Biología de la conservación de endemismos vegetales de los parques nacionales canarios

BIOLOGÍA DE LA CONSERVACIÓN DE ENDEMISMOS VEGETALES DE LOS PARQUES NACIONALES CANARIOS: CARACTERIZACIÓN GENÉTICA Y DEMOGRÁFICA PEDRO A. SOSA1, MIGUEL A. GONZÁLEZ PÉREZ1, EDNA A. GONZÁLEZ-GONZÁLEZ1, ELISABET RIVERO-SANTANA1, AGUSTÍN NARANJO-CIGALA2, GERARD OOSTERMEIJER3, JOSÉ J. PESTANO-BRITO4 YTHOMAS VAN HENGSTUM3 RESUMEN El presente proyecto se centra en aplicar técnicas de biología molecular, demográficas y de biología reproductiva en cuatro endemismos canarios amenazados que se encuentran total o parcialmente localizados en los parques nacionales de Canarias: Silene nocteolens Webb & Berthel. (Parque Nacional del Teide, Tenerife); Ilex perado ssp. lopezlilloi (G. Kunkel) A. Hansen & Sunding (Parque Nacional Garajonay, La Gomera), Sorbus aria (L.) Crantz (Parque Nacional de la Caldera de Taburiente, La Palma) y Bencomia exstipulata Svent. (parques nacionales del Teide y Caldera de Taburiente). Se estableció un estudio genético a través de marcadores moleculares hipervariables, microsatélites, y se determinó para cada taxón la variación genética de sus poblaciones, para su posterior aplicación en la gestión en el ámbito de la Biología de la conservación de estos taxones. En Ilex perado ssp. lopezlilloi se pudo comprobar que comparte el mismo acervo genético que I. perado ssp. platyphylla, mientras que I. canariensis e I. azorica se diferencian considerablemente. Para Sorbus aria, el análisis de los nueve microsatélites polimórficos caracterizados para la especie detectó una baja variación genética en las poblaciones Canarias. Por otro lado, se observó una diferenciación genética entre las muestras de La Palma y Tenerife, así como entre estas y las poblaciones de la Península. Entre las poblaciones de la Península destaca la alta diversidad genética del Parque Nacional de Sierra Nevada. Así mismo, cabe reseñar el carácter triploide detectado en los ejemplares de Canarias, así como de muchas de las muestras de la Península. Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 225 1Departamento de Biología, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Campus Universitario de Tafira, 35017, Las Palmas de Gran Canaria. Islas Canarias, España. [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] 2Departamento de Geografía. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, C/Pérez del Toro, 1 (35017), Las Palmas de Gran Canaria. Islas Canarias, España. [email protected] 3Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics (IBED) University of Amsterdam Postal address: P.O. Box 94062, 1090 GB Amsterdam, Holanda. [email protected] [email protected] 4Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Fisiología. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Campus Universitario de San Cristobal. Avda. Marítima Sur, s/n, 35016, Las Palmas de Gran Canaria. Islas Canarias, España. [email protected] SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 226 Los cinco microsatélites aislados y caracterizados para Silene nocteolens permitieron determinar los niveles de diversidad y diferenciación genética existente entre las dos únicas poblaciones naturales de la especie. Igualmente, estos marcadores moleculares revelaron la existencia de un alto grado de endogamia, sobre todo en los primeros estadios vitales, fruto de la posible autofecundación. Así mismo, se observó que el coeficiente de endogamia disminuye a lo largo de los distintos estadios vitales de la especie y que está proporcionalmente relacionado con la tasa de mortalidad registrada. Los experimentos de biología reproductiva en Bencomia exstipulata determinaron que el viento es el principal dispersor del polen de la especie. En general se discuten los resultados en el marco de la biología reproductiva para determinar un plan de actuación y manejo consensuado y coordinado bajo criterios científicos dentro del contexto de la biología de la conservación. Palabras clave: Biología de la Conservación; Demografía Vegetal; Diversidad Genética; parques nacionales de Canarias; Plan de Recuperación. SUMMARY The present project proposes apply and coordinate techniques of Molecular Biology, Demography and Reproductive Biology on four vegetal threatened species from the Canary Islands: Silene nocteolens Webb & Berthel. (Teide National Park, Tenerife); Ilex perado ssp. lopezlilloi (G. Kunkel) A. Hansen & Sunding (Garajonay National Park, Gomera), Sorbus aria (L.) Crantz (Caldera de Taburiente National Park, La Palma) and Bencomia exstipulata Svent. (Teide and Caldera de Taburiente National Parks). A genetic study was carried out using a highly polymorphic molecular marker, microsatellite, genetic variation of each population was determinate, in order to apply it in the management strategies within the Conservation Biology context. Ilex perado ssp. lopezlilloi and I. perado ssp. platyphylla shared the same genetic pool; whereas I. canariensis and I. azorica have strong genetic differentiation. Genetic analysis of the nine polymorphic microsatellite loci characterized in Sorbus aria showed a low genetic variation in the populations from the Canary Islands. On the other hand, there were genetic differentiations among La Palma and Tenerife populations, as well as, among these and those populations from the Peninsula. In regard to peninsula populations, a high genetic diversity was detected in the Sierra Nevada National Park. Also, a triploid pattern was recorded in the samples from the canaries, as well as, many individuals from the Peninsula. Genetic diversity and differentiation in the two natural populations of Silene nocteolens were estimated using the five microsatellites loci isolated and characterized for the species. Equally, these molecular markers showed a high inbreeding degree, mainly in the first stages, due to selfing. Also, we observed that inbreeding coefficient decreases along the different vital stages of the species, and possibly is related with the mortality rate recorded. Reproductive Biology analysis in Bencomia exstipulata showed that the wind is the principal pollen disperser. Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 227 INTRODUCCIÓN Es un hecho ampliamente reconocido que las islas oceánicas, como el archipiélago canario, son extensiones territoriales que atesoran una gran diversidad biológica; muchas veces exclusiva de cada isla en particular. Esa amplia diferenciación biológica no evita que las poblaciones de especies singulares y el número de individuos en cada población sean reducidos, razón por la cual se encuentran con algún grado de amenaza y es inminente actuar antes de que la erosión genética impida conservar su riqueza alélica (FERNÁNDEZ-PALACIOS & MARTÍN ESQUIVEL 2001, FRANCISCOORTEGA & SANTOS 2001, SOSA et al. 2002, BATISTA et al. 2004, GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009a, GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009b). En este sentido, en el Catálogo de Especies Amenazadas de Canarias (CEAC 2000) del Gobierno de Canarias se han inscrito 262 taxones vegetales, de los que 74 se han catalogado en su máxima condición de amenaza (peligro de extinción). En estas circunstancias, el estado de alta vulnerabilidad de las poblaciones de buena parte de estos endemismos canarios, no sólo es debido al impacto antrópico, sino también consecuencia de la propia dinámica de las poblaciones con un reducido número de individuos. En ellas, los fenómenos de aislamiento y consanguinidad son muy acusados, siendo por tanto imprescindible redoblar los esfuerzos y desarrollar programas y proyectos de conservación que eviten que la erosión genética en estos endemismos se torne irreversible, exhiban procesos de regresión por inestabilidad genética y/o demográfica, dando lugar de esta manera a la extinción local de sus poblaciones (SILVERTOWN & CHARLESWORTH 2001, FRANKHAM et al. 2002, SOSA et al. 2002, OOSTERMEIJER et al. 2003). En un proyecto de conservación es necesario por un lado averiguar el grado y el nivel de la variación genética de las especies, al mismo tiempo que determinar como esa diversidad se distribuye y se estructura en el espacio y en el tiempo. También es fundamental precisar las causas reales y potenciales que originan (o han originado) esos niveles y estructuración genética en las poblaciones estableciendo las medidas y pautas necesarias para maximizar el mantenimiento de dicha diversidad genética en las poblaciones naturales, y minimizar las razones que originan su disminución (SOSA 2001, SOSA et al. 2002). Examinar pues, la diversidad genética de las poblaciones naturales e identificar y ordenar las fuerzas y factores evolutivos responsables que expliquen la arquitectura genética de las mismas (selección natural, mutación, deriva y flujo genético) constituye un aspecto fundamental en la conservación biológica. Cualquier cambio en la distribución de la diversidad genética puede destruir adaptaciones locales o romper complejos y asociaciones genéticas coadaptadas (SILVERSTOWN & CHARLESWORTH 2001, SOSA 2001, SOSA et al. 2002). Uno de los más recientes instrumentos utilizados en la conservación genética de las poblaciones naturales son los marcadores moleculares, que nos permiten medir la diversidad genética en una amplia variedad de especies mostrando en ocasiones altos niveles de polimorfismo y numerosos alelos por locus, como es el caso de los microsatélites. Además, el carácter codominante de los microsatélites desvela el genotipo completo de los individuos, sin encubrimientos a causa de características dominantes (GOLDSTEIN & SCHOLÖTTERER 1999, FRANKHAM et al. 2002). Son muchos los estudios que aplican esta técnica en especies amenazadas y, de ellos, gran cantidad se centra en el descubrimiento y comparación de In general, results are discussed within the reproductive biology context, in order to suggest management strategies. Key words: Conservation Biology, plant demography, genetic diversity, Canary Islands National Parks, reinforcing strategies. SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 228 genotipos de especies vegetales. En las islas Canarias esta metodología se ha implementado para la caracterización genética de especies amenazadas como Bencomia exstipulata (GONZÁLEZPÉREZ et al. 2004a, GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009a), Myrica rivas-martinezii (GONZÁLEZPÉREZ et al. 2008) y Sambucus palmensis (SOSA et al. sometido) entre otras. Por otro lado, la determinación de los aspectos reproductivos y demográficos constituyen los dos pilares complementarios a la caracterización genética, mediante los cuales nos permitirán disponer de un método científico que contribuya a la conservación biológica de las especies amenazadas. Taxones estudiados: Ilex perado ssp. lopezlilloii (G. Kunkel) A. Hansen & Sunding (Aquifoliaceae). Ilex perado ssp. lopezlilloii es un endemismo exclusivo de La Gomera donde se localizan escasos individuos en el interior del Parque Nacional de Garajonay (BAÑARES et al. 2003, 2004). Además, y también en la Gomera, existe una segunda localidad (de 16 ejemplares), fruto de las actuaciones de recuperación del taxón que se han desarrollado en el Parque Nacional, y que procede de individuos obtenidos mediante propagación asexual (BAÑARES et al. 2003, 2004). Las causas de la escasez de este taxón podrían relacionarse con su aprovechamiento maderero y su interés forrajero en el pasado. Así mismo, el carácter dioico y la existencia de solo tres pies femeninos en condiciones naturales suponen una barrera en principio, insalvable para la reproducción sexual, de tal forma que las múltiples colectas de frutos realizadas muestran una inexistencia de embriones. No obstante, los ensayos de propagación de estaquillas exhiben mejores resultados, sobre todo cuando han sido realizados sin tratamiento previo hormonal (50% de éxito). El taxón se encuentra clasificado como “En Peligro de Extinción” en el Catálogo de Especies Amenazadas de Canarias (CEAC 2000), en el Libro Rojo de la Flora Vascular Amenazada de España (BAÑARES et al. 2004), y se propone su inclusión en la Directiva de Hábitats como especie prioritaria (VVAA 2000, BAÑARES et al. 2004). Sorbus aria (L) Crantz (Rosaceae) El peralillo de cumbre se distribuye en Canarias exclusivamente en las islas de Tenerife y La Palma debido a que está