Asociación de la apolipoproteína J a las lipoproteínas

1 TESIS DOCTORAL ASOCIACIÓN DE LA APOLIPOPROTEÍNA J A LAS LIPOPROTEÍNAS Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula Uni e sidad Au onóma de Ba celona Ma ía Ma ínez Bujidos 2015 2 3 Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula Uni e sidad Au onóma de Ba celona ASOCIACIÓN DE LA APOLIPOPROTEÍNA J A LAS LIPOPROTEÍNAS Memo ia p esen ada po la licenciada en Química Ma ía Ma ínez Bujidos pa a op a al g ado de Doc o a po la Uni e sidad Au ónoma de Ba celona en el p og ama de doc o ado en Bioquímica y Biología Molecula . La p esen e esis ha sido ealizada en el g upo de Bioquímica Ca dio ascula del Hospi al de la San a C eu i San Pau, di igida po el D . José Luis Sánchez-Quesada y el D . Jo di O dóñez Llanos. Los di ec o es de la esis: D . José Luis Sánchez Quesada D . Jo di O dóñez Llanos G upo de Bioquímica Ca dio ascula G upo de Bioquímica Ca dio ascula Ins i u de Rece ca San Pau Hospi al de la San a C eu i San Pau Uni e sidad Au ónoma de Ba celona La doc o anda: Ma ía Ma ínez Bujidos G upo de Bioquímica Ca dio ascula Hospi al de la San a C eu i San Pau Ba celona, 2015 4 5 AGRADECIMIENTOS En p ime luga a mi di ec o , el D . José Luis Sánchez Quesada, po habe me guiado en odo el abajo de es a esis, po habe me ansmi ido pa e de sus conocimien os sob e el ema y po su op imismo an e las di icul ades. Al D . Jo di O dóñez Llanos, codi ec o de es a esis, po acep a me en su g upo, po las apo aciones al abajo ealizado y po que sin su apoyo y con ianza es a esis no hab ía sido posible. A mis dos compis de g upo, las b ujis Mon se Pé ez y Anna Rull, po que sin ellas nada hubiese sido lo mismo… Anna Rull no puedo ene hacia i más que buenas palab as po u ayuda cons an e, us consejos, u op imismo, u dedicación y po odos los momen os que hemos pasado jun as… espe o que engas mucha sue e a pa i de aho a po que ú lo ales! Y a Mon se Pé ez po que siemp e es á dispues a a ayuda , po us consejos y po los g andes momen os de isas. Se e ha echado de menos en es a úl ima ec a de esis pe o espe o que en u nue a eina e aya genial! A odos los au o es de los a ículos po sus apo aciones pa a que los a ículos salie an adelan e. A odos mis compañe os del p e ab icado de lípidos, que en algún u o o momen o me han ayudado. Ha sido un place ene os como compañe os. A oda la gen e del Se icio de Bioquímica del Hospi al de San Pau que me ayudado y enseñado an o es os años y en especial a mis compañe os esis, que han sido el mayo apoyo que se puede ene du an e la esidencia, y que han i ido conmigo la e olución de es a esis. 6 A mis pad es po que sin ellos no hab ía llegado has a aquí, po su apoyo incondicional cada día de mi ida y enseña me que con es ue zo y abajo se puede consegui cualquie me a. Y a Jo ge po es a siemp e ahí, incluso cuando ha habido kilóme os de dis ancia. INDICE 7 ÍNDICE ÍNDICE 8 ÍNDICE 9 ABREVIATURAS ....................................................................................................... 13 RESUMEN .................................................................................................................. 17 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 21 1- ARTERIOSCLEROSIS ............. …………………………………………………………23 1. 1 O igen y e olución de la placa de a e oma .................................................... 23 2- ARTERIOSCLEROSIS Y LIPOPROTEINAS PLASMÁTICAS ................................. 26 2.1 Lipop o eínas plasmá icas............................................................................... 26 2.2 Me abolismo de las lipop o einas .................................................................... 27 2.3 T anspo e e e so coles e ol .......................................................................... 29 3- IMPLICACIÓN DE LA LDL EN LA ARTERIOSCLEROSIS ...................................... 31 3.1 Ca ac e ís icas gene ales de la LDL ............................................................... 31 3.2 Acumulación in acelula de coles e ol ............................................................ 32 3.2.1 Recep o de LDL ................................................................................... 32 3.2.2 Recep o es sca enge (SR) .................................................................. 34 3.3 Papel de la LDL en la a e ioscle osis ............................................................. 35 3.4 Modi icaciones de la LDL ................................................................................ 36 3.4.1 Oxidación ................................................................................................ 36 3.4.2 Ag egación y/o usión .............................................................................. 38 3.4.2.1 Lipólisis ......................................................................................... 39 3.4.2.2 P o eólisis ...................................................................................... 41 3.4.3 Modi icación enzimá ica ........................................................................... 42 3.4.4 Glicosilación ............................................................................................. 43 3.5 P opiedades a e ogénicas de las LDL modi icadas ........................................... 43 4- LDL ELECTRONEGATIVA ..................................................................................... 45 4.1 P opiedades de la LDL(-) .................................................................................. 45 4.2 Mecanismos in lama o ios de la LDL(-) ............................................................. 47 4.3 Ag egación de la LDL(-) .................................................................................... 48 ABREVIATURAS 16 nagLDL(-) LDL(-) no ag egada NASH es e ohepa i is no alcoholica nCLU o ma nuclea de clus e ina NEFAs ácidos g asos no es e i icados NHS N-hid oxisuccinamida oxLDL LDL oxidada PAF-AH ace ilhid olasa del ac o ac i ado de plaque as PC os a idilcolina PCR p o eína C eac i a PG p o einoglicanos PLC os olipasa de ipo C PON pa aoxonasa Qm quilomic ones LDL ecep o de LDL SDS-PAGE geles de poliac ilamida con dodecilsul a o de sodio SM es ingomielina SMasa es ingomielinasa sPLA2 os olipasa A2 sec e o a SR ecep o S a ange sSMasa es ingomielinasa sec e o a TEM mic oscopía elec ónica de ansmisión TEMED e ame ile ilendiamida TG iglice idos VEGF ac o es ascula es de c ecimien o endol elial VLDL lipop o eínas de muy baja densidad RESUMEN 17 RESUMEN RESUMEN 18 RESUMEN 19 La apolipop o eina J (apoJ) o clus e ina (CLU) es una chape ona ex acelula que o ma pa e del sis ema de con ol que ac úa pa a es abiliza las p o eínas ag egadas. Hay e idencias que mues an la exis encia de una elación en e la apoJ y el desa ollo de a e ioscle osis ya que se ha is o que la exp esión y la deposición de apoJ es án aumen adas en zonas de lesión a e ioscle ó ica mien as que es á ausen e en la pa ed a e ial sana. Una po ción impo an e de la apoJ se asocia a las lipop o eínas en plasma, siendo más abundan e en la HDL pe o ambién hay una pequeña pa e unida a la LDL y VLDL. La p ime a pa e de la p esen e esis se cen a en el papel de la apoJ sob e las p opiedades a e ogénicas de la LDL. Hemos is o que la apoJ se une en la ci culación plasmá ica p e e en emen e a las pa ículas de LDL ag egadas. Expe imen os lle ados a cabo con LDL deplecionada de apoJ mues an que es más suscep ible a ag ega se que la LDL o al. Po o o lado, la adición de apoJ pu i icada p e iene la ag egación de la LDL. Es os da os demues an un papel p o ec o de la apoJ en la inhibición de la ag egación de la LDL, que es un p oceso cla e en el desa ollo de la a e ioescle osis. La segunda pa e analiza la dis ibución ela i a de la apoJ en e las di e en es lipop o eínas y en o ma lib e. Nues os da os mues an que un 20% de la apoJ ci culan e en plasma es á asociado a las lipop o eínas y el 80% en o ma lib e. Clasi icando a los pacien es po el pe il lipídico se obse ó que en los indi iduos hipe lipémicos p esen an una concen ación mayo de apoJ que los no molipémicos. Es o indica que la concen ación de apoJ en sue o es dependien e del pe il lipop o eico, y es á asociada posi i amen e con la concen ación de coles e ol y iglicé idos. En pacien es no molipémicos un 30% de la apoJ es á asociada a lipop o eínas, mien as que en pacien es hipe lipémicos el po cen aje disminuye a un 17% en hipe coles e olémicos y un 15% en hipe iglice idémicos. RESUMEN 20 INTRODUCCIÓN 21 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 22 INTRODUCCIÓN 23 1- ARTERIOSCLEROSIS La a e ioscle osis es una pa ología in lama o ia ca ac e izada po un eng osamien o de la capa ín ima de la pa ed a e ial [1, 2]. Es o causa el es echamien o p og esi o de la luz ascula que puede e oluciona has a la oclusión del aso impidiendo el lujo sanguíneo po la a e ia a ec ada. La lesión a e ioscle ó ica, o placa a e oma osa, es á o mada po di e en es ipos celula es, que incluyen p incipalmen e células endo eliales, células muscula es lisas, mac ó agos y lin oci os, jun o con ejido conjun i o, es os nec ó icos, calcio y lípidos, p incipalmen e coles e ol oxidado y os olípidos deg adados. La a e ioscle osis se da p incipalmen e en las a e ias de g an y medio amaño y puede conduci a la isquemia del ejido. La mani es ación clínica depende á de la a e ia a ec ada, in a o agudo de mioca dio en el caso de a e ias co ona ias, acciden e ascula ce eb al en el caso de las a e ias que i igan el ce eb o, e c. 1. 1 ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LA PLACA DE ATEROMA La o mación de la placa de a e oma iene luga de o ma p og esi a. En es e p oceso se pueden dis ingui a ias e apas: inicio de la lesión, o mación de la es ía g asa, o mación de la placa ib osa (lesiones a anzadas) y ombosis ( igu a 1). El p ime acon ecimien o que iene luga en la a e ioscle osis es la acumulación del coles e ol, p incipalmen e p o enien e de las lipop o eínas de baja densidad (LDL), en la ma iz subendo elial. Cuando exis e un exceso de LDL ci culan e, aumen a el anspo e y la e ención de las mismas en los luga es dónde la pe meabilidad endo elial es mayo . Las LDL di unden a a és del endo elio y quedan e enidas debido a la in e acción en e la molécula de la apolipop o eína B (apoB) de las LDL y los p o eoglicanos de la ma iz subendo elial [3]. La acumulación de pa ículas de LDL INTRODUCCIÓN 24 es imula en el endo elio la p oducción de moléculas p oin lama o ias; es o ocasiona la llegada de monoci os y lin oci os a la pa ed a e ial, que median e sus ecep o es sca enge econocen y cap an las lipop o eínas modi icadas y o as pa ículas. La cap ación indisc iminada de lípidos po pa e de los mac ó agos p oduce su acumulación en el in e io de la célula ans o mándose en lo que se conoce como células espumosas. (Figu a 1a). Figu a 1: P og esión de la lesión a e ioscle ó ica. a) inicio de la lesion b) o mación de la es ia g asa c) lesión a anzada o placa ib osa d) up u a de la placa/ ombosis [2]. El siguien e paso en el desa ollo de la a e ioscle osis es la o mación de la placa ib osa que se ca ac e iza po un aumen o de la masa lipídica ex acelula , p incipalmen e coles e ol y és e es de coles e ol, la p oli e ación de células muscula es lisas (CMLs) y la o mación de una cubie a p o eica de ma iz ex acelula p oducida po las CMLs [4]. La placa ib osa se inicia con la mig ación de las CMLs desde la INTRODUCCIÓN 25 capa media hacia la ma iz subendo elial. Allí las células p oli e an y cap an las lipop o eínas modi icadas con ibuyendo así, jun o con las células espumosas de i adas de los mac ó agos, al eng osamien o del núcleo lipídico. Las CMLs sec e an p o eínas de la ma iz ex acelula , como colágeno y p o eoglicanos, conduciendo al desa ollo de la placa ib osa [5] (Figu a 1b). La espues a p oli e a i a de las CMLs y de las células in lama o ias hace que la es ía g asa e olucione a una placa a e ioscle ó ica más compleja lle ando la lesión a es adíos más a anzados que implican mue e celula , o u a de las placas, calci icación y p ocesos ombó icos. (Figu a 1c). Las placas a e oma osas más a anzadas p esen an un núcleo nec ó ico que consis e en un g an núcleo lipídico odeado po una delgada cubie a ib osa. La up u a de la placa (Figu a 1d) p o oca ombosis y ocu e gene almen e en si ios donde la cubie a ib osa es más delgada. Es e adelgazamien o de la cubie a es debido a la ac i ación de los mac ó agos, que libe an me alop o einasas y o as enzimas p o eolí icas. Es as enzimas p o ocan la deg adación de la ma iz y con ello la up u a del endo elio, lo que puede p o oca la o mación del ombo y la oclusión de es a a e ia. Las placas más complejas ambién pueden p esen a depósi os de calcio lo que ocasiona un cambio en las ca ac e ís icas mecánicas del ejido a e ial, con ibuyendo a la ines abilidad de la placa y limi ando la lexibilidad de los asos sanguíneos. Los componen es in e nos de la placa y el ac o isula inician la cascada de la coagulación que p o oca la adhesión de las plaque as ci culan es y que, a su ez, pueden p oduci ombosis po oclusión de la luz ascula [5]. El es echamien o p og esi o de la luz a e ial puede aca ea sín omas isquémicos ales como in a o de mioca dio o en e medad ce eb o ascula . INTRODUCCIÓN 32 La p o eína p incipal de es as pa ículas, la apo B-100, es una de las p o eínas monomé icas más g andes. Es á si uada odeando la supe icie de la lipop o eína y iene una es uc u a pen apa i a cons i uida po dominios con hélice α y hoja β [15]. 