Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo C6

Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis Universidad de Sevilla Consejo Superior de Investigaciones Científicas Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 Alejandro Torrado Maya Marzo 2017 ! ! ! Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis Universidad de Sevilla Consejo Superior de Investigaciones Científicas Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 Memoria presentada por el Licenciado Alejandro Torrado Maya para optar al grado de Doctor en Biología por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2017 Director Dr. Fernando Publio Molina Heredia Profesor Titular de Universidad A las cianobacterias, Sin ellas, nada de esto hubiera sido posible. ! ! Mientras los sueños no tengan fin, el camino será ilimitado. Solo el miedo puede detenerte. Flatley ! ! AGRADECIMIENTOS Me gustaría comenzar este apartado agradeciendo a la gente que me inició en este mundillo, bien por suerte o por desgracia. Al primero que quiero agradecer su ayuda es a José A. Monreal, que fue el primero que me echó un cable para entrar en el ambiente investigador en el departamento de Microbiología. A la gente del departamento de Microbiología, en el que estuve un par de años, les quiero agradecer su apoyo y sus enseñanzas; sobre todo a Nuria y Rocío, que fueron las que me enseñaron desde cero en las cocinas. De esa etapa, quiero agradecer a Rosario Espuny el que me acogiese y me tratase como uno más. Si no fuese por “Charo”, no habría conocido al que sería mi director de tesis. A Fernando Publio Molina Heredia, mi director de tesis, le quiero dar sinceramente las gracias. No solo confió en mí, un estudiante normal y corriente, sin grandes calificaciones, sino que me dio la oportunidad de desarrollar el trabajo de tesis que tienen ante ustedes. Con el paso del tiempo se ha convertido en una figura muy importante en mi vida y lo considero un verdadero amigo. Siempre voy a estar en deuda contigo, Fernando. También quiero agradecer a todo el grupo de investigación, que me han ayudado siempre que lo he necesitado. A Pepe Navarro, Manolo Hervás, Mercedes Roncel y José M. Ortega. De verdad, muchas gracias por todo lo que me habéis enseñado. A la otra parte del grupo de investigación, los “indios”, no puedo sino estar igualmente agradecido por todo. A Pilar Bernal, que fue la que me enseñó a conciencia a trabajar en un laboratorio de Bioquímica, muchas veces a golpe de regañinas pero con mucho cariño y pasión, le quiero igualmente agradecer su apoyo, sus lunes por la mañana con historias, sus "cafelillos", el escándalo que formamos hablando y su amistad. A Leonor Puerto, muchísimas gracias por todo, porque entre tu y Pilar habéis hecho de mi un profesional del campo. El L7 nunca fue lo mismo sin ti. También quiero agradecer a gente que estuvo en nuestro grupo pero que siguió otro camino, como Ana López, que en poco tiempo fue una mas de nosotros y una verdadera amiga. Así mismo, agradecer a una compañera que intenta abrirse un hueco en este oficio, Mari Carmen Castell, por esa energía y esa ilusión por todo y a nuestra técnico de laboratorio compartida, Soiartze, siempre diligente y dispuesta a aprender. Quiero agradecer también a dos compañeros de fatigas, que a pesar de no estar en mi grupo eran parte indispensable del día a día, Javier Santamaría e Isidro Álvarez, por aguantarnos mutuamente, por las cervezas de los viernes y por su amistad. El día que montéis el bar, allí me tendréis. De igual forma, hay mucha gente del IBVF a la que debo agradecer mucho, por hacer que mi experiencia en el centro haya sido tan gratificante día tras día. A Félix Ramos, compañero desde la carrera y un gran amigo, gracias por todo (sobre todo por tus apuntes). A Enrique Flores y Antonia Herrero y su grupo agradecerles la ayuda prestada para la manipulación de Nostoc/Anabaena. A los vecinos del laboratorio L6 también agradeceros por todo, Elvira, Manuel, Alicia y Agustín, ! ! ÍNDICE ! ! ! 14 ! ! 5. CONSIDERACIONES GENERALES 5.1. Localización subcelular de los citocromos alternativos 5.2. Posible función de los citocromos alternativos en fotosíntesis 5.3. Posible función de los citocromos alternativos en respiración 5.4. Papel del citocromo c6 y de la plastocianina en fotosíntesis y respiración 6. CONCLUSIONES 7. BIBLIOGRAFÍA 147 150 151 152 153 157 161 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 15 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Árbol filogenético de máxima verosimilitud de las cianobacterias Figura 2. Micrografía de transmisión electrónica de Nostoc sp. PCC 7120 Figura 3. Esquema de las cadenas de electrones fotosintética y respiratoria en cianobacterias Figura 4. Modelo tridimensional del citocromo c6 de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 5. Modelo tridimensional de la plastocianina de Anabaena variabilis Figura 6. Esquema del sistema de medida utilizado para la determinación de los potenciales rédox Figura 7. Fotografía y esquema del sistema de espectrofotometría cinética inducida por láser Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de DNA obtenidos mediante PCR Figura 9. Plásmido pEAC63 para la expresión del citocromo c6-3 Figura 10. Secuencia de la ORF del gen petJ-3 de Nostoc sp. PCC 7119 y de la proteína citocromo c6-3 Figura 11. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los citocromos c6, c6-2 y c6-3, de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 12. Predicción del péptido de tránsito del citocromo c6-3 Figura 13. Predicción de la estructura secundaria del citocromo c6-3 Figura 14. Árbol filogenético de los diferentes citocromos de tipo c solubles, con coordinación Histidina-Metionina, presentes en organismos fotosintéticos Figura 15. Modelo tridimensional de la estructura del citocromo c6-3 Figura 16. Superposición de los modelos estructurales de los citocromos c6 y c6-3 Figura 17. Comparación de los potenciales electrostáticos de superficie de los citocromos c6 y c6-3 Figura 18. Espectro de absorción UV/Vis del citocromo c6-3 de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 19. Análisis por MALDI-TOF del citocromo c6-3 de Nostoc sp. PCC 7119 expresado en E. coli Figura 20. Titulación potenciométrica rédox de los citocromos f, c6 y c6-3 a pH 7,0 Figura 21. Titulación potenciométrica rédox de los citocromos c6 y c6-3 a pH 4,0 Figura 22. Calorimetría de titulación isotérmica del complejo citocromo c6-3/citocromo f Figura 23. Docking molecular de la interacción entre citocromo c6/citocromo f y citocromo c6-3/citocromo f Figura 24. Transferencia electrónica desde los citocromos c6 y c6-3 al fotosistema I Figura 25. Reacción del citocromo c6-3 con las oxidasas terminales de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119 27 32 34 37 39 81 85 93 94 95 95 96 97 99 101 102 103 106 107 108 109 111 112 113 115 ! ! ÍNDICE ! ! ! 16 Figura 26. Reacción del citocromo c6-3 con mutantes de las oxidasas terminales de heterocistos de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 27. Inmunodetección del citocromo c6-3 mediante análisis de Western Blot Figura 28. Inmunodetección mediante análisis de localización por inmunofluorescencia del citocromo c6-3 Figura 29. Expresión relativa de los genes petJ y petJ-3 por qPCR Figura 30. Estudio mediante microscopía de la región promotora del citocromo c6-3 mediante visualización con GFP Figura 31. Calorimetría de titulación isotérmica del complejo citocromo c6-2/citocromo f Figura 32. Docking molecular de la interacción entre citocromo c6/citocromo f y citocromo c6-2/citocromo f Figura 33. Reacción del citocromo c6-2 con las oxidasas terminales de distintas preparaciones de membranas de Nostoc sp. PCC 7119 silvestre y de sus mutantes ∆Cox2 y ∆Cox3 Figura 34. Estudio de fluorescencia mediante microscopía confocal del citocromo c6-2, mediante visualización con GFP Figura 35. Secuencia de la ORF del gen cytM de Nostoc sp. PCC 7119 y de la proteína citocromo cM Figura 36. Esquema de la obtención del gen quimérico que codifica el citocromo cM fusionado al péptido de tránsito de la plastocianina Figura 37. Secuencia de la ORF del gen cytM de Nostoc sp. PCC 7119 optimizado para el uso de codones de E. coli, así como la secuencia de la proteína citocromo cM Figura 38. Plásmido pEACM para la expresión del citocromo cM Figura 39. Espectro de absorción UV/Vis del citocromo cM de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 40. Análisis por MALDI-TOF del citocromo cM de Nostoc sp. PCC 7119 expresado en E. coli Figura 41. Titulación potenciométrica rédox del citocromo cM a pH 7,0 Figura 42. Modelo tridimensional de la estructura del citocromo cM Figura 43. Comparación de los potenciales electrostáticos de superficie de los citocromos c6 y cM Figura 44. Docking molecular de la interacción entre citocromo c6/citocromo f y citocromo cM/citocromo f Figura 45. Transferencia electrónica desde los citocromos c6 y cM al fotosistema I Figura 46. Interacción del citocromo cM con oxidasas terminales de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 47. Estudio de fluorescencia mediante microscopía confocal del citocromo cM, mediante visualización con GFP 116 118 119 120 121 123 124 125 126 128 130 131 132 134 135 136 137 137 138 139 140 141 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 17 Figura 48. Localización subcelular del citocromo c6 y de la plastocianina de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 49. Localización subcelular del citocromo c6 de Nostoc sp. PCC 7119 en presencia de cobre Figura 50. Interacción del citocromo c6 y plastocianina con oxidasas terminales de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119 Figura 51. Esquema funcional propuesto para el citocromo c6 y la plastocianina y su relación en fotosíntesis y respiración en Nostoc sp. PCC 7119 143 144 145 154 ! ! ÍNDICE ! ! ! 18 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Estirpes mutantes de Nostoc sp. PCC 7119 desarrolladas en este trabajo Tabla 2. Medio de cultivo BG11 para cianobacterias Tabla 3. Estirpes de E. coli utilizadas en este trabajo Tabla 4. Medio de cultivo LB para E. coli Tabla 5. Plásmidos generados en este trabajo Tabla 6. Plásmidos adicionales utilizados en este trabajo Tabla 7. Lista de oligonucleótidos utilizados en este trabajo Tabla 8. Estirpes de E. coli utilizadas para la producción de las distintas metaloproteínas Tabla 9. Máximos de absorción en la banda α y la relación de pureza obtenida para los citocromos y la plastocianina estudiados Tabla 10. Características físico-químicas del citocromo c6-3 de Nostoc sp. PCC 7119 Tabla 11. Propiedades termodinámicas de la calorimetría de los complejos citocromo c6/citocromo f y citocromo c6-3/citocromo f Tabla 12. Valores cinéticos para la transferencia electrónica desde los citocromos c6 y c6-3 al fotosistema I Tabla 13. Propiedades termodinámicas de la calorimetría de los complejos citocromo c6/citocromo f y citocromo c6-2/citocromo f Tabla 14. Pruebas de expresión del citocromo cM en E. coli Tabla 15. Pruebas de expresión del gen sintético del citocromo cM en E. coli Tabla 16. Comparación entre los parámetros físico-químicos del citocromo cM Nostoc y Synechocystis 53 54 56 56 58 59 64 71 79 109 110 114 123 130 133 135 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 19 ABREVIATURAS Ap Ampicilina APS Persulfato amónico ATP Adenosina-5ʼ-trifosfato BCSA Batocuproína disulfonato sódico bisacrilamida N,Nʼ-bis-metilen-acrilamida Cit Citocromo Cm Cloranfenicol Cox Citocromo c oxidasa C-terminal Carboxilo terminal DNA Ácido desoxirribonucleico DNasa Desoxirribonucleasa DTT Ditiotreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EGTA Em,7 Ácido etilenglicol tetraacético Potencial redox a pH 7,0 g GFP h Aceleración de la gravedad Green fuorescent protein Hora HEPES Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-Nʼ-2-2 etanosulfónico IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido kDa kilo Dalton Km Kanamicina LB Medio de cultivo de Luria-Bertani min Minuto n Nucleótido N-terminal Amino terminal ORF p/v Fase abierta de lectura Relación peso/volumen pb Par de bases Pc Plastocianina PCC Colección de Cultivos del Instituto Pasteur PCR Reacción en cadena de la polimerasa pI Punto isoeléctrico PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PQ Plastoquinona PS Fotosistema RNA Ácido ribonucleico RNAm Ácido ribonucleico mensajero RNasa Ribonucleasa r Relación de máxima absorbancia A280/Abanda α r.p.m. Revoluciones por minuto RT Retrotranscripción RT-PCR Retrotranscripción seguida de PCR s Segundo SDS Laurilsulfato sódico TEMED N,N,Nʼ,Nʼ-tetrametiletilendiamina Tris Tris-(hidroximetil)aminoetano U Unidades v/v Relación volumen/volumen sf-GFP Superfold-green fluorescent ptotein X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiranósido ! ! ÍNDICE ! ! ! 20 Bases nitrogenadas A Adenina C Citosina G Guanina T Timina U Uracilo Aminoácidos A Ala Alanina L Leu Leucina R Arg Arginina K Lys Lisina N Asn Asparragina M Met Metionina D Asp Aspartato F Phe Fenilalanina C Cys Cisteína P Pro Prolina E Glu Glutamato S Ser Serina Q Gln Glutamina T Thr Treonina G Gly Glicina W Trp Triptófano H His Histidina Y Tyr Tirosina I Ile Isoleucina V Val Valina ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 21 COMPOSICIÓN DE TAMPONES Tampón de carga de DNA Azul de bromofenol al 0,25 % (p/v), xileno-cianol al 0,25 % (p/v) y glicerol al 30 % (v/v). Tampón de carga de proteínas Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8), SDS al 8 % (p/v), β-mercaptoetanol al 20 % (v/v) y azul de bromofenol al 0,25 % (p/v) y glicerol al 40 % (v/v). Tampón TBE Tris-borato 90 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0). Tampón TE Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM. Tampón TR Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), MgSO4 10 mM, CaCl2 1 mM. PBS NaCl 26 mM, KCl 0,54 mM, Na2HPO4 0,8 mM, KH2PO4 0,352 mM. PBS-T NaCl 26 mM, KCl 0,54 mM, Na2HPO4 0,8 mM, KH2PO4 0,352 mM Tween-20 al 0,05 % (v/v). Tampón de electroforesis Trizma base 25 mM, glicina 192 mM y SDS al 0,1 % (p/v) (pH 8,3). ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! 22 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 23 INTRODUCCIÓN ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! 30 pero parecen localizarse de manera transitoria en la membrana plasmática durante el proceso de biosíntesis y ensamblaje de las subunidades [Kaneko et al., 2001; Keren et al., 2005]. En cuanto a las membranas tilacoidales, estas están constituidas por una bicapa que genera en su interior un espacio, el lumen tilacoidal, donde se acumula el gradiente de protones generado en el proceso fotosintético. En la cara externa (plasmática) de la membrana tilacoidal se localizan, asociados al PS II, los ficobilisomas como pigmentos antena. En estas membranas tilacoidales, las cadenas de transporte de electrones de los procesos fotosintético y respiratorio comparten algunos elementos, como el complejo de citocromos (Cit) b6-f, la plastoquinona (PQ) y los donadores de electrones alternativos Cit c6 y plastocianina (Pc), con lo que incluso los electrones que están siendo transportados en la cadena respiratoria pueden pasar a la cadena fotosintética y viceversa [Scherer, 1990]. La disposición de las membranas tilacoidales en el interior celular, y de los complejos proteicos en zonas específicas de estas membranas, es actualmente objeto de estudio y no parece ser igual en todas las cianobacterias. Así, algunos estudios apoyan la continuidad de las membranas plasmática y tilacoidales [Van de Meene et al., 2006], mientras que otros autores han encontrado evidencias que caracterizan estos sistemas de membranas como compartimentos independientes [Keren et al., 2005]. Respecto a sus características genéticas, la mayoría de cianobacterias estudiadas son poliploides, presentando un alto número de copias cromosómicas (en torno a 12) por célula. Muchas cianobacterias pueden incorporar DNA exógeno a su genoma de manera estable, por medio de un sistema de conjugación y recombinación homóloga [Porter, 1986; Ochman et al., 2000]. Todo ello hace de las cianobacterias organismos ideales para el estudio molecular de los procesos fotosintéticos, respiratorios y metabólicos en general. