Perfil de resistência aos antibióticos e caracterização molecular de estirpes resistentes de Neisseria gonorrhoeae isoladas numa população de homens que têm sexo com homens da área de Lisboa

PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ESTIRPES RESISTENTES DE Neisse ia gono hoeae ISOLADAS NUMA POPULAÇÃO DE HOMENS QUE TÊM SEXO COM HOMENS DA ÁREA DE LISBOA JOANA LOURENÇO MESSIAS CALADO DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM MICROBIOLOGIA MÉDICA Janei o 2016 PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ESTIRPES RESISTENTES DE Neisse ia gono hoeae ISOLADAS NUMA POPULAÇÃO DE HOMENS QUE TÊM SEXO COM HOMENS DA ÁREA DE LISBOA JOANA LOURENÇO MESSIAS CALADO DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM MICROBIOLOGIA MÉDICA O ien ado a: P o esso a Dou o a Ri a Cas o Coo ien ado a: P o esso a Dou o a Filomena Pe ei a Ins i u o de Higiene e Medicina T opical (IHMT/UNL) Unidade de Mic obiologia Médica Janei o 2016 i AGRADECIMENTOS À P o esso a Dou o a Ri a Cas o, o ien ado a des a Disse ação de Mes ado, da Unidade de Mic obiologia Médica, do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, po e o ien ado o abalho conducen e à disse ação, po oda a simpa ia, disponibilidade e incen i o na p og essão des e abalho. À P o esso a Dou o a Filomena Pe ei a, coo ien ado a des a Disse ação de Mes ado, da Unidade Clínica T opical, do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, po oda a dedicação e empenho na conc e ização des e abalho. À Técnica Supe io Ângela Mendes, da Unidade de Mic obiologia Médica, do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, po oda a ajuda indispensá el e apoio ao ní el do abalho labo a o ial. Aos pais e i mão que me de am odo o apoio que necessi ei pa a pode ealiza e chega ao im des a e apa da minha ida. Aos meus ios e p ima po odo o apoio e ca inho. Hugo Cos a, que es e e semp e do meu lado, mesmo nos momen os mais di íceis, sem nunca deixa de ac edi a e con ia no meu abalho. Às minhas amigas e colegas So ia Simões, Ma a Nascimen o e Elize h Lopes po odo o apoio e amizade, po es a em semp e p esen es e disponí eis pa a ajuda . Aos meus amigos Susana Dias, Ruben Ma ins, Cá ia Lopo, Inês F anco, Ca la Pin o, Ma ia João, Te esa São José e Cá ia Simões po odo o apoio. Mui o ob igada. ii RESUMO A in eção po Neisse ia gono hoeae é a segunda in eção sexualmen e ansmissí el mais p e alen e na Eu opa. A ualmen e, a e apêu ica indicada pa a o a amen o da in eção po N. gono hoeae consis e na adminis ação de ce iaxona em combinação com a azi omicina. No en an o, o am ela adas alhas e apêu icas após a adminis ação de ce alospo inas de e cei a ge ação, a ní el mundial. A inexis ência de uma al e na i a à e apêu ica de p imei a linha, adequada e e icaz, o na impe a i o a ealização de igilância epidemiológica de esis ências, sob e udo nas populações de isco, como os homens que êm sexo com homens (HSH). O conhecimen o ab angen e sob e a base gené ica associada a pe is de susce ibilidade e esis ência aos an ibió icos em ele ada impo ância, uma ez que os es es de ampli icação de ácidos nucleicos es ão a subs i ui apidamen e o mé odo de cul u a no diagnós ico de in eção po N. gono hoeae. O es e de susce ibilidade aos an ibió icos oi ealizado pa a a penicilina, a e aciclina, a espec inomicina, a ce iaxona, a ce ixima, a cip o loxacina e a azi omicina, a a és dos mé odos di usão em disco e E es , de o ma a ob e -se o enó ipo de esis ência de cada isolado de N. gono hoeae em es udo. Com base no enó ipo de esis ência, pesquisou-se a p esença de mu ações nos genes penA, m R, pa C e gy A. Assim, na população es udada (homens que êm sexo com homens) ob i e am-se 30 cul u as posi i as pa a N. gono hoeae, das quais 73% ap esen a am esis ência in e média ou esis ência à penicilina, 60% à e aciclina e 37% à cip o loxacina. O eduzido núme o de casos posi i os não pe mi iu e i a conclusões com alo es a ís ico quan i a i o, no en an o, quali a i amen e, pe mi iu comp eende que as mu ações de e adas são idên icas às ob idas po ou os au o es, es ando associadas a enó ipos de esis ência. iii ABSTRACT Neisse ia gono hoeae in ec ion is he second mos p e alen sexually ansmi ed in ec ion in Eu ope. Cu en ly, dual he apy o N. gono hoeae in ec ions (e.g., ea men s including ce iaxone and azi h omycin) is now ecommended. Howe e , ea men ailu es ha e been epo ed ollowing adminis a ion o hi d-gene a ion cephalospo ins. The lack o an app op ia e and e ec i e al e na i e o i s -line he apy makes i impe a i e o ca y ou epidemiological su eillance o esis ance, especially among a - isk popula ions, such as men who ha e sex wi h men (MSM). In an e a in which N. gono hoeae in ec ion is inc easingly being diagnosed by nucleic acid ampli ica ion es s, knowledge on molecula su eillance o esis ance, is highly impo an . An ibio ic suscep ibili y es ing was ca ied ou o penicillin, e acycline, spec inomycin, ce iaxone, he ce ixime, cip o loxacin, and azi h omycin, by he di usion disc and E es me hods, so as o ob ain he esis ance pheno ype o each N. gono hoeae isola e unde s udy. Polyme ase chain eac ion and di ec DNA sequencing we e pe o med o iden i y mu a ions wi hin he penA, m R, gy A and pa C genes o he isola es, which hus explain he esis an pheno ypes. Thus, he s udy popula ion (men who ha e sex wi h men) yielded 30 posi i e cul u es o N. gono hoeae, o which 73% had in e media e esis ance o esis ance o penicillin, 60% o e acycline and 37% o cip o loxacin. The educed numbe o posi i e cases does no allow us o d aw conclusions in quan i a i e s a is ical alue. Howe e , allowed in quali a i e conclusions ha he de ec ed mu a ions a e iden ical o hose ob ained by o he au ho s, and a e associa ed wi h esis ance pheno ypes. i ÍNDICE GERAL Resumo ............................................................................................................................. ii Abs ac ............................................................................................................................ iii Índice ge al ...................................................................................................................... i Lis a de ab e ia u as ....................................................................................................... ii Índice de igu as .............................................................................................................. ix Índice de abelas .............................................................................................................. xi 1. In odução ................................................................................................................. 1 1.1. Jus i icação da ese ........................................................................................... 1 1.2. Neisse ia gono hoeae ..................................................................................... 3 1.2.1. Fisiologia, ca ac e ís icas bioquímicas e es u u a ..................................... 3 1.2.2. Mani es ações clínicas e ansmissão da in eção po Neisse ia gono hoeae ............................................................................................................. 5 1.2.3. Diagnós ico labo a o ial ............................................................................. 5 1.2.3.1. Iden i icação p esun i a ...................................................................... 6 1.2.3.2. Iden i icação con i ma ó ia ................................................................. 6 1.2.4. Tes e de susce ibilidade aos an ibió icos .................................................... 7 1.2.5. Te apêu ica pa a a in eção po Neisse ia gono hoeae .............................. 8 1.3. Pe spe i a his ó ica no desen ol imen o de esis ências aos an ibió icos ....... 8 1.3.1. E a p é-quinolona ....................................................................................... 9 1.3.2. E a quinolona ............................................................................................ 10 1.3.3. E a pós-quinolona ..................................................................................... 10 1.4. Mecanismos de ação e de desen ol imen o de esis ência a an ibió icos ...... 11 1.4.1. Sul onamidas ............................................................................................ 12 1.4.2. β-lac âmicos .............................................................................................. 13 1.4.3. Te aciclina ............................................................................................... 15 1.4.4. Aminocicli ol ............................................................................................ 16 1.4.5. Mac ólidos ................................................................................................ 17 1.4.6. Fluo oquinolonas ...................................................................................... 18 1.4.7. Ce alospo inas de e cei a ge ação ........................................................... 19 1.5. Te apêu icas do u u o .................................................................................... 20 1.5.1. Aumen o da dose das ce alospo inas de e cei a ge ação ......................... 20 1.5.2. Associação de an ibió icos ....................................................................... 20 1.5.3. No os á macos ........................................................................................ 20 1.6. Obje i os ......................................................................................................... 22 1.6.1. Obje i o ge al ........................................................................................... 22 1.6.2. Obje i os especí icos ................................................................................ 22 2. Ma e ial e mé odos ................................................................................................. 23 2.1. Ca ac e ização da população em es udo ......................................................... 23 2.2. Colhei a e anspo e de amos as ................................................................... 23 2.3. Iden i icação de Neisse ia gono hoeae ......................................................... 23 2.3.1. Tes e da oxidase........................................................................................ 