Aprofitament dels residus de pa per l'obtenció de glucosa

APROFITAMENT DELS RESIDUS DE PA PER L’OBTENCIÓ DE GLUCOSA Treball final de grau Grau en enginyeria alimentaria Autora: María José González Sánchez Tutor: Francisco Luis Sepulcre Sánchez Co-tutora: Montserrat Pujolà Cunill Data: 25/9/2015 I Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Agraïments En primer lloc, he d’agrair a tot l’equip de TECNOBAKERY SL el suport que m’han aportat durant el transcurs d’aquest treball; a Daniel Solis per deixar-me fer ús de les seves instal·lacions i el seus materials, a l’equip de laboratori, tant a Luigi Salis com a Susana Ojeda per deixar-me ocupar el seu espai de treball, per ajudar-me i donar-me idees i sobretot per en recordar-se de guardar-me mostres. No puc deixar de mencionar a Pablo Gracia per donar-me tot l’ajut incondicional moral i intel·lectual que he necessitat. A tots vosaltres, gràcies. Agraeixo als meus tutors, Francesc Sepulcre i Montserrat Pujolà per guiar-me durant el treball i donar-me el suport acadèmic necessari per tirar endavant. També he de donar les gràcies a la Monica Blanco per l’atenció rebuda i la rapidesa en solucionar-me els dubtes. D’altra banda, agraeixo a tots els companys que m’han acompanyat en el transcurs del projecte, especialment a la Carme Herrero i la Sandy Sosa que sempre que ho necessitat han estat allà per resoldrem qualsevol dubte. Finalment, a tota la família i amics que m’han entès i han sabut estar al meu costat en tot moment, ja que sense ells res hauria estat possible. En especial a Jesús Sánchez per la seva dedicació. III Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Resum APROFITAMENT DELS RESIDUS DE PA PER L’OBTENCIÓ DE GLUCOSA Autora: Mª José González Sánchez Directors: Dr. Francisco Luis Sepulcre, Dra. Montserrat Pujolà. Escola Superior d'Agricultura de Barcelona. Universitat Politècnica de Catalunya. (ESAB, UPC) Paraules clau: residus, hidròlisi enzimàtica, optimització, glucosa, α-amilasa, glucoamilasa. Actualment, una de les preocupacions socials més importants és la quantitat de residus que es generen ja que causen un problema social, econòmic i ambiental greu. Molts d’aquests residus sorgeixen de processos industrials en el sector de l’alimentació, que a l’hora presenten característiques importants per poder-los valoritzar i aprofitar. L’objectiu principal d’aquest treball és optimitzar un procés que permet la recuperació i reutilització dels residus del pa. Es pretén valoritzar el residu de pa obtenint glucosa apte per la utilització en la mateixa industria. Per optimitzar aquest procés s’han estudiat dos enzims, l’α-amilasa fúngica (16800 UFAU/g) i l’ l’α-amilasa bacteriana (800 KNUB/g), caracteritzant les seves activitats. En el present treball s’han utilitzat diferents mètodes com: l’anàlisi de la terbolesa en la mescla (aigua, pa i enzim), la disminució del pes del pa un cop realitzada la hidròlisi enzimàtica, quantificant la glucosa obtinguda com a conseqüència de l’activitat enzimàtica. En segon lloc, s’ha estudiat l’activitat combinada de l’α-amilasa bacteriana(800 KNU-B/g) amb la glucoamilasa (3300 BG) per obtenir la major quantitat de glucosa possible. Per últim, s’ha elaborat pa utilitzant l’extracte ric en glucosa obtingut del tractament enzimàtic dels residus de pa. Amb els resultats obtinguts hem trobat que una hora és temps suficient perquè l’enzim actuï i que l’acció combinada dels dos enzims es primordial per augmentar la quantitat de glucosa obtinguda. El resultats de la panificació demostren que abans d’aplicar l’extracte ric en glucosa s’han d’inactivar els enzims. Per tant, amb la mesura de l’absorbància produïda per la combinació dels enzims sobre els residus de pa i a una temperatura estable, es pot quantificar la glucosa i ser utilitzada com a matèria prima en la mateixa industria. V Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Resumen APROVECHAMIENTO DE LOS REDIUOS DE PAN PARA LA OBTENCIÓN DE GLUCOSA Autora: Mª José González Sánchez Directors: Dr. Francisco Luis Sepulcre, Dra. Montserrat Pujolà. Escuela Superior de Agricultura de Barcelona. Universidad Politècnica de Catalunya. (ESAB, UPC) Paraules clau: residuos, hidrolisi enzimática, optimización, glucosa, α-amilasa, glucoamilasa. Actualmente, una de las preocupaciones sociales más importantes es la cantidad de residuos que se generan ya que causan un problema social, económico y ambiental grave. Muchos de estos residuos surgen de procesos industriales en el sector de la alimentación, que a la vez presentan características importantes para poderlos valorizar y aprovechar. El objetivo principal de este trabajo es optimizar un proceso que permita la recuperación y reutilización de los residuos del pan. Para optimizar este proceso se han estudiado dos enzimas, la α-amilasa fúngica (16800UFAU/g) y la α-amilasa bacteriana (800 KNU-B/g). En el presente trabajo se han utilizado diferentes métodos como: el análisis de la turbidez en la mezcla (agua, pan y enzimas), la disminución de peso del pan una vez realizada la hidrolisis enzimática, y el análisis de glucosa obtenida como consecuencia de la actividad enzimática. En segundo lugar, se ha estudiado la actividad combinada la α-amilasa bacteriana (800 KNU-B/g) con la glucoamilasa (3300BG) para obtener la mayor cantidad de glucosa posible. Por último, se ha elaborado pan utilizando el extracto rico en glucosa obtenido del tratamiento enzimático de los residuos de pan. Con los resultados obtenidos se ha observado que una hora es tiempo suficiente para que la enzima actúe y que la acción combinada de las dos enzimas es primordial para aumentar la cantidad de glucosa obtenida. Por lo tanto, con la medición de la absorbancia producida por la combinación de las enzimas sobre los residuos de pan y a una temperatura estable, se puede cuantificar la glucosa y ser utilizada como materia prima en la misma industria. VII Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Abstract USE OF WASTE OF BREAD FOR PRODUCING GLUCOSE Author: Mª José González Sánchez Directors: Dr. Francisco Luis Sepulcre, Dra. Montserrat Pujolà. Escuela Superior de Agricultura de Barcelona. Universidad Politècnica de Catalunya. (ESAB, UPC) Keywords: waste, enzymatic hidrolisi, optimization, glucose, α-amylase, glucoamylase. Currently, one of the most important social concerns is the amount of waste generated, which causes serious social, economic and environmental problems. Many of these wastes arise from industrial processes in the food industry, which at the same time present enough interesting properties to rise in value and to take the most of it. The main objective of this work is to optimize a process that allows the recovery and reuse of waste of bread. The intent is to enhance the waste of bread attaining suitable glucose being used by self-industry. To optimize this process fungal α-amylase (16800 UFAU/g) and bacterial α-amylase (800 KNU-b/g) have been studied, characterizing their activities. Various methods have been used in this work to reach this point: analysis of turbidity in the mixture (water, bread and enzyme), the reduction of the weight of bread after making the enzymatic hydrolysis and the analysis of glucose obtained as a result of enzymatic activity. Secondly, combined activity of bacterial αamylase and glucoamylase (3300BG) has been studied to get as much glucose as possible. Lastly, bread has been prepared using glucose-rich extract obtained from the enzymatic treatment of waste bread. The final outcomes show that one hour is time enough for the enzyme to act besides combined action of both enzymes is essential to increase the quantity of glucose obtained, as well as the role of glucoamylase (3300 BG). The results show that before applying the extract rich in glucose in bread, enzymes have to be inactivated. Therefore, measuring the absorbance produced by the combination of enzymes on waste bread on a stable temperature can quantify the glucose used as raw material by self-industry. 