Caracterização preliminar da bioenergética do efluxo pelo sistema AcrAB-TolC em Escherichia coli

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA CARACTERIZAÇÃO PRELIMINAR DA BIOENERGÉTICA DO EFLUXO PELO SISTEMA Ac AB-TolC EM Esche ichia coli SUSANA CRISTINA NUNES SANTOS COSTA DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM MICROBIOLOGIA MÉDICA OUTUBRO DE 2010 UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA CARACTERIZAÇÃO PRELIMINAR DA BIOENERGÉTICA DO EFLUXO PELO SISTEMA Ac AB-TolC EM Esche ichia coli SUSANA CRISTINA NUNES SANTOS COSTA DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM MICROBIOLOGIA MÉDICA O ien ado : P o esso Dou o Miguel Vi ei os Labo a ó io onde o abalho expe imen al oi desen ol ido: Unidade de Ensino e In es igação de Micobac é ias Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, Uni e sidade No a de Lisboa OUTUBRO DE 2010 i Comunicações em cong essos Os esul ados ap esen ados o am objec o de ap esen ação em co-au o ia das seguin es comunicações em cong essos, sob e a o ma de Pos e : Susana Cos a, Ana Ma ins, Gab iella Spengle , Leona d Ama al e Miguel Vi ei os. 2009. Bioene ge ic Cha ac e iza ion o e lux in Esche ichia coli s ains, In Ac a Mic obiologica e Immunologica Hunga ica ol. 56 (suppl.) pp. 134. Second Cen al Eu opean Fo um o Mic obiology. Kesz hely, Hung ia, 7-9 Ou ub o 2009. Susana Cos a, Ana Ma ins, Gab iella Spengle , Leona d Ama al e Miguel Vi ei os. 2009. ATPase inhibi o s as new e lux pump inhibi o s o Esche ichia coli, In li o de abas ac s do Cong esso Nacional Mic obio ec09. Vilamou a, Po ugal, 28-30 No emb o 2009. Ana Ma ins, Gab iella Spengle , Susana Cos a, Miguel Vi ei os e Leona d Ama al. 2009. In luence o Calcium and pH in he accumula ion and e lux o e hidium b omide, In li o de abas ac s do Cong esso Nacional Mic obio ec09. Vilamou a, Po ugal, 28-30 No emb o 2009. ii Ag adecimen os Es e espaço é dedicado a odos aqueles que pa icipa am di ec a ou indi ec amen e e que es i e am ao meu lado du an e a ealização des e abalho. Mais uma e apa concluída… e a mui os de ocês o de o… O meu since o ag adecimen o a odos. Ao meu o ien ado , P o esso Dou o Miguel Vi ei os, Di ec o da Unidade de Micobac é ias, do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, pela disponibilidade em pa ilha o seu sabe e pelo in e esse demons ado desde o p imei o momen o. Pela paciência e empenhamen o com que acompanhou a elabo ação des a disse ação. Pelas suas pala as de incen i o que o na am possí eis a sua ealização, mesmo quando udo pa ecia indica o con á io. Ob igado po me e ajudado a não desis i . À P o esso a Dou o a Isabel Cou o, pela disponibilidade, suges ões e in e esse demons ado em odas as ases que le a am à conc e ização des e abalho, e po odo o apoio que me concedeu desde o p imei o dia. À Unidade de Ensino e In es igação de Micobac é ias, do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical da Uni e sidade No a de Lisboa, pelas condições labo a o iais disponibilizadas, e a odos os colegas de labo a ó io pelo companhei ismo e boa disposição com que azem in es igação e po es a em semp e dispos os a ensina o que sabem. À Ana Ma ins e Gab iella Spengle pela cumplicidade e espí i o de en eajuda que semp e exis iu en e nós du an e a ealização des e abalho. “Köszönök minden Ananak és Gabinak”. À Diana Machado e So ia Cos a, pela pa ilha de conhecimen os, pela ajuda e comp eensão nos momen os di íceis. Diana, o emp és imo do compu ado oi uma ajuda p eciosa, sem ele a ase inal e ia sido ainda mais caó ica. Às ins i uições o ganizado as do Mes ado, Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, Faculdade de Ciências Médicas, Ins i u o de Tecnologia Química e Biológica, e Faculdade de Ciências e Tecnologia, pela opo unidade cedida. iii À Dou o a Ma a Ma ins, pelos conselhos semp e ú eis, pelas pala as de apoio e pelo exemplo. A odos os elemen os da Unidade de Vi ologia, pelo apoio, mo i ação e amizade du an e a ealização des e p ojec o, pelos aleg es momen os de descon acção e cama adagem. Aos meus amigos, pela cons an e mo i ação e po odos os momen os de con í io pa ilhados, mas acima de udo ob igado po me en ende em. A oda a amília Nunes, um p o undo e since o ob igado pelo ca inho, apoio e acima de udo po ac edi a em em mim. Ao Má io, po es a semp e ao meu lado em odos os momen os, pela paciência, dedicação, incen i o e pelo seu apoio incondicional. Aos meus pais, que an os sac i ícios ize am pa a eu chega onde cheguei e que semp e me ize am ac edi a que só é impossí el aze o que não nos p opomos se iamen e aze e a quem eu que o dedica es a ese. Mui o ob igado a odos. i Resumo A esis ência aos an ibió icos em bac é ias G am-nega i as pode se aumen ada pela ex usão de an ibió icos a a és de sis emas de e luxo. Em Esche ichia coli, o p incipal sis ema de e luxo é o Ac AB-TolC o qual em como p incipal on e ene gé ica a o ça p o o-mo iz. Es e abalho p e endeu es uda alguns aspec os essenciais da bioene gé ica na ac i idade de e luxo de E. coli usando ês es i pes bem ca ac e izadas geno ipica e eno ipicamen e. Foi u ilizado um mé odo luo imé ico semi-au omá ico no qual a luo escência do luo oc omo b ome o de e ídeo, subs a o de bombas de e luxo oi seguida, pe mi indo a medição em empo eal da ac i idade de e luxo e acumulação de luo oc omo (inibição do e luxo). A u ilização de b ome o de e ídeo é pa icula men e an ajosa pois emi e baixa luo escência no ex e io da célula bac e iana o nando-se ex emamen e luo escen e no seu in e io . Es e mé odo é uma no a aplicação do e mociclado em empo eal Ro o GeneTM 3000 que pe mi e o cálculo da ciné ica de anspo e e lec indo o balanço en e acumulação de subs a o po di usão passi a a a és da memb ana e a sua ex usão/e luxo, p opo cionando uma de ecção ápida e económica de inibido es de e luxo. Os esul ados ob idos mos am, pa a odas as es i pes, que a GLU e o pH a ec am a acumulação e o e luxo do b ome o de e ídeo. De odos os inibido es de ias biossin é icas es ados, o o o anada o de sódio, oi o que demons ou maio ac i idade inibi ó ia, a qual é e e ida na p esença de GLU. Em conclusão, es e es udo mos a que a ac i idade de e luxo de E. coli depende não só da os o ilação oxida i a po ia da o ça p o o-mo iz mas ambém da ene gia p o enien e da hid ólise de ATP pelas ATPases. O o o anada o de sódio em po encial pa a se um no o inibido de bombas de e luxo de la go espec o. A ecnologia u ilizada nes e abalho demons ou se ap op iada pa a a ca ac e ização bioene gé ica da ac i idade de bombas de e luxo e pe mi e a selecção de no os inibido es de bombas de e luxo em bac é ias. Abs ac An ibio ic esis ance in G am-nega i e bac e ia can be inc eased by ex usion o he an ibio ic h ough e lux sys ems. In Esche ichia coli, he majo e lux pump sys em is he Ac AB-TolC which is mainly d i en by ene gy coming om he p o on mo i e o ce. In his wo k was s udied basic aspec s o he bioene ge ics o he e lux ac i i y o E. coli using h ee geno ipically and pheno ipically well cha ac e ized s ains. I was used he semi-au oma ed luo ime ic me hod ha u ilizes he luo och ome e hidium b omide, a known luo escen e lux pump subs a e, which allows he eal ime measu emen o e lux ac i i y and e lux inhibi ion (accumula ion). E hidium b omide has been shown o be pa icula ly sui able o be used as a p obe because i emi s weak luo escence ou side he bac e ial cell and becomes s ongly luo escen inside he cell. This me hod is a new applica ion o he Ro o GeneTM 3000 eal- ime he mocycle and p o ides he sum o anspo kine ics e lec ing he balance be ween accumula ion o subs a e ia passi e di usion h ough he memb ane pe meabili y ba ie and ex usion ia e lux, he eby o e s a apid and inexpensi e sc eening o inhibi o s. The esul s ob ained show, o all s ains, ha GLU and pH a ec s he accumula ion and e lux o e hidium b omide. F om all he inhibi o s o ene gy biosyn he ic pa hways es ed, sodium o ho anada e was he one ha e ealed he highes inhibi o y ac i i y and his inhibi o y e ec was e e sed by he p esence o GLU in he medium. In conclusion, his s udy shows he dependence o he e lux ac i i y o E. coli on ene gy om he hyd olysis o ATP by he ATPases, besides he al eady known dependence on he oxida i e phospho yla ion, o main ain he p o on mo i e o ce o he cells. Sodium o ho anada e has po en ial o be a new b oad ange e lux-pump inhibi o . The echnology used in his wo k showed o be sui able o he cha ac e iza ion o he bioene ge ic equi emen s o he bac e ial e lux pump ac i i y, allowing he sc eening o new e lux pump inhibi o s. i Índice Ge al Comunicações em cong essos i Ag adecimen os ii Resumo i Abs ac Índice de Figu as ix Índice de Tabelas xi Lis a de Ab e ia u as xii 1. INTRODUÇÃO 1 1.1. En e obac e iaceae 1 1.1.1. Esche ichia coli 1 1.1.2. Pa ede celula 2 1.1.3. Impo ância clínica e e apêu ica 5 1.1.4. Mecanismos de acção, e esis ência 5 1.2. Sis emas de e luxo e sua p esença em E. coli 8 1.2.1. Supe amília “ATP-binding casse e” (ABC) 10 1.2.2. Supe amília "Majo Facili a o " (MFS) 11 1.2.3. Família "Mul id ug and Toxic Compound Ex usion" (MATE) 11 1.2.4. Família "Small Mul id ug Resis ance" (SMR) 12 1.2.5. Supe amília "Resis ance Nodula ion Di ision" (RND) 12 1.3. Bioene gé ica bac e iana 16 1.3.1. ATPases, g adien e elec oquímico de p o ões e o ça p o o-mo iz (FPM) 18 1.3.2. Desacoplado es 24 1.3.2.1. Mecanismo de acção / E ei o bioene gé ico do CCCP 26 1.3.3. Inibido es das ATPases memb ana es 28 1.3.3.1. O o anada o de Sódio 28 1.3.3.1.1. Mecanismo de acção 29 1.3.3.2. Azida de Sódio 30 1.3.3.2.1. Mecanismo de acção 30 ii 1.3.4. Inibido es (das ATPases dependen es) dos canais de cálcio 30 1.3.4.1. Mecanismo de acção 31 1.3.4.2. Clo p omazina (CPZ) 32 1.3.4.3. Tio idazina (TZ) 32 1.4. Me odologias de de ecção do e luxo em bac é ias 33 1.4.1. Mé odo luo imé ico semi-au omá ico pa a moni o ização do anspo e de b ome o de e ídeo a a és de memb anas e pa edes celula es 34 1.5. Objec i os do abalho 37 2. MATERIAL E MÉTODOS 40 2.1. Ma e ial 40 2.1.1. Es i pes Bac e ianas 40 2.1.2. Meios de cul u a, compos os e soluções 40 2.2. Mé odos 44 2.2.1. Cul i o das Es i pes Bac e ianas 44 2.2.2. De e minação de CMI (Concen ação Mínima Inibi ó ia) pelo mé odo de diluição em mic oplaca (mic odiluição) pa a as ês es i pes de E. coli em es udo 44 2.2.3. De e minação de CMB (Concen ação Mínima Bac e icida) pa a as ês es i pes de E. coli em es udo 46 2.2.4. Fluo ime ia em Te mociclado de Tempo Real Ro o -Gene TM 3000 47 2.2.4.1. P o ocolo de acumulação de b ome o de e ídeo 47 2.2.4.2. De e minação da iabilidade celula 49 3. RESULTADOS 50 3.1. De e minação das concen ações mínimas inibi ó ias e concen ações mínimas bac e icidas dos compos os em es udo pa a as es i pes AG100, AG100A e AG100TET 50 3.2. Aplicação do mé odo luo imé ico semi-au omá ico pa a moni o ização do anspo e de b ome o de e ídeo 54 3.2.1. Pa âme os base na ca ac e ização do anspo e de E B 54 3.2.2. In luência de desacoplado es na acumulação de E B 57 3.2.3. In luência de Inibido es de ATPases memb ana es na acumulação de E B 63 1 1. INTRODUÇÃO 1.1. En e obac e iaceae As bac é ias en é icas pe encem a uma amília nume osa e são ca ac e izadas eno ipicamen e po se em bacilos G am-nega i os, ae óbios acul a i os, não espo ogénicos, imó eis ou mó eis, com lagelos pe í icos, e men ado es da glucose, p odu o es de ca alase e ci oc omo-oxidase nega i o, (23, 64) com equisi os nu icionais ela i amen e simples (64). Os p incipais géne os de mic o ganismos pa ogénicos des a amília são En e obac e , Esche ichia, Salmonella, Se a ia, Shigella e Ye sinia (23). Es es mic oo ganismos são esponsá eis po a iadas in ecções no se humano (in ecção u iná ia, en é ica, e c.) que se ca ac e izam po uma ele ada mo bilidade e mo alidade. A an ibio e apia das in ecções po En e obac e iaceae cons i ui p esen emen e um sé io p oblema de Saúde Pública, dada a ele ada esis ência das es i pes bac e ianas aos p incipais g upos de an ibió icos (β-lac âmicos, quinolonas e aminoglicosídeos), sob e udo em ambien e hospi ala (23, 95, 100). 1.1.1. Esche ichia coli E. coli oi iden i icada pela p imei a ez pelo pedia a Alemão Theodo Esche ich em 1885, endo sido o iginalmen e denominada de Bac e ium coli commune. Desde 1920, que E. coli em sido um o ganismo ú il pa a es udos de isiologia bac e iana, pois e a acilmen e acessí el, ge almen e não pa ogénico, e c escia apidamen e em meios com equisi os nu icionais simples. Po udo isso e de ido à sua eno me plas icidade me abólica é ainda hoje um alician e modelo pa a es udos em mic obiologia e em bioquímica mic obiana (5, 101). 