presente en zonas de alta montaña. Su distribución es amplia en la Península Ibérica y norte de África, con citas en todos los macizos montañosos. Crece casi siempre en forma de individuos aislados, con pies separados entre sí grandes distancias y más raramente en rodales de unos pocos individuos. En Canarias se ha descrito un escaso número de ejemplares, contabilizándose unos 50 individuos en La Palma muy aislados y ocupando un área considerablemente amplia, dentro y cerca de los límites del Parque Nacional (MMA 2003); mientras que en Tenerife, entorno a menos de 10 ejemplares se localizan exclusivamente en el interior del Parque Nacional del Teide, estando también sus individuos considerablemente aislados. Por ello, la especie se encuentra catalogada en el Catálogo de Especies Amenazadas de Canarias (CEAC 2000) como “De Interés Especial”. Desde un punto de vista reproductivo florece en el mes de mayo y sus flores son polinizadas por insectos, sobre todo por abejas y dípteros, aunque posiblemente una parte importante de la producción de frutos se lleve a cabo por apomixis y partenocarpia a partir de primordios seminales sin fertilizar. La dispersión de semillas es llevada a cabo por aves frugívoras, siendo la tasa de germinación en condiciones experimentales muy baja, no superando el 15% (CABEZUDO et al. 2000, BAÑARES et al. 2004). La especie se encuentra incluida en el Plan de Conservación del Hábitat de Cumbre del Parque Nacional de la Caldera de Taburiente y se considera de gran interés establecer un estudio genético que permita comparar sus poblaciones con las del Teide (MMA 2003). Silene nocteolens Webb & Berthel. (Caryophyllaceae) La conejera de risco es un endemismo de la isla de Tenerife. Crece exclusivamente en el Parque Nacional del Teide donde se presenta solamente en dos localidades en sectores de alta montaña con un número de efectivos relativamente bajo: Montaña Blanca con unos 756 individuos y Pico Viejo con unos 60 (BAÑARES et al. 2004). La población Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 229 de Montaña Blanca se encuentra bajo una aparente estabilidad, observándose en los últimos años un lento proceso expansivo de la misma. La especie en estudio se encuentra catalogada como “En Peligro Crítico” por la UICN. Dispone además de otras figuras de protección en el Convenio de Berna y en el Catálogo de Especies Amenazadas de Canarias donde aparece como “Sensible a la Alteración del Hábitat”. También se incluye en el Anexo I de la Orden del Gobierno de Canarias 20/02/91 (BAÑARES et al. 2004). Se cree que las poblaciones se han visto mermadas debido a depredación por los herbívoros (muflón y conejos) que destruyen las plantas en búsqueda de sus raíces rizomatosas (Informe técnico, Parque Nacional El Teide; sin publicar). Bencomia exstipulata Svent. (Rosaceae-Sanguisorbeae) Pertenece a la sección Bencomiella asociada a ecosistemas secos, constituye un endemismo relegado a las cumbres de Tenerife y La Palma, en los parques nacionales del Teide y Caldera de Taburiente, donde se integra en las comunidades rupícolas de Greenovio-Aeonietea Santos 1976 del matorral de alta montaña canaria, por encima de los 2.000 metros de altitud. El Rosal del Guanche se encuentra representado por tan sólo dos poblaciones situadas en piedemontes y escarpes prácticamente inaccesibles, una con 52 individuos en la isla de Tenerife (Tiro del Guanche; Parque Nacional del Teide) y, la otra, con 21 individuos en La Palma (Barranco de Tajodeque; Parque Nacional de La Caldera de Taburiente). Se encuentra clasificada en Peligro de extinción en el Catálogo Especies Amenazadas de Canarias además de estar incluida en la Directiva Hábitat y el Convenio de Berna (BELTRÁN et al. 1999). La especie ha sido estudiada genéticamente mediante microsatélites (GONZÁLEZ PÉREZ et al. 2004a, 2009a), encontrándose unos mayores niveles de diversidad genética en la población natural de La Palma que en la de Tenerife, a pesar de que esta última alberga más del doble de individuos naturales que en la primera. No obstante, los niveles de variabilidad genética disminuyen considerablemente al analizar los individuos restituidos, lo cual demuestra la existencia de un cuello de botella muy importante en dichas poblaciones, existiendo por tanto la necesidad de incluir individuos genéticamente diferentes en nuevas restituciones (GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009a). Objetivos El objetivo global del presente proyecto es determinar la variabilidad, el grado de diferenciación y el nivel de estructuración genética en las poblaciones naturales de Ilex perado ssp. lopezlilloi, Silene nocteolens y Sorbus aria del archipiélago canario. Además de establecer un análisis de la Biología reproductiva de Bencomia exstipulata del Parque Nacional del Teide. De esta forma, y con los resultados obtenidos, se espera contribuir a la Biología de la Conservación de estos endemismos vegetales incluidos en los dominios de los parques nacionales canarios. Por otro lado, los objetivos específicos de este proyecto han consistido en: 1. Buscar y desarrollar microsatélites que permitan identificar y diferenciar con rapidez, de forma objetiva y sin ambigüedades la identidad genética de los individuos de las especies analizadas. 2. Analizar la relación genética entre varias especies y subespecies del género Ilex de la Macaronesia para verificar el grado de diferenciación existente entre Ilex perado ssp. lopezlilloi y sus congéneres más cercanos. 3. Determinar la diversidad genética poblacional de Silene nocteolens y comparar los niveles de variación y diferenciación genética entre sus poblaciones naturales. 4. Conocer la dinámica reproductiva de Silene nocteolens a través de la variación molecular, detectada por microsatélites, de los diferentes estadios vitales de la especie. 5. Conocer el grado de diversidad genética entre los individuos de Sorbus aria para establecer su acervo genético existente. 