6 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Introducció 7 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 1 Introducció 1.1 El pa i l’evolució fins l’actualitat 1.1.1 Evolució històrica Situem l’aparició del pa en l’època Neolítica, on els nostres avantpassats comencen a conèixer les llavors i cereals. Feien papilles molturant les llavors i deixant-les amb aigua, casualment per un descuit van observar que aquella papilla es tornava dura i granulosa donant lloc al primer pa. Des de aquell moment, la historia del pa ha anat lligada a l’evolució de l’home i ha estat present en diferents moments de la historia: l’època del egipcis, dels grecs, dels romans, en l’edat mitja i moderna. A finals del segle XVII, hi ha un progrés en l’agricultura i augmenten les investigacions aconseguint millors farines i millores en la producció de blat. Per tant, el pa comença a arribar a gran part de la població que abans no hi tenia accés. Més endavant es comencen a perfeccionar noves tècniques i l’evolució de la fleca creix de manera ràpida. (www.ceopan.es) Va ser durant la dècada dels 80 on el fred va revolucionar el sector mundialment. Aquesta evolució es va iniciar amb la fermentació controlada i la ultracongelació de les masses, i va culminar amb l’aparició de la tècnica del pa precuit, el qual no només ha modificat els processos de producció, sinó inclús la tradicional forma de comercialitzar-lo. Per tant, l’aplicació de fred en els obradors es pot comparar com l’autèntica revolució industrial de la fleca (Tejero, 1998). En els últims anys la fleca ha patit modificacions a l’hora de produir tant tecnològicament com de disseny de producte. La revolució del fred i la gran industrialització del sector ha fet que petits i mitjans empresaris de fleca juntament amb les necessitats demandades pels consumidors busquin alternativa per donar sortida als seus productes. Ja sigui adaptant les instal·lacions o produint productes amb un valor afegit. En conseqüència, han nascut una gran varietat de productes derivats d’aquesta activitat. 8 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa 1.1.2 Consum El consum de pa a Espanya ha anat disminuint des de l’any 1964 fins al 2009 com es mostra a la Figura 1. A partir del 2012 el consum comença a incrementar-se lentament (Taula 1). Figura 1: Evolució del consum de pa a Espanya Font:<www.ceopan.es> De l’estudi publicat el 14 d’agost de 2013 pel Ministeri d’Agricultura, Alimentació i Medi ambient s’observa que a les llars espanyoles es va incrementar en un 1,8 % el consum de pa durant els mesos de maig de 2012 i abril de 2013, respecte al mateix període de l’any anterior. Per tant, el consum de pa es situava en una mitja de 36,1 kg per persona i any. (www.ceopan.es) Introducció 9 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Taula 1.Mercat total del pa (Abril 2013) TOTAL DEL PA DOMESTIC % VARIACIÓ VS ANY ANTERIOR VOLUM (Milers kg/any) 1.667.336,25 1,8 VALOR (Milers €/any) 3.903.011,50 -0,1 CONSUM PER CAPITA (kg/any) 36,12 1,4 GASTO PER CAPITA (€/any) 84,55 -0,5 PREU MIG (€/kg) 2,34 -1,9 Font: adecuada a partir de: <www.magrama.gob.es> A la Figura 2 es mostra el % de pans que es consumeixen segons si és pa fresc/congelat o si és pa industrial. Percentatge de pans que es consumeixen segons si són frescos/congelats o industrials: Figura 2: Percentatge de pans que es consumeixen segons si són frescos/congelats o industrials Font: adecuada a partir de: <www.magrama.gob.es> El perfil del consumidor intensiu de pa són les llars amb més de 4 persones, formades per parelles amb fills d’edat mitja i majors. També ho són parelles adultes sense fills on el responsable de la compra té més de 50 anys, no són actius i a demés viuen en poblacions petites/mitjanes fins a 10.000 habitants. Per comunitats autònomes, les més 10 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa consumidores de pa són Navarra, Galicia i Castella i lleó i les menys consumidores Balears i Madrid. (www.magrama.gob.es) 1.1.3 Procés de panificació El pa és un aliment basic que s’elabora amb una mescla de farina, generalment de blat, aigua, sal i llevat, sovint s’incorporen altres productes com els millorants i la massa mare. Aquesta mescla s’amassa i es cou en diferents peces. Per fer pa amb farina de blat són necessaries tres condicions: formació de l’estructura de gluten, esponjositat de la mescla per la incorporació d’un gas i coagulació del material per escalfament al forn. (www.datateca.unad.edu.co) En la següent figura (Figura 3) es mostra el procés basic de panificació: Figura 3: Procés bàsic de panificació Font: Elaboració pròpia a partir de <www.uco.es> Introducció 11 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Matèries primes: Farina Qualsevol producte procedent de la mòlta d’un cereal pot denominar-se farina, però en panificació la que s’utilitza més és la farina de blat. Només el blat i el sègol produeixen farines directament panificables (capacitat per retenir el gas de la fermentació i donar volum). Per una correcte panificació, es solen caracteritzar tres paràmetres fonamentals: - Taxa d’extracció És el pes de farina extreta per unitat de blat brut utilitzat. En general s’expressa en percentatge, que pot oscil·lar entre el 65 i el 98%. El contingut en cendres, expressa la quantitat de matèria mineral present en la farina i varia des de 0,45% al 1,40% per els valors extrems indicats per la taxa d’extracció. (www.uco.es) - Característiques físiques de la massa que origina  Es refereix fonamentalment a la elasticitat, tenacitat i suavitat. El procés més utilitzat per mesurar aquesta propietat és l’alveògraf de Chopín, que representa de forma gràfica i numèrica, la força i les qualitats físiques de la farina. (www.uco.es) - Propietats fermentatives Es concreten en la producció de gas, que té lloc durant la fermentació de la massa. La bona retenció dels gasos a la massa és una propietat lligada a les característiques plàstiques de la farina, facilita l’elaboració de qualitat produint pans esponjosos. Aquesta propietat es mesura mitjançant un fermentógraf de Brabender, el manòmetre de Bllish i Sandstedt. (www.uco.es) A la Taula 2 es mostres els paràmetres alveogràfics que es tenen en compte en l’anàlisi de les farines. 12 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Taula 2. Paràmetres alveogràfics Font: Elaboració pròpia a partir de <www.uco.es> Llevat: Els llevats realitzen la fermentació, transformant els sucres en CO2, alcohol etílic i energia. Aquest procés s’inicia quan s’incorpora el llevat a la massa i finalitza passats els primers 4 o 5 min de la cocció, o bé, quan la temperatura en l’interior de la massa és d’aproximadament 55ºC (mort de les cèl·lules del llevat). El llevat més utilitzat pels forners és el Saccharomyces cerevisiae i es pot trobar al mercat en diferents formats: granulat, sec instantani, premsat, en pasta o líquid. (Barriga, data desconeguda) VALOR P Expresa la tenacitat i medeix la resistencia al trencament. >60 Molt tenaç de 50 a 60 Tenaç de 35 a 50 Normal de 25 a 35 Limitada tenacitat VALOR L Expresa l¡extensibilitat i mesura la capacitat de la massa per ser estirada, indicant la seva elasticitat. >115 Molt extensible De 90 a 115 Bona extensibilitat De 90 a 70 Débil o limitada extensibilitat VALOR P/L Indica l'equilibri i és la relació entre la tenacitat i l'extensiblitat. De l'equilibri dependrà el desti més adequat de la farina. Es considera equilibri entre els següents valors: De 1,5 a 2 per blat millorant De 0,8 a 1,5 per blat d'elevada força De 0,6 a 0,8 per blats de força De 0,4 a 0,6 per blats de mitja força De 0,3 a 0,4 per blats fluixos VALOR G Anomenat grau d'inflament, indica l'aptitud de la farina per donar un pa ben desenvolupat. Llamado grado de hinchamiento, indica la aptitud de la harina para dar un pan bien desarrollado. Es classifica segons l'index de dilatació. >26 Excesiva De 23 a 26 Elevada De 20 a 23 Normal De 18 a 20 Limitada De 16 a 18 Baixa VALOR W Expresa la força en termes de panificació i indica el treball necesari per deformar una lámina de massa empesa per l'aire. >250 Fortes o millorants De 200 a 250 Gran força De 150 a 200 Mitja força De 90 a 250 Fluixes DEGRADACIÓ Indica la pèrdua de qualitats plàstiques de la massa durant el repòs. W=(W1-W2/W1)*100 Essent: W1: Valor a los 28 min. W2: Valor a las 3 h. PARAMETRES ALVEOGRÀFICS Introducció 13 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Millorants del pa: Són agents que s’afegeixen en petites quantitats com a ingredients del pa, amb la intenció de millorar les característiques inicials de la farina, referides fonamentalment al color, contingut en enzims i característiques plàstiques de la massa. El millorant complet que normalment s’utilitza esta composat per diacetil tartàric (E-472e), àcid ascòrbic (E-300) i enzims α-amilases. Aquesta mescla de principis