Preparación y caracterización de hidroxipatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis

Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 1 RESUMEN Es bien conocido que la hidroxiapatita puede incorporar diversos tipos de substituciones iónicas, con los cambios subsecuentes en sus parámetros estructurales y características fisicoquímicas. En estudios anteriores se ha presentado la mecanosíntesis como un nuevo método para obtener cristales nanométricos de hidroxiapatita con un buen control de la estequiometría. Aún más, esta técnica permite la incorporación de diversos iones en la estructura apatítica. Tres formulaciones fueron realizadas en un molino planetario de bolas (Fritsch). Primero, para obtener una hidroxiapatita deficiente en calcio (CDHA), segundo una hidroxiapatita substituida con silicio (Si-HA) y tercero una hidroxiapatita deficiente en calcio substituida por silicio (Si- CDHA) con 2 silicatos de calcio diferentes. Para hacer estas reacciones, los reactivos siguientes fueron utilizados: fosfato dicálcico dihidratada (DCPD), óxido de calcio (CaO) y silicato de calcio (CSH amorfo o CaSiO3 comercial). Estos fueron molidos a una velocidad de 350 rpm y la masa molida total era 40 gramos para cada reacción. Los productos obtenidos en cada una de las reacciones realizadas se estudiaron por espectroscopía de infrarojos y difracción de rayos X para distintos tiempos de molido intermedios, a fin de estudiar la evolución de la reacción con el tiempo de molido. De dichos análisis se concluye que la introducción de iones silicio en la estructura apatítica aumenta su cristalinidad y su estabilidad a altas temperaturas, además de verse reflejada en la aparición de bandas adicionales en los espectros de infrarojos. Dichos espectros de infrarojos mostraron que las hidroxiapatitas substituidas con silicio sintetizadas contenían además iones carbonato según sustituciones de tipo A, B o AB. Cabe destacar, que en el caso de la síntesis de hidroxiapatita deficiente en calcio sin introducción de iones silicio, se observa la transformación de dicha hidroxiapatita a fosfato tricálcico β para tiempos largos de molido. La morfología de las hidroxiapatitas sintetizadas se estdió mediante microscopía electrónica de barrido ambiental, poniendo de manifiesto el tamaño nanométrico de los cristales de hidroxiaptita tanto para la hidroxiapatita deficiente en calcio sin substitución de iones silicio com en el caso de contener iones silicio. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 2 Los dos silicatos de calcio utilizados en el estudio se analizaron mediante difracción de rayos X, espectroscopía de infrarojos y granulometría, para poder determinar la influencia de su utilización como fuentes de silicio en las reacciones de síntesis de hidroxiapatitas substituidas con silicio. Esta comparación se hizo necesaria ya que los resultados de espectroscopía de infrarojos mostraron diferencias según el silicato de calcio utilizado. Finalmente, se realizó un estudio de la contaminación de ágata proveniente del tarro y las bolas del molino. Debido a que el molino utilizado es de ágata con un 99.9%de SiO2 y muy poca cantidad de otras impurezas, se espera que esta contaminación no tenga un efecto excesivamente negativo en las propiedades biológicas de los fosfatos de calcio sintetizados. Del estudio realizado se concluye la posibilidad de sintetizar hidroxiaptita deficiente en calcio y fosfato tricálcico β nanométricos a partir de mecanosíntesis. Permitiéndose además la introducción de iones silicio y carbonato en su estructura. Por todo ello, la mecanosíntesis es una técnica que permite sintetizar hidroxiapatitas con grandes propiedades para una potencial bioactividad, como son el contenido de sustituciones iónicas de silicio y carbonato, así como el tamaño nanométrico de sus cristales. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 3 INDICE RESUMEN ___________________________________________________1 INDICE_____________________________________________________ 3 1. PREFACIO_________________________________________________5 1.1 ORIGEN DEL PROYECTO............................................................................... 5 1.2 OBJETIVOS DEL PROYECTO......................................................................... 6 1.3 ALCANCE DEL PROYECTO............................................................................ 7 2. FUNDAMENTOS TEORICOS __________________________________8 2.1 EL HUESO......................................................................................................... 8 2.2 BIOMATERIALES ........................................................................................... 10 2.3 BIOCERÁMICAS............................................................................................. 11 2.4 FOSFATOS DE CALCIO ................................................................................ 13 2.5 HIDROXIAPATITA .......................................................................................... 13 2.5.1 Introducción............................................................................................... 13 2.5.2 Interés de la hidroxiapatita sintética.......................................................... 14 2.6 MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE LA HA ....................................................... 15 2.6.1 Precipitación de HA a baja temperatura................................................... 15 2.6.2 Sinterización en estado sólido .................................................................. 15 2.6.3 La mecanosíntesis .................................................................................... 16 3. MATERIALES Y METODOS __________________________________19 3.1 REACCIONES POR MECANOSÍNTESIS...................................................... 19 3.1.1 PROCESO DE MOLIDO........................................................................... 19 3.1.2 PRODUCTOS SINTETIZADOS ............................................................... 21 3.2 CARACTERIZACIÓN DE LAS MUESTRAS.................................................. 25 3.2.1 DIFRACCIÓN DE RAYOS X .................................................................... 26 3.2.2 INFRARROJOS ........................................................................................ 27 3.2.3 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARIDO AMBIENTAL.................. 28 3.3 ESTUDIO DE LA CONTAMINACIÓN ............................................................ 28 Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 4 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN _________________________________30 4.1 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE MOLIDO .......................................... 30 4.2 CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO POR DRX .................................. 31 4.2.1 Hidroxiapatita deficiente en calcio ......................................................... 31 4.2.2 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio amorfo ......... 33 4.2.3 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida por silicio comercial ...... 35 4.2.4 Hidroxiapatita substituida con silicio ...................................................... 37 4.2.5 Reactivos utilizados como fuentes de silicio.......................................... 37 4.3 CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL PRODUCTO POR FTIR.... 39 4.3.1 Reactivos utilizados................................................................................. 39 4.3.2 Hidroxiapatita deficiente en calcio.......................................................... 