Aportación de nuevos datos moleculares de especies de la familia rhinonyssidae (Mesostigmata: Acari)

APORTACIÓN DE NUEVOS DATOS MOLECULARES DE ESPECIES DE LA FAMILIA RHINONYSSIDAE (MESOSTIGMATA: ACARI) Susana Araceli Sánchez Carrión Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla “APORTACIÓN DE NUEVOS DATOS MOLECULARES DE ESPECIES DE LA FAMILIA RHINONYSSIDAE (MESOSTIGMATA: ACARI)” Trabajo experimental. Línea de investigación: Parasitología Molecular Trabajo Fin de Grado. Grado en Farmacia Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla SUSANA ARACELI SÁNCHEZ CARRIÓN Tutor: Manuel de Rojas Álvarez Sevilla, 13 Junio de 2022 AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer de corazón a mis padres y a mi hermano por levantarme cada vez que me he caído. A Jordi, por escucharme tantísimas horas hablando de ácaros y por sostenerme cuando más lo necesitaba. A Jorge, por estar siempre ahí. A Manuel de Rojas por darme cada día en el Departamento una nueva razón por la que interesarme por la Parasitología. Al Departamento de Microbiología y Parasitología por acogerme siempre con tanto cariño y enseñarme durante años la belleza de la vocación y la investigación. 1 ÍNDICE 1 Resumen ...............................................................................................................................2 2 Introducción .........................................................................................................................3 3 Objetivos ..............................................................................................................................6 4 Material y métodos ...............................................................................................................7 5 Resultados y Discusión ......................................................................................................17 5 Conclusiones ......................................................................................................................28 6 Bibliografía ........................................................................................................................29 2 1 RESUMEN La familia Rhinonyssidae es una familia de ácaros hematófagos que se localizan de forma permanente en las cavidades nasales de las aves. En esta familia se incluyen alrededor de 600 especies que se clasifican en once géneros. En el presente trabajo se secuencian fragmentos de la región que comprende el ITS1, el 5.8S y el ITS2 para inferir relaciones filogenéticas en nuevas especies de ácaros rinonísidos pertenecientes a cuatro géneros (Tinaminyssus, Ptilonyssus, Rhinonyssus y Sternostoma) y abordar problemas morfológicos como dilucidar el estatus taxonómico de la subespecie Ptilonyssus motacillae phoenicuri y de las especies afines. Con este objeto, se analizaron las distancias genéticas mínimas para la delimitación de especies y géneros con estos marcadores. De esta manera, se observó que el fragmento ITS5.8S-ITS2 es útil para la resolución de estos problemas, en la familia Rhinonyssidae, a nivel específico y algo menor a nivel intergenérico. El análisis de los árboles filogenéticos, confirmó la división de los diferentes géneros con la morfología de sus quelíceros. También se encontraron diferencias significativas entre especies que, consideradas anteriormente como sinónimas, como es el caso de Ptilonyssus motacillae y Ptilonyssus fringillae deben ser consideradas especies distintas. Además, a la vista de los resultados se puede concluir que la subespecie Ptilonyssus motacillae phoenicuri debe alcanzar el estatus taxonómico de especie y pasar a denominarse Ptilonyssus phoenicuri. Asimismo, se confirma la existencia de especies crípticas (Tinaminyssus streptopelioides y Tinaminyssus streptopeliae). Finalmente, observaciones como la inclusión de Tinaminyssus bubulci, parásita de Ciconiformes, en el grupo de especies parásitas de Columbiformes debe ser analizado con nuevos datos moleculares, por lo que se hace necesario llevar a cabo nuevos estudios que incluyan el análisis de otros marcadores moleculares mitocondriales y/o nucleares. Palabras clave: ácaros, filogenia, ITSs, marcadores moleculares. 