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 31 1.1.1. Heterocistos Los heterocistos son células especializadas que han sufrido una diferenciación celular real y que poseen diferentes cualidades, tanto funcionales como estructurales, respecto a las células vegetativas, que constituyen la unidad de crecimiento del filamento (Figura 2). Estas células, que pierden la capacidad de división durante su desarrollo, son las encargadas de albergar el sistema de fijación de nitrógeno atmosférico, creando en su interior un ambiente libre de oxígeno para el correcto funcionamiento del sistema y, por lo tanto, perdiendo actividad fotosintética [Haselkorn, 1978; Wolk et al., 1994; Herrero et al., 2004]. Por ello, el papel que juega el heterocisto en el metabolismo de la cianobacteria en déficit de nitrógeno, o diazotrofía, es el de proporcionar a las células vegetativas adyacentes nitrógeno combinado en forma de glutamina, obteniendo de éstas glutamato y compuestos derivados de la fijación fotosintética del CO2 [Wolk et al., 1976, 1994]. Para evitar la entrada de oxígeno en la célula, el heterocisto desarrolla una gruesa capa externa a la pared celular, formada por polisacáridos [Murray y Wolk, 1989]. A su vez, para evitar que haya difusión de oxígeno a través de las células adyacentes, el contacto entre los dos tipos celulares se reduce al mínimo, produciéndose una serie de septos muy estrechos que forman canales [Lang y Fay, 1971; Giddings y Staehelin, 1978,1981]. Otra diferencia estructural presente en heterocistos es la reorganización de las membranas tilacoidales. La distribución periférica y con invaginaciones presente en las células vegetativas da lugar en los heterocistos a un sistema de membranas muy reticulado y polarizado en los septos, constituyendo los denominados “honeycomb”, o estructuras en panal [Lang y Fay, 1971], donde se concentra una gran cantidad de complejos respiratorios claves para mantener el ambiente libre de oxígeno y proporcionar el ATP necesario para el funcionamiento del complejo de fijación de nitrógeno [Murray et al., 1981; Fay 1992]. Por ello, la elevada actividad respiratoria del organismo en condiciones ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! 32 diazotróficas es debida casi exclusivamente a la actividad de las oxidasas respiratorias terminales de los heterocistos [Murray y Wolk, 1989]. Figura 2. Micrografía de transmisión electrónica de Nostoc sp. PCC 7120. Se muestran una célula vegetativa (V) y un heterocisto (H). La membrana tilacoidal de la célula vegetativa se encuentra estratificada de forma ordenada, mientras que en el heterocisto dicha membrana esta menos ordenada. La capa de polisacáridos (p) y la de glicolípidos (g) son visibles alrededor del heterocisto. La barra negra (arriba a la derecha) indica 1 µm. Extraído de Magnuson y colaboradores [2016]. La cianobacteria en la que se ha centrado este trabajo es Nostoc sp. PCC 7119, una cianobacteria filamentosa perteneciente a la sección IV que es capaz de desarrollar heterocistos. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 33 1.2. Las cadena fotosintética y respiratoria en cianobacterias La fotosíntesis es el proceso bioenergético principal de las cianobacterias, siendo en muchos casos la única fuente de entrada de energía, como ocurre en muchas cianobacterias fotoautótrofas estrictas, donde la respiración celular es casi inexistente. Como ya hemos comentado, las cianobacterias son el único grupo de procariotas capaz de llevar a cabo una fotosíntesis oxigénica similar a la de algas eucariotas o plantas [Blankenship, 1992]. Una característica esencial para entender la enorme versatilidad de las cianobacterias es el hecho de que en estos organismos procariotas las cadenas de transporte fotosintética y respiratoria están unidas espacialmente y comparten una serie de elementos comunes, como son la PQ, la Pc, el Cit c6 y el complejo Cit b6-f (Figura 3) [Paumann et al., 2005]. Sin embargo, se produce una cierta espacialidad en los procesos: en la membrana tilacoidal, se localizan ambas rutas bioenergéticas de forma intercalada, mientras que en la membrana citoplasmática sólo aparece una cadena respiratoria alternativa [Schmetterer, 1994]. A pesar de la existencia de dos sistemas respiratorios independientes, está establecido que la respiración en cianobacterias se inhibe en presencia de luz, por lo que la separación no es sólo espacial, sino también temporal [Brown y Webster, 1953]. 1.2.1. La cadena fotosintética La cadena fotosintética está constituida por tres grandes complejos de membrana: el PS II, el complejo Cit b6-f y el PS I, e interconectando estos complejos encontramos transportadores de electrones móviles. El transportador de electrones entre el PS II y el complejo Cit b6-f es la PQ, una pequeña molécula liposoluble que puede moverse a través de la membrana [Swiezewska, 2004], mientras que los mediadores entre el complejo Cit b6-f y el PS I son el Cit c6 y la Pc, dos pequeñas metaloproteínas hidrosolubles situadas ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! 34 en el lumen tilacoidal [Hope, 2000; Fromme et al., 2003]. El flujo de electrones a través del complejo Cit b6-f conlleva, a su vez, un trasiego de protones hacia el interior del lumen tilacoidal, generando un gradiente que puede ser empleado por las ATPasas para generar energía [Mitchell, 1961]. En ultima instancia, el PS I cede los electrones a la ferredoxina (Fd), o a la flavodoxina (Fld) en condiciones de déficit de hierro, que los transfieren a la Fd-NADP+ reductasa, y esta a su vez los cede al NADP+, dando lugar a NADPH. Al flujo de electrones desde el PS II hasta el NADP+ se denomina flujo lineal o no cíclico. Se llama así para diferenciarlo del llamado flujo cíclico, en el que la Fd, en vez de generar poder reductor, reduce a la PQ a través de una Fd-quinol reductasa, sin implicar al PS II, permitiendo generar un gradiente protón-motriz y producir ATP sin síntesis de NADPH [Bendall y Manasse, 1995]. Figura 3. Esquema de las cadenas de electrones fotosintética y respiratoria en cianobacterias. El complejo Cit b6-f y los transportadores rédox PQ, Pc y Cit c6 son comunes en fotosíntesis y respiración. Fotosistema II (PS II); plastocianina (Pc); citocromo c6 (c6); fotosistema I (PS I); ferredoxina (Fd); citocromo c oxidasa (Cox). PS I! ! Cox! ! PS II! ! NADH OXIDORREDUCTASA! ! H2O! ! ½ O2! ! PQ! ! H2O! ! ½ O2! ! NADH + H+! ! NAD+! ! NADH + H+! ! Fd! ! NAD+! ! Fotosíntesis! ! Respiración! ! h!" e-! e-! e-! e-! h!" Pc! ! b6 f! ! c6! ! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 35 En el caso de cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, durante la diferenciación de estas células especializadas se produce un reajuste importante del aparato fotosintético de la célula. De esta forma se pierde por completo el PS II, debido a que su actividad provocaría una liberación de O2 intracelular que inhibiría la actividad de la nitrogenasa [Donze et al., 1972; Fay, 1992; Wolk et al., 1994]. De hecho, no sólo se pierde este complejo, sino que además se observa una importante disminución de pigmentos fotosintéticos con respecto a las células vegetativas. Pese a esto, el heterocisto es capaz de realizar fotosíntesis cíclica, generando ATP para mantener la actividad nitrogenasa. 1.2.2. La cadena respiratoria En la cadena respiratoria principal de cianobacterias, que está situada en la membrana tilacoidal, se encuentran tres macrocomplejos embebidos en la membrana: la NADH deshidrogenasa, de nuevo el complejo Cit b6-f y la citocromo c oxidasa (Cox), u oxidasa terminal, encargada de transferir los electrones al oxígeno. Así, los electrones generados a partir de la oxidación del NADH en el complejo NADH deshidrogenasa, son transportados por la PQ (al igual que en la cadena fotosintética) al complejo Cit b6-f [Schmetterer, 1994]. Posteriormente, los electrones pasarán al Cit c6 o la Pc para, finalmente, llegar a la Cox y, en última instancia, al oxígeno [Lockau, 1981]. Existe, además, una cadena respiratoria alternativa situada en la membrana citoplásmica que implicaría algún tipo de oxidasa respiratoria terminal diferente a la oxidasa presente en las membranas tilacoidales de la cianobacteria [Schmetterer, 1994]. En Nostoc sp. PCC 7119 se encuentran tres operones que codifican para oxidasas terminales, los denominados genes cox. El primero de ellos, el operón cox1, codifica para una oxidasa terminal exclusiva de células vegetativas, mientras que los operones cox2 y cox3 codifican para oxidasas específicas de ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! 36 heterocistos [Jones y Haselkorn, 2002; Valladares et al., 2003]. Por lo tanto, se piensa que cox2 y cox3 contribuyen a la protección de la nitrogenasa, jugando cox3 un papel esencial en dicha protección [Valladares et al., 2007]. Se cree que la actividad respiratoria de estas oxidasas se concentra en los honeycombs, ya que la ausencia de dichas oxidasas provoca la desorganización de estas estructuras [Valladares et al., 2007]. La redundancia en la aparición de oxidasas terminales y el hecho de que hay pocos estudios que aborden la funcionalidad de Cit c6 y Pc con estas oxidasas complica el desarrollo de un modelo de transferencia electrónica que explique como ocurre la respiración en cianobacterias. 1.3. Citocromo c6 y plastocianina 1.3.1. Citocromo c6 El Cit c6 es un transportador soluble de electrones encargado de transferir electrones desde el complejo Cit b6-f (a través del Cit f) al PS I, en la fotosíntesis oxigénica. Está presente en todas las cianobacterias conocidas y en una gran cantidad de algas [Schmetterer, 1994; Ki, 2005]. Sin embargo, a lo largo de la evolución, ha sido sustituido en plantas por la Pc, aunque en cianobacterias y algas verdes ambas proteínas se pueden encontrar en el mismo organismo, sustituyendo el Cit c6 a la Pc en condiciones de deficiencia de cobre [Davis et al., 1980; Sandmann, 1985]. Cuando el Cit c6 y Pc aparecen en el mismo organismo, la expresión de uno u otro está fuertemente regulada en el inicio de transcripción por cobre [Bovy et al., 1992; Nakamura et al., 1992; Zhang et al., 1994]. Existen excepciones, como Chlamydomonas reinhardtii, donde la expresión del Cit c6 esta inhibida por cobre mientras que la expresión de la Pc es constitutiva. En este organismo, en deficiencia de cobre, se sintetiza la preapo-Pc pero esta se ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 37 degrada rápidamente mediante ubiquitinación [Hill y Merchant, 1992; Merchant et al., 1991]. Figura 4. Modelo tridimensional del citocromo c6 de Nostoc sp. PCC 7120. Su secuencia [código PDB 4GYD, Díaz-Moreno et al., 2014] es idéntica a la de Nostoc sp. PCC 7119. En amarillo se señala el grupo hemo y en naranja el átomo de hierro. El Cit c6 es un Cit de tipo c de clase I con un grupo hemo unido covalentemente a la cadena polipeptídica por la secuencia consenso Cys-X-X-Cys-His [Campos et al., 1993], siendo Cys-Ala-Ser-Cys-His en Nostoc sp. PCC 7119. Se trata de una hemoproteína soluble de unos 10 kDa, con un potencial rédox a pH 7 de +335 mV y un pico máximo de absorbancia a 553 nm, que corresponde a la denominada banda α [Cohn et al., 1989; Moore y Pettigrew, 1990; Campos et al., 1993]. Este Cit se codifica por el gen petJ y se sintetiza en el citoplasma en forma de preapocitocromo. Posteriormente se transloca al lumen tilacoidal dirigido por un péptido de tránsito conservado en el extremo N-terminal. En el lumen tilacoidal se madura, se elimina el péptido de tránsito y se produce la unión covalente del grupo hemo [Merchant et al., 1987; Bovy et al., 1992; Howe et al., 1994]. En la secuencia aminoacídica se encuentran tres regiones ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! 38 altamente conservadas. Las regiones comprendidas entre los residuos 9 al 21 y entre los residuos 56 al 65 contienen los dos ligandos axiales del grupo hemo: la His18 y la Met58. El otro área conservada que engloba los residuos del 68 al 71 se encuentra altamente conservada en organismos eucariotas, pero no en cianobacterias [Cohn et al., 1989; Kerfeld et al., 1995]. La estructura secundaria del Cit c6 consiste en cuatro hélices α conectadas entre sí por tres lazos (Figura 4) [Frazão et al., 1995; Beissinger et al., 1998]. El grupo hemo se localiza en un bolsillo hidrófobo rodeado por 23 aminoácidos, de los cuales 13 están altamente conservados. Hay, además, cuatro residuos aromáticos conservados (Phe10, Phe61, Tyr76 y Trp85) expuestos al solvente en la superficie de la proteína. De hecho, sólo el 6 % del grupo hemo está expuesto al solvente, concretamente los átomos de los pirroles C y D [Frazão et al., 1995]. Respecto al potencial electrostático de superficie, este varía en función del organismo, pudiendo tener carga neta positiva, negativa o neutra. En Nostoc encontramos en la superficie de la molécula una zona básica, con carga neta positiva, que sería clave para la interacción, tanto con el complejo Cit f como con el PS I [Molina-Heredia et al.,1999]. Cercano a esta región se encuentra un residuo estrictamente conservado que es clave para la transferencia de electrones al PS I: la Arg64 [Molina-Heredia et al., 1999, 2001]. 1.3.2. Plastocianina La Pc es una cuproproteína soluble, con un peso molecular de 10,5 kDa y un potencial rédox a pH 7 de +370 mV, que contiene un único átomo de cobre unido a una cadena polipeptídica de 100 aminoácidos [Redinbo et al., 1994]. La naturaleza y estructura de los ligandos del cobre son la causa del color azul que presenta la proteína oxidada, típico de cuproproteínas de tipo I, con un máximo de absorbancia cercano a 600 nm, debido a la transferencia de carga que se produce por el corto enlace (Cys89)S-Cu entre el ligando y el átomo de cobre, como consecuencia del solapamiento de sus orbitales [Sigfridsson, 1998]. Su estructura secundaria está muy conservada y se compone de ocho ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 39 cadenas conectadas por siete lazos. Siete de esas cadenas tienen una configuración en lámina-ß, mientras que la restante suele tener una conformación en α-hélice corta, formando un cilindro aplanado o barril-ß con el átomo de cobre en el denominado extremo norte de la molécula (Figura 5) [Guss et al., 1986]. Figura 5. Modelo tridimensional de la plastocianina de Anabaena variabilis. Su secuencia [código PDB 2CJ3] es idéntica a la de Nostoc sp. PCC 7119. En celeste se presenta el átomo de cobre. El gen que codifica para la Pc es el petE y la proteína se sintetiza en el citoplasma, como un precursor con un péptido de tránsito, al igual que el Cit c6. La preapoplastocianina se transporta al lumen tilacoidal, donde se escinde el péptido de tránsito y se une el átomo de cobre [Merchant et al., 1990; Van der Plas et al., 1989]. Los residuos conservados incluyen los cuatro ligandos del átomo de cobre (His39, His92, Cys89 y Met97), así como la Tyr88, entre otros. A pesar del alto grado de conservación de la estructura secundaria, hay una alta variación en el ! ! OBJETIVOS ! ! ! 46 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 47 OBJETIVOS ! ! OBJETIVOS ! ! ! 48 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 49 2. OBJETIVOS En todas las cianobacterias estudiadas, como ya hemos comentado, aparece el Cit c6, cuya función respiratoria y fotosintética está bien caracterizada. Así mismo, en un gran número de cianobacterias aparecen isoformas de este Cit cuya función no está definida, como el Cit cM, que se ha postulado como Cit respiratorio, o el Cit c6-2, que podría actuar en fotosíntesis. El Cit c6 está involucrado en fotosíntesis, respiración y en fotosíntesis anoxigénica. La presencia de varias isoformas dentro de una misma cianobacteria abre la posibilidad a que cada una de ellas juegue un papel funcional diferente. Por lo tanto, el objetivo fundamental de esta tesis ha sido el estudio de las diferentes isoformas del Cit c6 que aparecen en la cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos Nostoc sp. PCC 7119. ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 50 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 51 MATERIALES Y MÉTODOS ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 52 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 53 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Organismos y condiciones de cultivo 3.1.1. Nostoc Para este estudio se empleó la estirpe Nostoc sp. PCC 7119 (ATCC 29151) [Adolph y Haselkorn, 1971; Rippka et al., 1979]. Además, en esta tesis doctoral se han construido varias estirpes mutantes derivadas de Nostoc sp. PCC 7119 (de ahora en adelante Nostoc), cuyas características se describen en la Tabla 1: Tabla 1. Estirpes mutantes de Nostoc sp. PCC 7119 desarrolladas en este trabajo. Estirpe Características Resistencia a antibióticos AT1 Fusión de GFP a la región promotora, más los tres primeros aminoácidos, del gen petJ-3 Sm, Sp AT2 Fusión de GFP al extremo C terminal del gen petJ Sm, Sp AT3 Fusión de GFP al extremo C terminal del gen petJ-2 Sm, Sp AT4 Fusión de GFP al extremo C terminal del gen petJ-3 Sm, Sp AT5 Fusión de GFP al extremo C terminal del gen cytM Sm, Sp AT6 Fusión de GFP al extremo C terminal del gen petE Sm, Sp AT7 Gen petJ-3 con una deleción de 236 pb Sm, Sp AT8 Gen petJ-2 con una deleción de 250 pb Sm, Sp AT9 Gen petJ-3 con 6 histidinas unidas al extremo C terminal Sm, Sp El medio de cultivo utilizado fue el denominado BG11 [Rippka et al., 1979] cuya composición se describe en la Tabla 2. Para los ensayos realizados en ausencia de cobre, no se añadió CuSO4 y, para asegurar una total ausencia de cobre, se suplementó con 300 µg/ml del quelante de cobre BCSA (Batocuproína disulfonato sódico). Para los cultivos en ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 54 ausencia de nitrógeno combinado (BG110) no se añadió NaNO3. La esterilización de los medios se llevó a cabo en un autoclave, a 1 atm de sobrepresión (121 ºC), durante 20 min. Tabla 2. Medio de cultivo BG11 para cianobacterias. Componentes del medio BG11 según Rippka y colaboradores [1979]. Compuesto Concentración final (mg/l) NaNO3 150 K2HPO4 · 3H2O 40 MgSO4 · 7H2O 75 CaCl2 · 2H2O 36 Ácido Cítrico 6 Citrato Amónico-Férrico 6 EDTA 1 Na2CO3 20 H3O3 2,860 MnCl2 · 4 H2O 1,810 ZnSO4 · 7 H2O 0,222 NaMoO4 · 5 H2O 0,390 CuSO4 · 5 H2O 0,079 Co(NO3)2 · 6 H2O 0,049 Los cultivos en medio líquido se realizaron en frascos de Roux de 1 l, situados en cámaras termostatizadas a 30 ºC y con una iluminación continua de 75 µE·s–1·m–2. Los cultivos se realizaron en presencia de 10 mM de NaHCO3 y se burbujearon con aire suplementado con un 1 % (v/v) de CO2 (BG11C o BG110C en caso de cultivos burbujeados con aire y sin fuente de nitrógeno combinado). Para cultivos con agar en cajas de Petri, se añadió Bacto-Agar (Difco) al 1 % (p/v), esterilizado en autoclave separadamente de los nutrientes y mezclado con los mismos justo antes de verter el medio en las cajas. Los cultivos se incubaban a 30 ºC con iluminación continua de 75 µE·s–1·m–2. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 55 Cuando se requirió la adición de antibióticos para la selección de estirpes mutadas, estos se adicionaron a las siguientes concentraciones finales: estreptomicina (Sm) a 5 µg/ml, espectinomicina (Sp) a 5 µg/ml y neomicina (Nm) a 25 µg/ml. Para la selección de dobles recombinantes, y como control de la integridad del gen sacB, los medios se suplementaron con sacarosa al 5 % (p/v). Los antibióticos y la sacarosa se esterilizaron por filtración con membranas de nitrocelulosa de 0,22 µm de diámetro. Las células de Nostoc se recogieron por filtración, a temperatura ambiente, utilizando filtros de celulosa de 0,45 µm de diámetro de poro (Millipore). Cuando, por razones experimentales, se requería transferir las células a un medio con una fuente de nitrógeno diferente, tras ser recogidas por filtración se lavaron dos veces con medio BG110. Las células recogidas por filtración se lavaban en el filtro con 50-100 ml de medio. Las células para la extracción de RNA se recogían mediante filtración, se lavaban en el mismo filtro con 4 ml de tampón TE y se transfirieron luego a tubos de microcentrífuga, donde se centrifugaron a 13 000 r.p.m. durante 1 min. Posteriormente se congeló el sedimento en nitrógeno líquido y se conservó a –20 ºC. 3.1.2. Escherichia coli Las estirpes de Escherichia coli que se utilizaron en este trabajo y sus genotipos se describen en la siguiente Tabla 3. Como medio de cultivo habitual se utilizó el de Luria-Bertani (LB) [Green y Sambrook, 2012], cuya composición se describe en la Tabla 4. Para preparar agar-LB se añadió agar bacteriológico a una concentración final de 15 g/l. Para la producción de citocromos, el medio se suplementó con 6 mg/l de Citrato-NH4-Fe, mientras que para la producción de plastocianinas se ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 62 las instrucciones del fabricante. El DNA se eluyó de la columna utilizando un volumen de 40 µl de agua desionizada. 3.2.5. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 3.2.5.1. PCR Las PCR se realizaron en un termociclador Mastercycler (Biometra). La reacción contenía, en un volumen total de 50 µl, 10 µl de tampón de la polimerasa, 0,2 mM de cada deoxinucleótido trifosforado, 0,2 pmoles de cada oligonucleótido utilizado como cebador (Tabla 7), 1,5 ng de DNA molde y 1,25 U de GoTaq polimerasa (Go Taq Flexi® DNA Polymerase, Promega). El programa de amplificación utilizado fue el siguiente: 2 min a 95 ºC, seguido de 30 ciclos de 30 s de desnaturalización a 95 ºC, 30 s de renaturalización a temperatura variable y dependiente de la temperatura de alineamiento de los oligonucleótidos utilizados y 1 min de extensión a 72 ºC (el tiempo de extensión podía aumentar en función del tamaño del fragmento a amplificar). El resultado de la PCR se analizó en geles de agarosa de concentración variable, dependiendo del tamaño de la banda esperada. La separación de fragmentos de DNA se llevó a cabo como se describe en el apartado 3.2.4.2. 3.2.5.2. PCR de colonia En el caso de las PCR de colonias se usó el mismo termociclador y la misma enzima, pero en este caso la reacción se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl y el tampón de reacción contenía 10 mM de Tris-HCl pH 8,3; 1,5 mM de MgCl2; 40 mM de KCl; 0,16 mM de cada deoxinucleótido trifosfofato; 0,5 pmoles de cada oligonucleótido y 0,05 U de polimerasa Taq (Go Taq® Flexi DNA Polymerase, Promega). Como molde se usó la biomasa de una colonia de ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 63 E. coli aislada de una caja de Petri, disuelta en H2O. Los oligonucleótidos utilizados fueron los específicos para cada gen, a 500 nM de concentración final. El programa de amplificación utilizado fue el siguiente: 5 min a 95 ºC, 5 min a 52 ºC y 45 s a 72 ºC, seguido de 25 ciclos de 30 s de desnaturalización a 95 ºC, 45 s de renaturalización a 55 ºC y 2 min de extensión a 72 ºC. El resultado de la PCR se analizó en geles con concentración variable de agarosa, dependiendo del tamaño de la banda esperada. 3.2.6. Retrotranscripción (RT) La síntesis de cDNA se realizó con 1 µg de RNA total usando el QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.2.7. PCR cuantitativa (qPCR) La PCR cuantitativa en tiempo real se llevó a cabo usando el SensiFAST SYBR & Fluorescein kit (BIOLINE) y el sistema IQ5 Real-Time PCR detection system (BioRad) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó el siguiente perfil térmico estándar: 3 min a 95 ºC, seguidos de 40 ciclos de 10 s a 95 ºC y 30 s a 60 ºC. Los oligonucleótidos usados para los análisis de qPCR (Tabla 7) fueron comprobados previamente en una RT-PCR, para comprobar que la amplificación del gen era la correcta. 3.2.8. Diseño racional de genes sintéticos Para el diseño racional de genes sintéticos se utilizó la herramienta DNA Works [Hoover y Lubkowski, 2002]. Se mejoró el uso de codones para E. coli y se introdujeron dianas de restricción para el posterior subclonado. Posteriormente, ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 64 la síntesis se encargó al servicio de genes sintéticos de la empresa GeneCust (Distribio). Tabla 7. Lista de oligonucleótidos utilizados en este trabajo. Nombre Secuencia (5ʼ à 3ʼ) C63-D GCATAAGTTGCTAGAG C63-R GCTACACGAATTAGCTTG AnaCMD AACTTTTACAGGACACCTTATGGA AnaCMR TAAAATATGAATTCCTGATGTAAAAACC PC-D TAAAATGAATTCAGAAAAATAAAAC Adaptámero CM AGCCGATGCAGAAGGTGTATGAAAGGAGACCCAATA GFP C63-F PROM TTTTAGCCATAAGCTTTTTAGTGCC GFP C63-R PROM ATGGATATCAATTATTCTCAAAGCATTTTC GFP C6-F TTAAGCTTCATGCTGTAACTGGC GFP C6-R CCGGGCTAGCGCCGCCGCCGCCCTTCCAATCTGCATC GFP C62-F CCATCAATTTGAAGCTTGCAGTCTTTGCA GFP C62-R AAGCAAGGTCTCACGCCACGCCAGCCTT GFP C63-F TGCGGCAAGCTTGCGACGCTTAA GFP C63-R AAGCAAGGTCTCACGCCACCCTCTTTTTCCA QPCR C6-F CAGCAGACAGTGTAATGGAG QPCR C6-R CTTGAACCAAATTCTTGCCACC QPCR C63-F CCGAACTACCAACTGGAGCA QPCR C63-R ATTACCACCGCCTATGTGGC QPCR PC-F AAACTAGGTAGCGATAAAGGACTG QPCR PC-R AAATTCAACCGTGTCACCTG QPCR RNPB-F GGGCGATTATCTATCTGGGAC QPCR RNPB-R TTACCAGTTCCGCTATCAGAG 3.2.9. Manipulación enzimática del DNA 3.2.9.1. Restricción de DNA Las endonucleasas de restricción empleadas fueron suministradas por Amersham (Reino Unido), Roche (Alemania) o Takara (Francia) y se utilizaron ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 65 según las instrucciones de cada fabricante. Se utilizó 1 µg de DNA por cada 1 U de endonucleasa utilizada. 3.2.9.2. Clonación de fragmentos de DNA Los fragmentos de DNA, amplificados por PCR, se clonaron en el vector pGEM-T (Promega). La reacción se llevó a cabo durante 16 h a 4 ºC en un volumen final de 10 µl, en presencia de 30 mM de Tris-HCl pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 3 U de ligasa de DNA del fago T4 (Promega) y 25 ng del vector, siguiendo un ratio de inserto:vector de 3:1. Los clones positivos se detectaron en cajas de LB con ampicilina (100 µg/ml) suplementadas con 0,2 µM de X-Gal y 16 µM de IPTG y se seleccionaron colonias blancas para su análisis. Para la construcción de los vectores de expresión de los Cit c6-2 y cM se utilizó el vector multifuncional pBluescript II (SK+) (Stratagene) [Alting-Mees et al., 1989, 1992], en el cual se subclonaron los fragmentos de DNA clonados previamente en el vector pGEM-T, utilizando sitios de restricción únicos presentes en pGEM-T, pBluescript II (SK+) y en los genes amplificados. Para una mayor eficiencia en la ligación, se utilizó una relación aproximada de 3:1 (molar) inserto:vector. La mezcla de reacción y el método empleado para la ligación fueron los mismos que se utilizaron para la ligación de productos de PCR en pGEM-T. 3.2.9.3. Secuenciación del DNA Las secuenciaciones de DNA se llevaron a cabo en el servicio de secuenciación de la empresa Secugen (Madrid). ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 66 3.3. Métodos de transformación genética 3.3.1. Transformación de E. coli 3.3.1.1. Transformación de E. coli mediante choque térmico Las células competentes para la transformación por choque térmico fueron suministradas por el Servicio de Cultivos Biológicos del cicCartuja, preparadas siguiendo el método de Hanahan [1983]. Para realizar la transformación se mezclaron 40 ng del DNA transformante (hasta un máximo de 10 µl) con 100 µl de células competentes y se incubó en hielo durante 30 min. A continuación se sometió a un choque térmico de 2 min a 42 ºC y posterior enfriamiento en hielo durante 5 min. Tras esto se añadió 1 ml de caldo LB y se incubó a 37 ºC durante 1 h. Finalmente, las células fueron sembradas en cajas de Petri con agar-LB y el antibiótico adecuado para la selección de los transformantes. 3.3.1.2. Transformación de E. coli mediante electroporación Las células electroporables fueron suministradas por el Servicio de Cultivos Biológicos del cicCartuja, preparadas siguiendo el protocolo del fabricante del electroporador Micro Pulser (BioRad). La electroporación se realizó conforme a las instrucciones del fabricante del electroporador utilizado. Se mezclaron 40 ng del DNA transformante (hasta un máximo de 10 µl) con 50 µl de células electroporables y se incubó en hielo durante 1 min. A continuación, la solución se pasó a una cubeta de electroporación (EP-102, Cell Projects) de 2 mm y se le aplicó una diferencia de potencial de 2500 V durante 5 ms, tras lo cual se añadió 1 ml de caldo-LB y se incubó a 37 ºC durante 1 h. Finalmente, las células se sembraron en cajas de Petri con agar-LB suplementado con el antibiótico adecuado para la selección de transformantes. ! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 67 3.3.2. Conjugación en Nostoc La conjugación se llevó a cabo según el protocolo descrito por Elhai y Wolk [1988]. Se utilizó la estirpe de E. coli ED8654, que contiene el plásmido pRL443, el cual confiere la habilidad para formar los pili necesarios para la conjugación, junto con la estirpe de E. coli HB101, una estirpe que lleva el plásmido “cargo” (nuestro plásmido con la construcción de interés) y el plásmido “helper” pRL623. El plásmido pRL623 contiene los genes que codifican para las metilasas para los sitios de restricción AvaI, AvaII y AvaIII [Elhai et al., 1997], para proteger el plásmido cargo de la digestión por endonucleasas de la cianobacteria, así como el gen mob. En un segundo paso, ambos plásmidos se transfieren a Nostoc. El proceso de la conjugación consistió en lo siguiente: 250 µl de un cultivo en fase estacionaria de E. coli ED8654 y 350 µl de un cultivo en fase estacionaria de E. coli HB101 se reinocularon en 10 ml de Caldo-LB con los antibióticos pertinentes, y se incubó a 37 ºC en agitación durante 2,5 h. Las células en fase exponencial de crecimiento se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con caldo-LB para retirar los antibióticos y ambos cultivos se mezclaron hasta un volumen final de 300-500 µl. Esta mezcla se incubó durante 2 h sin agitación a 30 ºC. Posteriormente, un cultivo de Nostoc que contenía 10 µg/ml de clorofila a (Chla) se añadió a la mezcla de E. coli. La nueva mezcla de las dos E. coli y la cianobacteria se distribuyó en un filtro de nitrocelulosa (Millipore) y se dispuso en una placa de Petri con agar-BG11 al que se le añadió un 5 % (v/v) de LB. La placa de Petri se incubó a 30 ºC con luz continua (10 µE·s–1·m–2) durante al menos 3 h, para luego pasar a la intensidad de luz estándar (20 µE·s–1·m–2) durante toda la noche. Al día siguiente, el filtro se transfirió a una nueva placa de Petri con BG11 y se incubó durante un día a 30 ºC con luz continua estándar. Posteriormente, el filtro se transfirió a una placa con medio BG11 suplementada con antibióticos y se incubó igual que el día anterior. Esta última incubación se realizo de 2 a 15 días, cambiando el filtro a una placa con medio BG11 suplementada con antibióticos cada 3 días, hasta ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 68 que en el filtro aparecieron colonias resistentes a antibióticos que fueron transferidas a placas con medio BG11 y antibióticos. 3.4. Purificación de membranas y metaloproteínas 3.4.1. Preparación de membranas enriquecidas en oxidasas terminales Para la obtención de membranas enriquecidas en oxidasas terminales de Nostoc se siguió el protocolo de Schmetterer y colaboradores [2001]. Para ello, se partió de 800 ml de cultivos de Nostoc con una densidad celular de 3-6 µg de Chla·ml–1. Después de recolectar las células por filtración, se resuspendieron en 10 ml de una solución que contenía 10 mM de HEPES pH 7,4; 5 mM de NaCl; sacarosa al 20 % (p/v) y 10 mg de lisozima. La mezcla se incubó a 37 ºC durante 30 min. Posteriormente se centrifugó a 12 000 ×g durante 5 min y se resuspendió en 6 ml de la misma solución por cada gramo de peso húmedo, y se incubó en hielo durante 1 h. Una vez incubada, se añadió 1 mM de PMSF y DNasa I al 0,005 % (p/v), y se sometió a rotura mecánica pasándola tres veces por una Prensa de French a 11 000 PSI de presión. Luego se centrifugó a 0 ºC y 12 000 ×g durante 10 min. A partir de este punto, dependiendo de la fuente de nitrógeno del cultivo, hubo variaciones en el protocolo. Cuando la fuente de nitrógeno utilizada fue nitrógeno atmosférico, el sobrenadante de esta centrifugación contenía muy poca cantidad de membranas, por lo que el sedimento se utilizó directamente en el siguiente paso. En el caso de células cultivadas en BG11, el sobrenadante se ultracentrifugó a 40 000 r.p.m. (en un rotor SW41Ti) a 4 ºC durante 50 min y se descartó el sobrenadante. En ambos casos, los correspondientes sedimentos se resuspendieron en 10 mM de HEPES pH 7,4; 5 mM de NaCl; sacarosa al 20 % (p/v) a 4 ºC y se homogeneizaron en un Potter y diluyeron hasta una concentración de proteína de entre 3-5 mg/ml. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 69 3.4.2. Preparación de membranas enriquecidas en PS I Las partículas de PS I de Nostoc se obtuvieron mediante solubilización con ß-dodecilmaltósido según el protocolo descrito por Rögner [1990], con pequeñas modificaciones [Hervás et al., 1994]. Todo el proceso se realizó en una cámara termostatizada a 4 ºC y a baja intensidad de luz. Tras la sedimentación mediante centrifugación a 14 000 ×g durante 20 min las células procedentes de 10 l de cultivo se lavaron, resuspendiéndolas en 100 ml de tampón A (20 mM de MES, pH 6,5; 10 mM de CaCl2 y 10 mM de MgCl2) y se sedimentaron de nuevo. El sedimento de células resultante se resuspendió en 100 ml de tampón C (tampón A + 1 M de sacarosa) y se incubó a 4 ºC y con agitación suave en oscuridad durante 1 h. Las células se sedimentaron nuevamente y se volvieron a resuspender en 100 ml de tampón C suplementado con 1 mg/ml de lisozima, incubándose a 30 ºC con agitación suave y en oscuridad durante 1 h. Después se añadieron inhibidores de proteasas (14 mg de PMSF, 13 mg de benzamidina y 11 mg de ácido ε-aminocaproico), una punta de espátula de DNasa y 10 ml de perlas de vidrio de 0,2 mm de diámetro. Las células se rompieron en un Omnimixer (Sorvall) mediante 10 ciclos de 30 s de agitación a la máxima potencia con dos min de enfriamiento en hielo. Las perlas de vidrio se separaron por filtrado en vacío en un embudo Buchner al que se le había colocado un organdí de nailon. La suspensión se centrifugó a 1500 ×g y a 4 ºC durante 6 min para eliminar las células que no se habían roto. El sobrenadante se centrifugó a 125 000 ×g y a 4 ºC durante 30 min para sedimentar las membranas tilacoidales. El sedimento se resuspendió en 10 ml de tampón D (tampón B + glicerol al 20 % (p/v) e inhibidores de proteasas, siendo el tampón B: tampón A + 0,5 M de manitol) y se ajustó la concentración de Chla a 2 mg/ml. Dicha suspensión se almacenó a –80 ºC para procesarla con posterioridad. Para la extracción de PS I se partió de una cantidad de membranas tilacoidales correspondiente a unos 20 mg de Chla. Las membranas se descongelaron y se diluyeron con tampón D hasta una concentración de 1 mg de Chla por ml y se les añadió ß-dodecilmaltósido hasta una concentración final del 0,1 % (p/v). Dicha mezcla se incubó a 4 ºC ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 70 con agitación suave y en oscuridad durante 10 min, centrifugándose a 184 000 ×g y a 4 ºC durante 30 min. El sedimento se resuspendió en tampón D + ß-dodecilmaltósido al 1 % (p/v), ajustando la concentración de Chla a 1 mg/ml. La suspensión se incubó a 4 ºC, en oscuridad y con agitación suave, durante 30 min y se centrifugó a 184 000 ×g y a 4 ºC durante 90 min. El sobrenadante se mezcló con un volumen igual de tampón A + 0,25 M de manitol y se cargó en 6 tubos de gradiente discontinuo de sacarosa (7,5 ml) de las siguientes concentraciones de sacarosa en % (p/v): 8, 14, 32 y 40, en tampón B con ß-dodecilmaltósido al 0,03 % (p/v). Se añadieron aproximadamente 6 ml de la suspensión a cada tubo. Dicho gradiente se centrifugó a 150 000 ×g y a 4 ºC durante 18 h. Se recogió la banda verde inferior, que se lavó y concentró en un sistema Amicon con membranas con un tamaño de poro de 100 kDa. Para el lavado se utilizó tampón Tricina-KOH 20 mM, pH 7,5 + ß-dodecilmaltósido al 0,03 % (p/v). Finalmente se estimaron las concentraciones de clorofila y de P700 (Apartado 3.5.5.), se dividió la preparación en alícuotas y se almacenó a -80 ºC. El rendimiento final fue de ~3 mg totales de Chla, con una relación Chla/P700 de entre 130/1 y 150/1. 