actius, proporcionen una gran expansió en el forn. Quan la pujada del pa a la fase de cocció és exagerada hi ha el risc de que el pa s’arrugui durant el refredament. Per tant cal moderar l’ús d’aquest millorants, aconseguint el volum durant la fermentació i no per la expansió del pa en el format. Massa mare: Quan parlem de massa mare ja no ens referim a l’antiga massa mare d’origen natural, sinó formules equilibrades per obtindré el mateix producte amb regularitat. Això vol dir, que en produccions elevades la diferencia existent entre el pH d’una massa i una altre no varien substancialment. La massa mare serà la responsable de donar major sabor, olor i la forma estable i compacta a la massa. El mètode més utilitzat per realitzar-la és fer una amasada normal de pa, deixar-la tres hores més o menys a temperatura ambient i posar-la en refrigeració entre 5-8ºC. (Miralbés, 2000) Sal: La sal, clorur de sodi (NaCl), desenvolupa un paper molt important en l’elaboració del pa, actua com a regulador del procés fermentatiu i simultàniament millora la plasticitat de la massa, augmentant la capacitat d’hidratació de la farina i en conseqüència, el rendiment de la panificació. (Tejero, 1998) 14 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa 1.2 Residus en la industria del pa En las últimes dècades, els residus d’aliments s’han considerat un problema social, econòmic i ambiental greu. Els residus dels aliments no només representen una oportunitat perduda per mitigar els impactes ambientals, també per millorar la seguretat alimentaria mundial i l’ús dels recursos de les cadenes d’aliments. Agricultura i ramaderia de producció, poscollita, manipulació, emmagatzematge, processament, distribució i consum són les activitats que produeixen els residus al llarg de la cadena de subministra d’aliments. (Viganó, J et al.; 2015) Cada any es produeixen molta quantitat de residus derivats entre d’altres de la industria alimentaria. Els residus de pa formen part del bloc de residus d’indústries alimentaries, begudes i tabac que generen un 25,4% dels residus a Catalunya. La via de gestió principal dels residus de l’activitat industrial és la valorització (residu que rep un tractament i acaba tenint valor). Representa el 78,5 % de la gestió, si es té en compte tant la valorització en origen, la gestió de residus com a subproductes (residus que es poden reutilitzar sense rebre cap tractament), la valorització material externa i la valorització energètica. (www.residus.gencat.cat) A Catalunya, dins de les activitats industrials que més percentatge de residus valoritzen es troba la industria alimentaria que valoritza un 90,1% en relació a la seva generació. (www.residus.gencat.cat) Els residus que s’obtenen de l’elaboració del pa, segons la classificació pel codi europeu de residus (CER), pertanyen al grup 2 (residus de l’agricultura, horticultura, aqüicultura, silvicultura, caça o pesca, residus de la preparació i elaboració d’aliments) com es pot observar en la Taula 3. Introducció 15 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Taula 3. Classificació de residus segons el codi CER i quantitats que es generen a Catalunya Font: adecuada a partir de: <www.residus.gencat.cat> El pa, encara que és un aliment basic, també és un producte que genera molts residus ja que sinó es consumeix més o menys ràpid, passa a no ser apta pel seu consum . Actualment, gran part d’aquests residus es llençant a la brossa i acaben als abocadors, però , tenint en compte la seva composició és un residu potencialment valuós com a GRUP CER DESCRIPCIÓ DEL TIPUS DE RESIDU ESPECIALS (millers Tn) NO ESPECIALS (millers Tn) TOTAL GENERAL % 1 residus de la prospecció, extracció de mines i canteres i tractaments físics i químics de minerals 011 11 0,3 2 residus de l'agricultura, horticultura, aqüicultura, silvicultura, caça i pesca; residus de la preparació i elaboració d'aliments 0777 777 21,4 3 residus de la transformació de la fusta i de la producció de taulers i mobles, pasta de paper, paper i cartró 2219 221 6,21 4 residus de les indústries del cuir, de la pell i del tèxtil 1 34 35 1,0 5 residus de la refinació del petroli, purificació del gas natural i tractament pirolític del carbó 0 0 1 0,0 6 residus de processos químics inorgànics 12 57 69 1,9 7 residus de processos químics orgànics 186 90 276 7,6 8 residus de la fabricació, formulació, distribució i utilització (ffdu) de revestiments (pintures, vernissos i esmalts vitris), adhesius, segellants i tintes d'impressió 12 12 24 0,7 9 residus de la instústria fotogràfica 1 0 1 0,0 10 residus de processos tèrmics 40 460 499 13,8 11 residus del tractament químic de superfície i del recobriment de metalls i altres materials; residus de la hidrometal·lúrgica no fèrria 20 13 33 0,9 12 residus de l'emmotllament i tractament físic i mecànic de superfície de metalls i plàstics 8293 302 8,3 13 residus d¡olis i de combustibles líquids (excepte olis comestibles i els dels capitols 05, 12 i 19) 16 016 0,4 14 residus de dissolvents, refrigerants i propel·lents orgànics (excepte els capítols 07 i 0,8) 7 0 7 0,2 15 residus d'envasos; absorbents, draps de neteja; materials de filtració i roba de protecció no especificats en cap altra categoria 34 70 104 2,9 16 residus no especificats en cap altre capítol de la llista 22 42 64 1,8 17 residus de la construcció idemolició (inclosa la terra excavada de zones contaminades) 6265 270 7,4 18 residus de serveis mèdics o veterinaris o d'investigació associada (llevat dels residus de cuina i de restaurant no procedents directament de la prestació d'assistència sanitària) 21 122 0,6 19 residus de les instal·lacions per al tractament de residus, de les plantes externesde tractament d'aigües residuals i de la preparació d'aigua per a consum humà d'aigua per a ús industrial 456 60 1,7 20 residus municipals (residus domèstics i residus assimilables procedents dels comerços, indústries i institucions), incloses les fraccions recollides de manera selectiva. 3835 838 23,1 393 3.235 3.629 100 TOTAL 22 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa La concentració natural d’aquests enzims en els cereals panificables depèn en gran mesura de les condicions climatològiques durant les últimes fases del cultiu del blat. Si una vegada madurat el gra, s’exposa a un ambient humit, es produeix la germinació produint l’activació dels enzims amilacis que poden aparèixer en excés en la farina resultant de la mòlta d’aquest blat. Si per el contrari, la maduració i recol·lecció del blat es va realitzar en clima sec, el contingut d’enzims pot passar a ser insuficient. Per aquesta raó, per resoldre aquesta insuficiència enzimàtica, és necessari afegir-los a la farina o a la massa. (TecnoBakery S.L) 1.4.2 Tipus d’enzims A continuació es mostra una taula (Taula 4) on hi ha una classificació dels diferents enzims que es poden utilitzar en panificació: Taula 4. Enzims suggerits per la millora del pa i la farina (no exclusius) Font: <http://muehlenchemie.de> Introducció 23 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Amilases Les amilases són les responsables de trencar les cadenes de molècules de glucosa per obtindré sucres fermentables per els llevats, aquest procés s’anomena hidròlisis enzimàtica (Figura 9). Figura 9: Reacció general de la hidròlisi enzimàtica del midó per α-amilasa Font: Elaboració pròpia a partir de: <http://sisbib.unmsm.edu.pe> L’eficàcia d’aquest processos depèn de la temperatura i del grau d’hidratació del midó. El seu màxim s’aconsegueix quan es gelifica el midó, en els inicis de la cocció. Les amilases presents en la farina al inici de l’amasat comencen la seva activitat en el moment que s’afegeix l’aigua. El midó trencat durant la mòlta del gra de blat és més ràpidament hidratat, i per tant, més fàcilment atacable pels enzims. Aquests, actuen en acció combinada: l’α-amilasa va tallant les cadenes lineals en fraccions de menor longitud, anomenades dextrines, mentre que la β-amilases van tallant les cadenes en molècules de maltosa, formada per dos unitats de glucosa. El contingut en dextrines sembla tenir un efecte important en la capacitat de retenció d’aigua i en la consistència de la massa; si la farina procedeix de blat germinat es produeix una excessiva dextrinació i les masses resulten toves i enganxoses. (www.franciscotejero.com) Com el contingut en β-amilasa del blat és generalment suficient per l’activitat requerida en la fermentació, només es