Métodos analíticos en la detección del dopaje

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA MÉTODOS ANALÍTICOS EN LA DETECCIÓN DEL DOPAJE DEPORTIVO Juan Antonio Crespo Perea UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA GRADO EN FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO “MÉTODOS ANALÍTICOS EN LA DETECCIÓN DEL DOPAJE” Autor: Juan Antonio Crespo Perea Tutor: Ramón Aparicio Ruiz TRABAJO FIN DE GRADO DE CARÁCTER BIBLIOGRÁFICO Sevilla, Julio 2022 ÍNDICE 1. RESUMEN ........................................................................................................................... 1 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 3 2.1. Contexto histórico del dopaje. .................................................................................... 3 2.1.1. Contexto histórico a nivel deportivo. .................................................................... 3 2.2. Definición del dopaje y sustancias productoras de este. .......................................... 4 2.2.1. Definición del dopaje. ........................................................................................... 4 2.2.2. Sustancias dopantes. .............................................................................................. 5 2.3. Métodos prohibidos ................................................................................................... 10 2.3.1. Manejo de sangre o componentes de la sangre. .................................................. 11 2.3.2. Manipulación química y física. ........................................................................... 11 2.3.3. Dopaje genético ................................................................................................... 11 2.4. Abordaje del dopaje en la oficina de farmacia ....................................................... 12 3. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 14 4. METODOLOGÍA ............................................................................................................. 15 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 16 5.1. Recogida y preparación de muestras. ...................................................................... 16 5.2. Análisis de la muestra. .............................................................................................. 19 5.2.1. Cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (CG/EM) ......... 20 5.2.2. Inmunoensayo. .................................................................................................... 25 5.2.3. Isoelectroenfoque (IEF) y posterior detección por quimioluminiscencia. .......... 27 5.2.4. Cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (CL/EM). ........... 29 5.3. Otras sustancias dopantes. ....................................................................................... 33 6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 34 7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 35 1 1. RESUMEN El dopaje consiste en el uso de sustancias por parte del deportista con el objetivo de mejorar el rendimiento físico. La Agencia Mundial Antidopaje (AMA) ha elaborado una lista oficial de métodos y sustancias prohibidas en el ámbito deportivo, entre las cuales se encuentran algunos fármacos de uso cotidiano como los glucocorticoides, agonistas beta 2, diuréticos, etc. Esta revisión bibliográfica tiene como objetivo analizar los métodos analíticos actuales utilizados para detectar el dopaje deportivo. Además de ello, conocer la normativa que afecta a la recogida de muestras, así como los procedimientos y el transporte de esta. El análisis de muestras (orina o sangre) para la detección de sustancias dopantes se realiza preferentemente por cromatografía líquida (CL) o gaseosa (CG). La característica principal de estos métodos es que se ponen en contacto dos fases, una estacionaria y otra móvil, mutuamente inmiscibles. La diferencia entre ambas cromatografías reside en el estado en el que se encuentra la fase móvil. Estas técnicas suelen ir acopladas a la espectrometría de masas (EM) para facilitar la detección de las sustancias dopantes. Su fundamento se basa en ionizar la muestra y posteriormente separar los iones en función de su relación masa/carga. El resultado es un espectro que se puede definir como la “huella digital” de la muestra que se analiza. También se pueden utilizar otras técnicas analíticas como la electroforesis-quimioluminiscencia o los inmunoensayos, tal como se menciona en el código mundial antidopaje estándar internacional de laboratorios. El dopaje es uno de los principales problemas que afecta al deporte en la actualidad, y es por ello, que se utilizan métodos analíticos de elevada sensibilidad y especificidad para eliminarlo, como las técnicas cromatográficas acoplada a la espectrometría de masas. Palabras clave: dopaje deportivo, sustancia dopante, método analítico, cromatografía, espectrometría de masas. 2 Abreviaturas: - ACTH: Corticotrofinas. - ADN: Ácido desoxirribonucleico. - AEMPS: Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios. - AEPSAD: Agencia Española de Protección de la Salud y el Deporte. - AMA: Agencia Mundial Antidopaje. - AMEFIDE: Asociación de la Medicina de la Educación Física y el Deporte. - API: Ionización química a presión atmosférica - AUT: Autorización de Uso Terapéutico. - CACOF: Consejo Andaluz de Colegios Oficiales de Farmacéuticos. - CAUT: Comité de Autorizaciones de Uso Terapéutico. - CG/EM: Cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas. - CIMA: Centro de información de medicamentos. - CL/EM: Cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas. - COI: Comité Olímpico Internacional. - DTT: Ditiotreitol o Reactivo de Cleland - EAA: Esteroides androgénicos anabolizantes. - EPO: Eritropoyetina. - ESI: Fuente de ionización por electroaspersión. - FEMEDE: Federación Española de Medicina del Deporte. - FIP: Federación Internacional Farmacéutica. - HCL: Ácido clorhídrico. - hGh: Hormona de crecimiento. - HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento. - HTA: Hipertensión arterial. - IEF: Isoelectroenfoque. - Ig: Inmunoglobulina. - LH: Hormona luteneizante. - MBTFA: N-metil-bis(trifluoroacetamida). - MRPL: Límite mínimo de rendimiento requerido. - M/z: Masa/carga. - NESP: Novel Erythropoiesis Stimulating