Papel del fotoperiodo en la floración y senescencia floral de Petunia hybrida

Índice 1. RESUMEN ............................................................................................................... 1 2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1 2.1 Floración ............................................................................................................ 2 2.2 Control fotoperiódico de la floración ................................................................. 3 2.3 Senescencia floral .............................................................................................. 5 2.4 Senescencia floral y fotoperiodo ........................................................................ 5 3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 6 4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 7 4.1 Material vegetal, condiciones de cultivo y técnicas de manipulación .............. 7 4.1.1 Organismos y condiciones de cultivo............................................................. 7 4.1.2 Análisis del tiempo de floración..................................................................... 7 4.1.3 Análisis de la senescencia y abscisión de las flores ....................................... 7 4.2 Métodos de análisis y manipulación del DNA .................................................. 8 4.2.1 Plásmidos utilizados ....................................................................................... 8 4.2.2 Clonación de fragmentos de DNA mediante el sistema Gateway ................. 8 4.2.3 Transformación de E. coli mediante choque térmico ..................................... 9 4.2.4 Inóculo de colonias bacterianas y aislamiento de plásmidos de E. coli ....... 10 4.2.5 Amplificación de fragmentos de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ..................................................................................................... 10 4.2.6 Restricción del DNA .................................................................................... 12 4.2.7 Secuenciación del DNA ............................................................................... 12 4.3 Métodos de manipulación y análisis de RNA .................................................. 12 4.3.1 Aislamiento de RNA total y estimación de la concentración ....................... 12 4.3.2 Reacción de transcriptasa inversa seguida de amplificación de cDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR semicuantitativa) ....... 13 4.3.3 Electroforesis de DNA en geles de agarosa y cuantificación por análisis de imagen ...................................................................................................................... 14 4.4 Preparación y análisis de proteínas .................................................................. 14 4.4.1 Aislamiento de proteína total ....................................................................... 14 4.4.2 Cuantificación de proteína total por el método Bradford ............................. 15 4.4.3 Electroforesis analítica en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes ...................................................................................................... 15 4.4.4 Métodos inmunológicos e inmunocitoquímicos .......................................... 16 4.5 Análisis estadísticos ......................................................................................... 17 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 17 5.1 Identificación y caracterización del gen ortólogo de CONSTANS (CO) en P. hybrida ........................................................................................................................ 17 5.1.1 Identificación del gen ortólogo de CO en P. hybrida (PhCO) mediante análisis filogenético .............................................................................................................. 17 5.1.2 Análisis del patrón de expresión PhCO (RNA y proteína) en pétalos durante LD…… .................................................................................................................... 18 5.2. Clonaje de PhCO en un vector de expresión de A. thaliana ............................ 20 5.3 Comparación del cultivo de P. hybrida en condiciones LD y SD ................... 23 5.3.1 Análisis de la expresión de PhCO en pétalos de P. hybrida cultivada en LD y SD…... ..................................................................................................................... 23 5.3.2 Medida del tiempo de floración de P. hybrida LD y SD ............................. 25 5.3.3 Medida de la senescencia floral de P. hybrida LD ...................................... 