Prevalência de parasitoses intestinais em crianças e funcionários de uma creche comunitária na comunicade "Entra a Pulso" da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil: detecção e identificação de Crysporidium spp e Giardia sp. através de técnicas de Biologia Molecular

MESTRADO EM PARASITOLOGIA MÉDICA Prevalência de parasitoses intestinais em crianças e funcionários de uma creche comunitária na comunidade “Entra A Pulso” da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil: detecção e identificação de Cryptosporidium spp. e Giardia sp. através de técnicas de biologia molecular ALEXANDRE MACIEL DA SILVA LISBOA, 2010 2 Prevalência de parasitoses intestinais em crianças e funcionários de uma creche comunitária na comunidade “Entra A Pulso” da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil: detecção e identificação de Cryptosporidium spp. e Giardia sp. através de técnicas de biologia molecular ALEXANDRE MACIEL DA SILVA Orientadora: Profª Doutora Olga Mª Guerreiro de Matos Co-orientadora: Profª Doutora Vlaudia Mª Assis Costa Tese apresentada para obtenção do grau de Mestre em Parasitologia Médica. 3 RESUMO Apesar do crescente desenvolvimento científico e tecnológico observado nos últimos anos, as doenças parasitárias ainda constituem um importante problema de saúde pública, principalmente nos países em desenvolvimento. Este estudo tem como objetivo verificar a prevalência de parasitoses intestinais em crianças matriculadas na creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem, bem como os funcionários e seus filhos, para detecção e identificação de Cryptosporidium spp. e Giardia sp. através de técnicas de biologia molecular (nested-PCR/sequenciação de DNA). As amostras de fezes (94) foram obtidas de 58 crianças da creche, 18 funcionários e seus filhos (18). Estas amostras foram examinadas pelo método direto em esfregaços fecais após coloração com Lugol, utilizando o método modificado formol-éter. Para a identificação de Cryptosporidium as amostras foram coradas em lâmina pelo método Ziehl-Neelsen modificado (MT). Em amostras positivas por microscopia, o DNA dos ooquistos/quistos foi extraído pelo método MiniBeadBeater/silica. As espécies e genótipos dos isolados identificados foram determinadas por nested-PCR de um fragmento da subunidade menor (SSU) do gene rRNA. Para subsidiar os resultados obtidos dessa colheita foi utilizado também um questionário, o qual foi aplicado às mães e/ou responsáveis pelas crianças e aos funcionários, contendo a identificação do paciente e fatores predisponentes às parasitoses (tipo de abastecimento de água, destino do esgoto, possuir animais domésticos, higiêne das mãos e pessoal). Os resultados dos exames coprológicos evidenciaram que do total dos parasitados 43 (45,8%) eram positivos para pelo menos um parasita. sete (16,3%) eram funcionários e 36 (83,7%) eram crianças, sendo 27 (62,8%) do sexo feminino e 16 (37,2%) do sexo masculino, sem que fosse detectada diferença significativa entre os géneros. Em relação às espécies de parasitas, os dados evidenciaram 4 maior prevalência de Cryptosporidium spp. (53,4%) seguida de Giardia sp. (44,2%). A caracterização genética dos isolados evidenciaram presença de C. parvum e Giardia duodenalis. Os resultados e os dados epidemiológicos obtidos, neste estudo, reforçam a importância do diagnostico e controlo das enteroparasitoses na população de crianças frequentadoras de instituições comunitárias assim como dos seus funcionários, representando, ainda, um grave problema de saúde pública em países em desenvolvimento. PALAVRAS-CHAVE Enteroparasitos, Creche, Giardia, Genética, Protozooses, Protozoários 5 ABSTRACT Despite the growing scientific and technological development observed in recent years, the parasitic diseases still constitute a major public health problem, especially in developing countries. This study aims: to determine the prevalence of intestinal parasites in children enrolled in kindergarten Community Nossa Senhora de Boa Viagem, and the institution employees and their children; to detection and identification of Cryptosporidium spp. and Giardia sp. through molecular biology techniques (nested-PCR). Fecal samples (94) were obtained from 58 children of the daycare center, 18 staff members and their children (18). These samples were examined by direct and concentrated fecal smears, using a modified formol-ether method. Examination for enteric parasites was done by direct microscopy of a wet mount, following staining with Lugol’s iodine. Air-dried smears of the deposit of all samples were stained by modified Ziehl-Neelsen (MZN) for Cryptosporidium identification. In samples that were positive by microscopy, (oo)cysts’ DNA was extracted by a Mini-BeadBeater/silica method. The species and genotypes of the isolates identified were determined by nested PCR of a fragment of the small subunit (SSU) rRNA gene. A questionnaire was administered to mothers and/or guardians and staff, containing the patient identification and factors predisposing to parasitic infections (type of water supply, sewage destination, owning pets, hands and personal hygiene). A total of 43 (45,8%) people were infected with at least one parasite. Seven (16,3%) were employees and 36 (83,7%) were children; 27 (62,8%) were female and 16 (37,2%) male. For the species of parasites, the data showed a higher prevalence of Cryptosporidium spp. (53,4%) followed by Giardia sp. (44,2%). Genetic characterization of isolates showed the presence of C. parvum and Giardia duodenalis. 6 The results and epidemiological data obtained in this study reinforce the importance of diagnosis and of implementation of appropriate intervention strategies for the control of these parasitoses in the population of children attending Community institutions and their employees in developing countries. KEY WORDS Enteroparasites, Nursery, Giardia, Genetics, protozoan, protozoa 7 AGRADECIMENTOS Agradeço, À Deus, pela saúde e pela força para a realização do presente estudo. Grande e eterno orientador de todos os meus projectos. À minha esposa, pelo amor, confiança e incentivo; sem ela nenhum sonho seria possível ou valeria a pena. À minha família, em especial aos meus pais, a quem devo minha formação moral, pelo incentivo e dedicação; pela certeza de que sempre estarão ao meu lado por mais difíceis que sejam os meus dias. À professora doutora Olga Matos, que orientou o presente trabalho, agradeço pelo apoio, orientações e oportunidade que me concedeu. Ao Dr. Francisco Esteves, Drª Vera Códices e Drª Luiza Lobo, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, pelos momentos de descontração, pela amizade, pelo cozido à portuguesa e por terem me ajudado a concluir este trabalho, em especial à Drª Luiza Lobo. À Ana Rosa e família, pelo apoio e atenção dado durante estes meses que passei em Portugal, em especial à Marta e Bruno pelas bons momentos que passamos. À Sandra Maria, directora da creche, que demonstrou seu apoio e confiança a este projecto, dandonos prontamente todos os dados requeridos e organizando nossas entrevistas com os pais e responsáveis pelas crianças. Àqueles que directo ou indirectamente contribuiram para a realização deste trabalho, e que me é impossível relatar individualmente. A cada um: o meu muito obrigado! 8 SUMÁRIO RESUMO 3 ABSTRACT 5 AGRADECIMENTOS 7 SUMÁRIO 8 LISTA DE FIGURAS 10 LISTA DE GRÁFICOS 11 LISTA DE QUADROS 12 1. INTRODUÇÃO 14 2. JUSTIFICAÇÃO 18 3. OBJETIVO 20 3.1. OBJETIVO GERAL. 20 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 20 4. REVISÃO DA LITERATURA 21 4.1. AS ENTEROPARASITOSES: uma breve revisão. 21 4.2. Giardia: uma breve revisão. 23 4.2.1. Histórico. 23 4.2.2. Morfologia. 26 4.2.3. Ciclo de vida, Transmissão e Sintomatologia. 27 4.2.4. Taxonomia. 29 4.2.5. Epidemiologia. 32 4.2.6. Diagnostico e Tratamento. 36 4.3. Cryptosporidium spp.: uma breve revisão. 37 4.3.1. Histórico. 37 4.3.2. Morfologia. 39 4.3.3. Ciclo de vida, Transmissão e Sintomatologia. 39 4.3.4. Taxonomia. 44 4.3.5. Epidemiologia. 45 4.3.6. Diagnostico e Tratamento. 47 5. METODOLOGIA 50 9 5.1. CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL E DA POPULAÇÃO EM ESTUDO. 50 5.2. AMOSTRAS DE FEZES COLHIDAS E ANALISADAS. 52 5.3. COLHEITA DE DADOS. 52 5.4. CONTROLO DE QUALIDADE. 52 5.5. ANÁLISE EM LABORATÓRIO. 53 5.5.1. CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS FECAIS PELO MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO DIFÁSICA DE RITCHIE MODIFICADO (adaptado de Casemore et al., 1985). 53 5.5.2. COLORAÇÃO COM SOLUÇÃO DE LUGOL – IDENTIFICAÇÃO DE QUISTOS DE Giardia sp. E DE OUTROS PROTOZOÁRIOS E OVOS DE HELMINTAS EM AMOSTRAS DE FEZES A FRESCO. 54 5.5.3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR. 54 5.5.3.1. EXTRAÇÃO DO DNA. 54 5.5.4. REACÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR). 56 5.5.4.1. Amplificação por nested-PCR do gene β-giardina. 56 5.5.4.2. Amplificação por nested-PCR do gene SSU rRNA. 59 5.5.4.3. Purificação e sequenciação dos fragmentos amplificados por PCR. 60 5.5.4.4. Análise Bioinformática. 62 5.6. COLHEITA DOS DADOS ANTROPOMÉTRICOS. 62 5.7. ANÁLISE DOS DADOS. 63 5.8. ENTREGA DOS RESULTADOS. 64 5.9. ASPECTOS ÉTICOS. 64 5.10. ANÁLISE CRÍTICA DE RISCOS OU DESCONFORTO PARA POPULAÇÃO EM ESTUDO. 65 5.11. ANÁLISE CRÍTICA DE BENEFÍCIOS PARA A POPULAÇÃO EM ESTUDO. 65 6. RESULTADOS 66 7. DISCUSSÃO 77 8. CONCLUSÃO 92 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 95 10. ANEXOS 106 10.1. Questionário aplicado aos participantes deste estudo 106 10.2. Ficha do doente 107 10.3. Instruções para colheita de fezes 108 APÊNDICE A: FIGURAS 109 16 Entre os microrganismos emergentes, destacam-se os protozoários entéricos oportunistas, em especial os coccídios (Filo: Apicomplexa) e os microsporídios (Filo: Microsporidia), relatados como responsáveis por inúmeros casos patológicos, apresentando infecções refratárias ou incuráveis, com significativas causas de morte. Os coccídios intestinais de maior importância que infectam o trato intestinal humano são: Isospora belli, Cryptosporidium spp. e o Cyclospora cayetanensis. (Ortega et al., 1993) O Cryptosporidium spp. era considerado um patógeno oportunista que acometia apenas pessoas imunodeprimidas, mas o número de casos em indivíduos imunocompetentes vêm se tornando cada vez mais freqüente. Trata-se, na atualidade, de um patógeno intestinal distribuído em todo o mundo. Esta ocorrência é dependente de fatores que incluem o clima, a idade e outros aspectos demográficos de uma população (Palmer, 1990). Estudos demonstram que a criptosporidiose é endêmica na maioria das regiões tropicais e que Cryptosporidium ssp. é um dos três principais agentes de diarreia infecciosa que constitui importante causa de morbimortalidade em crianças de 0 a 5 anos de idade no Brasil (Oshiro et al., 2000, Gatei et al., 2003). Desta forma, assim como outros protozoários intestinais, Cryptosporidium spp., é cosmopolita, constituindo grande problema de saúde pública durante a infância, se forem considerados os danos que pode ocasionar ao desenvolvimento físico da criança. A exposição da criança ao agente ocorreria durante ou logo após o desmame, sendo as crianças menores de 3 anos de idade as mais suscetíveis a infecção (Griffiths, 1997; Agnew, et al., 1998, Guerrant et al., 1999; Newman et al., 1999; Lima et al., 2000). As creches, por se tratarem de ambientes fechados, nos quais as crianças ficam a maior parte do dia, passam a ser um fator a mais de exposição às enteroparasitoses. O fato de freqüentar creches é mais uma característica de nível sócioeconomico desfavorável. A maior urbanização e a maior participação feminina no mercado de trabalho fizeram com que estes ambientes passassem a ser, depois do ambiente doméstico, o primeiro espaço externo que a criança freqüenta. 