Protein - OCD: Oficial de control. - PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. - Psi: Libras por pulgada cuadrada. - PVDF: Fluoruro de polivinilideno. - RCF: Fuerza centrífuga relativa. - rhEPO: Eritropoyetina humana recombinante. - SIM: Método de monitoreo selectivo de iones. - tr: tiempo de retención. - Tris: tris-(hidroximetil)-aminometano. - VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular. 3 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Contexto histórico del dopaje. El dopaje se puede considerar uno de los principales problemas en la época actual del deporte. Sin embargo, la realidad es que el consumo de sustancias ergogénicas surge a la vez que el nacimiento del propio ejercicio físico. En el origen del dopaje destacan el uso de sustancias naturales como la muscarina, procedente del hongo “Amanita muscaria”, la cual es estimulante del parasimpático. También destacan en las civilizaciones chinas el uso de compuestos estimulantes como “Ma Huang”, al poseer efedrina, o la raíz de ginseng (Panax ginseng). En el continente americano destacan el mate, la psilocibina, el yagé, la mescalina y principalmente la coca, las cuales presentan efectos estimulantes, anorexígenos o alucinógenos. Con respecto a Oriente Medio y África nos encontramos con la catina, procedente de la planta “Catha edulis” con efectos estimulantes parecidos a la norefedrina, y la mandrágora (Mandragora autummalis), productora de efectos afrodisíacos, narcóticos o tóxicos. Una vez que el dopaje incrementó su transcendencia y relevancia en el mundo contemporáneo, surgen nuevos compuestos sintéticos utilizados para el doping como las anfetaminas. Ésta sustancia fue utilizada durante la Segunda Guerra Mundial o la guerra de Corea (López Gómez, 2010). Los primeros esteroides anabolizantes fueron utilizados por los levantadores de peso soviéticos en el 50. En el caso de los pilotos, se utilizó la transfusión de sangre y la ingesta de anfetaminas para aumentar la eficiencia y estimulación en vuelos nocturnos (Rodríguez-Pérez et al., 2015). Hoy en día, podemos decir que nos adentramos en una nueva fase del dopaje en base a los avances biotecnológicos como el desciframiento del genoma humano por James D. Watson. En esta etapa surge el dopaje genético (Atienza Macías et al., 2014). 2.1.1. Contexto histórico a nivel deportivo. Con el inicio de los Juegos Olímpicos en Grecia (776 a.C.), comienza el uso de pócimas, alimentos o brebajes para aumentar el rendimiento físico (López Gómez, 2010). Sin embargo, este tipo de dopaje era diferente al actual; se caracterizaba por el consumo de cocimientos de plantas, en el caso de los corredores para evitar la congestión, como la cola de caballo. También era habitual la ingesta de varios tipos de carne, como la de cabra, toro o cerdo, por atletas, lanzadores o boxeadores (Alfaya, 2018). Con el surgimiento del deporte moderno, se comienzan a usar compuestos farmacológicos. Hasta entonces, el dopaje era un acto no sancionado, e incluso aceptado por el mundo del deporte debido al desconocimiento de sus efectos. El primer caso detectado se atribuyó a un 4 grupo de nadadores en el canal de Ámsterdam que usaron una sustancia desconocida para aumentar su rendimiento. En la carrera de París-Burdeos (1886) se produjo la primera muerte documentada por dopaje del ciclista Arthur Linton, el cual consumió una mezcla de estupefacientes (Rodríguez-Pérez et al., 2015). El atleta Thomas Hicks en las Olimpiadas de St. Louis (1904) consumió alcohol y estricnina, las cuales le ayudaron a finalizar victorioso la carrera (Atienza Macías et al., 2014). En los Juegos Olímpicos de Londres (1908) el atleta Dorando Pietri ingirió estricnina produciéndole varias caídas a lo largo de la maratón. Debido a esto, surge la frase “lo importante no es ganar, sino participar” en la ceremonia de clausura de dichos juegos pronunciada por Pierre de Coubertin (Rodríguez-Pérez et al., 2015). También destaca la muerte televisada del ciclista Tommy Simpson durante el Tour de Francia (1967) (Marco et al., 2009) por el consumo de anfetaminas (Rodríguez-Pérez et al., 2015). La mayoría de estos casos fueron los causantes del cambio de perspectiva que se tenía del dopaje. A partir de este momento se incrementan las medidas antidoping y surgen laboratorios para el control de éste. En el año 1960 el Consejo Europeo publicó una sentencia contra el consumo de sustancias dopantes (Rodríguez-Pérez et al., 2015). En 1961 surge el primer laboratorio antidoping en Florencia, Italia (Casajús Mallén, 2005). El Comité Olímpico Internacional (COI) se une a la política antidoping en los Juegos Olímpicos de México (1968) (Marco et al., 2009) mediante la realización de controles de orina a los deportistas. Sin embargo, los análisis de orina se consideraron posteriormente técnicas poco desarrolladas desde un punto de vista técnico y sólo servían para un número limitado de drogas (Atienza Macías et al., 2014). Entre 1988 y 1998 se producen los siguientes hechos: positivo en esteroides de Ben Johnson y suceso Festina, y con ellos el COI produce cambios en la forma de realizar los exámenes de orina, haciéndolos de manera esporádica a lo largo de la temporada (Alfaya, 2018). Finalmente, surge la Agencia Mundial Antidopaje (AMA) en 1999 y con ella toda la normativa y directrices a seguir por parte de los países y delegaciones deportivas (Casajús Mallén, 2005). 