolated from the DES1 promoter region. This fragment comprises the genomic region upstream from the DES1 gene and its first intron. The intron was included based on a previous report demonstrating that the first intronic region of the OAS- A1 gene, other member of the OASTL family, includes essential elements for tissue-specific expression (Gutierrez-Alcalaetal., 2005). Thus, the DES1 promoter consists of 2836 bp from the intergenic region between DES1 (At5g28030) and the upstream gene At5g28040, 14 bp of the first exon containing the 5 -UTR region, 118 bp of the first intron and 34 bp of the second exon that contains the remainder of the 5 -UTR region, immediately upstream of the translation initiation site (Supplemental Figure 1; www.arabidopsis.org). The promoter sequence was analyzed for cis-acting regulatory elements using available web tools (AthaMapMan; AGRIS; PLACE). Several binding site motifs were detected, including ABA- and Auxin-related elements and leaf development and senescence-regulatory elements (Table 1). The DES1 promoter was fused to the GFP gene. The plant transformation construct was named PromDES1-GFP. Six transgenic A. thaliana plants were obtained; and homozygous lines were analyzed by laser confocal microscopy for in vivo GFP detection. One T4 line was selected for further studies. DEVELOPMENTAL DES1 EXPRESSION PROFILES IN ARABIDOPSIS WILD TYPE PLANTS To investigate the transcriptional regulation of the DES1 gene, we first examined its expression profile during the development and in different tissues of wild type Arabidopsis plants, using real-time RT-PCR analysis. Tissues were harvested either from seedlings grown on MS plates without sucrose or from plants grown in soil at different growth stages up to maturity (Boyes et al., 2001). The highest DES1 expression levels were detected in leaf tissues at the beginning and end of plant development; this corresponded to 14-day-old seedlings (growth stage 1.04) and to 35-day-old plants (growth stage 8.0). Flowering was completed at growth stage 8.0, at least under our experimental conditions (Figure 1). The lowest DES1 expression level found in leaves was observed at growth Table 1 | List of various cis-regulatory elements and their positions in the DES1 promoter. Function cis element Sequence Position TF family 1 Defense against insect herbivory AtMYC2 BS in RD22 CACATG (1578-1583) BHLH 2 Development Bellringer/Replumless /Pennywise AAATTAAA (2593-2600) Homeobox 3 Development Bellringer/Replumless /Pennywise AAATTAGT (1368-1375) Homeobox 4 Development Bellringer/Replumless /Pennywise ACTAATTT (293-300) Homeobox 5 Response to hiperosmolarity ATB2/AtbZIP53/AtbZlP44/GBF5 BS in ProDH ACTCAT (2537-2542) bZIP 6 Auxins response ARFI binding site motif TGTCTC (177-182) (1820-1825) ARF 7 ABA response DPBF1&2 binding site motif ACACTAG (897-904) bZIP 8 MYB binding site promoter AACCAAAC (2359–2366) MYB 9 Defense and stress MYB4 binding site motif AACAAAC (825-831) (775-781) (2446-2452) MYB4 10 Leaf maturation and senescence RAVI-A binding site motif CAACA (1-5) (2138-2142) (1508-1512) (583-587) (360-367) ABI3VPl 11 Development LFY consensus binding site motif CCAATG (1413-1418) LFY 12 Boxll promoter motif GGTTAA (2810-2815) 13 Drought response DRE-like promoter motif TACCGACCA (533-541) 14 Light response GATA promoter motif [LRE] TGATAG (2957-2962) 15 Light response GATA promoter motif [LRE] AGATAA (287-292) (96-101) 16 Light response GATA promoter motif [LRE] TGATAA (2308-2313) 17 Hexamer promoter motif CCGTCG (649-654) 18 T-box promoter motif ACTTIG (1529-1534) The immediate upstream nucleotide of the start codon is designated as position 1 as shown in the Supplemental Figure 1. www.frontiersin.org December 2014 | Volume 5 | Article 683 |3 61 Capítulo I Laureano-Marín et al. Tissue-specific expression of DES1 FIGURE 1 | Relative expression levels of the DES1 gene in different tissues at different growth stages. Wild type Arabidopsis plants were grown in soil under the growth conditions described in Materials and Methods. At the indicated growth stages, the tissues were collected for real-time RT-PCR analysis. For the growth stage 1.04, seeds were grown on solid MS medium without sucrose in Petri dishes. The DES1 transcript levels were normalized to an internal control, the constitutively expressed UBQ10 gene. Data shown are mean values ±SD from three independent analyses. stage 3.9, which corresponded to plants where rosette growth was complete but before flower buds were visible. Curiously, the DES1 expression levels in reproductive tissues (flowers and siliques) were significantly greater compared to rosette leaves in plants at vegetative growth stages. GFP EXPRESSION DRIVEN BY THE DES1 PROMOTER IN VEGETATIVE TISSUES The tissue-specific expression of the DES1 gene was examined further using the promoter-GFP approach. GFP was visualized in PromDES1-GFP plants using confocal microscopy. GFP expression largely correlated with DES1 expression profiles in wild type plants at the whole tissue level. At the seedling stage, we detected GFP fluorescence in the whole leaf; fluorescence was observed initially at 7 days after sowing (Figure 2). A closer examination of the abaxial side of the leaf revealed some specific sites with high GFP accumulation. High expression at the very tip of the leaf would correspond with hydathode pores (Figures 2A–D). In epidermal cells, we localized the GFP signal to the thin layer of cytoplasm underneath the cell wall; this included the guard cells of the stomata (Figures 2E,F). The localization of GFP to the nucleus that we observed was likely due to the relatively small size GFP, which can translocate to the nucleus on its own through nuclear pores (Seibel et al., 2007). GFP localization was also observed throughout the adaxial side of the leaf in 7-day-old seedlings. Obscure zones with no fluorescence corresponded to trichomes growing upwards in the vertical plane (Figures 2G,H). A strong GFP signal was observed inside the trichomes and in the trichome basement cells; GFP was localized to the cytoplasmic strands and clearly detectable (Figure 2I). GFP also appeared in the base of the petiole (Figure 2J). In root tissues, GFP was only observable in the hypocotyl-root transition zone (Figure 2K). At the 1.04 growth stage (14-day-old seedlings), the GFP signal increased and was distributed throughout the leaf (Figure 3). Accordingly, the maximum GFP localization was associated with the hydathode pores; the larger the leaf, the greater number of hydathodes contained (Figures 3A–C). A closer look at the mesophyll cell layer (Figures 3D,E) and leaf vascular tissues (Figure 3F) also revealed GFP expression. At this growth stage, GFP was detectable in root tissues; fluorescence was mostly observed in the meristematic zone and vascular tissues (Figures 3G–I). GFP EXPRESSION DRIVEN BY THE DES1 PROMOTER IN REPRODUCTIVE TISSUES At the mature stage, the promoter-GFP approach also confirmed previous data concerning DES1 expressionattheorganlevel.A significant level of GFP fluorescence was observed in floral tissues (Figure 4). In open flowers, a strong GFP signal was detected in the upper pistil and at the base of the pistil; only a very weak signal was observed in the stigma. The ovules inside the pistil were clearly distinguishable as black dots against the green GFP signal; this indicated that no GFP expression occurred in these cells (Figures 4A–D). A lower level of GFP fluorescence was observed in the stamen and was detectable both in the anther and the filament (Figures 4E,F). The GFP signal in the sepals and petals of the flower was high in the vascular tissues; GFP expression appeared to be significantly greater in the sepal than in the petal (Figures 4G–L). We also examined the green siliques containing developing seeds. A GFP signal was detected in the valve of the silique and the highest GFP expression was observed at the base of the seeds (Figures 5A–C). A closer look at the seed showed that the high GFP fluorescence appeared to be associated with the seed abscission zone (Figures 5D–F). An intense GFP signal was also found at the base of the siliques, which likely corresponds to the silique abscission zone (Figures 5G–I). REGULATION OF DES1 EXPRESSION BY EXOGENOUS AUXINS The spatial distribution of GFP expression conferred by the DES1 promoter suggests that DES1 is regulated by the hormone auxin (Teale et al., 2006; Wang et al., 2011; Basu et al., 2013; Baylis et al., 2013). Therefore, we analyzed DES1 gene expression in response to the exogenous application of auxins. Seeds were germinated directly on indole-3-acetic acid (IAA) at two different concentrations. After 7 days of growth, the level of DES1 gene expression was determined and compared to the level of gene expression in plants grown in the absence of IAA (Figure 6). We observed a strong and significant reduction in the level of DES1 expression in the presence of the auxin at a lower concentration of 0.1 μM. In the same samples, we measured the level of OAS-A1 gene expression. OAS-A1 is the cytosolic enzyme that acts in an opposite manner to DES1. A strong and significant induction in the expression level of OAS-A1 was observed (Figure 6). DISCUSSION Recent investigations have changed the view of the A. thaliana L-Cys desulfhydrase 1 (DES1) protein from a minor and auxiliary enzyme belonging to the OASTL protein family to an important and essential enzyme that regulates the homeostasis of cysteine and modulates the generation of sulfide in the Frontiers in Plant Science | Plant Physiology December 2014 | Volume 5 | Article 683 |4 62 Capítulo I Laureano-Marín et al. Tissue-specific expression of DES1 FIGURE 2 | GFP localization in 7-day-old seedlings from the PromDES1-GFP transgenic line. Transgenic Arabidopsis PromDES1-GFP plants were grown on solid MS plates for 7 days. GFP was visualized using confocal fluorescence microscopy. (A,B) GFP image and the same image with overlapping transmitted light image from the abaxial side of a leaf. (C) Magnification of (A) showing a hydathode pore. (D) GFP image of a hydathode pore in a different leaf. (E) GFP image with overlapping chloroplast autofluorescence image of epidermal cells on the adaxial side of a leaf. (F) Magnification of (E) showing a stoma. (G,H) GFP images from the adaxial side of two different leaves. (I) GFP image of a trichome. (J) GFP image with overlapping transmitted light image of a petiole. (K) GFP image with overlapping transmitted light image of a root neck. All images shown are Z-stacks of optical sections. cytosol for signaling purposes (Gotor et al., 2014; Romero et al., 2014). Consequently, knowledge of the tissue-specific localization and regulation of the enzyme will help us to understand the mechanisms underlying the specific functions of DES1. At the protein level, DES1 has very low abundance; this was confirmed by the identificaction of a small number of peptides in proteomic analysis (AtProteome Database). The steady-state DES1 transcript levels are also substantially low. For example, the expression level of the DES1 gene is approximately two orders of magnitude lower that the OAS-A1 expression level; this is illustrated in Figure 6, and easily verifiable using available web resources (www.arabidopsis.org; www.genevestigator. com). When GFP fluorescence is observed using the promoter- GFP approach, gene expression driven by the DES1 promoter is relatively high. Fluorescence is mainly observed throughout the whole leaf in early growth stages and in reproductive tissues. These results suggest that DES1 is regulated at posttranscriptional or post-translational level. Such a hypothesis makes sense considering the function of this protein in the generation of sulfide in the cytosol to be used for signaling in important processes such as autophagy (Alvarez et al., 2012a; Gotor et al., 2013; Romero et al., 2013). Sulfide is a toxic molecule; in recent years, it has been further recognized as an important signaling molecule in animal and plant systems (Gadalla and Snyder, 2010; Kimura, 2011; Wang, 2012; Garcia-Mata and Lamattina, 2013; Lisjak et al., 2013; Calderwood and Kopriva, 2014; Hancock and Whiteman, 2014). Therefore, sulfide generation activity in the cytosol should be precisely regulated to avoid deleterious effects. Further investigation will be necessary to determine timing, tissue regulation and the players responsible of this sulfide tuning. Sulfide has been implicated in the regulation of other essential process such as stomatal movement (Garcia-Mata and Lamattina, www.frontiersin.org December 2014 | Volume 5 | Article 683 |5 63 Capítulo I Laureano-Marín et al. Tissue-specific expression of DES1 FIGURE 3 | GFP localization in 14-day-old seedlings from the PromDES1-GFP transgenic line. Transgenic Arabidopsis PromDES1-GFP plants were grown on solid MS plates for 14 days. GFP was visualized using confocal fluorescence microscopy. (A,B) Reconstruction of two different leaves from a 14-day-old seedling by joining the GFP images from different sections. (C) GFP image of a hydathode pore. (D,E) GFP image and the same image with overlapping red chloroplast autofluorescence of mesophyll cells. (F) GFP image of a leaf showing the vascular tissue. (G–I) GFP image with overlapping transmitted light image from different root sections. All images shown are Z-stacks of optical sections. 