2 E. coli é um bacilo G am-nega i o de 1.1 a 1.5 µm de la gu a e 2.0 a 6.0 µm de comp imen o (101). Possui lagelos dispos os em o no da célula que lhe pe mi em a mobilidade. A exis ência de ímb ias ou adesinas acili am a sua ixação o que impede o seu a as amen o pela u ina ou ezes líquidas. O nucleoide con ém uma única molécula de DNA ci cula (já sequenciado) e o ci oplasma con ém um ou mais plasmídeos. Possui uma g ande quan idade de ibossomas, o que é uma e idência da ele ada capacidade de espos a me abólica des a bac é ia (52, 56). Figu a 1 - Fo og a ia de mic oscopia elec ónica de colónias de E. coli (x14000) (adap ado de 101). 1.1.2. Pa ede celula Tal como as es an es bac é ias G am-nega i as, E. coli ca ac e iza-se po possui uma pa ede celula complexa, cons i uída po egiões mo ologicamen e de inidas. A camada mais in e na é a memb ana plasmá ica, uma bicamada que con ém os olípidos e p o eínas de memb ana, é semipe meá el e egula a passagem de me aboli os pa a den o e pa a o a do ci oplasma (73, 113), de o ma a egula o pH, a p essão osmó ica e a disponibilidade de subs âncias essenciais. Ex e io men e a es a memb ana encon a- se a camada de pep idoglicano, que se e como um “exoesquele o”, que man ém a o ma celula e igidez. As bac é ias G am-nega i as êm uma camada ela i amen e ina de pep idoglicano o que con e e menos igidez compa a i amen e com a camada mais espessa de pep idoglicano das bac é ias G am-posi i as (113). 3 A camada de lipopolissacá idos (LPS) es á localizada adjacen emen e à camada de pep idoglicano, é cons i uída po uma bicamada os olipídica semelhan e à que cons i ui a memb ana plasmá ica e es á ligada ao pep idoglicano po lipop o eínas. Os polissacá idos que se es endem pa a o a da bicamada con ibuem pa a a oxicidade celula e a po ção lipídica do LPS con ém um lípido al amen e óxico, conhecido po lípido A, que é esponsá el pela maio ia dos e ei os pa ogénicos associados às bac é ias G am-nega i as. As bac é ias G am-posi i as não possuem es a memb ana adicional (73, 113). O LPS, as lipop o eínas e a associação dos polissacá idos o mam a chamada memb ana ex e na (26, 73, 113). Figu a 2 – Rep esen ação esquemá ica da pa ede celula de bac é ias G am-nega i as (adap ado de 6). O espaço en e a camada de pep idoglicano e a memb ana ex e na é o espaço pe iplasmá ico, o qual con ém p o eínas hid olí icas que des oem agen es ex e io es e impede a sua pene ação na célula (113). A memb ana ex e na, é uma bicamada assimé ica endo a sua composição lipídica e p o eica um o e impac o na sensibilidade das bac é ias a mui os ipos de an ibió icos, é comum a esis ência a esses compos os pela oco ência de modi icações dessas mac omoléculas (26), es a memb ana em como p incipal unção se i de ba ei a p o ec o a, p e enindo a en ada de subs âncias óxicas, endo po isso um impac o impo an e sob e a suscep ibilidade dos mic o ganismos a uma sé ie de compos os noci os, ais como an ibió icos, desin ec an es e de e gen es (26, 41, 80) não se a ando 4 no en an o de uma ba ei a impe meá el. Assim, exis em luxos de subs âncias pa a o in e io e pa a o ex e io da pa ede celula das En e obac e eaceae mediada po p o eínas especí icas (81). A memb ana ex e na é bas an e mais pe meá el que a memb ana plasmá ica pois pe mi e a passagem de pequenas moléculas como glucose e ou os monossacá idos pa a o espaço pe iplásmá ico a a és de po inas, que são p o eínas que o mam canais, os quais pe mi em a en ada dessas moléculas na célula (80, 113). Em oposição, as bombas de e luxo (BE) p omo em o anspo e de agen es químicos indesejá eis à célula a a és da memb ana plasmá ica pa a o ex e io po canais especí icos da memb ana ex e na, o que possibili a uma diminuição da sua concen ação den o da célula (87). Anco adas na memb ana ex e na encon am-se as po inas pe encen es à amília das p o eínas es u u ais da memb ana que o mam íme os de canais abe os (81), cheios de água (18, 41, 81) que pe mi em uma al a pe meabilidade (81) a a és da memb ana ex e na das bac é ias G am-nega i as (16) pe mi indo a di usão não especí ica de iões e pequenas moléculas hid o ílicas (41, 80, 81). Em E. coli as p incipais po inas ambém designadas de p o eínas de memb ana ex e na (Ou e Memb ane P o eins (OMP)) são a OmpC e OmpF (81, 130) e em e mos de massa são ge almen e as p o eínas mais abundan es de E. coli (80). Cada célula de E. coli em ce ca de 100,000 cópias des as p o eínas (73, 80) o que pe mi e a di usão passi a de pequenos solu os pola es a a és da memb ana celula (16). A exp essão de po inas é maxima em condições ambien ais óp imas, sendo ajus ada quando necessá io pa a minimiza a pene ação de compos os noci os ou maximiza a en ada de nu ien es (80, 81, 130) não oco endo a di usão de compos os de g andes dimensões o que diminui d as icamen e o in luxo da maio ia dos an ibió icos que são ge almen e de dimensões maio es ela i amen e aos nu ien es comuns (80, 140). Pa a além des as po inas exis em ambém as p o eínas monomé icas, al como a OmpA de E. coli, que pe mi e a di usão len a e não especí ica de pequenos solu os (80, 81). O canal de po inas de E. coli diminui a pH ácido, oco endo o es ei amen o do canal a pH 5.4 (81). 5 1.1.3. Impo ância clínica e e apêu ica Reconhecido como um o ganismo comensal, E. coli, é uma espécie de maio impo ância clínica, ocasionando equen emen e in ecções in es inais, u iná ias, gas oen e i es, pneumonias, sep icemias, abcessos, en e ou as (23, 101). E. coli é a causa comum de dia eia em países em ias de desen ol imen o e em iajan es pa a esses países. É a bac é ia ae óbia acul a i a p edominan e na lo a in es inal, sendo o ambien e na u al de E. coli o ac o in es inal de humanos e animais, pe encendo ao g upo dos coli o mes ecais. A sua p esença é indicado a de con aminação ecal na água e nos alimen os (52, 101, 64). As in ecções in es inais causam equen emen e dia eia em lac en es (52), em c ianças e em imunocomp ome idos, podendo causa in ecções mais g a es, associadas a al a mo bilidade e mo alidade. Pa a es es g upos de pacien es, a e apia an imic obiana é necessá ia, de endo se ei o com ce alospo inas de la go espec o ou luo oquinolonas (95). 1.1.4. Mecanismos de acção, e esis ência Os agen es an imic obianos são subs âncias que inibem o c escimen o mic obiano ou eliminam o mic oo ganismo. En e es es azem pa e, pa a além dos an ibió icos (de o igem na u al), os compos os p oduzidos sin e icamen e (24). A p op iedade mais impo an e que os agen es an imic obianos de em possui pa a e em u ilidade clínica, é a p esença de uma oxicidade selec i a que lhes pe mi a inibi ou elimina o mic oo ganismo sem e um e ei o óxico no hospedei o ao qual são adminis ados (24, 55, 136). Exis e, con udo, uma má u ilização dos an ibió icos, nomeadamen e a au o- medicação, o desconhecimen o do mecanismo de acção dos an ibió icos, u ilização excessi a dos mesmos, aumen o da quan idade des es compos os na alimen ação animal, en e ou os, que em como p incipal consequência o apa ecimen o das bac é ias mul i esis en es di íceis de comba e (118), ou seja, esis en es a ês ou mais classes de an ibió icos di e en es (96, 118). Des e modo, in ecções que an e io men e e am acilmen e con olá eis passam a se p a icamen e impossí eis de a a . 6 Os an ibió icos podem se classi icados segundo á ios c i é ios sendo a mais comum a que usa o seu mecanismo de acção como c i é io de classi icação (59, 118, 134): a) Inibido es da sín ese da pa ede celula – ac uam p oduzindo de ei os es u u ais na pa ede in e e indo no p ocesso de eplicação celula (eg. penicilinas e de i ados); b) Inibido es da memb ana celula – deso ganizam a es u u a das memb anas das bac é ias (eg. polimixina); c) Inibido es da sín ese de ácidos nucleicos - a ec am a sín ese de DNA ou RNA, ou ligam-se a es es de al o ma que a mensagem não pode se lida pelas p o eínas descodi ican es (eg. quinolonas e i ampicinas); d) Inibido es compe i i os – agen es quimio e apêu icos sin é icos que in e e em com unções me abólicas na célula (eg. sul amidas); e) Inibido es da sín ese p o eica – inibido es de e apas no p ocesso de adução, p o ocando uma pa agem na sín ese p o eica, consequen emen e no c escimen o le ando à eliminação da célula bac e iana (eg. clo an enicol, e aciclinas e mac olídos). En e os an ibió icos disponí eis pa a o a amen o de in ecções a E. coli, os que mais são p esc i os na p á ica clínica são, as sul onamidas, luo oquinolonas, ampicilina, ce alospo inas e aminoglicosídeos (15). O conjun o de an ibió icos mais comum pa a o a amen o das in ecções a E. coli (sob e udo as u iná ias) é uma combinação de sul onamida e ime op im, amoxacilina, cip o loxacina e ou as quinolonas. No en an o, a amoxacilina hoje em dia em-se o nado ine icaz no comba e às in ecções u iná ias, pelos pad ões de esis ência obse ados em in ecções causadas po E. coli. Os aminoglicosídeos e as ce alospo inas são ambém equen emen e u ilizados na p á ica clínica endo sido p o ado que egimes e apêu icos de longa du ação, são ão e ec i os como os de cu a du ação ( ês dias) usando an ibió icos de la go espec o (95). A esis ência aos an ibió icos su ge quando a bac é ia se al e a gené ica e isiológicamen e o nando os an ibió icos menos e ec i os ou comple amen e ine ec i os no seu comba e. Assim, a esis ência ao an ibió ico desc e e a capacidade da bac é ia pa a sob e i e ou se mul iplica na p esença de uma concen ação de an ibió ico que p e iamen e lhe se ia le al, ou pelo menos que se ia su icien e pa a inibi o seu c escimen o (98). 7 Os p incipais mecanismos pa a a esis ência das bac é ias aos an ibió icos são: a) al e ação da molécula al o, como po exemplo o u iliza de ou o enzima pela bac é ia pa a desempenha a mesma unção que o enzima al o do an ibió ico; b) decomposição ou inac i ação enzimá ica do an ibió ico po enzimas hid olí icas especí icas; c) diminuição da capacidade de pene ação do an ibió ico na bac é ia; d) Bombea do an ibió ico pa a o ex e io mais apidamen e do que es e en a na bac é ia; e) mu ação espon ânea e ecombinação gené ica que c iam a iabilidade sob e a qual ac ua a selecção na u al e ) aquisição de elemen os gené icos mó eis (plasmídeos, ansposões, bac e ió agos), que podem anspo a genes que codi icam de e minan es de esis ência (Figu a 3) (39, 55, 59, 83, 118). Figu a 3 – Rep esen ação esquemá ica dos p incipais mecanismos de esis ência a an ibió icos. a) al e ação da molécula al o, b) inac i ação enzimá ica do an ibió ico, c) diminuição da capacidade de pene ação do an ibió ico, d) e luxo, e) mu ações, ) aquisição de elemen os gené icos mó eis (adap ado de 59). Na p esença des a mul iplicidade de mecanismos de esis ência sabe-se hoje que a mul i esis ência eme ge sob e udo nos casos de doen es sob an ibio e apia p olongada, como po exemplo, um doen e com in ecções u iná ias ou do a o espi a ó io de epe ição que são sujei os a an ibio e apia epe ida ao longo do empo. O abuso do 8 a amen o empí ico com an ibió icos, mui as ezes de la go espec o, sem an es e sido iden i icado o o ganismo e o seu pe il de esis ência aos á macos, conduz à eliminação da lo a suscep í el comensal e ao apa ecimen o de ese a ó ios de es i pes mul i esis en es sob e udo de bac é ias comensais como E. coli. Os ac o es ambien ais, alimen a es e o abuso de desin ec an es domés icos e ou os agen es an ibac e ianos, ambém são apon ados como po enciado es de mul i esis ência, embo a sejam escassos os es udos de co elação di ec a en e a eme gência de es i pes mul i esis en es em animais, na ag icul u a e água, e as in ecções em humanos (3). Ao se p opo ciona condições pa a uma p esença cons an e de concen ações sub- e apêu icas e sub- inibi ó ias de an ibió ico numa de e minada população bac e iana, es a si uação i á conduzi à selecção da esis ência e um dos p incipias mecanismos de eacção imedia a à acção an ibió ica é a ac i ação dos sis emas de e luxo. O e luxo de an ibió icos só ecen emen e oi acei e como um possí el mecanismo de esis ência nas in ecções bac e ianas, embo a já enha sido desc i o em 1978 com a descobe a de p o eínas de anspo e de memb ana em bac é ias G am-nega i as que excluem e aciclinas de E. coli (58). Desde en ão chegou-se à conclusão que es e mecanismo es á p esen e na maio ia das bac é ias pa ogénicas, sendo esponsá el pela sua sob e i ência na p esença de de e minadas concen ações de an ibió icos e ou as oxinas (96). 