3 2 INTRODUCCIÓN Los ácaros rinonísidos son endoparásitos hematófagos permanentes de lento movimiento que se instalan en las cavidades nasales de las aves, aprovechándose de las zonas más vascularizadas para alimentarse (Knee & Galloway, 2017). En la mayor parte de los casos, dichos ácaros no suponen una patología significativa a sus hospedadores, aunque la forma de alimentación de los rinonísidos puede provocar trauma y rotura de los tejidos nasales (de Rojas et al. 2002). La familia Rhinonyssidae incluye alrededor de 600 especies descritas por todo el mundo agrupadas actualmente en 11 géneros (Knee, 2008): Larinyssus (Strandtmann, 1948) ; Locustellonyssus (Bregetova, 1965); Mesonyssus (Fain,1960); Ptilonyssoides (Vitzthum, 1948), Ptilonyssus (Berlese y Trouessart, 1889); Rallinyssus (Strandtmann, 1948); Rhinoecius (Cooreman, 1946), Rhinonyssus (Trouessart, 1894); Sternostoma (Berlesse y Trouessart, 1889); Tinaminyssus (Strandtmann y Wharton, 1958) y Vitznyssus (Castro, 1948). Los primeros estudios sobre estos parásitos datan de finales del siglo XIX, en los que varios investigadores europeos mencionan la presencia de parásitos nasales en aves (Nitzsch y Giebel, 1871; Weber y Zurn, 1882). Así, Berlesse y Touessart en 1889 definen el género Ptilonyssus y la subfamilia Rhinonyssidae (Trouessart, 1895). No es hasta 1935 cuando se revisa y se incluyen nuevas especies (Vitzhum, 1941), siendo años después los trabajos de Castro y Pereira los que de forma pionera recogen un compendio mayor y más completo (Pereira y Castro, 1949). Strandtmann, a mitad del siglo XX continúa aportando más información a las publicaciones de sus predecesores (Strandtmann, 1951). Fain comienza sus estudios sobre rinonísidos de Europa y África en el año 1957 a la que sigue una ingente producción científica sobre esta familia de ácaros (Fain, 1957). Los trabajos posteriores de Úbeda (1978, 1991…) siguen realizando una aportación importante al conocimiento de los rinonísidos. Ya en el presente siglo, los trabajos de Dimov (2010, 2011, 2012) o De Rojas (2001, 2002, 2012), tratan de resolver los problemas taxonómicos e inferir filogenia en esta familia de ácaros basándose en técnicas moleculares. 4 La clasificación de la familia Rhinonyssidae siempre ha estado basada en la morfometría de los ácaros encontrados. No obstante, muchos de los caracteres morfológicos que se han usado con fines discriminatorios se basan en características que cambian gradualmente entre especies próximas, observándose una gran variabilidad en grupos de especies cercanos taxonómica y ecológicamente. Esto finalmente conduce a identificaciones ambiguas, así como a agrupaciones de especies que puedan estar estrechamente relacionadas, como el “grupo sairae” de Ptilonyssus (Pence y Castro 1976), el “grupo melloi” entre los Tinaminyssus (Fain 1962) o el “grupo coniventris” en el género Rhinonyssus (Fain, 1963). Comprender los patrones y procesos de la especiación es un objetivo actual de la biología evolutiva (Templeton, 1998, Taylor, Larson 2019), siendo los parásitos un elemento gran interés debido a sus tasas de mutación y su capacidad de diversificación (Cole, Viney, 2019; Huyse et al., 2005). Las nuevas técnicas de Biología Molecular, a través del estudio de diferentes marcadores moleculares, permiten establecer la relación entre la genética de poblaciones con aspectos evidentes de la morfología (Huyse et al., 2005), aportando un enfoque complementario a la identificación