Producción de biomasa de microalgas rica en carbohidratos acoplada a la eliminación fotosintética de CO2

Tesis Doctoral PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE MICROALGAS RICA EN CARBOHIDRATOS ACOPLADA A LA ELIMINACIÓN FOTOSINTÉTICA DE CO2 Rafael García Cubero Directora: Dra. Mercedes García González Profesora Titular de la Universidad de Sevilla DE BIOQUÍMICA VEGETALY FOTOSÍNTESIS Consejo Superior de Investigaciones Científicas Universidad N DE MÁSTER Molecular y Biotecnología RAFAEL GARCÍA CUBERO Sevilla, Junio de 2011 INSTITUTO DE BIOQUÍMICA VEGETAL Y FOTOSÍNTESIS Universidad de Sevilla Consejo Superior de Investigaciones Científicas PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE MICROALGAS RICA EN CARBOHIDRATOS ACOPLADA A LA ELIMINACIÓN FOTOSINTÉTICA DE CO2 Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Biología por el licenciado RAFAEL GARCÍA CUBERO A mi familia ÍNDICE INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 19 EL CARBONO Y SU CICLO BIOGEOQUÍMICO ............................................................ 21 EL EFECTO INVERNADERO ....................................................................................... 23 EL ANTROPOCENO: CALENTAMIENTO GLOBAL Y CAMBIO CLIMÁTICO .................. 23 Efectos y consecuencias del cambio climático .................................................... 26 Estrategias frente al cambio climático ................................................................ 27 MITIGACIÓN DEL CO2 .............................................................................................. 28 Técnicas para la captura de CO2 .......................................................................... 28 Técnicas para el transporte de CO2 ..................................................................... 29 Secuestro y almacenamiento de carbono ........................................................... 30 Métodos abióticos ........................................................................................... 30 Métodos bióticos ............................................................................................. 31 VALORIZACIÓN DEL CO2 .......................................................................................... 32 LAS MICROALGAS .................................................................................................... 33 Biotecnología de microalgas ................................................................................ 34 Aplicaciones de las microalgas ............................................................................ 35 Alimentación .................................................................................................... 36 Fertilización ...................................................................................................... 37 Biorremediación ............................................................................................... 37 Generación de productos de interés ............................................................... 38 Pigmentos ..................................................................................................... 38 Compuestos con actividad biológica ............................................................ 39 Biocombustibles ........................................................................................... 39 Nuevos desarrollos .......................................................................................... 41 El cultivo de microalgas ....................................................................................... 41 Factores que afectan al cultivo de microalgas................................................. 43 Fotobiorreactores ............................................................................................ 44 Procesos para cosechado y secado de la biomasa .............................................. 48 OBJETIVOS ................................................................................................................... 51 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 55 Material biológico ................................................................................................... 57 Medios de cultivo .................................................................................................... 58 En primer lugar quisiera dar las gracias a INABENSA S.A., al Consejo Superior de Investigaciones Científicas y a la Universidad de Sevilla por apoyar y financiar este proyecto dentro del marco CENITSOSTCO2: Usos sostenibles del CO2, permitiéndome realizar esta Tesis Doctoral. Me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento a Miguel García Guerrero y Mercedes García González por la oportunidad que ambos me han dado, la confianza depositada en mí, su tiempo, su visión científica y todo lo que me han enseñado, tanto dentro como fuera del ámbito laboral. Siempre os estaré agradecido por todo. Parte importante de este trabajo, no se hubiese realizado sin la ayuda, la paciencia, el tesón y las ganas de Pepe Moreno. Gracias Pepe, porque sé que he tenido la suerte de conocer a una gran persona. A mis compañeros de laboratorio por haberme soportado durante estos cinco años. En especial a Rebeca, por darme tan buenos consejos cuando los necesitaba. A Juan Carlos, por siempre, siempre ayudarme para lo que fuese y aportar tanto. Sin ti, Juanca, hubiese sido todo un poco más tedioso y difícil. A Marta, Pitiña, por haber estado siempre ahí, pá lo bueno y pá lo malo. Gracias amiga. A Esperanza, Ana y Cristina. También a ti, Elena, por tanto, durante tantos años y por tu llamada que me cambiaría la vida (“Hay una oferta en el IBVF”). A la gente del Laboratorio 2-3… Sin ustedes habría sido bastante complicado todo… Sabéis que me habéis ayudado en momentos difíciles, y eso, lo llevaré siempre conmigo. Por tantas cosas… Gracias Miguel, Luis (habéis ayudado más de lo que pensáis), María José, Maribel, Rocío, Anita y Lore… Y sobre todo a Ale y Sandra y a Joaquín e Isa… Habéis sabido estar siempre al pie del cañón, apoyarme, escucharme y animarme… Gracias amigos. Al Dr. Gabriel Acién, por haber tenido la suficiente paciencia de enseñarme a modelar, y ser tan comprensivo ante las mil dudas con las que le he bombardeado. A todas esas personas del IBVF y CicCartuja que de alguna manera u otra me han echado un cable. En especial a Tere (L13) por tantísima paciencia y comprensión, y tener siempre tiempo para mí y para mi almidón. A José Enrique del servicio de cultivos, Alicia de microscopía, Bienvenido y Rafael del almacén, Juan Antonio, Rafael y Manolo de mantenimiento, y a toda la gente de seguridad, Luis, Ana, Javi y Eduardo. Gracias a aquellos que de alguna manera u otra me han aguantado y apoyado, y sé que están muy orgullosos de mí. A Leslie, Jessica, Lily, Livio, Alfredo, Flora, Alfonso. Gracias a Kurt, Krist y Dave… Muchas horas sonando y muchas horas acompañándome en el laboratorio. También va por ti, Juan. Por tantos años y tantas cosas vividas. Eres como un hermano…Nunca has fallado. A mi familia, sin ustedes, jamás hubiese llegado hasta aquí. A mi abuelo Luis, sé que estarás orgulloso de tu nieto. A ti, Astérix, que aunque no hables, lo dices todo con tu mirada. Desde que empecé la Universidad, jamás has faltado a una sola noche de estudio en mi regazo. Gracias por acompañarme tantas horas. A Paco, por ser como un padre, y siempre, siempre, dar sin pedir nada a cambio. A ti, Javi. Eres el mejor hermano y amigo que se podría tener. Gracias por confiar siempre en mí, desde que tengo uso de razón y quererme tanto. Y a ti, Mamá… Por todo, por luchar y sacrificarte tanto… haciendo que esto sea posible. Os quiero. Y por último te dejo a ti… Ana… Mi Principessa… por hacerme sentir tanto, apoyarme, ayudarme y comprenderme… por iluminar todo… Te quiero. “Sé valiente y la fuerza acudirá en tu ayuda” J.W. von Goethe (1749-1832) Parte de la investigación desarrollada durante este trabajo de tesis ha sido presentada como publicaciones y comunicaciones en los siguientes congresos: • Publicaciones o "Production of carbohydrate-rich microalgal biomass coupled to photosynthetic CO2 abatement" R.García-Cubero, E. Del Río, C. Hoys, M. García-González (2012).FEBS Special Issue, J 279: 554-554 • Comunicaciones a congresos: o 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress. Seville, Spain.Poster 27-55: "Production of carbohydrate-rich microalgal biomass coupled to photosynthetic CO2 abatement" R. García-Cubero, E. Del Rio, C. Hoys, M. García-González. September 2012 o 4th Congress of the International Society for Applied Phycology. Halifax, Canada. International Society for Applied Phycology. Póster P047: "Screening of microalgae for CO2 abatement." M. García-González, R. García-Cubero, A. Armendáriz, J. Moreno, M.G. Guerrero. June 2011 19 INTRODUCCIÓN Introducción 21 EL CARBONO Y SU CICLO BIOGEOQUÍMICO Las moléculas componentes de los seres vivos están basadas en el carbono, elemento sólido no metálico formado en el núcleo de las estrellas hace millones de años (Castelvecchi, 2009). A pesar de formar parte de una inmensa variedad de compuestos, el carbono es un elemento más bien escaso en la corteza terrestre, estimándose que representa tan solo el 0,1% de la misma, encontrándose en su mayor parte en forma de carbonato cálcico (creta, caliza y mármol) y magnésico (dolomitas) (Losada et al., 1998). El C puede formar parte de diferentes reservorios o componentes, entre los que fluye, constituyendo el llamado ciclo del C (Figura 1), de carácter complejo y con gran importancia dentro del sistema Tierra. Entre los reservorios existen dos tipos de movimientos, uno de carácter lento, con un tiempo de residencia alto (ciclo geoquímico) y otro con un tiempo de residencia menor (ciclo biológico) (http://earthobservatory.nasa.gov/). La permanencia en cada reservorio oscila de días a milenios. El ciclo geoquímico tiene tres componentes principales: litosfera, hidrosfera y atmósfera. Se estima que más de 7,5·107Pg de C (1Pg=1015g) se encuentran dentro de alguno de estos reservorios, mientras que en el ciclo biológico (biosfera) se encuentran implicados sólo unos 2-3·103Pg de C (Dhillon y Wuehlisch, 2013). En la atmósfera se encuentra aproximadamente 750-800Pg de C. Casi la totalidad corresponde a CO2, existiendo pequeñas trazas de CO, CH4 y otros compuestos hidrocarbonados distintos del metano (Siegenthaler et al., 2005). La cantidad total de C en los océanos es de aproximadamente 3,8·104Pg, esto es, unas 50 veces mayor que en la atmósfera (Houghton, 2007). El océano puede actuar así mismo como sumidero de C. En la superficie oceánica, el CO2 atmosférico se disuelve en agua acidificándola (Sarmiento et al., 2010). Por otro lado, en la atmósfera, el CO2 reacciona con el vapor de H2O formando un ácido débil, el ácido carbónico, que vehiculizado por la lluvia, disuelve las rocas, liberando Ca, Mg, K y Na. Los ríos y torrentes se encargan de transportar estos iones a los océanos. El Ca2+ reacciona con el bicarbonato formando sales, CaCO3, esenciales para organismos como corales, cocolitoforos, o para la formación de conchas y caparazones (Castanier et al., 1999). Una vez muerto el organismo, las estructuras carbonatadas pasan a formar parte del sedimento marino, cimentándose y transformándose en rocas, tipo arcillas. Aproximadamente el 80% de las rocas que contienen carbono se forman así, mientras que en el 20% restante el C se embebe en capas de barro y limo, formando esquistos (Craig et al., 2013). Las rocas carbonatadas sedimentarias constituyen el mayor reservorio de C, estimándose que pueden existir más de 6·107Pg de C así almacenados (Dhillon y Wuehlisch, 2013). En algunos casos especiales, bajo las condiciones idóneas de presión y temperatura, el carbono orgánico puede convertirse en carbón, petróleo o gas natural (Gao, 2013). Se Rafael García Cubero 28 En el protocolo de Kyoto se estableció el compromiso de reducir la emisión global de GEI al 5% con respecto al nivel de emisiones de 1990 entre los años 2008 y 2012 (Singh y Ahluwalia, 2012), aunque recientemente, en la cumbre de Doha (2012), se ha extendido este periodo hasta el 2020 (Pérez de las Heras, 2013) . Sin embargo, las emisiones han continuado aumentado, llegando a valores históricos de 400ppm de CO2 en 2013 (http://www.nature.com/news/global-carbon-dioxide-levels-nearworrisome-milestone-1.12900). Ante esta perspectiva, se hace necesario mitigar las emisiones de GEI, mediante las tres estrategias planteadas inicialmente (Lal, 2008): • La disminución del consumo energético global • El desarrollo de combustibles sin o con bajas emisiones de C • La descarbonización de gases de escape y secuestro de CO2 desde las fuentes emisoras o de la atmósfera MITIGACIÓN DEL CO2 El secuestro de CO2 viene determinado por la implantación de procesos para la captura, transporte y almacenaje del mismo, CCS (del inglés “Carbon Capture & Storage”) Técnicas para la captura de CO2 Previo al almacenaje y virtual aprovechamiento del CO2 (valorización), debe existir un proceso que capture las emisiones desde la fuente directa de producción (centrales térmicas, cementeras…). Se trata tanto de tecnologías físico-químicas como biológicas encaminadas a la captación y concentración de CO2 generado por una fuente de combustible primario (carbón, petróleo, gas natural) o por biomasa. Cabe destacar que este proceso de captura no es viable en fuentes difusas de emisión, como puede ser el tráfico rodado o aéreo. Las tecnologías biológicas se explicarán en apartados sucesivos, tratándose en este apartado las tecnologías físico-químicas. Las técnicas se dividen en tres grandes grupos (Figura 6) (Volkart et al., 2013): • Precombustión: El combustible primario se transforma primero en gas mediante su calentamiento con vapor y aire u oxígeno produciendo una mezcla que contiene, principalmente, monóxido de carbono e hidrógeno. El monóxido de carbono reacciona con el vapor, en un segundo reactor, produciendo CO2 e hidrógeno adicional que pueden separarse, mediante técnicas de absorción física o química, en un flujo de CO2 y un flujo de hidrógeno, que puede utilizarse para generar energía eléctrica y/o calor. • Postcombustión: Se separa el CO2 de los demás gases tras la quema del combustible primario en presencia de aire, mediante el empleo de sorbentes sólidos, separación por membranas, criogenia, líquidos iónicos o absorción química procurando una solución acuosa de aminas primarias, secundarias o terciarias. Introducción 29 • Oxicombustión: Se realiza la combustión de los combustibles fósiles en una atmósfera rica en oxígeno. De esta manera, la corriente de salida es prácticamente pura en CO2, sin la aparición de compuestos nitrogenados al no usar una corriente de aire en la combustión. No obstante, la separación previa del oxígeno requiere un gran coste energético. Algunos proyectos y plantas para la captura de CO2 ya están en pleno funcionamiento como Elcogas (Vega, 2010), Vattenfall, FutureGen, ZeroGen, E-oN (Stigson et al., 2012). Técnicas para el transporte de CO2 El CO2 capturado debe ser transportado al lugar donde se realice su almacenaje o reutilización. Hasta la fecha, los sistemas ensayados son tres: camiones/vagones cisterna, buques petroleros y gaseoductos (Aursand et al., 2013). Los primeros, utilizados para el transporte de pequeñas cantidades de CO2, a una temperatura de - 20ºC y 20 atmósferas de presión, son económicamente poco viables. Los buques petroleros no requieren del desarrollo de nuevas tecnologías ya que el CO2 licuado posee las mismas propiedades que los gases licuados de petróleo. Para el uso de gaseoductos se operaría de igual manera que con los oleoductos, comprimiendo el CO2 a altas presiones (78atm) hasta alcanzar el estado supercrítico (Vega, 2010; Knoope et al., 2013). Los CO2-ductos pueden discurrir a través de la superficie terrestre o por fondos oceánicos. Su uso se justificaría para distancias menores de 1500km; para distancias mayores, sería más rentable el uso de buques (IPCC, 2005). Figura 6. Sistemas de captura de CO 2 (Fuente: IPCC Special Report 2005) Rafael García Cubero 30 Secuestro y almacenamiento de carbono El objetivo de los procesos de secuestro y almacenamiento de carbono es reequilibrar el balance global de las emisiones, desarrollando una estrategia económica basada en emisiones neutras de carbono. Este tipo de estrategias deberían secuestrar la mayor parte de las emisiones antropogénicas de una manera segura, estable y medioambientalmente aceptables. Existen diversas opciones tecnológicas para el secuestro de carbono. La elección de una o una combinación de algunas de ellas es un factor importante para proponer políticas energéticas para un futuro crecimiento económico. Estas tecnologías pueden agruparse en dos amplias categorías: métodos abióticos y bióticos (Lal, 2008). Métodos abióticos El secuestro abiótico se basa en reacciones físico-químicas y en técnicas geológicas sin la intervención de organismos vivos. Ha recibido gran atención debido a que las estructuras geológicas y oceánicas poseen mayor capacidad de secuestro que cualquier método biótico utilizado. Sin embargo, los aspectos técnicos y económicos de este tipo de operación requieren una investigación más profunda (Houghton, 2007). Aún son tecnologías especulativas, sin estudios detallados de sus consecuencias medioambientales (Singh y Ahluwalia, 2012). • Inyección oceánica: El CO2 licuado se inyectaría a gran profundidad para minimizar posibles fugas. La inyección a más de 1000m de profundidad se realizaría usando buques o CO2-ductos, o bien a través de plataformas marítimas que lo harían a más de 3000m. Se formaría un lago de dióxido de carbono más denso que el resto de la columna de agua, inmiscible, y por tanto más estable. Se estima que la capacidad de este depósito sobrepasaría las reservas actuales de combustibles fósiles. No obstante, aún no es seguro su viabilidad económica ni medioambiental ya que aún no existen estudios que demuestren su estabilidad a largo plazo, ni cómo afectaría a la acidez del agua, a la biota marina y al ciclo global de C (Israelsson et al., 2010; Singh y Ahluwalia, 2012). • Inyección geológica: Se considera como una opción con gran potencial. Los estratos geológicos susceptibles a almacenar CO2 licuado serían los acuíferos salinos, capas de carbón inexplotables y yacimientos de petróleo y gas natural agotados. Independientemente del tipo de estrato usado, la característica prioritaria debe ser la impermeabilidad y la estanqueidad del reservorio (Dhillon y Wuehlisch, 2013; Volkart et al., 2013). Ya existen casos prácticos de esta técnica en Noruega (campo de Sleipner) y USA/Canadá (Dakota del Norte/Weyburn) (Lal, 2008). • Carbonatación mineral: Se consigue mediante la transformación química natural del CO2 con óxidos metálicos, produciendo carbonatos estables como CaCO3 o MgCO3. Estas rocas carbonatadas son estables quedando el Introducción 31 CO2 secuestrado permanentemente. Es una reacción lenta, con un alto consumo energético y por tanto, cara. Este proceso también puede darse de forma natural en los suelos, en determinadas condiciones físicoquímicas, aunque a tasas muy bajas (Lal, 2008). Métodos bióticos El secuestro biótico corresponde a tecnologías basadas en la utilización de organismos y microorganismos fotosintéticos tanto terrestres como acuáticos para la mitigación de carbono atmosférico (Lal, 2008). Se estima que los vegetales terrestres podrían asimilar hasta 1,1 Pg de C año-1 mediante las siguientes prácticas (Lal, 2001): • Gestión