1.2. Sis emas de e luxo e sua p esença em E. coli As p o eínas de e luxo de múl iplos agen es quiomio e apêu icos são p o eínas especí icas de anspo e pa a o ex e io das células que se encon am codi icadas nos plasmídeos ou no c omossoma bac e iano podendo se especí icas, acili ando o e luxo de exclusi amen e um subs a o, ou pelo con á io, anspo a uma a iedade de classes de subs a os, como no caso da amília das e aciclinas, ou podem se não especí icas quando ap esen am uma g ande especi icidade pa a compos os químicos que não êm qualque elação es u u al, es as designam-se de bombas de esis ência a múl iplos compos os (MDR, do inglês “Mul i D ug Resis ance”) (21, 96). 9 Ve i icou-se que exis em BE an o em p oca ion es como em euca ion es, sendo que a p imei a obse ação do e luxo de agen es quimio e apêu icos em euca ion es se e e e ao apa ecimen o de esis ência a ci os á icos em linhas celula es neoplásicas com P- glicop o eína. Algumas das BE não são apenas esponsá eis pela ex usão de agen es quimio e apêu icos mas ambém compos os como a hemolisina em E. coli (38), ou es e oídes como a p oges e ona e o co isol ou ainda expo a adesinas, oxinas e ou as p o eínas impo an es pa a a colonização e in ecção de células humanas e animais (30). O e luxo es á en ol ido na baixa suscep ibilidade in ínseca, esis ência c uzada a moléculas de classes quimícas não elacionadas, e selecção / aquisição de mecanismos de esis ência adicionais (65). Com base no c i é io bioene gé ico e es u u al, as BE podem se ca alogadas em duas g andes classes: os anspo ado es ac i os p imá ios pe encen es à supe amília ABC (do inglês, “Adenosine T iphospha e (ATP)-binding casse e”), que usam a ene gia da hid ólise do ATP; e os que u ilizam o g adien e ansmemb ana elec oquímico de p o ões e sódio, pa a anspo a os an ibió icos pa a o a da célula, cons i uindo os sis emas de anspo e secundá ios (87, 95, 98). Os anspo ado es da classe dos anspo ado es ac i os secundá ios englobam qua o amílias undamen ais de BE e a sua ca ac e ização es u u al e bioquímica depende do núme o de egiões ansmemb ana es p o eicas, núme o de componen es da bomba, da on e de ene gia u ilizada e do ipo de subs a os que a bomba expo a (61, 106). Assim emos: - Supe amília “majo acili a o ” (MFS). - Família “mul id ug and oxic compound ex usion” (MATE). - Família “small mul id ug esis ance” (SMR). - Supe amília “ esis ance nodula ion di ision” (RND). As BE podem ambém classi ica -se como sis emas mul icomponen es ou sis emas cons i uídos apenas po um componen e. Os sis emas mul icomponen es, exis en es em bac é ias G am-nega i as, são cons i uídos po uma p o eína memb ana de usão MFP 10 (do inglês,”Memb ane Fusion P o ein”), uma p o eína memb ana ex e na OMP (do inglês, “Ou e Memb ane P o ein”) e uma p o eína anspo ado a (53, 55). Es as bombas pe mi em o anspo e dos compos os pa a o espaço ex acelula a a és da pa ede celula . No caso das BE com apenas um componen e, p esen es em bac é ias G am-posi i as e G am-nega i as, os compos os são anspo ados apenas a a és da memb ana plasmá ica, sendo eliminados pa a o meio ex acelula no caso das bac é ias G am-posi i as, ou pa a o espaço pe iplasmá ico no caso das bac é ias G am-nega i as (53). Figu a 4 – Rep esen ação esquemá ica e simpli icada das cinco amílias de bombas de e luxo bac e ianas (MFS, SMR, MATE, RND, ABC) (adap ado de 53). Legenda: ATP: adenosina i os a o; ADP: adenosina di os a o; Pi: os a o ino gânico. 1.2.1. Supe amília “ATP-binding casse e” (ABC) Os anspo ado es da classe “ATP-binding casse e supe amily” (ABC), são complexos mul i-p o eícos ( o mando um canal de anspo e pela memb ana ci oplasmá ica) e p o eínas ci oplasmá icas com ac i idade de ATPases, u ilizando a ene gia da hid ólise do ATP pa a anspo a a a és de memb anas biológicas uma 17 Assim, os o ganismos he e o ó icos ae óbios como E. coli e i am ene gia das mais di e sas moléculas o gânicas (açúca es, aminoácidos, ácidos go dos, e c.) a a és de um p ocesso de ca abolismo que se inicia na glucose, p ocesso que oco e em p a icamen e odos os se es i os, denominado de glicólise, ambém designado po ia de Embden- Meye ho -Pa nas, mesmo que complemen ada com ou as eacções, o que pa ece con i ma que de e á e sido o p imei o enómeno e icien e de p odução de ene gia em células (64, 75). A glicólise oco e no ci oplasma e consis e na deg adação da glucose em ácido pi ú ico, é designada a ase anae óbia da espi ação pois é exac amen e igual ao p ocesso que deco e na e men ação, ao que se segue a desca boxilação oxida i a pelo ciclo dos ácidos ica boxilicos ou ciclo de K ebs. Po im a cadeia espi a ó ia ou cadeia anspo ado a de elec ões consis e na ans e ência dos elec ões, libe ados du an e a oxidação da glucose, pa a o oxigénio, acei ado inal des es elec ões, o qual ica ca egado nega i amen e e combina-se com os p o ões em solução, o iginando água. Es a ans e ência pa a além de o ma água, libe a ene gia, que é cap u ada ao ní el dos ci oc omos a a és do p ocesso de os o ilação oxida i a que ge a ATP po acção da enzima F1FO-ATPase (31, 62, 64, 75). Des e modo, a ene gia disponí el na célula que ga an e a sua sob e i ência que, pa a o objec i o des e abalho, ga an e a ene gia necessá ia pa a o anspo e de subs a os, é ge ada, a mazenada e disponibilizada a a és des a enzima essencial à bioene gé ica celula . Figu a 6 – Rep esen ação da memb ana ci oplasmá ica de E. coli com a maquina ia necessá ia à p odução de ATP [cadeia de anspo e elec ónico (ETC), ci oc omos, F-ATPase] e po encial de memb ana (ΔΨ). O ΔΨ o nece a ene gia elec oquímica pa a as p o eínas de anspo e e pa a o mo imen o lagela (adap ado de 75). 18 1.3.1. ATPases, g adien e elec oquímico de p o ões e o ça p o o-mo iz (FPM) As con e sões ene gé icas são comuns a odas as o mas de ida. A deg adação de nu ien es em animais ou bac é ias ou a o ossín ese em plan as, culmina com a p odução de ATP, a molécula uni e sal de ans e ência de ene gia (27) que supo a quase odas as ac i idades celula es que eque em ene gia. O ATP é a on e de ene gia p imá ia pa a o anspo e de solu os e mac omoléculas a a és de memb anas ci oplasmá icas (97). A sín ese de ATP é uma das p incipais eacções químicas no mundo biológico (139). ATPases ou es u u as semelhan es são encon adas em odos os o ganismos que sin e izam ou hid olisam ATP acoplado com a anslocação de p o ões (14). Exis em di e en es ipos de ATPases, as quais podem di e i na es u u a, no ipo de iões que anspo am e na unção (sín ese e/ou hid ólise de ATP). As ATPases podem se ag upadas em qua o ipos dis in os, P, F, V e ABC, com as ês p imei as designadas há mais de 20 anos a ás e as do ipo ABC ( ide secção 1.2.1.) desc i as mais ecen emen e. Es es qua o ipos êm em comum o ac o de exis i em inse idas e anspo a em pelo menos um á omo ou molécula a a és de memb anas biológicas acoplado com a hid ólise de ATP. De ac o, são nano-máquinas ( ipo P e ABC) ou duplas nano-máquinas ( ipo F e V) (Figu a 7) (93). As F1FO-ATPases es ão p esen es nas memb anas de bac é ias, mi ocônd ias e clo oplas os (17, 27, 33), e as V1VO-ATPases (ATPases acuola es) p esen es em acuolos in acelula es de células euca io as (25, 33, 93), em esículas in acelula es de le edu as, plan as e animais (25). Assim, as ATPases es ão p esen es em odos os domínios da ida, endo su gido de um ances al comum, mas e oluí am em classes dis in as de ATP sin e ases/ATPases (33). Todas as ATPases, incluindo as de mi ocônd ia e clo oplas os, pa ilham simila idades mecânicas e es u u ais (25). A dis ibuição ão ab angen e das F1FO-ATPases em mi ocônd ias e clo oplas os dos euca io as e nas memb anas celula es de eubac é ias demons a a sua g ande impo ância. 19 Figu a 7 - Es u u a das ATPases de anspo e. F-ATPase e V-ATPase (adap ado de 79); P-ATPase e T anspo ado ABC (adap ado de Func ional Memb ane P o eomics, si e: h p://www.s b628.uni- ank u .de/ acedido em Agos o de 2010). Assim, as F1FO-ATPases (Núme o EC 3.6.1.34) ( ambém denominada de F1FO-ATP sin e ase, ATP sin e ase, F-ATPase ou simplesmen e ATPase) de bac é ias êm duas impo an es unções isiológicas (25): i) usam um g adien e p o ónico (∆µH+) e o po encial de memb ana (Δψ) associado pa a sin e iza ATP a pa i de ADP e os a o ino gânico (Pi) na e apa inal da os o ilação oxida i a (17, 46), 20 ii) podem e e e a sua acção uncionando como ATPase pa a ca alisa a hid ólise de ATP (17) quando necessá io pa a ge a um g adien e elec oquímico ansmemb ana de p o ões eque ido pa a a locomoção, consumo de nu ien es e ou as unções (135). As F-ATPases consomem um g adien e elec oquímico de p o ões (H+) pa a sin e iza ATP, ou hid olisam ATP pa a cons ui um g adien e de H+. As V-ATPases cons oem um g adien e de H+ a a és da memb ana ca alisando a hid ólise de ATP pa a anspo a solu os e baixa o pH no in e io dos o ganelos, não uncionando em condições isiológicas de o ma e e sí el (42). Figu a 8 – Rep esen ação esquemá ica da unção isiológica da F-ATPase (adap ado de 62). Nes e abalho, dedicamos especial a enção às ATPases do ipo F. A F1FO-ATPase é a enzima cha e na in e con e são ene gé ica celula (17). A enzima é compos a po dois domínios es u u al e uncionalmen e dis in os: i) o domínio FO ( ambém denominado FO-ATPase) hid o óbico, in ínseco na memb ana, o qual es á en ol ido na anslocação de p o ões a a és da memb ana; ii) o domínio hid o ílico, ex ínseco/pe i é ico F1 ( ambém denominado F1-ATPase) que con ém os locais ca alí icos pa a a sín ese e hid ólise de ATP (25, 42, 47, 51, 115). 21 Po ou o lado, F1 e FO es ão ligados po um eio cen al e um eio pe i é ico (27). Quando F1 e FO es ão acoplados a a és de in e acções hid o óbicas e elec oes á icas, o complexo F1FO pode unciona como ATPase ou como ATP sin e ase (25). Os domínios F1 e FO podem unciona sepa adamen e, no en an o, a sín ese de ATP eque que as subunidades F1 e FO es ejam ligadas (14, 17). Figu a 9 - Es u u a da F1FO-ATPase de E. coli (adap ado de 135). A F1FO-ATPase usa a o ação ísica das suas p óp ias sub-unidades como um passo da ca álise – um mecanismo di e en e dos de qualque ou a enzima conhecida, pois a o ação não é um mecanismo celula p e e encial (139). É possí el de ini a F1FO-ATPase como um sis ema que unciona como um complexo de dois mo o es o acionais acoplados (Figu a 9) (33, 139); um no domínio F1, que execu a a a e a de sín ese e hid ólise de ATP (51) com os mo imen os de um o o in e no, e ou o no domínio FO, que liga a anslocação de p o ões com os mo imen os des e o o FO (17). Cada um des es domínios unciona como um mo o o acional e e sí el, com di ecções de o ação opos as (139) e ocam ene gia com o mo o opos o a a és de o ação mecânica do eio cen al (27). Quando F1 é sepa ado de FO, é consequen emen e dissociado da ge ação de FPM (51), passando F1 apenas a ca alisa a hid ólise de ATP (25, 51, 139). A pa e FO man ém-se in e calada na memb ana e, na ausência de F1, man ém in ac a a unção de anslocação 22 de p o ões a a és da memb ana, no en an o es a anslocação passa a se passi a e bidi eccional (17, 25, 46, 51, 139). O complexo F1FO-ATPase em 8 subunidades di e en es em p oca io as e 16-18 subunidades em mamí e os, com um peso molecula de 550-650 KDa. A composição mínima de subunidades de F1FO é ep esen ada pela F1FO-ATPase de E. coli (Figu a 9). Consis e em oi o di e en es subunidades, cinco das quais pe encem à F1-ATPase designadamen e, em o dem dec escen e de amanho e núme o de subunidades, α3β3γδε, com uma massa molecula de ~382 kDa, e ês subunidades pe encen es à FO-ATPase, com uma es equiome ia de ab2c10 e com uma massa molecula de ~148 kDa (17, 25, 34, 46). A egião do eio cen al é compos a po subunidades de ambos os domínios F1 e FO. A FO-ATPase em o ganismos supe io es é conside a elmen e mais complexa (14). Em E. coli, o mo imen o de p o ões a a és de FO le a à o ação da subunidade oligome ica c ela i amen e à subunidade a, com a qual o ma uma in e ace. Simul aneamen e a o ação da subunidade elongada e assimé ica γ le a a mudanças con o macionais nos locais de ligação a nucleó idos de F1 que são necessá ios pa a a sín ese de ATP. Na ausência de um g adien e de p o ões, a hid ólise de ATP le a á à anslocação de p o ões. As subunidades a e c, são duas p o eínas hid o óbicas memb ana es que es ão di ec amen e en ol idas na anslocação de p o ões, sendo a subunidade c um anel com dez monóme os com uma ca idade cen al p eenchida com lipidos (47). F1 e FO são en ão in e ligados po dois eios, um deles cen al que con ém as subunidades γ e ε, e ou o pe i é ico en ol endo as subunidades δ e b (17). Um segundo g upo de ATPases a que se dedica especial a enção nes e abalho é o das P-ATPases bac e ianas ou bombas iónicas que anslocam