Impresión 3D de biopolímeros para aplicaciones biomédicas

TRABAJO DE FIN DE GRADO Grado en Ingeniería Química IMPRESIÓN 3D DE BIOPOLÍMEROS PARA APLICACIONES BIOMÉDICAS Memoria y Anexos Autor: Isaac Domingo Gregorio Director: Carlos Enrique Aleman Llanso Codirector: Maria Leonor Matos Resina Convocatoria: Enero 2025 1 Resum Aquest treball es centra en el desenvolupament i aplicació de tecnologies d’impressió 3D utilitzant biopolímers per al camp biomèdic. La investigació analitza les característiques físico-químiques de diferents biopolímers i el seu potencial per a aplicacions com protèsis personalitzades, enginyeria de teixits i sistemes d’alliberament controlat fàrmacs. S’estudia l’optimització de paràmetres d’impressió per garantizar propietats mecàniques, biocompatibilitat i estabilitat estructural, fonamentals per el camp biomèdic. També, es té en compte aspectes étics i sostenibles relacionats amb lú’s de materials biodegradables i el seu impacte ambiental. Els resultats aconseguits destaquen la capacitat dels biopolímers per satisfer necessitats específiques del sector biomédic, donant noves perspectives per al disseny de solucions innovadores. 2 Resumen El presente trabajo se centra en el desarrollo y aplicación de impresión 3D utilizando biopolímeros para el campo biomédico. La investigación analiza las características físico-químicas de diferentes biopolímeros y su potencial para aplicaciones como prótesis personalizadas, ingeniería de tejidos y sistemas de liberación controlada de fármacos. Se estudia la optimización de parámetros de impresión para garantizar propiedades mecánicas, biocompatibilidad y estabilidad estructural, fundamentales para el campo biomédico. También, se tienen en cuenta aspectos éticos y sostenibles relacionados con el uso de materiales biodegradables y su impacto ambiental. Los resultados alcanzados destacan la capacidad de los biopolímeros para satisfacer necesidades específicas del sector biomédico, dando nuevas perspectivas para el diseño de soluciones innovadoras. 3 Abstract This thesis focuses on the development and application of 3D printing technologies using biopolymers for the biomedical field. The research analyzes the physicochemical characteristics of different biopolymers and their potential for applications such as customized prosthetics, tissue engineering, and controlled drug delivery systems. The optimization of printing parameters is studied to ensure mechanical properties, biocompatibility and structural stability, which are crucial in the biomedical field. Ethical and sustainable aspects related to the use of biodegradable materials and their environmental impact are also considered. The results highlight the ability of biopolymers to meet specific needs in the biomedical sector, opening new perspectives for the design of innovative solutions. 4 5 Agradecimientos Querría empezar agradeciendo a mi cotutora Leonor por guiarme con tanta dedicación durante todo el proceso de elaboración de este trabajo de una forma pasional y vocacional. Gracias también por darme la increíble oportunidad de poder realizar este proyecto tan enriquecedor e innovador. Además, no puedo dejar de mencionar a todos los amigos que he podido conocer a lo largo de mi carrera universitaria. Su compañía en este largo camino ha sido muy importante, especialmente en los momentos más difíciles. Gracias por las risas y lloros que he compartido durante esta etapa de mi vida. Por otro lado, quiero agradecer a mis padres y a mi hermano. Su presencia constante ha sido esencial en este largo camino. Han estado a mi lado en todo momento, escuchando mis inquietudes, aguantar mis fatigas y descontentos, y por darme la fortaleza necesaria para confiar en mí mismo. Sin lugar a duda, sin su apoyo nunca me hubiera imaginado poder estar cumpliendo los desafíos que la vida me está poniendo y poder sentirme orgulloso de mis logros. Como punto final, también quiero agradecer este trabajo a esa persona que siempre estuvo y estará a mi lado dándome las palabras de aliento que me dan fuerzas para seguir llegando a las metas que me propongo. Por eso aparte de agradecértelo, también me gustaría dedicarte este trabajo abuelo, ya que es la culminación de mis conocimientos de esta carrera que tanto admirabas. 