Identificação de múltiplos marcadores polimórficos em pneumocystis jirovecii: relação com a evolução clínica
Abstract
Pneumocystis jirovecii é um importante agente infeccioso, causador de pneumonia (PPc) em doentes com infecção vírus da imunodeficiência humana/síndroma de imunodeficiência adquirida (VIH/sida), tendo sido, também, já descritos casos de infecção em imunocompetentes ou em doentes com graus moderados de imunodeficiência. Sequências polimórficas de ácido desoxirribonucleico (DNA) são detectadas frequentemente em isolados de P. jirovecii, sugerindo que a variação genética é comum neste microrganismo e que diversos subtipos genéticos podem existir. Permanecem por esclarecer as razões pelas quais os doentes sofrem de diferentes graus de severidade de PPc. Alguns estudos apontam para que determinados indicadores do prognóstico clínico possam estar relacionados com a apresentação e a evolução da infecção por P. jirovecii. Por outro lado, também é sugerido que polimorfismos específicos possam determinar características epidemiológicas do microrganismo, como a distribuição geográfica de determinados subtipos, os modos de transmissão, ou mesmo, fenómenos de resistência a fármacos, ou diferentes graus de virulência. Coloca-se a hipótese de que a virulência de um determinado subtipo de P. jirovecii possa estar dependente de múltiplos genes e, portanto, da associação de polimorfismos múltiplos que ocorrem em diversas regiões do genoma. Com o objectivo de identificar genes potencialmente associados com factores da infecção por P. jirovecii e com o propósito de desenvolver técnicas moleculares de alto rendimento, efectuou-se o estudo da variabilidade genética de isolados deste microrganismo, em Portugal. O trabalho envolveu a recolha de espécimes pulmonares de doentes infectados por P. jirovecii com diferentes características clínicas e integrou as metodologias de imunofluorescência indirecta com anticorpos monoclonais (IFI/AcM), reacção de polimerização em cadeia (PCR), sequenciação directa, análise de fragmentos de restrição (RFLP), PCR multiplex, genotipagem por reacção de polimerização de base única (SBE), PCR em tempo real (RT-PCR) e DNA pooling. Os genes candidatos considerados no presente estudo, foram seleccionados com base numa extensa pesquisa bibliográfica: o gene da subunidade grande do rRNA mitocondrial (mtLSU rRNA), o gene do citocromo b (CYB), o gene da superóxido dismutase (SOD), o gene da -tubulina ( TUB), o gene da tiorredoxina reductase (TRR1), o gene da timidilato sintetase (TS), o gene da dihidrofolato reductase (DHFR), o gene da dihidropteroato sintetase (DHPS), a região conservada (UCS) dos genes da família das glicoproteínas major de superfície (MSG) e o gene da protease kexin-like (KEX1). Este procedimento inicial, permitiu avaliar o interesse relativo destes 10 loci, verificar a informação sobre as respectivas sequências, sua variabilidade, importância a nível metabólico e a potencialidade para estas regiões poderem estar relacionadas com características da infecção, como resistência a fármacos, ou factores de virulência. A diversidade genética, as frequências de distribuição de genótipos e a relação entre os genótipos observados e diversos parâmetros da infecção, foram investigadas por PCR seguido de sequenciação directa, ou RFLP. A análise dos resultados permitiu confirmar o declínio das mutações associadas a fenómenos de resistência aos fármacos da família das sulfas, em Portugal, provavelmente como consequência do decréscimo no uso de profilaxia anti-P. jirovecii com sulfas, após a introdução da terapêutica anti-retrovírica potente (HAART). Nos 10 loci de P. jirovecii analisados, foram identificados e caracterizados, um total de 23 polimorfismos, dos quais, quatro (mt85, SOD110, SOD215, DHFR312) demonstraram estar relacionados com parâmetros clínicos da infecção, e, por isso, foram considerados como relevantes no seguimento da investigação. Verificou-se que um genótipo específico (SOD110C/SOD215T) demonstrou estar associado a casos de PPc com maior severidade, enquanto que outros dois genótipos (mt85C/SOD215C e SOD110T/SOD215C) foram associados a casos de PPc com menor severidade. A análise cruzada das sequências permitiu detectar correlações estatisticamente significativas entre diversos polimorfismos, sugerindo a existência de potenciais haplótipos. Observou-se um elevado grau de recombinação entre os genótipos multilocus (MLGs) de P. jirovecii, sendo que, um dos MLGs (MLG E) se encontrava sobre-representado na população, sugerindo uma estrutura epidémica, na qual o fenómeno de recombinação genética é frequente, mas onde ocasionalmente, um clone bem sucedido, tende, rapidamente, a aumentar a sua frequência originando um clone epidémico. A técnica de PCR multiplex/SBE foi aplicada com sucesso na identificação de polimorfismos genéticos de P. jirovecii em pools de DNA, demonstrando que é possível uma análise num formato múltiplo, abrangendo um elevado número de amostras. A metodologia proposta demonstrou ser uma ferramenta útil na caracterização do perfil genético de P. jirovecii, permitindo a amplificação e caracterização de diversos fragmentos, de uma forma rápida, implicando redução de custos e de tempo de operação, e possibilitando, a aplicação em larga escala. A associação das técnicas de PCR multiplex/SBE e de DNA pooling por RT-PCR permitiu determinar a distribuição das frequências relativas dos polimorfismos de base única (SNPs, do inglês single nucleotide polymorphims) DHFR312, mt85, SOD215 e SOD110 em subgrupos de doentes, com diferentes características clínicas. Esta abordagem, possibilitou a identificação de SNPs presentes nos diferentes subgrupos, permitindo a classificação de polimorfismos, aparentemente, não relevantes (ex. DHFR312), e, conseguindo seleccionar outros polimorfismos, potencialmente relacionados com diferentes parâmetros da infecção (ex. mt85, SOD215 e SOD110). Assim, os SNPs seleccionados podem, de alguma forma, estar associados a haplótipos de P. jirovecii com características distintas, ou seja, potencialmente implicados em diferentes graus de severidade da doença. Os resultados obtidos com o presente estudo, permitem colocar a hipótese de que haplótipos de P. jirovecii com características distintas podem existir, e que, regiões genéticas específicas podem funcionar como marcadores desses mesmos organismos. A aplicação das metodologias de alto rendimento, propostas nesta investigação, pode acelerar a identificação de polimorfismos de P. jirovecii relevantes a nível clínico, permitindo uma aproximação baseada em haplótipos para caracterização clínica deste microrganismo patogénico, auxiliando e adequando a escolha do tratamento mais indicado, possibilitando assim, um melhor controlo da doença. A robustez, sensibilidade e especificidade, demonstradas pelas técnicas de PCR multiplex/SBE e de DNA pooling, fazem com que sejam indicadas, não só para o estudo de P. jirovecii, mas também para o estudo de inúmeros microrganismos, em especial de microrganismos não cultiváveis, nos quais, a limitação da amostra, faz com que sejam requeridas técnicas de alta capacidade, para que seja possível a caracterização de isolados, tal como ficou demonstrado, no presente estudo, para o caso de P. jirovecii.
Full text
FRANCISCO VAZ DE CARVALHO ESTEVES
IDENTIFICAÇÃO DE MÚLTIPLOS MARCADORES
POLIMÓRFICOS EM PNEUMOCYSTIS JIROVECII:
RELAÇÃO COM A EVOLUÇÃO CLÍNICA
LISBOA
2010
FRANCISCO VAZ DE CARVALHO ESTEVES
(Bolsei o de Dou o amen o pela Fundação pa a a Ciência e a Tecnologia,
Aluno de Dou o amen o pelo Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, da Uni e sidade No a de Lisboa)
IDENTIFICAÇÃO DE MÚLTIPLOS MARCADORES
POLIMÓRFICOS EM PNEUMOCYSTIS JIROVECII:
RELAÇÃO COM A EVOLUÇÃO CLÍNICA
LISBOA
2010
i
« A e olução é apenas en a i a e e o – mas em que os
êxi os são es imulados e mul iplicados e os alhanços são
implaca elmen e ex e minados, com abulosas
pe spec i as de empo disponí el pa a que o p ocesso se
e ec ue».
Ca l Sagan e Ann D uyan (1996), “Somb as de
an epassados esquecidos”.
ii
iii
Disse ação de candida u a ao g au de Dou o em
Ciências Biomédicas, especialidade de Pa asi ologia, pela
Uni e sidade No a de Lisboa, Ins i u o de Higiene e
Medicina T opical.
i
xi
Publicações
A pa i do conjun o de esul ados, ob idos no decu so do p esen e p ojec o de
dou o amen o, o am publicados os seguin es abalhos, em e is as de ci culação
in e nacional com a bi agem cien í ica:
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xii
A pa i dos esul ados des a disse ação, o am ap esen ados abalhos em
euniões cien í icas, cujos esumos o am publicados em li os de esumos ou em
e is as nacionais, ou in e nacionais, com comi é de lei u a:
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ji o ecii: Rela ionship wi h clinical da a. Ac a Pa asi ológica Po uguesa, 16(1-2):
410-411.
x
Resumo
Pneumocys is ji o ecii é um impo an e agen e in eccioso, causado de
pneumonia (PPc) em doen es com in ecção í us da imunode iciência humana/sínd oma
de imunode iciência adqui ida (VIH/sida), endo sido, ambém, já desc i os casos de
in ecção em imunocompe en es ou em doen es com g aus mode ados de
imunode iciência. Sequências polimó icas de ácido desoxi ibonucleico (DNA) são
de ec adas equen emen e em isolados de P. ji o ecii, suge indo que a a iação
gené ica é comum nes e mic o ganismo e que di e sos sub ipos gené icos podem
exis i . Pe manecem po escla ece as azões pelas quais os doen es so em de di e en es
g aus de se e idade de PPc. Alguns es udos apon am pa a que de e minados indicado es
do p ognós ico clínico possam es a elacionados com a ap esen ação e a e olução da
in ecção po P. ji o ecii. Po ou o lado, ambém é suge ido que polimo ismos
especí icos possam de e mina ca ac e ís icas epidemiológicas do mic o ganismo, como
a dis ibuição geog á ica de de e minados sub ipos, os modos de ansmissão, ou
mesmo, enómenos de esis ência a á macos, ou di e en es g aus de i ulência.
Coloca-se a hipó ese de que a i ulência de um de e minado sub ipo de P. ji o ecii
possa es a dependen e de múl iplos genes e, po an o, da associação de polimo ismos
múl iplos que oco em em di e sas egiões do genoma.
Com o objec i o de iden i ica genes po encialmen e associados com ac o es da
in ecção po P. ji o ecii e com o p opósi o de desen ol e écnicas molecula es de al o
endimen o, e ec uou-se o es udo da a iabilidade gené ica de isolados des e
mic o ganismo, em Po ugal. O abalho en ol eu a ecolha de espécimes pulmona es
de doen es in ec ados po P. ji o ecii com di e en es ca ac e ís icas clínicas e in eg ou
as me odologias de imuno luo escência indi ec a com an ico pos monoclonais
(IFI/AcM), eacção de polime ização em cadeia (PCR), sequenciação di ec a, análise de
agmen os de es ição (RFLP), PCR mul iplex, geno ipagem po eacção de
polime ização de base única (SBE), PCR em empo eal (RT-PCR) e DNA pooling.
Os genes candida os conside ados no p esen e es udo, o am seleccionados com
base numa ex ensa pesquisa bibliog á ica: o gene da subunidade g ande do RNA
mi ocond ial (m LSU RNA), o gene do ci oc omo b (CYB), o gene da supe óxido
dismu ase (SOD), o gene da β- ubulina (β TUB), o gene da io edoxina educ ase
x i
(TRR1), o gene da imidila o sin e ase (TS), o gene da dihid o ola o educ ase (DHFR),
o gene da dihid op e oa o sin e ase (DHPS), a egião conse ada (UCS) dos genes da
amília das glicop o eínas majo de supe ície (MSG) e o gene da p o ease kexin-like
(KEX1). Es e p ocedimen o inicial, pe mi iu a alia o in e esse ela i o des es 10 loci,
e i ica a in o mação sob e as espec i as sequências, sua a iabilidade, impo ância a
ní el me abólico e a po encialidade pa a es as egiões pode em es a elacionadas com
ca ac e ís icas da in ecção, como esis ência a á macos, ou ac o es de i ulência.
A di e sidade gené ica, as equências de dis ibuição de genó ipos e a elação
en e os genó ipos obse ados e di e sos pa âme os da in ecção, o am in es igadas
po PCR seguido de sequenciação di ec a, ou RFLP. A análise dos esul ados pe mi iu
con i ma o declínio das mu ações associadas a enómenos de esis ência aos á macos
da amília das sul as, em Po ugal, p o a elmen e como consequência do dec éscimo no
uso de p o ilaxia an i-P. ji o ecii com sul as, após a in odução da e apêu ica
an i- e o í ica po en e (HAART). Nos 10 loci de P. ji o ecii analisados, o am
iden i icados e ca ac e izados, um o al de 23 polimo ismos, dos quais, qua o
(m 85, SOD110, SOD215, DHFR312) demons a am es a elacionados com pa âme os
clínicos da in ecção, e, po isso, o am conside ados como ele an es no seguimen o da
in es igação. Ve i icou-se que um genó ipo especí ico (SOD110C/SOD215T)
demons ou es a associado a casos de PPc com maio se e idade, enquan o que ou os
dois genó ipos (m 85C/SOD215C e SOD110T/SOD215C) o am associados a casos de
PPc com meno se e idade. A análise c uzada das sequências pe mi iu de ec a
co elações es a is icamen e signi ica i as en e di e sos polimo ismos, suge indo a
exis ência de po enciais hapló ipos. Obse ou-se um ele ado g au de ecombinação
en e os genó ipos mul ilocus (MLGs) de P. ji o ecii, sendo que, um dos MLGs
(MLG E) se encon a a sob e- ep esen ado na população, suge indo uma es u u a
epidémica, na qual o enómeno de ecombinação gené ica é equen e, mas onde
ocasionalmen e, um clone bem sucedido, ende, apidamen e, a aumen a a sua
equência o iginando um clone epidémico.
A écnica de PCR mul iplex/SBE oi aplicada com sucesso na iden i icação de
polimo ismos gené icos de P. ji o ecii em pools de DNA, demons ando que é possí el
uma análise num o ma o múl iplo, ab angendo um ele ado núme o de amos as.
A me odologia p opos a demons ou se uma e amen a ú il na ca ac e ização do pe il
x ii
gené ico de P. ji o ecii, pe mi indo a ampli icação e ca ac e ização de di e sos
agmen os, de uma o ma ápida, implicando edução de cus os e de empo de
ope ação, e possibili ando, a aplicação em la ga escala. A associação das écnicas de
PCR mul iplex/SBE e de DNA pooling po RT-PCR pe mi iu de e mina a dis ibuição
das equências ela i as dos polimo ismos de base única (SNPs, do inglês single
nucleo ide polymo phims) DHFR312, m 85, SOD215 e SOD110 em subg upos de
doen es, com di e en es ca ac e ís icas clínicas. Es a abo dagem, possibili ou a
iden i icação de SNPs p esen es nos di e en es subg upos, pe mi indo a classi icação de
polimo ismos, apa en emen e, não ele an es (ex. DHFR312), e, conseguindo
selecciona ou os polimo ismos, po encialmen e elacionados com di e en es
pa âme os da in ecção (ex. m 85, SOD215 e SOD110). Assim, os SNPs seleccionados
podem, de alguma o ma, es a associados a hapló ipos de P. ji o ecii com
ca ac e ís icas dis in as, ou seja, po encialmen e implicados em di e en es g aus de
se e idade da doença.
Os esul ados ob idos com o p esen e es udo, pe mi em coloca a hipó ese de que
hapló ipos de P. ji o ecii com ca ac e ís icas dis in as podem exis i , e que, egiões
gené icas especí icas podem unciona como ma cado es desses mesmos o ganismos.
A aplicação das me odologias de al o endimen o, p opos as nes a in es igação, pode
acele a a iden i icação de polimo ismos de P. ji o ecii ele an es a ní el clínico,
pe mi indo uma ap oximação baseada em hapló ipos pa a ca ac e ização clínica des e
mic o ganismo pa ogénico, auxiliando e adequando a escolha do a amen o mais
indicado, possibili ando assim, um melho con olo da doença. A obus ez, sensibilidade
e especi icidade, demons adas pelas écnicas de PCR mul iplex/SBE e de DNA
pooling, azem com que sejam indicadas, não só pa a o es udo de P. ji o ecii, mas
ambém pa a o es udo de inúme os mic o ganismos, em especial de mic o ganismos
não cul i á eis, nos quais, a limi ação da amos a, az com que sejam eque idas
écnicas de al a capacidade, pa a que seja possí el a ca ac e ização de isolados, al como
icou demons ado, no p esen e es udo, pa a o caso de P. ji o ecii.
x iii
xix
Abs ac
Pneumocys is ji o ecii pneumonia (PcP) is a common and se ious disease in
pe sons in ec ed wi h he human immunode iciency i us (HIV). P. ji o ecii has also
been isola ed om immunocompe en pe sons and pa ien s wi h mode a e deg ees o
immunode iciency. Polymo phic desoxi ibonucleic acid (DNA) sequences a e
equen ly de ec ed in P. ji o ecii isola es sugges ing ha gene ic a ia ion is common
in his o ganism and di e en gene ic sub ypes may exis . Se e al aspec s o he disease
emain unknown; pa icula ly he easons why some pa ien s su e om mode a e PcP
wi h a o able esponse o he an i-P. ji o ecii d ugs, while o he s su e om se e e
PcP, which could be a al, despi e he apy. While se e al p ognos ic indica o s ha e
been associa ed wi h he ou come o PcP, ad ances in unde s anding he gene ic
di e si y o P. ji o ecii ha e shown ha speci ic polymo phisms could de e mine
epidemiological p o iles o he pa hogen, including geog aphical dis ibu ion, modes o
ansmission, d ug esis ance, and i ulence o pa icula sub ypes. Da a sugges s ha
he i ulence o a speci ic P. ji o ecii gene ic sub ype may be dependen on mul iple
polymo phisms ha occu a se e al genomic egions.
The aims o he p esen s udy we e o: (i) in es iga e possible associa ions
be ween ele an polymo phic sequences and P. ji o ecii in ec ion pa ame e s;
(ii) de elop a no el molecula app oach based on new high- h oughpu me hodologies.
A desc ip ion o gene ic di e si y in P. ji o ecii isola es, collec ed om
Po uguese in ec ed pa ien s p esen ing di e en clinical pa ame e s, based on he
iden i ica ion o mul iple single nucleo ide polymo phisms (SNPs), was achie ed using
indi ec immuno luo escence wi h monoclonal an ibodies (IFI/AcM), polyme ase chain
eac ion (PCR), DNA sequencing, es ic ion agmen leng h polymo phism analysis
(RFLP), mul iplex-PCR, single base ex ension (SBE), eal ime PCR (RT-PCR), and
DNA pooling.
The candida e P. ji o ecii DNA egions we e selec ed based on li e a u e
esea ch. A o al o 10 dis inc loci we e conside ed he mos p omising sequences:
he mi ochond ial la ge-subuni RNA (m LSU RNA), he cy och ome b (CYB),
he supe oxide dismu ase (SOD), he β- ubulin (β TUB), he hio edoxin educ ase
(TRR1), he hymidyla e syn hase (TS), he dihyd o ola e educ ase (DHFR),
xx
he dihyd op e oa e syn hase (DHPS), he ups eam conse ed egion (UCS) o he
majo su ace glycop o ein gene (MSG), and he kexin-like se ine p o ease (KEX1).
The impo ance o he candida e loci we e e alua ed based on he bibliog aphic
esea ch. This ini ial s ep p o ided subs an ial in o ma ion abou sequence a ia ion,
me abolic pa hways, and he ela ionship be ween hese sequences and pa ame e s o
in ec ion, such as d ug esis ance o i ulence.
The gene ic di e si y, he equency dis ibu ion o geno ypes and he
ela ionship be ween obse ed geno ypes and di e en pa ame e s o in ec ion we e
in es iga ed using PCR ollowed by DNA sequencing o RFLP. The esul s con i med a
decline o P. ji o ecii mu a ions associa ed wi h esis ance o sul a d ugs in Po ugal,
p obably as a esul o he dec eased use o sul a p ophylaxis a e he in oduc ion o
he highly ac i e an i e o i al he apy (HAART). Twen y h ee SNPs we e de ec ed
and cha ac e ized among he 10 loci s udied, o which ou (m 85, SOD110, SOD215,
DHFR312) we e demons a ed o be ela ed o clinical pa ame e s o in ec ion, and
he e o e we e conside ed as ele an sequence a ia ions o be analyzed in he
subsequen in es iga ion. I was ound ha a pa icula geno ype (SOD110C/SOD215T)
showed o be associa ed wi h mo e i ulen PcP episodes, whe eas wo o he geno ypes
(m 85C/SOD215C and SOD110T/SOD215C) we e associa ed wi h less i ulen PcP
episodes. The s udy o associa ed a ia ions and c oss-gene ic analysis demons a ed
signi ican s a is ical associa ions be ween se e al SNPs, sugges ing he exis ence o
P. ji o ecii haplo ypes. The esul s also sugges ed la ge ecombina ion be ween mos
P. ji o ecii mul ilocus geno ypes (MLGs). Howe e , one speci ic MLG (MLG E)
occu ed a a highe equency han would be expec ed acco ding o panmi ic
expec a ions, sugges ing linkage disequilib ium and clonal p opaga ion. The pe sis ence
o his speci ic MLG may be a consequence o clonal ep oduc ion o his success ul
geno ypic a ay in a P. ji o ecii popula ion wi h epidemic s uc u e.