17 Este trabalho teve como objetivo principal verificar a prevalência de parasitoses intestinais, em espécial Giardia sp. e Cryptosporidium spp., em crianças matriculadas na creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem, bem como dos funcionários e seus filhos, localizada na comunidade “Entra A Pulso” no bairro de Boa Viagem da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil. 18 2. JUSTIFICAÇÃO As enteroparasitoses são um grave problema de saúde pública, principalmente entre préescolares e escolares, nos quais pode determinar emagrecimento, diarreia, dificuldade na aprendizagem e no crescimento, estando a sua transmissão associada à carência de hábitos higiénicos, saneamento básico e intenso contacto pessoa–a-pessoa favorecido por ambientes fechados (Uchôa et al., 2004). As creches são instituições onde as crianças permanecem, na maioria das vezes, o dia todo e que além de necessárias socialmente, são relevantes do ponto de vista epidemiológico. A OMS considera as creches como Instituição adequada para a promoção do crescimento e desenvolvimento da criança. Nos países em desenvolvimento, as creches são instituições que protegem as crianças empobrecidas das injúrias propiciadas pelo meio. As creches têm sido utilizadas em muitos países para promover a saúde das crianças que vivem em situação de pobreza (Silva et al., 2000), no entanto, vários pesquisadores têm voltado a atenção para as creches no que diz respeito às condições favoráveis para a transmissão de enteroparasitoses intestinais (Barçante et al., 2008; Zaiden et al., 2008; Biscegli et al., 2009). Entre as enteroparasitoses, os surtos diarreicos são frequentes, como é o caso de Giardia duodenalis que pode ocasionar um quadro de diarreia aguda e auto-limitante ou um quadro de diarreia persistente, como evidências de má absorção e perda de peso. O protozoário Cryptosporidium spp. também causa lesão da mucosa do intestino delgado e alteração da absorção de nutrientes por diversos mecanismos (Neves, 2005). Ainda hoje, a diarreia é um problema de saúde pública devido à sua alta incidência com repercussões negativas sobre o crescimento pondero-estatural das crianças acarretando número levado de hospitalizações e implicando em taxas importantes de morbidade e mortalidade, principalmente em crianças pertencentes à famílias de baixa renda. Na literatura há inúmeros relatos de parasitismo intestinal por Giardia e 19 Cryptosporidium spp. em crianças que frequentam creches (Machado et al., 1999; Barçante et al., 2008; Zaiden et al., 2008; Biscegli et al., 2009) destacando assim a importância de se estudar este tipo de instituição, bem como o desenvolvimento de atividades que reduzam a incidência destes agentes. Assim, justifica-se o interesse pela pesquisa em questão. 20 3. OBJETIVO 3.1. OBJETIVO GERAL. Verificar a prevalência de parasitoses intestinais, em especial Giardia sp. e Cryptosporidium spp., em crianças matriculadas na creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem, funcionários e seus filhos, localizada na comunidade “Entra A Pulso” no bairro de Boa Viagem da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. • Identificar os protozoários e helmintas mais prevalentes; • Verificar o índice de monoparasitismo e poliparasitismo; • Identificar a prevalência dos enteroparasitas segundo a faixa etária; • Identificar a prevalência dos enteroparasitas entre os sexos; • Determinar, por nested-PCR, a presença de DNA de Giardia sp. e Cryptosporidium spp. em amostras de fezes dos participantes da pesquisa; • Relacionar Giardia sp. e Cryptosporidium spp. com a sintomatologia do paciente; • Relacionar as condições de saneamento básico, esgotamento sanitário, hábitos alimentares, hábitos higiénicos e presença de animais de estimação com a prevalência de parasitismo; • Relacionar as possíveis associações entre a ocorrência de enteroparasitas e o estado nutricional dos participantes da pesquisa; 21 4. REVISÃO DA LITERATURA 4.1. AS ENTEROPARASITOSES: uma breve revisão. As enteroparasitoses ou parasitoses intestinais são doenças advindas da associação entre seres vivos, em que existe unilateralidade de benefícios, sendo um dos associados prejudicados pela associação (Neves, 2005). Constituem um grave problema de saúde pública, tornando-se uns dos principais fatores debilitantes da população e, como consequência, temos o comprometimento do desenvolvimento físico e intelectual das crianças, principalmente na menor faixa etária (Chaves, 2006). Elas são relatadas mundialmente (pandémico) embora a incidência dos agentes etiológicos varie entre os continentes, devido às diferenças culturais, sociais, climáticas e ambientais. Para o desenvolvimento das parasitoses, segundo Neves (2005), há necessidade de alguns fatores, tanto relacionados aos parasitas como aos hospedeiros. Nos inerentes aos parasitas citam-se o número de exemplares, o tamanho, a localização no hospedeiro e a virulência, isto é, a severidade e rapidez com que um agente etiológico age sobre o hospedeiro. Em relação ao hospedeiro, consideram-se a idade (alertando que as crianças são mais susceptíveis à doença parasitária), a imunidade, a nutrição, os hábitos e costumes e o uso geral de medicamentos. Da combinação desses fatores poderemos ter “doentes” e “portador assintomático”. Ao apresentar a relação entre parasitas, homem e sociedade, o autor faz referência de que, no meio tropical, as doenças parasitárias são graves e constantes e são consequência do subdesenvolvimento, sendo chamadas, pejorativamente, de doenças tropicais. No entanto, questiona essa afirmação de que sejam doenças tropicais, considerando que no Brasil, país tropical, essas doenças ocorrem nas camadas sociais pobres, sem condições adequadas de trabalho, de educação, de moradia e sanitárias, sendo esporádicas ou acidentais nas classes sociais elevadas. Por outro 22 lado, considera que em países desenvolvidos, de clima frio, como a Inglaterra, essas doenças foram sério problema de Saúde Pública, há cerca de 100 anos atrás, tendo sido controladas não por mudança de clima, mas por terem desenvolvido a educação, incentivando a participação popular e implementando medidas sanitárias eficientes. As enteroparasitoses são provocadas por endoparasitas (parasitas que vivem dentro do corpo do hospedeiro), que são representados por protozoários e helmintos e que habitam normalmente o intestino do hospedeiro, em diferentes níveis (Vitor, 2000). A transmissão das enteroparasitoses ocorre na maioria dos casos por via passiva oral, com a ingestão de água ou alimentos contaminados com as estruturas parasitárias libertadas por esses agentes, sendo a sua maior prevalência vinculada a áreas que se apresentam com condições higiénico-sanitárias precárias associadas à falta de tratamento adequado de água e esgoto. Estes fatores facilitam a disseminação de ovos, quistos e larvas, sendo a transmissão também facilitada pelo aumento do contato pessoa-pessoa propiciado pelos ambientes fechados como asilos e creches, pois o grande número de indivíduos presentes nesses ambientes não permite, muitas vezes, obedecer às normas de higiene e assim, contribuem para o alto grau de enteroparasitismo (Cardoso et al., 1995). Outro fato observado é que o ambiente coletivo proporciona uma maior probabilidade de adquirirem infecção, tendo em vista a possibilidade de um grande número de crianças estarem parasitadas, o que provavelmente condiciona a um alto risco de contaminação a toda população exposta a esse convívio (Nunes et al., 1997). Nas protozooses intestinais, o problema da carga infectante é minorado pela capacidade de replicação parasitária no organismo do hospedeiro. Nesses, os quistos libertados juntamente com as fezes já são infectantes, o que facilita a transmissão pessoa-a-pessoa ou até mesmo a auto-infecção. G. duodenalis é geralmente o protozoário mais prevalente entre as crianças com ou sem a associação com outros agentes, incidindo mais em crianças com idades entre 2 e 4 anos, devido aos precários hábitos de higiene próprios da idade, como colocar a mão suja na boca ou não lavar as mãos antes das refeições ou após evacuarem. (Saturnino et al., 2003) 23 Os helmintas são, geralmente, encontrados em menor número, uma vez que o ovo ou larva, que são liberados juntamente com as fezes do indivíduo, em algumas espécies necessita passar pelo solo para que haja seu desenvolvimento para se tornarem infectantes. Dentre os helmintas Ascaris lumbricoides é o mais prevalente, seguido por Trichuris trichiura estando em vários casos associados em parasitismo, uma vez que as condições exigidas para o desenvolvimento dos seus ovos são semelhantes. (Saturnino et al., 2003) 4.2. Giardia: uma breve revisão. 4.2.1. Histórico. Giardia é um protozoário flagelado que parasita o intestino de quase todas as classes de vertebrados, sendo responsável pela doença chamada giardíase, que afeta principalmente crianças de países em desenvolvimento (Thompson, 2004; Monis et al., 2009). Trata-se de um microrganismo anaeróbio, porém aerotolerante, de organização celular simples, com ausência de mitocôndrias e peroxissomas, mas com um sistema secretório vesicular primitivo (Thompson, 2004). Segundo Monis et al. (2009), a filogenia desse protozoário ainda é controversa e pode ser explicada por duas teorias diferentes. Uma sugere que a Giardia pertence a uma linhagem de eucariotas que divergiu antes da aquisição da mitocôndria (Thompson & Monis, 2004), e a outra propõem que esse protozoário pertence a uma linhagem de eucariotos que se adaptou a condições microaerofílicas (Morrison et al., 2007). Esse microrganismo foi observado pela primeira vez por Antony van Leeuwenhoek (1681), mas somente em 1859 foi descrito detalhadamente por Vilem Lambl. A seguir, foi relatado em coelhos por Davaine (1875) e em anfíbios por Kunstler (1882) (citados por Faubert, 2000; Thompson, 2004; Monis et al., 2009). 24 Mais de 50 espécies de Giardia já foram descritas principalmente com base na ocorrência em um determinado hospedeiro, no entanto, em 1952, Filice (citado por Thompson, 2004; Monis et al., 2009) propôs uma nova divisão, baseada em características morfológicas distinguíveis por meio de microscópio óptico, mais especificamente, a forma dos corpos medianos e o formato e cumprimento do trofozoíto. Assim, três espécies passaram a ser reconhecidas: G. duodenalis, G. agilis e G. muris. O conhecimento a respeito do género Giardia aumentou amplamente na década de 70. Nesse período foi publicado um estudo clínico, no qual os autores detectaram malabsorção e alteração de determinada parte do intestino em indivíduos dos quais esse patógeno havia sido isolado (Faubert, 2000). Devido a associação entre castores infectados e surtos de giardíase em humanos, provocados pela utilização de água onde localizavam-se tais animais, Giardia passou a ser considerada um parasita zoonótico. Além disso, foi adicionada à lista de patógenos parasitários (WHO, 1979 e 1981). Anos mais tarde, com o emprego do microscópio eletrónico, outras espécies de Giardia foram descritas: G. psittaci, G. microti e G. ardeae (Erlandsen e Bemrick, 1987; Feely, 1988; Erlandsen et al. 1990a). Estudos de transmissão cruzada foram realizados com o objetivo de entender melhor a especificidade de certos isolados de Giardia a um hospedeiro e a questão de giardíase como uma zoonose. No entanto, uma limitação desses trabalhos foi o uso de isolados de Giardia não caracterizados geneticamente (Thompson, 2004; Monis et al., 2009). A possibilidade de realizar cultura "in vitro" de isolados de Giardia foi um grande avanço para o estudo desse parasita, pois forneceu material suficiente para a caracterização genética pela técnica de análise de isoenzimas. No entanto, uma dificuldade encontrada na aplicação dessa técnica é o facto de nem todos os isolados crescerem em tais culturas, o que dificultou a obtenção de dados representativos (Thompson, 2004). 