de los bosques: Las plantas leñosas forman estructuras resistentes como la lignina donde el C permanece almacenado durante un periodo largo de tiempo. Existen dos aproximaciones: a) protegiendo los ecosistemas boscosos que actualmente asimilan grandes cantidades de C, y/o b) gestionando bosques para incrementar su productividad. Se calcula que con reforestaciones futuras, los bosques podrían alcanzar tasas de fijación de hasta 5,4 Pg de C año-1 hacia el 2050 (Vanhala et al., 2013). Se postula que la productividad primaria de los bosques alcanzaría su máximo con una concentración de CO2 atmosférico de 800-1000ppm (Dhillon y Wuehlisch, 2013). • Gestión y uso mejorado de las tierras de cultivo/ganadería. Actualmente la agricultura y la ganadería emiten entre 10-12% del total de GEI, principalmente en forma de metano (fermentación de la materia orgánica residual y ganadería) y N2O debido al exceso de fertilizantes (Chowdhury y Dick, 2013; Dhillon y Wuehlisch, 2013). Por ello es necesario desarrollar nuevas técnicas agrícolas y ganaderas que reduzcan la dependencia actual de fertilizantes químicos y sintéticos, así como prácticas más sostenibles (Lal, 2013). • Gestión de los recursos edafológicos. Muy relacionado con el apartado anterior. Consiste en incrementar la materia orgánica de los suelos, tanto agrícolas como humedales, bosques o zonas degradadas (Dinakaran y Rao, 2012). Con la humificación, aumenta la calidad de los suelos, disminuye la erosión y se fomenta la recirculación del carbono hacia su ciclo biológico (Chowdhury y Dick, 2013; Olson, 2013). Fertilizando el suelo mediante la inyección de CO2 a 0,5-1m de profundidad, el incremento de carbono orgánico en el suelo aumentaría hasta tasas de 1000 kg de C ha-1 año-1 con tiempos de residencia de más de 70 años (Lal, 2008). Respecto a los vegetales acuáticos, se estima que el 40% de las emisiones de CO2 de origen antropogénico emitidas hasta ahora se han fijado en forma de materia orgánica en ecosistemas marinos por fitoplancton (Singh y Ahluwalia, 2012). Estos Rafael García Cubero 32 microorganismos se caracterizan por poseer una tasa de renovación de biomasa muy breve (días). Parte de las partículas orgánicas se depositan en el fondo oceánico, quedando secuestradas. La distribución del fitoplancton y su productividad primaria está definida por la disponibilidad de luz y nutrientes (N, P e Fe principalmente) (Figura 7). Se ha propuesto la fertilización de los océanos con estos nutrientes además de CO2. No obstante se desconoce las consecuencias que tendría la acidificación de los océanos debido al exceso de dióxido de carbono, y por tanto en el ciclo global del carbono, así como los efectos de una eutrofización de los ecosistemas marinos por exceso de P, N o Fe (Behrenfeld et al., 2006; Lal, 2008). VALORIZACIÓN DEL CO2 El dióxido de carbono puede encontrar un uso alternativo a la simple captura y almacenamiento, mediante una valorización del mismo. No obstante, esto conlleva describir el contexto medioambiental y económico que podría tener esta valorización (Vega, 2010). Los usos que puede tener el CO2 se dividen en: • Procesos industriales donde interviene de manera directa el dióxido de carbono, como por ejemplo, en la industria alimentaria (bebidas carbonatadas y alcohólicas, tratamiento de la leche, fabricación de quesos, envasado/ desinsectación de alimentos, aturdimiento de animales, refrigeración y congelación). El CO2 en estado supercrítico se puede usar como solvente para la extracción de compuestos naturales y pigmentos. También se usa en el sector textil, en la limpieza industrial y en la síntesis y modificación de materiales. Además, está generalizado el uso de CO2 en el tratamiento de aguas residuales. • Extracción mejorada de petróleo y gas natural: Esta técnica se inició en USA en la década de 1960. A los pozos petrolíferos explotados cuya presión es menor que la requerida para la extracción por bombeo se les aplica una inyección de CO2 que permite recuperar trazas de petróleo que no eran accesibles. Estos Figura 7. Distribución oceánica de la productividad primaria de fitoplancton (NPP) (Behrenfeld et al., 2006) Introducción 33 depósitos vacíos son idóneos para confinar el carbono, debido a su naturaleza estanca sin fallas ni discontinuidades. La misma idea se aplica para la recuperación de metano en capas de carbón inexplotables. • Síntesis de compuestos químicos: El CO2 se utiliza en la síntesis de urea (fertilizante), formación de resinas, producción de ácido acetilsalicílico y en la producción sintética de combustible como el metano. • Procesos biológicos: Los organismos fotosintéticos utilizan CO2 para generar biomasa empleando la energía solar. La composición de esta biomasa puede ser de interés comercial. De esa forma el CO2 pasa de ser un residuo a convertirse en un producto. El ejemplo más ilustrativo es el empleo de CO2 para el cultivo de microalgas, microorganismos fotosintéticos, con altas tasas de crecimiento y una composición de metabolitos muy amplia, que posibilita su uso para diferentes aplicaciones, como producción de biocombustibles, industria cosmética, compuestos nutracéuticos, vacunas, biorremediación… LAS MICROALGAS En ficología aplicada y biotecnología, el término microalgas define a organismos microscópicos, con clorofila a, que realizan fotosíntesis oxigénica y sin diferenciación en raíces, tallo y hojas. Incluyen tanto a microorganismos eucariotas (clasificados tradicionalmente según sus pigmentos fotosintéticos en rodofitas, clorofitas, dinofitas, crisofitas, prymnesiofitas, bacillariofitas, xantofitas, eustigmatofitas, rhaphidofitas y feofitas) como a procariotas (cianobacterias y proclorofitas) distribuidos por todos los hábitats terrestres y acuáticos (Richmond, 2004). Estos microorganismos fueron los responsables del cambio en la composición de la atmósfera primitiva hace unos 3500 millones de años, aumentando el nivel de oxígeno, originando una atmósfera rica en este gas, que ha permitido el desarrollo de la vida tal como la conocemos (Demirbas y Demirbas, 2010). Son responsables de al menos la mitad de la productividad primaria del planeta. La fotosíntesis representa un proceso único en la conversión de compuestos inorgánicos en compuestos orgánicos usando energía solar (Ho et al., 2011). Virtualmente todas las formas de vida en la Tierra dependen directa o indirectamente de la fotosíntesis como fuente de energía para su metabolismo y crecimiento (Masojídek et al., 2004). En la fotosíntesis oxigénica, la luz del sol se convierte en energía química, actuando el agua como donador de electrones y generando el poder reductor (NADPH) y ATP que servirán para diferentes propósitos metabólicos, uno de los más relevantes, la fijación de CO2. Los compuestos reducidos de carbono, se utilizan como estructura básica para la incorporación de elementos primordiales como nitrógeno, fósforo y azufre, generando monómeros orgánicos simples como aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y otros carbohidratos más complejos que se Rafael García Cubero 34 ensamblan para formar proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y polisacáridos que constituyen la biomasa de cualquier organismo vivo (Lehninger et al., 1995). La asimilación de CO2 es el proceso de mayor consumo energético en la fotosíntesis. Esta asimilación se lleva a cabo por una compleja ruta metabólica, el ciclo de Calvin, que implica 13 reacciones catalizadas por 11 enzimas diferentes y tiene lugar en el estroma. La primera fase, de carboxilación, consiste en la fijación del CO2 a un esqueleto de cinco átomos de carbono, la ribulosa 1,5 bifosfato, catalizada por la Rubisco (la proteína más abundante de la biosfera) (Stryer et al., 2002). Se forma así un intermediario inestable de 6 átomos de carbono que se hidroliza en dos moléculas de 3-fosfoglicerato (PGA). En la fase reductiva, las dos moléculas de PGA se reducen a triosas fosfatos consumiendo ATP y se condensan para formar hexosas monofosfato. En la fase de regeneración de la ribulosa-bifosfato (RuBP) interviene primero una transcetolasa que convierte un azúcar de 6 carbonos y otro de 3, en uno de 4 y otro de 5 carbonos. Una aldolasa combina el azúcar de cuatro y otro de tres carbonos generando otro azúcar de siete carbonos que se combina a su vez con otro de tres para formar dos azúcares de 5 carbonos (Malkin y Niyogi, 2000). El balance de todas estas reacciones es la formación de una hexosa y la regeneración de la ribulosa 5fosfato con el consumo de tres moléculas de ATP y dos de NADPH. La fijación del CO2 es el paso limitante de esta ruta siendo CO2 el único sustrato posible (no usa HCO3ni CO32-). Una concentración elevada de CO2 es necesaria para reducir al mínimo la pérdida de energía debida a la fotorrespiración (Falkowski y Raven, 1997). Cianobacterias y microalgas han desarrollado mecanismos muy diversos para concentrar el CO2 (Price et al., 2008; Wang et al., 2011). Las cianobacterias acumulan carbohidratos en forma de glucógeno mientras que plantas superiores y microalgas almacenan almidón. Ambos son polímeros de residuos de glucosa pero el almidón está menos ramificado por contener una menor proporción de enlaces α-1,6 glucosídicos. Otra diferencia respecto al glucógeno es que en el almidón el precursor activado es la ADP-glucosa y no la UDP-glucosa. El almidón se sintetiza y almacena en los cloroplastos y está constituido por amilosa, no ramificada, formada exclusivamente por residuos de glucosa con uniones α-1,4, y amilopeptina, la forma ramificada, con un enlace α-1,6 por cada 30 enlaces α-1,4. La hélice abierta formada por estos enlaces resulta muy útil para constituir un almacén de azúcar fácilmente accesible. Más de la mitad de los carbohidratos ingeridos por el hombre son almidón (Stryer et al., 2002). Biotecnología de microalgas Las microalgas están presentes en cualquier medio natural donde exista una fuente de carbono, nutrientes y luz suficiente, junto con un intervalo apropiado de temperatura. Hasta la fecha se han descrito más de 40.000 especies (Elliott et al., Introducción 35 2012), aunque algunos autores refieren números muy superiores (más de 100.000) (Demirbas y Demirbas, 2010). Las microalgas se han considerado buenos organismos modelo para el estudio de complejos procesos biológicos como la morfogénesis y diferenciación, el reconocimiento celular, los ritmos biológicos, la evolución de procesos y rutas metabólicas y la fisiología y bioquímica de la fotosíntesis. Por otro lado, en las microalgas se combinan propiedades metabólicas típicamente vegetales con características propias de células microbianas tales como la capacidad de crecimiento rápido en cultivo líquido, simplicidad de requerimientos nutritivos, plasticidad metabólica, tolerancia a condiciones extremas, capacidad de sintetizar y secretar algunos metabolitos y potencialidad de manipulación genética, que les confiere interés biotecnológico (Borowitzka 2013). Las primeras noticias acerca de la utilización de microalgas como alimento por el hombre se remontan al siglo XVI, cuando los cronistas del descubrimiento de América describen la elaboración de unos panecillos a partir de masas de algas que se recolectaban en el lago Texcoco y que utilizaba el pueblo azteca como alimento. Sin lugar a dudas se trataba de materia seca de la cianobacteria Spirulina maxima. El botánico belga J. Leonard, en 1964, describió la venta en los mercados de la región de Kanem (República del Chad) de tortas de color verde-azulado que empleaban como alimento la población nativa (Abdulqader et al., 2000; García-González et al., 2000). La primera microalga aislada y mantenida en condiciones axénicas fue Chlorella vulgaris, en 1890, aunque hasta la década de 1940, no se iniciaron estudios sobre la fisiología y bioquímica de estos microorganismos. La idea de producir microalgas a gran escala tuvo su origen en Alemania durante los años 40 utilizando diatomeas (Harder y von Witsh, 1942). En 1951 el Instituto Carnegie de Washington financió la construcción en Massachusetts de la primera planta piloto para la producción de microalgas. Otro centro importante durante esos años fue el Instituto Tokugawa de Tokio donde se llevaron a cabo estudios al aire libre en una planta piloto sobre el cultivo de Chlorella (García-González et al., 2000; Huntley y Redalje, 2007). La mayoría de las plantas industriales para el cultivo de microalgas están localizadas en el Pacífico a excepción de algunas factorías situadas en Israel (Nature Beta Technologies), en USA (Cyanotech en Hawaii o Algenol en Florida), y en Australia (Betatene Ltd. o Wester Biotechnology Ltd). La búsqueda de fuentes alternativas de biocombustible ha permitido el florecimiento de muchas nuevas compañías (Sapphire Energy, Solazyme, Joule Unlimited, Aurora Algae, PetroAlgae, OriginOil, Phycal…) Aplicaciones de las microalgas La biomasa de microalgas puede ser utilizada en la fertilización y acondicionamiento de suelos para uso agrícola, en la detección de contaminantes y Rafael García Cubero 36 evaluación de ecotoxicidad, en la depuración de aguas residuales y gases contaminantes y fundamentalmente, en la generación fotosintética de productos de interés agrícola, alimentario, industrial y energético. Alimentación Desde la década de 1950 se han realizado intensos esfuerzos para explotar nuevas y alternativas fuentes de proteínas y suplementos alimenticios anticipándose a una población creciente y a una carencia en la ingesta proteica. Las microalgas pueden utilizarse directamente como alimento, para incrementar el contenido en principios nutritivos de alimentos preparados y como agente probiótico con un efecto positivo en la salud humana y animal, lo que ha permitido el desarrollo de mercados para los productos derivados de microalgas (Becker, 2004). Durante las décadas de 1970 y 1980 se desarrolló un extenso trabajo para la producción a gran escala de cultivos de microalgas como fuente de proteínas. Bajo el concepto “Single-Cell Protein” se evaluó y estudió multitud de estirpes de microalgas buscando la de mayor contenido proteico así como el perfil de aminoácidos más adecuado para la dieta humana y animal (Borowitzka, 2013). Los géneros con mayor coeficiente de digestibilidad y valor biológico son Scenedesmus, Chlorella y Spirulina (Pal et al., 2011). Las microalgas sintetizan y acumulan gran variedad de carbohidratos como almidón o glucógeno fácilmente digeribles y sin restricciones para su uso como fuente de alimento (Becker, 2004). Sin embargo, su implantación es escasa salvo en algunas regiones de Asia. Los polisacáridos producidos por Pophyridium o Rhodella, así como el de muchas cianobacterias, sí tienen aplicación como espesantes en diversos sectores industriales: alimentación, cosmética, pinturas, etc… aunque con un mercado restringido debido a alternativas más económicas como los polisacáridos producidos por macroalgas (carrageno, fucoidano o agar) o por plantas superiores (goma xantano) (Borowitzka, 2013). Ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA) como γ-linoleico, araquidónico, eicosapentaenóico (EPA) o docosahexaenóico (DHA) se encuentran frecuentemente en la composición lipídica de las microalgas, constituyendo un mercado bien establecido tanto en alimentación humana como animal (acuicultura). Así mismo, las microalgas contienen un amplio rango de esteroles y vitaminas usados principalmente como constituyentes de alimentos funcionales (Borowitzka, 2013). La biomasa de microalgas es rica en pigmentos que se utilizan como colorantes alimentarios y precursores de vitaminas. En acuicultura tienen aplicación para mejorar la supervivencia y maduración del sistema inmune y la pigmentación de la carne y piel de pescados y crustáceos (Walker et al., 2005). Introducción 37 Fertilización Las microalgas pueden ser utilizadas como fertilizantes en agricultura sostenible. Dentro de las comunidades microbianas desarrolladas en los suelos, las microalgas y cianobacterias juegan un papel fundamental en la recirculación y biodisponibilidad de elementos importantes como P y por tanto, en el acondicionamiento de suelos agrícolas (Singh et al., 2011). Históricamente, en los campos de arroz del sureste asiático, cianobacterias del género azollae se han utilizado como fertilizantes por su capacidad de fijar nitrógeno (Roger, 2004). Actualmente se está poniendo en práctica el uso de microalgas para incrementar la productividad de cultivos como leguminosas y frutales (Ismail et al., 2011; Prasanna et al., 2013). Biorremediación Se ha propuesto el uso de microalgas en procesos de biorremediación tales como eliminación de dióxido de carbono proveniente de gases de escape de plantas industriales, tratamientos de aguas residuales o remoción de metales pesados provenientes de efluentes contaminados por la minería o zonas altamente contaminadas. La posibilidad disponer de una fuente de carbono económica hace que se esté valorando el cultivo de microalgas a escala industrial en instalaciones anexas a grandes centros de emisión de CO2 como pueden ser las centrales térmicas y cementeras con el doble objetivo de reducir sus emisiones y de generar un producto con diversas aplicaciones. Sin embargo, algunas de estas fuentes emisoras producen un gas con altas concentraciones de dióxido de carbono, así como de compuestos oxidados de nitrógeno y azufre, que no son adecuados para su aplicación al cultivo de microalgas (Barker et al., 2009; Douskova et al., 2009; Van Den Hende et al., 2012). El oxígeno es un elemento clave en el proceso de depuración de aguas residuales urbanas para la oxidación de la materia orgánica por un consorcio de bacterias. De manera tradicional, este oxígeno se suministra por soplantes con un importante costo energético. El oxígeno producido por los cultivos de microalgas como resultado de la fotosíntesis supone una clara mejora en el proceso. Así mismo, las microalgas favorecen la retirada de nitrato, fosfato e iones metálicos. Para dar salida a esta biomasa de microalgas se plantea la instalación de plantas de biogás y generación de calor o electricidad a partir de la biomasa algar (Acién Fernández et al., 2012; Ahmad et al., 2013). El cultivo de microalgas puede usarse para la biorremediación de efluentes provenientes de actividades industriales y agrícolas, eliminando sustancias altamente contaminantes como compuestos fenólicos y pesticidas. Se han descrito microalgas con capacidad de degradar crudo (Subashchandrabose et al., 2013). Diversas microalgas excretan carbohidratos y otros compuestos orgánicos complejos con capacidad de adsorber cationes, haciéndolas especialmente interesantes para la Rafael García Cubero 44 Fotobiorreactores Las características deseables en un biorreactor son (Tredici, 2004; Makareviciene et al., 2013): • Ser universal y adecuado para el cultivo de varias especies de microalgas • Proporcionar la mayor cantidad de luz posible • Proporcionar un buen intercambio gaseoso de CO2 y O2 • Minimizar la sedimentación de las microalgas y su adhesión a la superficie del reactor • Poseer una tasa alta de transferencia de masa y temperatura sin dañar a la célula o inhibir su crecimiento • Baratos de construir y operar • Fácilmente escalables En el diseño y ubicación de un reactor se debe tener en cuenta la relación superficie/volumen, la orientación e inclinación, acumulación de oxígeno y difusión de dióxido de carbono, mezclado, temperatura y coste (Tredici, 2004). Atendiendo a su diseño, los reactores utilizados a gran escala en la producción fotoautótrofa de microalgas se clasifican en abiertos