Mul iplex ampli ica ion o genomic DNA associa ed wi h single base ex ension
geno yping showed o be a sui able high- h oughpu me hodology o la ge-scale
P. ji o ecii SNPs sc eening. The associa ion o mul iplex-PCR/SBE and DNA pooling
by RT-PCR showed o be a eliable me hodology o es ima e P. ji o ecii SNPs allele
equencies in P. ji o ecii DNA pools. The p oposed me hodology p o ed o be a use ul
ool o s udy he P. ji o ecii gene ic p o ile, p o iding he cha ac e iza ion o mul iple
xx ii
PCR – Reacção de polime ização em cadeia, do inglês polyme ase chain
eac ion
PFGE – Elec o o ese em campo pulsado, do inglês pulsed- ield gel
elec opho esis
PPc – Pneumonia po Pneumocys is ji o ecii
PRT – P o ease sé ica de supe ície
RFLP – Análise de agmen os de es ição, do inglês es ic ion agmen
leng h polymo phism
u – Unidade ela i a de luo escência, do inglês ela i e luo escence uni
RNA – Ácido ibonucleico, do inglês ibonucleic acid
ROX – 6-Ca boxilo-X- odamina
RNA – Ácido ibonucleico ibossómico, do inglês ibosomal ibonucleic acid
RT-PCR – Reacção de polime ização em cadeia em empo eal, do inglês eal ime
polyme ase chain eac ion
SAP – Fos a ase alcalina isolada de cama ão, do inglês Sh imp Alkaline
Phospha ase
SBE – Reacção de polime ização de base única, do inglês single base
ex ension
SCID – Imunode iciência se e a combinada, do inglês Se e e combined
immunode iciency
Sida – Sínd oma de imunode iciência adqui ida
SMZ – Sul ame oxazol
SNP – Polimo ismo de base única, do inglês single nucleo ide polymo phim
SOD – Supe óxido dismu ase
SPSS – P og ama in o má ico de análise es a ís ica, do inglês s a is ical
package o social sciences
SSCP – Análise de polimo ismos po con o mação de DNA em cadeia
simples, do inglês single s and con o ma ion polymo physm
TA – Tempe a u a de hib idação, do inglês annealing empe a u e
TAE – Tampão is-ace a o-EDTA
TAG – Sequência oligonucleó ida de ma cação
TAMRA – 6-Ca boxi e ame il odamina
xx iii
TATA – Sequência ca ac e ís ica da egião p omo o a de genes, cons i uída po
imina e adenina
TBE – Tampão is-Bo a o-EDTA
TCD4+ – Lin óci os T com ecep o es do ag upamen o de di e enciação 4, do
inglês clus e o di e en ia ion 4
TCD8+ – Lin óci os T com ecep o es do ag upamen o de di e enciação 8, do
inglês clus e o di e en ia ion 8
TE – Tampão is-HCl-EDTA
TLR2 – Recep o do ipo oll 2, do inglês oll-like ecep o 2
TNF-α – Fac o de nec ose umo al al a
T is-HCL – T is(hid oxime ilo)aminome ano-ácido clo íd ico
RNA – Ácido ibonucleico de ansc ição, do inglês ansc ip ion ibonucleic
acid
TRR – Tio edoxina educ ase
TS – Timidila o sin e ase
TMP – T ime op im
U – Unidade
UDG – U acilo-DNA glicosidase
UCS – Região conse ada, do inglês ups eam conse ed egion
UTR – Região não ansc i a, do inglês un ansla ed egion
UV – Ul a iole a
V – Vol
VIH – Ví us da imunode iciência humana
W – Wa
χ2 – Tes e do Chi-quad ado
µl – Mic oli o
µm – Mic óme o
xxix
Índice ge al
Página
Ag adecimen os …….............................................................................................. ix
Publicações …………............................................................................................. xi
Resumo ……........................................................................................................... x
Abs ac ……........................................................................................................... xix
Lis a de ab e ia u as ……....................................................................................... xxiii
Índice ge al ……...….............................................................................................. xxix
Índice de igu as ……............................................................................................. xxx
Índice de quad os …................................................................................................ xxx ii
PRIMEIRA PARTE
(In odução aos concei os ac uais sob e Pneumocys is ji o ecii
e pneumonia po Pneumocys is ji o ecii) …………….......................... 1
1. In odução ge al …........................................................................................... 3
1.1. Pe spec i a his ó ica .……………………………………………....... 3
1.2. Pe spec i a ac ual ………………………............................................ 5
2. Mo ologia e ciclo de ida ................................................................................ 6
2.1. In odução ao ciclo de ida de Pneumocys is ji o ecii …………........ 6
2.2. T o ozoí o ou o ma ó ica …………................................................. 9
2.3. P é-quis o ou espo ocis o …………..................................................... 10
2.3. Quis o ou espo o ………….................................................................. 11
3. Taxonomia ………………................................................................................. 14
3.1. Ca ac e ização axonómica: Pneumocys is, de p o ozoá io a ungo .... 14
3.2. He e ogeneidade gené ica ……………................................................ 18
4. Me abolismo, bioquímica e ca ac e ís icas de supe ície .............................. 23
4.1. In odução ao me abolismo ge al de Pneumocys is ………………..... 23
4.2. Hid a os de ca bono …………………................................................. 24
4.3. Lípidos ………………………………................................................. 25
4.4. P o eínas …………..…………………................................................ 25
4.5. P op iedades an igénicas de supe ície ................................................ 26
xxx
5. Epidemiologia da in ecção po Pneumocys is ji o ecii .................................. 28
5.1. P e alência ………………………………………..………………..... 28
5.1.1. P eponde ância da pneumocis ose nos países
ociden ais indus ializados .................................................... 28
5.1.2. P eponde ância da pneumocis ose nos países
em ias de desen ol imen o ……......................................... 30
5.1.3. P eponde ância da pneumocis ose nos doen es
se onega i os pa a VIH …..................................................... 31
5.2. T ansmissão e ese a ó ios na u ais ................................................... 32
5.3. La ência e sus ein ecção ………....................................................... 35
6. Ap esen ação clínica da pneumocis ose ………………................................. 38
6.1. In odução à in ecção po Pneumocys is ji o ecii …..……………..... 38
6.2. In ecção pulmona po Pneumocys is ji o ecii .................................... 39
6.3. In ecção ex apulmona po Pneumocys is ji o ecii ............................ 40
7. Fisiopa ologia ………………………………………........................................ 42
7.1. In e acção pa asi a-hospedei o ………………….…..……………..... 42
7.2. Respos a imuni á ia …………………………..................................... 43
7.2.1. Imunidade celula ………..................................................... 43
7.2.2. Imunidade humo al ….......................................................... 48
8. Diagnós ico …………………………………………….................................... 49
8.1. In odução ao diagnós ico da pneumocis ose …...…..……………..... 49
8.2. Diagnós ico p esun i o ……………………….................................... 50
8.3. Diagnós ico de ini i o ……………………………............................. 52
8.3.1. Amos as clínicas .………..................................................... 52
8.3.2. Mé odos his oquímicos pa a pesquisa di ec a ....................... 53
8.3.3. Mé odos imunoespecí icos …………………........................ 54
8.3.4. Mé odos molecula es ………………………........................ 55
9. P e enção e a amen o da pneumocis ose ….………................................... 58
9.1. In odução às opções e apêu icas …………..…...…..……………..... 58
9.2. P o ilaxia da pneumonia po Pneumocys is ji o ecii …....................... 58
9.3. T a amen o da pneumonia po Pneumocys is ji o ecii ….................... 60
xxxi
SEGUNDA PARTE
(Po encial implicação de múl iplos ma cado es polimó icos de
Pneumocys is ji o ecii na ap esen ação e e olução clínica da PPc) ..... 65
10. Relação en e polimo ismos de Pneumocys is ji o ecii e
pa âme os clínicos da PPc ……………………………………………….... 67
10.1. O p oblema e o mé odo ...………………………………………....... 67
10.2. Objec i os ge ais ………………………............................................ 69
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii:
selecção de al os molecula es ….................................................................... 71
11.1. Di e sidade in a-especí ica de Pneumocys is ji o ecii ………........ 71
11.2. In odução à epidemiologia molecula de Pneumocys is ji o ecii .... 74
11.3. Di e sidade gené ica dos al os molecula es seleccionados .............. 76
11.3.1. Genes mi ocond iais …....................................................... 77
11.3.2. Genes nuclea es ………....................................................... 81
11.3.3. Genes implicados em enómenos de esis ência
aos á macos da amília das sul as ...................................... 85
11.3.4. Genes elacionados com p op iedades de supe ície .......... 89
11.4. Ma e ial e mé odos …………………………………...………........ 94
11.4.1. C i é ios de inclusão …....................................................... 95
11.4.2. População es udada …......................................................... 96
11.4.3. P ocessamen o das amos as de sec eções pulmona es ...... 96
11.4.4. Diagnós ico pa asi ológico de Pneumocys is ji o ecii ....... 98
11.4.5. Ex acção de DNA .…......................................................... 100
11.4.6. Diagnós ico molecula de Pneumocys is ji o ecii .............. 101
11.4.7. Ca ac e ização gené ica das egiões de in e esse ................ 105
11.4.8. In o mação clínica .….......................................................... 111
11.4.9. Análise dos esul ados ......................................................... 112
11.5. Resul ados ………..…………………………………...………......... 115
11.5.1. Análise da a iação gené ica das egiões de in e esse ........ 115
11.5.2. Va iabilidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii e
pa âme os clínicos da pneumocis ose ................................ 122
xxxii
11.5.3. Análise de componen es p incipais ..................................... 130
11.5.4. Es udo da dis ibuição de genó ipos e
c i é ios de clonalidade ........................................................ 130
11.6. Discussão dos esul ados ……………………………...……….........137
11.6.1. Va iabilidade e dis ibuição dos genó ipos
de Pneumocys is ji o ecii ……...…..................................... 137
11.6.2. Relação en e os genó ipos de Pneumocys is ji o ecii e
os pa âme os da in ecção ................................................... 144
11.6.3. Gené ica da população ………………………………........ 148
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a
análise de polimo ismos de Pneumocys is ji o ecii ..................................... 150
12.1. Impo ância da PCR mul iplex/SBE associada à écnica de
DNA pooling pa a geno ipagem de Pneumocys is ji o ecii ….......... 150
12.2. PCR mul iplex …………...…………................................................. 152
12.3. Técnica de single base ex ension (SBE) ............................................ 157
12.4. Pools de DNA ………...…………..................................................... 160
12.5. Ma e ial e mé odos ………………..................................................... 165
12.5.1. Selecção das amos as …..................................................... 165
12.5.2. Ampli icação de múl iplos ma cado es
polimó icos po PCR mul iplex .......................................... 168
12.5.3. Geno ipagem de múl iplos SNPs po SBE .......................... 169
12.5.4. Aplicação da écnica de DNA pooling pa a
geno ipagem de SNPs po PCR mul iplex/SBE .................. 174
12.6. Resul ados ……….………………..................................................... 180
12.6.1. Análise da ampli icação de ês loci de
Pneumocys is ji o ecii po PCR mul iplex .......................... 180
12.6.2. Análise da geno ipagem de múl iplos SNPs po SBE ......... 182
12.6.3. Análise da geno ipagem po
PCR mul iplex/SBE em pools de DNA …........................... 188
12.7. Discussão dos esul ados …..……......................................................198
12.7.1. Validação da geno ipagem de SNPs de
xxxiii
Pneumocys is ji o ecii po PCR mul iplex/SBE ................. 199
12.7.2. A aliação da geno ipagem de Pneumocys is ji o ecii
po PCR mul iplex/SBE em pools de DNA ......................... 199
13. Discussão ge al e pe spec i as u u as ……………..................................... 211
13.1. Discussão ge al ……………..………………….…..……………..... 211
13.2. Pe spec i as u u as …………...……………….…..……………..... 215
14. Re e ências bibliog á icas ………………...................................................... 217
Anexos
xxxi
xxx
Índice de igu as
Página
Figu a 1. Secção de al éolo pulmona in ec ado po Pneumocys is ..................... 7
Figu a 2. Rep esen ação esquemá ica do ciclo de ida de Pneumocys is ji o ecii
no al éolo pulmona .............................................................................. 8
Figu a 3. Rep esen ação esquemá ica das p incipais es u u as da o ma ó ica
de uma célula de P. ji o ecii .................................................................. 10
Figu a 4. Rep esen ação esquemá ica das p incipais es u u as da o ma quís ica
de uma célula de P. ji o ecii .................................................................. 12
Figu a 5. Rep esen ação esquemá ica ab e iada da classi icação axonómica
de Pneumocys is ..................................................................................... 18
Figu a 6. Máxima p obabilidade ilogené ica de Pneumocys is isolados de 12
hospedei os di e en es ............................................................................ 22
Figu a 7. Rep esen ação esquemá ica da composição da pa ede celula
de P. ji o ecii ......................................................................................... 26
Figu a 8. Rep esen ação g á ica dos esul ados de um es udo epidemiológico
e ec uado às axas de in ecções opo unis as, ealizado pelo CDC ....... 29
Figu a 9. Diag ama que demons a a impo ância das células TCD4+ na
espos a imuni á ia à in ecção po Pneumocys is .................................. 43
Figu a 10. Rep esen ação esquemá ica da in ecção e da espos a ina a celula
ao agen e in eccioso P. ji o ecii .......................................................... 45
Figu a 11. Rep esen ação esquemá ica das in e acções en e P. ji o ecii e
um mac ó ago al eola ........................................................................ 46
Figu a 12. Quis os de P. ji o ecii, co ados po duas écnicas de e e ência,
em sec eções pulmona es .................................................................... 54
Figu a 13. Rep esen ação esquemá ica da cadeia espi a ó ia e da acção da
supe óxido dismu ase dependen e de manganésio .............................. 79
xxx i
Figu a 14. Rep esen ação esquemá ica da ia biossin é ica do ácido ólico e da
acção de inibição do sul ame oxazol e do ime op im ....................... 85
Figu a 15. Rep esen ação esquemá ica do modelo de exp essão das glicop o eínas
de supe ície (MSGs) de P. ji o ecii ................................................... 91
Figu a 16. Rep esen ação g á ica de ês análises de componen es p incipais
mais in o ma i as ................................................................................. 131
Figu a 17. Dend og ama das elações en e os MLGs de P. ji o ecii, elabo ado
com base nos ma cado es nuclea es es udados ................................... 135
Figu a 18. Esquema ep esen a i o da écnica de SBE u ilizada pa a a
geno ipagem de SNPs de P. ji o ecii .................................................. 160
Figu a 19. Esquema ep esen a i o da écnica de DNA pooling u ilizada pa a a
iden i icação de polimo ismos de P. ji o ecii .................................... 163
Figu a 20. Fo og a ia dos p odu os de PCR mul iplex de isolados de P. ji o ecii,
após sepa ação po elec o o ese em gel de aga ose ............................ 181
Figu a 21. Esquema ep esen a i o da écnica de SBE em mul iplex u ilizada pa a
a iden i icação dos SNPs de P. ji o ecii em es udo ............................. 183
Figu a 22. Fo og a ia dos p odu os de SBE de isolados de P. ji o ecii po
sepa ação de agmen os po elec o o ese em gel de ac ilamida ........ 184
Figu a 23. G á ico de geno ipagem po SBE de um isolado de P. ji o ecii
a a és da écnica de sequenciação po elec o o ese capila .............. 185
Figu a 24. G á ico da cu a de calib ação o necida pela luo escência das
diluições de DNA de ago λ com concen ações conhecidas .............. 190
Figu a 25. G á ico da elação en e a quan idade de DNA das diluições do pad ão
do gene KEX1 de P. ji o ecii e os espec i os CT ….......................... 192
Figu a 26. Rep esen ação g á ica dos CT médios dos isolados indi iduais
calculados a a és da KEX1 RT-PCR pa a os pools A1, A2 e A3 ...... 193
PRIMEIRA PARTE
In odução aos concei os ac uais sob e Pneumocys is ji o ecii e
pneumonia po Pneumocys is ji o ecii.
1. In odução ge al
- 3 -
1. In odução ge al
1.1. Pe spec i a his ó ica
Pneumocys is ji o ecii [F enkel 1976; Redhead e al. 2006], an e io men e
designado po Pneumocys is ca inii . sp. hominis [S inge e al. 2001; S inge e al.
2002] é um agen e pa ogénico opo unis a que p o oca, em eg a, pneumonia in e s icial
se e a, conhecida po pneumocis ose ou, pneumonia po P. ji o ecii (PPc), em
imunocomp ome idos [Wake ield 2002; Mo is e al. 2004; Alioua -Denis e al. 2008;
Beck & Cushion 2009]. Es e euca io a unicelula , de dis ibuição ubíqua, pe manece
como um signi ica i o ac o de mo bilidade e mo alidade em se oposi i os pa a o
í us da imunode iciência humana (VIH), mesmo na e a da e apêu ica an i- e o í ica
po en e (HAART, do inglês Highly Ac i e An iRe o i al The apy) [Ko acs e al. 2001;
Ba y & Johnson 2001; Thomas, J . & Limpe 2007; Walze e al. 2008].
Pneumocys is oi descobe o po Ca los Chagas (B asil) no início de século XX,
mais p ecisamen e em 1909, sendo nes a al u a conside ado uma e apa do ciclo de ida
de T ipanosoma c uzi [Chagas 1909]. Um ano após Chagas e obse ado o
mic o ganismo no pulmão de um cobaio, An ónio Ca ini, ambém no B asil, ao es uda
o pulmão de um a o, econheceu e iden i icou uma es u u a que pa ecia se o mesmo
mic o ganismo. Em 1912, no Ins i u o Pas eu (Pa is), um es udo mais ap o undado,
sob e o ma e ial biológico p o enien e das in es igações de Ca ini, oi conduzido pelo
casal Delanoë. Es es in es igado es chega am à conclusão de que o o ganismo em
ques ão e a cla amen e dis in o de T. c uzi e, desde logo, a ibuí am-lhe a designação de
Pneumocys is, po e sido isolado no pulmão, e o es i i o especí ico ca inii,
homenageando An ónio Ca ini, que ha ia p opo cionado a in es igação [Delanoë &
Delanoë 1912]. Assim, os o ganismos do géne o Pneumocys is o am desc i os como
pequenas es u u as, densas e al amen e e ingen es, em o ma de quis os es é icos
[Va a & Kuce a 1970; S inge 1996; Cushion 2004; Thomas, J . & Limpe 2007].
Du an e as décadas que se segui am, o am encon ados mic o ganismos sob a
o ma de quis os mui o simila es aos de inidos pelo casal Delanoë, e i icando-se que a
sua oco ência pode ia es a associada a casos de pneumonia num ala gado leque de
espécies de mamí e os [S inge e al. 1992; Alioua -Denis e al. 2008]. Pneumocys is
oi econhecido como po encial agen e in eccioso, quando nas décadas de 30 e 40, do
1. In odução ge al
- 4 -
século passado, lhe o am a ibuídos á ios casos de pneumonia in e s icial em c ianças
desnu idas e p ema u as, mui as delas acolhidas em o ana os, como esul ado da
segunda gue a mundial [Gajdusek 1976; Wake ield 2002; Cushion 2004]. No en an o,
somen e no deco e dos anos 50, do mesmo século, os es udos de Vanek e Jí o ec
demons a am e es abelece am as ca ac e ís icas in ecciosas de Pneumocys is no
Homem [F enkel 1999; S inge e al. 2002]. To nou-se e iden e que os doen es que
desen ol iam PPc demons a am ca ac e ís icas clínicas comuns, que, de alguma
o ma, e am consequência de sis emas imuni á ios débeis, que po causa de anomalias
congéni as, como a hipogamaglobulinemia, que pela acção de á macos
imunossup esso es, que , ainda, po subnu ição, no caso de se em c ianças [Cushion
2004].
Na década de 70, do século XX, quando es e agen e in eccioso se o nou causa
equen e de pneumonia em doen es imunocomp ome idos, e omou-se o es udo mais
ap o undado da PPc, de endo-se en ão es e ac o ao aumen o conside á el do núme o
de doen es po ado es de si uações de imunodep essão g a e, em pa icula ecep o es
de ó gãos ansplan ados, sujei os a imunossup essão ia ogénica induzida, e doen es
oncológicos, sujei os a quimio e apia e adio e apia [Ma sumo o & Yoshida 1986;
S inge 1996; Wake ield 2002; Thomas, J . & Limpe 2007]. Ainda du an e os anos 70,
do século passado, oi desen ol ida uma combinação de á macos, o
ime op im-sul ame oxazol (TMP-SMZ), que demons ou se e icaz no a amen o
con a a in ecção po P. ji o ecii, pe mi indo um maio con olo da pneumocis ose, e o
melho acompanhamen o do quad o clínico dos doen es [Hughes e al. 1974; Sa le e
al. 1988].
Com a epidemia da sínd oma de imunode iciência adqui ida (sida), no início dos
anos 80, a pneumocis ose, o nou-se numa das p eocupações undamen ais no
seguimen o dos doen es se oposi i os pa a VIH [Moe & Ha dy 1994; Wake ield 2002;
Walze e al. 2008]. An es de se ins i uída p o ilaxia e icaz, 80% dos doen es,
in ec ados po es e í us, desen ol ia, pelo menos, um episódio de PPc no deco e da
in ecção que, em 60% dos casos ep esen a a a doença de inido a de sida e, que pa a 20
a 25% des es doen es e a mo al [Ko acs e al. 1984; Dei-Cas 2000; Ba y & Johnson
2001; Mo is e al. 2004].
1. In odução ge al
- 5 -
Nos úl imos anos, os in es igado es consegui am p og essos signi ica i os na
p o ilaxia, no a amen o e no diagnós ico da PPc, p opo cionando des a o ma um
aumen o da espe ança média de ida dos doen es com sida. Nos países indus ializados,
o uso gene alizado de quimiop o ilaxia, es abelecido no início dos anos 90, do século
passado, e a in odução da HAART, em meados da mesma década, pe mi i am o
dec éscimo na incidência da PPc. Con udo, a pneumocis ose, pe manece como um
p oblema clínico impo an e, sendo uma das p incipais in ecções opo unis as que
a ec am os doen es se oposi i os pa a VIH [Ko acs e al. 2001; Mo is e al. 2004;
Cushion 2004]. Po ou o lado, ac ualmen e, pa e dos casos de PPc, ilus am
desigualdades no acesso aos cuidados médicos de algumas populações, ou g upos
sociais, em á ias egiões do globo, nos quais, é complicado o diagnós ico a empado e
e icaz da in ecção po VIH, que, mui as das ezes, é ei o quando os doen es
ap esen am já um quad o sin omá ico [Mo is e al. 2004; Walze e al. 2008].
1.2. Pe spec i a ac ual
Ac ualmen e, a inexis ência de um p ocesso sus en ado de cul i o de P. ji o ecii
é uma impo an e limi ação nas á ias á eas de es udo da PPc [S inge 1996; Wake ield
2002]. No en an o, a e olução e o ape eiçoamen o dos mé odos de diagnós ico
clássicos e a aplicação das no as écnicas na á ea da biologia molecula ie am pe mi i ,
não só, a melho ia na iden i icação de P. ji o ecii em amos as clínicas, como ambém,
o es udo da he e ogeneidade gené ica in e e in a-hospedei os. Es as e amen as
possibili am a iden i icação de di e en es ipos de P. ji o ecii e o econhecimen o de
de e minadas ca ac e ís icas molecula es associadas ao pe il epidemiológico e
pa âme os clínicos especí icos da PPc, ais como a dis ibuição geog á ica, esis ência a
á macos, g aus de se e idade da in ecção e modos de ansmissão [S inge & Walze
1996; Ma os 1999; Ko acs e al. 2001; Ba y & Johnson 2001; Cushion 2004; Cos a
2006; Thomas, J . & Limpe 2007; Beck & Cushion 2009].
2. Mo ologia e ciclo de ida
- 6 -
2. Mo ologia e ciclo de ida
2.1. In odução ao ciclo de ida de Pneumocys is ji o ecii
Pneumocys is é conside ado um agen e com dis ibuição ubíqua, encon ado,
com equência, numa g ande a iedade de mamí e os, incluindo o Homem.
Ocasionalmen e, es e pa ogénico opo unis a é causado de in ecção, em pa icula nos
hospedei os imunocomp ome idos, mani es ando-se po uma pneumonia se e a. Nes es
hospedei os, Pneumocys is em a capacidade de se ixa , especi icamen e, às células
epi eliais do ipo I do al éolo pulmona (pneumóci os do ipo I), onde se desen ol e
p og essi amen e, p eenchendo as ca idades al eola es, num p ocesso que conduz à
insu iciência espi a ó ia do hospedei o [Dei-Cas 2000; Alioua -Denis e al. 2008].
Os es ádios de desen ol imen o de Pneumocys is conhecidos, são obse á eis nos
al éolos pulmona es, mas ambém, o am já desc i os nou os ó gãos [Cohen &
S oeckle 1991; Ma os 1999].
As di iculdades no desen ol imen o de mé odos ep odu í eis de cul i o in i o
êm impedido o p og esso do conhecimen o do ciclo de ida des e mic o ganismo.
Os es udos sob e as es u u as celula es de Pneumocys is, baseados na obse ação de
ecido pulmona in ec ado, com ecu so à mic oscopia elec ónica ( igu a 1), são
conside ados, pela maio ia dos au o es, os que melho es esul ados ep oduzem [Va a
& Kuce a 1970; Campbell, J . 1972; Dei-Cas 2000; Alioua -Denis e al. 2008].
A maio ia des es es udos oi e ec uada endo em con a in ecções em ecidos humanos e
de a os, ou cul u as de cu a du ação de Pneumocys is isolados a pa i do pulmão.
A ní el expe imen al, não se e i ica am di e enças mo ológicas en e Pneumocys is de
a o e de humanos [Ru olo 1994].
2. Mo ologia e ciclo de ida
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Figu a 1. Secção de al éolo pulmona in ec ado po Pneumocys is. Na imagem, ob ida
po mic oscopia elec ónica (x16.000), pode obse a -se um o ozoí o (T) e um quis o
(Q) de Pneumocys is con endo seis co pos in aquís icos [Sidhu e al. 2003].
T ês es ádios mo ológicos di e en es são econhecidos no ciclo de ida de
Pneumocys is ( igu a 2): o o ozoí o ou o ma ó ica, o p é-quis o ou em al e na i a
espo ocis o, e o quis o, ambém designado po espo o. Com base nos es udos de
mic oscopia elec ónica, con i mou-se que, no al éolo pulmona dos hospedei os, a
o ma de o ozoí o dá o igem a um p é-quis o e que es e e olui pa a um quis o com
oi o co pos in aquís icos, os quais po sua ez, são libe ados, quando o quis o ompe.
Cada co po in aquís ico o igina um no o o ozoí o, que pode di idi -se po issão
biná ia, ou conjuga -se com ou o o ozoí o, e omando-se o ciclo [Va a & Kuce a
1970; Campbell, J . 1972; Ma sumo o & Yoshida 1986; Ru olo e al. 1989; Yoshikawa
& Yoshida 1989; Ru olo 1994; de Souza W. & Benchimol 2005].
2. Mo ologia e ciclo de ida
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Figu a 2. Rep esen ação esquemá ica do ciclo de ida de Pneumocys is ji o ecii no
al éolo pulmona . Exis em duas o mas p edominan es no ciclo de ida de P. ji o ecii,
a o ma ó ica e a o ma quís ica. É p opos o que os o ozoí os (haplóides) enham a
capacidade de se mul iplica em po issão biná ia, dominando a ase de ep odução
assexuada (A). Os o ozoí os podem conjuga -se, dando o igem a um p é-quis o
(diplóide), que e olui pa a a o ma quís ica, numa ase de ep odução sexuada do ciclo
de ida (B). Fo am obse ados, a a és de mic oscopia elec ónica, ês es ádios
in e médios dis in os da o ma quís ica de P. ji o ecii, con endo dois, qua o e oi o
núcleos, espec i amen e. É suge ido que os o ozoí os emanem dos co pos
in aquís icos (haplóides) dos quis os madu os, quando es es ompem [Ma sumo o &
Yoshida 1984; Ru olo e al. 1989; Ru olo 1994; Cushion 1998; Thomas, J . & Limpe
2007] (adap ado de Cushion 1998; Thomas, J . & Limpe 2007).
2. Mo ologia e ciclo de ida
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2.2. T o ozoí o ou o ma ó ica
En e 1984 e 1986, Ma sumo o e Yoshida [Ma sumo o & Yoshida 1984;
Yoshida e al. 1984; Ma sumo o & Yoshida 1986], eco endo ao es udo ul aes u u al,
desc e e am o ciclo de ida de Pneumocys is, com duas ases, uma assexuada, onde os
o ozoí os haplóides se mul iplica am po di isão celula , e ou a sexuada, onde se
pode ia obse a a o mação de co pos quís icos. Em 1989, Yoshida [Yoshida 1989]
e iu e con i mou o ciclo de ida de Pneumocys is como um ciclo sexuado que começa
com a up u a de um quis o madu o e a consequen e libe ação e desen ol imen o dos
o ozoí os.
Pa alelamen e, os o ozoí os, ou o mas ó icas, células haplóides, podem
mul iplica -se, de o ma al e na i a, a a és de um ciclo assexuado, po di isão biná ia
ou po endogenia. Disseminados no al éolo pulmona , os o ozoí os, ep esen am a
o ma ege a i a do mic o ganismo, co espondendo a pequenas o mas haplóides que
podem se iden i icadas li es, em sec eções b oncoal eola es, agoci adas po
mac ó agos ou ligadas aos pneumóci os do ipo I [Yoneda & Walze 1983; Ru olo
1994; Wea e e al. 1996]. T a a-se de uma célula que ap esen a uma o ma edonda, ou
elipsóide, medindo ce ca de 2 µm de diâme o, quando ecém-libe ada do quis o
( o ozoí o jo em).
Com a ma u ação, o o ozoí o a inge os 3-5 µm, adqui indo uma o ma mais
i egula , o nando-se uma célula polimó ica (amebóide ou pleomó ica) à medida que
en elhece. O o ozoí o madu o, possui um núcleo excên ico com um nucléolo de
pequenas dimensões e uma memb ana celula ina, com 20-50 nm de espessu a, ica em
coles e ol, o que in luencia a sua luidez. Es a memb ana ap esen a duas camadas
dis in as, uma camada in e na uni o me (memb ana plasmá ica) (35 nm), e uma camada
ex e na (15 nm), ica em an igénios de supe ície e, p o a elmen e, com impo an es
unções na egulação osmó ica e no anspo e de mac omoléculas. Nes a ase, o
o ozoí o madu o ap esen a es u u as ca ac e ís icas, inas e de amanho a iado que se
aduzem po saliências que i ompem da pa ede celula ( ilopódias). Es as expansões
ubula es o necem um aspec o elpudo à camada ex e na da memb ana celula e es ão,
mui o p o a elmen e, ligadas à ixação do o ozoí o aos pneumóci os do ipo I e/ou à
cap u a de nu ien es pa a a célula de Pneumocys is [Ma sumo o & Yoshida 1986;
2. Mo ologia e ciclo de ida
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Ru olo e al. 1989; De S e ano e al. 1990a; Ru olo 1994]. As inclusões
ci oplasmá icas ca ac e ís icas dos o ozoí os es ão ep esen adas na igu a 3.
Figu a 3. Rep esen ação esquemá ica das p incipais es u u as da o ma ó ica de uma
célula de P. ji o ecii (adap ado de de Souza W. & Benchimol 2005).
2.3. P é-quis o ou espo ocis o
O ciclo sexuado de Pneumocys is em seguimen o, quando, po conjugação, dois
o ozoí os madu os, dão o igem a um o ozoí o diplóide [Ma sumo o & Yoshida
1986]. Não se sabe, exac amen e, quais os ac o es que conduzem ao enquis amen o, ou
espo ogénese, oda ia, uma eo ia da ada de 1981, p opõe que o es ímulo pa a a
o mação de quis os pode á oco e quando o al éolo es á p eenchido de o ozoí os,
não ha endo a possibilidade de no os pa asi as ade i em aos pneumóci os pa a
ob enção de nu ien es [Hasle on e al. 1981].
3. Taxonomia
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bas an e in e essan e obse a que a sequência da p o eína do ac o de elongação 3
(EF3, do inglês Elonga ion Fac o 3), ca ac e ís ica de ungos, é idên ica, em 57%, à
sequência EF3 de S. ce e isiae [Ypma-Wong e al. 1992]. Os genes que codi icam as
enzimas imidila o sin e ase (TS) e dihid o ola o educ ase (DHFR), ambas enzimas da
ia biossin é ica do ácido ólico, encon am-se sepa ados em c omossomas dis in os, o
que con as a com o que sucede pa a os p o ozoá ios pa asi as ípicos, que englobam
es as duas ac i idades enzimá icas num único pép ido, que po sua ez é codi icado po
um único gene. Foi ambém obse ado que o gene que codi ica pa a a TS em 65% de
semelhança com o gene co esponden e nos Ascomyco a [Edman e al. 1989b]. Es udos
molecula es, de ca ac e ização dos genes de Pneumocys is que codi icam pa a a
α- ubulina e a β- ubulina, demons a am ele ada semelhança com os seus congéne es
dos ungos. O gene da β- ubulina ap esen a um pad ão ca ac e ís ico, com uma
homologia de 89 a 91% com o gene co esponden e dos ungos ilamen osos, e uma
homologia de 79 a 82% com os genes da β- ubulina de le edu as e de ou os
p o ozoá ios [Edlind e al. 1992; Zhang & S inge 1993]. Ou os es udos indicam que a
sequência 5S RNA (gene que codi ica pa a a sequência pequena do RNA da
subunidade g ande ibossomal) es á elacionada com a sequência co esponden e,
p esen e nos Zigomyco a [Wa anabe e al. 1989]. Os esul ados da análise do gene da
ATPase do ipo-P (ATP de adenosina i os a o) de Pneumocys is, uma enzima
anslocado a de p o ões, demons a am que es a pa ilha um domínio que é exclusi o
dos ungos [S inge e al. 1992; Meade & S inge 1995]. Também, ou os loci, como
são o caso do gene que codi ica pa a a enzima mul i uncional a om, esponsá el pela
sín ese de aminoácidos a omá icos, o gene que codi ica pa a a ac ina, o gene da p o eína
de ligação à sequência TATA e os genes que cons i uem o DNA mi ocond ial,
ap esen am maio semelhança com os ungos, do que com os p o ozoá ios [Pixley e al.