controla el contingut d’α-amilasa de les farines abans de la seva utilització. Per conèixer el nivell d’activitat α-amilasa s’utilitzen dos tècniques 24 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa d’anàlisi: el Número de caiguda (nivells normals entre 250-300 segons) i l’Amilograma, ( 400-600 U.B). (Tecnobakery S.L) Durant la fermentació, continua l’acció de les amilases, i en el moment d’introduir el pa al forn augmenta l’activitat fins el moment que la temperatura interna de la massa arriba als límits tèrmics d’activació. Depenent de la mida de les elaboracions així com de la temperatura del forn, després d’uns 10 minuts aproximadament, els enzims del llevat es desactiven i la cèl·lula mor. A mesura que augmenta la temperatura de la massa al forn , comença a produir-se la gelatinització i per tant, el midó s’infla i forma un gel més o menys rígid, en funció de la quantitat d’α-amilases presents, i del seu origen. (www.franciscotejero.com) Quan el contingut d’amilases, especialment d’α-amilasa, és correcte (Número de caiguda 250-300s, Amilograma: 400-600 U.B), s’obtenen bons resultats en la panificació, no només pel que fa al volum, sinó també en la seva conservació ja que la retrogradació del midó es produeix més lentament. (Tecnobakery S.L) La retrogradació del midó es produeix quan el midó deixa de ser soluble i precipita degut a que les cadenes lineals d’amilosa s’orienten paral·lelament i interaccionen entre si per ponts d’hidrogen que es formen a través dels hidroxils. D’aquesta manera es crea com una organització cristal·lina molt rígida, que requereix d’una alta energia perquè es trenquin i el midó gelatinitzi. (Álvarez, 2008) Hi ha diferents tipus d’amilases segons l’origen d’on provenen:  Amilasa d’origen fúngic: Es produeix per fermentació d’una soca del Aspergillus niger, i és la més utilitzada en la fabricació del pa, com alternativa a la farina de malta. Això es deu al fet, entre altres, de que la alfa-amilasa fúngica té una major tolerància a la sobre dosificació que la d’origen cereal, el qual es basa en la seva desactivació durant la primera fase de la cocció (60-65ºC). Per tant no existeix el risc de que es produeixi excés de dextrines, lo qual produiria molles enganxoses. (www.franciscotejero.com) L’activitat de les alfa-amilases d’origen fúngic comercials es mesura en dos unitats: Introducció 25 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech -FAU (Unidad Fungal Amilasa): Correspon a la quantitat d’enzim que descomposa 5,6g de midó soluble per hora, sota condicions estàndard: temps de reacció: (7-20 min), Temperatura (37ºC), pH: 4,7. (Ruiz et al.; 2015) -SKB (Sandstedt, Kneen & Blish) és la quantitat d’enzim que dextrinitza un gram de beta-dextrines d’un tamany definit en una hora (substrat al 2%).(García, 2004) La relació entre les FAU i les SKB, és: 1.000 FAU/g ≈ 10.000 SKB/g. Les amilases d’origen fúngic utilitzades en els forns tenen una activitat variada que va des de baixa activitat 2.500SKB/g fins a alta activitat 50.000 SKB/g.  La α-amilasa bacteriana: : Es produeix a partir de la bactèria Bacillus subtilis, i és molt resistent al calor per el que a temperatures de 70-90ºC arriba a la seva màxima velocitat de reacció. L’efecte secundari típic de l’amilasa bacteriana és una disminució de la viscositat de l’engrut del midó. (www.franciscotejero.com)  La α-amilasa d’origen cereal (farina de malta): S’utilitza deixant germinar el blat (o l’ordi) per tal que es mobilitzin les α-amilases naturals del gra, es moltura i es converteix en farina enzimàticament activa. Fins la dècada passada els millorants complets de panificació es formulaven amb aquest tipus d’amilases. Aquestes amilases s’activen a 75ºC, per tant són més resistent i si hi ha sobredosificació podríem ocasionar els mateixos problemes que quan tenim farina procedent de blat germinat.  La amiloglucosidasa: També anomenada glucoamilasa s’obté també d’un fong, l’Aspergillus rhizopus, i actua sobre les dextrines produint glucosa, el que es tradueix en una acceleració de la fermentació. 26 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa -AGU (unitat d’amiloglucosidasa): Es defineix com la quantitat que hidrolitza 1 micromol de maltosa per minut sota condicions estàndard: Temperatura (60º),pH (4.5, tampó acetat 0,1M), temps de reacció (30 min). (www.muehlenchemie.de) Pentosanases Aquest enzims (EC 3.2.1.8) actuen sobre els pentosans que són uns polisacàrids diferents al midó. Catalitzen els enllaços glicosídics β-1,4, de la cadena central de D-xiloses (Figura 10). En conseqüència d’aquesta reacció d’hidròlisis augmenta la absorció d’aigua en la massa, augmentant la tenacitat i disminuint lleugerament l’extensibilitat. Figura 10: Reacció catalitzada per l'enzim Pentosanasa, hidròlisis d'enllaços β-1,4 entre molècules de xilosa Font: (Esteffolani, 2010) Al mateix temps, aquests enzims retenen aigua durant la cocció, i posteriorment aquesta aigua pot ser subministrada gradualment al midó, el que permet mantindré més temps el pa tendre. L’aplicació de preparats enzimàtics amb pentosanases en el pa precuit han tingut un efecte positiu ja que fa que s’acceleri la formació de la molla, aconseguint una rapida fermesa en l’estructura, podent-se d’aquesta manera reduir el període de precocció. (Tecnobakery SL) Introducció 27 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Proteasas La utilització d’enzims proteolítics (Figura 11) en la fabricació del pa no és d’us corrent a España, i només es solen utilitzar quan les masses fermentades són molt fortes i tenaces o en masses batudes (magdalenes, pa de pessic i plum-cakes), degut a que les farines són fluixes i extensibles , en molts casos la farina ja és portadora d’aquest enzims provinents de l’atac de la xinxa del blat (Aelia spp i Eurogaster spp).(Salis, 2010) Figura 11: Acció de la proteasa sobre el gluten Font: <http://muehlenchemie.de> Lipoxigenases La farina de soja activa és el principal portador de l’enzim lipoxigenasa. En la fabricació del pa de motlle i del pa d’hamburgueses i, en general, en aquells pans que es vulgui potenciar la blancor de la molla està recomanat l’ús de entre 5 i 10g/kg de farina de soja activa. (Tecnobakery SL) L’efecte de la lipoxigenasa sobre l’àcid linoleic, és la formació de hidroperòxids que produeixen una oxidació acoblada de substancies lipòfiles, com els pigments carotenoides. Aquesta oxidació (Figura 12) succeeix durant l’etapa de l’amasat i dona lloc a una molla més tova i brillant, al mateix temps que augmenta el volum del pa i que el seu sabor és més insípid. (www.franciscotejero.com) 28 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Figura 12: Reacció de catalització de la lipoxigenasa Font: (Sanz, 1992) Aquest efecte oxidant es pot aconseguir amb una dosificació alta d’àcid ascòrbic però resultaria una massa tenaç difícil de mecanitzar, o bé ,amb l’addició de farina de soja activa sense modificar l’equilibri de la farina. Lactasa En la fabricació de pa de motlle i pa per hamburguesa, l’ús de llet en pols o sèrum potenciarà el color de la crosta, disminuint el temps de cocció i mantenint el màxim la humitat. La lactosa procedent de la llet pot ser hidrolitzada a glucosa i galactosa mitjançant la lactasa. Aquesta hidròlisis produeix un augment en la velocitat de fermentació (perquè augmenta el substrat) i contribueix a la coloració del pa. (Tejero, 1998) Afecta a la coloració del pa perquè els dos sucres que apareixen després d’actuar la lactasa són aldoses i per tant en combinació amb els grups amino de les proteïnes de la farina i temperatura elevada en el forn es dur a terme la reacció de Maillard, principal responsable del desenvolupament de l’aroma, color i sabor del pa. (Serpen, 2012) Glucosa-oxidasa Aquest enzim (ec.1.1.3.4), en presencia de l’aigua i oxigen, catalitza la oxidació de α-Dglucosa a α-D-gluconolactona i peròxid d’hidrogen (H2O2), tal com es mostra a la (Figura 13). (Steffolani, 2012) Introducció 29 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Figura 13: Reacció de glucosa oxidasa i efectes probables sobre els components de la massa Font: <http://muehlenchemie.de> Aquesta transformació afavoreix l’oxidació de les proteïnes, augmentant la tenacitat del gluten, i reduint la seva extensibilitat. El seu efecte és com el de l’àcid ascòrbic: incrementa la retenció de gas i augmenta el volum del pa. (Tecnobakery SL) 1.5 Enzims en el tractament de residus Gran part