p o ões po oca com iões sódio, po ássio ou cálcio (Figu a 7). As P-ATPases (an e io men e denominadas E1E2- ATPases) encon am-se em bac é ias, ungos e na memb ana plasmá ica e o ganelos de euca io as, es ando en ol idas no anspo e de o mas ca iónicas de cálcio, sódio, po ássio, cob e, e ou os me ais a a és de memb anas biológicas, seguindo um ciclo de eacção que en ol e um in e mediá io os o ilado (93). Embo a se di idam em sub- classes ou sub- ipos, dependendo se anslocam me ais pesados ou iões sódio-po ássio- 23 cálcio, êm es u u as e mecanismos de acção semelhan es. O conhecimen o sob e a es u u a e unção das P-ATPases assen a no modelo canónico da Ca2+-ATPase do e iculo sa coendoplasmá ico do músculo dos mamí e os. É ge almen e econhecida que a es u u a des a ATPase, é ep esen a i a da amília de ATPases ipo P. Es a ATPase é compos a de uma secção no ci oplasma e uma secção ansmemb ana com dois locais de ligação ao Ca2+ (Figu a 10). A secção ci oplasmá ica é cons i uída po ês domínios ci oplasmá icos, denominados domínios P, N e A, con endo mais de me ade da massa da p o eína e ce ca de dez hélices ansmemb ana es (M1-M10), com os dois locais de ligação de Ca2+ pe o do pon o médio da bicamada lipídica. É ao longo des as secções ci oplasmá icas que oco e a os o ilação e a anslocação iónica associada (43). C ê-se que pa e da ene gia que ci cula ao ní el da memb ana plasmá ica bac e iana, ga an indo o po encial p o ónico e a FPM que ica acessí el às BE bac e ianas, ecebe impo an es con ibu os das P-ATPases e do anspo e iónico em pa ce ia com as F- ATPases e o anspo e p o ónico, as p incipais ATPases bac e ianas (138). Figu a 10 – Ca ac e ís icas ge ais da es u u a da P-ATPase (adap ado de 43). As F-ATPases anspo am p o ões ajudando a es abelece um g adien e elec oquímico ansmemb ana . Em de e minadas condições, es e p ocesso pode unciona em sen ido opos o, com a ATPase a se mo ida pela FPM e a passa a unciona como uma ATPsin e ase. O ATP é sin e izado a pa i da ene gia ob ida da anslocação de p o ões ou iões. Es a ligação de eacções ende gónicas e exe gónicas nas subunidades das ATPases denomina-se de acoplamen o. Quando deixa de ha e in e acção en e as Ci oplasma 24 subunidades (F1 e FO nas F-ATPases), a ansdução de ene gia é pe dida, e o sis ema diz-se es a desacoplado (17). A FPM c iada pelo g adien e p o ónico ansmenb ana (ΔμH+) é o po encial ene gé ico que pode se ob ido pela passagem de p o ões a a és da memb ana ci oplasmá ica celula , ou seja, é um g adien e elec oquímico ansmemb ana com dois componen es: um g adien e de p o ões (na o ma de hid ogeniões H+) que p omo e uma di e ença de pH (ΔpH) e uma di e ença na ca ga iónica ou po encial de memb ana (Δψ) de ido à dis ibuição desigual de ca gas (15, 92). Es es dois pa âme os ac uam, em ge al, em sen idos opos os, pe mi indo que a FPM se man enha cons an e (102). Em bac é ias me abolicamen e ac i as com memb anas ci oplasmá icas in ac as, a di e ença de po encial (Δψ) si ua-se ge almen e en e -100 mV e -200 mV, encon ando-se o in e io da memb ana ca egado nega i amen e (109). O mecanismo pelo qual a ATPase ca aliza o acoplamen o de ene gia e icien e e e e sí el en e o anspo e ec o ial de iões e subs a os a a és da memb ana e as eacções químicas da sín ese e hid ólise de ATP em sido um dos maio es pon os de in e esse na in es igação em bioene gé ica bac e iana (46). Pa a o e ei o em-se indo a u iliza compos os que azem o desacoplamen o en e a FPM e a ac i idade da ATPase de o ma a se possí el es uda a sua dinâmica, es u u a e ac o es condicionan es da ac i idade ge ado a de ene gia pa a o anspo e de subs a os a a és da pa ede e memb anas bac e ianas. 1.3.2. Desacoplado es P o ono ó os ou agen es despola izan es (94), al como o CCCP (ca bonil ciane o m- clo o enilhid azona) ou o 2,4-DNP (2,4-dini o enol), dissipam a FPM a a és da memb ana plasmá ica de E. coli (49), sendo o CCCP 10-100 ezes mais e ec i o que o 2,4-DNP (28). 25 Em células euca io as, a p incipal acção dos p o onó o os é colapsa o g adien e p o ónico a a és da memb ana in e na da mi ocônd ia ao pe mi i ea anjos e anslocações ansien es dos p o ões exis en es à supe ície in e na e ex e na da bicamada lipídica das memb anas mi ocond iais, le ando ao colapso do g adien e p o ónico ansmenb ana (ΔμH+), o que esul a na anulação comple a do po encial de memb ana e na acumulação de iões cálcio. Os p o onó o os, causam uma ápida pe da de ATP, a a és da inibição da sua sín ese e ac i ação da sua hid ólise pela ATP sin e ase mi ocond ial (123). O esul ado inal é que o CCCP ao o na a memb ana pe meá el a iões H+, colapsa comple amen e o g adien e de H+ e o g adien e de po encial a a és das memb anas mi ocond iais, bloqueando desse modo a sín ese de ATP, ha endo uma libe ação concomi an e de iões cálcio e uma es imulação da ATPase mi ocond ial p oduzindo-se assim um declínio ex emamen e ápido nos ní eis de ATP celula es (28). Em células de E. coli em ae obiose, o ΔμH+ é comple amen e anulado pelo CCCP, e esul a p incipalmen e do e luxo de p o ões acoplado à oxidação de subs a os (54). A despola ização causada pelo CCCP é dependen e da concen ação, limi ando com isso o seu po encial de acção (28). Assim, o CCCP e o 2,4-DNP, são desacoplado es di ec os da FPM e indi ec os da os o ilação oxida i a, sendo capazes de anspo a p o ões a a és de memb anas biológicas, que habi ualmen e êm baixa condu i idade p o ónica (36). O 2,4-DNP é usado na p odução de pes icidas, de co an es, o oquímicos, explosi os e como indicado pa a a de ecção de iões po ássio e amónio. É ambém usado na p odução de 2,4-diamino enol o qual é usado no a amen o médico da obesidade (108). Figu a 11 – Es u u a química do compos o 2,4-dini o enol (C6H3N2O5-) (adap ado de 77). 26 O CCCP é um ácido o gânico aco, lipo ílico (70, 132) que inibe o g adien e p o ónico, ou seja inibe a FPM (19), ac uado como um anspo ado e a ac o p o ónico e como desacoplado (70, 132). Figu a 12 – Es u u a química do compos o CCCP (C9H5ClN4) (adap ado de 77). 1.3.2.1. Mecanismo de acção / E ei o bioene gé ico do CCCP Em es ado es acioná io, o ní el celula de ATP em células iá eis é de e minado pelas axas de sín ese e hid ólise de ATP. A maio ia da sín ese celula de ATP es á associada ao p ocesso de ans e ência de elec ões na memb ana. O anspo e de p o ões na memb ana se e como ac o in e mediá io essencial pa a oco e a ans e ência de elec ões elacionada com a sín ese de ATP (72) e o anspo e de solu os dependen es de ene gia. As células u ilizam a ene gia p o enien e da hid ólise de ATP pelas ATPases memb ana es pa a man e a concen ação in e na de iões, e de pequenos me aboli os a a és dos sis emas de anspo e memb ana . Sendo um p o onó o o memb ana , o CCCP em a capacidade pa a colapsa o g adien e p o ónico necessá io pa a assegu a a sín ese de ATP e o anspo e memb ana . Consequen emen e a sua p esença diminui a sín ese de ATP, pela diminuição do g adien e p o ónico ansmenb ana (ΔμH+) e aumen a a u ilização de ATP pois as células são o çadas a hid olisa mais ATP pa a es abelece o po encial p o ónico (92, 124). A acção do CCCP e os seus e ei os bioene gé icos es ão ilus ados naFigu a 13. 33 Figu a 17 – Es u u a química do compos o Tio idazina (C21H26N2S2) (adap ado de 77). 1.4. Me odologias de de ecção do e luxo em bac é ias Dada a c escen e p esença de mul i esis ência bac e iana de ido à sob e-exp essão e sob e-ac i idade de BE em es i pes clínicas, sob e udo em doen es sob an ibio e apias p olongadas, o nou-se u gen e o desen ol imen o de mé odos de de ecção des a ac i idade, embo a es es ainda se encon em numa ase de in es igação e desen ol imen o (129). Não ha endo ainda disponí el, me odologias e ecnologias que pe mi am de ec a apidamen e a p esença des es enómenos em es i pes isoladas de doen es sob an ibio e apia, o único ecu so disponí el em sido a de e minação das concen ações mínimas inibi ó ias (CMIs) de cada es i pe pa a cada an ibió ico na p esença e ausência de compos os conside ados IBEs. Sendo um mé odo indi ec o e pouco p eciso, apenas pe mi e uma quali icação indi ec a da es i pe e a assumpção de que a mul i esis ência obse ada se de e à sob e-exp essão e sob e-ac i idade de BE. Vá ios mé odos labo a o iais de ec am e quan i icam a ac i idade dos sis emas de BE bac e ianos usando a medição de subs a os acumulados pelas células que possuem ma cação adioac i a ou são luo escen es. No en an o, es es mé odos na sua maio ia, êm di iculdade em sepa a a acumulação de subs a o da sua ex usão bem como não pe mi em a a iação simul ânea das condições ambien ais eque idas pa a os es udos de bioene gé ica (103, 129). Como al, mé odos que pe mi am a de ecção ápida e a quan i icação do e luxo são hoje uma necessidade pe manen e no labo a ó io de 34 Mic obiologia Médica, e a Unidade de Micobac é ias do IHMT, onde es e abalho de ese oi desen ol ido, em indo a con ibui pa a o desen ol imen o de mé odos que pe mi am a quan i icação em empo eal do e luxo ac i o em bac é ias usando ma cado es luo escen es que sejam e luxados pelas bac é ias. Em pa icula o am desen ol idas me odologias de de ecção do anspo e pa ie al do compos o qua e ná io luo escen e b ome o de e ídeo (E B ), usado como ma cado isual da ac i idade de e luxo de ido às suas ca ac e ís icas de baixa luo escência quando no ex e io das células, e máxima luo escência aquando da sua ligação no in e io das mesmas (89, 127, 129). Es e compos o luo escen e pode-se liga ansien emen e a á ios ní eis no in e io da bac é ia como seja ao RNA de cadeia dupla, RNA de cadeia simples, DNA de cadeia simples, oligonucleó idos e p o eínas (50) en ando po di usão passi a a a o do g adien e de concen ação e sendo o seu excesso ex uido das células pelos mecanismos de e luxo pois é subs a o de á ios sis emas de e luxo (89, 127, 129). Assim, a acumulação de E B na célula e o consequen e aumen o de luo escência de ec ada é o esul ado do equilíb io dinâmico en e a di usão passi a no sen ido do meio in acelula e o anspo e ac i o mediado pelas BE no sen ido in e so. Es e equilíb io é unção de uma di e sidade de ac o es como sejam a pe meabilidade da pa ede celula , o g au de ac i idade de e luxo e de ene gização da célula, em pa icula o ambien e p o ónico ex acelula a aliado pelo pH do meio, en e ou os ac o es. 1.4.1. Mé odo luo imé ico semi-au omá ico pa a moni o ização do anspo e de b ome o de e ídeo a a és de memb anas e pa edes celula es Nes e mé odo, é analisada a acumulação e ex usão do luo oc omo E B , o qual é conside ado subs a o uni e sal de BE (subs a o especí ico do Ac AB-TolC), uma molécula biocompa í el que, em condições de inidas e con oladas, não a ec a a iabilidade celula nem as unções celula es (82, 89, 103, 129). Pa a es abelece as condições expe imen ais que pe mi am de ec a di e enças na acumulação de E B po acção dos IBEs a es uda , oi necessá io de e mina as condições essenciais de cada ensaio pa a cada es i pe e cada compos o a es a . Assim, oi necessá io de e mina : 35 (i) Qual a concen ação de E B à qual a es i pe po si só não ap esen a acumulação signi ica i a de E B , oco endo apenas uma acumulação de E B esidual e basal, esul an e de um equilíb io en e a en ada po di usão passi a do E B e a sua saída po e luxo ac i o. A luo escência de ec ada em equilíb io não de e á ul apassa 20% da luo escência máxima de ec á el no in e alo máximo de 30 mínu os (i.e., ap oximadamen e um empo de ge ação de E. coli), a pH isiológico (pH=7) e de e á es a abaixo do 1/2 da CMI do E B pa a a es i pe em es udo. (ii) Qual a concen ação dos compos os IBEs a es a (que po si só não podem e luo escência signi ica i a) que não a ec e a iabilidade celula . Pa a o e ei o es abeleceu-se o 1/2 da CMI de cada compos o pa a cada es i pe em es udo como a ní el máximo a que se de e ia abalha com um IBE, de o ma a ga an i a condição an e io . (iii) Quais os compos os es ados nas condições an e io es que p omo em um aumen o signi ica i o de acumulação de E B na p esença e na ausência de uma on e de ene gia (glucose), sem que essa concen ação de E B e de IBEs a ec e a iabilidade celula , p ocesso inibi ó io es e que é moni o izado pelo a ingi de um no o es ado de equilíb io en e a en ada po di usão passi a do E B e a sua saída po e luxo ac i o (ago a diminuído/inibido pela acção do IBE) no in e alo máximo de 30 minu os (Figu a 18). Figu a 18 – Rep esen ação esquemá ica da en ada e e luxo de E B na célula de E. coli. A) es ado de equilíb io da concen ação de E B na célula ( axa de en ada ≈ axa de saída); B) Acumulação de E B de ido ao uso de IBE ( axa de en ada > axa de saída). Legenda: IBE (inibido de bomba de e luxo), BE (bomba de e luxo). 