Papel de la cadena de transporte de electrones mitocondrial en la respuesta aguda a hipoxia de los quimiorreceptores arteriales

Instituto de Biomedicina de Sevilla Facultad de Medicina Departamento de Fisiología Médica y Biofísica TESIS DOCTORAL Papel de la cadena de transporte de electrones mitocondrial en la respuesta aguda a hipoxia de los quimiorreceptores arteriales Trabajo de investigación presentado por BLANCA JIMÉNEZ GÓMEZ para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2023 La Dra. Patricia Ortega Saénz, y la Dra. Lin Gao Chen, ambas Profesoras Titulares del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: que la presente Tesis Doctoral titulada “Papel de la cadena de transporte de electrones mitocondrial en la respuesta aguda a hipoxia de los quimiorreceptores arteriales”, presentada por la doctoranda Blanca Jiménez Gómez, Graduada en Biología y Máster Universitario en Genética y Biología Celular, ha sido realizada bajo su dirección y cumple las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Sevilla, 21 de julio de 2023: Fdo.: Dra. Patricia Ortega Saénz Fdo.: Dra. Lin Gao Chen PUBLICACIONES Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han sido publicados: Artículo en revista peer review: Jiménez-Gómez, B., Ortega-Sáenz, P., Gao, L., González-Rodríguez, P., García-Flores, P., Chandel, N., & López-Barneo, J. (2023). Transgenic NADH dehydrogenase restores oxygen regulation of breathing in mitochondrial complex I-deficient mice. Nature communications, 14(1), 1172. doi: 10.1038/s41467-023-36894-2. ÍNDICE RESUMEN ...................................................................................................................... 3! SUMMARY ..................................................................................................................... 4! INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 7! 1. Función homeostática de la detección de oxígeno ................................................ 7! 1.1. Respuestas adaptativas a la hipoxia aguda ........................................................ 7! 1.2. Respuestas adaptativas a la hipoxia crónica ...................................................... 9! 2. El cuerpo carotídeo: principal quimiorreceptor periférico .............................. 12! 2.1. Localización, organización celular y funciones del cuerpo carotídeo ............. 12! 2.2. Fisiología y función de las células glómicas en respuesta a la hipoxia aguda 14! 2.3. Papel del cuerpo carotídeo en la aclimatación a la hipoxia crónica ................ 16! 3. Papel de la mitocondria como sensor agudo de oxígeno en las células glómicas .................................................................................................................................... 17! 3.1. Aspectos generales del metabolismo mitocondrial ......................................... 17! 3.2. Hipótesis mitocondrial ..................................................................................... 19! 3.3. Papel del complejo mitocondrial I (CMI) en la respuesta aguda a la hipoxia del cuerpo carotídeo ..................................................................................................... 21! 3.4. Particularidades genéticas de células glómicas implicadas en la detección de la hipoxia aguda .......................................................................................................... 28! 3.4.1. Papel del complejo mitocondrial IV (CMIV) en la respuesta a la hipoxia aguda ............................................................................................................... 30! 3.4.2. Modelo actual de la detección de hipoxia aguda por células glómicas 33! 4. NADH deshidrogenasa alternativa de levadura y complejo mitocondrial I ... 34! 4.1. Estructura y función de la NADH deshidrogenasa interna (NDI1) de Saccharomyces cerevisiae ...................................................................................... 36! 4.2. Alteraciones asociadas a la disfunción del CMI y expresión transgénica de la proteína NDI1 ......................................................................................................... 36! 5. Desactivación del complejo mitocondrial I y la respuesta aguda a la hipoxia 38! OBJETIVOS ................................................................................................................. 42! I MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 46! 1. Modelos animales de experimentación ............................................................... 46! 1.1. Mantenimiento, cuidados generales y eutanasia .............................................. 46! 1.2. Generación de modelos murinos modificados genéticamente ........................ 47! 1.2.1. Modelos embrionarios: TH-NDUFS2, TH-NDUFS2-NDI1 y TH-NDI1 .... 48! 1.2.2 Modelo adulto: ESR-NDUFS2 y ESR-NDUFS2-NDI1 ................................ 49! 1.2.3. Modelo adulto: COX4I2-UBC-CRE-ERT2 ................................................. 49! 1.2.4. Modelos embrionarios: TH-COX4I2 y TH-COX4I2/NDI1 ......................... 51! 2. Experimentos realizados en animales in vivo ..................................................... 51! 2.1. Medida de la frecuencia respiratoria mediante pletismografía ........................ 51! 2.2. Tratamiento en cámara de hipoxia ................................................................... 54! 2.3. Medida de lactato y hematocrito en sangre ..................................................... 55! 2.4. Medida de la temperatura corporal .................................................................. 55! 3. Técnicas histológicas ............................................................................................. 55! 3.1. Perfusión intracardiaca, inclusión y corte de tejidos ....................................... 55! 3.2. Inmunofluorescencia en secciones de criostato ............................................... 56! 4. Técnicas de biología molecular y bioquímica ..................................................... 57! 4.1. Genotipado de líneas de ratón mediante PCR ................................................. 57! 4.2. Análisis cuantitativo de la expresión génica .................................................... 59! 4.3. Actividad enzimática del complejo mitocondrial I .......................................... 60! 4.4. Medida de los niveles de IGF-1 y hormona del crecimiento en suero ............ 62! 4.5. Medida de los niveles de ATP ......................................................................... 62! 5. Cultivo primario de cuerpo carotídeo de ratón ................................................. 63! 6. Experimentos funcionales in vitro: estudio de la fisiología celular .................. 65! 6.1. Técnicas electrofisiológicas ............................................................................. 65! 6.1.1. Técnica de amperometría: medida de la actividad secretora ................ 65! 6.1.2. Técnica de patch-clamp: medida de corrientes iónicas y Vm .............. 69! 6.2. Técnicas microfluorimétricas .......................................................................... 70! 6.2.1. Medida de la concentración citosólica de Ca2+ .................................... 71! 6.2.2. Medida de la concentración de NADH citosólico ................................ 73! 6.2.3. Medida de los cambios en los niveles de ROS mitocondrial ............... 73! II 6.2.4. Medida de los niveles citosólicos de ATP/ADP mediante microscopía de excitación de dos fotones ................................................................................ 75! 6.3. Soluciones de registro y mezcla de gases ........................................................ 78! 7. Análisis estadístico ................................................................................................ 80! RESULTADOS ............................................................................................................. 83! 1. Restauración de la actividad NADH deshidrogenasa y la sensibilidad a la hipoxia mediante la expresión de NDI1 en animales deficientes en CMI ............ 83! 1.1. Estudio de las respuestas sistémica, celular y mitocondrial a la hipoxia aguda en el modelo TH-NDUFS2/NDI1 ............................................................................... 83! 1.1.1. Caracterización del modelo TH-NDUFS2/NDI1 ................................. 84! 1.1.2. Estado general y desarrollo de los animales TH-NDUFS2/NDI1 ........ 88! 1.1.3. Rescate de la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia aguda en ratones deficientes de CMI mediante la expresión de NDI1 ....................................... 90! 1.1.4. Restauración de las respuestas celulares a la hipoxia aguda en las células glómicas TH-NDUFS2/NDI1 ......................................................................... 91! 1.1.5. Recuperación de la señalización mitocondrial en hipoxia aguda en las células TH-NDUFS2/NDI1 ............................................................................ 97! 1.2. Estudio de las respuestas sistémica, celular y mitocondrial a la hipoxia aguda en el modelo adulto ESR-NDUFS2/NDI1 ................................................................ 101! 1.2.1. Estado general y desarrollo de los animales ESR-NDUFS2/NDI1 .... 102! 1.2.2. Caracterización del modelo ESR-NDUFS2/NDI1 ............................. 103! 1.2.3. Recuperación de la respuesta sistémica a la hipoxia aguda en el modelo ESR-NDUFS2/NDI1 .................................................................................... 105! 1.2.4. Restauración de la respuesta neurosecretora y mitocondrial a la hipoxia aguda en el modelo ESR-NDUFS2/NDI1 .................................................... 106! 1.3. Recuperación de otros parámetros celulares y sistémicos alterados en ratones deficientes de CMI con la expresión de NDI1 ..................................................... 110! 1.3.1. Alteraciones metabólicas asociadas a la deleción del CMI ................ 111! 1.3.2. Anomalías en la regulación del crecimiento asociadas a la disfunción del CMI ............................................................................................................... 114! 1.3.3. Adaptaciones sistémicas a la hipoxia crónica ..................................... 115! III 2. Participación de la desactivación del CMI en la respuesta a la hipoxia aguda del cuerpo carotídeo ..................................................................................................... 116! 2.1. Efectos del bloqueante del intercambiador Na+/Ca2+ mitocondrial en la respuesta celular a la hipoxia aguda de las células glómicas ............................................... 117! 2.2. Producción de señales mitocondriales hipóxicas en las células glómicas en ausencia de Na+ extracelular ................................................................................. 119! 3. Papel de la subunidad atípica COX4I2 del CMIV en la sensibilidad a la hipoxia de las células glómicas ............................................................................................ 120! 3.1. Estudio de la respuesta a la hipoxia aguda en el modelo COX4I2-UBC-CREERT2 ..................................................................................................................... 120! 3.1.1. Estado general y desarrollo de los animales ....................................... 121! 3.1.2. Caracterización molecular del modelo COX4I2-UBC-CRE-ERT2 ... 122! 3.1.3. Respuesta sistémica y celular a la hipoxia aguda del modelo COX4I2UBC-CRE-ERT2 .......................................................................................... 122! 3.2. Modulación de la respuesta a la hipoxia aguda por la aceleración de la cadena de transporte de electrones mediante NDI1 en el modelo COX4I2/NDI1-THIRESCRE .............................................................................................................. 127! 3.2.1. Estado general y desarrollo de los animales COX4I2/NDI1-THIRESCRE ...................................................................................................... 128! 3.2.2. Recuperación parcial de la respuesta sistémica a la hipoxia aguda en el modelo COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE ......................................................... 128! 3.2.3. Caracterización molecular del modelo COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE ...................................................................................................................... 130! 3.2.4. Respuesta mitocondrial a la hipoxia aguda del modelo COX4I2/NDI1TH-IRESCRE ............................................................................................... 132! DISCUSIÓN ................................................................................................................ 136! 1. Papel del CMI en la generación de moléculas señalizadoras (NADH y ROS) en respuesta a la hipoxia aguda en las células glómicas ........................................... 137! 1.1. Cambios en el metabolismo de las células glómicas deficientes en CMI. Efectos de NDI1 ................................................................................................................ 137! 1.2. Respuestas a la hipoxia aguda de las células glómicas que expresan NDI1 . 139! 1.3. Uso de NDI1 como terapia correctora de los defectos genéticos del CMI .... 145! IV 2. Función “sensora” de O2 del CMIV de las células glómicas. Importancia de las isoformas atípicas de subunidades específicas y de la velocidad de la cadena de transporte de electrones mitocondrial .................................................................. 147! 2.1. Contribución de la isoforma COX4I2 del CMIV en los mecanismos de la sensibilidad aguda a la hipoxia en el CC .............................................................. 148! 2.2. Contribución de la aceleración del transporte de electrones mitocondrial y el alto consumo de O2 a la sensibilidad a la hipoxia de las células glómicas ........... 150! CONCLUSIONES ...................................................................................................... 154! ANEXOS ...................................................................................................................... 158! Anexo I: índice de figuras ...................................................................................... 158 ! Anexo II: índice de tablas ...................................................................................... 164 ! Anexo III: documento/s correspondiente/s al dictamen favorable del CEI/Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural de la Junta de Andalucía ................................................................................................................. 165! BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 176! V Introducción 7 INTRODUCCIÓN 1. Función homeostática de la detección de oxígeno El oxígeno (O2) tiene un papel fundamental en la supervivencia de los organismos con metabolismo aeróbico, los cuales degradan los compuestos orgánicos por completo cediendo sus electrones a un aceptor externo, el O2, para la obtención de grandes cantidades de energía en forma de adenosín trifosfato (ATP). Este proceso conocido como fosforilación oxidativa (OXHPOS, del inglés Oxidative Phosphorylation) tiene lugar en la mitocondria. Adicionalmente, el O2 participa como sustrato de numerosas reacciones del metabolismo intermedio que son necesarias para la síntesis de nuevas moléculas (Nelson y Cox, 2017). Por tanto, el suministro adecuado de O2 a los tejidos es un reto fisiológico fundamental. Un déficit de O2 (hipoxia), aunque sea de forma localizada y/o transitoria, puede provocar daños celulares irreversibles. A lo largo de la evolución, los seres vivos y particularmente los mamíferos, han desarrollado mecanismos encargados de detectar la falta de O2 y generar respuestas adaptativas para disminuir los efectos deletéreos de la hipoxia. En función de la duración de la hipoxia, las respuestas ante este estímulo pueden ser agudas, las cuáles ocurren en una escala de tiempo de segundos a minutos, o crónicas, con un curso temporal de horas a días (López-Barneo y cols., 2001). 1.1. Respuestas adaptativas a la hipoxia aguda Para compensar una disminución en los niveles de O2 en la sangre (hipoxemia) de forma aguda, se activan rápidamente en el organismo una serie de respuestas adaptativas que favorecen la captación de O2 en los pulmones y garantizan el suministro a los órganos más críticos, como el cerebro y el corazón (López-Barneo y cols., 2001). Las respuestas agudas a la hipoxia están mediadas por diferentes tipos celulares localizados en los quimiorreceptores arteriales periféricos y otros tejidos sensibles a hipoxia como las arterias pulmonares y sistémicas, los cuerpos neuroepiteliales del pulmón y la médula adrenal (MA). Todos ellos forman parte del llamado “sistema homeostático sensor de O2” (Weir y cols., 2005) (Figura 1). Estos tejidos poseen un conjunto de células especializadas que expresan canales iónicos sensibles a los niveles de O2, capaces de responder a los cambios en la presión parcial de O2 (PO2) modificando la excitabilidad, Introducción 8 contractilidad, o la actividad secretora de estas células (Chadwick y cols., 2006; LópezBarneo y cols., 2001). El principal quimiorreceptor arterial periférico es el cuerpo carotídeo (CC), órgano par localizado en cada una de las bifurcaciones carotideas. El CC contiene células glómicas quimiosensibles capaces de responder ante una disminución de O2 en sangre liberando neurotransmisores que incrementan la frecuencia de descarga de las fibras nerviosas aferentes que conectan con el centro respiratorio y otras estructuras centrales responsables de modular el tono simpático. Como consecuencia, la hipoxia desencadena los reflejos cardiorrespiratorios adaptativos de hiperventilación, para aumentar la captación de O2 en los pulmones, y activación simpática para incrementar el gasto cardíaco y el flujo sanguíneo hacia tejidos, especialmente sensibles a la falta de oxígeno como el cerebro y el corazón (Figura 1) (López-Barneo y cols., 2008). Otros quimiorreceptores arteriales periféricos que forman parte de este sistema son los cuerpos aórticos, que contienen células quimiosensibles, similares a las del CC pero en menor número, que forman pequeñas estructuras "paraganglionares" distribuidas de manera irregular por la vasculatura cardiaca, fundamentalmente alrededor del arco aórtico. Ante la hipoxia aguda, las células sensibles a los cambios en los niveles de O2 liberan neurotransmisores que activan al sistema nervioso central (SNC) para incrementar la ventilación (Jonz y Nurse, 2012). Los cuerpos neuroepiteliales contienen un tipo especializado de células neuroendocrinas, localizadas en la mucosa del epitelio de las vías respiratorias, que son sensibles a O2 (Weir y cols., 2005). En respuesta a hipoxia liberan neurotransmisores como aminas, péptidos y serotonina, que participan en la vasoconstricción pulmonar hipóxica (VPH) (Fu y cols., 2002; Jonz y Nurse, 2012) y favorecen el aumento de la ventilación sistémica (Jonz y Nurse, 2012). Por último, la MA contiene las células cromafines que detectan la hipoxia (sobre todo en el periodo posnatal) y como respuesta liberan catecolaminas a la sangre, que incrementan el gasto cardíaco (López-Barneo y cols., 2001; Weir y cols., 2005). Las células de músculo liso de las arterias pulmonares y sistémicas también detectan cambios en los niveles de O2, sin embargo, la respuesta ante la hipoxia es diferente dependiendo de su localización (Figura 1). En zonas del pulmón mal ventiladas, la PO2 en los alvéolos disminuye produciéndose una hipoxia localizada que es detectada por los miocitos de las arterias pulmonares, y como respuesta se desencadena una contracción de Introducción 9 las arterias que irrigan los alveolos hipóxicos, reduciendo el flujo sanguíneo a esta zona y derivándolo hacía zonas del pulmón con mayor disponibilidad de O2. Este fenómeno local adaptativo es la VPH (Franco-Obregón y López-Barneo, 1996). Por el contrario, en las arterias sistémicas, la hipoxia produce una vasodilatación que produce un aumento del flujo sanguíneo y facilita la perfusión tisular (López-Barneo y cols., 2001; Madden y cols., 1992). La vasodilatación hipóxica se manifiesta especialmente bien en las arterias esqueléticas, coronarias y cerebrales (López-Barneo y cols., 2001). Figura 1. Sistema homeostático sensor de O2. Representación esquemática de los órganos que forman el sistema homeostático sensor de O2 y las respuestas adaptativas, cardiorrespiratorias y vasomotoras, desencadenadas ante la hipoxia aguda en mamíferos superiores. Modificado de LópezBarneo y Ortega-Sáenz, 2022. 