26 6. CONCLUSIONES ................................................................................................. 27 7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 28 1 1. RESUMEN El tiempo de floración es un proceso fundamental en el desarrollo de las plantas. En Arabidopsis thaliana (A. thaliana), la duración del día (fotoperiodo) presenta un papel crucial en la transición floral, y en concreto, el gen CONSTANS (CO) tiene una función central estrechamente regulada a nivel transcripcional y postraduccional. El objetivo de este trabajo es aplicar los resultados observados en A. thaliana sobre el papel de CO en la floración y senescencia floral a la planta modelo ornamental, Petunia hybrida (P. hybrida). Se llevó a cabo la identificación de un gen ortólogo a CO en P. hybrida, PhCO, y la caracterización del mismo, analizando su expresión génica y niveles proteicos durante 24h. El patrón de expresión de PhCO sugiere que éste está sometido a una regulación circadiana similar a la de CO. La clonación de PhCO en los vectores de expresión pMDC32 y pMDC43 y la posterior transformación de ambas construcciones en A. thaliana co-10, nos permitirá realizar un análisis de la floración y senescencia floral y comprobar si PhCO es realmente el gen ortólogo de CO. La expresión génica y niveles de proteína de PhCO también varían en función del fotoperiodo, con una mayor expresión en condiciones de día largo. Además, P. hybrida presenta una floración acelerada en condiciones de día largo con respecto a condiciones de día corto. Estos hechos sugieren, como sucede en A. thaliana, una inducción fotoperiódica de la floración por PhCO en P. hybrida. Palabras clave: Petunia hybrida, PhCO, CONSTANS, fotoperiodo, floración, senescencia floral. 2. INTRODUCCIÓN Las plantas necesitan coordinar su fisiología, y por ende su reproducción, con la información del ambiente que las rodea. Los ritmos biológicos permiten a las plantas anticiparse y coordinar eventos biológicos internos con ciertas condiciones exteriores cambiantes como pueden ser la longitud del día (fotoperiodo) y la temperatura (como en el caso de la vernalización). Los ritmos biológicos de mayor trascendencia para las plantas son los que ocurren con periodos cercanos a un día o ritmos circadianos (Capel et al., 2003; Ng Chee Ping, 2013). Éstos controlan varios procesos importantes en el desarrollo 2 de las plantas, incluida la fase de transición del crecimiento vegetativo al reproductivo, conocida como floración (Serrano et al., 2009). 2.1 Floración La floración tiene un papel fundamental en el ciclo de vida de las plantas angiospermas. Este proceso es también crucial en la industria ornamental porque determina la calidad después de la cosecha, el rendimiento de los cultivos y la adaptación de las plantas ornamentales (Valverde, 2011). En las plantas superiores, el momento de la transición floral es una decisión muy importante y se controla a través de señales internas y externas que interactúan para determinar el éxito reproductivo (Preston et al., 2014a). Las principales señales internas son la edad y estado de desarrollo y las señales externas o insumos ambientales son la duración del día (fotoperiodo), la calidad de la luz y la temperatura (He et al., 2020). Esta complejidad está mediada por varias vías genéticas que controlan la respuesta a diferentes señales ambientales. Una de estas vías, denominada vía del fotoperiodo, controla la promoción de la floración según la duración del día (Onouchi et al., 2000; Weller & Macknight, 2019; Yanovsky & Kay, 2001). De hecho, las plantas se han clasificado según su comportamiento de floración fotoperiódica. Se consideran plantas de día largo (Long day – LD) a aquellas que florecen preferentemente en días con 16h de luz y 8h de oscuridad, y plantas de día corto (Short day – SD), a aquellas en las que la floración se induce en días con 8h de luz y 16h de oscuridad (Golembeski et al., 2014; Valverde, 2011). La planta modelo, Arabidopsis thaliana (A. thaliana) florece rápidamente en condiciones de día largo, y por el contrario, se ralentiza durante días cortos (Onouchi et al., 2000). Similar es el caso de la planta modelo ornamental, Petunia hybrida (P. hybrida), considerada planta de día largo (Preston et al., 2014). Los genes de A. thaliana que afectan el tiempo de floración han sido identificados y colocados en diferentes rutas genéticas. En la vía fotoperiódica destacan el gen CONSTANS (CO) y el llamado florígeno o FLOWERING LOCUS T (FT) (Simpson et al., 1999; Suárez-López et al., 2001). CO promueve directamente la expresión de FT para inducir la floración en condiciones de LD. (He et al., 2020). 3 Figura 1. Control de la transición floral. Vías externas e internas de la regulación del proceso de floración. La flecha discontinua representa la transición del crecimiento vegetativo al reproductivo. 