2010; Lisjak et al., 2010). Very recently, the involvement of DES1 in the ABA-dependent signaling network in guard cells and the requirement for DES1 in ABA-dependent NO production have been demonstrated (Scuffi et al., 2014). These data suggest that the DES1 protein may be hormonally regulated and may crosstalk with other signaling molecules. The present study demonstrates that the maximum DES1 expression occurs at the initial (seedling) and final (maturity) stages of plant development. This suggests a specific role for DES1 at these developmental stages. These data fit well with data gathered using des1 null mutants, in which phenotypic differences were observed at these stages. ROS production was practically unchanged after cadmium treatment in des1 mutant seedlings, in contrast with wild type seedlings. Consequently, the DES1 mutation produces an enhanced tolerance to cadmium and H2O2 stress conditions (Alvarez et al., 2010). At maturity, mutation in the DES1 gene leads to premature leaf senescence and promotes the accumulation and lipidation of the ATG8 protein; ATG8 is typically associated with the induction of autophagy. The transcriptional profile of the des1 mutant corresponds with the observed premature senescence and induced autophagy phenotypes. Most important, the DES1 mutation significantly alters the Frontiers in Plant Science | Plant Physiology December 2014 | Volume 5 | Article 683 |6 64 Capítulo I Laureano-Marín et al. Tissue-specific expression of DES1 FIGURE 4 | GFP localization in the reproductive tissues of plants from the PromDES1-GFP transgenic line. Transgenic Arabidopsis PromDES1-GFP plants were grown in soil under physiological growth conditions for 35–40 days. GFP was visualized using confocal fluorescence microscopy. (A,B) GFP and transmitted light images of the upper part of a pistil. (C,D) GFP and transmitted light images of the base of a pistil. (E,F) GFP and transmitted light images of a stamen. (G,H) GFP and transmitted light images of a sepal. (I–L) GFP and transmitted light images of whole petal. All images shown are Z-stacks of optical sections. transcriptional profile at the late growth stage. When transcriptomic analysis was performed using leaves from plants grown for 20 d (growth stage 3.9), only 16 genes in the des1 mutant were differentially expressed compared to wild type plants. In contrast, the des1 transcriptional profile changed dramatically compared to wild type in leaves from plants grown for 30 d (growth stage 6.3). The normalized data revealed that 1614 genes were differentially expressedinthemutantcomparedtothewildtype(Alvarez et al., 2012a). Consequently, the function of DES1 seems to be critical at this late growth stage. An examination of GFP expression driven by the DES1 promoter in vegetative tissues reveals that the highest GFP signal occurs in the hydathode pores distributed along the margin of the leaf; the number of pores increases with the leaf size. Hydathodes are specialized pore-like structures that act as the exit point in vascular tissues. At these sites, water and ions are released from the xylem. It has also suggested that hydathodes are involved in ion reabsorption to other tissues through the phloem (Nagai et al., 2013). In addition, the hydathodes are open pores similar to stomata (Nagai et al., 2013). The Arabidopsis basic helix-loop-helix (bHLH) protein MUTE, which is a master regulator of stomatal differentiation, is also required for the production of hydathodes (Pillitteri et al., 2008). We have detected a significant GFP fluorescence signal localized to the cytoplasm of guard cells, which suggests the DES1 protein or the sulfide generated by DES1 has a specific function in these pore structures in Arabidopsis leaves. This suggestion is reinforced by our recent findings that show DES1 is required for ABA-dependent stomatal closure and the sulfide generated by DES1 acts upstream of nitric oxide in this signaling network (Scuffi et al., 2014). The DES1 promoter also confers strong GFP expression inside the trichomes; this result supports numerous reports that have demonstrated the significance of this cell type in relation to sulfur metabolism. In situ hybridization studies in combination with determinations of glutathione content by confocal microscopy demonstrated that highly active glutathione biosynthesis occurs www.frontiersin.org December 2014 | Volume 5 | Article 683 |7 65 Capítulo I Laureano-Marín et al. Tissue-specific expression of DES1 FIGURE 5 | GFP localization in developing siliques of plants from the PromDES1-GFP transgenic line. Transgenic Arabidopsis PromDES1-GFP plants were grown in soil under physiological growth conditions for 40 days. GFP was visualized using confocal fluorescence microscopy. (A–C) GFP image, transmitted light image, the same GFP image with overlapping transmitted light and red chloroplast autofluorescence image of a developing silique containing several immature seeds. (D–F) GFP image, transmitted light image, the same GFP image with overlapping transmitted light and red chloroplast autofluorescence image of an immature seed. (G–I) GFP image, transmitted light image, the same GFP image with overlapping transmitted light and red chloroplast autofluorescence image in the abscission zone of a silique. All images shown are Z-stacks of optical sections. in Arabidopsis trichome cells (Gotor et al., 1997; Gutierrez-Alcala et al., 2000). Furthermore, protein profiling performed in this specific cell type also identified an important number of proteins involved in sulfur metabolism (Wienkoop et al., 2004). This trichome-specific expression driven by the DES1 promoter is similar to expression driven by the OAS-A1 promoter (Gutierrez- Alcala et al., 2005). These findings suggest that, in this cell type, the homeostasis of cysteine is important and is modulated by the enzymes OAS-A1 and DES1; OAS-A1 catalyzes the synthesis of cysteine and DES1 catalyzes the degradation of cysteine. In this work, a detailed analysis of the expression of a reporter gene driven by the promoter of a gene encoding an enzyme involved in plant sulfur assimilation was performed for the first time. The localization of reporter expression conferred by such promoters in reproductive tissues was previously unknown. In open flowers, the DES1 promoter confers high GFP expression, which occurs mainly in the pistil, sepal, and petal. Weaker GFP signals were observed in the stamen. The presence of OAS-A1 transcripts was also detected in flowers by in situ hybridizations; this finding was analogous to our observations in trichomes (Gotor et al., 1997). When siliques were analyzed, strong GFP fluorescence was detected in the presumed abscission zones at the bases of the siliques and seeds. Cell separation is a process highly regulated by plant hormones. Ethylene, JA, and ABA act together to regulate organ abscission (Ogawa et al., 2009). Auxin is also involved in many abscission events (Basu et al., 2013). Frontiers in Plant Science | Plant Physiology December 2014 | Volume 5 | Article 683 |8 66 Capítulo I Running head: ROS-independent sulfide regulation of autophagy 1 2 3 Correspondence: Cecilia Gotor. Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Consejo 4 Superior de Investigaciones Científicas and Universidad de Sevilla. Avenida Américo 5 Vespucio, 49, 41092 Sevilla, Spain. Tel: 34.954489516. Email: g[email protected] 6 7 8 Research area: 9 10 Capítulo II 73 Negative regulation of autophagy by sulfide in Arabidopsis thaliana is 11 independent of reactive oxygen species 12 13 14 Ana M. Laureano-Marín, Inmaculada Moreno, Luis C. Romero, Cecilia Gotor 15 16 Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Consejo Superior de Investigaciones 17 Científicas and Universidad de Sevilla, Avenida Américo Vespucio, 49, 41092 Sevilla, Spain 18 19 20 Summary: 21 Sulfide, but not other sulfur-containing molecules, represses autophagy irrespective of the 22 redox conditions. 23 24 Capítulo II 74 Footnotes: 25 26 This work was funded in part by the European Regional Development Fund through the 27 Ministerio de Economia y Competitividad (grant MOLCIS, no. BIO2013-44648-P) and the 28 Junta de Andalucía (grant no. CVI-7190). A.M.L-M. thanks the Ministerio de Economia y 29 Competitividad for fellowship support through the program of Formación de Personal 30 Investigador. 31 32 33 34 Capítulo II 75 ABSTRACT 35 36 Accumulating experimental evidence in mammalian - and recently plant - systems has led to a 37 change in our understanding of the role played by hydrogen sulfide in life processes. In plants, 38 hydrogen sulfide mitigates stress and regulates important plant processes such as 39 photosynthesis, stomatal movement and autophagy, although the underlying mechanism is not 40 well known. In this study, we provide new experimental evidence that, together with our 41 previous findings, demonstrates the role of hydrogen sulfide in regulating autophagy. We used 42 GFP fluorescence associated with autophagic bodies and immunoblot analysis of the ATG8 43 protein to show that sulfide (and no other molecules such as sulfur-containing molecules or 44 ammonium) was able to inhibit the autophagy induced in Arabidopsis thaliana roots under 45 nitrogen deprivation. Our results showed that sulfide was unable to scavenge reactive oxygen 46 species generated by nitrogen limitation, in contrast to well-established reducers. In addition, 47 reducers were unable to inhibit the accumulation of autophagic bodies and ATG8 protein 48 forms to the same extent as sulfide. Therefore, we conclude that sulfide represses autophagy 49 via a mechanism that is independent of redox conditions. 50 51 52 53 54 Capítulo II 76 INTRODUCTION 55 56 Historically, sulfide has been considered to be a toxic molecule that is hazardous to life and 57 the environment. However, hydrogen sulfide is currently recognized as an important signaling 58 molecule that functions as a physiological gasotransmitter and is of comparable importance to 59 NO and CO in mammalian systems. The number of biological roles of sulfide has rapidly 60 expanded in recent times and is the subject of many reviews that have emphasized the 61 physiological importance of sulfide because most mammalian cells produce and metabolize 62 sulfide in a precise and regulated manner (Szabo, 2007; Li and Moore, 2008; Gadalla and 63 Snyder, 2010; Kimura, 2011; Wang, 2012). Accumulating evidence from numerous studies in 64 plant biology have also shown that hydrogen sulfide is a signaling molecule that can be as 65 important as NO and H2O2; thus, hydrogen sulfide has also been the subject of several recent 66 reviews (Garcia-Mata and Lamattina, 2013; Lisjak et al., 2013). Sulfide has been found to 67 mediate increases in tolerance and protection against certain plant stresses, primarily through 68 the increased performance of antioxidant defenses. For example, sulfide alleviates the 69 inhibitory effects of copper and aluminum stress on wheat germination and barley seedlings 70 (Zhang et al., 2008; Zhang et al., 2010; Dawood et al., 2012), the effect of boron on cucumber 71 root elongation (Wang et al., 2010), and the toxicity of cadmium in Populus euphratica (Sun 72 et al., 2013) and alfalfa seedlings (Li et al., 2012). Sulfide also improves drought and hypoxia 73 resistance and heat and salinity tolerance (Jin et al., 2011; Li et al., 2012; Cheng et al., 2013; 74 Christou et al., 2013). Furthermore, sulfide has been suggested to play a role in regulating 75 photosynthesis and flower senescence and in prolonging the postharvest shelf life of fruits 76 (Chen et al., 2011; Zhang et al., 2011; Hu et al., 2012). Interestingly, hydrogen sulfide has also 77 been identified as a component of the abscisic acid signaling pathway in guard cells (Garcia-78 Mata and Lamattina, 2010; Lisjak et al., 2010). Recently, it has been demonstrated that sulfide 79 acts upstream of nitric oxide to modulate abscisic acid-dependent stomatal closure (Scuffi et 80 al., 2014). The cross-talk between NO and sulfide has also been suggested based on the 81 induced alleviation of cadmium toxicity in alfalfa seedlings (Li et al., 2012), the improved 82 heat tolerance of maize seedlings (Li et al., 2013) and the enhanced salinity tolerance of alfalfa 83 seeds during germination (Wang et al., 2012). All of these findings clearly demonstrate the 84 importance of sulfide as a signaling molecule that is involved in regulating numerous essential 85 processes in plants. 