precisa de distintas especies de diferentes grupos de parásitos, y al establecimiento de relaciones filogenéticas entre ellas (Sunantaraporn et al., 2015; Kelomey et al., 2017). Algunos de los marcadores moleculares más utilizados son genes como el 16S ADNr, 12S ADNr y el gen COI (Citocromo Oxidasa I), que se encuentran en el ADN mitocondrial, así como genes constituyentes del ADN ribosómico nuclear, como el 18S, 28S y el 5.8 S, siendo también de interés los espaciadores internos transcritos (ITS1e ITS2) (Navajas y Fenton, 2000, Song et al., 2011; Kovalev et al., 2016). Según Cruickshank (2002), no existe marcador molecular que satisfaga todas las condiciones necesarias para ser perfecto, pues no todas tienen un fácil alineamiento, o no presentan variaciones entre las composiciones de bases entre taxones. Concretamente, el autor destaca los genes ribosomales en el estudio molecular de las especies ya que pueden ofrecer más información aquellos que codifican proteínas, señalando también la importancia del estudio y selección de un marcador apropiado antes de realizar cualquier secuencia, pues supondría un ahorro de tiempo y dinero considerable (Cruickshank, 2002). 5 Es entonces cuando destacan los estudios enfocados a la utilidad de cada marcador molecular. Mientras que algunos autores resaltan los genes 28S y 18S como marcadores válidos para la identificación de género y especie (Zhao et al., 2020), otros avalan la eficacia de los espaciadores internos transcritos ya que pueden ofrecer información a nivel de especies y cepas, siendo muy útiles en estudios poblacionales (Dabert M., 2006). Además, los espaciadores internos transcritos han demostrado ser útiles para inferir relaciones filogenéticas entre especies de otros géneros como Ixodes (Fukunaga, 2000) o Palpigradi (Giribet et al., 2014) En el caso de la familia Rhinonyssidae existen escasos trabajos moleculares y se han ensayado pocos marcadores moleculares como el fragmento ITS1-5.8S-ITS2, la citocromo oxidasa I (COI) y el 16S ADNr mitocondrial. Esto supone que los datos moleculares en la base de datos GenBank son escasos tanto en marcadores como en especies estudiadas. 6 3 OBJETIVOS Apoyándose en todo lo expuesto hasta el momento, el presente trabajo persigue tres objetivos generales: 1. Evaluar la utilidad de la región que comprende el ITS1, el 5.8S y el ITS2 para inferir relaciones filogenéticas en nuevas especies de ácaros rinonísidos. 2. Abordar problemas taxonómicos como la necesidad de revisar el estado taxonómico de la subespecie Ptilonyssus motacillae phoenicuri y de las especies afines. 3. Evaluar las distancias genéticas mínimas para la delimitación de especies y de géneros para el marcador molecular ensayado. 13 Tabla 3. Especies estudiadas en este trabajo junto a los datos de hospedador y el acceso a GenBank Especie Hospedador Procedencia hospedador Acceso a GenBank Tinaminyssus melloi Columba livia (Paloma común) Zaragoza Presente estudio Tinaminyssus melloi Columba livia (Paloma común) Utrera (Sevilla) Presente estudio Tinaminyssus columbae Columba livia (Paloma común) Zaragoza Presente estudio Tinaminyssus columbae Columba livia (Paloma común) Sevilla Presente estudio Tinaminyssus minisetosum Columba oenas (Paloma zurita) Sevilla (Gines) Presente estudio Tinaminyssus streptopelioides Streptopelia turtur (Tórtola europea) Montellano (Sevilla) Presente estudio Tinaminyssus streptopeliae Streptopelia decaocto (Tórtola turca) Sevilla Presente estudio Tinaminyssus bubulci Bubulcis ibis (garcilla bueyera) Montellano Presente estudio Ptilonyssus hirsti Passer domesticus (Gorrión común) Montellano Presente estudio Ptilonyssus hirsti Passer domesticus (Gorrión común) Utrera (Sevilla) Presente estudio Ptilonyssus motacillae Motacilla alba (Lavandera blanca) Montellano Presente estudio Ptilonyssus muscicapae