2.2 Control fotoperiódico de la floración Como comentamos en el apartado anterior, en A. thaliana, CO constituye un gen central en el control de la floración por fotoperiodo (Valverde et al., 2004). La regulación de CO es compleja y se produce, tanto a nivel de expresión génica como a nivel de proteína, lo que refleja la importancia que tienen que la planta elija el momento exacto del año en el que se debe liberar la señal del florígeno para un resultado reproductivo correcto (Valverde, 2011). La expresión del mRNA de CO está regulada por el ritmo circadiano y el fotoperiodo, mientras que la estabilidad de la proteína está controlada por fotorreceptores, E3 ubiquitin ligasas y por interacción con otras proteínas (Valverde et al., 2004). Esta regulación garantiza que la floración se produzca en condiciones óptimas (Ng Chee Ping, 2013). En condiciones de LD, la interacción entre la proteína GIGANTEA (GI) y la ubiquitina ligasa FLAVIN KELCH BOX1 (FKF1) produce la activación de la transcripción del mRNA de CO al inducir la degradación de los represores transcripcionales conocidos como CYCLING DOF FACTOR (CDF). Por lo tanto, al final de día largo (ZT12, ZT16) se observa un pico de expresión de mRNA de CO (Fig. 2A) (Andrés & Coupland, 2012). Además, CO también está sujeto a regulación postraduccional, que hace que se estabilice al final de un LD cuando la abundancia de mRNA de CO alcanza su punto máximo (Valverde et al., 2004). Durante periodos de oscuridad la proteína CO es ubiquitinilada por un complejo de ubiquitina ligasa que incluye CONSTITUTIVE 4 PHOTOMORPHOGENESIS 1 (COP1) y SUPPRESOR OF PHYTOCHROME A (SPA1), lo que permite su degradación por el proteasoma (Fig. 2A). Por el contrario, en SD no se produce la degradación de los represores transcripcionales de CO, y pueden reprimir la transcripción de CO. En estas condiciones, el mRNA de CO solo alcanza su punto máximo en la oscuridad y la proteína CO se degrada a través de la actividad de la ubiquitina ligasa COP1-SPA1, como se describió anteriormente (Fig. 2B) (Andrés & Coupland, 2012), por lo que no se produce la expresión de FT y la floración se retrasa. CO estable y activa desencadena la expresión de FT, que se mueve desde el floema hasta el meristemo apical (SAM) y activa el programa de transición floral (Andrés & Coupland, 2012). Este modelo conocido como modelo de la «coincidencia externa» basado en CO es el más aceptado para explicar la inducción de la floración por fotoperiodo (Bases Moleculares de La floración, 2011). Figura 2. Regulación transcripcional y postraduccional de CONSTANS como control de inicio de la floración en A. thaliana. (A) Al final del día largo se produce un pico de expresión de mRNA de CO debido a la inhibición de los genes CDFs que ejerce el complejo GI-FKF1. Al comienzo del día, PHYB y HOS1 mantienen bajos los niveles de proteína CO, mientras que PHYA participa en su estabilización inhibiendo al complejo CRY2-COP1-SPA1, a final del periodo de luz. Dicha estabilización permite la expresión de FT, señal que desencadena la floración. (B) Durante el día corto, los CDFs inhiben la transcripción de CO. El receptor PHYB activo junto con las ubiquitinas ligasas HOS1 y COP1-SPA1 inducen la degradación de CO, de manera que no se expresa FT y la floración no se produce (Andrés & Coupland, 2012). 5 2.3 Senescencia floral La senescencia es un fenómeno natural que implica una disminución gradual de las células y los tejidos funcionales (Serrano-Bueno et al., 2021). Aunque depende esencialmente de la edad, la senescencia ocurre cuando múltiples señales internas y externas se integran en la información relacionada con la edad a través de diferentes vías regulatorias (Majeed et al., 2020; Serrano-Bueno et al., 2021). La senescencia de la flor es la fase terminal de su desarrollo e incluye la marchitez de las flores, la decoloración de las flores y el desprendimiento de las estructuras florales (Tripathi & Tuteja, 2007). Durante la senescencia floral, tiene lugar una transición del desarrollo que provoca un cambio del anabolismo al catabolismo de biomoléculas, promoviendo la descomposición y removilización controlada de los constituyentes celulares. Además, en la senescencia de la flor se producen cambios como pérdida de organización celular, aumento en la permeabilidad de la membrana, degradación de orgánulos y generación de especies reactivas de oxígeno (Shahri & Tahir, 2011; Tripathi & Tuteja, 2007). Esto viene acompañado de un incremento de unos genes conocidos como SENESCENCE-ASSOCIATED GENES (SAGs), efecto considerado como marca de senescencia. Los SAGs están involucrados en varios aspectos de la senescencia, incluyendo el inicio del proceso, inducción de proteasas y nucleasas, modificación de la pared celular e inducción de enzimas oxidativas (Tripathi & Tuteja, 2007). 