6 3 2. ESTADO DEL ARTE En los últimos años, el avance de los hidrogeles en su formulación y nuevas técnicas de fabricación, han ampliado significativamente su campo de aplicación, que van desde la cosmética, la agricultura y en la medicina, siendo considerados materiales claves en diferentes áreas, en concreto en la biomedicina. En este contexto, los hidrogeles en la biomedicina son muy valiosos gracias a sus propiedades únicas, como la biocompatibilidad, que les permite interactuar de manera segura y eficiente con el cuerpo humano, sin provocar reacciones adversas en el organismo. Además, los hidrogeles tienen la capacidad de liberar fármacos de manera controlada, lo que hace que sean esenciales en la medicina personalizada. [1] Los hidrogeles actualmente siguen siendo un foco de investigación ya que se pretende mejorar sus propiedades mecánicas y capacidad de adaptación en diferentes aplicaciones biomédicas. El desarrollo de hidrogeles inteligentes permite crear materiales con respuestas adaptativas, como cambios de volumen o liberación de fármacos, cuando son puestos a estímulos externos como la temperatura, el pH o la luz. Por otra parte, los hidrogeles también se están optimizando para mejorar su estabilidad a largo plazo, su capacidad de integración en tejidos vivos y degradación de manera controlada en el cuerpo. [2] La impresión 3D y los hidrogeles es una combinación muy prometedora para el futuro ya que gracias a la impresión 3D, es posible fabricar estructuras tridimensionales precisas, aumentando la personalización en el campo de la biomedicina. 2.1. Hidrogeles Los hidrogeles son materiales tridimensionales compuestos por redes de polímeros con la capacidad de retener y absorber agua en su estructura. Esta característica junto con otras, hacen que los hidrogeles sean investigados y utilizados en varios ámbitos como por ejemplo en biomedicina, en agricultura, en cosmética y en otros campos industriales. A parte de poder retener y absorber agua, tienen otras características las cuales los hace especial para ciertas aplicaciones. Son materiales biocompatibles, ya que no provocan reacciones hostiles al entrar en contacto con tejidos vivos. Relacionado con esto, también pueden ser modificados para que sean sensibles a estímulos externos haciendo que puedan cambiar sus propiedades en respuesta a estos, como, por ejemplo, cambios de pH o de temperatura. Los hidrogeles tienen muchas aplicaciones, sobre todo en el campo de la biomedicina gracias a sus especiales características. Una de muchas aplicaciones es la liberación controlada de fármacos. Esto es posible ya que su capacidad de absorción puede regular la liberación de sustancias activas. Los hidrogeles ayudan mucho a la Memoria 4 ingeniería de tejidos ya que sirven como estructura para cultivar células, haciendo que se puedan usar para regenerar tejidos o incluso órganos. Hay varios ejemplos de hidrogeles fabricados con impresión 3D que están siendo usados para aplicaciones en el campo de la biomedicina. Uno de estos casos es el PLGA, que es un polímero de ácido láctico-glicólico, el cual se está investigando en varias universidades de Estados Unidos, para la liberación controlada de medicamentos, especialmente para el tratamiento de enfermedades crónicas. [3] Otros hidrogeles se están investigando para sobre todo ser aplicados a la ingeniería de tejidos. Es el caso de los hidrogeles basados en colágeno que, gracias a su capacidad de interactuar de manera beneficiosa con las células, se están utilizando para crear estructuras para la regeneración de tejidos como la piel, cartílago y hueso. [4] 2.2. Impresión 3D La impresión 3D a través del procesamiento digital de luz (DLP, por sus siglas en ingles), es una técnica muy usada recientemente para la fabricación de hidrogeles gracias a su precisión y velocidad para crear estructuras complejas. Esta técnica usa luz para solidificar selectivamente resinas fotosensibles lo que la hace una técnica idónea para campos como la biomedicina, ingeniería de tejidos y dispositivos médicos. El DLP se basa en el lanzamiento de luz ultravioleta (UV) o visible para polimerizar una resina liquida fotosensible capa por capa. La resina está compuesta por monómeros junto con fotoiniciadores que reaccionan al ser expuestos a la luz, creando enlaces cruzados que solidifican el material. En la Figura 1 se observa un diagrama esquemático que enseña el principio de funcionamiento y sus posibles aplicaciones en campos relacionados con tecnología de impresión 3D basada en DLP. [5] Figura 1. Diagrama esquemático del principio de funcionamiento de DLP 5 Para este proyecto, siempre se ha utilizado el mismo modelo de impresora, el cual se muestra en la Figura 2. Este modelo en concreto es la LUMEN X™ Gen 3, capaz de imprimir capa por capa con gran precisión y emitir luz visible a 405 nm. [6] Figura 2. Impresora 3D DLP 2.3. Materiales 2.3.1.Gelatina/GelMA El GelMA, Metacriloilo de gelatina (Figura 3), es un hidrogel derivado de la gelatina, que a su vez es una proteína obtenida por hidrolisis parcial del colágeno. Se sintetiza a través de la modificación química de la gelatina con grupos metacrilatos. Algunas de sus propiedades son su capacidad de ser naturalmente compatible con células y tejidos, y sus propiedades mecánicas ajustables que dependen de factores que se pueden modificar. Profundizando más en la síntesis del GelMA, se basa en modificar químicamente la gelatina con anhidrido metacrílico (MAA) para añadir grupos metacrílicos a las cadenas de gelatina, permitiendo que se formen hidrogeles fotopolimerizables. Memoria 6 Figura 3. Estructura química del GelMA 