del material generat com a residus d’aliments contenen components que podrien ser utilitzats com a substrats i nutrients amb processos microbians i enzimàtics per donar lloc a productes de valor. La determinació dels components de residus biològics és un primer pas per la valorització. L’aplicació d’enzims en residus alimentaris és molt variada i es troba en diferents punts i per una gran varietat d’aplicacions, a continuació es mostren alguns exemples:  Millora de la producció de metà d’una barreja de residus alimentaris a conseqüència d’un pretractament enzimàtic  En aquest estudi es pretén millorar l’extracció de metà a partir d’una pasta de fongs. Realitzen un pretractament enzimàtic en aquesta pasta i aconsegueixen millorar la hidròlisis i l’obtenció de metà. (Uzkun, 2015) 30 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa  Enzims microbians per la bioconversió de residus d’aus de corral en productes de valor afegit  En aquest article s’explica la possible utilització d’enzims per hidrolitzar els subproductes d’origen animal (aus de corral) per generar pèptids bioactius, que són importants molècules que poden exercir efectes fisiològics interesants com per exemple antioxidants. Per tant, conclouen que hidrolitzar subproductes d’aus de corral mostra potencial per l’ús d’ingredients funcionals. Els enzims que es poden utilitzar són proteases, lipases i queratinasas per la bioconversió de les plomes. (Brandelli, 2015)  Hidròlisis enzimàtica en el tractament de residus del Umarí (Poraqueiba serícea Tulasne) i de la Yuca (Manihotesculenta Crantz) (Ruiz, R et al.2001) En aquest estudi s’explica com realitzen el tractament enzimàtic en residus rics en carbohidrats (98,95% sms) i entre altres factors, es quantifica la glucosa resultant. Els carbohidrats, són un bon substrat per els següents enzims utilitzats en l’estudi: -α-amilasa fúngica que hidrolitza els enllaços α 1,4-d-Glucano-hidrolasa. El nom comercial és Fungamyl 5000BG amb una activitat de 5000 FAU/g. De la hidròlisi s’obté Oligosacàrids de 5-7 unitats, com per exemple glucosa. -glucoamilasa que hidrolitza els enllaços glicosídics α-1,4 i α-1,6 de la amilosa i amilopectina separant unitats de glucosa a partir de l’extrem no reductor de la cadena. El nom comercial és AMG 300 L de Novo Nordisk i l’activitat declarada és de 300 AGU/ml. -cel·lulasa que hidrolitza els enllaços β-1,4 glucan de les cadenes de cel·lulosa i els seus productes de degradació són la glucosa, cel·lobiosa i polímers de la glucosa més grans. El nom comercial és Celluclast 1,5 L i la activitat declarada és de 700 EGU/g. Un cop realitzen la hidròlisi quantifiquen la glucosa a partir de hexoquinasa i glucosa-6-p-deshidrogenasa en equivalents de dextrosa (ED). Realitzen tres tractament un amb α-amilasa, l’altre afegint glucoamilasa i una altre amb la combinació d’aquestes tres. S’estudien diferents concentracions i temps, els millors resultats s’obtenen en la combinació dels tres (0,1% d’amilasa i glucoamilasa i un 1% de cel·lulasa). El temps que es determina com a òptim són 60 min. Objectius 31 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 2 Objectius L’objectiu principal d’aquest treball és aprofitar els residus de pa que es generen a les industries agroalimentàries mitjançant un tractament enzimàtic. Es pretén valoritzar el residu de pa obtenint glucosa apte per la seva utilització en la mateixa industria. Els objectius específics són: 1. Dissenyar un procediment per optimitzar la reacció d’α-amilasa fúngica, d’αamilasa bacteriana i de glucoamilasa. 2. Relacionar l’activitat enzimàtica amb la terbolesa produïda per la hidròlisi del pa. 3. Quantificar el rendiment de la reacció mesurant els mg de glucosa extrets per grams de pa hidrolitzat. 4. Optimitzar el procés escollint quins enzims són els més idonis, ajustant dosis, temps i temperatura. 5. Comprovar la possibilitat d’elaborar pa de motllo utilitzant per donar dolçor la glucosa recuperada de residus de pa sec. 38 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Taula 10: Composició i valors nutricional d'α-amilasa bacteriana (BAN 800 MG) Composició i valor nutricional Clorur de sodi 88 % (p/p) Alfa-amilasa (definida com la concentració enzimàtica (base de matèrica seca)) 10 %(p/p) Aigua 2%(p/p) ENERGIA 170 kJ/100g PROTEïNA 10 g/100g CENDRES 88 g/100g -Sodi (34.32 g/100g) HUMITAT 2 g/100g Font: Tecnobakery SL (Annex 5) Material i mètodes 39 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Corbes de l’activitat enzimàtica en funció del pH i la temperatura (Figura 16): Figura 16: Corbes de l'activitat enzimàtica en funció del pH i la temperatura de l’α-amilasa bacteriana (BAN 800 BG) Font: Tecnobakery SL (Annex 6) 40 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa  Glucoamilasa La glucoamilasa que s’utilitza en aquest estudi és proporcionada per la casa comercial Novoenzyms i s’anomena GoldCrust 3300 BG (Annex 7). L’activitat enzimàtica d’aquest producte és proporcionada per: glucoamilasa que hidrolitza els enllaços (1,4) i (1,6)-alfa-D-glicosídics en els extrems no reductors dels polisacàrids. Les característiques tècniques del producte són les següents: Enzim declarat: glucoamilasa (Glucano 1,4-alfa-glucosidasa) (nª CAS: 9032-08-0) Activitat Declarada: 3300 AGU/g L’Activitat d’amiloglucosidasa és mesura en unitats AGU (amiloglucosidasa unitats), en relació a un estàndard d’enzim d’una resistència a la declarada. Organisme de producció de l’enzim: Aspergillus Niger A la Taula 11 es mostra la composició i el valor nutricional de la glucoamilasa: Taula 11: Composició i valors nutricionals de la glucoamilasa (GOLDCRUST 3300 BG) Composició i valor nutricional Glucoamilasa (Glucano 1,4-alfaglucosidasa) 85 %(p/p) Farina de blat 11%(p/p) Aigua 4%(p/p) ENERGIA 1621 kJ/100g PROTEÏNA 86 g/100g CARBOHIDRAT 9 g/100g -Fibra (0 g/100g) HUMITAT 5 g/100g Font: Tecnobakery SL (Annex 7) Material i mètodes 41 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 3.2 Disseny experimental i paràmetres analitzats 3.2.1 Equips i material -Pa sec -Termomix -Tamisos: de 2,24 mm i 4,75µ -Agitador magnètic -Balança tèrmica o termobalança (MOC.63U) -Enzims: Amilasa fúngica (Pan Amy Conc), Amilasa bacteriana (Ban 800) , Glucoamilasa (Goldcrust 3300 BG) -Centrifuga -Espectrofotòmetre (Nicolet evolution 200 thermo electron corporation) -Reactius del Kit de extracció K-RSTAR 08/11 de Megazyme (acceptat per: AOAC 2002.02 i AAC 32-40.01): Reactiu tampó GOPOD i Solució estàndard de D-glucosa. -Bany amb aigua -Panificadores (AUTOBAKERY) -Ingredients per panificació: farina W-18, millorant, llevat sec, sal, mantega -Estufa -pH-metre 3.2.2 Disseny experimental Prova 1 .- Relació pa/aigua per realitzar la hidròlisis 42 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa En primer lloc es realitzen uns assajos (Figura 17) per veure el comportament del pa amb l’aigua i poder escollir les proporcions d’aigua i pa amb les que es continuarà treballant. Figura 17: Diagrama procedimental per obtenir la mescla optima (Font: elaboració pròpia) Nota : La velocitat que s’indica al procediment de Triturar és dels programes emprats en la Termomix ASSAIG 1 ASSAIG 2 PA SEC TRITURAR: V=3,5 T= 1min 50s TAMISAR: ɸ: 2,24 mm PART FINA PART GROSA PART GROSA TAMISAR: ɸ: 4,75 µ PART FINA PART GROSA MOSTRA 1 MOSTRA 2 TAMISAR: ɸ: 4,75 µ PESAR: 10 g de MOSTRA 1 80 ml AIGUA DESTIL·LADA PESAR: 10 g de MOSTRA 2 80 ml AIGUA DESTIL·LADA TRITURAR: V=9 T= 2 min PART FINA AGITAR: 900 rpm, T: 1h REREPOSAR: 5min Material i mètodes 43 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Tot i que al diagrama s’indica una observació després d’una hora d’agitació, paral·lelament es fa el mateix procediment amb unes mostres que s’han deixat agitant durant dues hores per observar si hi ha diferencies. En aquest procediment hi ha dues proporcions d’aigua i pa, però en els següents diagrames no s’indiquen aquestes proporcions per la impossibilitat de treballar al laboratori degut a que la mostra quedava massa espessa. Per això en els següents diagrames la quantitat de mostra es de 8-10g de pa i s’enrasa a 100 ml. Prova 2 .- Proves d’hidròlisis amb α-amilasa fúngica mitjançant la mesura de la terbolesa Per poder optimitzar el procés primer s’estudia el comportament de l’amilasa de diferents orígens (fúngica i bacteriana) per escollir quin dels dos ens dona millors resultats. D’acord amb els objectius es vol trobar la manera de relacionar l’activitat enzimàtica de l’α-amilasa fúngica amb la terbolesa (Figura18). 