y cerrados: 1. Abiertos: Los estanques abiertos fueron los primeros sistemas de cultivo a la intemperie desarrollados a escala industrial para el cultivo de Chlorella, Scenedesmus y Spirulina. La explotación de estos sistemas de cultivo puede ser intensiva o extensiva (Figura 10). El sistema abierto de tipo extensivo utiliza grandes superficies (entre 5 y 50 ha) sin agitación mecánica, con una orientación tal que la turbulencia ocasionada por los vientos predominantes en la zona permitan una cierta homogeneización y movimiento de la masa líquida. La explotación extensiva se corresponde con el modo de operación de los lagos naturales, que se han empleado en la producción de hasta 20 t ha-1 año-1 de biomasa comestible (Chaumont, 1993). Los sistemas de cultivos Figura 10. A) Estanque natural para la producción de Dunaliella (Cognis, West Australia) B ) Reactores tipo raceway con diferentes volúmenes en Israel (Seambiotic Ltd.) Introducción 45 intensivos son estanques horizontales poco profundos tipo carrusel o “raceway”. Cada unidad de cultivo ocupa un área de entre varios cientos y pocos miles de metros cuadrados, estando compuesta de dos o más pistas niveladas de 2 a 10 m de ancho y 15-30 cm de profundidad, separadas entre sí por tabiques verticales, pudiendo adoptar un sistema de meandros. A lo largo de estos canales, cuyo piso y paredes suelen estar recubiertos por una capa de plástico inerte, fluye la suspensión celular a una velocidad de 0,2 a 0,5 m s-1, impulsada por la acción de paletas giratorias, hélices o bombas. El carbono inorgánico se suministra según las necesidades del cultivo, lo que se controla generalmente por medio de un pHstato y una válvula solenoide, de forma que se insufle CO2 cuando el pH supere un valor crítico, hasta restablecer el pH óptimo para el crecimiento. El cultivo en masa de microalgas en estanques abiertos combina características típicas de los cultivos agrícolas (uso extensivo de terreno, agua y nutrientes, así como dependencia del clima y de la radiación solar), con otras que asemejan la acuicultura y, sobre todo, con aquellas propias de procesos industriales para el cultivo de microorganismos, tales como operación continua, aporte dosificado de nutrientes y control del proceso de producción (García-Guerrero et al., 2006) Este reactor es el más económico y sencillo, aunque su explotación presenta notables limitaciones debido a la falta de control de temperatura y al empleo ineficiente de la luz. Se alcanzan valores bajos de densidad celular puesto que el paso de luz es amplio (20-30 cm), y la agitación con paletas no permite la apropiada sucesión de ciclos de luz-oscuridad que requieren los cultivos de microorganismos fotosintéticos (Grobbelaar, 1994) ni una buena transferencia de materia. El control de la temperatura es inviable debido a las dimensiones de las instalaciones, por ello la mayoría de las explotaciones al exterior de microalgas en estanques se realizan en climas templados. En algunos casos, los cultivos son posibles únicamente en determinadas épocas del año (Borowitzka, 1999). Las características de los sistemas abiertos dificultan el mantenimiento de cultivos monoalgales y libres de predadores, por lo que su empleo a gran escala se ha limitado a estirpes que se desarrollan adecuadamente en condiciones restrictivas de pH (Arthrospira) o salinidad (Dunaliella), o de muy rápido crecimiento (Chlorella). 2. Cerrados: Los sistemas de cultivo cerrados, de mayor sofisticación tecnológica, representan la alternativa a los estanques abiertos, aportando mejores condiciones para cultivar cualquier microalga al dificultar la invasión por organismos contaminantes. De hecho algunas microalgas sólo pueden ser cultivadas en reactores cerrados puesto que se contaminan con facilidad (Pulz et al., 2001). Los sistemas cerrados presentan múltiples ventajas frente a los reactores abiertos como un uso más eficiente de la irradiancia, que conduce a la producción de cultivos más concentrados, la posibilidad de cultivar todo el año, una disminución de Rafael García Cubero 46 las pérdidas por evaporación, un mejor control de algunas variables como la temperatura y mayor facilidad de operación en continuo (Tredici y Materassi, 1992; Borowitzka, 1999; Grobbelaar, 2009). Los reactores cerrados son apropiados para el cultivo de microalgas que generen productos de interés de elevado valor comercial, puesto que el coste de construcción y mantenimiento de estos reactores es elevado. Este hecho, unido al riesgo de inhibición de la fotosíntesis por la presencia de oxígeno, y la complejidad de su escalado, suponen los inconvenientes principales de los sistemas de cultivo cerrados. Existen varios diseños de reactores cerrados, siendo el reactor tubular el ejemplo más representativo, considerándose los reactores planos un punto intermedio entre los sistemas de cultivos abiertos y cerrados (Pulz y Scheibenbogen, 1998) (Figura 11). Reactor tubular: Los fotobiorreactores tubulares consisten esencialmente en tubos transparentes de vidrio o material plástico, conectados en serie o en paralelo para formar el colector solar, a través del cual se recircula la suspensión celular. Los tubos pueden estar dispuestos en horizontal (Molina Grima et al., 2001), en vertical (Converti et al., 2006), formando una espiral (Acién-Fernández et al., 2003), o inclinados (Vunjak-Novakovic et al., 2005). Para maximizar el empleo del terreno se ha situado en algunos casos un segundo nivel de tubos que están desplazados sobre los del nivel inferior (Torzillo et al., 1993). La recirculación de la suspensión por el fotobiorreactor se realiza mediante bombas mecánicas o sistemas “airlift”, en los que el flujo de aire sustenta el movimiento de la masa líquida. Los sistemas tubulares con circulación impulsada por “airlift” son robustos y menos susceptibles a la contaminación que los basados en bomba mecánica, estando las células menos expuestas a sufrir daños que en este último caso. El airlift cumple la doble función de bomba y de intercambiador de gases, eliminando el exceso de oxígeno generado fotosintéticamente, que acumula el cultivo en su recorrido por el colector solar (Eriksen, 2008). El diseño del reactor debe tener en cuenta el flujo idóneo y el adecuado intercambio gaseoso, además de maximizar la captura de luz, a la vez que se minimiza la ocupación de superficie. El diámetro del tubo debe estar entre 2 y 15 cm, siendo el valor óptimo de aproximadamente 10 cm. El tamaño de la unidad de este tipo de reactor no debería sobrepasar los 5.000 l. La mayor planta en operación basada en reactores tubulares (de disposición vertical) se encuentra en Klötze, Alemania, (600.000 l) y se dedica a la producción de biomasa microalgal (Chlorella) para consumo humano. Reactor plano vertical: Los reactores planos son aquellos en los que el cultivo queda dispuesto en una lámina orientada de manera que la luz incida directamente sobre ella. Los primeros reactores planos verticales se desarrollaron en la década de Introducción 47 los 50 (Burlew, 1953). Su diseño y componentes han variado desde su origen (Tredici y Materassi, 1992; Pulz et al., 1995; Hu et al., 1996) hasta la actual bolsa de PVC contenida y soportada por una estructura rígida, que supone una reducción sustancial del coste de estos reactores (Tredici, 2004; Sierra et al., 2008). El sistema puede termostatizarse mediante un intercambiador de calor colocado en su interior. La agitación de estos reactores se realiza generalmente inyectando aire en la base del mismo, lo que supone en algunos casos estrés hidrodinámico para las células (Sánchez Mirón et al., 1999). Estos sistemas semiabiertos, con propiedades híbridas de estanques y sistemas cerrados, presentan un interesante potencial para su empleo en aproximaciones masivas, como serían aquellas dirigidas al aprovechamiento de las microalgas para la captura de CO2 y/o la generación de biomasa para su empleo como materia prima de biocombustibles. Se ha citado mayor productividad por unidad de Figura 11. Diferentes diseños de fotobiorreactores cerrados: A) Tubular, C) Columna vertica l. Reactor semiabierto: D) Panel vertical . Todos ellos en las instalaciones del IBVF en Isla de La Cartuja (Sevilla). B) Bolsas de polietileno (www.empowernetwork.com) Rafael García Cubero 48 área para estos sistemas que la de estanques y reactores tubulares en el cultivo de Chlorella en Alemania (Pulz et al., 1995). La Tabla 1 resume las diferencias más notables entre los reactores abiertos y cerrados. Procesos para cosechado y secado de la biomasa De especial relevancia para el éxito de iniciativas a gran escala de cultivos de microalgas es el cosechado de la biomasa generada, que puede representar hasta el 20-30% de los costes de su producción (Molina Grima et al., 2004). Debe ser un proceso idealmente continuo, capaz de procesar grandes volúmenes de medio y económico. Las propiedades de las microalgas que influyen en su separación son: morfología (filamentosa o unicelular), tamaño, peso específico y carga superficial de la célula (habitualmente carga negativa). Los cultivos de microalgas suelen estar poco concentrados, dificultando este proceso. Generalmente se lleva a cabo en varias etapas, de forma que, la concentración de biomasa se va incrementando gradualmente. Los pasos habituales son: 1) Cosechado primario, aumenta la concentración de la biomasa 10 veces, 2) Espesado o concentración secundaria, incrementa otras 10 veces la concentración, 3) Deshidratación, para la retirada de la casi totalidad del líquido y 4) Secado o concentración cuaternaria, elimina cualquier traza de agua (Fon Sing et al., 2011). Algunos autores estiman que con una optimización de estos pasos, la biomasa podría concentrarse hasta 200 veces (Molina Grima et al., 2004). Las técnicas utilizadas para la recuperación de la biomasa algar son: • Sedimentación: Es el método más simple aunque muy influenciado por la capacidad de decantación que tenga la microalga. La principal desventaja es Tabla 1. Características de los reactores abiertos y cerrados para el cultivo de microalgas al exterior. Adaptado de Del Campo (Del Campo et al., 2007) y Acién Fernández (Acién Fernández et al., 2013) Abiertos Difusión de CO2Bajo Productividad de biomasa Bajo Tasa específica de crecimiento Bajo Riesgo de contaminación Muy alto Pérdidas por evaporación Alto Disponibilidad de luz Bajo Relación volumen/superficie Bajo Control de condiciones cultivo Difícil Costes instalación Bajo Costes operación Bajo Escalado Posible Cerrados Alto Alto Alto Bajo Bajo Alto Alto Posible Alto Alto Difícil Introducción 49 que los decantadores usados necesitan superficies adicionales además de generar una biomasa con un contenido en humedad alto. Es un proceso lento que puede modificar las características de la biomasa generada (Makareviciene et al., 2013). • Floculación: La biomasa se recupera formando agregados por la adición al cultivo de un polímero. Permite tratar grandes volúmenes, siendo una de las técnicas más usadas. La formación de coloides viene determinada por la adición de algún floculante que se une a las cargas superficiales negativas de las células. Pueden ser orgánicos (biodegradables y poco tóxicos como el quitosano, almidón...) o inorgánicos (sales de Fe3+, Al3+). También es corriente el uso de floculantes sintéticos como la poliacrilamida. Además, la floculación puede ser inducida por el cambio de pH del cultivo (autofloculación), por la presencia de bacterias u otras especies algares en el cultivo (biofloculación) o mediante una corriente eléctrica (electrofloculación) (Fon Sing et al., 2011; Banerjee et al., 2012). • Separación magnética con nanopartículas férricas: Basada en la adición de nanopartículas de Fe que quedan embebidas en la superficie celular; posteriormente se somete el cultivo a un campo magnético donde se recupera toda la biomasa. Puede considerarse un tipo especial de floculación. • Ultrasónica: formación de agregados inducida por la aplicación de ultrasonidos (Bosma et al., 2003). • Flotación o DAF: (del inglés Dissolved Air Flotation). Consiste en la inyección a presión de una corriente de aire en el cultivo favoreciendo la formación de microburbujas en el fondo del reactor. Éstas en su recorrido hacia la parte superior del reactor arrastran la biomasa adherida a ellas. Algunas especies algares tienen una flotabilidad natural debido a la formación de pequeñas burbujas de oxígeno o a un contenido alto en lípidos (Makareviciene et al., 2013). • Fraccionamiento por espuma: Es una variante de la flotación. Se adiciona al cultivo reactivos químicos que confieren un carácter hidrofóbico a la superficie de las células. Se inyecta, a continuación una corriente de aire comprimido en el cultivo que forma espuma (red de burbujas hidrofóbicas) donde quedan adsorbidas las células (Coward et al., 2013). • Centrifugación: Se trata de un proceso limpio y que puede realizarse de forma continua. Existen diferentes diseños de centrífugas industriales siendo objeto de una intensa investigación. Es el proceso más eficiente aunque sus costes de inversión y operación son altos (Acién Fernández et al., 2012). • Filtración: Se han utilizado satisfactoriamente muchos tipos de filtros. La fuerza a aplicar para realizar el filtrado, y por tanto, el consumo energético, aumenta conforme disminuye el tamaño de poro. La microfiltración (0,1-10µm) es el método más adecuado para todas las estirpes. Puede afectarse negativamente Rafael García Cubero 50 por la presencia de materia orgánica extracelular. Los equipos de filtrado están ampliamente desarrollados y utilizados en la industria en multitud de procesos. 51 OBJETIVOS Objetivos 53 La finalidad del proyecto es evaluar la viabilidad de sistemas de cianobacterias y/o microalgas para la producción de materia orgánica rica en carbohidratos, acoplada a la eliminación del CO2 presente en mezclas gaseosas procedentes de emisiones industriales. Para ello, deben seleccionarse las cianobacterias y/o microalgas más idóneas, así como profundizar en el manejo de su cultivo y en el conocimiento de factores determinantes que maximicen la producción de biomasa y compuestos orgánicos de interés energético. Para alcanzar este objetivo es necesario acometer las siguientes tareas: • Preseleccionar estirpes de microalgas y cianobacterias con elevada tasa de crecimiento y fijación de CO2. Evaluar estas estirpes en diferentes regímenes de cultivo para verificar dichas bondades y seleccionar un organismo para su caracterización posterior. • Con la estirpe seleccionada, estudiar de forma exhaustiva las condiciones de cultivo que permitan maximizar la fijación fotosintética de CO2 y su acumulación en forma de carbohidratos. Los resultados deben permitir modelizar el crecimiento de la estirpe seleccionada con vistas a evaluar el comportamiento en cultivos al exterior. • Proceder a una completa caracterización bioquímica de la biomasa generada en las experiencias anteriores, con especial atención a carbohidratos fermentables a etanol. • Evaluar la capacidad de crecimiento de la estirpe seleccionada usando gases de combustión con alto porcentaje de CO2 y COV (compuesto orgánicos volátiles). • Verificar la viabilidad de la estirpe seleccionada en cultivos a la intemperie empleando diferentes biorreactores y en diferentes condiciones ambientales optimizando su operación para maximizar de la tasa de fijación de CO2 y la productividad en carbohidratos. Rafael García Cubero 60 4mm de diámetro interno que alcanzaban la parte media del reactor, permitiendo el aporte de medio fresco. Dicho medio de cultivo, esterilizado en autoclave, se inyectaba en el biorreactor al flujo establecido para cada experimento de manera continuada durante el periodo de iluminación, a través de una bomba peristáltica (P-3, Pharmacia). El sistema se iluminaba durante 12 horas mediante tubos fluorescentes de potencia regulable mediante reostatos, controlados por una aplicación informática desarrollada por el Dpto. de Ingeniería Química de la Universidad de Almería. Mediante esta aplicación se modificaba la irradiancia desde 0 hasta 3000 µE m-2 s-1, simulando un ciclo circadiano. Cada reactor estaba iluminado por 6 tubos fluorescentes (Osram, FQ-24W/840 HO), rodeándolo completamente, asegurando una iluminación homogénea. Figura 15. Esquema de fotoquimiostato empleado en los cultivos continuos Figura 16. Instalación de fotoquimiostato Materiales y Métodos 61 Figura 17. Cultivo en estanque de 1m 2 Cultivo a la intemperie Los biorreactores utilizados en este trabajo estaban ubicados en el Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja en Sevilla (37º20’N, 6º0’O). Estanque abierto Fabricado con poliéster y fibra de vidrio, de dimensiones 1,25m x 0,8m, se operaba a una profundidad de cultivo de 10cm, correspondiendo a un volumen de 100 l. A lo largo de su eje longitudinal estaba dividido por un tabique vertical, de 0,75m de longitud, formando dos vías de circulación. Así mismo, en las proximidades de los extremos, se disponían dos pequeños tabiques verticales curvos del mismo material que facilitaban la circulación y homogenización del cultivo. La agitación de la suspensión celular se conseguía mediante un motor que hacía girar de manera regulable tres paletas de 28cm x 32cm, dispuestas en ángulos de 120º entre sí sumergidas parcialmente en el cultivo, asegurando la homogenización y un continuo desplazamiento de la suspensión celular a 0,3 m s-1 (16 r.p.m.) (Figura 17). El control de pH se hacía a través de la inyección de CO2 en burbujas de pequeño tamaño a través de un tubo poroso situado en el fondo del estanque. Un electrodo de pH (HI 2910, Hanna Instruments) unido a un controlador-medidor (HI 931700, Hanna Instruments) permitía la regulación del pH activando, mediante una electroválvula, la entrada de CO2 cuando el pH superaba el valor de consigna. Este tipo de reactor no disponía de control de temperatura. Un sensor de temperatura (TinyTag TGP-4020) permitió el registro de temperatura durante la operación de estos sistemas. Rafael García Cubero 62 Figura 18. Cultivo en reactor plano vertical Los cultivos se operaron en régimen semicontinuo, renovándose parcialmente la suspensión celular con medio fresco a fin de mantener el cultivo a la densidad celular inicial establecida en cada ciclo de dilución. Previo a la toma de muestras, el volumen del reactor se completaba hasta 100l para compensar las pérdidas por evaporación. Reactor plano vertical (RPV) Compuesto por dos estructuras rígidas de hierro que sustentaban una bolsa de plástico translúcido (200 µm de espesor y 55% transmitancia en el espectro fotosintéticamente activo) que contenía el cultivo (Sierra et al., 2008). Las dimensiones eran 1,5m de alto, 2,5m de largo, con una separación entre las dos estructuras (ancho) de 5cm (Figura 18). El volumen de cultivo en este reactor era de 300l, ocupando una superficie total de 2,5m2, considerando que, en la distribución global de un campo de reactores de este tipo debería existir una separación de 1 m entre cada fila de reactores. En la base de la bolsa se colocaba un tubo de metal perforado cada 10cm, a través del cual se hacía pasar una corriente de aire (8,3 l aire l-1 cultivo h-1) para mantener el cultivo en suspensión. Por este mismo tubo perforado se inyectaba CO2 a demanda para mantener el pH de consigna del cultivo. La suspensión celular se atemperaba mediante un intercambiador de acero en forma de serpentín, de 9m de longitud y 25mm de diámetro, ubicado dentro de la bolsa, a 50cm de la base de la misma. A través de este sistema, se hacía