41 4.3.3 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio amorfo .......... 46 4.3.4 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio comercial ...... 51 4.4 CARACTERIZACIÓN DE LA SUPERFICIE DEL PRODUCTO POR SEM.. 53 4.4.1 Hidroxiapatita deficiente en calcio.......................................................... 53 4.4.2 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio amorfo ......... 54 4.4.3 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio comercial ..... 54 4.5 GRANULOMETRIA......................................................................................... 56 4.6 ESTUDIO DE LA CONTAMINACIÓN ............................................................ 57 ANEXOS ____________________________________________________ 65 PRESUPUESTO ______________________________________________65 TECNICAS DE CARACTERIZACIÓN EMPLEADAS _________________66 Diffracción de rayos X.......................................................................................... 66 Infrarrojos............................................................................................................... 68 Microscopia electronica por barrido ambiental ................................................ 68 Centrifugacion diferencial ................................................................................... 70 Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 5 1. PREFACIO 1.1 ORIGEN DEL PROYECTO La búsqueda de materiales que puedan sustituir y añadirse a las diferentes partes del cuerpo humano parece hoy en día imprescindible en el objetivo de ofrecer una mejor calidad de vida a personas que sufren ciertos padecimientos crónicos sin solución medica. El desarrollo de nuevos materiales y sistemas utilizados en Medicina fue vertiginoso pero ha permitido que hoy se puedan reemplazar numerosos órganos y tejidos con resultados satisfactorios. Efectivamente, hoy más de cincuenta millones de personas en todo el mundo tienen implantado algún tipo de prótesis y es un hecho bien conocido la utilidad y necesidad de todo tipo de implantes. Los materiales que se emplean para la fabricación de implantes son de naturaleza diversa; pueden elaborarse con tejidos de los mismos pacientes (autoinjerto), con tejidos de algun donante humano (homoinjerto) o de otras especies (heteroinjerto), asi como a partir de materiales hechos por el propio hombre (aloinjertos); a estos últimos se les conoce como biomateriales, y pueden ser de origen sintetico o natural (pero modificados por el hombre). Estos se utilizan en la fabricación de dispositivos medicos capaces de desempeñar diferentes funciones en el organismo humano. Pero uno de los principales problemas que afronta la medicina de hoy es el incremento considerable de las patologías relacionadas con los problemas óseos. Efectivamente, en primer lugar, la mitad de las enfermedades crónicas que sufren las personas mayores de 65 años están relacionadas con problemas en las articulaciones. Este aumento de las enfermedades del hueso esperado en el siglo 21 y su impacto previsto en individuos y sociedades ha sido el comienzo para lanzar las investigaciones sobre el tema de nuevos materiales capaces de regenerar el hueso. Y segundo, aunque el tejido óseo posee la capacidad de crecer y de regenerarse naturalmente, el proceso de la reparación del hueso es deteriorado en muchos casos clínicos y patológicos. Por ejemplo, la pérdida masiva del hueso causada por trauma y la resección del tumor así como deformidades requiere cirugía reconstructiva. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 6 Si a estos factores sociológicos y médicos se les añade la mejora de las técnicas quirúrgicas, se puede entender el crecimiento acelerado en la utilización de prótesis, implantes, sistemas y aparatos médicos. 1.2 OBJETIVOS DEL PROYECTO En la ultima década, el interés por los cementos de fosfatos de calcio ha ido en aumento debido a las posibilidades en las prácticas quirúrgicas, ya sea como relleno de cavidades óseas, sustitución de hueso, recubrimiento de prótesis metálicas (aplicado principalmente las prótesis de cadera y tobillo), así como dispositivos de liberación controlada de fármacos, substratos para el crecimiento de nuevo tejido (ingeniería de tejidos), etc. El presente proyecto final de carrera se enmarca en el estudio la Hidroxiapatita. Las apatitas tienen mucho interés en el campo de los biomateriales porque su composición química y su estructura son equivalentes a la fase mineral del hueso. El objetivo de este proyecto es obtener un producto parecido a la Hidroxiapatita biológica y que sea lo más bioactivo posible a fin de ser incorporado en el cuerpo con éxito. Para ello se sintetizarán una hidroxiapatita deficiente en calcio con una relación molar Ca/P de 1.5 y una hidroxiapatita deficiente en calcio sustituida con iones silicio con una relación Ca/(P+Si) de 1.5. Además se estudiará la introducción de dichos iones silicio en la estructura apatítica según dos reactivos utilizados como fuentes de silicio: por una parte un silicato de calcio hidratado amorfo sintetizado en el laboratorio y un silicato de calcio comercial. También se estudiará la síntesis de una hidroxiapatita estequiométrica sustituida con silicio, a fin de analizar la posibilidad de dicha sustitución iónica en hidroxiapatitas con diferentes estquiometrías molares. Además las reacciones se harán por una técnica todavía poco convencional: la mecanosíntesis. En efecto, la mayor parte de las reacciones que dan hidroxiapatita se hacen con disolvente y en agua. Hoy en día, la atención para reacciones en estado sólido crece debido a los requisitos ecológicos y a la necesidad para purificar cantidades grandes de basuras. La mayoría de las tentativas clásicas en mecanosíntesis estuvieron dirigidas para conseguir productos directamente del tarro de un molino. Su desventaja principal es la contaminación, la cual se estudiará como apartada final. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 7 1.3 ALCANCE DEL PROYECTO El alcance de este proyecto se divide en cuatro estudios según las diferentes técnicas empleadas para caracterizar las tres formulaciones de Hidroxiapatita hechas: hidroxiapatita deficiente en calcio (CDHA), hidroxiapatita deficiente en calcio sustituida con silicio (Si- CDHA), hidroxiapatita estequiométrica sustituida con silicio (Si-HA). Dichas hidroxiapatitas se caracterizan por las siguientes relaciones molares: • CDHA  Ca/P = 1.5 • Si-CDHA Ca/(P+Si) = 1.5 • Si-HA Ca/(P+Si) = 1.67 Las relación Ca/(P+Si) será la más estudiada ya que la tendencia actual es que la HA más similar a la fase mineral del hueso es la deficiente en calcio, siendo el silicio un ión con importantes efectos en los procesos de remodelación ósea . Todas las reacciones se han hecho en un molino de bolas FRITSCH (ágata) a una velocidad de 350rpm. El alcance es determinar los componentes de las HA por Infrarrojos y Difracción de rayos X, así como determinar su morfología mediante microscopia electrónica de transmisión y barrido. También se estudiara la contaminación de ágata obtenida principalmente por el tarro y las bolas del molino. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 8 2. FUNDAMENTOS TEORICOS 2.1 EL HUESO  Funciones principales El esqueleto humano está compuesto por 206 huesos, sin contar los dientes. El hueso está formado por un tejido vivo que forma el esqueleto humano, junto al tejido cartilaginoso. Cumple numerosas funciones en el organismo. En primer lugar, el hueso proporciona forma y soporte al cuerpo, protege a los órganos internos frente a los traumatismos. En segundo lugar, facilita la locomoción y actúa como lugar de almacenamiento de minerales, especialmente calcio y fósforo, que a su vez pueden ser liberados para mantener el equilibrio entre los líquidos corporales. Además, la médula ósea suministra al organismo los glóbulos rojos que actúan como portadores de nutrientes para el sistema inmunológico. Existen dos tipos de hueso: - Cortical o compacto. Forma la capa externa y más dura de los huesos, aunque la mayor parte se encuentra en las diáfisis (parte central) de los huesos largos. Supone el 80% de la masa esquelética. Proporciona protección, sostén y resiste los esfuerzos que se producen en los movimientos. - Trabecular o esponjoso. Forma la mayor parte del cuerpo vertebral, las epífisis (extremos) de los huesos largos y está presente en otros lugares. Consta de unas laminillas dispuestas en red llamadas trabéculas; dentro de cada trabécula se encuentran las células que reciben directamente los nutrientes de la sangre que circula por las cavidades medulares. Es la parte metabólica más activa del esqueleto.  Componentes del hueso - Matriz ósea o inorgánica El componente mineral está principalmente compuesto por los cationes calcio y magnesio y por el anión fosfato, en forma de hidroxiapatita. La dureza del hueso se debe a las sales de calcio, que forman parte fundamental de su estructura. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 9 - Matriz orgánica También se denomina osteoide; representa el 25% del peso y el 38% del volumen del hueso adulto. La mayor parte de la matriz orgánica la constituye el colágeno (94%); la otra parte, o sustancia fundamental, está formada por líquido extracelular y complejo carbohidratoproteína. La osteocalcina es la segunda proteína más abundante en los huesos después del colágeno; se cree que influye en la mineralización ósea, uniéndose en parte el componente mineral del hueso, la hidroxiapatita. Esquema 1: Estructura del hueso. El hueso esta compuesto por varios tipos de células: - Osteoprogenitoras y osteógenas: células madre, las únicas con capacidad de división cuyas células hijas se transforman en osteoblastos. - Osteoblastos: sintetizan las fibras de colágeno y suponen la sustancia fundamental del hueso. Tienen la función de formar el tejido óseo. - Osteocitos: son los osteoblastos ya incorporados a la matriz ósea ya calcificada y son los encargados de mantener vivo el tejido óseo. - Osteoclastos: son las células encargadas de la resorción y eliminación del tejido óseo no deseado, imprescindibles para el desarrollo, crecimiento, mantenimiento y reparación normal del hueso. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 16 calcio, como el óxido de calcio (CaO); teniendo en cuenta la relación molar Ca/P deseada (1.67 para la HA). Ahora bien, estas HA’s suelen ser muy cristalinas lo cual las hace poco bioactivas. 2.6.3 La mecanosíntesis Durante el proceso de molido, existen distintos parámetros experimentales que influyen en la cinética de la reacción, como por ejemplo el tipo de molino, la velocidad de molido, el tiempo de molido, etc. La influencia de estos parámetros experimentales ha sido ampliamente estudiada en el caso de “mechanical alloying”(4), pero no se han encontrado en la literatura estudios referentes a la mecanosíntesis de fosfatos de calcio. Figura 1: Esquema de los procesos de fragmentación y coalescencia característicos en “mechanical alloying”. En la síntesis química convencional, las moléculas reactivas se encuentran una con otra con el movimiento térmico al azar en un líquido o vapor. En la mecanosíntesis, las moléculas se unen a los sistemas mecánicos moleculares y sus encuentros resultan de los movimientos mecánicos que las a traen juntas en secuencias, posiciones, y orientaciones. El proceso de mecanosíntesis puede evitar reacciones indeseadas manteniendo los reactivos potenciales Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 17 separados y puede favorecer fuertemente reacciones deseadas sosteniendo los reactivos juntos en las orientaciones óptimas para diferentes tiempos de vibración molecular. Existe diferentas maquinas que pueden ser utilizadas para obtener productos por mecanosíntesis:  Molino planetario de bolas;  attritor;  1D – vibratorio maquina;  3D – vibratorio maquina. Sin embargo, hoy en día, la mayoría parte de las reacciones de mecanosíntesis se hacen en un molino planetario de bolas. La mecanosíntesis se ha desarrollado en los años 70 en la industria aeronáutica para obtener aleación a base de níquel con buenas propiedades mecánicas a altas temperaturas, es un proceso de pulverización mecánica que puede tener lugar en una atmósfera inerte o con aire en un molino de alta energía. El principio de pulverización consiste en provocar una serie de choques y colisiones por algunas bolas con el objetivo de obtener un producto en polvo con un tamaño de partícula muy pequeño. El aumento del tiempo de molido conduce a un aumento del número de interfaz y el área del componente elemental disminuye de milímetro hasta micrómetro. Figura 2: Comportamiento general de las partículas durante el proceso de mecanosíntesis Hoy en día, la mecanosíntesis representa un método de elaboración para toda clase de compuestos tanto para la composición como para las características microestructurales. Pero Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 18 este proceso es sobre todo utilizado para obtener un material amorfo y en particular, estudiar los mecanismos que aportan este estado amorfo. Sus ventajas son:  Es un método simple;  Se puede controlar la estequiometría;  Posibilidad de introducción de iones;  Se puede controlar la cinética mediante los parámetros de molido En el proceso de mecanosíntesis se hace fácil el control de la relación molar Ca/P de la hidroxiapatita que deseamos obtener y además permite la incorporación de ciertos iones en su estructura cristalina. Recientemente, se han publicado estudios sobre el aumento de la bioactividad de la hidroxiapatita al incorporar iones silicatos en su estructura cristalina (5). En estos estudios, la incorporación de los iones silicatos en la hidroxiapatita se ha realizado mediante métodos de precipitación a bajas temperaturas, lo cual hace difícil el control de las estequiometrías obtenidas. La mecanosíntesis puede ser una vía que permita realizar esta incorporación iónica en la hidroxiapatita con unas estequiometrías controladas. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 19 3. MATERIALES Y METODOS La primera parte del proyecto engloba la síntesis y la preparación de las formulaciones de hidroxiapatita, esto se realizo integralmente en el departamento de "Biomateriales" de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales de Barcelona (UPC) así como el estudio de la microestructura (por microscopia electrónica de transmisión y barrido ambiental) y la composición de fases mediante difracción de rayos X (DRX). La caracterización de las muestras por infrarrojos, el estudio de contaminación y parte del estudio por DRX se llevaron a cabo en las instalaciones de los Servicios Científico Técnicos de la Universidad de Barcelona. 3.1 REACCIONES POR MECANOSÍNTESIS Las reacciones estudiadas presentan una sola variable: dependen de la cantidad y del tipo de reactivos introducidos en el molino pero un estudio paralelo sobre el tipo de junta utilizado fue hecho para una formulación. Los parámetros relacionados con el molino son: la velocidad de molido (N, rpm), el numero de bolas, sus diámetro y sus masa. Los parámetros relacionados con los reactivos son la masa inicial introducida y la relación molar Ca/P entre ellos. 