2.2. Definición del dopaje y sustancias productoras de este. 2.2.1. Definición del dopaje. Hoy en día existen muchas definiciones formales elaboradas por las diferentes agencias nacionales e internacionales involucradas en el mundo del dopaje. Entre ellas destacamos la definición de la AMA: Según el Artículo 1 del Código Mundial Antidopaje (2021) define el dopaje como “la comisión de una o varias infracciones de las normas antidopaje, siendo dichas infracciones: 5 - Presencia de sustancias prohibidas, sus metabolitos o marcadores en la muestra biológica del deportista. - Uso o intento de utilización de una sustancia o método prohibido. - Evitar o negarse a someterse a la recogida de muestras. - Localización fallida del deportista. - Manipulación o su intento en cualquier parte del proceso de control del dopaje. - Posesión o tráfico de una sustancia o un método prohibido. - Administración a un deportista durante o fuera de la competición, de una sustancia o método prohibidos” (AMA, 2021a). Según la Comisión de Dopaje en Medicina del Deporte de la Asociación de la Medicina de la Educación Física y el Deporte (AMEFIDE) y de la Federación Española de Medicina del Deporte (FEMEDE) plantea la siguiente definición: “Toma o aplicación de sustancias por parte del deportista, con el fin de mejorar su rendimiento, que pueden resultar peligrosas para la salud como consecuencia de las siguientes circunstancias: - Las propias características de riesgo de las sustancias empleadas. - La inducción de cambios en el entorno vital del deportista que impliquen la aparición o incremento de riesgo para el mismo. - La utilización de dosis masivas de sustancias. - La combinación de diversas sustancias” (Marqueta, 2001). Obviamente, como en muchos otros países, en España, el dopaje está tipificado como delito según el Artículo 362 quinquies del Código Penal, y está dentro del ámbito de aplicación en función de la Ley Orgánica 3/2013, de 20 de junio, de Protección de la salud del deportista y lucha contra el dopaje en la actividad deportiva. 2.2.2. Sustancias dopantes. A lo largo de los años la lista de sustancias y métodos prohibidos en competición ha ido modificándose y evolucionando según la situación científica y deportiva del momento. Entre las primeras listas que surgen encontramos la “Lista de 1966 del Consejo de Europa”, que incluye narcóticos, anfetaminas y sus derivados, estricnina, trinitroglicerina, éter dietílico, fenilmetilmorfolina y dialcohilamidas del ácido crotonilalcohilaminobutírico. A continuación, es la “Lista de 1972 del Comité Olímpico Internacional” la que constituye una importante evolución pasando de prohibir sustancias aisladas a prohibir grupos farmacológicos (aminas simpaticomiméticas, analgésicos narcóticos y derivados, diversos estimulantes del sistema nervioso central y estimulantes psicomotores). Listas posteriores incluyen diuréticos y 6 hormonas peptídicas como la eritropoyetina, así como métodos como el dopaje sanguíneo o el dopaje genético. Finalmente, en la “Lista de 2009 del Comité Olímpico Internacional” se dividen las sustancias en aquellas que están prohibidas siempre y las que están prohibidas durante la competición. También, algunas sustancias como los betabloqueantes y el alcohol sólo estarán prohibidas en determinadas modalidades deportivas. Incluso, se permite el uso de ciertas sustancias siempre y cuando se justifique clínicamente su uso por parte del deportista (Alfaya, 2018). Actualmente, las sustancias prohibidas estarán dividas en tres categorías según la Agencia Mundial Antidopaje: - Sustancias que están prohibidas siempre. - Sustancias que están prohibidas en competición. - Sustancias prohibidas en ciertos deportes. 2.2.2.1. Sustancias que están prohibidas siempre. Son aquellas sustancias prohibidas tanto dentro como fuera de la competición (Tabla 1). Encontramos: ➢ Agentes anabolizantes: esteroides anabolizantes androgénicos (testosterona, nandrolona) (Roldan-Tabares et al., 2019) y sustancias con efectos biológicos o estructura química similar como clembuterol, tibolona, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, zilpaterol y zeranol (Alfaya, 2018). Se suelen usar en suplementos deportivos u otros productos y sólo si las cargas de entrenamiento y las dosis usadas son altas producirán un incremento de la masa muscular, peso y efecto estimulante. Entre los problemas adversos más frecuentes se encuentran la detención del crecimiento, atrofia testicular, acné, caída del cabello, ginecomastia, hirsutismo, amenorrea, calvicie (Marqueta, 2001). Únicamente la testosterona será cuantificada debido a su producción endógena por el organismo; el resto de los esteroides anabolizantes androgénicos serán considerados positivos por poca cantidad que se detecte en orina (Gordillo, 1999). ➢ Hormonas peptídicas, factores de crecimiento, sustancias afines y miméticos: eritropoyetina (EPO), corticotrofinas (ACTH) o hormona de crecimiento (hGh) (Roldan-Tabares et al., 2019). En el caso de la EPO incrementa la hemoglobina y los glóbulos rojos en sangre, favoreciendo el transporte de oxígeno, pero pudiendo desencadenar hipertensión arterial (HTA), policitemia e incluso un accidente tromboembólico. La ACTH puede desencadenar fenómenos de euforia (Marqueta, 2001). Sin embargo, tiene efectos contraproducentes como reacciones alérgicas, HTA, retención de fluidos o síndrome de Cushing (Garro Zamora, 2013). Por último, la hGh incrementa la masa muscular, reduce el peso graso e incrementa la altura en adolescentes. En contraposición, tiene efectos adversos notables 13 También el farmacéutico puede trabajar en colaboración con la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS), usando el Centro de Información de Medicamentos (CIMA) para ver la ficha técnica de los medicamentos y ver si presentan sustancias ergogénicas. También, podrían ver la lista de sustancias prohibidas propuestas por la AMA. 14 3. OBJETIVOS El objetivo principal de este trabajo bibliográfico es conocer y describir los principales métodos analíticos que se utilizan actualmente para la identificación del dopaje deportivo. Para la consecución de este objetivo principal se consideran los siguientes sub-objetivos: • Explicar cómo se produce la recogida de muestras en el área de control del dopaje y el transporte de estas hasta el laboratorio. • Conocer la documentación precisa que debe entregar el deportista en caso de competición y la necesaria en caso de que tenga algún tratamiento farmacológico concreto. • Conocer toda la normativa legal que afecta a varios ámbitos del deporte y el dopaje (deportista, laboratorio, zona de recogida de muestras, etc). Además, conocer el “límite mínimo de rendimiento requerido” para las sustancias que lo precisen. • Describir los métodos analíticos que permiten la cuantificación e identificación de sustancias dopantes en el deportista. 