Caracterização epidemiológica da criptosporidiose em Portugal, por estudo molecular de isolados de Cryptosporidium spp. de humanos e de animais

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA Ins i u o de Higiene e Medicina T opical Unidade de P o ozoá ios Opo unis as/VIH e Ou as P o ozooses Ca ac e ização epidemiológica da c ip ospo idiose em Po ugal, po es udo molecula de isolados de C yp ospo idium spp. de humanos e de animais Ma ia Ma ga ida Fe ei a Al es Disse ação ap esen ada pa a ob enção do G au de Dou o em Ciências Biomédicas, especialidade de Pa asi ologia, pela Uni e sidade No a de Lisboa, Ins i u o de Higiene e Medicina T opical. O ien ado : P o . Dou o F ancisco José Nunes An unes Lisboa 2006 i O p esen e abalho oi ealizado na Unidade de P o ozoá ios Opo unis as/VIH e Ou as P o ozooses, Unidade de Pa asi ologia e Mic obiologia Médicas do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical e na “Di ision o Pa asi ic Diseases” do “Cen e s o Disease Con ol and P e en ion”. A dou o anda usu uiu de uma Bolsa de Dou o amen o da Fundação pa a a Ciência e Tecnologia (SFRH / BD / 2898 / 2000) ii Aos meus PAIS, que an as ezes enuncia am a si mesmos, em bene ício da minha o mação. A DEUS, pela inspi ação e o ça com que me guiou nes a caminhada. iii AGRADECIMENTOS Ao P o . Dou o F ancisco An unes, meu o ien ado , ag adeço a con iança deposi ada no meu abalho, o apoio e o incen i o à minha o mação e alo ização e as opo unidades que me p opo cionou. À P o .ª Dou o a Ma ia Amélia G ácio, ag adeço a amabilidade de e acedido aze pa e da comissão u o ial des e abalho de dou o amen o. À P o .ª Dou o a Olga Ma os, que co-o ien ou es e abalho, pelo ânimo, apoio e ensinamen os que me dispensou, o meu mui o ob igada. Ao Dou o Lihua Xiao, ag adeço a ex ao diná ia opo unidade de me e ecebido no seu labo a ó io, os ensinamen os, a p on a disponibilidade e a p eciosa ajuda que me concedeu. Ao Dou o I shad Sulaiman, exp esso o meu econhecimen o pelo modo amigo com que me acolheu, me ensinou e me ajudou du an e a minha pe manência no CDC. À P o .ª Dou o a Isabel Fonseca, à D .ª Esme alda Delgado e à D .ª Ana Ma alda Lou enço, ag adeço a cedência dos isolados de gado bo ino e de animais sil á icos que o am ca ac e izados nes e abalho. À D .ª Ana Ma alda Lou enço, ao D . Joaquim Hen iques e à D .ª Ma ia d’Ai es, deixo o meu since o ag adecimen o pelo empenho e en usiasmo na ecolha de ma e ial biológico dos animais de companhia. À D .ª Ma ga ida Ba ão da Cunha, do Ja dim Zoológico de Lisboa, es ou g a a pelo seu in e esse e en usiás ica coope ação nes e abalho. Ag adeço, ainda, a odos os uncioná ios do Ja dim Zoológico de Lisboa que colabo a am na ecolha das amos as. À Vanessa Lemos, pela ines imá el e incansá el ajuda em an os diagnós icos pa asi ológicos e, ambém, pela sua aleg ia, incen i o e amizade, o meu econhecido ag adecimen o. Aos inúme os colegas que passa am pela Unidade de P o ozoá ios Opo unis as/VIH e Ou as P o ozooses e que comigo “di idi am” a bancada de abalho, em pa icula , às “ esiden es” Luísa Lobo e Ma ina Cos a, ag adeço a amizade, o companhei ismo, a ajuda, a boa disposição e o óp imo ambien e de abalho. i Ao S . Luís Filipe Ma o, do Gabine e de Desenho e Audio isuais do IHMT, que elabo ou os desenhos p esen es nes e abalho, o meu since o ag adecimen o pelo auxílio e disponibilidade dispensados. A odos os uncioná ios do IHMT, em pa icula , a D. A minda Ba bosa, a D. Flo a Sil a, a D. Flo bela Almeida, a D. G acinda San os, a D. Leónia Be na des, a D. Manuela Moniz, a D. Ma ia da Luz No as e a D. Rosa Bo ão o meu ag adecimen o, pela sã con i ência, pela ajuda e pela amizade que semp e me dedica am. Aos meus amilia es e amigos, pela amizade, incen i o e paciência com que me acompanha am nes a caminhada. Mui o ob igada pela ossa p esença na minha ida. Aos meus pais, A mando e Ma ia do Ca mo, sem os quais nada na minha ida e ia sido possí el, exp esso a minha p o unda g a idão pelo ca inho e dedicação pe manen es, pela ines imá el ajuda, pela in ini a paciência e pelo seu exemplo de in eg idade, pe se e ança, gene osidade e humildade. A odos os que, de algum modo, con ibuí am pa a a minha chegada ao im des a e apa e que, po alha não in encional, não o am aqui mencionados, o meu since o ag adecimen o. À Fundação pa a a Ciência e Tecnologia, Minis é io da Ciência e Ensino Supe io , ag adeço a a ibuição da bolsa de dou o amen o. RESUMO C yp ospo idium spp. é um p o ozoá io ubíquo causado de pa ologia gas in es inal em humanos e animais. A in ecção oco e po inges ão de oocis os, após con ac o di ec o com pessoas – ansmissão an oponó ica – ou ou os animais in ec ados – ansmissão zoonó ica – podendo, ainda, oco e , indi ec amen e, a a és da água ou de alimen os con aminados. A impo ância ela i a dos di e en es modos de ansmissão, não se encon a, ainda, escla ecida. A c ip ospo idiose humana es á associada, sob e udo, à in ecção po C. hominis e po C. pa um, embo a se encon em desc i os, ambém, casos de in ecção po C. elis, C. meleag idis, C. mu is, C. canis, C. suis e C yp ospo idium genó ipo ce o. Com o p esen e abalho p e endeu-se de e mina as espécies e genó ipos de C yp ospo idium que, em Po ugal, se encon am associadas, que à in ecção humana, que à in ecção em gado domés ico, animais de companhia e animais sil á icos, a im de iden i ica , não só os pa asi as in ec an es pa a o Homem, como, ambém, os seus possí eis ese a ó ios zoonó icos. Pa a além disso, oi, ainda, objec i o des e abalho, con ibui pa a a comp eensão do papel desempenhado pelas ias de ansmissão zoonó ica e an oponó ica na epidemiologia da c ip ospo idiose humana no nosso País. Na população de in ec ados po VIH, com sin oma ologia gas in es inal, que es udámos, en e Junho de 2001 e Janei o de 2005, oi encon ada a pe cen agem de in ecção po C yp ospo idium spp. de 8,3% (18/217). Nos animais de companhia, a axa de in ecção ob ida pa a ga os com dono e pa a cães com e sem dono oi de, espec i amen e, 1,8% (2/109) e 0% (0/157). Nos animais sil á icos de ida li e es udados, ca ní o os e pequenos mamí e os, não oi encon ada in ecção po C yp ospo idium spp.. Nos animais do Ja dim Zoológico de Lisboa, apenas o am encon ados oocis os em duas amos as ecais de mamí e os, uma de um bison e ame icano e, ou a, de um gnu de cauda b anca, co espondendo a uma pe cen agem de amos as posi i as de 0,9% (2/217); ambém o am obse ados oocis os numa amos a ecal de uma a a uga es ela indiana que ha ia chegado ecen emen e ao Ja dim Zoológico. A ca ac e ização molecula de isolados humanos de C yp ospo idium spp., de ec ados en e 1994 e 2005, pe mi iu iden i ica , ao ní el da espécie, 51 pa asi as: 52,9% (27/51) pe enciam à espécie C. pa um, 31,4% (16/51) a C. hominis, 9,8% (5/51) a C. elis e 5,9% (3/51) a C. meleag idis. No que se e e e aos c ip ospo ídeos de hospedei os não humanos – gado domés ico e uminan es sil á icos (gamos da Tapada Nacional de Ma a e Bo ídeos do i Ja dim Zoológico de Lisboa), es udados e ospec i amen e, e ga os e animais do Ja dim Zoológico, es udados p ospec i amen e –, nos casos em que a ampli icação do DNA oi bem sucedida, os esul ados da sua ca ac e ização molecula mos a am que: i) 94% (80/85) dos isolados bo inos e odos os isolados de o inos (n = 2), de gamos da Tapada de Ma a (n = 4) e de Bo ídeos do Ja dim Zoológico (n = 11) pe enciam à espécie C. pa um; ii) 2,4% (2/85) dos isolados bo inos pe enciam à espécie C. bo is; iii) 2,4% (2/85) dos isolados bo inos pe enciam à espécie C. ande soni; i ) 1,2% (1/85) dos isolados bo inos pe enciam ao genó ipo semelhan e ao do gamo; ) os isolados de ec ados nos dois ga os pe enciam à espécie C. elis; i) os pa asi as encon ados nas ezes do bison e ame icano, do gnu de cauda b anca e da a a uga es ela indiana pe enciam, espec i amen e, ao genó ipo a o, a um genó ipo no o e ao genó ipo a a uga. En e as espécies e genó ipos iden i icados nos isolados animais, duas – C. pa um e C. elis – o am, ambém, encon adas em in ecções humanas, ac o que nos le a a conside a os seus espec i os hospedei os – gado domés ico, uminan es sil á icos e ga os – como possí eis ese a ó ios zoonó icos da in ecção humana. A de e minação da di e sidade in a-especí ica de C. hominis e de C. pa um oi ealizada po ca ac e ização molecula de um locus de mic ossa éli es – ML2 – e do gene GP60. A análise de agmen os po me odologia luo escen e do STR ML2, e elou a ausência de a iabilidade gené ica em C. hominis e pe mi iu ca ac e iza , somen e, 47% (8/17) dos isolados de C. pa um humanos es udados; a p esença de múl iplos picos nos elec o o e og amas dos es an es pa asi as de o igem humana e nos de odos os ou os animais impediu a iden i icação dos seus alelos. Os dois alelos iden i icados nos oi o isolados de C. pa um humanos – ML2-176 e ML2-191 – não o am encon ados em nenhum dos pa asi as de gado domés ico ou de uminan es sil á icos. Em i ude da impossibilidade de iden i ica o alelo de odos os pa asi as da espécie C. pa um em es udo, a ca ac e ização do locus ML2 mos ou se de pouca u ilidade pa a o nosso abalho. A ca ac e ização do gene GP60, pe mi iu iden i ica no e amílias de sub ipos, qua o em C. pa um e cinco em C. hominis. En e os pa asi as da espécie C. pa um, os de o igem humana ap esen a am maio a iabilidade de sub ipos do que os de gado bo ino e de uminan es sil á icos. A maio ia dos isolados de gado bo ino (61/72), um de gado o ino, um de gamos da Tapada de Ma a e odos os dos Bo ídeos do Ja dim Zoológico (n = 9) ap esen a am o mesmo sub ipo – IIaA15G2R1 –, o qual oi, ambém, encon ado em no e isolados humanos. O segundo sub ipo de C. pa um mais equen e em isolados bo inos – IIaA16G2R1 – não oi ii encon ado em isolados humanos. Os dois sub ipos menos equen es em gado bo ino e o ino – IIdA17G1 e IIdA21G1 – o am, ambém, iden i icados em isolados humanos. Em alguns pa asi as humanos de C. pa um o am, ainda, encon ados qua o sub ipos, pe encen es a ês amílias, não iden i icados nos isolados de gado domés ico ou de uminan es sil á icos – IIbA14, IIcA5G3, IIdA19G1 e IIdA22G1. O ac o de, em Po ugal, isolados de C. pa um com o mesmo sub ipo e em sido encon ados em in ecções, não só humanas, como, ambém, de gado domés ico e de uminan es sil á icos indica que a sua ansmissão ao Homem pode oco e pela ia zoonó ica e, ambém, pela an oponó ica. Ainda, a iden i icação, em isolados de C. pa um humanos, de amílias/sub ipos não encon ados nos animais, coloca a hipó ese des es pa asi as se em ansmi idos ao Homem, unicamen e, pela ia an oponó ica. Em suma, os esul ados ob idos no p esen e abalho suge em que, em Po ugal, a ansmissão de C. pa um ao Homem en ol e dois g upos de pa asi as, um cons i uído po aqueles que são ansmi idos, que pela ia zoonó ica, que pela an oponó ica e, ou o, compos o pelos que são eiculados, exclusi amen e, pela ia an oponó ica. iii SUMMARY C yp ospo idium species a e p o ozoan pa asi es ha eme ged wo ldwide as a cause o dia hoeal disease in humans and animals. In ec ion can be ansmi ed h ough pe son- o- pe son – an h opono ic ansmission –, animal- o-pe son con ac – zoono ic ansmission – o by inges ion o con amina ed wa e o ood. The in luence o each ansmission ou e in he ansmission dynamics o c yp ospo idiosis is no ye ully unde s ood. Al hough human in ec ions a e caused, mainly, by C. pa um and C. hominis, se e al o he species ha e also been associa ed wi h human disease – C. elis, C. meleag idis, C. mu is, C. canis, C. suis and C yp ospo idium ce ine geno ype. Wi h his wo k we in ended o iden i y he C yp ospo idium species and geno ypes esponsible o human in ec ions in Po ugal as well as hose ha pa asi ize ca le, pe s and wild animals, in o de o de e mine which ones a e in ec ious o humans and also hei possible zoono ic ese oi s. In addi ion, we also in ended o es ablish he ole o each ansmission ou e in he epidemiology o c yp ospo idiosis in Po ugal. The a e o C yp ospo idium spp. in ec ion in he HIV-in ec ed pa ien s wi h gas oin es inal symp oms, s udied be ween June 2001 and Janua y 2005, was 8,3% (18/217). In pe s, 1,8% (2/109) o he p i a ely owned ca s and 0% (0/157) o he p i a ely owned and shel e dogs we e exc e ing C yp ospo idium spp. oocys s. In ee- anging wild animals, ca ni o es and small mammals, no oocys s we e ound in he aecal samples s udied. In animals kep a he Lisbon Zoo, he a e o posi i e aecal samples among he mammals examined was 0,9% (2/217), co esponding o a black wildebees and a p ai ie bison exc e ing oocys s in hei aeces; C yp ospo idium spp. was also ound in he aeces o an indian s a o oise newly a i ed a he Zoo. Molecula cha ac e iza ion o human C yp ospo idium spp. isola es, de ec ed be ween 1994 and 2005, was success ully accomplished o i y-one pa asi es: 52,9% (27/51) we e iden i ied as C. pa um, 31,4% (16/51) as C. hominis, 9,8% (5/51) as C. elis and 5,9% (3/51) as C. meleag idis. Conce ning he pa asi es om non-human hos s – ca le and wild uminan s ( allow dee s om Tapada Nacional de Ma a and Bo ids om he Lisbon Zoo), s udied e ospec i ely, and ca s and Zoo animals, s udied p ospec i ely – in hose wi h posi i e DNA ampli ica ion, he esul s o i s molecula cha ac e iza ion showed ha : i) 94% (80/85) o he bo ine isola es and all he isola es om sheep (n = 2), allow dee s om x 10.3 Espécies e genó ipos encon ados em ou os hospedei os e eb ados ............. 62 10.4 Iden i icação de espécies e de genó ipos encon ados na água .......................... 65 10.5 Va iação in a-especí ica em C. pa um e C. hominis ....................................... 67 SEGUNDA PARTE – CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA CRIPTOSPORIDIOSE EM PORTUGAL ................................................................................ 70 CAPÍTULO I – OBJECTIVOS ................................................................................................ 71 CAPÍTULO II – MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 73 1. População es udada ...................................................................................................... 74 1.1 População humana ................................................................................................ 74 1.2 População animal ................................................................................................. 74 1.2.1 Gado bo ino e o ino ................................................................................. 75 1.2.2 Animais de companhia .............................................................................. 75 1.2.3 Animais sil á icos de ida li e ................................................................ 76 1.2.4 Animais sil á icos em ca i ei o ................................................................ 77 2. Diagnós ico pa asi ológico ........................................................................................... 80 2.1 Concen ação das amos as ecais ........................................................................ 80 2.2 Colo ação di e encial ........................................................................................... 80 2.3 Obse ação mic oscópica ..................................................................................... 81 3. Ex acção de DNA genómico de C yp ospo idium spp. .............................................. 82 3.1 P epa ação dos oocis os pa a ex acção de DNA ................................................. 82 3.2 Mé odo Mini-BeadBea e /Sílica ........................................................................... 82 3.3 Mé odo KOH/Qiagen ........................................................................................... 83 4. Ca ac e ização molecula de isolados de C yp ospo idium spp. .................................. 85 4.1 Ampli icação de DNA genómico po PCR .......................................................... 85 4.2 Visualização do DNA ampli icado ....................................................................... 88 4.3 Hid ólise do DNA ampli icado po endonucleases de es ição – RFLP ............. 88 4.4 Pu i icação e sequenciação dos agmen os ampli icados po PCR ..................... 89 4.5 Análise bioin o má ica ......................................................................................... 90 5. Ca ac e ização molecula in a-especí ica de C. pa um e C. hominis ........................ 91 5.1 Análise de mic ossa éli es .................................................................................... 91 5.2 Ca ac e ização molecula do gene GP60 .............................................................. 93 x i 5.2.1 Ampli icação de DNA genómico po PCR ............................................... 93 5.2.2 Pu i icação e sequenciação dos agmen os ampli icados po PCR .......... 95 5.2.3 Análise bioin o má ica .............................................................................. 97 CAPÍTULO III – INFECÇÃO POR CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH ........................................................................................................ 98 1. In odução ..................................................................................................................... 99 2. Resul ados .................................................................................................................... 99 3. Discussão ...................................................................................................................... 101 CAPÍTULO IV – INFECÇÃO POR CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS ............................................................................................. 104 1. In odução ..................................................................................................................... 105 2. Resul ados .................................................................................................................... 106 2.1. Animais de companhia ........................................................................................ 106 2.2. Animais sil á icos de ida li e .......................................................................... 107 2.3. Animais sil á icos em ca i ei o .......................................................................... 107 3. Discussão ...................................................................................................................... 108 3.1. Animais de companhia ........................................................................................ 108 3.2. Animais sil á icos de ida li e .......................................................................... 110 3.3. Animais sil á icos em ca i ei o .......................................................................... 113 CAPÍTULO V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. ....................................................................... 116 1. In odução ..................................................................................................................... 117 2. Resul ados .................................................................................................................... 119 3. Discussão ...................................................................................................................... 129 CAPÍTULO VI – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS ANIMAIS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. ..................................................................... 137 1. In odução ..................................................................................................................... 138 2. Resul ados .................................................................................................................... 139 3. Discussão ...................................................................................................................... 146 CAPÍTULO VII – CARACTERIZAÇÃO INTRA-ESPECÍFICA DE C. HOMINIS E C. PARVUM ........ 155 1. In odução ..................................................................................................................... 156 2. Resul ados .................................................................................................................... 158 x ii 2.1. Análise de mic ossa éli es ................................................................................... 158 2.2. Ca ac e ização do gene GP60 .............................................................................. 162 3. Discussão ...................................................................................................................... 173 CAPÍTULO VIII – CONCLUSÃO .......................................................................................... 184 CAPÍTULO IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 188 1 - P imei a Pa e - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2 1. PERSPECTIVA HISTÓRICA Os mic o ganismos do géne o C yp ospo idium o am desc i os, pela p imei a, ez em 1907, pelo pa asi ologis a ame icano E nes Tyzze , após obse ação, na mucosa gás ica de mu ganhos (Mus musculus), di e sas o mas de desen ol imen o sexuadas e assexuadas que esul a am na o mação de oocis os con endo qua o espo ozoí os li es. O au o iden i icou os pa asi as como sendo coccídeos de es a u o axonómico inde inido e deu-lhe o nome de C yp ospo idium mu is [Tyzze , 1907]. Em 1910, Tyzze ez a desc ição de alhada do ciclo de ida e das o mas de desen ol imen o de C. mu is e p opôs a c iação do géne o C yp ospo idium (que signi ica espo ocis o escondido ou ausen e), pe encen e à classe Spo ozoa e à subclasse Coccidia. O mesmo au o desc e eu, ainda, em 1912, uma no a espécie, que designou de C yp ospo idium pa um, que se desen ol e no epi élio in es inal de mu ganhos e cujos oocis os possuem dimensões in e io es às de C. mu is [Tyzze , 1912]. Nos anos seguin es, em mamí e os, a es, ép eis e peixes, o am desc i as 21 no as espécies pe encen es ao géne o C yp ospo idium, assumindo-se que cada hospedei o animal e a pa asi ado po uma espécie di e en e de C yp ospo idium spp.. No en an o, es udos subsequen es mos a am a a -se, algumas delas, de espo ocis os de Sa cocys is. Do mesmo modo, na sequência de es udos de ansmissão c uzada, ou as espécies o am in alidadas e sinonimizadas com C. pa um [Le ine, 1984; O’Donoghue, 1995; Faye e al., 1997]. A iden i icação, em 1971, de pa asi as do géne o C yp ospo idium, como causa de dia eia em i elos, ma cou o início do in e esse da Medicina Ve e iná ia po es es mic o ganismos e, desde en ão, mui os au o es desc e e am casos de dia eia aguda p o ocados po es es agen es em animais domés icos e sil á icos [Casemo e e al., 1985b; Cu en e Ga cia, 1991]. Os dois p imei os casos conhecidos de c ip ospo idiose humana o am ela ados em 1976. O p imei o oi egis ado numa c iança de ês anos, esiden e numa zona u al de Nash ille, nos Es ados Unidos da Amé ica (EUA), que ap esen a a dia eia se e a [Nime e al., 1976]. O segundo oi desc i o, ambém nos EUA, num ag icul o de 39 anos de idade que desen ol eu dia eia se e a após cinco semanas de e apêu ica imunossup esso a, pa a a amen o de doença au o-imune [Meisel e al., 1976]. Nos seis anos seguin es o am documen ados oi o casos de c ip ospo idiose, cinco em imunocomp ome idos e ês em REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3 imunocompe en es [Cen e s o Disease Con ol and P e en ion, 1982a; Reese e al., 1982; Slope e al., 1982; Tzipo i, 1983]. Em 1982, dois ela ó ios do “U.S. Cen e s o Disease Con ol and P e en ion” (CDC) epo a am a oco ência de um su o de c ip ospo idiose no Alabama, em 12 indi íduos imunocompe en es, odos a ado es de i elos com dia eia [Cen e s o Disease Con ol and P e en ion, 1982a] e de dia eia se e a c ónica po C yp ospo idium spp. em 21 doen es com sínd ome de imunode iciência adqui ida (SIDA) [Cen e s o Disease Con ol and P e en ion, 1982b]. Após es as duas úl imas e e ências, as comunidades médica e cien í ica oma am, inalmen e, consciência da impo ância des e pa asi a pa a a saúde humana. Mais a de, em 1993, em Milwaukee, EUA, a a és da ede de abas ecimen o público de água à cidade, 403.000 pessoas o am in ec adas po C yp ospo idium spp.. Nos dois anos que se segui am a es e su o, o núme o de óbi os po c ip ospo idiose oi 13,5 ezes supe io ao egis ado nos dois anos an e io es, endo 85% dos mesmos oco ido en e a população de doen es com SIDA [Hoxie e al., 1997]. Desde en ão, o in e esse po es e p o ozoá io passou a en ol e , ambém, as en idades dis ibuido as de água e as au o idades de saúde pública [MacKenzie e al., 1994]. O econhecimen o g adual da impo ância dada a es e mic o ganismo, ao longo do úl imo século, e lec iu-se no aumen o exponencial de publicações p esen es na “Na ional Lib a y o Medicine” (h p://www.ncbi.nlm.nih.go /en ez/que y. cgi) que, sendo de 100 a é 1982, aumen ou pa a 5.019, em Dezemb o de 2005. Essas publicações documen am, não só a in ecção po C yp ospo idium spp. no Homem e nou os animais e a p esença des e pa asi a na água e nos alimen os, como dão con a de á ios aspec os da sua biologia e do desen ol imen o de mé odos de diagnós ico, de ecção, p e enção, con olo e a amen o da c ip ospo idiose. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4 2. CICLO DE VIDA Os pa asi as do géne o C yp ospo idium ap esen am um ciclo de ida monoxénico, que se inicia após a inges ão de oocis os po pa e de um hospedei o suscep í el ( igu a 1). As condições de empe a u a, de pH e a p esença de sais bilia es e enzimas panc eá icas, encon adas no lúmen in es inal, induzem a libe ação dos qua o espo ozoí os exis en es em cada oocis o. A a és de um p ocesso ainda pouco comp eendido, mediado po p o eínas p oduzidas pelo espo ozoí o e po ecep o es especí icos exis en es na célula hospedei a, de e minados o ganelos do complexo apical (localizado na ex emidade an e io dos espo ozoí os) iniciam o p ocesso de in asão das células do epi élio in es inal. Es as úl imas começam, en ão, um p ocesso de eo ganização do seu ci osquele o, ao mesmo empo que a sua memb ana celula en ol e o espo ozoí o, o mando um acúolo pa asi ó o o, em que o pa asi a pe manece numa posição in acelula , mas ex aci oplasmá ica, passando, nes a al u a, a designa -se de o ozoí o. Com excepção dos me ozoí os e dos mic ogâme as, que se libe am da célula hospedei a pa a in adi em no as células, odo o desen ol imen o endógeno se p ocessa no in e io das células epi eliais. Pensa-se que a cha e da esis ência aos á macos, ap esen ada po es es mic o ganismos, possa encon a jus i icação nes a localização pa icula , en e o lúmen in es inal e o ci oplasma da célula hospedei a, que os p o ege do ambien e in es inal hos il e da espos a imunológica do hospedei o. Na base de cada acúolo pa asi ó o o desen ol e-se uma es u u a denominada o ganelo alimen ado (do inglês, “ eede o ganelle”) que sepa a os ci oplasmas da célula hospedei a e do pa asi a e que é o esponsá el pela en ada de ene gia e de nu ien es ( igu a 2b) [Wa d e Ce allos, 1998; Tzipo i e Wa d, 2002; Pe y, 2004]. A ase assexuada do desen ol imen o pa asi á io inicia-se den o do acúolo pa asi ó o o, quando o o ozoí o so e ês di isões nuclea es (me ogonia), o iginando os me on es ipo I, que con êm seis a oi o me ozoí os ( igu as 1 e 2c), os quais são libe ados pa a o lúmen in es inal. Cada no o me ozoí o in ade uma célula epi elial adjacen e ( igu as 1 e 2d) e, após ma u ação e duas ou ês ge ações de me ogonia, o igina, espec i amen e, um me on e ipo I (cons i uindo uma on e in e na de au o-in ecção) ou um me on e ipo II. Es e úl imo con ém qua o me ozoí os que, ao in ec a em no as células, se di e enciam em mic ogamon es (células masculinas) e mac ogamon es (células emininas) e ão inicia a ase REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5 sexuada do desen ol imen o (game ogonia). Os mic ogamon es o nam-se mul inucleados, sendo cada núcleo inco po ado num mic ogâme a que ai e iliza um mac ogamon e ( igu as 1 e 2e), o mando o zigo o. Es e, po sua ez, so e duas di isões nuclea es (espo ogonia) dando o igem ao oocis o, que con ém no seu in e io qua o espo ozoí os. Du an e a espo ogonia o mam-se dois ipos de oocis os, os de pa ede ina (ce ca de 20%), que pe manecem no hospedei o, cons i uindo uma segunda on e de au o-in ecção e os de pa ede g ossa (ce ca de 80%), que são exc e ados nas ezes, já sob a o ma in ec an e (espo ulados) e que, após inges ão, ão in ec a no os hospedei os suscep í eis [O’Donoghue, 1995; Faye e al., 1997; Kosek e al., 2001; Ca ey e al., 2004]. Oocis o espo ulado Espo ozoí o T o ozoí o Me on e ipo I Me ozoí os Me on e ipo II Me ozoí os Mic ogamon e Mac ogamon e Mic ogâme as Zigo o Au o-in ecção Au o-in ecção Oocis o de pa ede ina Oocis o de pa ede g ossa Exc eção Inges ão FIGURA 1 – Rep esen ação esquemá ica do ciclo de ida de C yp ospo idium spp. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6 FIGURA 2 – C yp ospo idium baileyi obse ado em mic oscopia elec ónica de a imen o: a) ele ada ca ga pa asi á ia na supe ície epi elial; b) egião basal do o ganelo alimen ado ; c) me on es ipo I; d) me ozoí o a pene a na célula hospedei a; e) mic ogâme a a e iliza um mac ogamon e [adap ado de h p://www.ksu.edu/pa asi ology/625 u o ials/Cbaileyi.h ml, consul ado a 10 de No emb o de 2004] a d b c e REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7 Os oocis os ap esen am o ma edonda a o alada, com dimensões que a iam en e 4 a 8 µm, dependendo da espécie. No seu in e io encon am-se qua o espo ozoí os e mi o mes e um co po esidual con endo um acúolo lipídico e alguns g ânulos de amilopec ina ( igu a 3) [Pe y, 2004]. Num es udo ecen e, após in ecção expe imen al em a inhos e i elos, oi desc i a, espec i amen e, em C. pa um e C. ande soni, a exis ência de o mas de desen ol imen o ex acelula es semelhan es aos gamon es dos g ega inas, algumas das quais em sizígia. Con udo, a sua o igem, o seu des ino e o seu papel no ciclo de ida daqueles pa asi as não é, ainda, conhecido [Hijjawi e al., 2002]. Rosales e al. (2005) ambém obse a am, em cul u as celula es de C. pa um, a p esença de o mas de desen ol imen o ex acelula es semelhan es aos gamon es dos g ega inas e de zigo os e oocis os com oi o espo ozoí os; algumas das o mas ex acelula es o am, igualmen e, obse adas em sizígia. Es es esul ados apon am pa a a necessidade de e isão do ciclo de ida de C yp ospo idium spp. o que, no en an o, só pode á se conseguido após a ealização de es udos in i o e in i o adicionais e da análise ul a-es u u al des as no as o mas de desen ol imen o [Hijjawi e al., 2002; Rosales e al., 2005]. FIGURA 3 – Rep esen ação esquemá ica de um oocis o de C yp ospo idium spp.. Esp – espo ozoí o, G – g ânulo de amilopec ina, VL – acúolo lipídico G Esp VL REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14 ii) Doença au olimi ada, ca ac e izada po dia eia aquosa p o usa, com du ação in e io a dois meses, seguida de comple a emissão dos sin omas e in e upção da exc eção de oocis os. Es es casos su gem em indi íduos com con agem de lin óci os TCD4+ supe io a 180 céls./mm3 [Blansha d e al., 1992; Flanigan e al., 1992]. iii) Doença c ónica, ca ac e izada po dia eia aquosa p o usa, com du ação supe io a dois meses. Es es indi íduos ap esen am con agem de lin óci os TCD4+ in e io a 140 céls./mm3 e, concomi an emen e, e elam má abso ção, desid a ação e pe da de peso acen uada [Blansha d e al., 1992; Flanigan e al., 1992]. i ) Doença com e olução ulminan e, em que a pe da de líquidos nas ezes é supe io a dois li os po dia. Os doen es e elam desid a ação g a e, al e ação do equilíb io hid oelec olí ico e caquexia, o que pode conduzi à mo e. Es es casos oco em, unicamen e, em doen es com con agem de lin óci os TCD4+ in e io a 50 céls./mm3 [Blansha d e al., 1992; Flanigan e al., 1992; Casemo e, 2000]. Num es udo com du ação de seis anos, ealizado em Lond es, em indi íduos com co- in ecção po VIH e C yp ospo idium spp., a in ecção c ónica oi a o ma de ap esen ação mais equen e (59,7%), seguindo-se-lhe os quad os clínicos de doença au olimi ada (28,7%), doença de e olução ulminan e (7,8%) e, po im, in ecção sem dia eia (3,9%) [Blansha d e al., 1992]. Nos países em ias de desen ol imen o, as o mas mais equen es da c ip ospo idiose nos in ec ados po VIH são a doença c ónica e a doença com e olução ulminan e [Fa hing, 2000]. O empo de sob e ida dos doen es depende da e olução clínica da in ecção, ap esen ando um alo médio de cinco, 20 e 36 semanas, espec i amen e, nos casos de doença com e olução ulminan e, c ónica e au olimi ada [Blansha d e al., 1992]. Os doen es com unção imuni á ia de icien e, p incipalmen e aqueles com in ecção po VIH, podem desen ol e localizações ex a-in es inais, como o es ômago, o ac o bilia , o pânc eas ou os pulmões [Hun e e Nichols, 2002]. A c ip ospo idiose bilia é a o ma mais comum da doença ex a-in es inal, embo a o núme o o al de casos seja desconhecido, uma ez que o seu diagnós ico depende do ecu so a écnicas in asi as, que não são ealizadas po o ina [Chen e al., 2002]. Na população a ec ada pelo g ande su o de c ip ospo idiose de 1993, em Milwaukee, Vakil e al. (1996), e i ica am que 87,5% dos doen es com mani es ações clínicas suge indo en ol imen o das ias bilia es, ap esen a am con agem de lin óci os TCD4+ in e io a 50 céls./mm3. Apesa de exis i em poucas desc ições de en ol imen o gás ico po C yp ospo idium spp., alguns au o es conside am que es e possa se mais REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 15 equen e do que se pensa, dada, não só a di iculdade da sua iden i icação, que depende da ealização de endoscopia gás ica com biopsia, como a equen e ausência de sin oma ologia na c ip ospo idiose do es ômago [Rossi e al., 1998; Hun e e Nichols, 2002]. A in ecção do apa elho espi a ó io, em doen es com SIDA, em sido desc i a po di e sos au o es, nos casos de iden i icação de oocis os na expec o ação, em aspi ado b oncoal eola ou em biopsia pulmona , sendo ca ac e izada po osse, dispneia, eb e e do na egião o ácica [Fa hing, 2000; Hun e e Nichols, 2002]. No en an o, o signi icado clínico des es achados não se encon a bem escla ecido, uma ez que a in ecção espi a ó ia po C yp ospo idium spp. se encon a, na maio ia dos casos, associada a ou os agen es in ecciosos do apa elho espi a ó io, nomeadamen e Mycobac e ium ube culosis, Pneumocys is ji o ecii e í us ci omegálico [Fa hing, 2000; Hun e e Nichols, 2002]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 16 5. TRATAMENTO DA CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA Não exis e, ac ualmen e, e apêu ica e io ópica e icaz pa a o a amen o da c ip ospo idiose. Nos úl imos anos, o am e ec uados di e sos ensaios, en ol endo mais de 100 á macos, mui os deles com acção con a ou os coccídeos, sem que, no en an o, a sua ac i idade con a os pa asi as do géne o C yp ospo idium i esse sido sa is a ó ia. Toda ia, alguns á macos mos a am alguma e icácia na diminuição do núme o de oocis os exc e ados e na melho ia do quad o clínico [Fa hing, 2000; A mson e al. 2003; Benson e al., 2004]. A pa amomicina oi um dos p imei os á macos a e idencia alguma ac i idade an i- C yp ospo idium. Quando adminis ada em doses ele adas, mos ou se e icaz no a amen o da c ip ospo idiose no modelo animal, sendo u ilizada no a amen o da doença humana. Con udo, di e sos es udos e ec uados em doen es com in ecção VIH mos a am que a sua e icácia é a iá el e limi ada ao pe íodo du an e o qual é adminis ada, sendo equen es as ecidi as [A mson e al., 2003; Benson e al., 2004]. A ni azoxanida é um á maco e icaz no a amen o de in ecções po bac é ias, helmin as e alguns pa asi as euca io as, nomeadamen e En amoeba hys oli ica, Gia dia lamblia e Isospo a belli, que mos ou esul ados p omisso es no a amen o da in ecção po C yp ospo idium spp. [A mson e al., 2003; Benson e al., 2004]. Em alguns es udos e ec uados em doen es com SIDA e c ip ospo idiose, o am obse adas axas de cu a pa asi ológica na o dem dos 70% [Rossignol e al., 1998; A mson e al., 2003]. Em 2002, a ni azoxanida oi ap o ada pela “U.S. Food and D ug Adminis a ion” pa a o a amen o da c ip ospo idiose em c ianças não endo, ainda, sido es abelecidas a sua e icácia e segu ança em imunocomp ome idos [U.S. Food and D ug Adminis a ion, 2002; Benson e al., 2004]. Como a e olução clínica da c ip ospo idiose nos doen es imunocompe en es é di e en e da dos doen es com imunode iciência, a e apêu ica pa a es as duas populações é, igualmen e, dis in a. Os doen es com sis ema imuni á io in ac o não necessi am, em eg a, de e apêu ica, pa a além da de supo e, pa a co ecção da desid a ação p o ocada pela dia eia aquosa [G i i hs, 1998; Chen e al., 2002; Benson e al., 2004]. Nos doen es com neoplasias ou que o am sujei os a ansplan e de ó gãos, a in e upção da quimio e apia ou da e apêu ica imunossup esso a, le a à econs i uição da unção imuni á ia e, consequen emen e, à esolução da in ecção [G i i hs, 1998]. Nos doen es com SIDA, o a amen o mais adequado REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17 consis e na adminis ação da e apêu ica an i- e o i al po en e ou HAART (ac ónimo anglo- saxónico pa a “highly ac i e an i e o i al he apy”), com o objec i o de baixa a i émia e es au a , na medida do possí el, a unção imuni á ia, que é condição essencial pa a a esolução da in ecção [G i i hs, 1998; Miao e al., 2000; Chen e al., 2002]. Nos casos de dia eia se e a c ónica ou ulminan e é, ainda, necessá io epo a pe da de líquidos e de elec óli os, po adminis ação o al ou in a enosa, de soluções con endo glucose, bica bona o de sódio, po ássio, magnésio e ós o o [Benson e al., 2004]. O a amen o sin omá ico com an idia eicos diminui a equência e o olume das dejecções, con ibuindo pa a a melho ia da qualidade de ida dos doen es [G i i hs, 1998; Benson e al., 2004]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18 6. DIAGNÓSTICO DA CRIPTOSPORIDIOSE O diagnós ico di e encial da c ip ospo idiose de e se conside ado em qualque doen e que ap esen e dia eia aguda ou pe sis en e, p incipalmen e, se es a oco e em associação com imunode iciência. Toda ia, o quad o clínico gas en e ológico causado po mic o ganismos do géne o C yp ospo idium não é pa ognomónico des es pa asi as, sendo, de igual modo, da esponsabilidade de bac é ias en e opa ogénicas, í us e ou os pa asi as. Des e modo, pa a o diagnós ico de ini i o da c ip ospo idiose é necessá ia, semp e, a iden i icação de oocis os em amos as ecais. Quando se suspei a de c ip ospo idiose ex a-in es inal, a pesquisa de oocis os pode se e ec uada nou as amos as, nomeadamen e na expec o ação, em la ado b oncoal eola , em aspi ado duodenal ou na bílis [Pe y, 2000]. 6.1 DIAGNÓSTICO HISTOLÓGICO Os p imei os casos de in ecção po C yp ospo idium spp. iden i icados no Homem e nou os animais, undamen a am-se na obse ação das o mas de desen ol imen o in acelula do pa asi a em biopsias da mucosa in es inal ou em ma e ial de au ópsia [O’Donoghue, 1995; Pe y, 2000]. Os mé odos his oquímicos mais u ilizados pa a o diagnós ico his ológico da c ip ospo idiose baseiam-se na colo ação pela hema oxilina-eosina e pelo giemsa [O’Donoghue, 1995]. O ecu so à mic oscopia elec ónica de ansmissão, pa a obse ação de co es his ológicos, pe mi e a obse ação mo ológica de alhada das di e sas o mas de desen ol imen o in acelula dos c ip ospo ídeos. No en an o, es es es udos são dispendiosos, demo ados e ap esen am baixa sensibilidade, dado que são obse adas, apenas, pequenas secções da mucosa e que as in ecções não se encon am uni o memen e dis ibuídas naquela, pa icula men e nos casos em que a ca ga pa asi á ia é baixa [O’Donoghue, 1995; Pe y, 2000]. Apesa da sua u ilidade na in es igação das al e ações ci ológicas e his opa ológicas que acompanham a in ecção, es es mé odos não são adequados pa a o diagnós ico pa asi ológico de o ina [O’Donoghue, 1995; Pe y, 2000]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19 6.2 DIAGNÓSTICO COPROLÓGICO A in odução, em 1981, do mé odo de colo ação de Ziehl-Neelsen modi icado [Hen iksen e Pohlenza, 1981] cons i uiu um sal o quali a i o no diagnós ico da c ip ospo idiose, pe mi indo a de ecção de oocis os nos es egaços ecais, associando, assim, um mé odo de colhei a não in asi o à simplicidade de execução da écnica de colo ação. Es a écnica baseia-se no ac o de os oocis os, depois de co ados com ucsina básica enolada, e e em es e co an e aquando da descolo ação pelo álcool-ácido. Es a ca ac e ís ica pe mi e, após colo ação de con as e, com o e de-de-malaqui e ou com o azul-de-me ileno, di e encia os oocis os do es an e ma e ial ecal. Os oocis os podem se obse ados ao mic oscópio óp ico (com uma ampliação de 200 ou 400 ezes) e ap esen am-se como pequenas es u u as co -de- osa, de o ma es é ica, com um diâme o de 4 a 6 µm, enquan o que o es an e ma e ial ecal ap esen a a co do co an e de con as e. Nalguns oocis os pode obse a -se, ainda, a sua es u u a in e na, nomeadamen e os espo ozoí os e os co pos esiduais, que ap esen am co mais escu a [Casemo e e al., 1985a; Pe y, 2000]. Pa a além do Ziehl-Neelsen modi icado exis em ou os mé odos, ulga men e u ilizados pa a a colo ação di e encial de oocis os de C yp ospo idium spp., nomeadamen e o de au amina- enol/ ucsina ou o de Kinyoun modi icado [Faye e al., 2000; Pe y, 2000]. Em qualque dos casos, a obse ação de e se ei a po um écnico expe ien e, capaz de dis ingui os oocis os de ou as es u u as semelhan es, como glóbulos de go du a e algumas le edu as [Casemo e, 1991]. A obse ação de p epa ações ecais a esco, pa a iden i icação de oocis os, não de e se e ec uada, uma ez que, pela sua o ma e pequena dimensão, podem se con undidos com le edu as e espo os de ungos, conduzindo a esul ados alsos posi i os [Casemo e, 1991]. Nos casos de in ecção aguda, em que a eliminação de oocis os é ele ada, es es são, acilmen e, obse ados em es egaços ecais. Con udo, quando a in ecção é ligei a ou nos casos assin omá icos, dada não só a na u eza in e mi en e da exc eção, como, ainda, a a iabilidade da quan idade de oocis os exc e ados du an e o deco e da in ecção, a obse ação po mic oscopia con encional pode o na -se di ícil, sendo necessá io eco e a écnicas de concen ação das amos as ecais [Casemo e, 1991]. Vá ios mé odos es ão desc i os pa a a concen ação de oocis os p esen es nas ezes, nomeadamen e, a cen i ugação após ex acção com o mol-é e , a cen i ugação em g adien es de clo e o de césio, a cen i ugação em g adien es de Pe coll, a lu uação em solução de saca ose e a lu uação em solução sa u ada de clo e o de sódio, en e ou os [Webe e al., 1992; Bukha i e Smi h, 1995; Pe y, 2000]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20 Es as écnicas con ibuem, ainda, pa a a emoção de go du as e ou os de i os ecais, melho ando a qualidade da obse ação mic oscópica. No en an o, alguns au o es êm e e ido que, du an e o p ocessamen o das amos as, oco em pe das de oocis os, p incipalmen e em ezes pas osas e moldadas, esul ando na diminuição da sensibilidade do diagnós ico [Webe e al., 1992; Bukha i e Smi h, 1995; Pe y, 2000]. Pa a além dos mé odos de colo ação di e encial, já e e idos, nos úl imos anos êm sido come cializados di e sos es es imunológicos pa a a de ecção de oocis os de C yp ospo idium spp., com base na u ilização de an ico pos monoclonais, em écnicas imunoenzimá icas e de imuno luo escência [Faye e al.,2000; Pe y, 2000]. O mé odo de imuno luo escência pe mi e a iden i icação ácil e ápida dos oocis os nos es egaços ecais, ap esen ando, oda ia, as des an agens do ele ado cus o dos “ki s” exis en es no me cado e da indispensabilidade de um mic oscópio de luo escência, pa a lei u a dos es egaços. No que diz espei o à sensibilidade des e mé odo, ela i amen e à colo ação di e encial, exis e alguma con o é sia, na medida em que alguns au o es desc e em a imuno luo escência como o mé odo mais sensí el, enquan o que ou os encon am sensibilidades idên icas pa a as duas écnicas [G i i hs, 1998; Pe y, 2000]. Os es es imunoenzimá icos pe mi em a análise simul ânea de um g ande núme o de amos as, sendo, no en an o, de sensibilidade in e io às écnicas de imuno luo escência. Pa a além disso, como não é obse ada a mo ologia dos pa asi as, é impossí el dis ingui os e dadei os dos alsos esul ados posi i os [Pe y, 2000]. Num passado ecen e, oco e am p oblemas de especi icidade em alguns es es imunoenzimá icos pa a de ecção de an igénios de C yp ospo idium spp. nas ezes, o que deu o igem a um ele ado núme o de esul ados alsos posi i os [Cen e s o Disease Con ol and P e en ion, 1999; Johns on e al., 2003]. Uma das limi ações associadas aos mé odos imunológicos é a possibilidade de oco e em eacções c uzadas com ou os mic o ganismos, o que le a ao dec éscimo da especi icidade com esul ados alsos posi i os [Faye e al., 2000]. Nos úl imos anos, á ios au o es êm desc i o écnicas de ampli icação de ácido desoxi ibonucleico ou DNA (sigla anglo-saxónica pa a “deoxy ibonucleic acid”), po eacção em cadeia da polime ase ou PCR (sigla anglo-saxónica pa a “polyme ase chain eac ion”), a im de de ec a a p esença de C yp ospo idium spp. em amos as clínicas e ambien ais, ul apassando as limi ações de sensibilidade e especi icidade ap esen adas pelas écnicas acima desc i as. Pa a além de se uma écnica sensí el e especí ica, a PCR ap esen a REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 21 an agens, ais como a acilidade de in e p e ação dos esul ados e a possibilidade de p ocessamen o de um ele ado núme o de amos as em simul âneo [Pe y, 2000]. Inúme os mé odos de PCR, di igidos a di e en es egiões al o do genoma de C yp ospo idium spp. es ão já desc i os; no en an o, es es ap esen am especi icidades e sensibilidades dis in as, o iginando, alguns deles, esul ados alsos posi i os ou alsos nega i os [Sulaiman e al., 1999; Jiang e Xiao, 2003]. A baixa especi icidade ap esen ada po alguns des es mé odos encon a jus i icação no ac o de se em u ilizados oligonucleó idos iniciado es (“p ime s”) di igidos a zonas do genoma mui o conse adas en e os euca io as, esul ando na ampli icação do DNA de ou os mic o ganismos, nomeadamen e os pe encen es ao géne o Eime ia [Sulaiman e al., 1999]. A sensibilidade da eacção de PCR pa a a de ecção de C yp ospo idium spp. depende de di e sos ac o es, ais como o núme o de cópias da egião do genoma a ampli ica ou a p esença de cons i uin es ecais inibido es da eacção [Widme , 1998; Ca ey e al., 2004]. Assim, os sais bilia es, a bili ubina, os me aboli os de á macos, o DNA de ou os mic o ganismos ou polissacá idos complexos de o igem ege al que seques em o ião magnésio, de cuja concen ação depende a ac i idade da enzima Taq DNA polime ase, ou que mime izem o compo amen o do DNA, eduzem a e iciência e a sensibilidade da eacção de PCR [Mon ei o e al., 1997; Pe y, 2000]. Pa a ul apassa es e p oblema são necessá ios mé odos de ex acção de DNA genómico e icazes na emoção daqueles inibido es ecais. Po ou o lado, é da máxima impo ância que a ex acção de DNA seja p ecedida da e icien e des uição da pa ede dos oocis os, uma ez que es a é mui o esis en e e que a sua lise incomple a comp ome e odo o p ocesso de ex acção e, consequen emen e, o endimen o da eacção de PCR [Al es, 1999; Ca ey e al., 2004]. Pa a além da de ecção de mic o ganismos do géne o C yp ospo idium, a écnica de PCR, associada a ou os mé odos de biologia molecula , como o polimo ismo do comp imen o de agmen os de es ição ou RFLP (sigla anglo-saxónica pa a “ es ic ion agmen leng h polymo phism”), ou a de e minação da sequência nucleo ídica de agmen os de DNA ampli icado, possibili a, ainda, a iden i icação da espécie e/ou genó ipo dos pa asi as [Faye e al., 2000; Pe y, 2000]. Con udo, alguns dos mé odos de PCR desc i os na li e a u a o am desen ol idos com base em sequências de C. pa um; assim, e em i ude não só da ele ada a iabilidade gené ica ap esen ada pelos pa asi as pe encen es ao géne o C yp ospo idium, como da possibilidade de ou as espécies/genó ipos causa em in ecção humana, a sua u ilidade pa a o diagnós ico da c ip ospo idiose humana é limi ada, uma ez que apenas REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 22 pe mi em a ampli icação de algumas espécies, nomeadamen e C. pa um e C. hominis, não ampli icando, po exemplo, C. meleag idis ou C. elis [Jiang e Xiao, 2003; Xiao e Ryan, 2004]. A eacção de PCR possui um ele ado po encial como écnica de diagnós ico da c ip ospo idiose. Toda ia, é necessá io, ainda, ul apassa alguns p oblemas a é que seja possí el adop a mé odos de e e ência bem de inidos e adequados à sua u ilização de o ina em odos os labo a ó ios. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 23 7. MODOS DE TRANSMISSÃO DA CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA A ansmissão da c ip ospo idiose humana oco e quando um indi íduo suscep í el inge e oocis os exc e ados po um hospedei o in ec ado, seja po con ac o di ec o ou, indi ec o, a a és da água ou dos alimen os con aminados. Na igu a 5 encon am-se ep esen ados os di e en es modos de ansmissão da c ip ospo idiose ao Homem. Híd ica Zoonó ica Alimen a An oponó ica FIGURA 5 – Rep esen ação esquemá ica dos di e en es modos de ansmissão da c ip ospo idiose ao Homem REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 30 du an e seis meses, quando conse ados a 0ºC, 5ºC, 10ºC, 15ºC e 20ºC. Quando a mazenados a 25ºC e 30ºC, o empo du an e o qual se man êm in ecciosos diminui pa a ês meses [Faye , 2004]. Tambu ini e al. (1999), obse a am que oocis os man idos em água salgada a i icial, no escu o, sob oxigenação mode ada e a uma empe a u a de 6 a 8ºC man êm a sua capacidade in ec an e du an e 12 meses. Robe son e al. (1992), mos a am que a congelação ápida em solução aquosa a –70ºC é le al pa a odos os oocis os. No en an o, quando congelados a –22ºC, 10% dos oocis os pe manece iá el po um pe íodo de seis dias. Ou os au o es desc e e am que oocis os a mazenados a 5ºC e –10ºC man êm a sua capacidade in ec an e a é se e dias, diminuindo esse empo pa a 24 e cinco ho as, quando congelados, espec i amen e, a –15ºC e a –20ºC [Faye e Ne ad, 1996]. Es es dados demons am a esis ência dos oocis os a baixas empe a u as e a possibilidade de pe manece em iá eis, po exemplo, em cubos de gelo. Os oocis os são mui o sensí eis à dessecação, pe dendo a sua iabilidade após qua o ho as de exposição ao a , numa lâmina, à empe a u a ambien e [Robe son e al., 1992]. Expe iências ealizadas em di e en es ipos de solo mos a am a pe da signi ica i a de iabilidade dos oocis os, após alguns ciclos de congelação-descongelação, sendo o empo du an e o qual os oocis os es ão sujei os à congelação um ac o de e minan e pa a que al acon eça. Em solos secos, a inac i ação dos oocis os oco e mais apidamen e do que em solos húmidos. Em condições de empe a u a idên icas, a pe da de iabilidade dos oocis os no solo acon ece mais dep essa do que na água, suge indo que ou os ac o es, pa a além da empe a u a, possam es a en ol idos no p ocesso [Ka o e al., 2002]. A ex ao diná ia obus ez ap esen ada pelos oocis os de C yp ospo idium spp. acima desc i a, o na di ícil a conc e ização e icaz do con olo da ansmissão da c ip ospo idiose. Pe an e ais di iculdades, a adopção de medidas de p e enção adequadas cons i ui o p imei o passo no sen ido de e i a o con ac o do Homem com es es pa asi as. Como as consequências da in ecção podem se pa icula men e g a es em imunode icien es, es a população de e á e cuidados especiais pa a p e eni uma e en ual in ecção. En e algumas das medidas ecomendadas, com o objec i o de p e eni a c ip ospo idiose humana, des acam-se as seguin es [Ca ey e al., 2004; Cen e s o Disease Con ol and P e en ion, 2004; Hla sa e al., 2005]: i) Adop a boas p á icas de higiene – la a as mãos depois de i à casa de banho, depois de muda aldas a c ianças, an es de p epa a alimen os e an es de come . As pessoas com REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 31 dia eia de em, ainda, p o ege os ou os de uma possí el in ecção, inibindo-se de u iliza piscinas e locais públicos com água de ec eio. ii) E i a o con ac o com água que possa es a con aminada – não engoli água de ec eio, não bebe água de poços, de ios, de lagos e de on es não a ada e não bebe água ou gelo em países onde a qualidade da água de abas ecimen o seja du idosa. Em caso de dú ida quan o à sua qualidade, a água de e á se e ida an es de consumida. iii) E i a inge i alimen os con aminados – la a bem ou i a a casca à u a e aos legumes e e i a come alimen os c us, em países onde o a amen o da água é de icien e. i ) E i a o con ac o com uminan es domés icos, especialmen e i elos e co dei os. ) E i a p á icas sexuais que en ol am o con ac o ecal-o al. Nas ins i uições de saúde, in an á ios e cen os de dia, pa a além da adopção de igo osos hábi os de higiene, o modo mais e icaz de p e eni a ansmissão da in ecção consis e na c iação de á eas es i as pa a os doen es in ec ados, e i ando o seu con ac o com ou as pessoas suscep í eis [Keusch e al., 1995; Ca ey e al., 2004]. A diminuição da con aminação ambien al cons i ui, igualmen e, uma impo an e medida de p e enção, podendo se conseguida a a és da edução da ansmissão da in ecção en e animais. Nas explo ações pecuá ias é essencial um bom maneio higio-sani á io das ins alações, sepa a os animais jo ens dos adul os, eduzi a densidade de animais num mesmo espaço, isola os animais doen es, impedi o acesso dos animais a zonas p óximas de cu sos de água e a a o es ume dos animais (secagem pelo calo , compos agem), an es da sua u ilização como e ilizan e do solo [Du y e Mo ia y, 2003; Rami ez e al., 2004]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 32 9. EPIDEMIOLOGIA DA CRIPTOSPORIDIOSE C yp ospo idium spp. é causa de doença gas in es inal no Homem e nou os animais em odo o Mundo, endo, nos EUA, sido conside ado agen e in eccioso eme gen e pelo “Cen e s o Disease Con ol and P e en ion”, a “En i onmen al P o ec ion Agency”, a “Ame ican Wa e Wo ks Associa ion”, o “Na ional Ins i u es o Heal h” e a “Food and D ug Adminis a ion” [Tzipo i, 2002]. A epidemiologia des es pa asi as é o emen e in luenciada po uma sé ie de ca ac e ís icas que acili am a sua ampla ansmissão: i) O pequeno amanho dos oocis os, a sua baixa elocidade de sedimen ação e a consequen e ele ada capacidade de lu uação acili am o seu anspo e e a sua dispe são no ambien e [Meinha d e al., 1996; Dillingham e al., 2002]. ii) Os oocis os são mui o obus os, podendo pe manece iá eis na água e no solo po á ios meses, em condições de “s ess” ambien al, que se iam le ais pa a mui os ou os agen es in ecciosos. Pa a além disso, a sua esis ência aos p ocessos químicos e ísicos, u ilizados no a amen o da água, acili am a sua ansmissão, cons i uindo um eno me desa io pa a es u u as en ol idas na dis ibuição de água [Robe son e al., 1992; Rose e al., 2002; Faye , 2004]. iii) O ciclo de ida é monoxénico, is o é, comple a-se num único hospedei o. O empo necessá io pa a que o ciclo de ida se comple e é de ce ca de ês dias [Meinha d e al., 1996]. i ) Os oocis os são eliminados já espo ulados, signi icando que, após a exc eção, a in ecção de no os hospedei os pode se imedia a, sob e udo a a és do con ac o pessoa-a- pessoa. O mesmo não acon ece, po exemplo, com Cyclospo a caye anensis que é exc e ado sob a o ma não espo ulada, sendo necessá ias condições ambien ais adequadas pa a que oco a a sua ma u ação e se o ne in eccioso, p ocesso que pode demo a en e uma a duas semanas [Dillingham e al., 2002; Ebe ha d e A owood, 2002]. ) A dose in ec an e pa a o Homem é pequena. Es udos e ec uados com olun á ios saudá eis e ês isolados di e en es de C yp ospo idium spp., mos a am que a dose in ec an e pode a ia en e 9 e 1.042 oocis os, dependendo dos isolados [Okhuysen e al., 1999, 2002]. A aplicação de um modelo ma emá ico de in ecção ao su o que oco eu em Milwaukee, em REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 33 1993, suge e que, pa a alguns casos, a dose in ec an e possa e sido in e io a 10 oocis os/L de água [Eisenbe g e al., 1998]. i) A dis ibuição ubíqua e a ausência de especi icidade de hospedei o ap esen adas po algumas espécies, pa icula men e C. pa um, con ibui pa a o ele ado núme o de ese a ó ios, aumen ando o seu po encial zoonó ico [Dillingham e al., 2002]. ii) O núme o de oocis os exc e ado é mui o ele ado, pa a o que con ibuem os ciclos in e nos de au o-in ecção, pe pe uados pelos me on es ipo I e pelos oocis os de pa ede ina. Es udos em i elos demons a am que es es podem exc e a en e 105 e 107 oocis os po g ama de ezes du an e um pe íodo de se e a dez dias, pensando-se que núme os semelhan es sejam, de igual modo, exc e ados po humanos com c ip ospo idiose. Es e ac o con ibui pa a o ní el ele ado de disseminação e de con aminação ambien al e a o ece a ansmissão [Meinha d e al., 1996; Faye e al., 1997]. iii) A exis ência de múl iplos modos de ansmissão (an oponó ica, zoonó ica e a a és da água ou de alimen os con aminados), que podem oco e em simul âneo, aumen a a sua e iciência [Casemo e e al., 1997]. 9.1 A CRIPTOSPORIDIOSE NO HOMEM A c ip ospo idiose humana, oco e em odas as egiões do Plane a, embo a seja desconhecida a sua e dadei a p e alência. Tal p ende-se com azões di e sas, en e as quais se des acam o ac o de mui os doen es com dia eia não p ocu a em assis ência médica, de alguns médicos não se encon a em amilia izados com es es pa asi as e não equisi a em a sua pesquisa nas ezes, de mui os labo a ó ios não e ec ua em as écnicas adequadas pa a a iden i icação de oocis os de C yp ospo idium spp. ou, ainda, po que mui as das in ecções são assin omá icas não sendo, po isso, in es igadas [Wheele e al., 1999; Die z e al., 2000; Hö man e al., 2004]. O con ac o com C yp ospo idium spp. nem semp e esul a em in ecção pa en e. Quando a exposição ao pa asi a é equen e, as in ecções o nam-se assin omá icas em consequência do desen ol imen o de imunidade à in ecção [Casemo e e al., 1997; F os e al., 1997]. Es as in ecções são mais comuns em egiões onde a c ip ospo idiose é endémica, pa icula men e em zonas pob es, com ele ada densidade populacional, condições de saneamen o de icien es ou ausen es e baixa qualidade da água de abas ecimen o e, em zonas u ais, onde é equen e o REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 34 con ac o com animais in ec ados [Casemo e e al., 1997; Faye e al., 2000]. Nas populações cuja água de abas ecimen o ap esen a ní eis baixos e cons an es de con aminação com oocis os, obse a-se, ambém, um meno núme o de casos sin omá icos da in ecção [F os e al., 1997, 2002]. Tan o as in ecções assin omá icas como as sin omá icas não iden i icadas desempenham um papel impo an e na cadeia epidemiológica da in ecção, p incipalmen e em populações mais suscep í eis, como é o caso das c ianças, dos idosos e dos doen es com imunode iciências [Hö man e al., 2004]. Os núme os disponí eis sob e a in ecção po C yp ospo idium spp., dizem espei o, unicamen e, aos casos em que oco e doença, pouco se sabendo sob e o ní el endémico da in ecção na população. Uma ez que a in ecção po es e pa asi a desencadeia uma espos a se ológica especí ica, os es udos de se op e alência podem se ú eis pa a es ima a espec i a p e alência na população [F os e al., 2002]. 9.1.1 ESTUDOS SEROEPIDEMIOLÓGICOS Alguns es udos se oepidemiológicos sus en am que a in ecção é equen e nos países indus ializados e é quase uni e sal nas egiões em ias de desen ol imen o [Kosek e al., 2001]. Um es udo ecen e, e ec uado em se e zonas geog á icas dos EUA, e elou que mais de 20% das c ianças e jo ens a é aos 21 anos ap esen am espos a se ológica do ipo IgG a dois ma cado es an igénicos especí icos de C yp ospo idium spp., núme o que aumen a pa a alo es supe io es a 50% nos indi íduos com idade supe io a 21 anos. Es a pe cen agem de se oposi i idade aumen a com a idade, sendo que ce ca de 70% da população com idade supe io a 70 anos ap esen a e idência se ológica de in ecção an e io [F os e al., 2004]. Es es alo es são semelhan es aos encon ados, pa a os mesmos ma cado es an igénicos, na população adul a em duas cidades do Canadá (>69% em Collingwood e 45% em To on o) e na Aus ália (>60% em Sidney e Melbou ne) [F os e al., 2000b, 2000c]. Na Eu opa, numa cidade do no e de I ália, o am desc i as pe cen agens de se oposi i idade supe io es a 82%, em adul os com mais de 45 anos [F os e al., 2000a] e a 68% numa cidade da Rússia, a no e de Mosco o [Ego o e al., 2004]. Alguns au o es suge em que es as pe cen agens de se oposi i idade possam es a associadas à qualidade da água. Es es in es igado es e ec ua am es udos de se op e alência em habi an es de á ias cidades dos EUA, com acesso a água p o enien e de di e en es REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 35 o igens e de qualidade a iá el, endo obse ado maio pe cen agem de indi íduos com espos a se ológica de ec á el nas cidades abas ecidas po água supe icial, de meno qualidade, do que nos esiden es em cidades sup idas po água sub e ânea, de qualidade mais ele ada [F os e al., 2001, 2002]. Nos países em ias de desen ol imen o, obse am-se pe cen agens de se op e alência ele adas desde a in ância. Na Gua emala, S einbe g e al. (2004) encon a am, em c ianças a é ao p imei o, segundo e e cei o anos de idade, p e alências de IgG an i-C yp ospo idium de 27%, 70% e 73%, espec i amen e. Na cidade de San An ónio, Es ado do Texas, EUA, o am obse adas, pa a os g upos e á ios 0-4 anos, 5-8 anos e 9-13 anos, se op e alências de 25%, 58% e 70%, espec i amen e. No mesmo es udo, e pa a os mesmos g upos e á ios, as pe cen agens de se oposi i idade encon adas em algumas colónias jun o da on ei a do Es ado do Texas com o México o am de 82%, 85% e 97% [Leach e al., 2000]. Es es es udos não podem, con udo, se is os como indicado es de in ecção ac i a, cons i uindo, somen e, e idência de exposição ou de in ecções p é ias [O’Donoghue, 1995]. 9.1.2 ESTUDOS COPROLÓGICOS As p e alências de in ecção po C yp ospo idium spp. ob idas a a és de es udos cop ológicos são bas an e in e io es aos alo es encon ados nos es udos se ológicos. Es ima i as baseadas em dados o necidos po di e sas en idades de saúde pública dos Es ados Unidos da Amé ica indicam que ce ca de 2% das ezes subme idas, anualmen e, a exame pa asi ológico são posi i as pa a C yp ospo idium spp., o que co esponde a 300.000 pessoas in ec adas [Mead e al., 1999]. Um es udo de me a análise baseado em dados epidemiológicos de 13 abalhos e ec uados em países nó dicos (Dinama ca, Finlândia, No uega e Suécia) apon a es ima i as de p e alência anual da in ecção po C yp ospo idium spp. na população sin omá ica e assin omá ica de 2,91% e 0,99% espec i amen e. Es es alo es co espondem a 12.530 casos anuais de in ecção po cada 100.000 habi an es, sendo que 3.340 são sin omá icos e 9.190 assin omá icos. Apesa da p e alência da in ecção se in e io na população assin omá ica, quando compa ada com a sin omá ica, o núme o de casos assin omá icos ep esen a ce ca de 73% do o al de casos anuais [Hö man e al., 2004]. O p oblema da c ip ospo idiose é mais d amá ico nos in ec ados po VIH, sob e udo nos países não indus ializados, dada a dimensão ala man e de indi íduos com in ecção VIH/SIDA, a maio ia dos quais sem acesso à e apêu ica an i- e o í ica [Fa hing, 2000]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 36 Nos países em ias de desen ol imen o, a c ip ospo idiose é uma doença endémica, sendo uma das causas mais equen es de dia eia pe sis en e em c ianças a é aos dois anos de idade [Casemo e e al., 1997; Nwabuisi, 2001; Pe ei a M.G.C. e al., 2002; Adjei e al., 2004]. Na população adul a imunocompe en e a in ecção é, com equência, assin omá ica [Casemo e e al., 1997]. Um es udo e ec uado no México, em ês comunidades pob es sem água canalizada nem saneamen o básico, e elou que em 70% das amílias exis ia, pelo menos, um memb o com in ecção po C yp ospo idium spp. e, em 56% dos casos, a in ecção e a assin omá ica [Redlinge e al., 2002]. Si uação simila oi iden i icada po Chai e al. (2001), numa aldeia u al da Co eia do Sul, onde 66% da população, com mais de 50 anos, ap esen a a oocis os nas ezes, sendo que mais de me ade es a a assin omá ica. Nos países pob es, os episódios dia eicos oco em, com maio equência e du ação, em c ianças malnu idas, embo a não se saiba se a malnu ição esul a da in ecção po C yp ospo idium spp. ou se a in ecção acon ece em consequência daquela [Checkley e al., 1997; Gue an e al., 2002; Tumwine e al., 2003]. Alguns au o es demons a am que a dia eia em c ianças, du an e os dois p imei os anos de ida, em e ei o nega i o no seu c escimen o (peso e al u a), desen ol imen o cogni i o e endimen o escola [Mølbak e al., 1997; Agnew e al., 1998; Lima e al., 2000; Gue an e al., 2002]. Num es udo e ec uado numa a ela em Lima, no Pe u, Checkley e al. (1997), (1998) e i ica am que as c ianças que desen ol iam c ip ospo idiose du an e os p imei os meses de ida ap esen a am, ao im de um ano, menos 1 cm de al u a do que as que não ha iam expe imen ado dia eia po C yp ospo idium spp.. Gue an e al. (1999), ealiza am um es udo de longa du ação em c ianças, numa a ela em Fo aleza, no B asil, endo obse ado uma associação, es a is icamen e signi ica i a, en e o núme o de in ecções po C yp ospo idium spp., so idas du an e a in ância, e a diminuição da unção cogni i a e obus ez ísica, ap esen adas po essas c ianças, qua o a se e anos mais a de. Es es dé ices de desen ol imen o ísico e cogni i o, esul an es de dia eia pe sis en e, em c ianças malnu idas, em egiões pob es, não só ap esen am ele ados cus os humanos e económicos pa a es es países, como pe pe uam o ciclo da pob eza e do subdesen ol imen o [Gue an e al., 2002]. Nos países indus ializados, a in ecção é mais comum em c ianças en e o p imei o e o quin o ano de idade oco endo, ambém, em adul os, na sequência de con ac os amilia es com c ianças in ec adas, de exposição ocupacional, de iagens a zonas onde a doença é REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 37 endémica ou do con ac o com animais in ec ados. A população, em ge al, pode, ainda, se a ec ada po su os de c ip ospo idiose, após a inges ão de água ou de alimen os con aminados com oocis os [Casemo e e al., 1997; Fa hing, 2000]. Enquan o que, em países como a Aus ália e os Es ados Unidos da Amé ica, a c ip ospo idiose é uma das in ecções humanas, ansmi idas po ia híd ica, mais p e alen es, a impo ância da in ecção na Eu opa pa ece se bas an e a iá el. A maio ia dos su os de o igem híd ica documen ados no Velho Con inen e dizem espei o ao Reino Unido [F icke e C abb, 1998]. Nos Es ados Unidos da Amé ica, segundo um ela ó io do CDC, pa a o pe íodo comp eendido en e 1999 e 2002, o núme o de casos de c ip ospo idiose humana, decla ados anualmen e, oi de 2.769, 3.128, 3.787 e 3.016, espec i amen e [Hla sa e al., 2005]. Os au o es c êem, con udo, que es es alo es es ejam mui o aquém da ealidade. Os es udos disponí es sob e a p e alência da c ip ospo idiose humana na Eu opa são escassos, es ando limi ados a um pequeno núme o de países, dos quais se des aca o Reino Unido, onde es a é uma doença equen e e de decla ação ob iga ó ia, encon ando-se os casos espo ádicos e su os de in ecção po C yp ospo idium spp. bem documen ados. Na Alemanha, embo a menos equen e, a in ecção é, de igual modo, de decla ação ob iga ó ia. No quad o II, são ap esen ados os núme os o ais de casos decla ados anualmen e nes es países e, quando disponibilizada, a pe cen agem ela i a ao g upo e á io dos ze o aos qua o anos, de aco do com dados das en idades o iciais de igilância epidemiológica. QUADRO II – Núme o de casos de c ip ospo idiose decla ados anualmen e em ês países eu opeus N.º DE CASOS DE CRIPTOSPORIDIOSE (% CASOS 0-4 ANOS) PAÍS 2000 2001 2002 2003 2004 REFERÊNCIA Alemanha - 1.481 (24%) 816 (29%) 885 (29%) 935 (21%) “Fede al S a is ical O ice / S a is isches Bundesam ”, 2005 Reino Unido 5.774 3.625 2.992 5.863 (29%) 3.547 (31%) “Heal h P o ec ion Agency”, 2005a, 2005b I landa do No e 417 (54%) 360 (39%) 126 (59%) 140 (44%) 137 (53%) “Communicable Disease Su eillance Cen e”, 2005 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 38 De en e os es udos epidemiológicos ealizados na Eu opa é de e e i um abalho ecen e, e ec uado em Ba celona, en e 2000 e 2004, en ol endo 1.473 doen es imunocompe en es com dia eia, onde oi encon ada uma p e alência global de c ip ospo idiose de 2,4% (35/1.473), sendo que 68,6% (24/35) dessas in ecções o am obse adas em c ianças [González-Mo eno e al., 2004]. Num ou o es udo, ealizado na Holanda, en e 1996 e 1997, o am de ec ados oocis os nas ezes de 2,1% (18/857) dos doen es com gas en e i e, descendo esse alo pa a 0,2% (1/574) na população sem queixas gas en e ológicas [de Wi e al., 2001]. Rela i amen e à população com in ecção VIH/SIDA, um es udo mul icên ico, en ol endo 17 países eu opeus, com 6.548 doen es, conduzido en e 1979 e 1989, encon ou a pe cen agem global de in ecção po C yp ospo idium spp. de 6,6% [Pede sen e al., 1996]. Em Po ugal, a in o mação disponí el sob e a c ip ospo idiose humana é escassa. Melo C is ino e al. (1988) desc e e am um su o, o p imei o documen ado em Po ugal, que a ec ou 27% (28/103) das c ianças e uma educado a do in an á io do Hospi al de San a Ma ia, em Lisboa. Se e anos mais a de, oi desc i o um caso clínico de c ip ospo idiose disseminada num doen e com SIDA, no Hospi al de San a Ma ia [Fe ei a e al., 1995]. Em 1998, Ma os e al. publica am os esul ados de um es udo e ec uado en e 1988 e 1997 en ol endo doen es se oposi i os pa a VIH com dia eia, ambém no Hospi al de San a Ma ia, onde a p e alência da c ip ospo idiose encon ada oi de 8% (36/465). A mesma au o a, ap esen ou, qua o anos depois, um no o abalho, en ol endo se oposi i os pa a VIH de á ios hospi ais da egião de Lisboa, ab angendo o pe íodo 1999-2001, endo encon ado in ecção po C yp ospo idium spp. em 9,7% (16/165) da amos a do es udo [Ma os e al., 2002]. Nos quad os III e IV é ap esen ada uma sín ese dos esul ados de alguns es udos epidemiológicos ealizados po di e sos au o es, em á ios países, e publicados ao longo dos úl imos anos. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 39 QUADRO III – Resul ados de es udos epidemiológicos sob e a in ecção po C yp ospo idium spp. em imunocompe en es, com e sem dia eia SINTOMÁTICOS (%) ASSINTOMÁTICOS (%) REFª Adul os Eslo énia 10,3% (62/602) - Loga e al., 1996 EUA 0,6% (2/315) - Ribes e al., 2004 Ingla e a e País de Gales 1,2% (463/37.763) - PHLS s udy g oup, 1990 Suécia 1,5 (12/786) 0% (0/203) S enungsson e al., 2000 Suíça 0,2% (13/6.435) - Baumga ne e al., 2000 C ianças A ábia Saudi a (idade <5 anos) 43% (27/63) 9,5% (18/190) Al B aiken e al., 2003 Bolí ia (4 anos <idade <20 anos) - 31,6% (119/377) Es eban e al., 1998 B asil (idade <11 anos) 18,7% (83/445) - Pe ei a M.G.C. e al., 2002 Cuba (idade <8 anos) 11,5% (13/113) 0% (0/288) Núñez e al., 2003 Dinama ca (idade <5 anos) 1,2% (4/327) 0% (0/561) Olesen e al., 2005 Eslo énia (idade <15 anos) 6,9% (39/563) - Loga e al., 1996 Espanha (idade <14 anos) 2,9% (334/11.599) - Moles e al., 1998 Gana (idade <6 anos) 27,8% (63/227) 15,6% (12/77) Adjei e al., 2004 Gua emala (2 anos ≤idade <14 anos) 32% (32/100) - Laubach e al., 2004 Índia (idade <5 anos) - 2,8% (14/508) Pali e al., 2005 Ingla e a e País de Gales (idade <15 anos) 4,1% (769/18.792) - PHLS s udy g oup, 1990 I landa (idade <13 anos) 4,4% (41/935) - Co be -Feeney, 1987 México (idade <6 anos) 6,5% (26/403) - En iquez e al., 1997 Nigé ia (idade <15 anos) 15,2% (30/198) - Nwabuisi, 2001 Paquis ão (idade <5 anos) 10,3% (49/475) 3,3% (5/150) Iqbal e al., 1999 Suíça (idade <14 anos) 4,8% (15/312) - Esse s e al., 2000 Tanzânia (idade <5 anos) 8,8% (9/102) - Cegielski e al., 1999 Uganda (idade <6 anos) 25% (444/1.779) 8,5% (57/667) Tumwine e al., 2003 Zâmbia (idade <2 anos) 18,9% (17/90) - Amadi e al., 2001 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 46 9.2.2 ANIMAIS DE COMPANHIA A p imei a desc ição da in ecção po C yp ospo idium spp. em ga os e cães acon eceu, espec i amen e, no Japão, em 1979 e nos EUA, em 1983 [Iseki, 1979; Wilson e al., 1983]. Desde en ão, alguns au o es êm documen ado casos de c ip ospo idiose em canídeos e elídeos domés icos e, embo a não se encon e, ainda, bem escla ecida a impo ância da doença nes es animais, o quad o clínico pa ece se mais se e o nos mais jo ens, nos sujei os a condições de “s ess” e/ou com unção imuni á ia diminuída [Robe son e al., 2000]. Nos cães, os animais com menos de seis meses de ida são mais a ec ados do que os adul os. Nes es úl imos, a in ecção é, na maio pa e das ezes, assin omá ica, excep o quando em associação com in ecções causado as de imunossup essão, como a pa o i ose ou a esgana [Tu nwald e al., 1988; Denholm e al., 2001]. A impo ância pa a a saúde pública da c ip ospo idiose nes es animais, eside no ac o de pode em cons i ui on es de in ecção zoonó ica pa a o Homem. No Es ado do Colo ado, EUA, oi conduzida uma in es igação sob e a p e alência da c ip ospo idiose em ga os endo, pa a al, sido es udados animais com dono e animais que i iam em associações de p o ecção. Os alo es obse ados pa a as duas populações de animais o am de 3,9% (5/129) e 7,8% (6/77), espec i amen e. En e os ga os pa asi ados, 40% (2/5) dos que possuíam dono e am assin omá icos, o mesmo acon ecendo em 83% (5/6) dos que i iam em associações [Hill e al., 2000]. Num es udo semelhan e, e ec uado na cidade de Pe h, na Aus ália, Sa gen e al. (1998) encon a am uma p e alência global da c ip ospo idiose de 1,2% (2/162). Um abalho ealizado na cidade de Glasgow, na Escócia, en ol endo ga os com dono e ga os de ua, e elou p e alências de c ip ospo idiose de 5,1% (7/136) e 12,1% (12/99), espec i amen e. De odos os animais com in ecção po C yp ospo idium spp., apenas 21% (4/19) ap esen a am dia eia e, des es qua o, ês inham menos de seis meses de idade [M ambo e al., 1991]. Um ou o es udo e ec uado em Tóquio, no Japão, mos ou que 3,8% (23/608) dos ga os com dono exc e a am oocis os de C yp ospo idium spp., sendo que 74% (17/23) dos mesmos e am jo ens; no en an o, nenhum dos ga os pa asi ados ap esen a a dia eia [A ai e al., 1990]. No Hospi al Ve e iná io da Uni e sidade do Colo ado, EUA, Hacke e Lappin (2003) es uda am os cães com dono que se ap esen a am à consul a no pe íodo 1997-1998, endo obse ado que 3,8% (5/130) dos animais ap esen a a in ecção po C yp ospo idium spp.. Ainda, nos EUA, numa cidade do Es ado da Cali ó nia, uma in es igação en ol endo cães de REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 47 ua e de canis municipais e elou uma p e alência de c ip ospo idiose de 2% (4/200), sendo odos os animais pa asi ados adul os e assin omá icos [El-Ah a e al., 1991]. Na cidade de Sa agoça, em Espanha, Causapé e al. (1996) obse a am em cães de ua e com dono pe cen agens de c ip ospo idiose de 6,8% (3/44) e 8,1% (3/37), espec i amen e. Me ade dos animais in ec ados ap esen a a dia eia, mas so ia, igualmen e, de ou as pa asi oses concomi an es, nomeadamen e de isospo ose, não endo, ambém, sido excluídas associações com in ecções po ou os agen es en é icos, como í us ou bac é ias. No Japão, num es udo e ec uado em cães de ua sem dia eia, Abe e al. (2002), encon a am 9,3% (13/140) dos animais a exc e a em oocis os de C yp ospo idium spp. Os au o es, po sequenciação de DNA dos pa asi as ampli icado po PCR, iden i ica am a espécie esponsá el pela in ecção em odos os cães como sendo C. canis. 