86 Capítulo II 77 The endogenous production of hydrogen sulfide in mammalian tissues occurs through the 87 enzymatic reactions of L-cysteine (Szabo, 2007; Li and Moore, 2008; Gadalla and Snyder, 88 2010; Kimura, 2011; Wang, 2012). In plants, we identified an enzyme, DES1, with L-cysteine 89 desulfhydrase activity that is located in the cytosol of Arabidopsis thaliana (Alvarez et al., 90 2010). This is the only enzyme that has been unequivocally established to catalyze the 91 desulfuration of L-cysteine to sulfide plus ammonia and pyruvate, and therefore, it is 92 responsible for the release of hydrogen sulfide in the plant cytosol. Mutations in the DES1 93 gene impede the formation of sulfide and strongly affect plant metabolism and stress 94 responses. Thus, the detailed characterization of des1 null mutants reveals premature leaf 95 senescence, a dramatically altered plant transcriptional profile at the mature developmental 96 stage and the induction of autophagy (Alvarez et al., 2012). The des1 mutants also present 97 increased tolerance to conditions that promote oxidative stress, a high resistance to biotrophic 98 and necrotrophic pathogens, salicylic acid accumulation and WRKY DOMAIN CONTAINING 99 TRASCRIPTION FACTOR54 and PATHOGENESIS RELATED1 induction; therefore, des1 100 mutants resemble constitutive systemic acquired resistance mutants (Alvarez et al., 2010; 101 Alvarez et al., 2012). Moreover, in des1 mutants, stomata do not close in response to abscisic 102 acid. This effect is restored by the application of exogenous sulfide or genetic 103 complementation, demonstrating the involvement of DES1 in ABA signaling in guard cells. 104 Further studies have shown that DES1 is required for ABA-dependent NO production (Scuffi 105 et al., 2014). Thus, in plant cells, DES1 could be responsible for modulating the generation of 106 sulfide for important signaling processes (Romero et al., 2013; Gotor et al., 2014) such as 107 autophagy. 108 Autophagy is a universal mechanism with a pro-survival role in eukaryotic cells and 109 involves the digestion of cell contents to recycle the necessary nutrients or to degrade 110 damaged or toxic components. The most important feature of autophagy (we refer to the 111 macroautophagy) is the de novo synthesis of double membrane-bound structures called 112 autophagosomes, which engulf and deliver materials to the vacuole to be broken down. 113 Proteins involved in autophagy (ATG proteins) have been used to monitor autophagic activity 114 in plants; the most commonly used protein is ATG8, which is tethered to autophagosomes by 115 lipidation (Thompson and Vierstra, 2005; Bassham et al., 2006; Bassham, 2007; Yoshimoto et 116 al., 2010; Li and Vierstra, 2012; Yoshimoto, 2012). DES1 deficiency promotes the 117 accumulation and lipidation of ATG8 isoforms in Arabidopsis leaves. Because mutation of the 118 Capítulo II 78 DES1 gene impedes sulfide generation in the cytosol, ATG8 protein accumulation and 119 lipidation is prevented in des1 mutants when sulfide is generated by genetic complementation 120 or exogenous application. Interestingly, exogenous sulfide also rescues the activation of 121 autophagy that results from dark-induced carbon starvation in wild type Arabidopsis leaf 122 tissues (Alvarez et al., 2012). 123 The underlying mechanism for transforming the sulfide signal into a biological response is 124 largely unknown. Two mechanisms of action have been proposed based on the chemical 125 properties of H2S. The nucleophilic properties of sulfide and its capacity to react with different 126 oxygen species and nitrogen oxides suggest that it can act as an antioxidant to reduce 127 oxidative stress (Fukuto et al., 2012). The second mechanism consists of the post-translational 128 modification of the –SH groups of protein cysteines to generate the persulfide group –SSH, 129 and, in this way, alter protein activities or functions (Mustafa et al., 2009; Paul and Snyder, 130 2012; Aroca et al., 2015). 131 The aim of this work was to determine the mechanism underlying the regulation of 132 autophagy by sulfide. For this purpose, we have investigated the role of sulfide in the 133 induction of autophagy under nitrogen deprivation. 134 135 136 137 138 139 Capítulo II 79 RESULTS 140 141 Sulfide Represses Autophagy when It Is Induced under Nitrogen Deprivation in 142 Arabidopsis Roots 143 144 Previously, we showed that the application of exogenous sulfide rescues the induction of 145 autophagy in Arabidopsis leaves, both in des1 mutant and in carbon-starved wild type plants, 146 by analyzing the accumulation of ATG8 protein isoforms (Alvarez et al., 2012). These results 147 prompted us to suggest that sulfide generated in the cytosol by DES1 behaves as a repressor of 148 autophagy (Gotor et al., 2013; Romero et al., 2013; Gotor et al., 2014). To complement our 149 previous studies and decipher the mechanism underlying the role of sulfide in autophagy, we 150 established a new experimental system in which autophagy was induced by a different 151 condition, in a different tissue and by using a different molecular tool. Thus, wild type 152 Arabidopsis plants expressing the GFP-ATG8a fusion protein were subjected to nitrogen 153 limitation, and the effects of exogenous sulfide on seedling roots were analyzed by confocal 154 microscopy of the GFP fluorescence. Seedlings were grown for 1 week on nitrogen-sufficient 155 media, and a portion of the seedlings were transferred to fresh nitrogen-rich media. The other 156 seedlings were transferred to media lacking nitrogen, and a third set of seedlings was placed 157 on the same nitrogen-deficient media supplemented with 200 μM NaHS. After the transfer, the 158 seedlings were grown for an additional 2 or 4 days, and then removed and treated with 159 concanamycin A prior to observing them by confocal microscopy. In the roots of plants grown 160 under nitrogen-rich conditions, we observed fluorescent punctate structures that were 161 previously identified as GFP-ATG8-tagged autophagosomes and autophagic bodies 162 (Yoshimoto et al., 2004; Contento et al., 2005; Thompson et al., 2005; Bassham, 2014; 163 Merkulova et al., 2014). However, when the seedlings were subjected to nitrogen deprivation, 164 independently of the time period, there was an increase in the number of autophagic bodies 165 (Fig. 1), as previously demonstrated (Thompson et al., 2005; Phillips et al., 2008). Therefore, 166 our results indicated that our nitrogen-limited conditions successfully induced autophagy. 167 Interestingly, the presence of NaHS in the media significantly inhibited the accumulation of 168 fluorescent vesicles observed during nitrogen deprivation (Fig. 1). Without concanamycin A 169 treatment, we failed to detect dotted structures; in contrast, we observed diffuse fluorescent 170 staining of only the cytoplasm, with no change in response to nitrogen limitation 171 Capítulo II 80 (Supplemental Fig. S1). 172 To determine whether the changes in the number of autophagic bodies observed by 173 confocal microscopy were significant, these structures were quantified using the images of 25 174 Capítulo II 81 to 35 different cells (Fig. 1). We quantified a large number of fluorescent vesicles per root cell 175 in nitrogen-deprived seedlings, both of which were grown for 2 or 4 additional days, compared 176 with those grown under nitrogen-rich conditions. The number of autophagic bodies was more 177 than 3-fold higher in nitrogen-deficient media than in rich media after 4 additional days of 178 growth. Moreover, the presence of exogenous sulfide produced an important decrease in the 179 number of vesicles that was more significant during a treatment period of 4 days, reaching 180 levels close to those observed in nitrogen-rich media. Both the increase in autophagic bodies 181 under nitrogen-limited conditions and their reduction by exogenous sulfide were statistically 182 significant. 183 It is important to note that the nitrogen-deficient media used in this study contained all of 184 the sulfate salts at the same concentrations that were present in the MS media and were 185 therefore sulfate-rich media. These results confirmed that sulfide represses autophagy in 186 Arabidopsis independently of sulfur limitation. 187 To establish that the role of sulfide in regulating autophagy was specific to this molecule 188 and therefore different from that of other inorganic sulfur-containing compounds, we 189 performed a similar nitrogen limitation experiment in the presence of different sodium salts 190 for 4 days (Fig. 2A). As expected, the sulfate and sulfite sodium salts that did not release 191 sulfide were unable to reverse the accumulation of autophagic bodies under nitrogen 192 deprivation to the same extent as sulfide. However, both the Na2S and NaHS treatments 193 produced a similar reduction in the number of autophagic bodies under nitrogen limitation. We 194 concluded that only sulfide donor molecules are responsible for the inhibition of autophagic 195 body accumulation induced by nitrogen deprivation in Arabidopsis roots. In addition, we 196 included a treatment with the same concentration of ammonium and under the same nitrogen 197 limitation conditions, and we did not observe a strong inhibition of fluorescent vesicle 198 accumulation similar to that produced by sulfide (Fig. 2A). This result again confirmed that 199 sulfide acts as a signaling molecule during the repression of autophagy. Furthermore, sulfide 200 acted in a dose-dependent manner (Fig. 2B). The effects of sulfide were optimal at 100 to 200 201 μM NaHS; higher concentrations of the donor were less effective and even induced an 202 increase in the accumulation of autophagic bodies. Thus, at 400 μM NaHS and nitrogen 203 deprivation, we observed an increase of approximately 20 % in the number of vesicles relative 204 to roots under nitrogen limitation stress alone. This pattern may stem from sulfide toxicity; the 205 generation of reactive sulfur and oxygen species after a certain concentration threshold that 206 Capítulo II 82 nitrogen-deficient media were supplemented with either 200 μM of reduced glutathione or 312 ascorbate, a decrease in the fluorescent signal was observed, reaching the same signal intensity 313 as observed under nitrogen-sufficient conditions, as expected for well-known antioxidants. 314 Capítulo II 89 These findings showed that hydrogen sulfide does not behave as a H2O2 scavenger in our 315 conditions. We cannot exclude that other ROS different to H2O2 might mediate the repressive 316 effect of sulfide. Such is the case of the superoxide radical anion, whose function in root 317 Capítulo II 90 development is well established (Foreman et al., 2003). Consequently, superoxide production 318 was also visualized by nitroblue tetrazolium staining of the same root tissues and basically the 319 same results were obtained (Fig. 5). The dark-blue stain due to the superoxide was observed 320 Capítulo II 91 most intensively and extensively distributed in roots after 4 days of growth on nitrogen-321 deficient media alone and in the presence of sulfide by comparison with the other studied 322 conditions, mainly in the root differentiation zone used for monitoring GFP-ATG8. 