1.2. Respuestas adaptativas a la hipoxia crónica El déficit de O2 mantenido en el tiempo durante horas o días, que denominamos hipoxia crónica, puede ser fisiológico y estar asociado a situaciones en las que la cantidad de O2 ambiental disminuya, cómo por ejemplo viajar a zonas de gran altitud, o patológico, asociado a enfermedades respiratorias como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Para reducir y minimizar los efectos deletéreos de la hipoxia crónica, los organismos han desarrollado respuestas adaptativas que inducen la expresión de genes que codifican transportadores, enzimas, factores de crecimiento, Introducción 10 etc., capaces de originar cambios moleculares e histológicos para reducir el consumo y aumentar el suministro de O2 a los tejidos (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). La activación de la respuesta genética a la hipoxia crónica depende de los factores de transcripción inducibles por hipoxia (hypoxia inducible factors, HIF) y de las prolilhidroxilasas (PHD), enzimas dependientes de O2 que participan en la degradación de HIF (Kaelin y Ratcliffe, 2008). Los factores de transcripción de la familia HIF, son heterodímeros formados por dos subunidades, HIF-α y HIF-β. HIF-β se expresa de forma constitutiva en la célula y sus niveles son independientes de la PO2, mientras que HIF-α es la subunidad reguladora de la respuesta a hipoxia y su expresión depende de los niveles de O2 (Figura 2) (Semenza y Wang, 1992; Wang y Semenza, 1995). Se han descrito tres isoformas diferentes en la subunidad HIF-α (HIF-1α, HIF-2α y HIF-3α). HIF-1α es la subunidad que presenta un patrón de expresión ubicuo, y es considerado cómo el mayor regulador de la respuesta a la hipoxia crónica (Semenza, 2014). HIF-2α tiene una regulación similar a la de HIF-1α, pero posee un patrón de expresión limitado a determinados tejidos y órganos como el endotelio vascular, riñón, pulmón, corazón, intestino delgado (Gordan y cols., 2007) y cuerpo carotídeo (Gao y cols., 2017; MorenoDomínguez y cols., 2020). HIF-3α, el menos estudiado, se ha propuesto que posiblemente podría actuar como un represor del sistema HIF (Loboda y cols., 2010; Makino y cols., 2001). Hasta la fecha se han identificado tres proteínas PHD: PHD1, 2 y 3 (Epstein, 2001; Kaelin y Ratcliffe, 2008). Aunque estos tres genes (Phd1, Phd2 y Phd3) están ampliamente expresados (Lieb, 2002), la expresión de alguna de las isoformas difiere según el tejido. Por ejemplo, los niveles de ARNm de Phd1 están aumentados en el tejido testicular y los de Phd3 en corazón (Kaelin y Ratcliffe, 2008) y reducidos en el CC (Gao y cols., 2017). El principal mecanismo de regulación de HIF por hipoxia está mediado por la acción de las PHD (Schofield y Ratcliffe, 2004). En condiciones normóxicas, las PHD llevan a cabo la hidroxilación de HIF-α en residuos de prolina específicos (Appelhoffl y cols., 2004) que favorecen la interacción con la proteína supresora de tumores Von Hippel-Lindau (VHL) que participa en la poliubiquitinización de HIF-α, necesaria para posteriormente ser degradado en el proteosoma (Ivan y cols., 2001; Maxwell y cols., 1999) (Figura 2). Una disminución en los niveles de O2 inhibe la hidroxilación de HIF-α mediada por las Introducción 11 PHD, evitando su degradación. De este modo, durante la hipoxia aumentan los niveles HIF-α y se produce el ensamblaje con la subunidad β. Este heterodímero (HIF) se une a secuencias específicas de ADN conocidas como elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) y así activa la transcripción de los distintos genes diana (Kaelin y Ratcliffe, 2008; López-Barneo y Simon, 2020; Semenza, 2014) (Figura 2). En concreto uno de los genes cuya expresión se ve aumentada durante la hipoxia prolongada es el codificante de la eritropoyetina (EPO), hormona que promueve la formación de glóbulos rojos y favorece el transporte de O2 en sangre y por tanto una mejor oxigenación sistémica (López-Barneo y cols., 2001; Semenza y Wang, 1992). Otro gen importante que se induce en respuesta a hipoxia crónica es el que codifica para el factor de crecimiento endotelial vascular, que estimula la angiogénesis y aumenta la oxigenación tisular (López-Barneo y Simon, 2020; Ratcliffe, 2013). Entre los genes que permiten una remodelación del metabolismo hacía la reducción del consumo de O2 a nivel celular, se incluyen los que codifican enzimas glucolíticas como la lactato deshidrogenasa A y la piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (Papandreou y cols., 2006; Semenza G, 1996). Figura 2. Vía de señalización HIF-PHD-VHL ante la disminución de O2. En normoxia, la proteína VHL se une al factor HIF-α hidroxilado por las PHD, lo que lleva a la ubiquitinación de HIF-α que se degrada en el proteosoma. En hipoxia, se produce una acumulación de HIF-α, que se ensambla con HIF-β y se une al ADN para activar la transcripción de genes específicos. PHD, prolil-hidroxilasas; VHL, proteína supresora de tumores Von Hippel-Lindau; HRE, elementos de respuesta a la hipoxia. Modificado de López-Barneo y Simon, 2020. Introducción 12 2. El cuerpo carotídeo: principal quimiorreceptor periférico 2.1. Localización, organización celular y funciones del cuerpo carotídeo El CC constituye el principal quimiorreceptor periférico en mamíferos y tiene un papel fundamental en el control cardiorrespiratorio durante la hipoxia aguda. El CC se localiza bilateralmente en la bifurcación carotídea (Figura 3A). Es un órgano muy vascularizado, de pequeño tamaño, con un volumen promedio de aproximadamente 20 mm3 en humanos (Ortega-Sáenz y cols., 2013). El CC deriva embriológicamente de la cresta neural (Le Douarin, 1986; Pardal y cols., 2007) que junto con el ganglio cervical superior (GCS) y la MA entre otros tejidos, forma parte del linaje simpatoadrenal (Kameda, 2014; Saito y cols., 2012). El parénquima del CC se encuentra organizado en grupos de células, denominados glomérulos, en los que se distinguen varios tipos celulares entrelazados con tejido conectivo, graso y numerosos vasos sanguíneos (Figura 3B). Las células más abundantes en esta estructura son las células tipo I o glómicas que son de tipo neuronal y actúan como elementos quimiosensibles con actividad neurosecretora (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). En menor proporción se encuentran las células tipo II, de tipo glial, que son células progenitoras capaces de proliferar y diferenciarse a los distintos tipos celulares que conforman el nicho neurogénico del CC y desempeñan un papel importante en el crecimiento del CC en condiciones de hipoxia crónica (Pardal y cols., 2007). Los glomérulos están en contacto estrecho con una red de capilares e inervados por fibras nerviosas aferentes por las que la información se conduce hasta el SNC (Figura 3B). Las fibras aferentes proceden del nervio del seno carotídeo, cuyos somas se localizan en el ganglio petroso (Figura 3A), desde el cuál proyectan axones a través del nervio glosofaríngeo hasta el núcleo del tracto solitario del tronco encefálico. El tronco encefálico participa en la regulación de la respiración, el ritmo cardiaco y la activación de SN simpático (De Castro, 1928; Fidone y González, 1986). Las células glómicas y las fibras aferentes forman la sinapsis quimiosensorial (Figura 3B) (López-Barneo y cols., 2008). El CC también recibe inervación eferente, simpática y parasimpática, cuya función es muy poco conocida (véase Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Introducción 13 Figura 3. Localización y organización tisular del cuerpo carotídeo. (A) Esquema de la localización e inervación del CC en la bifurcación carotídea. (B) Representación esquemática de un glomérulo en el que observan los diferentes tipos celulares que existen en el parénquima del CC. Modificado de López-Barneo y cols., 2016; Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020. Las células glómicas, con forma ovoide y tamaño de 10-15 μm de diámetro, aparecen en grupos de 4-8 en el centro de cada glomérulo. Estas células son excitables ya que tienen canales de Na+, K+ y Ca2+ dependientes de voltaje y son capaces de generar potenciales de acción (Duchen y cols., 1988; Ureña y cols., 1989). En su citoplasma se localizan abundantes mitocondrias, así como numerosas vesículas con una amplia variedad de transmisores con diversas funciones (acetilcolina, ATP, dopamina, endotelina-1, opioides, serotonina, sustancia P, entre otros) (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Las células glómicas son positivas para el marcador tirosina hidroxilasa (TH), enzima limitante en la síntesis de catecolaminas y que permite identificarlas fácilmente mediante técnicas inmunohistoquímicas (Figura 4A y B). Estas células neurosecretoras se activan durante la hipoxia y estimulan a las fibras nerviosas aferentes que en última instancia activan a los centros respiratorios. Además de la hipoxia, las células glómicas son capaces de detectar estímulos de diferente naturaleza y por tanto son consideradas como sensores multimodales. Se ha descrito que su actividad neurosecretora se activa por estímulos cómo la hipercapnia o acidosis, así como por modificaciones en los niveles plasmáticos de distintos metabolitos (por ejemplo, glucosa y lactato), hormonas (por ejemplo, insulina y leptina), alteraciones en la temperatura, la osmolaridad y el flujo sanguíneo (Figura 4 C) (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Introducción 14 Figura 4. Las células glómicas dopaminérgicas como sensores multimodales. (A) Ruta de síntesis de catecolaminas. En rojo se indica la enzima tiroxina hidroxilasa (TH), marcador específico de las células glómicas. Modificado de Nelson y Cox, 2017. (B) Marcaje TH+ de las células glómicas por la técnica de inmunofluorescencia en rodajas de CC de ratón. Modificado de Moreno-Domínguez y cols., 2020. (C) Esquema representativo de la función sensorial multimodal de las células glómicas. Modificado de Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020. 2.2. Fisiología y función de las células glómicas en respuesta a la hipoxia aguda En la mayoría de las células quimiosensoras del sistema homeostático sensor de O2 los canales de K+ tienen un papel fundamental. Se han descrito canales de potasio regulados por los niveles de O2 en las células glómicas (Figura 5A), los miocitos pulmonares, las células cromafines de la MA (Figura 5C) y en las células quimiosensoras de los cuerpos neuroepiteliales (Figura 5B) (López-Barneo y cols., 2001). La inhibición por hipoxia de los canales de K+, produce una despolarización celular que activa los canales de Ca2+ dependientes de potencial. La entrada de Ca2+ desde el medio extracelular favorece la actividad neurosecretora o la contracción de las células quimiosensibles (López-Barneo y cols., 2001). Figura 5. Modulación de la corriente macroscópica de K+ por la hipoxia en células quimiosensoras. (A-C) Registros representativo de la inhibición transitoria de la corriente macroscópica de K+ durante la hipoxia (low PO2) en las células glómicas (A), las células quimiosensoras de los cuerpos neuroepiteliales (B) y las células cromafines de la MA (C). Modificado de López-Barneo y cols., 2001. Introducción 15 En las células glómicas se han descrito hasta el momento varios subtipos de canales de K+ regulados por O2 entre los que se incluyen los canales de K+ dependientes de voltaje (Kv) (López-Barneo y cols., 1988), canales activados por Ca2+(maxi-K+) (López-López y cols., 1997; Peers, 1990) y canales de fuga (background/leakage) (Buckler y cols., 2000; Kim y cols., 2009). Los canales Kv, fueron los primeros en describirse como sensibles a los niveles de O2 en las células glómicas (López-Barneo y cols., 1988). Otros autores propusieron que en respuesta a la hipoxia aguda se producía una inhibición de los canales leakage pertenecientes a la familia TASK1 y TASK3 (Buckler y cols., 2000; Kim y cols., 2009). Sin embargo, la ablación de los genes que codifican la expresión de los canales TASK1 y TASK3 demostró que la eliminación de estos canales no altera significativamente la respuesta a hipoxia de las células glómicas (Ortega-Sáenz y cols., 2010). Por otro lado, la capacidad de responder ante una disminución en la PO2 se mantiene en células deficientes de TASK1/TASK3 en presencia de inhibidores de canales maxi-K+(iberotoxina) y de canales voltaje dependientes (tetraetilamonio) (Ortega-Sáenz y cols., 2010). Todos estos datos sugieren que en las células glómicas no existe un canal específico regulado por hipoxia, sino que, el déficit de O2 desencadena una vía de señalización que puede modular de manera redundante distintas clases de canales iónicos (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). La hipoxia aguda produce la inhibición de los diferentes canales de K+ de las células glómicas, lo que provoca la despolarización de su membrana plasmática (Figura 6A y B) (López-Barneo y cols., 1988; López-López y cols., 1989; Peers, 1990; Stea y Nurse, 1991). En consecuencia, se produce la apertura de canales de Ca2+ voltaje-dependientes y la entrada de Ca2+ extracelular (Fishman y cols., 1985; Ureña y cols., 1994). El aumento de Ca2+ citosólico desencadena la liberación de neurotransmisores (Figura 6C y D) (Buckler y Vaughan-Jones, 1994; Ureña y cols., 1994). Principalmente, el ATP y la acetilcolina, se unen a los receptores de las fibras aferentes del nervio del seno carotídeo, activándolas y generando respuestas ventilatorias y simpáticas en respuesta a la hipoxia aguda (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Este proceso descrito ya desde finales del siglo XX, se conoce como “Modelo de membrana de quimiotransducción”, donde las células glómicas actúan como elementos presinápticos capaces de detectar una disminución de O2 en sangre arterial (Figura 6A). Introducción 16 Figura 6. Modelo de membrana de quimiotransducción en respuesta a hipoxia aguda en las células glómicas. (A) Representación del modelo membrana de quimiotransducción. Modificado de López-Barneo y cols., 2016. (B) Registro representativo de las corrientes de Ca2+(ICa) y K + (Ik) en respuesta a hipoxia de células glómicas control registrado mediante la técnica de patch-clamp. Se observa una inhibición de la Ik en respuesta a la hipoxia. Modificado de López-Barneo y cols., 2008. (C) Incremento de Ca2+ citosólico en respuesta a hipoxia (H), que se suprime al eliminar el Ca2+ extracelular usando EGTA como quelante de Ca2+, registrado mediante técnicas microfluorimétricas. Modificado de Ureña y cols.,1994. (D) Secreción de neurotransmisores en respuesta a hipoxia de células glómicas control, registrado mediante la técnica de amperometría. Modificado de OrtegaSáenz y cols., 2020. 2.3. Papel del cuerpo carotídeo en la aclimatación a la hipoxia crónica El CC posee una extraordinaria plasticidad a nivel celular y de órgano completo. En situaciones de hipoxia crónica puede multiplicar su tamaño 2-3 veces. (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Esto conlleva a un aumento del número de glomérulos y de vasos sanguíneos, permitiendo la adaptación de los mamíferos a la hipoxia crónica (Joseph y Pequignot, 2009; López-Barneo y cols., 2001, 2008). La plasticidad celular del CC depende de una población de células madre adultas multipotentes (células tipo II) que están inactivas en condiciones normóxicas, pero se activan durante la hipoxia para proliferar y diferenciarse a distintos tipos celulares, como células glómicas, células endoteliales o células de músculo liso (Annese y cols., 2017; Pardal y cols., 2007). Estas Introducción 23 células glómicas (Ortega-Sáenz y cols., 2003). Para probar esta hipótesis, se generó en nuestro grupo de investigación un modelo de ratón modificado genéticamente (THNDUFS2) con una eliminación embrionaria del gen Ndufs2 en el tejido catecolaminérgico (Fernández-Agüera y cols., 2015). Figura 9. Estructura del complejo mitocondrial I y sitio de unión de ubiquinona. (A) Estructura del CMI de mamíferos ilustrando las 14 subunidades catalíticas altamente conservadas (rojo) y las 31 subunidades específicas de mamíferos (azul) (Zhu y cols., 2016). (B) Representación esquemática de la actividad catalítica del CMI. En el brazo periférico (dominio hidrofílico), se representa la transferencia de electrones desde el NADH al FMN y por diferentes centros Fe-S (círculos naranjas) hasta cederlos a la Q. N2: último centro Fe-S. En el dominio hidrofóbico, se lleva a cabo el bombeo de protones desde la matriz al EIM. Modificado de Fiedorczuk y cols., 2016. (C) Estructura del “core” de CMI. Marcado con de flechas negras, se muestran las subunidades que componen el sitio de unión a la quinona: 49 KDa (Ndufs2); PSST(Ndufs7) y ND1(Mt-Nd1) (Modificado de Zhu y cols., 2016). (D) Esquema de las subunidades que conforman el bolsillo de unión de ubiquinona. Modificado de Rhein y cols., 2013. IMS: intermembrane space. Al estudiar la respuesta sistémica a la hipoxia (10% O2) en el organismo completo THNDUFS2, estos autores observaron una abolición casi completa del reflejo hiperventilatorio a hipoxia aguda (HVR) (Figura 10A). Sin embargo, la hiperventilación inducida por la exposición a hipercapnia (5% CO2) no se vio afectada en el animal THNDUFS2 (Figura 10B). Estos hallazgos indicaron que la subunidad NDUFS2 del CMI es fundamental en la respuesta sistémica a la hipoxia aguda. Introducción 24 Figura 10. Pérdida selectiva de la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia aguda en animales TH-NDUFS2. (A y B) Registros representativos del cambio de la frecuencia ventilatoria de un ratón control (azul) y TH-NDUFS2 (naranja) durante la exposición a hipoxia (10% O2) o hipercapnia (5% de CO2). Nótese como en el ratón TH-NDUFS2 se abole la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia y responde sin alteración a hipercapnia. Modificado de Fernández-Agüera y cols., 2015. Además, estos autores demostraron que las respuestas agudas a la hipoxia a nivel celular, como el aumento del Ca2+ citosólico y liberación de neurotransmisores característico de las células glómicas control (Figura 11A y C) prácticamente desaparecían en las células glómicas deficientes en NDUFS2 (Figura 11B y D). Sin embargo, las células KO mantenían una respuesta normal frente a otros estímulos despolarizantes, como la hipercapnia (CO2) o el alto potasio (40 mM KCl) extracelular. Los resultados obtenidos por Fernández-Agüera y colaboradores, sugerían que NDUFS2 participa de forma directa en la respuesta a la hipoxia aguda también a nivel celular (Fernández-Agüera y cols., 2015). El modelo TH-NDUFS2 también reveló que NADH y ROS son moléculas que desempeñan un papel importante en la señalización de la hipoxia aguda, capaces de modular los canales de la membrana de las células glómicas (Fernández-Agüera y cols., 2015). Estudios anteriores habían demostrado que la concentración de NADH en las células glómicas (Duchen y Biscoe, 1992) y los niveles de ROS en las células de músculo liso vascular (Waypa y cols., 2010) se veían alteradas durante la hipoxia. Mediante Introducción 25 estudios microfluorimétricos, observaron que en las células glómicas control, durante la hipoxia aguda, se producía un aumento rápido y reversible en los niveles de NADH (Figura 12A) y que esta respuesta estaba reducida o prácticamente abolida en las células deficientes en NDUFS2 (Figura 12B) (Fernández-Agüera y cols., 2015). Las medidas de ROS en tiempo real, empleando una sonda fluorescente genéticamente codificada (roGFP) dirigida a diferentes compartimentos mitocondriales, han demostrado que en las células glómicas control, la hipoxia provoca un aumento gradual y reversible de ROS en el EIM (Figura 12C) (Fernández-Agüera y cols., 2015), así como una disminución en la matriz mitocondrial (Figura 12D) (Arias-Mayenco y cols., 2018). El incremento de la señal de ROS en el EIM inducido por hipoxia se abolió en las células deficientes en NDUFS2 (Figura 12E), aunque los cambios de ROS en la matriz mitocondrial se mantuvieron sin alteraciones (Figura 12F). Figura 11. Bloqueo selectivo de las respuestas celulares a la hipoxia aguda en ratones THNDUFS2. (A y B) Registros amperométricos representativos de la actividad neurosecretora registrada en rodajas de CC controles (A), y TH-NDUFS2 (B). (C y D) Medida de los cambios en los niveles de Ca2+ citosólico (ratio 340/380) en células glómicas control (C) y TH-NDUFS2 (D). En todos los paneles, las células se expusieron a distintos estímulos: hipoxia, hipercapnia (CO2) y alto potasio (40K). Modificado de Fernández-Agüera y cols., 2015. Introducción 26 Figura 12. Respuestas mitocondriales frente a la hipoxia aguda en las células glómicas. (A y B) Registros representativos del incremento de NADH en respuesta a la hipoxia aguda (Hx) en células glómicas control (A) y la abolición de este incremento en las células TH-NDUFS2 (B). (C y F) Compartimentalización en la producción de ROS durante la hipoxia aguda. Registros representativos del nivel de ROS (ratio 400/484) en el EIM usando la sonda roGFP. (C) Medida del incremento en la producción de ROS en el EIM en células glómicas control en respuesta a hipoxia (Hx), y la disminución en la matriz (D). (E) Abolición del aumento en los niveles de ROS en respuesta a hipoxia en el EIM registrado en células TH-NDUFS2. (F) Disminución de ROS en respuesta a hipoxia aguda en la matriz mitocondrial registrado en células TH-NDUFS2. (Modificado de Fernández-Agüera y cols., 2015; López-Barneo y Ortega-Sáenz, 2022). IMS: intermembrane space; a.u: arbitrary unit. Los resultados experimentales respaldan la interacción de las señales hipóxicas (NADH y ROS), con una variedad de canales, incluyendo los canales de K+ dependientes de voltaje y los canales background. (López-Barneo y Ortega-Sáenz, 2022). Se ha descrito que las subunidades β de los canales Kv contienen sitios de unión a piridinucleótidos (McCormack y McCormack, 1994) y que el NADH se une con una gran afinidad a estas subunidades (Liu y cols., 2001). Además, el NADH inhibe la actividad de varias subclases de canales Kv (Kilfoil y cols., 2013, 2019), los cuales están regulados por la hipoxia en diferentes tipos celulares, como los miocitos pulmonares (Archer y cols., 1998; Moral-Sanz y cols., 2016) o las células glómicas (Pérez-García y cols., 2004). Por otro lado, se ha descrito que las especies reactivas de oxígeno pueden inactivar directamente las subunidades β de los canales de potasio Kv, al interactuar con residuos de cisteína sensibles a ROS (Sahoo y cols., 2014). En estudios realizados en CC, se demostró que la diálisis de las células glómicas con NADH (150 mM) resultó en una inhibición de la Introducción 27 corriente macroscópica de K+ voltaje-dependiente (Fernández-Agüera y cols., 2015). También observaron, que la diálisis de las células glómicas con H2O2 (10-50 u) inhibe a los canales de K+ background. (Fernández-Agüera y cols., 2015). Las células THNDUFS2 mostraron una supresión del efecto inhibitorio de la hipoxia sobre la corriente de salida K+ característica de las células glómicas control (Figura 13) (Fernández-Agüera y cols., 2015). Figura 13. Pérdida de la modulación de los canales de K+ por hipoxia en células TH-NDUFS2. (A y B) En la parte superior se observa el protocolo de rampa aplicado a células glómicas registradas con la técnica de patch-clamp en la configuración de parche perforado. En la parte inferior se muestran registros de la corriente voltaje dependiente y leakage de K+ en células glómicas control (A) y células TH-NDUFS2 (B) en normoxia (PO2 145 mmHg, rojo), durante la hipoxia (PO2 10 mmHg, azul) y la recuperación en normoxia tras el estímulo hipóxico (recovery, gris). Modificado de Fernández-Agüera y cols., 2015. Todos estos resultados experimentales, permitieron completar el modelo de membrana de quimiotransducción en respuesta a la hipoxia aguda en las células glómicas, dando lugar al nuevo modelo de “señalización de mitocondria a membrana” (SMM) (Figura 14A). Las mitocondrias en las células glómicas se localizan cerca de la membrana plasmática, formando microdominios que facilitan la interacción rápida de las moléculas señalizadoras con los canales iónicos (Figura 14B) (Fernández-Agüera y cols., 2015). Según este modelo, la hipoxia produce una ralentización de la CTE, lo que provoca la acumulación de QH2 dejando al CMI en un estado más reducido. En esta situación, la actividad deshidrogenasa del CMI disminuiría o incluso se revertiría, produciéndose así una acumulación de NADH y un aumento en la producción de ROS en el EIM, que actuarían como moléculas señalizadoras para inhibir los canales de K+ de la membrana plasmática (Figura 14B) (Fernández-Agüera y cols., 2015). Introducción 28 Figura 14. Modelo de señalización de mitocondria a membrana en respuesta a la hipoxia aguda en las células glómicas. (A) Representación esquemática del modelo de membrana de quimiotransducción incluyendo el papel de la mitocondria como elemento señalizador en respuesta a la hipoxia aguda. (B) Esquema representativo de los microdominios celulares característicos de las células glómicas que permiten la interacción rápida entre las señales mitocondriales producidas por el CMI (NADH y ROS) y los canales de K+ de la membrana plasmática en respuesta a hipoxia. Modificado de Fernández-Agüera y cols., 2015. 