1991; Fle che e al. 1994; Bane ji e al. 1995; Sunkin & S inge 1995]. Po ou o lado,
genes elacionados com o ciclo de ida e com as espos as a si uações de s ess, es ão
p esen es no genoma de Pneumocys is, sendo que es udos labo a o iais pe mi i am
e i ica que alguns des es genes demons a am se uncionais, quando clonados em
S. ce e isiae e Schizosaccha omyces pombe [Fox & Smulian 2000; Ko om e al. 2000;
Smulian e al. 2001; Gus a son e al. 2001]. Em odos os casos es udados, os genes de
Pneumocys is e as p o eínas po eles codi icadas são semelhan es aquelas que os ungos,
3. Taxonomia
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de modo ge al, ap esen am pa a as mesmas unções. Com base nes es es udos o am
elabo adas á o es genealógicas, que pe mi i am es abelece a classi icação de
Pneumocys is como um euca io a memb o do Reino Fungi. Pneumocys is pe manece
como um dos mais enigmá icos o ganismos em es udo, com uma componen e
ilogené ica complexa e di ícil de de ini . A mais ecen e edição do dicioná io de ungos
segue a classi icação do Géne o Pneumocys is p opos a nos abalhos de E iksson e de
E iksson e Winka [Edman & Sogin 1994; E iksson 1994; E iksson & Winka 1997; Ki k
e al. 2001; Redhead e al. 2006]. A classi icação axonómica de Pneumocys is
encon a-se esumida na igu a 5.
Supe Reino: Euka yo a
Reino: Fungi
Sub- eino: Dika ya
Filo: Ascomyco a
Sub Filo: Taph inomyco ina
Classe: Pneumocys idomyce es
Subclasse: Pneumocys idomyce idae
O dem: Pneumocys idales
Família: Pneumocys idaceae
Géne o: Pneumocys is
Figu a 5. Rep esen ação esquemá ica ab e iada da classi icação axonómica de
Pneumocys is [S inge e al. 1992; Redhead e al. 2006; Beck & Cushion 2009].
3.2. He e ogeneidade gené ica
O ganismos de Pneumocys is isolados de di e en es espécies de hospedei os,
di e em en e si, que a ní el de enó ipo, que a ní el gené ico, suge indo a exis ência
de espécies dis in as. A ca ac e ís ica eno ípica, mais e iden e des as di e gências, é a
especi icidade pa a o hospedei o. Es udos labo a o iais, em di e sas espécies de
hospedei os, con i ma am que o ganismos de Pneumocys is, ob idos a pa i de um
hospedei o especí ico, são incapazes de causa in ecção num hospedei o di e en e,
pe mi indo es a ca ac e ís ica dis ingui Pneumocys is ob ido de di e en es hospedei os.
3. Taxonomia
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Ao con á io, quando o ganismos de Pneumocys is ob idos de um de e minado
hospedei o são ans e idos pa a ou o hospedei o da mesma espécie, e i ica-se
p oli e ação de Pneumocys is e o desencadeamen o de uma in ecção sin omá ica se e a
[Giglio i e al. 1993; Alioua e al. 1994; Bea d e al. 1999].
Com base em es udos eno ípicos, obse ou-se que Pneumocys is p o enien es
de hospedei os de espécies di e en es ap esen am an igénios de supe ície dis in os, não
ha endo, de um modo ge al, eacção c uzada en e an ico pos an i-Pneumocys is
isolados de um hospedei o e an igénios de Pneumocys is isolados de ou os hospedei os.
Po ém, an ico pos an i-Pneumocys is que êm eacção c uzada com an igénios de
Pneumocys is p o enien es de mais do que um hospedei o, econhecem di e en es
moléculas nos di e en es o ganismos de Pneumocys is, is o é, e i ica-se especi icidade
des es an ico pos pa a egiões molecula es (epi opos) dis in as en e Pneumocys is de
hospedei os di e en es [Ko acs e al. 1989b; Baue e al. 1993; Linke e al. 1994].
A a iabilidade eno ípica de Pneumocys is oi con i mada, eco endo-se à écnica de
sepa ação elec o o é ica de enzimas, seguida de a aliação da ac i idade enzimá ica
in si u, a qual pe mi iu demons a que Pneumocys is isolados de di e en es hospedei os,
p oduziam di e en es pad ões enzimá icos [Maza s e al. 1994; S inge 1996].
Com base nes es conhecimen os e em es udos de ca ac e ização gené ica, oi
inicialmen e p opos o um sis ema inominal dis inguindo os di e en es o ganismos do
Géne o Pneumocys is, onde mic o ganismos p o enien es de hospedei os di e en es são
designados como o mae specialis de P. ca inii [S inge e al. 1997], e lec indo a
o igem do pa asi a, al como o ep esen ado no quad o I. Após a classi icação de
Pneumocys is a ní el de Reino, os es udos molecula es ao DNA, que se lhe segui am,
esul a am na cons a ação de que Pneumocys is ob idos de di e en es espécies de
mamí e os são, conside a elmen e, di e en es. Os es udos ilogené icos, ealizados a
di e sas sequências de DNA de Pneumocys is isolados de á ios hospedei os,
con i mam a exis ência de ele ada he e ogeneidade, suge indo cla amen e que
Pneumocys is ob idos de di e en es hospedei os sejam o ganismos gene icamen e
dis in os. Es e g au de di e gência gené ica, pode mesmo aduzi -se pela exis ência de
espécies biológicas den o do Géne o Pneumocys is.
3. Taxonomia
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Quad o I. Exemplos da nomencla u a inomial pa a Pneumocys is ca inii. A neg i o
encon a-se a única o mae specialis que in ec a os humanos. Cada o ganismo
demons a uma sequência de DNA mi ocond ial p óp ia e dis in a. O ganismos de P.
ca inii que in ec am a mesma espécie de hospedei o são designados po
o mae specialis ( . sp.).
Espécies de Hospedei os Nome T inomial
Ra o P. ca inii . sp. ca inii
Ra o P. ca inii . sp. a us
Humano P. ca inii . sp. hominis
Ra inho P. ca inii . sp. mu is
Fu ão P. ca inii . sp. mus elae
Ca alo P. ca inii . sp. equi
Po co P. ca inii . sp. suis
Coelho P. ca inii . sp. o yc olagi
A di e gência gené ica en e os o ganismos do Géne o Pneumocys is icou
demons ada em es udos [Wake ield e al. 1990b; Pixley e al. 1991; Liu e al. 1992;
S inge e al. 1993b; Keely e al. 1994; Weinbe g & Du an 1994; Maza s e al. 1995;
Hun e & Wake ield 1996; Denis e al. 2000], onde se e i icou que:
1) Os c omossomas de Pneumocys is isolados de di e en es hospedei os mig am de
o ma di e enciada, quando subme idos à écnica de sepa ação elec o o é ica
em gel po campo pulsado;
2) Não há hib idização do DNA genómico de Pneumocys is isolado de a o com o
DNA genómico de Pneumocys is isolado de humano;
3) Po ções epe i i as de DNA, como os genes das amílias das glicop o eínas e das
p o eases de supe ície, p o enien es de Pneumocys is de di e sos hospedei os,
são al amen e di e gen es;
4) O gene que codi ica pa a a subunidade g ande do RNA mi ocond ial
(m LSU RNA) di e ge en e 4 e 27% en e Pneumocys is isolados de no e
espécies de hospedei os;
5) Todos os loci analisados demons am di e sidade gené ica em Pneumocys is
isolados de di e en es hospedei os.
3. Taxonomia
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O g au de di e gência gené ica, na sequência 18S do RNA, e i icado en e
o ganismos de Pneumocys is de di e en es hospedei os, é equi alen e a 140 bases
nucleo ídicas (8%). Ao con á io, espécies do Géne o Saccha omyces di e em en e si,
nesse locus, menos de 1% [Keely e al. 1994; Hun e & Wake ield 1996; Shah e al.
1996; S inge e al. 2002]. Num es udo que da a de 1994, uma equipe de in es igado es
clonou e sequenciou po ções dos genes 18S RNA, 5.8S RNA, e 26S RNA do RNA
nuclea , e as egiões ITS, do inglês in e nal ansc ibed space , do ope ão nuclea do
RNA. Nes e abalho sob e P. ji o ecii, as sequências nucleo ídicas dos genes que
codi icam pa a as subunidades ibossomais 18S, 5.8S e 26S mos a am 90% de
homologia ela i amen e às sequências co esponden es em P. ca inii de a o, enquan o
que as egiões ITS apenas ap esen a am 60% de homologia ela i amen e às egiões
equi alen es em P. ca inii de a o [Lu e al. 1994].
Es es no os dados de e mina am al e ações na nomencla u a e, em 1999,
apa eceu a p imei a nomencla u a binomial, p opos a po J. K. F enkel, e apoiada po
J. R. S inge , em que o o ganismo causado da pneumocis ose humana, an e io men e
designado po P. ca ini . sp. hominis, é econhecido como Pneumocys is ji o ecii, em
hon a ao pa asi ologis a checo O o Ji o eci, o p imei o in es igado a desc e e a
p esença des e mic o ganismo em humanos [F enkel 1999; S inge 2002]. Já em 1976,
F enkel, ha ia pe cebido que exis iam di e enças cla as en e Pneumocys is
p o enien es de humanos e de a os, publicando um abalho em que su gi am as
p imei as bases de sus en ação pa a es a impo an e al e ação na nomencla u a [F enkel
1976]. Apesa de o es esis ências a es as al e ações, em 2001, as e idências quan o à
exis ência de múl iplas espécies e ipos des e mic o ganismo conduzi am
necessa iamen e à acei ação consensual do no o sis ema de nomencla u a, em que
Pneumocys is cujo hospedei o é o homem é denominado po P. ji o ecii [S inge 2002;
S inge e al. 2002; Redhead e al. 2006]. A igu a 6 esume a di e gência ilogené ica
e olu i a de 12 di e en es espécies de Pneumocys is.
Mais ecen emen e, du an e a úl ima década, do século passado, su gi am linhas
de in es igação que endem a dis ingui ipos de P. ji o ecii gene icamen e di e en es
en e si. Es udos in a-especí icos apon am pa a a exis ência de a iações en e
Pneumocys is isolados a pa i de hospedei os de uma mesma espécie, que em animais,
que em humanos [Hong e al. 1990; Cushion e al. 1993; Lee e al. 1993; Wake ield e
3. Taxonomia
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al. 1994; Weinbe g e al. 1994]. Com base nes es dados, e com a en ada do no o
século, di e sas egiões polimó icas do genoma de P. ji o ecii êm sido es udadas com
o in ui o de cla i ica o pe il epidemiológico des e mic o ganismo, demons ando que a
ca ac e ização da di e sidade gené ica pode se ú il no es udo da sua dis ibuição
geog á ica, esis ência a á macos, i ulência e modos de ansmissão [Mille &
Wake ield 1999; A ms ong e al. 2000; Cos a e al. 2003; Ma os e al. 2003b; Bea d e
al. 2004; C o he s e al. 2005; Mille e al. 2007]. Es e ipo de in es igação, emá ica
cen al do p esen e abalho, i á se abo dada, com maio po meno , na segunda pa e do
abalho, secção 11.
Figu a 6. Máxima p obabilidade ilogené ica de Pneumocys is isolados de
12 hospedei os di e en es. Es a in e ência de elações ilogené icas (mé odo de análise
bayesiana) oi elabo ada com base nas sequências nucleo ídicas de dois genes de RNA
ibossomal (m LSU RNA e m SSU RNA) conca enados. Jun o aos nós de di e gência
encon am-se as pe cen agens co esponden es às p obabilidades in e idas pela análise
ilogené ica. As bi u cações com alo es in e io es a 50% não o am conside adas.
A ba a ep esen ada indica uma escala de 0.1 subs i uições po pa de bases (adap ado
de Alioua -Denis e al. 2008).
4. Me abolismo, bioquímica e ca ac e ís icas de supe ície
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4. Me abolismo, bioquímica e ca ac e ís icas de supe ície
4.1. In odução ao me abolismo ge al de Pneumocys is
Embo a do pon o de is a clínico, Pneumocys is e a pneumocis ose es ejam bem
ca ac e izados, a ní el bioquímico e me abólico, pouco se sabe ace ca do
mic o ganismo, do seu modus ope andi pa a ob enção de ene gia e de que o ma a sua
maquina ia celula es á o ganizada. Pensa-se que Pneumocys is é um o ganismo
sap ó i a, pois sin e iza e exc e a enzimas ex acelula es especí icas que ac uam,
especialmen e, sob e mac omoléculas, o iginando moléculas de amanho e peso
molecula mais eduzidos. De ido às pequenas dimensões, es as moléculas podem se
anspo adas a a és da memb ana celula e des a o ma in oduzidas na célula [Va a
& Kuce a 1970; Yoshida 1989]. A con i mação da ac i idade da os a ase ácida à
supe ície de o ozoí os e de quis os, bem como, a p esença de acúolos au o ágicos e
de lisossomas p imá ios, são ac os que supo am es a eo ia [I a ani & Ma shall 1988;
Palluaul e al. 1992]. Em odo o caso, não é conhecida ao ce o, qual a on e de
nu ien es do mic o ganismo, quando habi a o al éolo pulmona . Po ém, oi colocada a
hipó ese de os o ozoí os, ao ade i em às células hospedei as, e em a capacidade de
induzi a ac i ação do sis ema esicula de anspo e da memb ana plasmá ica dos
pneumóci os, endo es e p ocesso como consequência o o necimen o de nu ien es ao
pa asi a, a pa i dos capila es al eola es [Nielsen & Se nes 1991].
Ambien es com concen ações de O2 supe io es a 50% são óxicos pa a
Pneumocys is. O mic o ganismo consome baixos ní eis de O2, man endo-se iá el em
condições de hipoxia. Com excepção da supe óxido dismu ase, os ní eis de ac i idade
das enzimas an ioxidan es, como a glu a iono pe oxidase e a ca alase, apa en am se
baixos. Pneumocys is em, mui o p o a elmen e, um me abolismo ae óbio [Pesan i
1984; I a ani & Ma shall 1988; Yoshida 1989]. A p esença de mi ocônd ias suge e as
capacidades me abólicas ae óbias do mic o ganismo. A glucose é me abolizada pela ia
clássica da glicólise, mui o p o a elmen e, pela ia Embden-Meye ho , sequência
me abólica pela qual a glicose é oxidada, o iginando ácido pi ú ico, ATP e
nico inamida adenina dinucleó ido (NAD+, do inglês nico inamide adenine
dinucleo ide). Po ém, exis em e idências de á ias enzimas in eg an es da ia das
pen oses- os a o, ia al e na i a pa a a oxidação da glicose, du an e a qual é p oduzida
4. Me abolismo, bioquímica e ca ac e ís icas de supe ície
- 24 -
nico inamida adenina dinucleó ido hid o os a o (NADPH, do inglês nico inamide
adenine dinucleo ide hyd o phospha e) e ibose-5- os a o, molécula essencial pa a a
sín ese de ácidos nucleicos e de coenzimas, como ATP e NAD+. Es udos indicam,
ambém, a exis ência de enzimas do ciclo de K ebs, ia me abólica, que oco e na
ma iz da mi ocônd ia, e que u iliza o pi u a o, ob ido du an e a glicólise,
ans o mando-o em ace il coenzima A (ace il CoA). A ace il CoA eage com
oxaloace a o, o mando ci a o, que é p ocessado sucessi amen e a é à ob enção de
oxaloace a o. Es e p ocesso oxida i o pe mi e a ans e ência de elec ões que eduzem
as moléculas de NAD+ em NADH. No inal, o oxaloace a o é egene ado, epe indo-se o
ciclo. A p esença de componen es da cadeia anspo ado a de elec ões, localizada na
memb ana in e na das mi ocônd ias, con i ma a possibilidade de oco ência de
os o ilação oxida i a, que consis e na os o ilação de adenosina di os a o (ADP) em
ATP, a a és de uma sucessão de eacções de oxidação- edução [Pesan i & Cox 1981;
Maze e al. 1987; Kaneshi o & Sleigh 1994; Sul & Kaneshi o 1997; Kaneshi o 1998].
Ou os es udos indicam que o me abolismo das poliaminas, moléculas implicadas na
eplicação de DNA, pa ece se undamen al pa a a p oli e ação e di e enciação celula es
de Pneumocys is [Lipschik e al. 1991; Kaneshi o & Sleigh 1994].
4.2. Hid a os de ca bono
A glucose é o p incipal polissacá ido da pa ede celula , encon ando-se, ambém,
p esen es a galac ose e a manose, em igual pe cen agem e, em meno pe cen agem, a
ibose, a N-ace il-D-glucosamina e o ácido siálico. Es es açúca es desempenham,
p o a elmen e, unções es u u ais ligadas à pe meabilidade da pa ede celula dos
quis os e à adesão e in e acção pa asi a-hospedei o [Pesan i & Cox 1981; De S e ano e
al. 1990a; Ga ne e al. 1991]. O β-1,3-glucano, molécula in eg an e da pa ede celula
dos quis os de Pneumocys is, pa ece se esponsá el pela solidez e igidez des a
es u u a. Po seu lado, a qui ina oi de ec ada nas á ias o mas mo ológicas do ciclo
de ida do o ganismo, pa ecendo con e i igidez e esis ência à pa ede celula
[Ma sumo o e al. 1989; Walke e al. 1990; Ga ne e al. 1991].
4. Me abolismo, bioquímica e ca ac e ís icas de supe ície
- 25 -
4.3. Lípidos
O ci oplasma dos o ozoí os demons a g andes ese as lipídicas, ao con á io
dos co pos in aquís icos, onde es as ese as são p a icamen e inexis en es [Yoshida
1989]. Es udos e ec uados em Pneumocys is, isolado de pulmão de a o, demons a am
que o coles e ol é o es e ol mais abundan e [Kaneshi o & Sleigh 1994; Zhao e al.
2003]. Es udos in i o mos a am que quando células de Pneumocys is es abelecem
con ac o com células epi eliais al eola es dos hospedei os, conseguem in e io iza , nas
suas ese as, lípidos p o enien es que , do meio ci cundan e, que das p óp ias células
epi eliais [De S e ano e al. 1990b; Pauls ud & Queene 1994; Kaneshi o & Sleigh
1994]. Po ou o lado, êm, ambém, a capacidade de sin e iza lípidos especí icos, em
pequenas quan idades, de o ma a ga an i as suas unções e necessidades i ais. Quan o
à composição da pa ede quís ica, é in e essan e e i ica que es a é cons i uída po ce ca
de 50% de hid a os de ca bono e po ce ca de 50% de lípidos, suge indo, es e ac o, que
es es êm impo ância ulc al na es u u a da célula de P. ji o ecii [Campbell, J . 1972;
S inge e al. 1992].
4.4. P o eínas
A de ecção de uma ATPase ansmemb ana , que unciona como uma bomba de
p o ões, conduziu à eo ia de que es a enzima é esponsá el pela manu enção de um
g adien e de p o ões (H+) que pe mi e um mecanismo de anspo e memb ana de
nu ien es, como aminoácidos e glucose, pa a o in e io da célula de Pneumocys is
[Pesan i & Cox 1981; Meade & S inge 1991]. A iden i icação ul aes u u al de
mic o úbulos, suge e a p esença de monóme os de ubulina, cuja exis ência oi
con i mada po es udos molecula es que iden i ica am os genes que codi icam, pa a a
α- e β- ubulina [Edlind e al. 1992; Zhang & S inge 1993]. Enzimas com unções
undamen ais, ais como a a om, a imidila o sin e ase (TS) e a io edoxina educ ase
(TRR), o am ambém iden i icadas e ca ac e izadas com ecu so a mé odos
molecula es [Edman e al. 1989b; Bane ji e al. 1995; Ku y e al. 2003].
O mic o ganismo é incapaz de abso e ola os do meio ex e no, possuindo uma ba e ia
de enzimas que pe mi em a sín ese de ola os de no o, como é o caso da dihid op e oa o
sin e ase (DHPS) e da dihid o ola o educ ase (DHFR) [Alleg a e al. 1987; Hong e al.
1995].
4. Me abolismo, bioquímica e ca ac e ís icas de supe ície
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4.5. P op iedades an igénicas de supe ície
A pa ede celula de P. ji o ecii é compos a po uma complexa ma iz de hid a os
de ca bono e p o eínas es u u ais que, se pensa, es a em em cons an e luxo, du an e a
ase de eplicação e os es ádios de desen ol imen o do mic o ganismo ( igu a 7).
As p incipais p o eínas an igénicas de supe ície de P. ji o ecii, encon adas, que nos
o ozoí os, que nos quis os, são as MSG, que ep esen am a g ande maio ia dos
an igénios da supe ície das células des e o ganismo, e que e idenciam es a em
en ol idas na in e acção pa asi a-hospedei o [Linke e al. 1989; Ku y e al. 2001;
S inge 2007; Es e es e al. 2009].
Figu a 7. Rep esen ação esquemá ica da composição da pa ede celula de P. ji o ecii.
Na supe ície celula , pode-se obse a a abundância dos an igénios ípicos de
P. ji o ecii, as glicop o eínas de supe ície MSG. A ma iz de β-1,3-glucano e qui ina
con e e es abilidade es u u al e igidez à pa ede celula (adap ado de Thomas, J . &
Limpe 2007).
5. Epidemiologia da in ecção po Pneumocys is ji o ecii
- 33 -
p opagação bas an e iá el pa a a pneumocis ose [Singe e al. 1975; Fenelon e al.
1985; Goesch e al. 1990; Ba le e al. 1996; Olsson e al. 1996b]. Ao in es iga em as
ca ac e ís icas gené icas do DNA isolado a pa i do a dos qua os dos doen es com
PPc, os au o es desses es udos, depa a am-se com o ac o de que os genó ipos dessas
amos as e am coinciden es com os genó ipos isolados a pa i das amos as biológicas
ecolhidas dos doen es, suge indo a ia aé ea como um po encial mecanismo de
ansmissão de P. ji o ecii e um impo an e ac o a e em con a, especialmen e nos
locais onde podem co-habi a doen es imunocomp ome idos e doen es com PPc
[Ba le e al. 1996; Olsson e al. 1996b].
O isco de ansmissão nosocomial é ambém e iden e, pois, es udos se ológicos
indicam um aumen o do í ulo de an ico pos sé icos an i-P. ji o ecii no pessoal
hospi ala , que man ém con ac o com doen es com co-in ecção VIH/P. ji o ecii [Leigh
e al. 1993; Lundg en e al. 1997]. A ansmissão en e doen es com PPc e ou os
doen es imunocomp ome idos e, en e doen es com PPc e pessoal hospi ala , oi
con i mada po es udos molecula es que, de ido à sua ele ada sensibilidade, pa a além
de pe mi i em ca ac e iza as amos as dos doen es imunocomp ome idos, pe mi i am
ambém de ec a e geno ipa P. ji o ecii nas amos as do pessoal hospi ala ,
imunocompe en e. Es es abalhos de in es igação indicam que o pessoal médico pode
se po ado de P. ji o ecii e ep esen a uma po encial on e de in ecção pa a os
doen es imunocomp ome idos [Va gas e al. 2000; Mille e al. 2001; Rabodoni ina e
al. 2004; Hocke e al. 2005].
Es udos molecula es, baseados em écnicas sensí eis, pe mi i am a de ecção de
P. ji o ecii em amos as biológicas de pessoas hospi alizadas, se onega i as pa a VIH,
sem imunossup essão se e a. Foi ambém demons ado expe imen almen e, u ilizando o
modelo animal, que em de e minadas condições, o mic o ganismo em a capacidade de
se mul iplica , ansi o iamen e, nos pulmões de hospedei os imunocompe en es. Es e
g upo de hospedei os ep esen a, po um lado, uma impo an e on e de ansmissão po
ia aé ea pa a os imunocomp ome idos suscep í eis, e po ou o, uma impo an e
ese a de Pneumocys is [Mon es-Cano e al. 2004; Chabe e al. 2004; Pe e son &
Cushion 2005; Ma os e al. 2006]. Ou os es udos, ealizados em espécimes pulmona es
humanos, p o idencia am in o mação adicional que suge e a ansmissão des e agen e
in eccioso po ia aé ea, a pa i de uma on e in ecciosa exógena comum, ou en ão, a
5. Epidemiologia da in ecção po Pneumocys is ji o ecii
- 34 -
ansmissão a pa i de hospedei os colonizados, ou po ado es assin omá icos
(se oposi i os ou se onega i os pa a VIH) pa a hospedei os suscep í eis [Mille e al.
2002; Ri e o e al. 2008].
A ansmissão e ical de P. ji o ecii, apesa de con o e sa, oi suge ida pa a os
humanos [Mo ie e al. 1995; Hughes 1995a]. A oco ência des e modo de ansmissão
pa ece a ia con o me a espécie do mamí e o hospedei o. A ansmissão
ansplacen á ia oi demons ada em coelhos, no en an o, em es udos e ec uados nou os
oedo es, pa ece se um enómeno a o [Ce e e al. 1997; Hong e al. 1999; Sanchez e
al. 2007]. Recen emen e, um es udo molecula pa a a aliação da ansmissão e ical de
P. ji o ecii em humanos, oi e ec uado em placen as e ecido de pulmão de e os
abo ados po mulhe es imunocomp ome idas, pe mi indo conclui que, e ec i amen e,
a ansmissão de P. ji o ecii pode oco e da mãe pa a o e o, a a és da ia
ansplacen á ia [Mon es-Cano e al. 2009].
Pneumocys is que in ec a um de e minado hospedei o, apenas é capaz de causa
doença nesse mesmo hospedei o. A in ecção po Pneumocys is ap esen a especi icidade
en e a espécie do pa asi a e o espec i o hospedei o, is o é, o mic o ganismo que
in ec a os humanos, P. ji o ecii, é di e en e de Pneumocys is que in ec am ou os
mamí e os, não podendo a in ecção se adqui ida a pa i de um ese a ó io animal
[Giglio i e al. 1993; S inge & Walze 1996; Wake ield 2002]. Exis em inúme os
abalhos de in es igação que indicam a ansmissão di ec a de P. ji o ecii de
pessoa-a-pessoa. A e idência de ansmissão de P. ji o ecii en e imunocompe en es e
imunocomp ome idos, a in ecção po P. ji o ecii em ecém-nascidos e c ianças, e a
possí el associação en e a in ecção po P. ji o ecii e a sínd oma de mo e súbi a
in an il, apoiam, de ce a o ma, a eo ia de ansmissão pessoa-a-pessoa [Pi e e al.