323 Capítulo II 92 We further analyzed the effect of both GSH and ascorbate on the increased accumulation of 324 autophagic bodies in response to nitrogen limitation in plants expressing the GFP-ATG8a 325 fusion protein (Fig. 6). Only the presence of NaHS in the media significantly inhibited the 326 accumulation of fluorescent vesicles, while GSH and ascorbate were unable to produce any 327 effect (Fig. 6A). Representative single optical sections of the images visualized by confocal 328 microscopy are shown in the Supplemental Material (Supplemental Fig. S3). Similar results 329 were also obtained when the immunoblot analysis was performed. The presence of sulfide and 330 no GSH and ascorbate significantly decreased the accumulation of the free GFP level, 331 indicative of a repression of the autophagic flux by sulfide (Fig. 6B). These data clearly 332 suggested that the effect of sulfide on the progression of autophagy is independent of ROS. In 333 a previous work, however, a reduction of punctate structures was observed in the presence of 334 antioxidants (Liu et al., 2009). Differences in methodological procedures, antioxidant 335 concentrations and timing of the treatments make both investigations are not comparable. In 336 the present work the antioxidant treatment is performed in solid medium at 200 μM for 4 days 337 in nitrogen-deficient conditions, which are exactly the same conditions used to check the 338 effect of sulfide as a possible antioxidant. On the contrary, in the previous work (Liu et al., 339 2009) the treatment is performed in liquid nitrogen-rich medium with the antioxidant at 20 340 mM in one case (imidazole) and 2 mM in other case (ascorbate) for 4 h. 341 342 Correlation between Autophagy and DES1 343 344 Previously, we demonstrated that DES1 deficiency leads to the accumulation and lipidation 345 of ATG8 proteins. Through genetic complementation or exogenous application of sulfide, we 346 were able to rescue autophagy induction in des1 null mutants (Alvarez et al., 2012). 347 Consequently, we suggested that DES1 should modulate the generation of sulfide in the plant 348 cytosol for autophagy signaling (Gotor et al., 2013; Romero et al., 2013). In addition, we 349 wanted to determine whether stressful conditions that induce autophagy, such as nutrient 350 limitation, had any effect on DES1. To test this hypothesis, we performed the same 351 experiment as described above and compared seedlings grown under nitrogen-rich and 352 nitrogen-deficient conditions in terms of DES1 gene expression and DES enzyme activity (Fig. 353 7). A strong reduction (73 %) in DES1 gene expression was observed in the roots of seedlings 354 grown in nitrogen-deficient media compared with those grown in nitrogen-replete media. The 355 Capítulo II 93 total DES activity was also slightly decreased when the seedlings were transferred to nitrogen-356 deprived conditions, but this reduction was not statistically significant. Other enzymes with 357 H 2 S-releasing activity, which is the method used to measure DES activity, are present in 358 Capítulo II 94 plants; therefore, the contribution of cytosolic DES1 protein to total DES activity is expected 359 to be low. 360 361 Capítulo II 95 The Effect of Sulfide Is Observable at the Phenotypic Level 362 363 To establish that particular concentrations of sulfide molecule donors did not have a toxic 364 effect on seedling growth, we studied the phenotypic characteristics of seedlings expressing 365 GFP-ATG8a and grown in the different conditions described above. When the seedlings were 366 transferred from N-rich to N-deficient media, a decrease in shoot and root biomass was 367 evident at the beginning of the transfer period. After 4 days, a change in leaf color was 368 appreciable in the nitrogen-deficient media and reflected the repression of chlorophyll 369 synthesis and the induction of anthocyanin synthesis, which are characteristic plant responses 370 to nitrogen deprivation (Scheible et al., 2004; Peng et al., 2007). In contrast, the presence of 371 NaHS apparently reduced the extent of browning, which was primarily observable in the 372 abaxial portion of the leaves, resulting in a healthier phenotype (Fig. 8A). The level of 373 anthocyanin was approximately 6-fold higher in the nitrogen-starved seedlings than in the 374 nitrogen-sufficient seedlings. The presence of NaHS resulted in identical (or even slightly 375 lower) anthocyanin content compared to that in the nitrogen-sufficient seedlings (Fig. 8B). 376 Furthermore, the presence of sulfide in the nitrogen-limited medium was effective in 377 alleviating the stress induced by the absence of a nitrogen source during the longer treatment 378 periods (6 and 8 days). During these long periods of nitrogen deprivation, the application of 379 lower concentrations of sulfide and the use of NaHS as a sulfide donor were more effective for 380 reducing stress (Supplemental Fig. S4, S5). Therefore, we can conclude that hydrogen sulfide 381 can play important roles in plants, with phenotypically observable outcomes. 382 383 Capítulo II 96 384 Capítulo II 97 DISCUSSION 385 386 The conceptualization of the role of hydrogen sulfide in both animal and plant systems has 387 changed dramatically in recent years. Currently, hydrogen sulfide is viewed not as a toxic 388 molecule to life, but rather as a regulator of essential life processes. In mammals, hydrogen 389 sulfide has been considered to be a gasotransmitter with major physiological functions in 390 different body systems (Gadalla and Snyder, 2010). Alterations of H2S metabolism have 391 important pathological consequences, establishing the clinical relevance of this molecule 392 (Lowicka and Beltowski, 2007; Szabo, 2007; Wang, 2012). In addition to the protective 393 effects of hydrogen sulfide against a wide array of different stresses that have been 394 demonstrated in plants (Zhang et al., 2008; Wang et al., 2010; Zhang et al., 2010; Jin et al., 395 2011; Dawood et al., 2012; Li et al., 2012; Li et al., 2012; Cheng et al., 2013; Christou et al., 396 2013; Sun et al., 2013), this molecule has also been shown to regulate plant processes that are 397 critical for plant performance, such as photosynthesis (Chen et al., 2011), stomatal movement 398 (Garcia-Mata and Lamattina, 2010; Lisjak et al., 2010; Scuffi et al., 2014) and autophagy 399 (Alvarez et al., 2012; Gotor et al., 2013). In the present study, we provide new experimental 400 evidence that, together with our previous findings, demonstrates the role of hydrogen sulfide 401 in regulating the progression of autophagy independently of the condition in which the 402 autophagy originates. Most importantly, our findings contribute to our understanding of the 403 mechanism underlying the regulation of autophagy by sulfide in plant systems, by confirming 404 that its role is not dependent on the redox state. 405 As in other organisms, autophagy is constitutively active in plant cells under favorable 406 growth conditions (Slavikova et al., 2005). However, when plants are exposed to adverse 407 environmental conditions, one of their responses to cope with stress and survive is to increase 408 the induction of autophagy. These stresses include nitrogen and carbon deprivation. Several 409 studies have reported that autophagy can be induced by carbon and nitrogen deprivation, 410 which is detected in many cases through a substantial increase in ATG8 protein levels 411 (Doelling et al., 2002; Hanaoka et al., 2002; Thompson et al., 2005; Xiong et al., 2005; Chung 412 et al., 2009; Guiboileau et al., 2013). In the present study, we observed basal levels of 413 autophagy under nitrogen-sufficient conditions. However, under stressful growth conditions, 414 increased levels of autophagy were observed under nitrogen deprivation. Interestingly, the 415 presence of sulfide during stress prevented an increase in the activation of autophagy, 416 Capítulo II 98 600 Determination of Anthocyanin Content 601 602 Approximately 40-70 mg of aerial tissues from seedlings was homogenized in 1 mL of 603 propanol:HCl:water (18:1:81) and further extracted in a boiling water bath for 3 min. The 604 mixture was centrifuged at 5,000 g for 40 min. The absorbance of the supernatant was 605 measured at 535 and 650 nm, and the total anthocyanin content per gram fresh weight was 606 determined using previously described methods (Lange et al., 1971). 607 608 Statistical Analysis 609 610 Multivariate analysis of variance (ANOVA) statistical analysis of the data was performed 611 using the program Statgraphics Centurion. 612 613 614 615 ACKNOWLEDGMENTS 616 617 We thank Dr. Irene García for critical reading of the manuscript, Dr. Alicia Orea for confocal 618 microscopy service, Dr. José Luis Crespo for providing the anti-ATG8 antibodies, and Dr. 619 Richard Vierstra for providing seeds of wild type A. thaliana expressing GFP-ATG8a. 620 621 Capítulo II 105 FIGURE LEGENDS 622 623 Figure 1. Effect of exogenous sulfide on autophagy induced by nitrogen deprivation in 624 Arabidopsis roots. Wild type seedlings expressing GFP-ATG8a fusion were grown for 7 days 625 on N-rich medium and then transferred to the same medium (+N), to a N-deficient medium (-626 N), or to a N-deficient medium containing 200 μM NaHS (-N + NaHS) for an additional 2 627 days (A) or 4 days (B). The root cells were visualized by confocal fluorescence microscopy 628 and exposed to concanamycin A prior to observation as described in the Materials and 629 Methods. Representative single optical section of fluorescence, visible and overlaid images are 630 shown. The number of GFP-ATG8 puncta per cell section was determined using PDQuest 631 software as described in the Materials and Methods. Values are the average number (±SD) of 632 fluorescent vesicles within the central vacuoles per cell of 25-35 cells in each of the three 633 independent experiments. Different letters indicate significant differences (P < 0.05). 634 635 Figure 2. Effect of different chemicals (A) and concentrations (B) on the autophagy induced 636 by nitrogen starvation in Arabidopsis roots. Wild type seedlings expressing GFP-ATG8a 637 fusion were grown for 7 days on N-rich medium and then transferred for an additional 4 days 638 to the same medium (+N), to a N-deficient medium (-N), or to a N-deficient medium 639 containing 200 μM of different salts as indicated in panel (A); or alternatively to the N-640 deficient medium containing different concentrations of NaHS as indicated in panel (B). Root 641 cells were visualized by confocal fluorescence microscopy and, prior to observation, were 642 exposed to concanamycin A as described in the Materials and Methods. The number of 643 autophagic bodies per cell section was determined using the PDQuest software as described in 644 the Materials and Methods. Values are the average number (±SD) of fluorescent vesicles 645 within the central vacuoles per cell of 25-35 cells in each of the three independent experiments. 646 Different letters indicate significant differences (P < 0.05). 647 648 Figure 3. Immunoblot analysis of GFP-ATG8a fusion and endogenous ATG8 protein 649 accumulation in Arabidopsis roots. (A) Wild type and wild type seedlings expressing the GFP-650 ATG8a fusion were grown for 7 days on N-rich medium and then transferred to the same 651 medium (+N), to a N-deficient medium (-N), or to a N-deficient medium containing 200 μM 652 NaHS (-N + S) for an additional 4 days. Total protein extracts were prepared from roots as 653 Capítulo II 106 described in the Materials and Methods, and 3 μg of each extract was resolved by 10 % SDS-654 PAGE and subjected to immunoblot analysis with anti-GFP antibodies (left panel); and 20 μg 655 of each extract was resolved by 15 % SDS-PAGE and subjected to immunoblot analysis with 656 anti-ATG8 (right panel). As the protein loading control, before immunodetection, the 657 membrane was stained with SYPRO Ruby. The experiment was repeated three times and 658 representative images are shown. The amount of each immunodetected protein band relative to 659 the loading control was quantified in the three replicates of the experiment, and the average is 660 shown in parentheses, with a value of 100 % assigned to the band corresponding to the +N 661 sample. (B) Wild type and atg7-1 mutant seedlings were grown for 7 days on N-rich medium 662 and then transferred to the same medium (+N), to a N-deficient medium (-N), or to a N-663 deficient medium containing 200 μM NaHS (-N + S) for an additional 4 days. Total protein 664 extracts were prepared from roots and membrane and soluble fractions were separated by 665 centrifugation as described in the Materials and Methods, and 15 μL of each fraction was 666 resolved by 15 % SDS-PAGE and subjected to immunoblot analysis with anti-ATG8. As the 667 protein loading control, a gel was run in parallel and stained with Coomassie Brilliant Blue. In 668 the membrane fraction, the amount of the lipidated ATG8 protein band (shown with an 669 asterisk) was quantified relative to the loading control, with a value of 100 % assigned to the 670 band corresponding to the -N sample of the wild type. In the soluble fraction, all together 671 immunodetected protein bands were quantified relative to the loading control, with a value of 672 100 % assigned to the band corresponding to the -N sample of the wild type. Different letters 673 indicate significant differences (P < 0.05). 