25 Apesar da limitação da técnica anteriormente relatada, sua aplicação, em conjunto com procedimentos de análise de DNA, revelou diferenças genéticas entre os isolados da espécie G. duodenalis, que embora apresentassem semelhança morfológica, passaram a ser enquadrados em grupos, nomeados 1, 2 e 3 na América do Norte, "Polaco" e "Belga" na Europa, e ainda Assemblages (agrupamentos) A e B na Austrália (Nash et al., 1985; Homan et al., 1992; Mayrhofer et al., 1995). Anos mais tarde a heterogeneidade genética em G. duodenalis foi confirmada, e, além disso, foi observado que os isolados pertencentes aos grupos "Polaco", 1, 2 e Assemblage A eram correspondentes, assim como os grupos "Belga", 3 e Assemblage B (Monis et al., 1996). Outros autores relataram a existência de isolados de G. duodenalis que apresentavam diferenças genéticas em relação aos grupos previamente detectados e que pareciam ser específicos a determinados hospedeiros, sendo esses: Assemblage C e D, em cães; E em bovinos, ovinos e suínos; F, em gato e G, em rato doméstico (Hopkins et al., 1997; Ey et al., 1997; Monis et al., 1998; Monis et al., 1999). Dentre os nomes citados acima, utilizados para elucidar a heterogeneidade existente em G. duodenalis, o termo Assemblage (agrupamento) parece ter maior aceitação entre os investigadores, e por essa razão foi adotado nesse trabalho. Embora a microscopia e os métodos baseados em imunologia sejam reconhecidos na detecção de Giardia em amostras clínicas e ambientais, a recente aplicação das técnicas moleculares, que são altamente sensíveis e específicas, tem possibilitado a caracterização genética dos isolados de Giardia, auxiliando na taxonomia e na epidemiologia desse protozoário (Monis e Andrews, 1998; Thompson, 2004). Outro aspecto relevante sobre esse parasita deu-se em 2004, com a sua inclusão na "Iniciativa de Doenças Negligenciadas" da Organização Mundial da Saúde, que busca estratégias de controlo para doenças que ocorrem principalmente em países em desenvolvimento (Savioli et al., 2006). 32 Quadro 3: Nova classificação de Giardia proposta por Monis et al. (2009) Esses autores esperam que a sua proposta seja discutiva por outros grupos, originando um consenso e uma nova nomenclatura para os agrupamentos de G. duodenalis. 4.2.5. Epidemiologia. A espécie G. duodenalis apresenta distribuição global. Estima-se que cerca de 280 milhões de infecções anuais sejam causadas no homem por esse protozoário (Lane & Lloid, 2002). Trata-se do parasita intestinal humano mais comum em países desenvolvidos, sendo a incidência da giardíase, nos Estados Unidos, estimada em 2,5 milhões de casos por ano (Furness et al., 2000). Na África, Ásia e América Latina cerca de 200 milhões de pessoas apresentam giardíase sintomática e há 500 mil casos novos notificados a cada ano (Who, 1996). É também um parasito frequentemente encontrado em animais domésticos como gado, cães e gatos; em várias espécies de mamíferos selvagens e em aves (Thompson, 2004). No Brasil, como pode ser visualizado na figura (2), a giardíase apresenta grande variabilidade na prevalência entre as parasitoses gastrintestinais. Espécie Hospedeiro G. duodenalis (=agrupamento A) Homem e outros primatas, cães, gatos, bovinos, roedores, outros mamíferos silvestres G. enterica (=agrupamento B) Homem e outros primatas, cães, e algumas espécies de mamíferos silvestres G. agilis Anfíbios G. muris Roedores G. psittaci Aves G. ardeae Aves G. microti Roedores G. canis (=agrupamento C e D) Cães, outros canídeos G. cati (=agrupamento F) Gatos G. bovis (=agrupamento E) Bovinos, ovinos, suínos G. simondi (=agrupamento G) Ratos Fonte: MONIS et al, 2009 (adaptado) 33 Figura 2: Prevalência de giardíase no Brasil, entre parasitoses gastrintestinais (Adaptado de Cimerman; Cimerman, 2003). A prevalência de indivíduos com exame de fezes positivo para esse parasita é de 2 a 5% em países desenvolvidos e de 20 a 30% em países em desenvolvimento (Almeida et al., 2006). Pesquisas recentes investigaram a presença desse protozoário em crianças de creches de diferentes cidades e estados do Brasil. Uchôa et al. (2001) realizaram um estudo coproparasitológio em 218 crianças que frequentavam creches comunitárias de Niterói (RJ) e em 43 funcionários. Nas crianças, o protozoário mais prevalente foi G. duodenalis com 38,3%. Guimarães e Sogayar (2002) realizaram um estudo para detectar anticorpos séricos anti-G. duodenalis em crianças de creches e estimar a frequência de infecção deste parasita em áreas endémicas e de um total de 147 crianças, 93 (63,3%) apresentaram quistos de Giardia nas fezes. Carvalho et al. (2006) realizaram estudos de ocorrência de enteroparasitoses em quatro creches no município de Botucatu (SP) e dentre os parasitas G. duodenalis (26,8%) foi o que obteve maior frequência. Chaves et al. (2006) fizeram um levantamento de protozoonoses e verminoses em sete creches municipais de Uruguaiana (RS) e encontraram uma prevalência de 74,1% de giardíase. Mascarini e Donalísio (2006) realizaram dois estudos transversais com crianças em creches municipais de Botucatu (SP) e detectaram prevalência 34 de giardíase de 23,7% em 2002 e 21,4% em 2003. Thales et al. (2008) comprovaram num estudo de prevalência de enteroparasitos em 176 crianças (1 a 5 anos), matriculadas em três creches públicas do município de Vespasiano (MG), uma prevalência de giardíase de 40%. Andrade et al. (2008) ao tentarem conhecer a prevalência de Cryptosporidium spp. em crianças de 0 a 6 anos de idade, de um Centro de Educação Infantil Público de Blumenau (SC), entre Março e Maio de 2006, por meio de exames parasitológicos, verificaram uma maior prevalência de G. duodenalis com 18,9% e apenas 7,6% de Cryptosporidium spp. Barçante et al. (2008) estudaram a ocorrência de enteroparasitas em 176 crianças (1 a 5 anos), matriculadas em três creches públicas do município de Vespasiano (MG), e obtiveram um coeficiente de positividade de 22,7%. Das 40 crianças parasitadas, 7 (17,5%) estavam infectadas com mais de uma espécie de parasito. Quanto à distribuição total dos enteroparasitas na população parasitada, destacou-se a prevalência de: Entamoeba coli (57,5 %), G. duodenalis (40%), Entamoeba histolytica/dispar (15 %), Trichuris trichiura (7,5 %), Ascaris lumbricoides (7,5 %), Enterobius vermicularis (2,5 %), Taenia sp. (2,5 %) e Hymenolepis sp. (2,5 %). Zaiden et al. (2008) Estudou 276 crianças de creches de Rio Verde (GO), obtendo uma prevalência de 39,9%. O poliparasitismo ocorreu em 12 (4,4%) e o monoparasitismo em 98 (35,5%) das crianças. Os parasitas mais prevalentes foram G. duodenalis e E. coli 21,4% e 12,0% respectivamente. Os resultados da associação de G. duodenalis/E. coli foram mais prevalentes na C2 (5,5%) e C3 (4,6%). Por sua vez, Tashima et al. (2009) ao analisarem amostras de fezes de crianças que frequentavam determinada creche em Presidente Bernardes (SP), detectaram uma prevalência de giardíase de 16%. A análise das fezes dos familiares de tais crianças e dos funcionários da creche também foi realizada. Algumas mães e irmãos estavam parasitados por G. duodenalis. No entanto, como a técnica de Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso (RAPD) foi empregada, foi possível concluir que as crianças provavelmente adquiriram essa parasitose durante o período de estada na creche, pelo contato pessoal entre elas, já que a maioria dos isolados dessas crianças foi enquadrado em um dentre os três grupos genéticos encontrados, e os isolados dos familiares nos outros dois grupos. 35 Giardia tem sido considerada um patógeno re-emergente devido ao seu crescente papel em surtos de diarreia em crianças que frequentam creches e pelas altas taxas de giardíase em animais como bezerros, cães e gatos. (Thompson, 2000) Para Costa-Macedo e Rey (1996) a giardíase é também conhecida como a diarreia dos viajantes que entram em contacto com o agente etiológico quando em regiões endémicas. Também podem ser fontes de infecção, as babás e os manipuladores de alimentos crus como as mães, que preparam alimentos para os filhos sem levar em consideração regras básicas de higiene pessoal, atuando como fontes de infecção a partir do período de desmame e introdução de nova dieta. Um estudo de caso direcionado à giardíase relata a importância da água como veículo do parasita (Nunez et al., 2003). Nessa mesma linha de raciocínios, diversos autores alertam que a ingestão de água é de importância substancial para os seres vivos embora possa desencadear doenças gastrintestinais em níveis alarmantes por veicular, entre outros, quistos de G. duodenalis, chamando a atenção para a necessidade de tratamento da água potável e do esgoto para o que dele efluir não contamine a água dos rios e poços, tornando-os fonte de infecção (Semenas et al., 1999; Paulino et al., 2001; Heller et al., 2004; Tashima e Simões, 2004; Traviezo et al., 2004; Santos et al., 2004). Os diferentes ciclos de transmissão de Giardia sp. e Cryptosporidium spp. estão indicados na Figura (3), onde podem ser observadas muitas incertezas principalmente na interação entre os ciclos – parte zoonótica na transmissão desses protozoários ao homem. Figura 3 : Ciclos de transmissão de Thompson, 2005). (1) Os pontos de interrogação indicam incertezas na inter Em relação à transmissão hídrica de tratada ou de água contaminada com esgoto favorece a infecção por este parasit 2002b; Jakubowski & Graun , 2002) e que a maioria das epidemias de g tiveram relação com contaminação de lençóis freáticos ( irrigação de vegetais (que habitualmente são ingeridos crus) com água não tratada ou contaminada com quistos de Giardia também é um fator de contaminação do ambiente, incluindo a água, pode ser resultante da ação do homem, da agricultura e dos animais selvagens (H eitman 4.2.6. Diagnostico e Tratamento O método clássico para a detecção sensibilidade foi estimada entre 50 e 70% (B permite a detecção simultânea de outros parasitas. No entanto, uma limitação para seu uso é o fato Ciclos de transmissão de Giardia sp. e Cryptosporidium spp. (Adaptado de Hunter e Os pontos de interrogação indicam incertezas na inter ação. Em relação à transmissão hídrica de Giardia , está confirmado que o consumo de água não tratada ou de água contaminada com esgoto favorece a infecção por este parasit , 2002) e que a maioria das epidemias de g tiveram relação com contaminação de lençóis freáticos ( Jakubowski & Graun irrigação de vegetais (que habitualmente são ingeridos crus) com água não tratada ou contaminada também é um fator de risco (ThurstonEnriquez contaminação do ambiente, incluindo a água, pode ser resultante da ação do homem, da agricultura eitman et al., 2002). e Tratamento . O método clássico para a detecção de Giardia em amostras de fezes é a microscopia, cuja sensibilidade foi estimada entre 50 e 70% (B urke , 1975). Uma vantagem dessa técnica é que permite a detecção simultânea de outros parasitas. No entanto, uma limitação para seu uso é o fato 36 spp. (Adaptado de Hunter e ação. , está confirmado que o consumo de água não tratada ou de água contaminada com esgoto favorece a infecção por este parasit a (Hoque et al., , 2002) e que a maioria das epidemias de g iardíase em humanos Jakubowski & Graun , 2002). Além disto, a irrigação de vegetais (que habitualmente são ingeridos crus) com água não tratada ou contaminada Enriquez et al., 2002). A contaminação do ambiente, incluindo a água, pode ser resultante da ação do homem, da agricultura em amostras de fezes é a microscopia, cuja , 1975). Uma vantagem dessa técnica é que permite a detecção simultânea de outros parasitas. No entanto, uma limitação para seu uso é o fato 37 de sua sensibilidade depender das habilidades do microscopista (Johnston et al., 2003; Schuurman et al., 2007). Recentemente imunodiagnósticos (testes baseados na coloração com anticorpos fluorescentes e ensaios enzimáticos) mostraram ser uma possível alternativa para a microscopia, mas embora sensíveis, requerem muitos reagentes, procedimentos de lavagem e etapas de incubação (Mank et al., 1997; Schuurman et al., 2007). O emprego da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) na detecção de Giardia tem sido fundamental, pois sua associação a outras técnicas, como Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) e o sequeciamento, possibilita a caracterização molecular dos isolados de amostras clínicas e ambientais (Thompson, 2004). Além disso, as técnicas moleculares são altamente sensíveis, específicas e de fácil interpretação (Mahbubani et al., 1992; Mcglade et al., 2003). Alguns marcadores moleculares utilizados em estudos de caracterização molecular de Giardia são o SSU rRNA e genes que codificam a produção de glutamato desidrogenase (gdh), triose fosfato isomerase (tpi), beta giardina (β giardina) e fator de elongação 1α (ef1α) (Shith et al., 2006). Os derivados nitroimidazólicos (metronidazol, ornidazol, tinidazol e nimorazol) são os medicamentos mais recomendados para a cura da giardíase. Estes medicamentos podem apresentar efeitos colaterais e são contra-indicados durante a gravidez. Outros fármacos que podem ser empregados no tratamento da giardíase são o albendazol, furazolidona e a quinacrina (Rey, 2008). 