23 2.3.2. Colo ação de G am ................................................................................... 24 2.3.3. Tes e ápido de u ilização de açúca es ..................................................... 24 2.3.4. Tes es bioquímicos e enzimá icos ............................................................ 24 2.4. Tes e de susce ibilidade aos an ibió icos ........................................................ 25 2.4.1. Mé odo de di usão em disco ..................................................................... 28 2.4.2. Mé odo E es ............................................................................................. 28 2.5. Pesquisa de mu ações em genes que con ibuem pa a a esis ência aos an ibió icos ................................................................................................................. 29 2.5.1. Ex ação de ADN dos isolados de Neisse ia gono hoeae ...................... 29 2.5.2. Ampli icação dos genes que con ibuem pa a a esis ência po eação em cadeia da polime ase ............................................................................................... 29 2.5.3. Ele o o ese em gel de aga ose dos p odu os de pc ................................ 31 2.5.4. Sequenciação dos p odu os de pc ............................................................ 32 i 2.5.5. Análise dos esul ados da sequenciação ................................................... 32 2.5.6. Pesquisa de mu ações ............................................................................... 32 3. Resul ados e discussão ........................................................................................... 34 3.1. Resul ados dos es es de susce ibilidade aos an ibió icos ............................... 35 3.1.1. Tes e de susce ibilidade à penicilina ........................................................ 37 3.1.2. Tes e de susce ibilidade às ce alospo inas de e cei a ge ação ................ 38 3.1.3. Tes e de susce ibilidade à e aciclina ...................................................... 39 3.1.4. Tes e de susce ibilidade à cip o loxacina ................................................. 40 3.1.5. Tes e de susce ibilidade à azi omicina .................................................... 41 3.1.6. Tes e de susce ibilidade à espec inomicina .............................................. 41 3.2. Pesquisa de mu ações em genes que con ibuem pa a a esis ência aos an ibió icos ................................................................................................................. 42 3.2.1. Pesquisa de mu ações no ep esso M R e no p omo o do gene m R ... 42 3.2.2. Pesquisa de mu ações que con ibuem pa a a esis ência à penicilina ..... 44 3.2.3. Pesquisa de mu ações que con ibuem pa a a esis ência às ce alospo inas de e cei a ge ação .................................................................................................. 47 3.2.4. Pesquisa de mu ações que con ibuem pa a a esis ência à e aciclina ... 48 3.2.5. Pesquisa de mu ações na egião de e minan e de esis ência às quinolonas.. ............................................................................................................. 49 4. Conclusão ............................................................................................................... 51 5. Re e ências bibliog á icas ...................................................................................... 55 6. Anexos .................................................................................................................... 70 ii LISTA DE ABREVIATURAS µl – Mic oli os µM – Mic omole aa - Aminoácidos ADN – Ácido Desoxi ibonucleico ARN – Ácido Ribonucleico ARNm – Ácido Ribonucleico mensagei o ARN – Ácido Ribonucleico ibossomal ARN – Ácido Ribonucleico de ans e ência AziI – Resis ência in e média à azi omicina BSS – Solução de sal amponada CDC – Cen o de Con olo e P e enção de Doenças CLSI – Ins i u o de No mas Labo a o iais e Clínicas CMI – Concen ação Mínima Inibi ó ia CMRNG – Neisse ia gono hoeae com esis ência mediada po mu ações c omossómicas CQ – Con olo de Qualidade DHPS – Dihid op e oa o Sin e ase DIP – Doença In lama ó ia Pél ica dNTPs – Desoxi ibonucleó idos ESSTI – Vigilância Eu opeia de Doenças Sexualmen e T ansmissí eis E es – Tes e es ilomé ico EUCAST – Comi é Eu opeu pa a o Tes e de Susce ibilidade An imic obiano Eu o-GASP – P og ama Eu opeu de Vigilância An imic obiana dos Gonococos EV – Endo enosa g – g ama HSH – Homens que êm sexo com homens IM – In amuscula IST – In eções Sexualmen e T ansmissí eis K2HPO4 – Fos a o de po ássio dibásico anid o KCl – Clo e o de po ássio 1. INTRODUÇÃO 3 ansmissão da in eção po N. gono hoeae (13,17). O Cen o de Con olo e P e enção de Doenças (CDC) ecomenda a implemen ação na o ina do as eio de in eção po N. gono hoeae em locais ex ageni ais pa a odos os HSH sexualmen e a i os (18,19). Nes e es udo, conside a-se impo an e a igilância epidemiológica e icaz sob e udo das populações em maio isco, como é o caso da população de HSH, e o diagnós ico da in eção po N. gono hoeae po cul u a com pesquisa dos enó ipos de esis ência, bem como a ca ac e ização molecula dos isolados esis en es. 1.2. Neisse ia gono hoeae A espécie Neisse ia gono hoeae pe ence à amília Neisse iaceae que incluí ês géne os que são Neisse ia, Mo axella e Kingella. Es e mic o ganismo pe ence ao géne o Neisse ia designação que p o ém do nome do médico alemão Albe Neisse , o qual oi o p imei o a desc e ê-lo (em 1897) a pa i da obse ação mic oscópica de um exsudado u e al e da conjun i a. O nome da espécie N. gono hoeae p o ém dos nomes gone que signi ica “semen e” e hoia que indica “ luxo”, ou seja, e e e-se a um “ luxo de semen es” que se elaciona com os sin omas da in eção po N. gono hoeae (20,21). 1.2.1. FISIOLOGIA, CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E ESTRUTURA O mic o ganismo N. gono hoeae é uma bac é ia de G am-nega i o que mo ologicamen e se dispõe em diplococos. As espécies do géne o Neisse ia spp. ap esen am eação de oxidase e de ca alase posi i as. Além dis o, p oduzem ácido a pa i da u ilização de di e en es hid a os de ca bono (20). As espécies do géne o Neisse ia são cons i uídas po uma memb ana ci oplasmá ica in e na, uma ina camada de pep idoglicano, um espaço pe iplasmá ico e uma memb ana ex e na com lipopoligossaca ídeos (LOS), al como es á ep esen ada a igu a 3 (22,23). 1. INTRODUÇÃO 4 Figu a 3:Rep esen ação da es u u a de supe ície de N. gono hoeae. Adap ado de Koneman e al. (20). Bomba de e luxo M C-M D-M E A bomba de e luxo M C-M D-M E encon a-se p esen e nos isolados de N. gono hoeae e pe ence à amília de bombas de e luxo de esis ência-nodulação- di isão celula (RND). Es a bomba de e luxo pe mi e a expulsão di e a de di e sos compos os hid o óbicos do espaço pe iplasmá ico, ais como agen es an imic obianos (ß – lac âmicos, mac ólidos e e aciclinas), co an es ( iole a de c is al) e de e gen es (T i on X-100 e o nonoxinol-9) (24,25). A p o eína M R é um memb o da amília Te R e é codi icada pelo gene m R que se encon a localizado a 250 pa es de bases (pb) acima de m CDE. Es e gene é ansc i o di e gen emen e em cadeias opos as. A p o eína M R egula nega i amen e a ansc ição de m CDE, a a és da ligação de dois homodíme os numa sequência de ADN na egião do p omo o de m CDE, como demons ado na igu a 4 (26,27). Figu a 4: O ganização do ope ão m CDE de N. gono hoeae. Os cí culos selecionam os egulado es de ansc ição. As se as indicam os p omo o es de m F, m R e m CDE. Os p omo o es de m CDE e m R es ão ap esen ados na sequência aumen ada. A caixa a pico ado ma ca a egião in e ida (com 13pb) en e os hexâme os -10 e -35 na sequência que se encon a na sequência do p omo o do gene m R. Adap ado de Ohneck e al. (28). 1. INTRODUÇÃO 5 1.2.2. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E TRANSMISSÃO DA INFEÇÃO POR Neisse ia gono hoeae A in eção geni al masculina é p ima iamen e es i a à u e a e ap esen a sin omas como disú ia e co imen o u e al pu ulen o, con udo es a pode se assin omá ica. Caso a in eção não seja a ada, pode e olui com complicações, como a epididimi e, a p os a i e e o abscesso na ca idade pe i oneal (21,29). Nas mulhe es, o local p imá io da in eção é o colo do ú e o e, quando sin omá ica, ge almen e ap esen a co imen o cé ico- aginal pu ulen o, disú ia, hemo agia ano mal ou in e mens ual e do abdominal ou pél ica. As in eções geni ais ascenden es na mulhe podem causa salpingi e, doença in lama ó ia pél ica e abscesso no ubo o a iano. Es as podem es a na o igem de uma g a idez ec ópica e es e ilidade (21,30). A população HSH e as mulhe es podem adqui i in eção da a inge e/ou ec al, a a és de elações sexuais o ais e/ou anais desp o egidas com um pa cei o in e ado. A maio ia das in eções na população HSH são assin omá icas, po an o ecomenda-se o as eio de o ina anual de in eção po N. gono hoeae em locais ex ageni ais (17,18). A conjun i i e em ecém-nascidos é adqui ida du an e a passagem a a és do canal do pa o in e ado po N. gono hoeae. A in eção ocula mani es a-se po uma sec eção pu ulen a abundan e, hipe emia conjun i al, edema palpeb al, podendo oco e ceguei a se não a ada (31). A in eção disseminada po N. gono hoeae oco e quando a e e ida espécie in ade a co en e sanguínea. As complicações des a pa ologia incluem al e ações pe manen es das a iculações, pe i-hepa i e, endoca di e, e a amen e, meningi e (32). A ansmissão da in eção po N. gono hoeae oco e po inoculação di e a da sec eção da mucosa in e ada de pessoa a pessoa, po ia geni al-geni al, geni al-anal, o o-geni al, o o-anal ou ansmissão po pa e da mãe pa a o ecém-nascimen o du an e o pa o (2). 1.2.3. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL A colhei a de amos as pa a a pesquisa de N. gono hoeae, po mé odo de cul u a, de e se e e uada com uma za aga oa que de e se inse ida 2 a 3 cen íme os na u e a masculina ou 1 a 2 cen íme os no canal endoce ical, seguida po duas ou ês o ações. O melho sis ema de anspo e da amos a é o p óp io meio de cul u a inoculado com a za aga oa, após a colhei a, colocado imedia amen e numa a mos e a en iquecida com CO2 e anspo ado pa a o labo a ó io (18). 