36 O sinal de luo escência é moni o izado u ilizando um e mociclado de empo eal Ro o -Gene TM 3000 da Co be Reseach (Sydney, Aus ália), e os comp imen os de onda de exci ação e emissão de 530nm bp e 585 nm hp, espec i amen e (89). Num ensaio de acumulação, como o ep esen ado na Figu a 19, é obse ada a capacidade de acumulação de E B pela célula. Es a luo escência é maio , quan o maio a capacidade de acumulação de E B , e meno a capacidade de e luxo. Sabendo que a concen ação de E B é o balanço en e a en ada de E B den o da célula e a capacidade des a pa a o e luxa , a di e ença de luo escência (Δ) obse ada en e duas cu as, é uma medida da inibição do e luxo esul ando na acumulação de E B na célula. A Figu a 19 ep esen a um exemplo eó ico de duas possí eis cu as de acumulação pa a uma de e minada es i pe em condições de acumulação di e en es (X e ●). Na p esença de IBE (X), a es i pe acumula mais E B , ao in és na sua ausência (●) a capacidade de e luxo da es i pe não é inibida. Es a cons i ui, po isso, uma o ma expedi a e igo osa de se a alia o e ei o de IBEs em es i pes bac e ianas, al como p e endido nes e abalho. Figu a 19 – G á ico ilus a i o de um ensaio de acumulação de E B . (Δ) a di e ença de luo escência en e duas cu as, é uma medida do g au de inibição do e luxo p o ocado pelo IBE, esul ando na acumulação de E B na célula. Legenda: (●) ausência de IBE e (X) p esença de IBE. 37 1.5. Objec i os do abalho Como an e io men e e e ido, a esis ência a an ibió icos em bac é ias G am-nega i as pode de ida à ex usão ac i a do an ibió ico a a és de sis emas de e luxo. Pa a se comp eende de onde em a ene gia pa a as BE unciona em e como ao in e e i com o o necimen o des a ene gia pode a ec a a ac i idade de e luxo, oi e ec uada uma ex ensa pesquisa bibliog á ica, no sen ido de encon a compos os que consigam inibi di ec amen e a ac i idade de e luxo, ais como desacoplado es, inibido es das ATPases e inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio, com ac i idade po encial sob e a nossa bac é ia modelo, Esche ichia coli. Os inibido es da cadeia anspo ado a de elec ões como os clássicos ciane o de po ássio, o enona ou an imicina A, dado que ac uam a mon an e do p ocesso ene gé ico que ga an e a ac i idade das BE endo um e ei o le al sob e odos os p ocessos ene gé icos das células p oca io as e euca io as, não o am es ados pois o objec i o é o de iden i ica po enciais inibido es de BE que ac uem no o necimen o ene gé ico às bombas sem a ec a o es an e me abolismo celula ou a iabilidade celula de modo a que u u amen e possam i a se usados como adju an es da an ibio e ápia (89, 127, 129). Em E. coli, o p incipal sis ema de e luxo é a bomba Ac AB-TolC da amília RND, a qual unciona essencialmen e abas ecida pela ene gia que em da FPM ga an ido pela e icien e ac i idade das ATPases bac e ianas memb ana es, pelo que é um modelo académico excelen e pa a o es e de compos os inibido es. Pa a al, o am usadas ês es i pes de E. coli bem ca ac e izadas: (i) E. coli AG100, es i pe sel agem que con ém o sis ema de e luxo Ac AB-TolC in ac o e uncional; (ii) E. coli AG100A, que p o ém da es i pe AG100, nes a es i pe o am inac i ados os genes que codi icam pa a a p incipal bomba de e luxo Ac AB-TolC; (iii) E. coli AG100TET que oi an e io men e induzida a um al o ní el de esis ência à e aciclina (TET) e em sob eexp essão do sis ema de e luxo Ac AB-TolC. 38 Da ex ensa pesquisa bibliog á ica ei a sob e possí eis compos os inibido es do o necimen o di ec o de ene gia às BE em E. coli, escolheu-se 6 compos os pa a es e abalho: Como desacoplado es o ca bonil ciane o m-clo o enilhid azona (CCCP) e o 2,4 – dini o enol (2,4-DNP), Como inibido es de ATPases memb ana es o o o anada o de sódio e a azida de sódio, Como inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio a io idazina (TZ) e a clo p omazina (CPZ). Os c i é ios de escolha des es compos os, i e am como base a exis ência de egis os na li e a u a, de possí el acção di ec a ou indi ec a na inibição de BE bac e ianas po in e e ência no o necimen o de ene gia. Figu a 20 – Rep esen ação esquemá ica dos al os celula es dos compos os CCCP, 2,4-DNP, o o anada o de sódio, azida de sódio, TZ e CPZ (adap ado de 62, 99 e 124). 39 Assim, pa a a alia a ac i idade inibi ó ia des es compos os sob e o p incipal sis ema de e luxo em E. coli es ou-se, nas condições e com os c i é ios an e io men e desc i os, as ês es i pes de E. coli modelo com ecu so ao mé odo luo imé ico semi au omá ico que de ec a em empo eal, a acumulação e e luxo do E B (89, 127, 129). Pa a es e e ei o oi necessá io de e mina o pe il de suscep ibilidade pa a as ês es i pes, po de e minação dos alo es de CMI (Concen ação Mínima Inibi ó ia) e CMB (Concen ação Mínima Bac e icida) pa a odos os compos os em es udo de o ma a ga an i que os e ei os obse ados se de em apenas à inibição da ac i idade de e luxo do E B , o subs a o de eleição do sis ema Ac AB-TolC (82, 89, 127, 129). 40 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Ma e ial 2.1.1. Es i pes Bac e ianas Es i pe sel agem Esche ichia coli K-12 AG100 (a gE3 hi-1 psL xyl m l Δ(gal-u B) supE44), que con ém o sis ema de e luxo Ac AB-TolC in ac o e uncional (86). Es i pe E. coli K-12 AG100A (Δac AB::Tn903 Kan ), que p o ém da es i pe AG100. Nes a es i pe o sis ema de e luxo Ac AB-TolC oi inac i ado de ido a inse ção do ansposão Tn903 no ope ão ac AB (86). As es i pes AG100 e AG100A o am ca ac e izadas e gen ilmen e cedidas pelo D . Hi oshi Nikaido (Depa amen os de Química e Biologia Celula e Molecula , da Uni e sidade da Cali ó nia, Be keley, CA, E.U.A.). A es i pe E. coli AG100, suscep í el ao an ibió ico e aciclina (TET), oi induzida a a és de passos g aduais de exposição a concen ações c escen es de e aciclina a é um ní el ele ado de esis ência a es e an ibió ico (CMI de 12 mg/L de e aciclina). A es i pe adap ada, capaz de sob e i e a uma concen ação en e 8 e 10 mg/L de e aciclina po exp essão de bombas de e luxo (BE), em pa icula sob e-exp essão do sis ema Ac AB-TolC, designa-se po AG100TET (126). 2.1.2. Meios de cul u a, compos os e soluções A composição e modo de p epa ação dos meios de cul u a, compos os e soluções u ilizados ao longo do abalho encon am-se desc i os nas Tabelas 1 a 5. Todos os meios de cul u as o am p epa ados com água bides ilada e es e ilizados po au ocla agem a 121ºC du an e 20 minu os a 1 ba . 41 Tabela 1 - Composição de meios de cul u a u ilizados. Meio de cul u a Composição (po li o) Lu ia Be ani (LB) 10 g de pep ona caseína ( 2 ) ; 5 g de ex ac o de le edu a(2); 10 g de clo e o de sódio(3) Lu ia Be ani aga (LA) LB; 20 g de aga ( 1 ) Muelle -Hin on b o h (MHB) (1) 300 g de in usão desid a ada de ca ne; 17,5 g de caseína hid olisada; 1,5 g de amido; 4,347 mg Ca2+; 6,206 mg Mg2+; pH 7,3 ± 0,1 a 25ºC Muelle -Hin on aga (MHA) ( 1 ) MHB; 17 g de aga ( 1 ) ; pH 7,3 ± 0,1 a 25ºC (1) Oxoid L d., Basings oke, Ingla e a; (2) Me ck, Da ms ad , Ge many; (3) Pan eac Química SA, Ba celona, Espanha. Tabela 2 - Composição e modo de p epa ação de soluções u ilizadas. Solução Composição PBS (Phospha e Bu e ed Saline) 1X, pH 7 (1) PBS 1X, pH 5 (1) PBS 1X, pH 8 (1) 1 pas ilha dissol ida em 200mL de água bides ilada co esponde a 10 mM ampão os a o; 2,7 mM KCl; 137 mM NaCl. Pa a a solução de PBS 1X a pH 5, ace ou- se o pH da solução PBS 1X a pH 7 a a és da adição de uma solução de clo e o de hid ogénio (HCl) (3)(◊). Pa a a solução de PBS 1X a pH 8, ace ou- se o pH da solução PBS 1X a pH 7 a a és da adição de uma solução de hid óxido de sódio (NaOH) (2) (◊). Glucose ( 2,ө ) 0,2 g/mL em água bides ilada es é il. (1) Sigma Ald ich Chemie, S einheim, Ge many; (2) Me ck, Da ms ad , Ge many; (3) Pan eac Química SA, Ba celona, Espanha; (◊) U ilizou-se um medido de pH Me ohm He isau 632, Swi za land; (ө) a solução depois de p epa ada oi il ada com il os de se inga es é eis de PVDF com 0,22 μm de diâme o de po o da Ro ilabo ® Sp i zen il e S e il, Ka lshu e, Alemanha. 42 Tabela 3 - Composição e modo de p epa ação das soluções de desacoplado es, soluções de inibido es de cadeia anspo ado a de elec ões, soluções de inibido es de ATPases e soluções de inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio u ilizadas. Solução Composição / P epa ação da solução “s ock” Ca bonil ciane o m-clo o enilhid azona (CCCP) (1) (pm = 204,6158 g/mol) 1 mg/mL em água bides ilada es é il e me anol (3) 1:1 (∆). Diluições p epa adas em água bides ilada es é il. A mazenado ao ab igo da luz. 2,4,-dini o enol (DNP) ( 1 ) (pm = 184,10636 g/mol) 30 mg/mL em água bides ilada es é il e e anol absolu o (4) 1:1 (∆). Diluições p epa adas em água bides ilada es é il. Man ida ao ab igo da luz. Tio idazina (TZ) ( 1,ө ) (pm = 370,57454 g/mol) 10 mg/mL em água bides ilada es é il Clo p omazina (CPZ) ( 1,ө ) (pm = 318,86416 g/mol) 10 mg/mL em água bides ilada es é il Azida de sódio (NaN3) ( 2 ) (pm = 65,00987 g/mol) 12 mg/mL em água bides ilada es é il O o anada o de sódio (Na3VO4) ( 1 ) (pm = 183,908410 g/mol) 8 mg/mL em água bides ilada es é il (∆) (1) Sigma Ald ich Chemie, S einheim, Ge many; (2) Sigma Chemical Co., S . Louis, USA (3) Me ck, Da ms ad , Alemanha; (4) Pan eac Química Sau, Ba celona, Espanha; (∆) Necessá io aquecimen o a 50ºC numa placa de aquecimen o a é dissolução o al do compos o; (ө) as soluções depois de p epa adas o am il adas com il os de se inga es é eis de PVDF com 0,22 μm de diâme o de po o. As soluções s ock o am a mazenadas a -20ºC. A diluição de odas as soluções s ock oi ei a em água bides ilada es é il. 49 Jun amen e com os ubos con olo, em cada ensaio o am es ados os inibido es a di e en es pH e na p esença / ausência de GLU con o me se segue: i) 50 µL de suspensão celula e 50 µL de E B ; ii) 50 µL da suspensão celula , 5 µL de solução “s ock” de inibido es e 45 µL de PBS; iii) 50 µL da suspensão celula , 5 µL de solução “s ock” de inibido es e 45 µL de E B ; i ) 50 µL da suspensão celula , 5 µL de solução “s ock” de inibido es, 43 µL de E B e 2 µL de 0,4% GLU (C ); Pa a os pon os i), ii), e iii) os ensaios o am ealizados a pH 5, pH 7 e a pH 8, (Tabela 2 e Tabela 4). Pa a os pon os ii), iii) e i ) a C de inibido es u ilizada oi igual a 1/2 da CMI. Os ubos o am depois colocados num o o de 36 ubos no apa elho Ro o -Gene TM 3000. As medições luo imé icas, em empo eal, o am e ec uadas a 37ºC, u ilizando o il o pa a comp imen os de onda de exci ação de 530 nm “band-pass” (bp) e como il o de de ecção o il o de 585 nm “high-pass” (hp), canal A.530/585hp (67). A medição luo imé ica deco eu po um pe íodo de 30 minu os (ce ca de 30 ciclos de 60 segundos cada) e as lei u as o am e ec uadas após cada ciclo. Cada ensaio oi ealizado em iplicado. 2.2.4.2. De e minação da iabilidade celula Com o in ui o de ob e uma es ima i a do núme o de células iá eis após cada ensaio no Ro o -Gene TM 3000, pa a ga an i que as concen ações de inibido es u ilizadas não es ão a a ec a a iabilidade celula , e ec ua am-se diluições sucessi as (100 – 10-5) de cada amos a e dos con olos em PBS e plaqueou-se um olume de 100 µL em placas com meio MHA. Após 18 ho as de incubação a 37ºC, con ou-se o núme o de unidades o mado as de colónias (CFU). 50 3. RESULTADOS Com o in ui o de esponde às ques ões colocadas nes e abalho (qual o p incipal o necedo de ene gia pa a a p incipal bomba de e luxo (BE) de E. coli, o sis ema Ac AB-TolC e quais os compos os que podem ac ua como inibido es des e p ocesso), oi ei a uma ex ensa pesquisa bibliog á ica, no sen ido de encon a desacoplado es, inibido es de ATPases memb ana es e inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio. De aco do com os c i é ios an e io men e e e idos ( ide capí ulo In odução, secção 1.4.1.), o am escolhidos seis compos os, que incluem dois inibido es de ATPase (azida de sódio e o o anada o de sódio), dois desacoplado es (ca bonil ciane o m- clo o enilhid azona e 2,4-dini o enol) e dois inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio consequen emen e inibido es das ATPases dependen es des e ca ião (clo p omazina e io idazina). 