1978; Va gas e al. 1999; Va gas e al. 2000; Va gas e al. 2001].
A exis ência de ese a ó ios ambien ais de P. ji o ecii não es á colocada de
pa e, acei ando-se que es e mic o ganismo se encon e dis ibuído pelo ambien e.
O DNA de Pneumocys is, isolado do Homem e do a o, oi, ambém, de ec ado em
amos as ambien ais de a e de água, sem que, no en an o, enham sido iden i icadas
o mas mic oscópicas ípicas des e mic o ganismo. Alguns au o es suge em que o solo
ambém possa se um ese a ó io pa a Pneumocys is, uncionando como uma on e de
con aminação e de ansmissão pa a os hospedei os [Wake ield 1996; Casano a-Ca diel
5. Epidemiologia da in ecção po Pneumocys is ji o ecii
- 35 -
& Leibowi z 1997; Ba le e al. 1997; Lundg en & Wake ield 1998; Dei-Cas 2000;
Na in e al. 2000].
5.3. La ência e sus ein ecção
Du an e décadas pensou-se que os casos de PPc e am esul ado da eac i ação
de in ecção la en e no al éolo pulmona . O modelo e iológico da PPc em adul os
suge ia que odas as pessoas e am in ec adas du an e a in ância, e que, os episódios de
PPc esul a am da eac i ação de uma in ecção la en e. De ido à ele ada
se op e alência de an ico pos an i-P. ji o ecii em c ianças a é aos dois anos de idade,
p esumia-se que os o ganismos la en es e am adqui idos pelos hospedei os ainda em
en a idade [Pi e e al. 1978; Peglow e al. 1990; Hughes 1998].
Uma ez adqui ido, P. ji o ecii pode man e -se no pulmão do hospedei o
imunocompe en e sem causa sin oma ologia, pois o sis ema imuni á io con ola com
sucesso a in ecção clínica, mas não elimina o mic o ganismo [Ne ez e al. 1997; Sing e
al. 1999; Chabe e al. 2004; Ma os e al. 2006]. Apenas em si uação de
imunossup essão, a in ecção la en e eac i a-se e causa doença. A PPc oco e com
ele ada p e alência em subg upos especí icos da população, como po exemplo, em
doen es com sida. A hipó ese de la ência, oi conside ada álida, pois, na al u a, não
ha ia e idência de que pode iam exis i ou os subg upos da população que
uncionassem como po ado es de P. ji o ecii. Inicialmen e, a descobe a da capacidade
de a iação an igénica de supe ície de P. ji o ecii, ansmi iu a ideia de que o
mic o ganismo e ia co-e oluído de o ma a habi a os al éolos pulmona es do
hospedei o du an e um longo pe íodo de empo. Também a especi icidade pa a o
hospedei o suge e co-e olução do pa asi a e do hospedei o, implicando um longo
pe íodo de con ac o en e o mic o ganismo in ec an e e o hospedei o [Cushion 1994;
S inge & Walze 1996; Wake ield 2002; Alioua -Denis e al. 2008].
Resul ados de di e sos es udos supo am a ideia de que P. ji o ecii pode se
adqui ido de no o, con a iando a in ecção la en e como p incipal mecanismo de
in ecção. In o mação ecolhida em es udos epidemiológicos em humanos e no modelo
animal, demons am que o hospedei o consegue elimina Pneumocys is do seu
o ganismo, e u ando a hipó ese de que o pa asi a pe manece no pulmão do hospedei o
po um pe íodo de empo inde e minado [Chen e al. 1993; Va gas e al. 1995].
5. Epidemiologia da in ecção po Pneumocys is ji o ecii
- 36 -
Recen emen e, em alguns es udos onde o am aplicadas écnicas molecula es mui o
sensí eis e especí icas, não oi possí el de ec a P. ji o ecii em imunocompe en es
saudá eis. Es es es udos o am ealizados em amos as do apa elho espi a ó io, ecido
pulmona e sec eções pulmona es, e em amos as pos -mo em de pulmões, usando
écnicas imuno-his oquímicas e de ampli icação de DNA [Pe e s e al. 1992; Oz &
Hughes 2000].
A dis ibuição geog á ica cosmopoli a e o apa ecimen o de pequenos su os
pon uais de pneumocis ose, em g upos especí icos e es i os de hospedei os
imunocomp ome idos, indicam que, p o a elmen e, se es á pe an e enómenos de
ein ecção, com no os mic o ganismos, e não de eac i ação de P. ji o ecii adqui ido
na in ância [Singe e al. 1975; Chusid & Hey man 1978; Jacobs e al. 1991; Cushion
1994; S inge & Walze 1996]. A ein ecção po P. ji o ecii, po exposição a uma
on e de con aminação exógena, é um enómeno comum. A análise molecula ao DNA
de P. ji o ecii, em doen es se oposi i os pa a VIH com episódios eco en es de PPc,
demons ou, que em alguns des es doen es, os genó ipos iden i icados no segundo e
subsequen es episódios e am di e en es dos genó ipos de ec ados du an e o p imei o
episódio, suge indo ein ecção po di e en es mic o ganismos. A cons a ação da
al e ação de genó ipos en e os episódios de pneumocis ose e o ça a ideia de que a
in ecção pode se adqui ida de no o, em ez de se esul ado da eac i ação de uma
in ecção adqui ida an e io men e [Tsolaki e al. 1996; Keely & S inge 1997; La ouche
e al. 1997b]. Es udos populacionais molecula es demons a am que os pad ões de
dis ibuição das equências alélicas de isolados de P. ji o ecii es ão mais o emen e
associadas com o local onde o diagnós ico é ei o, do que com o local de nascimen o
dos hospedei os in ec ados. A elação da a iação geog á ica de dis ibuição de
genó ipos com o local de esidência dos hospedei os, indica um con ac o ecen e en e o
agen e pa ogénico e os hospedei os, an es des es desen ol e em PPc. [Dohn e al. 2000;
Bea d e al. 2000].
A cla i icação da ansmissão da in ecção é undamen al pa a que sejam
econhecidos odos os iscos pa a os doen es imunocomp ome idos. Se a in ecção o
la en e, não ha e á necessidade de p o ege os doen es adul os, de al o isco, e os
es udos de ansmissão da in ecção de em es ingi -se às c ianças. Toda ia, se a PPc é
causada po uma on e exógena, po in ecção de no o de P. ji o ecii, se á ap op iado
5. Epidemiologia da in ecção po Pneumocys is ji o ecii
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desen ol e es o ços pa a iden i ica as on es de con ágio, e i ando que os doen es de
al o isco sejam expos os às mesmas [S inge & Walze 1996; Ba y & Johnson 2001].
6. Ap esen ação clínica da pneumocis ose
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6. Ap esen ação clínica da pneumocis ose
6.1. In odução à in ecção po Pneumocys is ji o ecii
A in ecção po P. ji o ecii é conside ada como opo unis a, comum em doen es
com sida e ou os imunocomp ome idos, endo ganho especial impo ância no início da
década de 80, do século passado. An es de 1985, a sob e i ência de um doen e com um
episódio de PPc e a de 50%. De ido à con ínua deg adação do es ado de saúde dos
doen es com sida, 60% dos que ecupe a am de um caso de PPc, ol a am a padece da
doença. A se e idade da in ecção pulmona p o ocada pelo mic o ganismo azia com
que a maio ia dos doen es necessi asse de supo e de en ilação mecânica em unidades
de cuidados in ensi os. Em alguns locais, a axa de mo alidade po PPc, nos doen es
com supo e de en ilação ul apassa a os 80% [Ko acs e al. 1984; Wach e e al.
1986; Dohn e al. 1992]. G ande pa e da in es igação e ec uada na á ea da sida
ocou-se na p oblemá ica da pneumocis ose, a in ecção opo unis a que mais a ec a a os
doen es se oposi i os pa a VIH. Es es es o ços conduzi am a me odologias de
diagnós ico, de p o ilaxia e de a amen o mais e icazes.
Com os egimes p o ilá icos e a implemen ação de e apias an i e o i ais, os
doen es passa am a i e mais empo e com uma melho qualidade de ida [Moe &
Ha dy 1994]. Pe manecem po escla ece as azões pelas quais alguns doen es so em
de g aus mode ados de PPc, com espos a a o á el aos á macos an i-P. ji o ecii,
enquan o ou os so em de PPc se e a, que pode se a al, apesa da e apia.
A oco ência de casos de insucesso e apêu ico indica que de e minados isolados de
P. ji o ecii podem se mais i ulen os ou esis en es. Toda ia, ac o es elacionados
com o hospedei o ambém êm sido la gamen e es udados e associados à mo bilidade e
mo alidade causadas pela pneumocis ose [Ba y & Johnson 2001; Walze e al. 2008].
Na ausência de um sis ema ep odu í el e iá el de cul u a de P. ji o ecii, as espos as a
es as ques ões êm indo a se in es igadas a a és de es udos clínicos e
epidemiológicos.
6. Ap esen ação clínica da pneumocis ose
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6.2. In ecção pulmona po Pneumocys is ji o ecii
Dadas as ca ac e ís icas de P. ji o ecii e a sua a inidade pa a pa asi a os
pneumóci os do ipo I dos al éolos pulmona es, as mani es ações pulmona es são as
mais equen es numa in ecção causada po es e mic o ganismo. No hospedei o com
sis ema imuni á io in ac o, o con olo da in ecção é a eg a, não ha endo consequências
clínicas, mas quando o sis ema imuni á io se encon a agilizado, aumen a,
conside a elmen e, a p obabilidade des e mic o ganismo se o na ac i o e se
desen ol e . Após es abelece a in ecção no pulmão de um doen e
imunocomp ome ido, o pa asi a des ói as células hospedei as p omo endo o
consequen e p ocesso in lama ó io, que p o oca hipoxemia e que pode culmina na
mo e do hospedei o, po insu iciência espi a ó ia g a e [Yoneda & Walze 1983; Moe
& Ha dy 1994; Thomas, J . & Limpe 1998; Alioua -Denis e al. 2008].
Os sin omas ípicos de um doen e com PPc são a eb e, en e 38ºC e 40ºC, em
mais de 80% dos doen es, a osse não p odu i a, em mais de 50% dos doen es, podendo
se acompanhada de expec o ação em 20 a 30% dos casos, e a dispneia de ag a amen o
p og essi o, em mais de 60% dos doen es, podendo su gi , po ezes, e o es
c epi an es disc e os. Es e quad o clínico oco e du an e um pe íodo que pode i de uma
a ês semanas [Ko acs e al. 1984; Moe & Ha dy 1994; Dohn & F ame 1994; Ko acs
e al. 2001; Ba y & Johnson 2001].
Pa a além des es sin omas, que cons i uem o quad o clínico ípico da
pneumocis ose pulmona , pode ainda, se obse ada aquipneia, aquica dia, e
ocasionalmen e cianose, podendo, no en an o, a auscul ação se no mal. Exis em casos
em que a PPc pode “imi a ” a asma, em e mos de sin oma ologia [Schnippe e al.
1993; Ba y & Johnson 2001]. Nos doen es se oposi i os pa a VIH podem ainda se
obse ados ou os sin omas, ais como, emag ecimen o, do es o ácicas, as enia e suo es
noc u nos, elacionados com a e olução da doença e à passagem do es ádio de ARC, do
inglês AIDS ela ed complex, pa a o es ádio de sida [Engelbe g e al. 1984; Ma os
1999]. Nos indi íduos com co-in ecção VIH/P. ji o ecii, á ias semanas podem
p ecede a sin oma ologia da PPc, a asando o diagnós ico. Ao con á io do modo
insidioso como a PPc se ins ala nos doen es com sida, nos imunocomp ome idos,
se onega i os pa a VIH, a in ecção e olui, apidamen e, pa a a insu iciência espi a ó ia
aguda, acompanhada po uma sin oma ologia mais exube an e, embo a semelhan e à do
6. Ap esen ação clínica da pneumocis ose
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doen e se oposi i o pa a VIH [Ko acs e al. 1984; Moe & Ha dy 1994; Dohn & F ame
1994].
O adiog ama ao ó ax, ípico de um doen e com PPc, ap esen a em 40 a 80%
dos casos, uma imagem clássica que se aduz po um pad ão de in il ado in e s icial
di uso e bila e al [Fo es 1972; Ko acs e al. 1984; Moe & Ha dy 1994]. Po ém, os
pad ões adiológicos podem se a ípicos em 6 a 20% dos casos de PPc. Assim, o exame
adiológico pode ap esen a in il ados in e s iciais unila e ais ou localizados,
pneumo ó ax, localização nos lobos supe io es ou a é apicais, imagens ca i á ias ou de
abcessos e, embo a a amen e, de ame pleu al [Edels ein & McCabe 1990; Pas o es e
al. 1996; C ans, J . & Boiselle 1999]. G ande pa e dos casos de pneumocis ose, com
ap esen ação adiológica a ípica, es ão pa icula men e elacionados com a p o ilaxia
com pen amidina em ae ossol, e i icando-se o a ança da in ecção em á eas menos
ae ossolizadas, o que e lec e, mui o p o a elmen e, a dis ibuição desigual des e
á maco no pulmão [Edels ein & McCabe 1990; Ba y & Johnson 2001]. Alguns
es udos indicam mesmo que, en e 10 e 20% dos casos, o adiog ama do ó ax pode
ap esen a uma imagem no mal [Ko acs e al. 2001; Ba y & Johnson 2001]. Num
ou o es udo, onde se compa am os exames adiog á icos de doen es com PPc e a
se e idade da doença, em e mos clínicos, os au o es obse a am que o adiog ama do
ó ax no mal es a ia associado com casos menos se e os de PPc e com uma meno axa
de mo alidade [Op a il e al. 1994].
6.3. In ecção ex apulmona po Pneumocys is ji o ecii
A p esença de P. ji o ecii em indo a se desc i a nou os ó gãos e/ou ecidos
(sis ema lin á ico e hema opoié ico, glândulas endóc inas, mesen é io, apa elho
gas in es inal, co ação, ígado, baço, medula óssea, ins, músculo, pele, sangue,
meninges, có ex ce eb al, globo ocula e apa elho audi i o), e ge almen e, es as
mani es ações ex apulmona es só são descobe as quando se eco e a au ópsia [Cohen
& S oeckle 1991; Telzak & A ms ong 1994; Ng e al. 1997]. As localizações
ex apulmona es da in ecção po P. ji o ecii são a as e ge almen e concomi an es com
localização pulmona do mic o ganismo, suge indo disseminação sis émica, a pa i do
pulmão, em casos de imunossup essão mui o g a e, ausência de p o ilaxia ou p o ilaxia
com pen amidina. A hipó ese de disseminação oi já demons ada no deco e de um
6. Ap esen ação clínica da pneumocis ose
- 41 -
es udo em a os imunocompe en es, suge indo se a e olução na u al da in ecção no
hospedei o [Cha y-Reddy & G a es 1996; Rabodoni ina e al. 1997].
Apesa de não se conhecida, ao ce o, qual, ou quais, as ias de disseminação
do mic o ganismo, coloca-se a hipó ese des e enómeno oco e pela ia lin á ica e/ou
pela ia hema ógena, pois, os locais mais comuns de de ecção ex apulmona de
P. ji o ecii são os nódulos lin á icos, baço, ígado e medula óssea [Ra iglione 1990;
Telzak & A ms ong 1994]. Po ém, já o am desc i os casos de pneumocis ose,
unicamen e, ex apulmona , con i mando a possibilidade de que o enómeno de
disseminação não é ob iga ó io pa a que oco a es e ipo de in ecção po P. ji o ecii
[Ra iglione 1990; Ellison e al. 1995; Te is e al. 1996; Ng e al. 1997].
A é à da a, não es á de inido se os doen es com sida êm maio p obabilidade de
desen ol e pneumocis ose ex apulmona do que os doen es imunocomp ome idos,
se onega i os pa a VIH. No en an o, an es do início da pandemia de sida, es udos
e ospec i os de au ópsias em doen es com PPc, apenas pe mi i am de ec a um caso de
in ecção ex apulmona . A acompanha a pandemia de sida, e i icou-se, ambém, um
aumen o cla o dos casos de pneumocis ose ex apulmona . Calcula-se que a incidência
da in ecção ex apulmona po P. ji o ecii, em doen es se oposi i os pa a VIH, se si ue
en e os 2 e os 3% [Ra iglione 1990; Cohen & S oeckle 1991; Telzak & A ms ong
1994; Ng e al. 1997]. Es as pe cen agens pode ão es a subes imadas, pois o
diagnós ico des es casos é bas an e di ícil de es abelece . Po ou o lado, os doen es com
sida, ac ualmen e, êm maio espe ança de ida, sob e i endo du an e mais empo,
a ingindo ní eis mui o baixos de imunidade, podendo, po isso, es a mais suscep í eis
ao enómeno de disseminação de P. ji o ecii [Ha is 1990; Ng e al. 1997].
7. Fisiopa ologia
- 42 -
7. Fisiopa ologia
7.1. In e acção pa asi a-hospedei o
Tal como qualque doença in ecciosa, a pneumonia po Pneumocys is en ol e
uma in e acção complexa en e o mic o ganismo pa ogénico e o hospedei o.
A pa ogenicidade de P. ji o ecii pode se di idida em qua o es ádios [Walze P.D.
1994; Ma os 1999; Thomas, J . & Limpe 2007]:
1) Es abelecimen o da in ecção, quando o mic o ganismo pene a no apa elho
espi a ó io do homem, deposi ando-se no al éolo pulmona e ade indo às
células epi eliais do ipo I, sem in asão do epi élio;
2) P oli e ação do agen e in eccioso, cujo ac o p edisponen e p incipal é a
de iciência na imunidade celula ;
3) Al e ações no meio al eola , (I) numa p imei a ase (alguns dias após a
in ecção), após a ligação dos o ganismos de P. ji o ecii às células epi eliais ipo
I do al éolo pulmona , obse am-se al e ações celula es e eacção in lama ó ia
acompanhada de lesões limi adas, (II) numa segunda ase (após uma a duas
semanas de e olução), obse am-se aspec os ca ac e ís icos da in ecção, como
o apa ecimen o de um exsudado espumoso, a ejado, eosinó ilo ico em
mac ó agos, que p eenche uni o memen e o al éolo, (III) numa e cei a ase
(após ês a qua o semanas de e olução), obse am-se lesões ocais de nec ose
das células epi eliais do ipo I, hipe o ia das células al eola es e
p eenchimen o do espaço al eola po células de descamação e P. ji o ecii;
4) Respos a imunológica, em que as MSG, o β-1,3-glucano e a manose
desempenham um papel undamen al na in e acção P. ji o ecii-células do
hospedei o e no econhecimen o pelos lin óci os e mac ó agos.
Um passo c ucial pa a o es abelecimen o da in ecção é a ade ência de
Pneumocys is às células do ecido hospedei o. P. ji o ecii es abelece con ac o com as
células do ipo I do al éolo pulmona , e de e minadas moléculas, como as ib olec inas,
a laminina e a ma iz ex acelula , es ão implicadas no p ocesso. A o mação de
aglome ados ípicos de células de P. ji o ecii, conhecidos po “cachos”, ca ac e ís icos
des e pa asi a, bem como a adesão dos o ozoí os às células hospedei as, são mediadas,
8. Diagnós ico
- 49 -
8. Diagnós ico
8.1. In odução ao diagnós ico da pneumocis ose
A é à década de 80 do século passado, a pneumocis ose e a conside ada uma
doença a a, mas po encialmen e mo al, que a ec a a doen es imunocomp ome idos,
ais como ecep o es de ó gãos ansplan ados, doen es oncológicos subme idos a
quimio e apia, indi íduos com doenças au oimunes e c ianças malnu idas.
Ve i ica a-se que a PPc e oluía apidamen e nes es doen es, o nando-se, em mui os
dos casos, uma pneumonia ulminan e numa ques ão de dias [Sepkowi z 1993; Cushion
2004; Pe e son & Cushion 2005]. E a comum que o diagnós ico osse e ec uado de
o ma in asi a pa a o doen e, no malmen e a a és de biopsias pulmona es. O ad en o
da sida eio aumen a de o ma exponencial a oco ência de casos de pneumocis ose.
An es da implemen ação da p o ilaxia an i-P. ji o ecii, es a in ecção opo unis a
lide a a a lis a das causas de mo e nos doen es se oposi i os pa a VIH, mas,
ac ualmen e, a PPc é, na esmagado a maio ia dos casos, acilmen e diagnos icá el,
sendo, ambém, possí el eco e a a amen os e icazes, o que az eduzi a mo bilidade
e a mo alidade p o ocadas po P. ji o ecii [Ba y & Johnson 2001].
Sabe-se que a ap esen ação da pneumocis ose es á dependen e da doença
imunossup essi a adjacen e, pois, ao longo dos anos, os clínicos e i ica am que nos
doen es com sida, mais de 25 dias podem p ecede a sin oma ologia da PPc, o nando o
diagnós ico mais di ícil do que nos doen es com ou as imunode iciências, em que os
sin omas su gem num in e alo de empo en e os 5 e os 10 dias [Ko acs e al. 1984;
Dohn & F ame 1994; Dei-Cas 2000]. O diagnós ico clássico e de ini i o da PPc
baseia-se na obse ação mic oscópica de P. ji o ecii em sec eções pulmona es po meio
de écnicas de colo ação his oquímica, que são de execução simples, mas que co am em
simul âneo ou os mic o ganismos, dependendo o diagnós ico co ec o de um écnico
expe ien e. Po ou o lado, es e diagnós ico pode se ei o, ambém, po colo ações
imunoespecí icas (imuno luo escência di ec a/indi ec a com an ico pos monoclonais)
[Baughman 1994; Ma os e al. 2008].
8. Diagnós ico
- 50 -
8.2. Diagnós ico p esun i o
Pa a o diagnós ico p esun i o da pneumocis ose, são conside ados di e sos
pa âme os clínicos, que no seu conjun o podem se indica i os da doença.
A ap esen ação do quad o clínico, os es es de unção pulmona , a gasime ia a e ial em
epouso e após exe cício, os exames adiológicos e labo a o iais inespecí icos, são os
elemen os que compõem o undamen o do diagnós ico p esun i o [Ma os 1999; Ma os
e al. 2008]. Em es udos e ec uados en e o inal da década de 80 e p incípio da década
de 90, do século passado, 85% dos doen es com PPc demons a am con agens de
lin óci os TCD4+ in e io es a 250 células/mm3. Des a o ma, a a aliação do es ado
imuni á io do doen e é um pa âme o impo an e na a aliação do isco que o doen e em
de desen ol e in ecção po P. ji o ecii. Ac ualmen e, econhece-se que a p obabilidade
de doen es se oposi i os pa a VIH desen ol e em PPc aumen a conside a elmen e
quando a con agem de lin óci os do enó ipo TCD4+ no sangue pe i é ico é in e io a
200 células/mm3 [Masu e al. 1989; Moe & Ha dy 1994; Kaplan e al. 1998]. Po ou o
lado, o quad o clínico de doen es se oposi i os pa a VIH com dispneia e in il ados
pulmona es, que ap esen em, po exemplo, uma con agem de lin óci os TCD4+ de 500
células/mm3, di icilmen e es á elacionado com pneumocis ose. Nos doen es
imunocomp ome idos, se onega i os pa a VIH, o isco de colonização pulmona po
P. ji o ecii es á signi ica i amen e associado com con agens de lin óci os TCD4+
in e io es a 400 células/mm3 e a uma azão TCD4+/TCD8+ in e io a 1 [Ne ez e al.
1999].
O quad o clínico ípico de um doen e com PPc inclui sin omas como: eb e,
osse não p odu i a e dispneia. A ap esen ação adiológica clássica da PPc aduz-se po
um pad ão in e s icial bila e al, podendo no en an o a ia em unção do g au de
imunossup essão, da p esença de ou as in ecções concomi an es, ou da u ilização de
á macos especí icos, como é o caso da pen amidina [Moe & Ha dy 1994; Ba y &
Johnson 2001; Thomas, J . & Limpe 2007]. Tendo em con a que a PPc é uma doença
in e s icial, e como al, p o oca g a es di iculdades nas ocas gasosas que oco em no
pulmão, um ou o pa âme o u ilizado no diagnós ico p esun i o é a gasime ia a e ial.
Os es es de unção pulmona de doen es com pneumocis ose mos am que 80% dos
casos podem e ela hipoxemia, ou pelo menos, aumen o do g adien e de oxigénio
al éolo-a e ial, que se ag a a com o exe cício. Uma p essão pa cial do oxigénio (PaO2)
8. Diagnós ico
- 51 -
no sangue pe i é ico in e io a 65 mmHg é indica i a de PPc, sendo de conside a que
10 a 20% dos casos de PPc ap esen am ní eis no mais de PaO2 [S o e e al. 1989;
B ooks e al. 1993; Baughman 1994; Ba y & Johnson 2001].
A desid ogenase lác ica, do inglês lac a e dehyd ogenase (LDH), é uma enzima
es á el do ci oplasma, que é libe ada quando há des uição da memb ana ci oplasmá ica
das células do hospedei o. Os ní eis de LDH são ele ados nos doen es com in ecção
po P. ji o ecii, podendo o seu doseamen o no so o se ú il pa a e i ica o es ado da
doença e pa a a alia a espos a à e apêu ica. Po ém, alguns es udos indicam que en e
se e e 17% dos doen es com PPc ap esen am ní eis no mais de LDH, co espondendo,
p o a elmen e, a casos de in ecções pouco se e as e, po isso, com meno ac i idade
lí ica. In elizmen e, o aumen o da LDH não é exclusi o da PPc, sendo ambém comum
pa a ou as doenças [Zaman & Whi e 1988; Tasaka e al. 2007]. O β-glucano, um dos
p incipais componen es da pa ede celula dos quis os de P. ji o ecii, pa ece se ou a
molécula in e essan e pa a o diagnós ico de PPc. T abalhos de in es igação ecen es
mos a am que o β-glucano pode se de ec ado no so o ou no plasma dos doen es,
exis indo uma o e co elação en e os seus ní eis e a g a idade das in ecções úngicas.
Esses es udos suge em ambém que é possí el dis ingui a in ecção causada po
P. ji o ecii de ou as in ecções úngicas, o nando-o um po encial ma cado se ológico
de diagnós ico pa a a PPc [Te amo o e al. 2000; Tasaka e al. 2007]. Ou os es udos,
e ec uados em cul u as in i o, pe mi i am e i ica que Pneumocys is não em
capacidade de sin e iza S-adenosilme ionina, eco endo ao espaço ex acelula pa a
ob e o me aboli o ( undamen al nas eacções de me ilação e sín ese de poliaminas).
Obse ou-se que a concen ação média de S-adenosilme ionina em doen es com
suspei a de PPc e a de 8 nmol/L, enquan o que em indi íduos saudá eis e a de 106
nmol/L. Após a amen o, os doen es com PPc, ap esen a am concen ações do
me aboli o idên icas às e i icadas nos indi íduos saudá eis. A medição da a iação dos
ní eis de S-adenosilme ionina pode se ú il, como complemen o no diagnós ico da
in ecção, bem como na a aliação da espos a à e apêu ica an i-P. ji o ecii [Me ali &
Cla kson, J . 2004; Skelly e al. 2008].
Pelo ac o da população em ge al ap esen a ele adas pe cen agens de
po ado es de an ico pos an i-P. ji o ecii, os exames se o-imunológicos êm pouco
in e esse, pois é di ícil de e mina o í ulo com alo de diagnós ico. As écnicas de
8. Diagnós ico
- 52 -
ELISA, con a-imuno-elec o o ese e a aglu inação de pa ículas de lá ex sensibilizadas,
que pe mi em a de e minação de an igénios ci culan es no so o, são pouco sensí eis,
endo po isso eduzido alo de diagnós ico [McNabb e al. 1988; Hughes 1998].