9.2.3 ANIMAIS SILVÁTICOS In ecções po C yp ospo idium spp. êm sido documen adas em inúme os animais sil á icos e, embo a alguns au o es enham suge ido que es es possam cons i ui e en uais ese a ó ios e on es de in ecção pa a o Homem e animais domés icos, desconhece-se a dimensão de al con ibuição. Nos animais adul os, a in ecção po es e p o ozoá io é, na maio pa e das ezes, assin omá ica, o núme o de oocis os exc e ados é baixo e a sua eliminação é in e mi en e, podendo, no en an o, p olonga -se po longos pe íodos [Casemo e e al., 1997; Rami ez e al., 2004]. Embo a al não enha sido demons ado, o gado que i e em libe dade, nos campos de pas o, pode, ambém, cons i ui on e de in ecção pa a os animais sil á icos, com os quais pa ilha o habi a , na medida em que mui os deles, nomeadamen e pequenos mamí e os ( oedo es e insec í o os) e Ce ídeos são suscep í eis à espécie C. pa um que é, ambém, a mais ezes encon ada no gado domés ico [Olson e al., 2004]. A p esença ubíqua de pequenos mamí e os ( oedo es e insec í o os), no meio u al, e a pa ilha do habi a com gado domés ico, em explo ações ag ícolas e pecuá ias, em le ado alguns au o es a conduzi em in es igações, no sen ido de a alia a oco ência de pa asi as do géne o C yp ospo idium nes es animais. Numa explo ação ag ícola e pecuá ia, no Reino Unido, Chalme s e al. (1997) es uda am a p e alência de C yp ospo idium spp. em ês espécies de oedo es (Mus domes icus, Apodemus syl a icus e Cle h ionomys gla eolus), endo, po análise mo omé ica dos oocis os, encon ado o alo global de 18,6% (111/595) pa a C. pa um e de 6,4% (38/595) pa a C. mu is; nenhum dos animais pa asi ados REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 48 ap esen a a sinais de dia eia. Também, no Reino Unido, Quy e al. (1999) encon a am, em ês populações de Ra us no egicus, 24% (105/438) de animais in ec ados po C. pa um. O mesmo g upo de abalho ala gou a in es igação a ou os mamí e os sil á icos, nomeadamen e, insec í o os, lagomo os, ungulados e ca ní o os, endo iden i icado, po análise mo omé ica, oocis os de C. pa um em ou iços-cachei os, musa anhos, coelhos, exugos, aposas e gamos [S u dee e al., 1999]. Numa Rese a Na u al, na Polónia, Baje e al. (2002) es uda am, en e 1997 e 1999, a p e alência de C yp ospo idium spp., em ês espécies de oedo es (Apodemus la icollis, Cle h ionomys gla eolus e Mic o us a alis), endo encon ado o alo global de 61,8% (582/942). Em Espanha, To es e al. (2000) es uda am a oco ência de C yp ospo idium spp., em cinco espécies de oedo es (Apodemus syl a icus, Apodemus la icollis, Cle h ionomys gla eolus, Mus sp e us e Ra us a us) e em duas espécies de insec í o os (C ocidu a ussula e So ex a aneus), em á ias zonas da P o íncia da Ca alunha, endo, po análise mo omé ica dos oocis os, encon ado p e alências globais de 24,9% (110/442) pa a C. pa um, de 2,9% (13/442) pa a C. mu is e de 3,6% (16/442) pa a in ecções com ambos os pa asi as. Pa a além de pequenos oedo es e insec í o os, alguns au o es êm es udado a p esença des es pa asi as nou os mamí e os, nomeadamen e Ce ídeos e Suídeos. A will e al. (1997) es uda am a oco ência de C yp ospo idium spp. em populações de ja alis, que habi a am zonas ibei inhas de lagos, lagoas, nascen es e cha cos, dispe sas po dez locais di e en es no Es ado da Cali ó nia, EUA, endo encon ado uma p e alência de 5,4% (12/221) e um isco de in ecção maio nos animais com idade in e io a oi o meses e pe encen es a populações mais nume osas. Num ou o abalho, ambém ealizado na Cali ó nia, com o objec i o de de e mina a p esença de pa asi as do géne o C yp ospo idium em gamos e eados de ida li e, oi obse ada a pe cen agem de posi i idade de 15,9% (13/82), sendo odos os animais assin omá icos [Deng e Cli e , 1999]. Ricka d e al. (1999) encon a am, em eados que ocupa am di e sas zonas nos es ados da Vi gínia e do Mississipi, EUA, p e alências de in ecção po es es pa asi as de 8,8% e 5%, espec i amen e. Num es udo e ec uado na Tapada Nacional de Ma a, em Po ugal, Lou enço e al. (2000) obse a am a p esença de oocis os de C yp ospo idium spp. em 100% (12/12) dos gamos es udados, odos com idades en e os no e meses e os qua o anos. Os es udos epidemiológicos ealizados nes es animais são escassos, sendo, mui as ezes, ela i os a pequenos g upos ca i os em ja dins zoológicos ou ese as na u ais. Num abalho e ec uado no Ja dim Zoológico de Lisboa, en ol endo 34 espécies de REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 49 uminan es a iodác ilos, o am obse ados oocis os de C yp ospo idium spp. em 2,1% (8/388) das amos as ecais es udadas [Delgado e al., 2003]. Num es udo ealizado no Ja dim Zoológico de Ba celona, Gómez e al. (1996) e (2000) encon a am oocis os de C yp ospo idium spp., em amos as ecais de di e sos animais, pe encen es a á ias espécies de he bí o os (Gi a ídeos, Bo ídeos, Ce ídeos, Camelídeos, Rinoce o ídeos e Ele an ídeos) e de p ima as (Lemu ídeos, Pongídeos, Ce copi ecídeos e Hapalídeos). A de ecção de C yp ospo idium spp. em á ias espécies de he bí o os e p ima as em ca i ei o oi, igualmen e, desc i a po ou os au o es, em países como a Polónia e os EUA [Heuschele e al., 1986; Kalishman e al., 1996; Majewska e al., 1997]. A oco ência de c ip ospo idiose, em alguns des es animais, em sido, ambém, documen ada em Rese as Na u ais, algumas das quais izinhas de zonas u ais, onde os animais sil á icos, as populações humanas e o seu gado domés ico pa ilham habi a s mui o p óximos. Na E iópia, Legesse e E ko (2004) encon a am p e alências de C yp ospo idium spp. em babuínos e macacos de 11,9% (7/59) e 29,3% (12/41), espec i amen e, enquan o que no Uganda, Nizeyi e al. (1999) encon a am em go ilas um alo de 11% (11/100). Na Tanzânia, M ambo e al. (1997) obse a am p e alências de c ip ospo idiose em zeb as, bú alos e gnus de 28% (7/25), 22% (8/36) e 27% (7/26), espec i amen e. Os es udos exis en es sob e a c ip ospo idiose nos animais sil á icos são escassos e dispe sos, con ibuindo pa a o desconhecimen o quan o ao seu papel de ese a ó io e eículo da in ecção pa a o Homem e pa a ou os animais, seja po con ac o di ec o ou a a és de con aminação ambien al. 9.3 CONTAMINAÇÃO DOS RECURSOS HÍDRICOS A p esença de oocis os de C yp ospo idium spp. na água sub e ânea, lagos, ios, es uá ios e oceanos em sido desc i a po inúme os au o es [Faye e al., 2004]. Di e sos es udos, conduzidos nos EUA, e idencia am a p esença de oocis os em ce ca de 80% da água supe icial e de 26% da água de abas ecimen o a ada, em concen ações que a ia am en e 0,001 e 484 oocis os/L, no p imei o caso, e en e 0,005 e 0,017 oocis os/L no segundo. Es udos idên icos, ealizados no Reino Unido, mos a am que 50% da água supe icial e 37% da água de abas ecimen o se encon a am con aminadas po C yp ospo idium spp. [Smi h e Rose, 1998]. Moul on-Hancock e al. (2000) desc e e am, ainda, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 50 a p esença de oocis os em 10% da água sub e ânea in es igada em 20 Es ados dos EUA, e idenciando que a il ação, pelas di e en es camadas do solo, não é su icien e pa a e i a o anspo e des es pa asi as a é aos lençóis de água que alimen am poços e on es. Apesa da maio pa e da in o mação exis en e na Eu opa dize espei o ao Reino Unido, nos úl imos anos, a comunidade cien í ica eu opeia em despe ado pa a es e p oblema e desen ol ido in es igação di e sa, a im de a alia a ex ensão da p esença de c ip ospo ídeos nos ecu sos híd icos. Na Áus ia, o am de ec ados oocis os em 10% dos ese a ó ios de água não a ada es udados, sob e udo naqueles mais p óximos das zonas de maio densidade populacional; no en an o, não o am encon ados pa asi as na água de abas ecimen o [Hassl e al., 2001]. Num es udo e ec uado na Suíça e na Alemanha o am encon ados oocis os em 30,4% dos 56 ios, iachos, lagos e lagoas examinados, con i mando a p esença equen e des es pa asi as na água supe icial daqueles dois países [Wa d e al., 2002]. Conio e al. (1999) encon a am oocis os em 21% dos ios e lagos es udados em algumas egiões de I ália, endo, no en an o, a água sub e ânea e de abas ecimen o sido nega i as pa a a p esença des es pa asi as. Ainda, em I ália, o am encon ados oocis os no Ma Ad iá ico, onde exis em mui os i ei os de mexilhões, que são, com equência, consumidos c us [Tambu ini e Pozio, 1999] e em 70% das amos as colhidas, du an e um ano, no io Tib e, em concen ações en e 0,9 e 19 oocis os/L [Bonadonna e al., 2004]. Numa in es igação ealizada na No uega, Robe son e Gje de (2001a) analisa am a água de lagos e de ios, em á ias egiões do País, endo de ec ado pa asi as do géne o C yp ospo idium em 24,5% dos locais es udados, embo a em baixas concen ações (o alo máximo encon ado oi de 3,75 oocis os/10 L). Es es au o es obse a am, ainda, a associação en e a p esença de oocis os na água e a exis ência de gado bo ino e o ino nas p oximidades dos locais de amos agem. Os e luen es de esgo os, de o igem humana, não a ados ou a ados inadequadamen e, as desca gas de explo ações pecuá ias e a esco ência de solos es umados com dejec os animais, são, em ge al, conside ados como as p incipais on es de con aminação dos ecu sos híd icos po c ip ospo ídeos [Meinha d e al., 1996]. Pa a além disso, uma ez que a in ecção po C. pa um, uma das p incipais espécies causado as da c ip ospo idiose humana, é, ambém, causa de in ecção em animais sil á icos, como pequenos mamí e os e Ce ídeos, es es podem cons i ui on es de dispe são ambien al de oocis os e de con aminação dos cu sos de água [S u dee e al., 1999; Lou enço e al., 2000]. A ex ensão da con aminação da água supe icial é, ainda, dependen e de ac o es geog á icos, como a opog a ia dos e enos e climá icos, como REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 51 chu as o es, enxu adas, inundações e degelos [Meinha d e al., 1996; Rose e al., 2002; Faye , 2004; Joachim, 2004]. Também as a es aquá icas podem e um papel impo an e na con aminação da água supe icial, com oocis os. Pa a al con ibuem, po um lado, o ac o des as a es se em e ac á ias à in ecção po C. pa um, pe manecendo os oocis os iá eis e in ecciosos após a passagem pelo seu ac o in es inal e, po ou o, os seus hábi os de, du an e as mig ações de Ou ono e P ima e a, se alimen a em em pas os e campos de cul i o, á eas onde podem exis i oocis os iá eis, e de de eca em no meio aquá ico [G aczyk e al., 1997]. Po im, impo a salien a que, apesa dos pa asi as do géne o C yp ospo idium se em ubíquos no ambien e aquá ico, o isco dessa p esença pa a a saúde pública pe manece uma incógni a, na medida em que: i) na maio ia dos es udos desc i os, a iden i icação da espécie e/ou genó ipo dos oocis os encon ados não é de e minada, desconhecendo-se a sua capacidade de causa in ecção no Homem; ii) a p esença de oocis os na água só cons i ui isco de in ecção humana, se es es se encon a em iá eis, o que nem semp e em sido de e minado; iii) mui as ezes, o núme o de oocis os encon ado é baixo, igno ando-se se é ou não su icien e pa a causa in ecção humana, o que depende, não só da i ulência da espécie/genó ipo em ques ão, como do es ado imunológico do hospedei o [Cen e s o Disease Con ol and P e en ion, 1995; Joachim, 2004]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 52 10. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA CRIPTOSPORIDIOSE A epidemiologia molecula é, ac ualmen e, conside ada como um amo da epidemiologia que, a a és de écnicas de biologia molecula , p opo ciona um melho conhecimen o das doenças, não só ao ní el da ca ac e ização dos agen es que es ão na sua o igem, mas, ambém, em e mos da sua ecologia e dinâmica da ansmissão [Thompson e al., 1998]. An es da u ilização des as no as écnicas, a ca ac e ização dos mic o ganismos do géne o C yp ospo idium e a esul an e de obse ações mic oscópicas da mo ologia dos oocis os e/ou o mas de desen ol imen o endógeno, da cons a ação do hospedei o em que e am encon ados e de es udos de in ecção expe imen al. Es as obse ações pe mi i am a iden i icação de inúme as espécies de C yp ospo idium, o que o iginou g ande con usão e con o é sia axonómicas [O’Donoghue, 1995]. Po ém, os conhecimen os disponí eis sob e es es pa asi as so e am um p og esso signi ica i o, após a aplicação das écnicas de biologia molecula , sob e udo as baseadas na eacção de PCR, ao es udo da sua epidemiologia. Es a me odologia em-se e elado bas an e p omisso a, espe ando-se que possa aze algum escla ecimen o a ques ões impo an es como: i) a a iabilidade en e os pa asi as do géne o C yp ospo idium; ii) a es u u a populacional e a axonomia des e géne o; iii) a de inição dos pa asi as capazes de causa in ecção humana; i ) a iden i icação das on es de con aminação e de in ecção pa a o Homem; ) a ca ac e ização da dinâmica da ansmissão da in ecção em di e en es comunidades e si uações; i) a impo ância, pa a a saúde pública, da p esença de oocis os em água de consumo e de ec eio; ii) a pa ogenicidade e i ulência ap esen adas pelas di e en es espécies/genó ipos que p o ocam doença humana [Moo e e al., 2003; Thompson, 2003]. 10.1 IDENTIFICAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DO GÉNERO CRYPTOSPORIDIUM Os p imei os es udos sob e a di e sidade en e es es pa asi as da am con a da a iabilidade eno ípica encon ada en e isolados de C. pa um de humanos e de gado domés ico (bo ino, o ino e cap ino). Es a a iabilidade oi demons ada a a és da écnica de “Wes e n blo ing”, com u ilização de an ico pos monoclonais e policlonais, pa a análise da composição an igénica dos oocis os [Nichols e al., 1991; Nina e al., 1992] e da ca ac e ização REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 53 isoenzimá ica [Ogunkolade e al., 1993; Awad-el-Ka iem e al., 1995]. Em odos es es abalhos oi obse ado um dimo ismo en e os isolados de C. pa um de o igem humana e os de o igem animal. No en an o, es as écnicas ap esen a am a des an agem de necessi a em de um núme o conside á el de oocis os, o que, po ezes, e a di ícil de ob e . A eme gência das ecnologias baseadas na eacção de PCR pe mi iu ul apassa o p oblema da escassez de oocis os ob idos a pa i de amos as biológicas, o nando, assim, possí el o es udo da epidemiologia molecula des es pa asi as [Faye e al., 2000]. Em 1995, Mo gan e al., a a és da écnica de ampli icação de polimo ismos de dis ibuição alea ó ia ou RAPD (ac ónimo anglo-saxónico pa a “ andom ampli ied polymo phic DNA”), obse a am que isolados de C. pa um, de o igem humana e bo ina, se di idiam em dois g upos, um con endo a maio ia dos isolados humanos e ou o ab angendo odos os isolados bo inos e es an es isolados humanos. Mui os ou os au o es desen ol e am in es igações semelhan es, u ilizando as écnicas de PCR, RFLP e sequenciação aplicadas à ca ac e ização gené ica de isolados de C. pa um de humanos e de ou os animais (p incipalmen e gado domés ico), em egiões geog á icas di e sas. Es es es udos incidi am, essencialmen e, sob e os genes que codi icam a p o eína da pa ede do oocis o de C yp ospo idium ou COWP (ac ónimo anglo-saxónico pa a “C yp ospo idium oocys wall p o ein”), a p o eína de adesão elacionada com a ombospondina de C yp ospo idium-1 ou TRAP-C1 (ac ónimo anglo-saxónico pa a “ h ombospondin- ela ed adhesi e p o ein o C yp ospo idium 1”), a p o eína de adesão elacionada com a ombospondina de C yp ospo idium-2 ou TRAP-C2 (ac ónimo anglo-saxónico pa a “ h ombospondin- ela ed adhesi e p o ein o C yp ospo idium 2”), a dihid o ola o educ ase ou DHFR (sigla anglo- saxónica pa a “dihyd o ola e educ ase”), a β- ubulina, a p o eína de choque é mico de 70- kDa ou HSP70 (sigla anglo-saxónica pa a “hea shock p o ein 70-kDa”), a sin e ase da ace il- coenzima A, a subunidade pequena do RNA (SSU- RNA), as egiões dos espaçado es in e nos ansc i os ou ITS (sigla anglo-saxónica pa a “in e nally ansc ibed space s”) do RNA e algumas egiões genómicas não codi ican es. Os esul ados de odas es as in es igações con i ma am a exis ência de dois genó ipos de C. pa um, dis in os e amplamen e conse ados, o genó ipo humano, encon ado em isolados de o igem humana e o genó ipo bo ino, p esen e, que em isolados de gado domés ico, que em isolados humanos [Bonnin e al., 1996; Peng e al., 1997; Spano e al., 1997b; Gibbons e al., 1998; Mo gan e al., 1998a; Pa el e al., 1998; Spano e al., 1998a, 1998b; Sulaiman e al., 1998; Cacciò e al., 1999; Mo gan e al., 1999b; Xiao e al., 1999a, 1999c; Al es e al., 2001a, 2001b]. Pa a além das di e enças gené icas exis en es, en e REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 54 es es dois genó ipos de C. pa um, es udos de in ecção expe imen al mos a am que os isolados com o genó ipo bo ino inham a capacidade de p oduzi in ecção em a inhos e em i elos, o mesmo não acon ecendo com aqueles que exibiam o genó ipo humano [Peng e al., 1997]. Es es abalhos mos a am, assim, a exis ência de duas populações de C. pa um dis in as, com di e en es especi icidades de hospedei o e en ol idas em di e en es ciclos de ansmissão: a população cons i uída pelos isolados com o genó ipo bo ino, abundan e e conse ada en e o gado domés ico, que se encon a a en ol ida na ansmissão zoonó ica e a população dos isolados com o genó ipo humano, en ol ida num ciclo de ansmissão an oponó ico oco endo, exclusi amen e, en e humanos [Peng e al., 1997; Pa el e al., 1998]. A es es es udos, segui am-se inúme as in es igações, ealizadas com o objec i o de iden i ica e ca ac e iza a di e sidade gené ica exis en e en e os isolados de C yp ospo idium spp. encon ados em di e sos hospedei os animais, nomeadamen e ou os animais domés icos, animais de companhia e animais sil á icos, de á ias egiões geog á icas. A sequenciação, en e ou os, dos genes que codi icam a SSU- RNA e as p o eínas COWP, HSP70 e ac ina, o alinhamen o e a análise ilogené ica, pa a cada gene, das sequências nucleo ídicas ob idas pa a os di e sos isolados ca ac e izados, e idenciou a exis ência de sequências únicas, que ap esen a am di e enças signi ica i as en e si. Es es esul ados mos a am que C. pa um não e a uma espécie uni o me, mas sim cons i uída po á ios genó ipos dis in os, aos quais oi dado o nome do hospedei o onde os isolados ha iam sido iden i icados. Assim, pa a além do genó ipo bo ino, encon ado em bo inos, cap inos, o inos, suínos, oedo es, Ce ídeos e ou os mamí e os, o am iden i icados inúme os genó ipos de C. pa um, adap ados ao hospedei o, ais como os genó ipos bo ino B, po co I, po co II, , coelho, a o, ma supial I, ma supial II, u ão, cão, esquilo, gamo, ce o, macaco, u so, aposa, pa o, ganso, en ilhão, laga o e dois genó ipos de C. mu is, en e ou os. A análise ilogené ica cons i uiu, ainda, e idência adicional da alidade das espécies C. elis, C. mu is, C. baileyi, C. se pen is, C. w ai i, C. meleag idis e C. sau ophilum [Mo gan e al., 1998b, 1999a, 1999d, 1999e; Xiao e al., 1999a, 1999c; Mo gan e al., 2000b; Sulaiman e al., 2000; A will e al., 2001; G aczyk e al., 2001; Mo gan e al., 2001; Pe z e Le Blancq, 2001; Sulaiman e al., 2002; Xiao e al., 2002b; Abe e Iseki, 2003; Ryan e al., 2003b; Sil a e al., 2003; Powe e al., 2004; Xiao e al., 2004b; Zhou e al., 2004]. Na igu a 6, encon a-se ep esen ada uma á o e ilogené ica, cons uída pa a á ias espécies e genó ipos de C yp ospo idium, po compa ação das espec i as sequências do gene que codi ica a SSU- RNA, onde podem obse a -se dois g upos mono ilé icos, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 55 co esponden es aos seus b aços p incipais, um cons i uído pelos pa asi as in es inais e a espécie espi a ó ia C. baileyi e ou o con endo os pa asi as gás icos. FIGURA 6 – Relação ilogené ica en e espécies e genó ipos, pe encen es ao géne o C yp ospo idium, in e ida pela análise de sequências do gene SSU- RNA, a a és do mé odo “neighbo joining”, endo po base dis âncias gené icas calculadas pelo modelo de dois pa âme os de Kimu a. Os núme os sob e os amos indicam os alo es de con iança, de e minados po análise de “boo s ap” com 1.000 éplicas [Xiao e al., 2004a] A ex ensão da dis ância gené ica, exis en e en e alguns dos no os genó ipos, le ou alguns au o es a suge i que pudessem a a -se de espécies de C yp ospo idium dis in as. No en an o, pa a que no as espécies pudessem se desc i as, oi necessá io co elaciona as di e enças gené icas, com ou as ca ac e ís icas biológicas, como a especi icidade de hospedei o, o local de in ecção, a pa ogenicidade e a i ulência [Mo gan e al., 1999e; Xiao e al., 1999c]. Foi o que acon eceu, po exemplo, com C. ande soni. Oocis os semelhan es a C. mu is, In es inaisGás icos 0.02 subs i uições de nucleó ido/posição Eime ia enella AF026388 C. sau ophilum C. elis C. meleag idis Genó ipo a a uga Genó ipo esquilo Genó ipo a o-almisca ei o I C. suis Genó ipo po co II Genó ipo u so Genó ipo ma supial II Genó ipo ca alo Genó ipo a o C. canis genó ipo coio e Genó ipo galinhola C. bo is Genó ipo coelho Genó ipo ce o Genó ipo pa o C. pa um Genó ipo oi ão ame icano C. w ai i Genó ipo u ão Genó ipo gambá I Genó ipo ma supial I Genó ipo macaco C. hominis Genó ipo aposa Genó ipo a o-almisca ei o II Genó ipo gamo- a o Genó ipo gambá II C. canis genó ipo cão C. canis genó ipo aposa Genó ipo ganso I Genó ipo ganso II Genó ipo gamo Genó ipo semelhan e ao do gamo Genó ipo cob a C. baileyi C. se pen is Genó ipo laga o C. ande soni C. mu is C. galli genó ipo en ilhão C. galli 100 99 98 96 93 77 60 98 92 83 89 99 70 70 92 98 81 78 95 100 In es inaisGás icos 0.02 subs i uições de nucleó ido/posição Eime ia enella AF026388 C. sau ophilum C. elis C. meleag idis Genó ipo a a uga Genó ipo esquilo Genó ipo a o-almisca ei o I C. suis Genó ipo po co II Genó ipo u so Genó ipo ma supial II Genó ipo ca alo Genó ipo a o C. canis genó ipo coio e Genó ipo galinhola C. bo is Genó ipo coelho Genó ipo ce o Genó ipo pa o C. pa um Genó ipo oi ão ame icano C. w ai i Genó ipo u ão Genó ipo gambá I Genó ipo ma supial I Genó ipo macaco C. hominis Genó ipo aposa Genó ipo a o-almisca ei o II Genó ipo gamo- a o Genó ipo gambá II C. canis genó ipo cão C. canis genó ipo aposa Genó ipo ganso I Genó ipo ganso II Genó ipo gamo Genó ipo semelhan e ao do gamo Genó ipo cob a C. baileyi C. se pen is Genó ipo laga o C. ande soni C. mu is C. galli genó ipo en ilhão C. galli 100 99 98 96 93 77 60 98 92 83 89 99 70 70 92 98 81 78 95 100 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 62 FIGURA 7 – Rep esen ação esquemá ica dos ciclos de ansmissão e ese a ó ios de in ecção das espécies e genó ipos de C yp ospo idium, associados à c ip ospo idiose humana [adap ado de Thompson, 2003] 10.3 ESPÉCIES E GENÓTIPOS ENCONTRADOS EM OUTROS HOSPEDEIROS VERTEBRADOS A p esença de mic o ganismos do géne o C yp ospo idium, em á ios hospedei os e eb ados, em sido desc i a po inúme os au o es. Na maio ia dos casos, a iden i icação dos pa asi as em sido e ec uada, unicamen e, po obse ação mic oscópica da mo ologia dos oocis os e, os isolados encon ados, êm sido designados como C. pa um ou C yp ospo idium spp.. Uma ez que, só ecen emen e, as me odologias de biologia molecula o am aplicadas ao es udo des es pa asi as, desconhece-se quan os deles co espondem a espécies ou genó ipos já iden i icados [Faye , 2004]. C. pa um C. pa umi C. hominisi C. meleag idis . C. canis C. elis C. mu is Genó ipo ce o Ou as espécies Ou os g enó i p os ? ? + ou os animais C. suisii REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 63 O núme o de animais dis in os, pe encen es ao g upo dos mamí e os, onde, a é à da a, o am encon ados pa asi as de C yp ospo idium spp. ascende a 155 [Faye , 2004]. Resul ados de in es igações ecen es e idencia am a exis ência de eno me di e sidade biológica e gené ica en e as espécies de C yp ospo idium que in ec am es es animais. As espécies de C yp ospo idium que êm como hospedei os p incipais animais pe encen es ao g upo dos mamí e os são: C. pa um, C. hominis, C. mu is, C. ande soni, C. bo is, C. suis, C. canis, C. elis e C. w ai i. Pa a além des as oi o espécies o am, ainda, iden i icados dois genó ipos de C. canis (genó ipos aposa e coio e) e di e sos genó ipos de C yp ospo idium spp. adap ados ao hospedei o [Xiao e al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. Apesa de a c ip ospo idiose e sido desc i a em mais de 30 espécies di e en es de a es, apenas se conhecem ês espécies de C yp ospo idium esponsá eis po essas in ecções: C. meleag idis, C. baileyi e C. galli. Todas elas êm a capacidade de in ec a um g ande núme o de a es, di e gindo, no en an o, quan o ao local de in ecção ( e quad o I). Também en e os isolados de C yp ospo idium spp., encon ados em a es, o am iden i icados genó ipos adap ados ao hospedei o, nomeadamen e qua o genó ipos ganso, um genó ipo pa o e um genó ipo galinhola [Xiao e al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. En e os e eb ados, os ép eis e, sob e udo as cob as, são os animais em que a c ip ospo idiose se mani es a de uma o ma mais se e a, sendo causa de ele ada mo alidade. Apesa de á ios au o es e em documen ado p e alências ele adas des a in ecção, p incipalmen e nos ép eis em ca i ei o, poucos êm e ec uado a ca ac e ização desses pa asi as. As duas espécies, ac ualmen e, conhecidas, como causa de in ecção em ép eis são C. se pen is e C. sau ophilum. Dos genó ipos adap ados ao hospedei o encon ados nos ép eis azem pa e dois genó ipos cob a, um genó ipo laga o e um genó ipo a a uga [Xiao e al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. Nos peixes, é conside ada álida a espécie C. molna i. No en an o, a de inição des a espécie, po Al a ez-Pelli e o e Si jà-Bobadilla (2002), oi ei a, unicamen e, com base em ca ac e ís icas ul a-es u u ais e his opa ológicas, não endo sido e ec uada a ca ac e ização gené ica dos pa asi as. Recen emen e, o mesmo g upo de abalho desc e eu uma no a espécie, C. scoph halmi, no epi élio in es inal de p egados (Scoph halmi maximus L.) de aquacul u a [Al a ez-Pelli e o e al., 2004]. Também nes e caso, a ca ac e ização da espécie oi baseada, exclusi amen e, em obse ações ul aes u u ais e his opa ológicas. A ausência de uma iden idade gené ica, pa a es as espécies, pode i a cons i ui um p oblema no u u o, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 64 quando o em iden i icados em peixes ou o(s) pa asi a(s), que possa(m) i a se desc i o(s) como no a(s) espécie(s) [Xiao e al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. A é há pouco empo conside a a-se que, somen e, duas espécies e am esponsá eis pela c ip ospo idiose em gado bo ino: C. pa um e C. ande soni. Enquan o que a p imei a in ec a o in es ino e p o oca dia eia aguda, em animais não desmamados, a segunda in ec a o abomaso, em animais jo ens e adul os, não o iginando sin oma ologia gas in es inal, p o ocando, apenas, diminuição da p odução de lei e [Olson e al., 2004]. Recen emen e, o am iden i icados dois no os genó ipos, em gado bo ino, aos quais oi dado o nome de C yp ospo idium genó ipo bo ino B (pos e io men e desc i o como no a espécie – C. bo is) e C yp ospo idium genó ipo semelhan e ao do gamo (do inglês, “dee -like geno ype”) [Xiao e al., 2002b; San ín e al., 2004; Faye e al., 2005]. San ín e al. (2004), es uda am 971 i elos, pe encen es a 15 explo ações pecuá ias, localizadas em se e Es ados No e Ame icanos, endo obse ado in ecção po C. pa um em 100% dos animais a é às duas semanas de ida e en e 60% a 90% dos i elos a é aos dois meses. A pa i das duas semanas de ida já obse a am, em alguns animais, a in ecção po C. bo is e po C yp ospo idium genó ipo semelhan e ao do gamo. Nos animais que já ha iam sido desmamados (idade supe io a ês meses) não oi obse ada in ecção po C. pa um, endo, somen e, sido encon ados C. ande soni, C. bo is e C yp ospo idium genó ipo semelhan e ao do gamo. Uma ez que, das qua o espécies/genó ipos encon ados em gado bo ino, apenas C. pa um é conhecida como causa de in ecção humana, só a a és da ca ac e ização gené ica dos isolados implicados na c ip ospo idiose bo ina se pode á a alia o seu po encial zoonó ico e de e mina o isco de ansmissão ao Homem [San ín e al., 2004]. Em e mos epidemiológicos, a ca ac e ís ica de adap abilidade ao hospedei o, exibida pela maio ia das espécies e genó ipos de C yp ospo idium, pode signi ica que g ande pa e des es pa asi as não em ele ado po encial in ec an e pa a o Homem. De ac o, a maio ia das espécies e genó ipos, encon adas em ép eis e em mui os ou os animais sil á icos, ap esen am um g upo es i o de hospedei os onde causam in ecção, nunca endo sido encon ados em humanos. Recen emen e, com o p opósi o de a alia o isco pa a a saúde pública da con aminação do meio aquá ico com oocis os de C yp ospo idium spp., oi ealizado, nos EUA, um es udo en ol endo cinco espécies de mamí e os que habi am e enos adjacen es a zonas lu iais ( aposa, cas o , lon a, a o almisca ei o e guaxinim). A ca ac e ização molecula , dos oocis os encon ados nesses hospedei os, pe mi iu iden i ica C. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 65 canis, C. canis genó ipo aposa e mais ês genó ipos de C yp ospo idium spp. adap ados ao hospedei o que, a é à da a, não o am encon ados em humanos, nem em gado domés ico. Os au o es concluí am, assim, que as espécies e genó ipos de C yp ospo idium adap ados ao hospedei o exc e adas po es es animais, não cons i uem isco ele ado pa a a saúde pública [Zhou e al., 2004]. No en an o, a adap abilidade ao hospedei o não é sinónimo de es i a especi icidade, sendo equen e encon a -se uma de e minada espécie ou genó ipo de C yp ospo idium spp. em mais do que um hospedei o. Exemplos disso, são os casos de c ip ospo idiose humana, de idos à in ecção pelas espécies zoonó icas C. pa um, C. meleag idis, C. elis, C. canis, C. suis, C. mu is e C yp ospo idium genó ipo ce o. Excep uando C. pa um e C. meleag idis, encon ados, com mais equência, em in ecções humanas e que in ec am um la go núme o de hospedei os dis in os, as es an es espécies in ec am um núme o limi ado de hospedei os e, a é à da a, o am associadas a um pequeno núme o de casos humanos, a maio ia deles em c ianças e em in ec ados po VIH. Se, po um lado, é possí el especula sob e a maio suscep ibilidade dessas pessoas àqueles pa asi as não se pode, po ou o, exclui a possibilidade dos animais domés icos, de companhia e sil á icos, cons i uí em po enciais ese a ó ios de in ecção pa a o Homem. Toda ia, o papel des es animais na ansmissão das di e en es espécies e genó ipos de C yp ospo idium ao Homem é, ainda, desconhecido, em esul ado da ausência de es udos epidemiológicos que pe mi am conhece a sua p e alência naqueles animais. Des e modo, é necessá io que a comunidade cien í ica e as au o idades de saúde pública es ejam a en as, na medida em que algumas das espécies e genó ipos pouco p e alen es ou, ainda, não encon adas no Homem, podem eme gi como no os pa asi as humanos, se su gi em condições socioeconómicas e ambien ais que a o eçam a sua ansmissão [Xiao e al., 2002b, 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. 10.4 IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES E DE GENÓTIPOS ENCONTRADOS NA ÁGUA Os mé odos con encionais, pa a de ecção da p esença de oocis os na água, baseiam-se no mé odo 1622, ecomendado pela “Uni ed S a es En i onmen al P o ec ion Agency”, que consis e num p ocesso de concen ação po il ação, isolamen o dos oocis os po sepa ação imunomagné ica e sua de ecção po uma écnica de imuno luo escência [Ca ey e al., 2004]. Con udo, es e p ocedimen o não pe mi e a iden i icação das espécies e genó ipos dos oocis os encon ados, in alidando, assim, a a aliação do isco que cons i ui, pa a a saúde pública, a sua REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 66 p esença nos ecu sos híd icos. Embo a seja equen e a con aminação de cu sos e ese a ó ios de água, com oocis os de C yp ospo idium spp., é na u al que nem odos pe ençam a espécies esponsá eis pela in ecção humana, dado que as on es de con aminação podem se mui o di e sas [Xiao e al., 2004a]. A possibilidade de aplica as écnicas de biologia molecula à ca ac e ização gené ica e à iden i icação dos isolados encon ados em amos as de água eio pe mi i iden i ica o seu po encial in ec an e pa a o Homem e ul apassa as limi ações associadas à u ilização dos mé odos con encionais. Xiao e al. (2000a) analisa am 29 amos as de água de empes ade, ecolhidas numa zona de lo es a no Es ado de No a Io que, endo iden i icado a espécie C. baileyi e 11 genó ipos di e en es de C yp ospo idium spp., odos eles adap ados a hospedei os sil á icos e nunca encon ados em humanos. O mesmo g upo de abalho analisou, ainda, água supe icial não a ada, ecolhida em no e Es ados No e Ame icanos, endo iden i icado a p esença das espécies C. pa um, C. hominis, C. ande soni e C. baileyi, odas elas encon adas, com equência no Homem ou em gado domés ico, suge indo se em es as as p incipais on es de con aminação [Xiao e al., 2001b]. No Japão, es udos e ec uados em amos as de água, ecolhidas em á ios ios, iden i ica am a p esença das espécies C. pa um e C. meleag idis, le ando os au o es a suge i a e en ual con aminação com o igem em gado domés ico [Ka asudani e al., 2001; Ono, e al., 2001]. Na Eu opa, mais conc e amen e na Suíça e na Alemanha, em amos as de água supe icial e de e luen es de es ações de a amen o de águas esiduais, o am encon ados oocis os de C. hominis, C. pa um, C. ande soni, C. mu is, C. baileyi e ês genó ipos sil á icos não iden i icados, sendo as p imei as qua o espécies as mais p e alen es. Duas delas – C. pa um e C. hominis – são as esponsá eis pela maio ia dos casos de c ip ospo idiose humana de endo, a sua p esença na água, cons i ui um ale a pa a as en idades de saúde pública. En e as possí eis on es de con aminação daqueles ecu sos híd icos, os au o es enume am o gado bo ino, abundan e naqueles países, e luen es de o igem humana, pequenos oedo es, a es aquá icas e ou os animais sil á icos [Wa d e al., 2002]. Na I landa do No e, Lowe y e al. (2001) analisa am di e sas amos as de água supe icial a ada e não a ada, endo iden i icado C. pa um como a única espécie de C yp ospo idium p esen e nas amos as es udadas. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 67 A p esença de C. ande soni, C. bayleyi, C. mu is e di e sos genó ipos sil á icos na água, indica a p o á el con aminação po gado domés ico e po alguns animais sil á icos. Po ém, é impo an e salien a que a iden i icação de C. pa um na água não pe mi e uma associação ão linea ao ese a ó io zoonó ico, dada a possibilidade da sua con aminação e ido o igem humana [Xiao e al., 2004a]. Os casos aqui desc i os con i mam a di e sidade de espécies e genó ipos de C yp ospo idium, p esen es nos cu sos e ese a ó ios de água. Sendo que apenas pa e des es pa asi as é esponsá el pela in ecção humana, a a aliação do isco pa a a saúde pública, que cons i ui a sua p esença nos ecu sos híd icos, só pode á se de e minada com o auxílio de écnicas de biologia molecula , pa a iden i icação do seu po encial in ec an e pa a o Homem. Toda ia, é undamen al salien a que a a aliação do isco pa a a saúde pública só se comple a após a de e minação da iabilidade e in ecciosidade dos oocis os encon ados [Cen e s o Disease Con ol and P e en ion, 1995; Joachim, 2004]. 10.5 VARIAÇÃO INTRA-ESPECÍFICA EM C. PARVUM E C. HOMINIS Recen emen e, a ca ac e ização de á ios loci gené icos, em isolados de C. hominis e C. pa um e idenciou a exis ência de polimo ismos in a-especí icos, que pe mi iam a iden i icação de á ios alelos e sub ipos den o de cada uma das espécies [Aiello e al., 1999; Feng e al., 2000; S ong e al., 2000; Cacciò e al., 2001]. O econhecimen o des a he e ogeneidade in a-especí ica possibili ou o desen ol imen o de mé odos que pe mi em a ingi maio esolução da a iabilidade gené ica exis en e em isolados de C. hominis e de C. pa um. Os mic ossa éli es, ambém chamados epe ições cu as alea ó ias ou STR’S (sigla anglo- saxónica pa a “sho andem epea s”), são pequenas unidades de DNA não codi ican e, cons i uídas po dois a se e nucleó idos, que se epe em sucessi amen e e se encon am, amplamen e, dis ibuídas no genoma de á ios o ganismos euca io as. O núme o de ezes que essas unidades se encon am epe idas é mui o polimó ico, pe mi indo a dis inção de á ios alelos, em unção do núme o de epe ições exis en es [Webe e May, 1989]. A análise de STR’S em sido u ilizada, po alguns au o es, pa a a alia a a iabilidade in a-especí ica exis en e em C. hominis e em C. pa um. Cacciò e al. (2000), a a és da análise de um locus de mic ossa éli es, em á ios isolados humanos e bo inos, o iundos da I ália, da Holanda, do Japão e dos EUA, obse a am a exis ência de dois alelos dis in os em C. hominis e qua o em REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 68 C. pa um. Num ou o locus, os mesmos au o es obse a am, ainda, a exis ência de se e alelos dis in os en e os isolados de C. pa um de o igem humana e bo ina, de á ias egiões de I ália. Um des es alelos oi iden i icado, somen e, em isolados humanos, acon ecendo o con á io com ou os dois alelos, encon ados, exclusi amen e, em isolados bo inos [Cacciò e al., 2001]. Feng e al. (2000) iden i ica am no genoma de C. hominis e C. pa um 14 loci de STR’S, endo a aliado a sua u ilidade na ca ac e ização in a-especí ica dos pa asi as daquelas espécies. Enquan o que alguns des es loci se e ela am mui o polimó icos, com os isolados de ambas as espécies a exibi em á ios alelos di e en es, ou os ap esen a am uma esolução mais limi ada, não pe mi indo obse a a iação gené ica, em uma ou ambas as espécies. Na Dinama ca, Enema k e al. (2002a) u iliza am o STR desc i o po Cacciò e al. (2000), pa a a ca ac e ização de C. hominis e C. pa um de o igem humana e bo ina, endo encon ado, nos isolados de C. hominis, um dos dois alelos iden i icados, inicialmen e, po Cacciò e colabo ado es e, nos pa asi as de C. pa um, ês dos qua o alelos desc i os, ambém, po es es au o es. Mallon e al. (2003a) analisa am, em 180 isolados humanos e bo inos de C. pa um e C. hominis, da egião de Abe deenshi e, na Escócia, se e loci de mic ossa éli es. O núme o de alelos obse ados, pa a as duas espécies, nos se e ma cado es, a iou en e o mínimo de ês e o máximo de 13. A combinação do alelo exibido po cada isolado pa a cada um dos se e loci pe mi iu iden i ica 37 haplo ipos dis in os, se e co esponden es à espécie C. hominis e os es an es 30 a C. pa um. A cons ução de um dendog ama de semelhança pa a os di e en es haplo ipos jun ou odos os isolados de C. hominis no mesmo g upo, embo a sendo e iden e a sua sepa ação em dois subg upos dis in os. Os isolados de C. pa um o am dis ibuídos po cinco g upos di e en es, con endo, dois deles, unicamen e isolados de o igem humana e os es an es ês, isolados de ambos os hospedei os. O gene GP60 ( ambém denominado gp15/45/60) codi ica uma glicop o eína p ecu so a de 60-kDa que, após cli agem, dá o igem às glicop o eínas de supe ície gp45 e gp15, en ol idas na ligação e na in asão dos en e óci os pelos espo ozoí os. A sequenciação do gene GP60, em isolados de humanos e de bo inos de di e en es egiões geog á icas, e elou que es e locus ap esen a ele ada a iabilidade gené ica, exibindo á ios polimo ismos, p incipalmen e en e os isolados de C. hominis [S ong e al., 2000]. Es es au o es encon a am qua o sub ipos di e en es, en e os isolados des a espécie, não endo obse ado a iação em C. pa um. Vá ias ou as in es igações se segui am en ol endo a sequenciação do gene GP60 em isolados humanos e bo inos, de países como o Malawi, o Quénia, a Gua emala, o Kuwai , REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 69 a Á ica do Sul, Po ugal, a I landa do No e, a Aus ália e os EUA, endo mos ado a exis ência de inúme os polimo ismos an o em C. pa um como em C. hominis. Ac ualmen e, encon am-se iden i icadas 11 amílias de sub ipos, cinco em C. hominis e seis em C. pa um comp eendendo, cada uma, á ios sub ipos dis in os. A maio ia das amílias desc i as ap esen a ampla dis ibuição geog á ica, sendo encon ada em isolados de egiões mui o di e en es. Do mesmo modo, numa de e minada egião geog á ica, em sido obse ada a p esença de á ias amílias di e en es. Somen e um pequeno núme o de amílias de sub ipos ap esen a dis ibuição geog á ica limi ada, sendo es as encon adas, apenas, em isolados de egiões geog á icas es i as [Peng e al., 2001; Sulaiman e al., 2001; Glabe man e al., 2002; Lea e al., 2002; Al es e al., 2003b; Peng e al., 2003a, 2003b; Sulaiman e al., 2005]. A ele ada esolução ob ida a a és da ca ac e ização do gene GP60, em isolados de C. hominis e de C. pa um, ap esen a eno me po encial, não só pa a a iden i icação de on es de in ecção, em si uações de su o, cons i uindo in o mação aliosa pa a a implemen ação de medidas de con olo da ansmissão, mas, ambém, pa a a ca ac e ização da dinâmica da ansmissão da c ip ospo idiose, em zonas endémicas [Feng e al., 2000; Mallon e al., 2003a; Xiao e Ryan, 2004]. A in es igação ealizada, ao longo dos úl imos anos, no âmbi o da epidemiologia molecula da c ip ospo idiose, ouxe alguns p og essos impo an es no que diz espei o ao conhecimen o da di e sidade de mic o ganismos que cons i uem o géne o C yp ospo idium, do signi icado pa a a saúde pública de alguns desses pa asi as e da exis ência de á ios ciclos de ansmissão dis in os que en ol em o Homem. Con udo, mui as ques ões con inuam, ainda, em abe o, nomeadamen e no que se e e e à impo ância das espécies zoonó icas pa a a saúde pública, à dinâmica da ansmissão da c ip ospo idiose em di e en es comunidades, ao signi icado da a iação geog á ica da dis ibuição dos casos humanos, de idos a C. hominis e a C. pa um, na ansmissão da doença e, ainda, à co elação en e as ca ac e ís icas gené icas dos pa asi as com a sua i ulência e pa ogenicidade. O conhecimen o ap o undado de odas es as ques ões possibili a á, num u u o que espe amos p óximo, desen ol e es a égias de p e enção e de con olo adequadas, capazes de queb a os ciclos de ansmissão da c ip ospo idiose humana [Thompson, 2003; Xiao e Ryan, 2004]. 70 - Segunda Pa e - CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA CRIPTOSPORIDIOSE EM PORTUGAL 71 Capí ulo I OBJECTIVOS QUADRO VIII – Mamí e os do Ja dim Zoológico de Lisboa cujas ezes o am subme idas a écnicas pa asi ológicas, pa a iden i icação de oocis os de C yp ospo idium spp. NOME (ESPÉCIE) Cangu u de pescoço e melho (Mac opus u og iseus) Lému e de cauda anelada (Lemu ca a) Lému e de ace b anca (Lemu macaco albi ons) Lému e p e o (Lemu macaco macaco) Lému e mangus o (Lemu mongoz) Lému e cas anho (Va ecia a iega a ub a) Lému e de cola p e o e b anco (Lemu a iega us a iega us) Macaco ui ado (Aloua a ca aya) Macaco capuchinho (Cebus apella) Saki de ace b anca (Pi hecia pi hecia) Macaco Goeldi (Callimico goeldii) Saguim p a eado (Calli h ix a gen a a) Saguim de ace b anca (Calli h ix geo oyi) Mico leão de juba dou ada (Leon opi hecus osalia ch ysomelas) Mico leão dou ado (Leon opi hecus osalia osalia) Saguim de cabeça cas anha (Saguinus uscicollis) Saguim impe ado (Saguinus impe a o subg isescens) Saguim de beiço b anco (Saguinus labia us labia us) Saguim de mãos dou adas (Saguinus midas midas) Saguim de mãos neg as (Saguinus midas nige ) Saguim cabeça de algodão (Saguinus oedipus oedipus) Macaco a a e (Ce copi hecus ae hiops sabeus) Macaco de cauda e melha (Ce copi hecus ascanius ascanius) Macaco de beiço b anco (Ce copi hecus cephus cephus) Macaco Diana (Ce copi hecus diana diana) Macaco mona (Ce copi hecus mona) Macaco de B azza (Ce copi hecus neglec us) Macaco de na iz b anco (Ce copi hecus pe au is a pe au is a) Colobo Gue ezza (Colobus gue eza kikuyuensis) Macaco do Japão (Macaca usca a usca a) Macaco cauda de leão (Macaca silenus) Babuíno da Guiné (Papio cynocephalus papio) Babuíno Hamad ias (Papio hamad yas hamad yas) Mand il (Papio sphinx) Langu de Douc (Pyga h ix nemaeus nemaeus) Go ila (Go illa go illa go illa) Gibão de mãos b ancas (Hyloba es la ) Siamango (Hyloba es syndac ylus) Chimpanzé (Pan oglody es) P eguiça de dois dedos (Choloepus didac ylus) Lobo ibé ico (Canis lupus signa us) Feneca (Fennecus ze da) Raposa (Vulpes ulpes silacea) U so do Tibe e (Selena c os hibe anus) U so pa do (U sus a c os) Chi a (Acinonyx juba us juba us) Lince ibé ico (Felis lynx lynx) Ocelo e (Felis pa dalis) Se al (Felis se al) Pan e a nebulosa (Neo elis nebulosa) Leão de Angola (Pan he a leo bleyenbe ghi) Jagua (Pan he a onca) Leopa do (Pan he a pa dus) Tig e da Sibé ia (Pan he a ig is al aica) Tig e de Suma a (Pan he a ig is suma ae) Pan e a das ne es (Pan e a uncia) Leão ma inho da Cali ó nia (Zalophus cali o nianus) Foca i ulina (Phoca i ulina) Ele an e indiano (Elephas maximus indicus) Ele an e a icano (Loxodon a a icana a icana) Zeb a de G e y (Equus g e yi) Bu o (Equus asinus) Pónei (Equus caballus) Rinoce on e b anco (Ce a o he ium simum simum) Rinoce on e indiano (Rhinoce os unico nis) Po co (Sus sc o a) Hipopó amo pigmeu (Choe opsis libe iensis libe iensis) Hipopó amo (Hippopo amus amphibius) Camelo (Camelus bac ianus bac ianus) D omedá io (Camelus d omeda ius) Lama (Lama glama glama), Axis (Ce us axis axis) Veado do Canadá (Ce us elaphus canadensis) Veado da Bi mânia (Ce us eldi hamin) Gi a a de Angola (Gi a a camelopa dalis angolensis) Cab a (Cap a hi cus hi cus) Addax (Addax nasomacula us) Impala de ace neg a (Aepyce os melampus pe e si) Vaca do ma o (Alcelaphus buselaphus caama) Mu lão a icano (Ammo agus le ia) Ce icap a (An ilope ce icap a) Bison e ame icano (Bison bison bison) Iaque (Bos mu us g unniens) Gnu de cauda b anca (Connochae es gnou) Gnu azul (Connochae es au inus au inus) Damalisco do cas (Damaliscus do cas do cas) Palanca uana (Hippo agus equinus) Palanca neg a (Hippo agus nige nige ) Cobo de c escen e (Kobus ellipsip ymnus ellipsip ymnus) Cobo de leche (Kobus leche leche) O ix Cimi a a (O yx dammah) O ix aus al (O yx gazella gazella) O ix da A ábia (O yx leuco yx) Bú alo a icano (Synce us ca e ca e ) Pacaça (Synce us ca e nanus) Elande (Tau o agus o yx o yx) Niala (T agelaphus angasi) Bongo (T agelaphus eu yce us isaaci) Si a unga (T agelaphus spekei g a us) Ca alo de Timo (T agelaphus s epsice os s epsice os) II – MATERIAL E MÉTODOS 79 QUADRO IX – A es do Ja dim Zoológico de Lisboa cujas ezes o am subme idas a écnicas pa asi ológicas, pa a iden i icação de oocis os de C yp ospo idium spp. NOME (ESPÉCIE) Faisão Lady Amhe s (Ch ysolophus amhe s iae) Faisão dou ado (Ch ysolophus pic us) Faisão manchu iano azul (C ossop ilon au ium) Faisão manchu iano do Tibe e (C ossop ilon c ossop ilon d ouynii) Faisão siamês (Lophu a dia di) Faisão de Edwa d (Lophu a edwa dsi) Faisão impe ial (Lophu a impe ialis) Faisão Swinhoe (Lophu a swinhoii) Faisão de Palawan (Polyplec on emphanum) Faisão de Ge main (Polyplec on ge maini) Faisão de Ellio (Sy ma icus ellio i) Faisão ene ado (Sy ma icus ee esi) Faisão agopan Sa y (T agopan sa y a) Faisão agopan Temminck (T agopan emminckii) Pombo da u a de en e la anja (P ilinopus iozonus) Pombo da u a de ga gan a p e a (P ilinopus leclanche i) Pombo da u a sobe bo (P ilinopus supe bus) Ca a ua pequena de c is a ama ela (Caca ua sulphu ea sulphu ea) Ca a ua de Leadbea e (Caca ua leadbea e i) Ca a ua galah (Elophus oseicapillus) Papagaio chuão (Amazona du esniana hodoco y ha) Papagaio de ace e de (Amazona i idigenalis) A a a ma acanã (A a ma acana) A a a nanica (A a nobilis nobilis) Jandaia en e de ogo (A a inga au icapilla au i ons) Pe iqui o dou ado (A a inga gua ouba) Jandaia (A a inga jandaya) Papagaio cabeça de alcão (De op yus accipi inus accipi inus) Papagaio eclec us (Eclec us o a us polychlo os) Ma ianinha de cabeça b anca (Pioni es leucogas e ) Papagaio de bico g osso (Rhynchopsi a pachy hyncha) Tu aco da cos a dou ada (Tau aco co y haix pe sa) Tu aco de ace b anca (Tau aco leuco is leuco is) Tu aco de bico p e o (Tau aco schue i) Tu aco iole a (Musophaga iolácea iolacea) Tu aco de Ha laub (Tau aco ha laubi) Kokabu a (Dacelo no aeguineae) As amos as ecais o am subme idas a écnicas pa asi ológicas, pa a o diagnós ico da c ip ospo idiose. Os isolados de ec ados o am, subsequen emen e, sujei os a ca ac e ização gené ica, azendo uso de écnicas de biologia molecula . A ca ac e ização molecula oi, ambém, ealizada em oi o isolados, de ec ados po diagnós ico pa asi ológico, em igual núme o de animais, pe encen es a ês espécies de Bo ídeos (ó ix aus al, ó ix da a ábia e addax), ca i os no Zoo de Lisboa. Es es isolados o am iden i icados, no âmbi o de um es udo epidemiológico ealizado en e Se emb o de 1998 e Agos o de 1999, po Delgado (2000), na Unidade de P o ozoá ios Opo unis as/VIH e Ou as P o ozooses, do IHMT, e encon a am-se conse ados a 4ºC, em dic oma o de po ássio a 5%. Pa a além des es, o am, ainda, es udados ês isolados pe encen es a duas espécies de Bo ídeos (addax e elande) do Zoo de Lisboa, iden i icados po Isabel Fonseca, em 1996, que se encon a am a mazenados em condições idên icas às acima desc i as. II – MATERIAL E MÉTODOS 80 2. DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO O diagnós ico pa asi ológico da c ip ospo idiose consis iu na obse ação de oocis os de C yp ospo idium spp. em es egaços de ezes. Todas as amos as ecais, humanas e animais, ecolhidas no âmbi o do p esen e abalho, o am sujei as a um p ocesso de concen ação, a um mé odo de colo ação his oquímica dos es egaços di ec o e concen ado e, subsequen e, obse ação ao mic oscópio óp ico. Todas as amos as de ezes em que o am encon ados oocis os de C yp ospo idium spp., o am diluídas em igual olume de dic oma o de po ássio a 5% e a mazenadas a 4ºC. 2.1 CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS FECAIS A concen ação das amos as de ecais oi e ec uada segundo o mé odo de sedimen ação di ásica de Ri chie modi icado, adap ado de Casemo e e al. (1985a). Num ubo de cen í uga cónico, com capacidade de 12 ml, oi essuspendida uma alíquo a de ezes, em 3 ml de água desionizada. Após a adição de 3 ml de é e e agi ação igo osa, a suspensão oi il ada a a és de uma gaze pa a um no o ubo, com a inalidade de emo e os de i os ecais de maio dimensão. Uma ez comple ado o olume inal, com água desionizada, a amos a oi cen i ugada a 400 g, du an e cinco minu os. Depois de desp ezada a ase e é ea, o sob enadan e oi e i ado pa a um ubo limpo, pe ez-se o olume inal com água desionizada e ealizou-se no a cen i ugação, des a ez a 4.100 g, du an e dez minu os. O sedimen o, o iginado na p imei a cen i ugação, oi gua dado, pa a pos e io pesquisa de o os, quis os e pa asi as. Após a segunda cen i ugação, o sob enadan e oi ejei ado e, com o sedimen o esul an e, p epa a am-se dois es egaços numa lâmina onde, inicialmen e, se ha ia ei o um es egaço di ec o das ezes. Ambos os sedimen os o am conse ados a 4ºC, a agua da o esul ado do diagnós ico pa asi ológico; em caso de diagnós ico posi i o, o am subme idos a uma écnica de ex acção de DNA ( ide pág. 82). 2.2 COLORAÇÃO DIFERENCIAL O mé odo de colo ação his oquímica, u ilizado pa a de ecção de oocis os de C yp ospo idium spp., em es egaços ecais, oi o Ziehl-Neelsen modi icado. II – MATERIAL E MÉTODOS 81 A écnica oi ealizada com algumas pequenas al e ações, ela i amen e à desc ição de Casemo e e al. (1985a). Assim, os es egaços ecais, já secos, o am ixados com me anol, du an e um minu o. Em seguida, o am co ados com ucsina énica ( ucsina básica em pó 1% m/ , enol c is alizado 5% m/ , álcool absolu o 10% / ), po dez minu os e, após la agem com água, o am desco ados com álcool clo íd ico a 1%, a é à eliminação o al do co an e em excesso. Depois de no a la agem com água, os es egaços o am co ados com e de de malaqui e a 0,4%, du an e 30 segundos e, de no o, la ados com água. Depois de secos, p ocedeu-se à sua obse ação ao mic oscópio óp ico. 2.3 OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA Os es egaços ecais co ados o am obse ados num mic oscópio óp ico Olympus BX51, com uma objec i a de ×20, sendo a p esença de oocis os con i mada com as objec i as de ×40 e de ime são. A de e minação da dimensão média dos oocis os, encon ados nalgumas amos as, oi e ec uada, semp e que possí el, com base na obse ação de 20 oocis os po cada amos a, com uma ampliação de ×1000, a a és do p og ama Olympus DP-So 3.2. Po cada amos a de ezes o am obse ados dois es egaços concen ados e um es egaço di ec o. As amos as onde, no conjun o dos ês es egaços, se obse a am dois ou mais oocis os, o am conside adas posi i as. Nos casos em que apenas oi obse ado um oocis o, a p esença de pa asi as, na amos a, oi con i mada po eacção de PCR, aplicada ao gene SSU- RNA, con o me desc i o mais à en e ( ide 4.1, pág. 85). A ca ga pa asi á ia das ezes oi es imada, median e um es udo quan i a i o, po de e minação da média do núme o de oocis os obse ados nos es egaços di ec os, em 20 campos mic oscópicos, seleccionados ao acaso (quad o X). QUADRO X – Quan i icação da ca ga pa asi á ia das amos as posi i as pa a C yp ospo idium spp. CARGA PARASITÁRIA N.