3.4. Particularidades genéticas de células glómicas implicadas en la detección de la hipoxia aguda A pesar de los avances en el estudio de la respuesta a hipoxia de las células glómicas, los mecanismos moleculares subyacentes aún no habían sido esclarecidos en su totalidad. El análisis del perfil de expresión génica del CC, proporcionó datos críticos sobre los posibles genes implicados en la función quimiosensorial de las células glómicas (Gao y cols., 2017; Zhou y cols., 2016). Un estudio en particular utilizó la secuenciación masiva de ARN de células únicas de ratones neonatales, e identificó una alta expresión de varios genes en las células glómicas. Estos incluyen al gen Epas1, que codifica a HIF-2α, un factor de transcripción importante en la adaptación a la hipoxia crónica, así como otros genes codificantes de subunidades mitocondriales atípicas del CMIV (Ndufa4l2 y Cox4i2) (Zong y cols., 2018). Además, encontraron genes que codificaban canales iónicos, entre los que destacan los canales background TASK1 altamente expresados (Zhou y cols., 2016). Introducción 29 En paralelo al trabajo indicado anteriormente, en nuestro grupo se realizó un microarray comparativo de los transcriptomas de tres tipos celulares de ratón adulto, con el mismo origen embrionario pero distinta sensibilidad a la hipoxia (Gao y cols., 2017). Se compararon las células del CC y de la MA, cómo células sensibles a hipoxia (células glómicas > células cromafines) (García-Fernández y cols., 2007), con neuronas del GCS que son prácticamente insensibles a este estímulo (Buckler y Turner, 2013). En las células sensibles a la hipoxia se observó una sobreexpresión del gen Epas1 y una regulación a la baja del gen Phd3. Además, existía una regulación al alza de varios genes codificantes de subunidades mitocondriales atípicas del CMIV (Ndufa4l2, Cox4i2 y Cox8b) y del gen piruvato carboxilasa (Pcx), que codifica una enzima fundamental en la anaplerosis del ciclo de Krebs. Estos autores propusieron que este perfil genético podría conferir la capacidad de detectar la hipoxia aguda en el CC y en la MA (Gao y cols., 2017). Para tratar de determinar el papel específico de HIF-2α en la respuesta a la hipoxia aguda del CC, se generó un modelo ratón knockout inducible para el gen Epas1 en el animal adulto. Se ha descrito que la eliminación ubicua del gen Epas1 durante la etapa embrionaria resulta letal (Tian y cols., 1998). La deleción embrionaria del gen Epas1 específica de tejido TH+, produce atrofia del CC y una pérdida de la respuesta sistémica a la hipoxia aguda (Macias y cols., 2018). Sin embargo, la deleción del gen Epas1 de forma ubicua, activable por tamoxifeno en la vida adulta, proporcionó animales deficientes en HIF-2α (Epas1f/-, Cre; KO-HIF-2α) que se desarrollaban con normalidad y tenían un CC sin alteraciones estructurales aparentes (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Los animales KO-HIF-2α mostraron una disminución de la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia (Figura 15A y B), así como una alteración de la respuesta mitocondrial a la hipoxia (acumulación de NADH y ROS) en las células glómicas (Figura 15C) (MorenoDomínguez y cols., 2020). Estos datos demostraron que HIF-2α, además de ser un factor de transcripción que participa en la respuesta adaptativa a la hipoxia crónica, juega un papel importante en la sensibilidad a la hipoxia aguda de las células glómicas. Estudios moleculares realizados en el modelo KO-HIF-2α (Epas1f/-, Cre) revelaron que, en el CC de estos animales, se producía una reducción de la de la expresión de los genes Ndufa4l2, Cox4i2, Cox8b y Pcx (Figura 15D). Estos autores sugirieron que la expresión de las subunidades atípicas del CMIV (Ndufa4l2, Cox4i2, Cox8b), reguladas por HIF-2α podrían estar involucradas en la sensibilidad del CC a la falta de O2. (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Introducción 30 Figura 15. Alteración de la respuesta a la hipoxia aguda en animales KO-HIF-2α. (A y B) Registros representativos del cambio de la frecuencia ventilatoria de un ratón control (azul, A) y KOHIF-2α (rojo, B), durante la exposición a hipoxia (10% O2). En el animal Epas1 f/-, Cre (KOHIF-2α) se produce una pérdida selectiva de la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia. (C) Registros representativos de la abolición del incremento NADH y ROS en el EIM en respuesta a hipoxia aguda en las células Epas1 f/-, Cre (KOHIF-2α). (D) Niveles de ARNm en el CC de ratones control (azul) y Epas1 f/-, Cre (KOHIF-2α). Se observa una regulación a la baja de los genes Ndufa4l2, Cox4i2, Cox8b y Pcx. Modificado de Moreno-Domínguez y cols., 2020. CB: carotid body. 3.4.1. Papel del complejo mitocondrial IV (CMIV) en la respuesta a la hipoxia aguda El CMIV (citocromo C oxidasa, CCOX) cataliza la transferencia de electrones desde el citocromo C hasta el O2, reduciéndolo a H2O en la etapa final de la CTE (Figura 16B). La CCOX es una enzima homodimérica localizada en la MMI, compuesta clásicamente por 13 subunidades en cada monómero. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que en mamíferos está formada por 14 subunidades (Zong y cols., 2018). Tres de estas subunidades (I, II, III), que constituyen el sitio catalítico, están codificadas por ADN mitocondrial y se encuentra altamente conservadas a lo largo de la evolución (Nelson y Cox, 2017). Las otras 11 subunidades están codificadas por ADN nuclear, y desempeñan funciones relacionadas con el ensamblaje y/o la estabilidad del CMIV (Kadenbach y Hüttemann, 2015; Zong y cols., 2018) (Figura 16A). En este apartado, se destacarán las Introducción 31 subunidades del CMIV que presentan isoformas atípicas en las células glómicas: la subunidad IV, la subunidad VIII y la subunidad NDUFA4. La subunidad IV (COX4) del CMIV está compuesta por un polipéptido que atraviesa la MMI (Figura 17). La isoforma COX4I1 es ubicua, y se ha descrito que se une al ATP o al ADP, según la relación ATP/ADP celular (Arnold y Kadenbach, 1999). Cuando este ratio aumenta, el ATP se une a COX4I1 en el lado dirigido hacia la matriz mitocondrial, lo que inhibe alostéricamente a la CCOX y en consecuencia disminuye la OXPHOS (Arnold y Kadenbach, 1999; Napiwotzki y Kadenbach, 1998) (Figura 17). Por otro lado, la isoforma II (COX4I2) está altamente expresada en el CC (Gao y cols., 2017), en el pulmón adulto y algunas células vasculares (ej.: pericitos). COX4I2 carece de dominios de unión a ATP y está regulada transcripcionalmente por la hipoxia (Aras y cols., 2013; Feuda y cols., 2007) lo que sugiere que podría desempeñar un papel importante en la detección de O2. En cuanto a la subunidad VIII (COX8) del CMIV, se han identificado 3 isoformas diferentes, COX8A, COX8B y COX8C (Kadenbach y Hüttemann, 2015) (Figura 17). La isoforma COX8A se expresa de forma ubicua en el CMIV de humano y ratón (Merle y Kadenach, 1980). Su función está relacionada con la transferencia de electrones desde el citocromo C al O2 y se ha sugerido que participa modulación del sitio catalítico del CMIV (Hallmann y cols., 2016; Rotko y cols., 2021). COX8B tiene un patrón de expresión restringido al tejido adiposo marrón en rata (Kadenbach y cols., 1990), sin embargo, en ratones está sobreexpresado en órganos cómo el corazón (Mouse ENCODE Project, 2019) o el CC (Gao y cols., 2017). En humanos particularmente COX8B ha sufrido a lo largo de la evolución una serie de mutaciones, convirtiéndose en un pseudogen. (Goldberg y cols., 2003). Aunque no se comprende completamente su función, se ha descrito que juega un papel importante en la función y estabilidad del CMIV (Kadenbach y Hüttemann, 2015). Por último, la isoforma COX8C se identificó en distintas especies (Kadenbach y Hüttemann, 2015), particularmente en el ratón y el humano está altamente expresada en los testículos, pero su función se desconoce hasta el momento (Fagerberg y cols., 2014; Hüttemann y cols., 2003). La subunidad COX8 participa en la interacción entre complejos mitocondriales (MCI-MCIV o MCI/ MCIII2/MCIV) (Letts y cols., 2016; Wu y cols., 2016) por lo tanto es probable que estas isoformas de COX8, participen en la asociación del MCIV con otros complejos de la CTE (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Introducción 32 Clásicamente NDUFA4 se consideraba una subunidad accesoria del CMI (Carroll y cols., 2003, 2006) , pero análisis bioquímicos y filogenéticos han revelado que forma parte del CMIV (Figura 17) (Balsa y cols., 2012; Kadenbach y Hüttemann, 2015). La isoforma NDUFA4L2 presenta una expresión restringida a ciertos tipos celulares y tejidos, como las células glómicas (Gao y cols., 2017), el tejido pulmonar, los pericitos cerebrales y algunas células tumorales (Lucarelli y cols., 2018). Su expresión se induce por hipoxia a través de la acción de HIF (Tello y cols., 2011), pero su función exacta no está clara. Se ha sugerido que podría estar involucrada en la asociación entre complejos mitocondriales, así como en la regulación de la actividad de la CTE y la producción de ROS (LópezBarneo y Ortega-Sáenz, 2022; Tello y cols., 2011). Figura 16. Estructura y actividad enzimática del complejo mitocondrial IV. (A) Representación de la estructura homodimérica de la CCOX, donde se ilustran la subunidad I (amarillo), la subunidad II (rosa), la subunidad III (morado) y el resto de subunidades (verde). (B) Esquema de uno de los monómeros del CMIV donde se muestra el sitio catalítico y la transferencia de electrones desde el citocromo C al O2. Modificado de Nelson y Cox, 2017. Se han realizado estudios en modelos de animales modificados genéticamente para investigar el papel de las subunidades atípicas del CMIV en la respuesta a hipoxia aguda del CC. Moreno-Domínguez y colaboradores, llevaron a cabo la eliminación en el tejido catecolaminérgico, de la subunidad NDUFA4L2, y en otro modelo la subunidad COX4I2 (Moreno-Domínguez y cols., 2020). En el modelo KO-NDUFA4L2 no se observaron alteraciones en la respuesta a la hipoxia aguda ni a nivel sistémico ni celular. Sin embargo, en los animales KO-COX4I2 se observó una inhibición similar a la descrita en ratones KO para HIF-2α, afectando a la capacidad de respuesta sistémica, celular y mitocondrial a la hipoxia aguda (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Estos datos sugirieron, que la Introducción 39 respuesta a hipoxia aguda de las células endoteliales aórticas (Hernansanz-Agustín y cols., 2017, 2020). Recientemente se ha propuesto que la desactivación del CMI, y como consecuencia la entrada de Na+ en la mitocondria, son elementos clave en la respuesta a la hipoxia aguda en las células endoteliales de la aorta (Hernansanz-Agustín y cols., 2020, 2017). Estos autores sugieren que, durante la hipoxia aguda, el CMI se desactiva y actúa como un intercambiador Na+/H+, favoreciendo la entrada de H+ hacía la matriz mitocondrial. La acidificación resultante, facilita la solubilidad de los precipitados de fosfato cálcico (CaP) presentes en la mitocondria, lo que a su vez aumenta el contenido de Ca2+ en la matriz. El incremento de Ca2+ activa el intercambiador Na+/Ca2+ de la mitocondria, lo que resulta en una entrada de Na+ hacia la matriz. El Na+ interacciona directamente con los fosofolípidos de la MMI, lo que reduce la difusión de la Q, se genera semiquinona, y esto promueve la formación de ROS en la CTE. Es importante investigar si la desactivación del CMI y, por consiguiente, la cascada de quimiotransducción propuesta por estos autores también ocurre en las células glómicas. OBJETIVOS Objetivos 42 OBJETIVOS El objetivo fundamental de este trabajo ha sido avanzar en el conocimiento del papel de la CTE mitocondrial en la respuesta a la hipoxia aguda de los quimiorreceptores arteriales, con la finalidad de investigar aspectos importantes en el modelo de señalización de mitocondria a membrana de las células glómicas no esclarecidos hasta la fecha. Dentro de este marco general, concretamente se han estudiado: (i) Si el CMI en sí mismo, es esencial en la respuesta a la hipoxia aguda en las células glómicas. Además, tratamos de identificar cuál de sus funciones, metabólica (NADH deshidrogenasa) y/o bioenergética (bombeo de protones y síntesis de ATP) es necesaria para detectar la disminución en los niveles de O2. También exploramos la posibilidad de restaurar la sensibilidad al O2 en caso de deficiencia de CMI mediante la expresión de la deshidrogenasa de levadura NDI1. (ii) El papel de la isoforma atípica COX4I2 del CMIV en la sensibilidad a la hipoxia, y cómo esta capacidad quimiosensora ante la disminución O2 de las células glómicas se afecta por aceleración del transporte de electrones mitocondrial. Para lograr estos objetivos, se han utilizado diferentes modelos de ratones modificados genéticamente. (i) En relación con el estudio del papel del CMI en la respuesta a la hipoxia aguda de las células glómicas se plantearon los siguientes objetivos concretos: 1. Generar y caracterizar modelos animales modificados genéticamente con deleción condicional del gen Ndufs2 (CMI) y expresión de NDI1 tanto en el tejido catecolaminérgico en el estadio embrionario (modelo TH-NDUFS2/NDI1) como de forma ubicua en la etapa adulta (modelo ESR-NDUFS2/NDI1). 2. Estudiar la sensibilidad a hipoxia aguda del CC en el modelo TH-NDUFS2/NDI1 y ESR-NDUFS2/NDI1 a nivel de organismo completo, celular y mitocondrial. Determinar que función del CMI es esencial en la detección aguda de la hipoxia en el CC y evaluar si NDI1 es capaz de restaurar la sensibilidad hipóxica abolida en ratones deficientes en NDUFS2. 3. Investigar el efecto de la expresión de NDI1 sobre la adaptación metabólica de las células glómicas ante la disfunción del CMI (TH-NDUFS2/NDI1), así como su Objetivos 43 papel en los efectos deletéreos en el organismo completo descritos en ratones deficientes en NDUFS2 (TH-NDUFS2/NDI1 y ESR-NDUFS2/NDI1). 4. Comprobar si la desactivación del CMI es fundamental para desencadenar la respuesta hipóxica en las células glómicas. (ii) Respecto al papel de la expresión de la subunidad atípica COX4I2 en el CMIV y la aceleración del transporte de electrones mitocondrial en la sensibilidad a la hipoxia de las células glómicas, los objetivos específicos fueron los siguientes: 1. Generar y caracterizar los modelos de ratón modificados genéticamente con deleción ubicua del gen Cox4i2 en la etapa adulta (modelo COX4I2-UBC-CREERT2) y animales deficientes en COX4I2 con expresión de NDI1 en el tejido catecolaminérgico (modelo COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE). 2. Estudiar la respuesta a hipoxia aguda del CC de ratones COX4I2-UBC-CREERT2 a nivel de organismo completo y a nivel celular, para determinar si la reducción de la sensibilidad a la hipoxia descrita en el modelo deficiente en COX4I2 en la etapa embrionaria (modelo COX4I2-TH-IRESCRE) se mantiene en el modelo adulto. 3. Caracterizar la respuesta a hipoxia aguda del CC de ratones COX4I2/NDI1THIRESCRE, para evaluar el papel de la expresión NDI1 como acelerador de la CTE mitocondrial y su posible función moduladora de la sensibilidad aguda al O2 en ausencia de COX4I2. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 46 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Modelos animales de experimentación Para lograr los objetivos planteados en esta Tesis Doctoral se requirió la utilización de animales de experimentación. En particular, se empleó la especie Mus musculus, comúnmente conocida como el ratón de laboratorio. 1.1. Mantenimiento, cuidados generales y eutanasia Los animales de experimentación son objeto de especial atención ética y están regulados por la legislación nacional e internacional. En este trabajo, se siguieron las normativas españolas e internacionales (Ley 32/2007, de 7 de noviembre; Real Decreto 53/2013, de 1 de febrero, la Orden ECC / 566/2015, de 20 de marzo) para garantizar el cuidado y bienestar de los ratones utilizados en el estudio, así como durante los procedimientos experimentales. El Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA/CEI) del Hospital Universitario Virgen del Rocío/Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), con la autorización de la Consejería de Agricultura, Ganadería, Pesca y Desarrollo Sostenible de la Junta de Andalucía (números de referencia: 29/11/2016/175 y 07/04/2020/051), revisó y aprobó los procedimientos realizados en los animales utilizados. Los ratones se estabularon en las instalaciones del Servicio de Producción y Experimentación Animal del IBIS (número de registro, ES410910008015), en salas con una temperatura constante (22 ± 1ºC) y con un ciclo alternante de 12 horas de luz/oscuridad. Cabe mencionar que se aplicaron todas las medidas necesarias para garantizar el bienestar de los animales utilizados, como el suministro de alimento y agua ad libitum, así como la comprobación regular del estado de salud. Además, se minimizó en la medida de lo posible el número de animales empleados y se seleccionaron aquellos que mejor se adaptaban a los requisitos experimentales. Para la eutanasia de los animales se inyectó una sobredosis letal de tiopental sódico (120-150 mg/Kg) por vía intraperitoneal. Materiales y Métodos 47 1.2. Generación de modelos murinos modificados genéticamente En el presente trabajo se utilizaron líneas de ratones genéticamente modificados con un fondo genético mixto (129SvJ x C57BL/6) creadas mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. Este sistema permite la eliminación o la expresión de un gen específico, para generar modelos de animales knockout (KO) o knock-in respectivamente. Este sistema de recombinación Cre/loxP es una técnica de ingeniería genética que se basa en la utilización de la recombinasa Cre y los sitios de reconocimiento de ADN, llamados loxP. La expresión de la recombinasa Cre puede controlarse de forma espacial (limitada a determinados tipos celulares y controlado por un promotor específico de ese tipo celular) y/o temporal (induciéndola en un momento determinado). Los sitios loxP son secuencias específicas de ADN que normalmente se disponen en zonas del genoma no codificantes, delimitando al gen de interés (Figura 21). El alelo del gen que tiene estas secuencias loxP, recibe el nombre de alelo floxeado y tiene una expresión normal hasta que se expresa la recombinasa Cre (Sauer, 1998). Cuando la enzima Cre se une a dos sitios de loxP que flanquean un segmento de ADN, cataliza una recombinación entre los sitios de loxP, lo que resulta en la eliminación del segmento de ADN que se encuentra entre ellos (Figura 21A), generando así animales KO para un gen de interés. Por otro lado, en este trabajo para la generación de animales knock-in se utilizó el sistema loxP-STOP-loxP (LSL), en el que dos secuencias loxP separadas por una secuencia STOP preceden al gen de interés. Cuando se expresa la Cre recombinasa, ésta promueve la recombinación homóloga entre los dos sitios loxP y provoca la eliminación de la secuencia STOP, lo que permite la expresión del gen de interés en el tejido y en el momento deseados (Figura 21B). El sistema Flp/FRT es otro sistema de recombinación utilizado para generar modelos de ratón knockout. En este caso, la recombinasa utilizada es la flipasa (Flp), y los sitios de recombinación son FRT (Flp recombinase target). El proceso es similar al sistema Cre/loxP, donde se utilizan secuencias FRT para delimitar la región que se desea eliminar del genoma del ratón (Luetke y Sadowski, 1995). A continuación, se especifican los modelos de ratones modificados genéticamente que se emplearon en esta Tesis Doctoral. Se utilizaron tanto machos como hembras indistintamente para la realización de los experimentos. Materiales y Métodos 48 Figura 21. Sistema de generación de animales modificados genéticamente mediante el uso de la recombinasa Cre. (A) Esquema del sistema Cre/loxP para la generación de un modelo knockout. (B) Representación esquemática del sistema loxP/STOP/loxP para la expresión de un gen silenciado. Modificado de Jackson Laboratory, website, 2023. 1.2.1. Modelos embrionarios: TH-NDUFS2, TH-NDUFS2-NDI1 y TH-NDI1 Previamente en nuestro grupo de investigación se generó un modelo de ratón knockout condicional para la subunidad NDUFS2 del CMI en el tejido catecolaminérgico (Fernández-Agüera y cols., 2015). Para conseguir este modelo TH-NDUFS2, se cruzaron ratones portadores del alelo floxeado Ndufs2 (Ndufs2-flox) con ratones que expresaban la recombinasa Cre bajo el promotor del gen Th (Lindeberg y cols., 2004). La recombinación homologa de los sitios loxP que delimitaban al exón 2 del gen Ndufs2, permitieron la eliminación de esa región del genoma (Figura 22 B). Los ratones knockout obtenidos TH-NDUFS2 (genotipo Ndufs2 flox/- TH-IRES-CRE), denominados de ahora en adelante como KO, permiten la eliminación de la proteína NDUFS2 de forma específica en el tejido catecolaminérgico, desde el momento que las células comienzan a expresar la enzima TH en la vida embrionaria (Fernández-Agüera y cols., 2015). A continuación, para generar los modelos TH-NDUFS2/NDI1 y TH-NDI1, fue necesario la utilización de ratones de la cepa LSL-NDI1 cedida por el Dr. Navdeep S. Chandel, de la Universidad Northwestern de Chicago, EE. UU (McElroy y cols., 2020). La construcción genética LSL-NDI1 se insertó en el locus Rosa26 para crear el ratón condicional knock-in LSL-NDI1 (Figura 22A). La recombinación mediada por recombinasa Cre entre los sitios loxP eliminó el casete STOP de transcripción, permitiendo la expresión de NDI1 y EGFP. El modelo TH-NDUFS2/NDI1 (genotipo Ndufs2flox/- NDI1LSL/+ o LSL/LSL TH-IRES-CRE) que llamaremos KO/NDI1, se obtuvo cruzando los animales portadores del alelo Ndufs2flox (floxeados) con ratones LSL-NDI1 Materiales y Métodos 49 que expresaron la recombinasa CRE bajo el promotor TH (Figura 22C). De este modo, se consiguió la eliminación de la subunidad NDUFS2 y la expresión de NDI1 en el tejido catecolaminérgico. Por su parte, el modelo TH-NDI1 (genotipo NDI1LSL/+ o LSL/LSL THIRES-CRE) denominado como WT/NDI1, expresaba NDI1 en las células catecolaminérgicas y se consiguió cruzando ratones LSL-NDI1 con ratones TH-IRESCRE (Figura 22D). El genotipo de cada ratón se determinó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se ha describirá en el apartado 4.1. Para los estudios de microfluorimetría generamos ratones que no expresaban la proteína reportera de EGFP (Figura 22A) ya que presenta una fluorescencia verde que solapa con el espectro de emisión de algunas de las sondas fluorescentes utilizadas, como con la autoflorescencia del NADH (véase más adelante). Para ello, los ratones portadores del alelo NDI1 y EGFP se cruzaron con los portadores de la recombinasa flipasa (Flp) para eliminar la expresión de EGFP, que estaba flanqueada por dos sitios FRT (Figura 22A). 1.2.2 Modelo adulto: ESR-NDUFS2 y ESR-NDUFS2-NDI1 Con la misma estrategia genética empleada para el modelo TH, se generaron animales knockout condicionales en la etapa adulta utilizando ratones portadores de la recombinasa Cre expresada de forma ubicua e inducible por tamoxifeno (CRE-ESR1) (Hayashi y McMahon, 2002). Para inducir la expresión de la recombinasa CRE-ESR1 y por tanto la deleción ubicua de la subunidad NDUFS2 y la expresión de NDI1 en los casos necesarios, los animales fueron alimentados con una dieta que contenía tamoxifeno (TMX). Para ello, a los ratones adultos con una edad igual o superior a 2 meses se les administró una dieta que contenía una dosis de 400 mg/Kg de TMX (CRD TAM400/CreER Irradiated, Teklad Laboratory) durante un periodo de un mes. Después del tratamiento con TMX, se les suministró una dieta normal hasta el momento de su sacrificio para la realización de los experimentos. De esta forma se generaron los animales denominados ESR-KO (genotipo Ndufs2flox/- CRE ESR1) y ESR-KO/NDI1 (genotipo Ndufs2flox/- NDI1LSL/+ o LSL/LSL CREESR1). 