8.3. Diagnós ico de ini i o
8.3.1. Amos as clínicas
O diagnós ico da PPc é de e minado po um exame his opa ológico em amos as
ob idas po écnicas in asi as, como a biopsia pulmona ou o la ado b oncoal eola
(LBA), e em amos as ob idas po écnicas não in asi as, como a expec o ação induzida
(EI), a expec o ação espon ânea, o la ado o al (LO), as sec eções b ônquicas, ou o
aspi ado naso a íngeo. Ac ualmen e, o LBA e a EI são as amos as clínicas mais
u ilizadas pa a o diagnós ico da pneumocis ose [Ma os 1999; Ba y & Johnson 2001;
Cos a 2006].
A colhei a do líquido do LBA é e ec uada po b onco ib oscopia, no lobo médio,
pe mi indo a isualização de P. ji o ecii em mais de 80% dos casos de in ecção [Gosey
e al. 1985]. De ido ao ac o da ecolha do LBA se ei a po um mé odo in asi o, em
c ianças de en a idade, p ocede-se à la agem e aspi ação dos b ônquios p incipais, pa a
ecolha das sec eções b ônquicas [Ma os 1999]. A EI é ob ida pela inalação de um so o
salino a 1,8% du an e 10 a 15 minu os, o que p omo e o aumen o da ansudação e a
ex oliação aqueob ônquicas. Na maio ia dos casos de PPc, a ob enção de amos as de
sec eções pulmona es pa a es udo ci ológico, a a és des e mé odo não in asi o, é
su icien e, sendo possí el a isualização de P. ji o ecii, após colo ação com um co an e
não especí ico, em 30 a 70% dos casos de in ecção. Quando associada à écnica de
imuno luo escência com an ico pos monoclonais (IF/AcM) an i-P. ji o ecii, a
sensibilidade da EI aumen a pa a ní eis que se si uam nos 85% [Zaman e al. 1988;
Baughman e al. 1989; Ng e al. 1989; Ng e al. 1990; Ma os e al. 1995]. Po se a a
de uma écnica simples e não in asi a, o LO ambém em indo a se a aliado pa a o
diagnós ico da PPc, a a és de écnicas de de ecção de DNA de P. ji o ecii, como é o
caso da eacção de polime ização em cadeia (PCR), do inglês polyme ase chain
eac ion. O LO é ob ido po ga ga ejo com um so o salino, pe mi indo a de ecção de
DNA de P. ji o ecii em 75 a 89% dos casos de in ecção [Wake ield e al. 1993;
8. Diagnós ico
- 53 -
Helweg-La sen e al. 1997; Ma os e al. 2001]. Pa a o diagnós ico da pneumocis ose
ex apulmona , e ec ua-se biopsia dos ecidos a ec ados, seguida de exame
his opa ológico dos agmen os do ecido [Moe & Ha dy 1994].
8.3.2. Mé odos his oquímicos pa a pesquisa di ec a
Vá ios mé odos de colo ação his oquímica es ão desc i os pa a a pesquisa de
o ganismos de P. ji o ecii em amos as pulmona es. Pa e des es mé odos ci oquímicos
co am a pa ede dos quis os, como é o caso da colo ação pela me enamina p a a, pelo
azul de oluidina ou pelo calco lúo , ou os mé odos co am os o ozoí os e os co pos
in aquís icos, como é o caso da colo ação pelo Giemsa [Milde e al. 1980; Ma os
1999; Cos a 2006].
A colo ação pela me enamina p a a (GMS), do inglês Gomo i
me henamine-sil e s ain, é conside ada a écnica de colo ação his oquímica de
e e ência, no diagnós ico da PPc. Es a écnica a gên ica co a de cinzen o-escu o, a
pa ede dos quis os de P. ji o ecii, não co ando o seu con eúdo, nem os o ozoí os
( igu a 12.A). Também, co a le edu as que se assemelham aos quis os de P. ji o ecii,
di icul ando a lei u a mic oscópica das lâminas, eque endo écnicos expe ien es pa a a
sua execução e lei u a [Mus o e al. 1982; Moe & Ha dy 1994]. As écnicas de
colo ação pelo azul de oluidina, que deixa a pa ede quís ica co ada de azul
cla o-la anda, e pelo calco lúo , que pe mi e uma colo ação luo escen e da pa ede
quís ica, ambém demons am eduzida especi icidade pa a a de ecção de P. ji o ecii
[Gosey e al. 1985; Baselski e al. 1990]. Que a colo ação pelo Giemsa, que a écnica
modi icada de colo ação pelo Giemsa (Di -Quick), co am os o ozoí os e os co pos
in aquís icos, que ap esen am núcleo co ado de e melho, odeado pelo ci oplasma
azulado. São écnicas inespecí icas e de lei u a ambígua, pois é p oblemá ico di e encia
os o ozoí os dos es an es agmen os celula es que compõem a lâmina [Hol en-
Ande sen & Kolmos 1989]. Um es udo demons ou que, apesa de se uma écnica
ápida e pouco one osa, a Di -Quick pe mi e a de ecção de P. ji o ecii em apenas 76%
de amos as de casos de PPc, enquan o que a GMS, embo a mais mo osa e one osa,
pe mi e a de ecção de 86% dos casos de PPc [Chand a e al. 1988].
8. Diagnós ico
- 54 -
Figu a 12. Quis os de P. ji o ecii, co ados po duas écnicas de e e ência, em
sec eções pulmona es. Na o og a ia A, podem-se obse a as o mas quís icas co adas
pela écnica de me enamina p a a (x1000) [Ma os 1999]. Na o og a ia B, os quis os de
P. ji o ecii podem se isualizados pela écnica de IFI com AcM (x1000) (o iginal do
au o ).
8.3.3. Mé odos imunoespecí icos
A ca ac e ização de an igénios de supe ície de Pneumocys is eio pe mi i o
desen ol imen o de an ico pos especí icos e a aplicação de no as écnicas de colo ação
po imuno luo escência (IF), que di ec a, que indi ec a. No inal dos anos 80 do século
passado, su gi am as p imei as écnicas de colo ação com an ico pos luo escen es
especí icos. O desen ol imen o de an ico pos monoclonais (AcM), que eagem com
an igénios de supe ície da pa ede celula de Pneumocys is, ez com que, em 1988, osse
desen ol ida uma écnica de diagnós ico po imuno luo escência, que apesa de mais
one osa e de eque e equipamen o especial, demons ou se mui o mais sensí el e
especí ica do que as écnicas his oquímicas con encionais, em pa icula , quando
aplicadas a espécimes com endência a e em meno es ca gas pa asi á ias, como as EI e
as sec eções b ônquicas.
A compa ação en e di e sos es udos onde a sensibilidade das écnicas de IF oi
a aliada em sec eções pulmona es, demons am que, e ec i amen e, as écnicas de IF
são mais sensí eis do que as écnicas de colo ação con encionais. Esses es udos
8. Diagnós ico
- 55 -
de e mina am que os ní eis de sensibilidade das écnicas de IF se si uam en e os 90 e
97%, semp e supe io es às écnicas his oquímicas, ais como, a GMS (81 a 91%), a
colo ação pelo Giemsa (76 a 92%), ou a colo ação pelo azul de oluidina (80%).
Num es udo e ec uado em Po ugal, e i ica am-se ní eis de sensibilidade bas an e mais
eduzidos pa a as écnicas his oquímicas (33%), con i mando as écnicas de colo ação
po IF como os mé odos de diagnós ico mo ológico de P. ji o ecii mais sensí eis
(88%) [Ko acs e al. 1988; Baughman e al. 1989; Ng e al. 1990; Ma os e al. 1995;
Lau enschlage e al. 1996; Ko acs e al. 2001; Tu ne e al. 2003; Nassa e al. 2006].
As écnicas de IF co am de e de maçã luo escen e os quis os ( edondos ou
o ais com 4 a 7 µm) e os o ozoí os ( o ma de meia lua ou polimó icos com 1 a 5 µm)
( igu a 12.B). A IF di ec a com AcM undamen a-se na ligação dos an ico pos
especí icos, ma cados com luo esceína, a an igénios de supe ície de Pneumocys is.
Po mic oscopia de luo escência, pode-se a alia a p esença ou ausência de
Pneumocys is, pela emissão de co ca ac e ís ica de es u u as compa í eis. Con udo, a
imuno luo escência indi ec a (IFI) com AcM é, ac ualmen e, de ido à sua iabilidade, a
écnica mais u ilizada no diagnós ico da PPc. Os AcM eagem especi icamen e com
an igénios de supe ície do mic o ganismo. De seguida, aos AcM ligam-se
an i-an ico pos especí icos, conjugados com um ma cado luo escen e, que quando
expos o a uma on e de luz com o de ido comp imen o de onda, ica com as suas
moléculas exci adas, emi indo luo escência com uma co ca ac e ís ica. Pela
obse ação ao mic oscópio de luo escência, de e mina-se a p esença ou ausência do
mic o ganismo a a és da co emi ida pelas es u u as ca ac e ís icas [Baughman e al.
1989; Ba a e al. 2002].
Pa a aumen a a especi icidade da écnica de IF, pode aplica -se uma écnica
enzimá ica, que po diges ão pa cial da pa ede dos quis os de Pneumocys is, expõe
an igénios, que não es ão di ec amen e acessí eis à supe ície do mic o ganismo e, que
podem unciona como al os dos AcM [Lau enschlage e al. 1996].
8.3.4. Mé odos molecula es
A inexis ência de meios de cul u a e icien es e ep odu í eis, que pe mi am o
isolamen o e a mul iplicação de P. ji o ecii, ob ido de ma e ial biológico de doen es,
di icul a o diagnós ico des e mic o ganismo pelas écnicas clássicas de uso co en e, em
8. Diagnós ico
- 56 -
especial nos casos em que as amos as biológicas ap esen am baixas ca gas pa asi á ias
[Sloand e al. 1993; S inge 1996; Beck & Cushion 2009]. Nas úl imas duas décadas,
os p og essos ob idos na á ea da biologia molecula ie am pe mi i , não só um eno me
a anço na ca ac e ização geno ípica de um ele ado núme o de mic o ganismos
pa ogénicos, mas ambém, con ibuiu de o ma decisi a pa a a melho ia do diagnós ico
de in ecções p o ocadas po esses agen es, a a és do desen ol imen o de écnicas
ino ado as, como po exemplo a PCR. Es a écnica molecula pe mi e a de ecção de
P. ji o ecii, a a és da ampli icação de DNA.
A sequência de ácidos nucleicos é ca ac e ís ica e única pa a cada o ganismo,
con e indo a es a écnica ele ada especi icidade [Wake ield e al. 1990a; Tambu ini e
al. 1993]. Em 1990, Ann Wake ield e colabo ado es publica am os p imei os abalhos
onde oi aplicada a ecnologia de PCR pa a a de ecção de Pneumocys is, a a és da
ampli icação da sequência da subunidade g ande de RNA mi ocond ial (m LSU RNA),
isolado a pa i de pulmão in ec ado, de a o e de homem [Wake ield e al. 1990a;
Wake ield e al. 1990b]. Desde en ão, o am desen ol idas á ias écnicas pa a a
de ecção des e o ganismo po ampli icação de DNA a a és da PCR. Pa a além da
m LSU RNA, a PCR pode se aplicada numa a iedade de subs ac os gené icos.
Os mé odos que ap esen am maio sensibilidade englobam genes mul icópia, como al o
da eacção, ou p o ocolos que implicam PCR nes ed que eque em duas ases de
ampli icação [Moonens e al. 1995; Ma os e al. 2000; Ko acs e al. 2001].
Em compa ação com as écnicas de de ecção mo ológica, a maio ia dos es udos,
con i ma que as écnicas de PCR ap esen am al a sensibilidade e especi icidade, semp e
a onda os 100%, embo a a iá eis, dependendo do p odu o biológico u ilizado [A zo i
e al. 1998; To es e al. 2000]. A PCR pe mi e a de ecção de P. ji o ecii em amos as
clínicas (LBA, EI, expec o ação espon ânea, LO, sec eções b ônquicas, aspi ado
naso a íngeo, so o, sangue) e ambien ais [Wake ield e al. 1993; Olsson e al. 1993;
A zo i e al. 1995; Lundg en & Wake ield 1998; Ne ez e al. 2001; Ma os e al. 2001;
Ma os e al. 2003a; Ma os e al. 2006]. O mé odo de PCR nes ed em sido usado com
sucesso em amos as biológicas ecolhidas do apa elho espi a ó io supe io , onde o
núme o de o ganismos de P. ji o ecii é endencialmen e baixo. Enquan o os LO podem
se ob idos em doen es com PPc se e a, nos quais as écnicas mais in asi as se o nam
bas an e ag essi as e di íceis de execu a , os aspi ados naso a íngeos, podem se
8. Diagnós ico
- 57 -
acilmen e ob idos em doen es pediá icos, sendo que ambos os ipos de amos a êm
sido u ilizados com sucesso no diagnós ico da pneumocis ose po PCR [Wake ield e al.
1993; Olsson e al. 1996a; Ne ez e al. 2001]. Alguns es udos mos am que a
sensibilidade da PCR pa a de ec a P. ji o ecii em amos as o o a íngeas si ua-se en e
os 50 e os 70%, mais eduzida do que nas amos as de LBA, onde a sensibilidade a inge
os 100% [A zo i e al. 1998; Huang e al. 1999; Pinlao e al. 2004]. A de ecção de
DNA de P. ji o ecii em amos as de so o e de sangue em demons ado algum
po encial, embo a com esul ados díspa es. Es udos indicam que somen e em alguns
casos, onde se obse a disseminação da in ecção po P. ji o ecii, se consegue de ec a
DNA do mic o ganismo a a és da PCR, em amos as de sangue. A u ilidade des e ipo
de amos as pa a o diagnós ico da PPc pe manece po escla ece [Tambu ini e al.
1994; A zo i e al. 1995; Ma os e al. 1999].
Recen emen e, écnicas de PCR em empo eal, RT-PCR do inglês eal ime
polyme ase chain eac ion, o am ambém es adas pa a a de ecção de P. ji o ecii em
amos as biológicas. Es a me odologia, o nece, não só dados quali a i os em elação à
p esença do agen e pa ogénico, mas ambém, pe mi e a quan i icação de P. ji o ecii nos
espécimes pulmona es. Apesa de mais dispendiosa que a PCR no mal, a RT-PCR
demons a maio apidez na ob enção de esul ados e ele ados ní eis de sensibilidade e
especi icidade no diagnós ico e quan i icação de P. ji o ecii. Es udos demons am que a
sensibilidade (94%) des a écnica é semelhan e aos alo es da PCR nes ed,
habi ualmen e u ilizado pa a o diagnós ico molecula . Po ou o lado, a sua
especi icidade (96%) é supe io à da PCR nes ed, pe mi indo o apa ecimen o de menos
po enciais alsos posi i os [Al a ez-Ma inez e al. 2006; A cenas e al. 2006; Hugge
e al. 2008; Rohne e al. 2009].
Di e sos au o es [Lundg en & Wake ield 1998; Wake ield 2002; Mille e al. 2002;
Med ano e al. 2005; Ri e o e al. 2008] suge em que, pa a além da sensibilidade e
especi icidade que ap esen a a ní el do diagnós ico, a PCR, aliada a mé odos não
in asi os, de ob enção de p odu os biológicos, pode se aplicada na moni o ização de:
1) Doen es sob e apêu ica ou p o ilaxia an i-P. ji o ecii;
2) Doen es com ele ado isco de desen ol e em PPc;
3) Es udos epidemiológicos, que podem inclui a população em ge al, po ado es
assin omá icos, ou amos as ambien ais.
8. Diagnós ico
- 58 -
9. P e enção e a amen o da pneumocis ose
9.1. In odução às opções e apêu icas
Nos anos 80 do século passado, com o início da epidemia de sida, a
pneumocis ose o nou-se uma doença equen e. Nessa al u a, apenas ês á macos se
encon a am en e as opções e apêu icas an i-P. ji o ecii: a pen amidina, a
pi ime amina-sul adiazina e o ime op im-sul ame oxazol (TMP-SMZ) [I ády & Páldy
1958; F enkel e al. 1966; Hughes e al. 1974; Hughes e al. 1977]. Desde en ão, a
in es igação de no os á macos com e ei os an i-P. ji o ecii oi impulsionada. Di e sos
es udos demons a am que moléculas especí icas p o ocam a inibição de impo an es
enzimas do me abolismo de Pneumocys is. Desses es udos, des acam-se aqueles que
incidi am sob e as enzimas da ia biossin é ica do ácido ólico, como a DHFR, TS e
DHPS, o ci oc omo b, e a β-1,3-glucano sin e ase, que, ecen emen e, ganhou uma
maio impo ância, com o desen ol imen o de á macos an i- úngicos, cuja capacidade
é, p ecisamen e, a inibição des a enzima [Edman e al. 1989a; Ko acs e al. 1989a;
Schma z e al. 1991; Hughes e al. 1993].
9.2. P o ilaxia da pneumonia po Pneumocys is ji o ecii
An es da implemen ação da p o ilaxia con a a PPc e do uso ala gado da
HAART, a in ecção po P. ji o ecii oco ia em 60 a 80% dos doen es com VIH/sida
[Moe & Ha dy 1994; Lundbe g e al. 2000]. Es udos mos am que, que a
implemen ação de egimes p o ilá icos com á macos e icazes, que a u ilização da
HAART, con ibuí am decisi amen e pa a o declínio da equência des a doença, que
na Eu opa Ociden al e nos E.U.A., passou a oco e numa axa de dois a ês casos po
cada 100 pessoas/ano [Fu e e al. 1999]. Pa a além dos doen es com sida, a p o ilaxia
p imá ia de e se conside ada nou os g upos de doen es, ais como, c ianças com
leucemia, ou com de iciências imuni á ias combinadas, ansplan ados de ó gãos, en e
ou os doen es imunocomp ome idos [Hughes e al. 1977; K ame e al. 1992; Hughes
1994].
É econhecido que doen es com con agens de lin óci os do enó ipo TCD4+ no
sangue pe i é ico, in e io es a 200 células/mm3, ap esen am al o isco de desen ol e a
doença [Masu e al. 1989; Ko acs & Masu 1992; Kaplan e al. 1998]. Esse isco,
SEGUNDA PARTE
Po encial implicação de múl iplos ma cado es polimó icos de
Pneumocys is ji o ecii na ap esen ação e e olução clínica da PPc.
10. Relação en e polimo ismos de Pneumocys is ji o ecii e pa âme os clínicos da PPc.
10. Relação en e polimo ismos de Pneumocys is ji o ecii e pa âme os
clínicos da PPc
10.1. O p oblema e o mé odo
P. ji o ecii é um impo an e agen e in eccioso, causado de pneumonia em
doen es com in ecção VIH/sida, endo sido, ambém, já desc i os casos de in ecção em
pessoas imunocompe en es ou com g aus mode ados de imunode iciência [Pe e son &
Cushion 2005; Med ano e al. 2005; Ma os e al. 2006; Thomas, J . & Limpe 2007;
Hause e al. 2009]. Nos úl imos anos, o am conseguidos p og essos signi ica i os na
p o ilaxia, no a amen o e no diagnós ico da PPc. Con udo, a pneumocis ose,
pe manece como um p oblema clínico impo an e, sendo uma das p incipais in ecções
opo unis as que a ec am os doen es se oposi i os pa a VIH [Ba y & Johnson 2001;
Walze e al. 2008]. A inexis ência de um p ocesso sus en ado de cul i o de P. ji o ecii
é uma impo an e limi ação nas á ias á eas de es udo da PPc [S inge 1996; Wake ield
2002; Beck & Cushion 2009]. Apesa da ecen e aplicação de écnicas de biologia
molecula no es udo de P. ji o ecii, a é à p esen e da a, as en a i as de associa
genó ipos especí icos do mic o ganismo com a in o mação clínica da in ecção, êm
ap esen ado esul ados escassos e mui as ezes in u í e os. Poucos o am os es udos
conclusi os, onde se consegui am associa polimo ismos especí icos a ac o es da
in ecção po P. ji o ecii [A ms ong e al. 2000; Hause e al. 2001a; Hause e al.
2001b; Huang e al. 2006]. Pe manecem po escla ece as azões pelas quais alguns
doen es so em de g aus mode ados de pneumocis ose, com espos a a o á el aos
á macos an i-P. ji o ecii, enquan o ou os so em de pneumocis ose se e a que pode
e ela -se a al, apesa da e apia [Helweg-La sen e al. 1999; Ba y & Johnson 2001;
Hause e al. 2001b; Ma os e al. 2003b]. Se, po um lado, alguns es udos apon am pa a
que de e minados indicado es de p ognós ico clínico possam es a elacionados com a
e olução da in ecção, po ou o, os a anços no conhecimen o da di e sidade gené ica de
P. ji o ecii êm demons ado que polimo ismos especí icos podem de e mina o pe il
epidemiológico do mic o ganismo, como a sua dis ibuição geog á ica, a esis ência a
á macos, a i ulência de alguns sub ipos, os modos de ansmissão e a gené ica da
população [Helweg-La sen e al. 1999; Mille & Wake ield 1999; Bea d e al. 2000;
A ms ong e al. 2000; Mo is e al. 2004; C o he s e al. 2005; Thomas, J . & Limpe
10. Relação en e polimo ismos de Pneumocys is ji o ecii e pa âme os clínicos da PPc.
2007; Mille e al. 2007; Radhi e al. 2008; Walze e al. 2008]. Tendo po base es es
dados, coloca-se a hipó ese de que ac o es, como a i ulência ou a esis ência a
á macos, ca ac e ís icas ap esen adas po de e minados sub ipos gené icos de
P. ji o ecii, possam es a , de alguma o ma, dependen es de múl iplos genó ipos e,
po an o, da associação de polimo ismos múl iplos que oco em em di e sas egiões do
genoma do mic o ganismo. As di e en es associações de polimo ismos, ou hapló ipos,
pode ão con e i ao mic o ganismo ca ac e ís icas dis in as, in luenciando a
ap esen ação e a e olução clínica dos casos de PPc, aos quais dão o igem.
A descobe a de polimo ismos de base única (SNPs, do inglês single nucleo ide
polymo phims) em múl iplos genes de P. ji o ecii ab iu as po as pa a os es udos de
associação gené ica, onde se en a de e mina a exis ência de hapló ipos ca ac e ís icos e
a sua impo ância na ap esen ação e na e olução da doença. Po ém, as écnicas
implemen adas pa a a geno ipagem de isolados de P. ji o ecii ap esen am algumas
limi ações pa a es e ipo de abo dagem, pois, de um modo ge al, são me odologias
mo osas, dispendiosas e limi adas ela i amen e ao núme o de amos as e de egiões
genómicas a es uda [Olsson e al. 1998; Hause e al. 2001a; Hause e al. 2001b;
Cos a e al. 2006b; Es e es e al. 2008; Ma os & Es e es 2010b]. A ecen e e olução
nas me odologias de ca ac e ização gené ica, eio possibili a o aumen o do endimen o
e a diminuição dos cus os de ope ação, pe mi indo análises de associação gené ica mais
amplas e sensí eis [Kim & Mis a 2007]. Des a o ma, o p esen e p ojec o de
in es igação, subme ido e ap o ado pelos conselhos de é ica das ins i uições
en ol idas, e e como p opósi o a iden i icação e classi icação de SNPs de P. ji o ecii e
a aplicação de ecnologia de al a capacidade, que pe mi e elaciona , de o ma céle e e
obus a, as ca ac e ís icas gené icas de um ele ado núme o de isolados de P. ji o ecii
com os pa âme os clínicos da in ecção, em g upos especí icos de doen es, p o enien es
de uma de e minada população.
Com o objec i o de iden i ica egiões genómicas, po encialmen e associadas
com pa âme os da in ecção po P. ji o ecii, oi p opos o um passo inicial que consis iu
numa pesquisa bibliog á ica ab angen e, a qual e e como inalidade a a aliação do
in e esse ela i o dos loci, conside ando a sua a iabilidade, impo ância me abólica, e a
possí el elação com a esis ência a á macos, ac o es de i ulência, p op iedades de
supe ície do mic o ganismo e di e en es g aus de se e idade da in ecção. A di e sidade
10. Relação en e polimo ismos de Pneumocys is ji o ecii e pa âme os clínicos da PPc.
gené ica, as equências de dis ibuição de genó ipos e a elação en e os genó ipos
obse ados e di e sos pa âme os da in ecção, o am in es igadas, numa p imei a ase,
pa a cada gene indi idual, aplicando as écnicas de PCR, sequenciação di ec a e análise
de agmen os de es ição (RFLP do inglês es ic ion agmen leng h polymo phism).
Após es a abo dagem inicial, que pe mi iu a iden i icação dos SNPs de P. ji o ecii,
apa en emen e, associados a pa âme os clínicos especí icos, p osseguiu-se o es udo,
desen ol endo e op imizando me odologias de al o endimen o, com o p opósi o de
classi ica os SNPs, pe mi indo a exclusão de SNPs conside ados não ele an es, ou,
conseguindo, po exemplo, classi icá-los e elacioná-los com g aus de maio g a idade
da doença. As me odologias de geno ipagem, baseadas na associação das écnicas de
PCR mul iplex e de geno ipagem po polime ização de base única (SBE, do inglês
single base ex ension), com capacidade de p ocessa g andes quan idades de amos as,
de o ma al amen e sensí el e p ecisa, possibili a am a iden i icação simul ânea de
á ios loci polimó icos, demons ando po encial pa a o nece um g ande olume de
in o mação, que pode se u ilizado na ca ac e ização de múl iplas egiões genómicas de
P. ji o ecii [Hi schho n e al. 2000; Ma koula os e al. 2002; Fabe e al. 2005].
A associação e o encadeamen o das écnicas de PCR mul iplex/SBE, em
conjun o com a ino ado a écnica de ag upamen o de múl iplas amos as de DNA,
ambém designada po DNA pooling, pe mi iu a ca ac e ização gené ica de P. ji o ecii
a a és do es udo de múl iplos loci independen es, num ala gado núme o de amos as,
de o ma dinâmica e obus a. A associação des as me odologias, e e como objec i o,
po um lado, a iden i icação de genes polimó icos associados à i ulência e à
esis ência a á macos e, po ou o lado, o es abelecimen o de hapló ipos, que de alguma
o ma, pode ão es a implicados na g a idade da in ecção po P. ji o ecii [Sham e al.
2002; Le Hella d e al. 2002; Kim & Mis a 2007].
10.2. Objec i os ge ais
Com o p esen e es udo, p e endeu-se ob e in o mação ace ca da a iabilidade
gené ica de P. ji o ecii e da sua associação com de e minadas ca ac e ís icas clínicas,
como, po exemplo, os di e en es g aus de se e idade da in ecção, p o ocados po
de e minados sub ipos de mic o ganismos, usando, pa a isso, as me odologias de
imuno luo escência indi ec a com an ico pos monoclonais (IFI/AcM), PCR, PCR
10. Relação en e polimo ismos de Pneumocys is ji o ecii e pa âme os clínicos da PPc.
seguido de sequenciação di ec a, PCR seguido de RFLP, RT-PCR, PCR mul iplex
seguido de SBE e DNA pooling. O abalho en ol eu a ecolha de espécimes
pulmona es de doen es com co-in ecção VIH/P. ji o ecii, com e sem quad o clínico
compa í el com PPc, e de doen es se onega i os pa a VIH, in ec ados po P. ji o ecii.