1. INTRODUÇÃO 6 1.2.3.1. Iden i icação p esun i a A iden i icação p esun i a de N. gono hoeae a pa i de um isolado num meio sele i o pode se ealizada com base na mo ologia das colónias, na obse ação ípica de diplococos aos pa es, é ades ou em g upo (de um es egaço e e uado a pa i de colónias e co ado pela colo ação de G am) e a a és da obse ação de uma eação de oxidase posi i a (18,33). Cul u a Pa a o isolamen o p imá io, as amos as de locais ana ómicos no malmen e não es é eis (po exemplo, u e a, cé ix, agina, e o e o o a inge) de em se semeadas num meio de cul u a sele i o (po exemplo, meio de cul u a Thaye -Ma in ou Ma in-Lewis) e as amos as de locais ana ómicos es é eis, como a conjun i a, de em se semeadas em meios de cul u a não sele i os (po exemplo, meio de cul u a aga de chocola e) (18). Os meios inoculados são incubados en e 35 °C a 36,5 °C numa a mos e a en iquecida com 5% de CO2 e examinados após 24 ho as e 48 ho as. O CO2 suplemen a pode se o necido po uma incubado a de CO2, a a és de um asco echado com uma ela sem chei o ou po saque as ge ado as de CO2 (18). Colo ação de G am A colo ação pelo mé odo de G am em ele ada especi icidade (> 99%) e sensibilidade (> 95%) no diagnós ico de in eção po N. gono hoeae em homens sin omá icos (18). No caso de homens assin omá icos, amos as endoce icais, o o a inge ou amos as ec ais, es a écnica ap esen a meno sensibilidade (18). Tes e da Oxidase O es e da oxidase em como obje i o de e a a p esença da enzima ci oc omo c oxidase p esen e na cadeia espi a ó ia de um mic o ganismo. Nes e es e o subs a o N,N- e ame il-1,4- enilenodiamina en a em con a o com as colónias e caso a enzima es eja p esen e esul a em eação posi i a, isualizada pela al e ação de co . A espécie N. gono hoeae ap esen a es e de oxidase posi i o (33). 1.2.3.2. Iden i icação con i ma ó ia A iden i icação p esun i a de N. gono hoeae é su icien e pa a inicia a e apia an imic obiana, mas es es adicionais de em se ealizados pa a con i ma a iden i icação (34). Es es es es podem se bioquímicos e enzimá icos, que incluem: a 1. INTRODUÇÃO 7 eação de ca alase; a esis ência à colis ina; a p odução de polissaca ídeo de saca ose; o es e de u ilização de açúca es; a edução de ni a o (33). Tes e de u ilização de açúca es Es a écnica depende de enzimas o madas du an e o c escimen o do mic o ganismo que u ilizam os hid a os de ca bono como a glucose, a mal ose, a lac ose e/ou a saca ose. Na execução do es e é incubada uma suspensão do isolado a es uda jun amen e com os e e idos hid a os de ca bono. Caso haja p odução de ácido, de ido à u ilização dos mesmos, obse a-se mudança de co . Di e en es espécies de Neisse ia spp. u ilizam hid a os de ca bono di e en es. A espécie N. gono hoeae apenas u iliza a glucose (35). Tes e bioquímico come cial Um es e con i ma ó io pa a iden i icação labo a o ial de N. gono hoeae pode se um es e bioquímico come cial, como po exemplo, o sis ema API NH, que pe mi e a iden i icação con i ma ó ia de Neisse ia spp., Haemophilus spp. e Mo axella ca a halis (B anhamella ca a halis). A iden i icação é ob ida a a és de eações enzimá icas ou e men ações de açúca es em 10 mic o ubos com subs a os desid a ados, que se aduzem po mudanças de co espon âneas ou e eladas a a és da adição de eagen es (36). 1.2.4. TESTE DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS O mé odo de diluição em placa com aga é o mé odo de e e ência pa a es a a susce ibilidade aos an ibió icos pa a a espécie N. gono hoeae, no en an o, pode se mui o di ícil de execu a em labo a ó ios com capacidade limi ada. O mé odo de di usão em disco e o mé odo epsilomé ico (E es ) são mé odos al e na i os ao mé odo de e e ência no es udo da susce ibilidade dos isolados de N. gono hoeae (18). A im de se desen ol e uma pe spe i a global sob e a esis ência an imic obiana de N. gono hoeae, os labo a ó ios de e e ência ealizam es es de susce ibilidade an imic obiana pa a uma as a gama de an ibió icos: ce alospo inas de e cei a ge ação (po exemplo, a ce iaxona e a ce ixima) penicilina, e aciclina, espec inomicina, luo oquinolonas (po exemplo, a cip o loxacina), e a azi omicina (18). Apenas a es i pe N. gono hoeae ATCC 49226 é designada pelo Ins i u o de No mas Labo a o iais e Clínicas (CLSI) pa a o con olo de qualidade dos es es de susce ibilidade aos an ibió icos pa a a espécie N. gono hoeae (33). 1. INTRODUÇÃO 8 1.2.5. TERAPÊUTICA PARA A INFEÇÃO POR Neisse ia gono hoeae A e apêu ica ecomendada no caso de in eções u e ais, ce icais, ec ais e da a inge não complicadas po N. gono hoeae em adul os e adolescen es, quando a sensibilidade an imic obiana da in eção é desconhecida, é a ce iaxona 250 mg ou 500mg ia in amuscula em dose única em conjun o com 1 g ama (g) ou 2 g de azi omicina em dose única o al (37,2). Es a e apêu ica combinada pa a a in eção po N. gono hoeae ga an e ambém o a amen o de coin ecções po C. achoma is e e le e a p eocupação da eme gência de esis ência de N. gono hoeae aos an ibió icos (38). Os egimes e apêu icos al e na i os são:  Ce ixima 400 mg em dose única o al em conjun o com 2 g de azi omicina em dose única o al, se a ce iaxona não es i e disponí el ou a adminis ação de an ibió icos inje á eis não o possí el ou ecusada pelo indi íduo;  Ce iaxona 500 mg po ia in amuscula , numa dose única, se azi omicina não es i e disponí el ou o indi íduo se incapaz de oma a medicação o al;  Espec inomicina 2 g po ia in amuscula , numa dose única em conjun o com 2 g de azi omicina em dose única o al, pe an e suspei a ou con i mação de esis ência às ce alospo inas de e cei a ge ação ou quando o indi íduo em uma his ó ia de ana ilaxia à penicilina ou às ce alospo inas (2). 1.3. PERSPETIVA HISTÓRICA NO DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIAS AOS ANTIBIÓTICOS A espécie N. gono hoeae acilmen e desen ol e ou adqui e mecanismos de esis ência aos an ibió icos, pelo que ao longo do empo em desen ol ido esis ência aos di e en es an ibió icos u ilizados no seu a amen o. Assim o apa ecimen o das esis ências, po pa e des e mic o ganismo, oi di idido em ês e as: p é-quinolona, quinolona e pós-quinolona ( igu a 5) (39,40). 1. INTRODUÇÃO 9 Figu a 5: Di e en es an ibió icos que o am in oduzidos pa a o a amen o da in eção po N. gono hoeae. As ba as e icais ep esen am o núme o de anos que um de e minado an ibió ico oi usado an es de qualque indicação de esis ência. Os núme os a e melho indicam o ano quando a esis ência a esse an ibió ico oi documen ada pela p imei a ez. Adap ado de Dillon e al. (41). 1.3.1. ERA PRÉ-QUINOLONA As sul onamidas começa am a se u ilizadas no a amen o da in eção po N. gono hoeae em 1935, mas apidamen e deixa am de se e icazes, uma ez que, em 1940 começa am a eme gi esis ências a es es an ibió icos (42). A penicilina começou a se u ilizada como e apêu ica pa a a in eção po N. gono hoeae em 1943, inicialmen e pa a os casos de esis ência às sul onamidas, mas mais a de, eio a u iliza -se como an imic obiano de p imei a linha (43). Du an e os 40 anos seguin es, a penicilina oi u ilizada no a amen o des a pa ologia, a é que se começou a e i ica uma diminuição da susce ibilidade a es e á maco a a és esis ências mediadas po mu ações c omossómicas e, pos e io men e, de ido a esis ências mediadas po plasmídeos com genes que codi icam enzimas β-lac amases. No início dos anos 70, oi aumen ada a dose in amuscula da en ão ecomendada 50 000 unidades (U), em 1945, pa a 4,8 milhões U. No inal de 1989, a penicilina deixou de se um a amen o e icaz e oi abandonada como á maco de p imei a linha (44,45). Coinciden e com o desen ol imen o de esis ência à penicilina po N. gono hoeae, es a espécie ambém desen ol eu esis ência a ou os an ibió icos, incluindo a e aciclina, o clo an enicol, a es ep omicina e a e i omicina (46). A e aciclina oi uma impo an e e apêu ica al e na i a à penicilina pa a indi íduos alé gicos a es e an ibió ico (47). Aos poucos, e com o uso cons an e de e aciclina na 1. INTRODUÇÃO 10 e apêu ica de coin ecções, como po exemplo na in eção po C. achoma is, a N. gono hoeae adqui iu esis ência ambém a es e an ibió ico. A esis ência de al o ní el à e aciclina, mediada po mu ações c omossómicas e po plasmídeos inco po ados, su giu na década de 1970, jun amen e com a esis ência à penicilina (48). A espec inomicina oi um ou o impo an e an imic obiano, desen ol ido nos anos 1960, pa a casos de in eção po N. gono hoeae esis en e as an ibió icos ou em indi íduos alé gicos a ou os á macos. Foi u ilizado sob e udo no a amen o de in eção po N. gono hoeae p odu o a de penicilinase (PPNG). Es e an ibió ico não é e icaz nos casos de in eção da a inge. Além disso, nos anos 80, su gi am apidamen e esis ências de al o ní el à espec inomicina, quando oi u ilizada como e apêu ica de p imei a linha nos mili a es no e-ame icanos, na Co eia do No e (49–51). 1.3.2. ERA QUINOLONA Em espos a ao aumen o do núme o de isolados de N. gono hoeae esis en es à penicilina, e aciclina e espec inomicina, em odo o mundo, o CDC ecomendou o uso de ce alospo inas de e cei a ge ação ou luo oquinolonas pa a o a amen o de p imei a linha da in eção po N. gono hoeae. As luo oquinolonas, como a cip o loxacina e a o loxacina, o am amplamen e u ilizadas no a amen o des a in eção a pa i de meados da década de 1980 em dian e. Apesa de não se adequada pa a as mulhe es g á idas ou c ianças, a cip o loxacina em a an agem de possui poucos e ei os secundá ios, de pode se adminis ada como dose única e de ap esen a excelen e e icácia no a amen o de in eções em odos os locais ana ómicos, incluindo da a inge (52). T ês an ibió icos des a amília de an ibió icos (cip o loxacina, o loxacina e le o loxacina) o am ap o ados pelo CDC, no ano de 1993, como á macos de p imei a linha pa a o a amen o da in eção po N. gono hoeae (53,54). No ano 2000, as luo oquinolonas deixa am de se p esc i as pa a o a amen o da in eção po N. gono hoeae em á ios países da Eu opa de ido ao desen ol imen o de esis ências e em 2007 deixa am de se ecomendadas pelo CDC (53,55). 1.3.3. ERA PÓS-QUINOLONA Em 2006, 39% dos casos de in eção po N. gono hoeae na população HSH e am esis en es às quinolonas, en ão o CDC passou a ecomenda apenas as ce alospo inas de e cei a ge ação como e apêu ica de p imei a linha (56). A ce iaxona ( ia 1. INTRODUÇÃO 11 in amuscula ) e a ce ixima ( ia o al), em conjun o com a azi omicina, êm sido u ilizadas no a amen o da in eção po N. gono hoeae (57). A u ilização gene alizada de ce alospo inas o ais no Japão desen ol eu isolados de N. gono hoeae com susce ibilidade diminuída a es e an ibió ico e ausência de espos a ao a amen o (58,59). Mui os desses isolados ambém e am esis en es às luo oquinolonas, às e aciclinas e à penicilina (60,61). Deguchi e al.(58) e Yokoi e al.