674 675 Figure 4. Detection of hydrogen peroxide in Arabidopsis roots. Wild type seedlings were 676 grown for 7 days on N-rich medium and then transferred to the same medium (+N), to a N-677 deficient medium (-N), or to a N-deficient medium containing either 200 μM NaHS (-N + 678 NaHS), or GSH (-N + GSH), or ascorbate (-N + ASC) for an additional 4 days. The roots were 679 loaded with H2DCFDA for 5 min to detect H2O2 (pseudocolored in green) in the presence of 680 PI to visualize cell walls (pseudocolored in red). Representative images of two different zones 681 of the root for each sample are shown. 682 683 Figure 5. Detection of superoxide in Arabidopsis roots. Wild type seedlings were grown for 7 684 days on N-rich medium and then transferred to the same medium (+N), to a N-deficient 685 Capítulo II 107 medium (-N), or to a N-deficient medium containing either 200 μM NaHS (-N + NaHS), or 686 GSH (-N + GSH), or ascorbate (-N + ASC) for an additional 4 days. The roots were stained 687 with NBT as described in Materials and Methods. Representative images are shown. Bars = 688 250 μm. 689 690 Figure 6. Effect of exogenous sulfide, reduced glutathione and ascorbate on the autophagy 691 induced by nitrogen deprivation in Arabidopsis roots. Wild type seedlings expressing GFP-692 ATG8a fusion were grown for 7 days on N-rich medium and then transferred to the same 693 medium (+N), to a N-deficient medium (-N), or to a N-deficient medium containing either 200 694 μM NaHS (-N + NaHS), GSH (-N + GSH), or ascorbate (-N + ASC) for an additional 4 days. 695 (A) Root cells were visualized by confocal fluorescence microscopy and, prior to observation, 696 were exposed to concanamycin A as described in the Materials and Methods. The mean 697 fluorescence inside the vacuoles was determined using ImageJ software. Values are expressed 698 as relative units (±SD) of mean fluorescence within the central vacuoles of the three 699 independent experiments. Representative single optical section of fluorescence, visible and 700 overlaid images are shown in Supplemental Figure S3. (B) Immunoblot analysis of GFP-701 ATG8a fusion protein. Total protein extracts were prepared from roots as described in the 702 Materials and Methods, and 8 μg of each extract was resolved by 10 % SDS-PAGE and 703 subjected to immunoblot analysis with anti-GFP antibodies. As the protein loading control, a 704 gel was run in parallel and stained with Coomassie Brilliant Blue. The experiment was 705 repeated three times, and representative images are shown. The amount of the free GFP 706 protein band relative to the loading control was quantified, and the average is shown in 707 parentheses, with a value of 100 % assigned to the band corresponding to the -N sample. 708 Different letters indicate significant differences (P < 0.05). 709 710 Figure 7. Effect of nitrogen starvation on DES1 gene expression and DES activity in 711 Arabidopsis roots. Wild type seedlings were grown for 7 days on N-rich medium and then 712 transferred to the same medium (+N) or to a N-deficient medium (-N) for an additional 4 days. 713 Root samples were collected and used for quantitative real-time RT-PCR to analyze the 714 expression of the DES1 gene and to measure DES activity as described in the Materials and 715 Methods. Values are the means ±SD of three independent experiments. **P<0.01. 716 717 Capítulo II 108 Figure 8. Phenotypes of wild type seedlings expressing GFP-ATG8a under different 718 conditions. Wild type seedlings expressing the GFP-ATG8a fusion were grown for 7 days on 719 N-rich medium and then transferred to the same medium (+N), to a N-deficient medium (-N), 720 or to a N-deficient medium containing 200 μM NaHS for an additional 4 days. (A) 721 Representative bright field images of whole seedlings are shown. The lower panels show 722 images of the underside of the leaves (abaxial part of the leaves). Bars = 1 cm. (B) The 723 anthocyanin content per gram fresh weight was measured as described in Materials and 724 Methods. Values are the means ±SD of three independent experiments. Different letters 725 indicate significant differences (P < 0.01). 726 727 728 Capítulo II 109 Supplemental Data 729 730 Supplemental Figure S1. Autophagy induced by nitrogen deprivation in Arabidopsis roots. 731 Wild type seedlings expressing the GFP-ATG8a fusion were grown for 7 days on N-rich 732 medium and then transferred to the same medium (+N) or to a N-deficient medium (-N) for 4 733 additional days. The root cells were visualized by confocal fluorescence microscopy. 734 Representative single optical section images of fluorescence, visible and overlaid images are 735 shown. 736 737 Supplemental Figure S2. Representative SDS-PAGE of protein extracts. Wild type seedlings 738 expressing the GFP-ATG8a fusion were grown for 7 days on N-rich medium and then 739 transferred to the same medium (+N), to a N-deficient medium (-N), or to a N-deficient 740 medium containing 200 μM NaHS for 4 additional days. Root (20 mg) and leaf (100 mg) plant 741 materials were ground separately in liquid nitrogen with 100 and 300 μL of extraction buffer, 742 respectively, as described in Materials and Methods, and 10 μL of the final supernatant 743 fractions were electrophoresed in 10 % acrylamide gels and stained with Coomassie Brilliant 744 Blue. 745 746 Supplemental Figure S3. Representative single optical section of fluorescence, visible and 747 overlaid images visualized by confocal microscopy of the root cells corresponding to the 748 experiment described in Figure 5. 749 750 Supplemental Figure S4. Phenotypes of wild type seedlings expressing GFP-ATG8a under 751 different conditions. Representative bright field images of 7-day-old wild-type seedlings 752 grown on N-rich medium and then transferred to a N-deficient medium (-N) or to a N-753 deficient medium containing NaHS or Na2S at 100 or 200 μM for 6 additional days. The lower 754 panels show images of the abaxial part of the leaves. Bars = 1 cm. 755 756 Supplemental Figure S5. Phenotypes of wild type seedlings expressing GFP-ATG8a under 757 different conditions. Representative bright field images of 7-day-old wild-type seedlings 758 grown on N-rich medium and then transferred to a N-deficient medium (-N) or to a N-759 Capítulo II 110 deficient medium containing NaHS or Na2S at 100 or 200 μM for 8 additional days. The lower 760 panels show images of the abaxial part of the leaves. Bars = 1 cm. 761 762 Supplemental Figure S6. Image processing with PDQuest software (Bio-Rad). Two 763 representative fluorescence confocal images were subjected to PDQuest software. The black 764 and white images were automatically generated, and the images with selected spots are shown. 765 766 Supplemental Table S1. Protein concentration of root extracts. Wild type seedlings 767 expressing the GFP-ATG8a fusion were grown for 7 days on N-rich medium and then 768 transferred to the same medium (+N), to a N-deficient medium (-N), or to a N-deficient 769 medium containing 200 μM NaHS for 4 additional days. 20 mg of plant root materials were 770 ground in liquid nitrogen with 100 μL of extraction buffer as described in Materials and 771 Methods. The total amount of protein in the resulting supernatant was determined using a 772 previously described method (Bradford, 1976). Individual experiments and the average data 773 together with the percentages relatives to the +N sample protein concentration in parentheses 774 are shown. 775 776 777 778 Capítulo II 111 779 780 Capítulo II 112 Parsed Citations Alvarez C, Bermudez MA, Romero LC, Gotor C, Garcia I (2012) Cysteine homeostasis plays an essential role in plant immunity. New Phytol 193: 165-177 Pubmed: Author and Title CrossRef: Author and Title Google Scholar: Author Only Title Only Author and Title Alvarez C, Calo L, Romero LC, Garcia I, Gotor C (2010) An O-acetylserine(thiol)lyase homolog with L-cysteine desulfhydrase activity regulates cysteine homeostasis in Arabidopsis. 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Homologues of the yeast ATG genes have been identified in mammals and plants, which indicates the conservation of the core ATG mechanism during evolution. The ATG genes encode proteins required for phagophore initiation, enclosure of the autophagosome, and the fusion of the autophagosome with the vacuole. These ATG proteins include a group of proteins involved in the essential modification of ATG8 and ATG12, that are similar to the ubiquitin-like proteins (Downes and Vierstra, 2005). ATG8 is conjugated to phosphatidylethanolamine (PE) by E1 (ubiquitin-activating enzyme)-like ATG7, E2 (ubiquitinconjugating enzyme)-like ATG3, and E3-like ATG12-ATG5-ATG16 complex. The ATG4 protease is required to remove extra C-terminal residues of ATG8 precursors and thereby expose a conserved glycine residue for conjugation. ATG8-PE is then targeted to the phagophore and is required for the expansion and closure of the autophagic vesicle to form the autophagosome. When overexpression of an atg4 dominant-negative mutant was used to block the lipidation of ATG8 in mammals, it resulted in the accumulation of isolated unclosed membranes with abnormal morphologies (Fujita et al., 2008). In addition to processing the C- terminus of ATG8, ATG4 also functions as a deconjugating enzyme that cleaves the amide bond between ATG8 and PE (Kirisako et al., 2000). This deconjugating activity of ATG4 releases ATG8 from PE in membranes and plays an important role in regulating autophagy by allowing ATG8 recycling (Nair et al., 2012; Nakatogawa et al., 2012; Yu et al., 2012). Using an atg8 mutant that bypassed the initial ATG4-dependent processing, a study of yeast demonstrated that blocking the deconjugation of ATG8-PE resulted in a defect in autophagosome biogenesis (Nair et al., 2012). In addition, ATG4 also acts to compensate for the intrinsic defects in the lipidation system by recycling the ATG8 that is generated on inappropriate membranes to maintain a reservoir of de-lipidated ATG8, which is required for autophagosome formation at the phagophore assembly site (PAS) (Nakatogawa et al., 2012). These data collectively show that ATG4 plays crucial roles in the conjugation and deconjugation of ATG8 and that both functions are indispensable for autophagy; therefore, its activity is expected to be tightly regulated. Thus, after the initial cleavage of ATG8 proteins, Anexo 124 ATG4 can be inactivated to ensure the conjugation of ATG8 proteins to the autophagosomal membrane. Then, ATG4 may be locally reactivated to de-lipidate and recycle the ATG8 proteins when the autophagosome fuses with the lysosome. The precise control of ATG4 activity determines whether autophagy subsequently occurs. The involvement of reactive oxygen species (ROS) in the regulation of autophagy has been shown by several studies performed in different organisms. In mammals, nutrient limitation leads to increased levels of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), which in turn induce autophagy. The cysteine protease HsATG4 has been identified as a direct target of oxidation and inhibition by H 2 O 2 , and a cysteine residue (Cys 81 ) located near the cysteine (Cys 77 ) in the HsATG4 catalytic site was shown to be critical for this regulation. In addition, the inhibition of HsATG4 by H 2 O 2 was reversible. This regulation mainly targets the de-lipidating activity of HsATG4, which suggests that the accumulation of lipidated ATG8 under starvation conditions might result from the inhibition of ATG4 activity during the de-lipidation process (Scherz‐Shouval et al., 2007a). Another study conducted in the model yeast Saccharomyces cerevisiae has reported similar results: ROS can activate autophagy, and ScATG4 is the target of this redox regulation. ScATG4 is regulated by the oxidoreduction of a single disulfide bond between two cysteine residues, Cys 338 and Cys 394 , which is very efficiently reduced by thioredoxin (Trx). In vivo studies indicated that Cys 338 and Cys 394 are required for the proper regulation of autophagosome biogenesis, because mutation of these cysteines resulted in increased recruitment of ATG8 to the PAS (Pérez-Pérez et al., 2014). Two different AtATG4 isoforms are present in Arabidopsis thaliana, and the activity of both AtATG4s is reversibly inhibited in vitro by reactive oxygen species, such as H 2 O 2 . However, the redox regulation of cysteine residues analogous to what has been described in mammals and yeast has not been reported. In addition, it has been concluded that the AtATG4a is the predominant protease and is more active in the processing of the AtATG8 isoforms (Woo et al., 2014). In our previous investigation of the role of hydrogen sulfide (H 2 S) as a negative regulator of autophagy induced by nitrogen