circular agua caliente o fría manteniendo la temperatura del cultivo Materiales y Métodos 63 dentro del intervalo marcado como consigna con una desviación de ±5ºC. Al igual que en los estanques, previo a la recogida de muestras, el reactor se completaba con agua para recuperar las pérdidas por evaporación. Estos reactores se operaban en semicontinuo de forma similar a la descrita para los estanques abiertos. Métodos analíticos Determinación de la concentración de biomasa La concentración de biomasa se determinó mediante peso seco en el caso de microalgas y valorando el carbono orgánico total (TOC), tanto para microalgas como para cianobacterias. Así mismo, para las estirpes finalmente seleccionadas se realizó una curva de calibración que relacionase turbidez medida a una longitud de onda de 750nm con el peso seco. Determinación de biomasa por peso seco Se filtró un determinado volumen de cultivo (entre 5-10ml) a través de un filtro de microfibra de vidrio Whatman GF/C de 0,45 µm de poro, previamente secado en estufa (mínimo 24horas y atemperado en desecador) y tarado. Se lavaron las células retenidas con un volumen igual de formiato amónico al 1% para eliminar las sales del medio. Los filtros con células se secaron en estufa a 80ºC durante 24-48 horas, se atemperaron y se pesaron en una balanza de precisión. El peso seco de las células se determinó por diferencia de pesada y se refirió al volumen filtrado (gramos de biomasa por litro de cultivo). Determinación de biomasa por carbono orgánico total (TOC) La biomasa presente en cultivos de microalgas y cianobacterias se estimó a partir del carbono orgánico total utilizando un TOC Analyzer (Shimadzu). En primer lugar se medía el TOC al cultivo completo y se restaba el TOC medido en el medio tras retirar las células por centrifugación estimando así el TOC presente en la biomasa. A partir del contenido en carbono de la biomasa (% de C) medido por análisis elemental se calculaba la biomasa presente en la muestra. Se realizó un análisis de regresión siguiendo un modelo lineal para establecer la correlación entre la productividad de biomasa medida a partir de carbono orgánico total (TOC) y la medida a partir de peso seco. El ajuste de estos datos mostró una correlación lineal (r2=0,9) constante e indicativa de la correcta medida de la biomasa determinada a través del TOC (Figura 19). Rafael García Cubero 64 Determinación de la biomasa por turbidez del cultivo Para las estirpes Scenedesmus vacuolatus y Chlorella vulgaris se relacionó la turbidez presente en el cultivo a una determinada longitud de onda con el peso seco medido por filtración. Atendiendo al espectro de absorción presentado en el capítulo resultados (Figuras 25 y 50 respectivamente), la λ seleccionada fue 750nm, donde no existía interferencia con los pigmentos fotosintéticos. Las ecuaciones resultantes fueron (r2=0,99): • Scenedesmus vacuolatus: Biomasa (g l-1)= 0,4013·DO750nm – 0,0357 • Chlorella vulgaris: Biomasa (g l-1)= 0,1749·DO750nm + 0,0014 Determinación del carbono orgánico total (TOC) Para determinar el carbono orgánico total de las muestras (Total Organic Carbon, TOC) se empleó un analizador de carbono orgánico elemental TOC-VCSH (Shimadzu) con el módulo de inyección automático ASI-V (Shimadzu). Las muestras se Productividad de biomasa peso seco (g l-1 d-1) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 Productividad de biomasa TOC (g l-1 d-1) -0,5 0,0 0,5 1,0 Linea de ajuste Valores experimentales Intervalo de confianza 95% Figura 19 . Correlación entre productividad de biomasa determinada por peso seco y por TOC Materiales y Métodos 65 diluyeron en agua ultrapura hasta una concentración apropiada dentro del rango de sensibilidad del analizador. Durante el análisis, las muestras fueron agitadas mediante un agitador magnético para evitar la sedimentación. El contenido en carbono orgánico de la muestra se calculó por la diferencia entre el carbono total y el carbono inorgánico presente en la misma. Determinación del calor de combustión Se utilizó un microcalorímetro (PARR 6525). Muestras liofilizadas y prensadas con un peso aproximado de 0,2 g se colocaban en una bomba de inyección con alta presión y rica en oxígeno (30 atm). Esta cámara se sumergía en recipiente con agua destilada (0,4l) a temperatura ambiente y constante. A través de la cámara de inyección se hacía pasar una corriente eléctrica de alto voltaje que, en presencia de la atmósfera rica en oxígeno, quemaba la muestra. La energía liberada en esta combustión incrementaba la temperatura del agua contenida en el recipiente. La diferencia entre la temperatura del agua antes y después de la incineración, permitía estimar la energía contenida en la muestra expresándola en KJ g-1. Determinación de viscosidad Se empleó un viscosímetro, Visco Star Plus L. Muestras de 18ml sin tratamiento de homogenización se colocaban en el contenedor adaptador para baja viscosidad (LCP) y se realizaban las determinaciones de viscosidad (mPa·s) y esfuerzo de cizalla (N m-2) incrementando la velocidad de giro dentro del rango de fiabilidad (torque). La relación existente entre velocidad y esfuerzo de cizalla era una curva que expresaba la viscosidad de las muestras. Liofilización de la biomasa Para las determinaciones analíticas se utilizó biomasa liofilizada. Se recogió un volumen de cultivo por centrifugación y se lavó varias veces con formiato amónico al 1% para eliminar el exceso de sales. El sedimento se congeló en nitrógeno líquido y se deshidrató en el liofilizador (Virtis Sentry), durante al menos 2 días. Determinación de componentes celulares Obtención de extractos para la determinación de proteínas y carbohidratos Rafael García Cubero 66 Se pesaron entre 3 y 6mg de biomasa liofilizada y se resuspendió en un volumen de NaOH (1M) para obtener una relación de 0,8g de biomasa seca por ml de NaOH. Esta mezcla se calentó a 70ºC una hora y se dejó enfriar para la determinación de componentes celulares. Determinación de proteínas Para determinar el contenido en proteínas en los extractos liofilizados se utilizó el método de Lowry modificado por Herbert (Lowry et al., 1951; Herbert et al., 1971). Se tomaron 0,1ml de muestra (0,1ml de NaOH 1M para el blanco) y se diluyeron con 0,3ml de NaOH (1M) y 0,4ml de agua destilada. Se añadieron 2ml de solución A, agitando y dejando reposar 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 0,4ml de la solución B y se volvió a agitar y dejar reposar 30 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia de cada muestra a 750nm. El valor de la concentración de proteínas se determinó a partir de una recta patrón realizada con soluciones de concentración conocida de seroalbúmina bovina (BSA) 0,2 mg ml-1 y tratados de igual forma que las muestras problema. • Reactivo A: Debe ser preparado inmediatamente antes de usarse. Se mezclaron 50ml de Na2CO3 al 5% (p/v) con 2,4 ml de una solución 1:1 de tartrato sódico potásico al 2% (p/v) y CuSO4·5H2O 1% (p/v). • Reactivo B: Se diluyó el reactivo comercial Folin-Ciocalteu con agua destilada (1:1). Determinación de carbohidratos Estas determinaciones se realizaron según el método de Dubois (Dubois et al., 1956), de acuerdo con la técnica descrita por Kochert (Kochert, 1978). Se tomaron 0,1ml de muestra y se añadieron 0,9ml de agua destilada y a continuación 25µl de la solución de fenol. Tras agitar, se adicionaron 2,5ml de ácido sulfúrico (98% v/v). Se dejó reaccionar durante 30minutos a temperatura ambiente y se determinó la absorbancia a 480nm, frente a un blanco con 0,1ml de NaOH y 0,9ml de agua destilada tratado de la misma forma. La cantidad de carbohidratos en las muestras analizadas se determinó utilizando como referencia una recta de calibrado obtenida a partir de diferentes diluciones de glucosa (0,5mg ml-1) tratadas de igual manera que las muestras problema. Materiales y Métodos 67 Determinación de almidón Para determinar el contenido en almidón de los cultivos se adaptó el protocolo para almidón en hojas de arroz (Lin et al., 1988) siguiendo el método de rotura de biomasa de microalgas propuesto por Doucha (Doucha y Livansky, 2008). Las muestras de aproximadamente 5mg de biomasa liofilizada se resuspendieron en 1ml de una solución de cloroformo:metanol 2:1 (v/v) con 1ml de perlitas de vidrio de 0,5µm de diámetro. La rotura se realizó en un molino Bead-Beater TM con dos pases de 2 minutos a máxima potencia. Se centrifugó y se descartó el sobrenadante. Se realizaron lavados de las muestras con cloroformo:metanol tantas veces como fue necesario hasta obtener un sedimento blanco. De esta manera se eliminaron de la muestra pigmentos y sustancias lipídicas que interferían en la determinación. Los gránulos de almidón presentes en el pellet se solubilizaron alcalinamente (KOH 0,2M; 100ºC; 30minutos) reajustando, posteriormente, el pH a 5 mediante la adición de ácido acético (1N). Gracias a la acción conjunta de α-amilasas y amiloglucosidasas (0,2U µl-1 CH3COONa 0,1M pH 4,5 y 0,03U µl-1 CH3COONa 0,1M pH 4,5 respectivamente) se liberaron los residuos de glucosa. La valorización de esta glucosa se realizó mediante la acción secuencial de dos actividades enzimáticas: hexoquinasa (1U µl-1 HEPES 100mM pH 7,7), que fosforilaba la glucosa, y la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (2,5U µl-1 HEPES 100mM pH 7,7) que formaba poder reductor a partir de NAD+ y la glucosa fosforilada de la reacción anterior. Según la estequiometria del ensayo, un mol de glucosa generaba un mol de NADH. El valor registrado de absorbancia (λ=340nm) correspondía a la formación de NADH, y por lo tanto, al contenido en glucosa y almidón. Este contenido se refirió a una recta patrón con diferentes diluciones de almidón 1mg ml-1 tratadas de la misma forma que las muestras problema. Extracción y determinación de lípidos Se realizó una extracción de lípidos diferente según la estirpe. Para cianobacterias, muestras de biomasa liofilizada (20mg aproximadamente) resuspendidas en 1ml de metanol se calentaron a 70ºC durante 1hora. Este extracto se Glucosa + ATP Glucosa 6 fosfato + ADP Hexoquinasa Mg 2+ Glucosa 6 fosfato 6 Fosfogluconolactona + NADH G6PDH NAD + Rafael García Cubero 68 centrifugó y se recuperó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió y lavó con metanol tantas veces como fue necesario hasta dejar el pellet completamente azul. En el caso de microalgas, se llevó a cabo el mismo proceso de rotura y extracción utilizado para la determinación de almidón, pero recuperando los sobrenadantes hasta dejar el pellet blanco. El método de cuantificación de lípidos totales se basó en una adaptación del método gravimétrico descrito por Kochert (Kochert, 1978). A los sobrenadantes recogidos tras los sucesivos lavados y depositados en tubos de centrifuga de 10ml, se les añadieron 300µl de MgCl2 0,5% (p/v) y 3ml de HCl 1N. Después de una centrifugación en la que se separaron las proteínas, se recogió la fase inferior de color parduzco y se depositó en viales de vidrio previamente lavados con hexano y tarados. Tras secar el contenido de los viales en una campana de vacío, se determinó la cantidad de lípidos por diferencias de pesadas y refiriéndolos al peso inicial de la muestra liofilizada. Determinación de la composición elemental Para la determinación de la composición elemental se utilizó un Analizador Elemental CHNS-O THERMO, modelo FLASH-EA 1112 Series, conectado a un integrador. Para determinar la composición elemental de las células se tomaron 10 ml de cultivo y se centrifugaron a 3000g durante 5 min. Se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento con una solución de formiato amónico al 1%. Se centrifugó de nuevo y se guardó el sedimento en la estufa a 80ºC durante al menos 48 h. A partir de estas muestras secas y atemperadas, se pesaron alícuotas en cápsulas previamente taradas (de estaño para C, H, N, y de plata para O). La cantidad pesada siempre estuvo comprendida entre 500 y 1500 µg. Se utilizaron como patrones: sulfanilamida, Lcistina, D, L-metionina y BBOT (1,5 Bis (5-tert-butil-benzoxazol-2-il) tiofeno). Los contenidos en N, C, H y O de las muestras analizadas se calcularon por referencia a los patrones. Todos los análisis se efectuaron, al menos, por duplicado. Medidas de irradiancia La irradiancia incidente sobre los cultivos en fotoquimostatos se cuantificó con un medidor de radiación escalar QSL-100 de tipo 4 (Biospherical Instruments Inc.) que integra la radiación procedente de todas las direcciones. La irradiancia incidente se determinó en agua. La irradiancia solar que incidió sobre los cultivos al exterior se cuantificó usando una estación meteorológica Datalogger IQ3000 (Quimisur). Compuesta por un sensor (PQS1 PAR Sensor, Kipp & Zonen) que determinaba la radiación fotosintéticamente activa (PAR) y otro sensor (IQ-BUS) que medía la radiación total. Materiales y Métodos 69 Medidas de demanda de CO2 Instalaciones Inabensa S.A. desarrolló un método para determinar la demanda de dióxido de carbono por parte de los cultivos en fotoquimiostato. El método se basó en el desarrollo de un software que cuantificaba el tiempo de apertura de las electroválvulas que permitían el paso de CO2 cuando el pH del cultivo superaba el punto de consigna. Esta demanda estaba determinada por el crecimiento del cultivo. Mediante una estandarización de la temperatura y la presión de la línea de CO2 (fracción molar 100%); y suponiendo la densidad del aire y del CO2 constantes (1,2 y 1,3 kg m-3, respectivamente) a una temperatura ambiente constante (20ºC) se pudo calcular el caudal molar de gas (mmol CO2 s-1) que pasaba a través de la electroválvula en los periodos de apertura. Mediante la tasa de fijación de CO2 y los moles del mismo que se inyectaron en el cultivo, se pudo evaluar la eficiencia en la asimilación fotosintética de CO2 por parte de los cultivos (Ecuación 1) Cálculos Velocidad específica de crecimiento En cultivos estancos, la velocidad específica de crecimiento (µ) y expresada en d-1 se determinó durante la fase exponencial, según la siguiente Ecuación: Donde x1 y x2 representan la densidad celular a tiempos t1 y t2. Productividad en cultivo continuo La productividad de biomasa (g l-1 d-1) en cultivos en régimen continuo se determinó según la Ecuación 3. Los resultados presentados en este trabajo corresponden a los valores promedio de al menos 5 determinaciones en cada estado estacionario. x 100 Ecuación 1 Ecuación 2 Rafael García Cubero 76 Tabla 7. Productividad de biomasa y tasa de fijación de CO2 en estado estacionario de cultivos continuos Estirpe Productividad de biomasa (g l-1 d-1) Tasa de fijación de CO2 (g l-1 d-1) Chloroccocum sp. 0,4±0,0 0,7±0,1 Chlorella sp. 0,6±0,0 1,0±0,0 Chlorella vulgaris 0,6±0,0 1,1±0,0 Nostoc PCC 9202 0,4±0,1 0,7±0,2 Nostoc punctiforme 0,5±0,1 0,9±0,2 Scenedesmus vacuolatus 0,5±0,0 0,9±0,1 Spirulina PCC 6313 0,2±0,0 0,4±0,1 purpureum y las cianobacterias Anabaena PCC7119, PCC7120 y PCC7937 no soportaron las condiciones de experimentación impuestas y sus cultivos se perdieron por dilución. Los valores más altos de productividad de biomasa se registraron en los cultivos del género Chlorella ( C. vulgaris y Chlorella sp. 0,6 g biomasa l-1 d-1). Scenedesmus vacuolatus mostró también un comportamiento destacable, produciendo más de medio gramo de biomasa por litro y día. A partir de la biomasa liofilizada recogida en estado estacionario se analizó la composición bioquímica y el calor de combustión (Tabla 8). La biomasa de las microalgas ensayadas contenía aproximadamente un 50% de proteínas y el resto de carbono distribuido, en proporción diferente según la estirpe, entre carbohidratos y lípidos. Mientras que, las estirpes pertenecientes al género Chlorella presentaron valores de carbohidratos ligeramente superiores al del resto de las microalgas, Tabla 8. Composición bioquímica, calor de combustión y eficiencia fotosintética (R) en estado estacionario de cultivo continuo Proteínas Carbohidratos Lípidos Chloroccocum sp. 47,2±2,8 19,7±1,9 20,2±0,9 16,9±1,1 0,9 Chlorella sp. 48,5±1,3 23,8±1,6 17,7±0,1 19,1±2,2 1,3 Chlorella vulgaris 47,3±1,0 23,0±1,3 19,9±1,5 17,1±0,2 1,4 Nostoc PCC 9202 42,4±0,8 32,2±2,3 8,1±1,3 12,6±2,7 0,8 Nostoc punctiforme 45,8±0,7 29,9±2,1 13,6±2,1 15,4±1,3 1,1 Scenedesmus vacuolatus 44,6±2,1 20,3±0,6 28,0±3,8 18,9±1,2 1,2 Spirulina PCC 6313 43,7±1,7 32,4±0,5 17,7±0,1 15,6±1,4 0,5 Estirpe Calor de combustión (KJ g-1) R (%) (%) Biomasa Resultados 77 Scenedesmus vacuolatus destacó por almacenar mayor cantidad de lípidos (aproximadamente 30% de la biomasa seca). Las cianobacterias tuvieron un comportamiento distinto, localizándose una parte sustancial del carbono fijado como carbohidratos en detrimento de los lípidos. Respecto al poder calórico, las microalgas mostraron en general valores más altos que las cianobacterias, cercanos a 20 kJ g-1. Considerando la irradiancia incidente sobre los cultivos, se pudo estimar la fracción de energía luminosa transformada en energía química como medida de la eficiencia fotosintética. Los valores más elevados se obtuvieron con microalgas: Chlorella vulgaris, Chlorella sp y Scenedesmus vacuolatus (1,2-1,4 %). SELECCIÓN DE ESTIRPE Para la selección definitiva de la cianobacteria/microalga adecuada se tomó en consideración la capacidad de fijar CO2, la densidad de los cultivos una vez alcanzado el estado estacionario (cuanto más concentrado esté un cultivo, menos volumen hay que procesar para recoger la misma cantidad de biomasa) y la composición bioquímica de la biomasa generada, destacando según estos criterios Chlorella vulgaris , Chlorella sp. y Scenedesmus vacuolatus . Para la selección final entre estas tres especies se consideró de interés conocer su capacidad de autofloculación, para aplicar la economía en el proceso de cosechado como criterio selectivo. Las especies del género Chlorella debido a su pequeño tamaño no autofloculaban bien. Sin embargo, Scenedesmus vacuolatus , de mayor tamaño, sedimentaban rápidamente por lo que el cosechado de su biomasa resultaría más económico (Figura 20). Por tanto la selección definitiva de Scenedesmus vacuolatus se tomó basándose en las siguientes características: • Alta capacidad de fijación de CO2 • Alta densidad celular en cultivos continuos • Facilidad de cosechado • Generación de biomasa con prometedor valor añadido por su destacable contenido en lípidos y carbohidratos Rafael García Cubero 78 EL CASO DE Scenedesmus vacuolatus Previamente a operar los cultivos de cualquier microalga a la intemperie, se requiere una caracterización del comportamiento de la estirpe en condiciones controladas de laboratorio, con análisis de la influencia de parámetros críticos y la consecuente optimización de condiciones para el cultivo. A estos efectos, se desarrollaron cultivos de S. vacuolatus en fotoquimiostatos de tipo columna de burbujeo operados en régimen continuo e iluminados simulando un ciclo solar. De esta manera se establecieron las condiciones óptimas en las se maximizaba la fijación fotosintética de CO2, estableciéndose asimismo la tolerancia de los cultivos respecto del pH y la temperatura. La asignación de los valores óptimos para cada variable se llevó a cabo de manera secuencial. Una vez determinada la influencia de un parámetro sobre el rendimiento del cultivo, se seleccionó el valor con el que se obtenía mayor Figura 20. Decantación de cultivos densos (1 g l - 1 ) de S.vacuolatus (A) y C.vulgaris (B) durante 24h Resultados 79 productividad de biomasa, fijándose de dicho parámetro en las experiencias posteriores. Las variables analizadas fueron pH, temperatura y velocidad de