Muscicapa striata (Papamoscas gris) Cádiz Presente estudio Ptilonyssus sp. Phoenicurus ochruros (Colirrojo tizón) Montellano Presente estudio Ptilonyssus fringillae (Montellano) Fringilla coelebs (Pinzón vulgar) Montellano Presente estudio Ptilonyssus fringillae (Rusia) Parus sp. Rusia Presente estudio Rhinonyssus. echinipes Pluvialis squatarola (Chorlito gris) Isla Mayor (Sevilla) Acceso a GenBank AM238444 Rhinonyssus himantopus Himantopus mexicanus (Ciguüeñela cuello negro) California (USA) Acceso a GenBank EU889329 Rhinonyssus neglectus Calidris alpina (Correlimos común) Isla Mayor (Sevilla) Acceso a GenBank AM238442 Rhinonyssus tringae Tringa totanus (archibebe común) Isla Mayor (Sevilla) Acceso a GenBank AJ421838 Sternostoma boydi Larus argentatus (Gaviota argéntea) Utrera (Sevilla) Acceso a GenBank AJ421834 Sternostoma fulicae Fulica atra (Focha común) Isla Mayor (Sevilla) Acceso a GenBank AJ421833 Dermanyssus sp. (Outgroup) Acceso a GenBank L34326 14 4.3.6 Análisis de las secuencias de ADN Las secuencias del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 completo del operón ADNr, así como las del primer espaciador interno transcrito (ITS1), el gen 5.8S ADNr y el segundo espaciador interno transcrito (ITS2), fueron analizadas para conocer la composición cualitativa y cuantitativa de nucleótidos y su longitud. Dichas secuencias se alinearon y analizaron mediante los programas Clustal W y MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versión 11.01 (Tamura et al., 2021; Jukes. ,1969), con cuyos datos se elaboraron matrices de distancia genética y porcentajes de similitud en comparación por parejas. Se tuvieron en cuenta las siguientes variaciones: 1. Variaciones interespecíficas: Es decir, diferencias entre secuencias de distintas especies, obteniendo información sobre la conservación de los fragmentos a estudiar. 2. Variaciones interpoblacionales: Nos permite observar las posibles diferencias en especímenes de una misma especie, que podrían estar favorecidas por provenir de distintas localizaciones geográficas o por proceder de hospedadores de distinta especie. 4.3.7 Análisis filogenético La interpretación de los árboles filogenéticos es fundamental para comprender las relaciones entre los organismos, sus características o características, su ecología e incluso su biología genómica y del desarrollo (Staton, 2015). Las filogenias aportan grandes cantidades de datos biológicos en un todo integrado (Baum & Offner, 2008), ya que es posible estudiar las relaciones evolutivas de la gran mayoría de niveles taxonómicos existentes a través de la observación de la evolución de los genes o de regiones del ADN que varían ampliamente (Nei, 1996). Los árboles filogenéticos creados a partir de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos se conoce como “gene tree”. Estos árboles, puede diferir de la verdadera filogenia de las especies (árbol de especies) o de otros “gene trees” ya que puede existir polimorfismo genético, tasas dispares de mutaciones o incluso errores en el proceso (desde la toma de muestra hasta en el mismo proceso de extracción o secuenciación) (Cummings et al., 1995) 15 Método de inferencia bayesiana (IB): Es un tipo de inferencia estadística en la que mediante las evidencias se deduce la probabilidad de que una hipótesis pueda ser o no cierta (Berger, 1999). Siendo este parámetro utilizado en el estudio de la filogenia, se generan árboles filogenéticos basándose en la relación entre la función de la verosimilitud y distribuciones anteriores y posteriores. Este método se ejecutó mediante el programa MrBayes 3.1.2 (Ronquist y Huelsenbeck, 2003) Método de máxima verosimilitud (Maximun Likelihood): El método de máxima verosimilitud se basa en encontrar el árbol evolutivo más probable a partir de los datos obtenidos. Sin embargo, la probabilidad