3.4.3. Expresión y purificación de las metaloproteínas recombinantes de Nostoc en E. coli Los medios y las condiciones de cultivo se describen en el apartado 3.1.2. Las estirpes utilizadas se describen en la Tabla 8. Como paso común previo a las purificaciones de las metaloproteínas, se procedió con una recolección y rotura de las células. En cada caso, cuando el cultivo alcanzó una dispersión de luz a 600 nm de entre 1,6 y 1,8, las células se sedimentaron por centrifugación a 9000 ×g durante 10 min. Se desechó el sobrenadante y el sedimento se congeló en nitrógeno líquido para extraer el periplasma. La pasta celular se descongeló y se volvió a repetir el ciclo de congelación/descongelación. Posteriormente, se resuspendió en 4 ml de agua ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 71 desionizada y se centrifugó a 12 000 ×g durante 5 min, desechándose el sedimento. Posteriormente, el sobrenadante, que contenía la proteína en solución, se sometió a diferentes pasos de purificación, dependiendo de cada proteína. Tabla 8. Estirpes de E. coli utilizadas para la producción de las distintas metaloproteínas. Proteína Estirpe utilizada Citocromo c6 MC1061 Citocromo c6-2 JM109 Citocromo c6-3 MC1061 Citocromo cM JM109 Citocromo f BL21 Plastocianina MC1061 3.4.4. Expresión y purificación del citocromo c6 La producción y expresión de la proteína se realizó según lo descrito en el apartado 3.1.2. Se utilizó el vector de expresión pEAC-WT [Molina-Heredia et al., 1998] añadiendo, además, el vector pEC86 [Arslan et al., 1998] para la mejora en la producción de citocromos. Este plásmido sobreexpresa de forma constitutiva el locus ccm de E. coli, implicado en la maduración de citocromos de tipo c [Arslan et al., 1998]. Posteriormente, se recogió el cultivo en fase exponencial y se procedió a realizar una primera rotura (Apartado 3.4.3.). El sobrenadante se dializó exhaustivamente frente a 5 mM de tampón fosfato potásico, pH 7,0. Tras esto, la solución se sometió a una cromatografía de intercambio catiónico en una columna (2,5 × 60 cm, 100 ml, GE Healthcare) con una matriz CM-Cellulose (GE Healthcare). La elución se realizó aplicando un gradiente lineal de 0 a 400 mM de NaCl. Las cromatografías se llevaron a ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 78 tinción con Rojo Ponceau al 0,2 % (Amresco) de la membrana. Una vez terminada la transferencia, la membrana se incubó durante al menos 2 h con solución de bloqueo, consistente en leche semidesnatada en polvo (Central Lechera Asturiana) al 5 % (p/v) y Tween 20 al 0,1 % (v/v) en tampón PBS. A continuación se incubó la membrana con el anticuerpo primario anti-GFP (Santa Cruz Biotechnolgy) diluido 1:1000, en solución de bloqueo durante 16 h a 4 ºC y en agitación suave constante. La membrana se sometió a cuatro lavados de 15 min en una solución compuesta por tampón PBS suplementado con Tween 20 al 0,1 % (v/v) y se incubó posteriormente con una solución de anticuerpo (inmunoglobulina G) de cabra anti-inmunoglobulina G de conejo, conjugado con la peroxidasa de rábano (Sigma) diluido 1:5000 en solución de bloqueo, durante 1 h a temperatura ambiente y en agitación constante. Seguidamente la membrana se sometió de nuevo a cuatro lavados de 15 min en la solución de lavado. La presencia de proteínas se detectó mediante la actividad peroxidasa conjugada en el anticuerpo secundario, utilizando el kit Inmobilon® Western (Millipore) según las instrucciones del fabricante. 3.5.5. Determinación de la concentración de clorofila y de PS I de Nostoc en solución La concentración de Chla se determinó según el método de Mackinney [1941]. Para ello, 1 ml de cultivo se centrifugó a 12 000 ×g durante 5 min, se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 1 ml de metanol. Esta solución se agitó en vórtex durante 1 min y se volvió a centrifugar a 12 000 ×g durante 5 min. Posteriormente, la densidad óptica se midió a 665 nm utilizando como coeficiente de extinción: ε=74,46 mg–1·ml·cm–1. La concentración de clorofila de las preparaciones de membranas enriquecidas en PS I se determinó mediante la extracción de pigmentos con acetona y medida de la absorbencia a 652 nm según el método descrito por Arnon [1949]. Se diluyó 50 μl de suspensión de membranas en 1,5 ml de acetona al 80 % ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 79 (v/v), se homogeneizó agitando vigorosamente y se centrifugó a 13 000 ×g y a temperatura ambiente durante 5 min. A continuación se midió la absorbancia del sobrenadante a 652 nm y se calculó la concentración de clorofila utilizando un coeficiente de extinción de 34,5 mg·cm–1. La pureza de las preparaciones de PS I viene dada por la relación Chla/P700. El contenido en P700 de las muestras de PS I se calculó a partir de los cambios fotoinducidos de absorbancia a 820 nm, medidos mediante espectroscopia de excitación por láser (Apartado 3.3.7.), utilizando un coeficiente de absorción de 6,5 mM–1·cm–1 [Mathis y Sétif,1981]. 3.5.6. Espectro, concentración y pureza de las metaloproteínas Para la detección de las fracciones que contenían la metaloproteína durante su purificación, así como para la determinación de su grado de pureza y concentración, se midió la absorción de luz de éstas en solución utilizando un espectrofotómetro Jasco V-650 (Jasco). Los espectros de absorción de los citocromos se realizaron entre 250 y 650 nm y los de la Pc entre 250 y 750 nm. La pureza de las preparaciones de metaloproteínas se determinó por la relación entre la absorbancia a 275 (longitud de onda a la cual absorben los residuos de tirosina) y la banda de máximo de absorbancia de la proteína (en el estado reducido en los Cit y oxidado en la Pc). Los datos sobre la relación de pureza y picos de máxima absorción se encuentran en la Tabla 9. Tabla 9. Máximos de absorción en la banda α y la relación de pureza obtenida para los citocromos y la plastocianina estudiados. Proteína Máximo de absorbancia en la banda α r Referencia Cit c6 553 1,00 Molina-Heredia et al., 1998; 1999 Cit c6-2 553 1,50 Reyes-Sosa et al., 2011 Cit f 556 2,75 Albarrán et al., 2005 Pc 598 1,20 Molina-Heredia et al., 1998; 1999 Cit c6-3 552 1,17 Este trabajo Cit cM 550 0,78 Este trabajo ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 80 3.5.7. Determinación del coeficiente de extinción milimolar de los citocromos c6-3 y cM Para la determinación del coeficiente de extinción de las hemoproteínas se utilizó el método del piridín-hemocromo [Berry, 1987]. La concentración de los reactivos fue de 40 μM de Cit, 200 mM de NaOH, piridina al 40 % (p/v) y 0,1 M de ferricianuro potásico. A su vez, se midió el espectro diferencial ditionito– ferricianuro, para la cuantificación diferencial reducción–oxidación, en un espectrofotómetro V-650 (Jasco) tras la reducción con cristales de ditionito sódico y se determinó el coeficiente de extinción del citocromo utilizando un valor de 24,04 mM–1·cm–1 para el piridín-hemocromo. 3.5.8. Determinación del punto isoeléctrico de las metaloproteínas La determinación del punto isoeléctrico de las metaloproteínas de Nostoc expresadas en E. coli se realizó según el método descrito por Robertson y colaboradores [1987], en un soporte Mini-Protean II (BioRad). El gel contenía acrilamida/bisacrilamida al 5 % (p/v), glicerol al 9 % (p/v) y anfolito Biolite 5-7 (BioRad) al 1 % (v/v). Las muestras contenían 40 μg de proteína total y se prepararon en un tampón de carga que contenía el mismo anfolito al 2 % (v/v) y glicerol al 60 % (p/v). La electroforesis se llevó a cabo a 4 ºC y a 150 V durante 3 h. Tras la electroforesis, las proteínas se tiñeron y posteriormente destiñeron según lo descrito en el apartado 3.5.3. 3.5.9. Potenciometría rédox Las titulaciones rédox de los citocromos se realizaron en anaerobiosis siguiendo el método descrito por Dutton y Wilson [1974], con pequeñas modificaciones [Ortega et al., 1988; Molina-Heredia et al., 1998]. Se preparó una cubeta que contenía 10 μM de ferricianuro potásico y 20 μM de cada uno ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 81 de los siguientes mediadores: benzoquinona (Em,7 = +293 mV), diaminodurol (Em,7 = +240 mV) y menadiona (Em,7 = +422 mV), en un volumen final de 2,5 ml. La mezcla de reacción se sometió a agitación y gaseo mediante burbujeo con argón para asegurar la anaerobiosis. Posteriormente se añadieron 10 μM de la proteína en 50 mM de fosfato pH 7,0 y se midieron los cambios de absorbancia en la banda α de cada Cit (en el entorno de los 550 nm) menos la absorbancia a 570 nm, tras la adición sucesiva de pequeñas cantidades de ditionito sódico (50 mg/ml) preparado en el mismo tampón de ensayo, a la vez que se medían los cambios en el potencial rédox. El potencial rédox se midió con un electrodo de Pt-Ag/AgCl MI-800 (Microelectrodes Inc.) de 4 mm de diámetro, calibrado previamente con una solución saturada de quinhidrona (Em,7 = +280 mV) a 20 ºC y se registró en un potenciómetro digital Metrohm modelo 654. Los cambios de absorbancia se midieron en un espectrofotómetro de diodos UV/Vis Hewlett–Packard 8452A. Los datos se ajustaron a la ecuación de Nernst para 1e–. En la Figura 6 se puede ver el esquema del montaje del sistema. ! Figura 6. Esquema del sistema de medida utilizado para la determinación de los potenciales rédox. ! ! ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 82 3.5.10. Determinación de la tasa de consumo de O2 Para la medida del consumo de oxígeno se utilizó un electrodo de oxígeno tipo Clark, modelo Oxygraph (Hansatech), con cátodo de platino y ánodo de Ag-AgCl. Las medidas se realizaron según Yu y colaboradores [2009] con ligeras modificaciones, a 25 ºC de temperatura y en oscuridad. Para la determinación de la actividad citocromo c oxidasa (Cox) la mezcla de reacción contenía, en un volumen final de 1 ml, 5 mM de tampón HEPES pH 7,5; 2,5 mM de NaCl, 2 mM de ascorbato sódico y una cantidad de membranas enriquecidas en oxidasas (Apartado 3.4.1) de entre 3-5 mg/ml, así como 20 µM de cada proteína ensayada. Los resultados se analizaron mediante el programa informático Oxygraph acoplado al sistema. A partir de la representación de la concentración de oxígeno disuelto en la muestra a lo largo del tiempo se calcularon las tasas de consumo de oxígeno. 3.5.11. Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) Los experimentos de ITC se realizaron en el Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos, en colaboración con el Dr. Adrián Velázquez Campoy, en un Auto-ITC200 (Microcal, GE Healthcare). La mezcla de reacción contenía 5 mM de tampón fosfato pH 7,5 suplementado con Triton X-100 al 0,02 % (p/v). Las determinaciones se realizaron a 25 ºC y una agitación de 1000 r.p.m. La célula de referencia contenía agua destilada. Los experimentos se llevaron a cabo mediante adiciones sucesivas (2 µl) de las soluciones de metaloproteínas (400 µM) a la célula que contenía el Cit f concentrado (40 µM). Todas las soluciones se desgasearon previamente. Las adiciones se hicieron a intervalos de tiempo concretos para evitar un efecto aditivo del calor generado por la propia inyección de muestra. Los datos sobre los controles del experimento fueron directamente sustraídos de los valores medidos para cada caso. La normalización del calor de inyección, como función de la tasa molar, fue analizado con Origin 6 (OriginLab). En todos los casos, el calor desprendido ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 83 durante la titulación correspondía a una estequiometría de asociación de 1:1. Se determinaron los valores de la constante de asociación (KA), así como de la constante de disociación (KD), de la entalpía de unión (∆H), de la energía libre de Gibbs (∆G) y de la entropía (∆S). Los errores estimados para cada determinación fueron del 15 % para la constante de equilibrio, del 5 % para la entalpía de unión y de la entropía, y del 2 % para la Energía libre de Gibbs de Unión. 3.5.12. Determinación del peso molecular por MALDI-TOF El peso molecular de las metaloproteínas se determinó por el Servicio de Proteómica del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis mediante análisis MALDI-TOF (Bruker-Daltonics, Alemania). Para ello, se le proporcionó al servicio 5 µl de proteína pura a una concentración de 1 mM en tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5. 3.5.13. Secuenciación del extremo N-terminal Para la secuenciación del extremo amino terminal se preparó una muestra que contenía 50 µg de proteína en 200 μl de tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5. La secuenciación se realizó en el Servicio de Química de Proteínas del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC en Madrid. 3.6. Cristalografía de rayos-X La cristalografía de rayos-X se llevó a cabo en el Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos en colaboración con la Dra. Marta Martínez Júlvez. ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 84 3.7. Espectrofotometría cinética inducida por láser La funcionalidad de las metaloproteínas se analizó midiendo su reactividad hacia el PS I de Nostoc. El PS I excitado con un corto pulso de luz láser reduce a un aceptor de electrones exógeno (el metilviológeno en las condiciones experimentales de este trabajo), quedando el P700 oxidado y preparado para recibir un electrón del donador. La reducción del PS I por sus donadores puede seguirse midiendo los cambios de absorbancia a 820 nm, longitud de onda a la cual el dímero de clorofila P700 del PS I presenta un cambio de absorbancia específico según su estado rédox. Esta reacción se puede repetir cada pocos segundos en presencia de un reductor exógeno, como el ascorbato, que reduce a las metaloproteínas donadoras. El sistema utilizado (Figura 7) consta de un láser de Nd-YAG modelo INDI-HG (Spectra-Physics) a una longitud de onda 532 nm, en pulsos de 4 ns. El haz láser se atenuó con filtros neutros hasta conseguir justo la intensidad de luz de excitación saturante para evitar sobreexcitar el PS I a lo largo del experimento. La luz de análisis la proporcionó un diodo láser de 820 nm y 150 mW, modelo LQN830-150C (Newport). Tras atravesar la cubeta, la luz de análisis se recogió en un fotodiodo de silicio modelo SM1PD1A (ThorLabs). El fotodiodo se protegió de la luz de excitación, de la luz difusa reflejada y de la luz de fluorescencia de la muestra mediante un filtro Oriel de vidrio de banda estrecha de 820 nm. La señal de salida del fotodiodo se amplificó mediante un amplificador de alta impedancia (Melles Griot 13AMP005) y se recogió en un osciloscopio digital Nicolet 450. El haz láser se sincronizó con el osciloscopio mediante un generador de pulsos integrado en el sistema láser, lo que permitía activar el osciloscopio justo antes del impacto del haz láser sobre la cubeta de ensayo. Todos los experimentos se realizaron a 22 ºC en una cubeta de 1 mm de paso de luz. La mezcla de reacción contenía: 20 mM de Tricina-KOH pH 7,5, ß dodecilmaltósido al 0,03 % (p/v), 0,1 mM de metilviológeno, 2 mM de ascorbato sódico y una cantidad de membranas enriquecidas en PS I equivalente a 0,3 mg/ml de clorofila, en un volumen final de 200 µl. En los ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 85 ensayos de concentración de proteína, la mezcla de reacción se suplementó con 10 mM de MgCl2 y con la proteína de interés a una concentración variable. En los ensayos de concentración de proteína a baja fuerza iónica no se añadió MgCl2. En los casos en los que se realizaron ensayos de concentración de NaCl y MgCl2 se utilizó una concentración de proteína de 100 µM. Figura 7. Fotografía y esquema del sistema de espectrofotometría cinética inducida por láser. Para el análisis de los datos cinéticos, se tomó un promedio de 6-8 medidas independientes con un intervalo de 30 s entre cada disparo del láser. Las constantes cinéticas determinadas en la mayoría de los experimentos tuvieron un error no superior al 10 % del valor absoluto, según la relación señal/ruido y la repetitividad de los datos. Los experimentos cinéticos se realizaron en condiciones de pseudo-primer orden, al estar la proteína donadora de electrones en exceso con respecto al PS I (>10:1). Los trazos cinéticos se analizaron como sumas de exponenciales para calcular las constantes de reacción, lo que permite analizar cinéticas multifásicas. Para esto se utilizó un ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! 