6. Determinar los mecanismos y vectores que están imperando en la Biología reproductiva y demográfica de Bencomia exstipulata en las poblaciones naturales restituidas del Parque Nacional del Teide. SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 230 7. Contribuir, desde la perspectiva genética a la aplicación y desarrollo de los posibles planes de recuperación que se puedan establecer en estos endemismos amenazados. MATERIAL Y METODOS Muestreo Ilex perado. ssp. lopezlilloii En el presente proyecto se recolectaron 126 ejemplares de todas las especies y subespecies de Ilex en Canarias y Azores, y poder establecer así un análisis genético comparativo entre las mismas. Las muestras procedían de 16 localidades situadas en cinco islas e incluyen las cuatro especies o subespecies descritas hasta el momento (tabla 1): Ilex perado ssp. platyphyla, Ilex perado ssp. lopezlilloi, Ilex azorica e Ilex canariensis (tabla 1). Sorbus aria Para afrontar el estudio de Sorbus aria se ha recolectado un total de 198 ejemplares procedentes de 12 localidades distintas. Las muestras de Tenerife (4) constituyen todos los ejemplares descritos en la isla. En La Palma se han registrado unos 49 ejemplares de seis localidades separadas geográficamente. Finalmente, se recogieron muestras de cuatro localidades de la Península: Parque Nacional de Cabañeros (Extremadura), Parque Nacional de Aigüestortes (Cataluña), Parque Nacional de los Picos de Europa y Parque Nacional de Sierra Nevada (tabla 2). Silene nocteolens Se ha muestreado un total de 747 individuos procedentes de las dos poblaciones naturales existentes, así como de la germinación de semillas recolectadas en estas (tabla 3). El estudio en esta especie se ha encaminado desde dos enfoques diferentes; por un lado se pretende analizar la diversidad genética poblacional y comparar los niveles de variación y diferenciación genética existente entre ambas poblaciones naturales, y en segundo lugar, conocer la dinámica reproductiva de la especie utilizando para ello la variación molecular detectada en los microsatélites, además del grado de endogamia de los mismos atendiendo al genotipo de los progenitores y los de su descendencia. Los diferentes estadios vitales considerados para llevar a cabo este segundo enfoque fueron; juveniles (Ju): individuos inmaduros, pequeños; virginales (Vi): individuos vegetativos sin rastro de previa floración; vegetativos (Ve): individuos vegetativos con reminiscencia de floracioESPECIE LOCALIDAD CÓDIGO ISLA Nº Ilex perado ssp. lopezlilloi La Gomera ENGO-L La Gomera 5 5 Ilex perado ssp. platyphylla Ancule, Bailadero y Reventón Oscuro Zona de Parcelas Aparcamiento El Moquinal Casa Forestal Cruz de Taganana SUGO-P PARC-P APAT-P MOQU-P CAFO-P CRTA-P La Gomera La Gomera La Gomera Tenerife Tenerife Tenerife 4 5 8 28 17 31 93 Ilex azorica Troqueira Lago de Fogo TROQ-A LAFO-A San Miguel San Miguel 10 10 20 Ilex canariensis La Galería del Barbusano y Valle Hermoso JACA-C Gran Canaria y La Gomera 8 8 TOTAL 126 Tabla 1. Poblaciones de Ilex analizadas por taxón, localidad e isla. Table 1. Ilex populations analyzed by taxon, locality and island. Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 231 nes pasadas; reproductor joven (RJ): individuos con flores, sin vestigios de floraciones pasadas; reproductor adulto (RA): individuos con flores y evidencia de floraciones anteriores (tabla 3). Bencomia exstipulata Los estudios sobre la Biología reproductiva y demografía de Bencomia exstipulata se establecieron tanto en las poblaciones naturales como en las restituidas dentro del parque Nacional del Teide. En mayo de 2008 se procedió a determinar los mecanismos y actores que intervenían en la polinización de la especie. Para ello se prepararon diferentes puntos de observación en la población natural y restituida del Tiro del Guanche, y a través de un monocular de gran amplitud (Tasco 8 x 10) se procedió a contabilizar e idenTabla 2. Poblaciones de Sorbus aria analizadas. Table 2. Sorbus aria populations analyzed. Tabla 3. Número de muestras recogidas de Silene nocteolens por fecha y población. Muestras recogidas según estadio de vida (Ju: Juvenil, Vi: Virginal, Ve: Vegetativo, Rj: Reproductor joven, Ra: Reproductor adulto, S/D: sin determinar). Plantas madres sombreadas. Table 3. Number of samples collected of Silene nocteolens by date and population. Specimens collected by stage of life (Ju: Juvenile, Vi: Virginal, Ve: Vegetative, Rj: young player, Ra: adult player, S/D: indeterminate). Mother plants shaded. ESPECIE LOCALIDAD CÓDIGO LUGAR Nº Sorbus aria Guajara Los Cachorros GuT CaT Tenerife Tenerife 3 1 Curva del Observatorio Espigón del Roque La Parcela Grande El Espigón Los Andenes El Espigón del Norte COT ERP PGP EsP AnP ENP La Palma La Palma La Palma La Palma La Palma La Palma 3 5 5 1 32 3 P.N. Cabañeros P.N. Aigüestortes P.N. Picos de Europa P.N. Sierra Nevada PNC PNA PNP PNS Península Península Península Península 6 36 51 52 TOTAL 198 ORIGEN ESTADIO TOTAL Ju Vi Ve Rj Ra S/D Montaña Blanca Montaña Blanca Pico Viejo Montaña Blanca Montaña Blanca Pico Viejo Montaña Blanca Pico Viejo Montaña Blanca Pico Viejo Pico Viejo Montaña Blanca Pico Viejo Montaña Blanca Pico Viejo 0 26 27 0 0 0 63 1 0 0 0 20 24 23 48 29 25 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 25 25 0 0 0 0 92 2 0 0 0 0 0 0 0 0 25 25 35 3 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 124 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 124 78 130 50 35 3 63 1 92 2 25 20 24 23 48 29 Total 261 55 49 145 113 124 747 SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 232 tificar los insectos que visitaban la zona. Se determinó la tasa de visita de insectos siguiendo el método estandarizado empleado por ARROYO et al. (1985), que consiste en la observación durante 10 min. de los diferentes individuos que visitan la zona en durante seis espacios de tiempo al día (comprendiendo el periodo desde las 9:00 hasta las 17:00 h). Además, se determinó la proporción de flores masculinas y femeninas en los ejemplares vegetales muestreados en las poblaciones, a la vez que el número total de inflorescencias, distinguiendo por su morfología floral si estas eran bisexuales, masculinas o femeninas. Por otro lado, 23 individuos elegidos al azar se sometieron a tres tratamientos diferentes de polinización que consistía en envolver las inflorescencias femeninas en bolsas especiales y de diferente