44 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Figura 18: Relació de l'activitat enzimàtica de l' α-amilasa fúngica amb la terbolesa Font: elaboració pròpia Aquest experiment es realitza a temperatura ambient durant 4 hores a diferents quantitats de la dilució d’amilasa fúngica (1g amilasa fúngica/200ml aigua). Només es realitza una repetició ja que els resultats que s’obtenien no ens conduïen al que buscàvem inicialment, no s’observava cap relació determinant entre la terbolesa de la mescla d’aigua i pa amb l’activitat de l’enzim. En els següents diagrames comencem a utilitzar altres quantitats de dilució d’enzim a diferents temperatures tenint en compte les corbes de temperatura dels enzims. ASSAIG 0 ASSAIG ½ ASSAIG 1 MOSTRA DE PA AMILASA FUNGICA Dilució: 1g amilasa/200ml H2O Afegir: 0.2 ml d’amilasa fúngica Afegir: 0.4 ml d’amilasa fúngica Agafar una mostra: t=1,2,3,4 h Agafar una mostra: t=1,4 h Agafar una mostra: t=1,2,3,4 h Pesar: 10g en un erlenmeyer 10g en un erlenmeyer Enrasar fins a 100ml Agitar: Tª ambient, t= 4h Centrifugar: 500rpm t=5 min Agafar: una mostra del sobrenedant Lectura al espectrofotòmetre: Absorbància (λ=400-800nm) Material i mètodes 45 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Prova 3 .- Proves d’hidròlisis amb α-amilasa fúngica mitjançant la mesura de la pèrdua de pes Degut a la impossibilitat de relacionar els resultats obtinguts amb l’activitat enzimàtica, s’intenta fer la relació amb la pèrdua de pes (Figura 19 i 20). Figura 19: Relació de l'activitat enzimàtica de l' α-amilasa fúngica amb la pèrdua de pes del pa Font: elaboració pròpia Tª AMBIENT Tª 40ºC Tª 50ºC MOSTRA DE PA AMILASA FÚNGICA Dilució: 1g amilasa/200ml H2O Afegir: 0, 0.2, 0,4 y 20 ml d’amilasa fúngica Pesar: 10g en un vas de precipitats 10g en un erlenmeyer Enrasar fins a 100ml Agitar: Tª ambient t= 1,2,3,4 h Pesar el paper de filtre i filtrar Assecar: a l’estufa a Tª 60ºC fins a pes constant Pesar: (pa+paper) Agitar en el bany: Tª 40ºC t= 1,2,3,4 h Agitar en el bany: Tª 50ºC t= 1,2,3,4 h Mesurar el pH 46 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa L’experiment es dur a terme a diferents temperatures i diferents quantitats de dilució d’enzim tal i com s’indica a la figura 19 per trobar la millor combinació. D’aquest procediment es realitzen tres repeticions en les proves a temperatura ambient i dos repeticions en les proves a 40 i 50 ºC. No es realitzen més repeticions perquè els resultats no són representatius. El pH es mesura amb la mostra que conté la màxima quantitat d’enzim (20ml) i la mínima (0ml), com que no hi ha diferencies, en els pròxims procediments no es torna a mesurar. Figura 20: Imatges dels diferents moments del procés de la relació de l'activitat enzimàtica de l'α-amilasa fúngica amb la pèrdua de pes del pa Font: (elaboració pròpia) Nota :A/:Moment en que s’afegeixen els enzims a la mescla (prova a temperatura ambient). B/filtració de la mostra. C/Paper de filtre després de la estufa. Prova 4 .- Proves d’hidròlisis amb α-amilasa bacteriana mitjançant la mesura colorimètrica de la glucosa formada Malgrat les evidencies visuals que ens indiquen que hi ha diferencies d’activitat enzimàtica els resultats no són representatius, per tant es realitza la quantificació de glucosa obtinguda després de la hidròlisis d’α-amilasa bacteriana (Figura 21). . Material i mètodes 47 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Figura 21: Obtenció de glucosa amb l'αamilasa bacteriana Font: (elaboració pròpia) D’aquesta prova es realitzen 3 repeticions per cada mostra amb les diferents quantitats d’enzim i temps. Tot i que els resultats de la prova anterior no són molt significatius en les diferencies de temperatura de 40-50ºC, es decideix fixar la temperatura a 50ºC perquè si observem la MOSTRA DE PA AMILASA BACTERIANA Dilució: 1g amilasa/200ml H2O Afegir: 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.4 i 2 ml d’amilasa bacteriana Pesar: 8-10g en un vas de precipitats 10g en un erlenmeyer Enrasar fins a 100ml Preparació de la mostra per la determinació de glucosa: ·Blanco 0,1 ml aigua destil·lada + 3ml GODP ·Patró 0,1 ml glucosa (1 mg/ml) + 3ml GODP ·Mostra (sobrenedant) 0,1 ml + 3ml GODP Agitar en el bany: Tª 50ºC , t= 1,2,3 h Agafar: una mostra del sobrenedant Lectura a l’espectrofotòmetre: Absorbància (λ=510 nm) Incubació: T= 50ºC, t= 20 min Refredar: T ambient, t≈25min Centrifugar: 500 rpm, t=5 min 54 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Resultats i disussions 55 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 4 Resultats i discussions 4.1 Obtenció de la mescla òptima pa/aigua i mida de partícula La diferencia entre les dues probes com ja ha quedat especificat és la utilització de diferents tamisos, diferents velocitats i temps. El resultats que s’observen són: A la Assaig 1 durant el procediment es veu que la mostra no és homogènia i es descarta molta mostra. El problema que presenta aquest procediment és que la velocitat i el temps de trituració han estat insuficient ja que el resultat és una mostra poc homogènia i al tamisar-la perdríem part important del pa. Això faria que les proves no fossin representatives ni extrapolables a la mostra inicial (pa sec). A la Assaig 2 la mostra és més homogènia però en canvi hi ha molta diferencia en el color després de tamisar amb el tamís petit, la part que passa pel tamís petit és més blanca i l’altre marró fosc. Aquesta diferencia de color es deu a que la molla és més clara que la crosta i més fàcil de triturar, per tant, a la part més fina hi ha més proporció de molla que no pas de crosta, això faria que tinguéssim un resultat poc representatiu del que seria el pa sencer sec. A la mescla final es comprova l’efecte del temps . A diferents temps, visualment no hi ha diferencies entre el producte obtingut , sempre tenen la mateixa aparença tant les mostres obtingudes de la prova 1 com les obtingudes de la 2. Que no hi hagi diferència, ens indica que la mescla pràcticament no varia si només hi ha aigua (no enzims). El pa comença a solubilitzar el midó soluble de la mostra i es començar a hidrolitzar (sense presencia d’enzims) però a temperatura ambient aquesta hidròlisi és molt baixa. Per tant, a l’hora d’escollir la mescla òptima per continuar l’estudi es va observar que només es podia fer el procediment amb una relació de mescla de 20/80 (p/v) pa/aigua. A l’augmentar la proporció de pa no es podia agitar. Tot i que aquest procediment es va fer amb aquesta combinació, més endavant es va haver de variar la proporció d’aigua i pa perquè no es podia treballar bé al laboratori. El motiu de que no es pogués treballar va ser que la mescla era massa espessa i no es podia agitar correctament. 56 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Segons els resultats obtinguts, la millor manera de triturar el producte és amb la velocitat i temps de la prova 2 però utilitzant el tamís de 2.24mm de pas de llum. 4.2 Relació de l’activitat enzimàtica de l’alfa-amilasa fúngica amb la terbolesa Per visualitzar els resultats es mostren els gràfics amb l’evolució de cada assaig durant les quatre hores i uns gràfics comparatius on es mostren a la primera hora i a la quarta els diferents assajos. Els següents gràfics ens mostren com evoluciona el valor de l’absorbància de les diferents quantitats d’enzim segons la terbolesa del sobrenedant de la mostra: Figura 25: Gràfic de l'evolució de l'absorbància (terbolesa en funció del temps i la quantitat d'enzim (Assaig 0) Aquest gràfic ens mostra com varia l’absorbància d’una mescla que només conté pa i aigua. Es va realitzar per tenir-la de referència quan s’afegia l’enzim. Es pot comprovar en el gràfic (Figura 25) que no hi ha relació ja que després d’una hora presenta absorbàncies més baixes, però en canvi les absorbàncies més elevades es detecten a la segona hora. Per tant, no s’observa que a la tercera hora i a la quarta hi hagi més hidròlisi que en les altres. 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 Aλ λ(nm) Assaig 0 HORA 1 HORA 2 HORA 3 HORA 4 Resultats i disussions 57 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Figura 26: Gràfic de l'evolució de l'absorbància (terbolesa) en funció del temps i la concentració d'enzim (Assaig 1/2) En el gràfic anterior es mostra l’absorbància ja amb l’addició d’enzim i són molt similars els resultats obtinguts en la primera hora (rang Aλ: 2-1,7) que els obtinguts en la quarta (rang Aλ: 2,1-1,4). L’únic diferent que presenta el gràfic és que en un rang d’absorbància entre λ=450-500 nm es reverteixen els resultats ja que en longituds d’ona inferiors l’absorbància a les quatre hores (rang Aλ: 2-1,9) és lleugerament superior a la primera hora (rang Aλ: 1,9-1,9) i a longituds d’ona superiors passa al revés. 