Dinámica de compuestos alelopáticos en suelos agrícolas en relación con su aprovechamiento como plaguicidas naturales

Jose Antonio Galán Pérez Sevilla, 2022 afsdfasgd afsdfasgd afsdfasgd Dinámica de compuestos alelopáticos en suelos agrícolas en relación con su aprovechamiento como plaguicidas naturales Memoria que presenta Jose Antonio Galán Pérez para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, XXX 2022 Firmado por GALAN PEREZ JOSE ANTONIO - **** el día 16/09/2022 con un certificado emitido por AC FNMT Usuarios Dinámica de compuestos alelopáticos en suelos agrícolas en relación con su aprovechamiento como plaguicidas naturales Visado en Sevilla, a 16 de septiembre de 2022 LOS DIRECTORES EL TUTOR Dra. María del Carmen Florido Fernández Profesora Contratada Doctora de la Universidad de Sevilla Dr. Rafael Celis García Investigador Científico del CSIC Dra. Beatriz María Gámiz Ruiz Investigadora Postdoctoral del CSIC Firmado por FLORIDO FERNANDEZ MARIA DEL afsdfasgd DOCTORA Dña. ROSARIO VAZ PARDAL, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE CRISTALOGRAFÍA, MINERALOGÍA Y QUÍMICA AGRÍCOLA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Dinámica de compuestos alelopáticos en suelos agrícolas en relación con su aprovechamiento como plaguicidas naturales”, presentada por D. Jose Antonio Galán Pérez para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el marco del Programa de Doctorado en Recursos Naturales y Medio Ambiente del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola. VAZ PARDAL MARIA ROSARIO - A la Dra. Lucía Cox por haberme adoptado en su laboratorio, su trato, deferencia hacia mí. A Gracia, por su disponibilidad siempre, al Dr. Miguel Real por sus conversaciones de madrugón en aquella época de entrar tan temprano. A la Dra. María Jesús Calderón por su paciencia para enseñarme todo lo que sé sobre HPLC y ayudarme a solucionar todos los problemas asociados, que no han sido pocos. A la Dra. Rocío López-Cabeza que, aunque su llegada ha sido la más reciente (en esta Tesis, porque en el grupo lleva mucho más que yo), ha supuesto una nueva compañera en el lado oscuro de la Fuerza, gracias por tu disposición en los estadios finales de la Tesis, y por supuesto, a Pilar Velarde (Pili), un confidente, dentro y fuera del laboratorio, no hay palabras que te pueda dedicar que puedan expresar la gratitud y afecto que te tengo, a ti, a Jesús, tus hijos, y todos los tuyos. A Layla, Fran, Marta Gil, Marta Velasco, Miguel, Alba Cuecas, Alba Lara, Alicia, María, Carlos, Javi, Kike, Josan, Pablo y Antonio. Aunque no os he conocido demasiado a ninguno, habéis sido importantes al final, cuando el estrés más apremiaba. A mis amigos de la facultad, a los que reencontré de casualidad de nuevo durante el doctorado: Álvaro, María, Josemi y Manolo, y los amigos que en momentos tristes no me quisieron perder. Gracias, Chema. A los míos, mis amigos de siempre, a los que quiero y siempre me reciben cuando retorno: Ale, Ester, Sergio (Paco), Jesús (Muguito), Gabri, Jesús, Rocío, Elías, Marchena, Antonio, Lata, Marien e Iván. A los miembros de Piso Topex, Ezekie y Marco, por estar ahí desde siempre y en esta complicada última etapa, por ser dos personas tan maravillosas y sabias. Os quiero mucho. A Blanca, por todos estos años, por haber crecido juntos, siempre serás mi amiga. A mi compañero, amigo y hermano M. Yuste, realmente no puedo plasmar lo que has sido y eres en mi vida. A mi familia, A Jose Manuel por su predisposición, alegría y belleza humana, a mi hermana Mª del Mar, por ser ejemplo, por creer en mí más que nadie y estar siempre cuidándome. Y a su familia perruna Duna y Lela por amor incondicional. A la Dra. Campos, por aparecer. “Un mago nunca llega tarde, Frodo Bolsón. Ni pronto. Llega exactamente cuándo se lo propone”. Por traer a Grogu con sus mordisquitos con ronroneo. A mis padres, por su sacrificio constante, por su confianza plena, por brindarme de todas las oportunidades que he necesitado, porque siempre han estado ahí en mis peores momentos. Por tanto, por todo. Espero que estéis orgullosos. En memoria de mi tía Carmen Preámbulo La preocupación social por la elevada toxicidad y persistencia que presentan los plaguicidas sintéticos que se utilizan para controlar las plagas, malas hierbas y enfermedades de los cultivos está acrecentando el interés por la búsqueda de nuevas sustancias con menores efectos adversos sobre el medio ambiente y la salud humana. El empleo de plaguicidas basados en compuestos naturales está recibiendo una gran atención y, dentro del amplio abanico de compuestos naturales existentes, aquellos para los que se han descrito propiedades alelopáticas constituyen una importante fuente de inspiración para su desarrollo. Pese a sus ventajas, el uso de compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales presenta algunas limitaciones, entre las que destacan la dificultad de trasladar el comportamiento observado para estos compuestos en condiciones de laboratorio a condiciones reales de campo y la de predecir su eficacia bajo escenarios agronómicos concretos de aplicación. En gran medida, estas dificultades son consecuencia de la escasa información de la que se dispone acerca de los factores que gobiernan la biodisponibilidad y persistencia de los compuestos alelopáticos una vez que alcanzan el suelo, como medio en el que deben ejercer su acción. La presente Tesis Doctoral se planteó con el objetivo de mejorar el conocimiento relativo a los procesos de transferencia y transformación que pueden sufrir en el suelo dos compuestos representativos de importantes familias de alelopáticos, la hidroxicumarina escopoletina y el monoterpeno pulegona. Dos aspectos específicos que se tuvieron en cuenta fueron el estudio del posible comportamiento enantioselectivo para pulegona, por presentar un centro quiral en su estructura, y el empleo de materiales adsorbentes en estrategias de estabilización de los compuestos que pudieran llevar a mejorar su eficacia como herbicidas naturales. La memoria se presenta siguiendo el formato de compendio de publicaciones sobre la base de los cuatros artículos publicados a partir de los resultados obtenidos en la Tesis Doctoral. Los Capítulos I-IV incluyen una introducción que justifica la unidad temática de los artículos publicados, los objetivos planteados y un resumen global de los resultados alcanzados. En el Capítulo V se recopilan las cuatro publicaciones resultantes del trabajo y en el Capítulo VI se establecen las conclusiones finales del mismo. Además de poner de manifiesto la importancia de considerar el papel que el suelo puede ejercer en la biodisponibilidad de los compuestos alelopáticos y, por tanto, en la funcionalidad de estos, los resultados de esta Tesis también identifican posibles estrategias dirigidas a mejorar su actividad como altenativas fitosanitarias respetuosas con el medio ambiente, a partir de superar algunas de las limitaciones que a menudo se asocian a su uso con dicha finalidad. afsdfasgd Índice Capítulo I: Introducción. ................................................................................................... 1 I.1. Problemática del uso de los plaguicidas en la actualidad. ...................................... 3 I.2. Uso de compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales. .............................. 11 I.2.1. Compuestos naturales para la protección de cultivos. ....................................... 11 I.2.2. Alelopatía. .......................................................................................................... 13 I.2.3. Clasificación de los compuestos alelopáticos. ................................................... 17 I.2.3.1. Compuestos fenólicos. ................................................................................ 17 I.2.3.2. Terpenoides. ................................................................................................ 21 I.2.3.3. Compuestos alelopáticos con átomos de N. ............................................... 25 I.2.4. Ventajas y limitaciones del uso de compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales. ...................................................................................................................... 26 I.3. Dinámica de los compuestos alelopáticos en el suelo. ........................................... 31 I.3.1. Procesos de transferencia o transporte. .............................................................. 32 I.3.1.1. Adsorción-desorción. .................................................................................. 32 I.3.1.2. Lixiviación. ................................................................................................. 44 I.3.1.3. Otros procesos de transporte. ...................................................................... 49 I.3.2. Procesos de transformación. .............................................................................. 50 I.3.2.1. Degradación abiótica. ................................................................................. 51 I.3.2.2. Degradación biótica. ................................................................................... 52 I.3.2.3. Enantiomerización. ..................................................................................... 57 I.4. Estrategias de modulación del comportamiento de los compuestos alelopáticos en el suelo: uso de arcillas y de enmiendas orgánicas como adsorbentes. ................. 59 I.4.1. Uso de compuestos laminares como adsorbentes. ............................................. 61 I.4.1.1. Filosilicatos. ................................................................................................ 62 I.4.1.2. Hidróxidos dobles laminares. ..................................................................... 69 I.4.1.3. Granulación de compuestos laminares para su aplicación como adsorbentes. ............................................................................................................. 73 I.4.2. Uso de enmiendas orgánicas como adsorbentes. ............................................... 75 I.4.2.1. El alperujo como enmienda agrícola. .......................................................... 76 I.4.2.2. El biochar de alperujo. ................................................................................ 77 I.4.2.3. Efectos de la adición de alperujo en la dinámica de los plaguicidas y compuestos alelopáticos. ......................................................................................... 78 Capítulo II. Objetivos. ...................................................................................................... 81 Capítulo III. Resumen de resultados y discusión. .......................................................... 85 III.1. Efecto de las propiedades del suelo en la biodisponibilidad de escopoletina y en la expresión de su actividad fitotóxica. ................................................................. 87 III.2. Uso de enmiendas orgánicas y materiales laminares como moduladores de la adsorción, persistencia y bioactividad de escopoletina en el suelo. . .................. 90 III.3. Gránulos de organoarcilla como adsorbente de escopoletina y su aplicación como soportes del compuesto alelopático para protegerlo de una rápida degradación en el suelo. . ................................................................................................. 93 III.4. Caracterización enantioselectiva de la adsorción, disipación y fitotoxicidad del monoterpeno pulegona en suelos agrícolas. ........................................................... 97 Capítulo IV. Bibliografía. ............................................................................................... 101 Capítulo V. Publicaciones. ............................................................................................. 131 V.1. Artículo I. .............................................................................................................. 133 V.2. Artículo II. ............................................................................................................. 161 V.3. Artículo III. ........................................................................................................... 177 V.4. Artículo IV. ............................................................................................................ 195 Capítulo VI: Conclusiones. ............................................................................................ 221 afsdfasgd Capítulo I Introducción I. Introducción 8 subterráneas asociados a los periodos de lluvias intensas acaecidas durante el estudio. La concentración de herbicidas encontrada en las aguas también guardó relación con la solubilidad, la vida media y la dosis empleada de los herbicidas aplicados a los cultivos de olivar. Figura 5: Puntos de muestreo seleccionados por Hermosín et al. (2013) para la monitorización a largo plazo de herbicidas presentes en aguas superficiales y subterráneas de Andalucía. La aplicación repetida de los plaguicidas y su acumulación en el suelo también comprenden otros problemas como la resistencia gradual de plagas y sus consiguientes efectos adversos en la biodiversidad (Villaverde et al., 2016) y las funciones propias del suelo (FAO & ITPS, 2017; FAO, 2019). Por ejemplo, la creciente dificultad para llevar al mercado nuevos plaguicidas, con una media de 11 años y un coste medio de unos 250 millones de euros (AEPLA, 2019), ha generado la proliferación de malas hierbas resistentes a los herbicidas actuales, lo que supone una importante limitación en relación al rendimiento de los cultivos (Heap & Duke, 2018). La Fig. 6 muestra el aumento cronológico en el número de especies de malas hierbas resistentes a herbicidas sintéticos por mecanismos de acción, observándose que los herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS), que incluyen las sulfonilureas, imidazolinonas y triazolopirimidinas, son para los que se conocen más casos de resistencia en I. Introducción 9 la actualidad. En España podemos encontrar que el 31% de los productos fitosanitarios en uso tienen una antigüedad de más de 20 años en el mercado, lo que contribuye a la aparición de problemas de resistencia (AEPLA, 2019). Figura 6: Aumento cronológico de las malas hierbas resistentes a herbicidas a nivel mundial (adaptado de Heap, 2022). La demanda social de reducir los efectos perjudiciales que el uso de plaguicidas puede causar sobre el medio ambiente y la salud humana quedó plasmada en los objetivos europeos marcados en “Horizonte 2020” para el periodo de 2018-2020 dentro del Reto Social 2, entre los que se incluyó el reducir la actual dependencia que muestra la agricultura respecto a los plaguicidas sintéticos a través de la introducción de estrategias y productos alternativos con menores efectos adversos sobre organismos no objetivos, los recursos naturales y el medio ambiente (Unión Europea, 2022a). Este objetivo sigue presente en el nuevo programa marco de investigación e innovación de la Unión Europea para el periodo 2021-2027, “Horizonte Europa”, dentro de sus prioridades para una producción primaria sostenible (Unión Europea, 2022b), demostrando que el interés por encontrar alternativas a los plaguicidas sintéticos, más respetuosas con el medio ambiente y la salud humana, sigue siendo una prioridad internacional. A nivel legislativo, la problemática relacionada con el uso de plaguicidas sintéticos en la agricultura quedó reflejada en la aprobación del reglamento (CE) No. 1107/2009 relativo a I. Introducción 10 la comercialización de productos fitosanitarios (Comisión Europea, 2009). Dicho Reglamento entró en vigor en 2011, derogando las directivas 79/117/CEE y 91/414/CEE, con la finalidad de aumentar el nivel de protección sanitaria y medioambiental, contribuir a una mayor protección de la producción agrícola y ampliar y consolidar el mercado único de productos fitosanitarios. Esta y otras normativas complementarias han endurecido las condiciones de autorización, comercialización y aplicación de los productos fitosanitarios, reduciendo el número de plaguicidas sintéticos disponibles y estimulando el empleo de estrategias alternativas para la protección de los cultivos, así como el uso de