3.2 ACUMULACIÓN INTRACELULAR DE COLESTEROL 3.2.1 Recep o de LDL La unción isiológica de la LDL en el plasma es anspo a el coles e ol a los ejidos pe i é icos, p oceso mediado po el ecep o de lipop o eínas de baja densidad ( LDL) [16]. EL ecep o de LDL ( LDL) es una p o eína ansmemb ana de una única cadena pep ídica con 839 aa 164 kD de peso molecula y que cons a de 5 dominios (Figu a 6): 1. Dominio de unión ico en cis eínas 2. Dominio de homología con el p ecu so del ac o del c ecimien o epidé mico (EGF) 3. Dominio ico en ca bohid a os 4. Dominio ansmemb ana 5. Dominio in aci oplasmá ico. [17-19] Figu a 6: Es uc u a del ecep o de LDL Se sin e iza en el e ículo endoplasmá ico [20] y as se sin e izado, es anspo ado al INTRODUCCIÓN 33 apa a o de Golgi, donde se glicosila y pasa a la memb ana. Allí se desplaza ans e salmen e has a si ua se en unas zonas denominadas “hoyos ecubie os” o mados po la p o eína cla ina, que si e de anclaje. El LDL econoce especí icamen e la apoB-100 y la apoE. Las lipop o eínas que con ienen a ias copias de la apo E (VLDL, IDL y a ias subclases de HDL) se unen al ecep o con más a inidad que la LDL que sólo iene una copia de apoB-100. El LDL econoce la apoB de la LDL e in e naliza la pa ícula. Una ez in e nalizada hay una deg adación lisosomal de la LDL que da luga a la hid ólisis de és e es de coles e ol y a la deg adación de la apoB-100. En es e p oceso se gene an aminoácidos, que son eu ilizados pa a la sín esis de nue as p o eínas, y coles e ol que es u ilizado pa a la o mación de memb anas. Figu a 7: Mecanismo del LDL [21]. El apo e de coles e ol p o enien e de la LDL sup ime la ac i idad del enzima 3- hid oxi-3-me ilglu a il coenzima A educ asa (HMG-CoA educ asa), que egula la sín esis del coles e ol y ac i a el enzima coles e ol acil ans e asa (ACAT) que ees e i ica el coles e ol. Es e coles e ol es e i icado se almacena en el ci oplasma INTRODUCCIÓN 34 [22]. Po o a pa e se inhibe la ansc ipción del gen de LDL, lo que pe mi e a las células egula el núme o de LDL pa a que haya el coles e ol su icien e pa a las necesidades me abólicas [22]. Es undamen al el acla amien o de la LDL a a és del LDL pa a man ene su concen ación en plasma en unos ni eles adecuados. Pa a que la in e acción en e el LDL y la LDL sea adecuada es impo an e que es a úl ima no enga su es uc u a al e ada. El coles e ol de LDL cap ado po las células a a és del LDL es no a e ogénico po que és e egula nega i amen e la sín esis celula endógena de coles e ol. [21]. 3.2.2 Recep o es sca enge (SR) Comp enden un di e so g upo de p o eínas di e en es es uc u almen e. Fue on iden i icados po B own y Golds ein que de inie on su capacidad pa a uni se a LDLs modi icadas, incluyendo la LDL ace ilada y la LDL oxidada, además de un amplio núme o de ligandos que p esen an la ca ac e ís ica común de se elec onega i os. Sin emba go la ca ga nega i a no es el único de e minan e de la unión de moléculas al ecep o sino que se necesi an cie os eque imien os es uc u ales pa a una unión e ec i a. Clásicamen e se han desc i o es ipos o clases de SR, los ecep o es ipo A, los ipo B y los C, pe o ambién se han encon ados o os como los de clase E (LOX 1), los de clase F (SREC-I SREC-II), los de clase G (SR-PSOX), Clase D (CD 68). Es án p esen es en di e en es ejidos ascula es y ipos celula es que an desde mac ó agos, a monoci os, plaque as, células espumosas y células endo eliales. Además es án p esen es en ejido adiposo y es e eoidogénico. INTRODUCCIÓN 35 Figu a 8: SR implicados en la a e ioscle osis [23]. 3.3 PAPEL DE LA LDL EN LA ARTERIOSCLEROSIS La a e ioscle osis es á ca ac e izada po la acumulación de coles e ol en la pa ed a e ial y se ha demos ado que el descenso de la concen ación plasmá ica de coles e ol educe la apa ición de e en os ca dio ascula es [24]. El coles e ol es anspo ado po la LDL p incipalmen e, que con iene ap oximadamen e el 70% del coles e ol ci culan e. El coles e ol es el lípido mayo i a io que se acumula en las placas de a e oma, además se han aislado lipop o eínas simila es a la LDL en lesiones a e ioscle ó icas, lo que indica que la LDL es la lipop o eína más a e ogénica. Es o se pone de mani ies o en el caso de la hipe coles e olemia amilia monogénica (HF) que cu sa con concen aciones ele adas de LDL en plasma debido a una al e ación en el ecep o de la LDL, con el consecuen e iesgo a e ioscle ó ico. La LDL na i a no p esen a ca ac e ís icas a e ogénicas pe o en el mic oambien e del espacio subendo elial ienen luga di e sos p ocesos que modi ican las p opiedades biológicas de la LDL. Es os p ocesos incluyen la lipope oxidación, la lipólisis, la p o eólisis y la unión a componen es de la ma iz ex acelula . La modi icación de la INTRODUCCIÓN 36 LDL en la pa ed a e ial juega un papel cla e en la iniciación y p og esión de la a e ioscle osis, ya que las LDL modi icadas ienen la capacidad de p omo e la acumulación subendo elial de coles e ol y desencadenan la espues a c ónica in lama o ia ca ac e ís ica de las lesiones a e oma osas [25]. Además, las LDL modi icadas se unen más a los p o eoglicanos de la ma iz ex acelula de la pa ed a e ial y a o ecen la e ención subendo elial de lipop o eínas, que se conside a el p oceso inicial de la a e ioscle osis [26]. 3.4 MODIFICACIONES DE LA LDL 3.4.1 Oxidación La modi icación más es udiada que causa la acumulación de coles e ol es la modi icación oxida i a que p oduce nume osas modi icaciones químicas en las acciones lipídicas y p o eicas. Las p opiedades a e ogénicas de la LDL oxidada (oxLDL) se a ibuyen a su capacidad pa a con ibui en la o mación de células espumosas así como al eclu amien o de los monoci os ci culan es a la in ima a e ial, induciendo la ag egación plaque a ia y o os e ec os p o-in lama o ios y p o- ombó icos [27]. Las bases molecula es de es os e ec os son di íciles de es ablece debido a la complejidad de la oxidación de la LDL, que en uel e un nume o inmenso de modi icaciones posibles de las acciones lipídicas y p o eicas. Es o es debido a la he e ogeneidad de la LDL y sus p oduc os de oxidación. Es os p oduc os dependen de los oxidan es u ilizados, la ex ensión de la oxidación la composición de la LDL y o os muchos ac o es. La eacción de oxidación es un p oceso con inuo, pe o se pueden dis ingui a ias e apas (Figu a 9). P ime o la oxidación de la LDL a aca al doble enlace de los ácidos g asos insa u ados y gene a oxis e oles, liso os a idilcolina, hid ope óxidos, aldehidos y ce onas [28] y se gene a la LDL mínimamen e modi icada (MM-LDL), que aún iene a inidad po el LDL. Cuando es os p oduc os eaccionan con la apoB se modi ican las INTRODUCCIÓN 37 p opiedades de la LDL, eliminando la ca ga posi i a de los esiduos de lisina y a ginina de la apoB. Es o p o oca un inc emen o de la ca ga nega i a de la pa ícula y po an o aumen a el econocimien o po los SR de los mac ó agos. Así, es os ecep o es in e nalizan la oxLDL y es a es deg adada. Figu a 9: Di e encia en e la OxLDL y la minimamen e modi icada MM-LDL. [29]. O o de los mecanismos esponsables del aumen o de la cap ación de las LDL oxidadas po mac ó agos es su mayo endencia a la ag egación [30] ya que se obse a un aumen o de la cap ación po mac ó agos después de la acción de agen es oxidan es como el cob e, adicales lib es o hipoclo i o que p omue en la ag egación de la LDL. En con apa ida, o os au o es han desc i o que la usión de la LDL inducida po calo disminuye g adualmen e as la oxidación p og esi a con a ios agen es debido a la agmen ación de la apon [31]. Los aspec os elacionados con la a e ogenicidad de los p ocesos de ag egación y/o usión de la LDL se comen an más ex ensamen e en los siguien es apa ados. INTRODUCCIÓN 38 En los mecanismos de oxidación hay que conside a que concu en ac o es adicionales que ac úan pa alelamen e a la oxidación in i o, como la os olipasa A2 asociada a lipop o eínas (Lp-PLA2, ambién conocida como ace ilhid olasa del ac o ac i ado de plaque as, PAF-AH) que puede gene a ácidos g asos lib es (FFA), los cuales son agen es induc o es de usión de lipop o eínas [32]. 3.4.2 Ag egación y/o usión Modi icaciones de la es uc u a de la supe icie de la LDL pueden p o oca una pé dida de su es abilidad que a ec a á a las in e acciones en e las pa ículas y p o oca á su ag egación y consiguien e usión. La modi icación ex ensi a de un solo componen e de la supe icie de la LDL es su icien e pa a p o oca su ag egación y/o usión. La ag egación de la LDL pone en con ac o la supe icie de di e en es pa ículas de LDL pe o p oduce la usión de es as pa ículas, po ello se puede conside a que la ag egación no modi ica el amaño de las pa ículas indi iduales. Sin emba go, si es a modi icación es su icien emen e ex ensa la ene gía de es abilización p o oca á la usión de las pa ículas, que es un p oceso i e e sible, a di e encia de la ag egación que es e e sible [30]. Figu a 10: Ag egación y usión de la LDL [33]. INTRODUCCIÓN 39 La ag egación de las lipop o eínas es impo an e en la a e ogénesis po al menos dos azones. La p ime a es que la LDL ag egada es un po en e induc o de la o mación de células espumosas, y la segunda que la ag egación de las lipop o eínas en el espacio subendo elial inc emen a la can idad de lipop o eína e enida [34]. La desin eg ación de las lipop o eínas y libe ación de los lípidos apola es del núcleo con luyen en la o mación de go as lipídicas o lipids d ople s. El inc emen o de la cap ación de las pa ículas de LDL ag egadas, usionas y los lipid d ople s po los mac ó agos pe mi e la o mación de células espumosas e inicia la a e ioscle osis [33]. 3.4.2.1 Lipólisis Modi icación de la LDL po es ingomielinasa Se conocen a ios ipos de SMasa, aunque la elacionada con la ag egación de la LDL es la SMasa sec e o a (sSMasa). Es e enzima se hipe exp esa en la in ima a e ial lesionada y es sec e ado po mac ó agos y células del músculo liso. La sSMasa es una enzima dependien e de zinc que hid oliza la es ingomielina (SM) gene ando os ocolina y ce amida, es po an o una os olipasa de ipo C (PLC). T as la hid ólisis, la os ocolina (pola ) se libe a de la supe icie mien as que la ce amida, que es apola , queda e enida en la LDL, po lo que hay un inc emen o de los lípidos apola es en la supe icie de la pa ícula. El aumen o de ce amida, a a és de las in e acciones hid o óbicas de es as moléculas pa a p o ege se del en o no pola , induce la ag egación de la LDL, y es os ag egados inducen la o mación de células espumosas in i o. Las LDLs ag egadas que se han aislado de lesiones a e ioscle ó icas es án en iquecidas en ce amida, mien as que las pa ículas no ag egadas no [35]. Es e da o sugie e que la ce amida y, po an o, la SMasa, es án di ec amen e in oluc adas en la ag egación y usión de la LDL in i o. INTRODUCCIÓN 40 Modi icación de la LDL po la Fos olipasa C (PLC) La PLC hid oliza la os a idilcolina (PC) pa a gene a os ocolina y diacilglice ol. La os ocolina se libe a a la supe icie mien as que el diacilglice ol al se apola se edis ibuye desde la supe icie has a el núcleo de la LDL lo que gene a un desequilib io hid o óbico que p omue e la ag egación y usión de la LDL. Es un p oceso simila al de la lipólisis median e SMasa, con la di e encia que, al se la can idad de PC mucho mayo que la de SM (70% de los os olípidos de la LDL s 20%) el e ec o de inducción de ag egación es mucho más d ás ico. Se ha demos ado que la ag egación y usión p o ocadas po la PLC puede p e eni se po las apolipop o eínas in e cambiables pola es que ienen ele ada a inidad po la supe icie de la LDL [36], lo que co obo a la idea de que la usión de la LDL después de la hid ólisis po PLC es debida a la exposición en la supe icie