1.2.3. Modelo adulto: COX4I2-UBC-CRE-ERT2 El modelo COX4I2-UBC-CRE-ERT2 (genotipo Cox4i 2flox/- UBC-CRE-ERT2) se generó también mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. Para la generación de animales Materiales y Métodos 50 knockout condicionales para Cox4i2, fue necesario el cruce de ratones portadores del alelo floxeado Cox4i2 (Moreno-Domínguez y cols., 2020) con animales portadores del alelo de la recombinasa Cre inducible por tamoxifeno. Para conseguir la deleción del gen Cox4i2 en todo el organismo en la etapa adulta, concretamente, se empleó la recombinasa UBC-CRE-ERT2, bajo el promotor de la ubiquitina humana C (UBC). Para inducir la expresión de la UBC-CRE-ERT2, los animales de ≥ 2 meses de edad fueron alimentados durante un mes con la misma dieta con TMX mencionada en el apartado anterior. Una vez finalizado el mes de dieta con TMX, los ratones fueron alimentados con dieta normal hasta su uso experimental. Para simplificar, estos animales, se denominarán de ahora en adelante como KO/COX4I2-UBC-CRE. Figura 22. Generación del modelo TH-NDUFS2/NDI1 y TH/NDI1. (A) Esquema de la construcción genética LSL-NDI1 que se insertó mediante recombinación homóloga en el locus Rosa26 para generar el ratón condicional knock-in LSL-NDI1 (McElroy y cols., 2020). (B-D) Esquema representativo de la generación del modelo TH-NDUFS2 (KO) (B), TH-NDUFS2/NDI1 (KO/NDI1) (C) y TH-NDI1 (WT/NDI1) (B) Modificado de Jackson Laboratory, website, 2023. Materiales y Métodos 57 Tabla 1. Anticuerpos utilizados para la detección de proteínas mediante inmunofluorescencia. Antígeno Anticuerpo Dilución Compañía Referencia TH Primario 1:2500 Novus Biological Inc NB300-109 TH Primario 1:200 Millipore AB1542 NDUFS2 Primario 1:200 Abcam ab192022 GFP Primario 1:400 Aves Labs Inc 1010 Alexa fluor 568 Secundario 1:400 Invitrogen A11011 Alexa fluor 488 Secundario 1:400 Invitrogen A11015 4. Técnicas de biología molecular y bioquímica 4.1. Genotipado de líneas de ratón mediante PCR El genotipado de los ratones se realizó mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional, con el fin de determinar la presencia o ausencia de los alelos de interés en el genoma de los ratones estudiados. Para ello, a partir de las biopsias de los animales (trozos de deditos o cola) se obtuvo un lisado celular que contenía ADN genómico (ADNg) incubando las muestras durante 2,5 horas en 145 μl de reactivo de lisis PCR Direct (Viagen Biotech) y 5 μl de proteinasa K (3,4 x 10-2 mg/ml) (Roche) a 57ºC y 800 rpm en un thermomixer (Eppendorf). Posteriormente, se inactivó la proteinasa K incubando estas muestras durante 45 minutos a 85ºC sin agitación. Para detectar los distintos alelos, fue necesario realizar varias combinaciones de PCRs. Las mezclas de reacción de cada PCR contenían 2 μl del lisado celular que contenía ADN genómico de la muestra, 800 nM de cebadores específicos diseñados para amplificar los alelos de interés (forward y reverse), tal como se muestra en la Tabla 2, y la mezcla de la DreamTaq (DreamTaq Green PCR Master Mix) diluida 1x en agua libre de nucleasas (Thermo Scientific). En la Tabla 2 se muestran los cebadores empleados para amplificar los distintos alelos. La reacción de PCR se llevó a cabo en termocicladores C1000 Touch Thermal Cycler (BIO-RAD) con el programa que se ilustra en la Tabla 3. Los productos de la PCR se analizaron en geles de agarosa (2%) con la incorporación de SYBR Safe DNA Gel Stain al 0,01% (Invitrogen). La visualización de los fragmentos de ADN se llevó a cabo para determinar su tamaño mediante electroforesis. Materiales y Métodos 58 Tabla 2. Alelos amplificados, tamaño del producto de PCR (pb, pares de bases), temperatura de anillado y secuencias de los cebadores empleados en el genotipado de las líneas de ratón por PCR convencional. Línea Alelo amplificado Tª anillado Secuencia cebador (5’-3’) Ndufs2 WT (143 pb) Flox (355 pb) 58 ºC Fx51 ATAAGAGTGGATAGGATGTTT Fx31 CATTTCTCCCTTCCCGTC Ex (550 pb) 58 ºC Fx51 ATAAGAGTGGATAGGATGTTT FRT1 AGTGGCAGAACAATAGAGTG ATCCAGGG NDI1 WT (224 pb) 62 ºC Rosa BF GAGTTCTCTGCTGCCTCCTG Rosa BR CCGACAAAACCGAAAATCTG LSL (509 pb) 62 ºC WPREBF GACGAGTCGGATCTCCCTTT Rosa BR CCGACAAAACCGAAAATCTG NDI1 Exc (290 pb) 64 ºC NDI1 AACCCAGTATCAGCACGTTG CAG CAACGTGCTGGTTATTGTGC EGFP EGFP (300 pb) 58 ºC EGFP-F CCTACGGCGTGCAGTGCTTCA GC EGFP-R CGGCGAGCTGCACGCTGCGT CCTC Cox4i2 WT (510 pb) 55 ºC F2 CAGATTCTGAAGACTTACCAG CATCTCCTG R2 CTAAACTGTTCACATCTTACC CAGTAGCTTGAC KO (1059 pb) 55 ºC F2 CAGATTCTGAAGACTTACCAG CATCTCCTG Neo AATTCTATCAGGACATAGCGT TGGCTACC Materiales y Métodos 59 Flox (295 pb) 55 ºC 3 Lox1 GAG CCA GAG CTT CTG CTT AGA GGT C SDL2 ACC TAG ATC TTT GGG GCC CTC TTG TH IRES CRE WT (300 pb) Cre (400 pb) 57 ºC TH 5´ CACCCTGACCCAAGCACT TH 3´ CTTTCCTTCCTTTATTGAGAT UD GATACCTGGCCTGGTCTG CRE-ESR1C o UBC-CRE-ERT2 Cre (750 pb) 57 ºC Cre-Up TGTTCAGGGATCGCCAG Cre-Lo ACGGGCACTGTGTCCAG Tabla 3. Programa empleado para la reacción de PCR usando termocicladores C1000 Touch Thermal Cycler (BIO-RAD). Fase de la PCR Nº de ciclos Temperatura Tiempo 1. Desnaturalización inicial 1 ciclo 95 ºC 5 min. 2. Desnaturalización 1 ciclo 95ºC 30 seg. 3. Anillado 1 ciclo variable (ver Tabla 2) 30 seg. 4. Extensión 1 ciclo 72ºC 45-60 seg. Fases 2,3,4 30/40 ciclos 1 ciclo 72ºC 10 min. Fin 1 ciclo 4ºC ∞ 4.2. Análisis cuantitativo de la expresión génica Para analizar la expresión de los diferentes genes, se utilizó la técnica PCR cuantitativa (qPCR). Para ello, lo primero que se llevó a cabo fue la disección de los diferentes tejidos Materiales y Métodos 60 a estudiar (CC, GCS, MA y riñón) en PBS 0,01% DEPC (pirocarbonato de dietilo, Sigma), los cuales fueron rápidamente congelados en nitrógeno líquido y posteriormente almacenados a -80ºC hasta su uso. Para la extracción de ARN de muestras de tejido de pequeño tamaño (CC, GCS o la MA), se homogeneizaron los tejidos, con el politrón (Pro Scientific) y a continuación se empleó el kit RNeasy micro (QIAGEN) para la obtención de ARN. Las muestras de riñón, se homogeneizaron con el politrón y posteriormente se purificó el ARN con Trizol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. El ARN obtenido se eluyó en H2O libre de nucleasas y se cuantificó su concentración usando el espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Las muestras de ARN purificado se conservaron a -80ºC. Para el CC, dado su pequeño tamaño, fue necesario realizar una amplificación del ARN previa a la retrotranscripción para obtener ARNc mediante el kit de reactivos GeneChip WT PLUS (Affymetrix). A continuación, se procedió a la transcripción inversa de ARNc ó ARN a ADNc. Para ello, se utilizaron 500ng/μl ARNc o ARN de las diferentes muestras (CC, CGS, MA y riñón) y siguiendo el protocolo del fabricante utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen) se obtuvo el ADNc. Para la cuantificación de los niveles de expresión de los genes de interés se realizaron qPCRs con un sistema 7500 Fast Real Time PCR (Thermo Fisher Scientific) utilizando para cada gen de interés una sonda específica de expresión génica TaqMan (Thermo Fisher Scientific). Para poder obtener una cuantificación relativa, se emplearon genes con una expresión constitutiva (house-keeping), concretamente el gen del gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh) y la ciclofilina (PpiA) para normalizar las muestras (Tabla 4). Las reacciones de qPCR, se llevaron a cabo en un volumen final de 20 μl. Empleando ADNc de la muestra de interés, 10 μl de tampón TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), 1 μl de sonda TaqMan 20X (Applied Biosystems) y 4 μl de agua libre de nucleasas (Promega). Estas mezclas, se cargaron por duplicado, en placas de 96 pocillos MicroAmp Fast de 0,1 ml (Applied Biosystems). El nivel de expresión del gen de interés se analizó mediante cuantificación relativa (ΔΔCt) empleando Gapdh y PPia como genes housekeeping. 4.3. Actividad enzimática del complejo mitocondrial I Para medir la actividad enzimática del CMI en muestras de GCS y de riñón se empleó el Kit Complex I enzyme activity dipstick assay (Abcam), siguiendo las instrucciones del fabricante. El fundamento de este ensayo para medir la actividad enzimática del CMI se Materiales y Métodos 61 basa en el empleo de unas tiras reactivas que permiten la inmunocaptura del CMI a través de anticuerpos monoclonales específicos anti-CMI. El CMI inmunocapturado, se sumerge en una solución proporcionada por el kit y oxida el NADH, el H+ resultante reduce al azul de nitrotetrazolio (NBT) para formar un precipitado azul-púrpura. La intensidad de la señal de este precipitado se corresponde con el nivel de actividad enzimática del CMI en la muestra (Figura 25). Para realizar la medida, se homogeneizaron las muestras de GCS y riñón (40 mg), en 100μl y 200μl respectivamente, con el tampón de extracción del kit y una mezcla de inhibidores de proteasas y fosfatasas (Sigma). A continuación, se incubaron en hielo durante 20 minutos y se centrifugaron a 16000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante obtenido se utilizó para el ensayo enzimático, tras determinar la concentración de proteínas mediante un ensayo Bradford (BIO-RAD). Se emplearon 8 μg (GCS) y 5 μg (riñón) de extracto de proteína para la medida de la actividad del CMI siguiendo las instrucciones del fabricante y se obtuvo una banda azulada cuya intensidad es proporcional a la actividad enzimática del CMI. La cuantificación de la actividad enzimática se realizó adquiriendo imágenes de las tiras reactivas empleadas (ImageQuant LAS 4000 mini, GE Healthcare) y midiendo la intensidad de la señal de cada tira mediante el software ImageQuant TL (GE Healthcare). Tabla 4. Sondas TaqMan empleadas en las reacciones de la qPCR. Gen Sonda TaqMan (ID) Compañía Ndufs2 Mm00467601_g1 ThermoFisher Sdhd Mm00546511_m1 ThermoFisher Cox4i2 Mm00446387_m1 ThermoFisher Cox4i1 Mm01250094_m1 ThermoFisher NDI1 Sc04152682_s1 ThermoFisher Gapdh Mm99999915_g1 ThermoFisher PpiA Mm2342430_g1 ThermoFisher Materiales y Métodos 62 Figura 25. Esquema de la reacción para la medida de actividad enzimática del CMI. Modificado de Abcam, 2019. 4.4. Medida de los niveles de IGF-1 y hormona del crecimiento en suero Para la medida del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) y de la hormona del crecimiento (GH) se recogió sangre, directamente del corazón del animal, en tubos de suero específicos MiniCollect (Greiner Bio One GmbH). Para ello, una vez realizada la eutanasia se abrió la caja torácica, se hizo una incisión en la aurícula derecha y se aproximó el tubo colector para su llenado. Se obtuvieron de 10-100 μl de sangre y se mantuvieron en posición vertical durante 30 minutos, para su coagulación. El coágulo se eliminó centrifugando a 3.000 x g durante 15 minutos a 4 ºC, y el sobrenadante (suero) se almacenó a -80 ºC. La cuantificación de los niveles IGF-1 y de GH en las muestras de suero se realizó mediante un ensayo ELISA utilizando el kit mouse IGF-1 (Cat. ab240685, Abcam), y rat/mouse growth hormone ELISA (Cat. EZRMGH-45K, Millipore), respectivamente. En ambos casos, se utilizaron 10μl de muestras de suero, realizando un duplicado de cada muestra. Tras realizar el ensayo de ELISA, siguiendo las indicaciones de la casa comercial, la lectura se obtuvo utilizando un espectrofotómetro Multiskan Spectrum (Thermo). La concentración de cada muestra se estimó a partir de una curva estándar de referencia construida, en paralelo al ensayo, utilizando concentraciones conocidas de IGF1 y GH, proporcionadas por el fabricante. 4.5. Medida de los niveles de ATP El contenido de ATP se midió como se ha descrito previamente (Díaz-Castro y cols., 2012; Fernández-Agüera y cols., 2015). En resumen, se emplearon 200 mg de riñón, que se homogeneizaron en solución de homogeneización (100mM Tris, 4 mMEDTA, pH7.75), se hirvieron durante 3 min seguidos de centrifugación durante 1 min a 1000 x g y se mantuvieron a 4ºC antes de realizar la medida. Para determinar los niveles de ATP Materiales y Métodos 63 se empleó el kit ATP Bioluminescence Assay CLS II (Roche Applied Science), siguiendo el protocolo establecido por el fabricante. Este kit se basa en el uso de la luciferasa, cuya actividad enzimática requiere de ATP, para transformar la luciferina (sustrato) en un producto luminiscente. De este modo, la señal luminiscente que se detecta (lector Glomax, Promega), sería proporcional a la cantidad de ATP. Las muestras se normalizaron con respecto al contenido total de proteína de cada muestra de riñón, mediante el ensayo de Bradford (BioRad). 5. Cultivo primario de cuerpo carotídeo de ratón Para la elaboración de los cultivos primarios de CC de ratón utilizados para realizar los estudios funcionales in vitro, en primer lugar, se sacrificó a los animales utilizando una dosis letal de tiopental sódico (120-150 mg/Kg) vía intraperitoneal. A continuación, tras la extracción de las bifurcaciones carotídeas bajo una lupa binocular SZX16, se disecaron los CC en PBS frío. El procesamiento de los CC, fue diferente según el tipo de estudio funcional a realizar. Para el registro de la actividad secretora, la producción de ROS y la medida del ratio ATP/ADP se prepararon rodajas de CC, mientras que, para la medida de los niveles intracelulares de calcio, NADH y el registro de las corrientes iónicas se utilizaron células dispersas de CC, tal y como se describirá a continuación. Para mantener las condiciones de esterilidad en las distintas preparaciones celulares utilizadas en el presente trabajo, se utilizó una cabina de seguridad biológica Telstar Bio IIA. Los cultivos celulares se mantuvieron en un incubador (Thermo) con atmósfera humidificada, a 37ºC y 5% de CO2, 20% de O2 hasta su utilización. Las rodajas de CC se obtuvieron siguiendo un procedimiento previamente descrito en nuestro laboratorio (Ortega-Sáenz y cols., 2018; Pardal y cols., 1999; Piruat y cols., 2004). Los CC, disecados en PBS frío, se incluyeron en agarosa de bajo punto de fusión (SeaKem GTG, Lonza) al 1% en PBS a una temperatura de 42ºC (Figura 26A y B). El bloque de agarosa se colocó en hielo para que se solidificara rápidamente. A continuación, estos bloques se adhirieron a la plataforma de corte de un vibratomo, se cubrieron con PBS frío y se cortaron para obtener rodajas de 150 μm de grosor, utilizando un vibratomo (VT 1200S, Leica). Posteriormente, se llevó a cabo la digestión enzimática de las rodajas para eliminar el tejido fibroso que cubre a los glomérulos y dejar accesibles a las células glómicas para los experimentos funcionales. Para ello, las rodajas se Materiales y Métodos 64 incubaron durante 5 min a 37ºC en el baño con agitación, en 3 ml de solución de dispersión: 0,6 mg/ml colagenasa tipo II (Sigma), 0,27 mg/ml tripsina I (Sigma), 1,25 UI/ml elastasa porcina (Millipore) y 0,05 mM CaCl2 en PBS (Figura 26B). Finalmente, se retiró la solución enzimática, se lavaron las rodajas 3 veces con PBS frío y se incubaron en medio de cultivo de CC: DMEM, sin glucosa ni piruvato sódico/DMEM-F12, sin glutamina (3:1) (GIBCO), suplementado con 10% (v/v) FBS (GIBCO), 1% (v/v) penicilina/estreptomicina (GIBCO), 1% (v/v) L-glutamina (GIBCO), 84 UI/l de insulina (Actrapid) y 1,2 UI/ml de eritropoyetina (EPO, Binocrit). Las rodajas de CC resultantes se incubaron entre 24h y 48h antes de su registro en el set up correspondiente. Figura 26. Preparación de cultivos primarios de cuerpo carotídeo de ratón. (A) Representación que ilustra el procedimiento de extracción de la bifurcación carotídea y la disección del CC. (B) Esquema representativo de la preparación de rodajas de CC. (C) Diagrama que ilustra la preparación de células dispersas de CC. Modificado de Gao y cols., 2021. La dispersión de células de CC se realizó según el protocolo experimental descrito previamente en nuestro laboratorio (Muñoz-Cabello y cols., 2018). Brevemente, los CC disecados (Figura 26A y C) se pasan a una placa Petri de 35 mm conteniendo 3 ml de solución de dispersión (descrita anteriormente), y se mantienen en el incubador durante 20 minutos. Tras este tiempo, los CC se estiran en el microscopio invertido Olympus CKX41 (Olympus) con la ayuda de 2 agujas estériles para favorecer la disgregación mecánica del tejido y se incuban de nuevo, en las mismas condiciones durante 5 minutos Materiales y Métodos 65 más. La reacción enzimática se para añadiendo medio de cultivo completo de CC frío (sin EPO), y se pipetea repetidas veces para dispersar mecánicamente los CC. Posteriormente, se centrifuga a 4ºC, 300xg durante 5 minutos, y el pellet se resuspende en el medio previamente descrito (sin EPO). Por último, se siembran las células sobre cubreobjetos tratados con poli-L-lisina (Sigma) y colocados en placas de 35 mm y se introducen en el incubador. Transcurridas 2h desde la siembra, se añaden a la placa 2 ml de medio de CC (sin EPO) y se dejan en el incubador hasta el día siguiente, cuando las células dispersas pueden ser utilizadas para el registro (Figura 26C). 6. Experimentos funcionales in vitro: estudio de la fisiología celular El estudio de la fisiología de las células glómicas del CC se llevó a cabo utilizando distintas técnicas de registro electrofisiológico y microfluorimétrico, tanto en rodajas de CC, como en células glómicas aisladas. 6.1. Técnicas electrofisiológicas 6.1.1. Técnica de amperometría: medida de la actividad secretora La amperometría es una técnica electroquímica que se emplea para el registro de la actividad secretora de las células mediante el uso de un electrodo de fibra de carbono que se sitúa próximo a la célula. Este electrodo se polariza a un voltaje constante que supere el potencial de oxido-reducción de la molécula que se desea detectar. Al entrar en contacto con el electrodo, las moléculas se oxidan, cediendo los electrones a la fibra de carbono que se reduce y genera una corriente eléctrica que puede ser detectada por un dispositivo electrónico. En concreto, en este trabajo se midió la secreción de dopamina de las células glómicas en rodajas de CC expuestas a diferentes estímulos. Equipamiento de registro y proceder experimental Para detectar la secreción de dopamina en rodajas de CC se utilizó un electrodo de fibra de carbono polarizado a un voltaje fijo positivo de +750 mV (potencial oxidación de la dopamina). Este electrodo se situó, mediante un micromanipulador, próximo a la célula glómica (Figura 27A) de manera que los neurotransmisores liberados como respuesta a diferentes estímulos se oxidan cediendo electrones a la fibra de carbono y generando una Materiales y Métodos 66 corriente eléctrica que se puede monitorizar digitalmente (Ureña y cols., 1994). El electrodo de fibra de carbonó se fabricó de forma manual a partir de una fibra sintética de grafito de 10 μm de diámetro (AMOCO), que se insertó en un pequeño tubo de polietileno (Portex). En uno de los extremos de este tubo de polietileno se aplicó calor, para fundirlo con la fibra de carbono y conseguir su aislamiento eléctrico (a excepción de la punta). En el otro extremo se insertó en un capilar de vidrio (Kimax-51, Kimble products) y la unión se selló con Sylgard (Sigma), para evitar la entrada de la solución externa (Figura 27A). El capilar de vidrio se rellenó con una solución conductora 3M KCl para permitir el contacto eléctrico entre la fibra de carbono y el hilo de plata del head-stage (preamplificador). Esta fibra de carbono se polarizó mediante un generador de voltaje (npi electronic, GMBH) conectado al amplificador (EPC-8, HEKA Electronics) (Figura 27B). Para el registro amperométrico se transfiere una rodaja de CC desde el incubador hasta la cámara de registro, situada sobre un microscopio invertido Axiovert 35 (Zeiss). Con ayuda del micromanipulador el electrodo polarizado se situó próximo a una célula localizada en la superficie de un glomérulo en la rodaja de CC, tal y cómo se muestra en la imagen de la Figura 27B. Al exponer las rodajas a un estímulo que induce la secreción de dopamina por parte de la célula glómica, la dopamina se oxida liberando electrones que entran en contacto con la fibra de carbono. Estos electrones son transferidos a la fibra y generan una corriente que fluye por el electrodo hacia el head-stage (preamplificador), donde un amplificador operacional configurado como convertidor corriente/voltaje, proporciona un voltaje de salida proporcional a la corriente generada en la fibra (Figura 27B) (Chow y cols., 1992; Ureña y cols., 1994). Esta señal se filtró con un filtro de paso bajo con una frecuencia de corte de 100 Hz, se digitalizó mediante un convertidor analógico-digital a 250 Hz (ITC-16, Instrutech Corporation) y se almacenó en el ordenador. Los datos se adquirieron con el programa Pulse 8 (HEKA Electronics) y se analizaron con el programa Igor Pro (Wavemetrics). Los experimentos se realizaron a una temperatura constante de 35-37°C, para ello se colocó una rodaja de CC en la cámara de registro del microscopio, la cual se fijó con una lira de platino para evitar su movimiento. La rodaja de CC se perfundió con diferentes soluciones a un flujo constante por gravedad. Materiales y Métodos 73 6.2.2. Medida de la concentración de NADH citosólico Para el registro de la concentración de NADH citosólico en las células glómicas se utilizó el mismo equipo empleado para la medida de Ca2+ expuesto anteriormente (Figura 29). En este caso no fue necesario incubar las células dispersas con fluoróforos ya que tanto el NADH como en NAD(P)H son moléculas autofluorescentes. Se empleó un protocolo no ratiométrico en el que se excitó la muestra con luz UV a 360 nm, que corresponde al pico de excitación del NAD(PH) y se midió la fluoresencia emitida a 460 nm. ((Buckler y Turner, 2013; Duchen y Biscoe, 1992; Muñoz-Cabello y cols., 2018). El aumento de la fluorescencia emitida al excitar las células a 360 nm corresponde con un incremento en los niveles intracelulares de NADH/NAD(P)H. Tras un período de 24 horas en cultivo sobre los cubres, las células glómicas son transferida a la cámara de registro del microscopio para la adquisición de la señal de NADH. Se emplea un protocolo que utiliza una resolución espacial de 4x4, un tiempo de exposición de 150 ms y un intervalo de adquisición de 5 segundos. Durante el registro las células se perfundieron manteniendo un flujo constante, con distintas soluciones mediante una bomba peristáltica (Ismatec). 6.2.3. Medida de los cambios en los niveles de ROS mitocondrial Para la detección de los niveles de ROS, en diferentes compartimentos mitocondriales (espacio intermembrana y en la matriz mitocondrial), se empleó la sonda roGFP (reduction-oxidation sensitive green fluorescent protein) que permite la visualización en tiempo real del estado de oxidación de la célula. (Dooley y cols., 2004). La sonda roGFP es una proteína GFP modificada genéticamente que experimenta cambios de conformación al ser oxidados o reducidos unos residuos de cisteína que están posicionados específicamente en su estructura terciaria. Este cambio conformacional origina un cambio de intensidad de emisión cuando la sonda fluorescente es excitada previamente con la longitud de onda adecuada (Dooley y cols., 2004). El indicador roGFP se excitó a 400 y 480 nm y la fluorescencia emitida se detectó a 525 nm, permitiendo hacer mediciones ratiométricas (Gao y cols., 2021). Materiales y Métodos 74 Equipamiento de registro de ROS y proceder experimental El equipamiento para realizar los experimentos de microfluorimetría en rodajas de CC fue diferente, pero el funcionamiento es el mismo que el descrito anteriormente. Este equipo contaba con un microscopio directo (Olympus Bx51), equipado con luz óptica convencional, una cámara de registro donde se colocaron las rodajas de CC y un objetivo de inmersión 60x/0,90 AN (Olympus) (Figura 30). Como sistema de excitación de las muestras, se empleó una lámpara de xenón de 150 W, un monocromador Polychrome V (Till Photonics) y un espejo dicroico Di02-R488 (Semrock) que refleja hacia la muestra las λ por debajo de 488 nm, y deja pasar aquellas superiores a 488 nm. Para la detección de la luz emitida, el sistema llevaba incorporado un filtro de emisión FF01-520/35 (Semrock) y una cámara CCD iXon3 (Andor technology). La fluorescencia emitida por la muestra pasa por un filtro de emisión FF01-520/35 (Semrock) antes de ser detectada por la cámara CCD. El monocromador, la cámara CCD y la adquisición de imágenes se realizaron con el programa Live Adquisition (Till Photonics). Para conseguir la expresión de la sonda fluorescente roGFP, los cultivos de rodajas de CC se infectaron con los adenovirus y se mantuvieron 48 horas en el incubador para que se llevara a cabo la transducción de la sonda (Figura 30, ver imagen). Se han desarrollado diferentes versiones de la sonda roGFP para dirigir su expresión a distintos compartimentos celulares, como el citosol, el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial (Waypa y cols., 2010). Para ello los vectores adenovirales contenían la construcción roGFP y secuencias específicas que dirigían su expresión bien al espacio intermembrana (VQAd CMV GDFro-GFP) o a la matriz mitocondrial (VQAd CMV mito-roGFP). Las rodajas se infectaron con 5,5x108 y 6x108 partículas virualesl/ml, para cada compartimento respectivamente. Las rodajas de CC se llevaron a la cámara de registro del set up y aquellas células que expresaron roGFP, se excitaron a 400 nm y 480 nm, para monitorizar los cambios de ROS. El protocolo de adquisición fue diseñado con una resolución espacial de 8x8 pixeles, un tiempo de exposición de 20 ms, y un intervalo de adquisición de 5 segundos. La fluorescencia de fondo se restó en todos los experimentos. Los cambios en la producción de ROS se mostraron como cambios relativos a partir del ratio de emisión 400/480, considerándose un aumento en esta ratio como un incremento en la producción Materiales y Métodos 75 de ROS. Como control positivo de la detección de ROS, al final de cada registro se añadió 200-300 μM H2O2, que rápidamente interaccionó con la sonda roGFP provocando un incremento exagerado de la fluorescencia emitida. Las rodajas de CC se perfundieron con diferentes soluciones a un flujo constante por gravedad (Gao y cols., 2021). Figura 30. Equipamiento microfluorimétrico para medir los cambios de ROS. El equipo para medir ROS en rodajas de CC utiliza un microscopio directo. El monocromador emite un haz de luz a una longitud de onda específica que se refleja en un espejo dicroico para excitar la muestra (azul). La fluorescencia emitida por la muestra (flecha verde) atraviesa el espejo dicroico y un filtro de emisión, se registra con una cámara CCD y se monitoriza en el ordenador. La imagen muestra las células glómicas de un glomérulo infectado con adenovirus que expresan la sonda roGFP (imagen en campo claro e imagen con señal verde fluorescente). Modificado de Gao y cols., 2021. 