3.1.1 PROCESO DE MOLIDO 3.1.1.1 Características del molino El molino utilizado en el laboratorio, es un molino planetario de bolas, modelo Fritsch Pulverisette 6. La alimentación es f = 50Hz, 220V. El rango de velocidad de este molino es de 220rpm a 680rpm y esta equipado de un minutero. Para asegurarse que todo el polvo contenido dentro del tarro reacciona bien, es importante de apagar el equipo cada 2 horas y de rascar el polvo de las paredes como se ve en la fotografía 3. F otografía 2: Molino planetario de bola s abierto (FRITSCH Pulverisette 6). F otografía 1: Molino planetario de bolas en f uncionamiento (FRITSCH Pulverisette 6). Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 20 El molino Pulverisette de Fritsch hace girar el taro de ágata con un radio rd de excentricidad igual a 1,5, lo que corresponde a la longitud entre el centro del taro y el centro del disco de rotación dónde esta colocado el taro, tal como se ve en el esquema siguiente en vista plana: F igura 3: Diagrama del molino planetario de bolas. 3.1.1.2 Parámetros de molido utilizados Los parámetros fijados para las diferentes formulaciones de hidroxiapatita son: el número de bolas, sus diámetros y sus masas (sabiendo que las bolas disminuyen en tamaño y masa durante la reacción). En nuestro caso, el numero de bolas es de 6 que tienen un volumen y una masa casi similar. La masa total de reactivos insertados es 40g para cada reacción y la velocidad de molido es de 350 revolución por minuto. El unico parámetro variable en las reacciones es la relación molar Ca/P que permite de obtener las diferentes formulaciones de hidroxiapatita. Las formulaciones sintetizadas se describen en el apartado siguiente. F otografia 3: Tarro lleno durante una reacción. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 21 En la tabla siguiente, están reunidos las características del molino utilizado así como los parámetros de molido: 3.1.1.3 Efecto de la masa y del área superficial de las bolas Fritsch Tarro Material Ágata (99,9%SiO 2) Radio rv (cm) 5 Volumen(ml) 500 6 Bolas Material Ágata (99,9%SiO2) Diámetro (cm) 3 Masa (g) 37 Área superficial (cm2) 28,3 Velocidad wd (rpm) 350 Excentricidad rd (cm) 1.5 Tabla 3: Características del molino y parámetros de molido. El molino se utilizó con una velocidad de rotación de 350rpm y sin cualquier cambio en la dirección de rotación. El número y el diámetro de las bolas se ajustaron para obtener masas totales y áreas superficiales lo más adecuados al tipo de reacción y de los productos introducidos. Antes de cada reacción, la masa total de las 6 bolas así como los diámetros de cada una fueron pesados para ver la evolución de la área superficial y la pérdida de masa según el tiempo (6). Una tabla agrupa estos datos en la parte 5.1 de resultados y discusión. 3.1.2 PRODUCTOS SINTETIZADOS 3.1.2.1 Hidroxiapatita deficiente en calcio (CDHA) Para la obtención de hidroxiapatita deficiente en calcio con una relación Ca/P = 1,5, se llevó a cabo la siguiente reacción: 6 CaHPO4.2H2O+3 CaO Ca9(PO4)5(HPO4)(OH)+14 H2O Los productos químicos son reactivos comprados a Aldrich (óxido de calcio, CaO de referencia: 24,856-8) y Fluka (fosfato dicálcico dihidratado, DCPD: CaHPO4.H2O de referencia: 360466). El comercial CaO fue calentado hasta 950°C durante 2 horas para extraer Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 22 el H2O y el CO2 ; posteriormente se guardo en una estufa para guardar el óxido de la contaminación. Guardaremos estos mismos reactivos para las reacciones siguientes. Se molió una masa total de reactivos de 40g. Se tomaron 400mg de polvo para los tiempos de molido: 15min, 30min, 45min, 1h, 1h30 y 1,200g para los tiempos: 2h, 6h, 10h, 20h, 24h. Se realizó el test de la fenolftaleína para ver si el CaO había reaccionado en su totalidad. Este test consiste en tomar un poco de polvo, añadir agua destilada y algunas gotas de fenolftaleína. Si la mezcla cambia hasta un color rosa, esto significa que queda CaO en el producto y a la inversa si el color queda así, esto significa que no hay más de CaO. Para saber exactamente el tiempo final de reacción, se hizo una prueba cada 30 minutos. Esta prueba nos ha dado un color invisible para el tiempo de 1 hora. Es decir que el CaO se ha incorporado totalmente a 1 hora de molido. Finalmente, a t = 24h, tenemos 22,540g de CDHA. Se fabricaron dos nuevas juntas más adecuadas para el tarro porque la de teflón utilizada hasta ahora permite la fuga de polvo fuera de éste. Para ello, se compró una larga lámina de 2 milímetros de silicona a la que se le realizó un círculo de la misma anchura que el tarro (fotografía 4), a su vez se compró una lámina de caucho y se realizó otro círculo para poder ser introducido en el tarro (fotografía 5). Para ver el efecto de las nuevas juntas se ha hecho la misma reacción descrita anteriormente colocando la nueva junta de silicona (foto 4) y una tercera reacción colocando las dos nuevas juntas (fotografía 5). Se realizaron las tres pruebas moliendo 1 hora que el CaO se hubiese incorporado totalmente. Posteriormente se han pesado las masas finales y se calentó una parte de cada muestra en el horno hasta 950°C para analizar los compuestos finales por Infrarrojos. Fotografía 4: tarro con la junta en silicón. F otografia 5: tarro con las 2 juntas. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 23 3.1.2.2 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida por silicio (Si-CDHA) Para la obtención de la hidroxiapatita deficiente en calcio substituida por silicio con una relación molar Ca/(P+Si) igual a 1,5, se utilizó la siguiente reacción: 5 CaHPO4.2H2O + 3 CaO + 1 CaSiO3 Si-CDHA Esta reacción se llevó a cabo con dos fuentes de silicio: un silicato de calcio hidratado amorfo (CSHA) sintetizado vía mecanosíntesis y un CaSiO3 comercial (Aldrich, de referencia 372668-250G). En el caso del silicato amorfo, la mecanosíntesis se llevo a cabo según la reacción: 1 CaO + 1 SiO2 1 CaSiO3 El CSHA se realizó un estudio anterior llevado a cabo en Francia (7). Al igual que en la reacción anterior, se molió una masa total de reactivos de 40g. Tal y como haremos para cada reacción, hemos calculado las proporciones de reactivos para obtener 2g de la muestra al tiempo t = 0s. Se tomaron 800mg de polvo para los tiempos: 2, 6, 10, 20, 24, 28, 32, 36 y 40 horas.  Tratamientos térmicos El horno utilizado para los tratamientos térmicos desarrollados a lo largo de este proyecto fue un Hobersal, modelo CNR-58. En todos los tratamientos realizados se utilizaron rampas de calentamiento de 4ºC/min hasta llegar a la temperatura de sinterización deseada. Se calentaron las muestras hasta 950°C durante 2 horas. Esta calefacción se ha hecho para 2 razones. Primero, era necesario detectar la presencia de silicato de calcio para diferentes tiempos de molido. Segundo, en el objetivo de ver el efecto de la incorporación de silicato sobre la estabilidad de la CDHA a altas temperaturas. La siguiente reacción es la misma que anteriormente pero con un CaSiO3 comercial comprado a Aldrich. Antes de hacer la reacción, queríamos ver la cantidad de agua contenida en este CaSiO3 (Aldrich), entonces hemos puesto 250mg del reactivo en 4 crisoles para calentarlos a 950°C y ver la perdida de masa: Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 24 Masa de CaSiO3 introducida (mg) Masa de CaSiO3 recuperada (mg) Porcentaje de pérdida de masa (%) 250,2 188,64 24,6 250,6 188,38 24,8 249,7 187,47 24,9 243,7 183,54 24,7 Tabla 5: Datos para el cálculo del porcentaje de agua contenido en el CSH. Podemos calcular el porcentaje de agua contenido en este CaSiO3 comercial haciendo la media de las valores de la tercera columna: obtenemos un 24,75% de agua. Al igual que para las reacciones anteriores, se molió una masa total de reactivos de 40g. Se tomaron 800mg de muestra para los tiempos: 2h, 6h, 10h, 20h, 24h, 28h, 32h, 36h, 40h. Finalmente, hemos calentado 2 formulaciones diferentes de hidroxiapatita hasta 950°C durante 2 horas con el objetivo de analizar la pérdida de masa: (1 Ca9(PO4)5(HPO4)(OH) t=24h + 1 CaSiO3) t=0h 1. 