se observa según el tipo de hipótesis realizada (en nuestro caso, el árbol), significando esto que las probabilidades de diferentes árboles son completamente distintas (Schmidt, 2009) Es de interés puntualizar que es necesario encontrar el método e hipótesis adecuada para nuestro análisis. En nuestro caso utilizamos el programa MEGA 11.01 (Tamura K. y Nei M.,1993; Jukes y Cantor, 1969) y FigTree versión 1.4.4. En la creación de ambos tipos de árboles filogenéticos se tiene en cuenta la elección de un taxón de referencia externa, conocido comúnmente como “outgroup”. Es de importancia aclarar también que deben enraizarse, es decir, se valora esta secuencia permitiendo distinguir si el carácter estudiado es correspondiente a un antecesor con respecto a las otras secuencias o si dicho carácter ha evolucionado y el rumbo que ha tomado (Lyons-Weiler et al., 1998). En nuestro estudio, todos los análisis filogenéticos se realizaron con los conjuntos de datos del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 y las secuencias se alinearon utilizando el programa Clustal W versión 2.0 (Larkin et al., 2007). Los alineamientos se ajustaron manualmente. Las relaciones filogenéticas se analizaron mediante métodos incluidos en el programa MEGA 11.01 de Tamura et al., (2011), La estimación filogenética de Máxima verosimilitud (ML)se realizó utilizando el paquete (PHYML) de Guindon y Gascuel (2003) y el método ML incluido en MEGA 11.01. Por otra parte, las inferencias bayesianas (B) se realizaron a partir de Mr. Bayes 3.1.2. Para el análisis bayesiano, realizamos tres ejecuciones independientes de cuatro cadenas de Markov durante 10 millones de generaciones, muestreando cada 500 generaciones. Las probabilidades posteriores bayesianas se convirtieron en porcentajes. 16 Para la inferencia ML, se utilizó el programa JMODELTEST (Posada, 2008) para determinar el modelo de sustitución más adecuado para los datos obtenidos para especies de la familia Rhinonyssidae (ITS1, 5.8S, ITS2). Los modelos de evolución se eligieron para el análisis posterior según el criterio de información de Akaike (Huelsenbeck y Rannala, 1997; Posada y Buckley, 2004). El modelo de sustitución de nucleótidos que mejor se ajustó fue el modelo JC. El apoyo a la topología del árbol se examinó mediante bootstrapping (opción heurística) (Felsenstein, 1985) sobre 1000 réplicas. 17 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.4 RESULTADOS En el análisis de las secuencias alineadas mediante los programas Mega versión 11.01 y Clustal W versión 2.0 se obtiene un alineamiento para el marcador ITSs de 576 pares de bases, encontrándose 197 posiciones conservadas y 353 variables. Se observa una escasa variabilidad entre las longitudes de las distintas secuencias, que oscilan entre 449 y 536 pb, siendo la media de 506 pb. En cuanto a la composición nucleotídica (Tabla 4), se encuentra un mayor contenido en adenina y timina: 29,6% y 31,7% respectivamente, mientras que la cifra de citosina es la menor, con 14,5% seguida de guanina, con 24,2%. Para la recolección de estos datos no se tiene en cuenta los valores del elemento externo. Tabla 4. Composición nucleotídica de las secuencias descritas en el trabajo. Especie Longitud (pb) T(U) C A G Total Tinaminyssus melloi (Zaragoza) 475 32,3 13,5 30,7 23,5 473,0 Tinaminyssus melloi (Utrera) 520 31,9 13,5 30,6 24,0 520,0 Tinaminyssus columbae (Utrera) 502 30,9 15,3 28,7 25,1 502,0 Tinaminyssus columbae (Zaragoza) 502 30,9 15,3 28,7 25,1 502,0 Tinaminyssus minisetosum 502 31,5 15,1 28,9 24,5 502,0 Tinaminyssus streptopelioides 520 30,6 13,3 31,6 24,5 519,0 Tinaminyssus streptopeliae 524 29,0 13,5 32,8 24,6 524,0 Tinaminyssus bubulci 449 30,5 13,4 31,4 24,7 449,0 Ptilonyssus hirsti (Montellano) 494 30,0 16,4 29,8 23,9 494,0 Ptilonyssus hirsti (Utrera) 494 31,0 16,2 29,4 23,5 