de zonas hid o óbicas. Sin emba go, no hay e idencias de que la PLC se exp ese de o ma aumen ada en la lesión a e ioscle ó ica. No obs an e, se ha de ec ado una ac i idad de ipo os olipasa C en una acción mino i a ia elec onega i a de la LDL p esen e en plasma, lo que pod ía con ibui al aumen o de las p opiedades p o-a e ogénicas de es as pa ículas [37]. Los aspec os elacionados con es a ac i idad de ipo PLC (PLC-like) asociada a la LDL elec onega i a son comen ados en mayo de alle más adelan e. Modi icación de la LDL po la Fos olipasa A2 sec e o a (sPLA2) La sPLA2 se sec e a a la ci culación bajo condiciones in lama o ias, simila es a las que se dan en la lesión a e ioscle ó ica, e hid oliza los os olípidos en la posición sn-2 libe ando FFA insa u ados y liso os olipidos. Una hipe exp esión de la sPLA2 puede con ibui a la a e ogénesis induciendo la ag egación de la LDL, usión y e ención po p o eoglicanos. INTRODUCCIÓN 41 Modi icación de la LDL po la Fos olipasa A2 asociada a lipop o eínas (Lp-PLA2) La sPLA2 es di e en e a la ac i idad Lp-PLA2 que se ha comen ado en el apa ado de oxidación de lipop o eínas. La Lp-PLA2 es un enzima asociado a lipop o eínas, p incipalmen e a LDL y HDL. El con enido de Lp-PLA2 es a aumen ado en las LDL que se conside an más a e ogénicas, las LDLs pequeñas y densas y la LDL elec onega i a. Es o sugie e que la Lp-PLA2 con ibuye al aumen o de las p opiedades p o-a e ogenicas de las LDL pequeñas y densas y las LDL elec onega i as. Sin emba go, en es e caso la acción a e ogénica de la Lp-PLA2 no se ía median e la es imulación de la ag egación de LDL, sino median e la gene ación de lípidos in lama o ios y es a ía p incipalmen e elacionada con los p ocesos in lama o ios ca ac e ís icos de la lesión a e ioscle ó ica. 3.4.2.2 P o eólisis Se ha is o que la deg adación p o eolí ica de la apoB-100 de la LDL p o oca ag egación y usión de las pa ículas de LDL. Pa a que se induzca la usión es necesa io que agmen os de los pép idos de la apoB-100 se libe en de la pa ícula pa a que se gene en zonas hid o óbicas que sean lo su icien emen e ines ables como pa a inicia la usión de la LDL. [38]. La apoB-100 es un componen e impo an e de la supe icie de la LDL y po lo an o, cualquie pé dida pa cial de apoB-100 de la supe icie de la pa ícula de LDL es p obable que p oduzca la eo ganización de la supe icie y, como consecuencia, ambién de los lípidos del núcleo. La modi icación de la LDL po p o eólisis ha sido ampliamen e es udiada in i o usando α-quimo ipsina y se ha obse ado que el a amien o de la LDL con α- quimo ipsina p o oca la ines abilidad de la pa ícula y conduce a la o mación de pa ículas de mayo amaño y que se unen con mayo ue za a los p o eoglicanos. [39]. INTRODUCCIÓN 48 Se desconoce qué componen es de la LDL(-) son los esponsables de sus p opiedades in lama o ias. La liso os a idilcolina (LPC) y los NEFA se encuen an aumen ados en la LDL(-) [72] ambos son mediado es de la in lamación [73] po lo que pod ían se esponsables de su e ec o induc o de la libe ación de quimioquinas en células endo eliales. Recien emen e se ha desc i o que la gene ación de ce amida, quizás gene ada po la ac i idad PLC-like, ambién puede ene un papel en la acción in lama o ia. Exis en a ios mecanismos enzimá icos que al ac ua sob e la LDL o iginan un aumen o en su ca ga nega i a y en el con enido de LPC y NEFA: sPLA2, SMasa, coles e ol es e asa (CEasa) o Lp-PLA2 (PAF-AH). Además, es as modi icaciones enzimá icas a ec an a la con o mación de la LDL [14] y pueden se esponsables de su meno a inidad po el LDL y mayo ag egabilidad. 4.3 AGREGACIÓN DE LA LDL(-) La LDL(-) ag ega espon áneamen e o mando es uc u as de ipo amiloide, es as es uc u as es án compues as de una alineación de pa ículas de LDL(-) no usionadas que se amon onan. Además de au o-ag ega se, la LDL(-) iene la capacidad de induci la ag egación de la LDL na i a, lo que sugie e que la LDL(-) iene p opiedades amiloidogénicas. Se ha suge ido que es a p opiedad es debida a la con o mación ano mal de la apoB en la LDL(-) con mayo con enido p opo cional en es uc u as be a, que induce el cambio es uc u al de la apoB en pa ículas de LDL na i as. Sin emba go, su ac i idad PLC in ínseca ambién pa ece es a implicada en es e p oceso. La ac i idad PLC-like hid oliza los os olípidos, gene ando lipop o eínas ag egadas (agLDL(-)) que pueden de ec a se en ci culación plasmá ica y que ep esen an el 0,25-0.5% de la LDL o al. Análisis de mic oscopia elec ónica de agLDL(-) aislada del plasma han e elado que es a sub acción se encuen a ag egada pe o no usionada. Po an o, es as pa ículas pueden a a esa la in ima de la pa ed a e ial. En á eas de lesión a e ioscle ó ica hay una hipe exp esión de p o easas y INTRODUCCIÓN 49 lipasas implicadas en la ag egación de la LDL. Es os enzimas jun o a la ac i idad PLC- like in ínseca pueden acele a la usión de la agLDL(-). Es as lipop o eínas usionadas ienen mayo unión a los p o eoglicanos y po an o quedan ácilmen e e enidas en el espacio subendo elial. La Figu a 12 esquema iza la posible implicación de la agLDL(-) en el desa ollo de la a e ioscle osis. Figu a 12: Mecanismo de o mación de LDL(-), ag egación y unión a p o eoglicanos. [64] INTRODUCCIÓN 50 5- APOLIPOPROTEINA J O CLUSTERINA 5.1 GENERALIDADES La apolipop o eína J, (apoJ), ambién conocida como clus e ina (CLU), es á codi icada en humanos po un único gen de nue e exones, localizado en el c omosoma 8p21- p12. La apoJ se puede p esen a de acue do a su localización en dos iso o mas di e en es, la o ma nuclea de clus e ina (nCLU) y la o ma sec e o a (sCLU o apoJ). Las dos iso o mas ienen di e en es unciones como esul ado de un mecanismo de “splicing” al e na i o que gene a cadenas polipep ídicas de di e en e longi ud. Además, la apoJ su e una se ie de modi icaciones pos - aducionales, como son la unión en e las dos subunidades po puen es disul u o, glicosilación, os o ilación y oxidación de los enlaces disul u o en e los esiduos de cis eína (Figu a 13).[74] Figu a 13: Es uc u a del gen de la apoJ [74]. La o ma p edominan e de apoJ es la sec e o a, que es una p o eína glicosilada de 76- 80 kDa he e odimé ica unida po puen es disul u o, con 449 aminoácidos, de los que los 22 p ime os co esponden a la secuencia señal sec e o a hid o óbica [75]. La cadena polipep ídica se ompe p o eolí icamen e pa a elimina el pép ido señal y en e los esiduos 227/228 pa a gene a las cadenas α y β, que se unen an ipa alelamen e po cinco puen es disul u o pa a o ma la molécula he e odimé ica [76]. (Figu a 14). INTRODUCCIÓN 51 Figu a 14: Es uc u a de la apoJ [76]. La clus e ina se exp esa en odos los ejidos y es una p o eína abundan e en luidos biológicos incluyendo plasma, o ina, luido ce eb oespinal y semen [77-79]. La o ma nuclea es á es echamen e elacionada con el cánce y la egulación de la apop osis, el ciclo celula y la epa ación de DNA, mien as que la o ma sec e o a (sCLU o apoJ) juega un papel impo an e en las en e medades me abólicas asociadas con la in lamación y el es és oxida i o como la obesidad, la esis encia a la insulina, la diabe es y la a e ioscle osis. Se ha demos ado que la apoJ es una chape ona ex acelula , ya que iende a uni se a p o eínas pa cialmen e desna u alizadas con dominios hid o óbicos [80] inhibiendo la p ecipi ación inducida po es és de di e en es p o einas in i o [81, 82]. Su acción pod ía se p o ec o a educiendo la ex ensión de la p og esión de en e medades asociadas con la abundancia de p ecipi ados p o éicos. Localización Ex acelula /In acelula de la apoJ La Figu a 14 mues a el mecanismo median e el cual la apoJ es exc e ada. El mRNA de la apoJ se di ige al e ículo endoplasmá ico (ER) pa a la adución (1), la p o eína aducida se p ocesa en el apa a o de Golgi y se sec e a al espacio ex acecula apical INTRODUCCIÓN 52 (1’) o basola e al (1”). En las células que ienen una ía de exoci osis egulada, la sec eción de apoJ depende de la señal ex acelula ap opiada. Figu a 14: Mecanismo de exc eción de la apoJ [83]. G:apa a o de Golgi; NP:P o einas no males; En: endoci osis; L:lisosoma; Cy :ci osol; DP:p o eínas dañadas; Re: Recep o endocí ico; M.Mi ocond ía; N: núcleo; ER: e ículo endoplasmá ico; ERAD: deg adación de p o eínas asociadas al ER; R: ibosoma; SV: esicula sec e o a; P: p o easomas. En el espacio ex acelula , la apoJ puede ac ua como chape ona con p o eínas no males (NP) o uni se a p o eínas dañadas (DP) y di igi las a los lisosomas (L) po unión al ecep o endocí ico (Re) gp330/megalina/LRP2 o a o os ecep o es desconocidos. En algunas células, la apoJ puede e i a la ía sec e o a (3, 3’) y localiza se en compa imen os in acelula es: la mi ocond ia, el núcleo y el ci osol (Figu a 14). INTRODUCCIÓN 53 5.2 FUNCIÓN DE LA apoJ COMO CHAPERONA Las chape onas molecula es son un g upo di e so de p o eínas que in e accionan con p o eínas o al o pa cialmen e desplegadas pa a es abiliza las y p e eni su ag egación y p ecipi ación [83]. Condiciones como el es és é mico y el oxida i o pueden causa el desplegamien o pa cial de las p o eínas y su ag egación. Se ha p opues o que la apoJ es una de las abundan es chape onas ex acelula es que o man pa e del sis ema de con ol que ac úa pa a es abiliza las p o eínas ag egadas y media su acla amien o a a és de endoci osis mediada po ecep o y deg adación lisosomal. [84, 85]. Figu a 15: Mecanismo de acción de la apoJ [86]. Bajo condiciones de es és, una p o eína na i a comienza a desplega se y adop a una se ie de es ados in e medios plegados (I1 y I2) (Figu a 15). En es e ejemplo, el in e media io I2 iene mayo exposición de zonas hid o óbicas que acili an su ag egación median e una ía i e e sible. La apoJ en solución ambién o ma ag egados de a ios amaños y su o ma ac i a es un he e odíme o de 80kDa, que se INTRODUCCIÓN 54 une al in e media io I2 y o man un complejo de al o peso molecula . Hay dos ases en el p oceso de in e acción de la apoJ y el es ado I2. En p ime luga , I2 se es abiliza y se p e iene su ag egación y, a con inuación, se o ma un complejo de al o peso molecula con la apoJ. Se ha demos ado que du an e si uaciones de es és la apoJ ala ga la ida media del es ado in e medio I2, lo cual indica que la apoJ es abiliza la o ma no ag egada (p obablemen e monomé ica) de es e in e media io. Todo es o sugie e que la apoJ o ma complejos con es ados in e medios de ag egación [87]. La dis ibución de la clus e ina en e las di e en es o mas ag egadas es independien e de la empe a u a en el ango 37-50ºC. Además, la habilidad de la apoJ de uni se a las p o eínas y su capacidad pa a p e eni la p ecipi ación apenas mues a a iación en es e ango de empe a u as. Po el con a io, el es ado de ag egación si es sensible al pH, es ando la o mación de la o ma de 80 kDa monomé ica a o ecida con una acidez media. Es o es á co elacionado con el inc emen o de exposición de zonas hid o óbicas de la apoJ y el aumen o de su unión a la p o eína na i a sin apenas ningún cambio en su es uc u a secunda ia a es e pH [88] [89]. Es udios de in e acción de la apoJ con o mas es uc u ales di e en es de α- lac oalbúmina, -c is alina y lisozima mues an que la apoJ no se une a la o ma na i a, sino que pe manece es able en disolución como monóme o. En cambio, sí que se une a la o ma educida de es as p o eínas que ag ega y p ecipi a len amen e. Dado que las o mas na i a y educida de la p o eína ienen la misma es uc u a secunda ia, las di e encias de a inidad con la apoJ no se pueden explica en base a es o, sino a pequeñas di e encias de su con o mación que a o ecen una mayo exposición de zonas hid o óbicas de la o ma educida. Es a mayo habilidad de la apoJ de in e acciona con p o eínas que ienen un p oceso de ag egación y p ecipi ación len o, y su capacidad pa a p e eni lo, sugie e que los ac o es ciné icos son impo an es pa a egula la e icacia de la acción de la INTRODUCCIÓN 55 chape ona. La apoJ se une y es abiliza a p o eínas que se ag egan y p ecipi an len amen e pe o no iene la capacidad de es abiliza p o eínas que se hayan ag egado y p ecipi ado muy ápidamen e [87]. 