2.3.1.1. Reacción en la síntesis de GelMA La reacción central en la síntesis de GelMA implica la modificación de los grupos funcionales de la gelatina, en específico los grupos amino libres de los residuos de lisina y los grupos hidroxilo de hidroxilisina, usando anhidrido metracrílico (MAA). Esta reacción se realiza en un entorno acuso controlado para garantizar una alta eficiencia y reproducibilidad. Hay varias etapas en esta reacción, que empieza por la activación de los grupos funcionales. En la solución inicial, de pH alcalino (9.0), se favorece la deprotonación de los grupos amino (NH3+  -NH2), que son las principales entidades reactivas. Esta deprotonación es muy importante ya que los grupos amino neutros reaccionan con más facilidad con MAA. A continuación, el MAA reacciona con los grupos amino libres a través de una reacción nucleofílica, donde el nitrógeno del grupo amino ataca el carbono electropositivo en el anhídrido del MAA. Esto conduce a la apertura del anillo del anhídrido y la formación de un enlace amida con la incorporación del grupo metacrílico. Finalmente, se pasa a la metacrilación de grupos hidroxilo, donde a concentraciones más altas de MAA, los grupos hidroxilo (-OH) de hidroxilisina también pueden participar en reacciones similares, formando enlaces éster metacrílicos. [7] En la Figura 4 se muestra la reacción en cuestión. 7 Figura 4. Reacción en la síntesis de GelMA 2.3.2.Ácido Tánico El ácido tánico es un compuesto fenólico, representado en la Figura 5, que puede descomponerse en ácidos fenólicos más simples mediante la hidrolisis. Se puede obtener naturalmente a partir de cortezas, frutos y hojas, y también industrialmente mediante extractos vegetales. Su uso más común es en el campo de la farmacéutica para la protección de tejidos frente a daño oxidativo y en la limpieza de heridas y quemaduras. [8] Figura 5. Estructura química del Ácido Tánico 2.3.3.LAP El Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio, también conocido como LAP (Figura 6), es un fotoiniciador usado mayoritariamente en la fotopolimerización de hidrogeles para aplicaciones de bioingeniería de tejidos e impresión 3D. Es usado por su alta eficiencia generando radicales libres, y su solubilidad ya que es soluble en agua y eso facilita su uso. El LAP es ampliamente usado juntamente con GelMA para la producción de hidrogeles mediante una reacción de fotopolimerización como se detalla en el siguiente apartado. [9] Memoria 8 Figura 6. Estructura química del LAP 2.3.3.1. Reacción de fotopolimerización La reacción de LAP y GelMA bajo la luz implica un proceso de fotopolimerización que forma un hidrogel reticulado. Este proceso de fotopolimerización se utiliza ampliamente en ingeniería de tejidos y aplicaciones biomédicas debido a su citocompatibilidad y control espaciotemporal. Cuando se expone a la luz UV o visible (365-405 nm), el LAP se descompone y genera radicales libres. Estos radicales son especies altamente reactivas que inician el proceso de polimerización. GelMA contiene grupos metacriloílicos (-CH₂=C(CH₃)-COO-) introducidos durante su funcionalización. Estos grupos tienen dobles enlaces carbono-carbono (C=C). Los radicales libres atacan los dobles enlaces, haciendo que se rompan y formen enlaces simples como parte del proceso de polimerización. Los dobles enlaces rotos forman nuevos enlaces sigma C-C entre grupos metacriloílicos adyacentes en diferentes cadenas de GelMA, dando lugar a enlaces cruzados covalentes. El entrecruzamiento forma una densa red de hidrogeles en 3D, en la que las cadenas de GelMA están unidas covalentemente a través de estos enlaces C-C recién formados. Estos enlaces covalentes son estables y proporcionan la integridad mecánica y la estabilidad estructural del hidrogel. Tras la reticulación, los enlaces de hidrógeno entre los grupos funcionales restantes de GelMA (por ejemplo, los grupos amida e hidroxilo) también pueden contribuir a las propiedades del hidrogel, pero se trata de interacciones secundarias y no forman parte del mecanismo de fotopolimerización. Estos enlaces covalentes formados por fotopolimerización son fundamentales para la resistencia mecánica, la elasticidad y el comportamiento de degradación del hidrogel, lo que lo hace adecuado para aplicaciones como andamiajes tisulares, administración de fármacos y biofabricación. 9 3. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN 3.1. (GF y EQ) Las técnicas de GF y EQ (fracción de gel y contenido de agua en el equilibrio, respectivamente) son técnicas de laboratorio que se usan para medir la eficiencia de gelificación y el grado de hidratación de los hidrogeles. En el caso de la técnica GF, sirve para indicar el tanto por ciento de gel en la muestra analizada, como se muestra en la siguiente ecuación: 𝐺𝐹ሺ%ሻ=𝑚𝐶𝐿1 𝑚𝐶𝐿2·100 (Ec. 3.1) Donde 𝑚𝐶𝐿1 es el peso en seco después de congelar y liofilizar por primera vez, 𝑚𝐶𝐿2 es el peso de la muestra tras 1 día en PBS a 37 ⁰C y del mismo procedimiento de congelar y liofilizar hecho por segunda vez. En el caso de la técnica EQ permite medir el tanto por ciento de agua en equilibrio que hay en la muestra analizada, como se muestra en la siguiente ecuación: 𝐸𝑄ሺ%ሻ=ሺ𝑚𝐴𝐻−𝑚𝐶𝐿ሻ 𝑚𝐴𝐻 ·100 (Ec. 3.2) Donde 𝑚𝐴𝐻 es el peso en húmedo después de calentar la muestra a 37 ⁰C en PBS por 1 día, y 𝑚𝐶𝐿 es el peso en seco después de congelar y liofilizar. 