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 Aλ λ(nm Assaig 1/2 HORA 1 HORA 4 58 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Figura 27: Gràfic de l'evolució de l'absorbància (terbolesa) en funció del temps i la concentració d'enzim (Assaig 1) El gràfic anterior (Figura 27) mostra les absorbàncies a les diferents hores a una quantitat d’enzims més elevada (0.4ml de la dilució) que els anteriors (0ml i 0.2ml). Com es pot observar les línies que representen les hores apareixen molt més juntes que en els gràfics anteriors. Això demostra que les absorbàncies són molt similars en les diferents hores i en conjunt lleugerament superiors que amb menys quantitat d’enzim (Figura 26). En el gràfic de l’assaig 0, mostra sense enzim (Figura 26) només a la quarta hora i la segona hora els valors superen Aλ: 1,4, en canvi en els gràfics on hi ha enzims (Figura 27 i 28) aquest valors són en general més elevats. En els següents gràfics es mostra a la primera hora i a la quarta hora com es trobava el valor de l’absorbància de cada un dels assajos: 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 Aλ λ(nm Assaig 1 HORA 1 HORA 2 HORA 3 HORA 4 Resultats i disussions 59 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Figura 28: Gràfics comparatius de l'evolució de l'absorbància (terbolesa) en funció del temps i amb diferents quantitats d'enzim Igual que s’havia observat en els gràfics anteriors sembla que en quatre hores les absorbàncies siguin més similars que inicialment, és a dir, les línies del gràfic mostren que a les diferents quantitats d’enzim (Assaig 0, Assaig 1/2 i Assaig 1) segueixen la mateixa tendència i estan més juntes (Figura 9,Temps 4h). En els dos gràfics anteriors (Figura 28, Temps 1 h i temps 2h) es veu com l’assaig amb la quantitat mitja d’enzim (Assaig ½, 0,2 ml d’α-amilasa fúngica) tant a la primera hora com a la quarta mostra les absorbàncies més elevades. En canvi, la mostra que no conté enzim es torna més tèrbola amb el temps a diferència de la mostra amb més quantitat d’enzim (Assaig 1, 0,4 ml 60 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa d’α-amilasa fúngica) que pràcticament es manté amb els mateixos valors d’absorbància (Assaig 1, 1h rang Aλ: 2-1,5 i Assaig 1, 4h rang Aλ: 2-1,4) D’aquesta prova per tant, no es poden treure unes conclusions clares. Inicialment esperàvem alguna de les següents opcions: -l’absorbància fos menor perquè el midó del pa amb l’acció dels enzims s’hagués trencat tant que gran quantitat dels sucres s’haguessin dissolts (glucosa, maltosa...) -L’absorbància fos superior perquè l’enzim hagués tallat les cadenes de midó del pa però sense arribar a generar tots els sucres i per tant que les partícules fossin de baix pes molecular. Figura 29: Mostra centrifugada després del tractament enzimàtic En la imatge superior (Figura 29) es pot observar el que comentàvem, en la segona hora a la quantitat d’enzim superior (Assaig 1, 0,4 ml d’enzim) un cop centrifugada la mostra quedava part del pa a la part superior indicant-nos que aquestes partícules tenen un pes molecular més petit però no han arribat a hidrolitzar-se completament. Resultats i disussions 61 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 4.3 Relació de l’activitat enzimàtica amb la pèrdua de pes del pa Els resultats de la reducció de pes (%) són: -Temperatura ambient (18-23ºC) Taula 12: Reducció del pes del pa (%) a Temperatura ambient A la taula anterior (Taula 12) s’indiquen les mitjanes obtingudes de les repeticions i la desviació típica, com es pot observar algunes desviacions són bastant altes (S= 27,653). Tot i així, els resultats ens indiquen que certament hi ha una relació entre la pèrdua de pes del pa amb la concentració d’enzim ja que els valors de les mostres amb 20ml d’enzim de la dilució d’α-amilasa fúngica (1g/100ml) són més elevats en tots els casos que els anteriors. Pel que s’observa en els resultats (Taula 12) amb el pas del temps no sempre va augmentant però si que tots els valors, pel que fa a la reducció en %, en la quarta hora són superiors a la primera hora. En canvi, entre la segona hora i la tercera a vegades els resultats (Taula 12) es troben invertits. Amb aquest resultats (Taula 12) pensem que si estabilitzem la temperatura a la qual treballa l’enzim, també els resultats s’han d’estabilitzar i per tant es procedeix a realitzar el mateix experiment però amb temperatures fixes. 62 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa -Temperatura 40ºC Taula 13: Reducció del pes del pa (%) a Temperatura 40ºC Observant els resultats (Taula 13) a una temperatura fixada de 40ºC les desviacions són molt més baixes que en els resultats obtinguts a Temperatura ambient (Taula 12), per tant, podríem dir que respecte a les dades anteriors (Taula 14) els resultats són més fiables. D’altra banda, s’observa que de la primera hora a la quarta l’augment no és tant pronunciat com en els resultats obtinguts a temperatura ambient. A més quantitat d’enzim (20ml de la dilució d’’α-amilasa fúngica) la diferencia entre la primera hora (x=57,035% on S=1,101) i la quarta hora (x=62,729% on S=3,200) pràcticament és inexistent, això podria ser perquè la mescla esta saturada. És a dir, hi ha tanta quantitat d’enzim que la reacció es satura. -Temperatura 50ºC Taula 14:Reducció del pes del pa (%) a Temperatura 50ºC Resultats i disussions 63 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Aquesta taula de resultats (Taula 16) amb una temperatura més elevada (50ºC) tampoc mostra unes desviacions molt elevades per tant es confirma la hipòtesis dels resultats a temperatura ambient (18-23ºC). Els resultats amb les quantitats de 0,2ml i 0,4ml l’α-amilasa fúngica d’aquesta assaig, no mostren moltes diferencies i l’augment amb el pas del temps tampoc, són pràcticament iguals (a 0.2ml rang de % entre 43,812-53,336% i a 0,4ml rang de % entre 37,388-54,443%). Això potser perquè la reacció s’ha saturat. Si comparem els resultats obtinguts de l’assaig amb 20ml de dilució d’enzim (1g d’αamilasa fúngica/200ml aigua) de la Taula 14 amb els obtinguts a l’assaig anterior (40ºC, Taula 13) es veu que aquest són pràcticament iguals, però en canvi, en els assajos amb 0,2ml i 0,4ml de la dilució d’α-amilasa fúngica si que varia essent els percentatges més elevats a 50ºC (1h,0,2ml=28,921% (40ºC) i 43.812% (50ºC)). Aquests resultats ens estan indicant que amb 20 ml (dilució d’enzim) la quantitat és molt elevada i per tant la mescla es satura, quasi tot l’enzim reacciona en poc temps. D’altra banda, quan la quantitat d’enzim és baixa s’observa que l’enzim reacciona millor a 50ºC. D’aquesta prova per tant les conclusions que es treuen es que amb la temperatura fixa, l’activitat de l’enzim és més regular i que a una temperatura de 50ºC l’amilasa bacteriana treballa millor. Aquest resultats coincideixen amb els gràfics de l’activitat enzimàtica en relació a la temperatura que ens facilita el fabricant (Annex 6). Aquest procediment però, es va deixar de realitzar perquè durant el temps que la mostra estava a l’estufa hi havia creixement de fongs. Si sumem això al fet que les quantitats de pa eren molt baixes podíem estar acumulant errors. En aquest procediment a part de la diferencia de pes també es va mesurar el pH, els resultats són: -Mostra amb 0 ml de dissolució: 5.85 -Mostra amb 20 ml de dissolució: 5.86 Els resultats ens indiquen que el pH no varia de la mostra sense enzim a la mostra amb més quantitat d’enzim (20ml de la dilució d’α-amilasa fúngica). 