Caracterización de EMX1 y EMX2 como nuevos genes supresores de tumores en sarcoma

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA CARACTERIZACIÓN DE EMX1 Y EMX2 COMO NUEVOS GENES SUPRESORES DE TUMORES EN SARCOMA Manuel Pedro Jiménez García Licenciado en Biología Tesis doctoral Director: Amancio Carnero Moya Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) 2019 Introducción ii Dr. Amancio Carnero Moya, CERTIFICA: Que Manuel Pedro Jimenez García ha trabajado bajo su dirección en el trabajo titulado “CARACTERIZACIÓN DE EMX1 Y EMX2 COMO NUEVOS GENES SUPRESORES DE TUMORES EN SARCOMA” que presenta para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Que el trabajo ha sido realizado en el grupo de Biología Molecular del Cáncer, del Departamento de Oncohematología y Genética, del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). El trabajo ha sido realizado con una beca del plan de formación de personal universitario (FPU) del Ministerio de Educación (convocatoria 2013, código: FPU13/00426). Y una beca de estancia breve del Ministerio de Educacion (convocatoria 2016, código: EST16/00293). Sevilla, 5 de abril de 2019 El doctorando, El director de la tesis, El tutor de la tesis, Manuel P. Jiménez García Dr. Amancio Carnero Moya Dr. Ricardo Pardal Redondo 1 Entre expectativas y espejismos, este insólito víaje Gracias Pilar Delgado Maturana, por inspirar parte de esta vocación Introducción ii 3 ÍNDICE RESUMEN ...................................................................................................................................... i ABSTRACT .................................................................................................................................. iii ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................... v ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................... vii ABREVÍATURAS ........................................................................................................................ vii INTRODUCCIÓN........................................................................................................................... 1 1. El sarcoma humano y su origen embrionario ...................................................................... 3 2. Clasificación de los sarcomas humanos .............................................................................. 4 3. Mecanismos moleculares del proceso de sarcomagénesis ................................................ 7 3.1. Mecanismos genéticos en el proceso de sarcomagénesis ......................................... 7 3.1.1. Mutaciones en genes que afectan las vías de señalización................................ 7 3.2.3. Eventos que alteran la integridad genómica ....................................................... 7 3.3.3. Las alteraciones del número de copias de ADN ................................................. 8 3.4. Mecanismos epigenéticos en el proceso de sarcomagénesis..................................... 8 3.4.1. La metilación del ADN ......................................................................................... 8 3.4.2. Los procesos de modificación de las histonas .................................................... 8 3.4.3. Los procesos de remodelación de la cromatina .................................................. 9 3.4.4. MicroARNs y ARNs no codificantes .................................................................... 9 5. Células madre del cáncer y sus vías de señalización reguladoras ................................... 10 5. Familia de genes homeodominio Empty Spiracles Homeobox (EMX) .............................. 10 5.1. Situación en el genoma, estructura proteica y expresión tisular. .............................. 10 5.2. Papel de EMX en el desarrollo neuro-ontogénico ..................................................... 11 5.2.1. Patrón de expresión de Emx1/Emx2 en el embrión de ratón en desarrollo ...... 12 5.2.2. Papel de Emx1 en el desarrollo encefálico ....................................................... 15 5.2.3. Papel de Emx2 en el desarrollo encefálico ....................................................... 16 5.2.4. Papel de Emx1 y Emx2 analizado en los modelos KO ..................................... 16 5.2.5. Papel de EMX en la biología de las células madre neurales ............................ 17 5.3. Papel de EMX en el desarrollo urogenital.................................................................. 18 5.4. Papel de EMX en la vía de señalización de Wnt/β-catenina. .................................... 18 5.4.1. La vía canónica de Wnt/β-catenina. .................................................................. 18 5.4.2. Efectores de la vía de Wnt/β-catenina y autorregulación de la vía. .................. 20 5.4.3. Papel de la vía de Wnt/β-catenina en las propiedades de las células madre. .. 20 5.4.4. Relación de EMX con la vía de Wnt/β-catenina ................................................ 20 5.5. Papel de EMX en el cáncer ....................................................................................... 21 5.5.1. Papel de EMX en el cáncer de pulmón ............................................................. 22 5.5.2. Papel de EMX en el mesotelioma pleural maligno ............................................ 22 5.5.3. Papel de EMX en el cáncer gástrico .................................................................. 23 5.5.4. Papel de EMX en el cáncer endometrial ........................................................... 23 Introducción ii 5.5.5. Papel de EMX en la metástasis hepática de adenocarcinoma colorrectal ........ 24 5.5.6. Papel de EMX en el glioblastoma ...................................................................... 24 5.5.7. Papel de EMX en el melanoma ......................................................................... 24 OBJETIVOS ................................................................................................................................ 25 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................... 31 1. Reactivos biológicos usados .............................................................................................. 33 2. Técnicas básicas de biología molecular ............................................................................ 33 2.1. Transformación de células quimiocompetentes ........................................................ 33 2.2. Extracción de ADN plasmídico .................................................................................. 34 2.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción ........................................................... 34 2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................................ 35 2.5. Reacción específica de metilación (MSP) ................................................................. 35 2.6. Purificación de ADN a partir de un gel de agarosa .................................................... 36 2.7. Clonaje de ADNc ........................................................................................................ 36 2.8. Ligación ...................................................................................................................... 36 2.9. Secuenciación ............................................................................................................ 37 3. Cultivos celulares ............................................................................................................... 37 3.1. Líneas celulares ......................................................................................................... 37 3.2. Cultivo y conservación de las líneas celulares .......................................................... 38 3.3. Transfección de células ............................................................................................. 38 3.3.1. Transfección por precipitación con fosfato cálcico e infección lentiviral ........... 39 3.3.2. Infección retroviral .............................................................................................. 39 3.3.3. Transfección mediante el kit comercial TransIt-X2 (Mirus) ............................... 40 3.4. Selección de las células transfectadas o infectadas ................................................. 40 4. Ensayos celulares .............................................................................................................. 40 4.1. Ensayos funcionales de tumorigénesis ...................................................................... 40 4.1.1. Ensayo de proliferación ..................................................................................... 40 4.1.2. Clonabilidad ....................................................................................................... 40 4.1.3. Crecimiento en agar blando ............................................................................... 41 4.1.4. Ensayo de invasión ............................................................................................ 41 4.1.5. Análisis y clasificación de los fenotipos clonales ............................................... 41 4.1.6. Ensayo de formación de tumoresferas .............................................................. 41 4.1.7. Ensayo de formación de tumoresferas a partir de una célula aislada ............... 42 4.2. Análisis de marcadores por citometría de flujo .......................................................... 42 5. Ensayos con modelos murinos .......................................................................................... 42 5.1. Líneas de ratónes utilizadas y mantenimiento de las colonias experimentales ........ 42 5.2. Genotipaje de las líneas utilizadas ............................................................................ 43 5.3. Ensayos carcinogénicos ............................................................................................ 44 5.4. Generación de xenotransplantes tumorales .............................................................. 44 5.5. Necropsia ................................................................................................................... 44 5 6. Técnicas de análisis de expresión a nivel de ARN ............................................................ 45 6.1. Extracción de ARN total ............................................................................................. 45 6.2. Transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) ................ 45 6.3. PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) ............................................................... 46 7. Técnicas de análisis de expresión a nivel de proteínas..................................................... 47 7.1. Anticuerpos ................................................................................................................ 47 7.2. Extracción de proteína total ....................................................................................... 47 7.3. Western blot ............................................................................................................... 47 7.4. Cuantificación de bandas de Western blot ................................................................ 48 7.5. Inmunohistoquímica en tejido de ratón ...................................................................... 48 8. Análisis de bases de datos públicas de pacientes de cáncer ............................................ 49 9. Análisis estadístico ............................................................................................................. 50 RESULTADOS ............................................................................................................................ 51 1. Estudio del papel de EMX1 y EMX2 como genes supresores de tumores en células primarias de sarcoma ............................................................................................................. 53 1.1. Caracterización de las líneas celulares primarias de sarcoma y generación de los modelos ............................................................................................................................. 53 1.2. Efecto de la sobreexpresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vitro .......................................................................................................................................... 55 1.3. Efecto de la sobreexpresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vivo .......................................................................................................................................... 55 1.4. Efecto de la sobreexpresión de EMX1/EMX2 en el fenotipo de célula madre .......... 59 1.5. Efecto de la reducción de la expresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vitro ................................................................................................................. 67 1.6. Efecto de la reducción de la expresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vivo ................................................................................................................. 69 1.7. Efecto de la reducción de la expresión de EMX1/EMX2 en el fenotipo de las células madre ................................................................................................................................ 70 2. EMX1 y EMX2 como genes supresores de tumores en modelos murinos modificados genéticamente ........................................................................................................................ 75 2.1. Caracterización de los ratónes defectivos en Emx1 y en Emx2 ................................ 75 2.2. La ausencia de Emx1 ó Emx2 incrementa la capacidad tumorigénica de los sarcomas inducidos por 3MC en los modelos murinos KO .............................................. 77 2.3. La ausencia de Emx1 ó Emx2 incrementa la inflamación en los sarcomas inducidos por 3MC............................................................................................................................. 80 2.4. La ausencia de Emx1 o Emx2 incrementa el fenotipo de las células madre en los sarcomas inducidos por 3MC............................................................................................ 83 3. Estudio del papel de EMX1/EMX2 y su relación con la vía de Wnt/β-catenina en sarcoma ................................................................................................................................................ 87 Introducción vi Figura 22. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en el fenotipo de los clones en los modelos celulares de sarcoma…………………………………………………………………………………...71 Figura 23. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en la formación de tumoresferas en los modelos celulares de sarcoma………………………………………………………………………...72 Figura 24. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en la expresión de genes relacionados con el fenotipo de célula madre…………………………………………………………………………….73 Figura 25. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en el porcentaje de células CD133+ de los modelos celulares de sarcoma………………………………………………………………………...74 Figura 26. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en la expresión de genes involucrados en la transición epitelio-mesénquima……………………………………………………………………..75 Figura 27. Caracterización de la ausencia de Emx1 y Emx2 en ambas líneas de ratónes KO………………………………………………………………………………………………………...76 Figura 28. Características fisiológicas de los ratónes defectivos en Emx1 y Emx2……………..77 Figura 29. Modelo de sarcomagénesis in vivo inducida por 3MC en las diferentes cohortes de los ratónes KO de Emx1 y Emx2……………………………………………………………………...79 Figura 30. Efecto de la depleción de Emx1 o Emx2 en la capacidad de invasión tumoral de la médula ósea del fémur en los sarcomas inducidos por 3MC………………………………………80 Figura 31. Caracterización inmuno-fenotípica de KI67 de los sarcomas obtenidos por la inducción de 3MC en los KO de Emx1 y Emx2………………………………………………..…….81 Figura 32. Caracterización inmuno-fenotípica de CD45 de los sarcomas inducidos por 3MC, en los modelos KO………………………………………………………………………….……………...82 Figura 33. Caracterización inmuno-fenotípica de F4/80 de los sarcomas inducidos por 3MC, en los modelos KO………………………………………………………………………………………….83 Figura 34. Caracterización inmunofenotípica de EMX1 y NESTINA en los sarcomas obtenidos por la inducción de 3MC en los KO de Emx1………………………………………………………..85 Figura 35. Caracterización inmunofenotípica de EMX2 y NESTINA en los sarcomas obtenidos por la inducción de 3MC en los KO de Emx2…………………………………………………….….86 Figura 36. Análisis de los niveles de expresión de los genes reguladores de la biología de las células madre en los sarcomas inducidos por 3MC de los KO de Emx1 y Emx2………...……..87 Figura 37. La expresión de EMX1 y EMX2 correlaciona con los efectores de la vía de Wnt en muestras de pacientes de sarcoma……………………………………………..…………………….89 Figura 38. Caracterización transcripcional y proteica del estado de activación de la vía canónica de Wnt en las líneas primarias de sarcoma………………………..……………………………...…91 Figura 39. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en la expresión de genes relacionados con la vía de señalización Wnt………………………………………………...………92 Figura 40. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en la expresión de genes relacionados con la vía de señalización Wnt…………………………………………………………………………..…93 Figura 41. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt………………………………………………………………………...…95 vii Figura 42. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en los genes de la vía canónica de Wnt…………………..……….96 Figura 43. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en la capacidad proliferativa y la clonabilidad en AA………...…..98 Figura 44. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en la capacidad proliferativa y la clonabilidad en AW………..…..99 Figura 45. Efecto funcional de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2, en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en la capacidad de formación de tumoresferas……………………………………………………………………………………………100 Figura 46. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en los genes de las células madre ……….………………………101 Figura 47. Análisis de la supervivencia global de EMX1 y EMX2 en sarcoma…………………102 Figura 48. Modelo del papel de EMX1/EMX2 en el proceso de sarcomagenesis de los precursores de los sarcomas……………………....…………………...……………………………111 Figura 49. Modelo del papel de EMX1/EMX2 como genes supresores de tumores y su posible mecanismo de acción…………………………………………………………………………………113 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Clasificación de los subtipos de sarcoma según la WHO/OMS…………………………..5 Tabla 2. Características de los plásmidos utilizados………………………………………………..33 Tabla 3. Digestiones dobles realizadas……………………………………………………………...35 Tabla 4. Características de la PCR específica de metilación……………………………………..36 Tabla 5. Cebadores utilizados en la secuenciación de cada plásmido…………………………...37 Tabla 6. Características de las líneas celulares utilizadas…………………………………………38 Tabla 7. Características de las PCR utilizadas para el genotipaje de las diferentes líneas de ratón……………………………………………………………………………………………………....43 Tabla 8. Sondas TaqMan utilizadas en la qRT-PCR………………………………………………..46 Tabla 9. Características de los anticuerpos utilizados………………………………………………47 Tabla 10. Anexo Figura 37. Genes de la vía de Wnt correlacionados con EMX1/EMX2 (parte 1 de 2)……………………………………………………………………………………………….....