º OOCISTOS/CAMPO* I 1 a 5 II 6 a 10 III 11 a 15 IV >15 * Com a ampliação de 200× (ocula ×10 e objec i a ×20) II – MATERIAL E MÉTODOS 82 3. EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. O DNA genómico de odos os pa asi as do géne o C yp ospo idium, iden i icados po diagnós ico pa asi ológico, oi isolado a pa i dos oocis os p esen es nas ezes. Es e p ocesso cons i uiu o pon o de pa ida pa a a ealização da eacção de PCR e es an es écnicas de biologia molecula , que pe mi i am a ca ac e ização dos o ganismos em es udo. O mé odo u ilizado, pa a a ex acção do DNA de odos os isolados, oi o Mini- BeadBea e /Sílica. Nos casos em que a ampli icação, po PCR, do DNA isolado daquele modo não oi conseguida, p ocedeu-se à execução de um segundo mé odo de ex acção, o KOH/Qiagen. Es e úl imo mé odo oi, ambém, u ilizado em odos os isolados abalhados pela au o a na “Di ision o Pa asi ic Diseases”, CDC, A lan a, EUA. 3.1 PREPARAÇÃO DOS OOCISTOS PARA EXTRACÇÃO DE DNA Nas amos as com diagnós ico pa asi ológico posi i o, os sedimen os, esul an es da p imei a e segunda cen i ugações do mé odo de concen ação de Ri chie modi icado ( ide 2.1, pág. 80), o am colocados num único ubo de cen í uga e subme idos a uma la agem po essuspensão em água desionizada e cen i ugação a 4.100 g, du an e dez minu os. O sedimen o esul an e, com os oocis os concen ados, oi a mazenado a –20ºC, agua dando a subsequen e ex acção de DNA. Os isolados que se encon a am conse ados em dic oma o de po ássio a 5%, o am sujei os ao mé odo de concen ação de Ri chie modi icado, já desc i o em 2.1. A la agem dos dois sedimen os, desc i a no pa ág a o an e io , oi epe ida po duas ezes, pa a eliminação do dic oma o de po ássio, que é um compos o inibido da eacção de PCR. 3.2 MÉTODO MINI-BEADBEATER/SILICA Es a écnica, adap ada de Boom e al. (1990) e de McLauchlin e al. (2000), consis e na lise mecânica dos oocis os, po agi ação igo osa com pa ículas de zi cónio, seguida de um p ocesso, que en ol e a adso ção do DNA a pa ículas de sílica ac i ada, a la agem com um ampão e dois sol en es o gânicos e, po im, a eluição, em água desionizada es é il. II – MATERIAL E MÉTODOS 83 Num mic o ubo de 2 ml, o am colocados 300 µl de suspensão de oocis os concen ados, 900 µl de ampão de lise ( iociana o de guanidina 7 M, T is-HCl 50 mM [pH 6,4], EDTA 25 mM pH 8,0, T i on X-100 1,5% / ), 60 µl de álcool isoamílico e 0,3 g de pa ículas de zi cónio com 0,5 mm de diâme o (Biospec P oduc s). Após o e agi ação, num apa elho Mini-BeadBea e (Biospec P oduc s), e cen i ugação du an e 15 segundos a 23.100 g, pa a sedimen ação dos de i os ecais insolú eis e das pa ículas de zi cónio, o sob enadan e oi ans e ido pa a um mic o ubo de 1,5 ml, ao qual ha iam sido, p e iamen e, adicionados 25 µl de uma solução aquosa de sílica ac i ada (1%, pH 2,0). O sob enadan e e a sílica ac i ada o am incubados, à empe a u a ambien e, num agi ado o a i o, a elocidade mode ada e cons an e, du an e 30 minu os. Em seguida, pa a sedimen a a sílica com o DNA adso ido, oi e ec uada uma cen i ugação de 15 segundos, a 23.100 g e desp ezado o sob enadan e esul an e. Pos e io men e, o am ealizadas cinco la agens, duas com ampão de la agem ( iociana o de guanidina 7 M, T is-HCl 50 mM [pH 6,4]), duas com e anol a 80% a –20ºC e, po im, uma com ace ona. Cada la agem consis iu na essuspensão da sílica no ampão ou sol en e ap op iados, cen i ugação a 23.100 g, du an e 10 segundos, e ejeição do sob enadan e esul an e. Após a la agem com ace ona, a sílica sedimen ada oi incubada a 55ºC, a é comple a e apo ação daquele sol en e. A eluição do DNA oi ei a po essuspensão da sílica em 50 µl de água desionizada es é il e incubação a 60ºC, du an e cinco minu os. Após uma cen i ugação a 23.100 g, du an e dois minu os, o sob enadan e, con endo o DNA genómico dos pa asi as, oi ans e ido pa a um mic o ubo de 1,5 ml es é il e a mazenado a – 20ºC. 3.3 MÉTODO KOH/QIAGEN Es e mé odo baseia-se na lise inicial dos oocis os po choque álcali/ácido, seguida de ex acção o gânica e pos e io u ilização do “ki ” come cial “QIAamp® DNA S ool Mini Ki ” (Qiagen). Num mic o ubo de 1,5 ml o am cen i ugados, a 23.100 g, du an e se e minu os, 300 µl de suspensão de oocis os concen ados. Após ejeição do sob enadan e, o sedimen o oi essuspendido em 133,2 µl de hid óxido de po ássio (KOH) 1M e 37,2 µl de di io ei ol (DTT) 1M e incubado a 65ºC, du an e 15 minu os. Em seguida, o am adicionados 17,2 µl de ácido clo íd ico (HCl) 25% e 320 µl de T is-HCl 2M (pH 8.3), que o am igo osamen e II – MATERIAL E MÉTODOS 84 agi ados. Depois, adiciona am-se 500 µl de enol:clo o ó mio:álcool isoamílico (25:24:1) e, após sua e agi ação manual po in e são, a suspensão esul an e oi cen i ugada a 3.700 g, du an e cinco minu os. O sob enadan e oi ecolhido pa a um mic o ubo de 2 ml, ao qual oi adicionado 1 ml de ampão ASL (Qiagen), seguindo-se incubação a 80ºC, du an e cinco minu os. Após a adição de um comp imido Inhibi ex (Qiagen) e imedia a agi ação a é à essuspensão comple a do comp imido, a mis u a oi deixada em epouso du an e um minu o. De seguida, oi e ec uada uma cen i ugação de ês minu os, a 23.100 g. O sob enadan e esul an e oi ans e ido pa a um mic o ubo de 2 ml limpo, ao qual o am adicionados 300 µl de ampão AL (Qiagen) e, após o e agi ação, 800 µl de e anol absolu o. Depois de no a agi ação, a solução ob ida oi ans e ida pa a uma coluna QIAamp, colocada num ubo colec o , em alíquo as máximas de 750 µl, e cen i ugada a 23.100 g, du an e um minu o. Es e passo oi epe ido, a é oda a solução e passado pela coluna. Seguidamen e, a coluna oi colocada num ubo colec o limpo, o am-lhe adicionados 500 µl de ampão AW1 (Qiagen) e oi ei a no a cen i ugação a 23.100 g, du an e um minu o. A coluna oi, de no o, ans e ida pa a um ubo colec o limpo, endo-lhe sido adicionados 500 µl de ampão AW2 (Qiagen) e ealizada no a cen i ugação a 23.100 g, du an e ês minu os. Po im, a coluna oi ans e ida pa a um mic o ubo de 1,5 ml e, após adição de 50 µl de água desionizada es é il, oi a incuba a 70ºC, du an e cinco minu os. Te minada a incubação, ealizou-se uma cen i ugação a 23.100 g, du an e um minu o, após o que a coluna oi emo ida e o mic o ubo, com o DNA, a mazenado a –20ºC. II – MATERIAL E MÉTODOS 85 4. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. A ca ac e ização molecula dos isolados, de o igem humana e animal, de ec ados pelo diagnós ico pa asi ológico, oi ealizada com o p opósi o de de e mina a sua espécie ou genó ipo. O DNA de odos os isolados em es udo oi sujei o a ampli icação, po eacção de PCR, aplicada aos loci gené icos COWP, TRAP-C1, DHFR e SSU- RNA. Os agmen os ampli icados o am, pos e io men e, subme idos a hid ólise po endonucleases de es ição (RFLP) endo, a análise dos pe is de es ição esul an es, pe mi ido iden i ica a espécie de cada isolado. Pa a cada gene es udado, o am seleccionados dois isolados pe encen es a cada uma das espécies de C yp ospo idium iden i icadas, nos quais, pa a con i mação do esul ado da análise de RFLP, se p ocedeu à sequenciação dos agmen os ampli icados po PCR. Nos isolados de ec ados em gado bo ino oi, ainda, de e minada a sequência nucleo ídica do agmen o do gene SSU- RNA de odos os isolados pe encen es a animais de idade desconhecida ou supe io a 15 dias, cujas PCR’S dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1 não o am bem sucedidas. No caso dos isolados dos animais do Ja dim Zoológico não oi e ec uada análise de RFLP, endo a iden i icação do seu genó ipo sido ealizada po sequenciação do agmen o do gene SSU- RNA ampli icado po PCR. 4.1 AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO POR PCR A ampli icação do DNA dos pa asi as oi ealizada po eacção de PCR, aplicada aos genes COWP [Spano e al., 1997b], TRAP-C1 [Spano e al., 1998a, 1998b], DHFR [Gibbons e al., 1998] e SSU- RNA [Xiao e al., 1999a, 2000a]. No caso dos dois p imei os genes, a ampli icação oi ei a a a és de eacções de PCR simples, enquan o que, pa a os dois úl imos, se e ec ua am eacções de PCR “nes ed”. No quad o XI encon am-se desc i as as sequências dos oligonucleó idos iniciado es u ilizados na ampli icação de cada gene, bem como a dimensão dos agmen os ampli icados. As eacções de PCR, e ec uadas pa a os genes COWP, TRAP-C1 e DHFR, so e am alguns ajus es, em elação ao desc i o pelos au o es e e enciados, nomeadamen e, ao ní el da empe a u a de ligação, dos empos de ligação e de ex ensão, da concen ação de clo e o de II – MATERIAL E MÉTODOS 86 magnésio (MgCl2) e de oligonucleó idos iniciado es e/ou da concen ação da enzima DNA polime ase. QUADRO XI – Oligonucleó idos iniciado es u ilizados nas eacções de PCR GENE OLIGONUCLEÓTIDOS INICIADORES SEQUÊNCIA DIMENSÃO DO FRAGMENTO (pb) REFª COWP C y.15 C y.9 5’ – GTA GAT AAT GGA AGA GAT TGT G – 3’ 5’ – GGA CTG AAA TAC AGG CAT TAT CTT G – 3’ 553 Spano e al., 1997b TRAP-C1 E .E E .W 5’ – GGA TGG GTA TCA GGT AAT AAG AA – 3’ 5’ – CAA TTC TCT CCC TTT ACT TC – 3’ 506 Spano e al., 1998a 1ª PCR – DHFR1 DHFR2 5’ – GTG GGG ATT TAA CTT GAT TT – 3’ 5’ – GGT ATT TCT GGG AAA TAA GT – 3’ 575 DHFR 2ª PCR – DHFR3 DHFR4 5’ – ATG AGT GAA AAG AAC GTT TC – 3’ 5’ – CAC CCT TGT TAA GTA TAT TC – 3’ 408 Gibbons e al., 1998 1ª PCR – SSU1 SSU2 5’ – TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG – 3’ 5’ – CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA – 3’ ≈ 1325 SSU- RNA 2ª PCR – SSU3 SSU4 5’ – GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG – 3’ 5’ – AAG GAG TAA GGA ACA ACC TCC A – 3’ 826-864 Xiao e al., 1999a, 2000a As eacções de ampli icação dos genes COWP e TRAP-C1 o am e ec uadas em olumes de 25 µl, con endo, em ambos os casos, 2,5 µl de 10× ampão de eacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM T is-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 2 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mis u a dos desoxi ibonucleó idos dATP, dCTP, dGTP e dTTP (P omega), 20 pmol de cada um dos espec i os oligonucleó idos iniciado es (MWG Bio ech), 0,75 U de Bio aq™ DNA Polyme ase (Bioline), en e 2,5 a 7 µl de DNA genómico e água desionizada es é il, pa a pe aze o olume inal. A ampli icação do gene DHFR oi e ec uada num olume de 50 µl, con endo a mis u a eaccional da p imei a PCR, 5 µl de 10× ampão de eacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM T is-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 2,5 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mis u a de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (P omega), 20 pmol de cada oligonucleó ido iniciado (MWG Bio ech), 1,5 U de Bio aq™ DNA Polyme ase (Bioline), en e 1 a 5 µl de DNA genómico e água desionizada es é il, pa a comple a o olume inal. A segunda PCR oi ealizada com 1 µl do DNA ampli icado na p imei a eacção, sendo a mis u a eaccional igual à p imei a, com excepção da concen ação de MgCl2, que oi diminuída pa a 1,5 mM. II – MATERIAL E MÉTODOS 87 A ampli icação do gene SSU- RNA oi e ec uada num olume de 50 µl, con endo, a mis u a eaccional da p imei a PCR, 5 µl de 10× ampão de eacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM T is-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 6 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mis u a de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (P omega), 10 pmol de cada oligonucleó ido iniciado (MWG Bio ech), 1,5 U de Bio aq™ DNA Polyme ase (Bioline), en e 2,5 a 10 µl de DNA genómico e água desionizada es é il pa a pe aze o olume inal. A segunda PCR oi ealizada com 2 µl do DNA ampli icado na p imei a eacção, sendo a mis u a eaccional igual à p imei a, com excepção da concen ação de MgCl2, que oi diminuída pa a 3 mM. Em cada eacção de PCR oi incluído um ubo com uma amos a de DNA de C yp ospo idium spp. em condições óp imas de qualidade e concen ação, pa a unciona como con olo posi i o da mis u a eaccional, e um con olo nega i o, como indicado da inexis ência de con aminação po DNA exógeno onde, no luga do DNA, oi adicionada água desionizada es é il. As eacções de ampli icação o am e ec uadas num e mociclado “T1 The mocycle ” (Biome a) endo, em odas elas, o passo de desna u ação inicial sido de dez minu os a 95ºC e o de ex ensão inal de dez minu os a 72ºC. No quad o XII es ão desc i as as es an es condições de ampli icação pa a cada um dos loci es udados. QUADRO XII – Condições de ampli icação do DNA, pa a os qua o genes es udados GENE CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO N.º CICLOS COWP Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 50 seg. 55ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 30 TRAP-C1 Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 50 seg. 50ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 40 DHFR – 1ª PCR Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 45 seg. 50ºC, 60 seg 72ºC, 3 min. 30 DHFR – 2ª PCR Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 45 seg. 60ºC, 60 seg 72ºC, 3 min. 30 SSU- RNA 1ª e 2ª PCR’S Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 45 seg. 55ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg 35 II – MATERIAL E MÉTODOS 94 O p ocedimen o de ampli icação GP601 oi e ec uado num olume de 50 µl, con endo a mis u a eaccional da p imei a PCR, 5 µl de 10× ampão de eacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM T is-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 3 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mis u a de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (P omega), 10 pmol de cada oligonucleó ido iniciado (MWG Bio ech), 1,5 U de Bio aq™ DNA Polyme ase (Bioline), en e 5 a 10 µl de DNA genómico e água desionizada es é il pa a pe aze o olume inal. A segunda PCR oi ealizada com 1,5 µl do DNA ampli icado na p imei a eacção, sendo a mis u a eaccional igual à p imei a. O p ocedimen o de ampli icação GP602 oi e ec uado num olume de 50 µl, con endo a mis u a eaccional da p imei a PCR, 5 µl de 10× ampão de eacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM T is-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 1,5 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mis u a de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (P omega), 10 pmol de cada oligonucleó ido iniciado (MWG Bio ech), 0,02 mg de albumina do so o bo ino ou BSA (sigla anglo- saxónica pa a “bo ine se um albumin”) (Sigma-Ald ich), 1,5 U de Bio aq™ DNA Polyme ase (Bioline), en e 5 a 10 µl de DNA genómico e água desionizada es é il, pa a pe aze o olume inal. A segunda PCR oi ealizada com 3 µl do DNA ampli icado na p imei a eacção, sendo a mis u a eaccional igual à p imei a, com excepção da BSA, que oi excluída. Em cada eacção de PCR oi incluído um ubo com uma amos a de DNA, em condições óp imas de qualidade e concen ação, pa a unciona como con olo posi i o da mis u a eaccional, e um con olo nega i o, como indicado da inexis ência de con aminação, po DNA exógeno, onde, no luga do DNA, oi adicionada água desionizada es é il. As eacções de ampli icação o am e ec uadas num e mociclado “T1 The mocycle ” (Biome a), endo, em odas, o passo de desna u ação inicial sido de dez minu os a 95ºC e o de ex ensão inal de dez minu os a 72ºC. No quad o XIV es ão desc i as as es an es condições de ampli icação dos agmen os do gene GP60. Os agmen os de DNA ampli icados po PCR o am subme idos a elec o o ese em gel de aga ose a 1,5%, con o me desc i o em 4.2. II – MATERIAL E MÉTODOS 95 QUADRO XIV – Condições de ampli icação do DNA, pa a o gene GP60 PROCEDIMENTO CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO N.º CICLOS GP601 1ª PCR/2ª PCR Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 45 seg. 50ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg 35 GP602 – 1ª PCR Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 45 seg. 47ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg. 35 GP602 – 2ª PCR Desna u ação Ligação Ex ensão 95ºC, 45 seg. 50ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg 35 O g upo de amos as, ca ac e izadas no CDC, comp eendeu 20 isolados de C. pa um e de C. hominis de o igem humana, 32 de o igem bo ina e no e de uminan es sil á icos. A ampli icação, po PCR, do gene GP60, oi e ec uada segundo o p ocedimen o GP601, nas condições já desc i as. A eacção de ampli icação oi e ec uada num e mociclado “GeneAmp PCR Sys em 9700” (Pe kin Elme ) [Al es e al., 2003b]. 5.2.2 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS POR PCR O p ocedimen o adop ado com o p opósi o de sequencia os agmen os do gene GP60, ampli icados po PCR, oi dis in o pa a as amos as es udadas no CDC e no IHMT. O abalho desen ol ido no CDC oi ealizado con o me a desc ição que se segue. Os agmen os do gene GP60 ampli icados o am pu i icados a a és do “Mic ocon-PCR Cen i ugal Fil e De ices” (Amicon, Millipo e), con o me as ins uções do ab ican e: a um il o (Amicon, Millipo e) colocado num mic o ubo de 1,5 ml (Amicon, Millipo e), o am adicionados 460 µl de água desionizada es é il e o p odu o de PCR a pu i ica . Depois de echado, o ubo com o il o oi a cen i uga a 1.000 g, du an e 15 minu os. Em seguida, o am adicionados ao il o 20 µl de água desionizada es é il, p é-aquecida a 70ºC. Após um minu o de epouso, à empe a u a ambien e, o il o oi in e ido, colocado num no o mic o ubo e cen i ugado a 1.000 g, du an e dois minu os. Po im, o il o oi eliminado e o ubo com o p odu o de PCR pu i icado a mazenado a –20ºC. Pa a cada agmen o do gene GP60, ampli icado e pu i icado, o am ealizadas duas eacções de sequenciação, uma no sen ido di ec o e ou a no sen ido e e so. Em cada uma II – MATERIAL E MÉTODOS 96 des as eacções oi u ilizado, apenas, um dos oligonucleó idos iniciado es (AL3532 ou AL3534), esul ando na ampli icação de apenas uma das cadeias do DNA al o. A eacção de sequenciação oi p epa ada, segundo o mé odo “ABI PRISM® BigDye™ Te mina o Cycle Sequencing Ready Reac ion Ki ” (Applied Biosys ems). Em cada mis u a eaccional o am adicionados 4 µl de “Te mina o Ready Reac ion Mix”, compos a po qua o didesoxi ibonucleó idos e minado es ma cados com qua o luo oc omos di e en es (“A- Dye Te mina o ”, “C-Dye Te mina o ”, “G-Dye Te mina o ” e “T-Dye Te mina o ”), qua o desoxi ibonucleó idos (dATP, dCTP, dITP e dUTP), AmpliTaq DNA Polyme ase FS, MgCl2, e T is-HCl bu e , pH 9.0 (Applied Biosys ems), 4 µl de 5× ampão de sequenciação (Applied Biosys ems), 1,5 µl de p odu o de PCR pu i icado, 2 µl de um dos oligonucleó idos iniciado es e água desionizada es é il pa a comple a um olume inal de 20 µl. As eacções de sequenciação o am ealizadas num e mociclado “GeneAmp PCR Sys em 9700” (Pe kin Elme ), du an e 25 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 50ºC e qua o minu os a 60ºC. Os p odu os de sequenciação o am, pos e io men e, pu i icados de sais e dos oligonucleó idos iniciado es, didesoxi ibonucleó idos e minado es e desoxi ibonucleó idos não inco po ados que in e e em com a elec o o ese capila . Pa a al, oi u ilizado o “ki ”come cial “Cen i-Sep Columns” (P ince on Sepa a ions), de aco do com a desc ição que se segue: pa a hid a a a esina da coluna, o am-lhe adicionados 800 µl de água desionizada es é il e, após o e agi ação, es a oi deixada a epousa du an e uma ho a, à empe a u a ambien e. Depois, e i a am-se as ampas supe io e in e io da coluna que oi, em seguida, colocada num ubo de ecolha a elui , du an e 15 minu os. Após eliminação do eluído, oi e ec uada uma cen i ugação de ês minu os a 750 g e a coluna oi ans e ida pa a um mic o ubo de 1,5 ml. O p odu o da sequenciação oi adicionado à coluna, endo, em seguida, sido ealizada no a cen i ugação a 750 g, du an e ês minu os. Po im, a coluna oi eliminada e o eluído concen ado num “Vacu uge Concen a o 5301” (Eppendo ), a é comple a e apo ação do sol en e. Os p odu os de sequenciação pu i icados e concen ados o am essuspendidos em 15 µl de o mamida “ABI PRISM® Hi-Di™” (Applied Biosys ems). Em seguida, o am colocados numa mic oplaca “Mic oAmp® Op ical 96-well Reac ion Pla e” (Applied Biosys ems), apados com uma ampa “96-Well Sep a” (Applied Biosys ems), subme idos a 94ºC, du an e ês minu os, num e mociclado “GeneAmp PCR Sys em 9700” (Pe kin Elme ) e, de imedia o, congelados a –20ºC. II – MATERIAL E MÉTODOS 97 A esolução dos p odu os de sequenciação oi ealizada num sequenciado au omá ico “ABI PRISM® 3100 Gene ic Analyze ” (Applied Biosys ems), po elec o o ese capila , numa ma iz de políme o POP4™ (Applied Biosys ems). A ecolha e o p ocessamen o dos esul ados da elec o o ese oi e ec uada pelos p og amas “ABI PRISM® 3100 Gene ic Analyze Da a Collec ion So wa e” e “DNA Sequencing Analysis So wa e” (Applied Biosys ems). Os c oma og amas, com as sequências di ec a e e e sa, de cada agmen o sequenciado, o am compa ados, a a és do p og ama “Au oAssemble 2.0” (Applied Biosys ems) e, após a co ecção manual de alguns e os nas sequências di ec a e/ou e e sa, oi ob ida uma sequência consenso, pa a cada agmen o do gene GP60 ampli icado. Os agmen os do gene GP60, ampli icados na Unidade de P o ozoá ios Opo unis as/VIH e Ou as P o ozooses, o am pu i icados, a a és do “JETQUICK PCR P oduc Pu i ica ion Spin Ki ” (Genomed), con o me desc i o em 4.4, e en iados pa a o Labo a ó io de Sequenciação e Análise de F agmen os, do ICAT, onde o am sequenciados, num sequenciado au omá ico “CEQ™ 2000XL” (Beckman Coul e ) e analisados pelo so wa e “CEQ™ 8000 Gene ic Analysis Sys em” (Beckman Coul e ). As sequências de DNA o am de e minadas em ambos os sen idos, endo sido ob ida uma sequência consenso, po compa ação das sequências di ec a e e e sa. 5.2.3 ANÁLISE BIOINFORMÁTICA As sequências nucleo ídicas consenso do agmen o do gene GP60, de odos os isolados de C. hominis e de C. pa um es udados e de ou as disponí eis no GenBank (h p://www.ncbi.nlm.nih.go /Genbank/), pa a o mesmo gene e os mesmos pa asi as, o am alinhadas a a és do p og ama Clus alX [Thompson e al., 1997]. Ao alinhamen o esul an e, o am e ec uados alguns ace os manuais, de o ma a elimina algumas ambiguidades. A pa i des e alinhamen o inal, oi cons uída uma á o e ilogené ica, a a és do p og ama T eeconW [ an de Pee e de Wach e , 1994] e do mé odo “neighbou -joining”, endo po base dis âncias gené icas calculadas, pelo modelo de dois pa âme os de Kimu a. Os alo es de con iança, pa a os amos indi iduais da á o e, o am de e minados, po análise de “boo s ap” com 1.000 éplicas. 98 Capí ulo III INFECÇÃO POR C RYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 99 1. INTRODUÇÃO O sin oma gas en e ológico mais comum en e os indi íduos in ec ados po VIH é a dia eia. Nes es doen es, a c ip ospo idiose des aca-se como uma das in ecções opo unis as mais ezes associada a es a sin oma ologia [Call e al., 2000]. No p imei o abalho ealizado em Po ugal sob e a c ip ospo idiose em doen es in ec ados po VIH, da au o ia de An unes e al. (1990), a pe cen agem encon ada pa a es a pa asi ose oi de 13,4% (15/112). Num ou o es udo, e ec uado po Tomás e al. (1992), en ol endo 268 doen es in ec ados po VIH, no pe íodo en e 1988 e 1991, oi documen ada a pe cen agem de in ecção po C yp ospo idium spp. de 10% (27/268). Em 1998, Ma os e al. publica am um abalho sob e a p e alência da c ip ospo idiose em doen es com in ecção po VIH e dia eia, no Hospi al de San a Ma ia, em Lisboa. Es e abalho ab angeu um pe íodo de no e anos e meio, comp eendido en e o início de 1988 e Maio de 1997, endo a p e alência de c ip ospo idiose encon ada sido de 8% (36/465). Já no pe íodo pós-HAART, en e 1999 e 2001, o mesmo g upo de abalho encon ou, numa população semelhan e, uma pe cen agem de in ecção po C yp ospo idium spp. de 9,7% (16/195) [Ma os e al., 2002]. Es e úl imo abalho não con i mou a eg essão do núme o de casos de c ip ospo idiose nos doen es com in ecção po VIH, na e a pós-HAART, obse ada e desc i a po di e sos au o es [I es e al., 2001; Maggi e al., 2005; Pozio e Mo ales 2005]. No p esen e abalho oi de e minada a pe cen agem da c ip ospo idiose em doen es com in ecção po VIH e sin oma ologia gas in es inal, num pe íodo de ce ca de ês anos e meio, com início em Junho de 2001 e im em Janei o de 2005. 2. RESULTADOS O diagnós ico pa asi ológico das amos as ecais dos 217 doen es com in ecção po VIH e elou que 18 se encon a am pa asi ados com o ganismos do géne o C yp ospo idium spp., o que co esponde a uma pe cen agem da c ip ospo idiose nes a população de 8,3%. À excepção de um doen e, odos os ou os ap esen a am dia eia (duas ou mais dejecções aquosas diá ias), po al u a do diagnós ico de c ip ospo idiose ( ide capí ulo V, quad o XIX). III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 100 En e os 18 doen es pa asi ados, 16 e am adul os com idades comp eendidas en e os 24 e os 58 anos e, os dois es an es, e am c ianças de se e e 11 anos, ambas do sexo masculino, assim como 13 (81,25%) dos adul os. Apenas ês dos adul os e am do sexo eminino (18,75%) ( ide capí ulo V, quad o XIX). Rela i amen e à ca ego ia de ansmissão de VIH, no e (56,25%) dos adul os e am he e ossexuais, seis (37,5%) e am oxicodependen es e um (6,25%) e a homossexual. As c ianças adqui i am a in ecção po VIH po ansmissão e ical ( ide capí ulo V, quad o XIX). Nos adul os, os alo es de lin óci os TCD4+ a ia am en e 0 e 125 céls/mm3, endo, em 75% dos casos, sido in e io es a 50 céls/mm3 (quad o XV). A c iança de se e anos ap esen a a imunossup essão mode ada, com pe cen agem de lin óci os TCD4+ de 19% (213 céls/mm3), enquan o que a de 11 anos exibia imunossup essão g a e, com pe cen agem de lin óci os TCD4+ in e io a 15% (39 céls/mm3). Onze dos 18 doen es com c ip ospo idiose não se encon a am a aze e apêu ica an i- e o i al, ap esen ando, odos eles, alo es de lin óci os TCD4+ in e io es a 42 céls/mm3. QUADRO XV – Valo es de lin óci os TCD4+ ap esen ados pelos doen es adul os com c ip ospo idiose LINFÓCITOS TCD4+ (céls/mm3) N.