5.3 RELEVANCIA FISIOPATOLÓGICA La p esencia de apoJ es á asociada con depósi os de p o eínas ex acelula es incluyendo depósi os de inmunoglobulinas en en e medad enal, depósi os de p iones en la en e medad de C eu z eld -Jakob, placas amiloides en en e medad de Alzheime y placas a e ioscle ó icas. La p esencia de apoJ en es os depósi os sugie e que es á asociada con el desplegamien o de p o eínas in i o. La deposición pa ológica de es as p o eínas puede se consecuencia de que la capacidad de la apoJ de p e eni la acumulación de ag egados de p o eínas es á sob epasada po concen aciones ele adas de p o eínas desplegadas. De acue do con es as obse aciones, la exp esión de la apoJ es á aumen ada en en e medades ca ac e izadas po p o eínas mal plegadas, ag egación y p ecipi ación, po ejemplo en el Alzheime y la en e medad de C eu z eld -Jakob [90]. La apoJ ha sido elacionada con di e sas en e medades incluyendo en e medad ca dio ascula , sínd ome me abólico, en e medades degene a i as, in lamación y cánce [91-93]. Su concen ación es a aumen ada du an e la ase emp ana del in a o de mioca dio y el daño ascula [94], y se ha obse ado que, debido a su papel ci op o ec o , la adminis ación in a enosa de apoJ educe el amaño del in a o de mioca dio en a as [95]. A endiendo a la implicación de la apoJ en el sínd ome me abólico, se ha encon ado que la glucosa eje ce una egulación posi i a en la exp esión de apoJ en hepa oci os [96] y los polimo ismos de su gen es án asociados con la diabe es melli us ipo 2 [97]. El papel de la apoJ du an e la neu odegene ación es p incipalmen e ci op o ec o , debido a su unción como chape ona. Se ha iden i icado la apoJ como un de e minan e INTRODUCCIÓN 56 gené ico signi ica i o en la en e medad de Alzheime , y se c ee que la asociación en e los pép idos amiloidogénicos y la apoJ con ibuyen a limi a el mal plegamien o de las especies de pép ido amiloide β (Aβ) acili ando su acla amien o del espacio ex acelula [98]. Además, el con enido de apoJ en plasma es á asociado con la a o ia del có ex en o inal, la se e idad de la en e medad y la p og esión clínica del Alzheime [99]. La concen ación media de apoJ en plasma es de al ededo de 100 µg/ml, y es 10 eces más al a en semen [100, 101]. La concen ación plasmá ica aumen a en diabe es ipo 2 y du an e el desa ollo de en e medad co ona ia o in a o de mioca dio. En es udios más ecien es, como el es udio de Kuji aoka e al. en población japonesa, han encon ado asociada la concen ación de apoJ a la abundancia de lesiones en a e ias co ona ias en la en e medad de Kawasaki. Su concen ación en plasma es á elacionada posi i amen e con la concen ación de glucosa en sang e y se halla aumen ada en pacien es con diabe es ipo 2 [102]. O os es udios han encon ado que la concen ación de apoJ es á inc emen ada en pacien es con cánce de p ós a a, ca cinoma hepa ocelula no di e enciado y cánce de ejiga. En es e úl imo ambién se han encon ado concen aciones de apoJ aumen adas en o ina [103]. INTRODUCCIÓN 57 6- IMPLICACIÓN DE LA apoJ EN LA ARTERIOSCLEROSIS La p ime a e idencia de la elación de la apoJ en el desa ollo de a e ioscle osis es la iden i icación de apoJ en lesiones a e ioscle ó icas y el hecho de que su dis ibución en la pa ed a e ial aumen a con la p og esión de la a e ioscle osis [104, 105]. Es o se debe en pa e a un aumen o de la exp esión de apoJ po pa e de las células de la pa ed a e ial, pe o ambién p obablemen e a la il ación de las lipop o eínas del plasma. La apoJ mues a una dis ibución en la pa ed a e ial simila a la de la apoA-I y apoE, lo que sugie e que la apoJ pod ía ene un papel p o ec o en la a e ioscle osis a o eciendo el aspo e de coles e ol desde la pa ed a e ial al hígado median e la acción combinada de la apoJ y HDL que con ienen apoA-I y apoE [105]. Es a posible acción p o ec o a concue da con es udios que han mos ado que la apoJ p omue e el e lujo de coles e ol de líneas celula es de mac ó agos humanos THP-1 y U937 [106], lo que sugie e que la apoJ con ibuye a emo e el exceso de coles e ol de las células espumosas en las lesiones a e ioscle ó icas. Además, ya se ha comen ado an e io men e que la concen ación de apoJ es á aumen ada du an e la ase emp ana del in a o de mioca dio [94], y se ha pos ulado que puede se un impo an e agen e ci op o ec o en ca diomioci os isquémicos [107]. En un es udio in i o con sue o de a ón se ha desc i o que la apoJ se une o mando complejos a la lep ina, una ho mona p oducida po los adipoci os implicada en la egulación del peso co po al median e el con ol del ape i o. Es os complejos lep ina/apoJ se han encon ado p esen es an o asociados a la HDL como en el sue o sin lipop o eínas [108]. Es a unión sugi ió que la apoJ pod ía ac ua como un posible modulado de la acción de la lep ina aunque pos e io men e en un es udio en pacien es adolescen es obesos no se encon ó co elación en e la apoJ y la lep ina. [109]. Po o a pa e, en o o es udio en pacien es con en e medad co ona ia, se ha mos ado una co elación nega i a en e la apoJ y la lep ina, de al mane a que HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 64 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 65 La apolipop o eína J es una chape ona ex acelula que o ma pa e del sis ema de con ol que ac úa pa a es abiliza las p o eínas ag egadas y media su acla amien o. Una acción impo an e de la apoJ se asocia a las lipop o eínas en plasma, siendo más abundan e en la HDL pe o ambién hay una pequeña pa e unida a la LDL y VLDL. Di e sos es udios han desc i o que el con enido de apoJ en la HDL de pacien es con al o iesgo ca dio ascula se encuen a disminuido. También se ha desc i o que la apoJ es á aumen ada en la LDL de pacien es con diabe es. Es as obse aciones sugie en que p obablemen e la p incipal unción de la apoJ en el desa ollo de la a e ioscle osis es é elacionada con su capacidad pa a modula la uncionalidad de las lipop o eínas. Sin emba go, su dis ibución exac a en cada lipop o eína no ha sido de e minada con p ecisión, ni ampoco la p opo ción de apoJ que se encuen a asociada a las lipop o eínas o en o ma lib e. Un aspec o que pod ía se especialmen e ele an e es el papel que puede ene la apoJ que es á unida a la LDL. Dado que la ag egación de la LDL en la pa ed a e ial es un p oceso cla e en el desa ollo de la a e ioescle osis y que la ac i idad chape ona de la apoJ egula la o mación de ag egados p o éicos, se deduce ácilmen e que la apoJ unida a la LDL pod ía ene un papel impo an e en el p oceso de ag egación y usión de es a lipop o eína y, en consecuencia, pod ía modula la e ención subendo elial de lipop o eínas. Los obje i os que se han plan eado en la p esen e Tesis Doc o al, ag upados en las dos publicaciones p esen adas, son los que se exponen a con inuación: Publicación 1 1- De e mina el con enido de apoJ en las sub acciones de LDL con mayo o meno a e ogenicidad p esen es en el plasma. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 66 2- Compa a las ca ac e ís icas ísico-químicas de la LDL que con iene apoJ con la LDL que no con iene. 3- Es udia el papel que juega la apolipop o eína J en el p oceso de ag egación de la LDL. Publicación 2 4- De e mina la dis ibución de la apoJ en cada lipop o eína y en el sue o lib e de lipop o eínas. 5- Analiza el e ec o del pe il lipop o eíco en la dis ibución de la apoJ en las lipop o eínas. 6- Compa a la concen ación en sue o de apoJ y su dis ibución en e las lipop o eínas, en e suje os no molipémicos e hipe lipémicos. MATERIAL Y MÉTODOS 67 MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 68 MATERIAL Y MÉTODOS 69 1. OBTENCIÓN DE LIPOPROTEÍNAS 1.1 AISLAMIENTO PREPARATIVO DE LDL A PARTIR DE UN POOL DE PLASMAS. Es e es el p ocedimien o que se ha u ilizado en la p ime a pa e de la esis. Se ecogie on plasmas de indi iduos no molipémicos en ubos acu aine con EDTA como an icoagulan e y se conse a on a -80ºC. A pa i de la mezcla de es os plasmas pueden aisla se las di e en es lipop o eínas basándose en su di e encia de densidades, de acue do con el siguien e ango: quilomic ones<0,96 g/mL, VLDL 0,96- 1,006 g/mL, IDL 1,006-1,019 g/mL, LDL 1,019-1,063 g/mL, Lp(a) 1,050-1,100 g/mL y HDL 1,063-1,210 g/mL. Con es as di e en es densidades se pueden sepa a las lipop o eínas u ilizando un aislamien o secuencial median e ul acen i ugación de lo ación. El plasma es á a una densidad inicial de 1,006 g/mL, pa a lle a lo a la densidad deseada se añade la can idad de KB necesa ia según la siguien e ó mula de Radding y S einbe g: Volumen (mL)  (densidad inal – densidad inicial) G amos KB = 1-(0,312 x densidad inal) En nues o caso, como que emos aisla la LDL abajamos en un ango de densidad de 1,019-1,050 g/mL. Es e ango se escogió pa a e i a con aminación con la Lp(a). En un p ime paso se añade al plasma la can idad necesa ia de KB pa a llega a la densidad de 1,019 g/mL, se agi a sua emen e pa a e i a la ag egación y se di ide el olumen de plasma en ubos de polica bona o de pa ed ígida de 20 mL. Después se supe pone a cada ubo una solución de la misma densidad, se equilib an los ubos po peso y se ponen en los o o es de ángulo ijo (TFT 70.38 o TFT 55.38, Kon on) pa a lle a a cabo la cen i ugación a 100000 g (36000 pm) du an e 20 ho as a 4ºC. MATERIAL Y MÉTODOS 70 Las lipop o eínas de densidad in e io a 1,019 g/ml (VLDL+IDL) lo an y quedan sepa adas del in anadan e que con iene LDL, Lp(a) y HDL. T as la aspi ación de la acción VLDL/IDL po aspi ación,el in anadan e se ecoge en una p obe a y se lle a al olumen que eníamos inicialmen e de plasma o al adicionando solución de densidad 1,019 g/mL. Pa a lle a el siguien e paso de es e aislamien o secuencial necesi amos lle a el plasma a una densidad de 1,050 g/mL añadiendo la can idad necesa ia de kB . Se uel e a p ocede igual que en el caso an e io y se some en los ubos a un p oceso de ul acen i ugación a 36000 pm du an e 20 ho as a 4ºC. La LDL lo a as la segunda ul acen i ugación y puede sepa a se po aspi ación. Una ez aislada, se conse a a 4ºC y se elimina el KB dializándola en saco de diálisis con ampón A. Es e ampón es á compues o de T is-HCl 10 mM y EDTA 1 mM (pa a p e eni la oxidación) a pH 7,4. Después de la diálisis se il a la LDL po 0,2 m pa a elimina los ag egados. 1.2 AISLAMIENTO DE LIPOPROTEINAS A PARTIR DE 1 ml DE PLASMA Mé odo KB : Igual que en el apa ado an e io basándose en las di e en es densidades de las lipop o eínas se pueden sepa a u ilizando un aislamien o secuencial median e ul acen i ugación de lo ación. Se u ilizan ubos de ul acen i uga de polica bona o de pa ed ígida de 2,5 ml en los que se coloca 1 ml de plasma. El p ime paso es lle a el plasma que es á a una densidad 1,006 g/mL a densidad 1,019, pa a ello u ilizando la ó mula de Radding y S einbe g se cálculan los g amos de KB que se han de añadi . En ez de pesa el KB , u ilizamos las soluciones de densidad que es án p epa adas. Po an o, se añaden 1,402 ml de solución 1,006 + 98 µl de solución 1,340, se agi a sua emen e y se pone en la ul acen i uga a 36000 pm du an e 18 ho as. MATERIAL Y MÉTODOS 71 A con inuación, se ecogen po aspi ación la VLDL que lo a y después se ecoge 1 ml del in anadan e y se pasa a un ubo limpio de 2,5 ml. Pa a aisla la LDL, se lle a el plasma a una densidad de 1,063 g/ml añadiendole 1,171 ml de solución 1,019 + 329 µl de solución 1,340, se agi a sua emen e y se pone en la ul acen i uga a 36000 pm du an e o as 18 ho as. La LDL lo a as la segunda ul acen i ugación y puede sepa a se po aspi ación. Se ecoge 1 ml del in anadan e y se lle a a una densidad 1,210 añadiendole 288 µl de solución 1,063 + 1,212 ml de solución 1,340 y se uel e a lle a a cabo la ul acen i ugación a 36000 pm du an e o as 18 ho as. Po úl imo se ecoge la HDL lo an e po aspi ación. Mé odo D2O/saca osa: U ilizamos el mé odo desc i o po S ahlman [119] lige amen e modi icado. Es simila al desc i o pa a el KB u ilizando soluciones de densidad pa a lle a a la densidad necesa ia pa a cada lipop o eína, pe o en es e caso las soluciones se p epa an con D2O/saca osa. Ejemplos de can idades necesa ias pa a p epa a las soluciones de densidad a pa i de solución 1,006 y Bu e A que con iene D2O/saca osa [119]: La VLDL/IDL (densidad <1.019 g/mL) y LDL (densidad 1.019 - 1.063 g/mL) se ob ienen después de 18h de ul acen i ugación a 45.000 pm. La acción de HDL (1.063 - 1.210 g/mL) se ob iene cen i ugando 96h a 45.000 pm. MATERIAL Y MÉTODOS 72 Las siguien e abla [119] p esen a las can idades de cada solución que se han de emplea pa a llega a las di e en es densidades: 1.3 AISLAMIENTO DE LDL ELECTRONEGATIVA La LDL(-) se sepa a de la LDL na i a (LDL(+)) median e c oma og a ía de in e cambio aniónico usando la columna HiLoad 26/10 Q-Sepha osa High Pe o mance (Ame sham Biosciences) adap ada a c oma og á o ÄKTA-FPLC (“ÄKTA-Fas P o ein Liquid Ch omaog aphy”, GE Heal hca e). La columna nos pe mi e abaja con olumen de mues a de has a 50 mL en cada c oma og a ía. Como ampón de unión a la columna se u iliza el ampón A que empleamos pa a la diálisis de la LDL (T is-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH 7,4) y como ampón de elución se usa el ampón B (T is-HCl 10 mM, NaCl 1 M, EDTA 1 mM pH 7,4). P ime amen e hay que hace un la ado de bombas y el equilib ado de la columna con ampón A, con un mínimo de dos olúmenes de columna. Después ya se puede ca ga la mues a en el loop de 50 mL e inyec a en el c oma óg a o. La sepa ación de las dos acciones de LDL en unción de la ca ga se ealiza u ilizando un g adien e de sal escalonado que se de alla a con inuación. Volumen (mL) % ampón B 0-120 0 120-163 0-10 (con inuo) 163-269 26 269-374 60 374-480 100 480-507 0 MATERIAL Y MÉTODOS 73 Con es e mé odo c oma og á ico se consiguen aisla las acciones LDL(+) y LDL(-) las cuales eluyen en los escalones de 26% (0,26 M NaCl) y 60% (0,6 M NaCl), espec i amen e. Después se concen an po cen i ugación u ilizando il os de 10 kDa de amaño de po o (Amicon, Millipo e). 