15 4. METODOLOGÍA El Trabajo de Fin de Grado “Métodos analíticos en la detección del dopaje” se trata de una revisión bibliográfica de artículos, libros, documentos realizados por organismos públicos, páginas web e incluso tesis doctorales y otros trabajos de fin de grado relacionados con el dopaje en el ámbito deportivo y las diferentes técnicas analíticas para su detección. Para la búsqueda de información se utilizaron bases de datos como - Google Académico. - PubMed. - Sciencedirect. - Web of Science. - Biblioteca de la Universidad de Sevilla a través del catálogo FAMA. Las palabras claves utilizadas, de manera general, fueron: “dopaje”, “doping”, “historia del dopaje”, “control dopaje”, “métodos analíticos para el control del dopaje”, “fundamentos de química analítica”, “efectos de - sustancia ergogénica – en el deportista”. Más específicamente: “cannabinoides dopaje”, “ACTH dopaje”, “dopaje genético”, “cromatografía y dopaje”, “cromatografía de gas acoplada a la espectrometría de masas dopaje”, “EPO dopaje”, cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas dopaje”, “narcóticos dopaje”, “inmunoensayos dopaje”, “electroforesis dopaje”, “cuantificación – sustancia dopante – doping”, “esteroides anabolizantes androgénicos dopaje”. Para realizar la revisión también se usaron palabras claves en inglés como: “doping”, “effects of – doping substance – doping”, “doping control”, “doping history in sports”, “analysis method of – doping substance – doping”. Más específicamente: “effects of alcohol doping in sports”, “gene doping side effects”. Para la traducción de palabras en inglés se han utilizado las siguientes páginas: “Traductor de Google” y “WordReference”. En el caso de artículos completos, el programa: “deepl”. Para la elaboración de la “Figura 1” y “Figura 2” se utilizaron imágenes procedentes de Google y posteriormente se editaron en el programa “Paint”. También se ha buscado información en las páginas web de la AEPSAD y CACOF, así como en documentos elaborados por la AMA, como el Código Mundial Antidopaje. La imagen procedente de la portada ha sido sacada de “Google Imágenes” y pertenece a un vídeo elaborado por la AEPSAD. 16 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la actualidad existen dos tipos de control del dopaje, por un lado, el control de dopaje “en competición” – en el cual pueden ser elegidos cualquiera de los deportistas implicados en la prueba -, y por otro lado, el dopaje “fuera de competición” - para deportistas incluidos en el grupo de seguimiento de la AEPSAD - (Atletismo., 2018). Según la ley española, los controles antidopaje incluyen: - Organización del control antidopaje. - Recolección, manipulación y transporte de la muestra. - Análisis de la muestra en el laboratorio. - Gestión de los resultados (Macías, 2013b). 5.1. Recogida y preparación de muestras. Según la Ley Orgánica 3/2013 (“Ley de protección de la salud del deportista y lucha contra el dopaje en la actividad deportiva), cualquier deportista puede ser elegido para proporcionar una muestra por una agencia antidopaje (Yelmo, 2014). La selección del deportista para el control será notificada al mismo a través de un oficial de control (OCD) (AEPSAD, Agencia Española de Protección de la Salud y el Deporte). Los deportistas sometidos a control pueden ser: elegidos por sorteo, por la clasificación final o por otro motivo. Se tendrá en cuenta el sexo del deportista (Baltazarova Valentinova, 2013). El Área de Control de Dopaje donde se procederá a la recogida de la muestra deberá estar compuesta por un personal cualificado: un médico y un técnico o enfermero. Según la Orden PRE/1832/2011, de 29 de Junio (por la que se regula el área de control de dopaje, el material para la toma de muestras y el protocolo de manipulación y transporte de muestras de sangre), la estación de control deberá contar con una sala de espera, una sala de trabajo para completar formularios y realizar actividades complementarias a la recogida de muestras, una sala de extracción de sangre y una sala de recogida de muestras de orina (Ministerio de educacion cultura y deporte, 2021). Las muestras generalmente pueden ser de orina o de sangre. ➢ Para muestras de sangre se realiza una extracción o venopunción con aguja estéril por sistema de vacío. La recogida se lleva a cabo en tubos de vidrio los cuales contendrán anticoagulante o gel polímero inerte separador del activador de la coagulación y el suero en casos donde se quiera analizar la sangre o el suero. Como material complementario se pueden utilizar: esparadrapos, gasas y apósitos estériles, compresor, guantes desechables, una solución desinfectante que no interfiera 17 en el proceso de identificación de sustancias dopantes y un contenedor para residuos de riesgo o sanitarios. El transporte al laboratorio de las muestras de sangre se realizará en un depósito que evite la exposición solar directa y que permita la posición vertical de los tubos de vidrio. Los tubos de vidrio portadores de la sangre se introducirán en dos frascos de vidrio (un frasco A y un frasco B), los cuales estarán identificados con un código común correspondiente a un deportista. Ambos frascos deberán estar cerrados por dos tapones que se abren mediante rotura mecánica. Cada frasco se introducirá en una bolsa de plástico transparente, la cual debe incluir una bolsa con material adsorbente y al menos 8 etiquetas adhesivas con el código del deportista (Ministerio de educacion cultura y deporte, 2021) (Figura 1). Una vez en el laboratorio acreditado por la AMA se procederá al análisis de la muestra. Figura 1. Esquema de la recogida y preparación de las muestras de sangre. ➢ Para muestras de orina el deportista, en primer lugar, debe elegir el recipiente para la recogida de muestras. Una vez seleccionado, se procederá a la recogida de orina y para ello tiene que dejar libre de ropa desde la cintura hasta la rodilla para que el OCD pueda observar la emisión. El volumen de orina no debe ser inferior a 80 mililitros. La orina recogida será almacenada en frascos de vidrio (frasco A y frasco B) (BOE, 2011). Como mínimo los frascos deben poseer las siguientes características: ser de vidrio resistente, que incluyan algún procedimiento para evitar que se produzca un cierre accidental, capacidad de al menos 100 mililitros cada uno y deben garantizar que 18 la identidad del deportista no aparezca en ellos. Además, cada frasco estará identificado con un código común correspondiente a cada deportista, el cual constará de seis dígitos. Los frascos deben estar cerrados herméticamente y para ello se utilizan tapones que impiden la salida de muestra. Para el envío de