tamaño de diámetro de malla, de manera que según el tamaño de poro (0,41 y 1,0 mm) impidiesen la entrada de polen transportado por el viento o la polinización por insectos respectivamente. El experimento control se realizó con inflorescencias a las que no se instalaron bolsa alguna, permitiendo en ellas la acción de ambos tipos de polinización. Análisis de microsatélites En el caso de Ilex se llevó a cabo el estudio de la variabilidad genética mediante cebadores caracterizados por TORIMARU et al. (2004) para este género. Ocho de estos microsatélites amplificaron correctamente en las muestras de Ilex perado, I. azórica e I. canariensis (tabla 4). Sin embargo, para Sorbus aria y Silene nocteolens, los microsatélites caracterizados en otras especies del género (Sorbus torminalis, Silene latifolia y Silene vulgaris) no dieron lugar a amplificación positiva e interpretable para nuestras especies. Por este motivo, se tuvieron que caracterizar e aislar nuevos microsatélites para ambas especies (tablas 5 y 6). Las amplificaciones se realizaron a partir de 20 ng de ADN, con 10 pmol de cada cebador y 24 μl de solución Master Mix para PCR (Reddy-Mix, ABgene, Surrey, UK), que incluye 0,625 unidades de la enzima ADN Taq polimerasa, Tris-HCl 75mM, (NH4)2SO420 mM, Tween20 0,01%, 0,2 mM cada dNTP y 1,5 mM ó 2,5mM de MgCl2dependiendo del cebador. Así mismo las condiciones generales de amplificación fueron: 3 min de desnaturalización a 94 °C; 30-35 ciclos de 45 s de desnaturalización a 94 °C, 45 s de hibridación a la Tm correspondiente y 45 s de elongación a 72 °C; seguidos de 5 a 30 min de elongación a 72 °C. Para los cebadores de Sorbus aria se encontró que algunos de los individuos analizados presentaron tres alelos para un mismo locus. Este patrón triploide se observó en todos los microsatélites analizados, a pesar de que las citas existentes (NELSON et al. 2002) señalan a Sorbus aria como una especie diploide. Aunque el subgénero aria o “agregado de Sorbus aria” (Sorbus aria, S. graeca, S. wilmottiana, S. rupicola, S. lancastriensis, S. eminens, S. leptophylla, S. porrigentiformis, S. vexans y S. hibérnica) comprende especies triploides y tetraploides apomíticas. Para determinar si los tres productos de amplificación que se obtuvieron en las muestras de Sorbus aria se correspondían con verdaderos alelos o eran artefactos de las técnicas o debido a mutaciones en las secuencias flanqueantes de los miNOMBRE REFERENCIA ESPECIE MOTIVO ILE03-01 ILE03-38 ILE03-53 ILE04-02 ILE04-06 ILE04-10 ILE03-86b ILE05-81 Torimaru et al. , 2004 Torimaru et al. , 2004 Torimaru et al. , 2004 Torimaru et al. , 2004 Torimaru et al. , 2004 Torimaru et al. , 2004 Torimaru (Com. Pers.) Torimaru (Com. Pers.) Ilex leucoclada Ilex leucoclada Ilex leucoclada Ilex leucoclada Ilex leucoclada Ilex leucoclada Ilex leucoclada Ilex leucoclada (CT)9 (AG)22 (GA)12 (TA)11A(CA)10 (CT)24 (GA)22 (GA)8 (AG)22 Tabla 4. Microsatélites y motivos con amplificación positiva y polimorfismo en el género Ilex. Table 4. Polymorphic microsatellites and motifs characterized in Ilex genus. Proyectos de investigación en parques nacionales: 2005-2008 233 crosatélites, se llevó a cabo la secuenciación de estos productos de amplificación. Para ello, los productos de amplificación fueron ligados a un vector plasmídico (pGEM-T) que se utilizó para transformar células competentes (JM109). Las colonias resultantes fueron seleccionadas por la resistencia en un medio con ampicilina, que otorgaba el vector plasmídico y a la no expresión del gen lacZ (colonias blancas) debido Tabla 5. Secuencia, motivo y tamaño de los nueve cebadores caracterizados para las poblaciones naturales de Sorbus aria. EMBL: código correspondiente a cada loci en el Banco Europeo de Secuencias Nucleotídicas. Table 5. Primer sequences and characteristics of nine microsatellite loci from natural populations of Sorbus aria. EMBL: Genebank accession of each loci in the European Nucleotide Sequence Database. LOCUS CEBADORES/SECUENCIA (5'-3') TAMAÑO (PB) MOTIVO TM (ºC) EMBL SA1 R: GGTGGAGGGACAATTGTGTC 229 (GA)13 60 FN563114 F: ATGGAGTTGAGCTCCACATC SA2 R: ACGTAGCACTGAATGGTATAG 293 (GA)16 60 FN563115 F: CTAGGTATCATCTCCGACCA SA3 R: ACTACTGCTACTTCTGTGGG 384 (GA)12 60 FN563116 F: CACTTCTTCCTGCTGTTTGG SA6 R: TGCAGCGGTTGCAGATTGCA 297 (GA)32 60 FN563117 F: ATTTGATCCATGTGCGACTGCA SA7 R: CTTCGCAGTTCATTAAGCAC 334 (GA)15 60 FN563118 F: ACGTTTTCAGTATGATGGCC SA8 R: GAATTCTTGGCAGTTTGCCT 249 (CT)16 60 FN563119 F: CAGAGAGAGTGCACTGCCT SA9 R: CCAATACTTGAGTAGCATAC 174 (AG)17 55 FN563120 F: CTTGTTGGACGGATTTCTTC SA14 R: GAGGTAAAACCTACCAGTATAC 203 (TC)30 57 FN563121 F: ATGGATTTAGGTTAACAGTTGTC SA19.1 R: GAATTCATGAAAGCAGCTAATG 241 (GA)24 58 FN563122 F: AAGTTTACAAGAGTGTGTTCAG Tabla 6. Secuencia, motivo y tamaño de los ocho cebadores caracterizados para las poblaciones naturales de Silene nocteolens. EMBL: código correspondiente a cada loci en el Banco Europeo de Secuencias Nucleotídicas. Table 6. Primer sequences and characteristics of eight microsatellite loci from natural populations of Silene nocteolens. EMBL: Genebank accession of each loci in the European Nucleotide Sequence Database. LOCUS CEBADORES/SECUENCIA (5'-3') TAMAÑO (PB) MOTIVO TM (ºC) EMBL SN01 F: AGCTAAGGACCACTAGATCATACT R: GGAGATGCGCGTGGTTTCT 190 (AG)15 60 FN563106 SN02 F: GAATTCAAAATAACAAAAAGAAGT R: AACTGTTTGTACTCATCTTGTC 143 (AC)35 55 FN563107 SN05 F: CCGAGTGCAACATTATCGTC R: TCGTGCTCGCCTTCCAATC 241 (TC)17 55 FN563111 SN06 F: GCCTTAGTATATAAGTTTCC R: CCTTACAATTTGGTGTAAATC 194 (AG)37 55 FN563108 SN12 F: GTGCTCACGGCTGCATGCC R: CAAACTACTCGACTCGCGAC 117 (AC)10 65 FN563109 SN14 F: GAATTCCCTGCTTACCGCC R: GCCCTAAAACTCTGTTGCAC 95 (GA)22 60 FN563110 SN20 F: GTGCCTACAACATATGAAGA R: GGTGTTGATGCAAATGAAG 166 (GT)9 60 FN563112 SN21 F: TTGCAAAGTTTGGGTCCTTATC R: GTCTCCGGTTTAAGCTCAATC 156 (CT)14 60 FN56311 SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 240 sula. Mientras que Aigüestortes y Picos de Europa parecen compartir ancestros comunes, los individuos analizados del Parque Nacional de Cabañeros están completamente diferenciados del resto de parques nacionales de la Península. Así mismo, este análisis revela a la población del Parque Nacional de Sierra Nevada