1.4 SEPARACIÓN DE FRACCIONES LDL AGREGADA Y NO AGREGADA La LDL(-) ag egada (agLDL(-)) se sepa a de la acción no ag egada (nagLDL(-)) median e c oma og a ía de gel il ación usando la columna Supe osa 6 adap ada a c oma óg a o ÄKTA-FPLC (GE Heal hca e). U ilizamos un loop de 2 ml, pa a inyec a dicho olumen de LDL en el c oma óg a o a un lujo de 0,5 ml/min. Como ampón se u iliza una mezcla de ampón A (T is-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=7,4) y ampón B (T is-HCl 10 mM, NaCl 1 M, EDTA 1 mM pH=7,4) al 50%. La sepa ación de las dos acciones se p oduce po amaño, p ime o eluye la agLDL(-) a los 8-10 ml y después la nagLDL(-) a los 10-16 ml. Se ecogen acciones de 1 ml en eppendo s y después se concen an en il os de 10 kDa de amaño de po o (Amicon, Millipo e). 1.5 SEPARACIÓN DE FRACCIONES LDL CON Y SIN APO J 1.5.1 P epa ación columa NHS con an icue po apoJ El an icue po an i-apoJ (PAI-26903; The mo Scien i ic) se acopla a una columna HiT ap NHS (GE Heal hca e) pa a después sub acciona la LDL en la que con iene apoJ y la que no. La esina que usa es a columna es la NHS-ac i a ed Sepha ose High Pe o mance, diseñada pa a uni co alen emen e ligandos que con engan g upos amino a a és de del g upo eac i o N-hid oxisuccinamida (NHS) que se une a la aga osa. Usamos 100 µg de an icue po an i-apoJ y columnas HiT ap de 1 ml cada columna. Se p epa a el ampón de unión (0,2 M NaHCO3; 0,5 M NaCl; pH 8,3) y se disuel e el an icue po en es e ampón (en el olumen o al de las columnas que usemos). MATERIAL Y MÉTODOS 80 y en e en el gel, después se aumen a la co ien e a 100 V has a que el en e llegue al inal del gel. Tampón T is-glicina: T is 24 mM, Glicina 190 mM, SDS 0,1% pH 8,8 Tinción del gel: La inción se ealiza en Coomasie (Phas Gel Blue, Pha macia) o en ni a o de pla a (Sil e S ain Plus, BioRad) que es más sensible. Coomasie: Se pone el gel en el colo an e (azul de b omo enol 0,1%, me anol 40%, ácido acé ico 10% y H2O has a 1 L) has a que quede eñido (unos 30 minu os). Después se hacen sucesi os la ados con la solución decolo an e (me anol 50%, ácido acé ico 10%, glice ol 1% y H2O has a 1 L) has a que se ean las bandas de p o eína. Ni a o de pla a: Es un mé odo de al a sensibilidad. Se u iliza el gel Sil e S ain Plus de Bio-Rad. Todo el ma e ial u ilizado ha de se id io y se ha de la a p e iamen e con ácido ni ico al 50%. No se puede u iliza me al. - Lo p ime o, hay que ija el gel con la solución de ijación agi ando sua emen e 30 minu os. Si el gel es a eñido p e iamen e en Coomasie, nos sal amos es e paso. Solución de ijación: 50 ml me anol 10 ml ácido acé ico 10 ml concen ado de ijado 30 ml agua des ilada - Después se decan a la solución y se la an los geles con agua desionizada du an e 10 minu os agi ando sua emen e, es e p oceso se epi e dos eces. - Se p epa a la solución de inción y solución de acele ación jus o an es de usa las y se mezclan. Solución de inción: 2,5 mL Sil e Complex Solu ion 2,5 mL Reduc ion Mode a o Solu ion MATERIAL Y MÉTODOS 81 2,5 mL Image De elopmen Reagen Se en asa has a 25 ml con agua Solución de acele ación: 1,25 g De elopmen Accele a o Solu ion Se en asa has a 25 ml con agua Se mezclan es as dos soluciones y se añaden al gel. Se deja agi ando has a que se ean las bandas. - Después se e i a es a solución, y se añade la solución pa a de ene la eacción (solución de s op, ácido áce ico al 5%) du an e 15 minu os. - Se qui a la disolución de s op y la amos ex ensamen e con agua. 2.3.3 T ans e encia elec o o é ica Después de ealiza la elec o o esis en gel SDS que desna u aliza las p o eínas, es as se ans ie en a una memb ana de ni ocelulosa median e ca ga eléc ica. Las p o eínas se unen a la memb ana de ni ocelulosa median e in e acciones hid o óbicas, lo que pe mi e su de ección con an icue pos. P ocedimien o: - Se equilib a la memb ana de ni ocelulosa, papel de il o y esponjas en ampón de ans e encia pa a a o ece el p oceso. Tampón de ans e encia: 200 ml me anol 400 ml ampón T is-glicina con SDS (el mismo de la elec o o esis en SDS) 400 ml agua des ilada - Se coloca el gel con la memb ana de ni ocelulosa cubie as de papel de il o y esponjas en un case e y se me e den o de la cáma a de ans e encia con el ampón de ans e encia. Se co e 1 h y media a 30 V en ío. 2.3.4 Wes e n Blo - Se saca la memb ana del case e y se bloquea con caseína al 0,1 % en TBS (50 mM MATERIAL Y MÉTODOS 82 T is, 500 mM NaCl, pH 7,4) pa a e i a in e acciones inespecí icas en e la memb ana y el an icue po, ya que la caseína se une a la memb ana en las zonas donde las p o eínas no se han unido. - Se incuba la memb ana con el an icue po p ima io an i-apoJ (PAI-26903, The mo Scien i ic) diluido 1/1000 en TBS con caseína al 0,1% has a el día siguien e a 4ºC (o 2 ho as a 37ºC). - Se la a 3 eces con TTBS (TBS con 0,1% Tween 20). - Incubación con an icue po secunda io an i-cab a conjugado con HRP (dilución 1:2000, Jackson Immuno Resea ch) 2 ho as. - La memb ana se e ela con el ki Immune-S a TM HRP de Quimioluminiscencia (BioRad), es e eac i o eacciona con la HRP del an icue po secunda io y p oduce luminiscencia p opo cional a la can idad de p o eína de la mues a. La luminiscencia se cap a en una cáma a CCD (ChemiDoc, BioRad). 2. 4 MONITORIZACIÓN DE LA AGREGACIÓN 2.4.1 Inducción de la ag egación de la LDL Se indujo la ag egación de la LDL po di e en es mecanismos. - Ag egación espon ánea: Las LDLs se igualan a una concen ación de 2,5 mM de coles e ol con ampón A y se les añade BHT 2 M pa a p e eni la oxidación. Se incuban a 37ºC agi ándose has a 21 días. - Ag egación inducida po es ingomielinasa (SMasa): Las LDLs se igualan a una concen ación de 2,5 mM de coles e ol con ampón A, a con inuación se dializan en columnas PD10 equilib adas en ampón SMasa, ya que el enzima SMasa necesi a calcio pa a que se p oduzca la eacción. Se les añade BHT 2 M y SMasa (Bacillus ce eus sp., Sigma) a una concen ación inal de 25 mU/ml y se incuba a 37ºC du an e 48 ho as. MATERIAL Y MÉTODOS 83 Tampón SMasa: T is-HCl 10 mM, NaCl 40 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 10 mM, pH 7,4. - Ag egación inducida po -quimio ipsina (α-CT): Las LDLs se igualan a una concen ación de 2,5 mM de coles e ol con ampón A y se les añade BHT 2 M. Se incuba a 37ºC du an e 48 ho as con α-CT a una concen ación inal de 0,1 g/L, de es a mane a el a io mola LDL/α-CT se á 10/1. 2.4.2 Mé odos pa a moni o iza la ag egación 2.4.2.1 Abso bancia: Se mide la abso bancia a 450 y 680 nm de 200 l de LDL a 2,5 mM de coles e ol usando placas-UV de 96 pozos (G eine ) en un lec o de placas (Bio ek Syne gy HT). La abso bancia a es as dos longi udes de onda es indica i a de ag egación. A 450 nm la señal es más in ensa, aunque a 680 nm es más especí ica de es e p oceso. 2.4.2.2 P ecipi ación de lipop o eínas: Se cogen 200 l de LDL a 2,5 mM de coles e ol y se cen i ugan a 15000 pm du an e 10 minu os. La po ción de lipop o eína ag egada p ecipi a, se sepa a el sob enadan e y se mide el coles e ol. Los esul ados se exp esan como po cen aje de coles e ol no p ecipi ado. 2.4.2.3 C oma og a ía de gel il ación (CGF): Se lle a a cabo del mismo modo que el desc i o en el apa ado 1.3 2.4.2.4 Elec o o esis en g adien e de ac ilamida (GGE): Se lle a a cabo del mismo modo que el desc i o en el apa ado 2.2.1. 2.4.2.5 Mic oscopía elec ónica de ansmisión (TEM): Las LDLs se iñen nega i amen e con os o ungus a o de po asio al 2% y pH 7 sob e ejillas de ca bón. Se obse an y o og a ían las mues as en un mic oscopio elec ónico de ansmisión Jeol 120-kV JEM-1400 con una cáma a E langshen ES100 W CCD (Ga an, Abingdon, UK). MATERIAL Y MÉTODOS 84 2.4.2.6 Dic oismo ci cula (CD): Se analiza on las mues as de LDL a una concen ación de 50 mg de p o eina/L en PBS en una cube a de cua zo de 0,2 cm a 25ºC. Se ealiza on los espec os en un espec opola íme o JASCO J-175 en la egión del ul a iole a lejano (190-250 nm). Es e mé odo nos pe mi e p edeci el con enido de es uc u a secunda ia de una p o eína. 2.4.2.7 ATR-FTIR: Se analiza on mues as de LDL a una concen ación de 0,04 mg/dl en PBS a empe a u a ambien e. Pa a ello se ans ie en 5 µl de mues a a una supe icie de c is al de diaman e y se seca al ai e du an e 10 minu os y a con inuación se ealizan los espec os de in a ojos en modo abso bancia (4000-400 cm-1) un espec óme o Va ian Resolu ions P o spec ome e (Agilen Technologies, San a Cla a, CA, USA). Pa a cada medida se ecogen 400 espec os y se es a el blanco. 3. AISLAMIENTO DE APOLIPOPROTEINA J. La apoJ se aisla a pa i de sue o lib e de lipop o einas (LPDS). Pa a ello se some e el sue o a un p oceso de ul acen i ugación a 36000 pm, 18 ho as ajus ando a una densidad de 1,210 g/mL con KB . De es a mane a odas las lipop o eínas lo an mien as que el LPDS queda en la base del ubo. Una ez se iene el LPDS, pa a aisla la apoJ se u ilizan dos c oma og a ias en se ie, p ime o con la columna Blue Sepha ose y después con la NHS-apoJ. 3.1 CROMATOGRAFÍA CON LA COLUMNA BLUE SEPHAROSA U ilizamos dos columnas HiT ap Blue Sepha osa de 5 ml conec adas en línea pa a elimina el exceso de albúmina de las mues as de sue o, ya que se une co alen emen e a es a columna. Se inyec an 2 ml de LPDS. Como ampón de unión se u iliza PBS a pH 6, ya que a pH lige amen e ácido la apoJ se encuen a en o ma más monomé ica. Como ampón de elución (B) se u iliza el ampón de unión con KCl 2M. La mues a se eluye a un lujo de 1 ml/min con el siguien e g adien e: MATERIAL Y MÉTODOS 85 % ampón B minu os 0-20 20 20-100 10 100 20 0 20 El p ime pico del c oma og ama, co espondien e al LPDS sin albúmina se concen a al olumen inicial y se dializa en PBS a pH 6. 3.2 CROMATOGRAFÍA CON LA COLUMNA NHS-apoJ A pa i de la p ime a acción ob enida en la c oma og a ía an e io , se aisla la apoJ median e c oma og a ía de a inidad, u ilizando la columna HiT ap NHS con el an icue po an i-apoJ p epa ada p e iamen e (apa ado 1.4.1) adap ada al c oma og á o ÄKTA-FPLC (GE Heal hca e). Inyec amos 1 ml de LPDS en cada c oma og a ía. Como ampón de unión a la columna se u iliza el ampón A (T is-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH 7,4). Y como ampón de elución glicina a pH 2,5. Se equilib a la columna en ampón A y a con inuación inyec amos la LDL a un lujo de 1 ml/min. Todo el p oceso se ealiza como se ha indicado en el apa ado 1.4.2. 3.3 COMPROBACIÓN DE LA PUREZA DE LA apoJ Se mide su concen ación de p o eína usando un mé odo come cial (TPUC3, Roche diagnos ics) adap ado al au oanalizado Cobas 6000/c501. Se de e mina su pu eza median e geles de SDS-PAGE (de allado en el pa ado 2.3.2) y Wes e n Blo (de allado en el pa ado 2.3.4). MATERIAL Y MÉTODOS 86 PUBLICACIONES 87 PUBLICACIONES PUBLICACIONES 88 PUBLICACIONES 89 1) Ma ínez-Bujidos, M., Rull, A., González-Cu a, B., Pé ez-Cuélla , M., Mon oliu- Gaya, L., Villegas, S., O dóñez-Llanos, J., Sánchez-Quesada, J. L. Clus e in/apolipop o ein J binds o agg ega ed LDL in human plasma and plays a p o ec i e ole agains LDL agg ega ion. FASEB J. 2015 May;29(5):1688-700. 