4.3. Cryptosporidium spp.: uma breve revisão. 4.3.1. Histórico. O parasita Cryptosporidium é um protozoário intracelular obrigatório que se desenvolve preferencialmente nas microvilosidades de células epiteliais do trato gastrintestinal, respiratório e 38 urinário podendo atingir uma variedade de hospedeiros, inclusive o homem. Esse protozoário tem sido responsável por um crescente número de surtos de doença gastrintestinal em todo mundo. (Ferreira & Borges, 2002; Carey et al., 2004) O género Cryptosporidium foi descoberto pelo parasitologista Ernest Edward Tyzzer em 1907, ao descrever a primeira espécie do género C. muris, um protozoário frequentemente encontrado nas glândulas de seus camundongos de laboratório (Tzipori; Widmer, 2008). Em 1912, o mesmo pesquisador apresentou uma segunda espécie, Cryptosporidium parvum, também encontrada em um camundongo, mas com o desenvolvimento no intestino delgado e com ooquistos menores que C. muris (Xiao et al., 2004). A descrição de uma nova espécie, C. meleagridis, em perus no ano de 1955 e a identificação de criptosporidiose em bovinos, no ano de 1971, forneceram os primeiros relatos de mortalidade e morbidade associados a infecções por Cryptosporidium spp. (Fayer, 2004). Nesta ocasião sua função patogênica não estava bem elucidada, hoje e dia sabe-se que essa é a terceira espécie mais comum identificada no homem (Slavim, 1955; Xiao et al., 2004). Desde sua primeira descrição, o C. parvum foi considerado por várias décadas um patógeno raro e oportunista. Em 1971 ele despertou o interesse veterinário após ser identificado como agente associado a surtos de diarreia em bezerros. Desde então, inúmeros casos em diferentes animais estão sendo identificados e novas espécies e genótipos têm sido descobertos e descritos tanto no homem como em diversos animais (Current & Garcia, 1991; Fayer et al., 2000; Xiao et al., 2004) A criptosporidiose foi verificada em humanos apenas em 1976, quando se tornou comum em pacientes com Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (Aids), também ocorrendo com maior frequência em outros indivíduos imonocomprometidos, como por exemplo, pacientes transplantados e pacientes recebendo quimioterapia para câncer (Cimerman, 2004; Fayer et al., 2000; Hunter; Thompson, 2005). Acreditava-se que a criptosporidiose ocorresse somente em indivíduos com algum tipo de imunodepressão, contudo nos últimos anos estudos demonstram que a doença é relativamente 39 frequente em indivíduos imunocompetentes. Assim como ocorre com outras doenças diarreicas, as infecções causadas por Cryptosporidium podem ser auto-limitadas e com sintomas brandos. Esta característica desfavorece a busca por atendimento médico e consequentemente leva a ausência de diagnóstico, gerando subnotificação da doença e falta de informação quanto à ocorrência de surtos (Peng et al., 2003). 4.3.2. Morfologia. O Cryptosporidium se desenvolve, preferencialmente, nas microvilosidades de células epiteliais do trato gastrintestinal, mas pode se localizar em outras partes, como parênquima pulmonar, vesícula biliar, ductos pancreáticos, esófago e faringe. Ele parasita a parte externa do citoplasma da célula e dá a impressão de localizar-se fora dela; esta localização é designada, por vários autores, como intracelular extracitoplasmática. O parasita apresenta diferentes formas estruturais que podem ser encontradas nos tecidos (formas endógenas), nas fezes e no meio ambiente (ooquistos). Os ooquistos do Cryptosporidium são pequenos, esféricos ou ovóides (cerca de 5,0 x 4,5 µm para C. parvum, e 7,4 x 5,6 para C. muris), e contêm quatro esporozoítos livres no seu interior quando eliminados nas fezes (Neves, 2005). 4.3.3. Ciclo de vida, Transmissão e Sintomatologia. O ciclo de vida do Cryptosporidium spp. é mais complexo se comparado com a Giardia sp., pois possui estágios de reprodução assexuada e sexuada para se ter a formação do ooquisto, como pode ser visualizados na figura (4). 40 Figura 4: Ciclo biológico do Cryptosporidium spp. (CDC) O Cryptosporidium difere de outros coccídios por sua capacidade de desenvolver-se completamente em um único hospedeiro (Rose, 1990). O ciclo se inicia com a eliminação de ooquistos esporulados por um hospedeiro infectado, geralmente em fezes ou em secreções respiratórias. O hospedeiro susceptível então irá se infectar pela ingestão, e em menor escala pela inalação desses ooquistos presentes na água, alimentos ou em fômites. Assim, haverá excistação, liberação de quatro esporozoítos e a adesão desses esporozoítos na superfície das células epiteliais dos tratos gastrintestinal ou respiratório, onde serão englobados pelas microvilosidades, formando um vacúolo parasitóforo (localização intracelular extracitoplasmática). Haverá assim a diferenciação dos esporozoítos em trofozoítos, iniciando a multiplicação assexuada ou merogonia (Current, 1999; Sréter; Varga, 2000; Smith et al., 2007; Xiao; Fayer, 2008). Após os ciclos assexuados e sexuados de reprodução, são formados dois tipos de ooquistos: um de parede espessa (80%) que é liberado no ambiente junto com as fezes; e outro de parede mais fina (20%) que talvez seja o responsável por casos de auto-infecção (Bastos et al., 2003; Hunter; Thompson, 2005; Santos, 2007). 41 Pode-se citar cinco fatores importantes na disseminação do Cryptosporidium: (i) a resistência do ooquisto ao cloro e ácidos; (ii) seu pequeno tamanho; (iii) sua baixa dose de infecção; (iv) sua natureza esporulada infecciosa logo após eliminação e (v) seu potencial zoonótico (com exceção de C. hominis) (Dillingham et al., 2002). A criptosporidiose pode ser transmitida de um hospedeiro infectado, eliminando ooquistos nas fezes, para um hospedeiro suscetível por via fecal-oral, através do contato pessoa-a-pessoa ou animal-pessoa. Um dos principais modos de transmissão é a transmissão pessoa-a-pessoa (Roy et al., 2004), que ocorre com mais frequência entre crianças com menos de cinco anos de idade, muitas vezes provocando surtos em creches. Profissionais e doentes de hospitais também constituem grupos de risco para aquisição da infecção (Sodré & Franco, 2001). A transmissão interpessoal possivelmente inclui as atividades sexuais sendo esse o principal modo de transmissão entre os indivíduos com Aids (Fayer et al., 2000; Morgan et al., 2000; Sodré & Franco, 2001). Na década de 90, o parasita emergiu como um importante agente de surtos de veiculação hídrica, particularmente nos Estados Unidos e Reino Unido, desde então, muitos casos têm sido relatados tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento. Deste modo, estudos epidemiológicos sugerem que a contaminação dos recursos hídricos com ooquistos representa um importante fator para o desenvolvimento e transmissão da criptosporidiose (Fayer, 2004; Fayer et al., 2005; Dawson, 2005). Como surtos de criptosporidiose humana podem ter como origem água de bebida e destinada a lazer, animais domésticos e silvestres, sejam mamíferos ou aves, podem atuar como fontes de infecção deste parasito para o ser humano, por meio de contaminação de reservatórios de água (Dillinghama et al., 2002; Olson et al., 2004; Graczyk et al., 2007). Contudo, existem muitas dúvidas a respeito da epidemiologia da criptosporidiose, visto que os animais infectados são potenciais fontes de transmissão e disseminação no ambiente e que o agente possui baixa especificidade hospedeira tornando difícil estabelecer realmente os elos da cadeia de transmissão da doença. (Tzipori, 2002; Fayer, 2004) 48 a visualização dos oocistos, são utilizadas técnicas de coloração especiais, como: Ziehl-Neelsen, Kinyoun, coloração negativa, coloração a quente de safranina-azul de metileno, coloração modificada de Kohn, coloração modificada de Koster, auramina, entre outras (Martinez e Belda, 2001). Porém, os oocistos de Cryptosporidium estão entre os menores estágios exógenos dos apicomplexos e algumas diferenças morfológicas não são visíveis na microscopia óptica (Morgan et al., 1999). O factor limitante das técnicas convencionais é que nenhuma é específica para o C. parvum, sendo ainda que todos os métodos citados requerem uma grande quantidade de oocistos para sua detecção positiva (Sturbaum et al., 2001). Portanto, métodos moleculares mais sensíveis, como a PCR são requeridos para detecção de pequeno número de oocistos (<10.000) (da Silva et al., 1999). A biologia molecular pode fornecer aos epidemiologistas informações muito além das oferecidas pela microscopia tradicional, pela cultura e imunologia, auxiliando na vigilância de agentes infecciosos e na determinação das fontes de infecção (Morgan 2000). Várias técnicas moleculares são empregadas para estudos de Cryptosporidium, sendo elas: Hibridização de sondas de DNA, PCR (Polymerase Chain Reaction), PCR Multiplex, nested-PCR, Real Time PCR, PCR e Hibridização, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), PCR-SSCP (Single-Strand Conformatio Polymorphism), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Microsatélites e Heteroduplex. Cryptosporidium é um dos poucos protozoários entéricos contra o qual ainda não se descobriu uma terapia efetiva. A falta de um fármaco específico reflete a singularidade desse parasita que inclui a sua localização intracelular e suas afinidades filogenéticas (Thompson & Chalmers, 2002). Perto de uma centena de fármacos foram testados para o tratamento desta doença, entre elas: azitromicina, paramomicina, metronidazol, letrazuril, nitazoxanida; sem apresentar sucesso na erradicação (Cimerman; Cimerman, 2004). Estudos recentes têm demonstrado que a nitazoxanida possui eficácia comprovada no tratamento da criptosporidiose em crianças e adultos imunocompetentes. Estudos preliminares mostraram que o fármaco poderia também ser utilizado 49 para o tratamento de pacientes com Aids e criptosporidiose. A nitazoxanida é o primeiro fármaco a ser liberado para o tratamento da criptosporidiose nos EUA (Neves, 2005). 50 5. METODOLOGIA 5.1. CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL E DA POPULAÇÃO EM ESTUDO. O estudo foi realizado na creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na Comunidade “Entra A Pulso”, situada em um bairro nobre (Boa Viagem) da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil. Recife, capital do Estado de Pernambuco, situa-se no litoral nordestino e ocupa uma posição central, a 800Km das outras duas metrópoles regionais, Salvador e Fortaleza, disputando com elas o espaço estratégico de influência na Região. Encontra-se nas coordenadas geográficas: latitude 8º 04' 03'' S e longitude 34º 55' 00'' W. Possui 1.422.905 habitantes (2000), 219.493 km2 de área territorial, clima quente e húmido e uma temperatura média de 25,2ºC. Está dividida em 6 Regiões Político-Administrativas (RPA) com 94 bairros: RPA 1 (Centro: 11 bairros), RPA 2 (Norte: 18 bairros), RPA 3 (Noroeste: 29 bairros), RPA 4 (Oeste: 12 bairros), RPA 5 (Sudoeste: 16 bairros) e RPA 6 (Sul: 8 bairros). O municipio do Recife reconhece a existência de 66 Zonas Especiais de Interesse Social (ZEIS), disseminadas pelo espaço urbano. Devido à existência de perto de 490 favelas, representando 15% da área total do município e 25% da área ocupada, as ZEIS agregam cerca de 80% delas (http://www.recife.pe.gov.br). Boa Viagem está localizado na RPA 6, possui 738.1 hectares de área territorial e 100.388 habitantes, é considerado atualmente como o bairro mais populoso de Recife, seguido por COHAB (69.134 hab) e Várzea (64.512 hab). Este bairro possui 6 Zonas Especiais de Interesse Social e Áreas Pobres: Entra A Pulso, Borborema, Ilha do Destino, Rosa Selvagem, Sítio Wanderley, Vila Arraes e Sítio Cardoso (http://www.recife.pe.gov.br). 