como la más diversa, en concordancia con los valores observados en los diferentes índices de diversidad genética (tabla 9). Distancia e identidad genética El dendrograma UPGMA basado en la distancia genética de NEI (1972) (fig. 5) muestra una clara separación de las muestras de Sorbus aria procedentes del archipiélago canario con respecto a los ejemplares de la Península. Así mismo, dentro de Canarias, las diferentes localidades se agrupan atendiendo a su isla de origen. Por otro lado, las muestras de la Península se agrupan conjuntamente, si bien Parque Nacional de Cabañeros se separa ligeramente del resto dentro del mismo agrupamiento (fig. 5). No obstante, es importante señalar que las diferencias genéticas entre las poblaciones de la Palma y Tenerife son superiores a las encontradas entre las distintas poblaciones de la Península. Los análisis genéticos llevados a cabo en las muestras de Sorbus aria diferencian claramente las localidades presentes en el archipiélago canario con respecto a aquellas analizadas de la Península Ibérica. Está diferenciación genética puede ser consecuencia de un cuello de botella reciente que posiblemente ha sufrido esta especie en Canarias y que ha dado lugar a una separación genética de las mismas. No descartamos, no obstante, la posibilidad de que Sorbus aria haya sufrido la consecuencia de un efecto fundador, aunque en un caso u otro los resultados sobre las poblaciones son equivalentes dando lugar a una importante diferenciación genética y depauperados niveles de variación genética (deriva genética), tal y como se ha detectado. Resultados similares se han encontrado en otras especies endémicas de Canarias (Bencomia exstipulata; GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009a, Anagyris latifolia; GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009b, etc.). Sin embargo, llama la atención los escasos valores detectados en Sorbus aria, ya que en general los niveles de variación genética en especies vegetales endémicas en Canarias suelen ser superiores Figura 4. Diagrama de barras para los proporciones inferidas (K=6) en el análisis bayesiano de las poblaciones de Sorbus aria analizadas. Cada individuo es representado por una línea vertical, que es dividida en tantos segmentos coloreados como fracciones de pertenencia tenga en los grupos K. Las líneas negras separan individuos de diferentes poblaciones. Figure 4. Bar plots for proportion of inferred from Bayesian cluster analysis (K=6) of Sorbus aria populations analyzed. Each individual is represented by a thin vertical line, which is partitioned into K colored segments that represent the individual’s estimated membership fractions in K clusters. Black lines separate individuals from different populations. Guajara Los Cachorros Curva observatorio Espigón Roque Los Muchachos Parcela Grande El Espigón Los Andenes Espigón del Norte P.N. Cabañeros P.N. Agüestortes P.N. Picos de Europa P.N. Sierra Nevada 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 241 a los descritos en otras islas oceánicas (SOSA et al. 2002, GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2004b, GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009a, GONZÁLEZ-PÉREZ et al. 2009b). La fuerte diferenciación genética encontrada entre los ejemplares de Tenerife y La Palma desaconsejan el movimiento de individuos de una isla a otra, con el propósito de evitar la ruptura de la cohesión y adaptaciones locales que puedan haberse desarrollados en cada isla de forma independiente. Por otro lado, teniendo en cuenta que Sorbus aria ha sido descrita como una especie diploide (NELSON et al. 2002), aunque el denominado “agregado de Sorbus aria” comprende especies triploides y tetraploides apomíticas, no sería de extrañar que en Canarias, como en algunas de las muestras de la Península que han mostrado un carácter triploide, no estemos frente a Sorbus aria sensu stricto, sino más bien delante de uno de los miembros triploides de este agregado, o un híbrido entre los anteriores. Por todo ello, consideramos que una revisión exhaustiva a nivel taxonómico de los ejemplares de Sorbus aria presentes en los parques nacionales de Canarias es imprescindible para afrontar cualquier estrategia de conservación que se fuese a emprender con este taxón en el archipiélago canario. Silene nocteolens Diversidad genética Las dos poblaciones naturales analizadas muestran algunas diferencias genéticas. Así, la diversidad genética detectada en la población de Pico Viejo es superior a la detectada en Montaña Blanca, a pesar de que en la primera se analizó solamente la mitad de ejemplares que en la segunda (tabla 10). También se detecta en la población de Montaña Blanca, que la variabilidad genética aumenta a medida que nos desplazamos en los diferentes estadios de la planta desde descendientes hasta reproductores jóvenes. Sin embargo, esta tendencia no es tan evidente en la población de Pico Viejo, donde los valores de He varían arbitrariamente según el estadio. Los valores globales de diversidad genética observados en ambas poFigura 5. Dendrograma UPGMA basado en la distancia genética de Nei (1972) de las poblaciones de Sorbus aria analizadas. Figure 5. UPGMA dendrogram based on Nei genetic distance (1972) of Sorbus aria populations analyzed. Guajara Los Cachorros Curva del Obsevatorio Espigón del Roque de los Muchachos Parcela Grande Espigón del Norte Los Andenes El Espigón P.N. Cabañeros P.N. Agüestortes P.N. Picos de Europa P.N. Sierra Nevada 10 8 6 4 2 0 SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 242 blaciones naturales de S. nocteolens (He=0,669 y He = 0,742) son ligeramente inferiores a los descritos para su congénere S. flos-cuculi (He = 0.828), la cual es una especie de amplia distribución en el continente Europeo (GALEUCHET et al. 2005). Distancia e identidad genética El dendrograma UPGMA basado en la distancia genética de NEI (1972) (fig. 6) muestra una separación bien definida entre los diferentes estadios de las poblaciones de Montaña Blanca y Pico Viejo (con una fortaleza de 98%). Según este gráfico, los individuos de Montaña Blanca se encuentran más emparentados entre sí que con los de Pico Viejo (fig. 6). En