2) Anna Rull1; Ma ia Ma inez-Bujidos1; Mon se a Pe ez-Cuella ; An onio Pé ez; Jo di O doñez-Llanos; José Luis Sánchez-Quesada. Inc eased concen a ion o clus e in/apolipop o ein J (apoJ) in hype lipemic se um is pa adoxically associa ed wi h dec eased apoJ con en in lipop o eins. . A he oscle osis. 2015 Jun 6;241(2):463-470 1 con ibu ed equally o he wo k, and bo h should be conside ed as i s au ho s. a highe con en o ee choles e ol, iglyce ides, NEFA, and apoE han o al LDL. Because o he e y low amoun o LDL/J+, we we e unable o analyze i s ch oma og aphic p ofiles by anion-exchange ch oma og aphy o GFC o co obo a e inc eased nega i e elec ic cha ge and inc eased agg ega- ion. Howe e , bo h analyses we e pe o med in o al LDL and LDL/J2(Supplemen al Fig. S2). The 2 LDLs essen- ially p esen ed he same ch oma og aphic p ofiles e- ga ding elec ic cha ge (anion-exchange ch oma og aphy) and p esence o agg ega es (GFC). Suscep ibili y o agg ega ion o apoJ-deple ed LDL The e y low amoun o LDL/J+ did no allow analysis o i s suscep ibili y o agg ega ion. Howe e , bo h o al LDL and LDL/J2essen ially p esen ed he same composi ion and cha ac e is ics, including a simila p opo ion o LDL(2) and agg ega ed LDL (Supplemen al Fig. S2). Hence, we assumed ha he only di e ence be ween o al LDL and LDL/J2was he lowe con en o apoJ in he la e . This p omp ed us o analyze he specific oleo apoJinLDL pa icles by compa ing he beha io agains induced- agg ega ion o LDL/J2and o al LDL. Spon aneous agg ega ion In he fi s se o expe imen s, LDLs we e induced o spon aneous agg ega ion by incuba ion a 37°C in gen le agi a ion in he p esence o EDTA and BHT o p e en oxida ion. Supplemen al Fig. S3 shows an expe imen measu ing he inc emen o abso bance a 450 nm and he p ecipi a ion o choles e ol h oughou he pe iod o in- cuba ion. Tu bidi y emained s able up o days 11–12 and hen apidly inc eased. This inc ease was as e in LDL/J2 han in o al LDL (Supplemen al Fig. S3A). P ecipi a ion o he choles e ol me hod showed a simila pa e n, wi h LDL/J2p esen ing inc eased p opensi y o choles e ol p ecipi a ion (Supplemen al Fig. S3B).Howe e , al hough LDL/J2p o ed o be mo e suscep ible o agg ega ion han o al LDL in all he pe o med expe imen s (n=4), he esponse o LDLs was he e ogeneous among ba ches, wi h he pe iod o de ec e iden agg ega ion anging om 5days o3weeks. Agg ega ion induced by SMase and a-CT To sol e he p oblems wi h he he e ogeneous esponse o spon aneous LDL agg ega ion, we added SMase o a-CT o igge his p ocess. In hese expe imen al condi ions, ag- g ega ion occu ed as enough o ob ain ele an di e - ences a 24 hou s a e he p ocess s a ed. Abso bance esul s (Fig. 3A, B) showed ha bo h enzyma ic ea men s p omo ed he agg ega ion o o al LDL and LDL/J2,bu agg ega ion was highe in LDL/apoJ2.Thecholes e ol- p ecipi a ion me hod yielded esul s ha we e simila o he measu emen o abso bance (Fig. 3C,D). In he spe- cificcondi ions ha weused,SMase ea men p omo ed s onge agg ega ion han a-CT p o eolysis. Figu e 4 shows a ep esen a i e expe imen o SMase- o a-CT–induced agg ega ion a e 24 hou s, e alua ed by GFC. The esul s ob ained by his me hod we e simila o hose ob ained by he abso bance o he choles e ol p e- cipi a ion me hods. These findings indica e ha LDL/J2 is mo esuscep ible o agg ega ion han o al LDL wha e e he induc ion mechanism used. In addi ion, bo h ea - men s gene a ed a peak o smalle size, p obably co e- sponding o deg ada ion agmen s. These obse a ions we e also pa en in TEM mic og aphs (Fig. 4, igh ), which showed ha agg ega es in LDL/J2we e mo e abundan andla ge hanin o alLDLa e SMaseanda-CT ea men . CD spec a (Fig. 5A, B)showed ha SMase-induced ag- g ega ion sligh ly dec eased he elip ici y signal in LDL/J2 bu no in o al LDL. This dec ease is mo e e iden a he 208 nm egion, whe e he a-helix con ibu es; his sugges s a ela i e en ichmen o b-s uc u e o apoB in LDL/J2. ATR-FTIR analyses show a no iceable shi o lowe wa e- numbe s, om 1637 o 1622 cm 21 ,inbo hLDLs,al hough TABLE 1. Composi ion o LDL sub ac ions con aining o no con aining apoJ LDL composi ion To al LDL LDL/apoJ2LDL/apoJ+ Majo componen s a To al choles e ol 37.8 63.1 37.3 62.1 36.0 66.4 Es e ified choles e ol 26.8 63.9 26.9 63.3 20.4 67.5 b F ee choles e ol 11.0 61.8 10.7 61.8 15.6 62.7 b T iglyce ide 10.5 63.9 10.1 63.3 12.3 63.3 b Phospholipids 24.4 63.2 24.4 62.7 23.6 61.4 apoB 27.2 62.1 28.2 62.2 28.1 68.0 Mino componen s c NEFA 15.0 611.1 16.8 613.0 50.6 628.7 b apoA-I 0.205 60.279 0.103 60.075 0.570 60.265 b apoA-II 0.162 60.279 0.112 60.163 0.252 60.339 apoE 0.171 60.050 0.141 60.033 0.270 60.080 b apoC-III 0.207 60.059 0.146 60.035 0.152 60.039 apoC-II 0.088 60.032 0.067 60.029 0.103 60.042 a Exp essed as pe cen o he pa icle o al mass. Da a a e mean 6SD o 10 independen expe imen s. b S a is ically significan di e ences s. o al LDL and LDL/apoJ2. c Exp essed as mol/mol apoB. Da a a e means 6SD o 5 independen expe imen s. APOLIPOPROTEIN J INHIBITS LDL AGGREGATION 1693 he shi was a bi mo e e iden in he LDL/J2spec um (Fig. 5C, D). Al hough bo h egions o he spec a co e- spond o b-s uc u es, a shi o lowe wa enumbe s in he spec a o p o eins is indica i e o inc eased hyd ogen bonding, o a mo e plana shee , o o a la ge numbe o s ands (34). Howe e , such a change in he IR spec a o lipop o eins has been a ibu ed o he embedding o b- s ands in he lipid monolaye a he han o an inc ease in b-shee packing (35), which makes sense a e SMase ea men . Wha e e he case, bo h iews a e consis en wi h inc eased SMase-induced agg ega ion o LDL/J2 pa icles compa ed wi h o al LDL. a-CT–induced agg ega ion p omo ed a s onge modi- fica ion o CD spec a han SMase ea men in bo h LDLs (Fig. 5F, G) possibly because o he ex ensi e p o eolysis o apoB, as seen in Fig. 5J. He e, bo h he ela i e en ichmen o he b-s uc u e o apoB a 2 hou s o p o eolysis and he agg ega ion o he pa icles a 24 hou s a e mo e e iden in LDL/J2 han in o al LDL. These di e ences we e no obse ed in he o e all ATR-FTIR spec a (Fig. 5H, I). I mus be no ed ha IR spec oscopy in e p e a ion is no a s aigh o wa d p ocedu e because o he sensi i i y o IR o combined s uc u al and en i onmen al ac o s (36), especially when alking abou he ATR mode allowing he s udy o c ys allized samples o a oid wa e con ibu ion o he spec a. The de ec ion o con o ma ional di e ences in he na i e b-shee o apoB would equi e decon olu ion o he spec a, bu his would no be eliable wi h he cha ac e is ic 4 cm 21 esolu ion o ATR-FTIR. Albei his echnical limi a ion, i is appa en ha LDL/J2is mo e suscep ible o SMase and a-CT ea men s han o al LDL. SDS-PAGE showed ha apoB in LDL/J2was mo e suscep ible o p o eoly ic deg ada ion han o al LDL, bo h when i was p omo ed by a-CT and when p o eolysis was spon aneous in SMase- ea ed LDLs(Fig. 5E, J).apoJwould he e o e no only p o ec LDLs om agg ega ion bu could also p e en apoB deg ada ion. Because p o eolysis o apoB p omo es LDL agg ega ion, he inhibi o y e ec o apoJ on p o eolysis could be a mechanism in ol ed in p e en ing he agg ega ion o LDL pa icles. E ec o he addi ion o pu ified apoJ on LDL suscep ibili y o agg ega ion To al LDL was submi ed o SMase- o a-CT–induced agg ega ion in p esence o pu ified apoJ a 2 mola a ios in espec o apoB. The fi s was close o ha obse ed in agLDL(2) in plasma (mol apoJ/mol apoB 1/70, o exp essed as mass, mg apoJ/mg apoB 1/500). The second was 10- old highe (mola a io 1/7, mass a io 1/50). The p ocess o LDL agg ega ion induced by SMase o a-CT was p e en ed a 4 hou s o incuba ion by bo h doses o apoJ and was slowed in a dose-dependen manne o pe iods up o 24 h (Fig. 6A, B). GGE confi med ha he highe concen a ion o apoJ pa ially p e en ed he o ma ion o Figu e 3. Agg ega ion o o al LDL and LDL/J2a e SMase o a-CT ea men s. LDLs we e a 0.5 mg/ml apoB (equi alen o 3 mM choles e ol). Agg ega ion o LDLs was induced by a-CT (A) o SMase ea men (B) and moni o ed a 2 and 24 hou s by measu ing abso bance a 450 nm. P opo ion o nonp ecipi able choles e ol a e LDL agg ega ion induced by a-CT (C) o SMase ea men (D). Da a a e he mean 6SEM o 6 independen expe imen s in iplica e (abso bance) o duplica e (choles e ol p ecipi a ion). 1694 Vol. 29 May 2015 MART´ INEZ-BUJIDOS ET AL.The FASEB Jou nal xwww. asebj.o g agg ega ed pa icles a 24 hou s o agg ega ion (Fig. 6C, D). GFC also showed he inhibi o y e ec o he highe concen a ion o apoJ on he o ma ion o agg ega ed LDL pa icles a e 24 hou s o SMase- o a-CT–induced ag- g ega ion (Fig. 6E). Because pu ified apoJ con ained a low amoun o con- amina ing albumin and because albumin is known o in- hibi LDL agg ega ion a high concen a ions, we es ed hee ec o anamoun o albuminsimila o hosecon- amina ing apoJ p epa a ions. A his concen a ion (mol albumin/mol apoB 1/70), no e ec on LDL agg ega ion was obse ed (da a no shown). We used ans e in, yp- sin inhibi o , and immunoglobulin (Mab an i-CD14) as nega i e con ols a he same concen a ion as ha used o apoJ. None o hese p o eins had any e ec on LDL agg ega ion. DISCUSSION The cu en s udy shows ha he amoun o apoJ bound o LDL is inc eased in he agg ega ed o ms o his lipop o- ein p esen in blood. This inc eased binding should be a ibu able o he chape one unc ion o apoJ, which binds o un olded p o eins wi h sol en -exposed hyd o- phobic domains (37). Agg ega ion o LDL is p omo ed by he exposu e o hyd ophobic domains on he su ace o LDL pa icles, which can be induced by chemical (lipolysis o p o eolysis) o physical ( o exing) modifica ions (28, 38). Howe e , om ou obse a ion o an inc eased con- en o apoJ in agLDL(2), we canno deduce whe he he bindingo apoJ o heagg ega ed o mso LDLoccu s me ely due o he exposu e o hyd ophobic domains a e LDL agg ega ion o whe he apoJ plays a conc e e ole in Figu e 4. GFC and TEM o o al LDL and LDL/J2a e 24 hou s o SMase o a-CT ea men s. LDLs (0.5 ml a 0.4 mg/ml apoB) we e ch oma og aphed a a flow a e o 0.5 ml/min using a Supe ose 6 column in a AKTA-FPLC sys- em (GE Heal hca e) as desc ibed in Ma e ials and Me hods. Whi e ba s in TEM mic og aphs indica e 200 nm. APOLIPOPROTEIN J INHIBITS LDL AGGREGATION 1695 Figu e 5. CD and ATR-FTIR spec a. To al LDL and LDL/J2we e analyzed a 0 (black lines), 2 (da k g ay lines), and 24 hou s (ligh g ay lines) o SMase o a-CT ea men s. LDLs (0 a 0.5 mg/ml apoB) we e incuba ed o 24 hou s wi h SMase o a-CT, as desc ibed in Ma e ials and Me hods, and CD o ATR-FTIR spec a we e ob ained using 50 mg/L apoB on a JASCO J-715 spec opola ime e in he a -UV egion (190–250 nm) o on a Va ian Resolu ions P o spec ome e in he amide I egion (1700–1600 cm 21 ), espec i ely. CD and FTIR g aphs a e ep esen a i e o 3 independen expe imen s. A) CD spec a o o al LDL a e SMase ea men . B) CD spec a o LDL/J2a e SMase ea men . C) ART-FTIR spec a o o al LDL a e SMase ea men . D) ART-FTIR spec a o LDL/J2a e SMase ea men . F) CD spec a o o al LDL a e a-CT ea men . G)CD spec a o LDL/J2a e a-CT ea men . H) ART-FTIR spec a o o al LDL a e a-CT ea men . I) ART-FTIR spec a o LDL/J2 a e a-CT ea men . Eand J) SDS-PAGE o o al LDL and apoJ-deple ed LDL (LDL/J2) a e 2 and 24 hou s o SMase o a-CT ea men s. LDLs (5 mg/well) we e elec opho esed in 10% ac ylamide gels unde non educing condi ions o 2 hou s a 100 V and s ained wi h 0.05% Coomassie. Le gel, LDLs ea ed wi h SMase; igh gel, LDLs ea ed wi h a-CT. 1696 Vol. 29 May 2015 MART´ INEZ-BUJIDOS ET AL.The FASEB Jou nal xwww. asebj.o g he con ol o LDL agg ega ion. TEM mic og aphs and GGE elec opho esis o LDL/J+ showed ha , al hough agg ega ed o used pa icles in his sub ac ion we e mo e abundan han in LDL/J2, monome ic pa icles we e mo e equen han agg ega ed/ used pa icles. This ob- se a ion sugges s ha he binding o apoJ does no equi e he e ec i e agg ega ion o LDL pa icles. Ins ead, such binding could occu in monome ic pa icles ha expose some hyd ophobic domains bu a e s ill no agg ega ed. I is on hese pa icles whe e apoJ could exe some e ec con olling agg ega ion. Expe imen s pe o med wi h apoJ-deple ed LDLs demons a e ha apoJ plays an ac i e p o ec i e ole agains LDL agg ega ion. This p o ec i e unc ion was obse ed wha e e me hod induced agg ega ion, sugges - ing ha i would be a gene al mechanism o p e en LDL agg ega ion. In e es ingly, apoJ no only e a ded he agg ega ion o LDL pa icles bu i also diminished he deg ada ion o apoB, ei he when i was seconda y o deg ada ion o phospholipids by SMase o when i was di- ec ly induced by a-CT ea men . This unc ion o apoJ in LDL can be compa ed wi h ha sugges ed in HDLs, whe e apoJ would play a ole s abilizing he s uc u e and unc- ion o apoA-I o pa aoxonase 1 (39, 40). ApoJ could hus be in ol ed in s abilizing he apoB s uc u e and making i less sensi i e o p o eolysis. These findings in apoJ-deple ed LDLs we e confi med in ano he se o expe imen s in which pu ified apoJ added o LDLs was able o pa ially inhibi he agg ega ion induced by SMase o a-CT. I is no ewo hy ha he concen a ion o apoJ used in ou expe imen siswi hin hephysiologic ange.Se e als udies epo ha he concen a ion o apoJ in blood anges om 50 o 150 mg/ml (41–45), and he usual concen a ion o apoB in no molipemic subjec s anges om 0.8 o 1.0 mg/ml. The a io o apoJ/apoB in blood is he e o e a ound 1/10. The lowes apoJ/apoB a io (1/500, exp essed in p o ein mass) ha we used was simila o ha obse ed in agLDL(2) p esen inplasma,and hehighes a io(1/50) we used is e en