Es as amos as o am es udadas pa a a pesquisa de polimo ismos de genes en ol idos
em enómenos de esis ência a á macos ou associados com di e sos g aus de
se e idade da doença, p e iamen e desc i os na li e a u a e, ambém, pa a a selecção de
no os genes candida os. Pa a os polimo ismos seleccionados, como po encialmen e
ele an es, p ocedeu-se a uma análise indi idual das amos as, com o in ui o de
encon a di e enças signi ica i as en e os g upos analisados (ex. casos com e olução
clínica a o á el e sus casos com e olução clínica des a o á el, ou casos com ca gas
pa asi á ias ele adas e sus casos com ca gas pa asi á ias baixas).
Após a iden i icação dos polimo ismos po encialmen e ele an es, p e endeu-se
aplica , desen ol e e implemen a me odologias de ele ada capacidade, como a
PCR mul iplex/SBE em associação com DNA pooling, pa a haplo ipagem de
P. ji o ecii em amos as clínicas. A aplicação conjun a des as me odologias e e como
objec i o acele a a iden i icação dos polimo ismos de P. ji o ecii com impac o a ní el
clínico, pe mi indo uma ap oximação baseada em hapló ipos pa a a ca ac e ização
clínica des e mic o ganismo pa ogénico. Assim, com hapló ipos de idamen e
iden i icados, os quais pode ão es a elacionados com de e minados pa âme os da
in ecção po P. ji o ecii, o de adei o objec i o da p esen e in es igação, oi a aplicação
do conhecimen o ge ado no auxílio ao diagnós ico e à escolha adequada do a amen o,
pe mi indo um melho con olo da doença.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii:
selecção de al os molecula es
11.1. Di e sidade in a-especí ica de Pneumocys is ji o ecii
De ido à di iculdade em ob e g andes quan idades de o ganismos de
P. ji o ecii pa a ca ac e ização gené ica, não exis e, a é à da a, nenhum mapa genómico
des e mic o ganismo. No en an o, no início da década de 90, do século passado, a
écnica de elec o o ese em campo pulsado (PFGE, do inglês pulsed- ield gel
elec opho esis), que pe mi e sepa ação de agmen os de DNA de g andes dimensões,
começou a se u ilizada em es udos gené icos de Pneumocys is. A aplicação des a
écnica pe mi iu de e mina a dimensão do genoma nuclea de Pneumocys is, isolado de
a o, em ce ca de oi o milhões de pa es de bases (Mb) de DNA, encon ando-se di idido
en e 15 a 18 c omossomas, cada um deles com 700 a 1000 kilobases (Kb) de DNA.
Vá ios genes, de Pneumocys is isolado de a o, o am clonados e sequenciados,
demons ando que o DNA do mic o ganismo é ico em adenina e imina (60 a 65%)
[Wo ley e al. 1989; Cushion e al. 1993; S inge 1994; Wyde e al. 1998]. Num
es udo de 1998, a dimensão do genoma de Pneumocys is, isolado de humanos, oi
quan i icada em 7.7 Mb, ap esen ando um pe il elec o o é ico de 13 bandas com pesos
molecula es comp eendidos en e os 370 e os 810 Kb [S inge & Cushion 1998].
A aplicação de écnicas de biologia molecula na ca ac e ização gené ica de
Pneumocys is, eio le an a a ques ão de que, pa a além da di e gência en e
Pneumocys is isolados de di e en es espécies de hospedei os, pode ão ambém exis i
a iações gené icas en e Pneumocys is isolados de um mesmo hospedei o, como é o
caso de P. ji o ecii. Oco endo de uma o ma menos ex ensa do que a di e gência
obse ada en e Pneumocys is isolados de di e en es espécies de hospedei os, a
di e gência gené ica en e Pneumocys is isolados de hospedei os da mesma espécie, é
comum e equen emen e obse ada. Es a di e sidade pode á conduzi à exis ência de
o ganismos com ca ac e ís icas dis in as, den o dos di e en es géne os de Pneumocys is
[S inge & Walze 1996; S inge 2002; S inge e al. 2002; Wake ield 2002].
A he e ogeneidade gené ica de o ganismos de Pneumocys is isolados a pa i da
mesma espécie de hospedei o oi, pela p imei a ez, obse ada no início dos anos 90 do
século passado, a a és da écnica de PFGE em Pneumocys is de a o. Foi e i icado
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
que, quando subme idos a uma co ida elec o o é ica de campo pulsado em gel de
aga ose, os c omossomas de Pneumocys is, isolados de di e en es a os, mig am de
o ma di e encial. Es as di e enças nos pe is elec o o é icos êm, no caso des e
hospedei o, duas o igens p o á eis. Assim, a p imei a a iação de pe il elec o o é ico,
onde se obse am di e en es núme os de bandas em alguns dos isolados, indica a
p esença de duas espécies dis in as de Pneumocys is que in ec am os a os
(P. ca inii . sp. ca inii e P. ca inii . sp. a us). A segunda a iação de pe il
elec o o é ico, em que o núme o de bandas é igual en e os isolados, mas onde algumas
das bandas mig am de o ma di e encial, indica a iação gené ica en e o ganismos de
P. ca inii . sp. ca inii, a espécie mais comum en e os a os de labo a ó io. Assim,
nes es es udos, di e en es pe is elec o o é icos de P. ca inii . sp. ca inii o am
iden i icados. Es as obse ações apon am, mui o p o a elmen e, pa a a exis ência de
múl iplos sub ipos, ou mesmo de es i pes des e o ganismo [Hong e al. 1990; Cushion e
al. 1993]. Pa alelamen e, P. ji o ecii oi ambém in es igado no deco e de um desses
es udos. Di e en es pe is elec o o é icos o am de ec ados pa a P. ji o ecii.
No en an o, a isualização de bandas, a a és des e ipo de écnica, é bas an e di ícil e
limi ado em amos as pulmona es humanas, ac o ine en e ao núme o eduzido de
o ganismos disponí el nes e ipo de amos as biológicas. Mais ecen emen e, a
di e gência gené ica de P. ji o ecii em indo a se demons ada, a a és de écnicas
molecula es, que en ol em a ampli icação p é ia de po ções de DNA do
mic o ganismo, como é o caso da PCR [Cushion e al. 1993; S inge 1996].
Di e sos es udos, ealizados com base nessa me odologia, demons a am que
sequências polimó icas de DNA são de ec adas equen emen e em isolados de
P. ji o ecii, suge indo que a a iação gené ica é comum nes e mic o ganismo e que
di e sos sub ipos gené icos podem exis i . Numa p imei a abo dagem, na década de 90,
do século passado, uma análise à sequência nucleo ídica do gene que codi ica pa a a
subunidade g ande do RNA mi ocond ial (m LSU RNA), demons ou a p esença de
subs i uições pon uais em ês posições nucleo ídicas [Sinclai e al. 1991; Lee e al.
1993]. A pa i dessa al u a, di e sas egiões genómicas êm sido u ilizadas no es udo da
epidemiologia molecula da pneumocis ose. A geno ipagem dos espaçado es
ansc ip os in e nos 1 e 2 (ITS1 e ITS2, do inglês in e nal ansc ibed space s),
localizados no gene nuclea de cópia única que codi ica pa a o RNA ci oplasmá ico,
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
demons ou o e a iabilidade gené ica des as egiões, o que implica um mé odo
al amen e disc imina ó io, em especial na ca ac e ização geog á ica de clones de
P. ji o ecii. As egiões ITS são conside adas al amen e a iá eis en e os sub ipos do
mic o ganismo, so endo a iações mais apidamen e do que os domínios uncionais
que as lanqueiam. De aco do com a nomencla u a de Lee e al. 1998, pelo menos 60
combinações geno ípicas di e en es, de en e um o al de 240, eo icamen e possí eis,
o am já desc i as pa a as egiões ITS de P. ji o ecii. [Lu e al. 1994; Lee e al. 1998;
Nim i e al. 2002; Ma os e al. 2003b; Es e es e al. 2008]. Conside ando a
ca ac e ização de isolados de P. ji o ecii, numa abo dagem mul ilocus, a u ilização das
egiões ITS p omo e um aumen o conside á el do núme o de genó ipos, o que eduz a
u ilidade des e ipo de mé odo, especialmen e quando se p e ende a alia po enciais
co elações en e genó ipos especí icos e pa âme os clínicos da in ecção, ou quando se
p e endem aplica de e minados es udos populacionais ou e olu i os. Es udos
demons a am a ausência de co elação en e os genó ipos des as egiões, al amen e
a iá eis, e os pa âme os clínicos da in ecção po P. ji o ecii, bem como a sua
inu ilidade como ma cado es gené icos em es udos e olu i os [Helweg-La sen e al.
2001; Hause e al. 2001a; Mille e al. 2003a; Vale io e al. 2007; an Hal e al. 2009].
Nos es udos mais ecen es, e ec uados às egiões ITS de P. ji o ecii isolados na
população po uguesa, oi de e minada a p e alência de um genó ipo ITS especí ico
(Eg), que pode a ia en e os 29 e os 48% [Cos a 2006; Cos a e al. 2006b; Es e es e
al. 2008]. Es es esul ados o am conco dan es com es udos an e io es, ambém
ealizados em P. ji o ecii isolado na população po uguesa, onde Eg oi o genó ipo
p edominan e, com uma equência de 23% [Ma os e al. 2003b]. Di e sos es udos
e ec uados um pouco po odo o globo, em especial, na Eu opa e nos E.U.A.,
demons a am que alguns genó ipos, em pa icula o Eg, ap esen am uma dis ibuição
geog á ica e empo al ubíqua, sendo de ec ados em isolados de P. ji o ecii de di e sos
países e em anos a iados [Tsolaki e al. 1998; Helweg-La sen e al. 2001; Nim i e al.
2002; Es e es e al. 2008].
A maio ia dos es udos de a iabilidade gené ica de P. ji o ecii aplica a análise
de geno ipagem a apenas um locus. A de ecção de a iação nucleo ídica num gene de
P. ji o ecii pode indica a exis ência de sub ipos gené icos es á eis, mas ambém, pode
indica a ins abilidade dessa po ção de DNA e a acção de o ças de selecção, que podem
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
es a a ac ua sob e essa egião. Po ém, alguns es udos mul ilocus ealizados,
con i ma am a a iabilidade gené ica de P. ji o ecii em di e sos loci, de o ma
consis en e com a exis ência de sub ipos gené icos es á eis [Bane ji e al. 1995; Keely
e al. 1995; Keely & S inge 1997; Wake ield 1998; Hause e al. 1998; S inge 2002].
11.2. In odução à epidemiologia molecula de Pneumocys is ji o ecii
A ipagem gené ica o nou-se nos úl imos 20 anos uma das p incipais e amen as do
es udo epidemiológico da PPc [Goesch e al. 1990; Wake ield 1996; Casano a-Ca diel
& Leibowi z 1997; Ba le e al. 1997; Lundg en e al. 1997; La ouche e al. 1997a;
Olsson e al. 1998; Helweg-La sen e al. 1999; Mille & Wake ield 1999; Bea d e al.
2000; S inge 2002; Mon es-Cano e al. 2004; Chabe e al. 2004; Cos a e al. 2005;
C o he s e al. 2005; Hocke e al. 2005; Ma os e al. 2006; Es e es e al. 2008; Ma os
& Es e es 2010b]. As écnicas molecula es desen ol idas pe mi em:
1) O es udo da biodi e sidade, in e e in a-especí ica de P. ji o ecii;
2) A iden i icação de ese a ó ios ambien ais e de po enciais on es de in ecção;
3) A iden i icação dos modos de ansmissão e da dinâmica da ansmissão;
4) O es udo da a iabilidade gené ica em isolados de P. ji o ecii de doen es de uma
mesma população;
5) O econhecimen o de casos de colonização e de po ado es assin omá icos;
6) A ca ac e ização da dis ibuição geog á ica de de e minados ma cado es
molecula es;
7) A iden i icação de po enciais mecanismos de esis ência a á macos;
8) O econhecimen o de p o á eis ma cado es molecula es de i ulência.
A p incipal me odologia pa a in es iga a oco ência de a iações gené icas
en e o ganismos de P. ji o ecii e a exis ência de po enciais sub ipos, consis e no es udo
molecula de sequências nucleo ídicas de loci especí icos, a pa i de amos as
biológicas, en endendo-se po amos a biológica, ma e ial biológico especí ico
ecolhido a um indi íduo, num de e minado momen o, pa a de ecção de o ganismos de
P. ji o ecii. A di e sidade alélica de P. ji o ecii em sido es udada com ecu so a
écnicas de geno ipagem, ais como, sequenciação di ec a após ampli icação de DNA,
análise de polimo ismos po RFLP, análise de polimo ismos po con o mação de
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
11.3.2. Genes nuclea es
Como pa asi a do epi élio pulmona , P. ji o ecii localiza-se no mic oambien e
al eola , es ando cons an emen e expos o à p essão oxida i a exe cida pela acção dos
mac ó agos e neu ó ilos al eola es. Po ou o lado, moléculas eac i as de i adas do
oxigénio podem se p oduzidas, como esul ado da edução elec ónica de oxigénio
molecula , pelo p ocesso de os o ilação oxida i a, du an e a sín ese de ATP, na
mi ocônd ia. As espécies eac i as de oxigénio são uma po encial on e de danos na
célula do mic o ganismo, podendo a ec a es u u as suscep í eis, ais como, o ma e ial
gené ico, componen es memb ana es, p o eínas e enzimas. As supe óxido dismu ases
(SOD) são enzimas ubíquas, que p o egem as células con a os adicais li es de
oxigénio, ao ca aliza em a eacção do p imei o passo de des oxi icação, que consis e na
ans o mação do anião supe óxido em oxigénio e pe óxido de hid ogénio ( igu a 13).
São conhecidas ês g andes classes de enzimas SOD, classi icadas de aco do com o
me al que unciona como co ac o no cen o ac i o enzimá ico. Es udos indicam que o
gene SOD de P. ji o ecii codi ica pa a uma supe óxido dismu ase dependen e de
manganésio, uma enzima com localização mi ocond ial [Pesan i 1984; Denis e al.
1998]. T a a-se de um gene nuclea de cópia única, que dá o igem a uma enzima que
mig a pa a a mi ocônd ia do mic o ganismo. Após a sín ese no ci oplasma, a enzima é
anspo ada pa a a mi ocônd ia a a és de um pép ido de sinalização especí ico.
Apa en emen e, a enzima é es i amen e necessá ia pa a a des oxi icação dos compos os
eac i os de oxigénio, de i ados da cadeia de espi ação edox, que oco e na
mi ocônd ia, e do s ess oxida i o, impos o pelo ambien e pulmona , podendo cons i ui
um ac o de p o ecção celula , mas ambém, um impo an e ac o de pa ogenicidade
[Denis e al. 1998; Denis e al. 2000]. A di e sidade gené ica do locus SOD de
P. ji o ecii oi já demons ada em es udos an e io es, onde di e sos polimo ismos
o am de ec ados (quad o VI), e elando a impo ância des e gene pa a os es udos de
geno ipagem e de biodi e sidade do mic o ganismo [Wake ield e al. 2003; Mille e al.
2003a; Mille e al. 2005b].
Os mic o úbulos são o mados po díme os de α- e β- ubulina, desempenhando
impo an es unções como componen es de es u u as celula es basais, ais como o
ci osquele o, ou como componen es de es u u as de locomoção celula , como os cílios
e os lagelos. Os mic o úbulos es ão implicados em di e sos aspec os do anspo e
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
in acelula e, ambém, na di isão celula , pois são dos componen es p incipais dos
usos ac omá icos que se o mam du an e a mi ose e a meiose. Es udos indicam que o
gene de P. ji o ecii que codi ica pa a a β- ubulina em localização nuclea , oco endo
como cópia única nes e o ganismo. Fo am já desc i os di e sos polimo ismos no gene
β TUB, demons ando a sua u ilidade em es udos de geno ipagem de isolados de
P. ji o ecii [Edlind e al. 1992; Hause e al. 1997a; Nahimana e al. 2000; Volpe e al.
2001]. Apesa da sequência nucleo ídica da β- ubulina se ela i amen e conse ada, o
es udo da sua he e ogeneidade pode o nece impo an es dados epidemiológicos.
Os SNPs desc i os pa a es e gene encon am-se esumidos no quad o VII.
Quad o VI. SNPs desc i os pa a o gene de P. ji o ecii, que codi ica pa a a supe óxido
dismu ase dependen e de manganésio. Todas as a iações nucleo ídicas de ec adas no
gene SOD o am p e iamen e desc i as po Denis e al. 2000.
SNP Nucleó ido (aminoácido)
(posição : iden idade)
SOD110 110 In ão 2 : C
110 In ão 2 : T
SOD179 179 (29) Exão 3 : A (Ala)
179 (29) Exão 3 : T (Ala)
SOD215 215 (41) Exão 3 : T (Asp)
215 (41) Exão 3 : C (Asp)
Quad o VII. Va iações nucleo ídicas desc i as pa a o gene de P. ji o ecii que codi ica
pa a a β- ubulina. A cada um dos SNPs indicados, co esponde a e e ência
bibliog á ica, onde a sequência nucleo ídica oi publicada pela p imei a ez.
SNP Nucleó ido (aminoácido)
(posição : iden idade) Re e ência
β TUB24 24 (8) Exão 3 : A (Ala) [Edlind e al. 1992]
24 (8) Exão 3 : T (Ala) [Hause e al. 1997a]
β TUB96 96 (32) Exão 3 : G (Val) [Edlind e al. 1992]
96 (32) Exão 3 : A (Val) [Volpe e al. 2001]
β TUB282 282 (93) Exão 4 : G (Leu) [Edlind e al. 1992]
282 (93) Exão 4 : A (Leu) [Hause e al. 1997a]
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
A io edoxina educ ase (TRR) é uma enzima ci olí ica dimé ica que ca alisa a
edução de io edoxina, u ilizando NADPH, como co ac o . A io edoxina, na sua
o ma eduzida, é uma impo an e molécula dado a de elec ões em di e sas eacções
bioquímicas da célula, que incluem sinalização edox, espos a a p essão oxida i a e
edução de ligações dissul ido. Es a enzima es á implicada no c escimen o celula
(ac i ação de ac o es de ansc ipção e sín ese de DNA) e na pa ogenicidade de alguns
mic o ganismos [A ne & Holmg en 2000; Ku y e al. 2003]. No início do p esen e
século, os au o es de um es udo, onde se ca ac e izou o gene que codi ica pa a a
p o ease kexin-like de P. ji o ecii, localiza am o gene da io edoxina educ ase
imedia amen e a jusan e da sequência KEX1. Tal como o que sucede pa a o gene KEX1
de P. ji o ecii, o TRR1 é um gene de cópia única no genoma do o ganismo que in ec a
os humanos. Exis em dois ipos de io edoxinas educ ases, as de ele ado peso
molecula ( equen es em animais e p o ozoá ios como Plasmodium), que compo am
dois cen os ac i os edox, e as de baixo peso molecula ( equen es em plan as,
bac é ias e ungos), que apenas possuem um cen o ac i o edox, no domínio NADPH,
compos o po dois esíduos de cis eína sepa ados po ou os dois esíduos
aminoacídicos. A io edoxina educ ase codi icada po P. ji o ecii é de baixo peso
molecula , com um cen o ac i o edox CAVC (duas cis eínas sepa adas po uma
alanina e uma alina) localizado no domínio NADPH [Ku y e al. 2003]. A é à da a,
nenhum polimo ismo oi de ec ado no gene TRR1 de P. ji o ecii, exis indo apenas a
desc ição das sequências nucleo ídica e aminoacídica, e ec uada po Ku y e al. 2003.
No en an o, de ido à sua impo ância, es e gene ap esen a-se como um al o in e essan e
pa a o es udo de di e sidade em isolados de P. ji o ecii.
A imidila o sin e ase (TS) é uma enzima de e minan e no ciclo celula , sendo
esponsá el pela sín ese de no o de desoxi imidina mono os a o (dTMP), molécula
essencial pa a os mecanismos de sín ese e de epa ação de DNA. Es a enzima ca aliza a
me ilação educ i a de desoxiu idina mono os a o (dUMP) em dTMP, com a o mação
de dihid o ola o, molécula in e média da sín ese do ácido ólico ( igu a 14) [Edman e
al. 1989b; Ande son e al. 2000]. Sabe-se que, nos p o ozoá ios (ex. Leishmania e
Plasmodium), a TS e a DHFR cons i uem uma cadeia pep ídica única, codi icada no
mesmo c omossoma. Nessa p o eína bi uncional, os dois espec i os domínios
encon am-se sepa ados po um pép ido de junção. Num es udo, que deco eu no inal
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
da década de 80 do século passado, onde o gene da imidila o sin e ase de Pneumocys is
oi isolado e a sua exp essão oi es udada, e i icou-se que, nes e mic o ganismo, a TS e
a DHFR não se encon am ligadas, e que o gene TS es á p esen e no genoma de
Pneumocys is como uma cópia única. Es udos de clonagem, sequenciação e exp essão
da TS e da DHFR de P. ji o ecii con i ma am que ambas as enzimas são
mono uncionais e que os genes que as codi icam se localizam em di e en es
c omossomas [Edman e al. 1989a; Edman e al. 1989b; I ane ich & San i 1990;
Maza s e al. 1995]. Assim, o gene TS codi ica pa a uma enzima cons i u i a
(housekeeping), essencial pa a a iabilidade celula , sendo conside ada uma egião
conse ada. Es udos indicam di e sos polimo ismos nas sequências nucleo ídicas dos
genes TS isolados de di e en es espécies de hospedei os. Es e locus oi ambém
u ilizado em es udos molecula es de geno ipagem e biodi e sidade de P. ji o ecii, sem
que a é à da a enham sido desc i os polimo ismos. Po se a a de um gene que
codi ica pa a uma enzima cha e das ias me abólica dos pe cu so es de DNA e de ácido
ólico, a sua ca ac e ização pa ece se um impo an e ac o no es udo de isolados de
P. ji o ecii [Edman e al. 1989b; Maza s e al. 1995; La ouche e al. 1997a].
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
Figu a 14. Rep esen ação esquemá ica da ia biossin é ica do ácido ólico e da acção de
inibição do sul ame oxazol (SMZ) e do ime op im (TMP). PABA ; ácido
pa a-aminobenzóico.
11.3.3. Genes implicados em enómenos de esis ência aos á macos da amília das
sul as
O ácido ólico é um p ecu so essencial da sín ese de no o de pu inas (adenina e
guanina), imidina, glicina e me ionina. Ao con á io do hospedei o e eb ado,
P. ji o ecii não em a capacidade de ob e ácido ólico a pa i do ex e io da célula,
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
sendo absolu amen e dependen e do seu p óp io mecanismo de sín ese pa a ob e es a
molécula [Ko acs e al. 1989a; A ms ong e al. 2000]. A DHFR e a DHPS são enzimas
da ia me abólica do ácido ólico, al os da acção das diaminopi imidinas e dos
á macos da amília das sul as, como é exemplo, a combinação siné gica de á macos
TMP-SMZ, conside ado o á maco an i-P. ji o ecii de p imei a linha. Enquan o o TMP
ac ua como inibido compe i i o, in e e indo com a acção da DHFR e impossibili ando
a sín ese de e ahid o ola o, o SMZ em como al o a DHPS, ac uando como also
subs ac o pa a a enzima (inibido compe i i o), análogo do ácido pa a-aminobenzóico
(PABA), inibindo a sín ese de dihid op e oa o. Des e modo, a inibição da DHFR e da
DHPS, conduz a célula de P. ji o ecii ao colapso, po al a de bases nucleo ídicas
necessá ias pa a a epa ação, eplicação e ansc ipção de DNA, e po es ição de
aminoácidos pa a a sín ese p o eica [Ma e al. 1999; A ms ong e al. 2000]. O uso
gene alizado de TMP-SMZ, que na p o ilaxia, que no a amen o an i-P. ji o ecii,
du an e as úl imas ês décadas, conduziu a algumas ques ões ele an es, ace ca do
desen ol imen o de esis ência po pa e de P. ji o ecii ao TMP-SMZ, pois, es ão
desc i os ela os de oco ência de PPc em doen es sob p o ilaxia an i-P. ji o ecii.
O uso ala gado do á maco implica a exposição de doen es ao TMP-SMZ, com especial
ele ância pa a os se oposi i os pa a VIH, subme idos a p o ilaxia an i-P. ji o ecii,
podendo es e ac o es a associado, mui o p o a elmen e, com o desen ol imen o de
esis ências ao TMP-SMZ, desc i as, ambém, pa a ou os mic o ganismos [Lane e al.
1997; Ma in e al. 1999; Kazanjian e al. 2000; A ms ong e al. 2000; Cos a 2006].
A DHFR ao con e e dihid o ola o em e ahid o ola o, du an e a ia
biossin é ica do ácido ólico ( igu a 14), p omo e não só a sín ese de pu inas, mas
ambém in e e e na o mação de ou as moléculas com impo an es unções celula es,
como alguns aminoácidos [Schnell e al. 2004]. É econhecido que mu ações pon uais
de ec adas no gene DHFR são esponsá eis po um impo an e mecanismo de
esis ência, em di e sos mic o ganismos [Ma e al. 1999; Huang e al. 2004].
Recen emen e, alguns es udos êm analisado a a iabilidade gené ica do gene DHFR de
P. ji o ecii, a aliando a sua con ibuição pa a o desen ol imen o de esis ências ao
TMP. Nesses es udos, oi iden i icado um o al de 31 SNPs, dos quais oi o
co espondem a polimo ismos sinónimos e 23 a polimo ismos não sinónimos.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
No quad o VIII, encon am-se as a iações gené icas desc i as pa a o gene
DHFR de P. ji o ecii, em Po ugal [Ma e al. 1999; Takahashi e al. 2002b; Nahimana
e al. 2004; Robbe s e al. 2005; Cos a e al. 2006a]. A é ao momen o, a associação
en e a exposição ao TMP-SMZ e o aumen o da equência de mu ações no gene DHFR
de P. ji o ecii pe manece po cla i ica [Cos a 2006].
Quad o VIII. Va iações nucleo ídicas, de ec adas em Po ugal, pa a o gene DHFR de
P. ji o ecii. A cada um dos SNPs indicados, co esponde a e e ência bibliog á ica,
onde a sequência oi publicada pela p imei a ez.
SNP* Nucleó ido (aminoácido)
(posição : iden idade) Re e ência
DHFR38 38 (13) Exão 1 : T (Leu) [Ma e al. 1999]
38 (13) Exão 1 : C (Se ) [Cos a e al. 2006a]
DHFR68 68 (23) Exão 1 : A (Asn) [Ma e al. 1999]
68 (23) Exão 1 : G (Se ) [Cos a e al. 2006a]
DHFR92 92 (31) Exão 1 : C (Se ) [Ma e al. 1999]
92 (31) Exão 1 : T (Phe) [Cos a e al. 2006a]
DHFR154 154 (52) Exão 1 : A (Me ) [Ma e al. 1999]
154 (52) Exão 1 : T (Leu) [Cos a e al. 2006a]
DHFR200 200 (67) Exão 1 : C (Ala) [Ma e al. 1999]
200 (67) Exão 1 : T (Val) [Takahashi e al. 2002a]
DHFR201 201 (67) Exão 1 : T (Ala) [Ma e al. 1999]
201 (67) Exão 1 : A (Ala) [Cos a e al. 2006a]
DHFR272 272 In ão 1 : T [Ma e al. 1999]
272 In ão 1 : C [Cos a e al. 2006a]
DHFR312 312 (117) Exão 2 : T (Gly) [Ma e al. 1999]
312 (117) Exão 2 : C (Gly)
DHFR381 381 (140) Exão 2 : C (Se ) [Ma e al. 1999]
381 (140) Exão 2 : T (Se ) [Cos a e al. 2006a]
* Pa a além das a iações gené icas desc i as pa a o gene DHFR em Po ugal, são ambém conhecidos,
pa a es e loci, polimo ismos sinónimos nas posições 36, 277, 278 e 540, e polimo ismos não sinónimos
nas posições 40, 77, 107, 110, 156, 175, 188, 194, 235, 358, 422, 472, 500, 514, 539, 550, 553 e 632
[Ma e al. 1999; Takahashi e al. 2002b; Nahimana e al. 2004; Robbe s e al. 2005].