86 programa informático (cedido por el Dr. P. Sétif, Saclay, Francia) basado en el método Marquardt. Los resultados se analizaron según los modelos cinéticos propuestos previamente por Hervás y colaboradores [1995]. En el caso de Nostoc se pueden así estimar valores para la constante bimolecular de segundo orden de la reacción (kbim), para la constante bimolecular extrapolada a fuerza iónica infinita (kinf) y para la constante de primer orden de transferencia electrónica (kET). 3.8. Técnicas Microscópicas Los análisis mediante microscopía se realizaron en los equipos disponibles en el Servicio de Microscopía del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. 3.8.1. Microscopía óptica Los cultivos de Nostoc se visualizaron utilizando un microscopio Olympus BX60 (Olympus) con un objetivo UplanFI 40×/0,75Ph2 o con uno de mayor aumento, el UplanFI 100×/1,30, con aceite de inmersión. 3.8.2. Microscopía confocal láser para la visualización de la GFP Las muestras se visualizaron utilizando un objetivo de inmersión HCX PLAM-APO 63× 1,4 NA en un microscopio Leica TCS SP2 (Leica Microsystems). Las muestras se excitaron a 488 nm usando un láser de argón. La fluorescencia fue monitorizada en un rango de 500-540 nm (para visualizar la GFP) o bien de 630-700 nm (para la autofluorescencia de la cianobacteria). La muestra se obtuvo de un cultivo de la cianobacteria en agar. A partir de dicha placa, se recortó un fragmento de agar que contuviese el microorganismo, para poder ver todas las células en el mismo plano. Las ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 87 imágenes se trataron con el software de imagen LAS AF Leica software (Leica Microsystems) así como con el software libre ImageJ. 3.8.3. Microscopía de fluorescencia 3.8.3.1. Visualización de la GFP Para visualizar las muestras se utilizó un microscopio Leica DM6000B (Leica Microsystems) con objetivos de 40× y 63×, unido a una cámara ORCA-ER (Hamamatsu). La fluorescencia de la GFP fue detectada utilizando un filtro FITC L5, con una ventana de excitación BP (band-pass) de 480/40 y una de emisión BP 572/30. La autofluorescencia fue detectada utilizando un filtro Texas Red TX2 con una ventana de excitación de BP 530/40 y una ventana de emisión de BP 645/75. Las imágenes fueron analizadas utilizando el software de imagen LAS AF Leica (Leica Microsystems) así como con el software libre ImageJ. 3.8.3.2. Inmunofluorescencia Para visualizar el Cit c6-3 mediante inmunofluorescencia, se partió de 1,5 ml de un cultivo líquido (2-3 µg de Chla·ml–1) de Nostoc. Se concentró hasta 100 µl y se dispuso en un portaobjetos pretratado con poly-L-Lisina (Sigma) y se cubrió con un filtro de 0,45 µm de tamaño de poro (Millipore). Posteriormente, el filtro se retiró y se dejó secar el portaobjetos, tras lo cual se incubó durante 3 h en etanol al 70 % a –20 ºC y se secó durante 20 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces (2 min cada vez) con tampón PBS-T (137 mM de NaCl; 2,7 mM de KCl; 5,5 mM de Na2HPO4; 1,8 mM de KH2PO4 y Tween 20 al 0,05 % (p/v)) y se trataron con tampón de bloqueo (PBS-T + 5 % (p/v) de leche semi-desnatada en polvo) durante 20 min, seguido de una incubación durante 90 min con el anticuerpo primario 6× Anti-His rabbit (Sigma) diluido 1:500 veces ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 94 Figura 9. Plásmido pEAC63 para la expresión del citocromo c6-3. El plásmido original es el pBluescript II SK (+) con la inserción de la región codificante para el gen petJ-3 (rosa). Lo primero que se observó fue que, al igual que en los Cit c6 y c6-2, el Cit c6-3 posee un péptido de tránsito de 25 aminoácidos que podría ser capaz de enviar la proteína hacia el espacio periplásmico o al lumen tilacoidal. Este péptido sería muy similar al del sistema de transporte tipo Sec, que transloca la proteína hacia dicho espacio, donde se pliega. El péptido de tránsito contiene tres regiones bien definidas: una región N-terminal con carga neta positiva, una región central hidrófoba y una región C-terminal que posee un motivo conservado AXA para el procesado por medio de peptidasas. La localización subcelular del Cit c6-3 es un punto clave en el establecimiento de la función, por lo que la presencia de un péptido de tránsito muy similar al del Cit c6 sugiere una localización celular similar a éste (Figura 12). Origen f1! Gen reportero lacZ! Marcador Ampicilina! Promotor Ampicilina! Promotor lac! Promotor T3! Origen pBR322! Gen petJ-3! pEAC63! 3413pb! ! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 95 Figura 10. Secuencia de la ORF del gen petJ-3 de Nostoc sp. PCC 7119 y de la proteína citocromo c6-3. En verde se señala el péptido de tránsito; en azul, la secuencia codificante de la proteína; en rojo, el codón Stop. Figura 11. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los citocromos c6, c6-2 y c6-3, de Nostoc sp. PCC 7119. La flecha indica los péptidos de tránsito. Las regiones idénticas están sombreadas en rojo; las similares en rosa y las regiones diferentes en azul. Los residuos responsables del potencial de superficie del Cit c6 involucrados en las interacciones hidrófobas o electrostáticas con el PS I se encuentran señalados en cajas azules y verdes, respectivamente. El motivo de unión del grupo hemo se encuentra dentro de la caja negra. El rombo señala el residuo clave en la modulación del potencial rédox en este tipo de Cit. El triángulo señala a una tirosina muy conservada en los Cit c6-like, como el citocromo Cit c6-2, que no se encuentra conservado ni en el Cit c6 ni en el Cit c6-3. Los números de acceso de las secuencias en las bases de datos son los siguientes: Cit c6: AJ002361; Cit c6-2: AM949472 ; Cit c6-3: HG316543. TTG AGA ATA ATT TTA TTA CTA TTA TTT TTG GCG ATC GCT ATA TTT < 45! L R I I L L L L F L A I A I F ! AAA CTT ACA TTT ATC AGT CCA GCC CTA GCC GCC GAA CTA CCA ACT < 90! K L T F I S P A L A A E L P T ! GGA GCA AAA ATT TTT AAT AAT AAC TGC GCT TCC TGC CAC ATA GGC < 135! G A K I F N N N C A S C H I G ! GGT GGT AAT ATA CTT ATT TCT GAA AAA ACA CTC AAA AAA GAA GCA < 180! G G N I L I S E K T L K K E A ! TTA TTA AAG TAC CTG GAA GAT TAT GAG ACG AAC TCA ATC CAG GCC < 225! L L K Y L E D Y E T N S I Q A ! ATT ATC CAT CAG ATA CAG TAT GGC AAA AAC GCC ATG CCT GCT TTT < 270! I I H Q I Q Y G K N A M P A F ! AAA GAC AAA TTA AGT ACT GAA GAA ATT CTA GAA GTG GCT GCT TAT < 315! K D K L S T E E I L E V A A Y ! ATT TTT CAA AAA GCA GAA AAA GAC TGG TCA AAT CTG GAA AAA GAG < 360! I F Q K A E K D W S N L E K E ! GGT TAG < 366! G * ! Péptido de tránsito! Cit c6-3! Cit c6! Cit c6-2! Cit c6-3! Cit c6! Cit c6-2! -5!-10!-15!5!15!25! 45! 35! 65!85!75!95!55! ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 96 Figura 12. Predicción del péptido de tránsito del citocromo c6-3. Se observa que el péptido de tránsito (en rojo) aparece solo en los primeros 25 aminoácidos. El resto de la proteína se dispondría en una región no citoplásmica (azul). La predicción se realizó utilizando el servidor Phobius. Siguiendo el análisis de las secuencias (Figura 11), en la posición 54 (según la nomenclatura del Cit c6-3), encontramos una glutamina que se ha descrito como clave para establecimiento del potencial rédox [Worral et al., 2007]. La presencia de una glutamina en esta posición, en contraposición a la presencia de isoleucina como ocurre en el Cit c6-2, hace que el potencial rédox del citocromo sea hasta 100 mV más positivo [Worral et al., 2007]. El Cit c6-3 posee dicha glutamina, así como el Cit c6 (Em,7 = +335 mV) [Molina-Heredia et al., 1998], lo que sugiere un potencial rédox similar entre estas proteínas y diferenciado del Cit c6-2 (Em,7 = +200 mV) [Reyes-Sosa et al., 2011], en el que aparece isoleucina en dicha posición. Los Cit de tipo c poseen el grupo hemo unido covalentemente a la cadena polipeptídica a través del dominio consenso CXXCH, en el cual la histidina es uno de los dos ligandos axiales del hierro del grupo hemo. En el Cit c6-3, la secuencia completa es CASCH, idéntica a la del Cit c6. En el caso de los Cit c6-2 y cM, cuyos potenciales son muy inferiores al del Cit c6, la secuencia 0,8! 0,2! 0,4! 0,6! 1! 0! 20!60!40!80!100!120! Número de aminoácido! Probabilidad relativa! Péptido de tránsito! Región no citoplásmica! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 97 consenso es CAGCH. El Cit c6-3 presenta un 55 % y un 41 % de identidad, así como un 68 % y un 56 % de homología con los Cit c6 y c6-2, respectivamente. Sin embargo, el Cit c6-3 contiene dos regiones adicionales que no están presentes en los Cit c6 o c6-2 (Figuras 11 y 13). La primera de ellas constituye una elongación en una α-hélice central (LKYL) y la segunda se trata de una región C-terminal sin estructura secundaria definida (NLEKE). El Cit c6 interacciona con el PS I y con el Cit f a través de las mismas regiones de la proteína [Molina-Heredia et al., 1999; Crowley et al., 2002; Díaz-Moreno et al., 2005a]. La primera está constituida por una superficie hidrófoba, situada alrededor de la región por la cual el grupo hemo está expuesto al solvente, que proporciona una superficie de contacto para la transferencia de electrones. La segunda es una región con carga neta positiva, responsable de dirigir las interacciones electrostáticas a larga distancia con los complejos con los que reacciona. Figura 13. Predicción de la estructura secundaria del citocromo c6-3. Se observa que contiene cuatro hélices α (lazo verde) unidas entre sí por tres lazos. Las regiones rojas son predicciones con alta probabilidad de confianza, la gradación hacia el azul indica una menor confianza en la estructura modelada a partir de la secuencia. El recuadro rojo y el azul señalan dos inserciones no presentes en los otros citocromos c6 presentes en Nostoc sp. PCC 7119. La predicción se realizó utilizando el servidor Phyre2. Alto(9)!Bajo(0)! Desestructurada! α-hélice ! Lámina β! Grado de confianza! Secuencia! Grado de confianza! Grado de confianza! Estructura secundaria! Desestructurada! Secuencia! Grado de confianza! Grado de confianza! Estructura secundaria! Desestructurada! ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 98 El primer sitio se localiza, aproximadamente, entre los residuos 9 y 29 de la proteína madura y el segundo sitio entre el 57 y el 65 [Molina-Heredia et al., 1999; Crowley et al., 2002]. Los residuos de la superficie del Cit c6 implicados en la interacción con el PS I son: I9, S11, N13, L24, V25 y K29, en el sitio hidrófobo, y A57, M58, A60, F61, K62, R64, L56 y K66, en el sitio cargado [Díaz-Moreno et al., 2005a]. Como se observa en la Figura 11, estos residuos también están muy conservados tanto en el Cit c6-3 como en el Cit c6-2; de hecho, hay evidencia experimental de que el Cit c6-2 es capaz de interaccionar con el PS I, aunque con una eficiencia significativamente menor que el Cit c6 [Reyes-Sosa et al., 2011]. El hecho de que estas regiones estén conservadas sugiere la posibilidad de que el Cit c6-3 podría interaccionar con el Cit f y quizás también con el PS I. Además, en el Cit c6 aparece en la posición 64 (68 en el Cit c6-3) un residuo de arginina, estrictamente conservado, que es fundamental para la interacción eficiente con el PS I [Molina-Heredia et al., 1999; 2001]. Dicho residuo está presente en el Cit c6-2, el cual interacciona con el PS I [Reyes-Sosa et al., 2011], pero no se encuentra conservado en el Cit c6-3, lo que podría indicar que éste último lleva a cabo una función diferente a la del Cit c6, respecto a la interacción con el PS I. En cambio, la posición 61 (65 en el Cit c6-3) está ocupada por una fenilalanina (Figura 11). Se ha descrito que en los Cit c6 esa posición siempre está ocupada por fenilalanina o por triptófano (caso de los Cit c6A presentes en plantas y en algas verdes), en contraste con los Cit c6-2 en los que siempre aparece una tirosina [Bialek et al., 2008]. Para dilucidar el origen filogenético del Cit c6-3 se comparó su secuencia de aminoácidos con la de otros grupos de Cit monohemínicos de tipo c solubles, con coordinación axial His-Met, presentes en organismos fotosintéticos: Cit c6 (cianobacterias y cloroplastos de algas verdes), Cit c6-2 (cianobacterias), Cit c6A (cloroplastos de plantas y algas verdes), Cit cM (cianobacterias), Cit c2 (bacterias anoxigénicas) y Cit c respiratorio (mitocondrias de algas y plantas). Como se puede ver en la Figura 14, el Cit c6-3 constituye, por sí mismo, un clado diferente e independiente separado de otros Cit similares. Bialek y colaboradores [2008] describieron dos grupos bien definidos de Cit c6-2, a los ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 99 que denominaron Cit c6B y c6C, que no aparecen de forma simultánea en una misma cianobacteria. Mientras que el Cit c6-2 de Nostoc pertenece al grupo de los Cit c6C, como se ha mencionado antes, el Cit c6-3 constituye un nuevo grupo de Cit de tipo c, no descrito hasta ahora, que sólo aparece en cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos. Figura 14. Árbol filogenético de los diferentes citocromos de tipo c solubles, con coordinación Histidina-Metionina, presentes en organismos fotosintéticos. El árbol se diseñó siguiendo el algoritmo de máxima verosimilitud usando el software PROTML (MOLPHY) [Adachi y Hasegawa, 1992]. Se alinearon las siguientes secuencias: Cit c6-3 (c6-3) de Anabaena cylindrica PCC 7122 (GenBank gi 440681468), Bradyrhizobium Nostoc sp. PCC 7107 Roseobacter Synechococcus Monoraphidium Cylindrospermopsis Raphidiopsis Rhodospirillum Gloeobacter Oryza Arthrospira Medicago Nostoc sp. PCC 7120 Calothrix sp. PCC 7507 Prochlorotrix Cylindrospermum Cyanobium Enteromorpha Arabidopsis Chlorella Nostoc punctiforme Chlamydomonas Cyanothece Nostoc sp. PCC 7119 Trichodesmium Fischerella Synechococcus Solanum Oryza Gloeobacter Rhodopseudomonas Prochlorococcus Aegilops Rhodobacter Chlamydomonas Nodularia Solanum Calothrix sp. PCC 6303 Lyngbya Chlamydomonas Synechocystis Nostoc sp. PCC 7119 Nostoc azollae Arabidopsis Synechococcus Anabaena cylindrica Nostoc sp. PCC 7119 Rhodovulum Hordeum Synechocystis Cladophora c6 c6A cM c c2 c6-2 c6-3 0.07 ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 100 Calothrix sp. PCC 6303 (GenBank gi 428297476), Calothrix sp. PCC 7507 (GenBank gi 427719567), Cylindrospermopsis raciborskii (GenBank gi WP_006276584.1), Cylindrospermum stagnale PCC 7417 (GenBank gi 434404902), Fischerella sp. JSC-11 (GenBank gi 497072149), Nostoc azollae 0708 (GenBank gi 298490297), Nostoc punctiforme PCC 73102 (GenBank gi 186683068), Nostoc sp. PCC 7107 (GenBank gi 427710665), Nostoc sp. PCC 7119 (TrEMBL HG316543) y Raphidiopsis brookii (GenBank gi WP_009344415.1); Cit c6 (c6) de Arthrospira platensis NIES-39 (GenBank gi YP_005072220.1), Chlamydomonas reinhardtii (GenBank gi 117924), Chlorella vulgaris (GenBank gi 30578153), Cladophora glomerata (GenBank gi 24636293), Cyanobium sp. PCC 7001 (GenBank gi 493967399), Gloeobacter violaceus (GenBank gi 37521549), Monoraphidium braunii (GenBank gi 729268), Nostoc sp. PCC 7119 (EMBL AJ002361), Synechococcus elongatus (GenBank gi 25014058) y Synechocystis sp. PCC 6803 (EMBL P46445); Cit c6A (c6A) de Aegilops speltoides (GenBank gi 11222607), Arabidopsis thaliana (GenBank gi 9783643), Chlamydomonas reinhardtii (C_820065), Hordeum vulgaris (GenBank gi 16311393), Medicago trunculata (GenBank gi 11610049), Oryza sativa (GenBank gi 8955747) y Solanum tuberosum (GenBank gi 13615108); Cit cM (cM) de Gloeobacter violaceus (GenBank gi 37522351), Nostoc sp. PCC 7120 (gi 17228860), Prochlorococcus marinus subsp. pastoris CCMP1378 (GenBank gi 33861613), Prochlorothrix hollandica (GenBank gi 4098525), Synechococcus sp. WH 8102 (GenBank gi 33865254) y Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank gi 16330764); Cit c respiratorio (c) de Arabidopsis thaliana (GenBank gi 16177), Chlamydomonas reinhardtii (GenBank gi 322374), Enteromorpha intestinalis (GenBank gi 65520), Oryza sativa (GenBank gi 2394300), Solanum tuberosum (GenBank gi 65506); Cit c2 (c2) de Bradyrhizobium sp. ORS278 (TrEMBL Q8VUB4), Rhodobacter capsulatus (TrEMBL P00094), Rhodopseudomonas palustris (TrEMBL Q8GI80), Rhodospirillum centenum (TrEMBL P81153), Rhodovulum sulfidophilum (TrEMBL Q93I63) y Roseobacter denitrificans (TrEMBL P07625); y Cit c6-2 (c6-2) de Cyanothece sp. CCY0110 (GenBank gi 126660190), Lyngbya sp. PCC 8106 (GenBank gi 119484682), Nodularia spumigena CCY9414 (GenBank gi 119509989), Nostoc sp. PCC 7119 (EMBL AM902496), Synechococcus elongatus PCC 6301 (GenBank gi 56751577) y Trichodesmium erythraeum IMS101 (GenBank gi 113478003). La longitud de las ramas reflejan el número estimado de sustituciones por sitio. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 101 4.1.3. Modelo estructural del citocromo c6-3 En el apartado anterior se realizó el análisis de la estructura primaria y secundaria del Cit c6-3 en el que se observó que el Cit c6-3 tiene conservadas las regiones de interacción de la proteína con el Cit f y con el PS I. Ahora bien, no sólo es importante la homología a nivel de secuencia, sino que también lo es la localización tridimensional de estos aminoácidos conservados, ya que las proteínas interaccionan entre sí mediante superficies de contacto. Por ello, se realizó una colaboración con el grupo de investigación de la Dra. Marta Martínez Júlvez para resolver la estructura cristalográfica de la proteína. Sin embargo, a fecha de finalización de esta tesis, aún no se ha podido resolver la estructura cristalográfica, por lo que se realizó un modelado tridimensional de la estructura del Cit c6-3 mediante threading (Figura 15). Figura 15. Modelo tridimensional de la estructura del citocromo c6-3. Modelado mediante threading utilizando el servidor Phyre2. Las coordenadas del grupo hemo se modelaron a partir de la estructura del Cit c6 [código PDB 4GYD, Díaz-Moreno et al., 2014]. Para la visualización del cartoon se utilizó el software Chimera. En amarillo se observa el grupo hemo y en naranja el átomo de hierro. ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 102 Para poder analizar el grado de homología tridimensional entre el Cit c6 y el Cit c6-3 se hizo una superposición de ambos modelos (Figura 16). En ella observamos que la homología estructural es elevada, encontrando diferencias fundamentalmente en las regiones únicas del Cit c6-3, correspondientes a la elongación de la α-hélice y a una región C-terminal. Sin embargo, esta última región C-terminal aparece desordenada, ya que no se pudo modelar de manera fiable. Figura 16. Superposición de los modelos estructurales de los citocromos c6 y c6-3. En rojo se representa el Cit c6 y en azul el Cit c6-3. Están orientados con el sitio de interacción hidrófobo en la parte superior y con el electrostático de frente.El recuadro rojo señala la región desordenada C-terminal del Cit c6-3 que no se ha podido modelar de forma fiable. A partir del modelo de la estructura tridimensional del Cit c6-3 se estimó el potencial electrostático de superficie. A pesar de que ambas estructuras son muy similares (Figura 16), muestran una gran disparidad en el potencial electrostático de superficie (Figura 17). ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 103 Figura 17. Comparación de los potenciales electrostáticos de superficie de los citocromos c6 y c6-3. Los citocromos c6 (izquierda) y c6-3 (derecha) están orientados con el sitio de interacción hidrófobo en la parte superior y con el electrostático de frente. En rojo se muestran las zonas de la superficie con carga neta negativa y en azul las que presentan carga neta positiva. Como se ha mencionado anteriormente, el Cit c6 de Nostoc posee dos zonas mediante las cuales interacciona tanto con el PS I como con el Cit f [Molina-Heredia et al., 1999; Crowley et al., 2002; Díaz-Moreno et al., 2005a]. La primera es un área con carga neta positiva, responsable de las interacciones electrostáticas a larga distancia y de la formación de un complejo electrostático transitorio con el PS I y el Cit f. La segunda zona correspondería a una superficie hidrófoba alrededor del área en la que el grupo hemo es accesible al solvente, responsable de la formación de una interfase de contacto con el PS I y el Cit f, que permite que los electrones se transfieran de un centro rédox al otro [Molina-Heredia et al., 1999; Crowley et al., 2002; Díaz-Moreno et al., 2005a]. El Cit c6-3 conserva la región hidrófoba pero no la superficie de interacción electrostática que dirige las interacciones entre proteínas a larga distancia (Figura 17), lo cual hace presagiar que a baja fuerza iónica es probable que sea un donante de electrones al PS I muy ineficiente. Cyt c6-3! Cyt c6/Cyt c6-3!Cyt c6! )LJ Cyt c6-3! Cyt c6/Cyt c6-3!Cyt c6! )LJ ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 110 4.1.6.1. Interacción entre el citocromo c6-3 y el citocromo f A pesar de saber que los citocromos Cit c6 y Cit c6-3 son isopotenciales en condiciones de pH fisiológico y de que los residuos implicados en la interacción del Cit c6 con el Cit f están conservados en el Cit c6-3, estos datos no son suficientes para establecer una posible interacción del Cit c6-3 con el Cit f. Por ello, el primer objetivo funcional fue la caracterización de la interacción entre el Cit c6-3 y el Cit f mediante calorimetría de titulación isoterma y docking molecular. 4.1.6.1.1. Calorimetría de titulación isotérmica Se procedió a analizar la interacción entre el Cit c6-3 y el Cit f mediante calorimetría de titulación isotérmica, utilizando el Cit c6 como control de una interacción eficiente (Figura 22). Esta técnica permite detectar los pequeños cambios de calor que se producen al interaccionar dos elementos; en caso de no existir interacción, no se producirían esos variaciones. Al realizar dicho análisis, se concluyó que el Cit c6-3, al igual que el Cit c6, es capaz de interaccionar de forma eficiente con el Cit f en las condiciones ensayadas. Los datos extraídos a partir de las cinéticas de unión, ajustados para un modelo de unión de un ligando, sin cooperatividad, permitió estimar los valores de unión estequiométrica, la KA y la entalpía y entropía de unión para el proceso de interacción (Tabla 11). Tabla 11. Propiedades termodinámicas de la calorimetría de los complejos citocromo c6/citocromo f y citocromo c6-3/citocromo f. KA: constante de asociación; ΔH: entalpía de unión; ΔG: energía libre; -TΔS: entropía de unión; n: estequiometría de unión; KD: constante de disociación. Proteína KA (M-1) ΔH (kJ/mol) ΔG (kJ/mol) -TΔS (kJ/mol) n KD (µM) Cit c6 7,8·104 -14,64 -27,91 -13,26 1,10 13,0 Cit c6-3 5,0·105 3,76 -32,22 -35,99 0,99 2,0 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 111 Figura 22. Calorimetría de titulación isotérmica del complejo citocromo c6-3/citocromo f. (A) Termograma de la titulación en el que se observa una correlación entre la cantidad de Cit c6-3 añadido (ratio molar) y un desprendimiento de calor (dQ/dt); (B) Ajuste de la isoterma de unión a un modelo de sitio único. 4.1.6.1.2. Docking molecular entre el citocromo c6-3 y el citocromo f Aunque por microcalorimetría se concluye que el Cit c6-3 interacciona con el Cit f, no se puede afirmar con total seguridad que dicha interacción conduzca a la transferencia electrónica entre ambos. Esto es debido a que la interacción podría ocurrir por zonas de la proteína que no sean las adecuadas para la transferencia de electrones entre los grupos hemo. Por ello, se procedió a analizar la interacción entre el Cit c6-3 y el Cit f mediante docking molecular. El docking molecular se basa en la predicción de la conformación de una proteína al estar unida a otra, formando un complejo estable de mínima energía. Para ello hay diferentes algoritmos que alinean las proteínas siguiendo diferentes parámetros, como la complementariedad geométrica, incluyendo la complementariedad en la superficie molecular. También pueden acoplar en función de determinados rasgos hidrófobos o electrostáticos. Uno es esos algoritmos, que es el utilizado para el análisis de este trabajo, realiza una 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.05 0.00 0.05 0.10 010 20 30 40 50 time (min) dQ/dt (µcal/s) Molar Ratio Q (kcal/mol of injectant) Tiempo (min)! Ratio molar! 0,5!1,0!1,5!2,0! dQ/dt (μcal/s)! Q! (kcal/mol de inyección)! 0! 0! 0,2! 0,4! 0,6! 0,8! 1,0! 0! -0,05! 0,05! 0,1! 0!10!20!30!40!50! 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.05 0.00 0.05 0.10 010 20 30 40 50 time (min) dQ/dt (µcal/s) Molar Ratio Q (kcal/mol of injectant) Tiempo (min)! Ratio molar! 0,5!1,0!1,5!2,0! dQ/dt (μcal/s)! Q! (kcal/mol de inyección)! 0! 0! 0,2! 0,4! 0,6! 0,8! 1,0! 0! -0,05! 0,05! 0,1! 0!10!20!30!40!50! 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.05 0.00 0.05 0.10 010 20 30 40 50 time (min) dQ/dt (µcal/s) Molar Ratio Q (kcal/mol of injectant) Tiempo (min)! Ratio molar! 0,5!1,0!1,5!2,0! dQ/dt (μcal/s)! Q! (kcal/mol de inyección)! 0! 0! 0,2! 0,4! 0,6! 0,8! 1,0! 0! -0,05! 0,05! 0,1! 0!10!20!30!40!50! 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.05 0.00 0.05 0.10 010 20 30 40 50 time (min) dQ/dt (µcal/s) Molar Ratio Q (kcal/mol of injectant) Tiempo (min)! Ratio molar! 0,5!1,0!1,5!2,0! dQ/dt (μcal/s)! Q! (kcal/mol de inyección)! 0! 0! 0,2! 0,4! 0,6! 0,8! 1,0! 0! -0,05! 0,05! 0,1! 0!10!20!30!40!50! 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.05 0.00 0.05 0.10 010 20 30 40 50 time (min) dQ/dt (µcal/s) Molar Ratio Q (kcal/mol of injectant) Tiempo (min)! Ratio molar! 0,5!1,0!1,5!2,0! dQ/dt (μcal/s)! Q! (kcal/mol de inyección)! 0! 0! 0,2! 0,4! 0,6! 0,8! 1,0! 0! -0,05! 0,05! 0,1! 0!10!20!30!40!50! 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.05 0.00 0.05 0.10 010 20 30 40 50 time (min) dQ/dt (µcal/s) Molar Ratio Q (kcal/mol of injectant) Tiempo (min)! Ratio molar! 0,5!1,0!1,5!2,0! dQ/dt (μcal/s)! Q! (kcal/mol de inyección)! 0! 0! 0,2! 0,4! 0,6! 0,8! 1,0! 0! -0,05! 0,05! 0,1! 0!10!20!30!40!50! Q! (kcal/mol de inyección)! A B ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 112 estimación equilibrada de estos valores y devuelve una conformación de interacción de mínima energía. Así pues se realizó un modelado con este algoritmo (usando Cluspro V.2.0.) del complejo Cit c6-3/Cit f y, como control, del complejo Cit c6/Cit f (Figura 23). Figura 23. Docking molecular de la interacción entre citocromo c6/citocromo f y citocromo c6-3/citocromo f. Se presentan los modelados del complejo Cit c6/Cit f [A] y Cit c6-3/Cit f [B], escogiendo los modelos equilibrados de mínima energía para cada caso. Como se observa en la Figura 23, el Cit c6-3 interacciona con el Cit f en una orientación propicia para la transferencia de electrones, similar a la descrita por Díaz-Moreno y colaboradores [2005b] para el complejo Cit c6/Cit f. Por ello, se puede concluir que el Cit c6-3 interacciona con el Cit f, con una orientación adecuada para la transferencia de electrones. A!B!C! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 113 K2×10-8 (M-1·s-1)" I½ (s-1)" 0" 0,5" 1,0" 1,5" 2,0" 2,5" 0,2"0,3"0,4"0,5" kobs×10-4 (s-1)" 0" [Proteína] (μM)" 50"100"150"200" A"B" 0,5" 1,0" 1,5" 2,0" 3,0" 2,5" 0,1" 4.1.6.2. Interacción entre el citocromo c6-3 y el PS I La siguiente diana de interacción que se probó fue el PS I. Para realizar este análisis se realizaron experimentos de cinéticas rápidas inducidas por láser. Esta técnica consiste en la oxidación del PS I, mediante un pulso de luz láser, y la posterior medición de la reducción del PS I por el donador elegido en la escala del microsegundo al segundo. Estos experimentos permiten discriminar entre donadores específicos, que presentarán cinéticas rápidas, e inespecíficos, que tendrán unas cinéticas lentas. Como se observa en la Figura 24A, la transferencia de electrones desde el Cit c6-3 al PS I es muy lenta comparada con la del Cit c6. Figura 24. Transferencia electrónica desde los citocromos c6 y c6-3 al fotosistema I. Se presentan los valores de transferencia de Cit c6 (puntos negros) y c6-3 (cuadrados rojos) respecto a la concentración de proteína (A) y a la dependencia de fuerza iónica (B), indicando una ineficiencia del Cit c6-3 en la interacción con el PS I. La kbim para la reducción del PS I por parte del Cit c6-3 es de 75 veces inferior a la del Cit c6 (Tabla 12). Además, las cinéticas dependientes de fuerza iónica (Figura 24B) sólo refuerzan los datos de baja reactividad del Cit c6-3 con el PS I, ya que incluso a muy alta fuerza iónica no llega nunca a equipararse con el Cit c6. Con toda la información obtenida de este experimento concluimos que el Cit ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 114 c6-3 sería incapaz de interaccionar de forma eficiente con el PS I de Nostoc sp. PCC 7119. Tabla 12. Valores cinéticos para la transferencia electrónica desde los citocromos c6 y c6-3 al fotosistema I. kbim: constante bimolecular de segundo orden de la reacción; kinf: constante bimolecular extrapolada a fuerza iónica infinita; kET: constante de primer orden de transferencia electrónica. Proteína kbim (M–1s–1)×10–7 kinf (M–1s–1)×10–6 kET (s–1)×10–5 Cit c6 12,1 11,4 1,7 Cit c6-3 0,16 2,5 - 4.1.6.3. Reacción entre el citocromo c6-3 y las oxidasas terminales Cox1, Cox2 y Cox3 Siguiendo el esquema de la Figura 3, descartaríamos el posible transporte de electrones a través del Cit c6-3 desde el Cit b6-f hasta el PS I. Sin embargo, el Cit c6-3 podría transportar electrones hasta las oxidasas terminales respiratorias como está descrito que realiza el Cit c6 [Navarro et al., 2005]. Para comprobar esto, se analizaron las tasas de consumo de oxígeno de membranas enriquecidas en oxidasas terminales respiratorias en presencia de Cit c6-3 purificado. Como control positivo se utilizó el Cit c6 y como control negativo, de interacción inespecífica, se utilizó el Cit c respiratorio de caballo. Nostoc sp. PCC 7119 crece fotoautótrofamente, pero también puede crecer quimiotróficamente en oscuridad, en ambos casos en presencia de nitrógeno combinado o dinitrógeno como fuente de nitrógeno [Pils et al., 2004]. Así mismo, en este organismo hay diferentes oxidasas en función del tipo celular, teniendo las denominadas Cox1 exclusivamente en células vegetativas y las oxidasas Cox2 y Cox3 exclusivamente en heterocistos [Pils et al., 2004; Valladares et al., 2007]. Por ello, se ha estudiado la actividad respiratoria a través del consumo de oxígeno en membranas extraídas de cultivos en oscuridad (con fructosa en el medio) y en presencia de luz. De esta última ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 115 condición, se han extraído membranas de células totales en medio BG11 completo y membranas de células totales en medio BG110 sin nitrógeno combinado. Además, a partir de estos cultivos en luz y sin nitrógeno combinado, se procedió a hacer un aislamiento de heterocistos y se extrajeron membranas de este tipo celular para su análisis. Como se muestra en la Figura 25, mientras que el Cit c6 reacciona eficientemente con todas las preparaciones ensayadas, el Cit c6-3 sólo lo hace con las membranas obtenidas de heterocistos aislados. Figura 25. Reacción del citocromo c6-3 con las oxidasas terminales de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119. Tasas de consumo de oxígeno en presencia de Cit c6 (Verde), Cit c6-3 (Azul) o de Cit c de caballo (Rojo) con membranas extraídas en las siguientes condiciones: luz con medio BG11 completo (Luz + BG11); oscuridad con medio BG11 completo (Oscuridad + BG11); luz con medio BG110 sin nitrógeno combinado (Luz + BG110); de esta última condición, se realizó un aislamiento de heterocistos y posteriormente se hizo una extracción de membranas de estas células (Heterocistos). Las barras de error se calcularon a partir de la media de tres réplicas. Como hemos mencionado antes, en los heterocistos se encuentran las oxidasas exclusivas de este tipo celular, la Cox2 y Cox3, oxidasas de tipo hemo-cobre [Valladares et al., 2007]. Para discriminar qué oxidasas son las 0! 2! 4! 6! 8! 10! 12! 14! 16! !"#$%&'&("%)*%+& ,*)-&'&("%)*%+& !"#$%&.&("%)*%+& /+%+)0123%&4+56)*7+& Tasa de consumo de O2! (mmol mg -1 min -1)! Luz ! + BG11! Oscuridad ! + BG11! Luz ! + BG110! Heterocistos! ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 116 !Cox2 !!Cox3 !Silvestre! 0! 2! 4! 6! 8! 10! 12! 14! !"#"$%&'(#)*"+,$-.") /%01) &%02) Tasa de consumo de O2! (mmol mg -1 min -1)! que intervienen en el proceso, se realizaron nuevos análisis del consumo de oxígeno en mutantes de deleción de estas oxidasas (cedidos por el laboratorio de Enrique Flores y Antonia Herrero, del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla y CSIC). Figura 26. Reacción del citocromo c6-3 con mutantes de las oxidasas terminales de heterocistos de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119. Tasas de consumo de oxígeno en presencia de Cit c6 (Verde), Cit c6-3 (Azul) o de Cit c de caballo (Rojo) con membranas extraídas de heterocistos silvestres (Silvestre), de mutantes de la Cox2 (ΔCox2) y de mutantes de la Cox3 (ΔCox3). Las barras de error se calcularon a partir de la media de tres réplicas. Como se observa en la Figura 26, el Cit c6 reacciona con las membranas de heterocistos de las estirpes silvestre y ∆Cox3, pero no con las del mutante ∆Cox2, lo cual indicaría que el Cit c6 reacciona con la Cox1 de células vegetativas y con la Cox2 de heterocistos, pero no con la Cox3. Los resultados obtenidos con el Cit c6-3 son más complejos de explicar. El Cit c6-3 reacciona con las membranas de heterocistos silvestres pero no con las de los mutantes ∆Cox2 y ∆Cox3. Como se observa en la Figura 26, para que se produzca consumo de oxígeno en presencia de Cit c6-3 deben estar presentes Cox2 y Cox3 simultáneamente. Estos análisis indican que la posible función del Cit c6-3 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 117 en la cadena respiratoria del heterocisto debe ser diferente a la del Cit c6, el cual actúa como "citocromo c respiratorio". Como conclusión, el Cit c6-3 podría captar electrones del Cit f y cederlo a las oxidadas terminales presentes en los heterocistos; pero, en este último caso requeriría la intervención simultánea de Cox2 y Cox3. 