Análisis de la diversidad genética de poblaciones naturales de especies vegetales amenazadas (Silene nocteolens (Caryophyllaceae) y Sorbus aria (Rosaceae)

2 enero-junio 2011 Análisis de la diversidad genética de poblaciones naturales de especies vegetales amenazadas: Silene nocteolens (Caryophyllaceae) y Sorbus aria (Rosaceae) Edna Amada González González, Pedro A. Sosa y Miguel Ángel González-Pérez Introducción Por su gran riqueza biológica, el Archipiélago Canario ha sido integrado a uno de los 25 puntos calientes de biodiversidad mundial. Solo en lo referente a plantas, las Islas Canarias (que representan el 1,5% del te - rrito rio español) albergan más de la mi tad de la flora endémica del estado español y esto ha despertado gran interés en la comunidad científica que ya considera a las Islas Canarias co mo auténticos laboratorios naturales pa ra el estudio de la evolución. No obstante, la biodiversidad no está exenta de riesgos o amenazas; porlo cual es inminente actuar an tes de que la erosión genética nos impida conservar este legado natural (Sosa, 2001). El estado de alta vulnerabilidad de las poblaciones de muchos de los en - demismos canarios no se debe solamente al impacto antropogénico sino que también es consecuencia de la propia dinámica de las po - blaciones con un reducido número de individuos (Fernández-Palacios y Martín Esquivel, 2001). Los fenómenos de aislamiento y consanguinidad en estas poblaciones pueden ser muy acusados, siendo imprescindible redoblar los esfuerzos para evitar que la pérdida de diversidad en estos endemismos se torne irreversible, exhiban procesos de regresión por inestabilidad genética y/o demográfica y se generen extinciones locales de sus poblaciones (Sosa et al., 2002; Oostermeijer et al., 2003). Uno de los instrumentos más innovadores utilizados en la conservación genética de las poblaciones naturales son los marcadores moLa riqueza genética que nos ofrecen las poblaciones naturales de la flora en Canarias puede estar bajo riesgo. Con esto en mente, se desarrollaron marcadores moleculares (SSR) específicos para el análisis genético de Silene nocteolens , una planta herbácea que solo crece en el Teide; y Sorbus aria, 50 árboles que en Canarias están restringidos a Tenerife y La Palma. En S. nocteolens se encontró una gran variabilidad genética, poca diferenciación genética entre sus dos poblaciones y un bajo porcentaje autofecundación. En S. aria se reporta un carácter triploide, menor variabilidad genética en las muestras canarias que en las peninsulares y una diferenciación genética considerablemente alta. Genetic richness that natural populations of flora offer us on Canary Islands may be at risk. With this in mind, we developed specific molecular markers (SSR) to analyze genetically two plant species: Silene nocteolens, a herbaceous plant that only grows in Teide mountain (Tenerife Island); and Sorbus aria, 50 trees which on the Canaries are restricted to Tenerife and La Palma Islands. In S. nocteolens we found a high genetic variability, low genetic differentiation between the only two natural populations and low selfing percentage. In S. aria we can report triploid character, lower genetic variability in the Canary samples than in samples from Iberian Peninsula and higher genetic differentiation. Artículo patrocinado por Nogal Metal y Vidrieras Canarias Que las Islas Canarias atesoran una gran diversidad biológica a nivel de especies es un hecho ampliamente conocido, pero… ¿cuánto sabemos de la diversidad genética en esas especies? falta logo leculares. Estos marcadores son capaces de medir la diversidad genética en una amplia variedad de es - pecies. Algunos marcadores, como los microsatélites, pueden detectar muchas variaciones en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una población (es decir, son polimórficos). Además, son codominantes; esto es, re - velan el genotipo completo