51 A Comunidade do “Entra A Pulso”, nome dado pela sua resistência fundiária, possui uma área de 8.3 hectares com aproximadamente 10.000 habitantes segundo dados estatísticos do senso do IBGE (2000) e com 1.912 casas cadastradas na URB (Empresa de Urbanização do Recife). Esta comunidade possui nas suas proximidades escolas da rede pública estadual, municipal com Ensino Fundamental e Médio, atendendo a população da comunidade e entorno. A população da comunidade sobrevive do trabalho informal, ambulantes na orla da praia, domésticas, lavadeiras, pedreiros, comerciantes entre outras profissões (http://www.recife.pe.gov.br). A creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem, está situada no centro da comunidade “Entra A Pulso”. Actualmente a creche atende 92 crianças compreendidas na faixa etária de 0 a 6 anos, de ambos os sexos, residentes da comunidade. Possui 19 funcionários, residentes da comunidade, que trabalham em tempo integral (manhã-tarde) de segunda-feira à sexta-feira. Em relação à distribuição e organização das crianças na creche foram criados grupos separados pela idade, sendo eles: Berçário (0-1 anos), G1 (2 anos), G2 (3 anos), G3 (4 anos), G4 (5 anos) e G5 (6 anos). Os funcionários que trabalham na cozinha ocasionalmente cuidam das crianças e são orientados pela directora da creche quanto aos cuidados a serem tomados quanto à higiene comunitária entre uma criança e outra. A água que serve a creche é encanada e há utilização de água filtrada para ingestão das crianças e dos funcionários. O destino das fezes se dá pela utilização de fossa. O lixo produzido pela creche é removido três vezes por semana. A lavagem da caixa de água é realizada anualmente e a mesma encontra-se devidamente tapada. A creche possui parque de recreação, que é coberto por areia que nunca foi trocada, que contém diversos brinquedos (escorregador, gira-gira, etc.), cozinha, refeitório, sala de brinquedos comunitária, casas de banho comunitárias e sala para atendimento médico, além de espaços reservados à administração. A creche não possui horta e as refeições são produzidas pela própria creche, com o mesmo cardápio fornecido pela nutricionista da Secretaria da Educação para as demais creches. 52 5.2. AMOSTRAS DE FEZES COLHIDAS E ANALISADAS. Foram colhidas e analisadas 94 amostras de fezes de adultos e crianças com idade de 0 (zero) a 15 (quinze) anos de idade, de ambos os sexos, provenientes da creche e comunidade em estudo. Foram colhidas amostras durante três dias alternados, em potes colectores de plástico, sem conservante. 5.3. COLHEITA DE DADOS. Para cada indivíduo foi aplicado um pequeno questionário (Anexo 8.7) no qual constou uma ficha de identificação com dados gerais como Registro Geral (RG), nome, sexo, data de nascimento e nome do responsável (se menor de 18 anos). A ficha continha, mais, algumas perguntas sobre sintomatologias recentes como febre, diarreia, dor abdominal e vómitos e sobre dados epidemiológicos (se possuía animais de estimação, infra-estrutura de saneamento básico da residência e hábitos alimentares e higiénicos). As colheitas de fezes e exames coproparasitológicos de amostras seriadas foram feitas em datas previamente marcadas. As amostras foram colhidas pelos próprios voluntários e/ou responsáveis em seus domicílios, que receberam recipientes assépticos após serem previamente instruídos sobre como fazer adequadamente a recolha da amostra de fezes (Anexo 8.9) de modo a evitar ao máximo, contaminação do material. 5.4. CONTROLO DE QUALIDADE. Neste estudo procurou-se padronizar a metodologia de colheita e processamento das amostras. Para isso, partiu-se inicialmente da orientação de colheita ao voluntário e/ou responsável, 53 até à conservação e processamento das amostras de fezes. Outro cuidado foi o fornecimento de recipientes assépticos, próprios para colheita de fezes e a realização do questionário investigativo. 5.5. ANÁLISE EM LABORATÓRIO. As amostras foram encaminhadas para o Laboratório de Parasitologia do Departamento de Medicina Tropical da Univesidade Federal de Pernambuco (UFPE) para realização de exames coproparasitológicos, onde foram utilizadas duas técnicas: a) Método Directo, utilizando para vizualização microscópica o corante Lugol, de acordo com a descrição de Huggins et al. (1985); b) Método de Ritchie Modificado, utilizando para visualização microscópica o corante Ziehl-Neelsen para pesquisa de Cryptosporidium. As amostras positivas e negativas foram encaminhadas para a U.E.I. de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, no Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT), para detecção e identificação de Cryptosporidium spp. e Giardia sp. através de técnicas de biologia molecular (nested-PCR/sequenciação de DNA). 5.5.1. CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS FECAIS PELO MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO DIFÁSICA DE RITCHIE MODIFICADO (adaptado de Casemore et al., 1985). Num tubo de centrífuga de 10mL, devidamente identificado, colocou-se 3,0mL de água destilada, 0,5mL (ou o equivalente) de fezes e 2,0mL de éter dietílico (solubiliza os lípidos). Agitou-se vigorosamente o tubo no vórtex e transferiu-se o seu conteúdo para um novo tubo de centrífuga, filtrando-o através de uma gaze dobrada sobre um funil, para eliminar os detritos fecais de maiores dimensões. Perfez-se o volume do tubo com água destilada e procedeu-se a uma primeira centrifugação, durante 5 minutos a uma velocidade de 1500 rpm. No passo seguinte, desprezou-se o anel de gordura à superfície, transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo de 54 centrífuga e conservou-se o sedimento obtido. Perfez-se o volume do último tubo, com água destilada e efectuou-se a segunda centrifugação, durante 10 minutos a uma velocidade de 4500 rpm. Desprezou-se o sobrenadante e conservou-se o segundo sedimento. Juntamente os sedimentos resultantes das duas centrifugações num eppendorf de 1,5 mL e armazenou-se a 4ºC. 5.5.2. COLORAÇÃO COM SOLUÇÃO DE LUGOL – IDENTIFICAÇÃO DE QUISTOS DE Giardia sp. E DE OUTROS PROTOZOÁRIOS E OVOS DE HELMINTAS EM AMOSTRAS DE FEZES A FRESCO. Os quistos e, ocasionalmente, os trofozoítos de Giardia sp. são detectados em amostras de fezes por microscopia óptica, que continua a ser o melhor método para o diagnóstico da giardiose (Cook et al., 2002). Colocou-se uma gota do sedimento total numa lâmina. De seguida, adicionou-se uma gota de solução de Lugol. Homogeneizou-se com o auxílio de uma lamela. Cobriu-se a preparação com a referida lamela e removeu-se o excesso com papel de filtro. Por fim, observou-se ao microscópio óptico composto. As lâminas foram observadas ao microscópio com uma objectiva de 40x sendo a presença de quistos e trofozoítos confirmada com a objectiva de imersão. 5.5.3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR. 5.5.3.1. EXTRAÇÃO DO DNA. Para a extração do DNA dos quistos de Giardia sp. e oocistos de Cryptosporidium spp. foi utilizado o método Mini-BeadBeater/Sílica (adaptado de Boom et al., 1990 e Patel et al., 1998). Este método baseia-se na presença de concentrações elevadas de agentes caotrópicos como Guanidina Tiocianato (GuSCN – provou ser um agente poderoso na purificação e detecção quer de DNA ou RNA, devido ao seu potencial na lise celular combinada com a inactivação das nucleases), 55 os ácidos nucleicos deverão se ligar à sílica (Boom et al., 1990 ). Este método baseia-se no seguinte protocolo: A) Lise dos quistos/oocistos 1. A 200µL de suspensão de oocistos concentrados adicionar 0,3g de partículas de zircónio com 0,5mm de diâmetro, 900µL de tampão de lise (tiocianato de guanidina 7M; TrisHCl 50mM pH 6,4; EDTA 25mM pH 8,0; Trinton X-100 1,5% v/v) e 60µL de álcool isoamílico; 2. Agitar à velocidade máxima, durante 2,5 minutos num aparelho Mini-BeadBeater; 3. Centrifugar à velocidade máxima (14.000 rpm), durante 15 segundos, para a sedimentação dos detritos fecais insolúveis e das partículas de zircónio; 4. Transferir o sobrenadante para um tubo “eppendorf” limpo. B) Adsorção do DNA 1. Adicionar ao sobrenadante, 25µL de uma suspensão aquosa de sílica em pó (1% pH 2,0; Sigma); 2. Agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente, sob agitação constante, durante 30 minutos; 3. Centrifugou à velocidade máxima, durante 15 segundos, para que a sílica com o DNA adsorvido sedimente; 4. Desprezou o sobrenadante, vertendo diretamente o “eppendorf”. C) Lavagem 1. Lavar duas vezes com 200µL de tampão de lavagem (tiocianato de guanidina 7M, TrisHCl 50mM pH 6,4); 2. Lavar uma vez com 200µL de etanol a 80%; 56 3. Lavar uma vez com 200µL de acetona absoluta; 4. Desprezar a acetona e incubar a 55˚C, até à evaporação completa do solvente. D) Eluição do DNA 1. Ressuspender a sílica em 50µL de água destilada estéril; 2. Incubar a 55˚C, durante 5 minutos, para facilitar a eluição do DNA; 3. Sedimentar a sílica por centrifugação, à velocidade máxima (14.000 rpm), durante 2 minutos; 4. Recolher o sobrenadante com DNA dissolvido para um tubo “eppendorf” limpo; 5. Guardar a amostra a -20˚C, que será usada posteriormente para a PCR. 5.5.4. REACÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR). 5.5.4.1. Amplificação por nested-PCR do gene β-giardina. A vantagem de utilizar genes que codificam a giardina como alvo de detecção molecular de quistos de Giardia, é que estes são considerados exclusivos deste parasita (Cacció et al., 2002). A utilização de um sistema de tipagem baseado na análise da sequência de um único locus, como a βgiardina, com elevada heterogeneidade sequencial, possibilita uma resolução tão alta como a tipagem de sequências multilocus (Lalle et al., 2005). A PCR é um método muito eficaz na amplificação de sequências específicas a partir de uma mistura complexa de DNA. Permite, por exemplo, a amplificação de apenas um locus do genoma completo de um organismo e em pouco tempo, a partir de apenas uma cadeia molde, é possível obter mais de um bilião de cópias. No entanto, a capacidade de amplificar mais de um bilião de cópias também aumenta a possibilidade de amplificação de uma sequência não pretendida de DNA, mais de um bilião de vezes. A especificidade da PCR é determinada pela especificidade dos primers 57 utilizados na reacção. Se os primers se ligarem a mais do que um locus, no produto de PCR, aparecerão amplicões de diferentes tamanhos. Para minimizar esta possibilidade e assegurar a especificidade, usam-se frequentemente dois pares de primers, em duas fases de amplificação – nested-PCR. A designação nested deriva do facto de se utilizarem dois pares de primers na amplificação de um único locus: o primeiro par é usado na primeira fase desta técnica, que decorre como qualquer PCR de uma só fase; o segundo par (nested primers) liga-se aos fragmentos amplificados na primeira parte, resultando desta, amplicões de menor tamanho. A mais valia desta técnica, é que se ocorrer um erro e for amplificada uma sequência não pretendida, a probabilidade de tal voltar a acontecer, na segunda fase de amplificação, com o segundo par de primers, é muito baixa. Os primers utilizados nas duas fases deste procedimento diferem no seu tamanho e sequência e encontram-se caracterizados no Quadro 5. Quadro 5 – Características dos primers usados nas duas etapas de nested-PCR. Designação do primer Sequência nucleotídica Dimensão do amplicão (pb) Referência GIAFW1 GIARV1 5´-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC-3´ 5´-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3´ 753 Cacciò et al., 2002 GIAFW2 GIARV2 5´- GAACGAACGAGATCGAGGTCCG-3´ 5´- CTCGACGAGCTTCGTGTT-3´ 511 Lalle et al., 2005 As reacções de PCR foram optimizadas em relação às descritas por Lalle et al. (2005), através de ajustes na concentração de cloreto de magnésio e na quantidade de DNA utilizada. A preparação das misturas reaccionais, decorre numa câmara de segurança biológica, com material antecipadamente esterelizado com radiação UV e mantendo sempre os tubos no gelo. O procedimento de amplificação β-giardina foi efectuado num volume de 50 µl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 µl de 10⋅ tampão de reacção (160 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 670 mM 64 5.8. ENTREGA DOS RESULTADOS. Os resultados dos exames laboratorial foram entregues à directora da creche e foi feita a marcação de consulta, na própria creche, com os doentes parasitados. Uma médica voluntária dispôs-se a atender os doentes no local e de avaliar a necessidade terapêutica dos mesmos. 