(9) ela a am as p imei as alhas e apêu icas com ce alospo inas o ais. Oco e am no Japão, no início do ano 2000, em indi íduos que o am a ados com doses múl iplas de 200 mg de ce ixima e que es a am in e ados com isolados de N. gono hoeae com concen ações mínimas inibi ó ias (CMIs) que a ia am en e 0,125 µg/ml e 1 µg/ml. Na No uega, Unemo e al.(3) ela a am os p imei os dois casos de alha e apêu ica com a ce ixima na Eu opa. Ambos alha am o a amen o com 400 mg de ce ixima, mas o am cu ados com 500 mg de ce iaxona. Ison e al.(6), Unemo e al.(8) Unemo e al.(4), e Allen e al.(7) ela a am alhas e apêu icas com a ce ixima em Ingla e a, Áus ia, F ança e Canada, espe i amen e. 1.4. MECANISMOS DE AÇÃO E DE DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS Os mecanismos de esis ência aos an ibió icos desen ol idos pela espécie N. gono hoeae en ol em des uição ou modi icação do an ibió ico, po meios enzimá icos, modi icação ou p o eção do al o, o que diminui a a inidade, diminuição do in luxo ou aumen o do e luxo do an ibió ico. Gene icamen e, es as al e ações podem esul a de mu ações c omossómicas, conjugação de plasmídeos com genes de esis ência e ans e ência ho izon al de genes, pa icula men e a a és de ou as espécies de Neisse ia spp. Múl iplos de e minan es de esis ência podem coexis i num único mic o ganismo, de o ma que uma única es i pe possa se esis en e a di e en es an ibió icos (62,63). Os al os de ação dos an ibió icos u ilizados no a amen o da in eção po N. gono hoeae, ao longo do empo (sul onamidas, β-lac âmicos, e aciclinas, aminoglicosídeos, mac ólidos e ce alospo inas de e cei a ge ação), bem como os genes que con ibuem pa a o desen ol imen o de esis ência, com exceção da sul onamida, encon am-se ep esen ados na igu a 6. 1. INTRODUÇÃO 12 Figu a 6: Al os dos an ibió icos que êm sido u ilizados ao longo do empo no a amen o da in eção po N. gono hoeae com os espe i os genes de esis ência. ME – Memb ana ex e na; MI – Memb ana In e na. Adap ado de Goi e e al.(64). 1.4.1. SULFONAMIDAS Mecanismo de ação As sul onamidas inibem a sín ese do ácido ólico, um impo an e me aboli o na sín ese de ADN. Es as são um análogo es u u al do ácido pa a-aminobenzóico (PABA) e a uam po inibição compe i i a pela ligação à enzima dihid op e oa o sin e ase (DHPS), enzima undamen al pa a a sín ese do ácido ólico bac e iano, impedindo-a de ealiza a sua unção ( igu a 7) (65). Figu a 7: Mecanismo de ação das sul onamidas no me abolismo do ácido e ahid o óbico ( o ma eduzida do ácido ólico), um impo an e me aboli o na sín ese de ADN. DHFR - Diid o ola o edu ase; DHPS - Dihid op e oa o sin e ase. Adap ado de Osó io & Mo gado(66). Mecanismo de esis ência A espécie N. gono hoeae desen ol eu esis ência a es e an imic obiano a a és da hipe p odução do PABA, compe indo assim com uma maio an agem pelo local de ligação com o an ibió ico. Além disso desen ol eu uma mu ação no gene olP que codi ica a DHPS, p oduzindo assim uma enzima mu an e com pouca a inidade pa a as sul onamidas (67). 1. INTRODUÇÃO 19 1.4.7. CEFALOSPORINAS DE TERCEIRA GERAÇÃO Mecanismo de ação As ce alospo inas azem pa e da amília dos β-lac âmicos e são classi icadas po ge ações: a 1ª ge ação exibe a i idade nos mic o ganismos de colo ação G am-posi i a e a i idade mode ada na p esença de bac é ias de colo ação de G am-nega i o; a 2ª ge ação em a i idade aumen ada sob e as bac é ias de colo ação G am-nega i o e pa a anae óbios; po úl imo, a 3ª ge ação ap esen a a i idade em bac é ias de G am-posi i o e de G am-nega i o, nomeadamen e na p esença de mic o ganismos da amília de En e obac e iaceae (103). As ce alospo inas impedem a ligação do pep idoglicano à pa ede celula bac e iana, uma ez que se ligam ao anel β-lac âmico das PBPs (92). Mecanismos de esis ência A esis ência às ce alospo inas de e cei a ge ação po N. gono hoeae de e-se p incipalmen e a mu ações que modi icam o al o de ação (PBPs), como são exemplo mu ações nos genes penA e ponA (92). A esis ência a es es an ibió icos ambém se pode desen ol e a pa i do aumen o de e luxo e diminuição do in luxo, uma ez que, êm sido de e adas mu ações adicionais nos genes m R e po B en e isolados de N. gono hoeae com diminuição da susce ibilidade às ce alospo inas de e cei a ge ação (15,104,105). Há uma maio p opo ção de isolados N. gono hoeae com esis ência à ce ixima do que à ce iaxona de ido ao ac o de o desen ol imen o de esis ência à ce ixima oco e na p esença de mosaicos alelos penA, enquan o pa a o desen ol imen o de esis ência à ce iaxona são ambém necessá ias mu ações nos genes penA, m R e po B (15,106,107). Mosaico alelo penA Os mosaicos alelos penA (ou seja, alelos ge ados num isolado ece o po ecombinação de genes de egiões semelhan es do isolado doado , es ei amen e elacionados), podem se adqui idos po espécies de Neisse ia spp. comensais p esen es na a inge (N. sicca, N. pe la a, N. cine ea, e / ou N. la escens) po ans o mação in i o e ecombinação homóloga. Es e é conside ado o mecanismo mais comum de diminuição da susce ibilidade às ce alospo inas de e cei a ge ação (108–115). As p o eínas PBP2 com es u u a mosaico êm mais de 70 aminoácidos al e ados (92). 1. INTRODUÇÃO 20 Gene penA Pad ões de mu ações não mosaico no gene penA ambém podem con ibui pa a a esis ência, são exemplo as subs i uições A501V e A501T. As mu ações G542S, P551S e P551L já o am associadas es a is icamen e ao aumen o da CMI às ce alospo inas de e cei a ge ação dos isolados de N. gono hoeae (92,116). 1.5. TERAPÊUTICAS DO FUTURO De ido à ápida aquisição de esis ência po pa e dos isolados de N. gono hoeae aos an ibió icos disponí eis o desen ol imen o de e apêu icas al e na i as é p io i á io. 1.5.1. AUMENTO DA DOSE DAS CEFALOSPORINAS DE TERCEIRA GERAÇÃO Tem sido p opos o o aumen o da dose e du ação da e apêu ica com a ce iaxona pa a os casos em que se obse a diminuição da susce ibilidade a es e á maco (117,118). 1.5.2. ASSOCIAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS Vá ios au o es suge i am di e en es associações de an ibió icos de o ma a ul apassa a esis ência de N. gono hoeae, de aco do com as seguin es ecomendações:  Ce iaxona 1g IM, dose única, seguida de ce ixima o al 400mg po dia du an e dois dias ou de azi omicina o al 2g, dose única (118);  Combinação de espec inomicina 2g IM e azi omicina o al 2g, ambas em dose única, como al e na i a à ce iaxona 250mg nos casos de esis ência à ce ixima (39). 1.5.3. NOVOS FÁRMACOS O e apenem é uma molécula ela i amen e ecen e da amília dos ca bapenemos que pode ia cons i ui uma al e na i a e apêu ica nos casos de esis ência à ce iaxona. Con udo, o apa ecimen o de esis ências codi icadas pelo gene penA o na-a uma opção e apêu ica ine icaz nes es casos (119,120). O pép ido an imic obiano LL-37 az pa e da amília das ca elicidinas humanas e já oi demons ado que ap esen a a i idade bac e icida e imuno-modulado a pa a os isolados de N. gono hoeae (121). 1. INTRODUÇÃO 21 O aminocouma in é uma classe de an ibac e ianos na u ais (ob idos a pa i de espécies de S ep omyces sp.). Fazem pa e des a classe a no obiocina, clo obiocina e a coume micina (122). O eugenol é um an issé ico na u al ex aído da plan a Ocimum sanc um, e oi e idenciado em a os que ap esen a a i idade an imic obiana, pa icula men e em isolados de N. gono hoeae mul i esis en es (123). A soli omicina é um no o mac ólido que e elou e ele ada a i idade, in i o, em isolados de N. gono hoeae mul i esis en es (124). Te minalia mac op e a é uma plan a a icana com á ias aplicações medicinais que demons ou e a i idade an imic obiana em á ios isolados de N. gono hoeae, incluindo PPNG e TRNG (125). 1. INTRODUÇÃO 22 1.6. OBJETIVOS 1.6.1. OBJETIVO GERAL  Es uda a axa de in eção po Neisse ia gono hoeae, o pe il de esis ência e pesquisa mu ações de es i pes esis en es, p esen es numa população de homens que êm sexo com homens, que equen a am uma clínica de as eio de in eções sexualmen e ansmissí eis de Lisboa. 1.6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  De e mina a axa de in eção po N. gono hoeae na população de homens que êm sexo com homens que equen a am uma clínica de as eio de in eções sexualmen e ansmissí eis em Lisboa.  Ve i ica os pe is de susce ibilidade dos isolados de N. gono hoeae aos seguin es agen es an imic obianos: penicilina, e aciclina, azi omicina, cip o loxacina, le o loxacina, espec inomicina, ce iaxona e ce ixima.  Pesquisa mu ações nos genes penA, m R, g yA e pa C dos isolados de N. gono hoeae com esis ência in e média ou esis ência aos an ibió icos es ados.  De e mina a con ibuição de mu ações nos e e idos genes no desen ol imen o de esis ência aos an ibió icos. 23 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO Os isolados de Neisse ia gono hoeae es udados nes e abalho o am ob idos a a és da cul u a de amos as de exsudados ec ais ou exsudados u e ais (no caso de indi íduos com sin oma ologia) de HSH que se di igi am a uma clínica de as eio de in eções sexualmen e ansmissí eis, localizada no Bai o Al o, em Lisboa, du an e o pe íodo de Janei o de 2013 a Fe e ei o de 2015. 2.2. COLHEITA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS As amos as de exsudados u e ais e ec ais o am semeadas, imedia amen e após a colhei a, em meio de cul u a de chocola e VCA3 (gelose de chocola e com PolyVi ex e com uma combinação de agen es an imic obianos e an i úngicos, bioMé iux). As placas semeadas o am incubadas numa ja a com a mos e a en iquecida em CO2, p opo cionada po uma ela, e pos e io men e en iadas pa a o Ins i u o de Higiene e Medicina T opical de Lisboa, onde o am colocadas numa es u a a 36 °C. 2.3. IDENTIFICAÇÃO DE Neisse ia gono hoeae A iden i icação da espécie N. gono hoeae oi ealizada a pa i de colónias pu as no meio de cul u a de chocola e PVX (gelose de chocola e com PolyVi eX, bioMé iux) após incubação du an e a noi e, a 36 °C com uma a mos e a com ce ca de 5% de CO2. 2.3.1. TESTE DA OXIDASE As colónias ob idas no meio de cul u a PVX o am es adas com o es e da oxidase (Bac iden ® Oxidase, Me ck). Nes e es e, a supe ície da eação da i a en ou em con a o di e o com uma ou duas colónias e passados ce ca de 2 minu os oi obse ado o esul ado. Pa a o con olo de qualidade, oi ealizado o mesmo p ocedimen o com a es i pe Esche ichia coli ATCC 25922, sendo expec á el um esul ado nega i o (sem al e ação de co ) e com a es i pe Pseudomonas ae uginosa ATCC 27853 sendo expec á el um esul ado posi i o (al e ação da co da i a pa a iole a) (33). 