º DOENTES ≤ 10 5 11 – 50 7 51 – 125 3 Desconhecido 1 A ca ga pa asi á ia, p esen e nas ezes dos doen es com c ip ospo idiose, oi de ní el I, ní el II e ní el IV ( ide Ma e ial e Mé odos, quad o X) em 27,8% (5/18) dos casos e de ní el III nos es an es 16,6% (3/18) ( ide capí ulo V, quad o XIX). Dois dos cinco doen es com ca ga pa asi á ia de ní el I ap esen a am ezes de consis ência pas osa. Não oi obse ada qualque co elação en e a quan idade de oocis os exc e ados e os alo es de lin óci os TCD4+. Dos 18 casos de in ecção po pa asi as do géne o C yp ospo idium, um oi encon ado em associação com Gia dia lamblia, seis com Mic ospo ídia e um com Gia dia lamblia e Mic ospo ídia ( ide capí ulo V, quad o XIX). III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 101 Os oocis os iden i icados, no diagnós ico pa asi ológico, ap esen a am o ma es é ica a o alada e dimensão média de 4,68 × 4,28 µm. Na igu a 8 podem obse a -se oocis os de C yp ospo idium spp., num es egaço ecal, co ado pelo mé odo de Ziehl-Neelsen modi icado. FIGURA 8 – Fo og a ia de oocis os de C yp ospo idium spp., em es egaço ecal, co ado pelo Ziehl- Neelsen modi icado (×1000). O iginal da au o a 3. DISCUSSÃO No p esen e abalho oi encon ada uma pe cen agem de c ip ospo idiose, em doen es com in ecção po VIH e sin oma ologia gas in es inal, de 8,3%. Es e alo e ela diminuição em elação aos 9,7% (16/165) encon ados po Ma os e al. (2002), na e a pós-HAART, en e 1999 e 2001. Con udo, apesa des a diminuição, a pe cen agem encon ada é semelhan e aos 8% (36/465) desc i os no Hospi al de San a Ma ia, du an e o pe íodo p é-HAART de 1988 a 1997 [Ma os e al., 1998]. Em abalhos publicados ecen emen e, em doen es com in ecção po VIH e dia eia, du an e a e a pós-HAART, o am documen adas p e alências de 20,6% (35/170), em Cuba, du an e o ano de 1999 [Paz e al., 2003], de 19,7% (29/147), em Lima, no Pe u, en e 1998 e 2000 [Cá camo e al., 2005] e de 12,8% (20/156), em Non habu i, na Tailândia, em 2001 [Saksi isampan e al., 2002]. Na cidade de Bogo á, na Colômbia, a p e alência de c ip ospo idiose, em doen es com in ecção po VIH e sin oma ologia III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 102 gas in es inal, oi de 10,4% (12/115) [Fló ez e al., 2003]. No B asil, nas cidades do Rio de Janei o e de Ube lândia, os alo es encon ados, de co-in ecção C yp ospo idium spp./VIH, o am, espec i amen e, de 9,3% (7/75), no pe íodo 1998-1999 [Ribei o e al. 2004] e de 4% (4/100), en e 2001 e 2002 [Sil a e al., 2005]. Pa a além do ac o de as populações es udadas nem semp e se em compa á eis, es a di e sidade de alo es pode se explicada, en e ou os ac o es, pelas di e en es condições económicas, cul u ais e higio-sani á ias exis en es nas di e sas cidades, pelas di e en es axas de implemen ação da HAART e/ou pela u ilização de di e en es mé odos de diagnós ico. A compa ação dos esul ados ob idos, no p esen e abalho, com os desc i os po Ma os e al. (2002) mos am que, a pa i de 2001, se e i icou diminuição do núme o de casos de c ip ospo idiose, obse ados na população com in ecção po VIH e sin oma ologia gas en e ológica. Es a diminuição pode encon a jus i icação no dec éscimo do núme o de casos de SIDA, diagnos icados em Po ugal desde 2000, em consequência do e ei o da HAART no a aso da p og essão da in ecção po VIH pa a SIDA [An unes e Do oana, 2003; Cen o de Vigilância Epidemiológica das Doenças T ansmissí eis, 2005]. Desde a in odução da e apêu ica HAART, em 1996, que di e sos au o es êm desc i o, nos países indus ializados, diminuição acen uada da oco ência da c ip ospo idiose, em doen es in ec ados po VIH. Num es udo que en ol eu se oposi i os pa a VIH, da Aus ália e de dez países eu opeus (Dinama ca, F ança, Alemanha, G écia, I ália, No uega, Espanha, Suíça, Holanda e Reino Unido), Babike e al. (2005) compa a am a axa de oco ência da c ip ospo idiose enquan o doença de inido a de SIDA nos pe íodos 1994-1996 e 1997-2001, endo os alo es encon ados sido de 3.1% e 0,2%, espec i amen e. Numa in es igação e ec uada num hospi al em Lond es oi obse ado, após in odução da HAART, dec éscimo da incidência da c ip ospo idiose, em indi íduos com in ecção po VIH, que, endo sido de 1,1% no pe íodo de 1988 a 1995, passou pa a 0,3%, en e 1996 e 1998 [Miao e al., 2000]. Num hospi al associado à Uni e sidade do Alabama, nos EUA, Call e al. (2000) obse a am diminuição da incidência da c ip ospo idiose, como causa de dia eia em doen es com SIDA, de 2%, na e a p é- HAART, pa a 0,3%, na e a pós-HAART, em consequência da melho ia da unção imunológica dos doen es, po acção da e apêu ica an i- e o i al po en e. O ac o de 61% (11/18) dos doen es com c ip ospo idiose não es a em sob a acção da e apêu ica an i- e o i al, pode jus i ica os alo es baixos de lin óci os TCD4+. Com excepção da c iança de se e anos, que ap esen a a imunossup essão mode ada, os es an es III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 103 doen es, com alo es de lin óci os TCD4+ conhecidos, ap esen a am alo es in e io es a 125 céls/mm3 e 86,7% (13/15), des es, exibiam alo es iguais ou in e io es a 50 céls/mm3. A elação en e a dia eia po C yp ospo idium spp. e os alo es de lin óci os TCD4+ em sido documen ada po di e sos au o es [Blansha d e al., 1992; Flanigan e al., 1992]. Num es udo e ec uado num hospi al de Lond es, en e 2000 e 2001, a c ip ospo idiose oi conside ada a p incipal causa de dia eia em doen es com SIDA, com con agens de lin óci os TCD4+ in e io es a 200 céls/mm3, endo sido diagnos icada em 12% des es doen es. Naqueles com con agens en e 200-350 céls/mm3 e supe io es a 350 céls/mm3, a pe cen agem de in ec ados po C yp ospo idium spp. oi de 2,6% e 1,4%, espec i amen e [Da a e al., 2003]. Nou o es udo, na cidade de Ube lândia, no B asil, odos os doen es com in ecção po VIH e c ip ospo idiose ap esen a am alo es de lin óci os TCD4+ en e 8 e 49 céls/mm3. Nenhum des es doen es es a a sob e apêu ica an i- e o i al [Sil a e al., 2005]. No abalho ealizado po Ma os e al. (1998), a ca ego ia de ansmissão de VIH mais ep esen ada, en e os doen es com in ecção po C yp ospo idium spp., oi a dos he e ossexuais (36%), seguida da dos homossexuais (33%) e da dos oxicodependen es (6%). No p esen e abalho, obse ou-se um aumen o do núme o dos casos de c ip ospo idiose nas ca ego ias dos he e ossexuais (56,25%) e dos oxicodependen es (37,5%) e um dec éscimo na ca ego ia dos homossexuais (6,25%). Es es alo es acompanham o pad ão epidemiológico e i icado, anualmen e, desde 2000, em que se em egis ado um aumen o do núme o de casos de SIDA, esul an es da ansmissão he e ossexual de VIH e diminuição naqueles de ansmissão homossexual. Pa a os pe íodos 1983-1999 e 2000-2004, a ca ego ia da ansmissão he e ossexual, o alizou, espec i amen e, 26,9% e 40,9% dos casos de SIDA em Po ugal, enquan o que na ca ego ia da ansmissão homossexual, os casos de SIDA cons i uíam, espec i amen e, 17,3% e 7,3% dos casos o ais de SIDA [Cen o de Vigilância Epidemiológica das Doenças T ansmissí eis, 2005]. IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 110 pessoal]. De ido à al a de colabo ação po pa e dos donos dos ga os in ec ados, não nos oi possí el in es iga se os memb os da amília e/ou ou os animais de companhia, que pa ilha am o ambien e domés ico com esses animais, es a iam, ambém, in ec ados po C yp ospo idium spp.. A elação causa-e ei o, en e a pa ilha do ambien e domés ico com um animal de companhia in ec ado po C yp ospo idium spp. e a in ecção humana, é di ícil de consegui . Tal p ende-se com o ac o de a p esença de oocis os, nas ezes de um animal, não comp o a a o igem de uma e en ual in ecção do seu dono, de ido à possibilidade de ambos e em sido expos os à mesma on e de in ecção ou de o animal e sido in ec ado pelo seu dono [Casemo e e al., 1997; Glase e al., 1998]. Con udo, o ac o de se encon a em desc i os di e sos casos de c ip ospo idiose humana, de ido a C. elis e a C. canis, nomeadamen e em c ianças e em doen es com in ecção VIH/SIDA, le a-nos a c e que a p e enção é a melho de esa. Assim, os donos de animais de companhia, p incipalmen e aqueles com unção imuni á ia diminuída, de e ão da aos seus animais alimen ação e água de qualidade, con e i -lhes cuidados médico- e e iná ios egula es (despa asi ação, imunização ac i a e exame pa asi ológico das ezes) e adop a medidas de higiene, como la a bem as mãos, após a aga o animal, e i a o con ac o com as suas ezes e e i a o con ac o com o animal, caso ele ap esen e dia eia [Angulo e al., 1994]. Nes e aspec o é, ainda, undamen al que o médico e e iná io p opo cione aos donos dos animais in o mação cla a e objec i a sob e a exis ência des es pa asi as, o seu po encial zoonó ico e as medidas a oma , no sen ido de e i a uma e en ual ansmissão. O papel dos animais de companhia, como on e da in ecção, po C yp ospo idium spp., pa a o Homem, encon a-se, ainda, pouco escla ecido, sendo necessá ias in es igações epidemiológicas mais ab angen es e ap o undadas que possam cla i ica es e assun o. 3.2 ANIMAIS SILVÁTICOS DE VIDA LIVRE A in es igação ealizada, com o objec i o de con ibui pa a o conhecimen o sob e a oco ência da c ip ospo idiose, em animais sil á icos de ida li e, mos ou que, na al u a em que os animais es udados o am cap u ados, nenhum deles se encon a a a exc e a oocis os de C yp ospo idium spp.. No que diz espei o aos ca ní o os, não só o núme o de animais es udados oi mui o eduzido (13 aposas), como a sua cap u a se con inou a uma única ocasião, ac o es que limi am o alcance dos esul ados ob idos. O único abalho encon ado na li e a u a, sob e a IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 111 p esença de C yp ospo idium spp. em aposas, oi ealizado na egião de Wa wickshi e, no cen o da Ingla e a, e desc e e uma pe cen agem de in ecção de 9% (2/23) [S u dee e al., 1999]. Rela i amen e aos pequenos mamí e os, apesa do núme o de animais es udados e sido supe io ao dos ca ní o os, a sua cap u a oi ealizada, apenas, em ês ocasiões (Maio, Agos o e No emb o de 2003), ac o que não nos pe mi e ob e um quad o ep esen a i o da globalidade da si uação anual. Pa a além disso, não o am cap u ados animais du an e os meses de In e no, al u a em que se egis a maio p ecipi ação. A exc eção de C. pa um e C. mu is, po pequenos mamí e os, em sido documen ada po di e sos au o es, que u iliza am as ca ac e ís icas mo omé icas dos oocis os, como c i é io de iden i icação de espécie. Alguns desses au o es obse a am a iações empo ais, nos alo es de p e alência encon ados, an o en e di e en es al u as de um mesmo ano, como en e anos di e en es. Numa in es igação, conduzida na egião de Wa wickshi e, em Ingla e a, en e 1992 e 1997, S u dee e al. (2003) obse a am, não só uma a iação sazonal da p e alência da c ip ospo idiose em pequenos oedo es e insec í o os (Apodemus syl a icus, Cle h ionomys gla eolus, Mus domes icus, So ex a aneus e So ex minu us), com alo es mínimos de 17,8% (33/185), na P ima e a, e máximos, de 45,6% (139/305), no Ou ono, mas, ambém, uma a iação ao longo dos anos, com um máximo de 46,2% (54/117) egis ado em 1996, e um mínimo de 9,3% (8/86), encon ado em 1997. No Reino Unido, Webs e e MacDonald (1995) desc e e am, ambém, a a iação sazonal da p e alência da c ip ospo idiose em Ra us no egicus, endo egis ado alo es de 95% na P ima e a, 14% no Ve ão, 53% no Ou ono e 70% no In e no. Es a a iação sazonal oi, ambém, encon ada na p o íncia da Ca alunha, em Espanha, po To es e al. (2000), que, en e 1995 e 1997, obse a am, em se e espécies de oedo es e insec í o os (Apodemus la icollis, Apodemus syl a icus, Cle h ionomys gla eolus, C ocidu a ussula, Mus sp e us, Ra us a us e So ex a aneus), p e alências de c ip ospo idiose de 32,9% (30/91), no Ou ono e de 21,9% (34/155), na P ima e a. Na Polónia, Sisnki e al. (1993), desc e e am, em pequenos mamí e os, pe encen es às espécies Apodemus la icollis, Apodemus ag a ius, Cle h ionomys gla eolus, So ex a aneus e So ex minu us, a iação da p e alência de in ecção po C. pa um, du an e a es ação do Ou ono, em dois anos consecu i os, endo egis ado um alo de 29,2% (24/82), no ano de 1989 e de 12,9% (17/131), no ano seguin e. Es es esul ados demons am que as obse ações e ec uadas, em pe íodos de empo cu os, não são ep esen a i as da si uação global, sendo es a uma limi ação associada à in es igação que ealizámos. IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 112 O ac o de odos os animais cap u ados, no p esen e abalho, se em adul os pode á, ambém, jus i ica a ausência de in ecções po C yp ospo idium spp., na medida em que os animais jo ens são, eg a ge al, mais suscep í eis a es a in ecção. No Reino Unido, Quy e al. (1999) obse a am, em Ra us no egicus, jo ens e adul os, pe cen agens de in ecção po C. pa um, de 40% e 12%, espec i amen e. Também, na Polónia, Baje e al., 2002 obse a am, em ês espécies de oedo es (Apodemus la icollis, Cle h ionomys gla eolus e Mic o us a alis), maio p e alência de in ecção po C. pa um nos animais jo ens, do que nos adul os. Po im, não podemos exclui a in luência que as ca ac e ís icas climá icas e o og á icas, da egião onde os animais o am cap u ados, possam e ido nos esul ados nega i os que ob i emos. O Baixo Alen ejo em um clima sub-húmido a seco, ca ac e izado pela pouca p ecipi ação anual, que se concen a, p incipalmen e, nos meses de Ou ono e In e no. Segundo dados ecolhidos na es ação me eo ológica de Beja, o necidos pelo Ins i u o de Me eo ologia, a empe a u a média do a , egis ada en e Maio e Agos o de 2003, a iou, ap oximadamen e, en e 20ºC e 26ºC. Du an e os mesmos meses, a empe a u a mínima oscilou en e 11,5ºC e 18,5ºC, enquan o que a empe a u a máxima se si uou en e 27,3ºC e 35,7ºC. De salien a , ainda, que, pa a o mesmo pe íodo, e de aco do com a mesma on e, apenas se e i icou alguma p ecipi ação, du an e o mês de Maio, endo o alo egis ado sido ce ca de 10 mm. [Pi es e al., 2004; h p://www.me eo.p /In o macaoClima ica/Anos/Anos.h m, consul ado a 24 de Ab il de 2005]. No mês de No emb o de 2003, o am egis ados, pa a a empe a u a média do a e a p ecipi ação mensal o al, alo es comp eendidos nos in e alos de 12 a 14ºC e de 100 a 150 mm, espec i amen e [h p://web.me eo.p / esou ces/im/p odu os/clima/mapas/m o200311.jpg e h p://web.me eo.p / esou ces/im/p odu os/clima/mapas/m me200311.jpg, consul ados a 18 de Agos o de 2005]. As ele adas empe a u as, que se ize am sen i nes a egião, sob e udo nos meses de Ve ão, associadas à secu a do solo, em esul ado da ausência de p ecipi ação, cons i uem ac o es des a o á eis à sob e i ência dos oocis os, con ibuindo pa a a diminuição do núme o de oocis os iá eis exis en es no ambien e. Po ou o lado, não só a o og a ia pouco acen uada, dos locais es udados, como o ipo de bió opo, ca ac e izado po ege ação he bácea (juncos e g amíneas), sil ados e loend os, c iam condições que limi am a oco ência de esco imen os supe iciais de água, nas al u as em que se e i ica p ecipi ação. Pe an e o expos o, pode coloca -se a hipó ese de, nes a egião, em consequência dos ac o es acima e e idos, o ní el de ansmissão de C yp ospo idium spp. se eduzido. IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 113 No p esen e es udo, ealizado em pequenos mamí e os, na egião do Baixo Alen ejo, não oi obse ado nenhum animal com in ecção po C yp ospo idium spp.. Toda ia, os esul ados ob idos o am limi ados pelo ac o de a cap u a dos animais e sido ealizada num pe íodo de empo cu o e de o ma descon ínua, sendo necessá io p ocede a in es igações mais ap o undadas, de o ma a ob e esul ados ep esen a i os da si uação epidemiológica exis en e naquela egião. 3.3 ANIMAIS SILVÁTICOS EM CATIVEIRO Os esul ados da in es igação ealizada em mamí e os, ép eis e a es ca i os no Ja dim Zoológico de Lisboa, mos a am que, du an e o pe íodo em que deco eu o abalho, o núme o de animais a exc e a oocis os de C yp ospo idium spp. oi mui o baixo. En e os mamí e os es udados, o am encon ados oocis os, apenas, em duas amos as ecais, pe encen es a dois Bo ídeos – um bison e ame icano e um gnu de cauda b anca. Es es e am, ambos, adul os e não ap esen a am dia eia, obse ação conco dan e com as desc ições, e ec uadas po di e sos au o es, que dão con a do ac o de a in ecção po C yp ospo idium spp., em animais adul os, se , com equência, assin omá ica, [Majewska e al., 1997; Deng e Cli e , 1999; Gómez e al., 2000; Lou enço e al., 2000]. No Ja dim Zoológico de Ba celona, Gómez e al. (2000) e G acenea e al. (2002) já ha iam iden i icado oocis os de C yp ospo idium spp., nas ezes de bison es ame icanos. A in ecção po C yp ospo idium spp., em gnus de cauda b anca, oi, ambém, desc i a po M ambo e al. (1997), em 27% (7/26) dos animais es udados no pa que Nacional de Mikumi, na Tanzânia. A pe cen agem de amos as ecais posi i as, ob ida no p esen e abalho, pa a os uminan es a iodác ilos (2,3% – 2/87), oi idên ica à encon ada po Delgado (2000), ambém no Ja dim Zoológico de Lisboa, en e Se emb o de 1998 e Agos o de 1999, pa a o mesmo g upo de animais (2,1% – 8/388). Toda ia, ao con á io do sucedido no nosso abalho, aquela au o a es udou, não só animais adul os, mas, ambém, ecém-nascidos. Cinco dos oi o animais que Delgado (2000) encon ou pa asi ados inham menos de dois meses de ida. O ac o da c ip ospo idiose a ingi , com mais equência, animais jo ens encon a-se desc i o po di e sos au o es, que em gado domés ico [Olson e al., 1997a; Pe ei a da Fonseca e al., 2001; Izumiyama e al., 2001], que em animais de companhia [A ai e al., 1990; M ambo e al., 1991] e, ainda, em animais sil á icos [Kalishman e al., 1996; A will e al., 1997; Quy e al., 1999; Ricka d e al., 1999]. O nascimen o das c ias que Delgado (2000) iden i icou com c ip ospo idiose, acon eceu IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 114 no In e no, al u a em que a p ecipi ação é mais in ensa, le ando à p esença de águas de esco ência e poças de água, e en ualmen e con aminadas com oocis os, o que acili a a ansmissão do pa asi a. Pa a além disso, as condições de humidade e empe a u a, ca ac e ís icas des a es ação do ano, são a o á eis à sob e i ência dos oocis os no solo. Segundo in o mação disponibilizada pelo Ins i u o de Me eo ologia, no pe íodo comp eendido en e Se emb o de 2002 e Ma ço de 2003, a p ecipi ação mensal o al, egis ada em Lisboa, a iou en e o alo máximo de 193 mm (em No emb o de 2002) e o mínimo de 76 mm (em Ma ço de 2003) [h p://web.me eo.p /p /clima/clima.jsp, consul ado a 12 de Agos o de 2005]. À excepção do mês de Fe e ei o de 2003, os alo es de p ecipi ação, que se e i ica am naqueles se e meses, excede am, em média, 40,8 mm ( alo es mínimo e máximo de 7 mm e 79 mm, espec i amen e), os alo es médios mensais, egis ados en e 1961 e 1990. Apesa da ele ada plu iosidade e i icada, p incipalmen e en e Se emb o de 2002 e Ma ço de 2003, o núme o de in ecções po C yp ospo idium spp., iden i icado nos mamí e os es udados, oi mui o baixo. Es es esul ados suge em que, no Ja dim Zoológico de Lisboa, a con aminação ambien al é, p o a elmen e, pequena e que a limpeza dos ecin os e o maneio higio-sani á io dos animais são e icazes no con olo da ansmissão des e pa asi a. Com excepção da a a uga es ela indiana, que ha ia chegado de Singapu a e que se encon a a em qua en ena, não oi obse ada a exc eção de oocis os, po pa e de nenhum dos ép eis do Ja dim Zoológico de Lisboa, que o am al o do nosso es udo. Es es animais i em, em condições de empe a u a e humidade cons an es, em ecin os isolados, não só do ex e io como, ambém, de ou os animais. Es a si uação de isolamen o não é p opícia à in odução de pa asi as nos habi a s indi iduais, cons i uindo, p o a elmen e, uma das azões pela qual não o am encon ados oocis os de C yp ospo idium spp. nes e g upo de animais. A in ecção em a a ugas es ela já ha ia sido desc i a nos EUA, no “San Diego Wild Animal Pa k” [Heuschele e al., 1986], na “Wildli e Conse a ion Socie y”, em No a Io que [Raphael e al., 1997] e no Zoo de Louis ille [Xiao e al. 2004b]. Em elação às a es, apenas oi possí el ealiza uma única ecolha de ezes, o que acon eceu no mês de Agos o, al u a em que as condições de ele ada empe a u a e a ausência de p ecipi ação, não a o ecem a sob e i ência dos oocis os. Po es a azão, os esul ados ob idos, pa a es e g upo de animais, êm um alcance mui o limi ado. As ca ac e ís icas de acomodação dos animais em ca i ei o, em especial dos mamí e os, como a ida em g upo, ao a li e, em ecin os de e a ba ida e expos os aos elemen os IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 115 climá icos, pa icula men e, à chu a, são ac o es que podem a o ece a ansmissão da c ip ospo idiose. Con udo, a p esen e in es igação pa ece indica que es a é uma pa asi ose pouco equen e nos animais do Ja dim Zoológico de Lisboa es udados. No en an o, sendo a ansmissão zoonó ica uma das ias de in ecção do Homem, é impo an e, pa a a saúde pública, es uda a in ecção po C yp ospo idium spp. nos animais p esen es em locais públicos, como o Ja dim Zoológico de Lisboa, que ecebe, anualmen e, milha es de isi an es e, en e es es, pa icula men e, c ianças. 116 Capí ulo V CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE C RYPTOSPORIDIUM SPP. V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 117 1. INTRODUÇÃO A maio ia das in ecções po C yp ospo idium spp. são con i madas pela obse ação mic oscópica de oocis os do pa asi a, em amos as ecais. Toda ia, a semelhança mo omé ica exis en e en e as di e en es espécies pe encen es a es e géne o, não pe mi e que a sua iden i icação seja e ec uada po mic oscopia óp ica [Pe y, 2000; Fall e al., 2003]. Ao longo da úl ima década, assis iu-se à ampla u ilização das écnicas de biologia molecula , aplicadas ao es udo da epidemiologia de C yp ospo idium spp.. Com ecu so a écnicas de PCR, RFLP e sequenciação de DNA, en e ou as, endo como al o di e sos loci gené icos, oi possí el desen ol e mé odos que pe mi i am de ec a e di e encia as á ias espécies pe encen es a es e géne o [Peng e al., 1997; Spano e al., 1997b; Gibbons e al, 1998; Mo gan e al., 1998a; Spano e al., 1998b; Sulaiman e al., 1998; Cacciò e al., 1999; Xiao e al., 1999a, 1999c]. A aplicação des es mé odos a inúme os isolados, esponsá eis po in ecções humanas, em á ias egiões do Mundo, pe mi iu, assim, conhece a di e sidade de espécies de C yp ospo idium, in ec an es pa a o Homem. Apesa das espécies C. pa um e C. hominis se em as que mais se encon am associadas à c ip ospo idiose humana, sabe-se, hoje, que ou as, como C. elis, C. meleag idis, C. canis, C. mu is, C. suis e C yp ospo idium genó ipo ce o podem, ambém, se esponsá eis pela in ecção no Homem [Peng e al., 1997; Spano e al., 1997b; Gibbons e al, 1998; Mo gan e al., 1998a; Spano e al., 1998a, 1998b; Sulaiman e al., 1998; Cacciò e al., 1999; McLauchlin e al., 1999; Pieniazek e al., 1999; Al es e al., 2000, 2001a; Guyo e al., 2001; Xiao e al., 2001a; Ong e al., 2002; Cama e al., 2003; Ma os e al., 2004]. Com o objec i o de iden i ica as espécies de C yp ospo idium, esponsá eis pela c ip ospo idiose numa população de in ec ados po VIH, em Po ugal, os isolados de ec ados, po diagnós ico pa asi ológico, no decu so do p esen e abalho, o am ca ac e izados po PCR, RFLP e/ou sequenciação de qua o loci gené icos – COWP, DHFR, TRAP-C1 e SSU- RNA. No genoma de C yp ospo idium spp., exis em cinco cópias des e úl imo gene e uma cópia dos es an es ês [Vásquez e al., 1996; Le Blancq e al., 1997; Spano e al., 1997a, 1998c]. Le Blancq e al. (1997) es uda am, num isolado bo ino, pe encen e à espécie C. pa um, a o ganização e a es u u a dos genes que codi icam o RNA, endo obse ado, nas cinco cópias do ácido desoxi ibonucleico ibossómico ou DNA (sigla anglo-saxónica pa a “ ibosomal deoxy ibonucleic acid”), a exis ência de duas sequências nucleo ídicas dis in as, que denomina am de A e B. Es es au o es e i ica am que, das cinco cópias do DNA, qua o V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 118 ap esen a am a sequência nucleo ídica A e uma a sequência B. A di e ença nucleo ídica en e as sequências A e B do DNA localiza-se, essencialmen e, nas egiões ITS, embo a enham, ambém, sido iden i icadas pequenas dissemelhanças nos genes que codi icam as subunidades g ande (28S), pequena (18S) e 5.8S do RNA [Le Blancq e al., 1997]. Em C. pa um, as sequências das cópias A e B do gene que codi ica a subunidade pequena (SSU) do RNA, di e em, en e si, po uma delecção de ês nucleó idos e po duas subs i uições de um nucleó ido [Xiao e al., 1999b]. Es as di e enças não al e am os pe is de es ição dos p odu os de PCR, ob idos po hid ólise com as endonucleases SspI e VspI, que u ilizámos na análise de RFLP. Em C. elis e em C. hominis, o am, ambém, iden i icadas sequências nucleo ídicas dis in as nas di e en es cópias do gene que codi ica a SSU- RNA. Em C. elis, na sequência da cópia B, oi obse ada, ela i amen e à da cópia A, uma inse ção, uma delecção e uma subs i uição, odas elas, de um único nucleó ido. A subs i uição nucleo ídica que se e i ica em C. elis, na cópia B do gene SSU- RNA, esul a na c iação de um local de es ição adicional pa a a endonuclease VspI, o iginando, assim, pe is de es ição dis in os pa a os dois ipos de cópias des e gene [Xiao e al., 1999b]. Ao in és do desc i o em C. pa um, nos isolados de C. elis, não oi obse ada a p opo ção de qua o cópias da sequência A pa a, apenas, uma da sequência B [Xiao, L., 2005, comunicação pessoal]. Em C. hominis, a di e ença en e a sequência das cópias do gene que codi ica a SSU- RNA, consis e em duas subs i uições de um nucleó ido e na a iação do núme o de esíduos de imina (6T, 8T, 10T, 11T ou 12T), p esen es numa egião poli-T do gene. Ao con á io do que sucede em C. elis, es as di e enças não al e am os pe is de es ição dos agmen os ampli icados, que se ob êm com as endonucleases u ilizadas na análise de RFLP, sendo de ec adas, somen e, po sequenciação dos p odu os de PCR [Xiao e al., 1999b; Dalle e al., 2003]. Xiao e al. (1999b) alinha am as sequências das di e en es cópias do gene SSU- RNA de C. pa um, C. hominis e C. elis, com as de ou as espécies e genó ipos de C yp ospo idium e e i ica am, po análise ilogené ica do alinhamen o de sequências esul an e, que a elação exis en e, en e as á ias espécies e genó ipos do géne o C yp ospo idium, não é al e ada pelas dissemelhanças na sequência nucleo ídica das di e sas cópias do gene que codi ica a SSU- RNA. V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 119 2. RESULTADOS No conjun o dos qua o loci gené icos es udados (SSU- RNA, COWP, DHFR e TRAP- C1), oi possí el ampli ica , po PCR, o DNA genómico de 50 isolados de C yp ospo idium spp.. Des e g upo azem pa e seis dos 15 isolados, iden i icados en e Dezemb o de 1994 e Agos o de 1997, que se encon a am conse ados em MIF, odos os 26 isolados, iden i icados en e Se emb o de 1997 e Maio de 2001, que se encon a am conse ados em dic oma o de po ássio a 5% e odos os 18 isolados, iden i icados en e Junho de 2001 e Janei o de 2005, que o am ca ac e izados, logo após a sua de ecção. No quad o XVI, encon am-se esumidos, pa a cada locus es udado, os esul ados da ampli icação, po PCR, do DNA des es isolados de C yp ospo idium spp.. QUADRO XVI – Resul ados da ampli icação, po PCR, do DNA dos isolados de C yp ospo idium spp. iden i icados numa população po uguesa com in ecção po VIH N.