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
O gene DHPS de P. ji o ecii em indo a se es udado po in es igado es de
odo o Mundo no deco e dos úl imos anos. Es e in e esse de e-se à oco ência de
mu ações no gene DHPS que podem, e en ualmen e, se uma consequência da
exposição às sul as, po pa e do mic o ganismo. Alguns des es es udos demons a am
que mu ações especí icas nes e gene es ão associadas ao insucesso da p o ilaxia com
sul as, em doen es com sida que desen ol e am PPc. Es a ine icácia p o ilá ica pode á
indica que es as mu ações es ão, de alguma o ma, elacionadas com a eme gência de
es i pes de P. ji o ecii esis en es à acção des a amília de á macos [Kazanjian e al.
1998; Mei e al. 1998; Ma e al. 1999; Takahashi e al. 2000; Kazanjian e al. 2000;
Cos a e al. 2003]. Em meados da década de 90, do século passado, o gene DHPS de
P. ji o ecii oi sequenciado e ca ac e izado, e i icando-se que az pa e de uma
sequência única que codi ica pa a uma p o eína i uncional, esponsá el pela sín ese de
ácido ólico ( igu a 14), a FAS do inglês olic acid syn hesis, compos a pela DHPS, a
dihid oneop e ina aldolase e a hid oxime ildihid op e ina pi o os ocinase. No deco e
dessa década, es udos molecula es pe mi i am a iden i icação de seis polimo ismos em
zonas conse adas do gene DHPS, mais conc ec amen e nos codões 23, 55, 57, 60, 111,
171 e 248. [Volpe e al. 1993; Lane e al. 1997; Ma e al. 1999; Ma os & Es e es
2010a]. Recen emen e, o am ac escen adas mais cinco a iações nucleo ídicas à lis a
de polimo ismos do gene DHPS de P. ji o ecii, nos codões 75, 78, 83, 87 e 100
[Robbe s e al. 2005; Riebold e al. 2006; Ma os & Es e es 2010a]. Com a excepção
dos polimo ismos sinónimos dos codões 83 e 171, odas as al e ações co espondem a
polimo ismos não sinónimos que conduzem a mu ações na p o eína. Di e sos es udos
o am ealizados com o in ui o de a e igua a elação en e mu ações no gene DHPS e
casos de insucesso e apêu ico ou p o ilá ico. Os esul ados de alguns desses es udos
indicam uma po encial associação en e genó ipos com mu ações simples ou duplas,
iden i icadas nos codões 55 e 57 do gene DHPS, e a exposição às sul as, bem como a
esis ência p o ilá ica ao TMP-SMZ, suge indo que es as mu ações pode ão implica a
edução da sensibilidade de P. ji o ecii às sul as. Os esíduos aminoacídicos 55 e 57
es ão localizados numa egião al amen e conse ada da enzima, mui o semelhan e en e
di e sos mic o ganismos, e que se pensa es a en ol ida na ligação ao subs ac o
(dihid op e idina) e às sul as. Mu ações nes es locais, ou nas suas p oximidades, podem
es a implicadas no ea anjo es u u al da enzima, a ec ando a sua ac i idade
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
[Kazanjian e al. 1998; Mei e al. 1998; Ma e al. 1999; Helweg-La sen e al. 1999;
Takahashi e al. 2000; A ms ong e al. 2000; Cos a e al. 2005; Ma os & Es e es
2010a]. Po es as azões, as mu ações dos codões 55 e 57 são as a iações mais
es udadas da sequência do gene DHPS. Es as subs i uições pon uais, não sinónimas,
pe mi em a iden i icação de di e en es genó ipos de P. ji o ecii, con o me o ipo de
polimo ismo de ec ado (quad o IX).
Quad o IX. Va iações nucleo ídicas mais es udadas no gene DHPS de P. ji o ecii. As
a iações nucleo ídicas dos codões 55 e 57 o am desc i as po Lane e al. 1997.
SNP Nucleó ido (aminoácido)
(posição : iden idade)
DHPS165 165 (55) : A (Th )
165 (55) : G (Ala)
DHPS171 171 (57) : C (P o)
171 (57) : T (Se )
Todas es as a iações suge em que o uso gene alizado da combinação
TMP-SMZ pode á es a a causa p essão selec i a sob e os genó ipos de P. ji o ecii que
ci culam nos hospedei os humanos. Apesa de não es a em comple amen e escla ecidos
os e ei os de de e minados polimo ismos nos genes DHFR e DHPS na ap esen ação e,
em especial, na e olução clínica, da pneumocis ose, es es genes nuclea es de cópia
única de em se semp e conside ados nos es udos que enham como objec i o cla i ica
as causas do po encial desen ol imen o de esis ência ao TMP-SMZ, em P. ji o ecii.
11.3.4. Genes elacionados com p op iedades de supe ície
As egiões sub elomé icas dos c omossomas de mui os o ganismos con êm
amílias de genes especí icos que pe mi em, sob de e minadas condições, adap ação ao
ambien e en ol en e, e, ambém, adap ação a al e ações que oco em nesse mesmo
ambien e. Em mui os pa asi as, es as amílias de genes sub elomé icos codi icam pa a
p o eínas esponsá eis pela a iação an igénica. Es udos indicam que o genoma de
Pneumocys is con ém uma amília impo an e de sequências múl iplas, que se epe em
dezenas de ezes nas egiões sub elomé icas dos c omossomas, e que codi icam pa a as
glicop o eínas majo de supe ície (MSG) [S inge & Keely 2001; Es e es e al. 2009].
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
As MSGs são as p incipais p o eínas de supe ície de P. ji o ecii. Es as
glicop o eínas in e êm na ade ência do pa asi a aos pneumóci os do lúmen al eola e,
ao mesmo empo, pe mi em que o mic o ganismo desen ol a um p ocesso e asi o ao
sis ema de de esa do hospedei o, a a és de um mecanismo de a iação an igénica de
supe ície. Codi icadas po uma amília de genes, com ap oximadamen e 100 memb os,
o ganizados em clus e s de ês ou mais genes dispos os em sé ie, a sua exp essão
apa en a se egulada de modo a que oco am ea anjos gené icos p og amados. À ez,
e de o ma indi idual, di e en es genes de MSG são colocados e e i ados de um único
local do genoma pelo qual o RNA mensagei o (mRNA) das MSGs é ansc i o. Com
es a cons a ação, comp eendeu-se que a a iação na exp essão de MSGs é mediada po
uma egião conse ada, a qual oi denominada de UCS [Wada & Nakamu a 1996;
Sunkin & S inge 1996; Sunkin e al. 1998; S inge 2007; Ku y e al. 2008]. A UCS
ence a em si uma sequência comum a odas as MSGs exp essas. O local de exp essão
das MSGs engloba a egião comum UCS e uma ou a egião p óxima, a jusan e,
esponsá el pela pa e a iá el des a amília de genes. O modelo p opos o pa a o
con olo da exp essão da amília de genes das MSGs consis e na o ganização em
clus e s ansc ipcionais silenciados, localizados nos e minais c omossómicos. Apenas
é ansc i o o gene MSG localizado a jusan e do locus UCS, pelo que somen e uma
iso o ma de MSG é exp essa à supe ície ( igu a 15). Po ha e , apenas, um locus UCS,
pensa-se que a MSG de supe ície é al e ada, quando o gene MSG é ocado nessa
egião. A oca de MSG (swi ching) esul a numa a iedade de MSGs na supe ície de
mic o ganismos em di e en es populações, como, ambém, numa mesma população,
inc emen ando uma o e di e enciação an igénica de supe ície [Sunkin e al. 1998;
Ku y e al. 2001].
A capacidade de P. ji o ecii em exp essa di e en es p o eínas de supe ície
pode es a na génese da esis ência e/ou escapa ó ia ao sis ema imunológico do
hospedei o, icando e iden e que à supe ície, as MSGs es ão, p o undamen e,
en ol idas que no econhecimen o, que na ligação ao hospedei o [S inge & Keely
2001; Es e es e al. 2009]. A egião UCS con ém sequências de epe ição ca ac e ís icas
e alguns polimo ismos, que podem se ú eis na geno ipagem de isolados de P. ji o ecii,
al como es á desc i o nos quad os X e XI.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
Expec o ação Induzida (EI). Num passo inicial, adiciona-se, à amos a, igual
olume de di io ei ol (0,1%). Es e é um agen e químico mucolí ico que é adicionado à
amos a com o objec i o de sol e e solubiliza as pa ículas e ag egados de muco.
Agi a-se igo osamen e, a é que a mis u a se encon e bem homogeneizada. Coloca-se a
mis u a na es u a du an e 30 minu os a 37ºC, pa a que o di io ei ol ac ue. A amos a
lique ei a é ans e ida pa a um ubo de cen í uga, adiciona-se ampão os a o salino
(PBS do inglês phospha e bu e ed saline), 150 mM, com pH 7,2 (SIGMA), a é
p eenche o olume do ubo, le ando-se a cen i uga a 4100 g, du an e 20 minu os.
O PBS compo a-se como um ampão es abilizan e e a cen i ugação se e pa a
concen a as células de P. ji o ecii que icam no sedimen o. O sedimen o é compos o
po uma g ande a iedade de células e de de i os que exis em na u almen e nes e ipo
de p odu os biológicos, pa a além de P. ji o ecii. O sob enadan e é ejei ado,
seguindo-se a essuspensão do sedimen o em 0,5 ml de PBS. Fazem-se cinco
es egaços, com ap oximadamen e 50 µl de amos a cada, em lâminas de mic oscopia
p é- a adas com poli-L-lisina ( ide Anexo II). Deixa-se seca , à empe a u a ambien e
(no in e io de “ho e”), di idindo-se o es an e olume da amos a pa a mic o ubos de
1,5 ml. Quando secos, os es egaços são ixados em ace ona, du an e 10 minu os, à
empe a u a ambien e.
La ado b oncoal eola (LBA). Es e p o ocolo é bas an e semelhan e ao
ap esen ado pa a as amos as de EI, no en an o, como as amos as de LBA,
no malmen e, não apa en am muco, inicia-se o p ocessamen o ans e indo a amos a
di ec amen e pa a um ubo de cen í uga, pe azendo-se o olume do ubo com PBS e
cen i ugando-se a mis u a (4100 g). A pa i des e pon o, o p ocedimen o é igual ao
indicado pa a as amos as de EI.
No inal de ambos os p ocedimen os, uma das cinco lâminas de mic oscopia
com o es egaço (ma e ial biológico concen ado) é usada pa a e ec ua a écnica de
IFI/AcM e as es an es são conse adas a -20ºC, pa a pos e io es udo ou pa a
con i mação de algum esul ado, caso seja necessá io. Os ubos con endo a amos a
concen ada são a mazenados a -80ºC, de modo a conse a in ac o odo o ma e ial
biológico.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
11.4.4. Diagnós ico pa asi ológico de Pneumocys is ji o ecii
Nes a secção p e ende-se desc e e o p ocedimen o pa a a a aliação
mic obiológica e molecula de P. ji o ecii, em amos as de sec eções pulmona es.
A écnica de de ecção de P. ji o ecii po IFI/AcM é conside ada como a e e ência pa a
o diagnós ico da pneumocis ose, em amos as de sec eções pulmona es, pois, é bas an e
iá el e sensí el na de ecção de quis os de P. ji o ecii [Baughman e al. 1989;
Lau enschlage e al. 1996; Ba a e al. 2002]. Es a écnica consis e na iden i icação de
o ganismos de P. ji o ecii pelos seus an igénios de supe ície, u ilizando AcM
especí icos. Pa a o e ei o, oi u ilizado um p o ocolo come cial (MonoFluo® Ki
P. ji o ecii, BioRad) e a écnica oi execu ada com base nas ins uções do ab ican e:
1) Diges ão enzimá ica: Inicialmen e, a enzima é econs i uída com 250 µl de
ácido clo íd ico (HCl) 0,001 M. Numa lâmina de mic oscopia, com es egaço da
amos a, ixado com ace ona, colocam-se 20 µl de enzima diluída (1:10 com ampão
especí ico o necido pelo ab ican e) di ec amen e sob e o es egaço, espalhando-se
sua emen e. Coloca-se a lâmina em câma a húmida na es u a, a 37ºC e agua dam-se
30 minu os, conside ando-se, es e pe íodo de empo, como o ideal pa a que a enzima
ac ue sob e a camada mais expos a da pa ede celula dos quis os de P. ji o ecii de
o ma a expo , p eponde an emen e, os an igénios de supe ície. A enzima e e ida, é a
ipsina que pe ence à amília das p o eases sé icas, que ca alisam a hid ólise de
p o eínas nas ligações pep ídicas in e nas en e di e en es ipos de aminoácidos. Es a
p o ease ai ac ua sob e as p o eínas de supe ície, pe mi indo que os an igénios
especí icos iquem mais expos os e po isso mais acessí eis aos an ico pos. A incubação
de e demo a os 30 minu os indicados pelo ab ican e, pa a que não oco a
sob ediges ão ou subdiges ão das pa edes quís icas.
2) Reacção com o AcM: Logo após a incubação, a lâmina é la ada,
cuidadosamen e, com água desionizada. Sob e o es egaço bem seco, aplicam-se 20 µl
da solução de AcM especí ico. O es egaço, com o AcM an i-P. ji o ecii ai a incuba
em câma a húmida, a 37ºC, du an e 15 minu os. Es e AcM, p oduzido e pu i icados a
pa i de a os, é especí ico pa a os an igénios p esen es na pa ede dos quis os de
P. ji o ecii.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
3) Reacção com o conjugado com luo esceína: Passados os 15 minu os,
la a-se a lâmina com água des ilada, secando-se em seguida. Deposi am-se 20 µl de
solução de conjugado com iso iociana o de luo esceína sob e o es egaço, seguindo-se
incubação em câma a húmida du an e 15 minu os, a 37ºC. Es e conjugado consis e num
an i-an ico po (IgM) conjugado com iso iociana o de luo esceína, o qual ai eagi e,
consequen emen e, liga -se ao an ico po que já se encon a conec ado aos an igénios de
supe ície da pa ede dos quis os de P. ji o ecii. A luo esceína, quando expos a a uma
luz de comp imen o de onda de 475 nm emi e luo escência de co e de limão
ca ac e ís ica.
4) Obse ação po mic oscopia de luo escência: Po im, mon a-se a
p epa ação com o meio de mon agem o necido (glice ina amponada), icando es a
p on a pa a se obse ada ao mic oscópio óp ico de luo escência no comp imen o de
onda de 475 nm. Um es egaço é conside ado posi i o quando apa en a quis os o ais ou
a edondados com ce ca de 4-5 µm de diâme o, com co e de limão ca ac e ís ica
( igu a 12.B). Um es e con endo mais do que um quis o luo escen e é conside ado
posi i o e um es e que con enha apenas um quis o é conside ado inconclusi o, de endo
se epe ido.
Pa a além do diagnós ico pa asi á io, a écnica de IFI/AcM oi aplicada na
quan i icação das ca gas pa asi á ias das amos as em es udo. Assim, a ca ga pa asi á ia
de cada um dos isolados de P. ji o ecii, oi es imada po con agem do núme o de
quis os obse ados nos es egaços e ec uados, a pa i das sec eções pulmona es, al
como o desc i o no quad o XII.
Quad o XII. C i é io pa a a de e minação da ca ga pa asi á ia dos isolados de
P. ji o ecii, englobados no p esen e es udo.
Ca ga Pa asi á ia N.º de quis os de P. ji o ecii de ec ados po IFI/AcM (X1000)
Baixa* Nenhum quis o iden i icado em 30 campos (posi i o po PCR)
Mode ada Um a 30 quis os de ec ados em 30 campos
Ele ada Dois ou mais quis os de ec ados num campo
*Amos as de sec eções pulmona es, nega i as po IFI/AcM, mas posi i as pa a P. ji o ecii po de ecção
molecula (PCR nes ed).
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
11.4.5. Ex acção de DNA
O DNA genómico de P. ji o ecii oi ex aído, eco endo-se ao mé odo do Mini
Beadbee e / iociana o de guanidina-sílica, uma écnica de ex acção de DNA, adap ada
de ou os au o es [Boom e al. 1990; McLauchlin e al. 2000; Al es e al. 2001], que
assen a em qua o e apas. Assim, um milili o da amos a, p e iamen e p ocessada e
gua dada a -80ºC, é cen i ugado a 23100 g, du an e 10 minu os, seguindo-se:
1) Lise celula : Em ubos de 2 ml, pesam-se 0,3 g de pa ículas de zi cónio com
0,5 mm de diâme o (Biospec P oduc s), adicionam-se 900 µl de ampão de lise
( ide Anexo II), 60 µl de álcool isoamílico e, po úl imo, 300 µl do sedimen o ob ido,
após p ocessamen o das amos as. Agi am-se os ubos à elocidade máxima
(2800 oscilações/minu o), du an e dois minu os, no apa elho Mini Beadbee e (Biospec
P oduc s – Howaw dTH Indus ies). O ampão de lise p o oca o eben amen o celula ,
que é exponenciado pelo s ess mecânico, p omo ido pela acção das pa ículas de
zi cónio a al a elocidade. Po seu lado, o álcool isoamílico, é um compos o o gânico,
que ac ua, de imedia o, como sol en e de ma é ia o gânica p o enien e da lise celula ,
sendo, po isso, indicado pa a p o ocolos de pu i icação de ácidos nucleicos.
P ossegue-se com uma cen i ugação a 20200 g, du an e 15 segundos, de o ma a
sedimen a os de i os insolú eis, as pa ículas de zi cónio, e, a dissipa a espuma que é
p oduzida du an e o p ocesso de agi ação no Mini Beadbee e . Es a e apa e mina com a
ans e ência do sob enadan e esul an e da cen i ugação pa a um mic o ubo de 1,5 ml.
2) Adso ção de DNA: Ao mic o ubo de 1,5 ml, adicionam-se 35 µl da
suspensão aquosa de sílica ac i ada (1%, pH 2,0) ( ide Anexo II). A mis u a é agi ada
igo osamen e e é deixada a incuba à empe a u a ambien e, no agi ado o a i o
(F öbel Labo echnik GmbH), a elocidade mode ada, du an e uma ho a. Nes e pe íodo
de agi ação cons an e, o DNA, po e o e a inidade pa a as pa ículas de sílica
ac i ada, ica adso ido a es as, saindo de solução. Após es a incubação, az-se uma
b e e cen i ugação, du an e 15 segundos, a 23100 g, pa a que a sílica ac i ada com o
DNA adso ido, sedimen e. Desp eza-se o sob enadan e e com es e passo elimina-se
uma g ande quan idade de con aminan es e de moléculas que podem p o oca
in e e ências no deco e da expe imen ação.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
3) La agem: Cada uma das la agens abaixo desc i as consis e na essuspensão
da sílica em 200 µl da solução ou sol en e ap op iados e na cen i ugação à elocidade
máxima (23100 g), du an e 15 segundos. Em p imei o luga , azem-se duas la agens,
com ampão de la agem ( ide Anexo II), de o ma a que os de i os e as pa ículas
con aminan es, que se encon am adso idos à sílica, sejam eliminados. Segue-se uma
la agem com e anol a 80%, que, basicamen e, pe mi e sol e ma e ial o gânico
con aminan e. O mesmo sucede pa a a úl ima la agem, com ace ona absolu a, que no
inal é desp ezada, sendo o ubo colocado a seca no apa elho Block Hea e (S ua
Scien i ic) a 70ºC, a é à e apo ação comple a do sol en e.
4) Eluição de DNA: Ressuspende-se a sílica ac i ada com o DNA adso ido,
em 50 µl de água desionizada es é il, incubando-se a 60ºC, du an e cinco minu os, no
apa elho Block Hea e , de o ma a acili a a eluição do DNA. Es a é conside ada a
empe a u a ideal pa a que oco a uma boa eluição do DNA da sílica pa a a água.
Sedimen a-se a sílica po cen i ugação a 23100 g, du an e dois minu os, ecolhendo-se
o sob enadan e com o DNA dissol ido, pa a mic o ubos de 1,5 ml. Os ubos com as
amos as de DNA em solução aquosa são de idamen e gua dados a –20ºC.
11.4.6. Diagnós ico molecula de Pneumocys is ji o ecii
A écnica de PCR é uma das mais u ilizadas em biologia molecula , a ando-se
de um p ocedimen o ápido, com baixos cus os e que pe mi e ob e um ele ado núme o
de cópias, a pa i de uma pequena quan idade de DNA. Es a écnica pe mi e a
ampli icação especí ica de uma sequência de DNA, a a és de uma eacção de ex ensão,
designada po p ime ex ension, em ambas as cadeias da sequência molde. Des e modo,
p omo e-se a sín ese de uma cadeia complemen a à cadeia molde, na di ecção 5’ → 3’,
po acção de uma enzima polime ase.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
O p ocesso de ampli icação di ide-se em ês e apas, que se epe em ao longo de
30 a 50 ciclos:
1) Desna u ação da cadeia dupla de DNA, po acção do aumen o da empe a u a
(94ºC a 95ºC);
2) Ligação dos p ime s (annealing) às egiões complemen a es de ambas as
cadeias e início da acção da polime ase (dependen e da empe a u a de
hib idação especí ica de cada p ime );
3) Ex enção da eacção de polime ização, com inco po ação de
desoxi ibonucleó idos (dNTPs), po acção da empe a u a (72ºC), que pe mi e a
acção con ínua da polime ase.
Exis e ainda um passo de ac i ação da polime ase (95ºC), que p ecede o início
dos ciclos de ampli icação e, um passo de ex ensão inal (72ºC), que ga an e um
ele ado endimen o dos p odu os de eacção, e que oco e após os ciclos de
ampli icação.
No p esen e es udo, o diagnós ico molecula de P. ji o ecii consis iu na
ampli icação e de ecção de um segmen o de DNA especí ico (m LSU RNA), a a és da
écnica de PCR nes ed, após ex acção do DNA genómico do mic o ganismo.
Ampli icação de um agmen o do gene m LSU RNA de P. ji o ecii. As
sec eções pulmona es subme idas pa a o diagnós ico da PPc que ap esen a am esul ado
nega i o pela écnica de IFI/AcM, o am subme idas à de ecção de DNA especí ico de
P. ji o ecii. A iden i icação molecula oi e ec uada po ampli icação de um agmen o
do gene m LSU RNA de P. ji o ecii, com 263 pb, a a és de uma PCR nes ed, desc i a
an e io men e [Wake ield e al. 1990a; Tambu ini e al. 1996; Ma os 1999; Cos a
2006]. Es a écnica de PCR consis e num p o ocolo bas an e obus o e sensí el, no que
se e e e à ampli icação especí ica das egiões do DNA al o, baseando-se em duas
eacções de ampli icação consecu i as, com dois conjun os de sequências iniciado as
(p ime s) dis in as, di igidas pa a um gene mul icópia do genoma de P. ji o ecii
(quad o XIII). O conjun o mais ex e no de p ime s, co esponden e à 1ª pa e da eacção
de ampli icação e, o ou o, mais in e no, co esponden e à 2ª pa e, ambos ab angendo a
sequência de DNA a ampli ica .
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
Quad o XIII. Sequências dos p ime s u ilizados na ampli icação do gene m LSU RNA
de P. ji o ecii po PCR nes ed, e suas ca ac e ís icas (dimensão do oligonucleó ido,
empe a u a de hib idação, designada po TA, con eúdo em CG e amanho do agmen o
de ampli icação).
PCR P ime Sequencia (5’→ 3’) Dimensão
(pb)
TA
(ºC)
GC
(%)
Amplicão
(pb)
1ª
Pa e
pAZ 102-E GATGGCTGTTTCCAAGCCCA 20 59,4 55 346
pAZ 102-H GTGTACGTTGCAAAGTACTC 20 55,3 45
2ª
Pa e
pAZ 102-X GTGAAATACAAATCGGACTAGG 22 56,5 41 263
pAZ 102-Y TCACTTAATATTAATTGGGGAGC 23 55,3 35
A écnica de PCR nes ed compo a de e minadas componen es e condições
eaccionais indispensá eis. Assim, po cada amos a, p epa ou-se uma mis u a de
ampli icação con endo 1x ampão de eacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM T is-HCL
[pH 8,8], 0,01% ween-20; Bioline), 0,8 mM de uma mis u a de dNTPs (dATP, dCTP,
dGTP e dTTP) (Applied Biosys ems), 0,2 µM de cada p ime (pAZ 102-E e pAZ 102-H
na 1ª pa e; pAZ 102-X e pAZ 102-Y na 2ª pa e; MWG Bio ech), 2,5 mM de clo e o de
magnésio (MgCl2) (Bioline), 0,75 U de Bio aqTM DNA polime ase (Bioline), 0,01 µg/µl
de albumina sé ica bo ina, BSA do inglês bo ine se um albumin (SIGMA), 2 µl de
DNA genómico, ob ido após ex acção pelo mé odo do Mini Beadbee e / iociana o de
guanidina-sílica, e água desionizada es é il, pe azendo o olume inal de 50 µl. Pa a
moni o iza a qualidade dos esul ados, em cada ensaio de ampli icação, o am
incluídos, um con olo posi i o (suspensão de DNA de P. ji o ecii) e um con olo
nega i o (água desionizada es é il), subs i uindo, nas espec i as eacções, os 2 µl de
DNA genómico das amos as. As componen es é micas da eacção, desc i as no quad o
XIV, o am aplicadas num e mociclado (T1 The mocycle ; Biome a), onde deco eu
a ampli icação do DNA de P. ji o ecii.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
Quad o XIV. Condições é micas aplicadas na PCR nes ed, pa a ampli icação
especí ica do gene m LSU RNA de P. ji o ecii.
Condições de ampli icação*
Desna u ação inicial 95ºC, 3 minu os
Desna u ação 95ºC, 1,5 minu os
Ligação 55ºC, 1,5 minu os x 40 ciclos
Ex ensão 72ºC, 2 minu os
Ex ensão inal 72ºC, 10 minu os
*As condições é micas de ampli icação são iguais na 1ª e na 2ª pa e da PCR nes ed.
Visualização do DNA ampli icado. O DNA ampli icado po PCR oi subme ido
a elec o o ese em gel de aga ose, pa a pos e io a aliação dos p odu os de
ampli icação. A 10 µl de p odu o de eacção, adicionou-se 1 µl de ampão de aplicação
(Fe men as). Da mesma o ma, a 1 µl de ma cado molecula (Gene Rule TM 100 pb;
Fe men as), adicionou-se 1 µl de ampão de aplicação e 9 µl de água desionizada es é il.
Numa ina de elec o o ese, aplicou-se um gel de aga ose a 2% (m/ ) (SeaKem® LE;
FMC BioP oduc s), em ampão TAE 1X (T is-Ace a o 0,04 M; EDTA 0,001 M;
pH 8,3), no qual oi inco po ado b ome o de e ídio (SIGMA), a uma azão de 0,5 mg/L.