lowe han he a io usually p esen in plasma. Taken oge he , ou da a demons a e ha apoJ could play a de e minan ole in p e en ing he agg ega- ion o LDL pa icles in blood ci cula ion. The molecula mechanism o apoJ e ec s on LDL ag- g ega ion is unclea . I is p obably ela ed o he abili y o apoJ o bind o hyd ophobic domains exposed by p o eins unde going un olding. Wilson and colleagues sugges ed ha du ing amo phous agg ega ion o p o eins, apoJ in e ac s wi h slowly agg ega ing species o he o - olding Figu e 6. E ec o he addi ion o pu ified apoJ o LDL agg ega ion induced by SMase o a-CT ea men . To al LDL (a 0.5 mg/ml apoB) was subjec ed o agg ega ion by SMase o a-CT ea men s up o 24 hou s in he p esence o 1 and 10 mg o apoJ. The final mass a ios o apoJ/apoB we e 1/500 and 1/50, and mola a ios we e 1/70 and 1/7, espec i ely. Inc emen o abso bance a 450 nm a e a-CT ea men (A) o a e SMase ea men (B). GGE o LDLs (5 mg apoB/well) a e 24 hou s o a-CT ea men (C) o SMase ea men (D). E) GFC o o al LDL a e 24 hou s o SMase o a-CT ea men in he p esence o 10 mg o pu ified apoJ. LDLs (0.5 ml a 0.4 g/ml apoB) we e ch oma og aphied using a Supe ose 6 column in a AKTA-FPLC sys em. APOLIPOPROTEIN J INHIBITS LDL AGGREGATION 1697 pa hway (2, 3). Phospholipolysis o p o eolysis o LDL p omo es he o ma ion o hyd ophobic domains bo h in he lipid and p o ein moie ies o he lipop o ein, a o ing he agg ega ion o LDL. apoJ could bind o hese hyd o- phobic domains, p e en ing he in e ac ion o LDL pa icles media ed by hyd ophobic su aces and he sub- sequen agg ega ion. Ou esul s concu wi h he pos ula ed unc ion o apoJ as a pa o he quali y con ol sys em o p e en ing he accumula ion o p o ein agg ega es (4). apoJ exp ession inc eases du ing a ious physiologic and pa hologic s esses (44, 46–48), and i s binding o clien p o eins in blood, such as albumin, fib inogen, o ce uloplasmin, is p omo ed a e inducing shea s ess in plasma (6). In he con ex o ca dio ascula disease, a numbe o s udies ha e epo ed di e en p o ec i e e ec s o apoJ (49). apoJ egula es complemen and is eleased om ac i a ed pla- ele s o pa icipa e in wound epai (50). The concen a- ion o apoJ inc eases in a eas o a he oscle o ic lesions bu no in no mal a e ies (5, 51). This inc ease could be due in pa o he en y o lipop o eins om plasma bu also o i s enhanced exp ession by he a e ial wall cells. Kim e al. epo ed a p o ec i e ole o apoJ agains neoin imal hy- pe plasia ia an an ip oli e a i e e ec on ascula smoo h muscle cells and a cy op o ec i e e ec on endo helial cells (52). Ano he po en ial p o ec i e ac ion o apoJ is ha i induces choles e ol expo om mac ophage- oam cells (53), in a simila manne o ha p omo ed by apoA-I. The ole o apoJ in HDLs has been s udied in de ail by Na ab and cowo ke s. These au ho s epo ed ha apoJ p ese es he an i-inflamma o y, an ioxidan , and an ia he ogenic p ope ies o HDLs (39, 40). Se e al s udies ha e ound ha he con en o apoJ in HDLs is dec eased in subjec s wi h diabe es, obesi y, o me abolic synd ome and in pa ien s wi h ac i e co ona y disease (11, 12, 43). In he la e , he an iapop o ic ac i i y o HDLs is comp omised in pa by i s educed apoJ con en (12). Al hough all p o eomic analyses pe o med in LDL ha e de ec ed he p esence apoJ in his lipop o ein, ew s udies ha e in es iga ed he ole o apoJ on LDLs. Ka lsson e al. epo ed ha apoJ is inc eased in LDLs om obese subjec s (54),and Pe e ssone al. desc ibed inc eased apoJ con en in small dense LDLs om pa ien s wi h diabe es and me - abolic synd ome (20). These findings sugges ha he low con en o apoJ in HDLs in hese pa ien s could be caused by an al e ed dis ibu ion o apoJ among he lipop o ein ac ions. Howe e , hese s udies do no add ess he spe- cific ole o apoJ associa ed o LDLs. The only s udy o da e ha has in es iga ed a specific unc iono apoJonLDLs was conduc ed by Schwa z e al. (21). These au ho s epo ed a p o ec i e ole o apoJ agains cy o oxici y p o- mo ed by E-LDLs. They modified LDLs wi h plasmin and choles e ol es e ase and ob ained a highly inflamma o y o m o LDL (named E-LDL) cha ac e ized by inc eased con en in NEFA and apoB deg ada ion. Bo h cha ac e - is ics a e sha ed wi h LDL(2). These au ho s epo ed ha apoJ bound o E-LDL bu no o na i e LDL, a finding ha is in ag eemen wi h ou esul s o inc eased binding o apoJ o agg ega ed LDL. I is pe inen o conside ha phospholipases and p o- eases play a ele an ole in he igge ing o a he ogenesis in he a e ial wall. SMase exp ession is inc eased in a he- oscle os ic lesions. I deg ades SM o ce amide and phospho ylcholine, leading o he o ma ion o hyd o- phobic ce amide- ich domains ha p omo e LDL agg e- ga ion. Rega ding a-CT, al hough his enzyme is no di ec ly in ol ed in a he oscle osis, i is used as a model o p o eolysis because se e al endop o eases a e hype ex- p essed in a he oscle o ic lesions. a-CT induces apoB p o eolysis and igge s LDL pa icle usion, la e des abi- lizing hese lipop o eins. The p esen findings show a no el mechanism by which apoJ con ols he agg ega ion o LDLs. We p opose ha he inc eased exp ession o apoJ in a he oscle o ic lesions could be a esponse o he a e ial walls o LDL agg ega ion, he ini ial key s ep o a he o- genesis. This p oposal opens he possibili y ha apoJ-based he apeu ic s a egies conduc ed o inhibi LDL agg ega- ion could be use ul in he u u e o p e en ing ca dio- ascula disease. The use o mime ic pep ides de i ed om apoJ, o example, has been success ully used o e a d a he oscle osis in mice, al hough he e ec on LDL agg e- ga ion has no been e alua ed. Fu he esea ch add essing hese molecula mechanisms will hope ully con ibu e o he de elopmen o new apoJ-based he apies. The au ho s hank Ca olyn Newey (San Pau Biomedical Resea ch Ins i u e; IIB San Pau) o edi o ial assis ance. This wo k was suppo ed by he Spanish Minis y o Heal h (Ins i u o de Salud Ca los III/Fondo de In es igaci´ on Sani a ia; ISCIII/FIS) G an s PI10/00265, PI10/00975, PI13/00364, and PI13/01330. M.M.-B., A.R., M.P.-C., J.O.-L., and J.L.S.-Q. a e membe s o he Quali y Resea ch G oup 2009-SGR-1205 om Gene ali a de Ca alunya. L.M. and S.V. a e membe s o he Quali y Resea ch G oup 2014-SGR-00885 om Gene ali a de Ca alunya. M.M.-B., A.R., M.P.-C., J.O.-L., and J.L.S.-Q. a e membe s o he Ca dio ascula Resea ch Ne wo k (Red de In es igaci´ on Ca dio ascula ; RD12/0042/0043) om ISCIII. 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When bound o HDL, apoJ is an ia he ogenic by inhibi ing endo helial cell apop osis; hus, any ac o modi ying apoJ associa ion o HDL would dec ease i s an ia he ogenic unc ion. Howe e , he exac dis ibu ion o apoJ in each lipop o ein ac ion, o in lipop o ein-non bound o m has no been specifically in es iga ed ei he in no molipemia o in dyslipemia. Me hods: Basic lipid p ofile and apoJ concen a ion we e de e mined in se a om 70 subjec s, including a wide ange o choles e ol and iglyce ide concen a ions. Lipop o eins we e isola ed by ul acen i- uga ion and hei lipid and apolipop o ein composi ion was assessed. Resul s: In he o e all popula ion, se um apoJ posi i ely associa ed wi h choles e ol, iglyce ide and VLDL-C concen a ions, and HDL-C and iglyce ide we e independen p edic o s o inc eased apoJ concen a ion. App oxima ely, 20.5% o ci cula ing apoJ was associa ed wi h lipop o eins (18.5% HDL, 0.9% LDL and 1.1% VLDL) and 79.5% was no bound o lipop o eins. Se um apoJ concen a ion was highe in hype choles e olemic (HC), hype iglyce idemic (HTG) and combined hype lipidemic (CHL) se a compa ed o no molipemic (NL) se a (HC, 98.15 ±33.6 mg/L; HTG, 103.3 ±36.8 mg/L; CHL, 131.7 ±26.8 mg/L; NL, 66.7 ±33.8 mg/L; P<0.001). ApoJ dis ibu ion was also al e ed in hype lipidemia; app oxima ely 30% o ci cula ing apoJ was associa ed o lipop o eins in he NL g oup whe eas his p opo ion ounded 15% in hype lipidemic subjec s. Conclusions: Ou findings indica e ha hype lipidemia inc eases he concen a ion o apoJ in se um bu , in u n, he con en o lipop o ein-associa ed apoJ dec eases. The edis ibu ion o apoJ in hype lipidemia could comp omise he an ia he ogenic p ope ies o HDL. ©2015 Else ie I eland L d. All igh s ese ed. 1. In oduc ion Clus e in, also known as apolipop o ein J (apoJ), is a highly glycosyla ed p o ein in ol ed in ageing, a e ioscle osis, diabe es, cance , neph opa hy and neu on degene a ion [1e3]. Al hough he specific ole ha apoJ plays in hese p ocesses is no well unde s ood, i s chape one ac i i y seems o be in ol ed in a gene al p o ec i e ac ion. ApoJ was he fi s iden ified ex acellula chap- e one and i binds o a wide a ie y o pa ially un olded p o eins ha p esen hyd ophobic egions, including amyloid-like s uc- u es. I is he e o e pa o he quali y con ol sys em o p e- en ing ex acellula un olded p o ein accumula ion [1,2]. ApoJ is exp essed by nume ous cell ypes and is p esen in mos issues and body compa men s [3e6]. In ela ion o a he oscle- osis, i is hype exp essed in human a he oscle o ic lesions [7e9] and in a eas o ascula damage [10,11]. ApoJ is also p esen in blood, wi h alues anging om 50 o 200 mg/L, depending on he measu emen me hod [12e19]. ApoJ ci cula es mainly in ee o m *Co esponding au ho . Ca dio ascula Biochemis y G oup a Biomedical Resea ch Ins i u e IIB-San Pau, San An oni MªCla e 167, 08025 Ba celona, Spain. E-mail add ess: [email p o ec ed] (J.L. S anchez-Quesada). 1 AR and MM-B con ibu ed equally o he wo k, and bo h should be conside ed as fi s au ho s. Con en s lis s a ailable a ScienceDi ec A he oscle osis jou nal homepage: www.else ie .com/loca e/a he oscle osis h p://dx.doi.o g/10.1016/j.a he oscle osis.2015.06.003 0021-9150/©2015 Else ie I eland L d. All igh s ese ed. A he oscle osis 241 (2015) 463e470 Au ho 's pe sonal copy [33] T. Vaisa , S. Penna hu , P.S. G een, e al., Sho gun p o eomics implica es p o ease inhibi ion and complemen ac i a ion in he an iinflamma o y p ope ies o HDL, J. Clin. In es . 117 (2007) 746e756. [34] E. Bu illo, R. Ma eo-Gallego, A. Cena o, e al., Beneficial e ec s o omega-3 a y acids in he p o eome o high-densi y lipop o ein p o eome, Lipids Heal h Dis. 11 (2012) 116. [35] T. A nold, S. B andlho e , K. V ikapa, e al., E ec o obesi y on plasma clus- e in, [co ec ed] a p oposed modula o o lep in ac ion, Pedia . Res. 69 (2011) 237e242. [36] H. Allayee, L.W. Cas ellani, R.M. 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Rull e al. / A he oscle osis 241 (2015) 463e470470 DISCUSIÓN 113 DISCUSIÓN DISCUSIÓN 114 DISCUSIÓN 115 A lo la go de las úl imas décadas han ido apa eciendo e idencias que mues an la exis encia de una elación en e la apoJ y el desa ollo de a e ioscle osis. Una e idencia básica es que la exp esión y la deposición de apoJ es án aumen adas en zonas de lesión a e ioscle ó ica mien as que es á ausen e en la pa ed a e ial sana [133]. La células de la pa ed a e ial sin e izan y exc e an apoJ, que puede juga di e en es papeles du an e la e olución de la lesión a e ioscle ó ica, como se ha comen ado en la in oducción. Pe o además de la apoJ exp esada po las células de la pa ed a e ial, exis e una po ción signi ica i a de la apoJ que se halla asociada a las lipop o eínas, an o en la pa ed a e ial como en la ci culación plasmá ica [112]. La p esen e esis se ha cen ado en es e segundo aspec o. Es ela i amen e conocido el papel es abilizado de la apoJ sob e la uncionalidad de la HDL. Sin emba go, el papel de la apoJ sob e las p opiedades a e ogénicas de la LDL es p ác icamen e desconocido. De igual mane a, aunque se sabe que la apoJ es á p esen e en plasma en o ma lib e o unida a las lipop o eínas, ningún es udio ha analizado de una mane a cuan i icable la dis ibución ela i a de la apoJ en e las di e en es lipop o eínas y en o ma lib e. Es os dos aspec os son los analizados en las dos publicaciones que con o man la p esen e Tesis. 