muestras de orina al laboratorio se debe utilizar un contenedor que posea las siguientes características: - Para el transporte de muestras que no requieran congelación ni refrigeración, los frascos se incorporan en una bolsa de seguridad precintada. - Para el envío de muestras que se necesiten conservar congeladas o refrigeradas se utilizará una bolsa de seguridad precintada, la cual debe poder resistir los requerimientos de temperatura exigidos. En este caso, a las muestras de orina se les debe agregar acumuladores del frío para mantener las temperaturas (Ministerio de educacion cultura y deporte, 2021) (Figura 2). El OCD además debe medir la densidad de la orina y el pH utilizando el refractómetro y las tiras reactivas de orina respectivamente (BOE, 2011). Se procederá al análisis de la muestra una vez se encuentre en el laboratorio acreditado por la AMA. Figura 2. Esquema de la recogida y preparación de las muestras de orina. Todo esto viene regulado por el Real Decreto 641/2009, de 17 de abril (por el que se regulan los procesos de control de dopaje y los laboratorios de análisis autorizados, y por el que se establecen medidas complementarias de prevención del dopaje y de protección de la salud en el deporte) (BOE, 2011). Por último, el deportista tiene la obligación de firmar el Formulario de Control de Dopaje, el cual consta de cinco hojas dirigidas a: 19 - Autoridad de Control: Agencia Española de Protección de la Salud en el Deporte, Federación Internacional u organismo internacional competente. - Al deportista. - Autoridad de Recogida: Agencia Española de Protección de la Salud en el Deporte u organismo encargado en la toma de muestras. - Al laboratorio que se encarga del control del dopaje. Los datos que cumplimentar de manera obligatoria son: - Datos identificativos del deportista (nombre, apellidos, nacionalidad, tipo de documentado utilizado para la identificación y número). - Tipo de muestra a recoger. - Fecha y hora de la notificación. - Nombre y apellidos del personal sanitario que realiza la notificación. - Firma del personal sanitario que realiza la toma de muestras. - Firma del deportista (Ministerio de Cultura y Deporte, 2021). En casos donde el deportista esté bajo un tratamiento farmacológico que incluya sustancias dopantes prohibidas por la AMA será necesario solicitar una Autorización de Uso Terapéutico (AUT). Las condiciones para pedir la AUT son: - Demostrar el padecimiento de una determinada patología. - Que la sustancia o método prohibido es necesario para esa patología. - Que no existe otra alternativa farmacológica. - Que existen bajas probabilidades de que el tratamiento produzca una mejora de tu rendimiento. La solicitud se debe realizar lo más pronto posible a la AEPSAD, si es a nivel nacional, o a tu federación internacional y será aceptada y validada por el Comité de Autorizaciones de Uso Terapéutico (CAUT) (AEPSAD, s.f.). 5.2. Análisis de la muestra. Una vez la muestra se encuentre en el laboratorio, es el momento de analizarla. Para ello el laboratorio debe tener una serie de requerimientos (norma ISO/IEC 17025) (World Anti-Doping Agency, 2009): - Competencias humanas. - Instalaciones y condiciones ambientales adecuadas. - Métodos de ensayo y calibración. - Procedimientos de ensayo validado. 20 - Procedimientos y métodos óptimos de ensayo que aseguren la calidad de los resultados y permitan la acreditación del laboratorio (Consejo Superior de Deportes, 2008). Ahora bien, un método analítico es aquella técnica que se utiliza para identificar que sustancias puede haber presente en un material y para determinar las cantidades exactas de dicha sustancia (Gary D, 2009). En el análisis de las sustancias dopantes vamos a distinguir varios tipos de técnicas: - Cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (CG/EM). - Inmunoensayo. - Isoelectroenfoque (IEF) y posterior detección por quimioluminiscencia. - Cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (CL/EM). En el código mundial antidopaje estándar internacional para laboratorios (norma ISO/IEC 17025) se menciona que de elección para el análisis de sustancias dopantes son la CG/EM y la CL/EM. Sin embargo, también se pueden utilizar otros como el inmunoensayo o la electroforesis para algunas moléculas (hGh o EPO, respectivamente) (AMA, 2021b). Además, para cada sustancia la AMA establece un “Límite mínimo de rendimiento requerido (MRPL)” que viene recogido en el documento técnico de la AMA “TD2022MRPL” (WADA, 2022). Esto quiere decir que, si el resultado analítico del análisis de una sustancia es superior al MRPL, se reportaría. Este MRPL sólo es válido para las técnicas cromatográficas y espectrometría de masas. 5.2.1. Cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (CG/EM) La cromatografía de gases (GC) es una de las técnicas más utilizadas para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos (Gary D, 2009). La característica principal de este método analítico es que permite que los componentes de una muestra vaporizada se dividan al ser distribuidos entre una fase móvil y una fase estacionaria, la cual está retenida en una columna (Skoog et al., 2015). Existen dos tipos de CG, cromatografía de gas-sólido y cromatografía de gas-líquido, siendo la principal diferencia entre ambas el estado de la fase estacionaria (Gary D, 2009). Esta técnica utiliza como fuente móvil un gas inerte cuya función principal es trasladar los componentes de la muestra, permitiendo que éstas fluyan a través de la columna de fase fija (Skoog et al., 2015). Los compuestos a determinar deben ser volátiles y estables a las temperaturas utilizadas (50-300 ºC). Por ejemplo: gases, compuestos organometálicos, mayoría de compuestos orgánicos no ionizados, sólidos o líquidos que posean hasta unos 25 carbonos (Gary D, 2009). Si no se 21 pudiera cumplir estos requisitos, se recurre al proceso de derivatización a través del cual se modifica químicamente una sustancia dando lugar a un derivado con mejoras en su volatilidad o estabilidad térmica y, por tanto, facilitando su detección (Macián, 2016). Encontramos dos tipos de columnas en la CG: columna empacada y columna capilar (Skoog et al., 2015), siendo ésta última la más usada debido a su elevada eficacia de separación y con ello reduce el tiempo de análisis y el volumen de muestra (Macián, 2016). En conclusión, con esta técnica se permite separar mezclas muy complejas, aunque a veces no es posible y se le acopla la espectrometría de masas (EM) como sistema de detección. La espectrometría de masas es un método que consiste en ionizar y detectar las moléculas y átomos mediante su relación masa/carga (m/z) (Macián, 2016). Se puede utilizar para todo tipo de muestras. Los componentes básicos de un espectrómetro de masas serían un sistema de entrada de la muestra, el cual la impulsa hacia la fuente de iones donde los componentes de la muestra se transforman en iones gaseosos a través del choque de electrones, iones, fotones o moléculas. Estos iones salen hacia el analizador de masas, el cual los divide según su m/z, se recolectan y son transformados en una señal eléctrica. Además, requieren un sistema de vacío para asegurar una baja presión garantizando una frecuencia de colisión baja entre las diferentes especies químicas en el EM. Finalmente presentan un sistema de manipulación de datos que realiza el procesamiento de los resultados con el objetivo de producir el espectro de masas (Skoog et al., 2015). Encontramos dos tipos de analizadores de masas: cuadripolar, el cual permite el pasos de iones específicos y presenta como ventajas la alta rapidez de transmisión, son pocos costosos y son compactos, y analizador de tiempo de vuelo, utilizados para el análisis de iones de gran masa (Gary D, 2009). 5.2.1.1. Análisis de los esteroides androgénicos anabolizantes (EAA). Testosterona. Para este grupo de sustancias dopantes se usará la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas como método de elección. Previamente será necesario preparar la muestra (orina) mediante (Bueno, 1993): - Hidrólisis enzimática: para separar los enlaces entre el ácido glucurónico y el compuesto. - Extracción y secado: para ello se utilizará éter y se irá añadiendo poco a poco una disolución de timolol y metiltestosterona. El objetivo de esta fase será trasladar los compuestos de interés a la fase orgánica y finalmente purificar y concentrar. - Derivatización: bloqueando los grupos termolábiles para mejorar las propiedades cromatográficas (Consejo Superior de Deportes, 2016). Generalmente la derivatización 22 utilizada consiste en una reacción de silanización, en la cual se transforman los grupos hidroxilos en grupos trimetilsilanoles (Torres, 2013). Posteriormente, la muestra ya preparada puede analizarse mediante la CG/EM. Las características de este método serían: • Necesaria la conversión química de los esteroides para mejorar su estabilidad química (preferiblemente aquellas moléculas que presentan grupos polares). • Buscamos mejorar la resolución en las columnas capilares y la volatilidad de los esteroides debido a su elevado peso molecular y a la presencia de grupos polares (alcoholes o fenoles) que reducen las propiedades de separación en la columna. • Generalmente se suele utilizar un sistema cromatógrafo de gases con inyector automático (Bueno, 1993). Se utiliza el helio como gas portador. Las condiciones del cromatógrafo serían: columna capilar del tipo HP-1 (100% dimetilpolisiloxano) con 17 m de longitud, grosor de la fase estacionaria de 0,11 µm y diámetro inferior de 0,20 mm. Otras características de este método son la inyección tipo split (relación 10:1) con un volumen de inyección de 2 µL y el flujo constante (Martínez et al., 2007). • La sustancia química que se analiza suele ser algún metabolito del esteroide administrado, el cual se encuentra en la orina en concentraciones mínimas e imprevisibles, y puede permanecer en el organismo en un plazo variable de tiempo, incluso de meses (Bueno, 1993). • El acoplamiento de la EM es útil para obtener información estructural con una alta precisión y con la gran ventaja del espectro de masas, que es como una huella digital de la estructura química (Torres, 2013). El espectrómetro de masas, del tipo cuadrupolo (Martínez et al., 2007), utiliza el método de monitoreo selectivo de iones (SIM) con 70 eV de energía de ionización (Fernández et al., 2004). • El MRPL, en el caso de los esteroides androgénicos, es de 2,5 ng/mL (WADA, 2022). La testosterona a diferencia de los demás esteroides va a seguir un control diferente al tratarse de una sustancia endógena: - Análisis cualitativo: el cual no es significativo, ya que, como hemos dicho, se trata de una sustancia presente en nuestro organismo (válido para el resto de EAA). - Análisis cuantitativo: no es significativo porque el número de EAA varía de una persona a otra según el ciclo menstrual, sexo, periodo de vida, etc. Entonces, estas dos consecuencias llevaron esto a dos hechos: 29 de imágenes o una placa de radiografía. La intensidad de la luz será proporcional a la concentración de sustancia (Lasne et al., 2002). Tabla 4. Proceso de preconcentración de la muestra mediante ultracentrifugación. Etapa Preconcentración de la muestra 1 A una muestra de orina se le añade tris-(hidroximetil)-aminometano (tris)/ HCl y solución Complete (disolución de inhibidores de la proteasa). Todo se mezcla y se centrifuga a 2700 RCF (Fuerza centrífuga relativa) y 20 ºC durante 10 minutos. El sobrenadante se filtra a través del equipo Steriplip. 2 El filtrado sufre una ultrafiltración mediante centrifugación a 3570 RCF y 20 ºC durante 20 minutos. 3 Se realiza un lavado del filtrado obtenido y se centrifuga en las mismas condiciones anteriores. El resultado se somete a una ultrafiltración con el equipo Microcon YM-30 y se centrifuga a 14000 RCF y 20 ºC durante 12 minutos. 4 Finalmente, el filtrado obtenido se hace alícuota y se congela a - 20ºC hasta el siguiente paso. Tabla 5. Transferencias de las proteínas en el gel de electroforesis. PRIMERA TRANSFERENCIA SEGUNDA TRANSFERENCIA Las proteínas separadas en función de su punto isoeléctrico son transportadas a una membrana. Ésta se incuba con ditiotreitol o Reactivo de Cleland (DTT), con el objetivo de romper los puentes disulfuro de la EPO y así aumentar la sensibilidad del método. Posteriormente, incubamos con un anticuerpo monoclonal anti-EPO, el cual se une con la EPO que se encuentra en la membrana. Esta segunda transferencia tiene como objetivo solucionar la inespecificidad del anticuerpo secundario, permitiendo así, aislar la señal de la hormona de la señal del resto de moléculas presentes en la orina. Se debe realizar en medio ácido, por eso se le conoce también como transferencia ácida. 