sustancias con menor riesgo. Concretamente, el reglamento (CE) No 1107/2009 incentiva el registro de “sustancias de bajo riesgo” y de “sustancias básicas”, facilitando los trámites para su aprobación y ampliando los periodos de autorización respecto a aquellas sustancias que no cumplen los criterios para clasificarlas como tales (Czaja et al., 2015; Villaverde et al., 2016). En este contexto, en los últimos años se ha intensificado la investigación relacionada con la búsqueda de nuevas clases de compuestos que satisfagan la demanda de plaguicidas con nuevos mecanismos y sitios de acción y bajo impacto sobre la salud humana y el medio ambiente. Entre estos compuestos destacan los producidos por organismos naturales, muchos de los cuales presentan potencial para ser utilizados directamente como plaguicidas naturales o como fuente de inspiración para el desarrollo de nuevos plaguicidas sintéticos de bajo riesgo consistentes en versiones mínimamente modificadas de sustancias naturales (Dayan & Duke, 2014; Sparks et al., 2017). Aunque existen evidencias de que los primeros usos de compuestos naturales como plaguicidas se remontan a tiempos muy antiguos, la presión por reducir los efectos adversos asociados al empleo de plaguicidas sintéticos convencionales en la agricultura, unida a un mayor conocimiento de los mecanismos y compuestos que rigen las interacciones entre organismos en la naturaleza, ha acrecentado el interés por explotar las propiedades de este tipo de sustancias para la protección de los cultivos (Macías et al., 2007; Belz, 2007; Isman, 2008; Cantrell et al., 2012; Soltys et al., 2013). En el marco de la actual legislación europea, muchas de estas sustancias podrían beneficiarse de las ventajas asociadas a su posible designación como “sustancias de bajo riesgo” o “sustancias básicas”, lo que supone un estímulo para su registro y comercialización (Czaja et al., 2015). I. Introducción 11 I.2. Uso de compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales I.2.1. Compuestos naturales para la protección de cultivos Las restricciones legislativas introducidas desde 2011 respecto a la comercialización y el uso de productos fitosanitarios han provocado la retirada de un gran número de plaguicidas sintéticos. Este hecho, unido al aumento de plagas resistentes a los plaguicidas actuales y al interés social por los denominados “productos ECO” (Czaja et al., 2015), ha provocado que el mercado actual de fitosanitarios se esté encaminando hacia la búsqueda de nuevas sustancias que cumplan con los requisitos de ser más respetuosas con el medio ambiente y representar un menor riesgo para la salud humana. En este contexto surge como posible solución el uso de plaguicidas naturales o bioplaguicidas, términos que hacen referencia a aquellos plaguicidas consistentes en compuestos naturales u organismos vivos (Czaja et al., 2015; Villaverde et al., 2016). Conviene destacar, no obstante, que, aunque el uso del término bioplaguicida ha ido en aumento en los últimos años, no existe un consenso a nivel legislativo en cuanto a su definición. La USEPA, por ejemplo, los define como aquellos plaguicidas derivados de animales, plantas, bacterias y algunos minerales, mientras que en la UE no existe una definición específica. En el contexto de la presente Tesis Doctoral, el término plaguicida natural hará referencia a aquellos plaguicidas basados en compuestos naturales, más que a organismos vivos. La legislación europea suele enmarcar a los plaguicidas naturales como sustancias básicas o de bajo riesgo, para las cuales no es necesario establecer niveles máximos de residuos en alimentos debido a que sus efectos perjudiciales para el consumidor se consideran despreciables. Las sustancias que cumplen este requisito se recogen en el Anexo IV del Reglamento (CE) Nº 396/2005 del Parlamento Europeo y del Consejo (Unión Europea, 2005; Czaja et al., 2015). Se estima que los riesgos toxicológicos asociados a los plaguicidas naturales son, por lo general, menores que los que representan los plaguicidas sintéticos debido a que la mayoría de ellos poseen una elevada selectividad/especificidad y sus efectos sobre organismos no diana son mucho menores. No obstante, el hecho de que una sustancia sea de origen natural no le exime de la obligación de pasar una evaluación exhaustiva antes de aprobar su uso como plaguicida y de catalogarla como sustancia de bajo riesgo. No todas las sustancias naturales son inocuas para los seres humanos y el medio ambiente y, de hecho, algunos de los compuestos con una mayor toxicidad en mamíferos, como la aflatoxina o la palitoxina, son de origen natural (Sparks & Duke, 2021). I. Introducción 12 A pesar de que los plaguicidas naturales todavía representan un porcentaje menor en el mercado que los plaguicidas convencionales (Robin & Marchand, 2019; Sparks & Duke, 2021) (Fig. 7), su tasa de crecimiento anual supera el de los plaguicidas sintéticos y su desarrollo está en plena expansión. Como ejemplo, la Fig. 8 muestra los nuevos ingredientes activos registrados por la USEPA entre los años 1997 y 2010 en función de su origen. Se observa que el 36% de las nuevas sustancias registradas son compuestos naturales. Les siguen los plaguicidas de origen sintético con un 31%, los de origen biológico (organismos vivos o grandes biomoléculas producidos por los mismos) con un 27% y finalmente los plaguicidas sintéticos pero derivados de compuestos naturales, con un 6%. La suma de las nuevas sustancias registradas basadas en compuestos naturales y de origen biológico representan un 63% del total, lo que pone de manifiesto la importancia que está recibiendo en los últimos años el desarrollo de este tipo de sustancias (Cantrell et al., 2012). Figura 7: Mercado de plaguicidas consistentes en compuestos sintéticos y naturales: moléculas sintéticas (MS), equivalentes sintéticos de productos naturales (ESPN), mímicos de productos naturales (MPN), derivados de productos naturales (DPN) y productos naturales (PN) (datos de 2014, según Sparks & Duke, 2021). No se incluyen los plaguicidas de origen biológico. I. Introducción 13 Figura 8: Nuevos ingredientes activos de plaguicidas registrados por la USEPA desde 1997 a 2010 en función de su origen (adaptado de Cantrell et al., 2012). I.2.2. Alelopatía En los ecosistemas naturales y agrícolas, muchos metabolitos secundarios liberados por plantas, microorganismos, virus y hongos pueden afectar positiva o negativamente al crecimiento y desarrollo de organismos vecinos a través del fenómeno conocido como alelopatía (Molisch, 1937; Rice, 1984; IAS, 1996). Aunque se trata de un fenómeno ya descrito desde tiempos remotos por autores como Teofrasto (371-287 a.C.) o Plinio “el Viejo” (ca. 23-79 d.C.), el concepto actual de alelopatía se ha desarrollado a raíz de la intensificación de su estudio a partir de los años setenta y de su mejor compresión a partir de mediados los noventa, cuando comenzaron a estar disponibles técnicas avanzadas para la extracción, purificación, caracterización estructural y estudio de la bioactividad de compuestos orgánicos (Weston, 2005). Aunque inicialmente la alelopatía despertó interés como un proceso ecológico natural básico determinante de la abundancia y distribución de especies vegetales y de las interacciones entre cultivos y otras plantas (Cheng & Cheng, 2015; Macías et al., 2019; Bachheti et al., 2019), hoy en día también está recibiendo una gran atención por la posibilidad I. Introducción 14 de usarla en el ámbito aplicado del manejo de plagas (Macías et al., 2019; Lorenzo et al., 2020). En este sentido, una de sus aplicaciones más prometedoras recae en el descubrimiento de compuestos alelopáticos que puedan actuar como plaguicidas naturales y reemplazar a los análogos sintéticos (Fig. 9). Un aspecto que favorece esta aplicación es la continua mejora de la instrumentación dirigida a la identificación de compuestos químicos en matrices complejas y que ha reducido el tiempo y los esfuerzos necesarios para aislar compuestos bioactivos, disparando en los últimos años el número de nuevas moléculas propuestas como posibles agentes alelopáticos y, por consiguiente, como potenciales plaguicidas naturales (Duke et al., 2002; de Albuquerque et al., 2011). Figura 9: Procedimiento para producir un bioplaguicida comercializable (adaptación de Scavo & Mauromicale, 2021). Además de su uso como materias activas (inalteradas o levemente modificadas), los compuestos alelopáticos también pueden utilizarse para la protección de los cultivos a través de su liberación a partir de plantas alelopáticas o de la adición al suelo de residuos de estas (Cheng & Cheng, 2015). Se considera que estas aplicaciones podrían permitir, en un contexto de control integrado de plagas, reducir las grandes cantidades de plaguicidas sintéticos I. Introducción 15 convencionales que se utilizan actualmente en la agricultura y, con ello, los efectos adversos relacionados con la elevada toxicidad y desarrollos de resistencias asociadas a los mismos (Duke et al., 2002; de Albuquerque, 2011). El fenómeno de la alelopatía se puede explotar en distintos sistemas de cultivo, pero sus efectos pueden jugar un papel particularmente beneficioso en la agricultura ecológica y de conservación, donde el control de plagas resulta más problemático (Scavo & Mauromicale, 2021). A continuación, se describen brevemente las principales formas de aprovechamiento de la alelopatía basadas en la liberación “in situ” de agentes alelopáticos, las cuales han sido recientemente revisadas por Jabran et al. (2015): Establecimiento de cultivos alelopáticos: En los últimos años se viene consensuando que para que un cultivo sea considerado como alelopático ha de cumplir las siguientes características: i) afectar a la vegetación a su alrededor, ii) afectar al crecimiento del mismo u otros cultivos que se establezcan de forma sucesiva, iii) causar problemas de fatiga o agotamiento del suelo y iv) sintetizar y liberar compuestos alelopáticos bioactivos responsables de los efectos anteriores (Scavo & Mauromicale, 2021). En la actualidad se conocen un gran número de especies de plantas que poseen propiedades alelopáticas. Aunque la mayoría de ellas son malas hierbas, también se han identificado cultivos herbáceos y leñosos con efectos alelopáticos tanto en otros cultivos como en malas hierbas. La mayoría de los cultivos alelopáticos que se conocen pertenecen a las familias Asteraceae, Poaceae, Brassicaceae y Fabaceae (Scavo & Mauromicale, 2021). En algunas regiones del mundo ya se está considerando la capacidad alelopática supresora de malas hierbas y otras plagas como una característica importante a la hora de seleccionar una variedad de cultivo determinada (Kong et al., 2011; Worthington & Reberg-Horton, 2013). Rotación de cultivos: Plantar diferentes cultivos de forma secuencial en el mismo terreno es una estrategia agrícola tradicional que puede conllevar beneficios relacionados con el control de plagas, reducción de problemas de agotamiento del suelo, reducción del lixiviado de nutrientes, etc. A través de la liberación de agentes alelopáticos por un cultivo previo, la rotación de cultivos per se puede disminuir la proliferación de malas hierbas en el cultivo posterior y su uso combinado con otras estrategias de control de plagas puede favorecer incluso más dicho control (Garrison et al., 2014; Jabran et al., 2015). De acuerdo con Baker & Mohler (2015), la rotación de cultivos fue uno de los métodos más empleados por los agricultores de Nueva York para controlar las malas hierbas en cultivos ecológicos. I. Introducción 16 Intercalación de cultivos: Este método consiste en cultivar simultáneamente dos cultivos compatibles con el objetivo de conseguir mayores rendimientos tanto en producción como económicos. La intercalación de cultivos conlleva una mejora de la eficiencia en el uso de recursos, tales como la extensión de tierra, nutrientes, agua y luz (Jabran et al., 2015), pero además se puede usar como un método respetuoso con el medioambiente para el control de malas hierbas a través de un aprovechamiento de los procesos alelopáticos (Makoi & Ndakidemi, 2012). Un ejemplo lo encontramos en Saudy (2015), que observó cómo el intercalado de maíz con alubias ayudó a disminuir la incidencia de malas hierbas [Echinochloa colona (L.) Link., Portulaca oleracea L., Chorchorus olitorius L., y Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd.], aproximadamente en un 50%, aparte de mejorar la eficiencia del uso de la tierra. Cultivos de cobertura: Los cultivos de cobertura se implantan con la intención de mantener la sostenibilidad de un agro-ecosistema. Tienen numerosas ventajas, como mejorar la fertilidad y calidad de los suelos y disminuir el número de malas hierbas y patógenos de plantas (Jabran et al., 2015). Algunos sistemas de cultivo, principalmente los orgánicos, dependen en gran parte de cultivos de cobertura para el control de las malas hierbas (Mirsky et al., 2013). Altieri et al. (2011) observaron un efecto beneficioso de los cultivos de cobertura en la producción y control de malas hierbas en sistemas ecológicos a través de una combinación de efectos físicos, alelopáticos y sobre la calidad general del suelo. Se ha observado que, para el control de malas hierbas, el establecimiento de una mezcla de varios cultivos de cobertura puede resultar más efectivo que el establecimiento de un único cultivo individual, por producir una mayor variedad de compuestos alelopáticos que pueden actuar de forma sinérgica (Jabran et al., 2015). Empleo de restos vegetales como abonos verdes: La incorporación al suelo de restos vegetales procedentes de plantas alelopáticas ha demostrado ser una estrategia que puede disminuir el número de malas hierbas a través de la liberación de compuestos alelopáticos que tiene lugar durante la descomposición de los restos vegetales (Jabran et al., 2015). Dhima et al. (2006), por ejemplo, observaron que la aplicación de restos de cebada a un cultivo de maíz redujo la incidencia de S. verticillata y E. cruz-galli hasta en un 80% a la vez que aumentó el rendimiento del cultivo en un 45%. Al igual que en el caso de los cultivos de cobertura, la aplicación simultánea de restos vegetales procedentes de diversas plantas alelopáticas puede I. Introducción 17 mejorar el control de malas hierbas a través de un efecto sinérgico de los compuestos liberados (Khaliq et al., 2010). I.2.3. Clasificación de los compuestos alelopáticos Hasta la fecha, se han caracterizado muchos compuestos alelopáticos con diferente estructura química y actividad biológica. La primera clasificación se realizó basándose en su origen biosintético e incluye a los compuestos alelopáticos más citados, siendo por tanto la clasificación más empleada (Macías et al., 2007). A continuación, se describen las principales familias de compuestos alelopáticos según esta clasificación. I.2.3.1. Compuestos fenólicos Constituyen un amplio grupo de compuestos alelopáticos con distintos grados de complejidad estructural, destacando los compuestos fenólicos simples, los flavonoides, las cumarinas y las quinonas. Recientemente, también se han incluido en este grupo distintos compuestos aromáticos derivados de líquenes, como los dépsidos y depsidonas (Macías et al., 2007). Compuestos fenólicos simples: Estos compuestos se caracterizan por su diversidad estructural y variabilidad intraespecífica. Generalmente, son sintetizados en plantas por la vía de las pentosas fosfato a través de la ruta del ácido shikímico. Las principales funciones de estos compuestos en las plantas son la de atracción de polinizadores y protección frente a herbívoros (Li et al., 2010), habiéndose también descrito para ellos tanto actividad herbicida como fungicida (Sobolev et al., 2006; Santana et al., 2009). De manera general, los estudios de fitotoxicidad de compuestos fenólicos simples se han centrado en ensayos con compuestos previamente conocidos y especies estándar, donde la especie Lactuca sativa ha sido la más utilizada. Los fragmentos de acetofenona tales como la 4-hidroxiacetofenona y la 2,4dihidroxiacetofenona parecen contribuir de forma significativa a la actividad de los fenoles, aunque el esqueleto fenólico no es el único fragmento responsable de la actividad, tal