…133 Tabla 11. Anexo Figura 37. Genes de la vía de Wnt correlacionados con EMX1/EMX2 (parte 2 de 2). ……………………………………………………………………………………………………134 ABREVÍATURAS ADN: acido desoxirribonucleico ADNc: ADN complementario ADNr: ADN ribosómico Amp: ampicilina ARN: acido ribonucleico ARNasa: ribonuleasa A Introducción viii ARNm: ARN mensajero Blast: blasticidina CSC: células madres tumorales C-terminal: extremo carboxi-terminal de la proteína DMEM: medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco DMSO: dimetilsulfóxido EDTA: acido etilen diamino tetracetico EV: vector plasmídico vacío FACS: citometría de flujo FBS: suero fetal bovino FC: transfección por precipitación de fosfato cálcico F10: medio de cultivo F10 de Ham. GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato G418: geneticina Kan: kanamicina KEGG: por sus siglas en inglés Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KO: knock out LB: medio de cultivo de bacterias Luria-Bertani MIFT: factor de transcripción asociado con microftalmia NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato N-terminal: extremo amino terminal de la proteína ORF: marco de lectura Pb: pares de bases PBS: tampón fosfato alcalino PCR: reacción en cadena de la polimerasa pRS: pRetroSuper Puro: puromicina qPCR: PCR cuantitativa RPMI: medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute RT-PCR: transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa RT-qPCR: transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa SC: sh-ADN de secuencia aleatoria (del inglés, scrambled shDNA) SD: desvíación estándar SDS: docedil sulfato sódico SG: supervivencia global shARN: horquilla corta de RNA, complementaria a ARNm TCGA: por sus siglas en inglés The Cancer Genome Atlas WB: Western blot 1 INTRODUCCIÓN Introducción 2 Introducción 3 1. El sarcoma humano y su origen embrionario El cáncer es una enfermedad multifactorial cuyo origen son alteraciones en el genoma que pueden ocurrir a nivel genético y epigenético. Dichas alteraciones pueden ocurrir sobre dos conjuntos de genes: los oncogenes y los genes de susceptibilidad tumoral, que engloban los genes supresores de tumores y los genes de reparación del ADN. En el caso de los oncogenes la alteración de uno solo de sus alelos es suficiente para producir la activación oncogénica. En contraposición, los genes de susceptibilidad tumoral comprende aquellos cuya ausencia o mutación causa un aumento de la probabilidad de aparición de tumores. En el proceso de tumorigénesis las células sufren una serie de cambios fisiológicos, adquiriendo nuevas capacidades biológicas que les permiten romper la homeostasis tisular y escapar a los mecanismos de defensa anti-tumoral. Se han descrito diez alteraciones esenciales en la fisiología celular que dictan el crecimiento maligno: (1) la independencia de las señales de crecimiento, (2) la insensibilidad a las señales anti-proliferativas, (3) la resistencia a la muerte celular programada o apoptosis, (4) el potencial replicativo ilimitado, (5) la promoción de la angiogénesis, (6) la adquisición de la capacidad invasiva y la metástasis, (7) la inflamación relacionada con el tumor, (8) la desregulación de la energética celular, (9) la evasión de la respuesta inmune y (10) la inestabilidad genómica y el acúmulo de mutaciones1,2,3. Los sarcomas humanos, son tumores malignos poco comunes, que afectan a aproximadamente 200.000 individuos en todo el mundo cada año. Una prevalencia de 1 caso por cada 10.000 habitantes. Suponen aproximadamente menos del 5% de las neoplasias de los pacientes adultos y en torno a un 10% de los tumores infantiles. Algunos, como el sarcoma sinovíal, el sarcoma de Ewing o el osteosarcoma, son más frecuentes en los adolescentes o en los adultos jóvenes, mientras que el leiomiosarcoma o el liposarcoma son más frecuentes en pacientes de edad superior a los 55 años4. Dependiendo del subtipo, surgen a partir de dos orígenes embrionarios diferentes: de los precursores mesenquimales o mesodérmicos4–13 y de los precursores de la cresta neural14–18. Adicionalmente, se ha propuesto que los tumores de cabeza y cuello que deriven exclusivamente de cartílago, hueso, músculo y tejido adiposo tienen origen en la cresta neural, siendo sarcomas15,19. Generalmente todos los sarcomas tienen orígenes genéticos complejos y son clínicamente heterogéneos. Muchos sarcomas surgen impulsados por una única anomalía genética y algunos son progresivos presentando genomas complejos5. Generalmente, surgen de linajes múltiples y van desde sus formas benignas o intermedias a altamente invasivos y metastásicos8,20,21 El tejido mesenquimal se forma a partir de las células madre mesenquimales (MSCs) que derivan de la capa blastodérmica del mesodermo. El mesodermo durante la ontogenia se diferencia en mesodermo paraxial, intermedio y lateral. El paraxial da lugar al mesodermo dorsal-somítico, que a su vez forma las estructuras esclerotoma y miotoma, de los que derivan los diferentes tejidos mesenquimales que no comprenden la región cefálica. Permiten diferenciarse en el tejido adiposo, el cartilaginoso, el óseo, el hematopoyético y el muscular. Adicionalmente, dan lugar a los tejidos conectivos no especializados, que derivan en los tejidos conectivos laxo y denso6,11–13. Introducción 4 Por otro lado, la cresta neural es una estructura embrionaria transitoria en el embrión de vertebrados que da lugar a una población altamente versátil de células pluripotentes que contribuyen a la formación de múltiples tejidos. Las células derivadas de la cresta neural han desarrollado mecanismos especializados para promover su transición de un epitelio a un fenotipo mesenquimal, proceso denominado transición epitelio mesénquima. Estas capacidades de migración, de proliferación celular y de diferenciación celular en diversos tipos de células dependen del microambiente durante y después de la ruta migratoria. Desregulaciones a nivel de estas características pueden convertirse en un riesgo al contribuir en los procesos de la tumorigénesis y la metástasis14,15,22,23. Las células derivadas de la cresta neural contribuyen al desarrollo de múltiples tipos de células y tejidos, como los melanocitos, las células de Schwann, las células del sistema nervioso autónomo simpático y parasimpático, las células del sistema nervioso autónomo entérico, las células del sistema sensorial nervioso periférico, la medula suprarrenal y los derivados del cartílago y los huesos de la región cefálica. Para que las células derivadas de la cresta neural generen estos diversos tipos de células requieren de un programa transcriptómico de genes altamente orquestado. Este programa depende de las señales celulares y extracelulares que regulan la migración, la proliferación, la diferenciación y la supervivencia a larga distancia, para dar lugar a los histotipos derivados14,15,22. En términos generales, se ha propuesto que los sarcomas que derivan de la cresta neural son los sarcomas schwannoma, el tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST), el neurotecoma, el tumor rabdoide y el sarcoma sinovial17,24–26. 2. Clasificación de los sarcomas humanos Los sarcomas se clasifican atendiendo a diferentes criterios, como la histología, la clínica, la ultraestructura, el patrón inmunohistoquímico y la genética del tumor. Se clasifican en dos grandes categorías atendiendo a su genética molecular: los sarcomas con cariotipos casi diploides y alteraciones genéticas simples, que incluyen translocaciones o mutaciones activadoras específicas y los sarcomas con cariotipos complejos, por la inestabilidad del genoma y la heterogeneidad de las aberraciones genómicas8,27. Estas categorías no reflejan la diversidad genética entre los tumores de cada clase, el subtipo de sarcoma, ni su biología tumoral particular4,5,9. Los sarcomas tienen una presentación histológica muy variable, ya que suponen un grupo de tumores muy heterogéneo cuyo diagnóstico anatomo-patológico resulta complejo. Por lo tanto, la clasificación de los sarcomas suele ser difícil, así como su comportamiento clínico. Se engloban en tres grandes bloques: tumores de partes blandas, tumores de hueso y tumores derivados de síndromes familiares o hereditarios. En la Tabla 1, se resumen todos los tipos de sarcoma de partes blandas y de hueso, de acuerdo con la normativa de WHO (World Health Organization) o de la OMS (Organización Mundial de la Salud)21,28. Introducción 5 Tabla 1. Clasificación de los subtipos de sarcoma según la WHO/OMS. Tipo Benignos Intermedios Malignos Tumores de tejidos blandos Tumores adipocíticos Lipoma Lipomatosis Lipomatosis del nervio Lipoblastoma / lipoblastomatosis Angiolipoma Miolipoma de tejido blando Lipoma condroide Angiomiolipoma extrarenal Mielolipoma extra suprarrenal Célula fusiforme / lipoma pleomórfico Hibernoma Tumor lipomatoso atípico / liposarcoma bien diferenciado Liposarcoma desdiferenciado Liposarcoma mixoide Liposarcoma pleomórfico Liposarcoma, no especificado Tumores fibroblásticos / miofibroblásticos Fascitis nodular Fascitis proliferativa Miositis proliferativa Miositis osificante Pseudotumor fibroóseo de los dedos Fascitis isquémica Elastofibroma Hamartoma fibroso de la infancia Fibromatosis colli Fibromatosis hialina juvenil Fibromatosis del cuerpo de inclusión Fibroma de la vaina del tendón Fibroblastoma desmoplásico Miofibroblastoma de tipo mamario Fibroma aponeurótico calcificante Angiomiofibroblastoma Angiofibroma celular Fibroma de tipo nucal Fibroma Gardner Tumor fibroso calcificante Fibromatosis palmar / plantar Fibromatosis de tipo Desmoides Lipofibromatosis Fibroblastoma de células gigantes Dermatofibrosarcoma protuberans Tumor fibroso solitario Tumor miofibroblástico inflamatorio Sarcoma miofibroblástico de bajo grado Sarcoma fibroblástico mixoinflamatorio Fibrosarcoma infantil Fibrosarcoma adulto Mixofibrosarcoma Sarcoma fibromixoide de bajo grado Fibrosarcoma epitelioide esclerosante Tumores fibrohistiocíticos Tumor de células gigantes tenosinovíales Histiocitoma fibroso benigno profundo Tumor fibrohistiocítico plexiforme Tumor de células gigantes de tejido blando Tumor de células gigantes tenosinovíales Tumores del músculo liso Leiomioma de tejido blando profundo Leiomiosarcoma Tumores pericíticos (perivasculares). Tumores del músculo esquelético Rabdomioma Rabdomiosarcoma embrionario Rabdomiosarcoma alveolar Rabdomiosarcoma pleomórfico Rabdomiosarcoma alveolar (ARMS) Tumores vasculares Haemangioma Hemangioma epitelioide Hemangioendotelioma epitelioide Angiosarcoma Tumor de estroma gastrointestinal (GIST) Tumor de estroma gastrointestinal benigno Tumor de estroma gastrointestinal, potencial maligno incierto Tumor de estroma gastrointestinal maligno Tumores de la envoltura nerviosa Schwannoma (incluyendo variantes) Schwannoma melanótico Neurofibroma (incluyendo variantes) Perineurioma Tumor maligno de la vaina del nervio periférico Tumor de la vaina nerviosa maligna epitelioide Tumor maligno de Triton Tumor maligno de células granulares Introducción 6 Tipo Benignos Intermedios Malignos Tumor de células granulares Mixoma de la envoltura del nervio dérmico Neuroma solitario circunscrito Meningioma ectópico Heterotopia glial nasal Tumor benigno de Triton Tumores de la envoltura nerviosa híbrida Ectomesenquimoma Tumores de diferenciación incierta Fibromixoma acral Mixoma intramuscular (incluida la variante celular) Mixoma yuxtarticular Angiomyxoma profundo ("agresivo") Tumor angiectásico hialinizante pleomórfico Timoma hamartomatoso ectópico Tumor fibrolipomatoso hemoserótico Fibroxantoma atípico Histiocitoma fibroso angiomatoide Tumor fibromixoide osificante Tumor mixto NOS Tumor mixto NOS, maligno Mioepitelioma Carcinoma mioepitelial Tumor mesenquimal fosfatúrico, benigno Tumor mesenquimal fosfatúrico, maligno Sarcoma sinovíal NOS Sarcoma epitelioide Sarcoma alveolar de partes blandas Sarcoma de células claras de tejido blando Condrosarcoma mixoide extraesquelético Sarcoma de Ewing extraesquelético Tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas Tumor rabdoideo extrarenal Neoplasmas con diferenciación de células epitelioides perivasculares (PEComa) Sarcomas indiferenciados / no clasificados Sarcoma de células fusiformes indiferenciadas Sarcoma pleomórfico indiferenciado Sarcoma de células redondas indiferenciado Sarcoma epitelioide indiferenciado Sarcoma indiferenciado NOS Sarcoma de células redondas y de células fusiformes no diferenciadas Sarcoma pleomorfo indiferenciado (UPS) Tumores de hueso Tumores condrogénicos Osteocondroma Condroma Osteocondromixoma Exostosis subungueal Proliferación osteocondromatosa parosteal Condromatosis sinovíal Fibroma condromixoide Tumor cartilaginoso atípico / condrosarcoma grado I Condroblastoma Condrosarcoma (Grado II, grado III) Condrosarcoma desdiferenciado Condrosarcoma mesenquimal Condrosarcoma de células claras Osteocondromixoma Proliferación osteocondromatosa parosteal Condrosarcoma Tumores osteogénicos Osteoma Osteoma osteoide Osteoblastoma Osteosarcoma central de bajo grado Osteosarcoma convencional Osteosarcoma telangiectásico Osteosarcoma de células pequeñas Osteosarcoma secundario Osteosarcoma parosteal Osteosarcoma periosteal Osteosarcoma superficial de alto grado Tumores osteoclásticos Lesión de células gigantes de los huesos pequeños Tumor de células gigantes de hueso Tumor maligno de células gigantes de hueso Tumores fibrohistiocíticos Histiocitoma fibroso benigno / fibroma no osificante Tumores notocordales Tumor notocordal benigno Cordoma Introducción 7 3. Mecanismos moleculares del proceso de sarcomagénesis En el proceso de sarcomagénesis existen mecanismos moleculares genéticos y epigeneticos, los cuales son dependientes del contexto. Los mecanismos genéticos son: las mutaciones somáticas en genes que afectan las vías de señalización celulares, la desregulación de la expresión génica por factores de transcripción aberrantes generados por translocaciones cromósomicas y las alteraciones del número de copias de ADN. Por otro lado, los mecanismos epigenéticos de la sarcomagénesis son: la metilación del ARN, la modificación de las histonas, los microARNs y los ARNs no codificantes y la remodelación de la cromatina5,27,29,30. 3.1. Mecanismos genéticos en el proceso de sarcomagénesis 3.1.1. Mutaciones en genes que afectan las vías de señalización Las alteraciones moleculares son mutaciones adquiridas y somáticas o eventos moleculares que afectan a la vía germinal constituyendo los diferentes síndromes familiares. En las mutaciones adquiridas-somáticas se engloban cinco grandes tipos de mutaciones: las delecciones, las amplificaciones, las translocaciones, las inversiones y las mutaciones puntuales. Excluyendo las fusiones de genes por translocación, se han descrito pocas mutaciones en genes controladores altamente recurrentes en diferentes subtipos específicos de sarcoma, entre ellas las mutaciones puntuales en PIK3CA en el liposarcoma y BRAF en el tumor del estroma gastrointestinal (GIST); las mutaciones de amplificación en JUN en el liposarcoma y MYOCD en el leiomiosarcoma; o las delecciones y mutaciones puntuales del gen NF1 en los mixofibrosarcomas, el liposarcoma pleomórfico y el tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST)5,27. 3.1.2. Eventos que alteran la integridad genómica Las mutaciones pueden alterar la integridad genómica. Sin embargo, el caso de las translocaciones es de los más acusados a nivel molecular. Una translocación es el intercambio de material genético entre dos cromosomas no homólogos. Como resultado de las translocaciones se produce la interrupción o activación de ciertos genes, que se recombinan creando fusiones génicas. Estas tienen estructura y funciones nuevas porque se combinan dominios funcionales o promotores activados que se encontraban en moléculas separadas. La mayor parte de las proteínas quiméricas son factores de transcripción; es decir, proteínas con capacidad de unión a las regiones reguladoras de la transcripción de ciertos genes. Éstos están habitualmente implicados en ciertas funciones clave para la célula, como la proliferación o la supervivencia celulares. Ejemplos de translocaciones representativas en sarcomas son las de EWS-FLI1, EWS-ERG y EWS-OCT4 en el sarcoma de Ewing; las de SS18-SSX1 y SS18-SSX2 en el sarcoma sinovíal, y la de PAX3-FKHR en el rabdomiosarcoma alveolar, entre muchas otras7,27,31. Introducción 14 Figura 2. Patrón de expresión de EMX1 y EMX2 en tejidos normales y tumorales humanos. En (A) niveles de expresión tisulares según la base de datos The Human Protein Atlas (HPA). En (B) se representan los niveles de expresión de EMX1 extraídos de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA). En (C) el patrón de expresión nucleolar de EMX1 coloreado en color verde, extraído de HPA. (D y E) Patrón de expresión de EMX2 según HPA (D) y TCGA (E). (F) EMX2 se expresa en la célula a nivel nuclear, representado en color verde. En los gráficos (A, B, D y E) se indica en negrita y color morado los tejidos de expresión comunes a EMX1 y EMX2. Solo en negrita y color negro los específicos de cada gen. En ambos paneles de ambas bases de datos se muestran los niveles de expresión del ARNm relativos normalizados. Introducción 15 Figura 3. Patrón de expresión de EMX1 y EMX2 en el desarrollo neural. (A) Regulación de los precursores neurales por Emx2, Notch, Hes1 y Hes5 en la especificación de los distintos destinos de las células neuronales y gliales en el telencéfalo dorsal y ventral (adaptado de91). En (B) el patrón de expresión Emx2 en gradiente verde en la región dorsal del tubo neural con respecto a los derivados de la cresta neural. Intervienen con Emx2 los factores Gli3 y Pax6. Y en el gradiente dorsal del tubo neural: Shh, Nkx2.1 y Fgf8 (adaptado de22,104). (C) Patrón de expresión de los reguladores del desarrollo neuroontogénico del encéfalo murino en estadío 11 (E11). En la región del telencéfalo intervienen Emx1, Emx2 Fgf8 y Shh, en el diencéfalo y mesencéfalo Wnt1 y Shh y en el rombencéfalo Wnt1, Shh, Fgf4 y BMPs. Se destaca la expresión opuesta de Emx1 y Emx2 con respecto a Wnt1 (Tel: telencéfalo, Di: diencéfalo, Mes: mesencéfalo, Met: metencéfalo, Cb: cerebelo, Rom: rombencefalo) (adaptado de87,105–107). 5.2.2. Papel de Emx1 en el desarrollo encefálico Emx1 se expresa en la mayoría de las neuronas corticales. En la corteza cerebral madura, Emx1 se expresa en neuronas diferenciadas y ya organizadas97. La transcripción de Introducción 16 Emx1 está ampliamente distribuida a través de la corteza cerebral, de tal manera que Emx1 podría participar en los circuitos funcionales iniciales, así como en la definición de las identidades celulares específicas en la corteza cerebral108–110. El análisis de la distribución de Emx1 ha revelado que la mayoría se detecta en los núcleos de las células del telencéfalo en desarrollo, incluida la corteza cerebral, los bulbos olfatorios y el hipocampo111. De la misma manera que para el ARNm de Emx1, la proteína está presente en prácticamente todas las neuronas corticales, en diferentes cantidades, durante la proliferación, la migración, la diferenciación y la maduración. En embriones de gestación media y tardía, así como en ratónes postnatales, la distribución de Emx1 persiste en la corteza cerebral, los bulbos olfatorios, el giro dentado y el hipocampo, siendo este último una fuente de células madre y nuevas neuronas108–110. Es muy difícil atribuir una función precisa a Emx1 en el telencéfalo en desarrollo. Sin embargo, su presencia a lo largo de la corticogénesis podría conferir la identidad celular a las neuronas corticales88,95,96. 5.2.3. Papel de Emx2 en el desarrollo encefálico El gen Emx2 es un marcador dorsal del desarrollo de la corteza cerebral. Su estudio es más profundo que la isoforma Emx1. Es interesante destacar el gradiente antero-posterior y medio-lateral que forma a partir del E14.5 en adelante84,97, interviniendo directamente en la maduración de los neuroblastos durante la corticogénesis88,95,96. Emx2 podría tener un papel como un inhibidor de la proliferación celular, de la migración de los neuroblastos corticales, así como de la regulación de su proceso de diferenciación88,95,96. Adicionalmente, se conoce que al final de la gestación, Emx2 también se expresa en las capas celulares específicas del hipocampo, la amígdala y los cuerpos mamilares, estructuras cruciales involucradas en los procesos del aprendizaje y la memoria. Los niveles elevados en el hipocampo sugieren que Emx2 interviene no solo en la proliferación celular, sino también en los procesos cognitivos88,95,96. 