4.1.6.4. Localización subcelular del citocromo c6-3 Los datos funcionales indican que el Cit c6-3, en condiciones diazotróficas en las que se desarrollan los heterocistos, actuaría en este tipo celular, transfiriendo electrones desde el complejo Cit b6-f hasta las oxidasas terminales de heterocistos. Sin embargo, no se puede asegurar esto hasta comprobar que la proteína se expresa con un buen nivel de expresión y diferencialmente en los heterocistos. Se analizó en primer lugar la localización celular del Cit c6-3 mediante microscopía confocal, con una fusión traduccional con la proteína reportera sf-GFP (super folded Green Fluorescence Protein), una variante de la GFP mas estable. La construcción fue la denominada como AT4, que expresa la sf-GFP en el extremo C-terminal del Cit c6-3. Con esta construcción sólo se detectaron niveles marginales de proteína en todas las condiciones ensayadas. Para estar seguros de que este bajo nivel de expresión no era causado por la construcción de la estirpe, se realizó un ensayo de Western Blot para detectar la proteína, ya que la inmunodetección es más sensible que la visualización por microscopía. Se utilizaron anticuerpos anti-GFP, porque los anticuerpos anti-Cit c6-3 también reconocían a las variantes Cit c6 y Cit c6-2, debido a que la homología es muy alta entre estos Cit. La detección de la proteína se llevó a cabo bajo dos condiciones, medio completo BG11 y medio BG110, sin nitrógeno combinado. Como se puede ver en la Figura 27, la proteína se expresa en ambas ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 118 NO3 - N2NO3 - N2 GFP ! 34! 26! 17! :7 AT4! kDa! Silvestre! condiciones, pero se observa una reducción drástica en la condición BG110 en la que se desarrollan los heterocistos. Figura 27. Inmunodetección del citocromo c6-3 mediante análisis de Western Blot. La inmunodetección se realizó a partir de cultivos silvestres (Silvestre) y de la estirpe AT4, que expresa una fusión del Cit c6-3 con la sf-GFP. Las condiciones de cultivo son: BG11 con nitrógeno combinado (NO3-) y condiciones diazotróficas (N2), usando un anticuerpo anti-GFP. Para contrastar esta información se realizaron ensayos de inmunofluorescencia en la estirpe AT9, que contenía una secuencia de 6 histidinas en el extremo C-terminal del Cit c6-3. A pesar de que la inmunofluorescencia es menos resolutiva que la microscopía confocal, otorga una amplificación de señal muy potente. En la Figura 28 se pueden ver los resultados del ensayo, en los que se repite lo observado en el análisis por Western Blot. La proteína se expresa en BG11, con nitrógeno combinado, pero al entrar en diazotrofía, la cantidad de proteína disminuye de forma sensible, llegando al nivel basal de autofluorescencia del fondo. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 119 Figura 28. Inmunodetección mediante análisis de localización por inmunofluorescencia del citocromo c6-3. Inmunodetección realizada en las estirpes silvestre (A) y AT9 (B y C), que expresa el Cit c6-3 con una cola de 6 histidinas en el extremo C-terminal. Las condiciones de cultivo fueron BG11 (A y B) o BG110 (C) sin nitrógeno combinado. Las células se incubaron durante 24 horas con la fuente de nitrógeno indicada. Posteriormente se realizó el ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-6 histidinas y se visualizó el resultado mediante microscopía de fluorescencia. La barra de tamaño indica 6 µm, con una magnificación similar para las tres micrografías. La flecha indica un heterocisto. Simultáneamente a esto se estudió el nivel de expresión del gen petJ-3 por si hubiera algún tipo de regulación transcripcional similar al del Cit c6 y la Pc. El Cit c6 y la plastocianina poseen una fuerte regulación por cobre [Bovy et al., 1992], por lo que quizás los niveles de expresión que encontrábamos en los análisis previos se debían a algún tipo de regulación por este metal. Por ello, se realizaron análisis de la expresión del gen petJ-3 (Cit c6-3), así como del gen petJ (Cit c6) como control, mediante qPCR a partir de extracciones de RNA total (Figura 29). ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 126 c6-3. Para ello, se diseñó una construcción que expresaba el Cit c6-2 fusionado traduccionalmente a la proteína reportera sf-GFP. Como se observa en las imágenes de microscopía confocal de la Figura 34, no se obtuvieron resultados significativos de fluorescencia por GFP. Este tipo de patrón de expresión, unido a la improbable transferencia de electrones desde el Cit f, indica que no se trata de un transportador de electrones masivo similar al Cit c6. Sin embargo, podría jugar algún tipo de papel regulatorio o en transferencia electrónica, cediendo electrones al complejo Cit b6-f en lugar de captarlos. Esto abriría las puertas a la existencia de un pool de proteínas capaces de reducir al Cit b6-f que interviniesen en un flujo cíclico. Figura 34. Estudio de fluorescencia mediante microscopía confocal del citocromo c6-2, mediante visualización con GFP. Filamentos de la estirpe AT2 (Cit c6) y AT3 (Cit c6-2), que contienen una fusión traduccional de la sf-GFP con la región codificante de los genes petJ y petJ-2, respectivamente, así como filamentos de Nostoc sp. PCC 7119 (Silvestre). Los cultivos se presentan antes (0 h) y después de una incubación de 24 horas en ausencia de nitrógeno combinado (24 h). Cit c6!Cit c6-2!Silvestre! 0h! 24h! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 127 4.3. Citocromo cM Hasta ahora sólo se había caracterizado parcialmente el Cit cM de la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. PCC 6803 y su función aún se desconoce. Se ha propuesto que es capaz de donar electrones a las oxidasas terminales con una eficiencia mayor que el Cit c6 y la Pc [Bernroitner et al., 2009]. Por contra, es incapaz de captar electrones del Cit b6-f, así como de donárselos al PS I [Molina-Heredia et al., 2002]. Se ha demostrado que en células cultivadas en!condiciones normales el nivel de RNAm de Cit cM es muy bajo y que mutantes que carecen de Cit cM crecen normalmente bajo condiciones fotoautótrofas, exhibiendo tasas de fotosíntesis y respiración que son comparables a las de células de tipo silvestre [Malakhov et al., 1994; Manna y Vermaas,1997; Pils et al., 1997]. En cambio, en condiciones de estrés (baja temperatura y alta intensidad de la luz), cuando se reprime la síntesis de las dos metaloproteínas solubles Cit c6 y Pc, la expresión del Cit cM aumenta drásticamente [Malakhov et al., 1994]. Manna y Vermaas [1997] han sugerido que el Cit cM podría operar en el transporte de electrones respiratorio, mediando la transferencia de electrones desde la Pc y/o el Cit c6 a una Cox de tipo Caa3. Su sugerencia se basa en el análisis del transporte de electrones en los mutantes de deleción del Cit cM en Synechocystis sp. 6803, organismo en el cual fue imposible obtener un doble mutante de deleción Cit cM/Cit c6 y en el que en un mutante de deleción del Cit cM no se podía eliminar la actividad del PS I, indicando que el Cit cM podría ser necesario para la transferencia electrónica en respiración. Por eso, en esta tesis doctoral, se procedió a estudiar su localización celular y su posible reacción con las oxidasas terminales de la cadena respiratoria. Todo el trabajo se realizó en Nostoc sp. PCC 7119. ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 128 4.3.1. Clonación del gen cytM, expresión y purificación del citocromo cM Partiendo de la secuencia conocida del gen all1365 de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120, se diseñaron dos oligonucleótidos que, por PCR, permitiesen amplificar la ORF completa del gen cytM de Nostoc sp. PCC 7119. La secuencia de dichos oligonucleótidos fue: AnaCMD AACTTTTACAGGACACCTTATGGA AnaCMR TAAAATATGAATTCCTGATGTAAAAACC Tras la PCR, el fragmento de DNA amplificado se ligó en el plásmido pCRII, dando lugar al vector pCRII::CitM, y se secuenció (Figura 35). Al igual que en el caso del gen petJ-3, se secuenciaron tres insertos de DNA procedentes de tres PCR independientes para estar seguros de que la reacción de PCR no introducía ningún error. La secuencia se depositó en la base de datos de secuencias de ácidos nucleicos EMBL con el número de acceso: LT717489. Figura 35. Secuencia de la ORF del gen cytM de Nostoc sp. PCC 7119 y de la proteína citocromo cM. En verde se señala el péptido de tránsito; en azul, la secuencia codificante de la proteína. TTG GAT AAC CAG ATT ACC AAA CCT GAA ATT CTG ATT CAG CGT ATC < 45! L D N Q I T K P E I L I Q R I ! GCT TTA GTG GCG CTA GTG ATA CTG CTA GCA ATC CCT TTG GGC TTT < 90! A L V A L V I L L A I P L G F ! TTT GGT GTT CAG TTG GTG AAA GCC TCT GAC CCT TAT GTT AAG AGT < 135! F G V Q L V K A S D P Y V K S ! GTT CTT GCC ATG AAA GGA GAC CCA ATA CAG GGA CAC GCT ATT TTT < 180! V L A M K G D P I Q G H A I F ! CAA ATA AAT TGT GCT GGT TGT CAT GGT TTA GAA GCA GAT GGC CGA < 225! Q I N C A G C H G L E A D G R ! GTA GGC CCC AGC TTA CAA GCA GTT TCT AAG CGT AAG TCC AAG TAT < 270! V G P S L Q A V S K R K S K Y ! GGG CTA ATT CAC CAA GTT ATT AGC GGT GAT ACA CCA CCA ATG CCA < 315! G L I H Q V I S G D T P P M P ! AAA TTT CAG CCC AAC ACC CAA GAA ATG GCA GAT CTT TTA AGC TTT < 360! K F Q P N T Q E M A D L L S F ! TTG GAG ACT TTA TAG < 375! L E T L * ! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 129 La secuencia de aminoácidos deducida a partir del gen cytM se analizó con el programas SignalP 1.1, del servidor Expasy [Apartado 3.9 de Materiales y Métodos], para localizar, en cada caso, el posible péptido de tránsito, la diana de proteólisis y la posible localización celular en E. coli del Cit cM. Como resultado, el preapo-Cit cM presentó una posible secuencia transmembrana entre los residuos 1 y 38 (Figura 35) y una posible diana de proteólisis VLA-MK con un posible sitio de corte entre los residuos 48 y 49, algo lejos del fin de la región transmembrana. La localización estimada para la proteína madura resultó ser en el espacio periplásmico de las bacterias Gram negativas, con una probabilidad del 98,3 %. A la hora de expresar heterólogamente la proteína en E. coli se encontraron numerosos problemas. Para resolverlos se procedió a sustituir el péptido de tránsito de la proteína por un péptido de tránsito más favorable para la producción de proteínas: el péptido de tránsito de la Pc de Nostoc sp. PCC 7119. La sustitución del péptido de tránsito del Cit cM por el de la Pc de Nostoc sp. PCC 7119 se llevó a cabo mediante fusión por PCR. Para ello se diseñó un adaptámero con la primera mitad de la secuencia idéntica al extremo 3' del fragmento de DNA que codifica el péptido de tránsito de la Pc y con la otra mitad correspondiente a la región 5' del gen cytM, por donde empieza la proteína madura. De esta forma, y en un sólo paso de PCR, se pudo obtener un gen quimérico que codificaba el Cit cM fusionado al péptido de tránsito de la Pc (Figura 36). La PCR se realizó en las condiciones descritas en Materiales y Métodos, pero como DNA molde, se utilizó una mezcla de los vectores pCRII::CitM (este trabajo) y pEAPC-WT [Molina-Heredia et al., 1998] y como cebadores se utilizaron tres oligonucleótidos: el oligonucleótido directo PC-D, complementario al extremo 5' del gen petE (que codifica para la Pc); como cebador reverso se utilizó el oligonucleótido AnaCMR; y el adaptámero CM (reverso) para la fusión del péptido de tránsito. El producto de la PCR se ligó en el vector pCRII (Stratagene), en fase con el promotor del fago T7, dando lugar al vector pEACCM-T7, y en fase con el promotor lac, dando lugar al vector pEACCM-lac. ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 130 Figura 36. Esquema de la obtención del gen quimérico que codifica el citocromo cM fusionado al péptido de tránsito de la plastocianina. El gen quimérico se obtuvo en un sólo paso de PCR en el que se utilizaron dos moldes y tres oligonucleótidos. Se ensayó la expresión de los vectores pEACCM-T7 y pEACCM-lac, con y sin la co-expresión del plásmido pEC86, en diferentes estirpes de E. coli (el vector pEACCM-T7 sólo se probó en estirpes que expresaban la polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor lac). Como se puede observar en la Tabla 14, sólo se obtuvo expresión a partir del plásmido pEACCM-lac en las estirpes K12 y BL21 (DE3) y además con la co-expresión del vector pEC86. Tabla 14. Pruebas de expresión del citocromo cM en E. coli. Rendimiento volumétrico obtenido tras la expresión del Cit cM en diferentes estirpes de E. coli con o sin co-expresión con el plásmido pEC86. Estirpes de E. coli Sin pEC86 (mg/l) Con pEC86 (mg/l) JM109 0,0 0,0 GM119 (λ 1-pir) 0,0 0,0 K12 0,0 trazas DH10B 0,0 0,0 DH5α 0,0 0,0 BL21 (DE3) 0,1 2,0 MC1061 0,0 0,0 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 131 Estos niveles de producción de Cit cM se obtuvieron en volúmenes de 100 ml de cultivo. Al escalar, a partir de volúmenes de más de 500 ml de cultivo, se perdía casi completamente la producción. Dados los problemas con el escalado de la producción del Cit cM, se decidió optimizar el uso de codones del gen. Para eso se diseñó un gen sintético, teniendo en cuenta el mejor uso de codones de E. coli (Figura 37). Figura 37. Secuencia de la ORF del gen cytM de Nostoc sp. PCC 7119 optimizado para el uso de codones de E. coli, así como la secuencia de la proteína citocromo cM. En verde se señala el péptido de tránsito de la plastocianina de Nostoc sp. PCC 7119; en azul, la secuencia codificante de la proteína. Dicho gen sintético se clonó en el vector pBluescript II KS (+), utilizando la diana HindIII presente tanto en la secuencia sintética como en el sitio múltiple de clonación del vector, dando lugar al plásmido pEACM (Figura 38). Las pruebas de expresión de este nuevo gen sintético que codifica el Cit cM de Nostoc en E. coli se ensayaron en condiciones aerobias y microaerobias con distintos medios y tiempos de cultivo. El primer paso fue probar nuevamente todas las estirpes de E. coli que habían sido usadas antes del cambio de plásmido, obteniendo únicamente citocromo en la estirpe GM119, con y sin ATG AAA CTG ATC GCG GCG AGC CTG CGT CGT CTG TCT CTG GCG GTT < 45! M K L I A A S L R R L S L A V ! CTG ACC GTT CTG CTG GTT GTT TCT TCT TTC GCG GTT TTC ACC CCG < 90! L T V L L V V S S F A V F T P ! TCT GCG TCC GCG ATG AAA GGT GAC CCG ATC CAG GGT CAC GCG ATC < 135! S A S A M K G D P I Q G H A I ! TTT CAG ATC AAC TGC GCG GGT TGC CAT GGT CTG GAA GCG GAC GGT < 180! F Q I N C A G C H G L E A D G ! CGT GTT GGT CCG TCT CTG CAA GCG GTT TCT AAA CGT AAA TCT AAA < 225! R V G P S L Q A V S K R K S K ! TAC GGT CTG ATC CAC CAG GTT ATC TCT GGT GAT ACT CCG CCG ATG < 270! Y G L I H Q V I S G D T P P M ! CCG AAA TTC CAG CCG AAC ACC CAA GAA ATG GCG GAC CTG CTG TCT < 315! P K F Q P N T Q E M A D L L S ! TTC CTG GAA ACC CTG TAG < 333! F L E T L * ! ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 132 co-expresión con el plásmido pEC86, y trazas en JM109 al co-transformarse con el plásmido pEC86 (Tabla 15). Figura 38. Plásmido pEACM para la expresión del citocromo cM. El plásmido original es el pBluescript II KS (+), con la inserción de la región codificante para el gen cytM (rosa). Con estos resultados se consideró adecuada para la producción del citocromo la estirpe GM119, dado que presentaba un mayor rendimiento que el resto de estirpes probadas. Finalmente, se procedió al escalado y se realizó un cultivo de 24 l de LB inoculado con la estirpe GM119 (λ 1-pir) co-transformada con el plásmido pEC86 y se obtuvieron 27 mg de Cit cM, lo que supone una producción de 1,1 mg/l. Partiendo de esto los extractos se dializaron y posteriormente se procedió a realizar una cromatografía en una columna de intercambio aniónico. Tras este paso, las muestras se concentraron y se realizó una cromatografía de exclusión molecular. Finalmente se obtuvieron 1,7 mg de Origen f1! Gen reportero lacZ! Marcador Ampicilina! Promotor Ampicilina! Promotor lac! Promotor T3! Origen pBR322! Gen cytM! pEACM! 3285 pb! ! ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 133 Cit cM con una relación de pureza A275/A550 de 0,8, prácticamente puro a homogeneidad electroforética. Tras la producción de la proteína, pese a las dificultades encontradas, se comenzó con la caracterización físico-química del Cit cM. Tabla 15. Pruebas de expresión del gen sintético del Cit cM en E. coli. Rendimiento volumétrico obtenido con la expresión del Cit cM en diferentes estirpes de E. coli co-expresado con el plásmido pEC86 y sin él. Estirpes de E. coli Sin pEC86 (mg/l) Con pEC86 (mg/l) JM109 0,0 trazas GM119 (λ 1-pir) 0,5 0,76 K12 0,0 0,0 DH10B 0,0 0,0 DH5 α 0,0 0,0 BL21 (DE3) 0,0 0,0 MC1061 0,0 0,0 4.3.2. Caracterización físico-química del citocromo cM ! Primero se secuenció el extremo amino terminal, para comprobar el procesado de la proteína. La secuencia del extremo amino terminal obtenida por secuenciación por degradación de Edman, fue MKGD con lo que se confirma que E. coli es capaz de procesar correctamente a la proteína recombinante. Así mismo, se realizó un espectro de absorción UV/Vis para identificar las bandas características del Cit cM. En la Figura 39 se muestra el espectro de absorción UV/vis de la proteína reducida y oxidada. En el espectro reducido, se distinguen las siguientes bandas características: banda α (550 nm), banda β (521 nm) y Soret (416 nm). Tras su oxidación, las bandas α y β desaparecen y se observa otra, más amplia, a 525 nm y la banda Soret se desplaza hasta los ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 134 250 300 350 400 450 500 550 600 3,5 Absorbancia Longitud de onda (nm) 3 2,5 1,5 0,5 2 1 0 2 407 nm. Dichos valores prácticamente coinciden con los obtenidos para el Cit cM de Synechocystis sp. PCC 6803 (Tabla 16). Figura 39. Espectro de absorción UV/Vis del citocromo cM de Nostoc sp. PCC 7119. La línea discontinua representa el espectro de la forma oxidada y la línea continua, el espectro de la forma reducida. Se suprimió la región del espectro de la forma reducida entre 250-350 nm ya que el reductor empleado (ditionito sódico) absorbe en esta región. También se determinó el coeficiente de extinción mediante el método del piridín-hemocromo. Para el Cit cM se obtuvo un ɛ550 con el valor de 28,42 ± 0,37 mM-1·cm-1, un valor muy semejante al ɛ550 del Cit cM de Synechocystis sp. PCC 6803 (Tabla 16). El ɛ diferencial oxidado-reducido obtenido para el Cit cM de Nostoc sp PCC 7119 fue de 16,24 mM-1·cm-1. Posteriormente, se procedió con la determinación de la masa molecular del Cit cM. El peso molecular del Cit cM de Nostoc fue de 8851,87 Da (Figura 40), un valor muy semejante al teórico de 8905,4 Da y a la del Cit cM de Synechocystis sp. PCC 6803 (Tabla 16). En el espectro se aprecia un segundo pico de intensidad menor a 17 789,69 Da que podría tratarse de un dímero, o bien de un contaminante proteico. El pI del Cit cM no pudo determinarse con exactitud ya que aparecían dos bandas en el carril del gel del isoelectroenfoque. Los valores de pI eran muy ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 135 2,5! 