5.9. ASPECTOS ÉTICOS. O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE. Sob a descrição da resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde sobre a participação de pessoas na pesquisa (CNS: Conselho Nacional de Saúde – Ministério da Saúde. Resolução nº 196, de 10 de outubro de 1996), disponível em http://www.datasus.gov.br/conselho/resol96/res19696.htm. As colheitas das amostras só se iniciaram após aprovação do referido comitê. Os principais pontos trabalhados em relação às consideração ética são: a) da liberdade de participar ou não da pesquisa, tendo assegurada essa liberdade sem quaisquer represálias atuais ou futuras, podendo retirar o consentimento em qualquer etapa do estudo sem nenhum tipo de penalização ou prejuízo; b) da segurança de que não será identificado (a) e que se manterá o caráter confidencial das informações relacionadas com a privacidade, a proteção da imagem e a não-estigmatização; c) da liberdade de acesso aos dados do estudo em qualquer etapa da pesquisa; d) da segurança de acesso aos resultados da pesquisa. 65 5.10. ANÁLISE CRÍTICA DE RISCOS OU DESCONFORTO PARA A POPULAÇÃO EM ESTUDO. Não houve riscos para a saúde dos participantes, havendo apenas recolha de fezes, e os pacientes positivos encaminhados para tratamento. Os participantes tiveram seus direitos preservados quanto à confidencialidade. 5.11. ANÁLISE CRÍTICA DE BENEFÍCIOS PARA A POPULAÇÃO EM ESTUDO. Este estudo permitiu analisar a prevalência de parasitoses intestinais e seus riscos de transmissão entre crianças matriculadas na creche, funcionários e seus filhos que não estavam matriculados na creche. As pessoas infectadas pelos parasitas identificados neste estudo foram encaminhadas para o(a) médico(a) que interpretou os resultados e avaliou a necessidade terapêutica dos mesmos. As medicações foram fornecidas, gratuitamente, pelo Posto de Saúde da Família (PSF) da região. 66 6. RESULTADOS Na creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem, dos 135 participantes inclusos 69,6% (94) dispuseram-se a colaborar com a pesquisa. Assim, participaram neste estudo funcionários (n=18), filhos de funcionários não-matriculados na creche (n=18), crianças do berçário (n=13), crianças da turma G1 (n=11), crianças da turma G2 (n=12), crianças da turma G3 (n=5), crianças da turma G4 (n=9) e crianças da turma G5 (n=8). Dos 94 participantes cujas fezes foram analisadas, 43 (45,8%) estavam infectados por pelo menos um parasita e 51 (54,2%) apresentaramse negativos. Entre os parasitados, 79% (n=34) encontravam-se monoparasitados e 21% (n=9) poliparasitados (Quadro 9). As associações mais observadas foram entre G. duodenalis / Cryptosporidium spp. 2 (25%), seguidas de Cryptosporidium spp. / A. lumbricoides, G. duodenalis / Cryptosporidium spp. / E. histolytica, G. duodenalis / Cryptosporidium spp. / E. coli, G. duodenalis / E. histolytica / T. trichiura, Cryptosporidium spp. / E. nana / A. lumbricoides, Cryptosporidium spp. / S. mansoni e E. histolytica / A. lumbricoides 1 (12,5%) cada. No total, foram estudadas 36 pessoas do sexo masculino, das quais 16 (37,2%) estavam parasitadas, e 58 do sexo feminino, estando 27 (62,8%) parasitadas (Gráfico I). Não houve diferença estatisticamente significativa quanto ao género e à presença ou ausência de parasitismo entre os grupos. Em relação à prevalência de protozooses e helmintoses, entre os 43 parasitados, 72% (n=31) encontravam-se parasitados com protozoários, 7% (n=3) por hemintas e 21% (n=9) por ambos. O protozoário mais prevalente foi Cryptosporidium spp. 23 (53,4%), seguido de Giardia sp. 19 (44,2%), E. histolytica 3 (6,9%), E. coli 2 (4,6%) e E. nana 1 (2,3%). O helminta mais prevalente foi A. lumbricoides 6 (13,9%), seguido de T. trichiura e Schistosoma mansoni 1 (2,3 %) cada (Quadro 10). 67 A faixa etária que apresentou maior prevalência de enteroparasitas foi a compreendida entre 3-6 anos (55,8%), seguida dos 7-14 (28%), 22-40 anos (23,2%), 1-2 anos (16,3%), < 1 ano (4,6%), 15-21 anos e ≥ 41 anos (2,3%) cada. A prevalência dos parasitas encontrados e a sua distribuição por faixa etária encontram-se apresentadas na Quadro 11. Quadro 9: Prevalência das enteroparasitoses entre os 94 participantes da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010, e ocorrência de mono e poliparasitismo (poli) nos 43 participantes parasitados. Gráfico I: Prevalência das enteroparasitoses em relação ao género dos 94 participantes da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010. Amostra N n % n % n % Funcionários (F) 18 7 38,8 5 71,4 2 28,6 Filhos Funcionários (FF) 18 7 38,8 3 42,9 4 57,1 Berçário 13 9 69,2 9 100 0 0 G1 (Grupo 1) 11 3 27,27 3 100 0 0 G2 (Grupo 2) 12 6 50 6 100 0 0 G3 (Grupo 3) 5 3 60 3 100 0 0 G4 (Grupo 4) 9 4 44,44 2 50 2 50 G5 (Grupo 5) 8 4 50 3 75 1 25 Total 94 43 45,7 34 79 9 21 Grupos Positividade Monoparasitismo Poliparasitismo 68 Quadro 10: Prevalência das enteroparasitoses evidenciadas nos 43 participantes infectados da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010. Quadro 11: Prevalência das enteroparasitoses evidenciadas nos 43 pacientes infectados, segundo faixa etária, da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010. n % n % n % n % n % n % n % n % Funcionários 7 7 100 1 14,3 1 14,3 - - 1 14,3 1 14,3 - - - - Filhos de Funcionários 8 3 37,5 3 37,5 2 25 1 12,5 - - 2 25 1 12,5 1 12,5 Berçário 7 4 57,1 4 57,1 - - - - - - 1 14,3 - - - - Turma G1 3 - - 3 100 - - - - - - - - - - - - Turma G2 8 3 37,5 2 25 - - - - - - 1 12,5 - - - - Turma G3 3 1 33,3 2 66,6 - - - - - - - - - - - - Turma G4 4 3 75 2 50 - - - - - - 1 25 - - - - Turma G5 3 2 66,6 2 66,6 - - 1 33,33 - - - - - - - - Total 43 23 53,4 19 44,2 3 6,9 2 4,6 1 2,3 6 13,9 1 2,3 1 2,3 Helmintas Protozoários A. lumbricoides T. trichiura S. mansoniG. duodenalis E. histolytica E. coli E.nanaCryptosporidium spp. Grupos n n % n % n % n % n % n % n % G. duodenalis (n=19) 1 5,3 3 15,8 12 63,1 3 15,8 - - 1 5,3 - - E. histolytica (n=3) - - - - - - 2 66,6 - - 1 33,3 - - E. coli (n=2) - - - - 1 50 1 100 - - - - - - E. nana (n=1) - - - - - - - - - - 1 100 - - Cryptosporidium spp. (n=23) 1 4,3 3 13 9 39,1 3 13 - - 6 26 1 4,3 A. Lumbricoides (n=6) - - 1 16,6 2 33,3 1 16,6 1 16,6 1 16,6 - - T. trichiura (n=1) - - - - - - 1 100 - - - - - - S. mansoni (n=1) - - - - - - 1 100 - - - - - - Total 2 4,6 7 16,3 24 55,8 12 28 1 2,3 10 23,2 1 2,3 Parasitas mais prevalentes Idade (em anos) < de 1 1 a 2 3 a 6 7 a 14 15 a 21 22 a 40 ≥ de 41 69 O questionário epidemiológico foi respondido pelos 94 (100%) participantes desta pesquisa. A análise dos questionários respondidos pelos funcionários e responsáveis pelas crianças, revelou os seguintes resultados, relativos aos principais atributos epidemiológicos relacionados as condições de higiene e saneamento: 83% afirmaram possuir água ligada à rede pública, 12,8% afirmaram utilizar água de poço e 4,2% assinalaram utilizar ambos os sistemas de utilização hídrica; 58,5% afirmaram destinar o esgoto a céu-aberto, 32% afirmaram utilizar fossa dentro de suas propriedades e 9,5% assinalaram utilizar ambos os sistemas de esgotamento sanitário; 94,7% afirmaram não possuir animais domésticos em sua residência; 24,5% afirmaram lavar as mãos antes das refeições e após uso da casa de banho (higiene completa das mãos), 34% afirmaram não efectuar com frequência a higiene das mãos antes das refeições e após uso da casa de banho (higiene incompleta das mãos) e 41,5% afirmaram não ter tais costumes de higiene; 57,4% afirmaram utilizar apenas chuveiro para banhar-se, 24,4% costumam utilizar apenas balde para banhar-se e 18% afirmaram banhar-se de ambas as formas. Os dados obtidos pelo questionário epidemiológico estão apresentados no Quadro 12. Quanto à presença de sintomas entre os 43 parasitados, 69,8% (n=30) apresentavam-se com quadro assintomático e 30,2% (n=13) sintomáticos. Dentre os monoparasitados sintomáticos, o sintoma relatado com maior prevalência foi vómito (71,4%), seguido de diarreia (57,1%), dor abdominal e febre (28,6%) cada. Nos poliparasitados, o sintoma relatado com maior prevalência foi diarreia e dor abdominal (50%) cada, seguido de vómito (33,3%) e cefaleia (16,6%). Quando foi analisada a presença de sintomas nos doentes monoparasitados com Cryptosporidium spp. e G. duodenalis, prevaleceram os casos assintomáticos (81,2% e 78,6% respectivamente). Quanto à presença de sintomas nos doentes poliparasitados, com os parasitas supracitados, prevaleceram os casos sintomáticos (66,6% e 50% respectivamente). Nos casos de monoparasitismo por Cryptosporidum spp. o sintoma mais prevalente foi vómito (100%), porém nos casos de poliparasitismo envolvendo este parasita o sintoma mais prevalente foram vómito, diarreia e febre (33,3%). Nos casos de monoparasitismo por G. duodenalis o sintoma mais prevalente foi diarreia 70 (100%). A prevalência dos sintomas encontrados e a sua distribuição por parasitas encontram-se apresentados na Gráfico II. Tendo em consideração os 94 entrevistados, 47 (50%) já haviam sido medicados e/ou medicavam seus filhos com fármacos antiparasitários, entre os quais 23 (48,9%) faziam-no por indicação médica após análise coprológica e 24 (51%) sem indicação médica e análise coprológica. Dentre os fármacos utilizados sem solicitação médica, o relatado com maior prevalência foi Mebendazol 22 (91,7%), seguido de Albendazol 2 (8,3%). Entretanto, quanto aos fármacos utilizados com solicitação médica, o relatado com maior prevalência foi Mebendazol 12 (52,1%), seguido de Albendazol 9 (39,1%), Mansil e Ivermectina 1 (4,4%) cada. Quando analisámos os dados da associação entre a utilização de fármacos e a prevalência de enteroparasitoses, dos 11 doentes que medicaram-se com Albendazol, 4 (36,3%) encontravam-se parasitados por Cryptosporidium spp. e 1 (9%) por G. duodenalis e E. histolytica cada. Tendo em conta os 34 participantes que utilizaram Mebendazol, 10 (29,4%) encontravam-se parasitados por Cryptosporidium spp., 6 (17,6%) por G. duodenalis, 2 (5,8%) por E. coli e 1 (2,9%) por E. histolytica, A. lumbricoides, T. trichiura e S. mansoni, cada (Gráfico III). O estado nutricional mais prevalente nos 43 participantes parasitados foi “peso normal” 17 (39%), seguido de “obeso” 14 (33%), “excesso de peso” 11 (26%) e “abaixo do peso” 1 (2%). Entre os 51 pacientes não parasitados, o estado nutricional mais prevalente foi “peso normal” 29 (57%), seguido de “excesso de peso” 12 (23%), “obeso” 7 (14%) e “abaixo do peso” 3 (6%) (Gráfico IV). A distribuição dos parasitas encontrados, de acordo com o estado nutricional, e os distúrbios nutricionais, de acordo com a faixa etária e o género, encontram-se sumarizados nos Quadros 13 e 14, respectivamente. Os hábitos alimentares dos entrevistados encontram-se apresentados no Gráfico V. 71 Gráfico II: Presença de sintomas mais relatados pelos 43 participantes infectados da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010, e suas associações com os parasitas encontrados. Gráfico III: Associação entre o uso de fármacos antiparasitários com a solicitação médica de exame coprológico e prevalência de enteroparasitoses entre os 94 participantes da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010. 72 Gráfico IV: Distribuição dos distúrbios nutricionais encontrados nos 94 participantes da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010. Gráfico V: Hábitos alimentares dos 94 participantes da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010. Quadro 13: Distribuição dos enteroparasitas encontrados nos 43 parasitados da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem da comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010, de acordo com o estado nutricional. Parasitas / Total Abaixo do peso Peso normal Excesso de peso Obeso G. duodenalis (n=19) 1 (5,2%) 7 (37%) 2 (10,5%) 9 (47,3%) E. histolytica (n=3) - - 1 (33,3%) 2 (66,6%) E. coli (n=2) - - 1 (50%) 1 (50%) E.nana (n=1) - - 1 (100%) - Cryptosporidium spp. (n=23) - 11 (47,8%) 7 (30,5%) 5 (21,7%) A. lumbricoides (n=6) - 3 (50%) 3 (50%) - T. trichiura (n=1) - - - 1 (100%) S. mansoni (n=1) - - - 1 (100%) 73 Quadro 12: Principais atributos epidemiológicos relacionados com as condições de higiene e saneamento dos 94 participantes da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem localizada na comunidade “Entra A Pulso”, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010. Quadro 14: Distribuição dos estados nutricionais encontrados nos 43 doentes parasitados da creche comunitária Nossa Senhora de Boa Viagem da comunidade Entra A Pulso, Boa Viagem, Recife-PE, Brasil, no período de Outubro de 2009 a Julho de 2010, de acordo com a faixa etária e género. Qual tipo de abastecimento de água na residência? 83% encanada 12,8% poço 4,2% ambos 83,7% encanada 9,3% poço 7% ambos 82,3% encanada 15,7% poço 2% ambos Qual o destino do esgoto? 