dilución, estudiándose también el efecto combinado de temperatura/irradiancia. Los resultados obtenidos permitieron establecer un modelo del comportamiento de productividad y tasa de fijación de CO2 de los cultivos respecto a importantes factores, tales como irradiancia disponible y temperatura. Por último, y para completar la valoración del potencial de Scenedesmus vacuolatus para su empleo en procesos de tratamiento de emisiones gaseosas industriales, se ha analizado la viabilidad de su cultivo en presencia de mezclas gaseosas de composición análoga a la corriente de gases de chimenea de una central térmica. Efecto del pH La primera variable analizada fue el pH, estudiando cómo la variación del mismo afecta la productividad de biomasa y tasa de fijación de CO2. El intervalo de valores de pH estudiado fue entre 6 y 9. Resulta patente que S. vacuolatus es una microalga con amplia tolerancia a cambios de pH, siendo viable su cultivo en todo el intervalo ensayado (Figura 21). El mayor rendimiento se obtuvo a pH 7,5 con una productividad de biomasa de 0,55 g l-1 d-1, asimilando 1,1 g CO2 l-1 d-1. A pH 6, el valor más bajo ensayado, el rendimiento del cultivo solo descendió alrededor del 20%, siendo el valor de la productividad de biomasa 0,44 g l-1 d-1 y 0,9 g l-1 d-1 el de la fijación fotosintética de CO2. Al ensayar condiciones de cultivo más alcalinas, tampoco se registraba un descenso dramático ni en la productividad de biomasa ni en la fijación de CO2. A pH 8, 8,5 y 9, los cultivos de S.vacuolatus presentaron productividades superiores a 0,4 g l-1 d-1, con una asimilación de CO2 de 0,9 g l-1d-1. Por consiguiente, el comportamiento de esta microalga fue bastante estable dentro del margen de pH ensayado, manteniendo entre 75 y 80% de la productividad máxima. El análisis de varianza (Anova factorial) indicaba una influencia estadísticamente significativa del pH sobre la productividad de biomasa de los cultivos de S.vacuolatus , con un máximo a pH 7,5. Por tanto, para las siguientes experiencias, se operó a este valor de pH. Rafael García Cubero 80 Efecto de la temperatura Una vez establecido el pH óptimo, se llevó a cabo el estudio del efecto de la temperatura, analizando el comportamiento de S. vacuolatus en cultivo continuo a seis valores distintos para esta variable. Los resultados se presentan en la Figura 22. La temperatura óptima, tanto para la productividad de biomasa como para la fijación de CO2, fue 30ºC. Para los demás valores en los que fue viable el cultivo, es decir, 25 y 35ºC, la productividad en biomasa sufrió un descenso del orden del 10% (de 0,6 g l-1 d-1 a temperatura óptima, disminuyó a 0,54 y 0,56 g l-1 d-1 a 25 y 35ºC, respectivamente). Sin embargo, el rendimiento del cultivo se vio afectado claramente a temperaturas más extremas. Así, a la temperatura más alta ensayada (40ºC), el cultivo no alcanzó el estado estacionario, lavándose tras varios días de operación. A baja temperatura (15ºC), la productividad descendió hasta un 60% con respecto a la presentada a 30ºC. El análisis de la varianza (Anova factorial), indica la existencia de una influencia estadísticamente significativa de la temperatura en el comportamiento del cultivo. pH 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 Productividad de biomasa (g l-1 d-1) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Tasa de fijación de CO2 ( g l-1 d-1) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Figura 21. Efecto del pH sobre la productividad de biomasa y la tasa de fijación de CO2 de S. vacuolatus en cultivo continuo. Condiciones de cultivo: D: 0,4 d-1, temperatura: 25ºC, Imax: 3000µE m-2 s-1 , 20mM NO 3 - Resultados 81 En base a estos resultados, se fijó como temperatura óptima 30ºC. Efecto de la velocidad de dilución La tasa de renovación del medio es una de las variables más influyentes en el comportamiento de los cultivos en régimen continuo, por lo que es importante realizar un estudio detallado que comprenda un intervalo amplio de velocidades de dilución. Así, se ensayaron cinco velocidades, entre 0,15 y 0,8 d-1 (Figura 23). Los resultados indicaban que para una velocidad de dilución de 0,6 d-1 se obtenían las máximas tasas de fijación de CO2 y de productividad de biomasa. Las diferencias en cuanto a este último parámetro, no eran estadísticamente significativas cuando el cultivo se operaba a velocidades de dilución de 0,4 y 0,5 d-1. Por debajo de 0,4 d-1 se reducía hasta un 30% el rendimiento del cultivo (de 0,7 a 0,4 g l-1 d-1). El análisis de la varianza (Anova factorial) acreditó la relevancia de esta variable sobre el comportamiento del cultivo. Temperatura (ºC) 15 20 25 30 35 40 Productividad de biomasa ( g l -1 d -1 ) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Tasa de fijación de CO 2 (g l -1 d -1 ) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Figura 22. Efecto de la temperatura sobre la productividad de biomasa y tasa de fijación de CO2 de S.vacuolatus en cultivo continuo. Condiciones de cultivo: D: 0,4 d-1, pH: 7,5, Imax: 3000 µE m-2 s-1 , 20mM NO 3 - Rafael García Cubero 82 Análisis del efecto conjunto de temperatura e irradiancia La disponibilidad de luz y la temperatura son dos factores interrelacionados que afectan marcadamente al crecimiento y rendimiento de los cultivos al exterior. Por ello, es importante realizar un estudio detallado de cómo estos dos factores influyen en el comportamiento de los cultivos de S.vacuolatus . A este fin, se han evaluado los efectos para distintas combinaciones de valores de ambas variables, que pudieran ser representativas de la situación en las distintas estaciones del año en Sevilla. Estos estudios se llevaron a cabo a una velocidad de dilución de 0,6 d-1 y a pH 7,5. Los valores de irradiancia incidente máxima analizados fueron 1000, 2000 y 3000 µE m-2 s-1 y las temperaturas 15, 25, 30 y 35ºC. La Figura 24 ilustra la respuesta de la productividad de biomasa, que es análoga a la observada para la tasa de fijación de CO2, aunque los resultados para este último parámetro no se muestran. Como consideración de carácter general, cabe apuntar que la temperatura óptima fue la misma (30 ºC) para los tres valores ensayados de irradiancia máxima, y Velocidad de dilución ( d -1 ) 0,15 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 Productividad de biomasa (g l -1 d -1 ) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Tasa de fijación de CO 2 (g l -1 d -1 ) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Figura 23. Efecto de la velocidad de dilución sobre la productividad de biomasa y tasa de fijación de CO2 de S.vacuolatus en cultivo continuo. Condiciones de cultivo: Temperatura: 30ºC, pH: 7,5, Imax : 3000 µE m-2 s-1, 20mM NO3 - Resultados 83 que la productividad de los cultivos respondía positivamente al aumento del valor de irradiancia para todas las temperaturas ensayadas. Para condiciones de baja irradiancia (1000 µE m-2s-1) y baja temperatura (15ºC), Scenedesmus vacuolatus fue incapaz de mantenerse en cultivo continuo a la velocidad de dilución establecida; no se alcanzó el estado estacionario y se lavó a los pocos días de operación. Al mismo valor de irradiancia, pero a una temperatura más favorable (25ºC), el cultivo era viable, aunque con solo la mitad de la productividad de la registrada para la temperatura óptima, 30ºC. A 35ºC la productividad del cultivo se vio muy afectada, rindiendo prácticamente unos 0,15 g l-1 d-1. A irradiancia media (2000 µE m-2·s-1), el comportamiento fue similar al registrado a baja irradiancia. A 15º C, la velocidad de crecimiento de S.vacuolatus , fue incapaz de igualarse a la velocidad de dilución impuesta, por lo que el cultivo se lavó. A 30º C alcanzó el máximo de productividad, 0,52 g l-1 d-1, un 20% mayor que la presentada a 25ºC para la misma irradiancia. A 35ºC la productividad de biomasa solo alcanzaba un 45% (0,29 g l-1 d-1) del valor óptimo a 30ºC. Temperatura (ºC) 15 20 25 30 35 Productividad de biomasa (g l-1 d-1) 0,2 0,4 0,6 1000 µE m-2 s-1 2000 µE m-2 s-1 3000 µE m-2 s-1 Figura 24. Efecto conjunto de temperatura e irradiancia incidente máxima sobre la productividad de biomasa de S.vacuolatus en cultivo continuo . Las experiencias se realizaron a una velocidad de dilución de 0,6 d-1, pH 7,5, y 20mM NO3 - Rafael García Cubero 84 A 3000 µE m-2 s-1 pudo conseguirse el estado estacionario para cultivos continuos de S.vacuolatus a 15ºC, superándose los 0,2 g l-1 d-1. La productividad a 25 y 35ºC (0,55 y 0,53 g l-1 d-1, respectivamente) fue un 90% de la máxima. A 30 ºC y 3000 µE m-2 s-1 de irradiancia incidente, los cultivos de S.vacuolatus rindieron hasta 0,6 g l-1 d-1, siendo éstas las condiciones óptimas para el crecimiento y fijación de CO2 de los cultivos en régimen continuo. El análisis de la varianza refrendó la importancia de la irradiancia y la temperatura sobre el comportamiento de los cultivos de S.vacuolatus , resaltando la irradiancia como variable más significativa. Modelo de crecimiento y de fijación de CO2 Un completo análisis estadístico (ANOVA multifactorial) de la influencia de cada variable estudiada sobre la velocidad de crecimiento pone de manifiesto que el crecimiento en régimen continuo de Scenedesmus vacuolatus se encuentra fuertemente influenciado por la irradiancia promedio (Iav) y por la temperatura. Es por ello necesario definir un modelo de crecimiento (o función matemática) que tenga como base estas variables. Definición de un modelo de crecimiento en función de la velocidad de dilución e irradiancia La primera variable a considerar es la irradiancia promedio, por ser la variable con mayor influencia y significación sobre el crecimiento de S.vacuolatus . Iav se define como la irradiancia que recibe una célula media del cultivo, y se relaciona directamente con la irradiancia incidente (Io) e inversamente con el paso de luz del cultivo (p), la densidad celular del mismo (Cb) y el coeficiente de extinción de la biomasa (Ka), según la Ecuación 7: Por lo tanto, un incremento en la irradiancia incidente sobre la superficie del reactor no implica un aumento de la irradiancia promedio que recibe cada célula. Si la densidad del cultivo aumenta, se darán fenómenos de sombreado entre las células, disminuyendo Iav. Para determinar la irradiancia media que recibe cada célula en cada condición ensayada, es necesario determinar experimentalmente el valor de Ka (m2 g-1) ya que el resto de variables que conforman la ecuación de la Iav están determinadas Ecuación 7 Resultados 85 Ecuación 9 (p= 7cm; Io y Cb fueron medidas experimentales propias de cada condición ensayada). El valor de Ka se establece de acuerdo con la Ecuación 8: donde la absorbancia media se calcula a partir del espectro de absorción (Figura 25) de una suspensión celular con una concentración de biomasa determinada (Cb, g m-3), siendo l (m) el camino óptico que recorre la luz (cubeta de 0,01m). Para el caso de S. vacuolatus , el valor de la Ka fue 0,17 m2 g -1. Una vez determinada la Ka, se puede calcular la Iav de cada condición de acuerdo a la Ecuación 7. Por tratarse de un microorganismo, el modelo a aplicar inicialmente es el de crecimiento bacteriano de Monod (1949). Este modelo asume que, en un cultivo limitado por un nutriente, la tasa o velocidad de crecimiento (µ) y la concentración del sustrato limitante (S) están relacionadas según la expresión matemática: λ (nm) 400 500 600 700 Absorbancia 0,1 0,2 0,3 0,4 Figura 25. Espectro de absorción de Scenedesmus vacuolatus Ecuación 8 Rafael García Cubero 92 A) B) Figura 31. Aspecto de un cultivo de S.vacuolatus en condiciones óptimas de operación (A) y usando gases de escape con CO 2 al 12% (B) como fuente de C cultivo una corriente de aire enriquecido con la mezcla gaseosa a diferentes proporciones para asegurar un suministro de CO2 al 12 (sin diluir con aire) ,6 ,3 y 1%. Sólo cuando la mezcla se diluyó con aire doce veces (CO2 al 1%), el medio no se acidificaba exageradamente (pH estabilizado entre 7 y 8) y los cultivos de S. vacuolatus eran viables. Para diluciones menores de la mezcla gaseosa básica (CO2 al 3, 6 ó 12%), el cultivo se acidificó, con valores de pH por debajo de 5, afectándose severamente el desarrollo de las células e imposibilitando su cultivo (Figura 31). La comparación con un reactor operado en las mismas condiciones pero burbujeado de forma continua con una corriente de aire suplementado con CO2 puro al 1%, mostró una productividad análoga a la del cultivo burbujeado con la mezcla gaseosa básica diluida 12 veces, que contenía igualmente un 1% de CO2 (Tabla 10). Así mismo, la composición bioquímica de la biomasa generada no presentó diferencias significativas, con un contenido en proteínas del 40%, así como niveles del orden del 20% tanto de lípidos como de carbohidratos (Figura 32). Resultados 93 Por otra parte, cuando el CO2 (puro o combinado con otros gases de combustión) se suministró a demanda para mantener el pH del medio a 7,5, los valores de productividad, tasa de fijación y composición de la biomasa de cultivos de S.vacuolatus fueron similares independientemente de la fuente de CO2 (Tabla 11, Figura 33). Productividad de biomasa (g l-1 d-1)Tasa fijación de CO2 (g l-1 d-1) CO 2 puro 0,64 ± 0,2 1,17 ± 0,3 Gas combustión 0,67 ± 0,1 1,22 ± 0,2 Tabla 10. Productividad de cultivos continuos de S.vacuolatus burbujeados continuamente con aire enriquecido con CO2 puro o combinado con otros gases de combustión % Biomasa 0 10 20 30 40 50 Proteínas Lípidos Carbohidratos 1% CO2 puro 1% CO2 gases de combustión Figura 32. Composición bioquímica de cultivos en régimen continuo de S.vacuolatus burbujeados continuamente con aire enriquecido con CO 2 puro o combinado con otros gases de combustión Rafael García Cubero 94 Productividad de biomasa (g l-1 d-1)Tasa fijación de CO2 (g l-1 d-1) CO 2 puro 0,63 ± 0,1 1,15 ± 0,2 Gas combustión 0,64 ± 0,1 1,17 ± 0,1 Tabla 11. Productividad de cultivos burbujeados con aire enriquecido con CO2 puro o combinado con otros gases de combustión a demanda % Biomasa 0 10 20 30 40 50 Proteínas Lípidos Carbohidratos CO2 puro CO2 gases de combustión Figura 33. Composición bioquímica de cultivos en régimen continuo de S.vacuolatus burbujeados con aire enriquecido con CO 2 puro o combinado con otros gases de combustión a demanda Resultados 95 CULTIVO DE Scenedesmus vacuolatus AL EXTERIOR Empleando las condiciones óptimas para el cultivo de S.vacuolatus establecidas en laboratorio, se estimó la eficiencia de captación de CO 2 en cultivos a la intemperie empleando diferentes diseños de reactor. Los sistemas usados fueron: estanques abiertos agitados por paletas, con una relación volumen/superficie de 100 l m -2 y reactores planos verticales (RPV) de 115 l m -2 . El objetivo inicial era desarrollar el estudio comparativo a lo largo de un ciclo anual completo. Sin embargo, problemas de contaminación limitaron de forma importante estos ensayos. Cultivo en estanque abierto Los cultivos se operaron en modo semicontinuo, con inyección de CO 2 a demanda para el control de pH (punto de consigna 7,5) y sin control de temperatura. En las Tabla 12 y 13 se muestra las variables de operación y los resultados de productividad en aquellas experiencias que no tuvieron problemas de contaminación. La frecuencia de dilución generalmente viene determinada por el crecimiento del cultivo, y éste, a su vez, por la irradiancia incidente. Los ciclos de dilución fueron de 2-3 días tanto en verano como en otoño. Así, en verano, con valores elevados de irradiancia incidente, la densidad celular mínima era de 0,3 g l -1 , rindiendo 0,05 g l -1 d -1 . Tiempo (días) 0 2 4 6 8 10 12 14 Biomasa ( g l -1 ) 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Tiempo (días) 0 2 4 6 8 10 Biomasa (g l -1 ) 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Figura 34. Evolución de los cultivos semicontinuos en estanque abierto de S.vacuolatus representativo de experiencias viables en diferentes estaciones VERANO OTOÑO Estación Densidad celular mínima ( g l -1 ) Frecuencia diluciones (días) Irradiancia media incidente (MJ m -2 d -1 ) Temperatura media (ºC) Verano 0,3 2-3 21,3±1 25,3±5 Otoño 0,2 2-3 10,3±1 19,4±4 Tabla 12. Variables de operación de cultivo semicontinuo en estanque abierto de S.vacuolatus Rafael García Cubero 96 En otoño, con un valor menor de irradiancia, los reactores se operaron a 0,2 g l - 1 , rindiendo 0,04 g l -1 d -1 . En la Figura 34 observamos el progreso de los cultivos semicontinuos en estos reactores, que se mantenían durante periodos superiores a una semana. Cultivo en reactor plano vertical (RPV) Los cultivos de S.vacuolatus en este tipo de reactor, al igual que en estanques abiertos, presentaron problemas de contaminación. En la Tabla 14 se muestra las variables de operación de los cultivos semicontinuos en RPV. Los valores de productividad de biomasa y fijación de carbono (0,13 y 0,24 g l -1 d -1 , respectivamente) determinados en Primavera eran similares a los encontrados en Otoño (Tabla 15). El diseño de reactor plano vertical, permite un buen aprovechamiento de la luz, con valores de eficiencia fotosintética entre 1,5 (primavera) y 2,5% (otoño). En la Figura 35, se muestra la evolución de los cultivos semicontínuos en RPV en primavera y otoño, así como, la composición bioquímica de la biomasa generada, que es análoga, independientemente de la época del año en que se opera el cultivo. (g l -1 d -1 ) (g m -2 d -1 ) (g l -1 d -1 ) Verano 0,05±0,03 5±3 0,09±0,05 Otoño 0,04±0,03 4±3 0,07±0,05 (g m -2 d -1 ) 9±5 7±5 Estación Productividad de biomasa Tasa de fijación de CO 2 Tabla 13. Productividad de biomasa y tasa de fijación de CO2 de cultivos de S.vacuolatus en estanque abierto (g l-1d-1) (g m-2 d-1) (g l-1 d-1) Primavera 0,13±0,04 15±4,6 0,24±0,07 Otoño 0,13±0,06 15±7 0,24±0,11 (g m-2d-1) 27,7±8,4 27,7±12,8 Estación Productividad de biomasa Tasa de fijación de CO2 Tabla 15. Productividad de biomasa y tasa de fijación de CO 2 en cultivos de S.vacuolatus en RPV Tabla 14. Variables de operación de cultivos semicontinuos en RPV de S.vacuolatus Estación Densidad celular mínima ( g l -1 ) Frecuencia diluciones (días) Irradiancia media incidente (MJ m -2 d -1 ) Temperatura media (ºC) Primavera 0,5 2-3 18,6±3 29,1±3 Otoño 0,6 2-3 11,9±3 31,6±1 Resultados 97 Contaminaciones presentes en los cultivos al exterior de S.vacuolatus Los problemas de contaminación por otros microrganismos que presentaron los cultivos de S. vacuolatus fueron episodios independientes del tipo de reactor que se operó o de cualquier otro tipo de parámetros físico-químicos que afectase al cultivo. A parte de bacterias, organismos que difícilmente pueden ser eliminados en un cultivo a la intemperie, las infecciones más recurrentes fueron por hongos (Phylium Chytridiomycota ) y ciliados como Vorticella sp y Paramecium sp . (Figura 36). Figura 35. Evolución de la concentración de biomasa de los cultivos de S.vacuolatus en RPV. Composición bioquímica de la biomasa generada Rafael García Cubero 98 Figura 36. Aspecto de cultivos de S.vacuolatus contaminados. A) Célula no parasitada (x100), B) Célula infectada por quitridio (x100), C) Aspecto de un cultivo contaminado por quitridios (x100), D) Vorticella sp (x25), E) Paramecium sp (x63). Todas las fotos tomadas al MO. Resultados 99 EL CASO DE Chlorella vulgaris Comprobada la dificultad de mantener cultivos a la intemperie, estables en el tiempo, de Scenedesmus vacuolatus se descartó la opción de esta especie como sistema efectivo para retirar CO 2 procedente de emisiones. De acuerdo con la información obtenida en el proceso de selección, Chlorella vulgaris , también presentaba alta productividad de biomasa, elevada capacidad de fijación fotosintética de CO 2 y una composición bioquímica interesante, aunque se seleccionara a Scenedesmus vacuolatus fundamentalmente por su mayor facilidad para sedimentar, con su consecuente ventaja para el cosechado. Se reconsideró por tanto la idoneidad de C. vulgaris para el objetivo propuesto en este trabajo, determinando el efecto de diversos parámetros sobre la productividad de sus cultivos continuos (pH, temperatura, velocidad de dilución, irradiancia incidente y concentración de nitrato (como fuente de N combinado) en el medio de cultivo), estableciendo las condiciones óptimas para el crecimiento y fijación de CO 2 . Adicionalmente, debido a su perfil bioquímico, se evaluó la idoneidad de esta microalga en relación a su aprovechamiento para la producción de un compuesto de interés energético como es el almidón. En base a estos resultados se propone un modelo de crecimiento para C. vulgaris y otro para la producción de almidón. Se analizó su comportamiento cuando se aireaba con una mezcla gaseosa que simulaba las emisiones de una central térmica. Por último, se verificó la viabilidad del cultivo a la intemperie de esta microalga. Efecto del pH Bajo las condiciones de operación descritas en la Figura 37, se analizó la productividad y tasa de fijación de CO 2 en el intervalo de pH estudiado que abarca valores entre 6,5 y 9. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que C.vulgaris es una estirpe con amplia tolerancia al pH, sin que el rendimiento de sus cultivos se viese afectado en un intervalo de pH entre 6,5 y 8. Sin embargo, a pH 8,5, la productividad decaía un 20%, disminuyendo a pH 9 hasta 65% con respecto al máximo. El análisis de la varianza indica que el pH es una variable estadísticamente significativa en la productividad de biomasa. Así mismo, el análisis estadístico aplicado (test de Tukey) revela la existencia de dos grupos con diferencias estadísticamente significativas, uno para valores de pH comprendidos entre 6,5 y 8 y otro correspondientes al intervalo entre 8,5 y 9. Se seleccionó 7,5 como valor óptimo de pH para el cultivo de C.vulgaris , valor intermedio Rafael García Cubero 100 dentro del intervalo donde esta microalga presentaba sus valores máximos de productividad y fijación fotosintética de CO 2 . A pH 7,5, 25ºC y una velocidad de dilución de 0,4d -1 , el cultivo alcanzaba elevadas densidades celulares de 1,5±0,1 g de biomasa l -1 , poseyendo la biomasa un elevado contenido energético de 20 kJ g -1 . En cuanto a la composición bioquímica de la biomasa generada, el contenido de proteínas era máximo a pH 7,5 (próximo al 50%), descendiendo a pH más ácidos y alcalinos, pero sin ser nunca inferior al 40% de la biomasa. El contenido en lípidos no se modificó con el pH, oscilando entre un 20 y 25% de la biomasa generada. A pH más extremos, dentro del intervalo analizado, el contenido en carbohidratos, era mayor (23%) que a pH 7,5-8 (18%). Un patrón similar se observó para el contenido en almidón, que era notablemente superior para los valores más bajos y más elevados de pH, representando el almidón a pH 8,5 o 9 hasta un 66% de los carbohidratos totales. La productividad en almidón de los cultivos de C.vulgaris registraba su máximo (60 mg l -1 d -1 ) a pH 8,5 (Figura 38). pH 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 Productividad de biomasa (gl -1 d -1 ) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Tasa de fijación de CO 2 (g l -1 d -1 ) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Figura 37. Efecto del pH sobre la productividad de biomasa y tasa de fijación de CO2 de cultivos de C.vulgaris en régimen continuo. Condiciones de cultivo: D 0,4 d-1, Temperatura 25ºC, Imax 3000 µE m-2 s-1, 20mM NO3 - Resultados 101 Efecto de la temperatura Se ha evaluado la respuesta de los cultivos de C.vulgaris en régimen continuo a la temperatura, dentro de un intervalo amplio de valores, desde 15 a 35ºC. Los cultivos presentaron una amplia tolerancia a este factor, mostrando los valores más altos para productividad de biomasa y fijación fotosintética de carbono entre 15 y 25ºC. A 20 y 25ºC, el rendimiento del cultivo fue ligeramente superior a los 0,5 g l -1 d -1 , asimilando casi 1 g CO 2 l -1 d -1 . A 30ºC, disminuían la productividad de biomasa y la fijación de carbono un 50% con respecto al máximo obtenido a 20 y 25ºC. A 35ºC los cultivos en régimen continuo eran inviables (Figura 39). Una vez alcanzados los distintos estados estacionarios, se evalúo la composición bioquímica y el calor de combustión de la biomasa, determinándose la densidad celular y el contenido en C y N. A 20 y 25ºC, la concentración de biomasa una vez alcanzado el estado estacionario era cercana a 1,3 g l -1 , disminuyendo un 40% (0,77 g l -1 ) a 30ºC. El calor de combustión de la biomasa generada se mantuvo en 20 kJ g -1 . 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 % Biomasa 20 40 60 Productividad de almidón (mg l -1 d -1 ) 20 40 60 Proteínas Lípidos Carbohidratos Almidón Productividad de almidón pH Figura 38. Composición bioquímica y productividad de almidón de cultivos de C.vulgaris en régimen continuo a diferentes valores de pH. Condiciones de cultivo como las descritas en la Figura 37 Rafael García Cubero 108 Temperatura (ºC) 15 20 30 % Biomasa 20 40 60 Productividad de almidón (mg l -1 d -1 ) 5 10 15 20 25 Proteínas Lípidos Carbohidratos Almidón Productividad de almidón Temperatura (ºC) 15 20 30 % Biomasa 20 40 60 Productividad de almidón (mg l-1 d-1) 10 20 30 Proteínas Lípidos Carbohidratos Almidón Productividad de almidón A) B) Figura 45. Composición bioquímica y productividad de almidón de cultivos de C.vulgaris en régimen continuo a diferentes temperaturas para valores de irradiancia máxima incidente de 1000 (A) y 2000 (B) µE m-2 s-1 a diferentes temperaturas. Las condiciones de cultivo como las descritas en Figura 43. Resultados 109 Efecto de la disponibilidad de NO3sobre el cultivo continuo de Chlorella vulgaris Una vez completada la caracterización de las variables que influyen en el crecimiento de C.vulgaris en fotoquimiostato y establecidas las condiciones óptimas para el cultivo en régimen continuo, se ha procedido a valorar el efecto del aporte de una fuente de nitrógeno combinado sobre el crecimiento de esta microalga. Los cultivos se operaron a las condiciones óptimas establecidas: pH, 7,5; temperatura, 20ºC; velocidad de dilución, 0,5 d -1 ; irradiancia máxima incidente 3000 µE m -2 s -1 . Los valores de concentración para el nitrato presente en el medio fresco de aporte eran: 1, 5,10 y 20 mM. La concentración de biomasa en el estado estacionario en los cultivos con 1, 5 y 10 mM de nitrato fue marcadamente inferior a la de aquellos con 20mM de NaNO 3 . En los cultivos en que la concentración de nitrato era menor de 20 mM, el contenido en N de la correspondiente biomasa era inferior al 10%, lo que se traducía en valores de la razón C/N superiores a 5, más elevados cuanto menor era la concentración de nitrato en el medio fresco (Tabla 16). No obstante, el calor de combustión de la biomasa era análogo en todos los casos y próximo a 20 kJ g -1 . Tomando como valor de referencia el obtenido para el caso de medios con 20 mM de nitrato, los cultivos de C. vulgaris con bajo aporte de nitrato vieron comprometida su productividad. Así, a 1mM ésta era un 80% inferior que a 20 mM, mientras que a 5 y 10 mM se alcanzaba una productividad del orden del 40% de la de referencia (Figura 46). En cuanto a la tasa de fijación de CO 2 , los cultivos a 20 mM de nitrato asimilaban un 40% más de carbono que los cultivos a 5 y 10 mM y un 80% más que los cultivos con un aporte de nitrato de 1 mM. NaNO3 (mM) Biomasa (g l-1) C/N 1 0,3±0,0 8,27 5 0,8±0,1 6,78 10 0,8±0,2 5,55 20 1,4±0,1 4,96 Tabla 16. Biomasa acumulada y razón C/N en estado estacionario en cultivo continuo de C.vulgaris a diferentes concentraciones de nitrato aportado en el medio. Condiciones de cultivo: pH 7,5, temperatura 20ºC, D 0,5 d-1, Imax 3000 µE m-2 s-1 Rafael García Cubero 110 El análisis de la varianza permitió establecer que el aporte de nitrato tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la productividad de biomasa. Así mismo, la respuesta de los cultivos al aporte de nitrato mostraba tres grupos diferentes estadísticamente 1mM, 5 y 10 mM, y 20mM de NaNO 3 . La composición de la biomasa generada se afectaba por el nivel de aporte de nitrato en el medio (Figura 47). El contenido en proteínas se hacía mayor conforme lo hacía la concentración de nitrógeno combinado. Así, a 1mM conformaban apenas el 20% de la biomasa generada, mientras que a 5mM, aumentaba al doble (40%). A concentraciones de nitrato superiores a 10mM, el contenido en proteínas alcanzó al igual que a 20mM, el 50% del total. La acumulación de lípidos estuvo más favorecida a bajo nitrato, suponiendo a 1mM, más del 40% de la biomasa. A mayor concentración de nitrato, el contenido lipídico era menor y se mantenía constante, formando entre el 20 y 25% de la biomasa generada. El contenido en carbohidratos se incrementaba a bajo aporte de nitrato, mostrando valores más bajos a altas concentraciones del mismo. El almidón, siguió la misma pauta, acumulando hasta un 20% del mismo a 1mM de NaNO 3 . La productividad del mismo era máxima cuando el cultivo se operaba a 5mM de nitrato, rindiendo valores superiores a 50 mg l -1 d -1 . NaNO3 (mM) 1 5 10 20 Productividad de biomasa (g l-1d-1) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Tasa de fijación de CO2 (g l-1d-1) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Figura 46. Productividad y tasa de fijación de CO2 de cultivos de C.vulgaris en régimen continuo a diferentes concentraciones de NaNO3. Condiciones de cultivo: pH 7,5, temperatura 20ºC, D 0,4 d-1, I max 3000 µE m-2 s-1 Resultados 111 Evolución de la acumulación de almidón a lo largo del periodo luminoso En el curso de las experiencias descritas en el apartado anterior, se analizó en paralelo la evolución de los niveles de almidón a lo largo del periodo luminoso. A este fin, se tomaron muestras de biomasa antes del inicio del periodo luminoso y en distintos estadios del ciclo de luz, a los que correspondían distintos valores de irradiancia luminosa incidente analizando su contenido en almidón (Figura 48). Al final del periodo de oscuridad, el contenido en almidón de la biomasa era inferior al 3%. El nivel de celular de almidón aumentaba por efecto de la exposición a la luz, si bien lo hacía en distinta magnitud, dependiendo de la concentración de nitrato en el medio de aporte. Así, cuando la concentración de nitrógeno presente en el medio fresco era elevada (10-20 mM), el contenido en almidón se cuadruplicaba tras 12 horas de luz, alcanzando su nivel cerca del 10% de la biomasa. Cuando la disponibilidad de N era de solo 1 mM, el nivel de almidón se multiplicaba por diez en el mismo tiempo, llegando a suponer hasta un 30% de la biomasa al final del ciclo de iluminación. En el caso de 5 mM de NaNO 3 , el comportamiento era intermedio entre las dos situaciones descritas, con niveles de almidón de alrededor del 20% del peso seco tras 12 h de iluminación. NaNO 3 (mM) 1 5 10 20 % Biomasa 20 40 60 Productividad de almidón (mg l -1 d -1 ) 20 40 60 Proteínas Lípidos Carbohidratos Almidón Productividad de almidón Figura 47. Composición bioquímica y productividad de almidón de cultivos de C.vulgaris en régimen continuo para diferentes concentraciones de nitrato en el medio de aporte . Condiciones de cultivo como las descritas en la Figura 46 Rafael García Cubero 112 Maximización de la productividad de almidón y evolución diaria de su nivel celular El análisis de la productividad de almidón en las distintas condiciones de cultivo ensayadas permitió derivar una combinación de valores de las variables determinantes, potencialmente óptima, que permitiría obtener el máximo rendimiento de almidón por cultivo de C. vulgaris operando en régimen continuo. En dichas condiciones se siguió la evolución del contenido de almidón a lo largo de un ciclo diario completo (Figura 49). A lo largo del ciclo, el contenido en almidón nunca fue inferior al 5% del peso seco, registrado al final del periodo en oscuridad (6h), mientras que en los periodos de máxima acumulación llegaba a superar el 20% de la biomasa, correspondiendo con el final del periodo de máxima irradiancia (18h). En estas condiciones optimizadas, la productividad de almidón era de 65mg l -1 d -1 . 6h 10h 12h 18h % Almidón 10 20 30 1mM NO 35mM NO 310mM NO 320mM NO 3Figura 48. Evolución de la acumulación de almidón durante el periodo luminoso de cultivos de C.vulgaris en régimen continuo. Condiciones de cultivo descritas en la Figura 46 Resultados 113 Modelo de crecimiento y fijación de CO2 de Chlorella vulgaris en cultivo continuo El tratamiento estadístico de los resultados procedentes de las experiencias realizadas con cultivos de C.vulgaris en régimen continuo, indicó que el crecimiento de la microalga en dichas condiciones estaba afectado por distintas variables, que ordenadas por grado de influencia eran: irradiancia promedio (I av ), temperatura, suministro específico de nitrato (SEN) y pH. Por tanto, se desarrolló un modelo atendiendo a la posible variación de estos parámetros. La estrategia fue la misma que la empleada para el caso de S.vacuolatus . Esto es, desarrollar un modelo que justifique las variaciones en la tasa de crecimiento según la variable más influyente (en este caso, irradiancia promedio) e ir completando y afinando secuencialmente este modelo considerando el resto de variables por orden de influencia. Es decir, el modelo propuesto para la I av , se complementó con la influencia de temperatura, de SEN, y por último de pH. Hay que decir que, conforme se acumulaba la influencia de los distintos factores a la función que determinaba el crecimiento de C.vulgaris , los parámetros de % Almidón 5 10 15 20 25 18h 18h 20h 22h 2h 6h 10h 14h Figura 49. Evolución de la concentración de almidón en la biomasa de C.vulgaris cultivada en régimen continuo. Condiciones de cultivo: pH 7,5, temperatura 25ºC, D 0,9d-1, Imax 3000 µE m-2 s-1 , y 5mM NO3 - Rafael García Cubero 114 ajuste de las diferentes funciones, se modificaban, tratando de ajustar el comportamiento de la microalga con el propuesto por el modelo. Definición de un modelo de crecimiento en función de la irradiancia promedio A partir del espectro de absorción de C.vulgaris (Figura 50), se determinó que el valor de K a era 0,6 m 2 g -1 . A partir de los valores de irradiancia promedio calculados para los estados estacionarios alcanzado en distintas condiciones, se estableció su correlación con los valores correspondientes de velocidad de crecimiento (Figura 51). El comportamiento observado se correspondía con el modelo definido por la Ecuación 10 (página 88) (Molina-Grima 1994). Ajustando los datos experimentales a dicha ecuación por regresión no lineal se obtuvieron los siguientes parámetros característicos (r 2 =0,93): • µ max =1 d -1 • n=2 • I k =30 µE m -2 s -1 λ (nm) 400 500 600 700 800 Absorbancia 0,26 0,28 0,30 0,32 0,34 0,36 Figura 50 Espectro de absorción de Chlorella vulgaris Resultados 115 El valor obtenido para la constante de semi-saturación para la irradiancia I k , (30 µE m -2 s -1 ) indica una notable avidez por la luz de C.vulgaris. Ajuste del modelo de crecimiento en función de la influencia de la temperatura Establecido un modelo de crecimiento para la variable más influyente en el crecimiento de C.vulgaris , era necesario complementarlo con el efecto de la siguiente variable más influyente, la temperatura, aplicando la ecuación de Arrhenius (Ecuación 11) de manera análoga al caso de S.vacuolatus (Ecuación 12, página 88) Los valores obtenidos mediante regresión no lineal fueron (r 2 =0,9): • µ max =1,4 d -1 • n=2 • I k =50 µE m -2 s -1 • A 1 =3·10 5 d -1 • Ea 1 =3·10 4 J mol -1 • A 2 =1·10 12 d -1 • Ea 2 =7·10 4 J mol -1 Irradiancia promedio (µE m -2 s -1 ) 0 100 200 300 400 Velocidad de crecimiento (d -1 ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Figura 51. Variación de la velocidad específica de crecimiento con la irradiancia promedio en cultivos continuos de Chlorella vulgaris Rafael García Cubero 116 Ajuste del modelo de crecimiento en función de la influencia de la disponibilidad de nitrato La siguiente variable que más influía en el comportamiento de los cultivos de C.vulgaris era la disponibilidad de nitrato, medida como SEN (Suministro específico de nitrato, mmol g -1 d -1 ), y determinada por la Ecuación 13: El efecto de SEN sobre el crecimiento de los cultivos de C.vulgaris se ajustaba a la Ecuación 14, en la que interviene una constante de semi-saturación para el suministro específico de nitrato, k sen : Así la función global que definía la velocidad de crecimiento era: Los valores obtenidos por regresión no lineal fueron (r 2 =0,96): • µ max =1,53 d -1 • n=1,49 • I k =35,5 µE m -2 s -1 • A 1 =3·10 5 d -1 • Ea 1 =3·10 4 J mol -1 • A 2 =1,29·10 12 d -1 • Ea 2 =6,9·10 4 J mol -1 • k sen =2 mmol g -1 d -1 Ecuación 13 Ecuación 14 Ecuación 15 Resultados 117 Ajuste del modelo de crecimiento en función de la influencia del pH El efecto del pH fue la última de las variables incorporada al modelo de crecimiento, representando una variable de menor influencia. De esta forma, el modelo final propuesto indicaba que el crecimiento de C.vulgaris obedece a la Ecuación: Cuyos parámetros más significativos tienen los siguientes valores: • µ max =1,2 d -1 • n=1,5 • I k =35,5 µE m -2 s -1 • A 1 =3,67·10 5 d -1 • Ea 1 =3,22·10 4 J mol -1 • A 2 =2,97·10 12 d -1 • Ea 2 =7,3·10 4 J mol -1 • k sen =2,15 mmol g -1 d -1 • A 3 =4,97 d -1 • Ea 3 =4,81 J mol -1 • A 4 =3,27·10 5 d -1 • Ea 2 =109,4 J mol -1 Los valores de µ predichos por el modelo presentaban un ajuste preciso (r 2 =0,95) con los datos obtenidos experimentalmente (Figura 52), lo que da buena idea de la bondad del modelo propuesto. Ecuación 16 Rafael García Cubero 124 analizó también la posibilidad de su empleo sin dilución alguna, pero inyectada a demanda para mantener el valor de pH preestablecido (7,5). Sólo resultaron viables los cultivos de C.vulgaris burbujeados con la mezcla de gases diluida doce veces (aporte de CO 2 al 1%) o bien sin diluir pero con inyección a demanda. Con la mezcla diluida con aire menos de doce veces, el medio de cultivo se acidificó en pocas horas, alcanzando valores de pH inferiores a 4 (Figura 58). La acidificación es probablemente debida a la formación de ácidos sulfúrico y nítrico tras disolverse los óxidos de N y S en el agua del medio. En la Tabla 16, se muestra el rendimiento de los cultivos viables. Existía una ligera diferencia en la productividad de los cultivos a favor de aquellos que se operaban con aporte de gas a demanda para el control de pH, frente a los cultivos burbujeados de manera constante con gas diluido doce veces con aire. A su vez, la productividad registrada con aporte de mezcla sintética de gases a demanda era un 30% inferior a la obtenida cuando la demanda se satisfacía con CO 2 puro (0,66 g l -1 d -1 ), siendo más bien análoga a la registrada utilizando un suministro continuo de aire suplementado con CO 2 al 1% (0,45 g l -1 d -1 ). Figura 58. Evolución del pH de los cultivos de C.vulgaris burbujeados con una composición de gases de combustión a diferentes diluciones y a demanda Resultados 125 La biomasa producida en estos cultivos poseía un alto contenido tanto en proteínas como en lípidos en ambas situaciones de aporte de gases de combustión con valores próximos al 40%. El contenido en carbohidratos