de los individuos (rasgos dominantes y recesivos), sin los encubrimientos típicos de las características recesivas a causa de las dominantes (Akkak et al., 2009). Silene nocteolens es una planta herbácea, endémica del Teide (Tenerife) de la que hasta el momento se conocen sólo dos poblaciones se - paradas por aproximadamente seis kilómetros (Fig. 1), mientras que Sorbus aria es una especie arbórea distribuida en casi toda Europa y parte de Asia que en Canarias solamente se ha reportado para La Palma (Fig. 2) y Tenerife (Fig. 3) ya que crece a determinada altura; además, sus individuos son muy pocos y se encuentran bastante separados entre artículos de investigación 3 Localidades Naturales Pico Viejo Montaña Blanca P.N. El Teide Figura 1. Distribución de Silene nocteolens en el Parque Nacional del Teide Fuente: P.N. Teide sí, lo que dificulta su reproducción cruzada. En esta investigación el objetivo principal fue cuantificar la variabilidad genética (diversidad) existen - te en las poblaciones naturales de S. nocteolens y S. aria del archipiélago canario, determinar cuán parecidas son las poblaciones de ca da especie entre sí (diferenciación genética) y averiguar la organización espacial de sus genotipos (estructuración genética). Así, esperamos contribuir a la Biología de la Conservación de estas especies vegetales canarias a través del establecimiento de programas de conservación genética. Materiales y métodos Recolección de muestras Se tomaron unas cuantas hojas de cada planta y se almacenaron en bolsas de cierre hermético con gel de sílice para deshidratarlas y conservarlas hasta la extracción de su ADN. En el caso de Silene nocteolens se contó con muestras de 471 individuos procedentes tanto de las dos poblaciones naturales existentes (Montaña Blanca y Pico Viejo) como de plántulas germinadas (201 descendientes) de semillas recolectadas a partir 14 plantas madres (12 de Montaña Blanca y 2 de Pico Viejo) (Tabla 1, Fig. 4). Para Sorbus aria se analizaron 195 muestras. De La Palma se han regis - trado 46 ejemplares de cinco localidades separadas geográficamente. 4 enero-junio 2011 Parcela Grande Espigón del Norte El Espigón  P.N. Caldera de Taburiente Localidades Naturales Curva del Observatorio Los Andenes Espigón de Roque Figura 2. Ubicación de Sorbus aria en el Parque Nacional de la Caldera de Taburiente Las 4 muestras de Tenerife provienen de las dos únicas localidades descritas en esta isla (Guajara y Los Cachorros). Finalmente, dispusimos de muestras recogidas en los Parques Nacionales de Cabañeros, Aigüestortes, Picos de Europa y Sierra Nevada (Tabla 2). Análisis genético Los microsatélites (SSR), la base de este estudio, son marcadores hipervariables con alta reproducibilidad; pero con la desventaja de que deben ser caracterizados para cada taxón específico, lo que encarece el proceso. Una vez obtenido el ADN de cada planta y seleccionados los cebadores más eficientes, se procedió a la multiplicación del ADN (amplificaciones) a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las condiciones generales de amplificación fueron: 3 min de desnaturalización a 94 °C; 30-35 ciclos de 45 s de desnaturalización a 94 °C, 45 s de hibridación a la temperatura ( Tm ) correspondiente y 45 s de elongación a 72 °C; seguidos de 5 a 30 min de elongación a 72 °C. Procesamiento de datos Los productos de la amplificación del ADN fueron analizados usando un Secuenciador Genético ABI 3130XL y el genotipado fue determinado uti lizando los programas GENSCAN 2.02 y GENOTYPER 1.1 (Applied Biosystems, Inc.). Los datos obtenidos artículos de investigación 5 Localidades Naturales Los Cachorros Guajara  P.N. El Teide Figura 3. Ubicación de Sorbus aria en el Parque Nacional del Teide para cada individuo y locus amplificado se incluyeron en una matriz de doble en trada (individuo/locus) para posteriormente introducirse en el progra ma TRANSFORMER 3B.01 (Cauja pé-Castells y Baccari-Rosas, 2005) que permite exportar los da - tos a otros programas de análisis genético. Es importante destacar que, debido a su carácter triploide, en el caso de Sorbus aria hemos medido la diversidad en términos del número to tal de fenotipos alélicos en las poblaciones. Como consecuencia, algunos de los análisis necesitaron la utilización de un programa distinto para cada especie. La Tabla 3 detalla los recursos informáticos utiliza - dos en la caracterización genética de las especies estudiadas. Resultados Hemos desarrollado cebadores específicos para ambos taxones en es tudio y tras numerosas pruebas se han definido aquellos microsatélites funcionales, optimizando las condiciones para su uso en cada es - pecie, publicándose en la revista in - ternacional Conservation Genetics Re sources (González-González et al., 2010). Silene Nocteolens En general, la especie mostró un alto grado de diversidad genética ( A = 15,83 y He = 0,707). Los valores de la población de Pico Viejo fueron superiores a la detectados en Montaña Blanca tanto en riqueza alélica (A) como en heterocigosidad esperada ( He ), pero el polimorfismo ( P ) fue del 100% en todos los casos (Tabla 1). El dendrogra ma UPGMA (Fig. 5) que muestra la separación de las poblaciones de S. nocteolens con un 97% de fortaleza. En Montaña Blanca los reproductores jóvenes se separan del resto de los estadios (con 57% de fortaleza), mientras que en Pico Viejo son los juveniles y virgina - 6 enero-junio 2011 CÓDIGO Nº AH OHeP FIS Me MB-PL 159 0,557 0,654 100% 0,185 0,503 MB-JU 26 7,00 0,546 0,667 100% 0,200 0,313 MB-VI 24 7,50 0,574 0,686 100% 0,160 0,308 MB-VE 26 7,33 0,616 0,701 100% 0,098 0,237 MB-RJ 26 6,33 0,615 0,667 100% 0,100 0,129 MB-RA 37 6,17 0,631 0,698 100% 0,075 0,129 293 9,50 0,578 0,683 100% PV-PL 42 0,421 0,581 100% 0,455 PV-JU 26 9,50 0,681 0,782 100% 0,121 PV-VI 30 10,67 0,724 0,771 100% 0,063 PV-VE 23 8,33 0,636 0,756 100% 0,178 PV-RJ 25 9,50 0,693 0,768 100% 0,103 PV-RA 27 9,83 0,656 0,756 100% 0,152 173 13,67 0,649 0,773 100% 471 15,83 0,612 0,707 100% Tabla 1. Número de individuos y parámetros genéticos y reproductivos de Silene nocteolens por estadio y población “Nº” es el número de individuos analizados por estadio o población. Número medio de alelos por locus (A), Heterocigocidad observada ( H o ), Heterocigocidad esperada ( H e ), Porcentaje de loci polimórficos ( P ), Coeficiente de endogamia [ F IS = 1 - ( H o estadio/H e total )] e Índice de mortalidad por estadio de vida ( M e ). POBLACIÓN Montaña Blanca Total MB Pico Viejo Total PV TOTAL ESTADIO Plántulas Juveniles Virginales Vegetativos Reproductores Jóvenes Reproductores Adultos Plántulas Juveniles Virginales Vegetativos Reproductores Jóvenes Reproductores Adultos les quienes se dis gregan del res to de los individuos y con mayor fuer - za (72%). En términos generales, la diferenciación genética obtenida mediante el coe ficiente de F ST entre las poblaciones de Silene nocteolens fue bas - tante baja (0,053). Valores de FST por debajo de 0,15 re presentan una esca sa diferenciación genética; entre 0,15 y 0,25 indican que las poblaciones se encuentran considera ble - men te diferenciadas y si las ci frasson superiores a 0,25 se consi de ran poblaciones fuertemente diferenciadas genéticamente (Sosa et al., 2002). Los datos obtenidos os ci laron entre 0,006 y 0,080 (Tabla 4) y los valores medios confieren a Montaña Blan - ca un coeficiente de diferenciación algo mayor ( _ F ST = 0,017) que el encontra do en Pico Viejo ( _ F ST = 0,009). Por su parte, el flujo genético general entre las poblaciones fue de artículos de investigación 7 CÓDIGO LUGAR Nº NF H P GYCT Tenerife 4 1 0,004 0,72% COBP La Palma 3 2 0,004 1,45% EYMP La Palma 6 10 0,024 7,25% PAGP La Palma 5 5 0,015 3,62% LANP La Palma 29 15 0,039 10,87% EPNP La Palma 3 0 0,000 0,00% 50 28 0,056 20,29% PNCA Península 6 6 0,014 4,35% PNAI