starvation in A. thaliana roots, we determined that the mechanism of action of H 2 S was independent of the involvement of ROS such as hydrogen peroxide or superoxide anions (Laureano-Marín et al., 2016). The other possible mechanism of action proposed for H 2 S involves a posttranslational modification (PTM) on cysteine residues of proteins to produce a biological response; this type of PTM is known as S-sulfhydration. Recently, we have demonstrated that S-sulfhydration occurs in Arabidopsis under physiological conditions and that this PTM has a biological significance. For instance, this modification modifies the enzymatic activities of some proteins, such as ascorbate peroxidase (APX), glutamine synthetase (GS) and glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), in a reversible manner (Aroca et al., 2015). Anexo 125 In this study, we sought to determine if the protease AtATG4a is a target of S-sulfhydration in vitro and if this modification regulates the activity of AtATG4a using an enzymatic assay with the C. reinhardtii CrATG8 protein as the substrate. RESULTS AND DISCUSSION AtATG4a is S-sulfhydrated in vitro In a previous study, we reported that the mechanism by which sulfide regulates autophagy in Arabidopsis is independent of its antioxidant properties. Therefore, we want to further determine whether S-sulfhydration, the proposed second mechanism of action of sulfide, is involved in the regulation of autophagy in plants. One of the putative targets of S-sulfhydration could be AtATG4a from A. thaliana, which is the predominant ATG4 protease in this species of plant (Woo et al., 2014) and has 12 cysteine residues in its sequence. For this experiment, the full-length cDNA clone (At2g44140) was expressed in E. coli as an N-terminally 6x His-tagged recombinant protein and purified by affinity chromatography using Ni-NTA resin under hybrid conditions (Figure 1). The eluted fraction that was selected for further analysis showed two main protein bands, the upper and more abundant protein band with an approximate 53 kDa molecular weight corresponds to the recombinant AtATG4a protein, which was confirmed by mass spectrometry analysis and a lower and less abundant band that was co-purified with the main band. Figure 1. Purification of the AtATG4a recombinant protein, as shown by SDS-PAGE. The proteins were separated on a 12% polyacrylamide gel and stained with Coomassie Blue. Lanes 1 and 2, fractions from the uninduced cell cultures and cultures that were induced with L-arabinose for 2.5 h, respectively. Lane 3, fraction eluted from the Ni-NTA agarose column. The molecular weight markers are also shown. M, molecular weight marker. Due to the controversy that has arisen in relation to the specificity of the modified biotin switch method, a new method for detecting the posttranslational modification of proteins by S- Anexo 126 sulfhydration, i.e., the Tag-Switch Assay, has been described (Figure 2A) (Zhang et al., 2014). In the first step of this new method, the blocking reagent methylsulfonyl benzothiazole (MSBT) reacts with both thiol and persulfide groups to form corresponding blocked adducts that exhibit different reactivities. Although the thiol adducts are thiol ethers that do not react with nucleophiles, the persulfide adducts are disulfides that are strongly reactive with certain carbonbased nucleophiles, such as the cyanoacetate-based reagent CN-biotin. Therefore, the persulfide residues are converted to biotin-labeled adducts. These labeled proteins can be then detected by immunoblotting using anti-biotin antibodies. The Tag-Switch Assay was used to determine whether AtATG4a is susceptible to modification by this class of PTM in vitro. His-tagged recombinant GAPDH was used as a positive control for S-sulfhydration, as was previously described in Aroca et al. (2015). In addition, the pretreatment of GAPDH with reduced DTT transforms the persulfide groups into thiols groups and avoids S-sulfhydration and was used as a negative control for the method. When an immunoblot analysis was performed using antibodies against biotin, both the positive control GAPDH and AtATG4a, but not the DTT pretreated-GAPDH, were recognized by the antibodies (Figure 2B). These results clearly show that AtATG4a is sulfhydrated in vitro and suggest that S-sulfhydration could be the mechanism by which sulfide regulates autophagy in plants. Figure 2. A, Schematic representation of the Tag-Switch Assay used to detect posttranslational modification of proteins by S-sulfhydration, where the free thiol and persulfide residues are first blocked with MSBT and then only the blocked persulfides react with CN-biotin to form biotin-labeled proteins. B, Anexo 127 Purified recombinant AtATG4a was subjected to the Tag-Switch Assay (left panel), and purified recombinant GAPDH that had been treated with or without 1 mM DTT was used as a positive and negative control for S-sulfhydrated proteins (right panel), respectively. The anti-histidine western blot is shown as the protein loading control. AtATG4a is able to process CrATG8 To determine whether the modification of AtATG4 by S-sulfhydration could have an effect on its biological activity, we first had to develop an enzyme activity assay. ATG4 processes ATG8 at a conserved glycine residue located at the C-terminus of ATG8 (Kirisako et al., 2000). For the ATG4 activity assays, we employed CrATG8 from C. reinhardtii, as previously described (Pérez-Pérez et al., 2014), instead of using Arabidopsis ATG8 isoforms because Arabidopsis has nine different ATG8 isoforms, and none of them possess more than five amino acid residues behind the glycine (Doelling et al., 2002). In contrast, CrATG8 harbors a 15- amino acid extension after the glycine, allowing the detection and quantification of the unprocessed (ATG8) and processed (pATG8) forms of ATG8 in Coomassie Blue-stained SDSPAGE gels. Purified AtATG4a was found to be active on CrATG8. The activity was determined in a standard ATG4 activity buffer containing the reducing agent DTT (dithiothreitol) at a concentration of 1 or 50 mM, and the processed CrATG8 protein was detected after a 2 or 4 h treatment (Figure 3). The presence of a small concentration of reduced DTT is necessary for ATG4 to adopt the monomeric form (indicated by the white arrowhead in Figure 3), which is required to determine its activity. However, it is not known if the formation of ATG4 oligomers (indicated by the black line in Figure 3) also occurs in vivo or whether it has a regulatory function under certain conditions. Yeast ScATG4 requires a lower concentration of DTT (25 μM) to achieve the monomeric conformation without being activated, as previously described (Pérez-Pérez et al., 2014); however, its Arabidopsis counterpart requires a higher concentration of DTT (100 μM) to leave the aggregated state, as will be described below. This result suggests that the Arabidopsis protein is less susceptible to forming the monomer than its yeast counterpart. The processing of CrATG8 by AtATG4a increases as the concentration of DTT increases and with the time of incubation (Figure 3). Therefore, the Arabidopsis ATG4a protein shows a similar behavior as described for this protein in yeast, because a reducing agent is required to activate the protein (Pérez-Pérez et al., 2014). Anexo 128 Figure 3. AtATG4a is able to process CrATG8. ATG4 activity was monitored by following the cleavage of CrATG8 (5 μM) from the unprocessed (CrATG8) to the processed (pATG8) forms (indicated by the black arrowheads) using SDS-PAGE and Coomassie Blue staining. The purified AtATG4a fraction was incubated with or without 1 mM or 50 mM DTT and the purified CrATG8 protein for 2 or 4 h. The last lane shows a positive control, in which CrATG8 has been processed by CrATG4. AtATG4a does not monomerize in the presence of H 2 S Next, we wanted to test whether the sulfide treatment of AtATG4a could lead to a change in the aggregation state of the protein analogous to the change that occurs in the presence of reduced DTT or thioredoxin, thus promoting the activation of yeast ATG4 (Pérez-Pérez et al., 2014). For this purpose, we incubated the recombinant protein in presence of increasing concentrations of NaSH, a compound that releases H 2 S, without pre-exposing it to DTT and performed the ATG4 activity assay by monitoring CrATG8 cleavage. The results revealed that hydrogen sulfide did not affect the protein aggregation state, at least at the concentrations tested in our assay, and only DTT induced AtATG4a monomerization and activation at a suitable concentration (1 mM) (Figure 4). Anexo 129 Figure 4. AtATG4a does not monomerize in presence of NaSH. ATG4 activity was monitored as in Figure 3. AtATG4a was incubated with or without NaSH in concentrations ranging from 100 μM to 1 mM (lanes 2-6) and the purified CrATG8 protein for 4 h at 25 ° C. Monomerization and activation by 1 mM DTT for 4 h at 25 ° C was used as a positive control (lane 7). Lane 1, AtATG4a alone. Hydrogen sulfide does not activate the monomeric form of AtATG4a Based on previous work on yeast ATG4, which requires pretreatment with a low concentration of DTT (25 μM) to form an inactive ATG4 monomer and higher DTT concentrations to yield significant ATG4 activity (Pérez-Pérez et al, 2014), we hypothesized that sulfide may activate the inactive monomeric AtATG4 based on its reductant properties. Therefore, AtATG4a was pretreated with a low concentration of DTT (100 μM), which could lead to partial monomerization of the protein and thereby facilitate the exposure of the cysteine residues that are capable of being S-sulfhydrated to activate the protein. Then, AtATG4a was incubated with NaSH (100 μM) to test whether this compound activated the protein, and AtATG4 was finally treated with 1 mM DTT to promote full activation. The result showed that H 2 S, at least under our experimental conditions, was unable to activate the monomeric AtATG4a and promote CrATG8 cleavage and that a high concentration of DTT was required to promote cleavage (Figure 5). Anexo 130 Figure 5. NaSH does not activate ATG4. ATG4 activity was monitored as in Figure 3. Purified ATG4 was pretreated with 100 μM DTT for 4 h (lanes 2 to 4) and then treated with 100 μM NaSH for 30 min (lanes 3 and 4), followed by a 30 min incubation with 1 mM DTT (lane 4). Finally, ATG8 processing was analyzed after a 2 h incubation. All the steps were performed at 25 ° C. Untreated AtATG4a was used as a negative control (lane 1). Hydrogen sulfide inhibits the cleavage of CrATG8 by AtATG4a From the results obtained so far, we could infer that the effect of sulfide, and probably the S-sulfhydration of ATG4, do not imply an improvement in the monomeric state of the protein or in the activation of the monomeric form. Starting from a situation in which AtATG4a was in its monomeric and active form, we determined whether NaSH was able to inhibit ATG4 activity to some extent. For this experiment, the AtATG4a protein was pretreated with 1 mM DTT to produce a portion of this protein in the active, monomeric state, which was then incubated with 1 mM NaSH and finally treated with a higher DTT concentration (50 mM) to reverse the possible sulfide inhibition and promote complete activation of AtATG4a. The results showed that NaSH caused a significant inhibition of the ATG4 activity, which was observed as an increase in the accumulation of unprocessed ATG8, and this inhibition could be reversed when the protein was incubated with higher concentrations of DTT (Figure 6). Discusión Discusión 139 Como se ha descrito en apartados anteriores, la importancia de la cisteína en las plantas no sólo se debe a su papel como aminoácido proteinogénico, sino también a su función como precursor de moléculas biológicas esenciales y compuestos de defensa (Romero et al., 2014). En la biosíntesis de cisteína participan las enzimas serina acetiltransferasa (SAT) y O- acetilserina(tiol)liasa (OASTL). Por su parte, el catabolismo de la cisteína depende de la actividad enzimática L-cisteína desulfhidrasa de DES1 que cataliza la desulfuración de L- cisteína para producir sulfuro, amonio y piruvato (Romero et al., 2014) siendo hasta la fecha la única enzima con dicha actividad caracterizada bioquímicamente en plantas. El mantenimiento de la homeostasis de cisteína en el citosol de A. thaliana se produce a través de la acción coordinada de las actividades enzimáticas de OAS-A1 y DES1. La caracterización funcional de la proteína DES1 ha sido llevada a cabo por nuestro grupo de investigación y ha permitido un cambio en la visión que se tenía de esta proteína. Así, DES1 ha pasado de ser considerada una proteína minoritaria dentro de