apenas alcanzaba el 15% de la biomasa generada y el de almidón no superó el 3% del total (Figura 59), lo que representa una productividad de almidón del orden de 10 mg l -1 d -1 en ambas condiciones de cultivo. Proteínas Lípidos Carbohidratos Almidón % Biomasa 10 20 30 40 A demanda CO2 al 1% Figura 59. Composición bioquímica de la biomasa producida en cultivos continuos de C.vulgaris con aporte de CO2 mediante pulsos de gases de combustión o una corriente continua diluida doce veces con aire Productividad de biomasa (g l -1 d -1 )Tasa fijación de CO 2 (g l -1 d -1 ) A demanda 0,5 ± 0,0 0,9 ± 0,1 1/12 0,4 ± 0,0 0,7 ± 0,1 Tabla 17. Productividad de biomasa y tasa de fijación de carbono en cultivos de C.vulgaris con aporte de CO2 mediante pulsos de gases de combustión o una corriente continua diluida doce veces con aire Rafael García Cubero 126 Eficiencia en el aprovechamiento de CO2 Instalaciones Inabensa S.A. diseñó y montó un dispositivo que permitía medir en línea la demanda de CO 2 de los cultivo. Comparando el valor obtenido con el de carbono fijado en forma de biomasa se podría establecer la eficiencia del sistema para fijar CO 2 . Estas medidas de eficiencia en el aprovechamiento del CO 2 por parte de C.vulgaris se realizaron en todas las condiciones de cultivo planteadas. Sólo entre el 1 y 5% de todo el carbono que se aportaba al sistema quedaba incorporado a la biomasa. En la Figura 60 se presenta un ejemplo representativo de la demanda de CO 2 a lo largo del ciclo diario de un cultivo de C.vulgaris operado en condiciones óptimas. Figura 60 . Dem anda de CO 2 en un cultivo continuo de C.vulgaris operado en condiciones óptimas Resultados 127 CULTIVO DE Chlorella vulgaris AL EXTERIOR A fin de determinar el sistema más idóneo para el cultivo de Chlorella vulgaris a la intemperie, se analizó su productividad en régimen semicontinuo en los dos tipos de reactores ya descritos: estanque abierto y reactor plano vertical. El objetivo prioritario fue verificar la viabilidad de los sistemas, con determinación de valores para la tasa de fijación fotosintética de CO 2 , sin pretender derivar condiciones de cultivo que favoreciesen la productividad de almidón. Cultivo de Chlorella vulgaris en estanque abierto Se analizó el comportamiento a lo largo de un ciclo anual de cultivos de Chlorella vulgaris en estanques abiertos operados en régimen semicontinuo a pH 7,5 y sin control de temperatura. La frecuencia de dilución, así como la densidad celular inicial se fue modificando dependiendo de las condiciones climáticas (Tabla 18). Los cultivos en estanque abierto de C.vulgaris a una densidad celular mínima de 0,2 g·l -1 fueron viables a lo largo de todo el año (Tabla 19). En situaciones de baja irradiancia los ciclos de dilución fueron de 2-3 días. En condiciones más favorables, las diluciones fueron diarias (Figura 61). El contenido en proteínas de la biomasa generada era bastante constante a lo largo del año. Sin embargo, la relación lípidos/carbohidratos si se modificaba, siendo próxima a 2 en invierno y a 1 en otoño. La productividad de almidón se mantuvo constante a lo largo del periodo estudiado, no superando los 250mg almidón m -2 d -1 . (g l-1d-1) (g m-2 d-1) (g l-1 d-1) Invierno 0,05±0,02 5±2 0,09±0,04 Primavera 0,06±0,02 6±2 0,11±0,04 Verano 0,07±0,04 7±4 0,13±0,07 Otoño 0,03±0,02 3±2 0,06±0,04 13±7 6±4 (g m-2d-1) 9±4 6±2 Estación Productividad de biomasa Tasa de fijación de CO2 Tabla 19. Productividad de biomasa y tasa de fijación de CO2 en cultivos de C.vulgaris operados a densidad celular mínima de 0,2 g l-1 en estanque abierto Estación Frecuencia dilución (días) Irradiancia media incidente (MJ m -2 d -1 ) Temperatura media (ºC) Invierno 2-3 11,1±2 12,7±5 Primavera 2-3 16,1±3 16,9±4 Verano diarias 21,4±1 22,5±5 Otoño 2-3 5,9±2 15,5±2 Tabla 18 . Frecuencia de dilución, irradiancia media incidente y temperatura media en cultivos de C.vulgaris operados en estanque abierto a densidad celular mínima de 0,2 g l-1 Rafael García Cubero 128 Figura 61. Evolución de la concentración de biomasa y composición bioquímica en experiencias representativas de cada estación del año de cultivos de C.vulgaris en estanque operados a una densidad celular mínima de 0,2 g l-1 Resultados 129 Al elevar la densidad celular mínima de los cultivos a 0,3 g l -1 , los cultivos no fueron viables en invierno pero sí tuvieron la misma productividad y composición que los operados a 0,2 g·l -1 el resto del año. Así mismo, a densidades celulares iniciales más altas, 0,4 g l -1 , solo los cultivos operados en primavera y verano fueron viables, pero ni la productividad ni la composición bioquímica sufrieron modificaciones significativas con respecto a los cultivos operados a 0,2 g l -1 . Cultivo de Chlorella vulgaris en reactor plano vertical (RPV) Simultáneamente a las experiencias en estanque abierto, se realizó un análisis de la productividad en cultivos de C.vulgaris en reactor plano vertical (RPV), a lo largo de un ciclo anual. Debido a problemas técnicos en las instalaciones no se pudieron llevar a cabo experiencias representativas del comportamiento de esta microalga en RPV en otoño. La irradiancia incidente era especialmente limitante para la productividad de los cultivos de C.vulgaris en RPV. A baja irradiancia (invierno), la productividad de biomasa era menos de la mitad que la registrada en periodos de mayor irradiancia (primavera y verano). Con el fin de asegurar la viabilidad del cultivo fue necesario modificar la densidad celular mínima y la frecuencia de dilución en función de la irradiancia incidente. En condiciones en las que la irradiancia incidente era elevada, los cultivos se operaron con una densidad celular mínima de 0,8 g l -1 . A valores bajos de irradiancia, el valor de la densidad celular mínima se redujo a la mitad (Tabla 20). En condiciones de baja irradiancia (invierno) los cultivos presentaban una productividad de biomasa de 7 g m -2 d -1 . Esta productividad se incrementaba conforme la irradiancia se hacía mayor. Así, en verano, los cultivos de C.vulgaris tuvieron más del doble de productividad de biomasa (16 g m -2 d -1 ) que en invierno, fijando hasta hasta 30 g de CO 2 m -2 d -1 (Tabla 21). En la Figura 63 se recoge la evolución de la concentración de biomasa a lo largo de ciclos sucesivos de dilución de cultivos semicontinuos a la intemperie de C.vulgaris . El contenido de proteínas de la biomasa generada era constante a lo largo del año (cercano al 50%), al igual que el contenido en lípidos y carbohidratos (20 y 30%). La máxima productividad de almidón se daba en condiciones de alta irradiancia (verano), siendo aproximadamente 460mg almidón m -2 d -1 . Estación Densidad celular mínima ( g l -1 ) Frecuencia diluciones (días) Irradiancia media incidente (MJ m -2 d -1 ) Temperatura media (ºC) Invierno 0,4 2-3 10,5±2 19,8±3 Primavera 0,5 diarias 15,6±3 25,4±2 Verano 0,8 diarias 21±1 26,1±2 Tabla 20 . Densidad celular mínima, frecuencia de diluciones, irradiancia media incidente y temperatura media de cultivos semicontinuos de C.vulgaris en RPV Rafael García Cubero 130 (g l-1d-1) (g m-2 d-1) (g l-1 d-1) Invierno 0,06±0,05 7±6 0,11±0,09 Primavera 0,08±0,02 9,2±5 0,15±0,04 Verano 0,14±0,07 16,2±8 0,26±0,13 (g m-2d-1) 13±10 30±15 Estación Productividad de biomasa Tasa de fijación de CO2 17,3±5 Tabla 21. Productividad de biomasa y t asa de fijación de CO 2 en cultivos de C .vulgaris en RPV Figura 62. Evolución de la concentración de biomasa y composición bioquímica de la misma en experiencias representativas de cultivos de C.vulgaris operados en RPV a lo largo del año 131 DISCUSIÓN Discusión 133 Los principales criterios de preselección de estirpes para su aplicación a procesos de retirada de CO 2 fueron la capacidad relativa de generación de biomasa junto con el contenido en carbohidratos de la misma, si bien se prestó también atención a la tolerancia de los cultivos a condiciones de intemperie. Sobre estas bases se preseleccionaron las estirpes que figuran en la Tabla 1 (Materiales y Métodos). Esta selección preliminar se basó en una revisión exhaustiva de la bibliografía especializada, en combinación con la experiencia propia del grupo. Si bien existía una amplia información al respecto, ésta era altamente diversa y heterogénea. Los valores de productividad que se encontraban en la literatura correspondían en general a cultivos de laboratorio, algunos en régimen estanco, otros en semicontinuo o continuo, sometidos a distintos valores de irradiancia, con variedad de medios de cultivo y de condiciones de pH y temperatura. No parecía oportuno elegir alguna de las especies identificadas, como elemento central de un sistema de eliminación de CO 2 acoplado a la producción de carbohidratos, sin una verificación de su potencial. Resultaba por tanto esencial comparar el comportamiento de todas las estirpes en condiciones definidas e idénticas, para lo que se establecieron protocolos normalizados de experimentación, tanto para las condiciones de operación como de toma de muestras y de parámetros a valorar. De esta manera, se pudo obtener información contrastada sobre de la capacidad de generación de biomasa y de retirada de CO 2 para cada estirpe. Aproximación en cultivo estanco En una primera aproximación, se comparó el comportamiento de las distintas estirpes en régimen estanco de cultivo y bajo condiciones normalizadas. Los resultados obtenidos mostraron que Chlorella vulgaris y Spirulina sp. PCC6313 tenían la tasa de crecimiento más alta (0,8 d -1 ). Otras estirpes presentaban valores algo más bajos pero considerables, como Chlorococcum sp. , Scenedesmus vacuolatus o las del género Anabaena , con 0,7 d -1 . En cuanto a la capacidad de fijar CO 2 durante la fase exponencial, y con la excepción de Spirulina sp. PCC6313 , las microalgas presentaban valores superiores a las cianobacterias . Los resultados obtenidos se comparan, en general, favorablemente con los de la literatura. La mayor tasa de fijación correspondía a Chlorella vulgaris , con 1,2 g CO 2 l - 1 d -1 . Para algunas estirpes de Chlorella se han comunicado tasas de fijación de carbono de hasta 1,8 g CO 2 l -1 d -1 (Ho et al., 2011). Sin embargo, Hang (Han et al., 2012) encontraba para Chlorella vulgaris tasas similares a las obtenidas en este trabajo, aunque para Scenedesmus sp. eran casi el doble de las aquí determinadas para Rafael García Cubero 140 coeficiente de extinción de la biomasa es también muy superior, 0,6m 2 g -1 , indicando que la atenuación de la irradiancia en el seno del cultivo era muy fuerte. El ajuste entre los valores experimentales y los propuestos por el modelo aglutinando todas las variables es muy preciso. Los valores máximos que predice el modelo propuesto para productividad de biomasa y tasa de fijación de carbono para cultivos continuos de C. vulgaris eran ligeramente superiores a los de S. vacuolatus, aproximándose a los 0,7 g biomasa l -1 d -1 y debiendo superar los 1,2 g CO 2 l -1 d -1 y superiores a los descritos en la bibliografía para microalgas modelo para la eliminación de CO 2 (González López et al., 2009). Ciertas especies de microalgas tiene la capacidad de producir niveles altos de polímeros de reserva. C. vulgaris, particularmente, se ha considerado un organismo adecuado para su empleo en procesos de retirada de CO 2 asociados a la producción de lípidos (especialmente triacilgliceroles) y carbohidratos fermentables (Doucha et al 2005; Douskova et al 2009). Respecto a los carbohidratos generados fotosintéticamente, se les reconoce dos papeles esenciales, uno estructural como componentes de la pared celular, y otro como reservorio de carbono, en forma de almidón. Este compuesto, de movilización rápida, sirve para proporcionar energía metabólica de manera inmediata a los procesos que la requieren, fundamentalmente en condiciones de oscuridad. La acumulación de lípidos como reservorio de carbono se corresponde más con una situación de estrés más dilatado en el tiempo (Markou et al., 2012). Esta capacidad para acumular sustancias de reserva ha generado un creciente interés por el potencial uso de la biomasa de microalgas para generar biocombustibles (Vunjak-Novakovic et al 2005; de Morais y Costa 2007; Ratledge y Cohen 2008). Una proporción considerable de las investigaciones están centradas en la producción de biodiesel ya que muchas microalgas son de naturaleza oleaginosa y pueden ser explotadas para este fin (Chisti 2007). De hecho, es en la actualidad una línea prioritaria de investigación que ha llevado a la secuenciación de al menos 10 genomas de diferentes microalgas para la obtención de líneas celulares en las que se acumulen preferentemente lípidos (Work et al., 2012; Liu y Benning, 2013). Sin embargo, hasta la fecha se ha prestado poca atención a la producción de almidón a partir de microalgas como materia prima para la obtención de combustible. Almidón, celulosa u otros polisacáridos acumulados por ciertas microalgas puede ser utilizados como materia prima para la producción de etanol (Huntley y Redalje 2007; Rosenberg et al 2008; Subhadra y Edwards 2010). Microalgas como Chlorella , Dunaliella , Chlamydomonas , Scenedesmus o Spirulina contienen cantidades apreciables de almidón o glucógeno (>50% de su peso seco) (Ueda et al., 1996). Matsumoto et al. (Matsumoto et al., 2003) han descrito 76 especies de microalgas marinas con un contenido en carbohidratos entre el 40 y el 53%. La microalga Chlorococum sp también se ha considerado como una fuente interesante de etanol (Harun et al 2010). Se estima que se pueden producir Discusión 141 entre 50000 y 150000L de etanol por hectárea y año a partir de microalgas (Cheryl, 2010), varios órdenes de magnitud superior a la producción obtenida por otras materias primas. Múltiples estudios han demostrado que las alteraciones en las concentraciones de nutrientes pueden modificar el crecimiento y metabolismo secundario de las microalgas (Behrens y Kyle, 1996; Hsieh y Wu, 2009). Además este crecimiento depende no solo del adecuado aporte de macronutrientes sino de algunos micronutrientes como Fe, Mn o Zn (Sunda et al., 2005). La disponibilidad de nitrógeno en el medio, y su consecuente efecto sobre el contenido en N de la biomasa, reflejado en la razón C/N, tiene una fuerte influencia sobre el nivel celular de proteínas, carbohidratos y lípidos. En condiciones de limitación nitrogenada, se reduce el flujo del C recién fijado a proteínas y otras biomoléculas nitrogenadas, aumentando concomitantemente la síntesis de compuestos orgánicos no nitrogenados, como lípidos y carbohidratos, los cuales se almacenan como productos de reserva. Algunas microalgas almacenan preferentemente triacilgliceroles (Kumar et al 2010) y otras acumulan almidón (Rodolfi et al., 2009; Dragone et al., 2011). El alga modelo Chlamydomonas reinhardtii acumula cantidades significativas de almidón cuando se restringe su crecimiento, bien por limitación en la disponibilidad de CO 2 cuando se cultivan en luz o bien por la falta de acetato si están en oscuridad. Esta respuesta mimetiza la acumulación de almidón en hojas y órganos de almacenamiento no fotosintéticos de plantas superiores y parece responder a control genético nuclear relacionado con cambios en actividades enzimáticas asociadas al metabolismo del almidón. Para esta microalga se han descrito acumulaciones de hasta un 45% (Hirano et al 1997). Douskova (Douskova et al., 2008) ha publicado que Chlorella vulgaris crecida en condiciones de limitación de fósforo, nitrógeno o azufre aumenta de manera sustancial su contenido en almidón. Pero según otros autores (Branyikova et al., 2011) cuando las células de Chlorella tienen una limitación en el suministro de P y N, el contenido celular en almidón aumenta un 55% y un 38% respectivamente, pero tras 20h el cultivo deja de acumular almidón y comienza a consumirlo. Por otra parte, cultivos de Chlorella que creciendo en condiciones óptimas acumulan un 37% de almidón, cuando se someten a condiciones de supresión de síntesis de proteína alcanzan el 70% (Doucha y Livansky, 2009). En Scenedesmus quadricauda la limitación de nitrógeno inhibe la replicación del ADN, la división nuclear y celular y la síntesis de proteínas mientras que la síntesis de almidón no se veía sustancialmente afectada (Ballin et al., 1988). En la bibliografía consultada se encuentran propuestas de cultivos de C. vulgaris en régimen mixotrófico encaminados a la obtención de biomasa y almidón en los que se alcanza un contenido en almidón inferior al 5%, con una productividad de 15 mg l -1 d -1 (Abreu et al., 2012). Claramente, los costes de producción y los problemas de contaminación de estos cultivos hacen poco viable este tipo de estrategia. Todo ello Rafael García Cubero 142 sin tener en cuenta que la fijación de CO 2 queda reducida si se utiliza una estrategia de cultivo en la que parte del carbono incorporado proviene de una fuente orgánica. En este trabajo quedaba claramente de manifiesto que la disponibilidad de nitrógeno, medida como suministro específico de nitrato (SEN), y la velocidad de dilución, eran los factores que más afectaban a la acumulación de almidón en cultivos continuos de C. vulgaris refrendado, además, por el modelo de acumulación propuesto . En las condiciones óptimas determinadas, C. vulgaris acumulaba más del 30% de biomasa en forma de almidón, con una productividad máxima (65 mg l -1 d -1 ) más de cuatro veces superior a la del cultivo mixotrófico. No encontramos elementos de comparación en la bibliografía, respecto a la productividad de almidón en cultivos fotoautotróficos ya que en ninguno de los trabajos citados se refieren los valores alcanzados de productividad. Por otro lado, para gran parte de la bibliografía existente relativa a producción de biomasa rica en almidón por microalgas, los procedimientos empleados para su determinación no son específicos para este polisacárido, sino genéricos para carbohidratos totales, por lo que algunos de los valores publicados para contenido o productividad de almidón deben ser tomados con la debida cautela. En este trabajo se han empleado procedimientos específicos para almidón, evitando tener en cuenta los carbohidratos (principalmente celulosa) que forman parte de la pared celular. Éstos y otros carbohidratos celulares distintos del almidón podrían hacerse disponibles como sustrato para fermentación, tras un proceso adecuado de hidrolisis. Si bien este tratamiento comporta un importante coste añadido, posibilita un mayor aprovechamiento de la biomasa generada (Harun y Danquah, 2011; Gerken et al., 2012). Uno de los objetivos principales de este trabajo se centraba en la determinación de condiciones óptimas para la acumulación de almidón por cultivos de microalgas asociada a la eliminación de CO 2 . Este enfoque, con un marcado interés biotecnológico, combina la actividad de fijación fotosintética de carbono con la generación de biomasa apropiada para fines energéticos. A tal fin se ha determinado, para C. vulgaris, la acumulación y productividad de almidón en cada condición de cultivo. Atendiendo a estos resultados, las condiciones óptimas para dicha acumulación no coincidían con aquellas que maximizaban la tasa de fijación fotosintética de CO 2 . Por tanto, si se desea implementar un sistema de retirada de CO 2 ligado a la producción de almidón se debería llegar a un compromiso entre ambos objetivos, en el que, a pesar de verse reducida ambas capacidades respecto de sus correspondientes límites máximos, los rendimientos netos de fijación de carbono y producción de almidón fuesen aceptables y económicamente viables. Las