1. ARTÍCULO 1: PAPEL DE LA APOJ EN LA AGREGACIÓN DE LA LDL. Di e sos es udios han mos ado un papel p o ec o de la apoJ en la HDL. Los es udios se cen a on en la HDL ya que du an e mucho iempo se conside ó que la apoJ únicamen e se asociaba a es a lipop o eína. Sin emba go, los ecien es análisis p o eómicos que han analizado la composición de VLDL y LDL humana han de ec ado apoJ en es as pa ículas [60, 115, 120], aunque su con enido de apoJ es mucho más bajo que en la HDL. DISCUSIÓN 116 1.1 CONTENIDO DE APOJ EN LAS SUBFRACCIONES DE LA LDL (LDL(+), nagLDL(-) Y agLDL(-)). La p ime a obse ación ele an e del a ículo 1 es el di e en e con enido de apoJ en las dis in as sub acciones de LDL aisladas del plasma. Aunque el con enido de apoJ es muy bajo en odas las acciones de la LDL, és e es 6 eces supe io en la LDL(-) espec o a la LDL(+), y den o de las acciones de LDL(-), es 7 eces supe io en la acción de LDL(-) ag egada (agLDL(-)) espec o a la LDL(-) no ag egada (nagLDL(-)). Es deci , que la apoJ es mucho más abundan e en las acciones de LDL con mayo po encial a e ogénico. Es a obse ación se p es a a una doble in e p e ación. Po una pa e, pod ía pensa se que la apoJ con ibuye de alguna mane a a la a e ogenicidad de es as pa ículas. En con apa ida, ambién puede conside a se que su p esencia es debida a que pod ía ep esen a una unción p o ec o a en e a la modi icación de la LDL. Conside ando la unción chape ona de la apoJ, uniéndose a los dominios hid o óbicos de p o eínas que quedan expues os en su supe icie du an e su desna u alización [87], es ac ible pensa que la apoJ se una p e e en emen e a la LDL(-) cuando es as pa ículas su en algún ipo de modi icación que es imule el p oceso de ag egación. El hecho de que el con enido en apoJ en la LDL(-) no ag egada ya sea más ele ado que en la LDL(+) indica que no es imp escindible que exis a una ag egación eal de la LDL pa a la unión de la apoJ. Es e hallazgo pod ía in e p e a se como que la apoJ se uni ía a zonas hid o óbicas que se gene an en la LDL(-) du an e las ases más emp anas del p oceso de ag egación, p e iniendo que la ag egación de la LDL llegue a se e ec i a. 1.2 CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DE LA LDL QUE CONTIENE apoJ (LDL/J+). Con el in de con i ma la obse ación de un mayo con enido de apoJ en las acciones de LDL(-), se u ilizó la es a egia con a ia, es deci , se aisla on las DISCUSIÓN 117 pa ículas de LDL con apoJ y se de e minó si sus ca ac e ís icas se co espondían con las de las acciones de LDL(-). Median e c oma og a ía de a inidad se ob u ie on dos acciones de LDL, la que no con iene apoJ (LDL/J-) (> 99.7%) y la que con iene apoJ (LDL/J+) (< 0.3%). El con enido de apoJ de es as sub acciones y de la LDL o al ue comp obado po ELISA y Wes e n blo . Las ca ac e ís icas ísico-químicas de es as acciones se es udia on po a ías écnicas, aunque debido a la pequeña can idad de LDL/J+ no pudo ealiza se un análisis más exhaus i o. La mayo pa e de esul ados indican un al o g ado de simili ud en e la agLDL(-) y la LDL/J+. Respec o a la composición lipídica, la LDL o al y la LDL/J- p esen an una composición simila , mien as que la LDL/J+ con iene menos coles e ol es e i icado y más coles e ol lib e, iglicé idos, NEFAS y apoE, ca ac e ís icas que ambién compa e con la agLDL(-). La elec o o esis de SDS-PAGE mos ó la deg adación de la apoB en la LDL/J+ apoJ, al igual que mues a la agLDL(-). En la elec o o esis en gel de g adien e no desna u alizan e, an o en la LDL como en la LDL/J- se mues a una única banda del monóme o de LDL, mien as que en la LDL/J+ se ap ecian dos bandas, la monomé ica y una banda supe io que indica ag egación, es deci , con i en pa ículas mpnomé icas con pa ículas ag egadas. Median e mic oscopía elec ónica se puede obse a que la LDL/J- p esen a una composición de pa ículas monomé icas de un amaño muy egula , mien as que la LDL/J+ p esen a pa ículas muy he e ogéneas en amaño, es ando algunas de ellas ag egadas. No obs an e, las pa ículas monomé icas siguen siendo las más abundan es. Es a obse ación es á de acue do con la idea, plan eada en el apa ado an e io , de que la apoJ se une a pa ículas ag egadas, pe o ambién a pa ículas de LDL no ag egadas. El análisis de la es uc u a de la apoB po dic oísmo ci cula (CD) y ATR-FTIR mues a que la LDL/J+ p esen a una pé dida de es uc u a secunda ia (disminución de señal en el espec o de CD, y desplazamien o del máximo en el ATR-FTIR), lo cual es compa ible, an o con DISCUSIÓN 118 una ag egación pa cial, como con al e aciones en la apoB que oda ía no han dado luga a ag egación. 1.3 PAPEL DE LA apoJ EN LA AGREGACIÓN DE LA LDL. DEPLECIÓN DE LDL/J+. De los esul ados discu idos an e io men e solo puede a i ma se que la apoJ es más abundan e en las pa ículas de LDL ag egadas, y aunque su p esencia en LDLs no ag egadas pod ía suge i un papel p e en i o en el p oceso de ag egación, no se puede sabe cuál es su unción especí ica. Po ello, ue necesa io lle a a cabo expe imen os pa a de ini el papel p o- o an i-ag egan e de la apoJ. Sin emba go, la can idad que se puede aisla de LDL/J+ es an pequeña que e i a un análisis de allado que pe mi a de e mina la unción de la apoJ. En con apa ida, la coincidencia p ác icamen e o al en e las ca ac e ís icas de la LDL o al y la LDL/J- si que pe mi e hace un análisis compa a i o pa a de e mina el e ec o de la ausencia de apoJ sob e el p oceso de ag egación de la LDL. Pa a analiza el papel de la apoJ en la ag egación de la LDL se indujo la ag egación de la LDL o al y la LDL/J- po di e en es mé odos, incluyendo ag egación espon ánea, lipólisis con es ingomielinasa (SMasa) y p o eólisis con α -quimo ipsina (α-CT). Con cualquie a de los mé odos u ilizados, y a pesa de que la can idad de LDL/J+ en la LDL o al es muy pequeña (siemp e in e io al 0.3%), se io que la LDL/J- es más suscep ible a ag ega se que la LDL o al. Es os da os demues an que, a pesa de su escasez, la apoJ juega un papel p o ec o muy impo an e en el p oceso de ag egación de la LDL. Los análisis median e CD y ATR-FTIR con i man que aumen a la ag egación inducida con SMasa (disminución de señal en el CD y desplazamien o de máximo en ATR-FTIR) en la LDL/J- pe o no en la LDL o al. El hecho de que la disminución de la señal sea más acusada en la egión de 208 nm, donde con ibuye la -hélice, sugie e un en iquecimien o de es uc u a β de la apoB en la LDL/J-. DISCUSIÓN 119 Un aspec o no espe ado de los esul ados ue la obse ación en los geles de SDS- PAGE de que en la LDL/J- la apoB es más suscep ible a la deg adación p o eolí ica que en la LDL o al. Es o ue obse ado an o cuando la p o eólisis ue inducida po la α-CT, como cuando és a se p odujo de o ma espon ánea du an e el a amien o con SMasa. No conocemos el mecanismo po el cual la apoJ p e iene de la deg adación a la apoB, pe o,es e hecho que pod ía es a in oluc ado en la p e ención de la ag egación de la LDL, ya que es bien sabido que la p o eólisis de la apoB induce el p oceso de ag egación. 1.4 PAPEL DE LA apoJ EN LA AGREGACIÓN DE LA LDL. ADICIÓN DE apoJ. Pa a con i ma los esul ados ob enidos en los expe imen os de depleción de LDL con apoJ se hicie on los expe imen os in e sos, es o es, adicionando apoJ pu i icada de plasma en concen ación isiológica a LDL cuya ag egación e a inducida median e a amien o con α-CT y SMasa. Es os expe imen os con i ma on el papel de la apoJ inhibiendo la ag egación de la LDL. 1.5 FUNCIÓN ANTIATEROGÉNICA DE LA apoJ ASOCIADA A LA LDL. Los da os ob enidos en es e p ime a ículo demues an un papel p o ec o de la apoJ en un aspec o cla e en el desa ollo de la a e ioscle osis, como es la inhibición de la ag egación de la LDL, conside ado el e en o inical que inicia el p oceso a e ioscle ó ico. Es a unción p o ec o a la pod ía eje ce la apoJ en dos espacios bien di e enciados, la ci culación plasmá ica y el espacio subendo elial. A ni el de de la ci culación plasmá ica la apoJ pod ía e i a la o mación de pa ículas ag egadas de LDL, pa ículas que gene almen e son lipop o eínas en ejecidas que han sido modi icadas po mecanismos que las hacen po encialmen e más a e ogénicas. Pe o no solo puede se impo an e la inhibición de la ag egación de la DISCUSIÓN 120 LDL, sino que la apoJ pod ía juga o o papel p o ec o , que es a ía mediado po su capacidad pa a acili a el acla amien o de los espacios ex acelula es de p o eínas desplegadas o desna u alizadas. La apoJ iene un dominio de unión al LRP2 ( ambién conocido como megalina) un ecep o de la amilia del ecep o de LDL, que acili a la in e nalización de los complejos apoJ/p o eína desna u alizada [134]. Es e es el caso del pép ido be a-amiloide en la en e medad de Alzheime . El LRP2 ambién pa icipa en la in e nalización de complejos apoJ/lep ina, egulando las ías de señalización de la lep ina a ni el del hipo álamo [135]. Exis en cie as disc epancias espec o a si la apoJ es econocida po o os ecep o es de la amilia del ecep o de LDL, pe o no puede desca a se que o os ecep o es pudiesen es a implicados en el econocimien o de los complejos apoJ/LDL. En cualquie caso, son necesa ios es udios di igidos a de e mina si ealmen e la apoJ acili a el acla amien o de pa ículas ag egadas de LDL, an o en ci culación plasmá ica como en o os espacios isiológicos. La unción de la apoJ en el espacio subendo elial pod ía se simila al desc i o an e io men e, aunque en es e caso es ema cable que la exp esión de apoJ es á aumen ada en la pa ed a e ial lesionada [133], siendo, quizás, un mecanismo pa a p e eni la ag egación de pa ículas de LDL. O o aspec o a conside a es que el LRP2 no es exp esado po las células de la pa ed a e ial, po lo que los complejos apoJ/LDL debe ían se in e nalizados po las células a a és ecep o es al e na i os. La iden i icación de es os posibles ecep o es equie e el desa ollo de u u os es udios. Apa e de nues o es udio, únicamen e o o g upo ha analizado p e iamen e el e ec o de la apoJ sob e la LDL (Schwa z e al) [124]. En es e es udio los au o es demues an que la apoJ es capaz de inhibi el po encial ci o óxico de LDL modi icada enzimá icamen e (E-LDL) median e una combinación de p o easas (plasmina) y coles e ol és e hid olasa. La E-LDL iene p opiedades simila es a la LDL que se encuen a en las lesiones a e ioescle ó icas con un con enido ele ado de NEFAS y DISCUSIÓN 121 una g an deg adación de la apoB, ca ac e ís icas que hemos is o en la LDL ag egada que con iene apoJ. La E-LDL ac i a el complemen o y p omue e la o mación de células espumosas. Schwa z e al demues an que la apoJ se une a la E-LDL pe o no a la LDL na i a, educiendo la ci o oxicidad de la E-LDL sob e células endo eliales. Además encon a on que en lesiones a e ioescle ó icas la apoJ se colocaliza con la E-LDL. Es as obse aciones es án de acue do con nues os esul ados en los que desc ibimos que la apoJ se une a la LDL ag egada con mucha mayo a inidad que a la LDL o al. En conjun o es os da os indican que la exp esión aumen ada de apoJ en lesiones a e ioescle ó icas pod ía 1) inhibi el po encial ci o óxico de la LDL modi icada, 2) se una espues a inhibi o ia a la ag egación de la LDL, que es el p ime paso de la a e ogénesis, y 3) a o ece la cap ación celula de LDL ag egada e i ando su acumulación ex acelula . La igu a mues a esquemá icamen e los posibles mecanismos p o ec o es de la apoJ elacionados con la a e ogenicidad de la LDL. DISCUSIÓN 128 CONCLUSIONES 129 CONCLUSIONES CONCLUSIONES 130 CONCLUSIONES 131 CONCLUSIONES 1- La apoJ se une en la ci culación plasmá ica a las pa ículas modi icadas de LDL y p e e encialmen e a las pa ículas ag egadas, posiblemen e debido a su unción como chape ona uniéndose a dominios hid o óbicos. 2- La apoJ juega un papel p o ec o muy impo an e en el p oceso de ag egación de la LDL. El p oceso de ag egación de la LDL pod ía se una diana e apéu ica sob e la que ac ua con pép idos mimé icos de i ados de la apoJ que pod ían inhibi es e p oceso. 3- Del o al de la apoJ ci culan e un ap oximadamen e un 20% es á asociado a las lipop o eínas y el 80% se encuen a en o ma lib e. De la apoJ unida a lipop o eínas la mayo pa e se encuen a en la HDL, ap oximadamen e el 18%. 4- La concen ación de apoJ en sue o es al amen e dependien e del pe il lipop o eico, y es á asociada posi i amen e con la concen ación de coles e ol y iglicé idos. Los pacien es hipe lipémicos p esen an una concen ación aumen ada de apoJ. 5- La dis ibución de apoJ en plasma es di e en e en no molipemia e hipe lipemia. En pacien es no molipémicos un 30% de la apoJ es á asociada a lipop o eínas, po cen aje que desciende en pacien es hipe lipémicos has a un 17% en hipe coles e olémicos y un 15% en hipe iglice idémicos. CONCLUSIONES 132 BIBLIOGRAFÍA 133 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 134 BIBLIOGRAFÍA 135 1. Ross, R., The pa hogenesis o a he oscle osis: a pe spec i e o he 1990s. Na u e, 1993. 362(6423): p. 801-9. 2. Ross, R., A he oscle osis--an in lamma o y disease. N Engl J Med, 1999. 340(2): p. 115-26. 3. Bo en, J., e al., Iden i ica ion o he p incipal p o eoglycan-binding si e in LDL. A single-poin mu a ion in apo-B100 se e ely a ec s p o eoglycan in e ac ion wi hou a ec ing LDL ecep o binding. J Clin In es , 1998. 101(12): p. 2658- 64. 4. Lusis, A.J., A he oscle osis. Na u e, 2000. 407(6801): p. 233-41. 5. Glass, C.K. and J.L. 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