5.2.4. Papel de Emx1 y Emx2 analizado en los modelos KO Los ratónes Emx1(-/-) son víables y muestran defectos muy leves restringidos al cerebro anterior107. Se ven afectadas las estructuras anatómicas de la placa cortical, la sustancia blanca, el giro dentado y el hipocampo112. Además, a pesar de no tener defectos de comportamiento evidentes, los ratónes knock out (KO) de Emx1 carecen de la mayoría o la totalidad del cuerpo calloso, que supone el tracto fibrilar principal que conecta ambos hemisferios. Se ha demostrado que esta anormalidad depende de la cepa del ratón y que presenta penetrancia incompleta en ratónes heterocigotos102. El análisis del fenotipo de los embriones de ratónes Emx2(-/-) ha demostrado que Emx2 desempeña un papel importante en la proliferación, la migración y la diferenciación de los neuroblastos, así como en el desarrollo del diencéfalo113. Los cerebros de embriones KO de Emx2 tienen importantes alteraciones y cambios estructurales en la arquitectura de varias regiones, incluidas la corteza cerebral y el hipocampo. En particular, se observa la reducción de Introducción 17 los bulbos olfatorios y se modifica el patrón estructural del hipocampo con una ausencia total de la circunvolución dentada y de las células Cajal-Retzius93,94,114. Emx2 parece contribuir al tamaño del hipocampo y las anomalías son mucho más acusadas que las que cursa el KO de Emx1112. En este proceso, se observa una cooperación de Reelin y Emx2, de manera que Reelin disminuye gradualmente115. La función de Reelin es la de dirigir la migración neuronal al unirse a los receptores de lipoproteínas VLDLR y LRP8 (ApoER2)115. Adicionalmente, se ha demostrado que los factores ems y orthodenticle (otd) de D. melanogaster y sus homólogos de vertebrados Emx1/Emx2 y Otx1/Otx2, son genes que intervienen en la especificación del neuroectodermo y además tienen un papel en la formación del sistema sensorial en vertebrados e invertebrados. Los genes ems/Emx son esenciales para el desarrollo de las neuronas periféricas y centrales del sistemas olfativo, mientras que Otd/Otx son esenciales para el desarrollo de las neuronas periféricas y centrales del sistema visual116. En los ratónes Emx2(-/-), se observa la ausencia de la lámina de la escápula, por lo que se ha sugerido que Emx2 está involucrado en la formación de la escápula117. Además, se ha comprobado que la ausencia de EMX2 debido a mutaciones aparece en los trastornos de la proliferación celular y la migración que provocan neuropatologías humanas como la esquizencefalia, que son malformaciones corticales congénitas poco frecuentes del desarrollo118. Estos hallazgos respaldan la hipótesis de que EMX2 es necesario para la formación correcta de la corteza cerebral humana118. Con motivo del estudio de la posible redundancia funcional en el proceso de la corticogénesis entre los genes Emx1 y Emx2, se realizó el ratón doble KO. En los mutantes dobles se producían anomalías en el desarrollo de las estructuras del archipalio y del plexo coroideo, afecciones que producen un fenotipo letal. Se ha propuesto que Emx1 y Emx2 cooperan en la generación del límite entre el techo y el archipalio, paso que acontece inmediatamente después del cierre del tubo neural, concomitante con la expresión de Emx1119. 5.2.5. Papel de EMX en la biología de las células madre neurales Distintos conjuntos de células precursoras generan la corteza cerebral de mamíferos. Durante la neurogénesis, la mayoría de los precursores se especifican para generar un solo tipo de célula y solo unos pocos son multipotentes. Se ha descrito que Emx2 en los precursores de la corteza cerebral da como resultado un aumento significativo de clones que se generan principalmente por divisiones celulares simétricas y que se diferencian en las células neuronales y las gliales. Por lo tanto, Emx2 es el primer determinante intrínseco de la célula capaz de inducir la diferenciación de precursores del sistema nervioso central hacia un destino multipotencial120. Adicionalmente, Emx2 se expresa en niveles altos en las células madre neurales adultas (ANSC) in vitro y se modula a la baja después de la diferenciación. La sobreexpresión del gen Emx2 en las ANSC tiene un efecto anti-proliferativo pero no influye en una vía particular de diferenciación. Se ha demostrado que Emx2 puede actuar promoviendo un modo Introducción 18 asimétrico de división celular, aumentando así el tamaño de una población amplificadora de tránsito121. 5.3. Papel de EMX en el desarrollo urogenital Las anomalías congénitas del riñón y del tracto urinario (CAKUT) son la causa más común de enfermedad renal crónica en los niños. Se comprobó que los genes Pax2 y Emx2 son reguladores clave del desarrollo del sistema urogenital en ratónes. El análisis de los embriones murinos tempranos de “Pax2(+/-); Emx2(+/-)” apuntaron a los defectos de la incisión en el uréter como la principal causa de anomalías del tracto urinario que acaban en una alta sensibilidad al reflujo vesico-ureteral (fenotipo CAKUT). Ambos genes se encuentran en el cromosoma 10q humano, que se pierde en una proporción de pacientes con estas anomalías122. Adicionalmente, en otro estudio sugieren que en la metanefro-génesis, Emx2 es esencial para las funciones del brote ureteral posterior a la inducción de Pax2 en el mesénquima metanéfrico123. 5.4. Papel de EMX en la vía de señalización de Wnt/β-catenina. 5.4.1. La vía canónica de Wnt/β-catenina. La señalización de Wnt regula un grupo de tres vías evolutivamente conservadas. Las tres vías de señalización comienzan con la secreción de uno de los 19 ligandos WNT, y se inicia mediante un ligando WNT que se une extracelularmente al receptor transmembranal FZD (Frizzled), que es una proteína G y a su correceptor LRP5/LRP6 (receptor de proteína relacionado con LDL 5/6). La activación de FZD conduce al reclutamiento de la fosfoproteína citoplásmatica de andamiaje DVL (Dishevelled). La inducción de una de las múltiples cascadas de señalización posibles sigue a la vía canónica de Wnt/β-catenina o a una de las otras dos vías no canónicas. Las dos vías no canónicas de Wnt son la vía de polaridad celular plana, que regula la polaridad de las células epiteliales mediante la modificación del citoesqueleto de actina124,125. Y por otro lado, la vía Wnt/Ca2+, que regula la liberación de las reservas intracelulares del ion calcio124,125. Nos centramos en la vía canónica de Wnt/β-catenina, que se relaciona con la proliferación celular y el cáncer, así como con EMX125–128. La vía canónica de Wnt presenta dos estados de activación: activo (“on”) (Figura 4A) o inactivo (“off”) (Figura 4B). El estado inactivo se produce en ausencia de algún ligando WNT. En este contexto la proteína β-catenina citoplásmática se degrada constantemente por la acción del complejo macroproteico Axin, el complejo de degradación de la β-catenina. Este está compuesto por: la proteína andamiaje AXIN, el producto del gen supresor tumoral de la poliposis adenomatosa coli (APC) y las serina/treonina quinasas: caseína quinasa 1 alfa (CK1α) y glucógeno sintasa quinasa 3 beta (GSK3-β). En determinadas condiciones, la proteína fosfatasa 2A (PP2A) se asocia con el complejo Axin cumpliendo una función reguladora129. CK1-α y GSK3-β fosforilan secuencialmente la región amino terminal de β-catenina, lo que resulta en el reconocimiento de β-catenina por β-Trcp (proteína β-transducina contenedora de repeticiones F-box) y una subunidad de ubiquitina ligasa E3. Posteriormente, se produce la Introducción 19 ubiquitinación de β-catenina por β-Trcp y tras este etiquetado post-traduccional la degradación proteolítica por el proteasoma, asociándose este a todo el macrocomplejo proteico. Esta eliminación continua de β-catenina impide que se transloque al núcleo celular y los genes diana Wnt son reprimidos por TLE (Groucho) e histonas desacetilasas (HDAC), que se unen al ADN mediante la familia de proteínas TCF/LEF (factor de células T/factor potenciador linfoide) (Figura 4B). La ruta Wnt/β-catenina se activa cuando un ligando WNT se une al receptor FDZ y su correceptor LRP5/6. La formación del complejo WNT-FDZ-LRP5/6, junto con el reclutamiento de la proteína DVL, da como resultado la fosforilación y activación de LRP5/6 y el reclutamiento del complejo Axin a los receptores. Estos eventos conducen a la inhibición de la fosforilación de β-catenina mediada por el complejo Axin y por lo tanto a la estabilización de β-catenina, que se acumula en el citoplasma. Finalmente β-catenina se transloca al núcleo para formar complejos macroproteicos con TCF/LEF y activar la expresión de conjuntos de genes (Figura 4A). En condiciones fisiológicas la vía de señalización canónica de Wnt pasa la mayor parte del tiempo en la configuración "off" o apagada, donde FDZ es inactivo y el complejo de destrucción de βcatenina en el citoplasma produce la proteólisis de la misma (Figura 4B)125,126,128,130,131. La β-catenina está dirigida a la proteólisis descrita en un proceso de dos pasos secuenciales que comienzan con la fosforilación de una secuencia conservada N-terminal rica en serinas y treoninas para crear un sitio de unión de β-TrCP para la ubiquitinación subsiguiente. El primer paso es la fosforilación de la serina 45 por CK1-α, gracias a un grupo de residuos ácidos localizados a siete aminoácidos de distancia del sitio de fosforilación. A continuación, se produce la fosforilación secuencial de la treonina 41, la serina 37 y la serina 33, por GSK3-β132. La fosforilación de cada residuo prepara el siguiente paso de fosforilación, hasta completar las tres fosforilaciones. Juntos, los cuatro residuos fosforilados crean un sitio de unión para β-TrCP. La unión de β-TrCP desencadena el reclutamiento de las subunidades de proteína Cul1/Cdc53 y Skp1, para formar la ubiquitina ligasa SCFβ-TrCP 133. La subsiguiente ubiquitinación de β-catenina la dirige a la destrucción mediada por el proteasoma125,126,128,130,131. Cabe destacar, que de muchos de los factores de esta vía se pueden producir mutaciones genéticas y alterar la ruta a favor de su estado “on” u “off”. Dependiendo del contexto situacional se pueden alterar unos procesos celulares u otros. Las mutaciones en el gen que codifica β-catenina (CTNNB1), concretamente en los sitios de fosforilación regulados por GSK3-β, hacen posible que la β-catenina mutada posea una actividad activadora de la ruta de Wnt seis veces mayor que su homólogo natural134,135. Las mutaciones que induzcan algún tipo de reducción de la actividad o la falta de función en los efectores proteicos APC o Axin, provocarán un aumento del estado activo de la ruta de Wnt. De hecho estos factores se les considera genes supresores de tumores y sus mutaciones aparecen prevalentemente en numerosas neoplasias125,126,128,130,131. Introducción 20 5.4.2. Efectores de la vía de Wnt/β-catenina y autorregulación de la vía. Debido a que la señalización de Wnt/β-catenina regula la proliferación, la especificación del destino celular y la diferenciación en numerosas etapas del desarrollo y de la homeostasis del tejido adulto, los genes diana de Wnt son diversos y específicos del contexto celular126,136. Los componentes de señalización de Wnt, incluidos: FDZ, LRP5/6, el complejo Axin, TCF/LEF, DKK y RSPO, a menudo están regulados positiva o negativamente por el complejo TCF/β-catenina. La inducción del complejo Axin, de DKK y la supresión de FDZ y LRP5/6 constituyen circuitos de retroalimentación negativa que amortiguan la señalización de Wnt (Figura 4D). La supresión de FZD y LRP5/LRP6 también mejora la formación de gradiente Wnt en distancias más largas. Por el contrario, la inducción de Wnt de las proteínas RSPO y TCF/LEF constituyen circuitos positivos de alimentación directa que refuerzan la señalización Wnt (Figura 4C). Estos diversos bucles autorreguladores de la vía Wnt se utilizan principalmente de una manera específica de la célula, proporcionando una complejidad adicional en el control de la amplitud y la duración de las respuestas Wnt125,126,128,130,131,136. Los genes diana de la señalización Wnt/β-catenina son reconocidos por los factores de transcripción TCF/LEF, a través de la región altamente conservada WRE (elemento de respuesta a Wnt, del inglés “Wnt Response Element”), compuesto por una secuencia consenso (5’-CTTTG[A/T][A/T]-3’) en la región promotora cerca del sitio de inicio de la transcripción. Desde la identificación temprana de MYC (c-Myc) y CCND1 (Ciclina D1) como genes regulados directamente por la vía de Wnt/β-catenina, numerosos genes diana TCF/LEF han sido reportados, como AXIN1/AXIN2, TCF, CD44, JUN, LEF1, MET, MMP7, etc. (Figura 4A). Muchos de estos genes son capaces de regular ampliamente la proliferación celular y el metabolismo125,126,128,130,131,136. 5.4.3. Papel de la vía de Wnt/β-catenina en las propiedades de las células madre. La cascada de señalización de Wnt ha sido identificada como un regulador de la autorenovación y la proliferación entre una variedad de poblaciones de células madre y progenitoras135,137. La evidencia que demuestra el papel que desempeña Wnt en el mantenimiento de poblaciones de células madre proviene del estudio de la renovación de diferentes tipos de tejidos, incluidos el epitelio intestinal, el tejido musculoesquelético, las células hematopoyéticas, las células madre mesenquimales y el folículo piloso. También se ha demostrado que la señalización Wnt/β-catenina es capaz de mantener el perfil transcripcional de las células madre pluripotentes y se ha encontrado que está activa en las células progenitoras implicadas en la tumorigénesis, es decir en las células madre del cáncer (CSC)125,134,135. 5.4.4. Relación de EMX con la vía de Wnt/β-catenina No se conocen los co-factores que cooperan con los genes Emx1/Emx2 para regular diferentes genes diana, sin embargo, solo el ligando Wnt1 ha sido propuesto como único gen regulado directamente por la unión de Emx2 a una región genómica potenciadora que impide la expresión de Wnt1 in vitro138. Por tanto, Emx2 es un represor directo de la expresión de Wnt1 Introducción 21 en el contexto neural del telencéfalo de mamíferos en desarrollo. Además, las interacciones Emx2-Wnt1 son esenciales para el desarrollo normal de la corteza cerebral de mamíferos107. Por otro lado, se conoce que el factor de transcripción de la vía de Shh Gli3 es un regulador de los genes Emx en ratón, interviniendo en el control del desarrollo telencefálico dorsal, uniéndose a sus secuencias reguladoras88,95,96,139. Figura 4. Descripción general de la señalización de Wnt/β-catenina. (A) En presencia del ligando Wnt, se forma un complejo receptor entre FDZ y LRP5/6. El reclutamiento de DVL por FDZ conduce a la fosforilación de LRP5/6 y al reclutamiento del complejo macroproteico Axin. Esto interrumpe la fosforilación y posterior degradación mediada por Axin de la β-catenina, lo que permite que la β-catenina se acumule en el citoplasma y se transloque al núcleo donde sirve como co-activador para que TCF/βcatenina active los genes efectores de la vía de Wnt, uniéndose a la región WRE (elemento de respuesta a Wnt, del inglés Wnt Response Element). (B) En ausencia de Wnt, la β-catenina citoplasmática forma un complejo con Axin, APC, GSK3-β y CK1-α y se fosforila una vez con CK1-α y posteriormente tres veces con GSK3-β. La β-catenina fosforilada es reconocida por la ubiquitina ligasa β-TrCP, que dirige a la βcatenina para la degradación proteosómica. Los genes diana de Wnt son reprimidos por TLE e histonas desacetilasas (HDAC), que bloquean la acción de TCF/LEF. (C y D) Mecanismos de regulación de la vía de Wnt positivos mediados por RSPO, que degrada al receptor ZNRF3 y a su vez este bloquea a FDZ (C). Y mecanismos de regulación negativos mediados por DKK, que bloquea al receptor LRP5/6 (D). 5.5. Papel de EMX en el cáncer En términos generales, se ha asociado a los genes EMX1/EMX2 a cáncer en pocas referencias bibliográficas. Estos genes se relacionan con tumores sólidos de origen epitelial: como el cáncer de pulmón140,141, el mesotelioma pleural maligno142, el cáncer gástrico143, el Introducción 22 endometrial81,140,144–147. Además, en el glioblastoma148,149, cáncer cuyo origen es mesodérmico. Adicionalmente, en la metástasis hepática cuyo origen es el adenocarcinoma colorrectal en estadío avanzado150. Y por último, en melanoma103, cáncer cuyo origen proviene de los melanocitos, un derivado de la cresta neural. 5.5.1. Papel de EMX en el cáncer de pulmón El cáncer de pulmón es un cáncer con elevada prevalencia y la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. En el cáncer de pulmón se ha comprobado que existe una desregulación de la vía de señalización canónica de Wnt en el proceso de carcinogénesis. Además, los niveles de EMX2 están reducidos en tumores de pulmón, lo que se correlaciona con una hipermetilación del promotor de EMX2. La restauración de los niveles de expresión de EMX2 suprime la proliferación celular y el fenotipo invasivo, sensibiliza las células de cáncer de pulmón para el tratamiento del cis-platino y además se produce una inhibición de la vía canónica de Wnt. Por otro lado, el silenciamiento de EMX2 in vitro ha constatado que la disminución de los niveles de EMX2 promueve la proliferación celular, el fenotipo invasivo y la activación de la vía canónica de Wnt, sugiriendo que EMX2 puede ser un gen supresor de tumores en cáncer de pulmón151,152. En otros estudios, se ha intentado establecer a EMX2 como un potencial biomarcador del pronóstico de cáncer de pulmón, presentando mejor pronóstico y mayor tasa de supervivencia aquellos pacientes con niveles de expresión elevados140,141. A nivel clínico, se ha evaluado la importancia de EMX2 como un biomarcador pronóstico en el adenocarcinoma de pulmón en un estudio de 144 pacientes. En este estudio clínico se comprobó que la expresión de EMX2 disminuyó significativamente en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con el tejido normal adyacente. De manera similar, la expresión de EMX2 estaba regulada negativamente en el adenocarcinoma de pulmón. El grupo que expresaba mayores niveles de EMX2 tuvo unas mejores supervivencia global y supervivencia libre de recidiva en comparación con el grupo de baja o nula expresión de EMX2 en pacientes con adenocarcinoma140. 5.5.2. Papel de EMX en el mesotelioma pleural maligno El mesotelioma pleural maligno (MPM) es una neoplasia altamente agresiva con un pronóstico pobre y opciones de tratamiento limitadas. En el estudio que existe al respecto se evaluó la significación pronóstica y predictiva de la expresión de EMX2 en MPM. Se utilizaron 50 muestras de pacientes de MPM. Los bajos niveles de expresión de EMX2 se asociaron significativamente como un factor pronóstico negativo en la supervivencia libre de progresión tomando en conjunto todos los pacientes, en agrupaciones de la enfermedad en etapa temprana, en pacientes sometidos a pleurectomías y en pacientes con el subtipo epitelioide. Adicionalmente, la expresión de EMX2 predijo la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante, ya que la mayor expresión registrada de EMX2 se asoció con una reducción de la supervivencia libre de progresión después de la terapia neoadyuvante, lo que sugiere que la Introducción 23 terapia de inducción ha de evitarse en estos pacientes. La expresión de EMX2 se regula negativamente en casos avanzados de mesotelioma pleural maligno y puede servir como biomarcador predictivo de la supervivencia libre de progresión142. 5.5.3. Papel de EMX en el cáncer gástrico En cáncer gástrico se ha demostrado que existen bajos niveles de expresión de EMX2 en el caso de una mayor hipermetilación de su promotor. Se ha comprobado que aumentando los niveles de expresión de EMX2 in vitro e in vivo, se induce una parada de la proliferación celular y una inactivación de la vía canónica de Wnt, evidenciando el papel de EMX2 como potencial gen supresor de tumores en cáncer gástrico. En este trabajo se propone que la sobreexpresión de EMX2 mediada por adenovirus puede tener potencial como una nueva terapia génica para el tratamiento de pacientes con cáncer gástrico143. 