5 CaHPO4.2H2O + 3CaO +1CaSiO3 Si-CDHAt=40h 2. La formulación 2. viene de la 1ª reacción y hemos puesto en el horno la muestra de t = 40h. El CaSiO3 utilizado en estas dos experiencias fue el silicato de calcio hidratado amorfo (CSHA). Los porcentajes de pérdida de masa obtenidos son: WtSi-CDHA = 6,45% WtCDHA+CSH = 13,36% Esta diferencia en la pérdida de masa corresponde a los resultados que esperamos, hay 2 explicaciones:  Primero, puede ser debido al hecho que para un elemento que tiene una fase solamente, el aumento de temperatura cambia la estructura cristalina de una fase. Esto quiere decir que el CSHA esta bien incorporado en la Si-CDHA. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 25  Segundo, en la formulación (CDHA+CSHA), la CDHA se transforma en β-TCP con la temperatura (entonces pierde su grupo HPO4) y el CSHA se convierte en CaSiO3 y por lo tanto pierde su grupo H2O. Esto significa también que el CSHA esta mejor incorporado en la Si-CDHA. 3.1.2.3 Hidroxiapatita substituida por silicio (Si-HA) La segunda formulación estudiada es la hidroxiapatita substituida por silicio hecha a partir de la última muestra (t = 40h) de la reacción anterior y el añadido de un mol de CaO para obtener un producto de relación Ca/(P+Si) igual a 1,67: 1 Si-CDHA+ 1 CaO Si-HA Entonces, hemos cogido 20g de la última muestra de Si-CDHA y el cálculo para saber la cantidad de CaO a introducir es: mCaO = (MCaO * mSi-CDHA)/ MSi-CDHA El objetivo de esta reacción es de obtener una hidroxiapatita estequiométrica, entonces hemos hecho la prueba con fenolftaleína para ver el tiempo que toma el CaO a incorporarse. Al tiempo t = 11h30, la mezcla ha cambiado hasta un color rosa pálido y he pagado la reacción para hacer las análisis. Al final, hemos calentado el producto de la reacción hasta 1300° durante 2 horas para ver si era posible la obtención de una hidroxiapatita substituida por silicio estable a alta temperatura. 3.3 CARACTERIZACIÓN DE LAS MUESTRAS El principio de funcionamiento de las técnicas utilizadas para caracterizar los productos está descrito en anexos. Esta parte contiene la descripción de los instrumentos utilizados y la metodología empleada, así como las muestras analizadas en cada caso. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 32 20 25 30 35 40 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 DCPD CaO DCPD CaO DCPD DCPD DCPD DCPD Intensity Angle 2 Theta (º) CDHA,T=25ºC t = 24h t = 20h t = 10h t = 6h t = 2h t = 1h30 t = 1h t = 45min t = 30min t = 15min t = 0h Figura 8: Curvas DRX de la CDHA a T = 25°C para diferentes tiempos de molido 20 40 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 Intensity Angle 2 theta (°) HA CDHA t=24h Figura 9: Curvas DRX de la CDHA, t = 24h en comparación con el patrón de HA Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 33 4.2.2 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio amorfo (Si- CDHA) 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 0 2000 4000 6000 8000 10000 CaO CaO DCPD DCPD DCPD DCPD DCPD Si-CDHA T25 Intensity Angle 2 theta (°) t = 40h t = 36h t = 32h t = 28h t = 24h t = 20h t = 10h t = 6h t = 2h t = 0h Figura 10: Curvas DRX de la Si-CDHA a T =25°C para diferentes tiempos de molido. Los picos de DCPD y CaO son marcados para el tiempo, t = 0h y los picos de HA son marcados por un cuadrado. 20 40 0 5000 10000 15000 20000 Intensity Angle 2 theta (°) Si-CDHA,t40h,T25 HA Figura 11: Curva DRX de la Si-CDHA a t = 40h, T = 25°C en comparación con el patrón de HA. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 34 Antes de moler, solamente DCPD y CaO fue detectado por DRX. No se detectó el silicato puesto que es amorfo a temperatura ambiente. Después de 2h de molido, los curvas DRX mostraron un perfil apatítico. El único cambio detectado con el aumento del tiempo de molido es un aumento progresivo de la cristalinidad de las muestras. La fig. 11 muestra que la Si-CDHA obtenida después de un molido de 40h se ajusta perfectamente al patrón de HA. 20 25 30 35 40 CaO B-TCP B-TCP CaSiO3 B-TCP CaO B-TCP B-TCP B-TCP B-TCP Β-TCP B-TCP B-TCP B-TCP B-TCP β-TCP Intensity Si-CDHA T950 α-TCP t = 40h t = 36h t = 32h t = 28h t = 24h t = 20h t = 10h t = 6h t = 2h t = 0h Figura 12: Curvas DRX de la Si-CDHA a T = 950°C para diferentes tiempos de molido. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 35 20 40 0 5000 10000 15000 20000 Intensity Angle 2 theta (°) HA Si-CDHA,t40h,T950 Figura 13: Curva DRX de la Si-CDHA a 950°C, t=40h en comparación con el patrón de HA. Mirando la fig. 12, se observa que para bajos tiempos de molido, una mezcla de β-TCP, CaO y CaSiO3 se ha formado. Sin embargo, para tiempos altos de molido, el CaSiO3 no se detecta, la cantidad de TCP disminuye y la fase apatítica crece. A partir de las 6h de molido se detecta a-TCP. Esta fase a parece estar relacionada con la transformación de la fase b debido al efecto del silicio, que según diversos estudios estabiliza la fase a-TCP por debajo de la temperatura de transición b-a habitual (1180ºC) (9;10). Al final de la reacción, el TCP se detecta difícilmente y la fase principal es hidroxiapatita. Se sugiere que la introducción de silicato en la estructura de la CDHA estabiliza la fase apatítica a altas temperaturas. Como para la muestra final de la Si-CDHA a T = 25°C, la Si-CDHA obtenida después de un molido de 40h y sinterizada a 950ºC se ajusta perfectamente al patrón de HA (fig. 13). 4.2.3 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida por silicio comercial (Si-CDHA) Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 36 Al igual que en la reacción con el silicato amorfo sintetizado en el laboratorio, para tiempos cortos se observa una mezcla de DCPD y CaO, sin ser posible la detección de CaSiO3 debido a su baja cristalinidad. Al aumentar el tiempo de molido, los reactivos desparecen a medida que aparece una fase apatítica. 20 25 30 35 40 0 2000 4000 6000 CaO DCPD DCPD DCPD DCPD DCPD Intensity Angle 2 theta (°) Si-CDHA con CaSiO3 t = 40h t = 36h t = 32h t = 28h t = 24h t = 20h t = 10h t = 6h t = 2h t = 0h Figura 14: Curvas DRX de la Si-CDHA para diferentes tiempos de molido. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 37 Como en el caso anterior, la Si-CDHA obtenida después de un molido de 40h se ajusta perfectamente al patrón de HA. 4.2.4 Hidroxiapatita substituida con silicio (Si-HA) 22 24 26 28 30 32 34 20000 40000 Intensity Angle 2 theta (°) Si-HA Ca/(P+Si)=1.67 T=1300ºC HA Merck 1000ºC α-TCP Figura 16: Curva DRX de la Si-HA a 1300°C en comparación con los patrones de HA y α-TCP. Tal y como se observa en la Fig. 16, contrariamente a lo esperado se ha obtenido una mezcla de HA y α-TCP. Esto puede ser debido a una falta de precisión en la relación entre los reactivos a causa de su hidratación y/o carbonatación, las cuáles no se tuvieron en cuenta al pesar los mismos. También podría deberse a la contaminación de ágata proveniente del molino, la cual provocaría un aumento de iones silicio en el producto siendo la relación Ca/(P+Si) menor a 1.67. Además se observa un importante desplazamiento de los picos de Si-HA respecto a la HA comercial, el cual puede atribuirse al efecto de la incorporación de iones silicio en la estructura apatítica. 4.2.5 Reactivos utilizados como fuentes de silicio  CaSiO3 sintetizado por mecanosíntesis Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 38 Según un estudio realizado anteriormente (11), en el cual se sintetizo el CaSiO3 utilizado en las primera reacción de Si-CDHA desarrollada en este proyecto, se observa que dicho silicato es amorfo a temperatura ambiente pasando a transformarse en wolastonita al sinterizarlo a 950ºC.  