3.2. Ratio de hinchamiento Una característica distintiva de los hidrogeles es su capacidad de expandirse. Cuando el hidrogel entra en contacto con moléculas de disolvente, estas interactúan con su superficie y gradualmente se introducen en la estructura polimérica del hidrogel. Este fenómeno es conocido como “hinchamiento” o “swelling”. Esta capacidad de hinchamiento es una característica que puede ajustarse según los requerimientos específicos de diversas aplicaciones, esto hace que los hidrogeles sean materiales muy útiles en una amplia gama de campos. La absorción del solvente se evalua a partir de la relación de expansión en el equilibrio (Ec. 3.3), donde “mo” es el peso inicial del gel terminado de imprimir y “mt” es el peso del gel tras un tiempo t de inmersión. 10 𝐻𝑅ሺ%ሻ = 𝑚𝑜 𝑚𝑡·100 (Ec. 3.3) 3.3. Espectroscopía infrarroja (FTIR) La espectroscopia infrarroja (IR) se usa para identificar grupos funcionales, estudiar interacciones moleculares y analizar la composición química de materiales. En el caso de los hidrogeles, es útil para caracterizar las modificaciones químicas y las interacciones entre los componentes del hidrogel. La espectroscopia IR se basa en la absorción de radiación IR por las moléculas, eso provoca la vibración de los enlaces químicos dentro de ella. Cada tipo de enlace tiene una frecuencia distinta de vibración. De esta manera, las diferencias en la estructura química de los materiales hacen que se genere espectros IR diferentes. [10] Los espectrómetros de hoy en día, como el mostrado en la Figura 7, generan una amplia variedad de frecuencias que interactúan sobre las muestras. Estas señales se procesan usando una técnica conocida como espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), la cual produce el espectro IR correspondiente. Figura 7. Equipo de espectroscopia infrarroja 3.4. Microscopio electrónico de barrido (SEM) El microscopio electrónico de barrido (SEM), como el que se incluye en la Figura 8, es un instrumento utilizado para analizar la estructura tridimensional de las muestras con un gran nivel de detalle. Esta técnica es muy usada en la caracterización de hidrogeles y otros materiales que permite observar características como la porosidad y el tamaño de los poros. 11 La técnica del SEM usa un haz de electrones en vez de luz para generar imágenes de alta resolución. Este haz se emite desde un cátodo, generalmente de un material de emisión de campo, se acelera por un campo eléctrico y es dirigido hacia la muestra a partir de un sistema de lentes electromagnéticas que enfoca los electrones. Los electrones al chocar con la superficie de la muestra generan diferentes señales, a causa de las interacciones entre los electrones y los átomos del material. Entre estas señales hay que recalcar los electrones secundarios y retrodispersados. Los electrones secundarios nos aportan información sobre el relieve de la superficie mientras que los electrones retrodispersados nos indican el contraste basado en la composición química del material. La interacción mencionada anteriormente puede emitir rayos X característicos que son útiles para análisis químicos detallados. Las señales producidas son detectadas por detectores especializados que las transforman en una imagen de alta resolución, que muestra con precisión las características superficiales de la muestra. [11] Figura 8. Equipo del microscopio electrónico de barrido SEM 3.5. Micro CT Micro CT, o X-ray micro computed tomography, es una técnica de imagen avanzada que se usa para estudiar la estructura tridimensional de materiales como los hidrogeles, sin tener que destruir la muestra. Esto permite obtener imágenes detalladas a nivel micrométrico, que son muy útiles para analizar características internas y externas, como la porosidad y la distribución de los poros. El micro CT scanner utiliza rayos X para generar las imágenes. Durante el proceso hay una fuente la cual emite un haz de rayos X que traspasa el material al mismo tiempo que la muestra rota para que se observe desde 12 diferentes ángulos. A partir de esto se obtienen imágenes bidimensionales que posteriormente son procesadas por un software especializado el cual reconstruye un modelo tridimensional haciendo posible la visualización de las características externas e internas del material con una resolución micrométrica. [12] 3.6. UV-Visible La espectroscopía UV-Visible es una técnica analítica muy utilizada en el campo de la química y bioquímica para investigar la absorción de radiación electromagnética en las regiones ultravioleta (UV) (200-400 