5.2.4. Cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (CL/EM). La CL/EM se ha convertido en una de las principales técnicas de análisis y detección de sustancias dopantes, al igual que la CG/EM. La principal diferencia con ésta es que un soluto disuelto en un disolvente constituye la salida de la columna en la CL (fase móvil) (Skoog et al., 2015). La CL al principio se realizaba con partículas y columnas grandes y alimentación por gravedad. Al cabo del tiempo, con los avances tecnológicos se permite el uso de columnas de mayor longitud y menor volumen. A esto se le conoce como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Gary D, 2009). 30 La instrumentación del HPLC es más costosa y elaborada porque tiene, a parte de la válvula de inyección, la columna y el detector, presenta algunos elementos complementarios, ya que en esta técnica es necesario bombear altas presiones para alcanzar velocidades de flujo comprensibles (sistema de suministro de fase móvil o bomba). El sistema de suministro de la fase móvil consiste en una bomba que puede ser de dos tipos: bomba tipo jeringa impulsada por tornillos – que produce una salida libre de pulsos y el control es más fácil. Sin embargo, la capacidad es menor (unos 250 mL) y a la hora de cambiar el disolvente es poco práctico – y las bombas de tipo émbolo – las cuales presentan un flujo pulsado que debe ser paliado para que no salga ruido basal en el cromatograma. Las ventajas que presenta esta bomba son elevada presión de salida, velocidad de flujo constante, pequeño volumen interno y fácil adaptación a la elución en gradiente (Skoog et al., 2015). El sistema de inyección de la muestra se constituye de un anillo de acero inoxidable con seis conexiones, de las cuales una de ella conecta con la columna. La muestra se puede inyectar con una jeringa de forma manual o con un inyector automático (Gary D, 2009). La columna puede ser de acero inoxidable, vidrio o polímeros. Siempre son columnas rectas. Se pueden utilizar dos precolumnas: columna “de desperdicios” entre el reservorio de la fase móvil y el inyector (para preparar la fase móvil) y una columna de protección entre el inyector y la columna (previene que impurezas contaminen la columna). Se obtienen cromatogramas más reproducibles y mejores cuando permanece constante la temperatura. Para la HPLC se utilizan dos tipos de empacamiento: partículas peliculares y partículas porosas (de sílice más frecuentes). El detector debe tener un volumen interno pequeño y ser compatible con el flujo del líquido. Según la naturaleza de la muestra encontramos diferentes tipos: absorbancia, fluorescencia, electroquímico, conductividad, EM, etc (Skoog et al., 2015). El HPLC se utiliza en modo de cromatografía de partición líquido-líquido (más común) o de cromatografía de adsorción líquido-sólido. En la cromatografía de partición, la fase estacionaria es un segundo líquido inmiscible en la fase móvil (Gary D, 2009). Encontramos dos tipos según el empacamiento de su columna: a. Cromatografía en fase normal: presenta fase estacionaria polar (por ejemplo, agua) y fase móvil no polar (hexano, por ejemplo). Aquí el componente menos polar eluye primero. Si aumentamos la polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de elución. b. Cromatografía en fase inversa: presenta fase estacionaria no polar (por ejemplo, un hidrocarburo) y fase móvil polar. Aquí el componente más polar eluye primero. Si 31 aumentamos la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución (Skoog et al., 2015). Los fundamentos de la EM se encuentran explicados en el apartado 5.2.1. El acople a la CL es complicado porque hay que eliminar el disolvente. Actualmente hay una serie de técnicas que permite que esta conexión se haga posible. Entre ellas encontramos: fuente de ionización por electroaspersión (ESI) (para moléculas polares, iónicas o muy grandes), ionización química a presión atmosférica (API) (para compuestos no polares y grandes), ionización por termoaspersión (para compuestos polares y no polares) y la ionización con haz de partículas (para moléculas volátiles, pequeñas, polares y no polares) (Gary D, 2009). 5.2.4.1. Análisis de los diuréticos y agentes enmascarantes. Los diuréticos más utilizados por los deportistas, como hidroclorotiazida, triamtereno o furosemida, tienen una vida media muy corta y por lo tanto no se pueden detectar en la orina en un plazo de 24 a 48 horas posteriores a la administración. El análisis de estas sustancias se centrará en la detección de la molécula original o de los metabolitos más abundantes. A veces, el objetivo será el análisis de los productos de degradación en casos donde se retrase la recogida de muestras o análisis por parte del laboratorio. La principal técnica utilizada será la CL/EM, la cual ha relevado a la GC/EM (también aceptada para el análisis de los diuréticos) (Cadwallader et al., 2010). Para la preparación de la muestra se utiliza mefruside como patrón interno, se realiza una extracción sólido-líquido con agua y metanol y el extracto final se evapora con nitrógeno hasta sequedad (Goebel et al., 2004). El cromatógrafo líquido de alta resolución presenta las siguientes condiciones cromatográficas para el análisis de diuréticos y agentes enmascarantes (Tabla 6): Tabla 6. Condiciones cromatográficas para el análisis de diuréticos. HPLC/EM UHPLC/EM Bomba de suministro Binaria Cuaternaria Fase móvil Acetronilo y acetato de amonio Agua y acetronilo Columna XDB C8 (75 mm x 4,6 mm., 3,5 µm de tamaño de partícula) BEH C18 (100 mm x 2,1 mm., 1,8 µm de tamaño de partícula) Velocidad de flujo 0,4 mL/min 0,6 mL/min Volumen de inyección 10 µL 5 µL 32 HPLC/EM UHPLC/EM EM Triple cuadrupolo acoplado a ESI Acoplado a una interfase (API) Condiciones de ESI/API Nitrógeno: gas de desolvatación Argón: gas de colisión (Thieme et al., 2001) Temperatura de gas: 408 º C Presión del gas del nebulizador: 55 psi (libras por pulgada cuadrada) Presión del gas del calentador: 80 psi (Ventura et al., 2008) El MRPL, en el caso de los diuréticos, es de 200 ng/mL (WADA, 2022). 