5.5.4. Papel de EMX en el cáncer endometrial EMX2 es un factor de transcripción necesario para el desarrollo urogenital y en concreto, del tracto reproductivo femenino. En un estudio clínico de 122 pacientes de cáncer de endometrio comparados con 25 tejidos normales, se evaluó la expresión de EMX2 y su relación con las características clínico-patológicas. La expresión de EMX2 se redujo en los tejidos de cáncer de endometrio y se correlacionó con la etapa tumoral, el grado y la profundidad de la invasión miometrial. La regulación negativa de EMX2 se asoció con la progresión tumoral, pudiendo constituir un factor crítico en la carcinogénesis y la progresión del cáncer de endometrio. Esto permitió establecer a EMX2 como un marcador potencial para la predicción pronóstica140. Por otro lado, los esteroides sexuales regulan la expresión endometrial de HOXA10, que a su vez regula negativamente EMX2. En ausencia de endometriosis, los niveles de EMX2 disminuyen un 50% en el endometrio peri-implantario en comparación con los niveles en la fase proliferativa. Además, la regulación positiva de HOXA10 en la peri-implantación del endometrio no ocurre en mujeres con endometriosis, por lo que la expresión de EMX2 endometrial es aberrante en mujeres con endometriosis y está mediada por la expresión alterada de HOXA10144. Se demostró que EMX2 reduce la capacidad proliferativa en células epiteliales endometriales humanas. EMX2 controla la reproducción de mamíferos mediante el ajuste de la proliferación de células endometriales sin afectar a la diferenciación145. Por tanto, la inactivación de EMX2 en cánceres endometriales, junto con una mayor expresión en el endometrio quiescente, indican que este gen homeodominio está involucrado en el mantenimiento del estado diferenciado146. Además, desregulaciones de la expresión de EMX2 pueden propiciar malformaciones uterinas, ya que el aumento de EMX2 se observa en la endometriosis147. Adicionalmente, existen estudios realizados con el transcrito antisentido EMX2-OS de EMX2 en cáncer endometrial. Estos dos transcritos EMX2/EMX2-OS tienen una expresión coordinada, ya que EMX2 y EMX2-OS son abundantes en el endometrio post-menopáusico Materiales y métodos 30 31 MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y métodos 32 Materiales y métodos 33 1. Reactivos biológicos usados Plásmidos: los plásmidos usados en esta tesis se describen en la Tabla 2. Tabla 2. Características de los plásmidos utilizados Plásmido Secuencia R. bacterias R. eucariotas T Origen pRS-SC sh Amp Puro IR Origene (TR313216) pRS-sh1-EMX1 GCTTCAATTTAAGCCACAGTGTCTCCGAG Amp Puro IR Origene (TI363329) pRS-sh4-EMX1 GGCAGTCTCAGCCTCTCCGAGACGCAGGT Amp Puro IR Origene (TI363332) pRS-sh1-EMX2 TCAAGCCATTTACCAGGCTTCGGAGGAAG Amp Puro IR Origene (TI352857) pRS-sh4-EMX2 CGGTGGAGAATCGCCACCAAGCAGGCGAG Amp Puro IR Origene (TI352860) pCMV6-EV Kan G418 TI Origene (PS100001) pCMV6-EMX1 EMX1 ADNc Kan G418 TI Origene (RC208006) pCMV6-EMX2 EMX2 ADNc Kan G418 TI Origene (RC222758) pLentiB-EV Amp Blast IL Addgene (#17451) pLentiB-EMX1 EMX1 ADNc Amp Blast IL A. Carnero pLentiB-EMX2 EMX2 ADNc Amp Blast IL A. Carnero pLentiP-EV Amp Puro IL Addgene (#39481) pLentiP-EMX1 EMX1 ADNc Amp Puro IL A. Carnero pLentiP-EMX2 EMX2 ADNc Amp Puro IL A. Carnero pcDNA3.1-EV Amp G418 TI Invitrogen (V79020) pcDNA3.1βcat(4Mut) CTNNB1 (β-CATENINA) ADNc 4 mutaciones puntuales: S33/S37/T41/S45 Amp G418 TI Addgene (#29936) psPAX2 Amp - FC Addgene (#12260) pM2D.G Amp - FC Addgene (#12259) pLenti-GFP-EV Amp - FC Addgene (#19732) pRS: pRetroSuper; SC: sh-ADN de secuencia aleatoria (del inglés, scrambled shDNA); EV: vector vacío; R.: resistencia; Amp: ampicilina; Kan: kanamicina; Puro: puromicina; G418: geneticina; Blast: blasticidina; T: transfección; IR: infección retroviral; TI: transfección con Trans-It; IL: infección lentiviral; FC: transfección por precipitación de fosfato cálcico; A. Carnero: generados en el laboratorio de Amancio Carnero. Antibióticos: puromicina (Nucliber), blasticidina (SIGMA-MERCK), G418 (Quimigen), ampicilina (SIGMA-MERCK) y kanamicina (SIGMA-MERCK). Cepas bacterianas: todos los plásmidos se amplificaron en la cepa bacteriana quimiocompetente E.coli Stbl3™ (Invitrogen). Se crecieron en medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl pH 7,0) a 37oC, con agitación, durante 16h. Tratamientos: 3-metil-colantreno (SIGMA-MERCK). 2. Técnicas básicas de biología molecular 2.1. Transformación de células quimiocompetentes A 50 µl de bacterias quimiocompetentes se les añadió una cantidad apropiada de ADN (100 ng de plásmido purificado). La mezcla de bacterias y ADN se incubó durante 30 minutos en hielo y después se dio un choque térmico a 42oC en un termobloque durante 45 segundos. Materiales y métodos 34 A continuación, se mantuvieron las células en hielo durante 2 minutos y se añadieron 900 µl de medio SOC (20 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM). Se incubaron 1 hora a 37o C en agitación. Después se centrifugaron durante 2 minutos a 8.000 r.p.m. y se resuspendieron en 50 µl de medio SOC. Se extendió el cultivo de manera homogénea en placas de LB-agar con el antibiótico de selección apropiado y se incubaron a 37oC durante 16h. Las colonias obtenidas se analizaron mediante digestión del ADN del plásmido con enzimas de restricción. Posteriormente se secuenciaron 1000pb con el cebador indicado para validar el plásmido. Las colonias que contenían la construcción adecuada se conservaron a -80oC en forma de cultivo liquido en medio LB con 7,5% de dimetilsulfóxido (DMSO). 2.2. Extracción de ADN plasmídico La extracción de ADN se puede realizar a partir de pequeños (mini-preparaciones) o grandes volúmenes (midio maxi-preparaciones) de cultivos de bacterias. El protocolo se basa en una lisis alcalina seguida de la precipitación y la purificación del ADN en una columna de intercambio iónico (silice-dietilaminoetanol). El ADN se une a la columna en condiciones apropiadas de pH y baja concentración de sales, los contaminantes se eliminan en un lavado con tampón de fuerza iónica intermedia y el ADN se eluye en un tampón de alta concentración de sales. Por último, el ADN se precipita con isopropanol para concentrarlo y eliminar sales. En ambos casos utilizamos el PureLink® HiPure Plasmid Maxiprep Kit (ThermoFisher Scientific) para maxi-preparación, siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción Se preparó una mezcla constituida por 1µg de ADN plasmídico, 12 unidades de la/s enzima/s de restricción, 3 µg de BSA acetilado y el tampón apropiado para la/s enzima/s de restricción, diluido a una concentración 1X en agua destilada, en un volumen total de 30µl. La mezcla se incubó de 1 hora a 37oC en el caso de una digestión simple con una enzima, y de 2 horas a 37ºC si se realizaba una digestión doble. Además, se realizaba una inactivación de la enzima mediante un choque térmico de 15 minutos a 65ºC y posteriormente se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. En el caso del clonaje de los ADNc EMX1 y EMX2 desde los plásmidos pCMV6-EMX1 (#RC208006, Origene) y pCMV6-EMX2 (#RC222758, Origene) respectivamente, se utilizaron las siguientes combinaciones de enzimas de restricción, resumidas en la Tabla 3. Materiales y métodos 35 Tabla 3. Digestiones dobles realizadas. Plásmido de partida ADNc Plásmido receptor Enzimas de restricción Tampón utilizado (~100% actividad) pCMV6EMX1 (5700pb) ADNcEMX1 (869pb) pLentiB-EV (9341pb) SalI D (Promega) XhoI D (Promega) pLentiP-EV (7067pb) MluI 3.1 (NEB) EcoRI 3.1 (NEB) pCMV6EMX2 (5600pb) ADNcEMX2 (755pb) pLentiB-EV (9341pb) SalI D (Promega) XhoI D (Promega) pLentiP-EV (7067pb) MluI 3.1 (NEB) EcoRI 3.1 (NEB) 2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La amplificación de fragmentos de ADN por PCR se realizó mediante un procedimiento estándar. Se preparó una mezcla que contenía 0.2 mM de cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 pmol de cada uno de los iniciadores, 2 mM de MgCl2, 1U de polimerasa Taq y la cantidad adecuada de ADN molde (entre 30-100 ng), todo ello diluido en el tampón de reacción suministrado por el proveedor de la enzima (Promega). Las reacciones se realizaron en termocicladores Bioer XP Cycler. Las condiciones de reacción fueron específicas para cada caso, pero se siguió un programa estándar de partida: 1 minuto a 95ºC, 35 ciclos de amplificación (1 minuto a 95ºC, 2 minutos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC) y una extensión final de 5 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. 2.5. Reacción específica de metilación (MSP) Inicialmente, se procedió a la purificación del ADN siguiendo el protocolo indicado en el kit High Pure PCR Template Preparation (ROCHE), posteriormente se realizaba la conversión del ADN con bisulfito según el kit EZ DNA Methylation-Gold (ZYMO RESEARCH), y por último, la PCR del ADN tratado con bisulfito con el kit ZymoTaq DNA Polymerase (ZYMO RESEARCH). Las condiciones de la conversión de bisulfito fueron inicialmente un paso de 98ºC de 10 minutos y 4 horas a 53ºC. Para cada gen (EMX1 y EMX2), se usaron dos pares de cebadores para el análisis de MSP, el primero reconoce e hibrida solo con las secuencias metiladas (M), mientras que el segundo conjunto amplifica los alelos no metilados (U). Las reacciones metiladas y no metiladas de MSP se llevaron a cabo en un volumen total de 20 μl que contenía 40 ng de ADN, tampón 1 X de PCR, dNTPs 0,25 mM, 0,3 μM de cada cebador (SIGMA-MERCK) y 1,5U de la Taq Polimerasa (ZYMO RESEARCH). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 4, junto con el programa de PCR y el tamaño del fragmento. Se usó ADN placentario humano (SIGMA-MERCK) tratado in vitro con SssI metiltransferasa (New England Biolabs) como control positivo para la MSP metilada, mientras que se usó ADN de sangre completa como control para la reacción no metilada. El agua se usó como un control de PCR negativo. Materiales y métodos 36 Tabla 4. Características de la PCR específica de metilación. Cebadores de PCR Secuencia del cebador (5’-3’) Programa de termociclador Bandas esperadas (pb) M-EMX1-Fw CCTTATTCCTAAAATTTCGCGTT 95ºC 10min / [95ºC 30sec / 55ºC 30sec / 72ºC 30sec] / 4ºC pause. [40 ciclos] 170 M-EMX1-Rv GGGTATTGGAGTTGTTTTTAGTTTC U-EMX1-Fw ACCTTATTCCTAAAATTTCACATT 170 U-EMX1-Rv GGGTATTGGAGTTGTTTTTAGTTTT M-EMX2-Fw TTTAAAACTACCCTTCCTCATTCG 120 M-EMX2-Rv GGGGGTTATCGATTTGTAGATATC U-EMX2-Fw TTAAAACTACCCTTCCTCATTCACT 120 U-EMX2-Rv GGGGTTATTGATTTGTAGATATTGT M: metilado, U: no metilado, Fw: cebador forward o directo, Rv: cebador reverso o inverso. 2.6. Purificación de ADN a partir de un gel de agarosa El ADN (producto de PCR o fragmento de restricción) se separó en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio (SIGMA-MERCK). Las bandas de interés se cortaron del gel con un bisturí estéril, visualizándolo a través de un transiluminador de luz ultravioleta. La extracción del ADN se realizó mediante el sistema QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema se basa en la adsorción selectiva del ADN a una membrana de gel de sílice en presencia de una alta concentración de sales (la presencia de una sal caotrópica, el tiocianato de guanidinio, facilita además la solubilización de la agarosa). Después de un lavado, el ADN se eluyó en un tampón de baja concentración de sales a pH ligeramente básico (Tris pH 8.5), y posteriormente se cuantificó la cantidad de ADN mediante densidad óptica (Nanodrop). 2.7. Clonaje de ADNc Los fragmentos de ADNc digeridos de los genes EMX1 y EMX2 humanos, obtenidos de los plásmidos donadores pCMV6-EMX1 y pCMV6-EMX2, respectivamente (Tabla 2), se clonaron en los vectores lentivirales vacíos pLentiB (plásmido #17451, Addgene) y pLentiP (plásmido #39481, Addgene). Para ello, inicialmente se amplificaron los plásmidos donadores y se purificó el ADN plasmídico mediante el protocolo descrito en el apartado 2.2, y se liberaron los ADNc de EMX1 y EMX2 mediante digestión doble (apartado 2.3). En paralelo, se amplificaron y digirieron los plásmidos receptores pLentiB y pLentiP con las mismas enzimas indicadas en la Tabla 3 del apartado 2.3 y se procedió a la reacción de ligación. 2.8. Ligación Las reacciones de ligación se prepararon mezclando en hielo los fragmentos de restricción purificados (hasta un volumen de 7 μl), 1 μl de ADN ligasa de T4 y 2 μl del tampón de reacción de la enzima 5X (SIGMA-MERCK). La mezcla se incubó a 16ºC durante 16 horas y se transformó en las bacterias quimiocompetentes. En las ligaciones de extremos cohesivos se Materiales y métodos 37 utilizó una relación molar del vector:inserto 1:3 y con extremos romos de 1:6. Se utilizaron como control los vectores vacíos digeridos sin añadir el ADNc. El ADN plasmídico se extrajo mediante el protocolo descrito en el apartado 2.2 y se analizó mediante digestión doble con las mismas enzimas de restricción utilizadas en la liberación del ADNc (apartado 2.3). Posteriormente se secuenció para verificar la correcta inserción del ADNc (apartado 2.9). 2.9. Secuenciación Tras la cuantificación del ADN, se secuenció en el equipo de secuenciación automático de capilares (AB 3500, Applied Biosystems). El ADN se diluía a una concentración de 100 ng/μl. Y se utilizaba como cebadores iniciadores de la reacción, los indicados en la Tabla 5. Tabla 5. Cebadores utilizados en la secuenciación de cada plásmido. Plásmido Cebador de inicio de secuenciación (5’-3’) Secuencia del cebador (5’-3’) pRS-SC sh CF3-Fw ACGATACAAGGCTGTTAGAGAG pRS-sh1EMX1 pRS-sh4EMX1 pRS-sh1EMX2 pRS-sh4EMX2 pCMV6-EV pCMV6-EMX1 CMV-Fw CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG pCMV6-EMX2 pLentiB-EV pLentiB-EMX1 CMV-Fw CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG pLentiB-EMX2 pLentiP-EV pLentiP-EMX1 CMV-Fw CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG pLentiP-EMX2 pcDNA3.1-EV pcDNA3.1βcat(4Mut) CMV-Fw CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG psPAX2 CMV-Fw CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG pM2D.G pLenti-GFP-EV 3. Cultivos celulares 3.1. Líneas celulares Las características de las líneas celulares utilizadas en el presente trabajo, incluyendo el medio de cultivo, el origen y el tipo celular que representan, se muestran en la Tabla 6. Materiales y métodos 38 Tabla 6. Características de las líneas celulares utilizadas Línea celular Subcultivo Especie Tipo celular Medio de cultivo Crecimiento Origen A-673 1:8 Humana Sarcoma de Ewing RPMI Adherente ATCC SAOS-2 1:6 Humana Osteosarcoma DMEM Adherente ATCC SW-872 1:4 Humana Liposarcoma DMEM Adherente ATCC IMR-90 1:3 Humana Fibroblastos* DMEM Adherente ATCC WI-38 1:3 Humana Fibroblastos* DMEM Adherente ATCC CNIO-AA 1:3 Humana Leiomiosarcoma F10 Adherente A. Carnero CNIO-AW 1:3 Humana Liposarcoma F10 Adherente A. Carnero CNIO-AX 1:3 Humana Liposarcoma F10 Adherente A. Carnero CNIO-AZ 1:2 Humana Sarcoma fibrótico F10 Adherente A. Carnero CNIO-BC 1:2 Humana MPNST F10 Adherente A. Carnero CNIO-BD 1:2 Humana Sarcoma de Ewing F10 Adherente A. Carnero CNIO-BG 1:4 Humana Fibrosarcoma mixoide F10 Adherente A. Carnero CNIO-BO 1:2 Humana Fibrosarcoma mixoide F10 Adherente A. Carnero CNIO-BP 1:2 Humana Osteosarcoma F10 Adherente A. Carnero CNIO-CE 1:2 Humana Rabdomiosarcoma F10 Adherente A. Carnero CNIO-DA 1:2 Humana Fibrosarcoma mixoide F10 Adherente A. Carnero CNIO-DD 1:2 Humana Fibrosarcoma mixoide F10 Adherente A. Carnero HEK293T 1:12 Humana Tejido renal embrionario DMEM Adherente ATCC Phoenix-A 1:12 Humana HEK293T que expresan los genes retrovirales gag-pol y env (anfotrópico: infecta células humanas) DMEM Adherente ATCC ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo; A. Carnero: generadas en el laboratorio de A. Carnero; Fibroblastos*: de origen pulmonar. 3.2. Cultivo y conservación de las líneas celulares Todas las líneas se cultivaron en medio F10 o DMEM con glutamina estable (ThermoFisher Scientific), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; ThermoFisher Scientific), 40 µg/ml de penicilina, 40 µg/ml de estreptomicina (SIGMA-MERCK) y 1 µg/ml de fungizona (anfotericina B; SIGMA-MERCK). Las células se crecieron en placas de 10 centímetros (Falcon) y se subcultivaron 1:2-1:12 según la línea celular (Tabla 6), cada 2-4 días mediante tratamiento con tripsina/EDTA 0.25% (ThermoFisher Scientific). Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37ºC en una atmósfera de 5% CO2 (ThermoFisher Scientific). Todas las manipulaciones se hicieron en una campana de flujo laminar de Clase II Bio-II-A (nivel de seguridad biológica 2; Telstar). Para su almacenamiento a largo plazo, las células se conservaron en un contenedor de nitrógeno líquido, en criotubos de 2 ml, en su medio de cultivo normal o FBS, con 10% de DMSO. Para periodos de almacenamiento más cortos las células se conservaron a -80ºC. Para descongelar un víal, se sumergió en un baño de agua a 37oC, se centrifugó a 900 r.p.m. el contenido en 5 ml de medio y las células se resuspendieron en su medio de cultivo habitual. 3.3. Transfección de células El método de transfección de cada uno de los plásmidos se resume en la Tabla 1. Materiales y métodos 39 3.3.1. Transfección por precipitación con fosfato cálcico e infección lentiviral La mezcla de CaCl2, ADN y tampón fosfato origina la precipitación de pequeñas partículas insolubles de fosfato cálcico que contienen el ADN condensado. Estos complejos se adhieren a la membrana plasmática y entran en la célula por fagocitosis160. Las células HEK293T se sembraron el día anterior a la transfección de manera que estuvieran a una confluencia del 70-80% en el momento de la transfección. Entre 2 y 4 horas antes de la transfección se cambió el medio a las células, añadiendo 10 ml de medio fresco completo (para una placa de 10 cm). En un tubo de 15 ml se llevó a cabo una co-transfección transitoria de estas células con 10 μg del vector lentiviral de interés, y adicionalmente 8 μg del vector psPAX2 (que contiene los genes: GAG y POL) y 2 μg del vector pM2D-G (que contiene el gen VSV-G), para producir las partículas lentivirales, 10µg del ADN correspondiente, 50 µl de CaCl2 2,5M y se llevó a 500 µl con agua Milli-Q estéril. A esto se le añadieron 500 µl de tampón HBS 2X (NaCl 270 mM, HEPES 55 mM, Na2HPO4 1.5 mM, pH 7.04) gota a gota mientas se producían burbujas con una pipeta pasteur de vidrio. Se dejó la mezcla durante media hora para permitir que se formasen los cristales de fosfato cálcico y posteriormente se añadió sobre la placa del cultivo celular gota a gota. Se dejaron durante 8-16 horas a 37oC y se les cambió el medio. Tras 24 h de incubación a 37ºC, se le cambió el medio a las células, añadiendo 7 ml, y se incubaron 24 h a 37ºC. Se recogió el sobrenadante con lentivirus, que se guardó a 4ºC. Se depositaron otros 7 ml y se incubaron otras 24 h a 37ºC. Se volvió a recoger el sobrenadante unificándolo con el del día anterior. A continuación, el sobrenadante que contenía los virus se pasó por un filtro de acetato de celulosa (0.45 µm, VWR) y se realizó una dilución 1:4 con medio fresco DMEM suplementado y 8 μg/ml de polibreno (SIGMA-MERCK), un policatión que reduce la repulsión electrostática entre el virus y la membrana celular, favoreciendo la unión de los virus. Para la infección, se reemplazó el medio de cultivo de las células receptoras por medio nuevo con el sobrenadante lentiviral y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 4-6h. Después, se cambió el medio y se mantuvieron 24h a 37ºC, momento en el que se comenzó la selección con el antibiótico apropiado. 