520,0 Ptilonyssus motacillae 520 33,8 13,5 29,2 23,4 517,0 Ptilonyssus muscicapae 514 32,9 14,0 27,8 25,3 514,0 Ptilonyssus motacillae phoenicuri 514 33,7 14,4 27,0 24,9 514,0 Ptilonyssus fringillae (Montellano) 531 32,8 14,7 29,4 23,2 531,0 Ptilonyssus fringillae (Rusia) 533 33,0 14,8 29,3 22,9 533,0 Rhinonyssus. echinipes 502 32,7 12,7 30,9 23,7 502,0 Rhinonyssus himantopus 468 31,2 18,8 26,5 23,5 468,0 Rhinonyssus neglectus 506 32,4 12,6 30,4 24,5 506,0 Rhinonyssus tringae 489 32,5 13,1 28,8 25,6 489,0 Sternostoma boydi 540 30,4 15,0 29,3 25,4 540,0 Sternostoma fulicae 536 30,6 14,2 29,9 25,4 536,0 Dermanyssus sp. (Outgroup) 515 33,0 15,9 29,1 21,9 515,0 Media 506,4 31,6 14,5 29,6 24,3 507,4 18 Respecto a las longitudes del fragmento ITS1, 5,8S e ITS2, se reflejan en la tabla 5 en pares de base. Los límites de los ITS fueron determinados usando las zonas conservadas que flanquean las secuencias del 18S, 5.8 S y 28S según Navajas et al., 1999 y de Rojas et al., 2002. Tabla 5. Longitud en pares de bases de los espaciadores internos transcritos 1 y 2 (ITS1-ITS2) y del gen 5.8 del ADNr Especie ITS1 5.8S ITS2 Tinaminyssus melloi (Zaragoza) 218 184 - Tinaminyssus melloi (Utrera) 218 182 90 Tinaminyssus columbae (Utrera) 200 182 90 Tinaminyssus columbae (Zaragoza) 200 182 90 Tinaminyssus minisetosum 201 181 90 Tinaminyssus streptopelioides 218 182 90 Tinaminyssus streptopeliae 218 182 94 Tinaminyssus bubulci 198 181 - Ptilonyssus hirsti (Montellano) 214 189 - Ptilonyssus hirsti (Utrera) 214 189 87 Ptilonyssus motacillae 214 191 82 Ptilonyssus muscicapae 213 189 82 Ptilonyssus motacillae phoenicuri 213 189 82 Ptilonyssus fringillae (Montellano) 226 188 87 Ptilonyssus fringillae (Rusia) 226 188 89 Rhinonyssus. echinipes 206 177 89 Rhinonyssus himantopus 197 181 90 Rhinonyssus neglectus 210 177 89 Rhinonyssus tringae 193 177 89 Sternostoma boydi 236 184 90 Sternostoma fulicae 232 184 90 19 T. melloi (Zaragoza) T. melloi (Utrera) T. columbae (Zaragoza) T. colummba e (Utrera) T. minisetos um T. streptopelioid es T.streptopeli ae T.s bubulci P. hirsti (Montell ano) P. hirsti (Utrera) P.motaci llae P. muscicap ae P.motaci llae phoenicu ri P. fringillae (Montell ano) P. fringillae (Rusia) R. echinipes R. himantop us R.neglectu s R. tringae S. boydi S.fulicae Dermanyssus sp. (Outgroup) T.melloi (Zaragoza) 100 84,5 84,5 86,3 86,6 89,2 83,7 77,4 75,9 80,9 79,3 81,4 78,5 78,3 73,3 70,8 74,3 74,8 78,1 77,8 78 T. melloi (Utrera) 0,00 83,9 83,9 85,6 86,5 88,9 83,3 76,7 74 80,4 79 80,9 78,3 78 72,9 70,5 74,1 74,7 78 77,6 77,4 T.columbae (Zaragoza) 0,23 0,21 100 96 82,5 83,7 83,2 79,2 75,9 82,3 81,8 82,8 80,7 80,2 75 73,1 76 75,9 78,5 79,5 77,4 T.columbae (Utrera) 0,23 0,21 0,00 96,00 82,50 83,7 83,2 79,2 75,9 82,3 81,8 82,8 80,7 80,2 75 73,1 76 75,9 78,5 79,5 77,4 T. minisetosum 0,20 0,19 0,05 0,05 83,50 85,90 85,2 80 76,7 83,2 83,2 84 81,8 81,3 76,2 73,8 77,8 77,4 79,3 81,1 78 T.streptopelioide s 0,18 0,17 0,23 0,23 0,22 90,80 83,00 76,7 74,8 80 79 79,7 78,1 77,8 73,6 72,2 75,5 75,5 79,2 78,8 77,4 T.streptopeliae 0,14 0,14 0,22 0,22 0,18 0,11 85,20 76,90 73,8 81,8 81,3 82,1 77,8 77,4 74,5 72,9 75,3 75,7 79,5 79,5 77,3 T. bubulci 0,25 0,25 0,27 0,27 0,23 0,26 0,22 79,50 76,70 80,7 80,2 79,7 77,6 77,4 76,6 73,3 78,5 79,3 79,9 80,4 75,5 P. hirsti (Montellano) 0,36 0,35 0,32 0,32 0,30 0,35 0,34 0,34 96,70 82,10 82,1 82,5 86,3 85,9 74,8 73,6 75 76,4 79,7 80 77,4 Ptilonyssus hirsti (Utrera) 0,38 0,38 0,36 0,36 0,34 0,36 0,38 0,39 0,04 78,30 78,10 78,8 83 82,5 71,7 71,9 71,7 73,4 76,4 76,9 75,3 P. motacillae 0,29 0,27 0,24 0,24 0,23 0,27 0,24 0,31 0,25 0,30 91,30 93,20 82,5 82,1 79 72,6 78,5 79,3 80,4 81,8 79,2 P. muscicapae 0,32 0,29 0,25 0,25 0,23 0,29 0,25 0,32 0,25 0,30 0,10 90,60 82,30 81,9 78,1 72,6 76,9 78,8 80,9 82,5 79,2 P. motacillae phoenicuri 0,28 0,26 0,24 0,24 0,22 0,28 0,24 0,33 