y como describen Yang et al. (2016) al evidenciar la mayor toxicidad de S-(+)-isosclerona comparado con (−)-regiolona. De acuerdo con Macías et al. (2019), el potencial de los compuestos fenólicos simples para el control de malas hierbas ha sido sobreestimado por los investigadores. Esto se debe a I. Introducción 24 El mecanismo de acción de las lactonas sesquiterpénicas parece estar relacionado con la inducción de apoptosis, aunque también presentan actividad sobre importantes enzimas con grupos sulfhidrilo (Huang et al., 2010). Algunas lactonas sesquiterpénicas afectan a la membrana celular. Este es el caso de la deshidrozaluzanina C (Fig. 15), cuyo efecto a una concentración de 50 µM fue incluso más pronunciado que el del herbicida sintético acifluorfen, que presenta un mecanismo de acción similar (Galindo et al., 1999). Las principales limitaciones que presentan los sesquiterpenos para su uso como herbicidas naturales son la dificultad de obtenerlos en grandes cantidades y su escasa biodisponibilidad en el suelo. Las lactonas sesquiterpénicas, por ejemplo, a menudo exhiben una fuerte actividad herbicida en el laboratorio, pero funcionan mal en el campo debido a que presentan vidas medias muy bajas. Este fue el caso de la artemisinina (Fig. 15) que, aplicada a dosis superiores a 1 kg/ha, no consiguió proporcionar un control adecuado de malas hierbas (Duke et al., 2000). Diterpenos, triterpenos y esteroides: Los diterpenos y triterpenos son terpenoides de 20 y 30 átomos de carbono, respectivamente. La mayoría se encuentran en la naturaleza en forma cíclica, los diterpenos en forma polioxigenada y los triterpenos formando sistemas de 1 a 5 anillos presentes fundamentalmente en las mitocondrias, microsomas y cloroplastos de las células (Cheng et al., 2010). Su principal función en las plantas es la de protección contra insectos, hongos y bacterias (Heftmann, 1975; Nes & Heftmann, 1981). Además, los triterpenos cíclicos pueden dar lugar a esteroides y saponinas, que también tienen importantes funciones biológicas. Entre los diterpenos más estudiados destacan las momilactonas (Fig. 16), importantes compuestos alelopáticos producidos por Oryza sativa (Kato-Noguchi & Peters, 2013). En el caso de los triterpenos, algunos autores se han centrado en la actividad de sus derivados ácidos, por presentar mayor actividad que los propios triterpenos frente a especies monocotiledóneas (Wang et al., 2014). Uno de los principales problemas asociados a los triterpenos y esteroides es su posible autotoxicidad sobre el cultivo de origen, favorecida por una elevada estabilidad y baja solubilidad en agua del compuesto, que facilitan su retención y acumulación en el suelo. Por ejemplo, el esterol ergosta-5-en-3-ol (Fig. 16) causó una reducción en la longitud de la radícula y tallo propios de plantas de tabaco (Ren et al., 2015). A pesar de que existen numerosos estudios sobre estos compuestos, la limitada actividad que presentan unida a su I. Introducción 25 complejidad estructural y, por tanto, a su dificultad de obtención y análisis, reducen su potencial como bioherbicidas (Macías et al., 2019). Figura 16: Ejemplos de diterpenos (momilactonas A y B), esteroide (ergosta-5-en-3-ol) y saponina esteroidea con cadena glucosídica en C-3. I.2.3.3. Compuestos alelopáticos con átomos de N Entre los compuestos alelopáticos que contienen uno o varios átomos de nitrógeno en su estructura, los alcaloides, con al menos un átomo de N con carácter básico, constituyen el grupo más importante (Fig. 17). La mayoría de los alcaloides son derivados de aminoácidos, pero también pueden ser biosintetizados a partir de terpenoides, como en el caso de los alcaloides esteroides, o por la vía de los policétidos (Seupel et al., 2018; Ye et al., 2018), en cada caso usando un mecanismo distinto para incorporar el átomo de nitrógeno (Hotti & Rischer, 2017; Chen et al., 2018; Livshultz et al., 2018). Cuando el alcaloide posee una cadena alifática, como es el caso de la sarmentina (Fig. 17), su modo de acción suele ser similar al de los ácidos grasos de cadena media, afectando a I. Introducción 26 la membrana celular y causando peroxidación. No obstante, para sarmentina se han propuesto mecanismos de acción adicionales como la inhibición del fotosistema II, al competir con la plastoquinona por sus sitios de unión (Dayan et al., 2015). Sin embargo, los mayores daños citotóxicos ocasionados por los alcaloides se dan sobre el ADN y ARN y enzimas asociadas, tales como las telomerasas, polimerasas o topoisomerasas (Sajitha et al., 2018; Filippin et al., 2018). Entre los alcaloides con mayor potencial como herbicidas naturales, los glucosinolatos, presentes en las Brassicaceae, constituyen uno de los grupos más importantes. Figura 17: Algunos alcaloides con propiedades alelopáticas. I.2.4. Ventajas y limitaciones del uso de compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales Utilizar compuestos con actividad alelopática como plaguicidas naturales presenta una serie de ventajas, pero también ciertas limitaciones que deben tenerse en cuenta en el desarrollo e implementación de estas sustancias como alternativa eficaz para el manejo de plagas (Tabla I). Las principales ventajas de los compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales se asocian a su composición química. Al contrario que en el caso de los plaguicidas sintéticos, I. Introducción 27 los compuestos alelopáticos se caracterizan por presentar un alto contenido en oxígeno y nitrógeno y un bajo contenido en halógenos (F, Cl, Br) y en anillos “no naturales” (Dayan et al., 2009; Soltys et al., 2013). Estas características favorecen la percepción de que la mayoría de los productos naturales son toxicológica y ambientalmente benignos (Dayan et al., 2012) y, además, contribuyen a hacerlos biodegradables, reduciendo su vida media en el medio ambiente. Su baja persistencia constituye una de las propiedades más atractivas a la hora de emplearlos. La rápida degradación por parte de los microorganismos reduce los problemas de contaminación, previniendo su llegada a aguas superficiales y subterráneas y reduciendo los residuos en el suelo y en alimentos. Todo ello disminuye los riesgos ecotoxicológicos y para la salud humana respecto a los plaguicidas sintéticos tradicionales (Villaverde et al., 2016). A raíz de estas características, los organismos reguladores tienden a facilitar el registro de estas sustancias como “sustancias básicas” o “de bajo riesgo”, lo que supone un estímulo para su comercialización (Unión Europea, 2017). Tabla I. Principales ventajas e inconvenientes del uso de compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales. Una ventaja adicional de los compuestos alelopáticos la constituye la variabilidad que suelen presentar en cuanto a los mecanismos de acción a través de los que actúan (Koch et al., 2005; Dayan et al., 2012) (Tabla II). En comparación con los plaguicidas sintéticos convencionales, los compuestos naturales a menudo presentan una mayor diversidad y Ventajas •Perfil toxicológico y ambiental. •Nuevos mecanismos de acción. •Las nuevas técnicas hacen más simple su análisis. •Buena aceptación pública. •Facilidad en su registro. Inconvenientes •Estructuras complejas que pueden encarecer la síntesis. •Pueden tener propiedades fisicoquímicas inadecuadas. •Su investigación y/o su fuente pueden tener un gran coste. •Su vida media en el medioambiente puede ser demasiado corta. •El público espera que su uso sea en bajas dosis. I. Introducción 28 complejidad estructural, siendo frecuente que contengan centros quirales. Estas características les confieren una mayor especificidad asociada a nuevos sitios de acción que, en el desarrollo de nuevos plaguicidas, son muy demandados en la actualidad. Profundizar en los mecanismos de acción de los compuestos alelopáticos ayudará a explorar y comprender su papel ecológico y favorecerá el descubrimiento de plaguicidas con nuevos modos de acción. Esto último es relevante teniendo en cuenta el aumento de los problemas de resistencia a los plaguicidas sintéticos convencionales que se viene produciendo en las últimas décadas, motivado por el uso continuado de moléculas con los mismos mecanismos de acción. En el caso de los herbicidas sintéticos, por ejemplo, no se han lanzado al mercado materias activas con nuevos mecanismos de acción en las últimas décadas, existiendo una gran necesidad de combatir la resistencia generada por parte de las malas hierbas, además de compensar el descenso en el número de productos sintéticos autorizados que se ha producido en los últimos años (Cantrell et al., 2012). Tabla II. Mecanismos de acción para procesos alelopáticos según Dayan et al. (2012). Junto a las ventajas mencionadas anteriormente, el uso de compuestos naturales como plaguicidas también tiene algunas limitaciones que han venido dificultando su desarrollo e implantación (Dayan et al., 2012). Una primera cuestión a tener en cuenta es que la creencia generalizada de que todo lo natural es saludable puede llevar a una posible subestimación de I. Introducción 29 su toxicidad frente a organismos no diana. Como se ha mencionado con anterioridad, no todas las sustancias naturales son inocuas para los seres humanos y el medio ambiente y, de hecho, algunos de los compuestos con una mayor toxicidad en mamíferos son de origen natural (Abbas et al., 1997; Dayan et al., 2012; Sparks & Duke, 2021). Esto obliga a una evaluación exhaustiva antes de aprobar el uso de compuestos naturales como plaguicidas y, en su caso, de catalogarlos como sustancias de bajo riesgo. La escasa persistencia de los compuestos naturales en el medio ambiente constituye, junto a una de sus principales ventajas, su principal talón de Aquiles, pues una escasa vida media en el suelo puede llevar asociada una rápida pérdida de la eficacia biológica (Dayan et al., 2012; Chinchilla et al., 2015). Ante esta situación, se ha propuesto la modificación de compuestos naturales para dar lugar a plaguicidas más activos y selectivos, pero en ocasiones, variar ciertas propiedades fisicoquímicas para su correcta absorción y translocación puede ser contraproducente y no producir un efecto satisfactorio a una dosis económicamente viable (Dayan et al., 2009; Soltys et al., 2013). En relación con su estructura, la mayor diversidad y complejidad que caracteriza a los compuestos naturales, responsable de propiedades interesantes como una mayor especificidad asociada a nuevos sitios de acción, también los hace más difíciles de obtener o sintetizar (Duke et al., 2002). Por último, la dificultad de trasladar el comportamiento de los compuestos naturales observado bajo condiciones de laboratorio a condiciones reales de campo y de predecir la eficacia de los mismos bajo escenarios agronómicos concretos de aplicación constituye un importante obstáculo para que su uso pueda extenderse (Bhadoria, 2011; Soltys et al., 2013; Cheng & Cheng, 2015). En gran medida, esta última dificultad es consecuencia de la escasa información existente acerca de los factores que gobiernan la biodisponibilidad y la persistencia de estos compuestos una vez que alcanzan el suelo, como medio en el que generalmente deben ejercer su acción (Inderjit, 2001; Kobayashi, 2004; Trezzi et al., 2016). Las discrepancias observadas en distintos estudios sobre su aplicación en escenarios diferentes han puesto de manifiesto la complejidad de los factores que gobiernan su biodisponibilidad en el suelo, los cuales, a fecha de hoy, no están bien establecidos. Esto se debe, en gran medida, a que la investigación sobre compuestos alelopáticos se ha centrado en la identificación y evaluación de su bioactividad en experimentos de laboratorio en ausencia de suelo, obviando el papel fundamental de este en la expresión de la actividad alelopática (Inderjit, 2001; Kobayashi, 2004; Kaur et al., 2009; Reigosa-Roger & Sánchez-Moreiras, 2010; Trezzi et al., I. Introducción 30 2016). Muchos investigadores han expresado su preocupación acerca de la validez de extrapolar los resultados de los estudios de laboratorio realizados en ausencia de suelo a condiciones reales de campo (Bertin et al., 2009; Kaur et al., 2009; Hickman et al., 2021), remarcando que es crucial abordar el papel del suelo en la dinámica de estos compuestos para poder comprender su funcionalidad, así como para evaluar la viabilidad real de su posible aplicación como plaguicidas respetuosos con el medio ambiente (Macías et al., 2019; Bravetti et al., 2020). I. Introducción 31 I.3. Dinámica de los compuestos alelopáticos en el suelo En la mayoría de las ocasiones, los compuestos alelopáticos liberados por las plantas entran en contacto con el suelo y sufren procesos de transporte y degradativos que influenciarán su acumulación y, por tanto, su actividad fitotóxica (Inderjit, 2001). Un conocimiento profundo sobre la interacción de los compuestos alelopáticos con el sistema suelo resulta, por tanto, fundamental para poder predecir su comportamiento final en el mismo (Fig. 18). Figura 18: Procesos determinantes de la dinámica de los compuestos alelopáticos en los suelos (adaptado de Kobayashi, 2004). La llegada de los compuestos alelopáticos al suelo de forma natural puede producirse por múltiples vías: 1) por exudación y deposición en la superficie de las hojas con posterior lavado por la lluvia; (2) por exudación de compuestos volátiles de las partes verdes vivas de las plantas; (3) por descomposición de residuos vegetales (por ejemplo, hojarasca o raíces muertas) y (4) por exudación de las raíces (de Albuquerque et al., 2011). Con posterioridad a estos pasos, el movimiento de los compuestos alelopáticos hasta el organismo receptor dependerá fundamentalmente de las condiciones edafoclimáticas y de las propiedades físicoquímicas del compuesto, que marcarán su dinámica posterior a través de diversos procesos de transporte y transformación (Fig. 18). La incidencia de los procesos de transporte y transformación puede ocasionar la pérdida de la bioactividad de los compuestos alelopáticos, dado que pueden desplazarlos I. Introducción 32 hacia lugares alejados del organismo receptor o transformarlos química o biológicamente a formas no activas. Los procesos de biodegradación juegan un papel primario en la actividad y destino de los compuestos alelopáticos en los suelos, ya que una característica distintiva de la mayoría de los compuestos alelopáticos es que son transformados rápidamente por los microorganismos del suelo (Bravetti et al., 2020). Frecuentemente, la transformación biológica da como resultado una rápida pérdida en la toxicidad o inactivación del compuesto alelopático, aunque ciertos procesos de transformación pueden activar compuestos no activos (Macías et al., 2007; Hiradate et al., 2010). La rápida degradación de las formas activas de los compuestos alelopáticos por los microorganismos del suelo representa un importante inconveniente para su aplicación como herbicidas, porque puede dar lugar a que el tiempo de residencia en el suelo sea insuficiente para desarrollar su actividad. En resumen, un conocimiento profundo de los procesos de transferencia y transformación que pueden sufrir los compuestos alelopáticos una vez que alcanzan el suelo resulta clave para poder predecir el comportamiento medioambiental de los mismos y potenciar su uso como plaguicidas naturales. I.3.1. Procesos de transferencia o transporte Los procesos de transferencia o transporte se caracterizan por movilizar al compuesto sin producir ninguna transformación en su estructura química. De entre todos los procesos de transporte destaca el de adsorción, dado que es el que controla la cantidad de compuesto en la disolución del suelo, que es la que estará disponible para sufrir otros procesos de transporte o para ser transformada. Además de por el proceso de adsorción, la transferencia o transporte de los compuestos alelopáticos en el suelo puede ocurrir por lixiviación, escorrentía, volatilización, absorción y difusión. A continuación, se describe cada uno de estos procesos, que son de aplicación no sólo a los compuestos alelopáticos sino a cualquier otro compuesto orgánico que pueda alcanzar el suelo. I.3.1.1. Adsorción-desorción La adsorción se produce cuando un compuesto (adsorbato) pasa