3.1. De e minação das concen ações mínimas inibi ó ias e concen ações mínimas bac e icidas dos compos os em es udo pa a as es i pes AG100, AG100A e AG100TET O pe il de suscep ibilidade das es i pes AG100, AG100A e AG100TET, oi de e minado po cálculo dos alo es de CMI (concen ação mínima inibi ó ia) e CMB (concen ação mínima bac e icida) pa a o b ome o de e ídeo (E B ), desacoplado es, inibido es de ATPases memb ana es e inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio. Os alo es de CMI e CMB pa a cada compos o encon am-se nas Tabelas 7 e 8, espec i amen e. A e iciência de um an ibió ico é ca ac e izada pela sua CMI, sendo es a de inida como a meno concen ação de um compos o an imic obiano su icien e pa a impedi o c escimen o isí el de um mic o ganismo. Es e alo e lec e o sucesso de um an ibió ico em a a essa odas as ba ei as na célula bac e iana e a ingi o seu al o. No 51 en an o, di e en es mecanismos de esis ência podem in e agi pa a aumen a o ní el de esis ência. A inibição de um mecanismo de esis ência po um an ibió ico pode aumen a a suscep ibilidade da bac é ia a esse agen e especí ico, podendo no en an o ambém es au a ou melho a a ac i idade de uma segunda classe de an ibió icos (137). Tabela 7 - Valo es de CMI ob idos pa a subs a os de bombas de e luxo, desacoplado es, inibido es de ATPase e inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio nas ês es i pes de E. coli em es udo. Agen e CMI AG100 AG100A AG100TET mg/L M mg/L M mg/L M E B (*) 150 380x10-9 5 12,6x10-9 300 760x10-9 CCCP (◊) 10 48,8x10-9 10 48,8x10-9 20 97,7x10-9 2,4-DNP (◊) 290 1,57x10-6 290 1,57x10-6 145 788x10-9 CPZ (□) 60 188x10-9 20 62,7x10-9 140 439x10-9 TZ (□) 100 269x10-9 25 67,4x10-9 200 539x10-9 NaN3 (∆) 230 3,5x10-6 230 3,5x10-6 230 3,5x10-6 Na3VO4 (∆) 5000 27,2 5000 27,2 2500 13,6 Legenda: (*) Subs a o de bombas de e luxo; (◊) desacoplado ; (□) Inibido das ATPases dependen es dos canais de cálcio; (∆) inibido de ATPases memb ana es; CMI: concen ação mínima inibi ó ia; M= mola ; E B - B ome o de E ídeo; CCCP - Ca bonil ciane o m-clo o enilhid azona; 2,4-DNP - 2,4-Dini o enol, CPZ - Clo p omazina; TZ - Tio idazina; NaN3 - Azida de Sódio; Na3VO4 - O o anada o de Sódio. Os alo es são a média de pelo menos ês ensaios independen es, com esul ados consis en es. 52 Tabela 8 - Valo es de CMB ob idos pa a subs a os de bombas de e luxo, desacoplado es, inibido es de ATPase e inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio nas ês es i pes de E. coli em es udo. Agen e CMB AG100 AG100A AG100TET mg/L M mg/L M mg/L M E B (*) 150 480x10-9 10 25,3x10-9 500 1,26x10-6 CCCP (◊) 10 48,8x10-9 10 48,8x10-9 20 97,7x10-9 2,4-DNP (◊) 580 3,15x10-6 >580 >3,15x10-6 580 3,15x10-6 CPZ (□) 60 188x10-9 40 125,3x10-9 280 878x10-9 TZ (□) 200 538x10-9 50 134,5x10-9 800 215,6x10-8 NaN3 (∆) >920 >14x10-6 >920 >14x10-6 >920 >14x10-6 Na3VO4 (∆) 6000 32,6x10-6 >6000 >32,6x10-6 6000 32,6x10-6 Legenda: (*) Subs a o de bombas de e luxo; (◊) desacoplado ; (□) Inibido das ATPases dependen es dos canais de cálcio; (∆) inibido de ATPases memb ana es; CMB: concen ação mínima bac e icida;M= mola ; E B - B ome o de E ídeo; CCCP - Ca bonil ciane o m-clo o enilhid azona; 2,4-DNP - 2,4- Dini o enol, CPZ - Clo p omazina; TZ - Tio idazina; NaN3 - Azida de Sódio; Na3VO4 - O o anada o de Sódio. Os alo es são a média de pelo menos ês ensaios independen es, com esul ados consis en es. Como se obse a na Tabela 7, a es i pe AG100A (Δac AB::Tn903 Kan ) ap esen a uma suscep ibilidade ao E B 30 ezes supe io à da es i pe AG100. No espei an e à es i pe AG100TET, onde oco e sob e exp essão do sis ema Ac AB-TolC, a CMI pa a o E B é duas ezes supe io à da es i pe sel agem. Es es esul ados demons am que, a bomba Ac AB-TolC em um papel impo an e na ex usão do E B . A con i mação expe imen al des es esul ados, já epo ado em abalhos an e io es (89, 126), é undamen al pa a a alidação dos modelos expe imen ais escolhidos pa a o es e às hipó eses colocadas nes a ese. 53 Igualmen e, e i icam-se signi ica i as di e enças nas CMIs da es i pe AG100A pa a o compos o TZ, ap esen ando um alo de CMI 4 ezes in e io à es i pe AG100 e pa a o compos o CPZ, que ap esen a um alo de CMI 3 ezes in e io . A CMI do compos o CPZ pa a a es i pe AG100TET é 2,3 ezes supe io à da es i pe AG100. Es es esul ados indiciam que, como no caso de ou os inibido es de bombas de e luxo (IBE), as eno iazinas podem se elas p óp ias subs a o das bombas, pelo que es es compos os pode ão e um e ei o inibi ó io múl iplo: que compe i i o, que deple o de ene gia pa a o e luxo (63, 67). No caso dos es an es compos os a es uda : CCCP, 2,4-DNP, NaN3 e Na3VO4 o alo de CMI pa a as es i pes AG100 e AG100A é o mesmo, e i icando-se apenas algumas di e enças, na o dem de uma diluição, en e AG100TET e AG100. Nenhum des es compos os ap esen a assim sinais de se anspo ado pelo sis ema Ac AB-TolC. Os alo es de CMI e CMB ap esen ados nas Tabelas 7 e 8 são a média de ês ensaios independen es e odos ap esen a am esul ados conco dan es. As expe iências ealizadas endo como con olo os sol en es (DMSO, 50% e anol ou 50% me anol) mos a am que nenhum dos sol en es em e ei o signi ica i o no c escimen o celula e na iabilidade ( esul ados não ap esen ados), não ha endo po an o inibição do c escimen o das es i pes pelos sol en es usados. 54 3.2. Aplicação do mé odo luo imé ico semi-au omá ico pa a moni o ização do anspo e de b ome o de e ídeo Nes e es udo, o mé odo luo imé ico semi-au omá ico de moni o ização do anspo e de E B , desen ol ido na Unidade de Micobac é ias do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical (127, 129), oi seleccionado com o in ui o de iden i ica e a alia os compos os an e io men e seleccionados como po enciais inibido es especí icos de BE, bem como pa a pe mi i e ec ua es udos p elimina es de bioene gé ica do sis ema Ac AB-TolC de E. coli. Es a écnica pe mi e de ec a de o ma ápida, p ecisa e ep odu í el o anspo e de E B a a és da pa ede celula bac e iana em concen ações de abalho que não in e i am com a iabilidade celula nem pe u bam as unções celula es, usando uma me odologia que pe mi e a dis inção en e acumulação e e luxo, ou seja, a di ecção de anspo e do E B a a és da memb ana celula . 3.2.1. Pa âme os base na ca ac e ização do anspo e de E B De o ma a auxilia a lei u a e in e p e ação dos esul ados que se ap esen am de seguida, con ém elemb a que a acumulação de E B na célula bac e iana é o esul ado do equilíb io dinâmico en e a di usão passi a no sen ido do meio in acelula e a ex usão ac i a, mediada po BE, no caso pa icula de E. coli, pelo sis ema Ac AB- TolC, que o e ec ua u ilizando a o ça p o o-mo iz (FPM). Es e equilíb io é unção de uma di e sidade de ac o es como sejam a pe meabilidade da pa ede celula , o g au de ac i idade de e luxo e de ene gização da célula, em pa icula o pH do meio ex acelula , en e ou os ac o es. Quando se ul apassa a concen ação de equilíb io en e a di usão passi a e o e luxo ac i o de E B , es e i á liga -se i e e si elmen e aos componen es in acelula es, em pa icula aos ácidos nucleicos, e como al não pode á se ex usado po e luxo. Uma ez no in e io da célula oco e um inc emen o do sinal de luo escência do E B ace a soluções de E B li e, como esul ado da sua ligação ansien e a di e sos al os in acelula es (89, 131). 55 C i é ios u ilizados pa a odos os ensaios de acumulação e compos os es ados nes e abalho, com ecu so ao mé odo luo imé ico semi-au omá ico de moni o ização do anspo e de E B a a és de memb anas e pa edes celula es: • A concen ação de E B li e no ambien e ex acelula em cada ensaio de e á pe mi i o es abelecimen o do equilíb io en e a en ada po di usão passi a do E B e a sua saída po e luxo ac i o, não a ec ando de alguma o ma a iabilidade celula . A luo escência de ec ada em equilíb io não de e á ul apassa 20% da luo escência máxima de ec á el no in e alo máximo de 30 mínu os a pH isiológico (pH=7) e de e á es a abaixo de 1/2 da CMI do E B pa a a es i pe em es e; • A concen ação de compos o a es a como possí el inibido do e luxo não de e á excede 1/2 da CMI pa a a es i pe a se es ada, de modo a não a ec a a iabilidade celula . A ga an ia de iabilidade é um equisi o undamen al pa a a co ec a análise do e ei o de um de e minado compos o sob e a ac i idade de e luxo uma ez que não se p e ende que oco am a iações na luo escência de ec ada po a iação dos e ec i os celula es. Assim, os ensaios são e ec uados em ampão os a o e du an e não mais de 30 minu os (pa a e i a o e en ual aumen o de e ec i os po mul iplicação celula ), u ilizando concen ações dos compos os a es a que não ul apassem 1/2 das espec i as CMIs (diminuição de e ec i os po in e e ência na iabilidade); Após a de e minação da iabilidade celula , obse ou-se que as concen ações dos compos os u ilizadas não causa am diminuição signi ica i a no c escimen o (dados não ap esen ados). • O compos o não de e in e e i com o sinal de luo escência no e mociclado de empo eal; • De e á se ga an ida às celulas condições ideais de o necimen o de ene gia (glucose a 0,4%) em pelo menos um ubo com o compos o em es e pa a ga an i que, mesmo nas condições óp imas de o necimen o de ene gia, o e ei o inibi ó io do compos o sob e o e luxo é isí el. Sem es a condição pode -se-ia e i ica inibição do anspo e po depleção na u al da ene gia celula du an e o ensaio. 56 Todos es es c i é ios o am espei ados a a és da inclusão, em cada ensaio ealizado, e pa a odos os compos os e es i pes es ados nes e abalho, de ubos con olo de aco do com o desc i o no capí ulo Ma e ial e Mé odos, secção 2.2.4.1. Nenhum dos con olos ap esen ou luo escência signi ica i a nos ensaios e ec uados. Como exemplo es ão ap esen ados na Figu a 21 os esul ados ob idos pa a os con olos (i) a (i ) que, pa a acili a a lei u a e in e p e ação dos esul ados dos es an es g á icos o am aqui analisados sepa adamen e. As ês es i pes em es udo o am expos as a concen ações c escen es de E B de 0.05 mg/L a 2,5 mg/L, com o objec i o de de e mina a concen ação de E B a pa i da qual se começa a de ec a acumulação nas células (dados não ap esen ados). A concen ação imedia amen e abaixo dessa se á a concen ação pa a a qual as células são capazes de man e um equilíb io en e a en ada do E B po di usão passi a e a sua ex usão pelos sis emas de e luxo in ínsecos. Os esul ados da de ecção luo imé ica da acumulação de concen ações c escen es de E B mos ou que pa a a es i pe AG100A, uma concen ação de E B de 0.5 mg/L e pa a as es i pes AG100 e AG100TET uma concen ação de E B de 1 mg/L, ap esen am a mesma luo escência esidual/basal e são as concen ações que podem se usadas como limi e in e io de acumulação pa a as ês es ipes em es udo. Des e modo, as concen ações de E B u ilizadas nos ensaios de acumulação não são iguais pa a as ês es i pes, pois a es i pe AG100A em o p incipal sis ema de e luxo Ac AB-TolC inac i ado, não endo po isso capacidade pa a ex usa ão acilmen e o E B (subs a o do sis ema Ac AB-TolC), o que se comp o a pelo ac o de a CMI do E B pa a a es i pe AG100A se 30 ezes in e io ela i amen e à es i pe sel agem AG100, ide Tabela 7, o que az com que a AG100A enha maio suscep ibilidade a es e compos o. An e io men e já inha sido es udado e concluído que em E. coli a concen ação óp ima de E B pa a es uda a acumulação é de 1 mg/L (67), podendo es a concen ação a ia con o me a es i pe com que se es á a abalha , e que numa concen ação in e io a 0.5 mg/L o sinal es á abaixo da sensibilidade do ins umen o (111). 57 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 E B (1µg/mL) + Glucose 0.4% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Glucose 0.4% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 E B (1µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 AG100TET 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 AG100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 AG100A Tempo (minu os) Fluo escência (unidades a bi á ias) Figu a 21 - Moni o ização da in ensidade de luo escência dos con olos a 37ºC, ao comp imen o de onda de exci ação de 530 nm bp e de emissão de 585 nm hp. 3.2.2. In luência de desacoplado es na acumulação de E B Desacoplado es são compos os que pe mi em ea anjos e anslocações ansien es dos p o ões exis en es na supe ície in e na e ex e na da bicamada lipídica das memb anas celula es, le ando ao colapso do g adien e p o ónico ansmenb ana (ΔμH+) necessá io pa a assegu a a sín ese de ATP e o anspo e memb ana . Consequen emen e a sua p esença ac i a as ATPases da memb ana plasmá ica diminuindo a sín ese de ATP e aumen ando a sua u ilização/hid ólise, pois as células são o çadas a hid olisa ATP pa a apidamen e pode em es abelece o po encial p o ónico e sob e i e . U ilizou-se os compos os 2,4-DNP e CCCP com o objec i o de es uda a sua in luência na inibição do e luxo e consequen e, acumulação de E B nas células de E. coli u ilizadas nes e es udo. Os esul ados ob idos a a és de ensaios de acumulação, pelo mé odo luo ime ico semi-au omá ico de moni o ização do anspo e de E B , pa a es e compos os encon am-se nas Figu as 22 a 25. 