2. MATERIAL E MÉTODOS 24 2.3.2. COLORAÇÃO DE GRAM A colo ação de G am oi ealizada numa lâmina com um es egaço, ob ido a pa i de colónias pu as p esen es no meio de cul u a de chocola e PVX. A lâmina co ada oi obse ada com a obje i a de ime são (1000x). 2.3.3. TESTE RÁPIDO DE UTILIZAÇÃO DE AÇÚCARES O es e ápido de u ilização de açúca es oi ealizado semp e que se ob e e isolados G am-nega i os com mo ologia de diplococos e com o es e de oxidase posi i o. Pa a o es e oi p epa a a solução de sal amponada (BSS) com:  100 milili os (ml) de água des ilada;  0,04 g amas (g) de os a o de po ássio dibásico anid o (K2HPO4);  0,01 g de os a o de po ássio monobásico (KH2PO4);  0,8 g de clo e o de po ássio (KCl);  0,01 g de e melho de enol. O pH oi ajus ado a 8,4 após a solução se es e ilizada a a és de au ocla agem. A pa i de colónias pu as do meio de cul u a PVX, ob idas após incubação du an e a noi e a 36 °C numa a mos e a com 5% de CO2, oi p epa ada uma suspensão com u ação equi alen e a 5 da escala McFa land (bioMé ieux) em 1 ml da solução BSS. Des e inóculo o am dispensados 100 mic oli os (µl) em 5 poços de uma mic oplaca de plás ico es e ilizada. A qua o poços o am adicionados 25 µL de cada ca bohid a o (glucose, u ose, saca ose e mal ose) numa solução a 20% e ao quin o poço não se adicionou nada, pa a se i como con olo nega i o. Como con olo posi i o o am u ilizadas as es i pes Neisse ia meningi idis ATCC 13090 e Neisse ia lac amica ATCC 23971. A placa oi incubada a 36 °C em ae obiose e após duas a qua o ho as oi obse ado o esul ado (35). 2.3.4. TESTES BIOQUÍMICOS E ENZIMÁTICOS A con i mação da iden i icação de N. gono hoeae oi ealizada com o es e bioquímico e enzimá ico come cial api®NH (bioMé ieux). A pa i de colónias pu as em meio de cul u a PVX, após incubação du an e a noi e a 36 °C numa a mos e a com 5% de CO2, oi p epa ada uma suspensão com uma u ação equi alen e a 4 da escala McFa land (bioMé ieux) em 2 ml de solução API NaCl 0,85% Medium (bioMé ieux). O inóculo oi dis ibuído nas cúpulas da gale ia, o necida pelo 2. MATERIAL E MÉTODOS 25 ki come cial e de aco do com as ins uções do ab ican e. Pos e io men e, a gale ia icou a incuba du an e 2 ho as a 36 °C, numa a mos e a ae óbia. A lei u a e in e p e ação dos esul ados o am ealizadas de aco do com as ins uções do ab ican e (40). 2.4. TESTE DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS O es udo da susce ibilidade aos an ibió icos oi ealizado po dois mé odos: mé odo de di usão em disco e o mé odo epsilomé ico (E es ). Em ambos os mé odos o am incluídos os seguin es an ibió icos: penicilina, ce ixima, ce iaxona, e aciclina, cip o loxacina, azi omicina e espec inomicina (33). O mé odo di usão em disco em como an agens a acilidade de execução e ep odução, a u ilização de eagen es de baixo cus o e o ac o de o nece esul ados de ácil in e p e ação clínica. Con udo, apenas ap esen a esul ados quali a i os. Nes e mé odo os esul ados ob idos da lei u a dos diâme os dos halos de inibição o am in e p e ados como isolado susce í el (S), com esis ência in e média (I) ou esis en e (R) a um de e minado an ibió ico, de aco do com as no mas es abelecidas do Ins i u o de No mas Labo a o iais e Clínicas (CLSI) ( abela 1) (126). No mé odo E es , as i as ap esen am um cus o ele ado e o núme o de an imic obianos a se em es ados po placa é limi ado. No en an o, es e é um mé odo de ácil execução e com esul ados quan i a i os (127–129). Nes e mé odo os esul ados ob idos pa a a concen ação mínima inibi ó ia (CMI) ambém o am classi icados como isolado susce í el (S), com esis ência in e média (I) ou esis en e (R), de aco do com as no mas es abelecidas no CLSI ( abela 1) (126). Isolados de N. gono hoeae esis en es à ce ixima e ce iaxona são ecen es, po an o di icul a a de inição de ou as ca ego ias de esis ência, pa a além da “susce í el”. Como o aumen o do alo da CMI pa a um an ibió ico pode p e e o desen ol imen o de esis ência, o P oje o de Vigilância de Isolados de Gonococos (GISP) do CDC desen ol eu alo es de ale a, sendo es es abaixo dos alo es de c i é io de inidos pelo CLSI, com o im de igilância de esis ência e de p opo ciona uma maio sensibilidade na de eção da diminuição da susce ibilidade da espécie N. gono hoeae. O alo de ale a pa a a ce ixima é de CMI ≥ 0,25 µg/ml e pa a a ce iaxona é de CMI ≥ 0,125 µg/ml (38). 2. MATERIAL E MÉTODOS 26 Não es ão de inidos c i é ios de in e p e ação pa a a azi omicina no CLSI, con udo o CDC no GISP, em 2010, de iniu o alo de ale a pa a es e an ibió ico de CMI ≥ 2,00 µg/ml (38) e em 2005 o Labo a ó io de Re e ência de Neisse ia (NRL) ecomendou a u ilização do alo c í ico de halos de inibição de diâme os de ≤ 30 mm pa a in e p e ação de N. gono hoeae com susce ibilidade diminuída pa a a azi omicina (130). O Comi é Eu opeu pa a o Tes e de Susce ibilidade An imic obiano (EUCAST) de iniu pa a a azi omicina, os c i é ios de isolado susce í el com CMI ≤ 0,25µg/ml e isolado esis en e CMI ≥ 0,5µg/ml (131). A es i pe N. gono hoeae ATCC 49226 es á designada pelo CLSI pa a se u ilizada no Con olo de Qualidade (CQ). Se ao e e ua -se o es udo de N. gono hoeae ATCC 49226 pelo mé odo de di usão em disco e pelo mé odo E es e os diâme os dos halos e as CMIs co esponde em aos alo es de c i é ios do CLSI de CQ (Tabela 2) os esul ados ob idos dos isolados em es udo podem se conside ados como álidos (130,132). Tabela 1: C i é ios de in e p e ação dos esul ados do es e de susce ibilidade aos an ibió icos de aco do com as no mas CLSI (126,130,132). An ibió ico Mé odo C i é ios de In e p e ação S I R Penicilina Disco (10 U) (mm) ≥47,00 27,00-46,00 ≤26,00 E es (µg/ml) ≤0,06 0,12-1,00 ≥2,00 Ce ixima Disco (5 µg) (mm) ≥31,00 ND ND E es (µg/ml) ≤0,25 ND ND Ce iaxona Disco (30 µg) (mm) ≥35,00 ND ND E es (µg/ml) ≤0,25 ND ND Te aciclina Disco (30 µg) (mm) ≥38,00 31,00-37,00 ≤30,00 E es (µg/ml) ≤0,25 0,50-1,00 ≥2,00 Cip o loxacina Disco (5 µg) (mm) ≥41,00 28,00-40,00 ≤27,00 E es (µg/ml) ≤0,06 0,12-0,50 ≥1,00 Azi omicina Disco (15 µg) (mm) ND ND ≤30,00 E es (µg/ml) ND ND ≥2,00 Espec inomicina Disco (100 µg) (mm) ≥18,00 15,00-17,00 ≤14,00 E es (µg/ml) ≤32,00 64,00 ≥128 S – Susce í el, I – Resis ência in e média, R – Resis en e, CMI – Concen ação mínima inibi ó ia; ND – Limi es não de inidos. 2. MATERIAL E MÉTODOS 27 Tabela 2: In e alos de con olo de qualidade pa a N. gono hoeae ATCC 49226 (126,130). An ibió ico In e alos de Con olo de Qualidade de ATCC 49226 Penicilina Disco (10U) (mm) 26-34 CMI (µg/ml) 0,25-1,00 Ce ixima Disco (5µg) (mm) 37-45 CMI (µg/ml) 0,004-0,030 Ce iaxona Disco (30µg) (mm) 39-51 CMI (µg/ml) 0,004-0,015 Te aciclina Disco (30g) (mm) 30-40 CMI (µg/ml) 0,25-1,00 Cip o loxacina Disco (5µg) (mm) 48-58 CMI (µg/ml) 0,001-0,008 Azi omicina Disco (15µg) (mm) 27-36 CMI (µg/ml) 0,125-0,500 Espec inomicina Disco (100µg) (mm) 23-29 CMI (µg/ml) 8,0-32,0 As amos as o am classi icadas de aco do com os seguin es pad ões de esis ência (33,126,133):  CMRNG (Neisse ia gono hoeae com esis ência mediada po mu ações c omossómicas) - Resis ência à penicilina (CMI ≥ 2,0 µg/ml) e com CMI pa a a e aciclina en e 2,0 µg/ml e a 8,0 µg/ml;  PPNG (Neisse ia gono hoeae p odu o a de penicilinases) – Pesquisa de β- lac amase posi i a;  Te R (Resis ência à e aciclina mediada po mu ações c omossómicas) - Pesquisa de ß-lac amase nega i a, susce í el à penicilina (CMI < 2,0 µg/ml) e com esis ência à e aciclina (CMI ≥ 2 µg/ml);  TRNG (Neissei a gono hoeae com esis ência de al o ní el à e aciclina mediada po plasmídeo) – Resis ência de al o ní el à e aciclina de ido à p esença do plasmídeo com o gene e M (CMI ≥ 16 µg/ml);  PenR (Resis ência à penicilina mediada po mu ações c omossómicas) - Pesquisa de ß-lac amase nega i a e esis ência à penicilina mediada po mu ações c omossómicas (CMI ≥ 2 µg/ml);  PenI (Resis ência in e média à penicilina) - Pesquisa de ß-lac amase nega i a, com esis ência in e média à penicilina mediada po mu ações c omossómicas (0,12 µg/ml ≥ CMI ≤ 1,0 µg/ml); 2. MATERIAL E MÉTODOS 28  Te I (Resis ência in e média à e aciclina) - Resis ência in e média à e aciclina (0,5 µg/ml ≥ CMI ≤ 1,0 µg/ml);  QRNG (Neisse ia gono hoeae com esis ência às quinolonas) - Resis ência pa a a cip o loxacina mediada po mu ações c omossómicas (CMI ≥ 1,0 μg/ml);  AznR (Neisse ia gono hoeae com esis ência in e média à azi omicina) – Isolados com CMI ≥ 2 µg/ml à azi omicina; 2.4.1. MÉTODO DE DIFUSÃO EM DISCO O es udo da susce ibilidade aos an ibió icos oi ealizado em odos os isolados de N. gono hoeae pelo mé odo de di usão em disco (126). O inóculo oi ob ido po suspensão em meio de cul u a de Mulle -Hin on (OXOID), a pa i de colónias pu as, após c escimen o du an e a noi e a 36 °C com uma a mos e a de 5% de CO2 no meio de chocola e PVX, endo sido ajus ada a u ação ao equi alen e a 0,5 da escala McFa land (bioMé ieux). Após o ajus e da suspensão, o meio de cul u a GC aga (OXOID) com 1% de suplemen o de c escimen o (Bio i ex – Res o ing Fluid, Bioli e), oi inoculado com es ias po oda a supe ície da placa, odando a mesma 60º, duas ezes. Os discos dos an ibió icos o am colocados na supe ície do meio inoculado com uma dis ância mínima de 24 mm en e cen o a cen o de cada disco. As placas o am in e idas e incubadas a 36 °C em a mos e a de 5% de CO2 du an e 20 a 24 ho as. Pos e io men e, os diâme os das zonas de inibição, incluindo o diâme o do disco, o am medidos e o am u ilizados os c i é ios de in e p e ação pa a classi ica a isolado em es udo como sensí el, com esis ência in e média ou esis en e (126). 