º DE ISOLADOS COM AMPLIFICAÇÃO POSITIVA ISOLADOS (n.º es udado) SSU- RNA COWP DHFR TRAP-C1 Dez.94-Ago.97 (MIF) (n = 15) 6 (40,0%) 4 (26,7%) 2 (13,3%) 2 (13,3%) Se .97-Mai.01 (K2C 2O7) (n = 26) 26 (100%) 22 (84,6%) 20 (76,9%) 16 (61,5%) Jun.01-Jan.05 (n = 18) 18 (100%) 13 (72,2%) 13 (72,2%) 11 (61,1%) To al (n = 59) 50 (84,7%) 39 (66,1%) 35 (59,3%) 29 (49,2%) No quad o XVI é possí el obse a que, independen emen e do gene al o, a pe cen agem de ampli icação do DNA dos isolados que se encon a am conse ados em MIF, oi mui o in e io à daqueles que se encon a am p ese ados em dic oma o de po ássio ou que o am ca ac e izados logo após a sua iden i icação. O mé odo de PCR pa a o gene SSU- RNA, oi o que pe mi iu a ampli icação do DNA de um maio núme o de pa asi as, seguindo-se-lhe, po o dem dec escen e, os genes COWP, DHFR e TRAP-C1. Se exclui mos os isolados que se encon a am p ese ados em MIF, a pe cen agem de ampli icação pa a o QUADRO XIX – Dados demog á icos, clínicos, labo a o iais e epidemiológicos dos doen es com c ip ospo idiose, cujos isolados o am ca ac e izados no p esen e abalho (con inuação) ISOLADO DATA IDADE SEXO RAÇA TRANSMISSÃO VIH LINFÓCITOS CD4+ (céls/µl) CARGA PARASITÁRIA DIARREIA OUTROS PARASITAS INTESTINAIS EVOLUÇÃO CLÍNICA OUTROS ESPÉCIE CH.84 Ou -00 36 M – Homo 20 II S Gia dia spp. (oi o meses de e olução), Mic ospo idia Faleceu de c ip ospo idiose (2001) – C. meleag idis CH.86 No -00 34 M – Tóxico 19 II S N Melho ou – C. pa um CH.87 Dez-00 27 M Caucasiana Tóxico 3 II S Mic ospo idia Faleceu de c ip ospo idiose – C. pa um CH.88 Jan-01 40 F Neg a He e o 22 I S N Melho ou – C. elis CH.96 Mai-01 55 M Caucasiana He e o 16 IV S N Melho ou – C. pa um CH.104 Jan-02 24 F Cigana Tóxico 17 II S N – – C. hominis CH.105 Jan-02 11 M Neg a Ve ical <15% (39) I N Gia dia spp. (um mês an es), Mic ospo idia Melho ou – C. hominis CH.108 Ma -02 58 F Neg a He e o 13 IV S N Faleceu – C. hominis CH.113 Mai-02 40 F Neg a He e o 6 III S N Melho ou Residen e em Angola C. hominis CH.128 Ou -02 30 M Caucasiana Tóxico 7 IV S Mic ospo idia Melho ou – C. pa um CH.129 Ou -02 29 M Caucasiana He e o 23 II S Mic ospo idia Melho ou – C. pa um CH.130 Ou -02 7 M Caucasiana Ve ical 19% (213) I S (c ónica) Mic ospo idia Melho ou Con ac o com ga os no ambien e domés ico C. elis CH.151 Mai-03 40 M Caucasiana Tóxico – III S N Melho ou – C. hominis CH.170 No -03 30 M Caucasiana Tóxico 0 IV S N Faleceu – C. hominis CH.176 Jan-04 42 M Caucasiana He e o 37 II S (c ónica) Mic ospo idia – – C. pa um CH.182 Mai-04 38 M Caucasiana Homo 42 IV S N – – C. pa um CH.183 Mai-04 42 M Caucasiana He e o 57 III S (c ónica) Mic ospo idia (qua o meses an es) – – C. pa um CH.187 Mai-04 52 M Caucasiana He e o 7 I S Mic ospo idia – Residen e em Angola C. elis CH.190 Mai-04 40 M Neg a He e o 24 I S N – – C. hominis CH.191 Jun-04 41 M Neg a He e o 7 II S N – – C. hominis CH.198 Jul-04 38 M Caucasiana Tóxico 20 I S N – – C..hominis CH.201 No -04 50 M Caucasiana He e o 125 IV S Gia dia spp. – – C. pa um CH.203 Jan-05 >18 M Neg a Tóxico 50-100 II S N Melho ou – C. pa um M: masculino, F: eminino; “–“: in o mação desconhecida; Homo: homossexual; He e o: he e ossexual; Tóxico: oxicodependen e; S: sim; N: não V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 127 Tendo po base odos os casos de c ip ospo idiose humana iden i icados po diagnós ico pa asi ológico, na Unidade de P o ozoá ios Opo unis as/VIH e Ou as P o ozooses, no pe íodo comp eendido en e Janei o de 1995 e Janei o de 2005, oi elabo ado o g á ico da igu a 12, onde se pode obse a a dis ibuição do núme o de casos de c ip ospo idiose em unção dos meses do ano. Os esul ados ep esen ados nes e g á ico mos am que, pa a a o alidade dos anos conside ados, os meses de Janei o e Maio o am aqueles em que se e i icou maio núme o casos de c ip ospo idiose, seguindo-se-lhe os meses de Junho, Ou ub o e No emb o; o meno núme o de in ecções oi egis ado nos meses de Ab il e de Se emb o. No g á ico da igu a 13, é ap esen ada, pa a o mesmo pe íodo, a dis ibuição do o al mensal de casos de c ip ospo idiose, em unção da espécie causado a da in ecção, nos casos em que a sua iden i icação oi possí el. Es a ep esen ação g á ica mos a que, pa a o pe íodo conside ado, as in ecções po C. hominis oco e am ao longo de odo o ano, à excepção dos meses de Fe e ei o, Ab il e Agos o, endo ap esen ado picos em Janei o e Maio. Po seu lado, os casos de c ip ospo idiose de idos a C. pa um concen a am-se en e os meses de Ou ub o e Junho, excep uando o mês de Fe e ei o, endo sido e i icados picos nos meses de Janei o, Maio, Junho, Ou ub o e No emb o. Nos meses de Fe e ei o e de Agos o, apesa de não e em sido obse ados casos de c ip ospo idiose de ido a C. hominis ou a C. pa um, o am egis adas in ecções po C. meleag idis. FIGURA 12 – Rep esen ação g á ica do núme o de casos de c ip ospo idiose, diagnos icados en e Janei o de 1995 e Janei o de 2005, em unção dos meses do ano 0 1 2 3 4 N.º de casos de c ip ospo idiose Jan Fe Ma Ab Mai Jun Jul Ago Se Ou No Dez 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 128 FIGURA 13 – Rep esen ação g á ica do o al de casos de c ip ospo idiose, po mês, diagnos icados en e Janei o de 1995 e Janei o de 2005, em unção da espécie de C yp ospo idium spp. Em i ude do eduzido núme o de casos anuais de c ip ospo idiose es udados, não se e i ica am as condições necessá ias pa a a ealização de qualque in e ência es a ís ica, que pe mi isse a alia a e en ual a iação sazonal da in ecção humana pelas di e sas espécies de C yp ospo idium. Po im, encon a-se desc i a no quad o XX a dimensão média dos oocis os de cada espécie de C yp ospo idium spp., de aco do com os dados ob idos po mic oscopia óp ica. QUADRO XX – Dimensão dos oocis os pe encen es às espécies de C yp ospo idium, iden i icadas na população humana es udada ESPÉCIE DIMENSÃO MÉDIA DOS OOCISTOS (µm) C. pa um 4,97 × 4,42 C. hominis 4,91 × 4,36 C. elis 4,13 × 3,81 C. meleag idis 4,72 × 4,52 0 1 2 3 4 5 6 7 N.º de casos de c ip ospo idiose Jan Fe Ma Ab Mai Jun Jul Ago Se Ou No Dez C. pa um C. hominis C. elis C. meleag idis V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 129 3. DISCUSSÃO No conjun o dos qua o loci es udados (SSU- RNA, COWP, DHFR e TRAP-C1), oi possí el ca ac e iza , gene icamen e, 84,7% dos isolados de C yp ospo idium spp. de o igem humana (quad o XVI). Es a pe cen agem é, no en an o, um alo global, que não e lec e as assime ias obse adas, que en e di e en es g upos de isolados, que en e os di e sos loci. Con o me se obse a no quad o XVI, a pe cen agem de sucesso da PCR, no g upo de pa asi as que se encon a a conse ado em MIF, oi, no mínimo, duas ezes e meia in e io à obse ada no g upo dos que o am p ese ados em dic oma o de po ássio ou daqueles cuja ca ac e ização molecula oi ealizada logo após a sua iden i icação pa asi ológica. Es a si uação es á, com ce eza, elacionada com o ac o de os oocis os pe encen es ao p imei o g upo e em sido conse ados, du an e longo empo, num meio con endo o maldeído (MIF). O o maldeído é um compos o o gânico, amplamen e u ilizado na conse ação de ecidos e seus componen es. No en an o, es udos ealizados sob e as eacções químicas que oco em en e es e compos o e os ácidos nucleicos, e ela am que o o maldeído não só p o oca a deg adação das cadeias de DNA, a a és da o mação de ligações c uzadas po pon es de me ileno, da o mação de nucleó idos apu ínicos e api imidínicos e da cisão da ligação os odies e da cadeia nucleo ídica, como inibe a sua epa ação [G a s om e al., 1983; Douglas e Roge s, 1998; S ini asan e al., 2002]. Como consequência des as eacções, o DNA ex aído de ecidos p ese ados em o maldeído, encon a-se mui o agmen ado e ap esen a um peso molecula mui o baixo, o que comp ome e, se iamen e, a sua ampli icação po PCR [Douglas e Roge s, 1998; S ini asan e al., 2002]. Gillespie e al. (2002), compa a am, po PCR, a qualidade do DNA ex aído de amos as de ecido humano p ese adas em o maldeído e nou o ipo de conse an es, endo, no úl imo caso, obse ado maio acilidade de ampli icação do DNA do que no p imei o. Resul ados idên icos o am ob idos po Douglas e Roge s (1998), que desc e e am o insucesso da PCR em amos as de ecidos ege ais a adas com o maldeído, ao con á io do que acon eceu na ampli icação do DNA de amos as idên icas não a adas. No que espei a à ampli icação dos qua o loci, a PCR do locus SSU- RNA oi a que pe mi iu ampli ica o DNA de um maio núme o de isolados, seguindo-se-lhe, po o dem dec escen e, as dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1 (quad o XVI). Pa a os isolados que não se encon a am conse ados em MIF, as axas de ampli icação dos genes SSU- RNA, COWP, DHFR e TRAP-C1, o am de 100% (44/44), 79,5% (35/44), 75% (33/44) e 61,4% V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 130 (27/44), espec i amen e. Sulaiman e al. (1999) compa a am os mesmos qua o mé odos de PCR, endo iden i icado como mais sensí eis os que ampli ica am os genes SSU- RNA e DHFR, seguidos, po o dem dec escen e, pelos dos loci COWP e TRAP-C1. McLauchlin e al. (1999) obse a am, pa a as mesmas PCR’S dos genes TRAP-C1 e COWP e pa a ou a, di igida pa a o locus SSU- RNA, mas com oligonucleó idos iniciado es di e en es dos u ilizados no p esen e abalho, sensibilidades de 66% (139/211), 91% (191/211) e 97% (204/211), espec i amen e, alo es não mui o díspa es dos ob idos no p esen e abalho. Resul ados idên icos o am ob idos, ainda, po Ped aza-Díaz e al. (2001b), pa a es es mesmos mé odos. A maio sensibilidade, exibida pela ampli icação do gene SSU- RNA, não se á alheia à exis ência, no genoma de C yp ospo idium spp., de cinco cópias des e gene con a, apenas, uma dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1 [Vásquez e al., 1996; Le Blancq e al., 1997; Spano e al., 1997a, 1998c]. Des e modo, no início da PCR, pa a um mesmo núme o de oocis os, o núme o de cadeias al o do gene SSU- RNA disponí el é cinco ezes supe io ao do p esen e pa a os es an es genes, o que se aduz no aumen o da sensibilidade da sua ampli icação. A sensibilidade da PCR é, ambém, de e minada pelo ipo de eacção de ampli icação ealizada, na medida em que as PCR’S “nes ed” ap esen am, eg a ge al, maio sensibilidade do que as simples. O mé odo de PCR “nes ed”, pa a ampli icação do gene SSU- RNA, ap esen ou sensibilidade supe io à dos mé odos de PCR simples, esponsá eis pela ampli icação dos genes COWP e TRAP-C1. Con a iamen e ao espe ado e aos esul ados ob idos nos isolados de bo inos e de uminan es do Ja dim Zoológico de Lisboa ( ide capí ulo VI, quad o XXI), e, ainda, aos desc i os po Sulaiman e al. (1999), nos isolados humanos, a pe cen agem de sucesso de ampli icação do gene DHFR, po um mé odo de PCR “nes ed”, oi in e io à obse ada pa a a PCR simples do gene COWP. Con udo, es a si uação pode, em pa e, se explicada, pelo ac o da PCR do gene COWP e ampli icado o DNA de alguns pa asi as da espécie C. elis, o que não sucedeu com a PCR do gene DHFR. O núme o de c ip ospo ídeos p esen es nas amos as ecais cons i uiu ou o dos ac o es com in luência no sucesso dos mé odos de PCR, em pa icula , nos dos genes DHFR e TRAP-C1. Nes es dois loci, a pe cen agem de insucesso da PCR, obse ada nas amos as ecais com ca ga pa asi á ia baixa (ní el I e II), oi ce ca de duas ezes supe io (20% e 40%, espec i amen e) à da ob ida nas ezes com ca ga pa asi á ia de ní el III e IV (10,5% e 21,1%, espec i amen e), ac o que, con udo, não se e i icou na ampli icação do locus COWP. A in luência da ca ga pa asi á ia ecal, no sucesso da PCR, oi, igualmen e, desc i a po McLauchlin e al. (1999), que V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 131 obse a am, na ampli icação dos genes COWP e TRAP-C1, o aumen o da sensibilidade da eacção, p opo cional ao núme o de oocis os p esen es nas amos as ecais. O sucesso de cada mé odo de PCR é, ambém, medido em unção da sua capacidade de ampli icação do DNA das di e en es espécies de C yp ospo idium, o que depende, undamen almen e, da escolha dos oligonucleó idos iniciado es. Pa a que o DNA de odas as espécies e genó ipos de C yp ospo idium seja ampli icado, é essencial a ausência de polimo ismos do DNA al o, na egião de ligação dos oligonucleó idos iniciado es. No p esen e abalho, apenas os mé odos de ampli icação dos genes SSU- RNA e COWP pe mi i am ampli ica o DNA das qua o espécies iden i icadas na população es udada (quad os XVII e XVIII). Po ém, no caso do gene COWP, não só a ampli icação do DNA de C. elis oco eu em, apenas, 40% (2/5) dos isolados, como o endimen o da eacção oi mui o baixo. Jiang e Xiao (2003) compa a am di e en es mé odos de PCR-RFLP (SSU- RNA, COWP, DHFR, TRAP-C1, TRAP-C2, HSP70), no sen ido de a alia a sua capacidade de iden i ica as se e espécies de C yp ospo idium in ec an es pa a o Homem, endo e i icado que, apenas, dois mé odos, ambos baseados na ampli icação de um agmen o do gene SSU- RNA, pe mi iam a sua de ecção e/ou di e enciação. Xiao e al., (2000b) consegui am ampli ica , com o mé odo de PCR do locus COWP, desen ol ido po Spano e al. (1997b), o DNA de C. elis o que, no en an o, acon eceu com baixo endimen o e, apenas, em oocis os pu i icados. Es es au o es de e mina am a sequência nucleo ídica do gene COWP em á ias espécies de C yp ospo idium, endo obse ado g ande a iabilidade en e sequências de di e en es espécies, em pa icula , na egião de ligação dos oligonucleó idos iniciado es, sendo es a a azão da g ande di iculdade da ampli icação do gene COWP, em espécies como C. elis, C. canis, C. mu is ou C. ande soni. Xiao e al. (2000b) consegui am ampli ica o gene COWP des as espécies, somen e, com DNA isolado a pa i de um núme o supe io a 100 oocis os pu i icados. Tan o o mé odo de ampli icação do gene COWP, como o dos genes TRAP-C1 e DHFR, o am desen ol idos com base na sequência nucleo ídica das espécies C. hominis e C. pa um. Assim, a ampli icação do DNA de espécies cuja sequência nucleo ídica, na zona de ligação dos oligonucleó idos iniciado es, seja dis in a da daquelas espécies, ica comp ome ida [Mo gan e al., 2000a; Xiao e al., 2000b]. Po im, há, ainda, a e e i o caso do gene TRAP-C1, no qual, apesa de se e e i icado a ampli icação do DNA dos isolados pe encen es à espécie C. meleag idis, a eduzida a iabilidade da egião ampli icada, não possibili ou a dis inção en e es es pa asi as e os pe encen es à espécie C. hominis. Pe an e o V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 132 expos o, a u ilidade dos mé odos de ampli icação dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1, na iden i icação das espécies de C yp ospo idium que causam in ecção humana e daquelas p esen es em amos as ambien ais, encon a-se limi ada, não só pela baixa sensibilidade da eacção, como, ambém, pelo ac o de não pe mi i em a ampli icação ou a di e enciação do DNA das á ias espécies e genó ipos des e pa asi a. Em odos os isolados pe encen es à espécie C. elis, iden i icados no p esen e abalho, a isualização, em gel de aga ose, dos agmen os de es ição do gene SSU- RNA, ob idos po hid ólise com a endonuclease VspI, pe mi iu iden i ica a p esença dos dois ipos de cópias des e gene. Em ês isolados, oi obse ado o p edomínio do pe il de es ição co esponden e à cópia A do gene que codi ica a SSU- RNA, enquan o que, nou os dois, o pe il dominan e dizia espei o à cópia B daquele gene. Nes es cinco isolados, a di e ença de in ensidade, obse ada nos agmen os de es ição, co esponden es aos dois ipos de cópia do gene SSU- RNA, suge e a exis ência de a iabilidade na p opo ção do núme o de cópias A e B, p esen es em cada um ( igu a 10). Conside ando os doen es com c ip ospo idiose nos quais oi iden i icada a espécie esponsá el pela in ecção, 52% (26/50) encon a am-se pa asi ados po C. pa um, 32% (16/50) po C. hominis, 10% (5/50) po C. elis e 6% (3/50) po C. meleag idis (quad o XVII). Es es núme os põem em e idência o ac o de mais de me ade dos doen es se encon a em in ec ados po C. pa um. O p edomínio da in ecção humana po es a espécie em, ambém, sido obse ado em di e sos países do Con inen e Eu opeu. Es udos ealizados em F ança, no Reino Unido, na I landa do No e e na Suíça, dão con a de pe cen agens de in ecção humana, de idas a C. pa um, de 47,8% (22/46), 61,5% (1.049/1.075), 89,7% (35/39) e 53,8% (7/133), espec i amen e, con a alo es de 30,4% (14/46), 37,8% (645/1.075), 10,3% (4/39) e 15,4% (2/13), pa a a in ecção po C. hominis [McLauchlin e al., 2000; Mo gan e al., 2000a; Guyo e al., 2001; Lowe y e al., 2002]. Pelo con á io, nou os Con inen es, obse a-se maio núme o de in ecções de idas a C. hominis. Em dois es udos epidemiológicos, ealizados no Pe u, um em c ianças e ou o em adul os in ec ados po VIH, as pe cen agens de in ecção po C. hominis o am de 78,8% (67/85) e 66,9% (204/302), espec i amen e, con a alo es de 9,4% (8/85) e 11,2% (34/302) pa a a in ecção po C. pa um [Xiao e al., 2001a; Cama e al., 2003]. Nos Es ados Unidos da Amé ica, a ca ac e ização molecula de isolados de C yp ospo idium spp., iden i icados em casos espo ádicos e em su os, e elou pe cen agens de in ecção po C. hominis e C. pa um de 79,5% (35/44) e V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 133 20,5% (9/44), espec i amen e [Sulaiman e al., 1998]. No Malawi, no Uganda e na Tailândia, a pe cen agem de casos de c ip ospo idiose humana, a ibuída à espécie C. hominis, oi de 95,3% (41/43), 73,4% (326/444) e 50% (17/34), espec i amen e, enquan o que, pa a a in ecção po C. pa um, oi de 4,6% (2/43), 19,1% (85/444) e 14,7% (5/34) [Ga ei e al., 2002b; Peng e al., 2003a; Tumwine e al., 2003]. No que espei a à in ecção pelas espécies C. elis e C. meleag idis, as pe cen agens de in ecção, encon adas na população po uguesa es udada, de 10% (5/50) e de 6% (3/50), espec i amen e, são idên icas às de 13% (6/46) e de 6,5% (3/46) encon adas, em F ança, po Guyo e al. (2001), pa a as mesmas espécies. No Reino Unido, McLauchlin e al. (2000) encon a am uma pe cen agem de casos de c ip ospo idiose humana de idos a C. meleag idis de 0,46% (5/1705). Num es udo ealizado, em c ianças, no Uganda, a pe cen agem de in ecção po C. meleag idis, egis ada po Tumwine e al. (2003), oi de 1,1% (5/444). Nas in es igações ealizadas nes es dois úl imos países, não o am iden i icadas in ecções de idas a C. elis. No en an o, a ca ac e ização gené ica dos isolados oi e ec uada pela écnica de PCR-RFLP, aplicada ao gene COWP, que, como já oi e e ido, não pe mi e a de ecção do DNA de odos os pa asi as pe encen es a es a espécie. Con a iamen e ao obse ado nos es udos acima desc i os, nou os países, o núme o de casos de in ecção po C. meleag idis oi mais ele ado. No Pe u, em doen es in ec ados po VIH, as pe cen agens de c ip ospo idiose, de idas a C. meleag idis e a C. elis, o am de 12,6% (38/302) e 3,3% (10/302), espec i amen e [Cama e al., 2003]. Na Tailândia, numa população semelhan e, os alo es encon ados, pa a es as duas espécies, o am de 20,6% (7/34) e 8,8% (3/34), espec i amen e [Ga ei e al., 2002b]. Pa a além das qua o espécies já e e idas, di e sos au o es desc e e am, ainda, in ecções humanas causadas pelas espécies C. mu is, C. canis e C. suis e po C yp ospo idium genó ipo ce o [Pieniazek e al., 1999; Guyo e al., 2001; Xiao e al., 2001a; Ga ei e al., 2002a; Ong e al., 2002; Cama e al., 2003; Ga ei e al., 2003]. Es as espécies e genó ipo não o am, po ém, encon adas na população po uguesa es udada. O signi icado epidemiológico da di e en e dis ibuição das á ias espécies de C yp ospo idium esponsá eis pela in ecção humana, em di e sas zonas geog á icas, é, ainda, desconhecido, embo a se pense que possa es a elacionado com a exis ência de a iadas on es de in ecção e/ou se o e lexo de di e enças na con ibuição de cada modo de ansmissão, pa a a epidemiologia da c ip ospo idiose, numa dada egião. A oco ência, nos países eu opeus, de um maio núme o de in ecções po C. pa um, le a a supo a exis ência, não só de um ele ado ese a ó io zoonó ico des a espécie, como de um p edomínio da ansmissão zoonó ica, sob e a V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 134 an oponó ica [Xiao e al., 2000c; Thompson, 2003]. Es udos epidemiológicos, conduzidos no Reino Unido, mos a am que os casos espo ádicos, de idos a C. pa um, se encon am associados, sob e udo, ao con ac o com gado domés ico e ao consumo de água da ede de abas ecimen o não e ida, enquan o que os de idos a C. hominis são mais equen es em indi íduos que iaja am pa a o a do País ou que es i e am em con ac o di ec o com pessoas pa asi adas [McLauchlin e al., 2000; Ped aza-Díaz e al., 2001b; Goh e al., 2004]. Num es udo caso- con olo, sob e a c ip ospo idiose espo ádica em Ingla e a e no País de Gales, Hun e e al. (2004) encon a am uma associação, es a is icamen e signi ica i a, en e a in ecção po C. hominis e a deslocação ecen e ao es angei o ou o p ocede à muda de aldas em c ianças com idade in e io a cinco anos. Os mesmos au o es encon a am, ainda, o mesmo ipo de associação, en e a in ecção po C. pa um e o con ac o com gado domés ico. O ac o de as medidas adop adas, no Reino Unido, pa a o con olo da epidemia de eb e a osa, em 2001, e em ido como consequência um dec éscimo do núme o de casos de c ip ospo idiose humana po C. pa um, sus en a a hipó ese da impo ância da ansmissão zoonó ica naquele País [Sme don e al., 2003; Xiao e Ryan, 2004]. Num es udo ealizado na Suíça, em c ianças com dia eia, Glaese e al. (2004) obse a am que a in ecção po C. hominis e a esponsá el po 90% (9/10) dos casos de c ip ospo idiose associados a iagens pa a o a do País. Os dados epidemiológicos ecolhidos, ao longo do p esen e abalho, não o am su icien es pa a pe mi i a associação en e a in ecção po de e minada espécie de C yp ospo idium spp. e os ac o es de isco que se sabe pode em a o ece a sua ansmissão. A in o mação sob e a pe manência no es angei o, nos meses que an ecede am o diagnós ico, apenas oi disponibilizada pa a cinco doen es. Des es, ês in ec ados po C. hominis, um po C. pa um e ou o po C. elis, qua o ha iam eg essado de Angola (dois deles e am esiden es nes e País) e um da Guiné-Bissau (quad o XIX). Nos dois doen es, que se sabia esidi em em Angola, a c ip ospo idiose não pode, con udo, se conside ada como in ecção do iajan e. Quan o aos es an es ês doen es, odos eles a icanos, desconhece-se se e iam esidência em Angola e na Guiné-Bissau ou se a chegada a Po ugal se e á e i icado na sequência da deslocação àqueles países. No que se e e e ao con ac o com gado domés ico ou com animais de companhia, apenas oi conseguida a in o mação de que um dos doen es, com in ecção po C. elis, inha con ac o com ga os, no seu ambien e domés ico. Con udo, não oi possí el ealiza um exame pa asi ológico às ezes desses animais, pa a a e igua se es a iam a exc e a oocis os. V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 135 A a iação sazonal, do núme o de casos de c ip ospo idiose humana encon a-se bem desc i a em países, como os EUA ou o Reino Unido. Nos EUA, e i ica-se que o núme o de casos de c ip ospo idiose no i icados egis a um aumen o en e os meses de Junho e Ou ub o, o que os epidemiologis as associam à p á ica de ac i idades ao a li e, pa icula men e à u ilização de água de ec eio ( ios, lagos, piscinas) [Die z e al., 2000; Hla sa e al., 2005]. No Reino Unido, McLauchlin e al. (2000) e Ped aza-Díaz e al. (2001b), obse a am a exis ência de dois picos de oco ência da c ip ospo idiose, um du an e a P ima e a, que se encon a associado à in ecção po C. pa um, de ido ao aumen o dos casos de c ip ospo idiose no gado domés ico na época do pa o e, ou o, no im do Ve ão e início do Ou ono, associado à in ecção po C. hominis e a deslocações pa a o a do País. No que espei a ao p esen e abalho, a obse ação das igu as 12 e 13 e ela a exis ência de picos do núme o de casos de c ip ospo idiose, sob e udo, nos meses de Janei o e Maio, mas, ambém, nos de Junho, Ou ub o e No emb o. Enquan o que as in ecções de idas a C. hominis o am egis adas em odas as es ações do ano, o mesmo não se e i icou com as causadas po C. pa um, que não o am obse adas du an e os meses de Ve ão (en e Julho e Se emb o). Ainda, enquan o que a c ip ospo idiose po C. hominis e idencia uma ansmissão mais ou menos cons an e, des acando-se, somen e, dois picos de in ecção, um em Janei o e ou o em Maio, os casos de idos a C. pa um pa ecem egis a maio núme o anual de picos de in ecção (Janei o, Maio, Junho, Ou ub o e No emb o). Dado que o núme o de casos anuais de c ip ospo idiose es udado oi mui o eduzido, desconhece-se se es as obse ações cons i uem, ou não, o e lexo da ealidade epidemiológica do nosso País. Pa a além disso, ambém não dispomos de dados epidemiológicos su icien es que nos pe mi am in e p e a e undamen a as a iações na dis ibuição empo al dos casos de c ip ospo idiose, acima desc i as. A análise dos esul ados da iden i icação das espécies de C yp ospo idium, em unção da ca ga pa asi á ia exc e ada pelos doen es, mos ou que odos aqueles com in ecção po C. elis ou C. meleag idis exibiam ca gas pa asi á ias de ní el I ou II, enquan o que os doen es que exc e a am maio núme o de oocis os (ní el III ou IV) se encon a am pa asi ados po C. hominis ou po C. pa um (quad o XIX). A compa ação dos casos de in ecção de idos a es as duas úl imas espécies e elou, ainda, que a pe cen agem de in ec ados po C. hominis e com ele ada ca ga pa asi á ia (ní el III ou IV) – 50% (8/16) – oi ligei amen e supe io à dos pa asi ados po C. pa um – 46,2% (12/26). No Reino Unido, McLauchlin e al. (1999) e i ica am que 52,7% (39/74) dos in ec ados po C. hominis exibiam ca ga pa asi á ia