0,25 0,29 0,08 0,11 82,60 82,10 77,6 72,6 77,9 78,6 79,7 81,9 78,6 P. fringillae (Montellano) 0,33 0,30 0,27 0,27 0,25 0,30 0,30 0,37 0,18 0,22 0,23 0,23 0,23 99,50 76,00 73,4 76,9 77,6 79 80,4 77,3 P. fringillae (Rusia) 0,33 0,30 0,27 0,27 0,26 0,30 0,31 0,37 0,19 0,23 0,24 0,24 0,24 0,01 75,50 73,30 76,4 77,1 79 80,2 77,1 R.echinipes 0,45 0,41 0,38 0,38 0,35 0,39 0,38 0,41 0,40 0,44 0,30 0,32 0,33 0,35 0,36 72,60 93,5 91 75 75,5 73,8 R himantopus 0,54 0,52 0,47 0,47 0,46 0,47 0,46 0,49 0,48 0,49 0,48 0,48 0,48 0,45 0,45 0,48 73,1 74,5 72,7 72,7 70,1 R. neglectus 0,43 0,38 0,36 0,36 0,33 0,35 0,36 0,37 0,39 0,43 0,31 0,33 0,32 0,33 0,34 0,08 0,47 94,1 76,4 77,3 76 R tringae 0,44 0,39 0,37 0,37 0,34 0,37 0,37 0,36 0,38 0,42 0,30 0,31 0,32 0,33 0,34 0,11 0,46 0,07 76,4 77,8 76,4 S. boydi 0,33 0,30 0,30 0,30 0,29 0,28 0,27 0,32 0,29 0,33 0,26 0,26 0,28 0,28 0,28 0,36 0,46 0,34 0,35 91,5 79,00 S. fulicae 0,34 0,31 0,28 0,28 0,26 0,29 0,27 0,31 0,29 0,32 0,24 0,23 0,24 0,26 0,26 0,35 0,46 0,32 0,32 0,10 79,50 Dermanyssus sp. (Outgroup) 0,35 0,32 0,33 0,33 0,32 0,32 0,32 0,43 0,34 0,35 0,29 0,29 0,30 0,32 0,32 0,39 0,54 0,35 0,36 0,29 0,28 Tabla 6: Matriz de distancias genéticas (esquina inferior izquierda) y % de similitud entre las mismas (esquina superior derecha) entre las distintas especies consideradas en este estudio. 20 Figura 3: Árbol filogenético de diferentes géneros y especies de la familia Rhinonyssidae basado en el fragmento ITS1-5.8S-ITS2. La filogenia se ha inferido mediante los métodos Bayesiano (B) y de Máxima Verosimilitud (ML), y muestra topología bayesiana. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba Bootstrap (1.000 réplicas) se muestra en las ramas (B/ML). Las probabilidades posteriores bayesianas (BPP) se han convertido en porcentajes. También se muestran esquemas de los quelíceros que presentan los distintos géneros. 21 4.5 DISCUSIÓN 4.5.1 Sobre el estudio de las secuencias consideradas y sus relaciones. La cuestión de la delimitación de especies en la genética molecular sigue siendo un problema por resolver, porque no existe un límite objetivo en el que se pueda indicar que dos especies son distintas (Morelli and Spicer, 2007). Sin embargo, Dobler y Farrell (1999) han observado que en el caso de los organismos parásitos “el flujo de genes entre las poblaciones de parásitos en diferentes especies de hospedadores puede ser limitado, incluso si los parásitos no son 100% específicos". Esta estructura puede favorecer la formación de razas, o la especiación. En este trabajo pretendemos resolver en la medida de lo posible algunas de estas situaciones en especies de la familia Rhinonyssidae. Así, cuando se alinearon los fragmentos de la región ITS1-5.8S-TS2 de las especies consideradas en el presente estudio se obtuvo un alineamiento con 576 posiciones incluyendo los gaps, con 197 conservadas y 353 variables. Estos valores son similares a los obtenidos para otros análisis de este fragmento en otras especies de rinonísidos (de Rojas et al., 2002; de Rojas et al., 2006). Asimismo, la longitud del marcador considerado en las diferentes especies estudiadas y que se muestran en la tabla 5, son también similares a los obtenidos por de Rojas et al., (2006), para especies del género Rhinonyssus, entre 515 pb para R. tringae y 533 en R. vanellus o 584 pb para Sternostoma boydi (de Rojas et al., 2002) así como los de otros representantes de la superfamilia Dermanysoidea como Dermanyssus longipes (FM179377). En la tabla 5 se muestran las longitudes en pares de base de los espaciadores internos transcritos 1 y 2 (ITS1-ITS2) y del gen 5.8s del ADNr. La longitud del ITS1 varió entre los 232 pb en Sternostoma fulicae y los 193 en Rhinonyssus tringae. El gen 5.8 S ADNr osciló entre 189 pb en Ptilonyssus hirsti y 177 en Rhinonyssus echinipes. El ITS2 fue menos