6.2.4. Medida de los niveles citosólicos de ATP/ADP mediante microscopía de excitación de dos fotones Con el objetivo de cuantificar los niveles de ATP/ADP citosólico en las células glómicas, se empleó la sonda genética PercevalHR (Perceval High Range). PercevalHR es un biosensor fluorescente que se basa en la fusión de la proteína Glnk1, de origen bacteriano, con una proteína fluorescente verde modificada. La unión de PercevalHR al ATP causa un cambio estructural en el biosensor, lo cual se refleja en un cambio en la intensidad de fluorescencia emitida. Este cambio en la fluorescencia permite cuantificar los niveles de ATP/ADP en las células, ya que el biosensor actúa como un indicador de la concentración relativa de estos nucleótidos (Tantama y cols., 2013). Para los experimentos de medida del ratio ATP/ADP se utilizó la técnica de fluorescencia de dos fotones en inglés llamada Two-photon Laser Scanning Microscopy (2PLSM). Es Materiales y Métodos 76 una técnica de microscopía utilizada para visualizar estructuras biológicas con alta resolución en muestras vivas o intactas. A diferencia de la fluorescencia de un solo fotón, la técnica 2PLSM, requiere que dos fotones sean absorbidos de forma simultánea por un fluoróforo (Figura 31). Para que esto suceda es necesario emplear una fuente de excitación con una alta potencia, cómo es un láser, que permita aumentar la densidad de fotones que llegan a excitar la muestra. Este láser tiene que dar una serie de pulsos ultracortos para favorecer que estos dos fotones lleguen al mismo tiempo hasta el fluoróforo. Con la técnica 2PLSM, se emplean generalmente longitudes de onda en el rango infarrojo, y suelen ser aproximadamente el doble de λ que la requerida para microscopía de fluorescencia de un fotón. De este modo con la técnica 2PLSM la longitud de onda de emisión es la misma que empleando la excitación con un único fotón, pero la muestra se excita con la mitad de energía (Figura 31). Entre las ventajas de usar esta técnica destaca que la longitud de onda utilizada en la 2PLSM generalmente se sitúa alrededor de los 700-1000 nm, lo cual corresponde al rango de infrarrojo cercano. Este rango de longitudes de onda más largas permite una mayor penetración de la luz en la muestra biológica y reduce la dispersión y la fototoxicidad. Figura 31. Diferencias entre la excitación de un fluoróforo con un único fotón y con dos fotones. Nótese que en ambos casos la longitud de onda de emisión es la misma para el mismo fluoróforo, pero usando la técnica 2PLSM, la longitud de onda de excitación es el doble pero posee menor energía que la empleada en la microscopía de fluorescencia de un fotón. Modificado de Middlebury College, 2021, https://sites.middlebury.edu/ Materiales y Métodos 77 Equipamiento de registro y proceder experimental Para medir el ratio ATP/ADP, se empleó un microscopio de barrido láser de dos fotones (2PLSM) equipado con un sistema de barrido galvanométrico multifotón (Scientifica Ltd) y un objetivo de inmersión Olympus Å~60/1,0 NA. La fuente de excitación fue proporcionada por un láser Chameleon Ultra II (680-1080 nm), 3,5 W Ti: zafiro (Coherent laser group). La sonda utilizada, PercevalHR, se excitó sucesivamente a dos longitudes de onda: 950 nm y 820 nm. Para atenuar la potencia del láser, se utilizaron moduladores electroópticos de Pockels (S-MP-4700 y S-MP-6000-INT/UK) en serie, controlados mediante el software Labview (Figura 32). La señal de fluorescencia emitida por la muestra en el canal verde (490-560 nm) se dirigió a través de un espejo dicroico, se recolectó y se detectó mediante un fotomultiplicador PMT de GaAsP S-MDU-PMT50-50 de Scientifica (Figura 32). Esta señal se digitalizó y se visualizó en el ordenador mediante el software Labview. Para la adquisición de la señal, se realizaron 3 series temporales, cada una consistente en 10 adquisiciones de imágenes a una velocidad de 3-4 fotogramas por segundo (f.p.s.) con una resolución de 0,195 Å~ 0,195 mm por píxel. Estas series se llevaron a cabo para cada longitud de onda utilizada en la excitación de la sonda PercevalHR, a 950 nm y 820 nm respectivamente. Se seleccionaron múltiples regiones de interés (ROI) citosólicas, así como un ROI de fondo. Posteriormente, se restó el valor de fondo a cada ROI y se calculó el ratio 950/820 para cada ROI en cada punto temporal. Las rodajas de CC en cultivo fueron incubadas durante 48h con el adenovirus AAV9, que contenía la construcción genética PercevalHR, la cual estaba regulada bajo el control el promotor TH, de modo que únicamente las células glómicas expresaron esta sonda (González-Rodríguez y cols., 2021). Durante el registro de las imágenes, las rodajas fueron perfundidas con diversas soluciones utilizando una bomba peristáltica (Ismatec), lo que permitió mantener un flujo constante en el sistema. Para evaluar la contribución de la Fosforilación Oxidativa (OXPHOS) y la glucólisis a la relación ATP/ADP celular, se agregaron dos sustancias a la solución externa de control. Se añadió oligomicina (10 μM) como bloqueante de la ATP sintasa y 2-deoxiglucosa (2DG) como un sustituto de la glucosa no hidrolizable e inhibidor de la glucólisis Materiales y Métodos 78 (González-Rodríguez y cols., 2021). Se comparó la disminución del ratio ATP/ADP en respuesta a la oligomicina y al 2DG entre las células de diferentes genotipos. Para realizar esta comparación, se calculó el índice de fosforilación oxidativa (OXPHOS): (OXPHOS/(OXPHOS + glucólisis)). Figura 32. Sistema de microscopía de excitación con 2 fotones. Esquema representativo del sistema de microscopía de excitación 2PLSM. Se ilustra un láser, cómo fuente de excitación (color rojo), un espejo dicroico por el que pasa luz hacía la muestra, a través del objetivo. La luz emitida por la muestra (color azul) es filtrada por ese mismo espejo dicroico y recolectada por PMT (fotomultiplicador). Modificado de Taira y cols., 2007. 6.3. Soluciones de registro y mezcla de gases Para llevar a cabo los distintos registros in vitro de las rodajas y células dispersas de CC se utilizaron distintas soluciones externas, precalentadas a 30-33ºC y todas con una osmolaridad de 300 mOsm/Kg y un pH de 7,4 que se ajustó utilizando un burbujeo con 5% CO2 en las soluciones externas que contenía 23 mM de bicarbonato sódico o con sales (NaOH o HCl) en el caso de la solución externa con tampón HEPES. En la Tabla 5, se muestra la composición química de las diferentes soluciones externas utilizadas. Para los experimentos en 0 Na+, se utilizó la misma composición que la solución control, sustituyendo el NaCl el catión impermeable N-metil-D-glucamina (NMDG). Para los registros usando la técnica del patch-clamp se utilizó una solución en el interior del Materiales y Métodos 79 electrodo (configuración Whole-cell) y una solución externa para medir las corrientes de Ca+2 intracelulares (Tabla 6). La solución externa control se burbujeó con una mezcla de gases que contenía el 5% de CO2, 20% de O2 y el resto de N2. Para conseguir condiciones de hipoxia e hipercapnia, la solución control fue burbujeada con diferentes mezclas de gases: hipoxia (5% de CO2 y resto de N2) e hipercapnia (20% de CO2, 20% de O2 y resto de N2). Para realizar los experimentos de dosis respuesta de O2 se utilizaron botellas con 5% de CO2, distintos porcentajes de O2 y el resto de N2: 21% O2 (normoxia, 145 mmHg de O2); 12% O2 (85 mmHg de O2); 6% O2, (45 mmHg de O2); 3% O2, 25 mmHg de O2 y 0% de O2 (hipoxia, 45 mmHg de O2). La solución externa de Ca2+ fue burbujeada con aire comprimido (21% O2). Tabla 5. Soluciones de registro utilizadas para los experimentos de amperometría y microfluorimetría. Las concentraciones de los reactivos están expresadas en mM. Compuesto Control 40K+ 0 Glu NaCl 125 89,5 125 KCl 4,5 40 4,5 NaHCO3 23 23 23 Sacarosa 5 5 20 Glucosa 5 5 - MgCl2 1 1 1 CaCl2 2,5 2 2,5 Tabla 6. Soluciones de registro utilizadas en los experimentos de patch-clamp. Las concentraciones de los reactivos están expresadas en mM. Compuesto Externa Ca2+ Compuesto Interna Ca2+ NaCl 140 HEPES 10 BaCl2 10 CsCl 140 HEPES 10 EGTA 10 Glucosa 10 ATP 2 KCl 4,7 GTP 2 Materiales y Métodos 80 7. Análisis estadístico En esta Tesis Doctoral los análisis estadísticos de los datos se realizaron con la versión 8.2.1 de Prism (GraphPad) para MacOS. Primero se comprobó si los diferentes datos presentaban una distribución normal, utilizando las pruebas: Shapiro-Wilk, D'Agostino y Pearson o KolmogorovSmirnov. En algunos casos, se realizó una transformación logarítmica para normalizar la distribución antes de realizar un análisis paramétrico. Los datos con distribución normal se representaron utilizando diagramas de barras mostrando la media ± error estándar de la media (SEM), con todos los datos (puntos) superpuestos. Para la representación gráfica de los datos no paramétricos, utilizamos diagramas de caja mostrando la mediana, los cuartiles y valores extremos máximo y mínimo (representados como whiskers/bigotes). Igualmente se superpusieron todos los datos a modo de diagrama de puntos. Cuando los datos fueron paramétricos, para comparar dos grupos distintos se realizó la prueba estadística t de Student (two-tail), que dependiendo del experimento se realizó pareada o no. En los casos en los que se compararon tres o más grupos paramétricos, se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey o Newman-Keuls. En el caso en el que los datos fueron no paramétricos, para comparar dos grupos empleamos el test Mann-Whitney (two-tail) no pareado. La prueba de comparaciones múltiples Kruskal-Wallis seguido de la prueba post hoc de Dunn, se empleó en aquellos casos en los que tres o más grupos de datos no paramétricos fueron analizados. Las diferencias con un nivel de significación p<0,05 se consideraron significativas. RESULTADOS Resultados 83 RESULTADOS 1. Restauración de la actividad NADH deshidrogenasa y la sensibilidad a la hipoxia mediante la expresión de NDI1 en animales deficientes en CMI 1.1. Estudio de las respuestas sistémica, celular y mitocondrial a la hipoxia aguda en el modelo TH-NDUFS2/NDI1 El CMI desempeña dos funciones clave en la CTE. Por un lado, actúa como NADH deshidrogenasa, oxidando el NADH a NAD+ y transfiriendo sus electrones a la Q. Por otro lado, funciona como bomba de protones, generando un gradiente de H+ utilizado por la ATP sintasa para producir ATP mediante la fosforilación oxidativa (Nelson y Cox, 2017). Investigaciones previas han demostrado que la respuesta de las células glómicas del CC a la hipoxia aguda se abole completamente cuando se elimina el gen que codifica la subunidad NDUFS2 del CMI (Arias-Mayenco y cols., 2018; Fernández-Agüera y cols., 2015). Esta subunidad desempeña un papel fundamental en el ensamblaje y la actividad catalítica del CMI (Kashani-Poor y cols., 2001). En esta Tesis Doctoral se generó un modelo de ratón, denominado TH-NDUFS2/NDI1, para investigar si la expresión de NDI1, una NADH deshidrogenasa de levadura capaz de regenerar NAD+ pero que no contribuye al bombeo de protones en la CTE, podría restaurar la pérdida de las respuestas a la hipoxia aguda asociadas a la deleción del gen Ndufs2. Asimismo, este modelo fue utilizado para determinar qué función del CMI es esencial en la detección aguda de la hipoxia en el CC. El modelo TH-NDUFS2/NDI1 es un ratón modificado genéticamente en el estadio embrionario, en el que se ha eliminado de manera condicional el gen Ndufs2 y se ha introducido el gen NDI1 en el tejido catecolaminérgico (TH+) (Figura 33). Este modelo de ratón se denominó KO/NDI1. Adicionalmente, se utilizaron animales control (WT) y otros ratones modificados genéticamente para compararlos con el grupo KO/NDI1 de interés, estos incluyen los modelos TH-NDUFS2 (KO) y TH-NDI1 (WT/NDI1) (ver sección de “Materiales y Métodos”). Resultados 90 1.1.3. Rescate de la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia aguda en ratones deficientes de CMI mediante la expresión de NDI1 Para investigar el papel de la proteína NDI1 en la respuesta sistémica a la hipoxia aguda se llevó a cabo un estudio pletismográfico analizando la frecuencia ventilatoria de los animales WT, KO, KO/NDI1 y WT/NDI1. Los animales KO presentaron una inhibición completa del reflejo hiperventilatorio en respuesta a la hipoxia aguda (HVR) en comparación con los ratones WT, acorde a lo descrito en estudios previos (FernándezAgüera y cols., 2015). Sin embargo, en los animales KO/NDI1 la respuesta sistémica a hipoxia aguda se restauró casi por completo mediante la expresión de NDI1 (Figura 41A y C). Asimismo, se observó que los animales WT/NDI1 mantenían la respuesta sistémica ante la hipoxia aguda sin alteraciones (Figura 41A y C). En los animales WT, la respuesta sistémica ante la disminución de O2, se caracteriza por dos fases distintas (Figura 41A). En primer lugar, se produce un pico de hiperventilación, seguido de una fase de adaptación en la cual la frecuencia respiratoria se estabiliza o disminuye con el tiempo. Curiosamente, en la Figura 41A se observa que la respuesta a la hipoxia aguda de los animales que expresan NDI1, presenta una cinética distinta a la observada en los animales WT. Los animales KO/NDI1 y WT/NDI1 mostraron una fase de relajación más rápida, cuya posible explicación se tratará en el apartado de “Discusión”. Cabe destacar, que en los animales KO la frecuencia ventilatoria basal en condiciones normóxicas (21% O2) estaba disminuida (~10%) respecto a los animales WT (Figura 41C) y está disminución se recuperó mediante la expresión de NDI1 (Figura 41C). Como control de la capacidad de hiperventilar, los animales se expusieron a hipercapnia (5% CO2), otro estímulo capaz de producir un incremento en la frecuencia respiratoria. La respuesta a CO2 se mantuvo sin alteraciones en todos grupos estudiados (Figura 41B y D). Estos datos confirman que la expresión de la proteína NDI1 restaura la respuesta sistémica a la hipoxia aguda abolida en los ratones KO. Resultados 91 Figura 41. Respuesta ventilatoria a la hipoxia aguda y a la hipercapnia en el modelo KO/NDI1. (A) Registros pletismográficos promedio representativos del cambio en la frecuencia respiratoria durante hipoxia (~ 10% O2) en animales control (azul, n=16), KO (amarillo, n=12) y KO/NDI1 (naranja, n=12) y WT/NDI1 (rojo, n=15). Los cambios en el % de O2 con respecto al tiempo se representan en la parte inferior. (B) Registros pletismográficos promedio representativos del cambio en la frecuencia ventilatoria durante la hipercapnia (5% CO2) en los modelos estudiados (WT, n = 13; KO, n=8; KO/NDI1, n=21; WT/NDI1, n=15). En la parte inferior se muestran los cambios en % de CO2 con el tiempo. (C y D) Cuantificación de la frecuencia respiratoria media (respiraciones/minuto) registrada en normoxia (Nx) (C y D), hipoxia (Hx) (C) y durante la hipercapnia (CO2) (D) en cada uno de los modelos estudiados. Cada dato se representa como media ± SEM. Los valores P estadísticamente significativos fueron calculados mediante la prueba t Student (two-tail) para muestras pareadas. 1.1.4. Restauración de las respuestas celulares a la hipoxia aguda en las células glómicas TH-NDUFS2/NDI1 Con la finalidad de examinar como la expresión NDI1 afecta a las respuestas celulares a la hipoxia aguda, se realizó un estudio de la respuesta neurosecretora ante la falta de O2 y otros estímulos en las células glómicas de ratones KO/NDI1 y WT/NDI1 utilizando la técnica de amperometría (Figura 42A). De acuerdo con investigaciones previas Resultados 92 (Fernández-Agüera y cols., 2015), se observó que la respuesta secretora a la hipoxia aguda estaba selectivamente abolida en las células glómicas KO (Figura 42C y H) en comparación con las células WT (Figura 42B y H). Sin embargo, la expresión de NDI1 en las células glómicas KO, restableció completamente la respuesta secretora a la hipoxia aguda (Figura 42E), e incluso mostró una respuesta mayor que las células WT (Figura 42H). Las células WT/NDI1 exhibieron una respuesta secretora normal ante la disminución en los niveles de O2 (Figura 42F), aunque también superior a la observada en las células control (Figura 42H). Al cuantificar la respuesta secretora frente a la hipoxia (Figura 42H) se confirmó que en las células que expresan NDI1 (KO/NDI1 y WT/NDI1) se producía una respuesta de mayor amplitud en comparación con las células control. Además, se verificó que las células glómicas de los diferentes genotipos, partiendo de una tasa de secreción basal (Figura 42G), tenían la capacidad de liberar dopamina en respuesta a estímulos despolarizantes como el CO2 (20%) y el 40K (Figura 42I y J). Es relevante mencionar que las células KO/NDI1 presentaron una respuesta reducida a la hipercapnia en comparación con los demás grupos estudiados (Figura 42I). En paralelo, se realizó un experimento adicional para investigar si la liberación de catecolaminas inducida por la hipoxia en el modelo KO/NDI1, dependía de la entrada de Ca2+ extracelular (Figura 42A). Para ello se empleó cadmio (Cd2+) como bloqueante de canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Los resultados mostraron que la secreción inducida por la hipoxia aguda, desaparece en presencia de Cd2+ (Figura 42D), lo que confirma que en el modelo KO/NDI1 la liberación de neurotransmisores en respuesta a la hipoxia, depende de la entrada de Ca2+ extracelular, al igual que en las células control (Fishman y cols., 1985; Ureña y cols., 1994). Para investigar si el aumento de la respuesta secretora ante la disminución de O2 de las células KO/NDI1, se debía a una mayor sensibilidad a la hipoxia respecto a las células control, se realizaron experimentos de dosis respuesta. Se expusieron las rodajas de CC WT y KO/NDI1 a diferentes niveles de PO2: 21% O2 (Normoxia, ~150 mmHg), 6% O2 (~50 mmHg), 3% O2 (~25 mmHg) y 0% O2 (Hipoxia, ~10-15 mmHg). En la Figura 43, se muestra como la liberación de catecolaminas aumenta gradualmente a medida que los niveles de O2 disminuyen tanto en células control (Figura 43A y C) como KO/NDI1 (Figura 43B y C). Estos hallazgos confirman que la expresión de NDI1 restablece la Resultados 93 capacidad de las células KO de liberar catecolaminas en respuesta a la hipoxia aguda en un amplio rango de niveles de oxígeno. Figura 42. Respuesta neurosecretora de las células glómicas KO/NDI1. (A) Esquema de la liberación cuántica de dopamina a partir de una sola célula glómica. (B-F) Registros amperométricos representativos de la respuesta a hipoxia (PO2 ~15mmHg), CO2 (20%) y alto potasio (40K) de células glómicas de animales WT (azul), KO (amarillo), KO/NDI1 (naranja) y WT/NDI1 (rojo). (D) Inhibición de la respuesta secretora inducida por la hipoxia en células KO/NDI1 mediante el bloqueo de los canales de Ca2+ con cadmio (Cd2+) (200 μM). (G-J) Cuantificación de la tasa de secreción (pC/min) en condiciones basales (normoxia, pO2 ~ 21 mmHg), hipoxia, hipercapnia y alto potasio en los diferentes modelos estudiados. (G) Basal: WT, n = 26/21 células/ratones; KO, n =12/7 células/ratones; KO/NDI1, n=21/10 células/ratones; WT/NDI1, n=17/9 células/ratones. (H) Hipoxia: WT, n =25/21 células/ratones; KO, n = 12/7 células/ratones; KO/NDI1, n=11/6 células/ratones; WT/NDI1, n=17/9 células/ratones. (I) Hipercapnia: WT, n =11/9 células/ratones; KO, n =12/7 células/ratones.; KO/NDI1, n=11/6 células/ratones; WT/NDI1, n=13/9 células/ratones. (J) Alto potasio: WT, n=14/7 células/ratones; KO, n=10/7 células/ratones; KO/NDI1, n=9/6; WT/NDI1, n=15/9 células/ratones. Los datos se representan como media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. pA: picoamperios; pC: pico columbios. Resultados 94 Figura 43. Respuesta secretora inducida por distintas PO2 en las células glómicas KO/NDI1. (AB) Registros amperométricos representativos de la secreción de catecolaminas en células glómicas WT (A) y KO/NDI1 (B) expuestas a soluciones con niveles variables de PO2: Hipoxia (0% O2, ~15 mmHg), 3% O2 (~30 mmHg), 6% O2 (~50 mmHg), normoxia (21% O2, 150 mmHg). (C) Cuantificación de la tasa de secreción inducida por distintos niveles de O2 en células WT (azul) y KO/NDI1 (naranja). Hipoxia: WT, n=5/4 células/ratones; KO/NDI1, n=7/4 células/ratones; 3% O2: WT, n=5/4 células/ratones; KO/NDI1, n=6/4 células/ratones; 6% O2: WT, n=5/4 células/ratones; KO/NDI1, n=7/4 células/ratones; Normoxia: WT, n=5/4 células/ratones; KO/NDI1, n=7/4 células/ratones. Los datos se representan como media ± SEM. pA: picoamperios; pC: picocolumbios. Para comprender mejor cómo se restaura la respuesta celular a la hipoxia en el modelo KO/NDI1 y la relación entre NDI1 y la actividad del CMI, se investigó el efecto de la rotenona en las células glómicas de los modelos estudiados. Acorde a lo descrito en estudios previos (Ortega-Sáenz y cols., 2003), la rotenona aumentó la secreción de catecolaminas en las rodajas de CC control y bloqueó el efecto de la hipoxia (Figura 44A, E y F). Por el contrario, en células KO, la rotenona no tuvo ningún efecto debido a la ausencia de NDUFS2, que es el sitio de unión de esta droga (Figura 44B, E y F). Además, la combinación de hipoxia y rotenona no alteró la secreción basal en las rodajas KO (Figura 44B y F). Las células KO/NDI1, no respondieron a rotenona ya que NDI1 es insensible a esta sustancia (Figura 44C y E). No obstante, la respuesta a la hipoxia aguda en presencia de rotenona se mantuvo sin alteraciones en las células KO/NDI1 (Figura 44C y F), lo que indica que la restauración de la respuesta celular a la hipoxia en estas células se debe exclusivamente a la expresión de NDI1. Sorprendentemente, las Resultados 95 células WT/NDI1 mostraron una notable falta de sensibilidad a la rotenona en comparación con las células WT (Figura 44D y E). Además, la respuesta a la hipoxia no fue bloqueada en presencia de rotenona (Figura 44D y F). Estos experimentos apuntan a que cuando ambas deshidrogenasas están presentes, la enzima NDI1 es la responsable de casi toda la actividad NADH deshidrogenasa y por tanto desempeña el papel principal en la mediación de la respuesta neurosecretora ante la hipoxia aguda. Figura 44. Papel de la rotenona en la respuesta secretora de las células glómicas KO/NDI1. (AD) Registros amperométricos representativos de la secreción de catecolaminas en células glómicas WT (azul) (A), KO (amarillo) (B), KO/NDI1 (naranja) (C) y WT/NDI1 (rojo) (D) en rotenona (5 μM) y rotenona e hipoxia a la vez. (E y F) Cuantificación de la tasa de secreción (pC/min) inducida por rotenona (E) y rotenona+hipoxia (F) en células WT (n=7/7 células/ratones), KO (n=5/3 células/ratones), KO/NDI1 (n= 6/4 células/ratones) y WT/NDI1 (n= 8/5 células/ratones). Los datos se presentan como diagrama de cajas. Se indican los valores P estadísticamente significativos calculados mediante la prueba Mann-Whitney para muestras no pareadas. pA: picoamperios; pC: picocolumbios. El Ca2+ tiene un papel fundamental en el proceso de quimiotransducción de las células glómicas, ya que un incremento de Ca2+ intracelular (debido al flujo a través de canales iónicos) es el factor que desencadena la liberación de vesículas secretoras (Ureña y cols., 1994). Por este motivo, se monitorizaron los cambios en los niveles de Ca2+ citosólico que se producían en respuesta a diferentes estímulos en las células glómicas aisladas de ratones KO, KO/NDI1 y WT. Para ello se utilizó la técnica de microfluorimetría usando Resultados 96 la sonda fluorescente Fura-2AM (ver sección “Materiales y Métodos”). En las células glómicas control se produce un incremento reversible en los niveles de Ca2+ citosólico en respuesta a la hipoxia aguda (Figura 45A y D) y a otros estímulos despolarizantes como el 40K (Figura 45A y F) y el CO2 (20%) (Figura 45A y E). La abolición de la respuesta celular a hipoxia en células KO (Figura 45B y D) fue completamente restaurada en las células KO/NDI1 (Figura 45C y D), produciéndose un incremento en los niveles citosólicos de Ca2+ durante la hipoxia (Figura 45D). Tanto las células KO como las KO/NDI1 respondieron a CO2 y 40K (Figura 45E y F). Estos datos confirman que NDI1 tiene la capacidad de restaurar el incremento de Ca2+ citosólico en respuesta a hipoxia aguda abolido en las células KO. Figura 45. Medida de Ca2+ citosólico en las células glómicas KO/NDI1. (A-C) Registros microfluorimétricos representativos de los cambios de fluorescencia en el ratio 340/380, y por lo tanto de la [Ca2+] citosólico durante la exposición a hipoxia (Hx), hipercapnia (CO2) y alto potasio (40K) en células glómicas aisladas de ratones WT (A), KO (B) y KO/NDI1 (C). (D-F) Cuantificación del aumento de la [Ca2+] citosólico inducido por la hipoxia (D), hipercapnia (E) y 40K (F). Los datos se representan como media ± SEM. Ratones WT (azul, n=15/3 células/ratones), ratones KO (amarillo, n=31/3 células/ ratones) y ratones KO/NDI1 (naranja, n=22/4 células/ratones). Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. Resultados 97 1.1.5. Recuperación de la señalización mitocondrial en hipoxia aguda en las células TH-NDUFS2/NDI1 En el apartado "Introducción", se describió en detalle el modelo de señalización mitocondria-membrana en las células glómicas, resaltando la importancia del NADH y ROS mitocondrial en la regulación de los canales iónicos para activar al CC durante la hipoxia aguda (Fernández-Agüera y cols., 2015; Moreno-Domínguez y cols., 2020). Por lo tanto, nuestro siguiente objetivo fue investigar la respuesta mitocondrial en las células glómicas de ratones KO/NDI1 frente a la hipoxia aguda. Utilizamos técnicas microfluorimétricas para estudiar los cambios en los niveles de NADH citosólico y ROS en diferentes compartimentos mitocondriales (matriz mitocondrial y EIM). En primer lugar, se monitorizaron los niveles de NADH citosólicos basales y durante la exposición a la hipoxia aguda en células aisladas de los diferentes modelos de interés. Las células glómicas de animales KO tenían aumentados los niveles de basales de NADH en comparación con las células control (Figura 46E). Debido a la falta de un CMI funcional, el NADH no se oxida y se produce su acumulación (Fernández-Agüera y cols., 2015). Sin embargo, en las células glómicas KO/NDI1 se restauraron los niveles basales de NADH (Figura 46E) confirmando que NDI1 se integra en la CTE, actúa como NADH deshidrogenasa y mantiene los niveles de NADH basales similares a los de las células control. En las células WT/NDI1 los niveles de NADH en normoxia eran comparables a los de las células WT y KO/NDI1 (Figura 46E). Durante la hipoxia, el aumento en los niveles de NADH citosólico en las células WT (Figura 46A y F) estaba prácticamente abolido en las células KO (Figura 46B y F), como se había descrito previamente (Fernández-Agüera y cols., 2015). Sin embargo, al exponer a las células KO/NDI1 a hipoxia aguda, se reestableció la acumulación de NADH (Figura 46C y F). Sorprendentemente, se observó que en las células KO/NDI1, la hipoxia aguda inducía un incremento de NADH de mayor magnitud y velocidad que en las células control (Figura 46C y F). Del mismo modo, en las células WT/NDI1, el aumento de NADH ante la disminución aguda de O2, era similar al del modelo KO/NDI1 tanto en la amplitud como en la cinética (Figura 46D y F). Por lo tanto, durante la hipoxia aguda, NDI1 restaura la acumulación de NADH en las células KO, con respuestas de mayor amplitud y velocidad en comparación con las células control. Resultados 98 Figura 46. Medida de los niveles de NADH citosólico en respuesta a la hipoxia aguda de las células glómicas KO/NDI1. (A-D) Registros microfluorimétricos representativos del incremento de la autofluorescencia de NADH citosólico ante la hipoxia (Hx PO2 ~15mmHg), en células glómicas aisladas WT (A), KO (B), KO/NDI1 (C) y WT/NDI1 (D). (E) Cuantificación de los niveles basales de autofluorescencia de NADH (unidades arbitrarias, u.a.) en normoxia (PO2 ~150 mmHg) registrados en células glómicas control (azul, n =17/6 células/ratones), KO (amarillo, n=31/6 células/ratones), KO/NDI1 (naranja, n=32/6 células/ratones) y WT/NDI1 (rojo, n=40/7 células/ratones). Los datos se expresan como media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. (F) Cuantificación del aumento de la autofluorescencia de NADH en células glómicas aisladas en respuesta a la hipoxia (Hx) en los diferentes modelos. La n empleada en este caso es idéntica a la del panel E. Los datos se presentan como diagramas de caja, en los que se indica la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores extremos mínimo y máximo (bigotes). Los valores P indicados se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. post hoc test. La velocidad de producción de NADH durante la hipoxia de las células WT y KO/NDI1 se midió como el aumento de NADH (unidades arbitrarias) desde el comienzo de la hipoxia (tiempo 0 s) hasta los 37 s desde el inicio de este estímulo. La velocidad media de incremento de NADH fue mayor en las células KO/NDI1 (1,3 u.a./s) que en las células WT (0,5 u.a./s) (Figura 47). Resultados 99 Figura 47. Cinética en la producción de NADH durante la hipoxia en células WT y KO/NDI1. Cuantificación de la velocidad de incremento de NADH en respuesta a hipoxia aguda en los primeros 37 s de estímulo registrado en células glómicas WT (azul, n= 17) y KO/NDI1 (naranja, n=32). Los datos se expresan como media ± SEM. El valor P estadísticamente significativo fue calculado mediante la prueba t Student (two-tail) para muestras no pareadas. A continuación, se estudió el efecto de la rotenona sobre el incremento de NADH inducido por hipoxia en las células glómicas aisladas de los modelos de interés. La rotenona ocasionó un incremento del NADH citosólico y bloqueó cualquier efecto adicional de la hipoxia (Figura 48A, E y F). En cambio, en las células KO, ni la rotenona ni la aplicación combinada de hipoxia y rotenona produjeron cambios en los niveles basales de NADH (Figura 48B, E y F). En las células aisladas KO/NDI1, la rotenona no alteró el nivel de NADH basal y no se ocluyó la respuesta la hipoxia aguda (Figura 48C, E y F). Los resultados sugieren que en ausencia NDUFS2, NDI1 mantiene una actividad NADH deshidrogenasa insensible a la rotenona, capaz de producir un aumento de NADH en respuesta a la hipoxia aguda. Además, se observó que en las células WT/NDI1 la aplicación de rotenona no generó un aumento en los niveles de NADH (Figura 48D y E) y la respuesta a la hipoxia se mantuvo sin alteraciones (Figura 48D, E y F). Estos experimentos como se mencionó anteriormente (Figura 44), demostraron que cuando ambas enzimas están presentes (CMI y NDI1), la deshidrogenasa de levadura asume el papel principal en la producción de NADH en respuesta a la hipoxia aguda. Posteriormente, se examinaron los cambios en ROS en los diferentes compartimentos mitocondriales durante la hipoxia aguda en las células glómicas mediante el uso de la sonda fluorescente roGFP (ver “Materiales y Métodos”). De acuerdo con los datos previamente descritos (Arias-Mayenco y cols., 2018; Fernández-Agüera y cols., 2015). la hipoxia aguda induce un aumento en la señal de ROS en el EIM en las células glómicas control (Figura 49A y E), que se reduce significativamente en las células glómicas KO (Figura 49B y E). La expresión de NDI1 en células deficientes en NDUFS2, restableció la producción de ROS en el EIM en respuesta a la disminución de O2 (Figura 49C y E). Resultados 106 animales ESR-KO, ESR-KO/NDI1 y ESR-WT. La respuesta hiperventilatoria característica de los animales control frente a la hipoxia aguda (Figura 55A y G), abolida en el modelo ESR-KO (Figura 55B y G), fue restaurada en los animales ESR-KO/NDI1 (Figura 55C y G). Por otro lado, los animales ESR-KO presentaron una frecuencia ventilatoria basal (21% O2) disminuida en comparación con los animales ESR-WT (Figura 55G), que se recuperó mediante la expresión de NDI1 en el modelo ESRKO/NDI1 (Figura 55G), tal y como sucedía en el modelo embrionario. Los resultados de la Figura 55 muestran que tanto los animales ESR-KO (Figura 55E y H) como los ESR-KO/NDI1 (Figura 55F y H) mantenían una respuesta hiperventilatoria a la hipercapnia similar a la registrada en los ratones ESR-WT (Figura 5D y H). Los datos obtenidos confirman que la expresión de NDI1 en la etapa adulta restablece la respuesta sistémica a la hipoxia aguda de manera similar a lo observado en el modelo embrionario KO/NDI1. 1.2.4. Restauración de la respuesta neurosecretora y mitocondrial a la hipoxia aguda en el modelo ESR-NDUFS2/NDI1 Para evaluar si la restauración del HVR en el modelo adulto ESR-KO/NDI1 se correlacionaba con una recuperación de la capacidad de detectar y señalizar durante la hipoxia aguda de las células glómicas, se analizó la respuesta neurosecretora y la producción de moléculas de señalización mitocondriales (NADH) en el modelo ESRKO/NDI1. En primer lugar, se estudió la actividad neurosecretora de las células glómicas en rodajas de CC de animales ESR-WT, ESR-KO y ESR-KO/NDI1, frente a distintos estímulos. En la Figura 56 se observa que las rodajas ESR-WT respondieron con normalidad a la hipoxia, CO2 y alto potasio (Figura 56A, E y F), mientras que, las células glómicas ESRKO son insensibles a la hipoxia aguda, como se había reportado en investigaciones anteriores (Arias-Mayenco y cols., 2018; Fernández-Agüera y cols., 2015), pero mantienen sin alteraciones la respuesta a CO2 y 40K (Figura 56B, E y F). La expresión de NDI1 en las células ESR-KO/NDI1, restauró la respuesta neurosecretora a la hipoxia (Figura 56C y E). Las células ESR-KO/NDI1 mostraron una respuesta secretora a CO2 ligeramente menor a la observada en los otros grupos (Figura 56F). Estos resultados concuerdan con los hallazgos descritos en las células KO/NDI1 del modelo embrionario, donde también se observó una respuesta reducida a la hipercapnia (Figura 42I). Resultados 107 Figura 55. Respuesta ventilatoria a la hipoxia aguda y a la hipercapnia en animales ESR-KO y ESR-KO/NDI1. (A-C) Promedio de registros pletismográficos del cambio en la frecuencia respiratoria (respiraciones/min) durante hipoxia (~ 10% O2) en animales ESR-WT (azul, n = 10) (A), ESR-KO (amarillo, n=8) (B) y ESR-KO/NDI1 (naranja, n=13) (C). Los cambios en la tensión de O2 con respecto al tiempo se representan en la parte inferior. (D-F) Registros pletismográficos promedio representativos de la respuesta ventilatoria (respiraciones/min) a la hipercapnia (5% CO2) en animales ESR-WT (azul, n = 7) (D), ESR-KO (amarillo, n=8) (E) y ESR-KO/NDI1 (naranja, n=12) (F). En la parte inferior se muestran los cambios % CO2 con el tiempo. (G) Cuantificación de la frecuencia respiratoria media durante la normoxia (Nx, 21% O2) y la hipoxia (Hx). El n de animales se indica en los paneles A-B. (H) Cuantificación de la frecuencia respiratoria media durante la normoxia (Nx, 21% O2) y la hipercapnia. El número de animales utilizados se indica en los paneles D-F. Cada dato se representa como media ± SEM. Se indican los valores P estadísticamente significativos calculados mediante la prueba t Student (two-tail) para muestras no pareadas. Resultados 108 Los experimentos con rotenona, mostraron que en las rodajas de CC ESR-WT la aplicación de este inhibidor, induce un aumento en la tasa de secreción basal de catecolaminas e inhibe la respuesta a hipoxia (Figura 57A, D y E). En las células glómicas ESR-KO, ninguno de los estímulos (rotenona y rotenona+hipoxia) afectó la secreción basal de estas células (Figura 57B, D y E). Sin embargo, al igual que en el modelo embrionario KO/NDI1 (ver Figura 44C), la rotenona no indujo un aumento en la secreción, ni ocluyó la respuesta a la hipoxia en las células glómicas ESR-KO/NDI1 (Figura 57C, D y E). Estos resultados confirman que en el modelo ESR-KO/NDI1, la recuperación de la respuesta neurosecretora depende exclusivamente de la proteína NDI1, en línea con lo observado en el modelo embrionario KO/NDI1. Figura 56. Respuesta neurosecretora a hipoxia y otros estímulos en células glómicas WT, ESRKO y ESR-KO/NDI1. (A-C) Registros amperométricos representativos de las respuestas a hipoxia, CO2 y 40K en rodajas de CC de ratones ESR-WT (azul) (A), ESR-KO (amarillo) (B) y ESR-KO/NDI1 (naranja) (C). (D-F) Cuantificación de la tasa de secreción media en condiciones basales (normoxia), hipoxia e hipercapnia en los diferentes modelos adultos estudiados. Basal (D) e Hipoxia (E): ESRWT, (n=11/9 células/ratones); ESR-KO (n=8/4 células/ratones); ESR-KO/NDI1 (n=11/5 células/ratones). Hipercapnia (F): ESR-WT (n =8/7 células/ratones); ESR-KO (n=8/4 células/ratones); ESR-KO/NDI1 (n=6/4 células/ratones). Los datos se presentan como la media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. Resultados 109 Figura 57. Efecto de la rotenona en la respuesta neurosecretora de las células glómicas ESRKO/NDI1. (A-D) Registros amperométricos representativos de la secreción de catecolaminas en células glómicas ESR-WT (A), ESR-KO (B) y ESR-KO/NDI1 (C) en respuesta a hipoxia, en presencia de rotenona (5 μM) y durante la aplicación simultánea de rotenona e hipoxia. (D-E) Cuantificación de la tasa de secreción inducida por rotenona (D) en células ESR-WT (n=4/3 células/ratones), ESR-KO (n=6/3 células/ratones), ESR-KO/NDI1 (n=6/4 células/ratones) y por rotenona+hipoxia (E) en células ESR-WT (n = 4/3 células/ratones), ESR-KO (n=6/3 células/ratones), ESR-KO/NDI1 (n=5/3 células/ratones). Los datos se presentan como la media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. En el modelo ESR-KO/NDI1, se estudió el papel de NDI1 en la señalización mitocondrial hipóxica mediante el registro de NADH citosólico. Durante la hipoxia aguda, las células ESR-KO/NDI1 mostraron un incremento reversible en los niveles de NADH (Figura 58B y D), con una amplitud mayor a la de la respuesta observada en las células ESR-WT (Figura 58A y D). Estos resultados concuerdan con los patrones cinéticos de producción de NADH observados en los modelos embrionarios que expresan NDI1 (KO/NDI1 y WT/NDI1) (ver Figura 46). Además, en las células glómicas ESR-WT, la aplicación de rotenona provocó un aumento en los niveles basales de NADH y la abolición de la respuesta hipóxica (Figura 58A). Sin embargo, en el modelo ESR-KO/NDI1, la rotenona no afectó los niveles basales de NADH (Figura 58B), pero el aumento de NADH en respuesta a la disminución de O2, se mantuvo sin cambios (Figura 58B). Estos resultados confirman que, al igual que en el modelo embrionario, la proteína NDI1 desempeña un papel fundamental en la acumulación de NADH durante la hipoxia en el modelo ESRKO/NDI1. Resultados 110 En investigaciones previas de nuestro grupo, se describió que en las células ESR-KO, los niveles de NADH citosólico estaban disminuidos en comparación con el modelo embrionario KO, pero aún continuaban siendo más altos que los registrados en las células ESR-WT (Fernández-Agüera y cols., 2015). En las células ESR-KO/NDI1 se observó una recuperación de los niveles basales de NADH alcanzando valores similares a los de las células ESR-WT (Figura 58C). Todos estos resultados demuestran que la expresión de NDI1 en células glómicas deficientes en CMI, restablece la respuesta mitocondrial a la hipoxia y los niveles basales de NADH alterados en el modelo ESR-KO. Figura 58. Producción de NADH en respuesta a hipoxia aguda en el modelo ESR-KO/NDI1. (AB) Registros microfluorimétricos de los cambios en NADH inducidos por hipoxia (Hx), rotenona (1 μM) y rotenona+hipoxia en células glómicas ESR-WT (A) y ESR-KO/NDI1 (B). (C) Cuantificación del nivel basal de autofluorescencia de NADH en células aisladas ESR-WT (azul, n=26/5 células/ratones) y ESR-KO/NDI1 (naranja, n=26/7 células/ratones). (D) Cuantificación del aumento de autofluorescencia de NADH en respuesta a hipoxia aguda en células aisladas ESR-WT y ESRKO/NDI1 (la n, corresponde al mismo valor que en el panel C). Los datos se presentan como gráficos de caja, en los que se indica la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores extremos mínimo y máximo (bigotes). Se indican los valores P estadísticamente significativos calculados mediante la prueba Mann-Whitney para muestras no pareadas. 1.3. Recuperación de otros parámetros celulares y sistémicos alterados en ratones deficientes de CMI con la expresión de NDI1 La eliminación de la subunidad NDUFS2 en las células glómicas del modelo KO afecta al ensamblaje del CMI, lo que resulta en una disminución significativa de su actividad NADH deshidrogenasa (Fernández-Agüera y cols., 2015). Investigamos como la Resultados 111 disfunción del CMI y la expresión de NDI1 influyen en el metabolismo de las células glómicas. También evaluamos si la expresión de NDI1 en otros tejidos catecolaminérgicos, podría restaurar las alteraciones sistémicas asociadas a la falta de CMI, más allá de su papel en la sensibilidad a la hipoxia aguda. 1.3.1. Alteraciones metabólicas asociadas a la deleción del CMI En las células glómicas deficientes en NDUFS2, se observaron niveles elevados de NADH en condiciones basales (ver Figura 46E), lo que sugiere una alteración en la función del CMI y en consecuencia una posible disminución en la OXPHOS. No obstante, se ha descrito que la medida bioquímica de los niveles de ATP en muestras de CCs completos del modelo KO, es similar a la observada en las muestras de CCs control. (Fernández-Agüera y cols., 2015). Para investigar si realmente se produce una disminución en la OXPHOS o si hay algún cambio metabólico que mantenga los niveles normales de ATP en el modelo KO, se midió el ATP citosólico (expresado como ratio ATP/ADP) en células glómicas, utilizando la técnica de fluorescencia de dos fotones y el biosensor fluorescente PercevalHR (González-Rodríguez y cols., 2021). Se emplearon inhibidores específicos de la OXPHOS y la glucólisis, como la oligomicina y la 2deoxiglucosa (2-DG), respectivamente, para determinar la contribución de cada vía en la producción de ATP (índice OXPHOS) en las células glómicas de los diferentes genotipos (ver sección “Materiales y Métodos”). En las células glómicas control la inhibición del CMV por oligomicina causó una caída drástica en los niveles de ATP. La aplicación de 2-DG acentuó aún más la reducción del ratio ATP/ADP (Figura 59A). Al comparar la contribución de la OXPHOS y la glucólisis en la producción de ATP en estas células, a través del índice OXPHOS, se observó que en las células control la producción de ATP se realiza tanto por fosforilación oxidativa como por glucólisis (Figura 59B). En células glómicas KO, la relación ATP/ADP disminuyó únicamente en respuesta a la inhibición de la glucólisis al aplicar 2-DG (Figura 59A), mientras que la aplicación de oligomicina resultó en un ligero aumento en la relación ATP/ADP (Figura 59A). El índice OXPHOS de las células KO fue menor que en las células WT, siendo curiosamente negativo (Figura 59B), lo que sugiere que la producción de ATP en estas células depende principalmente del metabolismo glucolítico (ver “Discusión”). Las células KO/NDI1 también mostraron una reducción en la relación Resultados 112 ATP/ADP tras la aplicación de oligomicina, de manera similar a las células control. La aplicación de 2-DG sobre las células KO/NDI1, disminuyó aún más los niveles de ATP (Figura 59A). El valor del índice OXPHOS en las células KO/NDI1 fue similar al observado en las células control (Figura 59B), lo que sugiere, que NDI1 restaura la producción de ATP dependiente de la OXPHOS en células deficientes en CMI. En conjunto, todos estos resultados revelan que en ausencia de un CMI funcional, el metabolismo de las células glómicas es principalmente glucolítico. Sin embargo, la expresión de NDI1 restablece la funcionalidad de la CTE, lo que permite que la bioenergética celular vuelva a depender también de la OXPHOS. Figura 59. Cambio metabólico en las células glómicas KO ante la deficiencia de NDUFS2. (A) Medida representativa de los cambios en el ratio ATP/ADP con respecto al tiempo en células glómicas control (trazo azul), KO (trazo amarillo) y KO/NDI1 (trazo naranja) tras la aplicación de oligomicina (10 μM) y 2-deoxiglucosa (2-DG, 5mM). (B) Distribución del índice OXPHOS (%): (OXPHOS/ (OXPHOS + glucólisis)), en células WT (azul, n = 8/5 células/ratones), KO (amarillo, n=8/4 células/ratones) y KO/NDI1 (naranja, n=9/4 células/ratones). Los datos se presentan como gráficos de caja, en los que se indica la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores extremos mínimo y máximo (bigotes). Los valores P indicados se calcularon mediante la prueba de KruskalWallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn post hoc test. El piruvato, que es el producto final de la glucólisis, se utiliza en el ciclo de Krebs y en la OXPHOS en las células con un metabolismo oxidativo elevado. Sin embargo, en las células con un metabolismo mitocondrial más reducido, el piruvato se convierte en lactato y se secreta para ser utilizado por otras células, evitando su acumulación en el citosol de las células productoras (Torres-Torrelo y cols., 2021). Por tanto, si el metabolismo de los animales KO es fundamentalmente glucolítico, cabría esperar un incremento de los niveles de lactato en sangre (lactatemia) en estos animales. Para evaluar esta hipótesis, se Resultados 113 llevó a cabo la medida in vivo de los niveles de lactato en los animales KO y KO/NDI1. En la Figura 60 se evidencia un aumento en la concentración de lactato en sangre en los animales KO en comparación con los animales control. La expresión de NDI1 en el modelo KO/NDI1 restaura a valores normales la hiperlactatemia típica de los ratones KO. Estos resultados confirman que, en los animales KO, predomina un metabolismo principalmente glucolítico en las células deficientes en CMI, mientras que en los animales KO/NDI1, la proteína NDI1 favorece una transición hacia un metabolismo oxidativo. Figura 60. Niveles de lactato en sangre en los modelos embrionarios KO y KO/NDI1. Medida de los niveles sanguíneos de lactato (mM) en normoxia en animales WT (azul, n=15), KO (amarillo, n=13) y KO/NDI1 (naranja, n=16). Los datos se presentan como la media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. Como se mencionó previamente, los niveles de ATP medidos en muestras de CCs de animales KO, eran similares a los de los controles (Fernández-Agüera y cols., 2015). Debido al tamaño pequeño y la heterogeneidad celular del CC, para facilitar el procedimiento experimental utilizamos muestras de riñón de los modelos adultos de interés. En los riñones de animales ESR-KO, los niveles de ATP fueron comparables a los del ESR-WT (Figura 61), lo cual concuerda con los datos obtenidos en el modelo embrionario. Además, la expresión de NDI1 no se asoció con una disminución en los niveles de ATP de los riñones de animales KO/NDI1 y WT/NDI1 (Figura 61). Investigaciones recientes han demostrado que la eliminación de la subunidad NDUFS4 provoca una disminución en la temperatura corporal de los animales (Jain y cols., 2106), Para confirmar si este fenómeno ocurre en nuestro modelo KO-NDUFS2, evaluamos la temperatura corporal de estos ratones. En la Figura 62 se ilustra que en los animales deficientes en NDUFS2, la temperatura corporal era significativamente inferior a la de los animales control. La expresión de la proteína NDI1 en el modelo KO, reestableció la temperatura corporal a valores similares a los de los ratones WT. Resultados 114 Figura 61. Cantidad de ATP en muestras de riñón de los ratones adultos estudiados. Comparación de los niveles de ATP entre muestras de riñón de animales ESR-WT (azul, n=4), ESRKO (amarillo, n=4), ESR-KO/NDI1 (naranja, n=4), ESR-WT/NDI1 (rojo, n=4). Los datos se presentan como la media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. Figura 62. Análisis de la temperatura corporal en los modelos embrionarios KO y KO/NDI1. Medida de la temperatura corporal (ºC) en animales de WT (azul, n=14), KO (amarillo, n=16) y KO/NDI1 (naranja, n=12). Los datos se presentan como la media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. 