de estar en disolución o en fase gaseosa a la superficie de un sólido (adsorbente) sin que exista un cambio en la estructura química del mismo. En el suelo, los más frecuentes son los procesos I. Introducción 33 de adsorción que tienen lugar entre la disolución del suelo y las partículas sólidas de este, limitándose la adsorción sólido-gas a escenarios de extrema aridez (Pignatello, 1989). Existen distintos tipos de interacciones que son las responsables de la atracción entre los compuestos alelopáticos y los componentes del suelo (Kobayashi, 2004). En general, estas fuerzas son dependientes de las propiedades del adsorbato, así como de la superficie expuesta del sólido. Entre ellas predominan las interacciones de tipo van der Waals, iónicas, hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, enlaces covalentes, transferencias de carga y cambio de ligando (Fig. 19). Figura 19: Mecanismos relacionados con la adsorción de plaguicidas en el suelo clasificados según la fuerza impulsora principal del proceso. La desorción es el proceso inverso a la adsorción y se describe como el paso del adsorbato desde la superficie sólida del adsorbente a la disolución del suelo. Si la desorción se produce completamente con respecto a la cantidad de compuesto adsorbido, se dice que estamos ante una adsorción reversible (Wauchope & Myers, 1985; Monkiedje & Spiteller, 2002). Si, por el contrario, sólo es desorbible una fracción del total adsorbido estamos ante una desorción parcialmente irreversible (Cox et al., 1995; Celis & Koskinen, 1999; Fogg et al., 2003). Los fenómenos de adsorción-desorción son considerados fundamentales para determinar la dinámica de un compuesto en el suelo, ya que los otros fenómenos de transporte y degradación dependen de la disponibilidad del compuesto, que vendrá dada por el grado de adsorción-desorción al que esté sometido. Al igual que para los plaguicidas sintéticos, la adsorción de los compuestos alelopáticos a los constituyentes coloidales de los suelos, tanto minerales como orgánicos, I. Introducción 40 1980). Por otro lado, las sustancias húmicas están compuestas por ácidos fúlvicos (solubles en agua), ácidos húmicos (soluble en agua sólo a pH alcalino) y humina (insoluble a todos los pH), todos ellos estructuralmente relacionados (Pignatello, 2012). La fracción coloidal orgánica es la principal responsable de la adsorción de compuestos orgánicos hidrofóbicos sin carga, existiendo una correlación entre la adsorción de estos compuestos y la cantidad de materia orgánica del suelo. Por tanto, la adsorción de compuestos orgánicos no polares a suelos y sedimentos depende linealmente del contenido en carbono orgánico, produciéndose un reparto entre la fase acuosa y la orgánica (Chiou, 2002; Boyd et al., 2011). No obstante, debido a la heterogeneidad de la materia orgánica, también puede existir selectividad en la adsorción de compuestos orgánicos, por la existencia de determinadas propiedades como la presencia de grupos funcionales específicos, estructura o configuración, polaridad o aromaticidad (Celis et al., 2006; Pignatello, 2012). Los componentes inorgánicos comprenden mayoritariamente a los filosilicatos y a los óxidos, hidróxidos y oxihidróxidos metálicos, principalmente de Fe, Al, y Si. Normalmente, se emplea el término “arcilla” para hacer referencia a aquellos componentes inorgánicos de tamaño < 2 µm, mientras que el término “minerales de la arcilla” designa a un tipo de minerales que se encuentran en la fracción del suelo con tamaño menor a 2 μm (Moore & Reynolds, 1987). En la siguiente sección (I.4) se detalla más minuciosamente la estructura de los filosilicatos. Brevemente, se describen como compuestos que constan de unidades tetraédricas Si-O enlazadas a unidades octaédricas Al-(O, OH) ó Mg-(O, OH) formando capas cuyo apilamiento origina la estructura global del mineral. Son buenos adsorbentes para compuestos orgánicos catiónicos y polares como consecuencia de sus superficies hidrofílicas cargadas negativamente. Los óxidos metálicos se forman por empaquetamiento cúbico o hexagonal de aniones hidroxilo y óxido con cationes metálicos (Fe3+, Al3+, Mn4+) ocupando las posiciones octaédricas. Los óxidos metálicos presentan una elevada superficie específica y reactividad superficial y se les considera buenos adsorbentes para compuestos orgánicos (principalmente aniónicos) (Hingston et al., 1972; Filius et al., 1997; Celis et al., 1999b). Es importante resaltar que las características superficiales de carga de los óxidos metálicos son dependientes del pH del medio (Hingston et al., 1972). I. Introducción 41 Como consecuencia de las propiedades y características de los componentes del suelo más representativos (sustancias húmicas, filosilicatos y óxidos metálicos), las propiedades adsorbentes de estos componentes son susceptibles de modificarse, si en el suelo hay interacción entre ellos (Celis et al., 1999b; Illes & Tombacz 2004).  Características de la disolución del suelo Entre las características que presenta la disolución suelo, una de las más importantes y más influyente en los fenómenos de adsorción es el pH (Weber, 1982; Hermosín et al., 1987; Sarmah et al., 1998; Li et al., 2001). El pH de la disolución es el responsable de la carga superficial de los componentes del suelo que tienen carga variable, así como de la ionización de los compuestos con propiedades ácidas o básicas. El hecho de que los coloides presenten carga variable influye de forma directa sobre su capacidad de interaccionar con especies iónicas. Por ejemplo, los compuestos aniónicos, al disminuir el pH, aumentan su adsorción a los óxidos metálicos por un incremento de los centros con carga positiva en estos últimos. Por el contrario, los compuestos catiónicos disminuyen su adsorción a sustancias húmicas a pH bajos al producirse la protonación de los grupos carboxílicos de estas. Otra característica de la disolución muy influyente en la adsorción es la fuerza iónica, especialmente en los fenómenos de adsorción por cambio iónico. En ellos, la competencia por los sitios de adsorción entre los iones de la disolución y el soluto hace que la adsorción se vea disminuida conforme mayor sea la fuerza iónica de la disolución (Watson et al., 1973). Se ha observado que, para moléculas neutras, una fuerza iónica superior a la unidad da como resultado una mayor adsorción, mientras que para valores por debajo de la unidad no existe una tendencia general (Calvet, 1989).  Otros factores Factores como la humedad del suelo, la temperatura y el tiempo de residencia del compuesto pueden jugar también un papel importante en los procesos de adsorción. Como norma general, al disminuir la humedad del suelo y la temperatura y al aumentar el tiempo de residencia suele aumentar la adsorción (Calvet., 1989). I. Introducción 42 c) Enantioselectividad del proceso de adsorción-desorción Debido a las propiedades fisicoquímicas idénticas de los enantiómeros, a menudo se asume que, para compuestos quirales, los procesos ambientales abióticos, incluida la adsorción, no son enantioselectivos (Wong, 2006). En el caso de que se produjese una adsorción enantioselectiva en el suelo, otros procesos como la lixiviación, la escorrentía o la volatilización, se verían alterados, con la consiguiente contribución a la prevalencia de un enantiómero sobre el otro en los distintos compartimentos ambientales. La enantioselectividad de los procesos se establece comparando la abundancia de un enantiómero (E1) con la del otro (E2) a través de la fracción enantiomérica o EF, usando la expresión recomendad por Harner et al. (2000): 𝐸𝐹 =𝐸1 𝐸1+ 𝐸2 [5] donde E1 y E2 son las concentraciones de cada enantiómero. Los valores de EF oscilan entre 0 y 1, representando EF = 0.5 la mezcla racémica y EF ≠ 0.5 el predominio de un enantiómero sobre el otro. Muchos estudios han observado la ausencia de enantioselectividad en la adsorción en suelos de plaguicidas quirales como metalaxil (Celis et al., 2013; Gámiz et al., 2013; Sukul et al., 2013; Qin et al., 2014; López-Cabeza et al., 2016; Huang et al., 2017), benalaxil y furalaxil (Qin et al., 2014), tebuconazol (Gámiz et al., 2016b) o imazaquín (López-Cabeza et al., 2017). No obstante, a pesar de presentar un carácter no enantioselectivo, la adsorción puede afectar de forma indirecta a los residuos de compuestos quirales en el suelo. Celis et al. (2013), por ejemplo, demostraron que la mayor adsorción del fungicida metalaxil en suelos con elevados contenidos en arcilla podía reducir la disponibilidad de sus enantiómeros, restringiendo su biodegradación enantioselectiva, en comparación con suelos de textura más gruesa y que presentaron una menor adsorción. Los autores propusieron que la protección del plaguicida quiral era debida a la adsorción y atrapamiento en microporos, que derivó en un aumento de la persistencia del fungicida en su forma inicialmente racémica aplicada al suelo (Celis et al., 2013). Siguiendo en esta línea, existen pocos trabajos que hayan evaluado la enantioselectividad de la adsorción de compuestos alelopáticos y otros compuestos naturales quirales con potencial para ser utilizados como bioplaguicidas. Los I. Introducción 43 trabajos publicados para el ácido abscísico (Gámiz et al., 2016c; Gámiz et al., 2017a) o la carvona (Gámiz et al., 2018, 2019a) indicaron la ausencia de enantioselectividad en la adsorción, partiendo de disoluciones racémicas de estos compuestos en el estudio del proceso. Para que se produzca enantioselectividad en la adsorción se requiere la existencia de un entorno quiral. En el suelo se da esta premisa, ya que algunos minerales y ciertas regiones de la materia orgánica son quirales y, por tanto, poseen potencial para interaccionar de forma enantioselectiva con adsorbatos quirales (Pauzat et al., 2015). Existen varias razones que pueden explicar la aparente dificultad de observar procesos de adsorción enantioselectivos en los suelos. Las superficies aquirales del suelo, por ejemplo, pueden ser más abundantes que las quirales y, así, dificultar la observación de las interacciones enantioselectivas por los métodos experimentales convencionales (Celis et al., 2015; Gámiz et al., 2016a). Además, aunque los diferentes sitios de adsorción quirales en el suelo pueden causar una adsorción enantioselectiva a escala local o microscópica, debido a la heterogeneidad de los suelos, las diferencias pueden compensarse a escala global, dando lugar a una aparente falta de enantioselectividad (Gámiz et al., 2016a; Sanganyado et al., 2020). En esta línea, Celis et al. (2015) observaron adsorción enantioselectiva del fungicida metalaxil en un suelo agrícola mediterráneo, pero sólo cuando se partía de disoluciones no racémicas del fungicida. Específicamente en este caso, conforme a la forma de la isoterma (tipo S), se propuso que las disoluciones de metalaxil enriquecidas en el enantiómero R podrían haber inducido un comportamiento de adsorción enantioselectiva por el que el enantiómero R-metalaxil se adsorbía preferentemente debido a que las interacciones homoquirales R-R en el estado adsorbido eran más favorables que las interacciones heteroquirales R-S. Hay que destacar que existe un importante artefacto experimental que puede influir en la identificación de la enantioselectividad de la adsorción, originado por la biodegradación preferente de un enantiómero sobre el otro durante la medida de la adsorción. En la técnica tradicional, la cantidad de compuesto adsorbido suele determinarse calculando la diferencia entre la cantidad añadida inicialmente y la que queda en la disolución tras el equilibrio. En consecuencia, la biodegradación preferente de un enantiómero sobre el otro durante la medida de la adsorción podría interpretarse erróneamente como adsorción enantioselectiva. La degradación durante la medida de adsorción-desorción se ha descrito tradicionalmente como una posible causa de histéresis, la cual puede llegar a ser especialmente relevante I. Introducción 44 cuando se trata de compuestos naturales, que suelen biodegradarse muy rápidamente en los suelos. Gámiz et al. (2018), por ejemplo, observaron histéresis en la adsorción-desorción del monoterpeno carvona en suelos arenosos pre-autoclavados, obteniendo índices termodinámicos de irreversibilidad, TII = 1 – (Nf-des/Nf-ads), como descriptores de la histéresis, de 0.38 para la R-carvona y 0.65 para la S-carvona. Estos valores indicaban que la histéresis era selectiva para los enantiómeros. Un análisis de las isotermas de adsorcióndesorción reveló que la histéresis para la S-carvona era particularmente pronunciada en los últimos pasos de la desorción. Los autores demostraron que suponer una degradación del 10% durante la desorción era suficiente para explicar la histéresis observada para la Scarvona. I.3.1.2. Lixiviación La lixiviación es el proceso mediante el cual un compuesto se mueve a través del perfil del suelo por fenómenos de arrastre y disolución por parte del agua proveniente de las precipitaciones o del riego. Una de las consecuencias más importantes que se derivan de este proceso es la contaminación de acuíferos por la llegada de plaguicidas a través de su transporte vertical. El movimiento del compuesto desde su lugar original de aplicación dará lugar, por tanto, a una disminución en su efectividad. a) Medida de la lixiviación La forma de medirla en el laboratorio es a través de columnas de suelo a las que se aplica el compuesto de interés y, posteriormente, se eluye por la adición de agua a modo de precipitación o riego. El percolado se recoge y se analiza para obtener la cantidad de compuesto lixiviado. Tras esto, se extraen fragmentos del suelo de la columna a distinta profundidad y se les somete a un proceso de extracción, para determinar la cantidad de compuesto que haya podido quedar adsorbido al suelo. El análisis de los datos se lleva a cabo mediante la construcción de las denominadas curvas de elución, donde se representan la concentración de compuesto lixiviado frente al volumen de agua adicionada, pudiéndose obtener un modelo predictivo del comportamiento del compuesto ante unas condiciones semejantes de tipo de suelo y agua precipitada (Beck et al., 1993). I. Introducción 45 En condiciones de campo, los estudios de lixiviación se llevan a cabo mediante el empleo de lisímetros o barrenas. Estos estudios presentan la ventaja de realizar el ensayo bajo condiciones reales, pero también una mayor dificultad en su interpretación debido a la multitud de variables que intervienen en la obtención de resultados. b) Factores que afectan a la lixiviación  Adsorción a los coloides del suelo El fenómeno de adsorción juega un papel relevante en la lixiviación dado que, a mayor adsorción a los coloides de un suelo, menor será la capacidad de un compuesto de moverse a través de su perfil. Por tanto, todos los factores que afectan a la adsorción incidirán en la lixiviación (naturaleza del compuesto, propiedades del suelo y de la disolución, etc.). Se sabe que la presencia de materia orgánica soluble (MOS) puede afectar a la lixiviación de los plaguicidas por los efectos que puede tener sobre la adsorción. Se ha descrito que la MOS puede actuar como puente favoreciendo la interacción del plaguicida con las partículas de suelo, competir con el plaguicida por los sitios de adsorción o interaccionar con el plaguicida en disolución originando una asociación que favorecería la movilización del compuesto. Estos efectos pueden resultar un inconveniente a la hora de predecir y controlar el movimiento vertical de los plaguicidas (Celis et al., 1998a,b; Barriuso et al., 2011) y también el grado de exposición de los compuestos alelopáticos respecto al organismo receptor (Fig. 23). Figura 23: Representación esquemática de las posibles interacciones entre los compuestos alelopáticos (CA), la materia orgánica soluble (MOS) y el suelo. I. Introducción 46  Estructura del suelo La lixiviación ocurre bien a través de los macroporos del suelo, en los que predominan el transporte hidrodinámico y la difusión y en los que se pueden producir fenómenos de transporte preferencial, o bien a través de los microporos, donde prevalecen los procesos de difusión, adsorción y degradación y en los que la lixiviación se produce más lentamente (Cox et al., 1997a).  