2.4.2. MÉTODO ETEST O es e de susce ibilidade aos an ibió icos ealizado pelo mé odo E es ambém oi execu ado pa a odos os isolados de N. gono hoeae incluídos no es udo. O p ocedimen o oi semelhan e ao do mé odo de di usão em disco, em elação à p epa ação da suspensão com o isolado a es uda e a inoculação no meio de cul u a GC com 1% de suplemen o de c escimen o. Uma ou duas i as E es , que se encon a am à empe a u a ambien e, o am colocadas sob e a supe ície do meio inoculado, endo em a enção pa a que a supe ície da i a com o an ibió ico icasse em con a o com a supe ície do meio de cul u a. As placas o am in e idas e incubadas a 36 °C numa a mos e a com 5% de CO2 du an e 20 a 24 ho as. Pos e io men e, os esul ados das 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 35 3.1. RESULTADOS DOS TESTES DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS O mé odo de e e ência pa a o es udo da susce ibilidade aos an ibió icos pa a N. gono hoeae é o mé odo de diluição em aga . No en an o, es e é um mé odo complexo de execu a , pelo que an o o mé odo de di usão em disco, como a me odologia E es êm sido u ilizados pa a es uda a susce ibilidade aos an ibió icos de isolados de N. gono hoeae em subs i uição do mé odo de e e ência (33,130). Os esul ados do es e de susce ibilidade aos an ibió icos pelos mé odos de di usão em disco e E es encon am-se ap esen ados nas abelas 6 e 7, espe i amen e. Tabela 6: Resul ados do es e de susce ibilidade aos an ibió icos pelo mé odo de di usão em disco (126). An ibió ico Concen ação do disco Sensí el n (%) In e médio n (%) Resis en e n (%) Penicilina 10 U 2 (7%) 24 (80%) 4 (13%) Ce ixima 5 µg 30 (100%) 0 (0%) Ce iaxona 30 µg 30 (100%) 0 (0%) Te aciclina 30 g 3 (10%) 13 (43%) 14 (47%) Cip o loxacina 5 µg 16 (57%) 3 (10%) 11 (37%) Azi omicina 15 µg 27 (90%) 3 (10%) Espec inomicina 100 µg 30 (100%) 0 (0%) Tabela 7: Resul ados do es e de susce ibilidade aos an ibió icos pelo mé odo E es (33,126). An ibió ico In e alo de concen ação da i a E es Sensí el n (%) In e médio n (%) Resis en e n (%) Penicilina 0,02-32 µg/ml 8 (27 %) 17 (57%) 5 (17%) Ce ixima 0,016-256 µg/ml 30 (100%) 0 (0%) Ce iaxona 0,002-32 µg/ml 30 (100%) 0 (0%) Te aciclina 0,15-256 µg/ml 12 (40%) 13 (43%) 5 (17%) Cip o loxacina 0,002-32 µg/ml 19 (63%) 0 (0%) 11 (37%) Azi omicina 0,016-256 µg/ml 30 (100%) 0 (0%) 0 (0%) Espec inomicina 0,064-1024 µg/ml 30 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 36 Os esul ados ob idos pelos mé odos de di usão em disco e E es pa a os á ios an ibió icos es udados (penicilina, e aciclina, cip o loxacina e azi omicina) não o am conco dan es en e si, com exceção dos que se e e em à susce ibilidade à ce ixima, à ce iaxona e à espec inomicina. Es es o am conco dan es en e os dois mé odos u ilizados, uma ez que se e i icou que odos os isolados o am susce í eis a es es an ibió icos, como se pode obse a na igu a 13. Figu a 13: Resul ados do es e de susce ibilidade aos an ibió icos dos isolados de N. gono hoeae em es udo, pelos mé odos de di usão em disco e E es . Na Índia, e al como nes e es udo, Singh e al. (147) ap esen a am ambém uma maio disc epância de esul ados pa a a penicilina, cip o loxacina e e aciclina. Os au o es es uda am a susce ibilidade de 295 isolados de N. gono hoeae a a és dos mé odos de di usão em disco e E es pa a a penicilina, cip o loxacina, espec inomicina, ce iaxona e e aciclina. Os esul ados o am conco dan es em 87,5%, 88,5%, 100%, 98,6% e 74,9%, espe i amen e pa a cada an ibió ico. De ido a es as di e enças en e os dois mé odos, decidiu-se apenas discu i os esul ados ob idos pelo mé odo E es , uma ez que, é um mé odo al e na i o pa a a de e minação da concen ação mínima inibi ó ia (CMI) pa a a espécie N. gono hoeae. Vá ios au o es demons a am, an e io men e, que exis e uma ele ada conco dância (acima de 90%) com o mé odo de e e ência (127–129). Além dis o, e como an e io men e ci ado, é um mé odo mais ácil de execu a do que o mé odo de e e ência. Os isolados de N. gono hoeae o am classi icados de aco do com os co esponden es enó ipos de esis ência, endo em con a os alo es ob idos no es e de susce ibilidade aos an ibió icos pelo mé odo E es ( abela 8). 0 5 10 15 20 25 30 S I R S I/R S I/R S I R S I R S I R S I R Penicilina Ce ixima Ce iaxona Te aciclina Cip o loxacina Azi omicina Espec inomicina Núme o de isolados de N.gono hoeae Mé odo di usão em disco Mé odo E es 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 37 Tabela 8: Fenó ipos de esis ência dos isolados de N. gono hoeae ob idos nos exsudados ec ais e u e ais. Fenó ipo de esis ência Iden i icação dos isolados de N. gono hoeae PenI 1, 2*, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20*, 25, 26 e 28* PPNG 21*, 22, 23 e 27 Te I 1, 2*, 3*, 4, 6, 8, 9, 14, 17, 18, 19, 25 e 27 Te R 12 e 29 TRNG 5 e 13 CMRNG 7 QRNG 1, 5, 6, 7, 12, 17, 21*, 22, 23, 26 e 27 Sem esis ências 10, 15, 24, 29 e 30 * - Isolados de N. gono hoeae ob idas a pa i de amos as de exsudados u e ais. 3.1.1. TESTE DE SUSCETIBILIDADE À PENICILINA No es udo da susce ibilidade dos isolados de N. gono hoeae à penicilina ob i e am-se 27% (8/30) susce í eis, 57% (17/30) com esis ência in e média e 17% (5/30) esis en es, dos quais 80% (4/5) o am classi icados como N. gono hoeae p odu o a de penicilinase (PPNG). Em Po ugal, Flo indo e al. (148) obse a am 79,1% (149/187) de isolados de N. gono hoeae esis en es à penicilina, uma p opo ção mui o supe io à ob ida nes e es udo. No en an o, os e e idos au o es ealiza am o es udo en e 2004 e 2009, pa a o qual con ibuí am isolados de 25 labo a ó ios do país (Alga e, Lisboa, Lei ia e Po o) p o enien es na sua maio ia de uma população compos a po homens. No p esen e es udo, o núme o de isolados de N. gono hoeae com esis ência in e média oi supe io aos que ap esen a am esis ência. Allen e al. no Canadá (111), S a nino e al. em I ália (149) e Ilina e al. na Rússia (16) ambém obse a am es a si uação, em que 77,1% (115/149), 40,3% (131/326), 62,2% (289/464) dos isolados ap esen a am esis ência in e média e 12,1% (18/149), 25,5% (83/326) e 11,9% (55/464) o am esis en es, espe i amen e. No es udo que se ap esen a, a maio ia dos isolados com esis ência a es e an ibió ico o am PPNG (80%). De modo semelhan e, os isolados esis en es à penicilina (100%) o am classi icados como PPNG, no es udo de S a nino e al.(150). No en an o, a p opo ção de PPNG em di e en es á eas geog á icas é di e en e. Po exemplo, na China (2000 a 2012) (151) oi de 36,5% (429/1175), em Po ugal (2004 a 2009) (148) oi de 13,4% (29/149) e no Canadá (2008) (111) oi de 27,8% (5/18). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 38 A ele ância do enó ipo PPNG em isolados de N. gono hoeae esul a do ac o de con e em um plasmídeo com o gene blaTEM-1, que codi ica uma β-lac amase ipo TEM-1. Es a enzima hid olisa o anel β-lac âmico das penicilinas, ina i ando o an ibió ico (152). Após o apa ecimen o dos isolados PPNG em 1976, es as es i pes p opaga am-se apidamen e a ní el in e nacional, o que e e um g ande impac o na saúde pública na década de 1980, ob igando a uma mudança pa a uma e apêu ica al e na i a (153). 3.1.2. TESTE DE SUSCETIBILIDADE ÀS CEFALOSPORINAS DE TERCEIRA GERAÇÃO A maio ia dos isolados de N. gono hoeae oi susce í el à ce ixima e à ce iaxona. No en an o, hou e 1/30 (3,3%) isolado que ap esen ou uma CMI = 0,25 µg/ml pa a a ce ixima. Os c i é ios de in e p e ação da susce ibilidade às ce alospo inas de e cei a ge ação são di e en es po pa e das en idades CLSI e EUCAST. De aco do com a p imei a, a susce ibilidade à ce iaxona e à ce ixima é de inida com CMI ≤ 0,25 µg/ml, po an o, isolados com CMI > 0,25 µg/ml são conside ados não susce í eis (126). De aco do com EUCAST, a susce ibilidade aos an ibió icos é de inida po CMI ≤ 0,12 µg/ml, sendo que, isolados com CMI > 0,12 µg/ml, são classi icados como susce ibilidade diminuída/ esis ência (131). Além, dis o o CDC desen ol eu alo es de ale a pa a a ce ixima com CMI ≥ 0,25 µg/ml e pa a a ce iaxona com CMI ≥ 0,125 µg/ml. A OMS de iniu susce ibilidade diminuída pa a a ce ixima com CMI ≥ 0,25 µg/ml e pa a a ce iaxona com CMI ≥ 0,125 µg/ml (10,38). Po an o, o e e ido isolado, de aco do com as no mas de CLSI é susce í el, com o CDC ap esen a um alo de ale a e com EUCAST e a OMS ap esen a susce ibilidade diminuída/ esis ência à ce ixima. É necessá io ealiza mais es udos pa a cla i ica os c i é ios de in e p e ação do es e de susce ibilidade às ce alospo inas de e cei a ge ação. A diminuição da susce ibilidade de N. gono hoeae às ce alospo inas de e cei a ge ação su giu pela p imei a ez na Ásia. No Japão, en e 1999 e 2002, a pe cen agem de isolados com CMI ≥ 0,5 µg/ml pa a a ce ixima aumen ou de 0% a 30 % (59). Em Po ugal, Flo indo e al. (148) obse ou 2,1% (4/187) isolados com susce ibilidade diminuída à ce iaxona (0,125 µg/ml ≥ CMI ≤ 0,25 µg/ml). A diminuição da susce ibilidade às ce alospo inas de e cei a ge ação ambém em sido obse ada em ou os países da União Eu opeia (UE). Em 2011, num es udo com 21 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 39 países, obse a am-se 7,6% (145/1902) isolados com susce ibilidade diminuída à ce ixima, e pela p imei a ez, o am de e ados dez isolados com diminuição da susce ibilidade à ce iaxona (13). Na população de HSH, a ní el nacional nos EUA, os isolados de N. gono hoeae ap esen a am um aumen o da CMI pa a a ce ixima e pa a a ce iaxona de 0,2% (2006) pa a 3,8% (2011) e de 0,0% (2006) pa a 1,0% (2011), espe i amen e (38). 3.1.3. TESTE DE SUSCETIBILIDADE À TETRACICLINA Em elação à e aciclina os esul ados da susce ibilidade o am os seguin es 40% (12/30) susce í eis, 43% (13/30) com esis ência in e média e 17% (5/30) esis en es. Dois isolados (6,7%) o am classi icados como N. gono hoeae com esis ência de al o ní el à e aciclina mediada po plasmídeo (TRNG). Apenas 3,3% (1/30) isolados o am classi icados como N. gono hoeae com esis ência mediada po mu ações c omossómicas (CMRNG). Tal como no es udo da penicilina, ambém no caso da e aciclina, o núme o de isolados com esis ência in e média é supe io ao núme o de isolados com esis ência. No Canadá em 2011(111) e na I ália em 2008 (149) ambém ob i e am 47% (70/149) e 53% (172/326) de isolados com esis ência in e média e 25,5% (38/149) e 19,1% (62/326) de isolados com esis ência à e aciclina, espe i amen e. O p imei o caso de N. gono hoeae esis en e à e aciclina (TRNG) isolado em Po ugal oi documen ado em 1990, em um indi íduo a endido num Cen o de In eções Sexualmen e T ansmissí eis, em Lisboa (154). Na Eu opa em 2010 (155) e na China em 2014 (151) ela a am uma p e alência de isolados de N. gono hoeae com o enó ipo TRNG supe io à des e es udo, 16% (205/1284) e 46,4% (639/1378), espe i amen e. O es udo Eu opeu oi ealizado em 2008 e en ol eu 17 países da Eu opa, a maio ia da população e a compos a po homens, não ap esen ando a sua endência sexual. O es udo na China oi ealizado en e 2000 a 2012, com indi íduos que equen a am uma clínica de de ma ologia em Guangdong. Na Eu opa em 2010 (155) e na China em 2014 (136) obse a am p e alências de isolados classi icados como CMRNG supe io es com 27% (1284) e 27,8% (334). O p imei o caso de TRNG oi iden i icado pela p imei a ez em 1985, na Geo gia (EUA). O apa ecimen o dos p imei os conjun os de TRNG conduziu a um es udo de 3 semanas na Geo gia, onde se obse ou que 3,4% (6/174) o am iden i icados como 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 40 TRNG (66). Os isolados TRNG dispe sa am-se apidamen e, uma ez que, em ab il de 1987, o enó ipo TRNG oi de e ado em 17 es ados dos EUA (156). 