nm) y visible (400-700 nm) del espectro electromagnético. El principio de la espectroscopía UV-Visible se fundamenta en la interacción de la luz con las sustancias químicas, principalmente con las que contienen enlaces cromóforos, que son responsables de la absorción de la radiación en estas regiones del espectro. A partir de esto, se determina la cantidad de luz absorbida o transmitida por una muestra, para posteriormente, poder caracterizar y analizar materiales como los hidrogeles. Figura 9. Equipo de espectroscopia UV-Visible 3.7. Ensayos de compresión mecánica Los ensayos mecánicos de compresión son clave para analizar las propiedades mecánicas de un material, evaluando el comportamiento al aplicar fuerzas de compresión que tienden a disminuir su volumen. Estos ensayos muestran datos sobre la capacidad del material a aguantar cargas compresivas, la resistencia del material y sus características físicas. Durante los ensayos, se aplica una fuerza de manera progresiva sobre la muestra y se registra su respuesta en términos de fuerza y deformación. Con los datos obtenidos, se pueden determinar parámetros como la resistencia a la compresión, la rigidez, la elasticidad y otras propiedades mecánicas que caracterizan el rendimiento del material. 19 se repetiría el procedimiento del apartado 4.5.1 Secado por congelación y liofilización para pesar las muestras en seco por segunda y última vez. Este proceso también se puede entender como una ecuación la cual ya se ha mencionado con anterioridad siendo la Ec 3.1 En el caso de EQ, al terminar la impresión 3D, las muestras se deben dejar en remojo en PBS y calentarlas en un horno a 37ºC durante 1 día. A continuación, se pesarán las muestras en húmedo para finalmente repetir el procedimiento del apartado 4.5.1 Secado por congelación y liofilización y pesar las muestras en seco. Este proceso también se puede entender como una ecuación la cual ya se ha mencionado con anterioridad siendo la Ec 3.2 Este procedimiento se ha hecho tanto con las muestras de GelMA como las muestras de GelMA con AT. Figura 15. Horno 4.7. Espectroscopía infrarroja (FTIR) Al realizar las pruebas de IR, se ha realizado el procedimiento del apartado 4.5.1 Secado por congelación y liofilización. Este procedimiento se ha hecho tanto con las muestras de GelMA como las muestras de GelMA con AT. A parte, también se han hecho pruebas de IR con gel puro y acido tánico puro los cuales se han analizado directamente sin seguir el procedimiento del apartado 4.5.1, puesto que ya se encuentran secos. 4.8. Microscopio electrónico de barrido (SEM) Para realizar la técnica de SEM, se han aplicado los procedimientos explicados en el apartado 4.5.2 Deshidratación a partir de Etanol. 20 Por cuestiones técnicas y de tiempo, no se ha podido realizar esta técnica de caracterización. 4.9. Ratio de hinchamiento Para la ratio de hinchamiento o swelling, previamente, se han preparado 4 recipientes, con cada uno conteniendo una muestra de hidrogel, y a parte también se han preparado 500 mL de solución PBS de 0,1 M. Primero se tomará el peso inicial de las muestras y una vez obtenido su peso, se rellenará cada recipiente con 5 mL del PBS preparado anteriormente y se colocará en el horno (Figura 15) a calentar a 37 ºC durante una hora. Al finalizar la hora, se quitará el PBS del recipiente para poder pesar la muestra de hidrogel y una vez se obtenga su peso se volverá a rellenar el recipiente con 5 mL de PBS para volver a calentar a 37ºC en el horno. Este proceso se repetirá para los tiempos de espera en el horno de 2 horas, 1 día, 4 días y 7 días. Este procedimiento se ha hecho tanto con las muestras de GelMA como las muestras de GelMA con AT con la única diferencia de que con las muestras que contienen AT se añadió un tiempo de espera de más de 10 días. 4.10. UV-Visible En el caso de la UV-Visible se han imprimido 4 muestras de GelMA y 4 muestras de GelMA + AT, teniendo 8 muestras en total. Como se ha explicado en el apartado 4.3. Impresión 3D en la parte de añadir la tinta, en este caso, antes de añadir la tinta a la impresora, se le agregará un rango de entre 0,01 y 0,05 gramos de antibiótico Cloranfenicol en estado sólido. Una vez se tengan las muestras imprimidas, estas pasaran por una serie de lavados de PBS, previamente preparado, en tiempos de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora y 2 horas, guardando alícuotas de 1 mL del PBS de lavado de cada tiempo para determinar si hay liberación del antibiótico. Finalmente, las muestras de PBS estarán listas y se pasaron por el equipo de UV-Visible para hacer las pruebas correspondientes. 4.11. Micro CT Para hacer los ensayos de micro CT, es necesario trabajar con prototipos diferentes que el mencionado en el apartado 4.1 Diseño 3D del prototipo. Por esta razón se ha creado un prototipo nuevo, mostrado en la siguiente imagen. 