3.3.2. Infección retroviral Se sembraron las células Phoenix-A en placas de 10 centímetros el día previo, para que estuvieran a un 70-80% de confluencia en el momento de la transfección. Se llevó a cabo una transfección transitoria de estas células con el vector retroviral de interés, siguiendo la metodología del protocolo del fosfato cálcico (apartado 3.3.1), para producir las partículas retrovirales. Tras las 8-16 h de incubación a 37oC que permitían la formación de los cristales de fosfato cálcico, se cambió el medio a las células, añadiendo 10ml y se dejaron 48 h a 32oC. A continuación, el sobrenadante que contenía los virus se pasó por un filtro de acetato de celulosa (0.45 µm; VWR) y se suplementó con un volumen igual de medio fresco y con 8 µg/ml de polibreno (SIGMA-MERCK). Para la infección, se reemplazó el medio de cultivo de las células receptoras por medio nuevo con el sobrenadante viral y las placas fueron centrifugadas (1 h, 1500 r.p.m.) e incubadas a 32oC durante 8 h. Después, se cambió el medio y se Materiales y métodos 46 de nucleasas. Esta mezcla de 10 µl de volumen total se adicionó a un tubo de PCR que contenía 10 µl con 3 µg de ARN total diluidos en agua libre de nucleasas para completar el volumen de la reacción. Se mezcló el volumen de reacción en un vórtex durante unos segundos y se centrifugó brevemente. A continuación se introdujo el tubo de PCR en un termociclador para llevar a cabo la reacción de transcripción reversa. La reacción constaba de los siguientes pasos: 10 minutos a 25ºC, 120 minutos a 37ºC y 5 minutos a 85ºC. Una vez finalizada la reacción se guardó el ADN complementario (ADNc) a -20ºC hasta su uso. 6.3. PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) La detección de cambios en la expresión génica se realizó mediante PCR cuantitativa a tiempo real con ADNc procedente de la retrotranscripción reversa (qRT-PCR). Para llevar a cabo la qRT-PCR se añadieron las siguientes cantidades por pocillo en placas de 384 pocillos (ThermoFisher Scientific): 2 μL de ADNc (dilución 1/3 del producto de la reacción de la transcripción reversa), 5 μL de mezcla para qPCR GoTaq® 2X (Promega) y 0,5 µl de ensayo TaqMan 20X (Applied biosystem), que contiene los cebadores y la sonda para el ARNm de interés. Las distintas sondas TaqMan utilizadas en esta tesis se describen en la Tabla 8. La qRT-PCR se realizó en el termociclador ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). El programa de PCR consistió en 10 minutos a 95ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC. El análisis de los cambios relativos en la expresión génica se realizó con el método comparativo de ciclo umbral (ΔΔCt) y con el programa RQ manager (Applied biosystem). Para normalizar las muestras se usó el gen GAPDH como control endógeno. Cada reacción se hizo por triplicado y se realizaron al menos 3 experimentos independientes para cada gen analizado. Se introdujo una muestra de control negativo (sin ADNc) en cada experimento. Tabla 8. Sondas TaqMan utilizadas en la qRT-PCR. Todas las sondas se adquirieron de la casa comercial Applied biosystems (AB); MYC*: también es un gen efector de la vía canónica de Wnt. Proceso Gen humano Sonda (humano) Gen ratón Sonda (ratón) Control endógeno GAPDH Hs03929097_g1 Gadph Mm99999915_g1 Factores de transcripción EMX1 Hs00417957_m1 Emx1 Mm01182609_m1 EMX2 Hs00244574_m1 Emx2 Mm00550241_m1 Genes relacionados con la biología de las células madre CD133 Hs01009257_m1 NES Hs04187831_g1 Nes Mm00450205_m1 NANOG Hs04260366_g1 Nanog Mm02019550_s1 OCT4 Hs00999632_g1 Oct4 Mm03053917_g1 SOX2 Hs01053049_s1 Sox2 Mm03053810_s1 KLF4 Hs00358836_m1 Klf4 Mm00516104_m1 MYC* Hs00153408_m1 c-Myc Mm00487804_m1 BMI1 Hs00995536_m1 Genes de la transición epitelio-mesénquima (TEM) TWIST1 Hs01675818_s1 FOXC2 Hs00270951_s1 VIM Hs00185584m1 SNAI1 Hs00195591_m1 Genes de la vía canónica de Wnt CTNNB1 Hs00355049_m1 AXIN1 Hs00394718_m1 TCF4 Hs00162613_m1 GSK3β Hs01047719_m1 Materiales y métodos 47 7. Técnicas de análisis de expresión a nivel de proteínas 7.1. Anticuerpos Los anticuerpos utilizados en esta tesis, así como su procedencia, especie, tipo (monoclonal o policlonal), aplicaciones y diluciones empleadas se detallan en la Tabla 9. Tabla 9. Características de los anticuerpos utilizados. Anticuerpo Proveedor Dilución WB IHQ DIL DA EMX1 (policlonal conejo) Abcam ab136102 1:1000 1:100 EDTA EMX2 (policlonal ratón) Abcam ab171818 1:1000 - - EMX2 (policlonal conejo) Invitrogen PA5-34415 - 1:500 TC α-tubulina (monoclonal ratón) SIGMAMERCK T9026 1:10000 - - β-catenina (policlonal conejo) CST #8814 1:1000 - - p-β-catenina (S33/S37/T41) (monoclonal conejo) CST #9561 1:1000 - - c-MYC (monoclonal conejo) CST #5605 1:1000 - - AXIN1 (policlonal conejo) CST #2087 1:1000 - - TCF4 (policlonal conejo) CST #2565 1:1000 - - GSK3-β (monoclonal conejo) CST #9315 1:1000 - - WNT1 (monoclonal conejo) Abcam ab85060 1:1000 - - Ciclina-D1 (monoclonal conejo) Abcam ab16663 1:1000 - - KI67 (monoclonal conejo) MAD 000310-QD - 1:250 TC NESTINA (policlonal rata) SCB SC-101541 - 1:100 TC Conejo anti-ratón HRP (policlonal) Abcam ab97046 1:5000 - - Cabra anti-conejo HRP (policlonal) Abcam ab97051 1:5000 - - Cabra anti-conejo HRP (policlonal) JAC 111-035-003 - 1:400 - Cabra anti-rata HRP (policlonal) JAC 112-035-003 - 1:400 - Conejo anti-cabra HRP (policlonal) Abcam ab97100 - 1:400 - WB: Western blot; IHQ: Inmunohistoquímica; DIL: Dilución; DA: Desenmascaramiento del antígeno; EDTA: Tampón EDTA; TC: Tampón citrato; MAD: Master Diagnostica; JAC: Jackson Immuno Research, CST: Cell Signalling Technologies; SCB: Santa Cruz Biotechnology; sombreado gris: anticuerpos secundarios. 7.2. Extracción de proteína total Las células se lavaron con PBS frío (4ºC) y se añadió sobre ellas un volumen apropiado de tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM NP-40 1%, desoxicolato de sodio 1%, SDS 1%, Na3VO4 1mM, EDTA 0,5M pH 8,0, cóctel de inhibidores de fosfatasas (SIGMA-MERCK) y cóctel de inhibidores de proteasas (SIGMA-MERCK)). Se mantuvieron 10 minutos en hielo y en agitación, se recogieron los lisados y se echaron a un tubo de 1.5 ml. A continuación, se sonicaron las muestras durante 3 ciclos de 10 segundos al 45% de potencia (Fisher Brand). Posteriormente, los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC y el sobrenadante se guardó en alícuotas en nuevos tubos de 1.5 ml a -20ºC. 7.3. Western blot La inmunodetección de proteínas se realizó de acuerdo a un protocolo estándar. En primer lugar, se determinó la cantidad de proteína mediante el ensayo de Bradford (Biorad), se disolvieron 20-30µg de muestra en tampón de carga (Tris-HCl 62.5 mM pH 6,8, glicerol 10%, SDS 1%, 2-mercaptoethanol 5%, azul de bromofenol 0.0025% (SIGMA-MERCK)) y se desnaturalizaron durante 5 minutos a 95ºC. Las proteínas se separaron por electroforesis en Materiales y métodos 48 geles de poliacrilamida (con una concentración dependiente del tamaño de la proteínas a detectar, entre 8-15%) en presencia de SDS, utilizando el sistema Mini-Protean Tetra Cell (Biorad). El tampón de electroforesis utilizado contenía Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0.1, pH 8,3). A continuación, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Protran 0.2 µm), utilizando el equipo Mini Trans-Blot Cell (BioRad). La transferencia se realizó a 400 mA durante 2h en tampón de transferencia (TrisHCl 25 mM, glicina 192 mM, 20% metanol, pH 8,3). Las membranas se bloquearon durante 2h en agitación. El tampón de bloqueo contenía PBS, 0.1% Tween20 y 5% de BSA. Posteriormente, se incubaron toda la noche con la dilución adecuada de anticuerpo primario en tampón de bloqueo y agitación. Al día siguiente, se retiró el exceso de anticuerpo mediante 3 lavados de 10 minutos con PBS-Tween 20 0,1% en agitación. Finalmente, se incubaron las membranas durante una hora con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) diluido en PBS-Tween 20 0.1% y se retiró el exceso de anticuerpo mediante 3 lavados de 10 minutos con PBS-Tween 20 0.1%, en agitación. La detección se realizó mediante una reacción quimioluminiscente (ECL, Amersham) y la visualización con los equipos Chemidoc o Chemidoc Touch (Biorad). 7.4. Cuantificación de bandas de Western blot Para cuantificar las bandas de proteínas se usó el programa Image lab 5.1 de Biorad. Se seleccionó cada banda de forma individual y se refirió el valor a un control de carga de la misma membrana, que normalmente fue la inmunodetección de la α-tubulina. 7.5. Inmunohistoquímica en tejido de ratón Se extrajeron muestras de los diferentes tejidos de los ratónes y se fijaron en formalina al 25% tamponada, durante 24h. Tras un proceso de deshidratación con etanol a distintas concentraciones y xilol, se introdujeron las muestras en parafina a 65ºC, obteniendo bloques de los que se hicieron cortes de 2 μm en microtomo automático. Para la tinción con los anticuerpos KI67, CD45, F4/80, EMX2 y NESTINA se rehidrataron las muestras por el procedimiento habitual y se hizo la recuperación antigénica con tampón citrato a pH 6.5 (Dako/Agilent) calentando en una olla a presión durante 2 min. En el caso del anticuerpo EMX1, la recuperación antigénica se realizó con tampón EDTA a pH 9 (Dako/Agilent). Se incubó toda la noche (12 horas) todos los anticuerpos primarios en cámara húmeda y a 4ºC, siguiendo las diluciones (Tabla 9). Y posteriormente el anticuerpo secundario correspondiente, 1 hora y media a 1:400 en cámara húmeda y a temperatura ambiente. Se lavó con TBS+Tween 20 0.1%. Tras un bloqueo de la peroxidasa endógena con agua oxigenada y metanol (Dako/Agilent), se bloqueó con solución de bloqueo al 1% (SIGMA-MERCK) y se reveló con el sistema peroxidasa utilizando como sustrato diaminobencidina plus (Dako/Agilent). La contratinción se hizo con hematoxilina de Harris. Finalmente, se deshidrató completamente la muestra con xilol y el montaje se hizo con Pertex. Las fotos se tomaron con un microscopio Olympus BX-61. La valoración de las muestras se realizó mediante análisis microscópico cuantitativo. Se asignaron valores de porcentajes de inmunotinción, con respecto a 5 campos. Materiales y métodos 49 8. Análisis de bases de datos públicas de pacientes de cáncer En esta tesis se han utilizado las siguientes plataformas de bases de datos:  cBioPortal (http://www.cbioportal.org/): análisis de mutaciones en tumores humanos163,164.  MapLab, aplicación Wanderer (http://maplab.imppc.org/): análisis de niveles de metilación en tumores humanos165.  NCBl (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/): secuencias de nucleótidos y bases de datos GEO (The Gene Expression Omnibus, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)166,167.  Uniprot (https://www.uniprot.org/): secuencias aminoacídicas y estructura de proteínas168.  GeneCards (http://www.genecards.org/): genes humanos169.  The Human Protein Atlas (THPA, https://www.proteinatlas.org/) y The Cancer Genome Atlas170 (TCGA, https://www.cancer.gov): análisis tisulares de expresión diferencial.  Plataforma de visualización y análisis genómico R2-Genomics (http://hgserver1.amc.nl): análisis bioinformático de datos de pacientes procedentes de bases de datos transcriptómicas públicas. Plataforma desarrollada por el Departamento de Oncogenómica del Centro Médico Académico (AMC) de Ámsterdam167.  SurvExpress (http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp): herramienta de validación de biomarcadores y una plataforma de bases de datos de expresión génica y de análisis de supervivencia en cáncer171 Se utilizaron las siguientes bases de datos de sarcoma para realizar los análisis de los niveles de expresion de EMX1/EMX2 y de los genes relacionados con las propiedades de las células madre en las bases de datos públicas de las células humanas embrionarias (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC):  Yamanaka, GEO ID: GSE9561172  Thomson, GEO ID: GSE15148173 Se utilizaron las siguientes bases de datos de sarcoma para realizar los análisis de correlación y adicionalmente análisis transcriptómicos: 1) Bases de datos de sarcoma general:  TGCA (N=259), ID174  Boshoff (N=96), ID175  Filion (N=137), ID176 2) Bases de datos de sarcoma de Ewing:  Delattre (N=117), GEO ID: GSE34620  Savola (N=117), GEO ID: GSE17679 3) Bases de datos de osteosarcoma:  Kuijjer (N=127), GEO ID: GSE30385 4) Bases de datos de rabdomiosarcoma:  Davicioni (N=147), ID177  Barr (N=58), GEO ID: GSE66533 Materiales y métodos 50 5) Bases de datos de sarcoma rabdoide:  Foreman (N=71), GEO ID: GSE35493  Perlman (N=53), GEO ID: GSE11482 6) Bases de datos de tumores de cabeza y cuello:  TGCA (N=520), ID178 El análisis de los niveles de expresión de EMX1/EMX2 se realizó con las bases de datos indicadas, ya que son comparables entre ellas por haber sido generadas con la misma plataforma y normalizadas con el mismo método. Se exportaron los valores de expresión de R2-Genomics al programa GraphPad-PRISM 6, con el que se realizó el estudio estadístico con el test T-student. Para identificar los genes cuya expresión correlacionaba positiva o negativamente con la expresión de EMX1/EMX2, se analizó la correlación entre los genes EMX y los genes pertenecientes a los KEGG (Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto): “vía de señalización Wnt”, “vía de Notch”, “vía de Hippo”, “microARNs en cáncer”, “vías de señalización de cáncer” y “vías de señalización que regulan la pluripotencia de las células madres”, presentes en la plataforma R2. Se examinaron estas correlaciones en las bases de datos indicadas y se seleccionaron únicamente aquellos genes que correlacionaban con EMX1/EMX2 en con un pvalor inferior a 0,05 y el coeficiente de correlación de Pearson (R) igual o superior a 0,3 en las correlaciones positivas e inferior a -0,3 en las correlaciones negativas. Los diagramas de Venn se representaron con la herramienta online del grupo de Bioinformática y Genómica evolutiva de la Universidad de Gante (Bélgica) (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/). Las listas de genes obtenidas en la intersección del diagrama de Venn fueron clasificadas por KEGG y ordenadas por p-valor. 9. Análisis estadístico Utilizamos el programa informático GraphPad-PRISM 6 para todos los análisis estadísticos de los experimentos realizados con las líneas celulares y los experimentos in vivo. Para analizar las diferencias en todos los ensayos funcionales o transcriptómicos realizados con las líneas transfectadas con el ADNc de EMX1, EMX2 ó CTNNB1 y las líneas transfectadas con los diferentes vectores control, se utilizó el test estadístico T-student para muestras no pareadas o el test T-student con la corrección de Welch. Para determinar la significación estadística de los gráficos de supervivencia se utilizó un test Chi cuadrado (test LogRank). Valores de p-valor inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos y se representaron según la siguiente clasificación: p<0,05 (*), p<0,01 (**) y p<0,001 (***). Materiales y métodos 51 RESULTADOS Resultados 106 Resultados 53 1. Estudio del papel de EMX1 y EMX2 como genes supresores de tumores en células primarias de sarcoma 1.1. Caracterización de las líneas celulares primarias de sarcoma y generación de los modelos Con el objetivo de caracterizar los genes EMX1 y EMX2 en sarcoma, se midieron los niveles de expresión de EMX1 (Figura 5A) y EMX2 (Figura 5B) en las líneas de sarcoma primarias, las líneas comerciales de sarcoma y las líneas de fibroblastos control (tabla 7). Los niveles de expresión de EMX1 (Figura 5A) son más bajos en términos absolutos en comparación con EMX2 (Figura 5B) y existen menor número de líneas con expresión de EMX1, que de EMX2. No hay niveles de expresión en las líneas fibroblastos control. En paralelo, se realizó en las mismas líneas un análisis de metilación del promotor mediante la técnica PCR específica de metilación (MSP) de EMX1 (Figura 5: C y E) y de EMX2 (Figura 5: D y E). Existen mayor número de líneas con el promotor de EMX1 hemio hiper-metilado, que el de EMX2. Estos resultados indican que las líneas celulares que presentan mayor grado de metilación también presentan menores niveles de expresión de los genes EMX. Figura 5. Análisis de los niveles de expresión y del estado de metilación del promotor de EMX1 y EMX2 en el panel de líneas de sarcoma. (A y B) Gráficas de los niveles de expresión (2-ΔCt) de EMX1 (D) y EMX2 (E), medidos por qRT-PCR. Se representa la media de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. (C y D) Imágenes de los geles de agarosa con la amplificación de las bandas de la PCR de metilación (MSP) de los pares de cebadores que amplifican si la región está metilada (M, MET), hemimetilada (hemi MET), o no metilada (U, no MET) de los genes EMX1 (C) y EMX2 (D). (E) Tabla resumen del estado de metilación del promotor de ambos genes. Resultados 54 Una vez caracterizados el estado de metilación de los promotores de EMX1 y EMX2 y sus niveles de expresión en las líneas de sarcoma, se decidió comprobar si la expresión de los genes EMX1/EMX2 tenía algún efecto en las células de sarcoma. Para ello se estudió si la sobreexpresión o reducción estables de EMX1 ó EMX2 tenía algún efecto en las propiedades tumorales de las células. Se eligieron dos líneas primarias de sarcoma que no presentaban niveles de expresión de EMX1 y EMX2 como modelos de sobreexpresión: AA (leiomiosarcoma) y AW (liposarcoma). Los modelos de sobreexpresión en AA y AW se realizaron mediante transfección estable con un vector pCMV6 que expresaba el ADNc de los genes EMX1 ó EMX2 y como control parental se transfectó con un vector vacío (pCMV6-EV). Se validaron todos los modelos tanto a nivel de ARNm, mediante qRT-PCR (Figura 6: A y C), como a nivel de proteína, mediante Western-blot (Figura 6: B y D). Figura 6. Validación de los niveles de expresión de EMX1 y EMX2 en los modelos celulares de sobreexpresión. En (A y C) se representan los niveles de expresión medidos por qRT-PCR y en (B y D) por Western-blot, de los modelos de sobreexpresión de EMX1 y EMX2, en las líneas primarias de sarcoma AA (A y B) y AW (B y C). En las qRT-PCRs, se representa la media de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. En los Western-blot, se muestra un experimento representativo de 3 experimentos realizados de forma independiente. El control endógeno es α-TUB (αtubulina). El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). En primer lugar realizamos los ensayos funcionales de tumorigenicidad de las líneas de sarcoma, que se dividieron en tres bloques: (1) los ensayos funcionales in vitro: de proliferación, de clonabilidad, de migración, de invasión y de crecimiento independiente de anclaje; (2) el ensayo de tumorigénesis in vivo realizando xenotransplantes en ratónes inmunodeprimidos; (3) los ensayos funcionales relacionados con las propiedades de las células madre: el análisis de los fenotipos clonales y de formación de tumoresferas. Resultados 55 1.2. Efecto de la sobreexpresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vitro En primer lugar, realizamos una curva de crecimiento de cada línea celular en dos condiciones de suero (10% y 0,5%), para comparar la tasa de proliferación de las líneas con sobreexpresión de EMX1 o EMX2 (Figura 7). Observamos que ambas líneas celulares en ambas condiciones de suero y en el contexto de sobreexpresión tanto de EMX1 como de EMX2, crecían con menor tasa proliferativa que las líneas con el vector control (Figura 7: A-D). A continuación se realizó el ensayo de clonabilidad a baja densidad celular, que mide la capacidad de las células de formar colonias en ausencia de contacto celular. Para ello sembramos las células a baja densidad (1000 células en placas de 10 cm), esperamos hasta que formaron colonias (10-15 días) y cuantificamos tanto el número como el tamaño de las colonias formadas (Figura 7: E-J). Se observó que la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 reducía tanto el número, como el tamaño de las colonias en ambos modelos celulares. Se llevó a cabo el ensayo de invasión, que mide la capacidad invasiva de las células a través de una matriz porosa. Se observó una disminución de la invasión en ambas líneas sobreexpresando EMX2, mientras que las líneas que sobreexpresan EMX1 no presentaban variaciones con respecto al control (Figura 8). También medimos la capacidad de crecimiento de forma independiente de anclaje con el ensayo de formación de colonias en agar blando. Sembramos las células en matrices de agar blando y las dejamos crecer durante 30 días. Tras este periodo de tiempo cuantificamos las colonias formadas en cada caso. En ambos casos, la sobreexpresión de EMX1/EMX2 provocaba una disminución en el número y el tamaño de las colonias en las líneas de AA (Figura 9: A, B y C) y de AW (Figura 9: D, E y F). 1.3. Efecto de la sobreexpresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vivo Tras validar el efecto funcional de la sobreexpresión de EMX1/EMX2 in vitro, se realizó in vivo con xenotransplantes en ratónes inmunodeprimidos. Para ello inyectamos subcutáneamente un millón de células de cada una de las líneas celulares en el flanco derecho de la pata trasera de ratónes inmunodeprimidos. Observamos que los tumores que sobreexpresaban EMX1 y EMX2 crecían más lentos que los tumores formados por cada una de las líneas control de AA (Figura 10: A y C) y de AW (Figura 10: D y F). Este resultado se complementa con el gráfico de supervivencia, donde se observa una reducción de la misma en los ratónes inoculados con las líneas celulares control (Figura 10: B y E). Resultados 62 Figura 13. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en la expresión de genes relacionados con el fenotipo de las células madre en el modelo de AA. Cuantificación de los niveles relativos de ARNm de los genes EMX1, EMX2, OCT4, SOX2, KLF4, MYC, BMI1, NANOG, NES y PROM1 por qRTqPCR en el modelo de AA. Se muestran las gráficas de los niveles de expresión (2-ΔCt) para el extracto total de las líneas celulares (ET), las tumoresferas (TO) y los tumores xenotransplantados (XEN). Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 63 Figura 14. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en la expresión de genes relacionados con el fenotipo de las células madre en el modelo de AW. Cuantificación de los niveles relativos de ARNm de los genes EMX1, EMX2, OCT4, SOX2, KLF4, MYC, BMI1, NANOG, NES y PROM1 por qRTqPCR en el modelo de AW. Se muestran las gráficas de los niveles de expresión (2-ΔCt) para el extracto total de las líneas celulares (ET), las tumoresferas (TO) y los tumores xenotransplantados (XEN). Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 64 Figura 15. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en el porcentaje de células CD133+ de los modelos celulares de sarcoma. (A y C) Gráfico del porcentaje de expresión del marcador CD133 (conjugado con PE: CD133-PE), medido por FACS en los diferentes modelos de las líneas AA (A) y AW (C). En (B y D) los gráficos FACS de citometría de flujo de AA (B) y AW (D). En (E) se realiza la medición de los niveles de expresión (2-ΔCt) de EMX1, EMX2 y NES en la separación celular de las fracciones de CD133(-) y CD133(+) de las líneas parentales de AA y AW. Se representa la media de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). A continuación, se midió la expresión de genes implicados en la transición epiteliomesénquima (SNAI1, TWIST1, FOXC2 y VIM), ya que se ha descrito que la inducción de este proceso está asociado a la migración celular, al posterior proceso de la metástasis y a la aparición de las células madre tumorales49. Se observa un incremento en los niveles de expresión de los genes SNAI1, TWIST1 y FOXC2 en las condiciones de sobreexpresión de EMX1/EMX2, sin embargo los niveles de VIM no mostraron variaciones significativas (Figura 16). A partir de estos resultados, se realizó un análisis bioinformático de EMX1/EMX2 donde se observó que también aparecían correlacionados negativamente con determinados genes relacionados con la biología de las células madre, como es el caso de OCT4, SOX2, KLF4, Resultados 65 MYC, NES y PROM1. El análisis se realizó de los niveles de expresión de EMX1/EMX2 y de los genes relacionados con las propiedades de las células madre en las bases de datos públicas extraídas de la plataforma GEO167. Las bases de datos fueron la de Yamanaka172 (GSE9561) y la de Thomson173 (GSE15148), donde utilizaban las células humanas embrionarias (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) (Figura 17). Se comprobó en ambos contextos celulares pluripotentes (hESC e iPSC) que los niveles de los genes EMX aparecían disminuídos. EMX1 y EMX2 reducen sus niveles en ambas condiciones de pluripotencia embrionaria e inducida (IPSC), de ambas bases de datos (Figura 17: A y B). Adicionalmente, como era de esperar, los genes relacionados con las propiedades de las células madre aparecen sobreexpresados en hESC y en iPSC (Figura 17: C y D). Figura 16. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en la expresión de genes involucrados en la transición epitelio-mesénquima en las líneas de sarcoma. Cuantificación de los niveles relativos de ARNm de los genes SNAI1, TWIST1, FOXC2 y VIM medidos por qRT-qPCR en los modelos de AA (A) y AW (B). Tanto en (A), como en (B) se muestran las gráficas de los niveles de expresión (2-ΔCt) del extracto total de cada línea celular (ET), y de los tumores xenotransplantados (XEN). Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 66 Figura 17. Análisis transcripcional de los genes EMX1, EMX2 y los relacionados con las propiedades de las células madre en bases de datos públicas. (A y B) Análisis de la base de datos Yamanaka (GSE9561), donde se miden los niveles relativos de ARN de EMX1 y EMX2 (A) y los genes relacionados con las propiedades de las células madre (OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG, NES PROM1) (B) en las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) generadas a partir de los fibroblastos dérmicos humanos (hFD). (C y D) Análisis de la base de datos de Thomson (GSE15148), donde se miden los niveles relativos de ARN de EMX1 y EMX2 (C) y los genes de las células madre (D) en las iPSC humanas generadas a partir de fibroblastos del prepucio, utilizadas como control y en las células madre embrionarias humanas (hESC). El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 67 Estos resultados funcionales in vitro e in vivo indican que la sobreexpresión de EMX1/EMX2 en dos modelos celulares de sarcoma induce una reducción en las propiedades funcionales tumorigénicas, independientemente de que sean diferentes subtipos de sarcoma. Esto sugiere que los genes EMX son supresores tumorales en sarcoma humano. A esto podría contribuir la reducción de las propiedades de las células madre in vitro e in vivo en la sobreexpresión ectópica de EMX1/EMX2. 1.5. Efecto de la reducción de la expresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vitro Para confirmar estas propiedades anti-tumorigénicas dependientes de los genes EMX en un modelo independiente, se eligió una línea con expresión de EMX1 y EMX2 (BG, fibrosarcoma mixoide), como modelo para reducir los niveles de ambos genes. El modelo de reducción de los niveles de EMX1/EMX2 en BG, se realizó con los vectores retrovirales estables con sh-ARN frente a una secuencia común de EMX1 y EMX2 (pRS-sh1 y pRS-sh4). Se utilizaron como controles los vectores vacío (pRS-EV) y con una secuencia de sh-ARN aleatoria (pRS-SC). Se validaron todos los modelos tanto a nivel de ARNm (Figura 18: A y B), como a nivel de proteína (Figura 18C). Se utiliza un segundo sh-ARN, para comprobar que los resultados obtenidos no se deban a efectos inespecíficos del sh-ARN contra EMX1/EMX2 en otras secuencias del ADN genómico celular. Figura 18. Validación de los modelos celulares de silenciamiento de los niveles de expresión de EMX1 y EMX2. (A-B) Niveles de expresión medidos por qRT-PCR del modelo de silenciamiento de EMX1 y EMX2 en la línea BG. En las qRT-PCRs, se representa la media de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. (C) En los Western-blot, se muestran los niveles proteicos de EMX1, EMX2 y el control endógeno α-tubulina (α-TUB), en un experimento representativo de 3 experimentos realizados de forma independiente. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Al igual que en las líneas AA y AW, se realizaron los ensayos funcionales in vitro en las líneas de BG, comenzando por el ensayo de proliferación. Se realizó una curva de crecimiento en dos condiciones de suero (10% y 0,5%). Se observó que la reducción de los niveles tanto de EMX1, como de EMX2, induce una mayor tasa proliferativa que en las líneas con el vector control y SC (Figura 19: A y B). Resultados 68 Figura 19. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en las capacidades proliferativa, de formación de colonias y de invasión en las líneas celulares de sarcoma. (A y B) Curvas de crecimiento de los modelos de silenciamiento de EMX1 y EMX2 de la línea de sarcoma BG en las condiciones del 10% (A) y 0.5% (B) de FBS. Imágenes de los pocillos de la placa de crecimiento teñida con cristal violeta en un día determinado del experimento. (C-E) Ensayo de clonabilidad en los modelos de sobreexpresión de la línea de sarcoma BG. (C) Imágenes de las placas del ensayo de clonogenicidad teñidas con cristal violeta en el último día del experimento. (D) Gráfico del número de colonias. (E) Gráfico del tamaño de las colonias. (F y G) Ensayo de invasión de la línea BG. (F) Porcentaje de la densidad óptica (OD) medida a 595 nm. (G) Micrografías a 100 aumentos de las células fijadas y teñidas con cristal violeta del ensayo de invasión. La barra se corresponde con 200µm. Se representa la media de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 69 Se continuó con el ensayo de clonabilidad. Se cuantificó tanto el número como el tamaño de las colonias formadas en los modelos de sobreexpresión de BG (Figura 19: C-E). Se observó que en las condiciones de reducción de EMX1 y EMX2 se incrementaba tanto el número (Figura 19D), como el tamaño de las colonias en ambos modelos sh-ARN (sh1 y sh4) (Figura 19E). Posteriormente, en el ensayo de invasión, se observó una mayor capacidad invasiva en las líneas con reducción de los niveles de EMX1/EMX2 (Figura 19: F y G). En la capacidad de crecimiento de forma independiente de anclaje, observamos un incremento en el número (Figura 20: A y B) y tamaño de las colonias en las líneas de BG (Figura 20C) en el contexto de reducción de los niveles de ambos genes de EMX. Figura 20. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en el crecimiento independiente de anclaje en los modelos celulares de sarcoma. (A) Imágenes de las colonias embebidas en el agar en las líneas del modelo de BG. (B) Gráfico del porcentaje del número de colonias en diagrama de barras. (C) Gráfico del tamaño medio de las colonias. La barra horizontal corresponde a 500 mm. Se representa la media de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Todos los ensayos realizados en este apartado, muestran un aumento de las propiedades tumorales cuando se disminuyen los niveles de expresión de EMX1/EMX2 en la línea de fibrosarcoma mixoide BG. 1.6. Efecto de la reducción de la expresión de EMX1/EMX2 en células primarias de sarcoma in vivo A continuación, se realizaron in vivo xenotransplantes en ratónes inmunodeprimidos de los diferentes modelos celulares de BG. Observamos que los tumores con niveles reducidos de Resultados 70 los genes EMX crecían más rápido que los tumores formados por las líneas control (Figura 21: A y C). En paralelo se midió la supervivencia, obteniéndose una reducción acusada de la misma en los ratónes inoculados con las líneas del sh-ARN, con respecto a las líneas control (Figura 21B). Figura 21. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en el crecimiento tumoral de los xenotransplantes del modelo de BG. (A) Crecimiento tumoral de los tumores xenotransplantados en ratónes inmunodeprimidos, a partir de los modelos celulares de BG. (B) Supervivencia de las diferentes cohortes de ratónes inmunodeprimidos. (C). Fotografías representativas de los tumores ya crecidos en el ratón en el día 42. La barra se corresponde con 0.5 cm. El p-valor de los gráficos de supervivencia se obtuvo utilizando el test LogRank. El resto de análisis se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 1.7. Efecto de la reducción de la expresión de EMX1/EMX2 en el fenotipo de las células madre Se realizaron los ensayos funcionales relacionados con las propiedades de las células madre. En el análisis de fenotipos clonales se observa un incremento significativo en las líneas expresando los sh-ARN de los clones con mayores propiedades de célula madre del cáncer (holoclones), con respecto a los clones con mayor grado de diferenciación (meroclones y paraclones) (Figura 22). Por otro lado, medimos la formación de tumoresferas de las dos maneras anteriormente descritas, en los modelos celulares de BG. Se observó que en las condiciones de silenciamiento estable de EMX1 y EMX2, se producía un aumento del número de Resultados 71 tumoresferas primarias y secundarias cuando se sembraban 5000 células iniciales (Figura 23: A y B) y un aumento del tamaño de las tumoresferas (Figura 23C). Cuando se realizaba el ensayo de formación de una esfera a partir de una célula aislada mediante citometría de flujo, se observaba un aumento tanto en el tamaño de las tumoresferas, como en la eficiencia de formación de tumoresferas en el contexto de silenciamiento de EMX1/EMX2 de BG (Figura 23: D, E y F). Figura 22. Efecto de la reducción de EMX1 y EMX2 en el fenotipo de los clones en los modelos celulares de sarcoma. (B) Ensayo de clonabilidad en el modelo de silenciamiento de EMX1/EMX2 de la línea de sarcoma BG. En (B) se indica el número de colonias. En (C) se indica el gráfico del tamaño de las colonias. (A) Se acompañan unas imágenes de las placas del ensayo de clonabilidad teñidas con cristal violeta en el último día del experimento. En (D) se indican los diferentes fenotipos clonales atendiendo a las propiedades de célula madre y el grado de diferenciación: holoclón, meroclon y paraclón. (E) Gráfico del porcentaje de los tipos clonales. La barra se corresponde con 200µm. Se representa la media de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). A partir de estos resultados, al igual que en los modelos de AA y AW, se decidió medir la expresión de algunos factores de transcripción implicados en rutas de señalización que regulen la pluripotencia de las células madre (OCT4, SOX2, KLF4, MYC, BMI1, NANOG, NES y PROM1). Como resultado, se observó un incremento estadísticamente significativo de la expresión de los genes reguladores de las propiedades de célula madre en las líneas que silencian EMX1/EMX2 (Figura 24). El resultado fue más robusto y presentó mayores niveles de expresión en el extracto de las tumoresferas (TO), con respecto al extracto total de la línea celular (ET) y al extracto del tumor generado en los xenotransplantes (XEN). Resultados 78 vivo. Así pues, establecimos las cohortes experimentales de 15 ratónes por genotipo de ambas líneas murinas KO y se procedió a la inducción tumorigénica mediada por el carcinógeno 3MC con dos dosis de 1 mg intramuscular de 3MC en el músculo abductor de la pata izquierda de cada ratón (Figura 29A). Se realizó un seguimiento de cada animal donde se iban anotando los primeros signos tumorales y se fueron sacrificando conforme los tumores alcanzaban un tamaño de 1,7cm3. En ese momento se realizaba una necropsia completa observando el estado de cada órgano y las posibles metástasis. Se observó que aparecían los tumores antes con una diferencia estadísticamente significativa en las líneas defectivas de Emx1(-/-) (Figura 29: B y D) y de Emx2(-/-) (Figura 29: C y E), con respecto a los ratónes silvestres y hemicigotos de ambos genes. No se observaron metástasis en ningún órgano, ni otras anomalías. Adicionalmente, el dato de la aparición de los tumores correlacionaba con la reducción significativa de la supervivencia en los ratónes Emx1(-/-) (Figura 29F) y Emx2(-/-) (Figura 29G). Para comprobar la causa fisiológica de la reducción de la supervivencia y el aumento de la malignidad tumoral, se hizo una evaluación histopatológica de la infiltración ósea de las secciones de tumor obtenidas, comparándolas con el tejido muscular control. Para ello, se desosificó el fémur embebido en el tejido tumoral, se cortaron secciones con el microtomo y se realizó una tinción de HE. Tras analizar las secciones de todas las cohortes de ambas líneas murinas, se clasificaron los diferentes grados de infiltración de la médula ósea del fémur en 3: (1) infiltración ósea incipiente, (2) infiltración ósea patente, e (3) infiltración ósea agresiva. Observamos un incremento estadísticamente significativo del grado 3 de infiltración ósea agresiva en los ratónes Emx1(-/-) (Figura 30: A y C) y los Emx2(-/-) (Figura 30: B y C), indicando una mayor malignidad tumoral en el contexto de ausencia de los genes Emx1/Emx2. Por lo tanto, se establece que la falta de Emx1 y de Emx2 aumenta la malignidad tumoral en el modelo de inducción de sarcoma mediado por el carcinógeno 3MC. Resultados 79 Figura 29. Modelo de sarcomagénesis in vivo inducida por 3MC en las diferentes cohortes de los ratónes KO de Emx1 y Emx2. (A) Esquema del procedimiento experimental y seguimiento de la inducción carcinogénica intramuscular mediada por 3MC en los modelos murinos de Emx1 y Emx2. Cada cohorte está formada por 15 ratónes. (B y C) Gráfico de los días desde el primer signo tumoral en cada cohorte de Emx1 (B) y Emx2 (C). (D y E) Fotografías representativas de la extremidad control y tumoral de cada cohorte de Emx1 (D) y Emx2 (E). (F y G) Curva de supervivencia, con respecto al tiempo posttratamiento con 3MC en Emx1 (F) y Emx2 (G). El p-valor de los gráficos de supervivencia se obtuvo utilizando el test LogRank. El resto de análisis se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 80 Figura 30. Efecto de la depleción de Emx1 o Emx2 en la capacidad de invasión tumoral de la médula ósea del fémur en los sarcomas inducidos por 3MC. (A y B) Gráficos del grado de infiltración tumoral medidos en las cohortes de Emx1 (A) y Emx2 (B). Cada cohorte tiene 15 ratónes. En (C) se indican micrografías representativas de los tres grados en los que se ha dividido la evolución de la infiltración tumoral del sarcoma inducido por 3MC en la médula ósea, con respecto al tejido control. Se destacan los puntos de inicio o progresión de la infiltración con la punta de flecha. La barra indica 200 μm. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 2.3. La ausencia de Emx1 ó Emx2 incrementa la inflamación en los sarcomas inducidos por 3MC Una vez recolectados todos los tumores de las diferentes cohortes de ambas líneas KO, se caracterizó el establecimiento del fibrosarcoma mixoide. De manera que inicialmente se realizó la inmunotinción con el marcador de proliferación celular KI67, comparando las secciones del sarcoma inducido con el tejido muscular control en cada cohorte de ambos modelos KO (Figura 31). Se observó que el sarcoma inducido presentaba un nivel de inmunotinción de KI67 del 60-65 ± 12 % en todos los genotipos, en comparación con un 8-9 ± 2 % en las secciones de tejido control. Indicando la homogeneidad de inducción tumoral del modelo mediado por el carcinógeno 3MC, lo que permite realizar comparativas con los diferentes marcadores utilizados con menor variabilidad. Resultados 81 Figura 31. Caracterización inmuno-fenotípica de KI67 de los sarcomas obtenidos por la inducción de 3MC en los KO de Emx1 y Emx2. (A y B) Resultado de inmunohistoquímica frente al marcador de proliferación celular KI67. En el panel superior se muestran micrografías del corte del tejido muscular control a 200 aumentos y en el inferior las del sarcoma inducido por 3MC, en los modelos murinos de Emx1 (A) y de Emx2 (B). La imagen de la esquina inferior derecha de cada micrografía es de 400 aumentos. La barra indica 200 μm. Se acompaña el porcentaje de inmuno-marcaje celular medio medido en 5 campos por réplica ± la desvíación típica. Las inmunohistoquímicas se realizaron en un mínimo de 3 réplicas por cada muestra. Se midieron los niveles proteicos de los marcadores de inflamación celular de linaje leucocitario (CD45) y macrofágico (F4/80), ya que por un lado se observó inflamación tisular macroscópica en el seguimiento del crecimiento tumoral inducido por 3MC y por otro, se quería comprobar si este podría ser un motivo añadido de la mayor malignidad tumoral en los genotipos de falta de uno o dos alelos de Emx1/Emx2. Como resultado, se obtuvo que existía una mayor presencia tanto de leucocitos medidos por CD45 (Figura 32: A y B) y de macrófagos Resultados 82 medidos por F4/80 (Figura 33: A y B), en los genotipos hemicigoto (+/-) y homocigoto recesivo (-/-) de ambos modelos murinos. Figura 32. Caracterización inmunofenotípica de CD45 de los sarcomas inducidos por 3MC, en los modelos KO. (A y B) Resultado de inmunohistoquímica frente al marcador de proliferación celular CD45. En el panel superior se muestran micrografías del corte del tejido muscular control a 200 aumentos y en el inferior las del sarcoma inducido por 3MC, en los modelos murinos de Emx1 (A) y de Emx2 (B). La imagen de la esquina inferior derecha de cada micrografía es de 400 aumentos. La barra indica 200 μm. Se acompaña el porcentaje de inmuno-marcaje celular medio medido en 5 campos por réplica ± la desvíación típica. Las inmunohistoquímicas se realizaron en un mínimo de 3 réplicas por cada muestra. Resultados 83 Figura 33. Caracterización inmunofenotípica de F4/80 de los sarcomas inducidos por 3MC, en los modelos KO. (A y B) Resultado de inmunohistoquímica frente al marcador de proliferación celular F4/80. En el panel superior se muestran micrografías del corte del tejido muscular control a 200 aumentos y en el inferior las del sarcoma inducido por 3MC, en los modelos murinos de Emx1 (A) y de Emx2 (B). La imagen de la esquina inferior derecha de cada micrografía es de 400 aumentos. La barra indica 200 μm. Se acompaña el porcentaje de inmuno-marcaje celular medio medido en 5 campos por réplica ± la desvíación típica. Las inmunohistoquímicas se realizaron en un mínimo de 3 réplicas por cada muestra. 