variable en tamaño, todas las especies con valores muy cercanos a 90. Estos valores son muy parecidos a los encontrados por de Rojas et al., 2002 y de Rojas et al., 2007. Además, cuando se consulta la base de datos GenBank, los miembros de la superfamilia Dermanysoidea (Dermanyssus longipes FM179377 y Androlaelaps casalis AM903317 muestran valores similares para el ITS1 y para el gen 5.8s ADNr, siendo el ITS2 sensiblemente más corto (73 y 62 pb respectivamente). Respecto al porcentaje en el contenido de las distintas bases queda reflejado en la tabla 4. Como puede observarse, es prácticamente idéntico al obtenido por de Rojas et al. (2002) para un menor número de especies de rinonísidos. 22 En cuanto a la variabilidad de los distintos fragmentos, y como era de esperar, el gen 5.8S ADNr es la región más conservada, mientras que el ITS1 es la más larga y variable. Finalmente, el ITS2 es el fragmento más corto y curiosamente bastante conservado. Este hecho ya había sido observado por Navajas et al. 1999 en ácaros de la familia Phytoseiidae y por de Rojas et al., 2002 en representantes de Rhinonyssidae. Por otra parte, cuando se compararon por pares el fragmento ITS1-5.8SITS2 de todas las especies consideradas en este estudio, se obtuvieron porcentajes de similitud y distancias genéticas para cada pareja de taxa (Tabla 6). Del análisis de los datos de distancias genéticas y porcentajes de similitud pueden deducirse aportaciones significativas. Así, observamos que existen especies como T. columbae y T. minisetosum que son muy similares desde el punto de vista morfológico y sólo la longitud de sedas dorsales parece un carácter válido para su separación. La distancia entre ambas es de sólo 0,05 y el porcentaje de similitud de 96% el más alto para especies aceptadas como diferentes. De forma análoga, T. streptopeliae de Streptopelia decaocto y T. streptopelioides procedente de Streptopelia turtur son dos especies prácticamente indiferenciables y posiblemente sus citas en la literatura han sido, a menudo, intercambiadas. No obstante, la distancia genética es más del doble que en el caso anterior y su porcentaje de similitud del 90,8%, por lo que pueden considerarse especies crípticas, como ya adelantó de Rojas et al., (2018). Los mismos valores en distancias y porcentajes de similitud presentan especies de otros géneros como Sternostoma fulicae y S. boydi (0,10 y 91,5%) procedentes de especies de aves acuáticas, lo que ha podido influir en el intercambio de los parásitos al compartir hábitat próximo sus hospedadores. Otro grupo de especies con caracteres morfológicos tremendamente similares son las especies del “grupo coniventris” del género Rhinonyssus (R. echinipes, R. tringae y R. neglectus) cuyos hospedadores comparten también hábitats acuáticos. En este caso, las distancias genéticas oscilan entre 0,07 y 0,08 y la similitud entre el 94,1 y el 93,5%. La enorme distancia que se muestra entre R. himantopus y el resto de las especies de este género incluidas en este estudio puede deberse, por una parte, a que esta especie no se incluye en el denominado grupo coniventris, y por otra porque los ácaros han sido localizados en Himantopus mexicanus, ave que no se encuentra en Europa. Sería interesante poder estudiar ácaros procedentes de la cigüeñuela europea Himantopus himantopus. 29 6 BIBLIOGRAFÍA Amaral VD, Reboucas M M.Notes on rhinonyssid mites from Brazilian birds (MesostigmataRhinonyssidae). Biologico (Brazil).1974. Baum DA, Offner S. Phylogenics & tree-thinking. Am. Biol. Teach. 2008; 70:222-229. Berlese A ,Trouessart E. Diagnoses d’Acariens nouveaux ou peu connus. Bull. De la Bibl. Scient. De L’Quest; 1889; 2 an., 2 pt (9): 121-143. Berlesse A , Trouessart E. Diagnoses d’Acariens nouveaux ou peu connus. Bull. De la Bibl. 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