21 Figura 16. Prototipo para micro CT Este nuevo prototipo es un cilindro de 5 mm de altura y 7 mm de diámetro. Estas medidas son necesarias para poder realizar los ensayos de micro CT. Una vez imprimido el prototipo, se deshidratan las muestras segundo el apartado 4.5.1 Secado por congelación y liofilización, y se procede a realizar las pruebas de micro CT para determinar la porosidad total y la distribución del tamaño de poro de las muestras. Estas pruebas se han realizado tanto para muestras de GelMA como para muestras de GelMA con AT. 22 5. ANÁLISIS DE RESULTADOS DE LOS HIDROGELES 5.1. Impresión 3D Como se ha explicado en el apartado 4.3. Impresión 3D, antes de imprimir una muestra de hidrogel se han tenido que definir unos parámetros de impresión. Se han realizado varias pruebas de impresión para ver el efecto de estos parámetros. Finalmente se han concretado los siguientes parámetros:  Tiempo de impresión por capa = 10 segundos  Porcentaje de luz emitida = 70% A parte, hay otros factores que afectan a la impresión fuera de la impresora. Uno de estos es la temperatura de la tinta al imprimir. Para conservar la tinta, es necesario guardarla en una nevera, haciendo que se solidifique. Al querer hacer uso de ella, hay que calentarla a unos rangos de temperatura de entre 30 y 40 ºC para que vuelva a ser líquida. La cuestión es que, si se usa la tinta recién sacada de calentar, la tinta será demasiado líquida para poder imprimir y si se tarda mucho en usar, dejando que se enfrié, la tinta será demasiado sólida para poder imprimir. Este factor de temperatura se debe tener en cuenta cada vez que se quiera imprimir. Como resultado, con la impresora mostrada en la Figura 8 se ha podido imprimir las siguientes formas necesarias para la caracterización:  Cubo de altura 2,5 mm, longitud 2,5 mm y anchura 2,5 mm, mostrado en la Figura 11  Cubo de altura 2,5 mm, longitud 6,5 mm y anchura de 2,5 mm, similar a la Figura 11 pero con longitud diferente  Cilindro de altura 1 cm y diámetro de 1 cm, mostrado en la Figura 12  Cilindro de altura 5 mm y diámetro de 7 mm, mostrado en la Figura 16 5.2. Microscopio electrónico de barrido (SEM) Como se ha comentado en el apartado 4.8, la técnica de SEM, no se han podido realizar por razones técnicas y de tiempo. 23 5.3. Grado de hidratación (GF y EQ) Para determinar GF y EQ se ha procedido a usar las ecuaciones Ec 3.1 y Ec 3.2: 𝐺𝐹ሺ%ሻ=𝑚𝐶𝐿1 𝑚𝐶𝐿2 ·100 𝐸𝑄ሺ%ሻ=ሺ𝑚𝐴𝐻 − 𝑚𝐶𝐿ሻ 𝑚𝐴𝐻 ·100 Donde 𝑚𝐶𝐿1 es el peso en seco después de congelar y liofilizar por primera vez, 𝑚𝐶𝐿2 es el peso de la muestra tras 1 día en PBS a 37 ⁰C y del mismo procedimiento de congelar y liofilizar hecho por segunda vez, 𝑚𝐴𝐻 es el peso en húmedo después de calentar la muestra a 37 ⁰C en PBS por 1 día, y 𝑚𝐶𝐿 es el peso en seco después de congelar y liofilizar. Al realizar los cálculos, salen los siguientes resultados: Tabla 2. Resultados de GF GF GelMA GelMA + AT MEDIA 80,43% 80,64% Desviacio n 0,070% 0,018% Tabla 3. Resultados de EQ EQ GelMA GelMA + AT MEDIA 93,01% 94,05% Desviacio n 0,004% 0,0146% 24 Como se puede observar en el caso de GF, si se comparan los resultados entre GelMA y GelMA + AT, no hay mucha diferencia entre ellos (una diferencia de 0,21). En el caso de EQ, la diferencia entre porcentajes es un poco más notable, pero tan solo de un 1,04%, siendo que la diferencia aun sea pequeña. Una observación posible es que, en ambos casos, la eficiencia de crosslinking resultado de la reacción de fotopolimerización durante la impresión no se ve afectada por la presencia de AT en el hidrogel, resultando en GF y EQ muy similares. El pequeño aumento de EQ en las muestras de GelMA + AT puede significar que las muestras de este tipo guarden una cantidad de agua en su interior mayor que las muestras de GelMA por el aumento de grupos hidroxilo (OH) debido al AT y que mejora interacción con moléculas de agua. 5.4. Ratio de hinchamiento Haciendo referencia al apartado 3.3. Ratio de hinchamiento, concretamente a la Ec 3.3, esta será la manera de proceder con los cálculos para la ratio de hinchamiento. Una vez realizados, se han graficado los resultados. Figura 17. Resultados de degradación de las muestras de GelMA 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00% 100.00% 0. 2. 4. 6. 8. Degradación (%) Tiempo (dias) DEGRADACIÓN GelMA 25 Figura 18. Resultados de degradación de las muestras de GelMA + AT Como se puede ver en la Figura 17, las muestras de GelMA a lo largo del tiempo van perdiendo peso ya que se disuelven en el PBS, llegando a un valor de 30% de su peso inicial como máximo al día 7 donde hay muestras que se disuelven completamente. Por otro lado, en la Figura 18, se puede observar que las muestras de GelMA + AT tienen un pequeño incremento de peso en los primeros instantes de tiempo, pero a medida que pasa el tiempo, van perdiendo peso hasta disolverse completamente en el PBS, llegando a un valor de 40% de su peso inicial al final de 10 días. Hay que tener en cuenta que los puntos representados en ambos gráficos son la media de 4 pruebas para cada instante de tiempo. Si comparamos ambas gráficas, se puede ver que las muestras de GelMA + AT tardan mucho más en disolverse completamente antes que las de GelMA. Esto puede ser debido a que el AT aumente la capacidad de retención de disolvente por el aumento de los grupos hidroxilo del AT que establecen puentes de hidrogeno con el agua, y haciendo que se retardara más el efecto de degradación. 