2.4 Senescencia floral y fotoperiodo Datos recientes obtenidos en el laboratorio han demostrado una relación directa entre senescencia floral y expresión de CO en A. thaliana. Como se muestra en la Fig. 3A, la senescencia floral está acelerada en el sobreexpresor de CO, 35S:CO, mientras que se encuentra retrasada en el caso del mutante co-10 respecto al WT. Además, estos fenotipos van acompañados de un incremento en la expresión de los genes asociados a senescencia, SAG13 y SAG29, en flores 35S:CO, y una disminución significativa en el caso del mutante co-10 (Serrano-bueno et al., n.d.). 6 Figura 3. CONSTANS promueve la senescencia y abscisión de la flor. (A) Senescencia floral y abscisión de fenotipos de plantas WT, 35S:CO y co-10. La posición y el número de flores para los fenotipos Senescencia (S) y Abscisión (A) están marcados con flechas blancas. (B) Análisis por RT-qPCR de SAG13 (gris claro) y SAG29 (gris oscuro) en flores WT, 35S:CO y co-10, etapa 14, LD, ZT16. Se utilizó ACT2 como control. Las barras de error indican la desviación estándar (s.d.) de tres experimentos independientes (Serrano-bueno et al., n.d.). Además de estos datos, existen varios trabajos que sugieren una relación entre senescencia y fotoperiodo. En este sentido, un estudio en 2016 refiere que la expresión del marcador de senescencia SENESCENCE 4 (SEN4) en hojas de A. thaliana aumenta en plantas cultivadas en condiciones de día largo, sugiriendo una potencial dependencia del fotoperiodo en el proceso de senescencia (Kim et al., 2016). Otra posible conexión entre CO y senescencia está mediada por los factores de transcripción básico FLOWERING BHLHs (FBHs). En A. thaliana, la sobreexpresión de FBH4 promovió un alto aumento en los niveles de CO y condujo a un fenotipo de floración temprana, mientras que la expresión de CO se redujo en el mutante fbh1-4 (Ito et al., 2012). En cuanto a la senescencia de P. hybrida, (Yin et al., 2015) observaron que en flores, los niveles de PhFBH4 aumentaban drásticamente durante la senescencia de la flor, lo que indica una posible conexión con la señalización fotoperiódica. Esto sugiere que, si FHB4 aumenta los niveles de CO, y durante la senescencia aumentan los niveles de FBH4, entonces CO también aumenta durante la senescencia. 3. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo es aplicar los resultados observados en A. thaliana sobre el papel de CO en la floración y senescencia floral a la planta modelo ornamental, Petunia hybrida. Para ello se llevan a cabo los siguientes objetivos específicos: 1. Identificación y caracterización del gen ortólogo de CONSTANS (CO) en P. hybrida. A B 13 M, se dejó 10 min en hielo y se volvió a centrifugar en frío (15000 rpm, 10 min). El precipitado se lavó con 500 µL de EtOH 85% (v/v) y se centrifugó (15000 rpm, 10 min, 4 ºC). Por último, se resuspendío el precipitado en 22 µL de H2O de alta pureza. Por último, se cuantificó el RNA en nanodrop utilizando 2 µL de cada muestra. 4.3.2 Reacción de transcriptasa inversa seguida de amplificación de cDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR semicuantitativa) Para las reacciones de RT-PCR semicuantitativa, se obtuvo cDNA a partir de RNA total. Para ello se usó el juego de reactivos “Hiscript III 1 st Strand cDNA Synthesis (+ gDNA wiper)” (Vazyme). En primer lugar, se añadió el volumen correspondiente de cada muestra de RNA (para 500 ng) según las concentraciones obtenidas en el paso anterior y hasta 4 µL de agua libre de RNasas. A esta mezcla se le añadió 1 µL de 5x gDNA wiper Mix y se incubó a 42 ºC durante 2 min. Posteriormente, se añadió a cada muestra 5 µL de un stock que contenía la enzima retrotranscriptasa, buffer 10x RT Mix, primers oligo (dT)20 VN (tabla 2), random hexamers y agua libre de RNasas. Se incubó durante 37 ºC durante 15 min según las especificaciones del fabricante y la enzima se inactivó incubando la mezcla a 85 ºC durante 2 s. Por último, se diluyó la preparación añadiendo 10 µL de agua libre de RNasas. Las reacciones de RT-PCR semicuantitativa permitieron cuantificar la expresión del gen PhCO de P. hybrida. Utilizamos como gen constitutivo el gen de actina (PhACT), que mantenía unos niveles de expresión constante. Todas las amplificaciones se llevaron a cabo en un aparato T100TM Thermal Cycler de Bio-Rad. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 µL que contenía 5 µL de tampón 5x MyTaq DNA polymerase (Bioline), 1 µL de cada cebador a concentración 10 µM, 1 µL de Taq polimerasa, 1 µL de cDNA de la reacción de transcripción reversa anterior, y agua Mili-Q hasta completar los 25 µL. Una vez desnaturalizado el DNA (95 ºC, 3 min), se sometieron las muestras a 35 ciclos sucesivos con los siguientes pasos: desnaturalización del DNA molde (95 ºC, 30 s), hibridación de los cebadores con el DNA (55 ºC, 30 s) y elongación (72 ºC, 30 s). Por último, se incubó a 72 ºC durante 5 min. 14 4.3.3 Electroforesis de DNA en geles de agarosa y cuantificación por análisis de imagen El resultado de las reacciones de PCR se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1-1,5 % (p/v) en tampón TBE (Tris-ácido bórico 45 mM pH 8, EDTA 2 mM). Como agente intercalante se utilizó SYBR® Safe DNA Gel Stain (Thermo Fisher Scientific) a concentración final de 1 μg/ml en el gel. Las electroforesis se llevaron a cabo en cubetas horizontales y se aplicó una diferencia de potencial entre 100-120 V. Se cargaron las muestras de PCR, además del marcador de peso molecular, en este caso HyperLadder™ 50bp. Antes de cargar las muestras, se añadió en la cubeta tampón TBE cubriendo todo el gel. Esto permite que la conductancia eléctrica vaya desde el polo negativo al positivo, y posibilita la separación y detección del fragmento de DNA que habíamos amplificado. La visualización de los geles se llevó a cabo con un transiluminador de luz UV acoplado a una cámara fotográfica. La cuantificación de la intensidad de bandas en geles de agarosa permitió estimar la cantidad de material genético. Como comentamos anteriormente, se realiza en comparación con el gen actina. El análisis de imagen se realizó con Image Lab y los resultados fueron analizados en gráficas hechas mediante Microsoft Excel. 4.4 Preparación y análisis de proteínas 4.4.1 Aislamiento de proteína total Para el aislamiento de proteína total se realizó también la extracción con Trizol con algunas modificaciones con respecto a la extracción de RNA. A lo que quedó en el microtubo original después de añadir el sobrenadante en tubos nuevos para la extracción de RNA, se añadieron 300 µL de EtOH 100 % (v/v). A continuación, las muestras se centrifugaron (2000 g, 10 min, 4 ºC) y el sobrenadante se pasó a un tubo de 2 mL. Se añadió 1 ml de isopropanol 100% (v/v) para que las proteínas precipitaran y se dejó 10 min a temperatura ambiente. Se volvió a centrifugar (12000 g, 10 min, 4 ºC), y el precipitado se resuspendió en 1,5 mL de guanidina 0,3 M en 95 % (v/v) EtOH. Las muestras se volvieron a poner en el molino de bolas 2 min a 300 s-1, se pasó el líquido a un tubo nuevo de 2 mL y se centrifugó (8000 g, 5 min, 4 ºC). El sobrenadante se tiró y se repitió el mismo lavado dos veces. 15 Una vez lavado, el precipitado se resuspendió en 1,5 mL de EtOH 90% (v/v) y se colocó en el molino de bolas 2 min a 300 s-1. Se pasó el líquido a un tubo nuevo de 2 mL, y se centrifugó (8000 g, 5 min, 4 ºC). Este lavado también se realizó por duplicado (en el último paso de la segunda repetición, la centrifugación fue a velocidad máxima y durante 10 min). El pellet se dejó secar unos minutos debajo del extractor y se resuspendió en 50100 µL del componente E del tampón EZ (Martínez-García et al., 1999). A continuación, las muestras se sometieron a sonicación a 4 ºC en un aparato Bioruptor® Pico sonication device siguiendo un programa de 10 min que consistió en 10 ciclos 30 s ON, 30 s OFF. Por último, para la correcta resuspensión del precipitado, se colocaron las muestras en un termobloque a 50 ºC en agitación durante 10 min. Por último, se realizó la cuantificación de las muestras. 4.4.2 Cuantificación de proteína total por el método Bradford El método de Bradford se usa para la cuantificación de proteínas y se basa en la unión del colorante, Comassie Blue G-250 a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas, una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante (Fernández & Galván, 2006). Por tanto, el color azul es proporcional al contenido de proteínas y se puede medir en un espectrofotómetro a 595 nm. Para calcular la concentración de proteínas de las muestras, se realizó una curva de calibración utilizando concentraciones crecientes conocidas de ovoalbúmina (µg/µL). Cada una de estas muestras contenía el volumen correspondiente de ovoalbúmina en función de la concentración (desde 0 a 20 µg/µL), hasta 200 µL de agua-MiliQ y 1 mL de Protein Assay Dye Reagent Concentrate (BIO-RAD). Las muestras problemas contenían 1 y 2 µL de cada muestra, 199 y 198 µL de agua-MiliQ respectivamente, y 1 mL del reactivo. Una vez calculadas las concentraciones de las muestras con 1 y 2 µL, se hizo la media aritmética de ambas. 