esta última población es notable la fuerte diferenciación genética de las plántulas (100%) del resto de los estadios de vida. Esta diferenciación genética entre las plántulas (descendientes) y el resto de estadios de vida de la especie posiblemente es debida al exceso de homocigóticos detectado en el primero. Dinámica reproductiva El coeficiente Fis mide la magnitud de la homocigosis en relación con la expectativa al asumir el apareamiento al azar dentro de una población. Para todos los estadios, excepto en los reproductores jóvenes de Montaña Blanca, y en ambas poblaciones los valores del coeficiente de endogamia son positivos, lo que implica que existe un defecto de heterocigóticos en cada uno de ellos. Este defecto de heterocigóticos puede ser debido al hecho de que existe cierto grado de autofecundación o fecundación cruzada entre individuos genéticamente relacionados en Silene nocteolens, incrementando la endogamia. En este sentido, al comparar el coeficiente de endogamia entre los diferentes estadios se observa una tendencia descendiente a lo largo de los diferentes estadios del ciclo de vida de la especie. Así, la homocigosis relativa al cruzamiento aleatorio para la población Montaña Blanca es mayor en las plántulas (Sd) y va disminuyendo a través de los estadios sucesivos (Ju, Vi, Ve, Rj); sin embargo, aumenta repentinamente en los reproductores adultos (Ra). En Pico Viejo, la magnitud de homocigotos en la fase vegetativa (Ve) es mayor y persiste la tendencia de un alto valor para los reproductores adultos en esta población (Fig. 7). La disminución del coeficiente de endogamia en los sucesivos estadios del ciclo de vida de una especie está relacionada con la selección natural y la eliminación del exceso de homocigosis y es característica de especies autocompatibles (selfing). Ya que en especies autoincompatibles (outcrosTabla 10. Parámetros de diversidad genética para las poblaciones Silene nocteolens. Número medio de alelos por locus (A), Heterocigosidad observada (Ho), Heterocigosidad esperada (He) y Proporción de loci polimórfico (P). “Nº” es el número de individuos analizados por estadio de vida o población. Table 10. Parameters of genetic diversity of Silene nocteolens populatios. Average number of alleles per locus (A), Observed heterozygosity (Ho), Expected heterozygosity (He) and Proportion of polymorphic loci (P). “Nº” is the number of individuals analyzed by stage of life or population. POBLACIÓN ESTADIO CÓDIGO Nº A Ho He P Montaña Blanca Descendientes Sd 132 10,80 0,516 0,634 100% Juveniles Ju 26 7,00 0,525 0,639 100% Virginales Vi 24 7,20 0,610 0,666 100% Vegetativos Ve 26 7,40 0,637 0,685 100% Reproductores jóvenes Rj 26 6,60 0,693 0,709 100% Reproductores adultos Ra 36 7,60 0,608 0,684 100% Total Población 270 7,70 0,598 0,669 100% Pico Viejo Descendientes Sd 24 7,00 0,556 0,694 100% Juveniles Ju 26 9,60 0,680 0,765 100% Virginales Vi 30 11,20 0,721 0,756 100% Vegetativos Ve 23 8,60 0,645 0,742 100% Reproductores jóvenes Rj 25 9,40 0,706 0,757 100% Reproductores adultos Ra 25 9,80 0,677 0,740 100% Total Población 153 9,267 0,664 0,742 100% Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 243 sing) se ha detectado unos valores de endogamia más homogéneos a lo largo del ciclo de vida de la planta. Sin embargo, el coeficiente de endogamia observado en los reproductores adultos (Ra) de Montaña Blanca y Pico Viejo, así como los vegetativos (Ve) de esta última población presentan unos valores superiores a los esperados. Aunque por el momento no tenemos una explicación definitiva para estos resultados, éstos parecen estar relacionado con los índices de mortandad registrados en la especie. En este sentido, cruzando los valores de endogamia con la tasa de mortalidad estimada en los diferentes estadios (fig. 8) observamos una importante correlación entre ambas variables. Es factible que estemos observando el efecto de la erosión de la depresión endogámica según los diferentes estadios. Así, en las fases más jóvenes existen un importante número de individuos homocigóticos (altos valores de Fis - tabla 11) que albergan una escasa eficacia biológica consecuencia de su homocigosidad. Parte de estos individuos no alcanzan el siguiente estadio vital y mueren, por lo que el grado de endogamia en el siguiente estadio es inferior, relacionándose con el índice de mortalidad entre los estadios. Bencomia exstipulata Biología Reproductiva Los individuos de Bencomia fueron visitados de manera muy frecuente por abejas obreras melíferas (Apis mellifera), detectándose más de 9.300 observaciones de visitas. La gran mayoría de las abejas (77,4%) visitaron las inflorescencias masculinas, y sólo un 22,5% visitó también las inflorescencias mixtas masculinas y femeninas. En el experimento de polinización se capturó un número importante de granos de polen de Bencomia en las placas de cristal instaladas en la población y sometidas a diferentes tratamientos de Figura 6. Dendrograma UPGMA basado en la distancia genética de Nei (1972) de los diferentes estadios considerados en las poblaciones de Silene nocteolens. Figure 6. UPGMA dendrogram based on Nei´s genetic distance (NEI 1972) of the different state considered of Silene nocteolens populations. SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 244 Figura 7. Coeficiente de endogamia por estadio de vida para las poblaciones de Silene nocteolens. (Sd: descendientes, Ju: Juvenil, Vi: Virginal, Ve: Vegetativo, Rj: Reproductor joven, Ra: Reproductor adulto) Figure 7. Inbreeding coefficient by stage of life in Silene nocteolens populations. (Sd: seedling, Ju: Juvenile, Vi: Virginal, Ve: Vegetative, Rj: young player, Ra: adult player). Figura 8. Correlación entre la mortalidad y el coeficiente de endogamia en Silene nocteolens. Figure 8. Correlation between mortality and inbreeding coefficient in Silene nocteolens. Tabla 11. Diversidad genética, coeficientes de endogamia e índices de mortalidad para Silene nocteolens. Ho= Heterocigosidad observada, He= Heterocigosidad esperada, Fis = coeficiente de endogamia y M = tasa de mortalidad Table 11. Genetic diversity, inbreeding coefficient and mortality index for Silene. Ho= observed