70 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa Conclusions 71 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 5 Conclusions Les industries alimentaries poden aprofitar els residus de pa valoritzant-los mitjançant tractaments enzimàtics i produint productes per a matèria prima d’altres processos de panificació. En concret, es pot extreure glucosa mitjançant amilasa i glucoamilasa. D’altra banda, aquests enzims són assequibles pels industrials ja que són típicament utilitzats en processos de panificació com a coadjuvants tecnològics. Responent als objectius del treball: 1. Es conclou que el mètode de la terbolesa no serveix per mesurar la hidròlisi enzimàtica produïda en els residus de pa sec. 2. Mitjançant el mètode colorimètric (Kit de extracció K-RSTAR 08/11 de Magazyme) descrit a materials i mètodes i estabilitzant la temperatura (T=50ºC) s’han pogut quantificar els mg de glucosa que s’han extret després de la hidròlisis enzimàtica mitjançant α-amilasa bacteriana (800KNU-B/g) i glucoamilasa (3300BG). Aquest procediment ens ha permès relacionar aquest resultats (Figura 30 i 31) amb el rendiment d’aquests enzims, optimitzant el procés i obtenint com a màxim rendiment 175,49 mg de glucosa per cada gram de pa. 3. S’ha aconseguit optimitzar els procediments per extreure en el menor temps i menor concentració la major quantitat de glucosa per gram de pa (175,49 mg glucosa/g pa). Les condicions òptimes han estat afegir 1ml d’amilasa bacteriana (dilució: 1g amilasa bacteriana(800KNU-B/g)/200ml aigua) i 2 ml de glucoamilasa (dilució: 1g glucoamilasa(3300BG)/200ml aigua) a una temperatura de 50 ºC durant 60 min. 4. S’ha comprovat que hi ha possibilitat d’elaborar pa de motllo mitjançant glucosa extreta del tractament enzimàtic dels residus de pa. 5. Per elaborar el pa i que sigui acceptable tecnològicament cal aturar l’activitat enzimàtica present en l’extracte ric en glucosa, si no es realitza, els resultats que s’obtenen en l’elaboració del pa no són acceptables (no es recupera la molla, 72 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa presenta excés de fermentació i per tant alvèols grans i poc regulars). Es pot bullir l’extracte ric en glucosa com a mètode d’inactivació d’enzims. 6. El pa elaborat amb l’extracte ric en glucosa bullit, ha presentat bones condicions pel que fa a la regularitat de la crosta i dels alvèols (ben repartits). La recuperació de la molla és correcte, el color una mica més fosc i l’olor lleugerament àcida. Amb aquestes característiques es podria arribar a comercialitzar. Referències bibliogràfiques 73 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 6 Referències bibliogràfiques ÁLVAREZ, I (2008). ¿Porque endurece el pan? CTA Magazines. <http://www.catedu.es/ctamagazine/index.php?option=com_content&view=artic le&id=567&catid=55:curiosidades>[Consulta: 8 de setembre de 2015] APAZA, V., i LUIS, S (Data desconeguda). Selección y evaluciación de bacterias del genero Bacillus productores de amilasa en cultivo sumergido. Tesis digitales UNMSM (Universidad Nacional Mayor de San Marcos) <http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/salud/vargas_as/antec_fund_cie ntif.pdf> [Consulta:23 de setembre de 015] BARRIGA, X (2003). Panaderia Artesana, Tecnologia y producción. (Barcelona).Montagut Editores, S.A. BRANDELLI, A., SALA, L., i JULIANO, S (2015). Microbial enzymes for bioconversion of poultry waste into added-value product. Food Research International. Elseiver. Vol 73 (2015), p. 3-12. CEOPAN. Historia del pan. <http://www.ceopan.es/index.php?type=public&zone=smartportalcategorias& action=view&categoryID=295&codeID=295> [Consulta: 18 d’Agost de 2015] CEOPAN. Evolución del consumo del pan en España (1964-2009). <http://www.ceopan.es/index.php?type=public&zone=items&action=view&cat egoryID=291&codeID=489>[Consulta: 18 d’Agost de 2015] MAGRAMA.(2013) Consumo de pan en hogares espanyoles. <http://www.magrama.gob.es/es/prensa/13.08.14%20consumo%20pan%20en% 20hogares%20espa%C3%B1oles_tcm7-291994_noticia.pdf >[Consulta: 11 de Septembre 2015]. 74 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa MÜHLENCHEMIE. Las mejores amigas de las harinas. Las pequeñas ayudantes de los fabricantes de harinas. < http://muehlenchemie.de/downloadsexpertenwissen/mc-enzyme-popper-esp.pdf> [Consulta: 15 d’Agost 2015] FRANCISCO TEJERO. Las enzimas en la panificación. <http://www.franciscotejero.com/webft/pdf/tecnicas/Los%20enzimas%20en% 20la%20panificacion.pdf> [Consulta: 15 de Novembre 2014] GARCÍA, G., QUINTERO, Q i LÓPEZ, L (2004). Biotecnologia alimentaria. Limusa, S.A de C.C. Grupo Noriega editores. Vol. 121, p.p. GENCAT (2013). La gestió dels residus de les industries. <http://residus.gencat.cat/web/.content/home/consultes_i_tramits__nou/estadistiques/estadistiques_de_residus_industrials/La-gestio-dels-residusde-les-industries-2013.pdf>[Consulta: 10 de Septembre 2015]. KOSSEVA, M (2013). Assessment and Recuperation of Commodities. Food Industry Waste. Capitulo3, 37-69. MIRALBÉS, C (2000). Enzimas en panadería. Montagut Editores S.A. MOREIRAS, O. et al. (2006). Tablas de composición de alimentos. Madrid: Ediciones Piramide. RUÍZ, R i ÀZQUEZ, J (2001). Hidrolisis enzimática de desechos del Umari (Poraqueiba sericea Tulasne) y de yuca (Manihotesculenta Crantz) . Revista Amazónica de Investigación Alimentaria. vol. 1, nº 1, p. 22-9. SALIS, L., GOULA. M., VALERO, J., & GORDÚN. E. (2010). Prolamin proteins alteration in durum wheat by species of the genus Eurygaster and Aelia (insecta, Hemiptera). Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Spanish Journal of Agricultural Research, Vol. 2010 8 (1), 82-90. Referències bibliogràfiques 75 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech SANZ, L., PÉREZ, A., i OLÍAS, J (1992). La lopixigenasa en el reino vegetal. I. Propiedades. Instituto de la Grasa y sus Derivados (Sevilla). Vol. 43 Fasc. 4 (1992), <file:///C:/Users/KX125/Downloads/1157-1161-1-PB.pdf> [Consultat: 23 de Septembre] SARKHEIL, H., i RAHBARI, S (2015). Fractal geometry analysis of chemical structure of natural starch modification as a green biopolymeric product. Arabian Journal of Chemistry. Elseiver. SERPEN, A., GÖKMEN, B., i MOGOL, B.M (2012). Effects of different grain mixtures on Maillard reaction products and total antioxidant capacities of breads. Journal of Food Composition and Analysis. ELSEIVER, Vol 26 (1-2), p. 160-168. STEFFOLANI, M.(2012). Efecto de las enzimas pentosanasa, glucosa oxidasa y transglutaminasa en productos de panificación. Traball de Tesis Doctoral. La Plata: Universidad Nacional de La Plata <http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2638/Documento_completo_e n_baja_resoluci%C3%83%C2%B3n.pdf?sequence=3>[Consultat: 20 de Septembre] TEJERO, F (1998). El pan precocido. (Barcelona). Ed. Montagud. 6 pp TENA, M., i JORRIN, J (data desconeguda). Estudio cinético de la actividad invertasa de la levadura de panadería. Departarmento de Bioquímica i Biologia Molecular de la UCO. <www.uco.es/dptos/bioquimica.../32%20INVERTASA%20CINÉTICA.pdf> [Consulta: 15 d’Agost de 2015]. 76 Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa UCO. Anejo I. Materias Primas. <http://www.uco.es/dptos/bromatologia/tecnologia/bibvirtual/bajada/mempan.pd f>[Consulta: 10 de Septembre 2015]. UNAD. Proceso de panificación. <http://datateca.unad.edu.co/contenidos/232016/contLinea/leccin_22_proces o_de_panificacin.html>[Consulta: 11 de Septembre 2015] UZKUN, E., TRZCINSKI, A., i LIU, Y (2015). Enhacing the hydrolysis and methane production potential of mixed food waste by an effective enzymatic pretreatent. Bioresource Technology. Elseiver, Vol 183 (2015), p. 47-52. VAZQUEZ, E (2003). Equación de Michaelis-Menten. <http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/ecuacion%20de%20michaeli s.html>[Consulta: 20 de Setembre 2015] VIGANÓ, J., DA FONSECA, M i MARTÍNEZ, J (2015).Sub-and supercritical fluid Technology applied to food waste processin a The Journal of Supercritical fluids. Elseiver, vol. 96, 272-286. A n n e x o s 77 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Annexos Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech VI Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa A n n e x o s VII Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Annex 2:Fitxa tècnica del llevat sec VIII Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa A n n e x o s IX Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Annex 3: Control de producció del millorant E X Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa A n n e x o s XI Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech XII Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa A n n e x o s XIII Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Annex 4: Fitxa tècnica de l’α-amilasa fúngica (Pan Amy Conc) XIV Aprofitament dels residus de pa per l’obtenció de glucosa A n n e x o s XV Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Annex 5: Fitxa tècnica de l’α-amilasa bacteriana (BAN 800 MG)