2.4. La ausencia de Emx1 o Emx2 incrementa el fenotipo de las células madre en los sarcomas inducidos por 3MC Con el objetivo de correlacionar los resultados obtenidos in vitro e in vivo con respecto a la relación de las propiedades de las células madre con los genes EMX en las líneas de sarcoma primarias, estudiamos los genes reguladores de las propiedades de célula madre en los dos modelos murinos de inducción de sarcoma mediada por 3MC siguiendo dos metodologías: (1) midiendo los niveles de proteínas en secciones de tejido realizando Resultados 84 inmunohistoquímica de EMX1, EMX2 y NESTINA y (2) midiendo los niveles de ARNm mediante qRT-PCR de los genes: Nanog, Nes, Oct4, Sox2, Klf4 y Myc. Ambas aproximaciones se realizaron en el tejido tumoral del sarcoma inducido con respecto al tejido muscular control. Se observa en el modelo murino de Emx1, una reducción de la expresión proteica de EMX1 en el genotipo Emx1(+/-), tanto en el sarcoma inducido como el tejido control, no observándose expresión en el homocigoto recesivo Emx1(-/-), comparado con el genotipo silvestre. (Figura 34A). Este resultado correlaciona negativamente con la expresión proteica del marcador neural NESTINA, que presenta su mayor nivel de expresión en el genotipo homocigoto recesivo Emx1(-/-) del sarcoma inducido. En cambio, presenta niveles bajos en la cohorte silvestre y hemicigota del sarcoma inducido, niveles bajos en el genotipo silvestre y nulos en los genotipos hemicigoto y homocigoto recesivo de los tejidos control (Figura 34B). En las inmunotinciones de EMX2 y NESTINA en el modelo murino de Emx2, se obtuvo un resultado similar al del modelo de Emx1. Obteniéndose una reducción de la expresión proteica de EMX2 en el genotipo Emx2(+/-), tanto en el sarcoma inducido como en el tejido control, no observándose expresión en el KO Emx2(-/-), comparado con el genotipo silvestre. (Figura 35A). Este resultado supone una nueva correlación negativa con la expresión proteica del marcador neural NESTINA, que presenta su mayor nivel de expresión en el genotipo homocigoto recesivo Emx2(-/-) del sarcoma inducido. Sin embargo, aparecieron de nuevo niveles bajos en la cohorte silvestre y nulos en el resto de cohortes del tejido control (Figura 35B). Por último, se realizó una caracterización molecular de los genes de las células madre, se midieron mediante qRT-PCR los genes Emx1, Emx2 para caracterizar los dos modelos murinos KO de Emx y los genes Nanog, Nes, Oct4, Sox2, Klf4 y Myc (Figura 36). En el modelo murino de Emx1 se obtuvo una reducción de los niveles de Emx1 en los ratónes heterocigotos Emx1(+/-)y nula expresión en los homocigotos recesivos Emx1(-/-) (Figura 36A), siendo los niveles de expresión menores en el sarcoma inducido (T), con respecto al tejido muscular control (C). Se observan niveles homogéneos del gen Emx2 en los tres genotipos de la línea murina KO de Emx1. En cuanto a los genes de las células madres, se observa un aumento de la expresión de Nanog, Nes, Oct4, Sox2, Klf4 y Myc en los ratónes con un alelo funcional de Emx1(+/-) y sobre todo en el KO Emx1(-/-). Sobreexpresando mucho más sus niveles en el sarcoma inducido en comparación con el tejido muscular control (Figura 36A). De manera similar ocurre con el KO de Emx2. Se obtuvo el mismo resultado de reducción de los niveles del gen Emx2 en los ratónes heterocigotos Emx2(+/-) y nula expresión en los homocigotos recesivos Emx2(-/-), con mayor expresión absoluta en el tejido control (Figura 36B). Además, se observaron unos niveles estables de Emx1 en los tres genotipos de la línea murina de Emx2. Y ocurría de igual manera con los de las células madres, un aumento de la expresión en el contexto de los ratónes hemicigotos y mucho más expresión en el homocigoto recesivo, siendo más patente la sobreexpresión en los sarcomas inducidos. Estos resultados indicarían que la reducción de un alelo o de los dos alelos de Emx1/Emx2 permite la expresión de los genes relacionados con las propiedades de las células Resultados 85 madre (Nanog, Nes, Oct4, Sox2, Klf4 y Myc), siendo más clara esta sobreexpresión en el caso de los sarcomas inducidos y en los modelos murinos homocigotos recesivos de ambos genes. Esto vuelve a correlacionar negativamente a los genes Emx con los genes relacionados con las propiedades de las células madre, pero esta vez en un contexto murino. Figura 34. Caracterización inmunofenotípica de EMX1 y NESTINA en los sarcomas obtenidos por la inducción de 3MC en los KO de Emx1. (A y B) Resultado de inmunohistoquímica frente al factor de transcripción EMX1 (A) y al marcador de linaje neural NESTINA (B). En el panel superior de (A y B) se muestran micrografías del corte del tejido muscular control a 200 aumentos y en el inferior las del sarcoma inducido por 3MC en el modelo de Emx1. La flecha indica un detalle de inmunotincion celular positivo de NESTINA. La imagen de la esquina inferior derecha de cada micrografía es de 400 aumentos. La barra indica 200 μm. Se acompaña el porcentaje de inmuno-marcaje celular medio medido en 5 campos por réplica ± la desvíación típica. Las inmunohistoquímicas se realizaron en un mínimo de 3 réplicas por cada muestra. Resultados 86 Figura 35. Caracterización inmunofenotípica de EMX2 y NESTINA en los sarcomas obtenidos por la inducción de 3MC en los KO de Emx2. (A y B) Resultado de inmunohistoquímica frente al factor de transcripción EMX2 (A) y al marcador de linaje neural NESTINA (B). En el panel superior de (A y B) se muestran micrografías a 200 aumentos del corte del tejido muscular control, y en el inferior las del sarcoma inducido por 3MC en el modelo de Emx2. La imagen de la esquina inferior derecha de cada micrografía es de 400 aumentos. La barra indica 200 μm. Se acompaña el porcentaje de inmuno-marcaje celular medio medido en 5 campos por réplica ± la desvíación típica. Las inmunohistoquímicas se realizaron en un mínimo de 3 réplicas por cada muestra. Resultados 87 Figura 36. Análisis de los niveles de expresión de los genes reguladores de la biología de las células madre en los sarcomas inducidos por 3MC de los KO de Emx1 y Emx2. (A y B) Resultado de la expresión relativa (2-ΔCt) de Emx1, Emx2, Nanog, Nes, Oct4, Sox2, Klf4 y Myc en las diferentes cohortes murinas de Emx1 (A) y de Emx2 (B), en el tejido muscular control (C) y en el tejido tumoral del sarcoma inducido por 3MC (T). Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 3. Estudio del papel de EMX1/EMX2 y su relación con la vía de Wnt/β-catenina en sarcoma 3.1. Correlación de la expresión de EMX1 y EMX2 con genes de la vía de Wnt y otras rutas de señalización reguladoras del fenotipo de célula madre Los resultados obtenidos en nuestro modelo celular mostraban una reducción de las características de célula madre al sobreexpresar EMX1/EMX2 en las líneas celulares primarias de sarcoma. Para examinar si este efecto se observaba en pacientes de sarcoma, analizamos Resultados 94 Se generaron y validaron los modelos celulares de sobreexpresión de EMX1/EMX2 con CTNNB1 mutado y se estudió la reversión del fenotipo tumorigénico mediante los ensayos de proliferación celular y de clonabilidad. Para estudiar la reversión de las propiedades relacionadas con la biología de las células madre se realizó el ensayo de formación de tumoresferas y además se midieron los niveles de expresión de los genes relacionados con estas propiedades. Se validaron los modelos celulares de AA y AW de sobreexpresión dobles (EMX1 ó EMX2 + CTNNB1 mutado) y triples (EMX1 + EMX2 + CTNNB1 mutado) a nivel de ARN mensajero y a nivel de proteína (Figura 41). Se observó una reducción de los niveles de los efectores positivos de la vía de Wnt y un incremento de la expresión de p-β-CAT en la sobreexpresión simple de EMX1 (Figura 41: E y H) o EMX2 (Figura 41: F e I) sin sobreexpresión de CTNNB1 mutado. Así como en la sobreexpresión doble de EMX1 + EMX2 sin sobreexpresión de CTNNB1 mutado (Figura 41: G y J). Adicionalmente, se observó un incremento en la expresión proteica de los efectores positivos de la vía canónica de Wnt y una disminución en los niveles de p-β-CAT en la sobreexpresión doble de EMX1 (Figura 41: E y H) o EMX2 (Figura 41: F e I) con la sobreexpresión de CTNNB1 mutado. Se observó el mismo comportamiento en la sobreexpresión triple de EMX1 + EMX2 + CTNNB1 mutado (Figura 41: G y J). Por tanto, se concluye que los genes EMX1/EMX2 no son capaces de inactivar la vía de Wnt en presencia de β-catenina activada constitutivamente. Adicionalmente, se caracterizaron los genes de la vía canónica de Wnt mediante qRTPCR (Figura 42). Se observa una reducción en los niveles de expresión relativos del gen AXIN1 y un incremento en los efectores positivos (TCF4, WNT1 y CCND1) en la sobreexpresión doble de EMX1 ó EMX2 con CTNNB1 mutado (Figura 42: A y C) y triple de EMX1 + EMX2 con CTNNB1 mutado (Figura 42: B y D) en AA y AW. De la misma manera, los niveles de expresión transcripcionales de los efectores de Wnt no se ven alterados en presencia de la sobreexpresión de EMX1/EMX2. Resultados 95 Figura 41. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt. (A y C) Niveles relativos de ARNm (2-ΔCt) de los genes EMX1 (E1), EMX2 (E2) y CTNNB1 (β-CAT) por qRT-qPCR en los modelos de sobreexpresión de EMX1 ó EMX2 y CTNNB1 de AA (A) y de AW (C). (B y D) Y en los modelos de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 y además CTNNB1 de AA (B) y de AW (D). Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). (E y F) Caracterización de los niveles proteicos de EMX1/EMX2 y de los factores de la vía de WNT: β-CAT (β-catenina), p-β-CAT (p-β-catenina S33/S37/T41), TCF4, c-MYC, WNT1 y CIC-D1 (Ciclina D1) en los modelos simples de sobreexpresión de EMX1 (E) y de EMX2 (F) de AA con la activación constitutiva de la vía de Wnt. (G) Y del modelo doble de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 + CTNNB1 mutado en AA. (H y I) Caracterizacion en AW en los modelos simples de sobreexpresión de EMX1 (H) y de EMX2 (I) con CTNNB1. (J) Y del modelo doble de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 + CTNBB1 en AW. Se muestra un experimento de Western-blot representativo de 3 experimentos realizados de forma independiente por triplicado. Resultados 96 Figura 42. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en los genes de la vía canónica de Wnt. (A y C) Cuantificación de los niveles relativos de ARNm de los genes AXIN1, GSK3β, TCF4, WNT1, CCND1 por qRT-qPCR en los modelos de sobreexpresión de EMX1 ó EMX2 y CTNNB1 de AA (A) y de AW (C). (B y D) Y en los modelos de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 + CTNNB1 de AA (B) y de AW (D). Se muestran las gráficas de los niveles de expresión (2-ΔCt) para el extracto total de cada línea celular. Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 3.3.2. Efecto funcional de la sobreexpresión de EMX1/EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt Los resultados obtenidos sugieren que EMX1/EMX2 regulan la vía de Wnt, ya que la sobreexpresión de EMX1/EMX2 inhibe la vía de Wnt y la activación constitutiva de la vía es independiente de los niveles de EMX1/EMX2. Sin embargo, aún se desconoce si el efecto funcional de EMX1/EMX2 es dependiente de la vía de Wnt. Se realizaron los ensayos funcionales de proliferación, de clonabilidad, de formación de tumoresferas y la medición de los niveles de expresión de los genes relacionados con la biología de las células madre para comprobar el efecto de la vía de Wnt constitutiva en la sobreexpresión de los genes EMX1/EMX2. Resultados 97 Se observó como existía una reducción de la proliferación celular en la sobreexpresión de EMX1/EMX2 sin la expresión de CTNNB1 mutado y un cambio en este comportamiento funcional cuando se añadía la expresión de CTNNB1 mutado, donde aumentaba la tasa proliferativa tanto en los modelos dobles y triples de las líneas celulares de AA (Figura 43: A y B) y de AW (Figura 44: A y B). Adicionalmente, en el ensayo de clonabilidad se observó una reducción en el tamaño (Figuras 43 y 44: C y E; F y H) y el número (Figuras 43 y 44: D y E; G y H) de las colonias formadas en la sobreexpresión de EMX1/EMX2 sin la expresión de CTNNB1 mutado. Y de nuevo un cambio en este comportamiento funcional cuando se añadía la expresión constitutiva de CTNNB1 mutado, aumentándose el número y el tamaño de las colonias formadas, tanto en los modelos dobles (Figura 43 y 44: C, D y E) y triples (Figura 43 y 44: F, G y H). Por lo tanto, el efecto supresor tumoral de los genes EMX1/EMX2 medido en la tasa proliferativa y la clonabilidad se pierde cuando se sobreexpresa CTNNB1 mutada. De la misma manera, se comprobó si existía una reversión del comportamiento en las propiedades relacionadas con las células madre. Se realizó el ensayo de formación de tumoresferas en los modelos dobles y triples de las líneas de AA y AW (Figura 45). Se observó en el contexto de sobreexpresión de EMX1 o EMX2 o de EMX1 + EMX2 sin la expresión de CTNNB1 mutado una reducción en el número (Figura 45: A y C, D y F) y el tamaño (Figura 45: B y C, E y F) de las tumoresferas formadas. Observándose un aumento del número y del tamaño de las tumoresferas formadas al nivel del la línea control con la adición de la expresión de CTNNB1 mutado (Figura 45). Adicionalmente, se midieron los niveles de expresión de los genes de las células madre (OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG, NES, PROM1) en los modelos dobles y triples de las líneas de AA (Figura 46: A y B) y de AW (Figura 46: C y D). En todos los genes medidos se produce una reducción estadísticamente significativa de los niveles de expresión con sobreexpresión de EMX1/EMX2. Sin embargo, con CTNNB1 mutado, se produce un aumento de la expresión de estos genes al nivel del control parental en los modelos dobles y triples de las líneas de AA (Figura 46: A y B) y de AW (Figura 46: C y D). Estos resultados muestran una reversión clara de las propiedades relacionadas con las células madre con la sobreexpresión de EMX1/EMX2, cuando se activa constitutivamente la vía canónica de Wnt. De esta manera se establece la vía de Wnt, como una de las vías relacionadas con la acción de los factores de transcripción EMX1/EMX2 en la tumorigénesis en sarcoma. 4. Análisis de la supervivencia global en bases de datos de sarcoma con respecto a los niveles de EMX1 y EMX2 La supervivencia global se corresponde con el tiempo transcurrido entre la fecha del diagnóstico o cirugía y la última fecha de seguimiento de los pacientes. Se analizó en dos plataformas de bases de datos diferentes: las de sarcoma de Ewing, osteosarcoma y carcinoma escamoso de cabeza y cuello son de la plataforma R2-Genomics167 y las de fibrosarcoma y liposarcoma de SurvExpress171. En términos generales, se observa una Resultados 98 reducción de la supervivencia en el grupo de pacientes con niveles bajos de EMX1 y EMX2 (Figura 47). Estas diferencias son significativas en el caso de las bases de datos de sarcoma de Ewing, en el resto se encuentran muy próximas a la significación estadística. Esto es debido, entre otros factores, a que el número de casos del grupo de baja expresión de EMX1 y de EMX2 siempre era muy pequeño. Figura 43. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en la capacidad proliferativa y la clonabilidad en AA. (A y B) Curvas de crecimiento de los modelos de sobreexpresión de EMX1 (E1) o EMX2 (E2) y CTNNB1 (β-CAT) de AA (A) y en los modelos de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 + CTNNB1 de AA (B). (C-H) Ensayo de clonabilidad en los mismos modelos de AA. En (C) y (F) se indica el gráfico del tamaño de las colonias. En (D) y (G) grafico del número de colonias. En (E) y (H) las imágenes representativas de las placas del ensayo de clonabilidad teñidas con cristal violeta en el último día del experimento. Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 99 Figura 44. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en la capacidad proliferativa y la clonabilidad en AW. (A y B) Curvas de crecimiento de los modelos de sobreexpresión de EMX1 (E1) o EMX2 (E2) y CTNNB1 (β-CAT) de AW (A) y en los modelos de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 + CTNNB1 de AW (B). (C-H) Ensayo de clonabilidad en los mismos modelos de AW. En (C) y (F) se indica el gráfico del tamaño de las colonias. En (D) y (G) gráfico del número de colonias. En (E) y (H) imágenes representativas de las placas del ensayo de clonabilidad teñidas con cristal violeta en el último día del experimento. Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 100 Figura 45. Efecto funcional de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2, en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en la capacidad de formación de tumoresferas. (A-L) Resultado del ensayo de formación de tumoresferas (TO) de los modelos de sobreexpresión de EMX1 (E1) o EMX2 (E2) y CTNNB1 (β-CAT) de AA (A, B y C) y de AW (G, H e I). Y en los modelos de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 + CTNNB1 de AA (D, E y F) y de AW (J, K y L). En (A, D, G y H) se representa el número medio de tumoresferas, en AA (A y D) y en AW (G y J). En AA (B y E) y en AW (H y K), el tamaño medio de las tumoresferas. En (C, F, I y L) micrografías representativas del resultado de formación de tumoresferas, en AA (C y F) y en AW (I y L). Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 101 Figura 46. Efecto de la sobreexpresión de EMX1 y EMX2 en combinación con la activación constitutiva de la vía de Wnt, en los genes de las células madre. Cuantificación de los niveles relativos de ARNm de los genes OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG, NES y PROM1 por qRT-qPCR en los modelos de sobreexpresión de EMX1 o EMX2 y CTNNB1 de AA (A) y de AW (C). En los modelos de sobreexpresión de EMX1 + EMX2 + CTNNB1 de AA (B) y de AW (D). Gráficos de los niveles de expresión (2-ΔCt) para el extracto total de cada línea celular. Se representa la media de un minimo de 3 experimentos independientes, en triplicado ± desvíación típica. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 102 Figura 47. Análisis de la supervivencia global de EMX1 y EMX2 en sarcoma. (A-J) Análisis de la supervivencia global mediante curvas Kaplan-Meier en diferentes bases de datos: (A y B) sarcoma de Ewing, (C y D) osteosarcoma, (E y F), carcinoma escamoso de cabeza y cuello, (G y H) fibrosarcoma y (I y J) liposarcoma. Las bases de datos de sarcoma de Ewing, osteosarcoma y carcinoma escamoso de cabeza y cuello son de la plataforma R2-genomics, y las de fibrosarcoma y liposarcoma de SurvExpress. Las curvas muestran la reducción de la supervivencia global en los grupos de altos y bajos niveles de expresión de EMX1 y EMX2. Se aplicó el test estadístico log-rank (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 103 DISCUSIÓN Discusión 110 En esta tesis se han comprobado los niveles de expresión de varios conjuntos de bases de datos de sarcoma disponibles, comprobándose que existe una reducción de los niveles de expresión de EMX1/EMX2 en estos sarcomas analizados en comparación con los tejidos sanos. Esto correlaciona con el análisis de la supervivencia global en las bases de datos disponibles de sarcoma. En todas ellas, aunque con significación estadística variable, se comprueba que existe una mejor supervivencia global en los grupos de altos niveles de EMX1 y EMX2. Volviendo a demostrar la asociación de los mayores niveles de EMX2 con un mejor pronóstico y una mayor supervivencia libre de enfermedad140,142,150,152,187. Pudiendo proponer a estos dos genes como biomarcadores tumorales predictivos de respuesta en sarcoma, aunque es necesario el análisis de determinados parámetros adicionales relacionados con la supervivencia y el contraste con un mayor número de bases de datos, para llegar a establecer a estos genes como biomarcadores predictivos de respuesta en todos los sarcomas. En estudios embrionarios de Emx1 y Emx2 en el desarrollo de progenitores neurales en ratón, se sugiere que existe un patrón de expresión en la región dorsal del tubo neural, permitiendo constituir un gradiente de expresión que afecta no solo al tubo neural, sino a la cresta neural por proximidad directa del gradiente (Figura 3). De tal manera, que a medida que avanza el proceso del desarrollo ontogénico en el tubo neural y la cresta neural con las sucesivas etapas de diferenciación celular, se van disminuyendo progresivamente los niveles de expresión de Emx llegando a la diferenciación de los diferentes subtipos de tejido91,105,106. Es por ello que en cada una de las etapas los genes de célula madre estarán regulados por diversos factores, pero en la progresiva reducción de la expresión de los genes EMX cabe esperar que se permita la expresión de los genes de célula madre, así como la de los efectores de la vía de Wnt. Por lo que se propone que en este nivel de diferenciación donde existe pérdida de EMX, otras vías de señalización o genes son los que podrían regular los procesos ontogénicos. Los genes EMX son indispensables en las primeras etapas del desarrollo induciendo la diferenciación celular de los diferentes precursores neurales, así como en el proceso neoplásico donde su falta contribuye a una mayor malignidad tumoral y a un aumento de las CSCs. De manera análoga a como sucede en los precursores neurales, se propone la reducción de los niveles de expresión de EMX1/EMX2 en los precursores mesodérmicos, que posteriormente puedan derivar en diferentes subtipos de sarcoma. Por todo ello se plantea el siguiente modelo que permite explicar la función de EMX1/EMX2 a lo largo del desarrollo y en el proceso de sarcomagénesis partiendo de los diferentes precursores neurales y mesodérmicos de los sarcomas (Figura 48). En el momento mediante el cual un tejido preneoplásico se convierte en tumor, se deben dar una serie de eventos moleculares genéticos y/o epigenéticos que se denominan segundo “hit” y permiten constituir el tumor en la célula somática, independientemente del tejido embrionario de origen. Una manera de emular este segundo “hit” es el uso de carcinógenos como 3MC, utilizado para la inducción de sarcomas in vivo. El primer “hit” supone la pérdida de los genes EMX con la consiguiente activación de la vía de Wnt y de los genes reguladores de las propiedades de las células madre. Discusión 111 Figura 48. Modelo del papel de EMX1/EMX2 en el proceso de sarcomagenesis de los precursores de los sarcomas. Esquema que muestra la relación entre los niveles de expresión de EMX1/EMX2 y los diferentes precursores que originan los sarcomas durante la diferenciación celular y el posterior proceso de sarcomagénesis. Los genes EMX1/EMX2 se expresan en determinados precursores neurales (neuroectodérmicos) induciendo los procesos de diferenciación, proliferación y migración celulares. Los precursores neurales se diferencian en los precursores de la cresta neural y esta a su vez, en los precursores mesenquimales que dan lugar al cartílago, hueso, musculatura y tejido adiposo de la región cefálica. Por otro lado, partiendo del proceso ontogénico del desarrollo del mesodermo, este se divide en tres derivados: el mesodermo paraxial (MPx), el mesodermo intermedio (MI) y el mesodermo lateral (ML). El mesodermo paraxial se diferenciará en el mesodérmico dorsal-somítico, el cual dara lugar a dos estructuras: el esclerotoma y el miotoma. El esclerotoma dará lugar al cartílago y hueso del resto del organismo y el miotoma a la musculatura. Tras los procesos de desarrollo en los que los genes EMX se cree que inducen la diferenciación celular en precursores tempranos, se produce su hipermetilación y silenciamiento, momento que supone el primer “hit” que permite la activación de determinados genes de las células madre y de la vía de Wnt. Cuando los mecanismos genéticos y/o epigenéticos de la tumorigénesis tienen lugar (segundo “hit”), se da la sarcomagénesis y se constituyen los diferentes subtipos de sarcomas, dependiendo del origen embrionario. El efecto de los carcinógenos como el 3MC se podría considerar como segundo “hit”, tal y como se plantea en los modelos de sarcomagénesis in vivo. Los diferentes subtipos de sarcoma derivados del mesodermo, son: tumores de tejidos blandos (liposarcomas, fibrosarcomas, rabdomiosarcomas, leiomiosarcomas, angiosarcomas, GIST) y tumores de hueso (condrosarcomas y osteosarcomas). Los diferentes subtipos de sarcoma derivados de precursores neurales, son: schwannomas, tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST), neurotecomas, tumores rabdoides y sarcomas sinoviales. El diferente grosor de las flechas que ejemplifican el proceso de sarcomagénesis indica la contribución a los diferentes subtipos de sarcoma, así pues, de los precursores mesodérmicos (verde) se generan la mayoría de sarcomas y de los precursores neurales (rojo) se generan un porcentaje menor. (TN: tubo neural, CN: cresta neural, NC: notocorda). De manera unificada se propone el siguiente modelo mecanístico de los genes EMX (Figura 49), relacionando la función de EMX1/EMX2 como supresores tumorales con respecto a los efectores de la vía Wnt y los genes de célula madre, en los contextos celulares de los precursores neurales y de las CSCs en sarcoma. EMX1/EMX2 se expresan en determinados Discusión 112 precursores neurales en los que intervienen en el desarrollo ontogénico fundamentalmente en los procesos de diferenciación y autorrenovación celulares. Por tanto, se propone que EMX1/EMX2 bloquean la expresión de determinados efectores de la vía de Wnt y genes de célula madre. En este modelo se hace hincapié en que los genes EMX1/EMX2 se silencian por la hipermetilación de sus promotores tras concluir sus funciones en el desarrollo ontogénico, permitiendo que bajo su represión se active la vía de Wnt y los genes de célula madre. Los niveles de EMX1/EMX2 van desapareciendo conforme se van diferenciando los precursores neurales, siendo su función la de regular la proliferación y la diferenciación celulares. A medida que van reduciéndose los niveles de EMX1/EMX2 con el mayor grado de diferenciación celular, va siendo ocupada esta función por parte de la vía de Wnt y de los genes de célula madre. Finalmente, tras la adquisición de un fenotipo neoplásico en precursores de sarcomas, la pérdida de EMX1/EMX2 en las células madre del cáncer provoca el aumento de las CSCs, de sus genes reguladores y de las propiedades tumorigénicas, contribuyendo en el proceso de sarcomagénesis (Figura 49). Proponemos que a raíz de los datos que corroboran el efecto supresor tumoral de EMX en los modelos en sacoma, se puede extrapolar a la heterogeneidad de todos los sarcomas. Se debe a que su comportamiento como supresores tumorales es robusto en varias líneas primarias de sarcoma (leiomiosarcoma, liposarcoma y fibrosarcoma mixoide), xenotransplantes de las mismas, un modelo murino de sarcomagénesis in vivo y tumores de sarcoma de las bases de datos de pacientes analizadas. Los sarcomas son un grupo muy heterogéneo y se ha descrito que no tienen un origen embriológico único, la mayoría parecen derivar de precursores mesodérmicos4–11,13,18 y algunos de precursores de la cresta neural14–17. Además, los sarcomas de cabeza y cuello que derivan exclusivamente de cartílago, hueso, músculo y tejido adiposo se han propuesto que tienen su origen en la cresta neural15,19. Se propone que independientemente a esta heterogeneidad EMX1/EMX2 pudieran ejercer de supresores tumorales mejorando el pronóstico tumoral en todos ellos en el contexto que haya expresión y no estén silenciados. Además, teniendo en cuenta las referencias que ponen de manifiesto el origen mesodérmico de los sarcomas4,5,9,11,13,18,27,207–209 y de los precursores de la cresta neural17,23–26,209, se propone un modelo en el cual los factores de transcripción EMX1/EMX2 bloquean la expresión de NESTINA (NES) y otros genes de célula madre esenciales en el proceso de sarcomagénesis. En este proceso intervienen directamente las CSCs del tejido normal previo a la neoplasia del sarcoma. Es por ello que los precursores neurales y mesenquimales con mayores propiedades pluripotentes son los que se diferencian en las células madres somáticas que constituyen las CSCs en las que se observan nulos niveles de expresión de EMX1/EMX2 y altos de NESTINA (NES) y de otros genes de célula madre, contribuyendo en la constitución del sarcoma (Figura 49). Nuestro modelo se adapta al modelo de desarrollo existente, añadiendo el dato de que determinadas poblaciones de CSCs positivas para los marcadores de célula madre analizados y dependientes de EMX son las que pueden Discusión 113 dar lugar al origen de todos los sarcomas, independientemente del origen embriológico, de la histología del tumor y del lugar de aparición (Figuras 48 y 49). Figura 49. Modelo del papel de EMX1/EMX2 como genes supresores de tumores y su posible mecanismo de acción. Esquema que muestra la relación entre EMX1/EMX2 y los diferentes efectores de la vía de Wnt y los genes de célula madre correlacionados. EMX1/EMX2 se expresan en determinados precursores neurales bloqueando la expresión de los efectores de la vía de Wnt (CTNNB1, CCND1, TCF4, MYC, WNT1) y los genes de célula madre (OSKM: OCT4, SOX2, KLF4 y MYC; NANOG, NES y PROM1). Tras las diferentes fases del desarrollo y la adquisición de un fenotipo neoplásico, la pérdida de EMX1/EMX2 en las células madre del cáncer provoca el aumento del fenotipo de célula madre y un aumento de las propiedades tumorigénicas. Hasta ahora hemos considerado a EMX1 y EMX2 como dos genes con idéntica función en base a los resultados obtenidos en nuestro trabajo. Cabe destacar que la literatura científica en general solo menciona a EMX2, ya sea ontogénica u oncológicamente. Sin embargo, cabe esperar que EMX1 y EMX2 tengan diferente función, aunque sea superponible en parte. Sin embargo, en este apartado son necesarios más experimentos para desligarlos funcionalmente, así como permitir el estudio de los diferentes programas transcripcionales que pudieran activar o reprimir cada uno al tratarse de factores de transcripción. En resumen, nuestro trabajo muestra que EMX1 y EMX2 actúan como supresores tumorales reprimiendo la actividad de los genes reguladores de las células madre (OSKM, Discusión 114 NANOG, NES y PROM1) y los efectores de la vía canónica de Wnt (CTNNB1, TCF4, MYC, WNT1 y CCDN1) en sarcoma. Se propone que existe nula o baja expresión de EMX1 y EMX2 en las células madre del cáncer embebidas en el tejido origen del sarcoma, permitiendo con su falta la autorrenovación del tumor. En la sobreexpresión de los factores de transcripción EMX se produce una reducción de la capacidad proliferativa, de la clonabilidad, de la reducción del número de holoclones (CSCs) y de la capacidad de formación de tumoresferas, indicando que deplecionan las capacidades de autorrenovación y mantenimiento de las CSCs en líneas primarias de sarcoma y en los xenotransplantes de las mismas in vivo. Se ha validado en modelos murinos KO de Emx1 o Emx2 cómo se ve comprometido el proceso de sarcomagénesis de un sarcoma inducido con niveles silvestres o hemicigotos de Emx1/Emx2. Siendo el escenario del sarcoma inducido de los KOs más agresivo, más infiltrativo y con mayor capacidad de autorrenovación tumoral. Por todas estas evidencias se proponen a los genes EMX como posibles nuevos biomarcadores predictivos de respuesta en el sarcoma, donde juegan un papel fundamental como genes supresores de tumores regulando genes de célula madre y genes de la vía de Wnt, esenciales en el mantenimiento de las poblaciones renovadoras del tumor. Discusión 115 CONCLUSIONES Conclusions y métodos 122 Conclusions 117 De los resultados expuestos y la discusión de los mismos se han obtenido las siguientes conclusiones: 1. Los niveles elevados de EMX1 y/o EMX2 disminuyen las propiedades tumorigénicas y el fenotipo de las células madre tumorales en las líneas celulares primarias de sarcoma. En cambio, la reducción de los niveles de EMX1 y/o EMX2 aumentan dichas propiedades. 2. La expresión de EMX1 y/o EMX2 correlaciona negativamente con la expresión de los genes reguladores de las propiedades de las células madre (OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG, NES) y con la expresión del marcador de las células madre CD133 (PROM1), generalmente asociado a sarcomas. 3. La ausencia de los genes Emx1 y Emx2 incrementa la malignidad tumoral del proceso de sarcomagénesis reduciendo la supervivencia y aumentando la inflamación e infiltración en la médula osea del sarcoma inducido en los ratónes KO para Emx1 o Emx2. 4. La ausencia de los genes Emx1 y Emx2 del sarcoma inducido en los modelos murinos correlaciona con la sobreexpresión de los genes de las células madre (Oct4, Sox2, Klf4, Myc, Nanog y Nes). 5. La sobreexpresión de EMX1 y/o EMX2 en las líneas de sarcoma reducen la activación de la vía de Wnt, como ruta reguladora a las propiedades de las células madre, a través de la reducción de la expresión de los efectores positivos de la vía de Wnt (CTNNB1, TCF4, MYC, WNT1 y CCDN1). 6. La activación constitutiva de la vía de Wnt tras la sobreexpresión de EMX1/EMX2 recupera las propiedades tanto tumorigénicas como de las células madre en las líneas primarias de sarcoma. 7. La expresión de EMX1 y/o EMX2 se reduce o pierde en las neoplasias humanas y en los sarcomas, lo que se correlaciona con la hipermetilación de sus promotores, el grado de malignidad y el peor pronóstico del sarcoma. 8. Los genes EMX1 y EMX2 actúan como supresores tumorales en sarcoma, reduciendo las propiedades de las células madre del tumor, los genes que las regulan y determinados efectores la vía de Wnt, por lo que su pérdida se propone que incrementa la malignidad tumoral en los sarcomas derivados de los precursores neurales, de la cresta neural y precursores mesodérmicos. Conclusions 119 CONCLUSIONS Bibliografía y métodos 126 tumorigenesis. Cellular Signalling 25, 1264–1271 (2013). 68. Shi, Y. and Ai, W. Function of KLF4 in Stem Cell Biology. Pluripotent Stem Cells 317–343 (2013). doi:10.5772/54370 69. Wu, C.-W. (Ken), Wang, M.-L. and Chiou, S.-H. Targeting cancer stem cells: emerging role of Nanog transcription factor. Onco. Targets. Ther. 1207 (2013). doi:10.2147/ott.s38114 70. Tan, S. T., Itinteang, T., Davis, P. F., Wickremesekera, A. C. and van Schaijik, B. Subcellular localisation of the stem cell markers OCT4, SOX2, NANOG, KLF4 and c-MYC in cancer: a review. J. Clin. 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EMX1(+) EMX1(-) EMX2(+) EMX2(-) (29 genes) EMX1(+) EMC1(-) EMX2(+) (29 genes) EMX1(+) EMX1(-) EMX2(-) (5 genes) EMX1(+) EMX2(+) EMX2(-) (15 genes) EMX1(-) EMX2(+) EMX2(-) (9 genes) EMX1(+) EMX2(+) (44 genes) EMX1(+) EMX2(-) (13 genes) EMX1(-) EMX2(+) (7 genes) EMX1(-) EMX2(-) (22 genes) LEF1 RAC1 AXIN1 EP300 CTBP2 CAMK2B VANGL2 MAP3K7 DVL3 TCF7L2 SERPINF1 CCND2 PRKCB ROCK2 NFATC1 LRP5 DVL2 CCND1 FZD5 TCF7 BTRC FZD1 CAMK2A PRKACB SMAD4 WNT10A TBL1XR1 FRAT1 WNT10B GPC4 PORCN TCF7L1 TBL1X FZD7 SFRP5 CREBBP PPP3CB VANGL1 NFATC4 PPP3CA CTNNB1 AXIN2 WNT2 SFRP4 WIF1 DVL1 APC FZD4 WNT11 FZD10 JUN WNT2B SFRP1 WNT16 MAPK9 NFATC2 FBXW11 DAAM2 CHD8 LRP6 SENP2 RAC2 DKK1 CTNNBIP1 PLCB4 CTBP1 FZD3 FZD6 SMAD3 PPP3R1 NKD1 SKP1 FRAT2 DKK4 BAMBI MAPK10 CAMK2G RAC3 TP53 PLCB2 CACYBP WNT5A FZD2 MAPK8 MYC CCND3 SIAH1 COL4A6 WNT3A FASLG MMP7 MITF PRKCG WNT6 EGF VEGFC PDGFB PLCG2 CSF3R RXRA PIK3R5 PLCB1 PRKACA FGF4 WNT9A FGF12 LAMC3 WNT4 DAPK2 WNT7A FZD9 CTNNA2 PRICKLE1 NKD2 WNT5B PIK3CB CAMK2D WNT3 ADCY9 GSK3B FOXO1 DAAM1 PAX8 TRAF1 PRKACG FZD8 COL4A3 RET PRICKLE2 APC2 ARHGEF1 PTGER3 CXXC4 NLK SOST CDH1 DCC CSNK1D TPR TRAF3 STK4 WNT7B FGFR3 BRAF PPARD DKK2 STAT3 CSNK2A2 CSNK1A1 SNAI2 PPP3CC ROCK1 CKS1B SMAD2 CSNK1E CRK JAK1 RUVBL1 CSNK2B BAD PIK3CA RBX1 PTK2 NFATC3 TCEB1 LIMD1 PLCB3 HSP90AB1 RALBP1 RHOA FOSL1 TP73 MSH2 Anexos y métodos 134 Tabla 11. Anexo Figura 37. Genes de la vía de Wnt correlacionados con EMX1/EMX2 (parte 2 de 2). EMX2(+) EMX2(-) (10 genes) EMX1(+) (28 genes) EMX1(-) (26 genes) EMX2(+) (109 genes) EMX2(-) (74 genes) DLG1 DLG2 TGFB3 SOX17 TGFBR1 YWHAQ WNT9B TGFB1 CRB1 PRKCA BMP6 CCNA1 CCDC6 IKBKG PML LPAR3 PIAS2 ZBTB16 PGF XIAP WNT8B PPP2R2C NT6 FLT3 BMP2 ADCY8 FGF18 PIK3R2 FGF8 TBL1Y IL6 FGF5 GSK3 VHL CER1 CEBPA CSNK1G1 CUL1 PPP1CC FH SNK1D CSNK1G3 CYCS CSNK1A1L RAB23 CDKN1A MAP2K2 INVS GNAI2 AKT1 AJUBA MAPK1 SNK2A2 MAP2K1 ARNT CDKN1B FOS PSEN1 BCL2L1 BIRC2 PPP1CB CSNK2A1 STAT1 MMP9 RASGRP4 ACTB SFRP2 SERPINE1 RXRG ARHGEF11 TGFB2 WNT1 LAMA2 PTEN CDK6 YWHAH PDGFRB NOS2 ADCY3 TGFBR2 COL4A5 BMP8A WWTR1 LAMB2 WWC1 YWHAG HHIP CASP9 FRMD6 MET SMAD7 CUL2 LAMC2 TEAD1 PTGER2 PPP2CB EDNRB EGLN1 PDGFRA ADCY4 ADCY2 SCRIB GNG3 EGLN3 SPI1 GNAS FGF7 COL4A4 PARD6G GNG4 GNAI1 EGFR NFKB1 BMPR1B ITGA6 KITLG TPM3 AGTR1 PDGFA LAMA4 LLGL2 BCL2 EPAS1 FGF2 ARAF ID1 CXCL12 LPAR5 BIRC7 CDKN2B VEGFA CBLC WNT8A SOS2 ITGA2 ADCY5 CSF1R GNA11 PLEKHG5 AR FGF20 BMP5 WTIP ETS1 CTNNA3 GNG12 LAMA5 FGF1 PLD1 PPARG AKT3 NCOA4 RASGRP3 RARB HGF LAMC1 MPP5 TGFA RUNX1 CTGF TP53BP2 STAT5A SLC2A1 PTGER4 BMP8B VEGFB ADCY1 PTCH2 DLG3 GNG7 TEAD4 ARNT2 MECOM TRAF2 MOB1B GNB5 LAMB3 SUFU BID PPP2R2D NTRK1 GNAI3 RAD51 BBC3 TCEB2 BRCA2 KIT CTNNA1 FGF11 LPAR4 BMPR1A LAMB1 GLI1 BIRC5 HDAC1 MDM2 PLCG1 CBL CCNE1 GNB1 MSH6 FADD YWHAE GRB2 SMAD1 PARD6A CDK4 PRKCI LATS1 RALA GNAQ SKP2 HRAS PPP2R1A TRAF4 LPAR1 PPP2R2A PTCH1 F2R ABL1 E2F1 MAPK3 GNB2 CASP8 CCNE2 HDAC2 HUGO E2F3 HSP90B1 BAX GNGT1 DAPK1 RASSF1 GSTP1 PARD6B ID2 FGF14 GNB4 TFG LPAR2 NRAS CKS2 CDK2 HSP90AA1 CASP3 PPP1CA E2F2 Anexos 135 ANEXO II: ESTANCIA, PUBLICACIONES, PATENTES Y CONGRESOS DURANTE LA ETAPA DE DOCTORADO. ESTANCIA: Estancia breve durante la etapa de doctorado, en el centro Icahn School of Medicine del Hospital Monte Sinaí de Nueva York (09/2017–12/2017).  Financiado por el Ministerio de educación (FPU2016, código de la ayuda: EST16/00293).  Investigadora principal: PhD, Emily Bernstein (Jefa del grupo de epigenética del cáncer. Departamento de Ciencias Oncológicas del centro Icahn School of Medicine del Hospital Monte Sinaí de Nueva York). PUBLICACIONES: 1. Lucena-Cacace A, Otero-Albiol D, Jiménez-García MP, Carnero A. (2017). NAMPT is a potent oncogene in colon cancer progression that modulates cancer stem cell properties and resistance to therapy through Sirt1 and PARP. Clinical Cancer Research. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-17-2575. 2. Jiménez-García MP, Lucena-Cacace A, Robles-Frías MJ, Ferrer I, Narlik-Grassow M, Blanco-Aparicio C, Carnero A. (2017). Inflammation and stem markers association to PIM1/PIM2 kinase-induced tumors in breast and uterus. Oncotarget. doi: 10.18632/oncotarget.19438. 3. Lucena-Cacace A, Otero-Albiol D, Jiménez-García MP, Peinado-Serrano J, Carnero A. (2017). NAMPT overexpression induces cancer stemness and defines a novel tumor signature for glioma prognosis. Oncotarget. doi: https://doi.org/10.18632/oncotarget.20577. 4. Jiménez-García MP, Verdugo-Sivíanes EM, Lucena-Cacace A. (2016). Nicotinamide adenine dinucleotide+ metabolism biomarkers in malignant gliomas. Cancer Translational Medicine. 2 (6): 189-196. Doi: 10.4103/2395-3977.196912. 5. Jiménez-García MP, Lucena-Cacace A, Robles-Frías MJ, Narlik-Grassow M, BlancoAparicio C, Carnero A. (2016). The role of PIM1/PIM2 kinases in tumors of the male reproductive system. Scientific Reports. 6, 38079; doi: 10.1038/srep38079. 6. Perez M, Munoz-Galvan S, Jiménez-García MP, Marín J, Carnero A. (2015). Efficacy of CDK4 inhibition against sarcomas depends on their levels of CDK4 and p16ink4 mRNA. Oncotarget. 6 (38): 40557-74. doi: 10.18632/oncotarget.5829. 7. Czarny P, Seda A, Wielgorski M, Binczyk E, Markiewicz B, Kasprzak E, Jiménez-García MP, Grabska-Liberek I, Pawlowska E, Blasiak J, Szaflik J. (2014). Mutagenesis of mitochondrial DNA in Fuch endothelial corneal dystrophy. Mutation Research. 760, 42-47. http://dx.doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2013.12.001. 8. Wójcik KA, Synowiec E, Jiménez-García MP, Kaminska A, Polakowski P, Blasiak J, Szaflik JP. (2013). Polimorphism of the transferrin gene in eye diseases: keratoconus and