la familia OASTL, a la que se le atribuía una función auxiliar, a convertirse en una enzima esencial que regula la homeostasis de cisteína y modula la generación de sulfuro con fines señalizadores en el citosol de A. thaliana (Gotor et al., 2014; Romero et al., 2014). Conocer la localización tisular y estudiar la regulación de esta enzima puede ayudarnos a entender las bases moleculares de la función de DES1. Este objetivo ha sido abordado en la primera parte de esta Tesis Doctoral donde hemos estudiado la regulación transcripcional del gen DES1. Para llevar a cabo este objetivo, hemos realizado una búsqueda de posibles elementos reguladores dentro de la región promotora de DES1 mediante el empleo de diferentes herramientas disponibles en la web, lo que ha permitido la identificación de diferentes elementos cis que apuntan a una regulación hormonal de su expresión. En una segunda aproximación experimental, hemos analizado la expresión génica de DES1 mediante qRT-PCR en plantas silvestres a lo largo de su desarrollo. Por otra parte, hemos clonado las 3 Kb de la región intergénica comprendida entre DES1 y el gen situado aguas arriba, que contienen el promotor de DES1, y la hemos fusionado con el gen reportero GFP (“Green Fluorescent Protein”) para poder realizar un seguimiento de su expresión mediante microscopía confocal. El análisis espacial y temporal de la expresión de DES1 ha revelado que, a pesar de ser una proteína ubicua, la mayor expresión se registra en las hojas durante las etapas iniciales y finales del desarrollo y en los tejidos reproductivos en las etapas más tardías. A pesar de su ubicuidad, DES1 es una proteína muy poco abundante, lo que ha sido confirmado mediante un análisis proteómico realizado en la planta modelo A. thaliana donde se ha identificado un pequeño número de péptidos pertenecientes a esta proteína (“AtProteome Database”). De igual forma, los niveles de transcrito del gen DES1 son también muy bajos. De hecho, el nivel de expresión del gen DES1 es aproximadamente dos órdenes de magnitud Discusión 140 inferior al que presenta el gen OAS-A1, algo fácil de verificar mediante el empleo de los recursos disponibles en las bases de datos (www.genevestigator.com). Los resultados obtenidos del estudio de la expresión de GFP dirigida por el promotor de DES1 muestran que la expresión de GFP es, sin embargo, relativamente alta. Esta aparente contradicción puede explicarse si se asume que DES1 puede estar regulado a nivel posttranscripcional y/o post-traduccional. Esta hipótesis tiene sentido si se tiene en cuenta la función de esta proteína en la generación de sulfuro implicado en la regulación de distintos procesos fisiológicos como la autofagia (Álvarez et al., 2012b; Gotor et al., 2013; Romero et al., 2013). El sulfuro es una molécula tóxica que en los últimos años ha sido reconocida también como una molécula señal en sistemas animales y vegetales (Gadalla and Snyder, 2010; Wang, 2012; Garcia-Mata and Lamattina, 2013; Lisjak et al., 2013; Calderwood and Kopriva, 2014; Hancock and Whiteman, 2014). La generación de sulfuro en el citosol de A. thaliana debe estar, por tanto, controlada de forma muy precisa con el fin de mantener unos niveles óptimos necesarios para ejercer su función señalizadora y para evitar efectos perjudiciales provocados por el aumento de su concentración por encima del umbral de toxicidad. El análisis del perfil transcripcional de DES1 en diferentes tejidos a lo largo del desarrollo muestra que la máxima expresión de DES1 tiene lugar en las hojas durante las etapas iniciales y finales del desarrollo de la planta y en los tejidos reproductivos (flores y silicuas). Estos resultados apuntan a que DES1 puede desempeñar un papel específico durante esos estadíos del desarrollo. Además, estos datos se ajustan bien con los obtenidos mediante el estudio de mutantes nulos des1, en los que las principales diferencias fenotípicas se observan en esas mismas etapas. Durante las fases más tempranas del desarrollo, los mutantes des1 son más tolerantes a la presencia de cadmio que las plantas silvestres (Álvarez et al., 2010). En estadíos más avanzados, la mutación en el gen DES1 tiene importantes consecuencias en el desarrollo normal de la planta. Así, las plantas mutantes des1 presentan una senescencia prematura de las hojas, una alteración del perfil transcripcional y una inducción de la autofagia (Álvarez et al., 2012b). Por ello, la función de DES1 parece ser crítica en esta última etapa del crecimiento. El análisis de la expresión de GFP dirigida por el promotor de DES1 en los tejidos vegetativos se correlaciona con el patrón de expresión de DES1 observado previamente. En las plántulas, la fluorescencia se extiende homogéneamente por toda la hoja, detectándose señal en el citosol de las células de la epidermis, del mesófilo, así como en el de las células guarda y los tricomas. Sin embargo, un examen más detallado de la hoja muestra unas zonas distribuidas a lo largo del margen foliar que presentan una mayor expresión de GFP. Estas zonas se corresponden con los hidátodos, unas estructuras especializadas similares a poros que actúan como punto de salida de los tejidos vasculares donde el agua y los iones son liberados desde el xilema. También se ha sugerido que los hidátodos están implicados en la reabsorción de los iones procedentes de otros tejidos a través del floema (Nagai et al., 2013). El número de Discusión 141 hidátodos presentes en una hoja aumenta con el tamaño de la misma y coincide espacialmente con zonas que presentan una alta acumulación de auxinas (Teale et al., 2006; Wang et al., 2011). La alta expresión de GFP en los hidátodos junto con la identificación en el promotor de DES1 de elementos de respuesta a auxinas nos llevó a pensar en una posible regulación de DES1 por este tipo de hormona. Para demostrarlo, realizamos la cuantificación del transcrito del gen DES1 en plantas silvestres de Arabidopsis cultivadas en presencia de concentraciones crecientes de la auxina ácido indol acético (IAA) y determinamos que el IAA produce una represión del gen DES1. Sin embargo, estos resultados son contradictorios con el patrón de acumulación de GFP observado en los hidátodos que, por el contrario, apuntaba a una relación directa entre la acumulación de auxinas y la expresión de DES1. Esto puede explicarse teniendo en cuenta la complejidad de los mecanismos que controlan la acción de las auxinas que dependen de una serie de procesos que incluyen la biosíntesis, la conjugación, el catabolismo y el transporte de dicha hormona. Aunque en este trabajo no hemos podido esclarecer la implicación específica de DES1 en este aspecto, lo que sí sugerimos es la existencia de una interacción entre DES1 y la señalización mediada por auxinas. De forma análoga, realizamos la cuantificación del transcrito del gen OAS-A1, y observamos que su expresión, a diferencia de lo que ocurre con DES1, se induce en presencia de IAA. Además, el promotor del gen OAS-A1 también presenta elementos de respuesta a auxinas (Gutiérrez-Alcalá, 2007) lo que parece indicar que existe una interconexión entre estas proteínas relacionadas con el metabolismo del azufre y las auxinas. La relación entre el azufre y las auxinas ha sido demostrada con anterioridad por el análisis transcripcional de plantas sometidas a deficiencia de azufre. Estas plantas presentan inducidos algunos genes implicados en la biosíntesis de auxinas, lo que parece indicar que estas hormonas participan en la respuesta de la planta a la carencia de azufre (Hirai et al., 2003; Nikiforova et al., 2003). Otro estudio ha determinado que algunos de los factores de transcripción que median la respuesta a auxinas participan también en la coordinación de los cambios metabólicos inducidos por la carencia de azufre (Falkenberg et al., 2008). Las auxinas regulan numerosos procesos fisiológicos y de desarrollo en plantas, como la senescencia y la organogénesis radicular. En relación con la regulación de la senescencia, hay líneas de investigación que sugieren que las auxinas provocan un retraso de la senescencia (Lim et al., 2010) mientras que otras respaldan que las auxinas promueven la senescencia (Hou et al., 2013). En cualquier caso, el fenotipo de senescencia prematura así como la inducción de genes sensibles a auxinas como SAUR en el perfil transcripcional de los mutantes des1, sugieren que DES1 está regulada por auxinas (“Gene Expression Omnibus” repositorio GSE32566) (Álvarez et al., 2012b). La interconexión entre el sulfuro y las auxinas en la regulación del desarrollo del sistema radicular ha sido puesta de manifiesto. Algunos autores han demostrado que el sulfuro promueve el desarrollo de raíces adventicias en un proceso regido por las auxinas y en cuya Discusión 142 cascada de señalización participa el NO (Zhang et al., 2009). Otro estudio ha descrito que el tratamiento con auxinas provoca un incremento del transcrito y la actividad de DES1 con el consiguiente aumento del contenido endógeno de H 2 S en plantas de tomate, lo que favorece la formación de raíces laterales. Mediante ensayos farmacológicos han concluido que el H 2 S es un componente de la vía de señalización por auxinas localizado aguas abajo de dicha hormona y cuyo efecto se atribuye a la regulación de la expresión de genes del ciclo celular (Fang et al., 2014). Una investigación muy reciente aborda, en cambio, el estudio del efecto inhibidor del H 2 S en el desarrollo radicular desde un punto de vista molecular. Este trabajo ha demostrado que el H 2 S altera el patrón de respuesta a auxinas, lo que modifica la arquitectura radicular. Este efecto del H 2 S es consecuencia de la inducción de genes ABP (“Actin Binding Proteins”) que desestabilizan los filamentos de actina del citoesqueleto, lo que repercute en el transporte polar de las auxinas en las células del meristemo radicular (Jia et al., 2015). En nuestro laboratorio hemos obtenido resultados similares mediante el estudio de plantas transgénicas de A. thaliana que expresan el promotor sintético de respuesta a auxinas DR5 fusionado con el gen reportero GUS (Ulmasov et al., 1997; Shin et al., 2005). Nuestros datos ponen de manifiesto el efecto inhibidor del sulfuro sobre la distribución y la acumulación de las auxinas en el tejido foliar (resultados no publicados). La identificación de elementos de respuesta a ácido abscísico (ABA) en el promotor de DES1 y la detección de la fluorescencia de GFP en el citoplasma de las células guarda, apuntan a una posible función de la proteína DES1 o del sulfuro en estas células especializadas en las que se sabe que el ABA desempeña un importante papel. El sulfuro ya había sido relacionado con la regulación de procesos como el movimiento estomático (Garcia-Mata and Lamattina, 2010; Lisjak et al., 2010) y recientemente se ha demostrado la implicación del sulfuro generado por DES1 en el cierre estomático dependiente de ABA (Scuffi et al., 2014). En este trabajo las plantas silvestres cierran los estomas en respuesta a la aplicación exógena de ABA, en cambio, los mutantes des1 no responden al estímulo por ABA y no cierran sus estomas. Esta falta de respuesta a ABA en los mutantes es restaurada por complementación genética o por la adición de sulfuro. Además, existe una regulación transcripcional de DES1, específicamente en las células guarda, lo que demuestra de forma inequívoca la conexión entre ABA y DES1 (Scuffi et al., 2014). También se sabe que el ABA media la regulación de OAS-A1 en respuesta al estrés salino (Barroso et al., 1999). El promotor de DES1 confiere también una fuerte expresión de GFP dentro de los tricomas, y este resultado apoya numerosos estudios que han demostrado la importancia del metabolismo del azufre en este tipo de células. Mediante la realización de ensayos de hibridación in situ junto con la determinación del contenido en glutatión por microscopía confocal, se demostró que la biosíntesis de glutatión es muy activa en los tricomas de Arabidopsis (Gotor et al., 1997; Gutierrez-Alcala et al., 2000). Además, en el perfil proteico realizado en este tipo específico de Discusión 143 célula también se identificó un importante número de proteínas implicadas en el metabolismo del azufre (Wienkoop et al., 2004). Esta expresión en los tricomas dirigido por el promotor de DES1 es similar a la expresión dirigida por el promotor de la OAS-A1 (Gutierrez-Alcala et al., 2005). Estos hallazgos sugieren que, en los tricomas, la homeostasis de la cisteína es importante y es modulada de forma coordinada por la acción de las enzimas OAS-A1 y DES1. Aparte de los elementos en cis identificados en el promotor de DES1 relacionados con la regulación por auxinas o ABA, han sido