5.5. Espectroscopía infrarroja (FTIR) 5.5.1.Preparación muestra Para poder proceder con la espectroscopia infrarroja es necesario que las muestras hayan sido procesadas mediante el procedimiento del apartado 4.5.1. Secado por congelación y liofilización. 0.00% 35.00% 70.00% 105.00% 140.00% 0. 2.5 5. 7.5 10. 12.5 Degradación (%) Tiempo (dias) DEGRADACIÓN GelMA + AT 26 5.5.2.FTIR En esta prueba se han reproducido los espectros de la gelatina pura, del ácido tánico, de una muestra de hidrogel GelMA y de una muestra de hidrogel GelMA + AT: Figura 19. Gráfico de los espectros FTIR Como se puede observar en la Figura 19, se muestran los grupos funcionales del Ácido Tánico. Si se comparan los espectros de AT y GelMA + AT, se puede ver que los grupos funcionales concuerdan en ambos espectros indicando que la muestra de hidrogel GelMA + AT contiene AT en su estructura. En la Tabla 4 se puede observar mejor esta concordancia entre el hidrogel de GelMA + AT y AT. Tabla 4. Asignación de las principales bandas de absorción del espectro infrarrojo [14] Grupos funcional es GelMA + AT AT O-H 3300-3000 3300-3000 -CH3000-2800 3000-2800 C=O 1800-1600 1800-1600 C-O 1200-1000 1200-1000 27 C=C 700-600 700-600 Figura 20. Gráfico de los espectros FTIR Si se compara el espectro del gel puro con los espectros de los hidrogeles de GelMA y GelMA + AT, se puede observar grandes similitudes indicando que ambos hidrogeles, tanto de GelMA como de GelMA + AT, tienen gel puro en su estructura. En la Tabla 5 se pueden ver mejor estas similitudes. Tabla 5. Asignación de las principales bandas de absorción del espectro infrarrojo [15] Grupos funcional es GelMA + AT GelMA Gel Puro Amida iii 3300-3100 3300-3100 3300-3100 C-H extensión 3000-2800 3000-2800 3000-2800 Amida i 1800-1600 1800-1600 1800-1600 Amida ii 1550-1450 1550-1450 1550-1450 C-H doblando 1400-1250 1400-1250 1400-1250 28 C-N extensión 1200-950 1200-950 1200-950 5.6. Compresión 5.6.1.Análisis numérico En los ensayos de compresión mecánica, al realizar las pruebas con las muestras de hidrogel GelMA e hidrogel GelMA + AT, se obtienen los siguientes resultados: Figura 21. Gráfico de la compresión mecánica con muestras de hidrogel GelMA 35 Hay algunas sustancias que se han utilizado en este proyecto que el Reglamento (CE) nº 1272/2008 no las tiene en cuenta, ya que, según este mismo reglamento, no están clasificadas como sustancias químicas peligrosas porque no presentan una gran amenaza. - LAP - Gel - GelMA Indicaciones de peligro: H225 – Líquido y vapores muy inflamables H302 – Nocivo en caso de ingestión H314 - Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves H317 – Puede provocar una reacción alérgica en la piel H318 - Provoca lesiones oculares graves H319 – Provoca irritación ocular grave H330 - Mortal en caso de inhalación H334 – Puede provocar síntomas de alergia o asma o dificultades respiratorias en caso de inhalación H351 - Se sospecha que provoca cáncer H361fd - Se sospecha que perjudica a la fertilidad. Se sospecha que daña al feto H410 - Muy tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos 36 7. ANÁLISIS DE VISTA SOCIAL El presente trabajo se enfoca en el desarrollo y aplicación de tecnologías de impresión 3D utilizando biopolímeros, dirigidas al ámbito biomédico. Desde una perspectiva social, esta investigación representa una contribución significativa en varios aspectos que vale la pena remarcar. En primer lugar, la investigación aborda necesidades críticas en el sector de la salud. Gracias a la aplicación de tecnologías de impresión 3D, es posible diseñar y fabricar dispositivos médicos personalizados que se ajusten a las necesidades específicas de cada paciente. Este nivel de personalización tiene un impacto directo en la calidad de vida de las personas, especialmente en aquellas que requieren prótesis u otros dispositivos médicos. Además, la posibilidad de utilizar estas tecnologías para la regeneración de tejidos y la liberación controlada de fármacos abre las puertas hacia tratamientos más efectivos y seguros, contribuyendo así al bienestar general. Otro aspecto fundamental es la accesibilidad tecnológica que estas soluciones pueden proporcionar. La impresión 3D permite una producción local y bajo demanda, lo que disminuye significativamente los costos asociados con la logística y la importación de dispositivos médicos. Esto resulta particularmente relevante en regiones con recursos limitados, donde estas innovaciones podrían marcar una diferencia crucial en los sistemas de salud públicos. Además, estas tecnologías ofrecen la posibilidad de adaptarse a contextos