heterozygosity, He= expected heterozygosity, Fis = inbreeding coefficient and M = mortality rate. ESTADIOS CÓDIGO HO HE FIS M MONTAÑA BLANCA Descendientes Sd 0,516 0,634 0,229 0,50 Juveniles Ju 0,525 0,639 0,215 0,31 Virginales Vi 0,61 0,666 0,088 0,31 Vegetativos Ve 0,637 0,685 0,048 0,13 Reproductores jóvenes Rj 0,693 0,709 -0,036 0,13 Reproductores adultos Ra 0,608 0,684 0,091 0,24 Total 0,598 0,669 0,106 0,27 PICO VIEJO Descendientes Sd 0,556 0,694 0,251 0,50 Juveniles Ju 0,68 0,765 0,084 0,31 Virginales Vi 0,721 0,756 0,028 0,31 Vegetativos Ve 0,645 0,742 0,131 0,13 Reproductores jóvenes Rj 0,706 0,757 0,049 0,13 Reproductores adultos Ra 0,677 0,74 0,088 0,24 Total 0,664 0,742 0,105 0,27 Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 245 envolvimiento. Así, en las placas cubiertas por bolsas de plástico con poros de 0,4 mm (pollen proof) se pudieron contar en torno a una media de 10 granos de polen por cada porta, lo cual significó un 90% menos que el valor medio capturado en portas cubiertos por mallas de 1,0 (insect proof), donde el número de granos de polen capturado alcanzó una media de 100 granos por porta. El experimento control alcanzó una media de dos veces superior a este último tratamiento, llegando en torno a 225 granos de polen por porta (fig. 9). Dicho de otro modo, las bolsas de 1,0 mm de diámetro de malla (insect-proof) dejaron pasar una media del 41% de los granos de polen respecto al experimento control, mientras que las bolsas de 0,4 mm (pollen-proof) mantenían fuera la mayor parte del polen (alrededor de un 96% de media del experimento control). Por otro lado, destaca el elevado número de granos de polen que parece existir en el aire de las poblaciones de Bencomia, lo cual se traduce en que el viento constituye el principal agente dispersor del polen de Bencomia exstipulata en las poblaciones estudiadas. Aunque los tratamientos con las bolsas que impedían la polinización por insectos mantenían un 41% menos de polen que el experimento control, no se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre la producción de semillas obtenidas mediante ambos sistemas de bolsas. De la misma forma, tampoco hubo diferencias significativas entre los experimentos de cruzamiento llevados a cabo con cruzamientos manuales, ya que las flores que se encontraban completamente abiertas, y por tanto expuestas a la polinización (cross 1 en fig. 10), producían la misma cantidad de semillas (o al menos no existían diferencias significativas) con aquellas flores que no se habían abierto completamente (cross 2 en fig. 10). Además, las inflorescencias mixtas que albergaban flores masculinas y femeninas a la vez que se cubrieron con bolsas de plástico de malla pequeña (mixed inflo en fig. 10). Esto permitía la autofecundación, y dio lugar Figura 9. Número medio de granos de polen de B. exstipulata capturados mediante portas de cristal cubiertos de un gel pegajoso. Insect-proof: Placas envueltas con bolsas de 1 mm de diámetro; pollen-proof: Placas envueltas con bolsas de 0,4 mm. de diámetro; Control: Placas situadas en las poblaciones totalmente expuestas y sin bolsas. Figure 9. Average number of pollen grains of B. exstipulata caught using glass slides covered with a sticky gel. Insect-proof: plates wrapped in bags of 1 mm in diameter, pollen-proof: plates wrapped in bags of 0,4 mm. diameter; Control: plates located in the towns were completely exposed and without bags. SOSA, P. A. YCOLS. «Biología de la conservación de endemismos vegetales de los P. N. canarios» 246 a una producción de semillas equivalente a la de que aquellas inflorescencias exclusivamente femeninas cubiertas por mallas de diámetro pequeño (pollen proof en fig. 10). AGRADECIMIENTOS Agradecemos a Ángel Bañares, Manolo Marrero y Eduardo Carqué (Parque Nacional Teide) por facilitarnos gran cantidad de datos del Parque Nacional y por su ayuda en la recogida de muestras. A Ángel Palomares, Álvaro Rodríguez Felipe (Parque Nacional Caldera del Taburiente), Ángel Fernández, Cito Chinea (Parque Nacional de Garajonay), Agustín Naranjo, Juan Ojeda, Alicia Escandell y Nancy Cabanillas por su colaboración en el muestro en los parques nacionales de Canarias. A Mónica Moura (Universidade dos Açores) por los ejemplares de Ilex azorica, al Dr. Juli Caujapé y Ruth Jaén (Jardín Botánico Viera y Clavijo) por cedernos ADN de Ilex canariensis, al personal de los parques nacionales de Picos de Europa, Cabañeros, Sierra Nevada y Aigüestortes que nos han facilitado las muestras de Sorbus aria de la Península. A la Dra. Pilar García (Universidad de Las Palmas de Gran Canaria) por su asesoramiento en el proceso de clonación. Finalmente, al Dr. Takeshi Torimaru (Universidad de Nagoya, Japón) por su cooperación desinteresada al compartir información no publicada sobre los microsatélites desarrollados para Ilex leucoclada. Figura 10. Media (±1 SE) de la producción de semillas en cada tratamiento de polinización en B. exstipulata. Las diferentes letras en la parte superior de cada barra indican las diferencias significativas obtenidas entre las medias (Bonferroni Posthoc test P<0.05). Figure 10. Mean (±1 SE) seed set for each pollinition treatment for B. exstipulata. Different letters on top the bars indicate significant differences between means (Bonferroni Posthoc test P<0.05). Proyectos de investigación en parques nacionales: 2006-2009 247 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARROYO, M.T.K., ARMESTO, J.J. & PRIMACK, R.B. 1985. Community studies in pollination ecology in the high temperate Andes of central Chile II. Effect of temperature on visitation rates and pollination possibilities. Plant Systematics and Evolution, 149, 187-203. BAÑARES, A., BLANCA, G., GÜEMES, J., MORENO, J.C. & ORTIZ, S. 2004. Atlas y libro rojo de la flora vascular amenazada de España. DGCN. Madrid. 1072p. BAÑARES, A., MARRERO, E., CARQUÉ, E. & FERNÁNDEZ, Á. 2003. Plan de recuperación de la flora amenazada del Parque Nacional Garajonay, La Gomera (Islas Canarias): Germinación y restitución de Pericallis hamsenii, Gonospermun gomerae e Ilex perado ssp. lopezlilloi. Botánica Macaronésica, 24: 3-16. 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