4.4.3 Electroforesis analítica en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes Las separaciones analíticas mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes se realizaron en geles de acrilamida que contenían dodecil sulfato sódico (SDS). El gel separador se preparó al 12 % (p/v) de poliacrilamida (acrilamida:bisacrilamida 29:1) con 16 SDS al 10 % (p/v) en tampón Tris HCl 1,5 M (pH 8,8). El gel de empaquetamiento se preparó al 5 % (p/v) de poliacrilamida de la misma composición, con SDS al 10 % (p/v) en tampón Tris HCl 0,5 M (pH 6,8). Los geles se polimerizaron con persulfato amónico (APS) al 10 % (p/v), y como agente catalizador se usó N,N,N,N’-Tetrametiletilendiamina (TEMED). La electroforesis se llevó a cabo a un voltaje constante de 150 V. Se usaron aparatos PowerPac™ Basic Power Supply (BIO-RAD), utilizando como tampón de electroforesis de proteínas una disolución que contenía Tris HCl 0,25 M, glicina 1,92 M y SDS al 1 % (p/v). 4.4.4 Métodos inmunológicos e inmunocitoquímicos 4.4.4.1 Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa Para la transferencia del gel de proteínas a la membrana de nitrocelulosa se utilizó un aparato de transferencia Pierce™ Power Blotter de la marca Thermo Scientific™. Tras la electroforesis de las muestras de proteína, el gel de poliacrilamida se colocó sobre una membrana de nitrocelulosa de 0,45 µm de diámetro de poro, previamente humedecido con tampón de transferencia (tampón Dumm 10 % [v/v], metanol 20% ([v/v]). Por encima del gel y por debajo de la membrana, se colocaron 3 papeles 3 MM Chr (Whatman) humedecidos en el mismo tampón de transferencia. Las placas del aparato también se humedecieron en el tampón, y se colocó el “sándwich” en el orden descrito (el gel siempre tiene que ir arriba de la membrana puesto que la corriente va de arriba a abajo). A este se le sometió una corriente máxima de 25 V y 2,5 A durante 45 min. A continuación, la membrana se tiñó unos minutos con una disolución de colorante rojo Ponceau al 0,2 % (p/v) disuelto en una disolución acuosa de TCA al 3 % (p/v). Tras esto, se enjuagó con agua, quedando las proteínas transferidas teñidas de rojo. De esta manera, pudo comprobarse la eficacia de la transferencia utilizando el aparato Amersham™ Imager 680. 4.4.4.2 Inmunodetección por Western blot La membrana con las proteínas fijadas se incubó en tampón TBSt (Tris HCl 1 M [pH 7,5], NaCl 5 M, Tween-20 0,1 % [p/v]), que contenía leche desnatada en polvo al 5 % (p/v) como bloqueante. La membrana se incubó en este tampón durante 1 h 17 aproximadamente. A continuación, se añadió el anticuerpo primario en una disolución de leche en polvo en TBSt en una dilución apropiada (1:1000) y se incubó en agitación a 4 ºC durante toda la noche. Tras esta primera incubación, la membrana se lavó 3 veces durante 15 min con TBSt y se incubó durante al menos 1 h con una dilución 1:10000 de anticuerpos secundarios (anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo) en la misma disolución de leche en polvo en TBSt. Tras la incubación con el anticuerpo secundario, la membrana se lavó de nuevo 3 veces durante 15 min con TBSt. A continuación, se añadió de forma uniforme sobre toda la membrana la solución “ClarityTM Western ECL Substrate” (BioRad), que contenía 500 µL de “Clarity Western Peroxide Reagent” y 500 µL de “Clarity Western Luminol/Enhancer Reagent”. La membrana se cubrió con un plástico y se colocó en oscuridad durante 2-3 min. La peroxidasa catalizó la oxidación del luminol, emitiendo quimioluminiscencia, que fue detectada por el equipo Amersham™ Imager 680. 4.5 Análisis estadísticos Los datos mostrados son medias de al menos dos experimentos, mostrando la desviación típica en forma de barras de error, excepto en el caso de la Fig. 9B. La significancia estadística entre las medias de diferentes muestras fue calculada usando un test de T de Student de dos colas. Las diferencias estadísticamente significativas se marcan con asteriscos, según sean P<0,05 (*), P<0,01 (**), P<0,001 (***). 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Identificación y caracterización del gen ortólogo de CONSTANS (CO) en P. hybrida 5.1.1 Identificación del gen ortólogo de CO en P. hybrida (PhCO) mediante análisis filogenético El primer paso en este trabajo fue identificar el gen ortólogo de CO en Petunia hybrida var Mitchell. Para ello, basado en homología de secuencias (BLAST) se identificaron un total de 5 secuencias homólogas de CO en el genoma de P. hybrida: Peaxi162Scf00020g01929.1 CONSTANS-like 2, Peaxi162Scf00045g01824.1 Zinc finger protein CONSTANS-LIKE 4, Peaxi162Scf00459g00510.1 Zinc finger protein CONSTANS-LIKE 4, Peaxi162Scf00942g00122.1 Zinc finger protein CONSTANS-LIKE 18 5 y Peaxi162Scf00128g01749.1 Zinc finger protein CONSTANS-LIKE 14. Con el fin de identificar el gen ortólogo de CO entre las 5 secuencias homólogas, se llevó a cabo un análisis filogenético, incluyendo homólogos de CO pertenecientes a otras especies de solanáceas como