Península 36 83 0,093 60,14% PNPE Península 51 97 0,097 70,29% PNSN Península 52 63 0,119 45,65% 145 131 0,127 94,93% 198 138 0,149 100,00% Tabla 2. Número de muestras y parámetros genéticos de Sorbus aria por localidad “Nº” es el número de individuos analizados por estadio o población. Número de fragmentos polimórficos ( NF ), Diversidad genética ( H ), Porcentaje de loci polimórficos (P) LOCALIDAD Guajara y Los Cachorros Curva del Observatorio El Espigón y Espigón del Roque de Los Muchachos La Parcela Grande Los Andenes El Espigón del Norte Canarias Parque Nacional Cabañeros Parque Nacional Aigüestortes Parque Nacional Picos de Europa Parque Nacional Sierra Nevada Península TOTAL Figura 4. Germinación de semillas de Silene nocteolens en invernadero procedentes de Pico Viejo (izquierda) y Montaña Blanca (derecha) Nm = 4,486 y varió de 2,877 entre los vegetativos de Pico Viejo y los reproductores jóvenes de Montaña Blanca (PV-Ve/MB-Rj) a 41,105 entre los virginales y juveniles de Pico Viejo (PV-Vi/PV-Ju). Puesto que to dos los valores son mayores que uno, se deduce que existe un gran flujo genético entre ambas poblaciones. Un análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en los valores de F ST muestra de manera gráfica (Fig. 6) que a pesar de la poca di ferenciación genética detectada, se trata de dos poblaciones distintas. Las coordenadas explican el 84,77% de la varianza. Mediante el análisis bayesiano (que incluyó 256 individuos, 6 loci y 2 poblaciones) se pudieron asignar losindividuos a cada una de las dos po blaciones, o lo que es lo mismo, las dos poblaciones de Silene nocteolens están claramente definidas (Fig. 7) desde el punto de vista genético. El coeficiente de endogamia ( F IS ) mide la magnitud de la homocigosis en relación con la expectativa al asumir el apareamiento al azar dentro de una población. Para todos los estadios de vida y en ambas poblaciones los valores de F IS fueron positivos, lo que implica que existe un defecto de heterocigóticos (o sea, un exceso de homocigóticos) en cada uno de ellos (Tabla 1). Hemos notado cierto grado de relación entre estos 8 enero-junio 2011 MB-Rj MB-Ju MB-Ra MB-Vi MB-Ve Montaña Blanca PV-Ju PV-Vi PV-Ve PV-Rj PV-Ra Pico Viejo 55 64 34 57 72 27 15 47 0.000.050.100.15 97 Figura 5. Dendrograma UPGMA basado en las distancias genéticas de Nei (1972) entre los estadios de vida y poblaciones de Silene nocteolens Tabla 3. Programas informáticos utilizados en la caracterización genética de las poblaciones naturales estudiadas ANÁLISIS PROGRAMA INFORMÁTICO REFERENCIA PÁGINA WEB Genotipado GenScan 2.02 y GenoTyper 1.1 Applied Biosystems, Inc. - Transformación de datos Transformer 3b.01 Caujapé-Castells y • http://www.demiurge-project.org Baccari-Rosas, 2005 Índices de variabilidad, PopGene 3.2 Yeh et al., 1997 • http://www.ualberta.ca/~fyeh/ Identidades genéticas y Distancias genéticas UPGMA y NJ Populations 1.2.30Beta Langella, 2005 • http://bioinformatics.org/~tryphon/populations/ PopTree 2 Takezaki et al., 2010 • http://homes.bio.psu.edu/people/faculty/nei/software.htm Rapdplot 3.0 Black, 1995 • http://www.biosci.ohio-state.edu/~awolfe/ISSR/data.2.html Philip 3.5C Felsenstein, 1993 • http://www.be.embnet.org/phyliphelp/phylip.html Mega 4 Kumar et al., 2001 • http://www.megasoftware.net/ Bayesiano Structure 2.2 Falush et al., 2007 • http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html Hardy-Weingberg GenePop V4 Rousset, 2008 • http://kimura.univ-montp2.fr/~rousset/Genepop.htm Arlequin 3.11 Excoffier et al., 2005 • http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin35/Arlequin35Updates.html PCoA y Coeficientes GeneAlEx 6.4 Peakall y Smouse, 2006 • http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/genalex_download.php de diferenciación Arlequin 3.11 Excoffier et al., 2005 • http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin35/Arlequin35Updates.html