3.1.4. TESTE DE SUSCETIBILIDADE À CIPROFLOXACINA Em elação à cip o loxacina os esul ados da susce ibilidade o am os seguin es 63% (19/30) susce í eis e 37% (11/30) esis en es. Es e úl imo g upo oi classi icado com o enó ipo de N. gono hoeae esis en e às quinolonas (QRNG). Ní eis ele ados de isolados de N. gono hoeae esis en es à cip o loxacina êm sido egis ados em á ios locais da Eu opa em 2011 (157) num es udo com 17 países da UE, 63% (861/1366) de isolados ap esen a am esis ência a es e an ibió ico (157). A axa de isolados esis en es a es e an ibió ico é semelhan e à p opo ção ela ada po ou os es udos, como po exemplo, em Po ugal em 2010(148) e em I ália em 2008(149) ob i e am 37,4% (70/187) e 34,2% (111/326) isolados com esis ência à cip o loxacina, espe i amen e (15,16,22). A ualmen e, á ios au o es obse a am que a p e alência de QRNG se man ém ele ada no mundo (62,106,107,158). Es i pes de N. gono hoeae com mu ações nos aminoácidos 91 e 95 na subunidade Gy A da enzima ADN gi ase, que causam diminuição da susce ibilidade ou esis ência à cip o loxacina aumen am o i ness bac e iano em compa ação com es i pes de N. gono hoeae do ipo sel agem, no mesmo modelo mu ino (159). Es e é um exemplo de que os mecanismos de esis ência an imic obiana podem aumen a a sob e i ência e o i ness das bac é ias, jus i icando o mo i o pelo qual es es mecanismos de esis ência são man idos apesa da in e upção dos an imic obianos especí icos nos egimes de a amen o (106,158,160). A pe sis ência dos de e minan es de esis ência an imic obiana pode de e -se ao ac o de não a e a em signi ica i amen e o i ness bac e iano (ap idão biológica da bac é ia em sob e i e , alimen a -se e ep oduzi -se, que pode se demons ada a a és do i mo de c escimen o, de capacidade de i ulência e/ou da capacidade de ansmissão bac e iana en e hospedei os); de diminuí em o i ness bac e iano, su gindo no en an o, ou as mu ações secundá ias compensa ó ias; e melho a em a ap idão bac e iana na sua capacidade de ansmissão e de i ulência (159). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 3.1.5. TESTE DE SUSCETIBILIDADE À AZITROMICINA Todos os isolados de N. gono hoeae demons a am se susce í eis à azi omicina. A ualmen e a azi omicina é u ilizada jun amen e com a ce iaxona como e apêu ica combinada pa a o a amen o da in eção po N. gono hoeae (38). A esis ência a es e an ibió ico em isolados de N. gono hoeae em Po ugal, de aco do com os dados de ESSTI (Vigilância Eu opeia de Doenças Sexualmen e T ansmissí eis), em 2006 e 2007 oi de 6,9% e 8,3%, espe i amen e (155). Na Eu opa em sido egis ado um aumen o dos ní eis de esis ência à azi omicina. Os au o es Cole e al. em 2009 (157) e Cole e al. em 2010 (155) ealiza am es udos com 17 países da UE e obse a am 2% (24/1285) e 13% (180/1366) de isolados esis en es à azi omicina. Isolados com um ní el ele ado de esis ência à azi omicina (CMI ≥ 256 µg/L) o am de e ados em I ália (150), na A gen ina (161), na Escócia (162), em Ingla e a (163) e na F ança (164). A azi omicina não é ecomendada como o único an imic obiano no a amen o pa a a in eção po N. gono hoeae, mas em um papel impo an e na e apêu ica combinada com as ce alospo inas de e cei a ge ação (165). 3.1.6. TESTE DE SUSCETIBILIDADE À ESPECTINOMICINA Todos os isolados de N. gono hoeae o am susce í eis à espec inomicina. Em Po ugal, Flo indo e al. (148) ambém obse a am que odos os isolados de N. gono hoeae o am susce í eis à espec inomicina. Isolados esis en es à espec inomicina o am ela ados em 1967 nos Países Baixos (166), 1981 nas Filipinas (167), 1981 na Co eia do Sul (168) e 1983 em Ingla e a (169). Pos e io men e, espec inomicina oi emo ida como mono e apia empí ica de p imei a linha pa a a in eção po N. gono hoeae, a ní el in e nacional (92). A ualmen e, an o quan o é do nosso conhecimen o, na Eu opa os isolados de N. gono hoeae ap esen am susce ibilidade à espec inomicina, al como obse ado po á ios au o es (56,155,157,168). Es e an ibió ico pode se uma al e na i a e apêu ica em doen es in e ados po N. gono hoeae, com in ole ância às ce alospo inas. No en an o, a espec inomicina não es á disponí el em mui os países, e eme-se que oco a um desen ol imen o ápido de esis ência, caso seja u ilizada como e apêu ica de p imei a linha. Além disso, 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 42 espec inomicina é pouco e icaz no a amen o da in eção po N. gono hoeae da a inge (170). 3.2. PESQUISA DE MUTAÇÕES EM GENES QUE CONTRIBUEM PARA A RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS A pesquisa de mu ações nos isolados de N. gono hoeae com esis ência ou esis ência in e média aos an ibió icos es udados oi ealizada no domínio da anspep idase da PBP2 (gene penA), no domínio de ligação ao ADN do ep esso M R (gene m R), na sequência que codi ica o p omo o do gene m R e na egião QRDR da subunidade Pa C da opoisome ase IV (gene pa C) e da subunidade Gy A da enzima ADN gi ase (gene gy A). O gene penA (nucleó idos 1011 a 1869) oi ampli icado em 18 isolados de N. gono hoeae (CMRNG e PenI), o gene m R e a sequência que codi ica o p omo o do gene m R (nucleó idos 853 a 1253) o am ampli icados em 23 isolados de N. gono hoeae (CMRNG, PenI, TRNG, Te R e Te I), e as egiões QRDR dos genes pa C (nucleó idos 121 a 420) e gy A (nucleó idos 17 a 433) o am ampli icadas em 11 isolados de N. gono hoeae (QRNG). 3.2.1. PESQUISA DE MUTAÇÕES NO REPRESSOR M R E NO PROMOTOR DO GENE m R A pesquisa de mu ações no domínio de ligação ao ADN do ep esso M R [aminoácidos (aa) 1 a 60] e no p omo o do gene m R oi ealizada em 23 isolados de N. gono hoeae com os enó ipos CMRNG, PenI, TRNG, Te R e Te I ( abela 9 e Anexo A). Todos os isolados com os enó ipos CMRNG, PenI, TRNG, Te R e Te I ap esen a am mu ações na egião do p omo o do gene m R e/ou no domínio de ligação ao ADN do ep esso M R. Mu ações no gene m R e no p omo o do gene m R, an o isoladamen e ou em combinação, causam uma sob e-exp essão da bomba de e luxo, diminuindo a susce ibilidade de N. gono hoeae a á ias an ibió icos (mac ólidos, penicilinas e e aciclinas) (81,83,84). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 43 Tabela 9: Mu ações no domínio de ligação ao ADN no ep esso M R e no p omo o do gene m R, enó ipos dos isolados es udados, ob idos a pa i de exsudados ec ais e exsudados u e ais. Fenó ipo de esis ência Iden i icação dos isolados N. gono hoeae Mu ações no ep esso M Ra Mu ações no p omo o do gene m R 11 A39T +T PenI 20* e 26 A39T WT 16 e 28* A39T; R44H WT Te I 3*, 4, 14 A39T; R44H WT Te R 29 A39T; Y48D WT PenI; Te I 18 e 19 A39T; R44H WT 1, 6, 8, 17, 25 WT -A 2* G45D WT 9 b PenI; TRNG 13 A39T; Y48D WT 5 A39T WT PenI; Te R 12 WT -A PenR; Te I 27 A39T WT CMRNG 7 WT -A WT – Isolado do ipo sel agem, ou seja, a sequência de ADN do isolado em es udo é igual à sequência de ADN do isolado de e e ência; a – As mu ações o am pesquisadas nos aa 1 a 60 do ep esso M R; b- Sequência que codi ica o p omo o do gene m R do isolado nº 9 ap esen a 100% de iden idade nucleo ídica com a es i pe N. meningi idis C:2b,4:P1.5 (Núme o de acesso no GenBank AJ270527); * - Isolados de N. gono hoeae ob idas a pa i de amos as de exsudados u e ais. O isolado nº 9 ap esen ou a sequência ampli icada (que codi ica o p omo o do gene m R e o domínio de ligação ao ADN do ep esso M R) com 100% de iden idade nucleo ídica com a es i pe Neisse ia meningi idis LNP21362 (GenBank CP006869), con i mada a a és do p og ama BLAST (Basic Local Alignmen Sea ch Tool) (h p://blas .ncbi.nlm.nih.go /Blas .cgi) do Na ional Cen e o Bio echnology In o ma ion (NCBI) ( igu as 14 e 15). Figu a 14: Ele o o ese dos p odu os de PCR dos isolados de N. gono hoeae (nº1 a nº13) após ampli icação do p omo o do gene m R e do gene pa cial m R. A banda do isolado nº 9 ap esen a maio amanho molecula . CP – Con olo posi i o e CN – Con olo nega i o. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 CP CN 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 44 Figu a 15: Alinhamen o com sequências que codi icam o p omo o do gene m R e pa e do gene m R da es i pe N. gono hoeae CH95 (GenBank Z25796), da es i pe N. meningi idis LNP21362 (GenBank CP006869) e do isolado nº 9 T embizki e al. (171) ambém e i ica am que dez isolados de N. gono hoeae inham a egião do p omo o do gene m R com uma iden idade nucleo ídica de 76,9% com o isolado N. gono hoeae FA1090 e 94,8% com um isolado N. meningi idis (Núme o de acesso no GenBank CP002422) (171). A exposição de Neisse ia spp. a agen es an imic obianos (no a amen o da in eção po N. gono hoeae ou ou as in eções) pode esul a na seleção de es i pes esis en es, de ido a mu ações gené icas espon âneas e/ou de ido a aquisição de odo ou pa es de genes de esis ência. Assim, es a pode su gi inicialmen e em espécies de Neisse ia spp. comensais, que a uam como um ese a ó io de genes que con e em esis ência, e podem se ans e idos pa a es i pes de N. gono hoeae a a és do p ocesso de ans o mação (capacidade de adqui i pa es de ADN dispe sos no meio e u ilizá-lo com se osse ADN p óp io) (83,107,172). A in eção po N. gono hoeae na a inge ge almen e é assin omá ica. Pa ece que, N. gono hoeae e Neisse ia spp. comensais podem coexis i po longos pe íodos na a inge, onde pode oco e a maio ia das ans e ências de ma e ial gené ico en e as e e idas espécies. Uma ez os de e minan es de esis ência adqui idos po N. gono hoeae podem oco e ans e ência de sequências de ADN en e es i pes de N. gono hoeae, ia ans o mação, podendo ansmi i apidamen e os de e minan es po oda a população (4,173). 