Nicotiana benthamiana o Solanum lycopersicum. Para ello, se utilizó la herramienta MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis). Se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias biológicas mediante la herramienta MUSCLE con el objetivo de comparar las distintas secuencias. Por último, se llevó a cabo la construcción de un árbol filogenético con un método basado en distancia, conocido como UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean). Como se puede observar en la Fig. 5, la secuencia más próxima a CO fue Peaxi162Scf00020g01929.1 CONSTANS-like 2, apareciendo en el mismo clúster filogenético (cuadro amarillo). De esta manera podemos concluir que Peaxi162Scf00020g01929.1 CONSTANS-like 2 podría ser el ortólogo de CO en Petunia hybrida (PhCO). Figura 5. Árbol filogenético de CO y sus homólogos. Las secuencias de proteínas proceden de diferentes especies como Solanum lycopersicum (SolCyc), Nicotiana benthamiana (Niben), Petunia axillaris (Peaxi) y Arabidopsis thaliana. 5.1.2 Análisis del patrón de expresión PhCO (RNA y proteína) en pétalos durante LD Como comentamos anteriormente, la expresión de CO en A. thaliana depende del ritmo circadiano, es decir, varía a lo largo del día (Valverde et al., 2004). En este apartado, analizamos el patrón de expresión y los niveles de proteína cada 4h durante LD y para 19 encontrar si PhCO también presenta una expresión distinta durante el día. Este se llevó a cabo en pétalos de P. hybrida debido a que es el órgano de interés para posteriormente analizar la senescencia floral. Para analizar la expresión de PhCO se realizaron RT-PCRs semicuantitativas del gen PhCO, y del gen constitutivo PhACT, usando como cDNA el obtenido en las RTs a partir de extractos totales de pétalos de P. hybrida obtenidos cada 4h en LD (Fig. 6A). En el caso del análisis de los niveles de proteína, se llevaron a cabo ensayos de inmunodetección a partir de los mismos extractos, utilizando un anticuerpo contra CO (Fig. 6B) (Serrano-Bueno et al., 2020). Figura 6. Análisis de la expresión génica y niveles proteicos de PhCO. (A) Análisis mediante RT-PCR semicuantitativa y cuantificación de los niveles de expresión de PhCO y PhACT durante 24h. (B) Análisis por Western blot de los niveles proteicos de PhCO durante 24h usando anticuerpos contra CO y FT. Como se muestra en la Fig. 6A, la expresión de PhCO varía a lo largo del día observándose en un pico de expresión máxima a ZT12 y un segundo pico menor a ZT20. Este hecho coincide con lo observado en plantas de A. thaliana en LD, donde el pico de expresión CO también se da al final de la tarde (Andrés & Coupland, 2012). Por tanto, estos resultados sugieren que, en P. hybrida, PhCO también está sometido a una regulación circadiana similar a la de CO. Respecto al análisis de los niveles de proteína PhCO en LD (Fig. 6B), los resultados mostraron un incremento de PhCO a ZT16, es decir, al final del día. Esto sugiere, que 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 4 8 12 16 20 24 PhCO/PhACT ZT 0 2 4 6 8 10 12 14 16 -1 4 9 14 19 24 CO amount (R.U.) ZT A 200 pb 0 4 8 12 16 20 24 PhCO PhACT 0 4 8 12 16 20 24 AbCO Ponceau AbFT 50 kDa 37 kDa 0 4 8 12 16 20 24 B 20 PhCO podría presentar una regulación a nivel de proteína similar a la previamente descrita para A. thaliana (Andrés & Coupland, 2012). Como comentamos previamente, CO activa la expresión de FT en A. thaliana. Para comprobar que este hecho también sucedía en P. hybrida, se analizó por inmunodetección la producción de la proteína de PhFT a nivel de proteína. Como se muestra en la Fig. 6B, se observó un incremento de la proteína a ZT16. Por lo tanto, este experimento sugiere que, al igual que ocurre en A. thaliana, PhCO podría activar a PhFT en condiciones de día largo (Samach et al., 2000). 5.2. Clonaje de PhCO en un vector de expresión de A. thaliana Para comprobar que realmente PhCO es el gen ortólogo de CO en P. hybrida, y que, al igual que CO, tiene un papel importante en la floración y senescencia floral, se llevó a cabo la clonación de PhCO en un vector de expresión de A. thaliana para complementar ambos fenotipos en el mutante de CO co-10. Para ello, PhCO se clonó en los vectores de expresión pMDC32 (promotor 35S) y pMDC43 (promotor 35S y fusión N-terminal GFP). Se partió del gen PhCO sintetizado con las secuencias attB para utilizar el sistema de clonación Gateway. En primer lugar, se llevó a cabo la reacción BP para clonar PhCO en el plásmido pDONR207 (Fig. 7A) y se transformó E. coli DH5α mediante choque térmico. De lo clones generados se comprobaron un total de 8, tanto por digestión con enzimas de restricción HindIII y PstI, como por PCR (tabla 2) (Fig. 7 B-C). Se observó que tras la digestión con las dos enzimas aparecían 2 bandas de diferentes tamaños en todos los casos (Fig. 7B). Una de ellas correspondiente al fragmento PhCO (1891 pb), y la otra al plásmido restante (3276 pb). En el caso de la comprobación por PCR, como era de esperar, y a diferencia del control negativo, se observó una banda de 2500 pb en los 8 clones analizados (Fig. 7C). Dado que los 8 clones resultaron positivos, se decidió continuar con el clon #1, cuyo DNA se mandó a secuenciar. 