condiciones ambientales también juegan un papel importante en la composición de la biomasa. La alta intensidad de luz tiende a aumentar la producción de polisacáridos (Friedman et al., 1991). Se ha demostrado que la síntesis de Discusión 143 carbohidratos al exterior es significativamente superior en los días soleados (Tredici et al., 1991). La síntesis de almidón en C. vulgaris está claramente influenciada por la luz, encontrándose los valores de acumulación más altos en situaciones de máxima irradiancia incidente. Branyikova et al (2011) sugieren que el factor con mayor impacto sobre la síntesis de almidón en Chlorella sp. es la irradiancia disponible como combinación de la concentración de biomasa y la irradiancia incidente. Según estos autores, el contenido en almidón de la biomasa se multiplica por cinco al pasar de 215 a 330 µ E m -2 s -1 . Nuestro estudio sobre la acumulación de almidón a lo largo del ciclo diario mostraba que los valores máximos se obtenían al final del periodo de iluminación. Por tanto, estaría justificado diseñar estrategias de cosechado de la biomasa que coincidiesen con este momento del día para optimizar la productividad de almidón a la intemperie. Resultados similares, también con Chlorella pero cultivada a la intemperie en reactores de capa fina, han sido publicados por Branyikova et al (2011) con contenidos máximos de almidón del 18% al comienzo de la tarde y mínimos, 10%, al inicio de la mañana. Para que la productividad de biomasa de microalgas sea máxima es necesario suplementar al cultivo con una cantidad suficiente de dióxido de carbono (Benemann, 1993) ya que el contenido atmosférico, junto a la limitación en la transferencia de masa, no permite sustentar un crecimiento activo. El CO 2 representa una parte sustancial de los costos de operación de los sistemas de producción de microalgas (Kadam, 1997). Para su reducción se han propuesto diversas aproximaciones utilizando gases con un alto contenido en CO 2 procedentes de incineradoras de residuos (Wang et al., 2008), centrales eléctricas de carbón (Maeda, 1995; Kadam, 2002) o de keroseno (Chae et al., 2006) , calderas de gas natural (Doucha et al., 2005), o mezclas de gases de combustión simuladas (Brown, 1996). La mayor parte de estos gases residuales contienen más de un 15% de CO 2 , suficiente para sustentar la producción de microalgas a gran escala. Desde otro punto de vista, los cultivos de microalgas pueden considerarse una de las aproximaciones más efectivas para fijar CO 2 (de Morais y Costa, 2007) contribuyendo a su retirada de las fuentes emisoras y por tanto a la calidad medioambiental (Nigam y Singh, 2011). La mayor parte de los estudios se han centrado en evaluar la tolerancia de distintas microalgas a concentraciones elevadas de dióxido de carbono sin prestar demasiada atención al posible uso de la biomasa generada (Douskova et al., 2009) y sin tomar en consideración que la concentración de CO 2 en la fase gaseosa no refleja necesariamente la concentración a la que está expuesta la microalga ya que ésta depende de la trasferencia de materia y del pH del medio (Kumar et al., 2011). Diversas especies de microalgas pueden crecer con altas concentraciones de CO 2 (Wang et al., 2008) y moderados niveles de SO x y NO x (Matsumoto et al., 2003). El flujo al que se pueda inyectar el gas va a depender de la irradiancia y temperatura del Rafael García Cubero 144 cultivo (Doucha et al 2005). Las especies más utilizadas en estos estudios han sido Chlorella , Scenedesmus , Nannochloropsis y Chlorococcum empleando concentraciones de CO 2 que van desde el nivel atmosférico al 100% (Seckbach et al., 1970; Kurano et al., 1995). Chlorococcum littorale , una microalga marina, mostraba una excepcional tolerancia a altas concentraciones de CO 2 , por encima del 60% (Satoh et al., 2004). De Morais y Costa (2007) también han publicado que Scenedesmus obliquus , Chlorella kessleri y Spirulina sp . exhiben buena tolerancia a altos contenidos de CO 2 (superiores al 18%). Especies aisladas de ambientes extremos pueden crecer rápidamente y tolerar condiciones de alto CO 2 como Thermosynechococcus elongatus que crece con 20% de CO 2 (Eberly y Ely, 2012). Varios experimentos han revelado que la regulación de los fotosistemas I y II, la producción de ATP y la homeostasis de pH se mantienen en condiciones de alto CO 2 en especies que toleran elevadas proporciones de este gas pero no en especies sensibles (Demidov et al., 2000) pero, en cualquier caso, se desconocen hasta la fecha los procesos que hacen posible que estas células crezcan en condiciones de alto CO 2 (Baba y Shiraiwa, 2012). El aporte adecuado de CO 2 para asegurar el máximo crecimiento es aproximadamente de un 5% para Chlorella (Nielsen, 1995). De forma general, el crecimiento de microalgas y cianobacterias se inhibe a altas concentraciones de CO 2 . Como ya se ha comentado, el uso de gases de escape viene justificado como medida de abaratamiento de costes para la producción de biomasa acoplada a la eliminación de CO 2 . Estos gases tienen una composición heterogénea con presencia en algunos casos de compuestos altamente tóxicos y ácidos como NO x y SO x , responsables de la rápida acidificación del medio de cultivo. En este trabajo se ha evaluado la capacidad tanto de S. vacuolatus como C. vulgaris de emplear, como adecuada fuente de carbono, el CO 2 proveniente de gases de combustión de centrales térmicas de generación de electricidad. A tal fin, se utilizó una mezcla de gases preparada “ad hoc” de composición similar a la de las emisiones de una central térmica que emplea carbones bituminosos como combustible fósil para la producción del vapor de agua necesario generar energía eléctrica y que contenía, entre otras sustancias, 12% de CO 2 , 0,06% de SO 2 o 0,08% de NO 2 . Previamente se analizó la tolerancia de estas microalgas al suministro en continuo de distintas concentraciones de dióxido de carbono puro. C. vulgaris mostraba una excelente respuesta a gaseo constante con diferentes concentraciones de CO 2 puro, siendo su cultivo viable hasta un 10% de dióxido de carbono en la corriente general de gas. S. vacuolatus era más restrictiva que C. vulgaris , ya que sus cultivos sólo eran viables cuando se gaseaban en continuo con un 1% de CO 2 puro. Respecto al uso de la mezcla de gases de combustión, S.vacuolatus toleraba estos efluentes cuando la corriente estaba diluida 12 veces, conteniendo por tanto un 1% de CO 2 . En estas condiciones, S.vacuolatus presentaba la misma productividad de biomasa y tasa de fijación de carbono que cuando se burbujeaba con 1% de CO 2 puro o Discusión 145 cuando se hacía a demanda, con valores de asimilación de carbono de 1,2 g de CO 2 por litro de cultivo y día y productividades de 0,7 g biomasa l -1 d -1 . Estos valores de productividad de biomasa y de fijación de carbono estaban próximos (0,8 g biomasa l -1 d -1 ) a los descritos para especies de Scenedesmus aisladas en ambientes extremos, si bien, las condiciones de cultivo diferían a las de este trabajo (de Morais y Costa, 2007) y eran muy superiores a los 0,5 g de CO 2 l -1 d -1 referenciados por Ho et al (2010) para Scenedesmus obliquus . Por otro lado, C.vulgaris a pesar de admitir un rango más amplio de porcentajes de CO 2 puro, era igualmente restrictiva en cuanto al origen de la fuente de carbono, tolerando exclusivamente mezcla de gases de combustión diluida 12 veces o a demanda sin dilución. Su capacidad de fijación de carbono en todos los casos se veía mermada, siendo un 25% (0,9 g CO 2 l -1 d -1 ) menor que el máximo determinado en este trabajo (1,2 g CO 2 l -1 d -1 ). Las especies del género Chlorella han sido ampliamente estudiadas y utilizadas en procesos de biomitigación de gases de origen industrial (Van Den Hende et al., 2012), aunque las condiciones de cultivo, los valores para la asimilación de carbono y los contenidos en óxidos nitrosos y sulfurosos son muy heterogéneos, como queda recogido en revisiones recientes (Pires et al., 2012), donde se reportan tasas de fijación de carbono en especies del género Chlorella con valores que van desde 0,6 hasta 14 g CO 2 l -1 d -1 . Cabe destacar las experiencias llevadas a cabo por Douskova (Douskova et al., 2009), utilizando como fuente de carbono el CO 2 proveniente de gases de escape de una incineradora municipal, con una composición muy heterogénea (NO x , SO x , Hg…), donde se mostraba que el cultivo de C.vulgaris era viable rindiendo unos valores de fijación de carbono superiores a los aquí determinados (4,4 g CO 2 l -1 d -1 ). Los resultados presentados por Keffer (Keffer y Kleinheinz, 2002) se aseguran también un efecto nulo sobre el crecimiento de C.vulgaris de los óxidos nitrosos y sulfurosos. En la mayor parte de los trabajos dirigidos a analizar el uso de microalgas para depurar gases contaminantes no se hace alusión al destino final de la biomasa, es decir, a la productividad de sus componentes celulares. En este trabajo se ha demostrado que la utilización de gases de combustión diluidos convenientemente permite obtener una biomasa de Scenedesmus con más de un 50% proteína y 30% de lípidos. En el caso de los cultivos de Chlorella se han registrado productividades de 10 mg de almidón l -1 d -1 , bastante inferiores a las obtenidas con CO 2 puro inyectado a demanda. Se han comunicado valores de contenido en almidón de hasta un 34% de la biomasa generada (Maršálková et al., 2010). De nuevo se trata de cultivos estancos, si bien a la intemperie, que utilizan el CO 2 contenido en gases de escape. Cultivos al exterior de Scenedesmus vacuolatus y Chlorella vulgaris La adecuada elección del sistema para la producción de microalgas a gran escala es un aspecto clave en el proceso de eliminación de CO 2 . Se han desarrollado multitud de diseños, desde sistemas abiertos a biorreactores cerrados; estos últimos Rafael García Cubero 146 permiten un mejor control del proceso y mayores productividades. Además, pueden construirse en una disposición vertical, reduciendo los requerimientos de espacio (Pulz et al., 2001). Sin embargo los costes de construcción, de operación y mantenimiento resultan muy elevados. Puesto que el objetivo básico de este trabajo es la retirada de CO 2 , los costes del reactor deben ser bajos y la eficiencia energética elevada, aunque ello implique una reducción en la productividad de biomasa (Muñoz y Guieysse, 2006). Con estas consideraciones, para el presente estudio se compararon estanques abiertos y reactores planos operados a la intemperie, para evaluar su potencial respecto a la retirada de CO 2 . Aunque los estudios en laboratorio han permitido establecer las condiciones óptimas para maximizar la fijación de dióxido de carbono por ambas microalgas, los estudios al exterior requieren un nuevo esfuerzo de optimización. Para ambos tipos de reactor se ajustó la densidad celular mínima y la frecuencia de dilución, en función de la época del año, para conseguir un uso eficiente de la luz, ya que la irradiancia incidente es un parámetro que no se puede controlar en los sistemas a la intemperie. Otro factor clave en los cultivos al exterior, la temperatura, estuvo controlada en el RPV dentro de unos márgenes y sin control en los sistemas abiertos. Sólo el pH se ajustó al óptimo establecido. La primera información destacable de este estudio al exterior fue la acusada diferencia en la capacidad de retirar CO 2 que presentan los cultivos a la intemperie respecto a la obtenida en las columnas de burbujeo, mantenidas bajo estricto control, dentro del laboratorio. Las tasas de fijación se reducían un orden de magnitud para las dos especies de microalgas y en ambos sistemas de cultivo. Este resultado es de especial interés porque a menudo se hacen extrapolaciones a grandes superficies y periodos anuales, del potencial de las microalgas para generar un determinado producto, a partir de datos en pequeño volumen y condiciones controladas. Otro aspecto clave puesto de manifiesto en los cultivos al exterior es la diferente susceptibilidad de las microalgas a contaminaciones por otros organismos. Entre los patógenos con capacidad para infectar microalgas se han descrito virus, bacterias, protozoos, hongos (Elbrächter y Schnepf, 1998; Brussaard, 2004; Mayali y Azam, 2004). Se ha detectado contaminación por virus en más de 50 especies de microalgas (Nagasaky et al., 2005), incluyendo algunos que infectan a especies de microalgas responsables de afloramientos masivos. En las dos últimas décadas se han identificado muchas bacterias algicidas, la mayor parte de ellas gram-negativas (Doucette et al., 1998). Parece que su efecto dañino se debe a la liberación de ectoproteasas (Mitsutani et al., 2001). Los protistas descritos como parásitos de microalgas son zooflagelados, amebas y euglenas (Schweikert y Schneph, 1997). El género Amoebophrya es el más infectivo (Park et al., 2004). La presencia de protozoos puede comprometer seriamente la viabilidad del cultivo (Subashchandrabose et al., 2013). Los hongos más genéricamente implicados en asociaciones parasitarias con Discusión 147 microalgas pertenecen al filum Chytridiomycota , denominados comúnmente como quítridos (Ibeling et al., 2004). Estos parásitos tienen un amplio rango de huéspedes (Gutman et al., 2009) y causan una alta mortalidad en poblaciones da microalgas de agua dulce o marina (Van Donk, 1989). Se han descrito contaminaciones por estos hongos en sistemas de cultivo al exterior de Scenedesmus obliquus (Abeliovich y Dikbuck, 1977). Su eliminación resulta complicada y costosa (Letcher et al., 2013) ya que requiere el uso de fungicidas. Estos episodios de contaminación se han manifestado en los cultivos de C. vulgaris y S. vacuolatus tanto en estanques abiertos como en RPV. Este hecho ha resultado especialmente dramático en el caso de Scenedesmus que durante la experimentación sufrió continuas infecciones por el quítrido Paraphysoderma sedebokerensis haciendo inviable su cultivo y por tanto reconsiderando su selección inicial como organismo idóneo para procesos de retirada de CO 2 . Gutman et al (2009) han descrito episodios de infección por este mismo quítrido en varias microalgas, algunas explotadas comercialmente como es el caso de Haematococcus pluvialis . Los datos referenciados de cultivo al exterior de alguna especie de Scenedesmus ( S.obliquus) corresponden a sistemas tubulares cerrados (Hulatt y Thomas, 2011). Sin embargo, los cultivos de Chlorella vulgaris solo resultaron infectados ocasionalmente por protozoos que, aunque reducían la productividad, no afectaban la viabilidad. Este hecho justifica la elección definitiva de esta microalgas para el propósito de este trabajo y permiten enfatizar la necesidad de verificar en cultivos al exterior, en condiciones reales de producción, el uso potencial de una microalga para cualquier aplicación práctica. C. vulgaris ha sido ampliamente utilizada en sistemas masivos de producción al aire libre por su adaptabilidad a condiciones ambientales cambiantes y su alta tasa de crecimiento que la hacen competitiva en relación a algunos contaminantes. Esta capacidad de adaptación a las condiciones de exterior se ha reflejado en los resultados de este trabajo donde ha sido posible cultivar la microalga tanto en estanques abiertos como en RPV a lo largo de todo el año a pesar de las fluctuaciones en luz y temperatura. La Figura 63 resume el comportamiento de los cultivos de C.vulgaris en estanque abierto en un ciclo anual correspondiente a la latitud de la ciudad de Sevilla. Cuando la irradiancia incidente es baja, los cultivos deben operarse a una densidad celular mínima menor que en condiciones de alta irradiancia. Por tanto, la operación de los cultivos al exterior debe ser modulada en función de la situación ambiental. Realizando un promedio anual, en estanque abierto, Chlorella vulgaris es capaz de fijar unos 11 g de CO 2 por metro cuadrado y día. Este valor es el doble del obtenido en nuestro grupo con la cianobacteria Anabaena ATCC 33047 , en el mismo diseño de reactor y mismo emplazamiento (Clares, 2011), superior a la obtenida con Dunaliella salina (García-González et al., 2003) y del mismo orden que la publicada para Muriellopsis sp (Blanco et al., 2007). Considerando un tiempo de operación anual Rafael García Cubero 148 aproximado de 300 días (paradas de limpieza, etc) se pueden estimar rendimientos de 3,3 Kg de CO 2 m -2 año -1 no muy alejados del valor máximo de 6 Kg de CO 2 m -2 año -1 propuesto por algunos autores (Borowitzka, 2010). En cultivos al exterior cobra especial importancia el diseño del reactor, cuyo principal objetivo es maximizar la utilización de la luz manteniendo una elevada relación entre el volumen de cultivo y la superficie ocupada, además de una adecuada distribución de nutrientes y transferencia de masa y gases (Acién Fernández, 2013). En este sentido, el reactor plano vertical utilizado en este trabajo tenía mayor relación volumen/superficie que el estanque abierto, además del control de temperatura, uno de los aspectos más favorables en este reactor. La tasa de fijación de CO 2 de los cultivos de C.vulgaris en RPV era el doble que en estanques abiertos, con valores mínimos de 15 g CO 2 m -2 d -1 y máximos de 30 g CO 2 m -2 d -1 , en las mejores condiciones de iluminación (Figura 64). A pesar que, por problemas en la instalación, no se pudo completar el estudio anual, el valor promedio calculado fue de 6 kg de CO 2 m -2 año -1 para 300 días de operación, similar al obtenido por nuestro grupo para Anabaena ATCC 33047 (Clares, 2011), o publicado para Nanochloropsis sp (Zhang et al., 2001). Aun asumiendo que el emplazamiento geográfico de los reactores es distinto, así como sus dimensiones, y por tanto las comparaciones deben ser tomadas con precaución, los datos de productividad volumétrica de C.vulgaris a lo largo del año en Invierno Primavera Verano Otoño Tasa de fijación CO 2 (g m -2 d -1 ) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Figura 63. Evolución de la fijación de CO2 a lo largo de un ciclo anual de cultivos de C.vulgaris en estanque abierto. Cada punto representa el valor promedio de las experiencias llevadas a cabo en cada estación (4 - 5 experiencias) Discusión 149 RPV son similares a los obtenidos por Ugwu (Ugwu, 2008) para Nannochloropsis y por Rodolfi (Rodolfi, 2009) para diferentes estirpes de Chlorella y Scenedesmus. El rendimiento de cada uno de los reactores podría mejorarse introduciendo modificaciones: en el caso de los estanques, aportando elementos de control de temperatura, en el caso de los RPV reduciendo el paso de luz o mejorando el sistema de aireación (Richmond y Cheng-Wu, 2001). De acuerdo con los resultados que aquí se presentan, el reactor más adecuado para el cultivo de Chlorella vulgaris es el RPV ya que, además de su elevada capacidad de fijación de CO 2 , presenta ventajas adicionales como un bajo consumo energético, gran capacidad de mezcla, moderado coste de construcción, simplicidad de manejo y susceptibilidad de escalado. Tomando estas consideraciones en su conjunto, el RPV puede suponer una opción de interés como sistema de cultivo para su aplicación a la retirada de CO 2 presente en gases de chimenea acoplada a la producción de una materia orgánica con alto contenido en almidón a partir de microalgas. Invierno Primavera Verano Tasa de fijación CO 2 (g m2 d1 ) 0 5 10 15 20 25 30 Figura 64 Evolución de la fijación de CO2 a lo largo de un ciclo anual de cultivos de C.vulgaris en RPV. Cada punto representa el valor promedio de las experiencias llevadas a cabo en cada estación (4-5 experiencias)