CaSiO3 Aldrich (referencia 372668-250G) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 2 7 12 17 22 27 Angle (°θ) Intensity 0 400 800 1200 1600 2000 2 6 10 14 18 Angle (°θ) Intensity Ca(OH)2 Ca(OH)2 Ca(OH)2 CSH 0h 33h Figura 18: Curva DRX del CaSiO3 sintetizado al ultimo tiempo de molido. Figura 17: Curvas DRX de evolución del CaSiO3 sintetizado según el tiempo de molido. Antes de sinterizar el reactivo se observa un wolastonita de baja cristalinidad. Después de sinterizarlo a 950ºC durante 2h30 se observa el DRX correspondiente al CaSiO3 (JCPDS). 0 1020304050 0 1000 2000 3000 4000 5000 Intensity Angle 2 theta (°) CaSiO3T25 CaSiO3T950 F igura 19: Curvas DRX de los CaSiO3 a temperatura ambiental y calcinada a 950°C. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 39 4.3 CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL PRODUCTO POR INFRARROJOS Antes de comentar los elementos contenidos en las diferentes formulaciones de hidroxiapatita estudiadas por infrarrojos, es importante conocer los picos que corresponden a una estructura apatítica (12;13): Tabla 4: recapitulación de los picos más significativos de una hidroxiapatita. El grupo (HPO4)2- se observa en apatitas deficientes en calcio (Ca/P<1.67). A menor relación molar Ca/P mayor cantidad de grupos (HPO4)2-. Las apatitas carbonatadas se pueden dividir en dos grupos según el CO32- sustituya grupos (OH)- (tipo A) o grupos (PO4)3- (tipo B). 4.3.1 Reactivos utilizados Esta parte agrupa las curvas infrarrojos de los reactivos utilizados para obtener las hidroxiapatitas: (PO4)3- (OH)- H 2O (HPO4)2- CO32--Ap tipo A CO32-Ap tipo B 962, 470 3573, 3580 3700, 3000 1119, 1098 878, 1455, 1495 873, 1418, 1455 1090, 1062, 1030 631, 630 1615 1114 879, 1457, 1548 1465, 1412, 873 Frecuencia de los picos significativos (cm-1) 601, 571, 565 1080, 1030 1,4 1,6 CaOcalc DCPD 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Absorbancia Numero de onda (cm-1) Figura 20: Curvas Infrarrojos de los 2 reactivos utilizados para todas las reacciones (DCPD y CaO calcinado ) . Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 40 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1 , 1 Absorbancia Numero de onda (cm-1) CSH T25 CSHT950 F igura 21: Curvas Infrarrojos de los CSH a temperatura ambiental y calcinada a 950°C. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 Numero de onda (cm-1) CaSiO3 CaSiO3 Calcinado F igura 22: Curvas Infrarrojos de los CaSiO3 a temperatura ambiental y calcinada a 950°C. Absorbancia Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 41 4.3.2 Hidroxiapatita deficiente en calcio (CDHA) Al igual que en los DRX, para t = 0h observamos las bandas correspondientes al DCPD y al CaO. A partir de 30 minutos de molido se empieza a observar la formación de una estructura apatítica. Para tiempos largos de reacción se observan las siguientes bandas: - Las frecuencias ν3 y ν1 del fosfato se identifican por tres picos (1089, 1039 y 958 cm-1) tal como ν4 y ν2 por tres más picos (603, 565 y 472 cm-1). - Los picos de 1456 y 1417 cm-1 se podían asignar a un substitución de carbonato tipo B (14)aunque estos picos no se observan para los tiempos largos de molido. - La frecuencia ν5 que representa el enlace P-OH del elemento HPO4 se observa a 873 cm-1. A su vez la banda observada a 873 cm-1 se puede atribuir también a un grupo (CO3)2- correspondiente a una apatita carbonatada tipo B(12), aunque cabe la duda, ya que al final de la reacción no observamos los picos anteriores (flechas), de si se trata del modo de vibración P-OH ν5 HPO4 el cual se ha detectado en algunos estudios a 875 cm-1 (15). - La presencia de CO 2 se detecta por los picos 2356 y 2341 cm-1. Una banda débil del OH en 3568 cm-1 fue obscurecida parcialmente por la amplia banda entre 2500-3700 centímetro -1 que es característico de la humedad en la muestra. Por otra parte, una banda más fuerte del OH se detecta en 1647 centímetros -1 (16). - Si comparamos el producto final (t=24h) con el patrón de HA (Fig.25) se observan algunas diferencias debido a la existencia de β-TCP(hombro a 544 cm-1 y pico muy débil a 444 cm- 1).Pero también aparecen picos adicionales en 800, 779 y 735 cm-1 no atribuibles a ninguna banda de fosfato de calcio. Estos picos se podrían atribuir a la existencia de contaminación de ágata proveniente del molino, ahora bien para poder confirmar este hecho sería necesario el análisis por infrarrojos de dicha ágata. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 48 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 t=40h t=0h Si-CDHA T=25ºC Absorbancia Numero de onda (cm-1) t = 36h t = 32h t = 28h t = 24h t = 20h t = 10h t = 6h t = 2h Figura 28: Curvas Infrarrojos de la Si-CDHA a 25°C para diferentes tiempos de molido. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 t=0h t=40h Numero de onda (cm-1) Si-CDHA T950 t = 36h t = 32h t = 28h t = 24h t = 20h t = 10h t = 6h t = 2h 49 Figura 29: Curvas Infrarrojos de la Si-CDHA a 950°C para diferentes tiempos de molido. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Absorbancia Numero de onda (cm-1) Si-CDHA,t40h,T950 HAmerck 50 Figura 30: Curva Infrarrojo de la Si-CDHA a 950°C, t=40h en comparación con el patrón de HA. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 Absorbancia Numero de onda (cm-1) T25_SiCDHAt40h HA Merck Figura 31: Curva Infrarrojo de la Si-CDHA a 25°C, t=40h en comparación con el patrón de HA. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 51 4.3.4 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio comercial (Si-CDHA) Para esta reacción se ha obviado el resultado correspondiente al tiempo de molido de 36h. Los infrarrojos muestran las típicas bandas de fosfatos correspondientes a la hidroxiapatita, ya mencionadas en los apartados anteriores. Para esta reacción se ha obviado el resultado correspondiente al tiempo de molido de 36h. Los infrarrojos muestran las típicas bandas de fosfatos correspondientes a la hidroxiapatita, ya mencionadas en los apartados anteriores. Ha que destacar que los picos debidos a sustitución de grupos carbonatos en este caso se observan a 1458, 1419 y 877 cm-1, lo cual indica una sustitución tipo AB. En cuanto a las bandas representativas de grupos con silicio sólo observamos una banda adicional a 800 cm-1 (no detectada en la reacción anterior con el CSH amorfo) y varias bandas entre 2000 y 2200 cm-1(detectadas anteriormente). También cabe destacar el aumento de grupos (OH)- con el tiempo de molido, tal y como podemos observar en la Fig.33 con el aumento de las bandas a 630 y 3569 entre los tiempos de molido de 2 y 40h. También parece haber habido un aumento del pico a 474 cm-1. Aunque, tal y como ya se ha comentado para las reacciones anteriores, estas observaciones no pueden tomarse como una conclusión definitiva ya que los análisis realizados han sido cualitativos. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Absorbancia Numero de onda (cm-1) Si-CDHA t40H HA Merck F igura 32: Curva Infrarrojo de la Si-CDHA con CaSiO3, t = 40h en comparación con e l patrón de HA. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 52 4000 3000 2000 1000 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 t=0h t=40h Absorbancia Numero de onda (cm-1) Si-CDHA con CaSiO3 t = 32h t = 28h t = 24h t = 20h t = 10h t = 6h t = 2h Figura 32: Curvas Figura 33: Curvas Infrarrojos de la Si-CDHA con CaSiO3 para diferentes tiempos de molido. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 53 4.4 CARACTERIZACIÓN DE LA SUPERFICIE DEL PRODUCTO POR SEM Con las micrografias obtenidas mediante el SEM, se ve que las hidroxiapatitas son siempre muy aglomeradas. Sin embargo, esta técnica ha permitido de obtener una idea del tamaño de los aglomerados pero no del tamaño de las partículas. Para cada formulación de hidroxiapatita estudiada por SEM, se tomo 2 aumentos diferentes: 6000 y 3000. 4.4.1 Hidroxiapatita deficiente en calcio (CDHA) Micrografia 2: CDHA, t=24h (3000x). Micrografia 1: CDHA, t=24h (6000x). Con estas micrografías, se observa que la hidroxiapatita deficiente en calcio (Ca/P)=1,5 después 24 horas de molido se encuentra en forma aglomerados de hasta 30µm. Pero la mayoría de estos aglomerados están comprendidos entre 10 y 15µm. En ampliaciones de las micrografías ha sido posible detectar los cristales de tamaño nanométrico que forman estos aglomerados. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 54 4.4.2 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio amorfo (Si- CDHA) Micrografía 4: Si-CDHA con CSH amorfo, t=28h (3000x). Micrografía 3: Si-CDHA con CSH amorfo, t=28h (6000x). Estas micrografías muestran aglomerados de Si-CDHAs comprendidos entre 5 y 30µm de tamaño. No hay mucha diferencia con las micrografías de la CDHA, lo que quiere decir que la introducción de CSH amorfo en la hidroxiapatita deficiente en calcio no cambia mucho su morfología. Al igual que en el caso anterior, fue posible comprobar la existencia cristales nanométricos formando los aglomerados. 4.4.3 Hidroxiapatita deficiente en calcio substituida con silicio comercial (Si- CDHA) Micrografia 3: Si-CDHA con CaSiO3 comercial, t=24h (6000x). Micrografia 4: Si-CDHA con CaSiO3 comercial, t=24h (3000x). Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 55 Micrografía 5: Si-CDHA con CaSiO3 comercial, t=40h (3000x). Micrografía 6: Si-CDHA con CaSiO3 comercial, t=40h (6000x). Las 4 micrografías anteriores presentan la misma formulación de hidroxiapatita (Si-CDHA con CaSiO3 comercial) para 2 tiempos de molido: t = 24h y el tiempo final, t = 40h. A primera vista, parece que el tiempo de molido no influye sobre el tamaño de los aglomerados. Lo que cambia con la CDHA es que los aglomerados son de mayor tamaño, pueden medir hasta 150µm. Esto quiere decir que el silicio esta bien incorporado en la hidroxiapatita. También en este caso fue posible comprobar la existencia de cristales nanométricos. Para poder medir dichos cristales con mayor precisión se haría necesario el estudio de su morfología mediante microscopía electrónica de transmisión. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 56 4.5 GRANULOMETRIA Los gráficos siguientes muestran la distribución de tamaño medio de las partículas de Silicato de calcio introducidas en las HAs substituidas con silicio: Figura 33: Distribución del tamaño de partículas de CaSiO3. Figura 34: Distribución del tamaño de partícula del CSH amorfo. Se puede notificar que las distribuciones del tamaño de partícula de las muestras siguen una evolución diferente: la proporción de grandes partículas es mayor que la de pequeñas partículas para el CaSiO3 comercial al inverso del CSH amorfo. El grafico (fig. 33) muestra que las partículas de CaSiO3 tienen un tamaño comprendido entre 2 y 200µm, la mayoría de estas tienen Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 57 un tamaño medio de 40µm. En lo que se refiere a las partículas de CSH amorfo, sus tamaño esta comprendido entre 0 y 80µm y la mayoría tienen un diámetro de 4µm. Entonces las partículas de CaSiO3 comercial están en medio 10 veces más grandes que las de CSH amorfo, lo que influye sobre la incorporación del silicio en la hidroxiapatita. En efecto, la introducción de CSH amorfo en la CDHA da una dispersión más grande de aglomerados que con la introducción de CaSiO3 comercial. 4.6 ESTUDIO DE LA CONTAMINACIÓN Este estudio concierne 2 formulaciones de Hidroxiapatita: la CDHA y la Si-CDHA. Para la primera, el porcentaje en masa de precipitado traduce directamente el añadido de Silicio provocado por las bolas durante la reacción: 026102024 0 2 4 6 8 10 12 % en masa de precipitado tiempo de molido (horas) HA3 CDHA Figura 4: Evolución de la contaminación según el tiempo de molido. Sabiendo que la muestra de 24 horas ha quedado 2 días en la estufa en vez de 2, se puede decir que la contaminación tiene un máximo al tiempo de molido de 10 horas, pues parece que un parte del silicio se incorpora en la hidroxiapatita. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 64 18. Peña, J. and Vallet-Regi, M. (2003) Journal of the European Ceramic Society 23, 1687-1696 19. Leventouri, T., Bunaciu, C. E., and Perdikatsis, V. (2003) Biomaterials 24, 4205-4211 20. Botelho, C. M., Lopes, M. A., Gibson, I. R., Best, S. M., and Santos, J. D. (2002) Journal of Materials Science-Materials in Medicine 13, 1123-1127 21. Boudeville, P., MP Ginebra, Terol, A., Pauvert, B., and Planell, J. A. (2002) Proceedings of the17th European Conference on Biomaterials 22. Gibson, I. R., Best, S. M., and Bonfield, W. (1999) Journal of Biomedical Materials Research 44, 422-428 23. Kim, S. R., Riu, D. H., Lee, Y. J., and Kim, Y. H. (2002) Bioceramics 14, 85-88 Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 65 ANEXOS PRESUPUESTO  Coste del material necesario a la obtención de hidroxiapatitas PRECIO/UNIDAD PRECIO TOTAL (euros) CaO 98% (500g) Aldrich 30,72 30,72 DCPD (1kg) Fluka 66,26 66,26 Molino a bolas FRITSCH (Pulverisette) 4500,00 4500,00 COSTE (euros) 7857,71  Coste de la caracterización de las hidroxiapatitas obtenidas CONCEPTE N° MUESTRAS N° HORES PRECIO POR MUESTRA (euros/muestra) PRECIO HORA (euros/h) COSTE (euros) DRX 46 92 45,23 4161,16 INFRARROJOS 36 12 64,14 769,68 MEB Ambiental 13 90,36 1174,68 CENTRIFUGADORA 10 27,33 273,3 DIFRACCION LASER 2 2 15,37 30,74 COSTE (euros) 6409,56 En el coste de este proyecto, no se tiene en cuenta el precio del material que dispone ya el laboratorio de biomateriales, ni el coste de los productos básicos de un laboratorio (acetona, etanol, agua destilada, etc…) CONCEPTE COST (euros) MATERIAL UTILIZADO 7857,71 EQUIPO UTILIZADO 6409,56 COSTE TOTAL (euros)sin IVA 14267,27 Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 66 TÉCNICAS DE CARACTERIZACION EMPLEADAS Difracción de rayos X La identificación de las fases presentes en la fase sólida del cemento se lleva a cabo mediante estudios de difracción de rayos X en un difractómetro Siemens modelo D-500. Las condiciones de trabajo son de una diferencia de potencial de 40 kV y una corriente de 30 mA, con un rastreo del tipo θ-2θ, entre 4 y 60 grados de 2θ. En el espectro electomagnético, los rayos X se encuentran entre los rayos gamma de longitud de onda menor y la región del ultravioleta de longitud de onda mayor, es decir, entre los 0.1Å y 100Å. La difracción de rayos tiene lugar cuando las ondas se dispersan desde un objeto e interfiere destructivamente con otros. A partir de la representación del átomo de Bohr se puede entender la obtención de los rayos X. Cuando un electrón interno, generalmente del nivel K o L, es expulsado del átomo por otro electrón de energía elevada rayo X primario), un tercer electrón que se encuentra en un nivel electrónico más externo puede caer en el orbital vacío emitiendo simultáneamente un fotón de rayos X. La energía del rayo X emitido corresponde exactamente a la diferencia de energías entre los dos niveles que intervienen. Por ejemplo, si se expulsa un electrón del nivel K y un electrón del nivel L ocupa su lugar, se obtiene el rayo X Kα que tendrá la energía expresada en la siguiente fórmula, donde EL y EK, representan las energías de los niveles L y K respectivamente. Las líneas de la serie K se obtienen cuando se expulsa un electrón del nivel más interno K, las líneas de la serie L se obtienen cuando se expulsa un electrón del nivel L, etc. Los subíndices α, β, γ, etc. se usan para identificar el nivel electrónico original del electrón que ocupa el lugar vacío. Así, una transición desde el nivel energético más cercano se indica con la letra α, la de los siguientes con la letra β, y así sucesivamente. En la práctica, el espectro de rayos X emitido por un elemento dado puede consistir en una serie de líneas agudas y características tal con se deduce de la discusión precedente o bien puede ser un espectro mucho más complicado formado por un espectro continuo de rayos X que presenta unas líneas espectrales muy agudas superpuestas. El que se obtenga uno u otro depende de si se ha utilizado rayos X primarios o electrones de elevada potencia para bombardear el elemento y expulsar el electrón de un nivel interno. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 67 El espectro continuo se debe sencillamente a la rápida desaceleración de los electrones que bombardean la muestra, debido a las múltiples interacciones que tienen lugar con los electrones de la misma medida que los primero pasan a través del material. La energía perdida se transforma en una radiación continua de rayos X que presenta un mínimo de longitud de onda λmin (frecuencia máxima) que corresponde a la energía máxima de los electrones. Este límite de longitud de onda límite es inversamente proporcional al voltaje aplicado tal como se ve en la siguiente ecuación: Ve hc = min λ Donde h es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz, e la carga del electrón y V el voltaje de aceleración de aplicado al tubo de rayos X. En los años 1910 W.L. Bragg fue el primero en demostrar que los procesos de dispersión propios de la difracción pueden ser visualizados como si los rayos X fueron reflexiones de los planos imaginarios definidos por los índices de Millar. Existen dos espectros geométricos a tener en cuenta, el primero es que el haz incidente, la normal al plano de reflexión y el haz difractado son siempre coplanares. El segundo es que el ángulo entre el haz difractado y el haz transmitido es siempre 2θ. Este ángulo se denomina ángulo de difracción y es el que se mide experimentalmente. La difracción en general tiene lugar sólo cuando la longitud de onda del haz es del mismo orden de magnitud que la distancia interplanar. Este requerimiento se expresa en la ley de Braga, de forma que el sinθ no puede ser mayor que 1. 1sin 2≤= θ λ d n Esto significa que n λ a de ser menor que 2d. Para la difracción el valor más pequeño es n = 1, ya que n = 0 corresponde al haz difractado en la misma dirección que el haz transmitido. Para lo que, la condición de difracción para cualquier ángulo observable cumple λ≤2d. Infrarrojos El espectro infrarrojo de absorción, reflexión o de emisión de un mineral es una característica única del mismo. Por eso el espectro puede dar la fórmula estructural sin tener los datos del análisis químico. Los análisis cualitativas de una sustancia desconocida (por ejemplo, mineral) pueden hacerse Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 68 en general sin conocer los detalles de la interacción entre la energía infrarroja y una muestra. Utilizando este método realizan también el análisis semicuantitativo de los minerales y sus mezclas. La característica de cada espectro es determinada por las vibraciones de los grupos atómicos de la estructura cristalina de los minerales. Existen las relaciones complicadas, por una parte, entre las distancias interatómicas y el ángulo y la fuerza de las masas relativas de los átomos por otra parte. Todas las características de los espectros infrarrojos de los minerales estan relacionadas con la constitución (composición química y estructura cristalina) de una sustancia. En este trabajo damos solo muy breve la discusión teórica sobre el origen y la naturaleza de la radiación infrarroja. En primer lugar y sobre todo quisieramos llamar la atención al uso práctico de la espectrometría infrarroja que es un método muy importante para los mineralogistas y gemologistas. La espectrometría infrarroja de reflexión completa muy bien la espectrometría de Raman sobre todo para determinar más facilmente la presencia de ciertos cationos y grupos atómicos, que están presentados en muchos minerales y los cuales no siempre pueden destacarse en los espectros de Raman. Este método también es no destructivo y puede utilizarse para determinar la naturaleza de los minerales. Microscopia electrónica de barrido ambiental La microscopia electrónica de barrido ambiental es una técnica muy útil para la observación y caracterización de los materiales que no necesita de hacer el vació; nos da informaciones sobre la microestructura y tiene la posibilidad de realizar análisis químico puntual mediante el espectrómetro de rayos X. Las imágenes tienen una apariencia tridimensional debido a la gran profundidad del foco y a la gran sensibilidad de los electrones secundarios con la topografía del material. El microscopio electrónico de barrido utiliza como sonda un haz de electrones procedente de un cañón de electrones. Dicho cañón está formado por un filamento de tungsteno que actúa como cátodo montado en un cilindro (Wehnelt) que contiene una pequeña apertura. El ánodo Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 69 es una placa plana, conectada a tierra, con una apertura axial a través de la cual pasan los electrones. Los electrones procedentes del filamento son emitidos termoiónicamente con energías bajas (< 1 eV) antes de ser acelerados por el campo eléctrico del cañón adquiriendo una gran energía cinética. Posteriormente, este haz de electrones es focalizado a través de la columna mediante lentes electromagnéticas hasta llegar a la muestra. Cuando interacciona un haz de electrones sobre un material se producen una serie de señales que pueden ser de gran utilidad a la hora de caracterizar los materiales. Con la técnica del microscopio electrónico de barrido se estudian los electrones dispersados hacia atrás o reflejados y los electrones secundarios o emitidos La resolución espacial viene dada por el área de muestra reflectante, y depende del volumen de interacción de la radiación con la muestra. Los electrones secundarios son los que se reflejan con baja energía (< 50 eV) procediendo de una penetración del orden de sólo varios nm. Estos electrones son reflejados a ángulos grandes y atraídos por el detector para dar las imágenes conocidas como SEI. Las imágenes SEI son topográficas y de alta resolución ya que corresponden a volúmenes de interacción muy pequeños. Los electrones elásticos o retrodifundidos son electrones de alta energía que pueden proceder de penetraciones superiores a 1 µm. Dentro de la cámara del microscopio su trayectoria es rectilínea. La cantidad de electrones retrodifundidos que se refleja depende de la composición química de la muestra. Las imágenes producidas por estos electrones se conocen como BEI y son imágenes de baja resolución. El microscopio electrónico de barrido ambiental forma la imagen con los electrones secundarios que se generan en la interacción de la radiación electrónica con una capa superficial y fina de la muestra mediante un proceso de barrido. Preparación y caracterización de hidroxiapatitas substituidas con silicio obtenidas por mecanosíntesis 70 Centrifugación diferencial Esta técnica se utiliza para el estudio de la contaminación, es un método de separación de los componentes celulares (orgánulos). Se basa en someter a la muestra a giros a alta velocidad, lo que provoca la precipitación de los componentes según su densidad.