localizados otros elementos que se correlacionan con la respuesta a diferentes estreses y procesos relacionados con el desarrollo. Estos incluyen elementos de respuesta a sequía (DRE-like), elementos de respuesta a cambios en la osmolaridad celular (ATB2), y varias secuencias relacionadas con la respuesta a estrés biótico y estrés lumínico (MYB4) (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994; Chen et al., 2002; Satoh et al., 2004). El promotor de DES1 también contiene numerosos elementos de respuesta a luz (LRE), así como elementos reguladores implicados en floración (LFY), y varios motivos RAV1, implicados en la maduración y la senescencia de la hoja (Terzaghi and Cashmore, 1995; Woo et al., 2010; Siriwardana and Lamb, 2012). La presencia de los elementos RAV1 en el promotor de DES1 apoya tanto el fenotipo como los datos transcriptómicos de los mutantes des1, que sugieren que esta proteína juega un importante papel en las plantas maduras. En los tejidos reproductivos, la expresión de GFP conferida por el promotor de DES1 es detectada en las flores abiertas, principalmente en el pistilo, los sépalos, y los pétalos, a diferencia de los estambres, donde la señal GFP es más baja. La presencia del transcrito de OAS-A1 también fue demostrada en las flores de A. thaliana en una investigación previa llevada a cabo por nuestro grupo mediante la técnica de hibridación in situ (Gotor et al., 1997). Las zonas de abscisión presentes en las bases de las silicuas y en las semillas presentan una fuerte fluorescencia de GFP. La abscisión es un proceso regulado por hormonas como el etileno, el ácido jasmónico (JA) y el ABA. Las auxinas también participan en muchos eventos de abscisión (Basu et al., 2013). En conclusión, el patrón de expresión tisular de GFP conferido por el promotor de DES1 apoya la regulación hormonal de DES1 y la existencia de una red de interconexión entre diferentes hormonas y la molécula de sulfuro actuando como molécula señalizadora. En la segunda parte de esta Tesis Doctoral hemos abordado el efecto regulador del sulfuro en la autofagia. Hemos aportado nuevos datos experimentales que, junto a los previamente obtenidos en nuestro laboratorio, demuestran el papel del sulfuro en la regulación de la progresión de la autofagia, independientemente de la condición que la origine. Nuestros resultados contribuyen a comprender el mecanismo mediante el cual el sulfuro actúa regulando este proceso en plantas, al confirmar que su función no depende de su capacidad antioxidante. Como se ha mencionado anteriormente, el papel del sulfuro en sistemas animales y vegetales ha cambiado drásticamente en los últimos años. Actualmente, el sulfuro no es solo Discusión 144 considerado una molécula tóxica para la vida, sino que también se ha establecido como un regulador de procesos biológicos esenciales. En mamíferos, el sulfuro se considera un nuevo gasotransmisor con diferentes funciones fisiológicas (Gadalla and Snyder, 2010). La alteración del metabolismo del sulfuro tiene importantes consecuencias patológicas, lo que pone de manifiesto la relevancia clínica de esta molécula (Łowicka and Bełtowski, 2006; Szabó, 2007; Wang, 2012). En plantas, el sulfuro posee un efecto protector frente a una amplia variedad de estreses (Zhang et al., 2008; Wang et al., 2010; Zhang et al., 2010; Jin et al., 2011; Dawood et al., 2012; Li et al., 2012a; Li et al., 2012b; Cheng et al., 2013; Sun et al., 2013). Además, regula procesos cruciales para el desarrollo de las plantas, como la fotosíntesis (Chen et al., 2011), el movimiento estomático (Garcia-Mata and Lamattina, 2010; Lisjak et al., 2010; Scuffi et al., 2014) y la autofagia (Álvarez et al., 2012b; Gotor et al., 2013; Laureano-Marín et al., 2016). La autofagia es un proceso constitutivo y las células vegetales, como ocurre en otros organismos, presentan unos niveles de autofagia basales en condiciones fisiológicas (Slavikova et al., 2005). Sin embargo, cuando las plantas se exponen a condiciones ambientales desfavorables, una de las respuestas para contrarrestar el estrés y poder sobrevivir es inducir la autofagia. La carencia de macronutrientes como el carbono o el nitrógeno es un ejemplo de estrés que comúnmente induce la autofagia en plantas, lo que suele ir acompañado de un incremento de los niveles de la proteína ATG8 (Doelling et al., 2002; Hanaoka et al., 2002; Xiong et al., 2005; Thompson et al., 2005b; Chung et al., 2009; Guiboileau et al., 2013). Esto coincide con los resultados obtenidos en nuestro estudio en el que hemos observado unos niveles basales de autofagia en raíces de plántulas de Arabidopsis que expresan la proteína de fusión GFP-ATG8a en condiciones de aporte suficiente de nitrógeno. Sin embargo, cuando las plántulas son transferidas a medios de cultivo en ausencia de nitrógeno, observamos una inducción de la autofagia. La autofagia se ha estudiado utilizando dos aproximaciones experimentales. Por un lado, mediante la detección de la fluorescencia de GFP asociada con los cuerpos autofágicos por microscopía confocal, con la posterior cuantificación de las vesículas marcadas; y por otro, mediante la inmuno-detección de los niveles de las distintas formas tanto de la proteína de fusión GFP-ATG8a como de la proteína ATG8 endógena en su forma libre y en su versión lipidada (ATG8-PE). La presencia de sulfuro durante el estrés nutricional evita la inducción de la autofagia, y mantiene unos niveles de autofagia similares a los que exhiben las raíces de plántulas cultivadas en un medio con suficiente nitrógeno. Además, hemos determinado la acumulación de la proteína GFP libre que se libera de la proteína de fusión cuando el cuerpo autofágico se transporta a la vacuola y que se correlaciona con el flujo autofágico, constituyendo otro marcador del proceso autofágico (Chung et al., 2010; Suttangkakul et al., 2011; Li et al., 2014) . De esta forma observamos que la acumulación de GFP libre disminuye en presencia de sulfuro en el medio deficiente en nitrógeno y por tanto se demuestra una vez más una represión del flujo autofágico por esta molécula. El efecto del Discusión 145 sulfuro sobre la inducción de la autofagia no está relacionado con su disponibilidad como nutriente, ya que el medio de cultivo presenta una concentración suficiente de azufre en forma de sulfatos. La presencia de amonio a esa misma concentración tampoco afecta a la inducción de la autofagia. También, este efecto sobre la autofagia es específico de la molécula de sulfuro (tanto Na 2 S como NaHS) ya que otros compuestos azufrados como sulfato o sulfito son incapaces de revertir la acumulación de los cuerpos autofágicos que se produce en condiciones de estrés nutricional de nitrógeno. El impacto del sulfuro en la autofagia ya se había descrito previamente por nuestro grupo de investigación. Sin embargo, los efectos de esta molécula azufrada habían sido estudiados empleando un tejido diferente (hojas), de plantas en un estadio de desarrollo más avanzado (plantas maduras), donde la autofagia había sido inducida por una condición de estrés distinta (limitación de carbono) e incluso en un fondo genético diferente (mutante des1) (Álvarez et al., 2012b). Todos estos datos indican que la regulación de la autofagia por el sulfuro en sistemas vegetales es independiente del estadío de desarrollo, tejido y condición de estrés (al menos, el estrés nutricional), y que la regulación es a través de su acción represora. En mamíferos, el efecto del sulfuro en la autofagia no está claro, y existen estudios que han descrito un efecto supresor mientras que otros han demostrado lo contrario (Wang et al., 2012; Kundu et al., 2014). Recientemente, se ha puesto de manifiesto que los aminoácidos azufrados cisteína y metionina regulan la traducción proteica e inhiben la autofagia (Laxman et al., 2013; Sutter et al., 2013). En este último trabajo, la importancia es atribuida a la metionina que actúa como precursor del donador del grupo metilo, S-adenosil-metionina, el cual ha demostrado inhibir la autofagia mediante la acción de enzimas metiltransferasas, aunque la cisteína también ha demostrado suprimir la autofagia. Descifrar el mecanismo que transforma la señal del sulfuro en una respuesta biológica e identificar sus dianas moleculares sigue siendo un reto. Estudios previos han demostrado que el sulfuro puede generar persulfuros de cisteína y glutatión que poseen propiedades antioxidantes superiores a la que presenta el glutatión. Los grupos persulfuros actúan como agentes reductores capaces de reaccionar rápidamente con moléculas electrófilas como el H 2 O 2 (Francoleon et al., 2011; Ida et al., 2014). La relación existente entre la autofagia y las especies reactivas del oxígeno (ROS) se ha demostrado en estudios llevados a cabo en organismos fotosintéticos, donde se ha visto que la inducción de la autofagia se correlaciona con un aumento en la generación de ROS producida como consecuencia de algún estrés (Pérez-Pérez et al., 2012b). Nuestro objetivo era determinar si el mecanismo por el que el sulfuro reprime la autofagia está relacionado con la eliminación de ROS, como el H 2 O 2 y el radical superóxido. Nuestros resultados muestran que el sulfuro es incapaz de eliminar las ROS generadas por la limitación de nitrógeno, lo que sí ocurre en presencia de glutatión reducido y ascorbato. Sin embargo, el tratamiento con estos compuestos antioxidantes no disminuyen los niveles de autofagia, a pesar Discusión 146 de su capacidad reductora. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el efecto del sulfuro en el progreso de la autofagia es independiente de su capacidad de reaccionar con el H 2 O 2 o con el anión superóxido. El segundo mecanismo propuesto para explicar el efecto fisiológico del sulfuro en sistemas animales es la modificación post-traduccional de proteínas conocida como S-sulfhidratación (Paul and Snyder, 2012). Esta modificación puede ser regulada por competición entre la nitrosilación y la sulfhidratación de los mismos residuos de cisteína. La S-sulfhidratación transforma un grupo –SH en un –SSH, modificando la reactividad química y posiblemente el acceso de las enzimas a sus respectivas dianas, como se ha demostrado para la proteína gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Gadalla and Snyder, 2010; Kabil and Banerjee, 2010; Paul and Snyder, 2012). Nuestro grupo ha demostrado recientemente que la S-sulfhidratación de las proteínas también tiene lugar en plantas de Arabidopsis cultivadas en ausencia de estrés, y se ha determinado por primera vez la presencia de un residuo de cisteína sulfhidratado en una proteína vegetal (Aroca et al., 2015). De estos resultados surgen dos cuestiones: si la S- sulfhidratación tiene un efecto regulador sobre la autofagia, y cuáles son las dianas implicadas en autofagia reguladas por el sulfuro. Para responder a estas cuestiones, hemos profundizado en el estudio del mecanismo de acción del sulfuro y de sus posibles dianas moleculares en la regulación de la autofagia, como continuación del capítulo anterior. Nuestros resultados demuestran que una de las dos isoformas ATG4 presente en A. thaliana se S-sulfhidrata y que el sulfuro inhibe su actividad proteolítica. El efecto represor del sulfuro en la autofagia que observamos in vivo podría producirse, por tanto, a través de este mecanismo. Es la primera vez que se describe este tipo de modificación post-traduccional en una proteína ATG. Basándonos en los resultados descritos que indican que el efecto represor del sulfuro en la autofagia no depende de la eliminación de las ROS generadas por la carencia de nitrógeno y, teniendo en cuenta que el segundo mecanismo propuesto de regulación es mediante la modificación post-traduccional de proteínas por S-sulfhidratación, nuestro objetivo ha sido determinar si el sulfuro modifica de esta forma a alguna proteína implicada en autofagia. Son varias las proteínas que participan en este proceso que contienen cisteínas reactivas en sus secuencias susceptibles de sufrir S-sulfhidratación. El estado redox de los tioles puede influir sustancialmente en la autofagia, especialmente durante las etapas iniciales y finales de la formación de los autofagosomas, debido a la capacidad de algunas proteínas ATG de percibir alteraciones de las condiciones redox de la célula a través de dichos residuos de cisteína reactivos (Filomeni et al., 2010). Los sistemas análogos a los de ubiquitina, ATG7-ATG10 y ATG7-ATG3, que participan en la elongación de la membrana y cuya función depende de un residuo de cisteína (Filomeni et al., 2010), son algunos de los ejemplos de proteínas ATG que podrían ser dianas de la S-sulfhidratación. Sin embargo, la única proteína ATG para la que se ha