1.3.2. Anomalías en la regulación del crecimiento asociadas a la disfunción del CMI En animales con disfunción en los complejos mitocondriales II y III, se ha observado una reducción en el tamaño y el peso, asociada con una disminución de los niveles plasmáticos de la hormona de crecimiento (GH, del inglés growth hormone) (CabelloRivera y cols., 2022; Díaz-Castro y cols., 2012). Por tanto, investigamos si el enanismo asociado con la eliminación del gen Ndufs2 también estaba relacionado con una disminución en los niveles de GH y del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1). En la Figura 63A se observa una tendencia hacia una disminución de los niveles de GH en el modelo KO, aunque no se encontraron diferencias significativas entre los grupos WT y KO, posiblemente debido a la variabilidad entre las muestras. El análisis de los niveles de IGF-1 en suero mostró una reducción significativa de IGF-1 en los animales KO en comparación con los controles (Figura 63B). En el modelo KO/NDI1 la Resultados 115 concentración de IGF-1, recupera valores similares a los de los animales WT (Figura 63B). La normalización de los niveles de IGF-1 en ratones KO/NDI1 posiblemente pueda contribuir a la restauración del peso corporal en los animales KO. Sin embargo, no se realizó un análisis exhaustivo de las posibles causas del enanismo fenotípico y hormonal en los animales KO, ni se investigó en detalle la recuperación de este defecto en los animales KO/NDI1. Figura 63. Niveles plasmáticos de GH e IGF-1 en los modelos embrionarios WT, KO y KO/NDI1. (A) Concentración de GH en suero de animales WT (azul, n=22), KO (amarillo, n=17) y KO/NDI1 (naranja, n=9). (B) Concentración de IGF-1 en suero normalizados con respecto al control en animales WT (n=11), KO (n=10) y KO/NDI1 (n=9). Los datos se presentan como la media ± SEM. Los valores P representados se calcularon usando One way ANOVA seguido de Tukey’s post hoc test. 1.3.3. Adaptaciones sistémicas a la hipoxia crónica Una de las principales adaptaciones a la hipoxia crónica es el aumento de la eritropoyesis como mecanismo compensatorio ante la mayor demanda de O2 (López-Barneo y cols., 2001; Semenza y Wang 1992). En animales que carecen de respuesta ventilatoria a hipoxia aguda, se ha descrito un incremento mayor del hematocrito al someterlos a un ambiente hipóxico de forma crónica (Macias y cols., 2018). Por este motivo, evaluamos el cambio en el hematocrito en respuesta a hipoxia crónica (~10% O2 durante 10 días) de los animales KO para NDUFS2 que carecen de HVR, y lo comparamos con los de los animales WT y KO/NDI1. En la Figura 64 se muestra como en los tres grupos de animales estudiados los valores de hematocrito medidos en normoxia (21% O2) oscilaban entre un 52-54%. Tras la exposición a hipoxia crónica, los ratones KO mostraron un incremento mayor del hematocrito en sangre (80%) en comparación con el aumento observado en los ratones control (70%). El incremento de hematocrito se restableció en el modelo KO/NDI1 a valores similares a los observados en animales control (Figura Resultados 122 3.1.2. Caracterización molecular del modelo COX4I2-UBC-CRE-ERT2 Antes de realizar los experimentos funcionales, se estudiaron los niveles de expresión de Cox4i2 (nuestra proteína de interés) y Cox4i1 (isoforma común de COX4 ampliamente expresada) en diferentes tejidos del modelo KO/COX4I2-UBC-CRE mediante qPCR. En primer lugar, se observó una disminución en los niveles de ARNm de Cox4i2 tanto en las muestras de GCS (Figura 71A) como en las muestras de MA (Figura 71C) del modelo KO/COX4I2-UBC-CRE, en comparación con los controles. Sin embargo, los niveles de Cox4i1 no mostraron cambios significativos en ninguna de las muestras de GCS o MA en los modelos estudiados (Figuras 71B y 71D). Además, en el modelo KO/COX4I2UBC-CRE, se observó una disminución significativa de Cox4i2 en las muestras de riñón (Figura 71E), mientras que los niveles de Cox4i1 no se vieron afectados (Figura 71F). Estos resultados demuestran que en el modelo adulto KO/COX4I2-UBC-CRE la aplicación de TMX produce una eliminación ubicua de la subunidad COX4I2, sin afectar la expresión de la isoforma COX4I1. 3.1.3. Respuesta sistémica y celular a la hipoxia aguda del modelo COX4I2-UBCCRE-ERT2 Para investigar si la disminución de la respuesta sistémica a la hipoxia aguda, observada en el modelo embrionario con deleción del gen Cox4i2 (Moreno-Domínguez y cols., 2020), también ocurría al eliminar COX4I2 en la vida adulta, se llevó cabo un estudio pletismográfico analizando la frecuencia ventilatoria de los animales KO/COX4I2-UBCCRE en los tres períodos de tiempo previamente mencionados (Figura 70). En este análisis, observamos que una parte de los animales KO/COX4I2-UBC-CRE mantuvieron una respuesta aparentemente normal a la hipoxia, mientras que en otros esta respuesta se redujo considerablemente. La Figura 72 muestra el porcentaje de animales KO/COX4I2UBC-CRE con respuesta sistémica normal a la hipoxia en los tres períodos de tiempo evaluados. Entre el 40-60% de los animales mantuvieron la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia aguda cualitativamente normal (mantenida en el tiempo aunque en promedio inferior a la de los animales control, ver abajo), independientemente del tiempo transcurrido desde el final del tratamiento con tamoxifeno. Resultados 123 Figura 71. Caracterización molecular mediante PCR cuantitativa en muestras de tejidos catecolaminérgicos y de riñón del modelo KO/COX4I2-UBC-CRE. (A y B) Niveles relativos de ARNm del gen Cox4i2 (A) y Cox4i1 (B) en muestras de GCS de animales WT-UBC-CRE (azul, n=4 replicas/grupo), HET-UBC-CRE (verde, n= 4 replicas/grupo) y KO/COX4I2-UBC-CRE (rosa, n= 3 replicas /grupo) (B). (C y D) Niveles relativos de ARNm del gen Cox4i2 (C) y Cox4i1 (D) en muestras de MA de animales WT-UBC-CRE (azul, n=4 replicas/grupo), y KO/COX4I2-UBC-CRE (rosa, n= 8 replicas /grupo). (E y F) Niveles relativos de ARNm del gen Cox4i2 (E) y Cox4i1 (F) en muestras de riñón de animales WT-UBC-CRE (azul, n=4 replicas/grupo), y KO/COX4I2-UBC-CRE (rosa, n= 8 replicas/grupo). Los datos se presentan como diagramas de caja, en los que se indica la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores extremos mínimo y máximo (bigotes). Los valores P indicados se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn post hoc test (A y B) y la prueba Mann-Whitney para muestras no pareadas (C-F). Resultados 124 Figura 72. Evolución de la respuesta sistémica a la hipoxia aguda a diferentes tiempos tras finalizar la dieta con tamoxifeno en el modelo KO/COX4I2-UBC-CRE. Porcentaje de animales KO/COX4I2-UBC-CRE que mantienen una respuesta hiperventilatoria a hipoxia aguda (Hx) en tres puntos temporales diferentes tras finalizar el tratamiento con tamoxifeno: 1-2 meses (n=7/14), 3-5 meses (7/11) y a los 9 meses (n=7/14). Al no encontrarse una correlación entre el tiempo de lavado de la proteína y la pérdida de la respuesta sistémica a la hipoxia aguda, se dividió a los animales en tres grupos: animales control, animales KO/COX4I2-UBC-CRE con respuesta ventilatoria a la hipoxia cualitativamente normal mantenida pero de menor amplitud (si HVR) y animales KO/COX4I2-UBC-CRE con una respuesta muy alterada (no HVR). Durante la hipoxia aguda, todos los animales control (Figura 73A, D y E) y el 43% de los animales KO/COX4I2-UBC-CRE (si HVR) (Figura 73B, D y E) mostraron un aumento mantenido y reversible de la frecuencia ventilatoria. Sin embargo, en estos animales KO/COX4I2-UBC-CRE (si HVR) el incremento fue menor que el observado en los animales control (Figura 73D). El 57% de los animales KO/COX4I2-UBC-CRE (no HVR), mostraron una alteración en la respuesta sistémica a la hipoxia aguda (Figura 73C y D). Se observó un pico inicial de hiperventilación al comienzo de la exposición a la hipoxia, pero no se mantuvo con el tiempo. Esta respuesta fue similar a la descrita en el modelo embrionario KO-COX4I2 (Moreno-Domínguez y cols., 2020). La respuesta a CO2 se mantuvo sin cambios en todos los animales KO/COX4I2-UBC-CRE, independientemente de su respuesta a la hipoxia aguda (Figura 73F, G y H). Para determinar si las diferencias en la respuesta hiperventilatoria a hipoxia registrada en los animales KO/COX4I2-UBC-CRE, podrían estar relacionadas con la deleción de Cox4i2, se reanalizaron los datos de qPCR (previamente mostrados). Se separaron las muestras del modelo KO/COX4I2-UBC-CRE en dos grupos en función de su respuesta registrada en la pletismografía: aquellos que respondían a hipoxia de forma mantenida (si HVR) y aquellos en los que la respuesta estaba muy alterada (no HVR). Los niveles de ARNm de Cox4i2 disminuyeron en las muestras de MA (Figura 74A) y riñón (Figura Resultados 125 74C) de los animales KO/COX4I2-UBC-CRE, independientemente su respuesta hiperventilatoria a la hipoxia aguda. Además, no se observaron cambios en los niveles de Cox4i1 en las muestras de MA (Figura 74B) ni en las de riñón (Figura 74D) de los animales KO/COX4I2-UBC-CRE. Figura 73. Respuesta sistémica a la hipoxia aguda y a la hipercapnia en el modelo KO/COX4I2UBC-CRE. (A-C) Promedio de registros pletismográficos del cambio en la frecuencia respiratoria (respiraciones/min) durante hipoxia (~ 10% O2) en animales WT-UBC-CRE (azul, n=13) (A), KO/COX4I2-UBC-CRE (si HVR normal, rosa oscuro, n=9) (B) y KO/COX4I2-UBC-CRE (no HVR, respuesta a hipoxia alterada, rosa claro, n=12) (C). (D) Cuantificación de la frecuencia respiratoria en normoxia (Nx, 21% O2) e hipoxia (Hx) (n indicada en paneles A-C). (E) Porcentaje de animales WTUBC-CRE y KO/COX4I2-UBC-CRE que responde a Hx normal. (F) Promedio de los cambios en la frecuencia ventilatoria medida en (respiraciones/minuto) durante la hipercapnia (5% CO2) en animales WT-UBC-CRE (n=10) (A), KO/COX4I2-UBC-CRE (si HVR, n= 11) (B) y KO/COX4I2-UBC-CRE (no HVR, n=7) (C). (G) Cuantificación de la frecuencia respiratoria media (respiraciones/minuto) registrada en normoxia (Nx) e hipercapnia (CO2). (n indicada en panel F). (H) Porcentaje de animales WT-UBC-CRE y KO/COX4I2-UBC-CRE que responden a CO2. Cada dato se representa como media ± SEM. Se indican los valores P estadísticamente significativos calculados mediante la prueba t Student (two-tail) para muestras pareadas. Resultados 126 Figura 74. Nivel de expresión de los genes Cox4i2 y Cox4i1 en muestras de MA y riñón del modelo KO/COX4I2-UBC-CRE según su respuesta sistémica a la hipoxia aguda. (A -D) Niveles relativos de ARNm del gen Cox4i2 (A y C) y Cox4i1 (B y D) en muestras de MA (A y B) y riñón (C y D) de animales WT-UBC-CRE (azul), KO/COX4I2-UBC-CRE (si HVR normal, rosa oscuro) y KO/COX4I2-UBC-CRE (no HVR, respuesta a hipoxia alterada, rosa claro). N=4 replicas /grupo en todos los paneles (A-D), excepto en panel D muestras WT-UBC-CRE (n=8 replicas /grupo). Los datos se presentan como diagrama de cajas, en los que se indica la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores extremos mínimo y máximo (bigotes). Los valores P indicados se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn post hoc test. Posteriormente, examinamos si los animales KO/COX4I2-UBC-CRE con una respuesta sistémica alterada a la hipoxia (no HVR), mostraban también una falta de sensibilidad a nivel celular. Las células glómicas de los animales WT-UBC-CRE mostraron un aumento en secreción en respuesta a la hipoxia aguda (Figura 75A y C). Por el contrario, en las células KO/COX4I2-UBC-CRE (no HVR) se observó una falta notable de sensibilidad a este estímulo (Figura 75B y C), aunque respondieron normalmente a 40K, hipoglucemia y CO2 (Figura 75B). Estos resultados (todavía preliminares debido al relativamente bajo número de experimentos realizados hasta la fecha) indican que existe una correlación entre la disminución de la respuesta sistémica a la hipoxia y la reducción de la sensibilidad a la hipoxia a nivel celular en el modelo adulto KO/COX4I2-UBC-CRE, en línea con lo descrito previamente en el modelo embrionario (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Resultados 127 Figura 75. Respuesta neurosecretora a la hipoxia aguda y a otros estímulos de rodajas de CC de animales KO/COX4I2-UBC-CRE (no HVR). (A) Registro amperométrico representativo de la respuesta a hipoxia (pO2 ~15mmHg), CO2 (20%) y alto potasio (40K) de células glómicas de animales WT-UBC-CRE (azul, n= 5/4 células/ratones). (B) Registro amperométrico representativo de la respuesta a hipoxia (pO2 ~15mmHg), hipoglucemia (0 Glu), CO2 (20%) y alto potasio (40K) en células glómicas de animales KO/COX4I2-UBC-CRE (no HVR, respuesta a hipoxia alterada, rosa claro, n=7/3 células/ratones). (C) Porcentaje de células glómicas WT-UBC-CRE y KO/COX4I2-UBC-CRE que respondieron a hipoxia. 3.2. Modulación de la respuesta a la hipoxia aguda por la aceleración de la cadena de transporte de electrones mediante NDI1 en el modelo COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE Para verificar nuestra hipótesis sobre si la sensibilidad a la hipoxia aguda de las células glómicas depende tanto de un metabolismo mitocondrial y CTE muy activa como de la expresión de subunidades mitocondriales atípicas, generamos el modelo animal COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE, con deleción de la subunidad COX4I2 y expresión de NDI1 en el tejido catecolaminérgico (KO-COX4I2/NDI1). Utilizamos NDI1 para acelerar la velocidad de la CTE y evaluamos si de este modo se podría restaurar la sensibilidad reducida a la hipoxia aguda a nivel sistémico, celular y mitocondrial en los animales embrionarios KO-COX4I2 (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Resultados 128 3.2.1. Estado general y desarrollo de los animales COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE A diferencia de otros modelos KO mitocondriales, la eliminación de COX4I2 en el territorio catecolaminérgico no afecta al desarrollo, ni ocasiona una disminución de peso o alteraciones de fenotipo visibles (Moreno-Domínguez y cols., 2020). La expresión de la proteína NDI1 en los animales KO-COX4I2, tampoco provocó cambios en el desarrollo ni diferencias apreciables en el peso corporal del modelo COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE (datos no mostrados). 3.2.2. Recuperación parcial de la respuesta sistémica a la hipoxia aguda en el modelo COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE Para estudiar el efecto de NDI1 en la respuesta ventilatoria a la hipoxia aguda reducida de los animales KO-COX4I2 (Moreno-Domínguez y cols., 2020), se llevó a cabo un estudio pletismográfico en animales control, KO-COX4I2 y KO-COX4I2/NDI1. En primer lugar, observamos que el 52% de los animales KO-COX4I2/NDI1 mostraron una respuesta hiperventilatoria a la hipoxia alterada muy similar a la descrita previamente en los animales KO-COX4I2 (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Por el contrario, en el 47% de los ratones KO-COX4I2/NDI1 se observó una restauración parcial de la sensibilidad a la hipoxia inducida por la expresión de NDI1 (Figura 76). Figura 76. Evaluación de la respuesta sistémica a hipoxia aguda en el modelo KOCOX4I2/NDI1. Se muestra el porcentaje de animales KO-COX4I2/NDI1 (violeta, n=11/23) que mostraron una recuperación de la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia aguda (Hx) en comparación con animales WT (azul, n=15/15) y KO-COX4I2 (naranja, n=7/7). En la Figura 77 se muestra la respuesta sistémica a la hipoxia aguda en los tres grupos de animales estudiados. De acuerdo con lo anteriormente descrito (Moreno-Domínguez y cols., 2020), todos los animales KO-COX4I2 mostraron una disminución significativa del HVR durante la hipoxia aguda (Figura 77B y E) en comparación con los ratones WT (Figura 77A y E). En el 47% de animales KO-COX4I2/NDI1, la expresión de NDI1 Resultados 129 permitió una restauración casi completa de la respuesta a la hipoxia aguda, aunque con una menor amplitud que el grupo control (si HVR, Figura 77C y F). En el 52% de los animales KO-COX4I2/NDI1, el HVR se mantuvo alterado (no HVR, Figura 77D y F), similar a lo observado en el modelo KO-COX4I2 (Figura 77B y F). No obstante, se aprecia que el primer pico de hiperventilación fue aparentemente de mayor amplitud en los animales KO-COX4I2/NDI1 (no HVR) que en los ratones KO-COX4I2 (Figura 77B y D). En contraste, la respuesta hiperventilatoria frente a la hipercapnia (~5% CO2) fue prácticamente similar en todos los modelos estudiados (Figura 78), indicando que no había ninguna alteración ni central ni periférica en los sistemas de control respiratorio. Los resultados obtenidos sugieren que la respuesta sistémica a la hipoxia aguda que se encuentra reducida en los ratones KO-COX4I2, puede ser parcialmente recuperada mediante la expresión de NDI1. Figura 77. Respuesta ventilatoria a la hipoxia aguda en el modelo KO-COX4I2/NDI1. (A-D) Registros pletismográficos promedio representativos del cambio en la frecuencia respiratoria durante hipoxia (~ 10% O2) en animales control (azul, n=15) (A), KO-COX4I2 (naranja, n=7) (B), KOCOX4I2 /NDI1 si HVR (violeta, n=11) (C) y KO-COX4I2 /NDI1 no HVR (morado, n=12) (D). Los cambios en el % de O2 con respecto al tiempo se representan en la parte inferior. (E-F) Cuantificación de la frecuencia respiratoria media (respiraciones/minuto) registrada en normoxia (Nx) e hipoxia (Hx) en cada uno de los modelos estudiados. El número de animales empleados en la cuantificación se indica en los paneles A-F. Los valores P estadísticamente significativos fueron calculados mediante la prueba t Student (two-tail) para muestras pareadas. Resultados 130 Figura 78. Respuesta ventilatoria a la hipercapnia en el modelo KO-COX4I2/NDI1. (A) Registros pletismográficos promedio representativos del cambio en la frecuencia respiratoria durante la hipercapnia (5% CO2) en animales control (azul, n=12), KO-COX4I2 (naranja, n=6), KO-COX4I2 /NDI1 si HVR (violeta, n=9) y KO-COX4I2 /NDI1 no HVR (morado, n=9). (B) Cuantificación de la frecuencia respiratoria media (respiraciones/minuto) registrada en normoxia (Nx) e hipercapnia (CO2) en cada uno de los modelos estudiados. El número de animales empleados en la cuantificación se indica en el panel A. Cada dato se representa como media ± SEM. Los valores P estadísticamente significativos fueron calculados mediante la prueba t Student (two-tail) para muestras pareadas. 3.2.3. Caracterización molecular del modelo COX4I2/NDI1-TH-IRESCRE Tras llevar a cabo el estudio funcional sistémico, se realizó un análisis molecular para investigar si la variabilidad en la expresión de la proteína NDI1 podría estar relacionada con la recuperación diferencial de la respuesta a la hipoxia aguda en los animales KOCOX4I2/NDI1. En primer lugar, se analizó el nivel de expresión de NDI1 en muestras de GCS mediante PCR cuantitativa. Se observó la presencia de ARNm de NDI1 con valores similares en ambos grupos de animales KO-COX4I2/NDI1, independientemente de su respuesta sistémica a la hipoxia, en comparación con las muestras de GCS de ratones WT y KO-COX4I2 (Figura 79). A continuación, se llevó a cabo un análisis histológico por inmunofluorescencia, para detectar la expresión de NDI1 en el CC de los animales KO-COX4I2/NDI1. Para ello se utilizaron anticuerpos contra la tiroxina hidroxilasa (TH, rojo) y la proteína reportera GFP (verde) asociada a la expresión de NDI1. En los cortes de CC de los ratones KOCOX4I2/NDI1, las células glómicas marcadas por la enzima TH, expresaron la proteína GFP. (Figura 80). En cambio, en las células glómicas de los ratones WT no se observó esta señal GFP (Figura 80). Estos resultados indican que la proteína NDI1 se expresa en las células catecolaminérgicas del CC en el modelo KO-COX4I2/NDI1. Resultados 131 Figura 79. Caracterización molecular mediante PCR cuantitativa en muestras de ganglio cervical superior del modelo KO-COX4I2/NDI1. (A) Niveles relativos de ARNm del gen NDI1 en muestras de GCS de animales WT (azul, n=4 replicas/grupo), KO-COX4I2 (naranja, n= 4 replicas/grupo), KO-COX4I2/NDI1 si HVR (violeta, n=4 replicas/grupo) y KO-COX4I2/NDI1 no HVR (morado, n=4 replicas/grupo). Los datos se presentan como diagramas de caja, en los que se indica la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores extremos mínimo y máximo (bigotes). Los valores P indicados se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. post hoc test. Figura 80. Expresión de NDI1 en secciones de cuerpo carotídeo del modelo KO-COX4I2/NDI1. Detección de NDI1 (GFP, verde) mediante inmunofluorescencia en células catecolaminérgicas marcadas como TH + (rojo) de ratones WT (azul), KO-COX4I2/NDI1 (violeta) en secciones de CC. Los núcleos se detectaron por marcaje con DAPI (azul). Se utilizaron 2 animales de cada genotipo en cada experimento. Con el objetivo de demostrar que la recuperación parcial de la respuesta sistémica a hipoxia en el modelo KO-COX4I2/NDI1 no se debe a una eliminación inadecuada de la subunidad COX4I2, sino a la expresión de NDI1, se estudió mediante qPCR el nivel de expresión de Cox4i2 y Cox4i1 en muestras de MA. Los niveles de ARNm de Cox4i2 se redujeron significativamente en las muestras de MA de los ratones KO-COX4I2/NDI1 en comparación con los controles, independientemente de la respuesta sistémica a la hipoxia que presentaron (Figura 81A). Esta reducción fue similar a la observada en el modelo KO-COX4I2 (Figura 81A). En contraste, los niveles de ARNm de Cox4i1 no se Discusión 139 de caída del ratio ATP/ADP citosólico, en respuesta a oligomicina en las células glómicas KO-NUDFS2/NDI1 (Figura 59). NDI1 restaura el funcionamiento de la CTE detenida en las células glómicas que carecen de CMI. Además, la oxidación del NADH por NDI1 ocurre a una velocidad más rápida que en el CMI (Figura 47), lo que permite un flujo de electrones más eficiente en la CTE. Esto permitiría que los complejos mitocondriales CMIII y CMIV bombeen más protones y mantengan el ΔΨm en ausencia de un CMI funcional (Figura 83B). Las células glómicas deficientes en NDUFS2 presentan una disminución en la actividad de la NADH deshidrogenasa y niveles elevados de NADH en comparación con las células control (Figura 38 y 46E). Esta acumulación de NADH tiene efectos negativos en el ciclo de Krebs (Yang y cols., 2020) y ralentiza /detiene a la CTE (Figura 83A). Por otro lado, la regeneración de NAD+ es crucial para diversas funciones celulares, como el mantenimiento del equilibro redox, la regulación génica o la reparación del ADN en las células (Nelson y Cox, 2017). NDI1 es capaz de restaurar la oxidación de NADH en la CTE, reduciendo los niveles de NADH basales en las células KO, y reactivando el metabolismo oxidativo (Figura 83B). La presencia de NDI1 en células deficientes en CMI permite restaurar de nuevo la fosforilación oxidativa, lo que se traduce en niveles de lactato similares a los observados en células normales (Figura 60). 