Aporte de agua A mayor cantidad de agua que recibe el suelo, tanto en términos de intensidad como de frecuencia, mayor será la cantidad de compuesto lavado (Wauchope, 1978). Según el aporte de agua, la lixiviación puede ocurrir en condiciones de flujo saturado, insaturado o saturado-insaturado.  Prácticas culturales El laboreo, así como la adición de enmiendas orgánicas, van a alterar la estructura del suelo y también su porosidad, además de su contenido en materia orgánica, influyendo en la movilidad de los compuestos (Cox et al., 1997a). En el caso de compuestos alelopáticos, existen algunos trabajos que han abordado el movimiento de estos compuestos a lo largo del perfil del suelo. Li et al. (2013) estudiaron la lixiviación de 10 compuestos alelopáticos en un suelo y encontraron que la diferencia observada en el factor de movilidad (Rf) entre los distintos compuestos era resultado de una adsorción preferencial sobre los coloides del suelo. Los autores también encontraron relaciones positivas entre el factor de movilidad, Rf, y el pH, y negativas entre Rf y el contenido de materia orgánica del suelo. Como hecho interesante, observaron también que la adición de una mezcla de los compuestos llevaba a una mayor movilidad que cuando eran aplicados de forma individual, lo que podría contribuir a posibles efectos sinérgicos en la actividad alelopática de los compuestos. Otras investigaciones sobre la lixiviación de compuestos alelopáticos han manifestado la influencia, además de la adsorción, de la rápida degradación de los mismos en el suelo. I. Introducción 47 Real et al. (2019) estudiaron la lixiviación de la hidroxicumarina umbeliferona en dos suelos, uno ácido y otro alcalino. Encontraron que el compuesto sólo se detectó en los lixiviados del suelo alcalino, con una cantidad total lixiviada del 14% del total aplicado. Esta cantidad tan baja se debió, probablemente, a su rápida degradación en la columna de suelo. En el suelo ácido, sólo se detectó umbeliferona en el interior de las columnas, lo que se atribuyó a una mayor adsorción en este suelo. Por último, existen estudios que han demostrado la influencia de la lixiviación en la fitotoxicidad de algunos compuestos alelopáticos. Xiao et al. (2017) evaluaron la fitotoxicidad de los residuos de siete compuestos alelopáticos tras su lixiviación en columnas de suelo y encontraron que la concentración de los compuestos alelopáticos disminuía conforme se descendía en el perfil de la columna, como consecuencia de procesos de adsorción, degradación microbiana y transformación durante el tiempo de lixiviado. Realizando bioensayos con segmentos de las columnas, demostraron que la inhibición en la germinación de plantas sensibles decrecía conforme lo hacía la cantidad de compuesto alelopático presente. c) Enantioselectividad en el proceso de lixiviación La lixiviación de los enantiómeros de una molécula quiral va a estar íntimamente relacionada con los procesos de adsorción y degradación en el suelo. Si ocurren cambios en la fracción enantiomérica (EF) durante estos procesos, se verán reflejados en los residuos presentes en los lixiviados. Celis et al. (2013) describieron las curvas hipotéticas que pueden encontrarse para la lixiviación de mezclas racémicas de un plaguicida quiral en columnas de suelo, las cuales se ilustran en la Fig. 24. Si los enantiómeros se adsorben y transforman en la misma medida, las curvas de lixiviación deben solapar (Fig. 24A). Sin embargo, la situación más habitual es la que se muestra en la Fig. 24B, donde los enantiómeros se adsorben en igual medida, pero uno de ellos se degrada más rápido que el otro durante el transporte vertical. Este comportamiento se ha observado tras la aplicación de mezclas racémicas de metalaxil, benalaxil y furalaxil en columnas de suelo (Celis et al., 2013; Qin et al., 2014). Las otras dos situaciones se darían cuando un enantiómero se retiene en mayor medida que el otro sin diferencias (Fig. 24C) o con diferencias en la degradación (Fig. 24D). I. Introducción 48 Figura 24: Curvas de lixiviación hipotéticas que podrían encontrarse para una mezcla racémica de un plaguicida quiral en columnas de suelo según Celis et al. (2013). Las líneas negras y rojas representan a cada enantiómero (adaptado de Gámiz et al., 2022). La lixiviación de mezclas no racémicas de enantiómeros de plaguicidas quirales ha sido poco estudiada. Gámiz et al. (2016a) observaron un cambio en la fracción enantiomérica de una disolución enriquecida en el enantiómero R del fungicida metalaxil durante la lixiviación a través de columnas de suelo. Este comportamiento se atribuyó a la adsorción preferente del enantiómero R por la presencia de este mismo enantiómero ya adsorbido (Celis et al., 2015). Para ambos enantiómeros, la cantidad total lixiviada fue de superior al 95%, lo que aseguró que los procesos de degradación y enantiomerización tuvieron poca influencia en la enantioselectividad de la lixiviación. Este caso se corresponde con el mostrado en la Figura 24C. Existen algunos estudios que ponen de manifiesto comportamientos enantioselectivos en el proceso de lixiviación de compuestos alelopáticos. Gámiz et al. (2016c), por ejemplo, encontraron que el movimiento de los enantiómeros del ácido abscísico (ABA) a través de columnas de suelo fue enantioselectivo, observando que los lixiviados de las columnas estaban enriquecidos en el enantiómero R-ABA. Esto se debió a la mayor persistencia de I. Introducción 49 este enantiómero en los suelos. Asimismo, la lixiviación se retrasó más en el suelo que mostró una mayor adsorción para ambos enantiómeros. I.3.1.3. Otros procesos de transporte Escorrentía. La escorrentía es el proceso por el cual se produce el transporte de agua y las sustancias presentes en la misma sobre la superficie del suelo, al superarse la capacidad de infiltración de este, bien sea por la llegada de agua de riego o de precipitación. Wauchope (1978) define un rango de solubilidad según el cual un soluto será transportado en disolución o por adsorción coloidal: a) si la solubilidad en agua es mayor a 2 mg/l el compuesto será mayoritariamente transportado en disolución, b) si la solubilidad es menor a 2 mg/l, el transporte mayoritario se dará mediante adsorción a los coloides del suelo en suspensión. Lixiviación y escorrentía son procesos relacionados entre sí en lo que respecta a la influencia del aporte de agua por precipitación o por riego. La mayor diferencia entre estos procesos radica en el tipo de movimiento que experimentará el compuesto, siendo el transporte lateral hacia aguas superficiales el sentido de transporte en el proceso de escorrentía, frente al transporte vertical, a través de los poros del suelo, hacia aguas subterráneas, que es el que se experimenta en el proceso de lixiviación. Volatilización. La volatilización es el proceso por el cual un compuesto pasa de la fase líquida a la gaseosa, facilitándose así su disipación por la atmósfera. Algunos factores climáticos muy relevantes en este proceso son la humedad del suelo, la temperatura y la velocidad del viento. Las propiedades de los plaguicidas que afectan a la volatilización (presión de vapor, constante de Henry, coeficiente de partición aire-octanol) son idénticas para los enantiómeros (López-Cabeza, 2017), así que cabe esperar que sea un proceso no enantioselectivo. La volatilización es un proceso importante en el caso de compuestos alelopáticos presentes en aceites esenciales, como los monoterpenos. Estos son considerados como compuestos orgánicos volátiles (COV) de origen biogénico (Marmulla & Harder, 2014), por poseer una elevada presión de vapor y estructura específica que los hace muy volátiles (Ouédraogo et al., 2013). Los monoterpenos se consideran importantes agentes alelopáticos en climas cálidos y secos, donde pueden actuar en la fase de vapor (Vaughn & Spencer, 1993). I. Introducción 56 la disponibilidad de los compuestos quirales para los microorganismos degradadores del suelo (Semple et al., 2003; Arias-Estévez et al., 2008; Pignatello & Nason, 2020). Celis et al. (2013) demostraron que el R-metalaxil era degradado de forma preferencial en comparación con el enantiómero S en suelos alcalinos, pero el grado de biodegradación enantioselectiva para metalaxil fue dependiente del suelo. La mayor adsorción observada para el metalaxil en un suelo con alto contenido de arcilla redujo la disponibilidad de ambos enantiómeros, restringiendo su biotransformación en comparación con suelos de textura gruesa. Los autores apuntaron que la protección del plaguicida quiral frente a la biodegradación y el atrapamiento en los poros de pequeño tamaño se tradujo en una mayor persistencia y en residuos de metalaxil más racémicos en el suelo, existiendo un efecto indirecto de la adsorción en la quiralidad de los residuos. El efecto indirecto de la adsorción en la biotransformación enantioselectiva de los plaguicidas quirales también se ha observado para compuestos naturales, como el ácido abscísico. El ácido abscísico mostró una mayor persistencia y una menor variación en su fracción enantiomérica en suelos que presentaban mayor afinidad por los enantiómeros de dicho compuesto (Gámiz et al., 2016c). No obstante, además de la adsorción, la participación de microorganismos específicos del suelo en el proceso de biodegradación podría haber contribuido también a estos resultados. pH: Se ha demostrado que el pH es capaz de modificar la biodegradación de los compuestos quirales en suelos. Por ejemplo, Buerge et al. (2003) observaron que el Smetalaxil se degradaba más rápidamente que el R-metalaxil en suelos anaeróbicos y en suelos aeróbicos con pH < 4, mientras que el enantiómero R era degradado preferencialmente en suelos aeróbicos con pH > 5. Otros ejemplos se han encontrado con el herbicida beflubutamida, cuya biotransformación fue ligeramente enantioselectiva en suelos alcalinos, con una degradación más lenta para el enantiómero bioactivo, y mucho más enantioselectiva en suelos ácidos (Buerge et al., 2013). El pH del suelo también alteró la fracción enantiomérica de imazetapir durante su transformación en condiciones aeróbicas (Wu et al., 2017). En todos los suelos estudiados, el enantiómero R se degradó más rápidamente que el S, pero el grado de enantioselectividad fue dependiente del pH. Los autores atribuyeron esta observación a la baja adsorción y elevada biodisponibilidad de imazetapir a pH elevados de los suelos (Wu et al., 2017). I. Introducción 57 Para el compuesto alelopático carvona, se han obtenido evidencias del efecto del pH sobre las poblaciones microbianas y de su capacidad de modificar la enantioselectividad de la degradación del compuesto (Gámiz et al., 2018). La biodegradación de la mezcla racémica de carvona en un suelo ligeramente alcalino se produjo rápidamente, siendo el enantiómero S degradado con mayor rapidez que el R. Cuando se acidificó el mismo suelo con HCl hasta un pH de 5.5, la disipación de carvona se volvió más lenta y apenas enantioselectiva, con valores de EF residuales de carvona cercanos a 0.5 (Gámiz et al., 2018). Dado que la adsorción de carvona al suelo sin tratar y tratado con ácido fue similar, este comportamiento se atribuyó a las alteraciones de la actividad microbiana del suelo producidas por el cambio de pH (Gámiz et al., 2018). Condiciones redox: Las condiciones redox constituyen un parámetro muy importante en la disipación de algunos compuestos quirales en el suelo. Por ejemplo, para ambientes aeróbicos y concentraciones relevantes a nivel medioambiental, se observó una degradación preferencial del enantiómero R del herbicida mecoprop (MCPP); sin embargo, bajo condiciones anaeróbicas y a altas concentraciones de MCPP, fue el enantiómero S el que se degradó preferencialmente (Frková et al., 2016). Los autores encontraron tres tipos de comunidades microbianas que actuaban preferentemente en función de las condiciones ambientales (Frková et al., 2016). Prácticas culturales: Las prácticas agrícolas, junto a las distintas formas de aplicación del compuesto quiral, pueden influir en la disponibilidad de los enantiómeros y también en la naturaleza y actividad de las poblaciones microbianas del suelo (Gámiz et al., 2013, 2016b, 2022; López-Cabeza et al., 2017). I.3.2.3. Enantiomerización La enantiomerización es el proceso mediante el cual un enantiómero se convierte en el otro. En general, la enantiomerización es un proceso muy energético que suele producirse en carbonos quirales que pueden formar grupos metino. No obstante, cuando la energía necesaria se puede obtener, por ejemplo, a través de la absorción de radiación ultravioleta, la enantiomerización también puede implicar roturas homolíticas de enlaces C—C (Katagi, 2012). La enantiomerización puede ocurrir por vía abiótica, donde predominan los procesos de hidrólisis, ácida o básica, y fotolisis, o por vía biótica, producida por la actividad enzimática de los microorganismos del suelo (Katagi, 2012). I. Introducción 58 La enantiomerización es un proceso que se debe considerar cuando se evalúa el comportamiento de un compuesto quiral en el suelo. Por ejemplo, si se produce la desaparición enantioselectiva de un compuesto, esta puede tener lugar no sólo como consecuencia de una degradación preferencial de uno de los enantiómeros, sino que puede deberse a la interconversión de un enantiómero en el otro (Müller & Buser, 1997; Romero et al., 2001). En el caso de los plaguicidas quirales, el conocimiento de este proceso resulta fundamental a la hora de valorar la posible sustitución de una mezcla racémica en favor del enantiómero puro biológicamente activo correspondiente, ya que el coste de dicha sustitución podría no estar justificado si el enantiómero puro racemiza rápidamente (Katagi, 2012). I. Introducción 59 I.4. Estrategias de modulación del comportamiento de los compuestos alelopáticos en el suelo: uso de arcillas y de enmiendas orgánicas como adsorbentes Desde una perspectiva general, a pesar de representar una alternativa prometedora para un control sostenible de plagas, la aplicación de compuestos alelopáticos como herbicidas naturales todavía requiere esfuerzos dirigidos a solventar las limitaciones que a menudo se asocian al empleo de estos compuestos. Entre ellas destacan la escasa persistencia que suelen presentar una vez que alcanzan el suelo, que puede reducir rápidamente su eficacia biológica, y la inconsistencia que puede manifestar su actividad dependiendo del escenario concreto de aplicación. Por ello, el desarrollo de estrategias que permitan superar estas limitaciones se considera un objetivo que podría contribuir a estimular la comercialización y el uso de los compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales. Algunas de estas estrategias, que se abordan en la presente Tesis Doctoral, son las siguientes: Selección de los escenarios de aplicación. Puesto que las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo, así como las condiciones ambientales, afectan de forma decisiva a la bioactividad de los compuestos alelopáticos a través de su influencia en su adsorción y transformación, la selección de condiciones edafo-climáticas favorables podría constituir una forma inmediata de maximizar su eficacia. Como se ha mencionado con anterioridad, las propiedades del suelo que más afectan a la biodisponibilidad de los compuestos alelopáticos son su composición (contenido en arcilla y materia orgánica), estructura (tamaños de poros y su distribución), humedad, pH y actividad biológica (Scavo et al., 2019). Dependiendo de estas propiedades, el potencial alelopático de muchos compuestos puede expresarse selectivamente en unos suelos y no en otros. Hiradate et al. (2010), por ejemplo, observaron que la expresión de la fitotoxicidad de la juglona variaba en función del tipo de suelo. También se ha comprobado que la presencia de minerales de la arcilla en los suelos puede inactivar compuestos alelopáticos fenólicos al inducir reacciones de polimerización oxidativa (Inderjit, 2001; Polubesova et al., 2010). Dado que existe muy poca información acerca del comportamiento de la mayoría de los compuestos alelopáticos en el medio ambiente, resulta de gran importancia generar datos sobre la adsorción y transformación de estos compuestos en suelos con características distintas y bajo diferentes condiciones ambientales que ayuden a identificar los factores y mecanismos que gobiernan su biodisponibilidad y posibiliten la selección de las condiciones agroclimáticas más idóneas para la expresión de su fitotoxicidad. I. Introducción 60 Formulación. Los herbicidas se aplican a los cultivos como formulaciones que, además de la sustancia activa, contienen componentes adicionales introducidos para facilitar su aplicación o aumentar su eficacia. Estos componentes adicionales o adyuvantes mejoran la dispersión en agua del compuesto, prolongan su actividad o aumentan su absorción por la planta a combatir (Uddin et al., 2014). Varios estudios han puesto de manifiesto la necesidad de desarrollar formulaciones adecuadas capaces de retrasar la rápida degradación microbiana que suelen sufrir los compuestos alelopáticos en el suelo, con el fin de aumentar su eficacia. Un ejemplo lo encontramos en Bertin et al. (2009), quienes observaron que las excelentes propiedades herbicidas del amino ácido no proteico m-tirosina se perdían completamente en sólo dos días por su rápida biodegradación en suelos. Los autores señalaron que una posible formulación que permitiese estabilizar el compuesto en el suelo podría ayudar a que la mtirosina pudiera tener aplicación como herbicida natural. Travaini et al. (2016) obtuvieron resultados similares para las furanocromonas kelina y visnagina. El desarrollo de formulaciones adecuadas que protejan al compuesto activo de rápidas pérdidas por transporte o degradación y permitan mantener concentraciones moderadas del mismo el tiempo suficiente para que ejerza su acción biológica es una estrategia que se ha propuesto para aumentar la eficacia y reducir el impacto ambiental de los plaguicidas sintéticos convencionales y que podría ser particularmente interesante para prolongar la eficacia de los plaguicidas naturales (Bertin et al., 2009; Gasic & Tanovic, 2013; FloresCéspedes et al., 2015; Pang et al., 2016; Gámiz & Celis, 2021). Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el soporte o encapsulación del compuesto en matrices de diversa naturaleza. El nuevo fungicida antibotrítico comercial ARAW (Sipcam Iberia) a base de tres terpenos (eugenol, geraniol y timol) encapsulados en microesferas biológicas con capacidad para liberarlos de forma gradual, en consonancia con las condiciones que favorecen la aparición de algunas enfermedades sobre las que actúa la mezcla de terpenos (Ruiz-García et al., 2015; MAGRAMA, 2016), constituye un ejemplo de que existe un interés real por el desarrollo de plaguicidas naturales y por mejorar la sofisticación de las tecnologías de formulación con el fin de optimizar la eficacia de los mismos. Dado que los terpenos eugenol, geraniol y timol son sustancias incluidas en el Anexo IV del reglamento (CE) No. 396/2005, no requieren fijación de límites máximos de residuos (LMRs), lo que supone una ventaja para su registro y comercialización. En este sentido, el reciente auge en el diseño de materiales nanoestructurados, con una gran variedad de propiedades morfológicas y funcionales, abre un amplio abanico de posibilidades en cuanto a la utilización de este tipo I. Introducción 61 de materiales como soportes en la formulación de plaguicidas naturales (Forim et al., 2013; Kah & Hofmann, 2014; Benelli et al., 2017; Real et al., 2019). Hasta la fecha, no obstante, el uso de estos materiales para optimizar la actuación de los compuestos alelopáticos como herbicidas naturales está poco explorado. Modificaciones del suelo. Se sabe que la modificación del suelo a través de la adición de enmiendas orgánicas e inorgánicas puede tener un gran impacto sobre la dinámica de los plaguicidas. Aunque, como práctica agrícola, el principal propósito de la adición de enmiendas orgánicas es aumentar la fertilidad de los suelos, a menudo esta práctica aumenta la adsorción y reduce la movilidad de los plaguicidas y puede acelerar o retrasar su biodegradación en función de las características físico-químicas del plaguicida, la naturaleza de la enmienda y el tipo de suelo (López-Piñeiro et al., 2013; García-Delgado et al., 2020). Las enmiendas inorgánicas y los complejos organoarcillosos también han demostrado su capacidad de alterar la movilidad y la persistencia de los plaguicidas en suelos, tanto en condiciones de laboratorio como de campo (Rodríguez-Cruz et al., 2007; Gámiz et al., 2010, 2016b). Por lo tanto, la manipulación de los sistemas agrícolas mediante la adición de enmiendas a los suelos podría ser una estrategia útil para incrementar la bioactividad de los compuestos alelopáticos, por la influencia que puede ejercer en la adsorción y degradación de los mismos (Gámiz et al., 2019b). I.4.1. Uso de compuestos laminares como adsorbentes Los minerales de la arcilla, en particular los filosilicatos 2:1, y sus análogos sintéticos estructuralmente complementarios, los hidróxidos dobles laminares (HDL), han suscitado un gran interés como materiales adsorbentes para evitar o combatir la contaminación por compuestos orgánicos como los plaguicidas (Cornejo et al., 2008). Este hecho se debe principalmente a sus elevadas superficies específicas asociadas a su estructura en láminas, a la facilidad con que se obtienen o sintetizan y a la posibilidad de modificar sus superficies para aumentar su afinidad por compuestos específicos. Las distintas aplicaciones que se han propuesto en el campo de los plaguicidas abarcan desde su empleo como soportes para la liberación lenta de los mismos hasta su adición directa al suelo como barreras inmovilizantes o su uso como filtros para aguas contaminadas. En el contexto de esta Tesis Doctoral, es de esperar que también puedan tener aplicación en el ámbito relativo al uso de los compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales. I. Introducción 62 Tanto los filosilicatos como los hidróxidos dobles laminares presentan unas características estructurales comunes, ya que están constituidos por la combinación de láminas de tetraedros y/u octaedros de diferentes óxidos e hidróxidos metálicos. La composición y el empaquetamiento de las láminas determinará la naturaleza de los diferentes compuestos laminares. Si tenemos en cuenta la carga neta del material, estamos ante filosilicatos o las denominadas “arcillas naturales” si la carga es negativa, o ante hidróxidos dobles laminares (HDL) o compuestos tipo hidrotalcita si su carga laminar es positiva (Fig. 25). Figura 25: Representación esquemática de las estructuras de los filosilicatos e hidróxidos dobles laminares. I.4.1.1. Filosilicatos a) Estructura Los filosilicatos forman parte del grupo conocido como minerales de la arcilla, que están presentes en suelos y sedimentos y que coexisten con otras fases, tanto cristalinas como amorfas (gibbisita, goetita, hematites…) (Guggenheim & Martin, 1995). Se generan por la meteorización de silicatos o se encuentran en yacimientos enriquecidos en alguno de ellos. Estos materiales juegan un papel clave en la agricultura porque su presencia en el suelo modifica ciertas propiedades fundamentales del mismo como la textura, la estructura, la capacidad de retención de agua y la fertilidad. La estructura global de los filosilicatos consiste en unidades tetraédricas con Si y O y de unidades octaédricas con Mg y O/OH o Al y O/OH, formando capas bidimensionales que se apilan a su vez en láminas tridimensionales. Dependiendo de cómo se apilen las capas para formar las láminas, los filosilicatos se clasifican de la siguiente manera: I. Introducción 63 Filosilicatos 1:1. Las láminas tridimensionales del mineral se forman por la condensación de una capa octaédrica con una tetraédrica y se unen entre sí mediante enlaces de hidrógeno entre grupos OH y O de capas contiguas. Filosilicatos 2:1. Las láminas tridimensionales se forman por la condensación de una capa octaédrica entre dos tetraédricas y se unen entre sí a través de fuerzas de van der Waals que se establecen entre los átomos de oxígeno de capas contiguas. Estos minerales se caracterizan por presentar, en la mayoría de los casos, carga negativa permanente en sus láminas debido a la sustitución isomórfica en la capa tetraédrica de un átomo de Si4+ por otro de similar tamaño y menor carga, como puede ser, por ejemplo, el Al3+. A su vez, este fenómeno también puede producirse en la capa octaédrica, en la que el Al3+ puede ser reemplazado por Mg2+ provocando un desbalance en la carga. La carga negativa neta generada se compensa mediante la presencia de cationes inorgánicos, hidratados en menor o mayor grado, que se sitúan tanto en los bordes como entre las láminas del mineral. Los cationes inorgánicos pueden ser intercambiados por otros, con mayor o menor facilidad dependiendo de si la carga permanente se encuentra en la capa tetraédrica o en la octaédrica, de la carga neta de la celda unidad y de la naturaleza del catión. Filosilicatos 2:1:1. La estructura de este grupo de minerales es similar a la de los minerales 2:1. En ellos, el balance de carga se mantiene gracias a la presencia en el espacio interlaminar de grupos hidroxilo coordinados octaédricamente de forma similar a las capas octaédricas. Esta característica hace que su capacidad de intercambio catiónico y de expansión sean nulas, como les ocurre a las cloritas, que forman parte de este grupo (Karathanasis et al., 1983; Ezzaim et al., 1999). En esta Tesis Doctoral nos hemos centrado en filosilicatos de estructura 2:1, concretamente del grupo de las esmectitas y subgrupo de las montmorillonitas, que son minerales en los que las posiciones octaédricas están ocupadas por cationes Al y sus sustituciones isomórficas. Su fórmula general es la siguiente: (Na,Ca)0.3(Al, Mg)2Si4O10(OH)2. b) Características adsorbentes de las esmectitas En la Figura 26 se muestran los principales centros de adsorción de las esmectitas. Los centros activos son determinados puntos estructurales que coinciden con los cationes de intercambio hidratados presentes en el espaciado interlaminar y en los bordes del mineral, los I. Introducción 64 sitios de carga variable dependientes del pH, como son los grupos silanoles (Si-OH) y aluminoles (Al-OH) de los bordes de ruptura de los enlaces Si-O-Si y Al-O-Si, y los grupos siloxanos laminares de los planos basales externos o interlaminares. Estos últimos se sitúan entre los sitios cargados y poseen carácter hidrofóbico (Jaynes & Boyd, 1991). Figura 26: Centros activos de un mineral esmectítico en relación con la adsorción de compuestos orgánicos. La interacción de estos centros activos con compuestos orgánicos depende en gran medida de la carga que presenten estos últimos. Así, los compuestos catiónicos y protonables se adsorben rápidamente, atraídos por la carga negativa permanente de las láminas, intercambiándose con el catión interlaminar o mediante la formación de puentes de H y enlaces polares (Hermosín & Pérez-Rodríguez, 1981; Cox et al., 1997b). Por el contrario, aquellos compuestos que son aniónicos o ácidos débiles presentan una baja afinidad por las superficies cargadas negativamente del mineral y, al ser repelidos por estas, su adsorción es muy baja o prácticamente nula (Celis et al., 1999a). En ocasiones, los bordes de las láminas de las esmectitas pueden estar cargados positivamente, normalmente a valores de pH inferiores a 5, representando sitios de adsorción para especies aniónicas, que también pueden interaccionar con metales polivalentes que ocupen sitios de intercambio o, si se produce el ambiente adecuado, mediante fuerzas de van der Waals (Lagaly, 2001). No obstante, estos sitios no son predominantes y la adsorción suele quedar gobernada por la presencia de carga negativa en la I. Introducción 65 superficie. En cuanto a los compuestos neutros e hidrófobos, estos no suelen presentar una elevada afinidad por las esmectitas, como consecuencia de las características hidrofílicas de su superficie conferidas por los cationes de cambio hidratados (Jaynes & Vance, 1996), mientras que los compuestos neutros con carácter polar que presenten ciertos grupos funcionales (-OH, =O, -NH2…) son adsorbidos por fuerzas polares (ion-dipolo o dipolodipolo) o enlaces de coordinación (López-Cabeza, 2017). c) Propiedades adsorbentes de las esmectitas modificadas con cationes orgánicos Como se ha expuesto previamente, las características de carga de las esmectitas hacen que sean materiales adecuados para la adsorción de especies catiónicas y polares, tanto inorgánicas como orgánicas. La presencia de cationes inorgánicos hidratados confiere un carácter hidrofílico a su superficie, reduciendo su afinidad hacia moléculas orgánicas neutras hidrofóbicas (Jaynes & Vance, 1996). De forma análoga, los compuestos aniónicos son repelidos por las superficies basales con carga negativa de las esmectitas y presentan una escasa afinidad por las mismas (Celis et al., 1999b). Sobre esta base, para mejorar las propiedades de adsorción de las esmectitas hacia estos compuestos, puede procederse a la modificación de las propiedades superficiales de la arcilla mediante la sustitución de los cationes inorgánicos presentes en el espacio interlaminar por cationes orgánicos (Jordan, 1949; Akelah et al., 1994; Ruiz-Hitzky & Van Meerbeek, 2006). Estos cambios son posibles porque las esmectitas son filosilicatos de tipo expansibles, lo que les permite incorporar cationes incluso muy voluminosos dando lugar a las denominadas organoarcillas. Los cationes orgánicos más empleados para la modificación de esmectitas y obtención de organoarcillas son los cationes alquilamonio cuaternarios, que suelen representarse como [(CH3)nNR4-n]+, siendo R un hidrocarburo aromático o alifático (Fig. 27) (Cornejo et al., 2008), aunque también se emplean otros compuestos, como especies poliméricas (Ruiz-Hitzky & Van Meerbeek, 2006; Gámiz et al., 2010; Celis et al., 2012). Las organoarcillas, tradicionalmente, se han clasificado en dos tipos dependiendo del catión orgánico introducido en la interlámina y cuya disposición en este espacio depende principalmente de la combinación entre su tamaño y la densidad de carga de la arcilla. Por tanto, se distinguen: I. Introducción 72 muchos aniones orgánicos para modificar las propiedades de adsorción, pero los más utilizados han sido los tensioactivos dodecilsulfato (DDS) y dodecilbencenosulfonato (DBS) (Meyn et al.,1990; Lagaly & Beneke, 1991; Pavlovic et al., 1997) (Fig. 31). La fuerte afinidad de estos surfactantes por la interlámina de los HDL y su tendencia a formar micelas dan como resultado la creación de un entorno hidrófobo. Figura 31: Estructura de los aniones orgánicos más empleados para modificar hidrotalcitas. Los organo-HDL u organohidrotalcitas se pueden sintetizar fácilmente mediante síntesis directa, intercambio aniónico o por rehidratación del óxido mixto en presencia del surfactante aniónico. Debido a la gran densidad de carga superficial de los HDL, las moléculas del surfactante generalmente se orientan perpendicularmente a las láminas, aunque la síntesis y el secado pueden influir en su inclinación e incluso dar como resultado la formación de bicapas. Dependiendo del tamaño de las cadenas alquílicas del anión, los espaciados basales de los organo-HDL pueden variar entre 1.7 y 4.7 nm (Meyn et al., 1990; Clearfield et al., 1991). Más recientemente, se ha buscado la incorporación de aniones que puedan resultar menos dañinos para el medio ambiente en el caso de que los HDL modificados puedan alcanzar suelos o ambientes acuáticos tras su aplicación. En este contexto, Celis et al. (2014) compararon la modificación de un HDL de Mg/Al-CO3 con ácidos grasos con el mismo número de carbonos (C18) pero que contenían un número diferente de insaturaciones en su cadena (Fig. 32). Demostraron que la capacidad de adsorción de cada organo-HDL dependió del grado y tipo de insaturación. Los ácidos grasos cis-insaturados dieron lugar a organoHDL con una menor afinidad por plaguicidas no iónicos que los trans-insaturados, al originar estructuras menos hidrofóbicas en el espacio interlaminar. I. Introducción 73 Figura 32: Ácidos grasos empleados para modificar hidrotalcitas. En lo que se refiere a su interacción con compuestos bioactivos, los hidróxidos dobles laminares han sido menos estudiados que las esmectitas. Por ejemplo, Lobo-Sánchez et al. (2018) prepararon un HDL de Zn/Al con una relación 3:1 que mostró capacidad bactericida tras la adsorción de un extracto de aceite de eucalipto. De forma similar, Radwan et al. (2022) adsorbieron diferentes sustancias extraídas del aceite de hinojo en un HDL de Mg/Al y prepararon nanocomposites que presentaron buenas propiedades insecticidas a través de su desorción controlada. 