21 Figura 7. Clonaje de PhCO en pDONR207 (A) Mapa del plásmido pDONR207. En morado se representan los cebadores usados y en negro los sitios de corte único de las enzimas de restricción. Imágenes obtenidas de la base de datos SnapGene. (B) Resultados de la digestión tras la reacción BP. Bandas separadas por electroforesis tras la digestión de 8 clones pDONR207_PhCO (1-8) con HindIII y PstI. (C) Análisis por PCR de los 8 clones pDONR207_PhCO (1-8). Como control positivo (+) se utilizó el plásmido pDONR207 vacío y como control negativo (-) se utilizó agua como muestra. Tras la comprobación de la correcta secuenciación, se llevó a cabo la reacción LR para clonar PhCO en los dos plásmidos destino pMDC32 y pMDC43 (Fig. 8A) y la trasformación de DH5α. Se comprobaron 4 clones de cada construcción tanto por digestión con enzimas de restricción HindIII y EcoRI por separado, como por PCR (tabla 2) (Fig. 8 B-C). Se observó que tras la digestión tanto con HindIII como con EcoRI de ambas construcciones aparecieron 2 bandas de diferentes tamaños (Fig. 8B). Tras la digestión de los clones pMDC32_PhCO con HindIII, las bandas presentaron un tamaño de 2866 pb y 9439 pb, mientras que con EcoRI, los tamaños fueron de 2175 pb y 10130 pb. En el caso de los clones pMDC43_PhCO, tras la digestión con HindIII las bandas tenían un tamaño de 3920 pb y 9095 pb, mientras que con EcoRI, las bandas obtenidas presentaron un tamaño de 2175 pb y 10840 pb. Con respecto a la comprobación por PCR, a diferencia del control positivo (pMDC32 y pMDC43), donde uno de los cebadores no estaba presente, y al control negativo, se observó una banda de 1550 pb en pMDC32_PhCO#1 y pMDC43_PhCO#1 (Fig. 8C). Dado que los clones utilizados de pDONR207_PhCO C B 2500 pb 2000 pb 2500 pb A pDONR207_PhCO 3000 pb + 1 2 3 4 5 6 7 8 - 1 2 3 4 5 6 7 8 22 cada construcción resultaron positivos, se decidió continuar con el clon #1 de cada construcción, los cuales se mandaron a secuenciar. Figura 8. Clonaje de PhCO en pMDC32 y pMDC43. (A) Mapa de los plásmidos pMDC32 y pMDC43. (B) Resultados de la digestión tras la reacción LR. Bandas separadas por electroforesis tras la digestión de 4 clones pMDC32_PhCO y 4 clones pMDC43_PhCO con HindIII y EcoRI. (C) Análisis por PCR de 1 clon de cada construcción, pMDC32_PhCO#1 y pMDC43_PhCO#1. Como control positivo (+) se utilizaron los plásmidos pMDC32 y pMDC43 vacíos y como control negativo (-) se utilizó agua como muestra. Con la clonación de PhCO en los vectores de expresión pMDC32 y pMDC43, se han realizado los primeros pasos para determinar si realmente es el gen ortólogo de CO en Petunia hybrida. Para continuar con este apartado de resultados se transformará con ambas construcciones, por un lado, pMDC32_PhCO y pMDC32_PhCO en A. tumefaciens para posteriormente poder transformar por inmersión floral el mutante de CO de A. thaliana (co-10). Posteriormente, se analizarán tanto el tiempo de floración como la senescencia floral para ambas líneas transgénicas con el fin de revertir ambos fenotipos. Como segunda aproximación, se usarán estas construcciones para transformar P. hybrida. Se analizará también la floración y senescencia floral de esta línea transgénica sobreexpresora, en comparación con el fenotipo silvestre. A través de ambas estrategias, A HindIII 2500 pb 10037 pb 10037 pb 2500 pb 2000 pb EcoRI pMDC32_PhCO#1-4 pMDC43_PhCO#1-4 pMDC43_PhCO#1-4 pMDC32_PhCO#1-4 C B 1500/1517 pb 29 Lin, Y., & Jones, M. L. (2021). Silencing ATG6 and PI3K accelerates petal senescence and reduces flower number and shoot biomass in petunia. Plant Science, 302, 110713. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2020.110713 Majeed, N., Panigrahi, K. C. S., Sukla, L. B., John, R., & Panigrahy, M. (2020). Regulatory mechanisms across networks of the circadian clock and senescence pathways. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 29(4), 665–674. https://doi.org/10.1007/s13562020-00612-6 Martínez-García, J. F., Monte, E., & Quail, P. H. (1999). A simple, rapid and quantitative method for preparing Arabidopsis protein extracts for immunoblot analysis. Plant Journal, 20(2), 251–257. https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.1999.00579.x Ng Chee Ping. (2013). 基因的改变NIH Public Access. 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