1.2. Respuestas a la hipoxia aguda de las células glómicas que expresan NDI1 El modelo SMM postula que la hipoxia aguda ralentiza la CTE, lo que causa una acumulación de QH2 y un enlentecimiento o incluso una reversión del CMI, dando lugar a la acumulación de las moléculas señalizadoras (NADH y ROS) que modulan los canales iónicos de la membrana de las células glómicas (López-Barneo y Ortega-Sáenz, 2022). Las respuestas mitocondriales a la hipoxia aguda en las células glómicas KO-NDUFS2, se abolen de forma selectiva y se recuperan con la expresión de NDI1 (Figuras 46, 49 y 50). Estos resultados demuestran que la función del CMI esencial para la respuesta a aguda a la hipoxia es su actividad NADH deshidrogenasa, y en consecuencia la acumulación de NADH y de ROS, por tanto no está relacionada con su función bioenergética (bombeo de protones y síntesis de ATP) ni con la desactivación del CMI en ausencia de O2. Además, sugerimos que la función señalizadora del CMI (producción de NADH y ROS), más que el CMI en sí mismo, es necesaria para la detección de la Discusión 140 hipoxia aguda en las células glómicas, debido a que esta función puede ser reemplazada por una deshidrogenasa de levadura. Figura 83. Cambios metabólicos en células glómicas KO-NDUFS2 y su restauración mediante NDI1. (A) Esquema de los efectos metabólicos asociados a la deleción del CMI en células KONDUFS2: aumento de la glucólisis, detención de la CTE y la actividad reversa del CMV para mantener el ΔΨm. Uso de 2-DG y oligomicina. (B) Papel de NDI1 en metabolismo de las células KONDUFS2/NDI1: recuperación de actividad de NADH deshidrogenasa, CTE activa y producción de ATP por vía oxidativa debido a la restauración del bombeo de protones por el CMIII y CMIV. La función catalítica de NDI1 posee particularidades funcionales que aportan información sobre la respuesta de la CTE a la hipoxia y sobre el funcionamiento de NDI1 en el contexto de la actividad mitocondrial. La expresión de NDI1 en la célula glómicas deficientes en NDUFS2, no solo recuperó por completo el incremento de NADH en respuesta a la hipoxia, sino que generó una respuesta de mayor magnitud y velocidad que en las células control (Figura 46 y 47). Estos hallazgos indican que la actividad Discusión 141 enzimática de NDI1 (tanto en sentido forward como reverse) es considerablemente más rápida que la del CMI. La actividad enzimática NADH/Q oxidorreductasa del CMI, implica varios pasos intermedios para transferir electrones desde el NADH a la Q. Las moléculas de Q/QH2 tienen que moverse dentro y fuera de la estructura de la jaula de la quinona (Rhein y cols., 2013), y simultáneamente se inducen cambios en el dominio transmembranario del CMI, para facilitar el bombeo de protones hacia el exterior de la mitocondria (Fiedorczuk y cols., 2016). Este proceso catalítico en el CMI es relativamente lento, lo que limita la velocidad de la CTE (Sazanov, 2014; Zhu y cols., 2016). En contraste, NDI1 tiene un ciclo catalítico más simple, con uno o dos pasos intermedios y una proximidad estrecha entre los sitios de unión de NADH y Q (Feng y cols., 2012; Iwata y cols., 2012). Las señales de NADH más elevadas en respuesta a hipoxia en presencia de NDI1, se correlacionaron con respuestas secretoras más intensas durante la hipoxia en las células KO-NDUFS2/NDI1 (Figura 42H). Los estudios in vitro mostraron que el CMI de las células glómicas WT/NDI1 tiene una actividad NADH deshidrogenasa similar a la observada en las células control (Figura 38). Sin embargo, los estudios funcionales indican que cuando ambas deshidrogenasas están presentes, NDI1 parece suprimir la función del CMI. Los experimentos de rotenona en células glómicas WT/NDI1 respaldan esta hipótesis. El bloqueo del CMI con rotenona no afectó los niveles basales de NADH ni tampoco bloqueó la respuesta a hipoxia en las células WT/NDI1 (Figura 44 y 48). Una posible explicación de este fenómeno es que NDI1 utiliza la mayor parte del NADH disponible, lo que inactiva a CMI (Babot y Galkin, 2013; Zhu y cols., 2016). Se ha propuesto que la transición del CMI de su forma activa a desactiva, se debe a la falta o a la disminución drástica de sustratos (NADH/Q) (Babot y Galkin, 2013; Zhu y cols., 2016). En esta conformación, el CMI no oxida NADH, el bombeo de protones disminuye se abole y actúa como un intercambiador Na+/H+ mitocondrial (Roberts y Hirst, 2012). Este proceso podría tener implicaciones tanto en la respuesta celular como en la respuesta ventilatoria ante la hipoxia aguda (ver más adelante). Durante la hipoxia aguda, las células glómicas experimentan cambios en los niveles de ROS de forma compartimentalizada. (Arias-Mayenco y cols., 2018). Se ha descrito un aumento de ROS en el espacio intermembrana (EIM), que actúa como molécula señalizadora modulando los canales de la membrana plasmática, y una disminución de Discusión 142 ROS en la matriz mitocondrial (Arias-Mayenco y cols., 2018; Fernández-Agüera y cols., 2015). El aumento de ROS en el EIM proviene principalmente del CMI y se encuentra inhibido en las células KO-NDUFS2 (Arias-Mayenco y cols., 2018). Sin embargo, se ha observado que en las células de músculo liso, el CMIII también puede contribuir a la generación de ROS en el EIM (Waypa y cols., 2010). En las células deficientes de CMI que expresan NDI1, se recupera el incremento de ROS en el EIM durante la hipoxia aguda (Figura 49). Sin embargo, la disminución de ROS en la matriz mitocondrial durante la hipoxia aguda se produce tanto en células control como KO-NDUFS2 (Arias-Mayenco y cols., 2018). Se ha sugerido que la producción de ROS en la matriz mitocondrial se debe principalmente a la actividad de las deshidrogenasas del ciclo de Krebs (Figura 84A). Durante la hipoxia aguda, el déficit del sustrato (O2) para la producción de ROS, provoca una disminución no específica de ROS en la matriz mitocondrial, que no desempeña un papel importante en la señalización de la respuesta a hipoxia del CC (Arias-Mayenco y cols., 2018). Sin embargo, en las células que expresan NDI1, la hipoxia aguda induce un aumento reversible de los niveles de ROS en la matriz mitocondrial (Figura 50). Estos hallazgos sugieren que durante la hipoxia, la proteína NDI1 puede disminuir su actividad e incluso actuar en modo reverso, generando ROS, al igual que el CMI. Una posible explicación de este fenómeno es que durante la hipoxia aguda, NDI1 produce ROS en la matriz mitocondrial debido a su anclaje a la membrana mitocondrial interna (Iwata y cols., 2012) que posiblemente difunda hacia el EIM. Por tanto, en las células que expresan NDI1, la hipoxia aguda induce un aumento de los niveles de ROS en ambos compartimentos mitocondriales (Figura 84B). Este hallazgo contradice la creencia general que afirma que la expresión de NDI1 reduce la producción de ROS mitocondrial (Seo y cols., 2006). Otras deshidrogenasas similares a NDI1 presentes en la matriz mitocondrial también son capaces de generar ROS (Starkov y cols., 2004). Además, estudios estructurales han demostrado que en la reacción enzimática de NDI1, la transferencia de electrones ocurre de manera secuencial desde el NADH a la Q, generando semiquinona. Este proceso podría promover la producción de ROS tanto en la reacción directa e inversa de esta enzima (Feng y cols., 2012). Un estudio llevado a cabo en Drosophila melanogaster respalda nuestros hallazgos al demostrar que existe una producción de ROS dependiente de NDI1 relacionada con un aumento en la esperanza de vida en este modelo (Scialo y cols., 2016). Discusión 143 Figura 84. Producción compartimentalizada de ROS en respuesta a hipoxia aguda en las células glómicas WT y KO/NDI1. (A) Esquema de la producción de ROS en hipoxia aguda en las células glómicas control. Se representa el aumento de ROS en el EIM y la disminución en la matriz mitocondrial durante la hipoxia (Hx, líneas y símbolos rojos). (B) Representación de la producción de ROS en hipoxia en las células KO/NDI1. Se muestra que el aumento de ubiquinona reducida (QH2) durante la hipoxia (Hx, líneas y símbolos rojos) que provoca el enlentecimiento/reversión de NDI1. La producción de ROS por NDI1 en la matriz mitocondrial, predomina sobre la disminución de ROS mediada por las deshidrogenasas del ciclo de Krebs (DH). El ROS de la matriz, posiblemente difunde al IMS, en forma de H2O2. Hx: hipoxia; DH: deshidrogenasas del ciclo de Krebs. La expresión de NDI1 restaura el reflejo hiperventilatorio sistémico a la hipoxia abolido en los animales KO-NDUFS2 (Arias-Mayenco y cols., 2018; Fernández-Agüera y cols., 2015). En los animales control, la fase de relajación del HVR durante la hipoxia, se debe a la eliminación excesiva de CO2 (hipocapnia) que inhibe tanto el centro respiratorio como las células glómicas (Guyton y Hall, 2006). Los animales que expresan NDI1 mostraron una disminución más rápida y marcada del HVR, posiblemente debido a la alcalinización de su citosol (Figura 41A). Este aumento del pH citosólico, puede ser resultado de la disminución del bombeo de protones en ausencia de CMI funcional (KO/NDI1) o la presencia de un CMI inactivo cuando se expresa NDI1 (WT/NDI1). En las células glómicas que expresan NDI1, la alcalinización del citosol durante la hipocapnia inhibe aún más el CC, lo que resulta en una relajación más rápida y pronunciada del reflejo hiperventilatorio (Figura 41A). Además, este fenómeno podría explicar una disminución en la sensibilidad a CO2 en las células glómicas KO/NDI1 (Figura 42I), ya que esta alcalinización citosólica puede tamponar la acidificación necesaria para la activación de las células glómicas por el CO2 (Ortega-Sáenz y LópezBarneo, 2020). Discusión 144 A nivel sistémico NDI1 fue capaz de restaurar la frecuencia respiratoria basal reducida en los ratones deficientes en NDUFS2 (Figura 41C). Esta reducción de la frecuencia respiratoria basal, se ha observado también en el modelo animal deficiente en la subunidad RISP del CMIII (Cabello-Rivera y cols., 2022). Sugerimos que en estos modelos con alteraciones en la CTE, la falta de sensibilidad a PO2, disminuye la frecuencia de descarga del nervio del seno carotídeo y la activación al centro respiratorio, lo que resulta en una disminución de la frecuencia respiratoria basal. La expresión de NDI1 reestablece el funcionamiento de la CTE y la sensibilidad del CC al O2, lo que a su vez restaura la estimulación del centro respiratorio. Esto permite que la frecuencia ventilatoria basal en los animales que expresan NDI1 se mantenga en valores similares a los observados en los animales control (Figura 41C). En diferentes tipos de células sensibles al O2, se ha propuesto que el CMI desempeña un papel importante en la respuesta a la hipoxia aguda. En las células de músculo liso de la arteria pulmonar, se ha sugerido que la sensibilidad a la hipoxia está relacionada con la oxidación de ciertos residuos de cisteína en la subunidad NDUFS2, lo que resulta en la inhibición CMI (Dunham-Snary y cols., 2019). Por otro lado, en las células endoteliales de la aorta, se ha propuesto que durante la hipoxia aguda se activa una cascada de quimiotransducción que comienza con la desactivación del CMI y la activación del intercambiador Na+/Ca2+ mitocondrial. Como resultado, la hipoxia provoca cambios rápidos en la producción de ROS y aumentos en los niveles de Ca2+ citosólico (Hernansanz-Agustín y cols., 2020). NDI1 ha sido de gran utilidad para investigar si los mecanismos propuestos en estas células ocurrían en las células glómicas. Nuestros resultados empleando el modelo KO-NDUFS2/NDI1, han demostrado que contrariamente a lo descrito en las células de músculo liso arterial. (Dunham-Snary y cols., 2019), la subunidad NDUFS2 en sí misma no es necesaria para la detección de la hipoxia aguda en las células glómicas. Además, nuestros hallazgos sugieren que la desactivación del CMI no es crucial en la respuesta a la hipoxia aguda en las células glómicas. En las células KO-NDUFS2/NDI1 a pesar de la falta de CMI, la sensibilidad a la hipoxia aguda se mantiene cuando se expresa NDI1. Asimismo, los experimentos utilizando un bloqueante del intercambiador mitocondrial Na+/Ca2+ (CGP-37157) y el análisis de la respuesta mitocondrial (NADH y ROS) en ausencia de Na+ extracelular, han demostrado que las células glómicas (control y KO/NDI1) mantienen la respuesta Discusión 145 celular y mitocondrial durante la hipoxia aguda (Figuras 65, 68 y 69). Por lo tanto, todos nuestros resultados revelan que el modelo de señalización de las células glómicas quimiosensoras es diferente del propuesto en las células endoteliales de la arteria aorta y líneas celulares tumorales (Hernansanz-Agustín y cols., 2020). En resumen, los datos mencionados anteriormente indican que la producción de señales mitocondriales, como NADH y el ROS, bien a través del CMI o de la proteína NDI1, desempeñan un papel crucial en la respuesta a la hipoxia en las células glómicas. Se ha confirmado que la actividad NADH deshidrogenasa del CMI y su papel en la generación de ROS y NADH son elementos esenciales para mediar la respuesta ante la falta de O2 en el CC. Esto demuestra que en las células glómicas el CMI en sí mismo no se modifica por la hipoxia, sino que su función esencial es actual como efector/señalizador de la respuesta al déficit agudo de O2. 1.3. Uso de NDI1 como terapia correctora de los defectos genéticos del CMI La expresión de NDI1, tanto en la etapa embrionaria como en la edad adulta, no solo mejora la disfunción mitocondrial de las células glómicas deficientes en CMI sino que evita las alteraciones producidas por defectos mitocondriales en otros tipos celulares. Por tanto, la expresión transgénica de NDI1 podría ser una herramienta terapéutica útil para compensar la deficiencia de CMI. Los ratones KO-NDUFS2 tienen retraso en el crecimiento y una esperanza de vida más corta que la de los animales control (Fernández-Agüera y cols., 2015). Estas alteraciones podrían estar relacionadas con la degeneración de las neuronas en el núcleo arcuato del hipotálamo ante la falta de un CMI funcional, lo cual afecta los niveles plasmáticos de hormona de crecimiento (GH) y el factor de crecimiento similar a la insulina (IFG-1). Otros estudios han mostrado que la deficiencia en el tejido catecolaminérgico de otras subunidades mitocondriales (SDHD y RISP) también causa reducción del peso y el tamaño corporal de los animales KO (Cabello-Rivera y cols., 2022; Díaz-Castro y cols., 2012). Estos hallazgos, resaltan la importancia del núcleo arcuato en la regulación del crecimiento y el metabolismo (Decourtye y cols., 2017). La expresión de NDI1, fue suficiente para, normalizar los niveles hormonales de GH e IGF-1, restablecer el peso corporal normal y revertir el enanismo característico de los animales KO-NDUFS2 Discusión 146 (Figuras 40 y 63). Esto sugiere que NDI1 podría restaurar el metabolismo oxidativo en las neuronas TH+ del núcleo arcuato, contrarrestando los efectos negativos de la deficiencia de CMI y mitigando los síntomas característicos de este modelo KONDUFS2. Por otro lado, nuestras observaciones en ratones KO-NDUFS2 revelan un patrón interesante en términos de mortalidad. En el modelo embrionario, la ausencia de mortalidad en los primero 30-50 posnatales (Figura 39A), alude a que la manifestación de los efectos negativos de la deficiencia de CMI pueden aparecer varias semanas después del nacimiento, lo que posiblemente se debe a el lavado lento (varias semanas) de las proteínas mitocondriales (Fornasiero y cols., 2018). Estudios recientes en neuronas dopaminérgicas centrales también han observado un retraso similar en la aparición de los efectos patológicos relacionados con la deficiencia de CMI (González-Rodríguez y cols., 2021). Estas observaciones indican que la manifestación de los efectos fenotípicos y el lavado de las proteínas mitocondriales podrían estar sincronizados y dependientes del tiempo. La parada de la CTE en las células glómicas KO-NDUFS2, junto con la reducción del metabolismo oxidativo, puede afectar de manera similar a otros tejidos catecolaminérgicos centrales, que podrían ser más susceptibles a esta disfunción. Esta asociación podría estar relacionada con la mortalidad prematura observada en el modelo KO-NDUFS2. En cuanto a la mortalidad de los animales adultos ESR-KO-NDUFS2, podría ser el resultado de una disfunción generalizada del CMI que afecta múltiples sistemas o procesos del organismo. Sin embargo, se requieren más investigaciones para comprender completamente estos mecanismos y la relación entre la mortalidad y la disfunción del CMI en ratones deficientes en NDUFS2. Nuestros datos indican que NDI1 es capaz de restaurar el funcionamiento mitocondrial en ambos modelos (embrionario y adulto), prolongando la esperanza de vida de estos animales. Estos hallazgos, ofrecen nuevas posibilidades terapéuticas para tratar enfermedades neurodegenerativas y trastornos asociados con la disfunción del CMI, como el Parkinson, el Alzheimer, la neuropatía óptica hereditaria de Leber o el síndrome de Leigh. (González-Rodríguez y cols., 2021; Giachin y cols., 2016; Tuppen y cols., 2010). El uso de NDI1 u otras enzimas similares, podría mejorar la función neuronal, brindando una alternativa para el tratamiento de estos trastornos. Discusión 147 Una cuestión interesante a estudiar en más detalle es cómo influye la alteración de la detección aguda a la hipoxia de las células glómicas sobre la respuesta a la hipoxia crónica Nuestros resultados muestran que, en condiciones de hipoxia crónica (10% O2, 10 días), los ratones deficientes en NDUFS2 tienen un mayor incremento del hematocrito en comparación con los ratones control (Figura 64), fenómeno también observado en otros modelos con alteraciones en la respuesta sistémica a la hipoxia aguda (Cabello-Rivera y cols., 2022; Macias y cols., 2018). Sin embargo, la expresión de NDI1 restableció el incremento de hematocrito a niveles similares a los de los animales control expuestos a hipoxia crónica (Figura 64). Esto posiblemente se debe al papel de NDI1 como restaurador de la sensibilidad aguda a la hipoxia a nivel sistémico. Investigar en detalle cómo la disfunción mitocondrial afecta a la adaptación a la hipoxia crónica es una línea de investigación prometedora. Estos estudios podrían tener aplicaciones en el tratamiento de enfermedades cardiorrespiratorias como la apnea del sueño, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la hipertensión (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). 2. Función “sensora” de O2 del CMIV de las células glómicas. Importancia de las isoformas atípicas de subunidades específicas y de la velocidad de la cadena de transporte de electrones mitocondrial Los datos experimentales obtenidos en los últimos años indican que las células glómicas poseen mitocondrias con características moleculares específicas. De especial importancia es la presencia en dichas células de isoformas atípicas de las subunidades mitocondriales del CMIV (NDUFA4L2, COX4I2, COX8B) (Gao y cols., 2017; Zhou y cols., 2016). La expresión de los genes que codifican estas moléculas depende de HIF-2α, factor de transcripción que a su vez también está altamente expresado en el CC (Tian y cols., 1998; Moreno-Domínguez y cols., 2020). El CMIV o citocromo c oxidasa (CCOX), desempeña un papel como elemento sensor en el modelo de SMM (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Su función sensora se basa en la expresión de subunidades específicas, particularmente COX4I2, que posiblemente disminuyen la afinidad aparente de la CCOX por el O2 (López-Barneo y Ortega-Sáenz, 2022). Esto ocasiona cambios en la actividad enzimática de la CCOX dentro de rangos fisiológicos en los niveles de O2 celular, que en consecuencia, conducen a la acumulación de moléculas señalizadoras. Es posible que la velocidad de reacción de la CCOX, que produce H2O como producto final, no solo dependa de la afinidad de la enzima por el O2, si no también de un “matching” adecuado Discusión 148 entre la disponibilidad de O2 y el flujo de electrones que llega al sitio catalítico de la CCOX. En esta sección discutiremos por un lado el posible papel de la subunidad COX4I2 del CMIV en las células glómicas y las características específicas de este complejo mitocondrial, y por otro lado trataremos la restauración parcial de la respuesta a la hipoxia aguda en células glómicas sin la isoforma COX4I2 pero que expresan NDI1. 2.1. Contribución de la isoforma COX4I2 del CMIV en los mecanismos de la sensibilidad aguda a la hipoxia en el CC La isoforma 2 de COX4, una de las 14 subunidades del CMIV, es una variante específica de tejido mucho menos frecuente que la isoforma 1. COX4I1, se encuentra ampliamente expresada en el CMIV de la mayoría de los tejidos (Kadenbach y Hüttemann, 2015). Por el contrario, en las células glómicas la isoforma más expresada es COX4I2 (Gao y cols., 2017; Zhou y cols., 2016). La eliminación de COX4I2 en las células glómicas durante la etapa embrionaria resulta en una notable disminución en la respuesta a la hipoxia aguda a nivel sistémico, celular y mitocondrial (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Nuestro estudio ha demostrado que la eliminación de COX4I2 en la etapa adulta tiene, en la mayoría de los casos, resultados consistentes con los hallazgos obtenidos en la etapa embrionaria. Sin embargo, cabe destacar que algunos de los animales adultos en los que se ha eliminado la subunidad COX4I2, aún mantienen una respuesta sistémica a la hipoxia aparentemente normal, pero de menor amplitud que la de los ratones control (Figura 73B y D). A pesar de que a nivel molecular observamos una disminución en la expresión de COX4I2 en la MA y en riñón del modelo KO/COX4I2-UBC-CRE (Figura 74), el mantenimiento del HVR, posiblemente podría deberse a la existencia de una expresión residual de COX4I2 en el CC de estos animales. Dado que durante la ejecución de en este trabajo los CC extraídos de animales KO/COX4I2-UBC-CRE, se usaron preferentemente para estudios funcionales, no disponemos todavía de datos moleculares definitivos que puedan confirmar o no esta hipótesis. A pesar de esta limitación, nuestros hallazgos revelan una correlación entre la alteración sistémica de la respuesta a la hipoxia y la reducción en la respuesta celular en el modelo adulto deficiente en COX4I2 (Figura 75). Estos resultados respaldan la importancia de COX4I2 en las células glómicas del CC (Gao y cols., 2017) y su papel en la detección de la hipoxia aguda, ya que su eliminación tanto en la etapa adulta como embrionaria produce una alteración significativa en la respuesta hipóxica (Moreno-Domínguez y cols., 2020).