3.2.2. PESQUISA DE MUTAÇÕES QUE CONTRIBUEM PARA A RESISTÊNCIA À PENICILINA A pesquisa de mu ações, no domínio da anspep idase da PBP2 (aa 340 a 575), no domínio de ligação do ep esso M R (aa 1 a 60) e no p omo o do gene m R oi 51 4. CONCLUSÃO A axa de in eção po Neisse ia gono hoeae ob ida no p esen e es udo oi semelhan e a ou os es udos ealizados com a mesma população em cidades dos EUA (17,146). Nes e es udo, o es e de susce ibilidade aos an ibió icos oi ealizado pelos mé odos de di usão em disco e E es , como al e na i as ao mé odo de e e ência (33,130). Decidiu- se u iliza os esul ados ob idos pela me odologia E es , uma ez que se sabe da exis ência de uma ele ada conco dância com o mé odo de e e ência, pa a es uda a susce ibilidade aos an ibió icos (127–129). O núme o de isolados de N. gono hoeae que ap esen a am esis ência à penicilina oi in e io ao ob ido po Flo indo e al. (148). Ainda em elação à penicilina, a axa de isolados com esis ência in e média e com esis ência oi semelhan e às p opo ções ob idas po Allen e al. (111), S a nino e al. (149) e Ilina e al. (16). Tan o quan o é do nosso conhecimen o, em Po ugal não exis em es udos sob e a esis ência in e média de N. gono hoeae a es e an ibió ico, assim como, pa a odos os an ibió icos es udados. No p esen e es udo, a maio ia dos isolados esis en es à penicilina e am p odu o es de β-lac amases (PPNG) al como no es udo de S a nino e al. (150). No en an o, ou os au o es ela a am alo es mui o mais baixos de isolados PPNG (16,148,151). A maio ia dos isolados de N. gono hoeae oi susce í el às ce alospo inas de e cei a ge ação. Apenas um isolado ap esen ou susce ibilidade diminuída à ce ixima. Em Po ugal (148) e em ou os países da União Eu opeia (13) ambém o am ela ados isolados com susce ibilidade diminuída a es e an ibió ico. Isolados classi icados como esis ência de al o ní el à e aciclina (TRNG) êm sido e e idos, po á ios au o es, com uma axa supe io à ob ida nes e es udo (151,155). O mesmo oi obse ado ela i o ao enó ipo CMRNG, na sua elação com es udos ealizados na China (136) e na Eu opa (155). No en an o, a p opo ção de isolados com esis ência à cip o loxacina (QRNG) oi semelhan e aos esul ados ob idos nos es udos ealizados po Flo indo e al. (148) e S a nino e al. (149). Todos os isolados es udados o am susce í eis à azi omicina. No en an o, o núme o de isolados com esis ência a es e an ibió ico em indo a aumen a na Eu opa e no es o do mundo (155,157,161). Em elação, à espec inomicina odos os isolados o am susce í eis, al como se em e i icado po oda a Eu opa, de aco do com ou as publicações (56,155,157,168). 4. CONCLUSÃO 52 Nes e es udo, a sequência que codi ica o p omo o do gene m R de um isolado de N. gono hoeae ap esen ou 100% de iden idade nucleo ídica com isolados de N. meningi idis. Es e enómeno e le e a ele ada axa de ans o mação que oco e em N. gono hoeae. As espécies do géne o Neisse ia êm a capacidade de ans e i em sequências de ADN en e si. É ele an e quando oco em ans e ências de de e minan es de esis ência, que podem acilmen e dispe sa po oda a população de N. gono hoeae (83,107,172). Em elação à pesquisa de mu ações nos isolados de N. gono hoeae, o eduzido núme o de casos posi i os não pe mi iu e i a conclusões com alo es a ís ico quan i a i o, no en an o, quali a i amen e, pe mi iu comp eende que as mu ações de e adas são idên icas às ob idas po ou os au o es, es ando associadas a enó ipos de esis ência. Vá ios au o es concluí am que as mu ações (no gene m R e no p omo o do gene m R) que causam a sob e-exp essão da bomba de e luxo M C-M E-M D diminuem a susce ibilidade de N. gono hoeae à penicilina, e aciclina e mac ólidos (81,83,84). Nes e es udo ambém se obse ou que odos os isolados com esis ência in e média e esis ência à penicilina e à e aciclina (os enó ipos CMRNG, PenI, TRNG, Te R e Te I) ap esen a am mu ações na egião do p omo o do gene m R e/ou no domínio de ligação ao ADN do ep esso M R. Os isolados es udados e ca ac e izados com esis ência in e média ou esis ência à penicilina, com exceção de um isolado, ap esen a am uma inse ção do ácido aspá ico (D) na posição 345 na p o eína PBP2, associação ambém oi obse ada po á ios au o es (16,74,174). A CMI à penicilina ambém pode se aumen ada po mu ações especí icas que aumen am a sob e-exp essão da bomba e pela diminuição da pe meabilidade da memb ana ex e na a a és da po ina B (p o ocada pela p esença de mu ações no gene po B) ambém causa uma diminuição da susce ibilidade dos isolados de N. gono hoeae ao e e ido an ibió ico (79,105,106,183). Nos esul ados des e es udo, obse a am-se que os isolados com esis ência in e média ou esis ência à penicilina ap esen a am mu ações na bomba de e luxo M C-M E-M D. O que es á de aco do com ou os au o es, de que as e e idas mu ações causam esis ência in e média à penicilina e que con ibuem no desen ol imen o de esis ência ao e e ido an ibió ico (81,83,84,176). Um isolado des e es udo ap esen ou a es u u a mosaica XXXIV. Es i pes con endo o e e ido mosaico podem desen ol e a mu ação A501P com a p obabilidade do apa ecimen o de es i pes ex ensi amen e esis en es, em odo o mundo, uma ez que 4. CONCLUSÃO 53 êm sido ela ados em á ios países isolados de N. gono hoeae com o mosaico XXXIV (4,111,177–179). A diminuição da susce ibilidade des e mic o ganismo à e aciclina, al como pa a a penicilina, ambém pode se obse ada na p esença de mu ações que conduzem à sob e- exp essão da bomba de e luxo M C-M E-M D e de mu ações que al e am a pe meabilidade da memb ana ex e na bac e iana (mu ações no gene po B) (79,105,183). Em odos os isolados classi icados como esis en es à cip o loxacina es a am p esen es duas mu ações na subunidade Gy A e uma mu ação na subunidade Pa C que o am e i icadas po ou os au o es es a em associadas a isolados de N. gono hoeae com esis ência à cip o loxacina (102,143,180). O mé odo de cul u a e os es es de susce ibilidade de N. gono hoeae aos an ibió icos, a sequenciação do genoma e o apa ecimen o de ou as ecnologias molecula es, combinadas com dados epidemiológicos e análises ilogené icas, êm p opo cionado uma melho comp eensão da dinâmica da eme gência nacional e in e nacional, ansmissão e e olução da esis ência dos isolados de N. gono hoeae aos an imic obianos. A ualmen e, o egime e apêu ico de p imei a linha ecomendado nos Es ados Unidos da Amé ica e na Eu opa é a combinação da ce iaxona com a azi omicina (184). No en an o, a susce ibilidade à ce iaxona em indo a diminui a ní el mundial, nos úl imos anos. A esis ência à azi omicina é p e alen e em alguns países e es á a eme gi apidamen e (150,162–164). Nes e es udo, os isolados de N. gono hoeae ap esen a am esis ência e esis ência in e média à penicilina (73%), à e aciclina (60%) e à cip o loxacina (37%), e o am susce í eis à ce ixima, à ce iaxona, à azi omicina e à espec inomicina. Po an o, os isolados de N. gono hoeae ci culan es na população en e HSH, na á ea de Lisboa, são susce í eis à e apêu ica ecomendada a ualmen e. Uma no a possibilidade e apêu ica se á a u ilização da espec inomicina que se ia ambém e icaz em Po ugal. No en an o, os p oblemas com a disponibilidade do á maco, em mui os países eu opeus, limi am o posicionamen o des e an ibió ico nas no mas de a amen o de N. gono hoeae e pode não se e icaz no a amen o da in eção po N. gono hoeae na a inge (63). De uma pe spe i a global de saúde pública, num cu o espaço de empo, é essencial a inclusão de um no o egime e apêu ico com no os agen es an imic obianos ou ou os compos os e apêu icos. 4. CONCLUSÃO 54 No en an o, é necessá io e em con a que N. gono hoeae desen ol eu esis ência a odos os an imic obianos in oduzidos na e apia de p imei a linha du an e os úl imos 70 a 80 anos. Po es as azões, é impe a i o in es i não só na pesquisa de de i ados de an imic obianos, mas ambém no desen ol imen o e in es igação de no os al os e abo dagens e apêu icas pa a o a amen o da in eção po es e mic o ganismo. O e o ço das capacidades de diagnós ico, o uso co e o de an ibió icos, a no i icação de casos de in eção po N. gono hoeae com susce ibilidade diminuída aos an imic obianos, a igilância de esis ência, são essenciais. 55 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Bignell C, Fi zGe ald M. UK na ional guideline o he managemen o gono hoea in adul s, 2011. In J STD AIDS. 2011;22:541–7. 2. Bignell C, Unemo M, Jensen J, Babayan K, Ba on S, Cusini M, e al. 2012 Eu opean guideline on he diagnosis and ea men o gono hoea in adul s. In J STD AIDS. 2013;24:85–92. 3. Unemo M, Golpa ian D, Sy e sen G, Ves heim D, Moi H. Two cases o e i ied clinical ailu es using in e na ionally ecommended i s -line ce ixime o gono hoea ea men , No way, 2010. Eu Su eill. 2010;15:4–6. 4. 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E olu ion o Neisse ia gono hoeae is a con inuing challenge o molecula de ec ion o gono hoea: alse nega i e gonococcal po A mu an s a e sp eading in e na ionally. Sex T ansm In ec . 2013;89(3):197–201. 185. Ku ahashi U. An ibio ics LVSM. h p://an ibio icsl sm.weebly.com/index.h ml, acedido a 15 de No emb o de 2015. 70 6. ANEXOS ANEXO A – SEQUÊNCIAS DE NUCLEÓTIDOS E AMINOÁCIDOS 6. ANEXOS 71 Figu a A1: Sequência pu a i a pa cial de aminoácidos do ep esso M R dos isolados de Neisse ia gono hoeae. As mu ações o am pesquisadas nos aa 1 a 60 do ep esso M R, a a és da compa ação da sequência de aminoácidos da es i pe de N. gono hoeae CH95 (núme o de acesso no GenBank: CAA81045). 6. ANEXOS 72 Figu a A2: Sequência de nucleó idos do p omo o do gene m R dos isolados de Neisse ia gono hoeae. A pesquisa de mu ações no p omo o do gene m R oi ealizada a a és da compa ação das sequências de nucleó idos da es i pe de N. gono hoeae CH95 (núme o de acesso no GenBank: Z25796). RI – Região de epe ição in e ida; * - Codão de iniciação. 6. ANEXOS 73 Figu a A3.1: Sequência pu a i a pa cial de aminoácidos da PBP2 dos isolados de Neisse ia gono hoeae. As mu ações o am pesquisadas nos aminoácidos 340 a 575 na PBP2, a a és da compa ação da sequência de aminoácidos da es i pe de N. gono hoeae LM306 (Núme o de acesso no GenBank: M32091). 6. ANEXOS 74 Figu a A3.2: Sequência pu a i a pa cial de aminoácidos da PBP2 dos isolados de Neisse ia gono hoeae (con inuação). As mu ações o am pesquisadas nos aminoácidos 340 a 575 na PBP2, a a és da compa ação da sequência de aminoácidos da es i pe de N. gono hoeae LM306 (Núme o de acesso no GenBank: M32091). 6. ANEXOS 75 Figu a A4: Sequência pu a i a pa cial de aminoácidos da enzima de ADN gi ase dos isolados de N. gono hoeae. A pesquisa de mu ações oi ealizada na egião QRDR da subunidade Gy A do ADN gi ase (aminoácidos 55 a 110) a a és da compa ação com a sequência de aminoácidos da e e ida subunidade da es i pe MS11 (núme o de acesso no GenBank: AAA82128). 6. ANEXOS 76 Figu a A5: Sequência pu a i a pa cial de aminoácidos da enzima Topoisome ase IV dos isolados de Neisse ia gono hoeae. A pesquisa de mu ações oi ealizada na egião QRDR da subunidade Pa C da opoisome ase IV (aminoácidos 66 a 119), a a és da compa ação com a sequência de aminoácidos das e e idas subunidades da es i pe MS11 (núme o de acesso no GenBank: AAA82151).