Correlación y regresión PAWS Statistics 18 IBM Company, Chicago, IL - Test de alelos nulos Micro-Checker Oosterhout et al., 2004 • http://www.microchecker.hull.ac.uk/ Sistema de cruzamiento MLTR Ritland, 2002 • http://genetics.forestry.ubc.ca/ritland/programs.html Secuenciación BioEdit 5.0.6 Hall, 2001 • http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html resultados y los índices de mortalidad registrados para esta especie ya que al cruzar los valores de endogamia con la tasa de mortalidad de las poblaciones (Fig. 8) observamos resultados significativos entre estas variables para Montaña Blanca ( R 2= 0,6721; P = 0,04); pero no significativos para Pico Viejo ( R 2= 0,5289; P = 0,09). Finalmente, los parámetros del sistema de cruzamiento revelaron una proporción de autofecundación de 29,7% ( tm = 0,703) y una paternidad efectiva (1/ rp ) de 6,329 en el caso de Montaña Blanca; esto último sugiere que para cada planta madre de esta población existen aproximadamente 6 padres distintos que logran una fecundación efectiva. En Pico Viejo los resultados fueron algo mayores (34,7%; tm = 0,653 y 1/ rp = 7,692). artículos de investigación 9 PV-RA PV-VE PV-VI PV-JU PV-RJ MB-RJ MB-VI MB-RA MB-JU MB-VE 1ª Coordenada (75,89%) 2ª Coordenada (8,88%) Figura 6. Análisis de Coordenadas Principales basado en los valores de FST para las poblaciones naturales de Silene nocteolens Figura 7. Diagrama de barras para los agrupamientos inferidos (K = 2) con el análisis bayesiano para Silene nocteolens 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Montaña Blanca Pico Viejo Sorbus aria Los valores de diversidad genética estimados para las muestras de Sorbus aria de Canarias revelan una baja variabilidad genética (Tabla 2). Los resultados muestran casi cinco veces más fragmentos polimórficos ( NF ) en la Península que los encontrados para las ejemplares canarios. También son mayores los valores para heterocigosidad ( H ) y el porcentaje de loci polimórificos ( P ). La variabilidad genética detectada en las poblaciones de la Península están significativamente relaciona - das con el tamaño de la muestra ( R 2= 0,93). El dendrograma UPGMA basado en las frecuencias genéticas entre poblaciones (Fig. 9) muestra una clara disgregación de las muestras de Sorbus aria procedentes del archipiélago canario con respecto a los ejemplares de la Península. Con excepción de la separación entre los parques nacionales de Sierra Neva - da y Picos de Europa que presentan una fortaleza del 74%, todas las poblaciones manifiestan una defi10 enero-junio 2011 Tabla 4. Coeficiente de diferenciación genética ( F ST ) y flujo genético ( N m ) para las poblaciones de Silene nocteolens . En rojo los menores valores y en amarillo los valores más altos MB-JU MB-VI MB-VE MB-RJ MBRA PV-JU PV-VI PV-VE PV-RJ PV-RA MB-JU 11,842 14,925 8,490 18,301 3,587 3,427 2,997 4,004 3,448 MB-VI 0,021 30,601 11,588 15,982 4,013 3,685 3,356 4,396 3,857 MB-VE 0,016 0,008 15,009 21,477 4,026 3,876 3,485 4,745 4,360 MB-RJ 0,029 0,021 0,016 13,339 3,172 3,013 2,877 3,575 3,575 MBRA 0,013 0,015 0,012 0,018 4,079 3,710 3,368 4,327 3,816 PV-JU 0,065 0,059 0,058 0,073 0,058 41,105 24,186 28,184 21,437 PV-VI 0,068 0,064 0,061 0,077 0,063 0,006 26,071 28,615 26,625 PV-VE 0,077 0,069 0,067 0,080 0,069 0,010 0,009 26,447 26,104 PV-RJ 0,059 0,054 0,050 0,065 0,055 0,009 0,009 0,009 28,212 PV-RA 0,068 0,061 0,054 0,065 0,061 0,012 0,009 0,009 0,009 Flujo genético (arriba) y coeficiente de diferenciación genética (abajo) Figura 8. Correlación entre la tasa de mortalidad y el coeficiente de endogamia (homocigosis) en Silene nocteolens Montaña Blanca 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Mortalidad por estadio de vida y = 2,2173x -0,0328 R² = 0,6721 Fis Pico VIejo 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,00 0,10 0,20 0,35 0,40 0,55 Mortalidad por estadio de vida y = 0,7227x + 0,1405 R² = 0,5289 Fis