1.4.1.3. Granulación de compuestos laminares para su aplicación como adsorbentes Una de las formulaciones utilizadas para la aplicación al campo de plaguicidas es mediante su conformación en gránulos, que presenta ciertas ventajas frente al resto de formulados, como la de requerir una escasa manipulación al permitir su aplicación directa. La granulación, también conocida como aglomeración, peletización o formación de esferas, consiste en la agregación de partículas finas en una masa semipermanente de mayor tamaño. La granulación encuentra aplicaciones en una amplia gama de industrias, incluido el procesamiento de minerales, productos agrícolas, detergentes, productos farmacéuticos, productos alimenticios y productos químicos especiales. El proceso de granulación húmeda se puede realizar de varias maneras, como rociar un aglutinante líquido sobre las partículas mientras se agitan en un tambor giratorio, I. Introducción 74 granuladores de lecho fluidizado, mezcladores de alto cizallamiento o dispositivos similares. El líquido une las partículas por la combinación de fuerzas capilares y viscosas hasta que se forman enlaces más permanentes por el secado posterior (Visavale et al., 2007). Normalmente, la granulación húmeda comprende los siguientes pasos (Iveson et al., 2001): 1. Humectación y nucleación, donde el aglutinante líquido se pone en contacto con el polvo seco. Esta es una etapa importante en el proceso de granulación, pues se espera que el aglutinante se distribuya uniformemente por todo el lecho para dar gránulos de núcleos de tamaño uniforme. 2. Consolidación y crecimiento, donde la colisión entre dos gránulos, gránulos y polvo de alimentación o gránulos y el equipo conducen a la compactación y crecimiento de los gránulos. El crecimiento ocurre siempre que el material presente en el granulador choca y se pega. El proceso de crecimiento comienza tan pronto como el líquido entra en contacto con la masa de polvo agitada. Durante la agitación, los gránulos generalmente se consolidan. 3. Desgaste y rotura, donde los gránulos húmedos o secos se rompen debido a un impacto, desgaste o compactación en el granulador o durante la manipulación posterior. La rotura de los gránulos húmedos suele determinar la distribución final del tamaño de los gránulos, especialmente en un granulador de alto cizallamiento. La rotura se puede utilizar para limitar el tamaño máximo de los gránulos o para ayudar a distribuir un aglutinante viscoso (Bardin et al., 2004). Las arcillas se han propuesto como adsorbentes de plaguicidas sintéticos, pero, aunque presenten gran poder adsorbente, no se pueden aplicar directamente en forma de polvo debido a su pequeño tamaño de partícula y los problemas de inhalación que conllevan (Durán et al., 2019). La conversión de polvos de arcilla en gránulos mejora la permeabilidad y retrasa la desorción de los compuestos debido a la estructura porosa y la densidad aparente del material granulado (Du et al., 2017). Asimismo, se facilita el manejo del material al evitar la segregación de partículas finas durante su uso (Visavale et al., 2007). En el caso de las arcillas, existen muchos tipos de aditivos aglomerantes entre los que se encuentran celulosas o alginatos, ceras y resinas (Bueno et al., 2021). A veces, el uso de ligantes para la granulación de arcilla puede fallar debido al hinchamiento de las esmectitas. I. Introducción 75 Sin embargo, las organoarcillas, modificadas con cationes de amonio cuaternario, se pueden granular fácilmente, ya que el catión modificador actúa como coaglutinante (Alther, 2004). Existen en la bibliografía ejemplos de aplicación de organoarcillas granuladas en el ámbito de la descontaminación de aguas. Así, Du et al. (2017) obtuvieron gránulos de una bentonita modificada con el catión hexadeciltrimetilamonio (HDTMA) que presentó características satisfactorias para la adsorción del contaminante tributilo de estaño. Más recientemente, Durán et al. (2019) obtuvieron diferentes gránulos de una organobentonita que resultaron ser efectivos como componentes de filtros al presentar buena resistencia al agua y obtenerse porcentajes de adsorción similares a los obtenidos con el polvo de la organoarcilla. En esta Tesis Doctoral hemos empleado una organoarcilla comercial Cloisite 10A para la formación de gránulos en su aplicación como adsorbente de compuestos alelopáticos. Gámiz & Celis (2021) prepararon gránulos a base de esta organoarcilla comercial y los utilizaron como soportes del monoterpeno S-carvona. Los gránulos preparados se comportaron como un sistema de liberación lenta, reduciendo las pérdidas por transporte del compuesto alelopático y prolongando su efecto fitotóxico en ensayos de laboratorio. I.4.2. Uso de enmiendas orgánicas como adsorbentes La adición de enmiendas orgánicas constituye una práctica que mejora las propiedades fisico-químicas de los suelos agrícolas, al incrementar el contenido en carbono orgánico, la capacidad de retención de agua y la porosidad del suelo (Tester, 1990). Al mejorar la estructura del suelo, la biodisponibilidad de los nutrientes y la actividad microbiana, aumenta la fertilidad, por lo que puede contribuir a recuperar suelos degradados (García et al., 2017; Galán-Pérez & Peña, 2019). Además, la adición de enmiendas orgánicas suele tener un importante efecto en los procesos de retención de compuestos orgánicos y también en su degradación (Si et al., 2006). Para plaguicidas sintéticos, se ha comprobado que en suelos con abundante materia orgánica, propia o aplicada a través de enmiendas, disminuyen las pérdidas de agroquímico por los fenómenos de lixiviación y escorrentía en comparación con suelos con poca materia orgánica (Gámiz, 2012; Perez-Lucas et al., 2021). Es de esperar, por tanto, que las enmiendas orgánicas puedan tener un efecto similar sobre el comportamiento de los compuestos alelopáticos. I. Introducción 76 El interés acerca de los cambios que puede provocar la aplicación de enmiendas orgánicas en la dinámica de los plaguicidas en el suelo surge en la década de los 80 (Gerstl & Helling, 1985; Azam et al., 1988). A raíz de los beneficios encontrados, se han llevado a cabo estudios con enmiendas muy diferentes como el carbón vegetal (Bosetto et al., 1992), la turba (Moorman et al., 2001), lodos de estaciones depuradoras de aguas residuales (Celis et al., 1998a,b; González et al., 2008), residuos sólidos urbanos (Fernández et al., 2000; Cox et al., 2001) y residuos o subproductos agroalimentarios (Businelli, 1997; Marín-Benito et al., 2009). A nivel nacional, por la importancia del sector relacionado con la producción del aceite de oliva, los residuos de almazaras, como el alperujo, han sido muy estudiados (Albarrán et al., 2003; Cox et al., 2004a; López-Piñeiro et al., 2013). Por ser uno de los materiales ensayados como enmienda en la presente Tesis Doctoral, las características del alperujo se resumen a continuación. I.4.2.1. El alperujo como enmienda agrícola La producción de aceite de oliva a través del sistema de dos fases como el que se utiliza en España lleva asociada la generación de un subproducto sólido formado por fragmentos de las aceitunas, aguas de vegetación y restos grasos, conocido como alperujo (Fig. 33A). El alperujo tiene una elevada humedad, una relación C/N alta y carácter ácido. Es rico en lignina, hemicelulosa celulosa, proteínas, lípidos e hidratos de carbono (Alburquerque et al., 2004). Además, contiene compuestos fenólicos a los que se les atribuye carácter fitotóxico (Alburquerque et al., 2006). Con la finalidad de mejorar las propiedades físicas y químicas del alperujo y disminuir su fitotoxicidad, el producto que resulta de las almazaras suele someterse a un proceso de secado y compostaje. A través de este proceso, se produce una descomposición microbiana de la materia orgánica en un ambiente húmedo, templado y aeróbico, dando lugar a un material denominado compost (Fig. 33B). Estos residuos son apilados y acumulados. Por la acción de los microorganismos se producen reacciones exotérmicas que hacen que estos cúmulos puedan llegar a temperaturas de hasta 80ºC en el centro, causando su pasteurización. Esta degradación por micoorganismos de la materia orgánica hace que se produzca una reducción de masa de hasta un 50%. I. Introducción 77 I.4.2.2. El biochar de alperujo El carbón biológico o biochar (BC) es un material que está recibiendo una gran atención en los últimos años como enmienda agrícola (Fig. 33C). Se forma a partir de la transformación termoquímica de biomasa mediante procesos de pirólisis, gasificación o carbonización hidrotermal, principalmente (Cha et al., 2016). A través de estos procesos, se genera un material muy estable que, al aplicarlo al suelo, incrementa la fertilidad, la capacidad de retención de agua, el potencial de captura de carbono y disminuye la emisión de gases con efecto invernadero. Aparte de la optimización de la producción de cultivos asociada a estos efectos, otra aplicación del biochar es su uso como adsorbente en la recuperación de suelos contaminados, tanto por metales pesados (Campos et al., 2021) como por contaminantes orgánicos (Gámiz et al., 2017b). Los factores que más determinan las propiedades del biochar son la temperatura de obtención y el origen de la biomasa. Tang et al. (2013) investigaron la influencia de estas variables en la superficie específica y porosidad de diferentes biochars, relacionándola con la capacidad de adsorción. Los biochars preparados a una temperatura de pirólisis más elevada (> 500 °C) presentan una estructura más grafitizada (aromática), una mayor superficie específica y un menor contenido en grupos funcionales que los preparados a menor temperatura (Gámiz et al., 2017b). La evolución de la estructura molecular y el desarrollo de microporos con la temperatura de calentamiento determinarán el comportamiento posterior del biochar como adsorbente de compuestos orgánicos, así como los mecanismos involucrados (Lian & Xing, 2017). Figura 33: Muestras de: A) alperujo, B) alperujo compostado y C) biochar de alperujo. I. Introducción 78 Los residuos de almazaras constituyen una de las materias primas a partir de las cuales puede obtenerse biochar. Varios trabajos han determinado las propiedades adsorbentes de biochars obtenidos de alperujo, poniendo de manifiesto su elevada capacidad de adsorción para metales pesados (Ahmad et al., 2014) y compuestos orgánicos como los plaguicidas (Cabrera et al., 2011; García-Jaramillo et al., 2014). I.4.2.3. Efectos de la adición de alperujo en la dinámica de los plaguicidas y compuestos alelopáticos Se sabe que el efecto de las enmiendas orgánicas en la dinámica de los plaguicidas depende de las propiedades del suelo y de la enmienda, así como de las características del plaguicida. De forma similar a lo que ocurre con otros residuos orgánicos, la materia orgánica insoluble del alperujo suele aumentar la adsorción de los plaguicidas, mientras que el efecto de la materia orgánica soluble puede ser más variable (Cox et al., 2004b; Fernandes et al., 2006). Se ha descrito que la materia orgánica soluble del alperujo puede aumentar la adsorción, cuando recubre las partículas del suelo y proporciona nuevos sitios de interacción, o reducirla, por la formación de complejos solubles o por competencia por los sitios de adsorción de las partículas del suelo (Cox et al., 2004b; Peña et al., 2015). En cuanto al efecto en la persistencia, la adición de alperujo puede ralentizar la degradación microbiana de los plaguicidas como consecuencia de una degradación preferencial de la materia orgánica proporcionada por la enmienda por parte de los microorganismos degradadores del suelo (Albarrán et al., 2003; Gámiz et al., 2019b). Este hecho es más habitual en el caso del alperujo fresco, que contiene un mayor contenido en materia orgánica lábil y, por tanto, fácilmente biodegradable. Los tratamientos de compostaje y pirólisis transforman la materia orgánica en compuestos más humificados y aromáticos, alterando también sus propiedades adsorbentes y sus efectos sobre los microorganismos del suelo respecto al material de partida (Fig. 34). Mientras que la información acerca de los efectos que la adición de residuos orgánicos como el alperujo puede tener en la dinámica de los plaguicidas en el suelo es considerable, los estudios realizados sobre sus posibles efectos en la dinámica de los compuestos alelopáticos son mucho más escasos. La mayoría de los trabajos publicados en este sentido se han diseñado para demostrar que la adición de biochar puede ser útil para reducir la fitotoxicidad que determinados compuestos alelopáticos pueden ejercer sobre cultivos, a través de una I. Introducción 79 disminución de su biodisponibilidad (Rogovska et al., 2014; Lu et al., 2015; Sujeeun & Thomas, 2017; Zhang et al., 2018). Algunos estudios, sin embargo, apuntan a que, dependiendo de la naturaleza de la enmienda, es posible regular la biodisponibilidad del compuesto alelopático, por ejemplo, a través de un aumento de su persistencia, para potenciar su bioactividad (Gámiz et al., 2019b, 2021; Real et al., 2019, 2021). Teniendo esto en cuenta, la aplicación de compuestos alelopáticos en suelos enmendados podría constituir un escenario propicio para optimizar su actividad como herbicidas naturales, aunque este es un aspecto que se encuentra todavía muy poco explorado en la bibliografía. Figura 34: Posibles mecanismos de interacción entre el biochar y compuestos orgánicos (adaptado de Ahmad et al., 2014). afsdfasgd Capítulo II Objetivos III. Resumen de resultados y discusión 88 Los resultados de adsorción de escopoletina a los suelos (Fig. 36) mostraron que esta presentaba mayor afinidad por los suelos ácidos que por los suelos alcalinos, de manera que las correlaciones entre adsorción y las propiedades de los suelos reflejaron una relación negativa entre los coeficientes de adsorción (Kd) y el pH. Cuando solo se consideraron los suelos alcalinos, existió una relación positiva entre la adsorción y el contenido en fracción fina del suelo (limo/arcilla). También se concluyó que la adsorción del compuesto en suelos ácidos estuvo dominada por interacciones débiles, mientras en suelos alcalinos, en especial arcillosos, adquirieron importancia interacciones más fuertes con los constituyentes minerales de los mismos (filosilicatos y óxidos de Fe/Al). Figura 36: Coeficientes de adsorción (Kd) de escopoletina en 8 suelos agrícolas (S1-S8) con diferentes características fisicoquímicas. Los resultados de los experimentos de disipación de escopoletina reflejaron que su persistencia en los suelos fue escasa, con constantes de degradación que resultaron en tiempos de vida media (t1/2) inferiores a 4 días. Los valores de t1/2 en los suelos ácidos fueron ligeramente mayores que en los alcalinos (Fig. 37), lo cual se relacionó con la mayor adsorción de escopoletina observada en suelos con niveles de pH inferiores al pKa del compuesto. Asimismo, la degradación de escopoletina en los suelos transcurrió principalmente por vía microbiana, ya que tras la esterilización de los suelos el compuesto mostró un aumento de la III. Resumen de resultados y discusión 89 persistencia, alcanzando valores de t1/2, obtenidos por extrapolación, superiores a 29 días (Fig. 37). Los estudios de persistencia de escopoletina en un suelo alcalino bajo distintas condiciones de humedad, temperatura y concentración inicial de compuesto pusieron de manifiesto que su concentración inicial y su adición al suelo en condiciones moderadas de temperatura y humedad tuvieron poco impacto en su velocidad de degradación. Condiciones extremas de temperatura y sequedad, sin embargo, incrementaron notablemente la persistencia de escopoletina en el suelo. Figura 37: Curvas de disipación de escopoletina en un suelo ácido (S1) y