58,5% céu-aberto 32% fossa 9,5% ambos 60,5% céu-aberto 25,5% fossa 14% ambos 56,9% céu-aberto 37,2% fossa 5,9% ambos Possuem animais domésticos? 5,3% sim 94,7% não 7% sim 93% não 5,8% sim 94,2% não Efetua a lavagem das mãos antes das refeições e após uso da casa de banho? 24,5% completa 34% incompleta 41,5% não 14% completa 46,5% incompleta 39,5% não 33,3% completa 23,5% incompleta 43,2% não Qual a forma de banhar-se? 57,4% chuveiro 24,4% balde 18% ambos 55,8% chuveiro 25,5% balde 18,6% ambos 58,8% chuveiro 23,5% balde 17,6% ambos Questões Total dos Entrevistados (n=94) Parasitados (n=43) Não Parasitados (n=51) Respostas 80 que a transmissão pode estar ocorrendo nos ambientes de terra, nos quais as crianças brincam, veiculados por alimentos e pela falta de educação sanitária. No presente trabalho, a maior prevalência de parasitas intestinais foi verificada na faixa etária de 3-6 (55,8%) anos, sendo G. duodenalis (50%) e Cryptosporidium spp. (37,5%) os parasitas mais prevalentes nas crianças compreendidas nesta faixa etária, embora o resultado não tenha sido significativo (P=0,095), concordando com dados preliminares de vários autores que verificaram um maior número de indivíduos infectados dentro da faixa etária de 3-12 anos sendo a giardiase a enteroparasitose mais prevalente nesta faixa etária (Ludwing et al., 1999; Gurgel et al., 2005; Komagome et al., 2007; Biscegli et al., 2009; Nascimento et al., 2009). Este resultado pode ser justificado pelo facto de que crianças compreendidas nesta faixa etária, têm maior autonomia, maior contacto com o solo e com outras crianças, o que favorece a contaminação por parasitas, inclusive com maior diversidade de espécies. Quando analisamos a presença do protozoário Cryptosporidium spp. nas demais faixa etárias, verificamos uma alta prevalência (26%) na faixa entre 22-40 anos (P=0,023), na qual estão compreendidos os funcionários. A detecção dos mesmos protozoários intestinais patogénicos, tais como Cryptosporidum spp., G. duodenalis e E. histolytica, nas crianças e nos adultos pode indicar transmissão pessoa-a-pessoa, das crianças para os funcionários ou vice-versa, no entanto, não foi possivel demonstrar a transmissão pessoa-a-pessoa pois vários outros factores interferem na transmissão dos agentes, como a deficiência de saneamento e abastecimento da água da comunidade e qualidade dos alimentos, embora a mesma possa estar ocorrendo. Por outro lado, a alta prevalência destes agentes indicam, também, consumo de água e ou alimentos contaminados por material fecal de origem humana, ou ingestão do quistos/ooquistos a partir de mãos contaminadas, diretamente ou na manipulação de alimentos. Este resultado pode ser justificado pelo facto de que crianças compreendidas nesta faixa etária, estão em contacto maior com o solo e com outras crianças da comunidade, o que favorece a contaminação por parasitas, inclusive com maior diversidade de espécies. 81 Alguns autores referem que nesta faixa etária as crianças passam por mudanças quanto à resposta imune aos enteroparasitas e também nos hábitos pessoais, sociais e alimentares, tais como introdução de alimentos crus na dieta, diminuição dos cuidados diretos, maior contacto com o solo, com outras crianças e animais domésticos, sendo importante a implementação de medidas preventivas primárias e secundárias. Também chamam a atenção para o facto de que a resposta imune aumenta com a idade e a exposição ao parasita (Costa-Macedo et al., 1999; Machado et al., 1999; Bórquez et al., 2000; Rocha et al., 2000; Scolari et al., 2000; Uchoa et al., 2001; Carneiro et al., 2002; Bezerra et al., 2003; Nolla & Cantos, 2005). Entre as variáveis consideradas diretamente relacionadas às enteroparasitoses, está a qualidade de água disponível à população, uma vez que, a mesma, é um importante veículo de transmissão de enteroparasitoses e explica alguns factores epidemiológicos envolvidos na predisposição dos grupos estudados à contaminação (Nuñez et al., 2003; Santos et al., 2004; Heller et al., 2004; Costamagna et al., 2005). No presente estudo 83,3% da população investigada residiam em casas cujo abastecimento de água era proveniente da rede pública, 12,6% por poços e 4,2% por ambas as formas. Com base nestes dados é possível afirmar que a água que chega, na grande maioria, às residências dos participantes do estudo passa por um tratamento prévio, que inclui retirada de sólidos, filtragem e cloração, procedimentos estes adequados à produção de uma água de qualidade razoável para o consumo. A principal fonte de água disponível, proveniente da rede pública de abastecimento, também pode ter influenciado pelo facto de mais da metade da população estudada ter apresentado resultados negativos (51; 54,2%) quanto às parasitoses, embora este resultado não tenha sido significativo estatisticamente. Porém não descarta a possibilidade da mesma ter influenciado na contaminação da população em estudo, pois, protozoários como Cryptosporidium spp. e G. duodenalis apresentam grande resistência às condições ambientais e aos desinfectantes químicos empregados para potabilizar a água, tais como cloro, cloraminas ou dióxido de cloro, assumindo 82 assim grande relevância para os sistemas de abastecimento público de água (Dyksen et al., 1998). Entretanto, vários surtos de doenças de veiculação hídrica têm sido relatados, associados ao consumo de água de sistemas públicos de abastecimento. Dentre esses episódios, destaca-se o de Milwaukee (US) em 1993 onde estimou-se que 403.000 pessoas contraíram criptosporidiose, das quais 4.400 foram hospitalizadas (Rose, 1997; Fayer et al, 2000). No período de 1989 a 1999, 21 surtos de criptosporidiose foram relatados afetando aproximadamente 481.126 pessoas (Fayer et al, 2000) sendo estas águas enquadradas ao padrão de potabilidade exigidos. Neto (2004) em seus estudos, pesquisou a ocorrência de quistos de Giardia sp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em águas de uma estação de tratamento em Campinas (SP-Brasil) encontrando a presença de 90% de quistos de Giardia sp. nas amostras analisadas, não tendo, entretanto, observado a presença de Cryptosporidium spp. nestas amostras. A segunda principal fonte de água disponível para a população neste estudo foi através de água de poço (12,6%). O manancial subterrâneo é um recurso utilizado por ampla parcela da população brasileira (15,6%), porém uma das principais fontes de contaminação desses lençóis freáticos são os esgotos que são lançados in natura no solo. A contaminação da água subterrânea de poços e sistemas de distribuição com bactérias do grupo coliformes foi registrada entre os anos de 1994 e 1999 quando a Agencia de Proteção Ambiental dos EUA (USEPA) constatou violação nos níveis máximos de contaminantes em 25,6% (40.000/156.000) das amostras analisadas. A USEPA (1994) listou mais de 100 patógenos virais e bacterianos que podem ocorrer nas águas subterrâneas, incluindo espécies de Giardia e de Cryptosporidium, apesar de que a presença destes protozoários em água subterrânea indica influência da água superficial. A maioria desses organismos é de origem fecal e são transmitidos por uma rota de exposição fecal-oral (Macler e Merkle, 2000). No Brasil, o cenário actual é caracterizado pela progressiva contaminação das águas superficiais e subterrâneas devido à deficiente infra-estrutura do sistema de esgotamento sanitário (FUNASA - Fundação Nacional de Saúde; Ministério de Saúde). Dos 5.507 municípios existentes em 2000, 47,8% não dispõe de redes de esgoto sanitário e os principais receptores do esgoto in natura, não tratados, são 83 os rios e o mar o que compromete a qualidade de água utilizada para o abastecimento, irrigação e recreação (IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia Estatística, 2000). Vários surtos epidêmicos decorrentes da ingestão das águas subterrâneas foram associados a deficiência no sistema de distribuição de água ou poços e nascentes que não foram adequadamente protegidos da contaminação por esgotos ou fezes de animais drenadas das áreas de pastagem após a ocorrência de chuvas (Craun et al., 1998; Searcy et al., 2006). Nos últimos anos, as investigações sobre a ocorrência destes protozoários patogénicos no ambiente aquático vêm aumentando significativamente no Brasil. Ooquistos foram detectados em água de consumo humano (Tomps, 1998), em esgoto e águas superficiais (Ré, 1999; Dias-Junior, 1999; Farias et al., 2002), em águas de poços subterrâneos (Gamba et al., 2000) e tratadas (Muller, 2000), mediante o emprego de precipitação química ou filtração em membranas. Diante destes factos, a utilização de águas de poços na residência dos participantes desta pesquisa pode estar relacionada com a transmissão das enteroparasitoses encontradas. É do conhecimento geral que o destino dado aos dejectos é um factor preponderante na disseminação das enteroparasitoses. Ao obter-se junto aos responsáveis pelas crianças, as informações referentes ao destino dos dejectos humanos, observou-se que 58,5% referiram lançálos em esgotos a céu-aberto. Os restantes, 32% informaram utilizar fossa e 9,5% referiram utilizar combinação de esgoto a céu-aberto e fossa. Estes resultados demonstram a total falta de saneamento básico nesta comunidade, mostrando que nenhum dos entrevistados residiam em casas que possuiam intalações com rede de esgoto público o que, de forma direta ou indireta, poderia contribuir para o declínio das enteroparasitoses e melhoria das condições de vida, além da preservação do ambiente. A exemplo dessa preocupação, Ludwing et al. (1999) numa tentativa correlacionou as condições de saneamento básico e as parasitoses intestinais, observaram que a frequência de parasitoses diminuiu com o aumento do número de ligações de água e esgoto. Da população estudada, a veiculação fecal, factor de predisposição às parasitoses, mostrou significância estatística quando confrontada com a presença de organismos patogénicos (P=0,004). Concordando 84 com os resultados encontrados por Mello e Bohland (1999) que associaram a prevalência de enteroparasitoses às condições ambientais e verificaram que 96,2% das crianças apresentaram resultados positivos quanto às parasitoses intestinais. No entanto, apenas 4,8% dos domicílios analisados possuíam instalações sanitárias com rede de esgoto. Essas realidades reforçam as considerações de Paulino et al. (2001) e Semenas et al. (1999) sobre a necessidade de melhoria no saneamento básico, disponibilizando mais rede de esgoto à população, em relação a sistemas não tratados como fossas a céu-aberto, melhorando assim, também, o próprio ambiente. A higiene pessoal como tomar banho todos os dias, lavar as mãos antes das refeições e após defecação, entre outras, são medidas básicas e necessárias para uma boa saúde, e deve acontecer individual e diariamente. Nesse trabalho 58% dos entrevistados fazem a sua higiene em chuveiros, 24,2% com banhos de assento e 17,8% banham-se de ambas as formas. Possivelmente, pela maior parcela dos entrevistados banharem-se de chuveiro, este poderia ser um factor que contribuisse para que mais da metade da população pesquisada esteja livre das parasitoses, embora não tendo significância estatistica.Outro aspecto de limpeza pessoal, de maior importância, é o habito de lavar as mãos. Dos 94 participantes deste estudo, 39 (41,5%) afirmaram não lavam as mãos antes das refeições e após uso de casa de banho, contra 23 (24,2%) dos que fazem asseios completos. Estes resultados, embora em percentagem elevada mas sem significância estatística, é um dos factores predisponentes às enteroparasitoses. Tal como no presente trabalho, Nuñez et al. (2003) não encontraram diferenças significativas tanto quanto ao hábito de lavar as mãos antes das refeições, quanto após o uso de sanitários. No entanto, Bezerra et al. (2003) evidenciaram que a falta de higiene pessoal é fonte de contaminação, transmissão e autoinfecção, reforçando a necessidade de intervenção educacional, objetivando minimizar a ocorrência dessas parasitoses. Os cuidados com a preparação e a forma de consumo dos alimentos também são factores que podem proteger ou propiciar a proliferação das parasitoses, pois a manipulação incorreta dos alimentos pode estar diretamente relacionadas às parasitoses