58 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) E B Es i pe Es i pe + E B 2,4-DNP 2,4-DNP + E B Es i pe + 2,4-DNP Es i pe + 2,4-DNP + E B Es i pe + 2,4-DNP + E B + GLU 0.4% (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 22 - In luência do 2,4-dini o enol na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC e pH 7, pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de 2,4-DNP a ½ da CMI (145mg/L pa a E. coli AG100 e AG100A, e 72,5mg/L pa a E.coli AG100TET). Concen ação de E B pa a E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concen ação de E B de 0.5 mg/L pa a E. coli AG100A. Os á ios con olos es ão ep esen ados no g á ico. Como se cons a a na Figu a 22B, ensaio de acumulação pa a a es i pe AG100, na p esença de glucose (GLU) linha a e melho, em compa ação com o ensaio sem GLU linha la anja, a di e ença de luo escência en e as duas cu as e lec e a capacidade de e luxo de E B que as células êm na p esença de GLU. O a ingi de alo es de luo escência di e en es, e lec e o e luxo de E B na cu a de acumulação. 2,4-Dini o enol 65 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) Es i pe + E B Es i pe + NaN 3 + E B Es i pe + NaN 3 + E B + GLU 0.4% Azida de Sódio Dos g á icos ap esen ados na Figu a 26, podem-se des aca como esul ados mais impo an es os que se ap esen am na Figu a 27. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 27 - In luência da azida de sódio na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC e pH 7, pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de NaN3 a ½ da CMI. As concen ações de NaN3 e de E B são as mesmas da igu a an e io . Pa a as ês es i pes em es udo, na p esença de azida de sódio, e compa ando com o con olo da es i pe na p esença apenas de E B , não se obse a aumen o signi ica i o da acumulação de E B na p esença de compos o, sendo as cu as de acumulação p a icamen e sob epos as ao longo do empo. Pa a a es i pe AG100TET não se obse a acumulação de E B , o que indica uma o al incapacidade da ac i idade inibi ó ia da azida de sódio sob e o sis ema Ac AB-TolC sob eexp esso nes a es i pe. A azida de sódio oi desc i a como sendo um inibido p e e encial das V-ATPases (H+- ATPases acuola es ípicas dos euca io as), que uma ez inibidas não conseguem man e o po encial de memb ana, dada a diminuição do anspo e de p o ões pa a o meio ex acelula , o que conduz à edução da FPM (48, 132, 141). Con udo, oi 66 igualmen e epo ado que a ac i idade enzimá ica da F1FO-ATPase é ambém inibida, em meno escala pela azida, bem como ou as ATPases são pa cialmen e inibidas pela azida, ais como os anspo ado es ABC, a anslocase SecA e a DNA opoisome ase IIα (13, 133). Não exis indo um g ande núme o de V-ATPases ao ní el das memb anas ci oplasmá icas p oca io as, es es esul ados enquad am-se na hipó ese de que, a FPM que ga an e o uncionamen o das BE da amília RND como a Ac AB-TolC, p o ém sob e udo do acoplamen o com as F-ATPases memb ana es e as P-ATPases, comp eendendo-se po isso que a azida de sódio não enha uma acção inibi ó ia signi ica i a sob e a ac i idade do sis ema Ac AB-TolC no e luxo de E B em E. coli. 67 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) E B Es i pe Es i pe + E B Na 3 VO 4 Na 3 VO 4 + E B Es i pe + Na 3 VO 4 Es i pe + Na 3 VO 4 + E B Es i pe + Na 3 VO 4 + E B + GLU 0.4% O o anada o de Sódio Nas Figu as 28 e 29 encon am-se os esul ados ob idos pa a o compos o o o anada o de sódio. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 28 - In luência do o o anada o de sódio na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC e pH 7, pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de Na3VO4 a ½ da CMI (2500mg/L pa a E. coli AG100 e AG100A, e 1250mg/L pa a E.coli AG100TET). Concen ação de E B pa a E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concen ação de E B de 0.5 mg/L pa a E. coli AG100A. Os á ios con olos es ão ep esen ados no g á ico. 68 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) Es i pe + E B Es i pe + Na 3 VO 4 + E B Es i pe + Na 3 VO 4 + E B + GLU 0.4% O o anada o de Sódio Dos g á icos ap esen ados na Figu a 28, podem-se des aca como esul ados mais impo an es os que se ap esen am na Figu a 29. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 29 - In luência do o o anada o de sódio na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC e pH 7, pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de Na3VO4 a ½ da CMI. As concen ações de Na3VO4 e de E B são as mesmas da igu a an e io . Pa a as ês es i pes em es udo, compa a i amen e ao con olo da es i pe somen e com E B , obse a-se que na p esença do compos o o o anada o de sódio, há uma o e acção inibi ó ia do e luxo que p omo e uma g ande acumulação de E B nas células. Pa a a concen ação u ilizada, e i ica-se que a p esença de GLU não al e a signi ica i amen e a acumulação de E B pelas células, o que e idência o po encial inibi ó io des e compos o. De ido ao ac o de se um compos o com um esul ado ão e iden e a 1/2 da CMI, e sendo a CMI pa a es e compos o bas an e ele ada (5000 mg/L), al signi ica que mesmo na p esença de uma g ande concen ação de compos o, a célula con inua a mul iplica - se no malmen e, não sendo po isso um e ei o inibi ó io le al. Tal e idencia que es e compos o é especí ico das ATPases não essenciais en ol idas no anspo e de iões a 69 ní el memb ana . Po ou o lado, e uma ez que ela i amen e à acumulação de E B na p esença de Na3VO4, se obse am os mesmos esul ados pa a odas as es i pes, inclusi e pa a a AG100A, que em o sis ema de e luxo Ac AB-TolC inac i ado, logo a inibição não é especí ica do sis ema Ac AB-TolC, mas sim de odas as BE que usam a ene gia p o enien e da FPM acoplada às ATPases inibidas po es e compos o. Na mesma linha de aciocínio e pa a a es i pe AG100TET, que em o p incipal sis ema de e luxo Ac AB-TolC sob e-exp esso, obse a-se uma acumulação signi ica i a de E B na p esença de o o anada o de sódio, compa ando com o con olo sem compos o, a ingindo um máximo de acumulação ao im de 15 minu os. Igualmen e a GLU, como on e de ene gia al e na i a, em pouca capacidade pa a al e a /supe a o e ei o do o o anada o de sódio, pois a inibição com es e compos o é ão o e, que mesmo com GLU não se consegue supe a es a inibição, uma ez que a ligação en e a p odução de ATP ao ní el das ias me abólicas e a sua u ilização pa a ge a FPM pa a as BE encon a-se bloqueada. Sendo o o o anada o de sódio um inibido p e e encial de F- e P-ATPases (13, 78, 133), e i ica-se que, na p esença des e compos o, há inibição das BE dependen es da FPM sem se a ec ado di ec amen e o me abolismo celula o que o coloca como um excelen e candida o a adju an e de quimio e apia po inibição do e luxo de agen es quimio e apeu icos ao mesmo ní el que ou os compos os, ambém idos como inibido es de ATPases de anslocação iónica (P-ATPases), como as eno iazinas (2, 68, 128). 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) E B Es i p e Es i pe + E B CPZ CPZ + E B Es i pe + CPZ Es i pe + CPZ + E B Es i pe + CPZ + E B + GLU 0.4% CPZ 3.2.4. In luência de compos os que inibem os canais de cálcio na acumulação de E B Como compos os inibido es dos canais de cálcio, e consequen emen e inibido es das ATPases dependen es dos canais de cálcio, u iliza am-se os compos os clo p omazina (CPZ) e io idazina (TZ), ambos do g upo das eno iazinas. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 30 - In luência da Clo p omazina na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC e pH 7, pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de CPZ a ½ da CMI (30mg/L pa a E. coli AG100, 10mg/L pa a E. coli AG100A, e 70mg/L pa a E.coli AG100TET). Concen ação de E B pa a E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concen ação de E B de 0.5 mg/L pa a E. coli AG100A. Os á ios con olos es ão ep esen ados no g á ico. 71 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) Es i pe + E B Es i pe + CPZ + E B Es i pe + CPZ + E B + GLU 0.4% CPZ Dos g á icos ap esen ados na Figu a 30, podem-se des aca como esul ados mais impo an es os que se ap esen am na Figu a 31. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 31 - In luência da Clo p omazina na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC, e pH 7 pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de CPZ a ½ da CMI. As concen ações de CPZ e de E B são as mesmas da igu a an e io . Pa a as ês es i pes em es udo, e compa a i amen e ao con olo da es i pe somen e com E B , obse a-se acumulação signi ica i a de E B na p esença de CPZ, a ingindo-se um alo máximo aos 30 minu os de acumulação pa a a es i pe sel agem. 72 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) E B Es i pe Es i pe + E B TZ TZ + E B Es i pe + TZ Es i pe + TZ + E B Es i pe + TZ + E B + GLU 0.4% TZ Nas Figu as 32 e 33 encon am-se os esul ados ob idos com a io idazina (TZ). (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 32 - In luência da Tio idazina na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC e pH 7, pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de TZ a ½ da CMI (50mg/L pa a E. coli AG100, 12,5mg/L pa a E. coli AG100A, e 100mg/L pa a E.coli AG100TET). Concen ação de E B pa a E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concen ação de E B de 0.5 mg/L pa a E. coli AG100A. Os á ios con olos es ão ep esen ados no g á ico. 73 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluo escência (unidades a bi á ias) Tempo (minu os) Es i pe + E B Es i pe + TZ + E B Es i pe + TZ + E B + GLU 0.4% TZ Dos g á icos ap esen ados na Figu a 32, podem-se des aca como esul ados mais impo an es os que se ap esen am na Figu a 33. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figu a 33 - In luência da Tio idazina na acumulação de E B . Ensaio de acumulação de E B , du an e um pe íodo de 30 minu os, a 37ºC e pH 7, pa a as es i pes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na p esença e ausência de GLU, e na p esença de TZ a ½ da CMI. As concen ações de TZ e de E B são as mesmas da igu a an e io . Na p esença do compos o TZ, as es i pes AG100 e AG100TET na p esença e na ausência de GLU, acumulam E B a é um alo máximo de luo escência ao im de 10 minu os, de 70 e 80 unidades ela i as de luo escência, espec i amen e, e a pa i desse momen o as células começam a e luxa E B , supe ando o e ei o inibi ó io da TZ. Com base nes es esul ados, há que conside a a hipó ese de o sis ema Ac AB-TolC e ias al e na i as, pa a supe a a inibição p o ocada pela TZ pois, pa a a es i pe AG100A, não se obse a esse enómeno, obse ando-se apenas acumulação de E B nas mesmas condições expe imen ais. Pa a ambas as eno iazinas es adas, a p esença de GLU não al e ou a acumulação de E B em qualque uma das es i pes. Os inibido es dos canais de cálcio não êm o seu e ei o a ec ado pela GLU, al como os es an es inibido es de ATPases es ados. 74 3.3. In luência de di e sos inibido es na acumulação de E B a pH 5, pH 7 e pH 8 Do conjun o dos esul ados an e io es, o nou-se e iden e a dependência do e luxo de E B em E.coli da exis ência e manu enção da FPM, sendo que, os compos os que melho es e ei os e idencia am, o am aqueles que p omo em a dissipação do po encial p o ónico (desacoplado es) e os inibido es das F e P-ATPases bac e ianas (o o anada o de sódio e eno iazinas), que ga an em a manu enção da FPM. Os e ei os an e io men e pos os em e idência o am obse ados a pH isiológico (pH 7). Se as hipó eses an e io men e a ançadas o em álidas, en ão a a aliação do e ei o des es mesmos compos os na acumulação de E B ambém a pH 5 e a pH 8, na p esença e ausência de GLU, i á coloca em e idência, a dependência do anspo e de E B em E. coli do g adien e elec oquímico ansmemb ana , com os seus dois componen es: um g adien e de p o ões que p omo e uma di e ença de pH (ΔpH) e uma di e ença na ca ga iónica ou po encial de memb ana (Δψ) de ido à dis ibuição desigual de ca gas, os dois componen es da FPM (15). Ao es a mos a acumulação de E B a di e en es pH, podemos obse a di e en es esul ados con o me a quan idade de p o ões que es ão disponí eis no meio ex acelula , pois a célula bac e iana u iliza os p o ões como an ipo e pa a as BE, as ATPases e a p óp ia FPM, espe ando-se que a pH baixo (ele ada concen ação de hid ogeniões no meio ex acelula ) o e ei o dos inibido es an e io men e iden i icados seja diminuído quando em compa ação com os esul ados a pH 7. Ao in és, espe a-se uma exace bação dos e ei os inibi ó ios a pH al o (baixa concen ação de hid ogeniões no meio ex acelula ). Pa a es e e ei o seleccionou-se o desacoplado , o inibido das ATPases memb ana es e o inibido dos canais de cálcio que melho es esul ados inibi ó ios ap esen a am nas secções an e io es, nomeadamen e o CCCP, o Na3VO4 e o CPZ. 81 4. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Tal como an e io men e e e ido, nes e abalho p ocu ou-se comp eende a o igem da ene gia u ilizada pelas BE (bombas de e luxo) de E. coli, em pa icula , o seu p incipal sis ema de e luxo, Ac AB-TolC, in e e indo no o necimen o des a ene gia e obse ando como isso pode a ec a a ac i idade de e luxo. Depois de seleccionados os compos os que, na li e a u a, são apon ados como possí eis inibido es da ac i idade de e luxo em E. coli, ais como desacoplado es (CCCP e 2,4-DNP), inibido es das ATPases memb ana es (NaN3 e Na3VO4) e inibido es dos canais de cálcio (TZ e CPZ), oi u ilizado um mé odo luo imé ico semi-au omá ico que de ec a em empo eal, a acumulação e e luxo do b ome o de e ídeo (E B ), com o objec i o de a alia a sua ac i idade inibi ó ia e in e i da sua acção sob e a bioene gé ica do p ocesso de anspo e de E B em E. coli. Iniciou-se o es udo pela de e minação da CMI e CMB. Tal como obse ado na Tabela 7, a es i pe AG100A, ap esen a suscep ibilidade ao E B 30 ezes supe io à es i pe AG100. O mesmo acon ece pa a o compos o TZ, ap esen ando um alo de CMI 4 ezes in e io à es i pe AG100. No que espei a ao compos o CPZ, es e ap esen a um alo de CMI 3 ezes in e io . Podendo-se in e i que quando o sis ema Ac AB-TolC es á inac i ado, ou os sis emas de e luxo subs i uem es a ac i idade, embo a menos e icien emen e, como se demons a pelas CMIs meno es dos compos os pa a a es i pe AG100A. No caso dos compos os CCCP, 2,4-DNP, NaN3 e Na3VO4, o alo de CMI pa a a es i pe AG100 e AG100A é o mesmo. Sabe-se que o genoma de E. coli em á ias BE que são homólogas ao Ac B (86), ou seja, mesmo endo o sis ema Ac AB-TolC inac i ado, alguns compos os podem ambém se ex usados po ou as bombas homólogas ao Ac AB-TolC ou po ou o sis ema de e luxo que use di ec amen e a ene gia da hid ólise de ATP, cons i uindo os sis emas de anspo e p imá ios como os sis emas ABC. 82 Do es udo e ec uado nes e abalho, sob e o anspo e de E B po luo ime ia em empo eal em E. coli, podemos conclui que: • O p o ocolo de luo ime ia no Ro o -Gene 3000TM, que cons i ui um mé odo semi-au omá ico, de ec a acumulação e e luxo de E B em empo- eal, e no qual podem se al e adas condições como a empe a u a e o pH, se mos ou adequado aos objec i os e hipó eses colocadas desde que se cump am os equisi os e condições seguin es: i) a concen ação de E B li e no ambien e ex acelula em cada ensaio, de e á pe mi i o es abelecimen o do equilíb io en e a en ada po di usão passi a do E B e a sua saída po e luxo ac i o, não a ec ando de alguma o ma a iabilidade celula , ii) a concen ação de compos o a es a , como possí el inibido do e luxo, não de e á excede 1/2 da CMI pa a a es i pe a se es ada, de modo a não a ec a a iabilidade celula ; iii) o compos o ou mesmo o sol en e u ilizado, não de em de in e e i com o sinal de luo escência no e mociclado de empo eal, i ) de e ão se dadas às células condições ideais de o necimen o de ene gia (glucose a 0,4%) em pelo menos um ubo com o compos o em es e pa a ga an i que, mesmo nas condições óp imas de o necimen o de ene gia, o e ei o inibi ó io do compos o sob e o e luxo é isí el; • A acumulação de E B aumen a na p esença dos compos os inibido es de bombas de e luxo (IBEs) seleccionados pa a es e abalho; • O sis ema Ac AB-TolC é al amen e suscep í el à dissipação da FPM p omo ida pelos desacoplado es 2,4-DNP e CCCP, essal ando a impo ância que a manu enção da FPM em pa a a e icien e ac i idade do sis ema Ac AB-TolC e consequen emen e pa a o e luxo de E B em E. coli; • Quando se inibe di ec amen e a acção das ATPases, que ga an em a FPM, po ecu so a inibido es de V, F e P-ATPases memb ana es, como o NaN3 (V- ATPases) e o Na3VO4 (F e P-ATPases), e i ica-se um subs ancial aumen o da acumulação de E B nas células, pois es as não conseguem man e o po encial de memb ana dada a diminuição do anspo e de p o ões pa a o meio ex acelula ; • Na p esença de inibido es especí icos das P-ATPases, como as eno iazinas CPZ e TZ, oco e signi ica i a inibição do e luxo de E B nas es i pes AG100 e AG100TET na p esença e na ausência de glucose (GLU). Os inibido es dos canais 83 de cálcio não êm o seu e ei o a ec ado pela GLU al como os es an es inibido es de ATPases es ados; • De odos os compos os es ados, o Na3VO4, oi o que e elou um maio e ei o inibi ó io, não sendo um e ei o inibi ó io le al. Tal obse ação e idência que es e compos o é especí ico das ATPases não essenciais en ol idas no anspo e de iões a ní el memb ana , não sendo a inibição especí ica do sis ema Ac AB- TolC, mas sim de odas as BE que usam a ene gia p o enien e da FPM acoplada às ATPases inibidas po es e compos o (F e P-ATPases) (13, 78, 133). A GLU, como on e de ene gia al e na i a, em pouca capacidade pa a al e a /supe a o e ei o do Na3VO4, pois a ligação en e a p odução de ATP ao ní el das ias me abólicas e a sua u ilização pa a ge a FPM pa a as BE se encon a bloqueada. O Na3VO4 se á en ão um excelen e candida o, pa a u u os es udos, como adju an e de quimio e apia po inibição do e luxo de agen es quimio e apeu icos; • A acumulação e e luxo de E B em E. coli são dependen es da ene gia disponí el na célula, sendo o seu e luxo a ec ado pelo pH e pela disponibilidade em GLU no meio ex acelula ; • A GLU, como on e de ene gia e a pH isiológico (pH 7) ou a pH 8, es imula a p odução/manu enção da FPM pelo acoplamen o com a p odução p o ónica pelas ATPases, o que con a ia a acção inibi ó ia do 2,4-DNP e do CCCP po dissipação e desacoplamen o do po encial p o ónico, sob e udo na es i pe AG100TET onde es e e ei o é mais no ó io dado o ele ado núme o de cópias do sis ema Ac AB-TolC que es ão a ope a na dependência da FPM; • Num ambien e ico em p o ões (pH 5) o e ei o de dissipação do po encial p o ónico causado pelo CCCP, sob e a acumulação de E B é apidamen e sup imido, ou seja, a pH 5 a ac i idade do desacoplamen o do po encial p o ónico p o ocada pelo CCCP, é apidamen e sup imida e a p esença ou ausência de GLU não em in luência sob e a manu enção da ac i idade de e luxo de E B em E. coli. Num ambien e com escassez em p o ões (pH 8) o e ei o de dissipação do po encial p o ónico causado pelo CCCP, sob e a acumulação de E B é len amen e sup imido na ausência de GLU, o que cla amen e p omo e a acumulação de E B . Uma ez o necida GLU ao meio, a glicólise é ac i ada 84 bem como as ATPases, as quais ão ge a uma maio disponibilidade de p o ões, pa a o es abelecimen o do po encial p o ónico, que ga an e o e oma do e luxo de E B pelo sis ema Ac AB-TolC; • As ou as BE que subs i uem o sis ema Ac AB-TolC no e luxo de E B , na es i pe AG100A não eco em à FPM pa a ac ua , não sendo a ec adas pela dissipação causada pela p esença do desacoplado CCCP, pela escassez em p o ões (pH 8), ou pela p esença ou ausência de GLU, a qualque um dos ês pH es ados, na ausência de IBEs. São p o a elmen e BE dependen es da ene gia ge ada di ec amen e pela hid ólise do ATP, pe encen es ao sis ema ABC, pois apenas quando es ão p esen es no meio IBEs especí icos pa a es as bombas é possí el inibi o e luxo de E B pela es i pe AG100A; • Num ambien e ico em p o ões (pH 5), o e ei o de inibição das ATPases memb ana es causado pelo Na3VO4, que conduz a um aumen o da acumulação de E B , é g andemen e diminuído e a p esença de GLU em g ande in luência no e oma do e luxo de E B pelo sis ema Ac AB-TolC e pelos sis emas que o subs i uem na es i pe AG100A. De no a que na p esença de sob eexp essão do sis ema Ac AB-TolC e num ambien e ico em p o ões, o e ei o do inibido Na3VO4 é comple amen e anulado, ealçando a dependência do sis ema Ac AB- TolC da FPM. Num ambien e com escassez em p o ões (pH 8), o e ei o de inibição das ATPases memb ana es causado pelo Na3VO4 é aumen ado, não sendo sup imido ou diminuído mesmo na p esença de GLU, mesmo na es i pe com sob eexp essão de Ac AB-TolC (AG100TET). No caso da es i pe AG100A, a inac i ação das BE do ipo ABC pelo Na3VO4 é di ec a e signi ica i a, uma ez que es as bombas dependem di ec amen e da ene gia p o ida po es as ATPases memb ana es pa a pode em ope a ; • Num ambien e ico em p o ões (pH 5), o e ei o de inibição das P-ATPases dependen es dos canais de cálcio, po ássio e sódio, causado pelo CPZ, é mui o eduzido uma ez que a inibição das P-ATPases não a ec a a FPM pa a as bombas RND ( al como o Ac AB-TolC) ope a em, ou as F-ATPases que ga an em o uncionamen o dos sis emas ABC da es i pe AG100A. A p esença ou ausência de GLU não em pois qualque in luência na manu enção do e luxo de E B . Num ambien e com escassez em p o ões (pH 8), o e ei o de inibição 85 das P-ATPases causado pelo CPZ conduz a um aumen o da acumulação de E B , não sendo sup imido ou diminuído mesmo na p esença de GLU. Em esumo, oi possí el op imiza a aplicação do mé odo luo imé ico semi- au omá ico, pa a moni o ização do anspo e de E B a a és da pa ede de E. coli, u ilizando a luo ime ia em empo eal no Ro o -Gene TM 3000, a a és da de inição dos pa âme os e condições expe imen ais essenciais pa a a ob enção de esul ados signi ica i os em e mos da bioene gé ica des e e luxo bac e iano. Os esul ados mos a am que, o sis ema de e luxo in ínseco de E B em E. coli é maio i a iamen e e ec uado pelo sis ema Ac AB-TolC, o qual é con olado di ec amen e pela ene gia p o enien e da FPM ansmemb ana , a qual é maio i a iamen e man ida pelas F- ATPases apoiadas secunda iamen e pelas P-ATPases bac e ianas. Todo es e sis ema es á dependen e do ca abolismo da GLU e da concen ação de p o ões no meio (pH ex acelula ). Quando o sis ema Ac AB-TolC es á inac i o, ou as BE enca egam-se de e luxa o E B , endo os esul ados apon ado que es as de e ão se BE dependen es de ATPases, ou seja, do ipo ABC. De odos os compos os es ados, o mais e icien e na inibição do anspo e de E B em E. coli oi o Na3VO4, ao inibi di ec amen e a on e p imo dial de p o ões pa a a FPM bac e iana, as F-ATPases. O segundo mais e icien e oi a eno iazina CPZ que inibe p e e encialmen e as P-ATPases bac e ianas, as quais ac uam como supo e secundá io pa a a manu enção da FPM, ao ansloca em ca iões po p o ões. Con ibuiu-se assim pa a um melho conhecimen o da bioene gé ica do e luxo em E. coli. Uma ez que a esis ência in ínseca das es i pes de E. coli é a ec ada pelos IBEs es ados ais como o Na3VO4, CPZ e TZ, es es e ei os podem i a se impo an es na pesquisa e desen ol imen o de no as e mais e icazes e apias an imic obianas. 86 4.1. Pe spec i as Fu u as Sendo a esis ência bac e iana aos an ibió icos um aspec o do conhecimen o ac ualmen e em g ande expansão, a acção das bombas de e luxo (BE), e a sua in e ligação com ou os mecanismos de egulação do anspo e celula , como o da sín ese de po inas, é hoje uma ealidade que se e á de e em con a quando se p ocu a explica o enómeno conhecido de médicos e mic obiologis as de que à medida que se acen ua o uso de um an ibió ico, maio a apidez no apa ecimen o de es i pes esis en es. Os in es igado es são unânimes em a i ma que o an ibió ico é um ac o de selecção que p i ilegia as bac é ias que possuem de e minan es gené icos pa a a esis ência, seja as que adqui i am genes de esis ência ou uma mu ação de esis ência, seja po aumen o dos enómenos associados de esis ência di a isiológica ou aumen o da exp essão e da ac i idade das BE. Ce amen e que o desen ol imen o de inibido es especí icos de BE, nomeadamen e aqueles que in e i am nos equisi os ene gé icos especí icos des e e luxo, acili a á g andemen e a quimio e apeu ica an ibac e iana, podendo o na bac é ias esis en es, em suscep í eis a doses e apêu icas no mais, e como al pe mi i um eap o ei amen o do ac ual a senal quimio e apeu ico e assim con ibui pa a o comba e ao lagelo da esis ência aos an ibió icos. A ecnologia e me odologia aqui aplicada e op imizada, endo em con a os esul ados ob idos, pode á se uma eno me mais alia na de e minação em empo eal de no os inibido es e das melho es condições ambien ais, pa a que se possa p e eni e comba e a mul i esis ência po BE. 87 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Ama al, L., M. Vi ei os e Molna , J. 2004. An imic obial ac i i y o pheno hiazines. In Vi o. 18(6): 725-732. 2. Ama al, L., M. Ma ins, e M. Vi ei os. 2007. 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