un suelo alcalino (S7) esterilizados y sin esterilizar. Los bioensayos llevados a cabo en placas de Petri sin suelo revelaron que el principal efecto fitotóxico de escopoletina fue un efecto inhibitorio en el crecimiento radicular de las plantas ensayadas, Eruca vesicaria y Hordeum vulgaris, más acentuado en la planta dicotiledónea que en la monocotiledónea, similar a lo observado con herbicidas auxínicos (Graña et al., 2017). En macetas, la presencia de suelo tuvo un efecto muy pronunciado en la expresión de su fitotoxicidad, de manera que escopoletina sólo expresó su actividad fitotóxica en suelos ácidos, pero no en alcalinos (Fig. 38). Este hecho se explicó por la combinación de dos efectos. Por una parte, la mayor adsorción registrada en suelos ácidos protegió al compuesto de su biodegradación, alargando su persistencia. Por otra, al transcurrir la adsorción en suelos ácidos mediante interacciones débiles, estas favorecieron la desorción progresiva de escopoletina manteniendo concentraciones biodisponibles suficientes para ejercer su actividad biológica (Blum, 1998; Kaur et al., 2009). III. Resumen de resultados y discusión 90 Figura 38: Efecto de escopoletina aplicada a dosis de 6 y 12 kg/ha en el crecimiento de la raíz de Eruca vesicaria sembrada en macetas de un suelo ácido (S1) y un suelo alcalino (S7). En resumen, los resultados recopilados en el primer artículo de esta Tesis ilustran cómo la actividad de los compuestos alelopáticos puede verse determinada por su comportamiento en el suelo y resaltan la importancia de conocer en profundidad los procesos de transferencia y transformación que pueden sufrir en el mismo a la hora de comprender tanto su papel ecológico como su verdadero potencial como plaguicidas naturales. III.2. Uso de enmiendas orgánicas y materiales laminares como moduladores de la adsorción, persistencia y bioactividad de escopoletina en el suelo La adición de enmiendas, tanto orgánicas como inorgánicas, a los suelos agrícolas es una práctica que suele tener un gran impacto en la dinámica de los plaguicidas sintéticos (López-Piñeiro et al., 2013; Gámiz et al., 2016b). Sin embargo, se sabe muy poco acerca de cómo esta práctica puede afectar al comportamiento de los compuestos alelopáticos en el suelo y a la expresión de su actividad biológica. Sobre la base de los resultados obtenidos en el primer artículo, en la segunda publicación que compone esta Tesis Doctoral se partió de la hipótesis de que la adición de enmiendas orgánicas y complejos organoarcillosos podría alterar la escasa adsorción y persistencia que presentó la escopoletina en suelos alcalinos, modificando la limitada bioactividad que esta hidroxicumarina pareció mostrar en este tipo de III. Resumen de resultados y discusión 91 suelos. El objetivo fue, por tanto, comprobar si la adición de enmiendas orgánicas y organoarcillas pudiera dar lugar a cambios en la adsorción y persistencia del compuesto alelopático que favorecieran la expresión de su actividad fitotóxica en un suelo poco propicio para ello. Las enmiendas orgánicas seleccionadas para el estudio fueron un alperujo fresco (OMW), un alperujo compostado (OMWc) y biochar (BC) preparado a partir de este último. Las organoarcillas fueron una organomontmorillonita comercial (Cloi10) y una hidrotalcita modificada con aniones oleato preparada en el laboratorio (HT-OLE). Los resultados mostraron que las enmiendas aumentaron la adsorción de escopoletina en el suelo en consonancia con sus afinidades individuales por el compuesto, es decir, siguiendo el orden: Cloi10 >> OMW > BC > OMWc > HT-OLE. Para las enmiendas con mayor afinidad por escopoletina (Cloi10, OMW y BC), un estudio de isotermas confirmó que sus propiedades adsorbentes se mantenían en un amplio rango de concentraciones iniciales del compuesto alelopático y un estudio de desorción sugirió un mecanismo de retención a través de interacciones débiles. En el caso de las organoarcillas (Cloi10 y HT-OLE) y el biochar (BC), los coeficientes de adsorción experimentales (Kd-exp) para los suelos enmendados resultaron ser inferiores a los calculados (Kd-calc) a partir de los coeficientes de adsorción individuales de los componentes de la mezcla, mientras que en el caso del alperujo compostado (OMWc) y, sobre todo, del fresco (OMW) los coeficientes de adsorción experimentales fueron superiores a los calculados (Tabla III). Tabla III. Coeficientes de adsorción, Kd, experimentales y calculados para escopoletina en un suelo alcalino franco arcillo arenoso sin enmendar y enmendado con enmiendas orgánicas y organoarcillas. Kd-exp (L/kg) Kd-calc (L/kg) pH Suelo Suelo sin enmendar 0.38 ± 0.04 0.38 8.4 Suelo + Enmiendas orgánicas Suelo + OMW 4.14 ± 0.29 2.98 7.9 Suelo + OMWc 0.99 ± 0.04 0.88 8.3 Suelo + BC 1.54 ± 0.10 2.18 8.4 Suelo + Organoarcillas Suelo + HT-OLE < 0.15 0.88 9.1 Suelo + Cloi10 44.6 ± 6.6 > 385 8.4 III. Resumen de resultados y discusión 92 Estas desviaciones se atribuyeron a fenómenos de competencia entre los constituyentes solubles del suelo y la escopoletina por los sitios de adsorción en la superficie de las enmiendas Cloi10, HT-OLE y BC (Gámiz et al., 2010) y a un mecanismo por el cual la materia orgánica soluble del alperujo fresco (OMW) pudo proporcionar sitios de adsorción adicionales en la superficie de las partículas del suelo tras su adsorción a las mismas (Celis et al., 1998a; Cox et al., 2004b; Peña et al., 2015). Los resultados de los experimentos de disipación revelaron que la adición de las enmiendas aumentó significativamente la persistencia de escopoletina en el suelo, especialmente en el caso de Cloi10, OMW y BC (Fig. 39), lo que se atribuyó al hecho de que una mayor adsorción de escopoletina a los suelos enmendados la protegió de procesos biodegradativos (Gámiz et al., 2017a; Real et al., 2019). No obstante, medidas de la respiración del suelo sin tratar y tratado con las enmiendas reflejaron cambios tras la adición de las enmiendas. El resultado más remarcable fue el obtenido con OMW, que aumentó la respiración del suelo mucho más que las otras enmiendas e incrementó la persistencia de escopoletina en mayor medida que Cloi10 a pesar de presentar una afinidad por el compuesto diez veces menor que la organoarcilla. Se concluyó que una rápida mineralización de la materia orgánica lábil presente en OMW pudo contribuir a retrasar la degradación de escopoletina como consecuencia de una degradación preferencial de la materia orgánica de la enmienda por los microorganismos del suelo (Albarrán et al., 2003). Figura 39: Efecto de la adición de enmiendas orgánicas y organoarcillas en la disipación de escopoletina en un suelo alcalino franco arcillo arenoso. III. Resumen de resultados y discusión 93 Con el fin de establecer una relación entre los cambios en la adsorción y persistencia de escopoletina y su actividad fitotóxica, se realizaron bioensayos con la especie Lactuca sativa en suelo sin enmendar y enmendado con Cloi10, OMW y BC. En el caso del suelo enmendado con OMW y Cloi10, las enmiendas per se produjeron efectos inhibitorios que oscurecieron una posible fitotoxicidad de escopoletina en los suelos enmendados. Sin embargo, la aplicación de escopoletina a suelo tratado con BC reflejó un grado de fitotoxicidad de escopoletina que no se observó en suelo sin tratar y que ocurrió a pesar de que la aplicación de BC per se no mostró efectos negativos sobre los parámetros de crecimiento de la planta estudiados (Fig. 40). Figura 40: Efecto de la adición de biochar (BC) en la fitotoxicidad de escopoletina (12 kg/ha) en un suelo alcalino franco arcillo arenoso frente a Lactuca sativa L. En conclusión, los resultados de este artículo mostraron que el tratamiento de suelos con enmiendas adecuadas podría proporcionar un escenario que favoreciera la expresión de la actividad biológica de ciertos compuestos alelopáticos a través de su impacto en la adsorción y persistencia de los mismos. III.3. Gránulos de organoarcilla como adsorbente de escopoletina y su aplicación como soportes del compuesto alelopático para protegerlo de una rápida degradación en el suelo Los resultados que se incluyen en el tercer artículo que compone esta Tesis Doctoral completan los estudios realizados en la misma con la hidroxicumarina escopoletina. En los III. Resumen de resultados y discusión 94 trabajos anteriores encontramos que la expresión de la fitotoxicidad de escopoletina dependía del tipo de suelo y, específicamente, de cómo la adsorción y la persistencia afectaban a su biodisponibilidad. Asimismo, observamos que la arcilla organofílica comercial Cloisite 10A, empleada como enmienda, aumentaba la persistencia de escopoletina en suelos alcalinos al modificar su capacidad de adsorción. Partiendo de la base de que escopoletina presenta adsorción reversible en esta organoarcilla, en este trabajo postulamos que, mediante su adsorción a la misma, podría ser posible modular su biodisponibilidad y, por tanto, la expresión de su actividad biológica. No obstante, la aplicación directa al suelo de organoarcillas en forma de polvo presenta algunos inconvenientes que necesitan considerarse, como, por ejemplo, los riesgos de ingesta, inhalación y dispersión por fenómenos ambientales como el viento o la lluvia o su rápida pérdida de poder adsorbente una vez que alcanzan el suelo (Du et al., 2017; Gámiz et al., 2017a). En este contexto, uno de los objetivos planteados en el tercer artículo fue desarrollar un procedimiento de granulación que mejorara las propiedades físicas de la organoarcilla comercial Cloisite 10A y comparar las propiedades adsorbentes de los gránulos y el polvo de la misma para escopoletina y sus efectos en la degradación del compuesto en un suelo alcalino bajo condiciones controladas de laboratorio. El estudio se completó ensayando la persistencia y fitotoxicidad de una formulación consistente en gránulos de la organoarcilla con escopoletina previamente adsorbida en un escenario real en condiciones de campo. Los resultados mostraron que la adsorción de escopoletina en la organoarcilla en forma de polvo fue prácticamente instantánea, alcanzándose el máximo de adsorción (86%) a las 8 h de contacto entre el adsorbente y el adsorbato. Para la forma granulada, sin embargo, la cinética de adsorción fue más lenta; la cantidad de escopoletina adsorbida de forma inmediata por los gránulos fue insignificante y sólo después de 72 h la adsorción alcanzó valores similares a los observados para el polvo (Fig. 41). La cinética de adsorción a los gránulos se ajustó de forma satisfactoria a un modelo de difusión intraparticular (Weber & Morris, 1963; Schwaab et al., 2017), lo que sugirió que el principal efecto de la granulación de la organoarcilla fue reducir la accesibilidad de los sitios de adsorción. III. Resumen de resultados y discusión 95 Figura 41: Cinéticas de adsorción de escopoletina a la organoarcilla Cloisite 10A en forma de polvo y de gránulos. La adsorción de escopoletina observada en los gránulos y en el polvo se tradujo en un aumento de la persistencia del compuesto en el suelo tras tratar este con las diferentes formas de la organoarcilla, si bien el patrón de degradación fue distinto en función del tipo de tratamiento. La organoarcilla en polvo fue más efectiva que los gránulos a la hora de prolongar la persistencia de escopoletina a tiempos cortos de incubación (t ≤ 1 día), mientras que este efecto se revirtió para tiempos más prolongados (t ≥ 2 días). Por otra parte, los gránulos de organoarcilla con el compuesto preadsorbido incrementaron su vida media en el suelo de 0.34 a 14.4 días. Este fenómeno corroboró el mecanismo de adsorción propuesto y el efecto de la granulación de la organoarcilla en la adsorción y persistencia de escopoletina. Así, una mayor disponibilidad de los sitios de adsorción (externos) en el polvo de organoarcilla condujo a una rápida protección frente a la biodegradación, pero también a una elevada bioaccesibilidad de la fracción adsorbida para ser posteriormente degradada por los microorganismos del suelo. Por el contrario, la menor disponibilidad de los sitios de adsorción en los gránulos derivó en una adsorción más lenta y una menor protección a tiempos de incubación cortos, pero, una vez que escopoletina alcanzó los sitios de adsorción, quedó más protegida frente a los procesos biodegradativos. Bajo condiciones reales de campo, el comportamiento de escopoletina aplicada a un suelo alcalino en forma libre o preadsorbida en gránulos de organoarcilla fue similar al III. Resumen de resultados y discusión 96 observado en el laboratorio. La escopoletina libre se degradó rápidamente mientras que su aplicación en gránulos aumentó notablemente su persistencia en el suelo hasta incrementar su tiempo de vida media de 0.54 a 20.1 días (Fig. 42). Figura 42: Curva de disipación de escopoletina aplicada a parcelas de campo en forma libre y soportada en gránulos de la organoarcilla Cloisite 10A. Respecto a la bioactividad, la escopoletina formulada en los gránulos de organoarcilla mejoró la expresión de su fitotoxicidad y redujo tanto la germinación como la elongación de las raíces de Lactuca sativa L. en mayor grado que el compuesto libre. De los resultados de este trabajo concluimos que la interacción de escopoletina con gránulos de la organoarcilla Cloisite 10A protegió satisfactoriamente al compuesto de su rápida biodegradación en suelos alcalinos, tanto en condiciones de laboratorio como de campo. El uso de gránulos de organoarcilla podría ser, por tanto, una estrategia eficaz de formulación para mejorar el rendimiento de los compuestos alelopáticos como plaguicidas naturales a partir de un incremento de su persistencia. Optimizando ciertos parámetros, tales como su coste, su bioactividad hacia malas hierbas específicas o la cantidad necesaria tanto de compuesto como de organoarcilla a emplear, podrían estandarizarse formulaciones similares a la aquí preparada para implantarse como estrategia de aplicación de compuestos alelopáticos con características mejoradas respecto al producto libre. III. Resumen de resultados y discusión 97 III.4. Caracterización enantioselectiva de la adsorción, disipación y fitotoxicidad del monoterpeno pulegona en suelos agrícolas Los monoterpenos constituyen una importante familia de compuestos alelopáticos que destacan por encontrarse entre los principales componentes de los aceites esenciales de las plantas aromáticas (Chaimovitsh et al., 2017). Se trata de compuestos orgánicos con 10 átomos de carbono derivados de la unión de dos unidades de isopreno, volátiles y para los que se han descrito una gran variedad de actividades biológicas, entre las que cabe destacar un marcado carácter fitotóxico frente a diferentes especies de plantas (Vaughn & Spencer, 1993; Vokou et al., 2003). Se ha comprobado que los monoterpenos que contienen oxígeno en su estructura presentan una mayor solubilidad en agua y un mayor carácter fitotóxico que los monoterpenos hidrocarbonados (Chaimovitsh et al., 2017). Sin embargo, al igual que en el caso de las cumarinas, se sabe muy poco acerca de cómo los diferentes procesos de transporte y degradación pueden afectar al comportamiento y a la actividad fitotóxica de los monoterpenos en el suelo. Además, el hecho de que muchos monoterpenos presenten centros quirales en su estructura añade complejidad al estudio de su dinámica en el medio ambiente debido a que los procesos a los que se ven sometidos pueden ser enantioselectivos, siendo este un aspecto que ha recibido muy poca atención en la bibliografía. El objetivo planteado en el cuarto artículo que compone esta Tesis Doctoral fue el de caracterizar los procesos de adsorción y disipación de los dos enantiómeros del monoterpeno oxigenado pulegona (Fig. 43) en diferentes suelos, así como comparar su fitotoxicidad hacia tres especies de plantas (Lactuca sativa, Hordeum vulgare y Eruca sativa) a través de bioensayos realizados en ausencia y en presencia de suelo. En los bioensayos con suelo, se abordó si la adición de una organo-hidrotalcita como material adsorbente pudiera llevar a una estabilización del compuesto que ayudara a potenciar su bioactividad. Figura 43: Estructura de los dos enantiómeros del monoterpeno pulegona. IV. 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