2! 1,5! 1! 0,5! 0! Intensidad relativa! "#$! 6000!14 000! 10 000!18 000! 8851,87 Da! 17 789,69 Da! similares, entre sí (6,5 y 6,8, respectivamente) y al pI teórico de 6,8. Esto podría deberse a que, como la proteína es muy inestable, una de las bandas correspondiese a la de la proteína nativa y la otra a la proteína desnaturalizada. Cabe destacar que el pI del Cit cM de Synechocystis sp. PCC 6803 es mucho menor, con un valor de 5,57 [Cho et al., 2000]. Figura 40. Análisis por MALDI-TOF del citocromo cM de Nostoc sp. PCC 7119 expresado en E. coli. El pico base corresponde al Cit cM de Nostoc sp. PCC 7119 de masa molecular de 8851,81 Da. El ruido de fondo es muy pequeño revelando el alto nivel de pureza de la muestra. Tabla 16. Comparación entre los parámetros físico-químicos del citocromo cM Nostoc y Synechocystis. * Datos obtenidos de Molina-Heredia y colaboradores [2002]. Otra característica importante a determinar fue el potencial rédox, clave en la función que podría realizar. El potencial rédox estándar del Cit cM fue de 186,9 ± 1,32 mV. En la Figura 41 se muestra la titulación reductiva del Cit cM. Este potencial rédox es 37 mV superior al del Cit cM de Synechocystis sp. PCC 6803 Organismo Banda α (nm) ε banda α (mM–1·cm–1) Peso molecular (Da) Em,7 (mV) Nostoc 550 28,4 8852 187 Synechocystis 551* 28,5* 8300* 150* ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 142 4.4. Citocromo c6 y plastocianina El Cit c6 y la Pc han sido ampliamente estudiados, tanto a nivel funcional como estructural. El Cit c6, como ya se ha comentado, sería el encargado del transporte de electrones desde el complejo Cit b6-f hasta el PS I o hasta las oxidasas terminales en el lumen tilacoidal de cianobacterias y en cloroplastos de numerosas algas eucariotas [Hervás et al., 2003]. Sin embargo, no se conoce aún en detalle la localización subcelular de la Pc, y mucho menos la localización de ambas proteínas en cianobacterias que presentan diferenciación celular en heterocistos. Se ha localizado el Cit c6 en el espacio periplásmico y en el lumen tilacoidal de células vegetativas. La Pc se ha encontrado, también, en el lumen tilacoidal de células vegetativas, aunque no se ha estudiado su posible presencia en el espacio periplásmico. Tampoco se ha estudiado la presencia de ambas proteínas en heterocistos. Así pues, en esta tesis se ha estudiado en detalle la localización subcelular de ambas proteínas, tanto en las células vegetativas cómo en heterocistos de Nostoc sp. PCC 7119. También, a pesar de que algunos estudios previos indican que ambas metaloproteínas están implicadas tanto en fotosíntesis como en respiración, aún se desconoce su función en las cadenas respiratorias y fotosintéticas de heterocistos y su implicación en la fijación de nitrógeno atmosférico. Por eso, a parte de la localización celular y subcelular, se ha realizado un estudio de la reacción de ambas proteínas con membranas de células vegetativas, en las cuales está presente Cox1, y con membranas de heterocistos, en las cuales sólo aparecen Cox2 y Cox3. 4.4.1. Localización subcelular de citocromo c6 y plastocianina La localización subcelular de estas proteínas es crucial para saber dónde desempeñan la función. Ambas proteínas se transportan por un sistema de secreción tipo sec, con un péptido de tránsito que enviaría a las proteínas a los mismos sistemas de membrana. Para localizar estas proteínas se han ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 143 NO3 -! N2! GFP!Fusión!GFP!Fusión! Plastocianina! Citocromo c6! realizado fusiones traduccionales con la proteína sf-GFP que se han visualizado con un microscopio confocal. Como vemos en la Figura 48, en células vegetativas, el Cit c6 se localizaría en el lumen tilacoidal y en el espacio periplásmico, mientras que la Pc solo la encontramos en el lumen tilacoidal. En heterocistos, sin embargo, ambas proteínas co-localizan en las estructuras de membrana denominadas honeycombs. En estas estructuras es donde el heterocisto acumula las oxidasas terminales Cox2 y Cox3, así como el Cit b6-f y el PS I. Figura 48. Localización subcelular del citocromo c6 y de la plastocianina de Nostoc sp. PCC 7119. Las condiciones ensayadas fueron BG11 completo (NO3-) y BG110 (N2), en cuyo caso el organismo desarrollaba heterocistos. Para el caso concreto del Cit c6, las células se cultivaron en ausencia total de cobre, para evitar la represión del gen. Se muestra el campo fluorescente de la sf-GFP (GFP) y la fusión de este con el campo rojo de la clorofila (Fusión). Todas las fotografías constan del mismo aumento. La flecha blanca señala un heterocisto. Estos experimentos están realizados en condiciones de presencia (para el caso de la Pc) o ausencia (para el caso del Cit c6) de cobre. Sin embargo, también se realizaron estudios de localización subcelular en las condiciones inversas. En el caso de la Pc en ausencia de cobre, fuimos incapaces de localizar la ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 144 NO3 -!N2! GFP! Fusión! proteína en ninguna condición (no se muestran los datos); algo esperable, ya que la expresión de la Pc está altamente reprimida en ausencia de cobre [Bovy et al., 1992; Nakamura et al., 1992; Zhang et al., 1994]. Sin embargo, en el caso del Cit c6, cuya expresión está fuertemente reprimida por la presencia de cobre [Bovy et al., 1992; Nakamura et al., 1992; Zhang et al., 1994], encontramos unos niveles de expresión altos en presencia de cobre, pero sólo en los heterocistos (Figura 49). En el resto del filamento apenas encontramos la proteína. Figura 49. Localización subcelular del citocromo c6 de Nostoc sp. PCC 7119 en presencia de cobre. Las condiciones ensayadas fueron BG11 completo (NO3-) y BG110 (N2), en cuyo caso el organismo desarrollaba heterocistos. Se muestra el campo fluorescente de la sf-GFP (GFP) y la fusión de este con el campo rojo de la clorofila (Fusión). Todas las fotografías constan del mismo aumento. La flecha blanca señala un heterocisto. Como se deduce de los datos expuestos, la Pc sólo se expresa en presencia de cobre y lo hace en el lumen tilacoidal de células vegetativas y en los honeycombs de heterocistos. Por otro lado, el Cit c6, en ausencia de cobre, se expresa en el espacio periplásmico y en el lumen tilacoidal de células vegetativas, y en los honeycombs de heterocistos. En presencia de cobre, la expresión del Cit c6 se reprime en el lumen tilacoidal de células vegetativas, pero sigue expresándose en el espacio periplásmico de éstas y en los honeycombs de heterocistos. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 145 0! 2! 4! 6! 8! 10! 12! 14! 16! !"#$%&'&("%)*%+& ,*)-&'&("%)*%+& !"#$%&.&("%)*%+& /+%+)0123%&4+56)*7+& Tasa de consumo de O2! (mmol mg -1 min -1)! Luz ! + BG11! Oscuridad ! + BG11! Luz ! + BG110! Silvestre!!Cox2!!Cox3! Heterocistos! Células Vegetativas! 4.4.2. Reacción del citocromo c6 y la plastocianina con las oxidasas terminales Cox1, Cox2 y Cox3 En primer lugar, se estudió la reacción de ambos donadores de electrones con membranas enriquecidas en oxidasas terminales, como ya hemos visto para los otros Cit estudiados y después, se decidió incluir membranas enriquecidas en oxidasas terminales de los mutantes simples de deleción de las oxidasas de heterocistos Cox2 y Cox3 (Figura 50). Figura 50. Reacción del citocromo c6 y plastocianina con oxidasas terminales de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119. Tasas de consumo de oxígeno en presencia de Cit c6 (Verde), de la Pc (Azul) y de Cit c de caballo (Rojo) con membranas extraídas de cultivos de Nostoc sp. PCC 7119 en las siguientes condiciones: luz con medio BG11 completo (Luz + BG11), oscuridad con medio BG11 completo (Oscuridad + BG11), luz con medio BG110 sin nitrógeno combinado (Luz + BG110), de esta última condición se realizó un aislamiento de heterocistos y posteriormente se hizo una extracción de membranas de estas células (Heterocistos) para el silvestre, así como de los mutantes de las oxidasas Cox2 (∆Cox2) y Cox3 (∆Cox3). Las barras de error se calcularon a partir de la media de tres réplicas. ! ! RESULTADOS Y DISCUSIÓN ! ! ! 146 Como se observa en la Figura 50, el Cit c6 es capaz de reaccionar de forma eficiente con la oxidasa principal de células vegetativas, la Cox1. Además, reacciona de forma específica con la oxidasa terminal del heterocisto Cox2, ya que mutantes de deleción de esta oxidasas no muestran reactividad con el Cit c6 y no reacciona con la Cox3. En el caso de la Pc, vemos que también hay una buena reactividad entre esta proteína y la oxidasa Cox1. Sin embargo, es interesante ver que no es capaz de reaccionar de forma específica con las oxidasas terminales de heterocistos, lo que sugiere que la función de la Pc en el heterocisto no sería respiratoria, ya que como hemos comentado, la oxidasa terminal Cox1 no está presente en heterocistos. En resumen, tendríamos que cuando hay cobre presente en el medio, la Pc se expresaría tanto en células vegetativas como en heterocistos, mientras que el Cit c6 se seguiría expresando en heterocistos. En ausencia de cobre, no se expresaría la Pc, mientras que el Cit c6 se expresaría en células vegetativas y heterocistos, siendo además en este tipo celular donde encontramos una mayor expresión de la proteína. Así mismo, el Cit c6 sería el único donante de electrones soluble en Nostoc sp. PCC 7119 capaz de reaccionar con la oxidasa terminal Cox2 de heterocistos, ya que en este tipo celular es necesaria una alta actividad respiratoria, que es incapaz de cubrir la Pc. Además, el Cit c6 se puede localizar en el espacio periplásmico de las células vegetativas, donde se localiza una cadena respiratoria alternativa, mientras que la Pc solo se localiza en el lumen tilacoidal. ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 147 CONSIDERACIONES GENERALES ! ! CONSIDERACIONES GENERALES ! ! ! 148 ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 149 5. CONSIDERACIONES GENERALES El Cit c6, cuya principal función es transferir electrones desde el complejo Cit b6-f hasta el PS I (fotosíntesis) o hasta las oxidasas terminales (respiración) [Sandmann, 1985], se encuentra presente en todas las cianobacterias cuyo genoma ha sido secuenciado [Schmetterer, 1994; Ki 2005]. Alternativamente, en muchas cianobacterias esta función la lleva a cabo la Pc, que reemplaza al Cit c6 en presencia de cobre en el medio. Algo similar ocurre en algas verdes, mientras que en plantas superiores la Pc ha reemplazado completamente al Cit c6 [Davis et al., 1980]. El gran número de genomas de organismos fotosintéticos recientemente secuenciados ha permitido encontrar una serie de secuencias codificantes similares al Cit c6 en algunas cianobacterias, algas verdes e incluso plantas. Es interesante el hecho de que en todas las cianobacterias secuenciadas se puede encontrar una copia del denominado Cit cM [Malakhov et al., 1994], cuya función se propuso que podría estar relacionada con la respiración [Manna y Vermaas, 1997], a pesar de ser incapaz de interactuar con el Cit f [Molina-Heredia et al., 2002]. Sin embargo, los resultados de esta tesis descartan esta posible función, ya que el Cit cM no interacciona eficientemente con la Cox1. Además de los genes que codifican para el Cit c6 canónico o para el Cit cM, multitud de cianobacterias presentan el Cit c6-2 [Bialek et al., 2008; Reyes-Sosa et al., 2011], e incluso, como hemos descrito en este trabajo, un tercer Cit, el Cit c6-3, que está presente sólo en cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos [Torrado et al. 2016]. Por lo tanto, en cianobacterias como Nostoc sp. PCC 7119, cuyas cadenas de transporte fotosintética y respiratoria se encuentran localizadas en los mismos sistemas de membranas [Blankenship, 1992], encontramos genes codificantes de cuatro citocromos solubles que podrían aportar una gran versatilidad al metabolismo de estas cianobacterias. Está bien descrito el papel fotosintético o respiratorio del Cit c6 y Pc, mientras que poco o nada se conocía de estos citocromos alternativos hasta este trabajo. ! ! CONSIDERACIONES GENERALES ! ! ! 150 4.5. Localización subcelular de los citocromos alternativos A la hora de establecer la posible función de estos Cit, es muy importante conocer la localización de estas proteínas, así como saber cuáles son sus niveles de expresión relativos. Respecto al Cit c6-2 o al Cit cM, pese a numerosos intentos de determinar su localización subcelular en las condiciones de cultivo estudiadas, sólo se pudo detectar su presencia en el organismo. Esto es debido al bajo nivel de expresión de dichas proteínas, lo que nos conduce a pensar que no jugarán un papel determinante como proteínas de transferencia de electrones masiva. En relación al Cit c6-3, sí que encontramos unos niveles de proteína significativos, pero no suficientes como para establecer una localización subcelular definitiva. Cabe destacar que esta proteína se encuentra únicamente en cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, por lo que en principio podría jugar algún tipo de papel en el desarrollo y función del heterocisto o como regulador del metabolismo del nitrógeno. Por ello, se realizaron estudios en presencia o ausencia de nitrógeno combinado, resultando que, en presencia de nitrógeno combinado, la expresión de la proteína es inferior en heterocistos que en células vegetativas. Esto es muy llamativo ya que, según los datos de reacción con las oxidasas específicas de heterocistos y el hecho de que esta proteína solo esté presente en cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, esperábamos lo opuesto. Park y colaboradores [2013] publicaron un análisis del genoma de A. variabilis, una cianobacteria similar a Nostoc, bajo diferentes condiciones diazotróficas y encontraron que el gen petJ-3 aumentaba su expresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, aunque como ya hemos comentado, los datos obtenidos sobre cantidad de proteína total in vivo nos induzcan a concluir lo contrario. A modo de conclusión podemos afirmar que los niveles de expresión de los Cit cM y c6-2 son muy bajos en las condiciones de cultivo que hemos estudiado, ! ! ! Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c6 ! ! ! 151 llegando al nivel de la autofluorescencia del silvestre, por lo que no podemos concretar la localización subcelular. Respecto al Cit c6-3, concluimos que la proteína se expresa en células vegetativas en presencia de nitrógeno combinado. Sin embargo, cuando la célula entra en condiciones de crecimiento diazotrófico y desarrolla heterocistos, los niveles de Cit c6-3 disminuyen sensiblemente en el heterocisto. En cualquier caso, los niveles de expresión del Cit c6-3 son muy inferiores a los del Cit c6 y no presentan ningún tipo de regulación por cobre. 4.6. Posible función de los citocromos alternativos en fotosíntesis La fotosíntesis es uno de los procesos estudiados en relación a los Cit alternativos, ya que el Cit c6 es uno de los principales transportadores de electrones desde el Cit b6-f hasta el PS I. La presencia de estos Cit alternativos abriría la posibilidad de que en cianobacterias como Nostoc pudiesen jugar un papel accesorio en este proceso fisiológico. El Cit c6-2, como describieron Reyes-Sosa y colaboradores [2011], es capaz de interaccionar con el PS I de forma relativamente eficiente, aunque con cinéticas muy inferiores al Cit c6 o a la Pc, sus principales donadores fisiológicos en la cadena fotosintética. Sin embargo, el bajo potencial rédox de esta proteína le impide ser capaz de captar electrones desde el Cit f, aunque sí que le permitiría donárselos. Esto, unido a la baja cantidad de proteína observada, imposible de localizar con la proteína reportera GFP, descarta al Cit c6-2 como transportador de electrones en fotosíntesis. Por ello, aunque se podría especular sobre si este Cit podría desempeñar, o no, un papel en la fotosíntesis, como algún tipo de sensor o regulador, queda descartado como un donador fotosintético masivo. Respecto a los citocromos c6-3 y cM, tras los estudios cinéticos realizados, concluimos que no interaccionan eficientemente con el PS I, ya que las