5.2.4.2. Análisis de glucocorticoides. Los glucocorticoides están prohibidos siempre y cuando se administren por vía intravenosa, rectal, intramuscular u oral. Para la administración por vía inhalatoria o tópica sí están permitidos con una AUT (Morales Herrera et al., 2014). Para la preparación de la muestra se realiza una hidrólisis con la enzima Escherichia coli β glucuronidasa. Se añade como estándar interno la metiltestosterona. La extracción se realiza con dietil éter, usando embudo con lecho de sulfato de sodio anhidro. Finalmente, la fase orgánica es evaporada hasta secado con nitrógeno, y reconstituida en un volumen de 100 µL con los disolventes acetronilo-agua (50:50). El análisis de glucocorticoides se realiza a través de HPLC acoplado a un EM, que lleva añadido un ESI. Las condiciones del cromatógrafo líquido son las siguientes: el volumen de inyección de la muestra es de 3 µL (mediante inyector automático), y se produce a una velocidad de flujo de 0,3 mL/min. Para suministrar la fase móvil (formiato de amonio y acetonitrilo) presenta una bomba binaria de dos pistones y, además, se utiliza una columna C18 (100 mm x 2,1 mm., 1,8 µm de tamaño de partícula). El espectrómetro de masas tiene un ESI como fuente de ionización (operado en el modo de iones positivos), donde se utiliza el nitrógeno como gas de secado (flujo de secado: 10 L/min) y nebulización. La temperatura de 350 º C y la presión de 45 psi (Georgakopoulos et al., 2007). La AMA establece en 30 ng/mL el MRPL de los glucocorticoides (WADA, 2022). 33 5.3. Otras sustancias dopantes. En este punto se mencionan algunos métodos analíticos para el análisis y la detección de otras sustancias dopantes (Tabla 7). Tabla 7. Otras sustancias dopantes. Sustancia dopante Técnica analítica ACTH Cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (purificación por inmunoafinidad). βbloqueantes Cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a la espectrometría de masas (tiempo de vuelo) con una fuente de ionización por electroaspersión. Cannabis Cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (simple cuadrupolo), cromatografía de gases acoplada a detector de ionización de llamas. En el caso de la ACTH se utiliza la CL/EM. Lo más característico de la técnica es la purificación mediante inmunoafinidad, la cual aporta eficiencia y sensibilidad al método. Se realiza con anticuerpos ACTH policlonales (primarios) y también anticuerpos secundarios recubiertos con anticuerpos. Al proceso se le agregan perlas magnéticas y disolución salina tamponada con fosfato. El complejo antígeno-anticuerpo se separa con ácido acético. Finalmente, se introducen 2 µL del eluato en el cromatógrafo (Tretzel et al., 2015). En el caso del cannabis se utiliza la CG/EM o la CG acoplada a un detector de ionización de llamas. Para la CG/EM, el cromatógrafo presenta un automuestreador, el cual introduce un volumen de 1 µL (modo split; 5:1) y una columna DB-1 (30 m x 0,25 mm x 1 µm). Además, se utiliza helio como gas de arrastre a un flujo de 1 mL/min. El EM utiliza el modo de ionización electrónica, con un potencial de 70 eV. Para la CG acoplada a un detector de ionización de llamas, la diferencia es que el flujo del gas de arrastre es de 5 mL/min y la columna es OV-1 (100% polidimetilsiloxano) (30 m x 0,53 mm x 0,50 µm). La temperatura del horno es de 260 ºC (Florian R et al., 2009). El MRPL para el cannabis es de 1 ng/mL (WADA, 2022). Los β-bloqueantes se analizan mediante la CL/EM (EM con detector de tiempo de vuelo: tiempo necesario para que un ion alcance el detector al final de la parte libre de campo es inversamente proporcional a la masa del ion (Skoog et al., 2015)). Para la preparación de la muestra se realiza una extracción sólido-sólido, una hidrólisis con β-glucuronidasa y un posterior lavado con HCl. Posteriormente, se eluyen con metanol y las fracciones se evaporan hasta estar secas y se reconstituyen con acetronilo/ácido fórmico en 150 µL. El cromatógrafo, en el cual se inyectan 10 µL de muestra, se utiliza una columna C18 (100 mm x 2 mm, 3 µm) y como fase móvil: agua, ácido fórmico y acetonitrilo (Domínguez Romero, 2015). Para los βbloqueantes, el MRPL es de 50 ng/mL (WADA, 2022). 34 6. CONCLUSIONES 1. La recogida de muestras se hace en los puestos instalados para el control del dopaje con todos los requerimientos que sean necesarios (personal cualificado, sala de espera, etc). En el caso de la recogida de sangre, hay que tener precaución ya que se realiza una punción con aguja. Además, hay que tener precaución a la hora del almacenamiento de las pruebas y utilizar los reactivos necesarios según lo que se quiera analizar (anticoagulante, suero o gel polímero inerte separador del activador de la coagulación). 2. Para el transporte hasta el laboratorio se tendrá especial cuidado, utilizando contenedores con las muestras en bolsas y añadiendo los compuestos precisos en caso de que requieran refrigeración. 3. La acreditación del laboratorio y el cumplimiento de la normativa impuesta por la AMA permiten obtener resultados analíticos confiables. Estos laboratorios acreditados para realizar el análisis antidoping emplearán el término “Límite mínimo de rendimiento requerido (MRPL)” para confirmar un positivo por dopaje. 4. Es necesario, aportar la “autorización de uso terapéutico” en casos donde el deportista esté con tratamiento farmacológico. 5. El uso de métodos analíticos para la identificación y cuantificación de sustancias dopantes es de vital importancia para combatir el dopaje deportivo. Se emplearán aquellas técnicas oficiales o recomendables por la AMA, en caso de que haya varias formalizadas. 6. Para el análisis y la detección de las posibles sustancias dopantes se utilizarán principalmente las técnicas cromatográficas (gaseosa o líquida) acopladas a la espectrometría de masas. Estas técnicas permiten detectar un gran número de compuestos con una elevada especificidad y sensibilidad. 7. El farmacéutico como profesional sanitario y conocedor de la información del medicamento puede jugar un papel muy importante advirtiendo al paciente, que realice cualquier tipo de deporte, sobre los riesgos del consumo de estos ante un control antidoping. 35 7. BIBLIOGRAFÍA Alfaya, E. (2018). Sustancias Dopantes Y Técnicas Antidopaje: Una Visión Histórica. Gaceta Internacional Ciencias Forense. AMA. (2021a). Código Mundial Antidopaje. 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