específicos, lo que refuerza su potencial para reducir desigualdades en el acceso a tratamientos avanzados. Desde una óptica social, el trabajo también promueve la inclusión y la equidad. En el diseño y desarrollo de estas soluciones, se ha priorizado un enfoque no sexista ni discriminatorio, asegurando que los dispositivos sean accesibles y útiles para personas de diferentes géneros, edades y condiciones socioeconómicas. La inclusión de principios de accesibilidad universal en el desarrollo de los dispositivos biomédicos también garantiza que puedan ser utilizados por personas con diversas capacidades físicas o culturales. A parte, este trabajo tiene implicaciones educativas y de investigación a largo plazo. La exploración de la integración de biopolímeros y tecnologías avanzadas como la impresión 3D abre nuevas líneas de investigación y promueve el desarrollo de conocimiento interdisciplinario. La implementación de estas tecnologías podría generar oportunidades laborales en campos como la manufactura, el diseño y la investigación, contribuyendo al crecimiento económico y social. Sin embargo, también es importante considerar los posibles riesgos sociales asociados. Por ejemplo, la producción de biopolímeros podría depender de materias primas cuya extracción pueda afectar negativamente a comunidades vulnerables. Para mitigar este riesgo, es fundamental colaborar con proveedores que cumplan con estándares éticos y ambientales. La adaptación de estas tecnologías en contextos de bajos recursos podría enfrentar barreras como el acceso limitado a la tecnología o la capacitación insuficiente del personal. 37 En este contexto, el trabajo también se alinea con varios de los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS) promovidos por Naciones Unidas. Particularmente, contribuye al ODS 3 (Salud y bienestar) al proporcionar herramientas innovadoras para mejorar la atención sanitaria; al ODS 9 (Industria, innovación e infraestructuras) mediante el fomento de tecnologías avanzadas en sectores clave; y al ODS 12 (Producción y consumo responsables) al promover el uso de materiales biodegradables y procesos sostenibles. 38 8. PRESUPUESTO Y/O ANÁLISIS ECONÓMICO En este apartado se realizará un estudio económico del proyecto. Tabla 10. Coste de los productos químicos [17][18] Tabla 11. Coste de los equipos [19][20] Tabla 12. Coste del personal 39 En la siguiente tabla está representado el coste total del proyecto, el cual tiene en cuenta todo lo mostrado en las tablas anteriores. Tabla 13. Coste total Figura 27. % Costes 40 9. CONCLUSIONES Como punto final de este proyecto, hay que hacer un análisis de todo lo que se hecho y todo lo que se ha cumplido. Uno de los principales objetivos establecidos, el cual se ha cumplido en su mayor parte ha sido demostrar la viabilidad y el potencial de los hidrogeles de GelMA y GelMA combinado con ácido tánico (AT) fabricados mediante impresión 3D para aplicaciones biomédicas A parte, también hay que remarcar otros objetivos importantes de este proyecto: 1. Fabricación de hidrogeles mediante impresión 3D: Se ha llegado a poder optimizar el proceso de impresión 3D utilizando parámetros, como el tiempo de impresión por capa y la intensidad emitida, que han permitido obtener estructuras 3D reproducibles y funcionales, necesarias para las pruebas posteriores. 2. Caracterización físico-química de los hidrogeles: - Las técnicas de FTIR confirma la integración de AT en los hidrogeles, destacando la compatibilidad de los materiales. - La porosidad y distribución del tamaño de los poros que se han analizado mediante micro-CT, se demuestra que los hidrogeles mantienen una estructura homogénea. - Los ensayos de compresión muestran unas mejores propiedades mecánicas de los hidrogeles con AT, teniendo un módulo de Young y resistencia a la deformación mayores, lo que los hace más viables para aplicaciones que necesitan materiales elásticos y resistentes. 3. Estudio del comportamiento del hidrogel: - Con los resultados de hinchamiento y degradación se observa que los hidrogeles con AT tienen una mayor capacidad de retención de agua y mayor resistencia a la degradación, indicando que refuerza su estabilidad estructural prolongada. - En las pruebas de UV-Visible no se obtuvieron los resultados esperados con el antibiótico, pero incluso y así estos resultados proporcionan una base para futuras investigaciones en este campo Como conclusión, en este proyecto se han logrado los objetivos marcados inicialmente y ha generado resultados que validan el potencial de los hidrogeles de GelMA y GelMA + AT en el campo biomédico. Estos materiales proporcionan una combinación de biocompatibilidad, personalización y sostenibilidad, abriendo nuevas oportunidades para el desarrollo de soluciones innovadoras en ingeniería de tejidos y liberación controlada de fármacos. 41 10. BIBLIOGRAFÍA [1] Koshy, J., & Sangeetha, D. (2022). 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