intestinais (Silva et al., 2005; Nolla & Cantos, 2005). Segundo Soares e Cantos (2005), as hortaliças são amplamente comercializadas e 85 consumidas no Brasil, sendo este factor um importante meio de transmissão de enteroparasitas. Os autores alertam para o facto de que estes alimentos consumidos in natura são determinantes de doenças parasitárias quando cultivados em áreas contaminadas com dejectos fecais ou irrigados com águas poluídas. Na população estudada, 84,2% referiu fazer uso de legumes e verduras, porém o resultado obtido não mostrou significância estatística em relação à presença dos enteroparasitas, embora seja um dos factores predisponentes às enteroparasitoses. A utilização dos vegetais na alimentação é sempre estimulada para o bom desenvolvimento físico e mental das crianças destacando-se a necessidade de orientação da população sobre as boas condições higiênicas para a preparação dos mesmos, junto com a cozedura adequada. (Heller et al., 2004; Traviezo-Valles et al., 2004) Neves (2000a) alerta para que os enteroparasitas podem circular indiferentemente entre humanos e animais, ou seja, ambos funcionam como hospedeiros ressaltando a importância de se atentar para os animais domésticos tais como cão, gato e outros. Esses animais domésticos estão presentes nas residências, tanto para distração como protecção da família, e constituem factores preponderantes na disseminação das parasitoses. Da população estudada, apenas 5,2% referiram presença de animal doméstico convivendo directamente no mesmo ambiente. Esse resultado não apresentou relação estatisticamente significativa com as enteroparasitoses encontradas, provavelmente por a grande maioria (94,8%) dos entrevistados não possuirem animal doméstico nas suas residências.Faleiros et al. (2004), ao contrário dos resultados do presente estudo, encontraram a presença do hospedeiro intermediário (cão) nas residências de 84,3% das crianças contaminadas. Da mesma forma, Florêncio (1990) ao pesquisar 60 famílias em relação a alguns aspectos da epidemiologia de G. duodenalis, procurando relacioná-los com a presença de cão domiciliado, observou uma prevalência de infecção de 40%, 20,5% e 11,6%, respectivamente, nas famílias, nas crianças e nos cães. O autor, diante desses resultados, considerou ainda que uma maioria significativa de famílias infectadas pelo parasita não destinava um local reservado para seus cães evacuarem, e que a maior porporção das crianças com Giardia mantinha contacto com o cão 86 também parasitado. O referido autor ainda procurou chamar a atenção para o facto de que os cães domésticos podem circular livremente pelas ruas adjacentes às suas casas ficando vulneráveis à contaminação com Giardia através da ingestão de água e alimentos fora do domicílio, podendo também carregar quistos desse parasita em seus pêlos, tomando-se fontes de contaminação para seus donos, principalmente as crianças. A disseminação das enteroparasitoses também pode ocorrer através do contato interpessoal com outras pessoas contaminadas que moram na mesma residência. Crianças frequentadoras de creches, assim como as pessoas que lá trabalham, apresentam altas taxas (17 a 47%) de infecção por Giardia, manifestada de forma clínica ou subclínica (Steketee et al., 1989). Sabe-se que quando uma criança apresenta giardíase, há 5 a 25% de chance de um ou mais membros da família estarem contaminados (Steketee et al., 1989; Wharton et al., 1990). Nesse sentido, Otto et al. (1998) demonstraram a presença de protozários e helmintas num estudo coproparasitológico realizado em 40 grupos familiares sendo que 35 famílias apresentaram infecção parasitária e nove apresentaram três ou mais elementos do grupo familiar parasitados. Costa-Macedo et al. (1999) demonstraram infecção com carga parasitária moderada a elevada em cerca de 38% das crianças e 36% das mães, reforçando a importância da investigação parasitária na população materno-infantil uma vez que o parasitismo acomete não só a criança, mas também os familiares. Resultado semelhante foi apresentado por Costa-Macedo e Rey (2000) que observaram a simultaneidade de parasitismo entre mãe e filho e, esta situação mostrou um risco 1,7 vezes maior para o filho da mulher parasitada de apresentar também doença. Ainda que neste estudo não se tenha tido a preocupação de conhecer a prevalência de contaminação por enteroparasitas nas famílias das crianças, nas mães ou nos responsáveis, foram realizados exames coprológicos em 18 filhos de funcionários da creche que não estavam matriculados na creche. Destes, 38,8% (7/18) estavam infectados com enteroparasitas. Ressaltamos que 38,8% (7/18) dos funcionários encontravam-se infectados com parasitas intestinais e que 87 albergavam parasitas em comum ao de seus filhos tais como Cryptosporidium spp., G. duodenalis e E. histolytica, podendo então contribuir para a transmissão na creche e familiares. As protozooses e as helmintoses são doenças de manifestação espectral, variando desde casos assintomáticos à leves. Nos casos leves, os sintomas são inespecíficos, tais como anorexia, irritabilidade, distúrbios do sono, náuseas, vômitos ocasionais, dor abdominal e diarreia. Os quadros graves podem ocorrer em doentes com maior carga parasitária e em imunodeprimidos e desnutridos. O aparecimento ou agravamento da desnutrição ocorre através de vários mecanismos, tais como, lesão da mucosa (G. duodenalis, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, coccídios), alteração do metabolismo de sais biliares (G. duodenalis), competição alimentar (A. lumbricoides), exsudação intestinal (G. duodenalis, S. stercoralis, N. americanus, T. trichiura), favorecimento de proliferação bacteriana (E. histolytica) e hemorragias (N. americanus, T. trichiura) (Melo et al., 2004). No presente estudo, 69,8% dos 43 participantes infectados afirmaram não apresentar sintomas, concordando com resultados apresentados por outros autores (Santos et al., 2008). Dentre os sintomáticos monoparasitados, o sintoma mais prevalente foi vómito (71,4%), seguido de diarreia 57,1%. Enquanto que, nos poliparasitados, diarreia e dor abdominal (50% cada), foram os mais prevalentes. Quando foram analisados a prevalência de sintomas nos doentes com criptosporidiose e giardiase, nos monoparasitados prevaleceram os casos assintomáticos (81,2% e 78,6%, respectivamente) em relação aos sintomáticos. Nos casos de monoparasitismo tanto por Cryptosporidium spp. Como por G. duodenalis os sintomas mais prevalentes foram diarreia e vómito 66,6% cada. Entretanto, nos poliparasitados, os casos sintomáticos foram mais evidentes (75% Cryptosporidium spp. e 60% G. duodoenalis), tal facto deve-se a possivel associação com outros enteroparasitas que em associação debilitam o sistema imunológico do doente. A infecção por Cryptosporidium spp. está frequentemente associada com episódios diarreicos, persistentes, com duração variável (Newman et al., 1999). Andrade, et al., (2008) em seus estudos, em um centro de educação infantil público (Blumenau-SC, Brasil), obtiveram uma prevalência de 7,6% de Cryptosporidium spp. e relataram que 14% dos entrevistados afirmaram que seus filhos 88 apresentavam episódios de diarreia. Nascimento et al., (2009) pesquisando presença de Cryptosporidium spp. em crianças, em uma creche pública (Recife-PE, Brasil), obtiveram uma prevalência de 32% para Cryptosporidium spp. e dos entrevistados 48,8% relataram apresentar casos de diarreia. O espectro da giardíase é extenso, desde infecções assintomáticas até infecções com diarreia crónica acompanhada de esteatorreia, perda de peso e má absorção intestinal, que podem ocorrer em 30 a 50% das pessoas infectadas (Neves, 2005). A forma aguda caracteriza-se por diarreia do tipo aquosa, explosiva, acompanhada de distensão e dor abdominal. A giardíase pode levar à má absorção de açúcares, gorduras e vitaminas A, D, E, K, B12, ácido fólico, ferro e zinco (Melo et al., 2004). Em crianças, principalmente, pode surgir intolerância à lactose devido à perda da actividade enzimática na mucosa do intestino delgado (Teo, 2002). A diversidade de parasitoses exige tratamento com medicamentos específicos, sendo desaconselhável o uso de fármacos sem a determinação do agente etiológico. Os exames de detecção de parasitas intestinais devem ser específicos para diminuir os riscos de reincidências devido à resistência dos parasitas aos anti-helmínticos e anti-protozoários (Barnabé et al., 2008). O uso de fármacos antiparasitários entre os entrevistados (50%), conforme evidenciaram os relatos deste estudo, pode ter contribuído na maior prevalência (54,2%) de participantes não parasitados, embora não tenha tido significado estatístico. Porém, segundo Andrade et al. 2010, o tratamento das parasitoses intestinais consiste, além do emprego de antiparasitários, em medidas de educação preventiva e de saneamento básico. Em vista da dificuldade de diagnóstico específico das parasitoses, muitas vezes, são realizados tratamentos empíricos com mais de um fármaco. Dentre os entrevistados que afirmaram ter usado algum tipo de medicação antiparasitária, nos ultimos dois meses, antes deste estudo, 36,2% encontravam-se parasitados. Dentre os fármacos, Mebendazol (72,3%) foi o mais relatado, seguido de Albendazol (23,5%). A baixa prevalência de helmintas (18,6%) no presente estudo pode ser justificado pela maior utilização do Mebendazol entre os entrevistados, embora não se tenha verificado diferenças estatisticamente significativas. Tal 89 fármaco, apresenta eficácia clínica entre 93,8-100% para os Nemátodeos: ascaridíase, ancilostomíase, tricuríase e enterobíase (Upcroft & Upcroft, 2001), porém, não apresenta eficácia para protozoários intestinais. O tratamento das protozooses intestinais (giardíase e amebíase) tem sido feito com os derivados nitroimidazólicos: metronidazol, tinidazol ou secnidazol. O metronidazol, pelo seu baixo custo e por integrar a cesta básica de medicamentos do Sistema Único de Saúde (SUS), tem sido o fármaco mais utilizado no Brasil. Possui o inconveniente de exigir o tratamento por sete dias e apresentar efeitos colaterais, como cefaleia, vertigem, náuseas e gosto metálico. O secnidazol é dado usualmente em dose única para adultos e crianças. O seu efeito é rápido sendo completamente absorvido, com meia-vida de 17 a 29 horas, mais longa em relação aos derivados imidazólicos. Náuseas, dor abdominal, sabor metálico e anorexia foram relatados, mas normalmente não exigem descontinuação do fármaco (Gardner & Hill, 2001). Taxas de resistência clínica em torno de 20% foram relatadas com o uso de metronidazol no tratamento da giardíase e taxas de recorrência em torno de 90%. Resistência cruzada ao tinidazol foi demonstrada com estirpes de G. duodenalis resistentes ao metronidazol. Como alternativa a este, o albendazol pode ser usado no tratamento da giardíase (Upcroft & Upcroft, 2001). Um estudo em larga escala em Bangladesh mostrou a eficácia média, do albendazol, de 62 a 95%, comparado com 97% para o metronidazol (Hall & Nahar, 1993). Estes altos níveis de eficácia são atingidos utilizando-se mais de uma dose. Isto pode contribuir para a resistência ao albendazol, tal como verificam alguns autores (Upcroft & Upcroft, 2001). O tratamento da criptosporidiose é essencialmente sintomático e visa aliviar os efeitos da diarreia e desidratação. Em imunocompetentes geralmente ocorre cura espontânea. A maioria dos fármacos testados não apresenta eficácia específica comprovada e consistente contra a criptosporidiose. Em imunodeficientes portadores da síndrome de imunodeficiência adquirida (Sida) o tratamento anti-retroviral específico para o virus da imunodeficiência humana (VIH) foi responsável por uma redução de 90% na incidência da criptosporidiose nos Estados Unidos da América (EUA). Estudos recentes têm demonstrado que a nitazoxanida possui eficácia comprovada 96 BEZERRA, F.S.M., et al., 2003. Incidência de parasitos intestinais em material sub-ungueal e fecal em crianças de Creche Aprisco - Fortaleza, CE. Revista Brasileira de Análises Clínicas, 35:39-40. BÓRQUEZ, C., et al., 2004. Enteroparasitosis en niños escolares del valle de Lluta. Arica - Chile. Parasitologia Latinoamericana, 59:175-178. CACCIÒ, S.M., de GIACOMO, M. e POZIO, E., 2002. 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