Aplica am-se as amos as nos espec i os poços e, a sepa ação elec o o é ica oi
e ec uada a 60 ol s (V), du an e, ap oximadamen e, uma ho a. Os agmen os de DNA
ampli icados o am isualizados, po acção de luz ul a iole a, num ansiluminado
(ECX-20.M; Vilbe Lou ma ). Os esul ados o am egis ados com uma máquina
o og á ica digi al do sis ema de aquisição de imagem inco po ado ao ansiluminado
(Powe Sho A710 IS; Canon). O DNA in e calado com as moléculas de b ome o de
e ídio o na-se luo escen es de ido à p esença des e compos o químico, que,
ca ac e is icamen e, ica exci ado, emi indo luo escência quando lhe é incidida
adiação ul a iole a. Assim, odas as amos as con endo DNA ampli icado emi em a
luo escência ca ac e ís ica, o necida pelo b ome o de e ídio, podendo-se e i ica a
qualidade da eacção da PCR, pela de e minação das dimensões molecula es dos
agmen os ampli icados.
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
11.4.7. Ca ac e ização gené ica das egiões de in e esse
A ca ac e ização gené ica dos isolados de P. ji o ecii, iden i icados po mé odos
pa asi ológicos e molecula es, e que cump i am os c i é ios de inclusão do p esen e
es udo, oi e ec uada em 10 loci, conside ados de in e esse, nomeadamen e, os genes
m LSU RNA, CYB, SOD, β TUB, TRR1, TS, DHFR, DHPS, UCS e KEX1.
Tendo po base as sequências nucleo ídicas dos genes CYB, SOD, β TUB, TRR1,
TS, UCS e KEX1, o am desenhados p ime s especí icos, u ilizando-se o p og ama
bioin o má ico P ime 3.0 P og am ( e são 0.4.0), disponí el on-line
(h p:// odo.wi.mi .edu/cgi-bin/p ime 3/p ime 3.cgi). A escolha dos p ime s pa a
ampli icação das egiões de in e esse, obedeceu a c i é ios que incluí am, as dimensões
das sequências oligonuclo ídicas, as ca ac e ís icas conse adas das zonas de ligação
(annealing), a empe a u a de hib idação, o con eúdo CG, a ausência de es u u as
secundá ias e de díme os de p ime s. Es es p ime s o am desenhados pa a uma
empe a u a de hib idação de 61,5ºC, endo sido sin e izados pela MWG Bio ech.
Os genes m LSU RNA e DHFR o am ampli icados eco endo-se a pa es de p ime s,
p e iamen e desc i os [Wake ield e al. 1990a; Tambu ini e al. 1996; Ma e al. 1999].
Pa a es es dois loci, de en e as sequências disponí eis, o am seleccionados os pa es de
p ime s que ap esen a am melho es esul ados de ampli icação (bandas bem de inidas
após co ida elec o o é ica em gel de aga ose e ele adas quan idades de p odu o de
PCR). Finalmen e, o gene DHPS oi ca ac e izado u ilizando-se a écnica de PCR
nes ed, seguida de RFLP [Helweg-La sen e al. 2000; Cos a e al. 2005; Es e es e al.
2008]. No quad o XV, encon am-se desc i as odas as sequências de oligonucleó idos,
u ilizadas pa a a ca ac e ização dos genes em es udo, e as dimensões dos espec i os
p odu os de PCR (amplicões).
11. A aliação da di e sidade gené ica de Pneumocys is ji o ecii: selecção de al os molecula es.
Quad o XV. Sequências nucleo ídicas e ca ac e ís icas (dimensão do oligonucleó ido,
empe a u a de hib idação, designada po TA, con eúdo em CG e amanho do agmen o
de ampli icação) dos p ime s u ilizados pa a ampli icação e sequenciação di ec a dos
genes conside ados de in e esse pa a o es udo da a iabilidade gené ica de P. ji o ecii e
da sua po encial elação com ac o es da in ecção.
Locus P ime Sequencia (5’→ 3’) Dimensão
(pb)
TA
(ºC)
GC
(%)
Amplicão
(pb)
m LSU RNA pAZ102-X a GTGAAATACAAATCGGACTAGG 22 56,5 41 304
pAZ102-E a GATGGCTGTTTCCAAGCCCA 20 59,4 55
CYB Cy bFw CCCAGAATTCTCGTTTGGTCTATT 24 61,8 42 638
Cy bRw AAGAGGTCTAAAAGCAGAACCTCAA 25 61,1 40
SOD MnSODFw GGGTTTAATTAGTCTTTTTAGGCAC 25 61,8 36 448
MnSODRw CACTTCCTTGAATCCCAGACAA 22 61,4 58
Β TUB Β- ubFw GAGGGAGCGGAATTGGTAGATA 22 61,6 50 541
Β- ubRw GGAGCAAACCCAACCATGA 19 61,9 53
TRR1 TRR1Fw ATGGCAACTGGGGCGTAT 18 61,3 56 631
TRR1Fw CAAGTCCTGCCATACATCCACT 22 61,3 50
TS TSFw GTTTCAATGGCGACACTTCG 20 61,6 50 376
TSRw GGAACACCTAGCCCCATGTC 20 61,7 60
DHFR FR208
b
GCAGAAAGTAGGTACATTATTACGAGA 27 58,6 37 831
FR1018
b
GCTTCAAACCTTGTGTAACGCG 22 64,0 50
DHPS
(1ª Pa e)
Dp15 c TCTGAATTTTATAAAGCGCCTACAC 25 58,1 36 785
Dp800 c ATTTCATAAACATCATGAACCCG 23 55,3 35
DHPS
(2ª Pa e)
DHFR-NF
d
AAATGCAGGGGCGACGATAAT 21 57,2 48 186
DHPS-NR
d
GCCTTAATTGCTTGTTCTGCAA 22 54,5 41
UCS UCSFw GCCCATCTCCTGTTTTAGTGTCTTA 25 61,9 44 814
UCSRw AAATGCATCCTAAGCTCCAAGTC 23 61,0 43
KEX1 KEX1Fw GACGATGATGGAAAAACTGTTGA 23 61,3 39 738
KEX1Rw TGGGTTGGATATGACTAGTGAAGACT 26 61,4 42
Os p ime s pa a ampli icação dos genes CYB, SOD, β TUB, TRR1, TS, UCS e KEX1, o am desenhados
no deco e do p esen e es udo. Os es an es p ime s o am p e iamen e desc i os po ou os au o es:
a [Wake ield e al. 1990a; Tambu ini e al. 1996]
b [Ma e al. 1999]
c [Helweg-La sen e al. 1999]
d [Cos a e al. 2005]
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
calculada com base numa amos a pad ão do gene KEX1, endo sido aplicado na
quan i icação de DNA de P. ji o ecii pa a a p epa ação de pools. Des e modo, um
p o ocolo de p epa ação de pools de DNA oi aplicado pela p imei a ez ao es udo de
P. ji o ecii, demons ando se uma ino ado a écnica pa a a de e minação da
impo ância de SNPs especí icos, endo em con a as suas equências em subg upos de
isolados com ca ac e ís icas clínicas dis in as.
A associação das écnicas de PCR mul iplex/SBE e de DNA pooling, aplicada
pela p imei a ez no es udo de isolados de P. ji o ecii, demons ou se uma
me odologia obus a e especí ica pa a o es udo de SNPs, ca ac e izando-se po uma
abo dagem de al o endimen o, com moni o ização dinâmica do p ocedimen o
expe imen al, a qual pe mi iu a iden i icação e classi icação de múl iplos SNPs
elacionados com di e en es pa âme os clínicos. Com es a in o mação, p e ende-se que
a PCR mul iplex/SBE possa se i como uma écnica u ilizada pa a o p ognós ico da
in ecção po P. ji o ecii. Ao pe mi i , de uma o ma ápida, sensí el e especí ica a
iden i icação de múl iplos SNPs de P. ji o ecii, elacionados com di e en es g aus de
se e idade da doença, es a écnica pode se aplicada no as eio de amos as de
sec eções pulmona es, ob idas de doen es com suspei a de pneumocis ose, podendo-se
desde logo, disponibiliza in o mação ace ca do isolado, e se es e ap esen a genó ipos
elacionados com alguma ca ac e ís ica especí ica da in ecção. Com es a abo dagem
p e ende-se que o clínico possa ob e in o mação p é ia sob e os o ganismos de
P. ji o ecii que in ec am um de e minado doen e, podendo es a in o mação auxilia as
suas decisões.
Ou os es udos de e ão se ealizados, conside ando pools p o enien es de
di e sas egiões geog á icas e com um maio núme o de isolados, bem como pools
cons i uídos po isolados com ou as ca ac e ís icas clínicas, englobando pa a além das
ca gas pa asi á ias e da e olução clínica dos doen es, pa âme os, ais como, diagnós ico
clínico, con agem de lin óci os TCD4+, p o ilaxia, e apêu ica, e dados demog á icos
como a idade dos doen es. Des a o ma, pode -se-á es abelece em de ini i o,
associações en e ca ac e ís icas gené icas especí icas do pa ogénio e os pa âme os da
in ecção, de modo a que écnicas p ecisas de iden i icação de SNPs ele an es de
P. ji o ecii, ais como a PCR mul iplex/SBE, possam se u ilizadas como me odologias
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
complemen a es de apoio na iden i icação e ca ac e ização dos casos de PPc, auxiliando
as decisões clínicas.
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
13. Discussão ge al e pe spec i as u u as
13.1. Discussão ge al
P. ji o ecii é econhecido como uma impo an e causa de pneumonia em doen es
imunocomp ome idos, com especial ele ância no g upo de doen es se oposi i os pa a
VIH. Di e sos es udos molecula es demons a am que sequências polimó icas de DNA
são equen emen e de ec adas em isolados de P. ji o ecii, suge indo que a a iação
gené ica é comum nes e mic o ganismo e que di e sos sub ipos gené icos podem exis i
[Lee e al. 1993; Lu e al. 1994; Wake ield 1998; Hause e al. 1998; Mo is e al. 2004;
Beck & Cushion 2009; Es e es e al. 2010a; Es e es e al. 2010b; Ma os & Es e es
2010b]. A é ao momen o, as en a i as de associa genó ipos especí icos des e agen e
pa ogénico opo unis a com a in o mação clínica, ou com pa âme os da in ecção, êm
sido inconclusi as. As azões pelas quais alguns doen es so em de g aus mode ados de
PPc, com espos a a o á el aos egimes e apêu icos ins i uídos, enquan o ou os
so em de PPc se e a, que pode se a al, apesa da e apia, bem como, as azões que
le am ao es abelecimen o de in ecções com di e en es ca gas pa asi á ias, não es ão
comple amen e escla ecidas. Alguns es udos apon am pa a que di e sos indicado es do
p ognós ico clínico possam es a elacionados com a ap esen ação e a e olução da
in ecção po P. ji o ecii. Ou os es udos demons a am que polimo ismos especí icos
podem de e mina ca ac e ís icas epidemiológicas do mic o ganismo, como a gené ica
da população, a dis ibuição geog á ica de de e minados sub ipos, os modos de
ansmissão, ou mesmo, enómenos de esis ência a á macos, ou di e en es g aus de
i ulência [Mille & Wake ield 1999; Bea d e al. 2000; Ba y & Johnson 2001; Hause
e al. 2001b; C o he s e al. 2005; Cos a e al. 2006b; Mille e al. 2007; Radhi e al.
2008; Walze e al. 2008; Es e es e al. 2010a; Ma os & Es e es 2010a; Es e es e al.
2010b; Ma os & Es e es 2010b]. Tendo po base es es dados, coloca-se a hipó ese de
que a i ulência de um de e minado sub ipo de P. ji o ecii possa es a dependen e de
múl iplos genó ipos e, po an o, da associação de polimo ismos múl iplos que oco em
em di e sas egiões do genoma.
Com o objec i o de iden i ica genes associados com ac o es da in ecção po
P. ji o ecii, e ec uou-se o es udo da a iabilidade gené ica de isolados des e
mic o ganismo, em Po ugal. O abalho en ol eu a ecolha de espécimes pulmona es
de doen es in ec ados po P. ji o ecii com di e en es ca ac e ís icas clínicas (doen es
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
com co-in ecção VIH/P. ji o ecii, com e sem quad o clínico compa í el com PPc,
e doen es se onega i os pa a VIH, in ec ados po P. ji o ecii), e in eg ou as
me odologias de IFI/AcM, PCR, PCR seguido de sequenciação di ec a, PCR seguido de
RFLP, RT-PCR, PCR mul iplex seguido de SBE e DNA pooling.
Na p imei a ase da in es igação e ec uou-se uma pesquisa bibliog á ica com o
in ui o de a alia o po encial in e esse de genes de P. ji o ecii. Os genes m LSU RNA,
CYB, SOD, β TUB, TRR1, TS, DHFR, DHPS, egião UCS das MSGs e KEX1, o am
seleccionados com base nas on es bibliog á icas, das quais oi possí el ob e
in o mação ace ca das ca ac e ís icas e a iabilidade das sequências, a sua impo ância a
ní el me abólico, e a e en ual associação en e es as egiões e pa âme os da in ecção,
ais como enómenos de esis ência a á macos, ac o es de i ulência, p op iedades de
supe ície do mic o ganismo e di e en es g aus de se e idade da in ecção. Nes a
p imei a ase, a di e sidade gené ica, as equências de dis ibuição de SNPs e a elação
en e os genó ipos obse ados e di e sos pa âme os da in ecção, o am in es igadas,
aplicando as écnicas de PCR, sequenciação di ec a e RFLP. Assim, pa a os
polimo ismos seleccionados, p ocedeu-se a uma análise indi idual das amos as, com o
objec i o de encon a di e enças signi ica i as en e os di e sos subg upos em análise
(ex. casos com ca gas pa asi á ias ele adas e sus casos com ca gas pa asi á ias baixas,
ou casos com e olução clínica a o á el e sus casos com e olução clínica
des a o á el). Nes a ase da in es igação, os 10 loci de P. ji o ecii, seleccionados como
genes de in e esse, o am ca ac e izados, de ec ando-se um o al de 23 SNPs. Fo am
iden i icados qua o SNPs po encialmen e elacionados com pa âme os clínicos da
in ecção, e, po isso, conside ados como ele an es (m 85, SOD110, SOD215 e
DHFR312). Foi obse ado que um genó ipo especí ico (SOD110C/SOD215T) se
encon a a associado a casos de PPc com maio se e idade, enquan o que ou os dois
genó ipos (m 85C/SOD215C e SOD110T/SOD215C) se encon a am associados a casos
de PPc com meno se e idade. Adicionalmen e, os esul ados pe mi i am con i ma o
declínio das mu ações do gene DHPS, associadas a casos de insucesso da p o ilaxia
an i-P. ji o ecii com á macos da amília das sul as, declínio esse, que pode e sido
causado pelo dec éscimo no uso des es á macos, após a in odução da HAART, em
Po ugal. A análise c uzada das sequências pe mi iu de ec a co elações en e SNPs,
suge indo a exis ência de po enciais hapló ipos de P. ji o ecii. O es e ecombina ó io
d1 oi aplicado pa a es uda des ios à dis ibuição panmí ica, na população de
P. ji o ecii, endo sido calculado com os esul ados combinados da geno ipagem de
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
qua o genes nuclea es (SOD, β TUB, DHFR e DHPS), que unciona am como
ma cado es gené icos, e que pe mi i am a iden i icação de 14 MLGs de P. ji o ecii,
cujas equências a ia am en e 3 e 30%. Os esul ados do es e d1 suge em ele ada
ecombinação en e a maio ia dos MLGs de P. ji o ecii. Po ém, e i icou-se que o
MLG E se encon a sob e- ep esen ado na população e, p o a elmen e, sob p opagação
clonal e em desequilíb io de ligação, indicando que, mui o p o a elmen e, P. ji o ecii é
ep esen ado po uma população com es u u a epidémica, ca ac e izada po
ecombinação gené ica equen e, mas, na qual, ocasionalmen e, um clone bem
sucedido, ende, apidamen e, a aumen a a sua equência o iginando um clone
epidémico.
Na segunda ase da in es igação, desen ol e am-se e implemen a am-se
me odologias de ele ada capacidade (PCR mul iplex/SBE em associação com DNA
pooling) pa a haplo ipagem de P. ji o ecii em amos as clínicas. A aplicação des as
me odologias e e como objec i o acele a a iden i icação dos SNPs de P. ji o ecii com
impac o a ní el clínico, pe mi indo uma ap oximação baseada em hapló ipos pa a a
ca ac e ização des e mic o ganismo pa ogénico. A op imização da me odologia de
pooling seguida de PCR mul iplex/SBE assen ou em di e sos passos, como a selecção e
alidação da écnica de quan i icação de DNA, a p epa ação dos pools de DNA de
P. ji o ecii, a de e minação das equências dos SNPs nos espec i os pools po PCR
mul iplex/SBE, e o es udo da co elação en e os SNPs e os pa âme os clínicos da PPc.
O sucesso des a abo dagem demons ou se dependen e de di e sos ac o es, incluindo
as empe a u as de hib idação dos p ime s, que de em se semelhan es en e si, a
o mação de es u u as secundá ias e a complemen a idade en e oligonucleó idos
(ex. p ime s), que de em se minimizadas, e ainda, as concen ações dos di e sos
eagen es nas mis u as de eacção, que de em se op imizadas. Po ou o lado, na
p epa ação e composição dos pools de e se u ilizada uma écnica de quan i icação de
DNA exac a e p ecisa, endo sido adap ado e desen ol ido um modelo expe imen al
baseado numa eacção de RT-PCR especí ica, pa a quan i icação de DNA de
P. ji o ecii. Assim, o am c iados pools compos os po isolados de doen es com PPc
com di e en es pa âme os clínicos (ex. casos de PPc com di e en es ca gas pa asi á ias,
ou casos de PPc com e olução clínica dis in a). A dis ibuição das equências dos
SNPs nos di e en es pools oi in es igada. A écnica de PCR mul iplex/SBE oi aplicada
com sucesso na iden i icação de polimo ismos gené icos de P. ji o ecii em pools de
DNA, demons ando que é possí el o es udo de SNPs de P. ji o ecii num o ma o
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
múl iplo, ab angendo um ele ado núme o de amos as. Es a me odologia oi
desen ol ida u ilizando como modelo os SNPs DHFR312, m 85, SOD215 e SOD110,
que demons a am se egiões a iá eis, associadas, du an e a p imei a ase do es udo, a
pa âme os clínicos da in ecção.
O p esen e es udo, o p imei o a aplica a écnica de PCR mul iplex/SBE em
pools de DNA de P. ji o ecii, pe mi iu de e mina a dis ibuição das equências
ela i as dos SNPs DHFR312, m 85, SOD215 e SOD110 em subg upos de doen es, com
di e en es ca ac e ís icas clínicas. Os pools analisadas com sucesso pela écnica de PCR
mul iplex/SBE consis i am em isolados de doen es se oposi i os pa a VIH, com PPc
con i mada labo a o ialmen e, com quad o clínico compa í el, e com di e en es ca gas
pa asi á ias (baixa pool A1, mode ada pool A2 e ele ada pool A3), e em isolados de
doen es se oposi i os pa a VIH, com casos de PPc que ap esen a am di e en e e olução
clínica ( a o á el pool E e des a o á el pool F). Es a abo dagem, pe mi iu a
iden i icação de polimo ismos p esen es nos di e en es g upos em es udo,
possibili ando a exclusão de SNPs, apa en emen e não ele an es (ex. DHFR312), e,
conseguindo, classi ica e elaciona , ou os SNPs, com di e en es ní eis de ca ga
pa asi á ia, e/ou, com g aus de maio g a idade da doença (ex. m 85, SOD215 e
SOD110). Os di e en es SNPs iden i icados podem, de alguma o ma, es a associados a
hapló ipos de P. ji o ecii com ca ac e ís icas dis in as, ou seja, po encialmen e
implicados em di e en es g aus de se e idade da doença.
Os esul ados ob idos, pe mi em coloca a hipó ese de que hapló ipos de
P. ji o ecii com ca ac e ís icas dis in as podem exis i , e que, egiões gené icas
especí icas, podem unciona como ma cado es desses mesmos o ganismos.
Foi iden i icado um MLG (m 85C/SOD215C/SOD110T) que, apa en emen e, se
encon a associado a in ecções de P. ji o ecii com ca gas pa asi á ias baixas a
mode adas. Es e MLG pode se pa e in eg an e de um hapló ipo de P. ji o ecii
associado a o ganismos que se eplicam a uma axa ela i amen e baixa, e que, po isso,
es abelecem, com maio equência, in ecções com ca gas pa asi á ias baixas a
mode adas. Po ou o lado, oi iden i icado um MLG (SOD215T/SOD110C) que pa ece
es a associado a in ecções de P. ji o ecii com ca gas pa asi á ias ele adas. Es e MLG
pode aze pa e de um hapló ipo de o ganismos de P. ji o ecii que, du an e a in ecção,
se eplicam apidamen e, es abelecendo, com maio equência, uma in ecção aguda,
ca ac e izada pela de ecção de ca gas pa asi á ias mais ele adas. Es as di e enças
podem se causadas pelo ac o des es MLGs in eg a em hapló ipos de P. ji o ecii com
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
p op iedades dis in as, o que se pode aduzi , po exemplo, pela di e en e capacidade
de eplicação dos o ganismos de cada hapló ipo, du an e a in ecção.
A obus ez e a e sa ilidade da me odologia p opos a demons ou que a sua
aplicação em es udos de geno ipagem de P. ji o ecii, onde se p e endem elaciona
pa âme os clínicos da PPc com in o mação gené ica dos isolados, pode se uma opção
álida com ele ada sensibilidade, ep odu ibilidade e idelidade. Com base nes es
esul ados, conclui-se que a PCR mul iplex/SBE pode se uma e amen a impo an e na
ca ac e ização do pe il gené ico de P. ji o ecii, possibili ando a ampli icação e
ca ac e ização de di e sos agmen os, de uma o ma ápida, e pe mi indo, po um lado,
o uso em la ga escala (ex. pools de DNA), com geno ipagem e icien e de um ele ado
núme o de amos as, e po ou o, o aumen o do endimen o de ope ação, ob iando os
cus os ine en es. Com hapló ipos de idamen e iden i icados, os quais pode ão es a
implicados com de e minados pa âme os clínicos da in ecção po P. ji o ecii,
p e ende-se que, em u u os abalhos, se con i mem es es esul ados, de modo a aplica
o conhecimen o ge ado, no auxílio ao diagnós ico e à escolha adequada do a amen o
da in ecção po P. ji o ecii.
13.2. Pe spec i as u u as
De u u o, no as in es igações de e ão se ealizadas, conside ando pools de
DNA de P. ji o ecii cons i uídos po isolados que englobem, pa a além de di e en es
ca gas pa asi á ias e e olução clínica dos doen es, ou os pa âme os da in ecção, como
o diagnós ico clínico, a con agem de lin óci os TCD4+, a p o ilaxia, a e apêu ica, bem
como dados demog á icos, como a idade dos doen es. Com o objec i o de alida as
associações es abelecidas en e os subg upos de doen es e as ca ac e ís icas gené icas
dos o ganismos de P. ji o ecii, esses pools de e ão con e um maio núme o de
isolados, os quais de e ão se ob idos em di e en es egiões geog á icas. P opõe-se
assim, a ealização de um es udo mul icên ico, onde, a me odologia u ilizada no
p esen e es udo, seja aplicada em pools de amos as ob idas em á ios pon os do globo,
de modo a compa a esul ados. P opõe-se ambém que ou os genes de in e esse sejam
in es igados, como os genes associados a casos de esis ência a á macos da amília das
sul as, que pode ão ap esen a di e en es equências nas di e sas egiões geog á icas a
es uda , consequência da u ilização di e enciada das sul as nas di e sas populações.
Com es e p ocedimen o, p e endem-se es abelece em de ini i o, associações en e as
ca ac e ís icas gené icas especí icas do agen e pa ogénico e os pa âme os da in ecção,
12. Desen ol imen o de me odologias de al o endimen o pa a análise de polimo ismos de P. ji o ecii.
de modo a que écnicas p ecisas de iden i icação de SNPs ele an es, ais como a PCR
mul iplex/SBE, possam se u ilizadas como me odologias complemen a es de
diagnós ico da pneumocis ose. A aplicação des as me odologias pode acele a a
iden i icação de polimo ismos de P. ji o ecii ele an es a ní el clínico, pe mi indo uma
ap oximação baseada em hapló ipos pa a ca ac e ização clínica des e mic o ganismo
pa ogénico, auxiliando e adequando a escolha do a amen o mais indicado, e po isso
pe mi indo um melho con olo da doença.
Pa a além da ele ada e sa ilidade, obus ez e sensibilidade, demons ada pelas
écnicas de PCR mul iplex/SBE e de DNA pooling, a moni o ização dinâmica que
p opo cionam du an e o p ocesso expe imen al, azem com que sejam indicadas, não só
pa a o es udo de P. ji o ecii, mas ambém pa a o es udo de inúme os mic o ganismos,
em especial de mic o ganismos não cul i á eis, nos quais, a limi ação da amos a, az
com que sejam eque idas écnicas de al a capacidade, pa a que seja possí el a
ca ac e ização adequada de isolados, al como icou demons ado, no p esen e es udo,
pa a o caso de P. ji o ecii.
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Anexo I
La ado b ocoal eola (LBA)
As amos as o am ob idas po ia b onco ib oscópica, sob anes esia local. Cada LBA oi
ob ido, pos e io men e ao enc a amen o do ib oscópio no lobo médio do doen e, ins ilando
150 ml de so o isiológico p é-aquecido a 37º C, di idido po ês se ingas de 50 ml, endo
sido aspi ado sua emen e. As amos as, ob idas po es e p ocesso, o am ecolhidas em
ecipien es es é eis e en iadas pa a o labo a ó io. Todos os p ocedimen os o am e ec uados
po écnicos especializados.
Expec o ação induzida (EI)
Com o objec i o de ga an i uma boa higiene o al e uma hid a ação adequada, p e iamen e
à ecolha das EI, odos os doen es espei a am um pe íodo de jejum pa a alimen os sólidos
de 12 ho as. A odos os doen es adminis ou-se uma solução salina hipe ónica a 1,8 %,
du an e 15 minu os, a a és de um nebulizado ul assónico. As amos as, ob idas po es e
p ocesso, o am ecolhidas em ecipien es es é eis e en iadas pa a o labo a ó io. Todos os
p ocedimen os o am e ec uados po écnicos especializados.
Anexo II
T a amen o de lâminas com poli-L-lisina
Me gulham-se as lâminas em álcool ácido a 1%, as quais são secas com papel abso en e.
De seguida, colocam-se as lâminas numa solução de poli-L-lisina a 1:10, du an e
5 minu os, deixando-se seca à empe a u a ambien e.
Tampão de lise ( iociana o de guanidina 7 M; T is-HCl 50 mM pH 6,4; EDTA 25 mM
pH 8,0; T i on X-100 1,5% / ) 200 ml
(Adap ado de Boom e al. 1990)
Pesam-se 120 g de iociana o de guanidina (SIGMA), aos quais se adicionam 100 ml de
T is-HCl (T is(hid oxime ileno)aminome ano-ácido clo íd ico) (0,1M, pH 6,4) 22 ml de
EDTA (ácido e ilenodiamina e acé ico) (0,2M, pH 8) e 2,6 ml de T i on X-100 (Se a).
Pe az-se o olume inal com água des ilada. A dissolução do iociana o de guanidina é
acili ada po aquecimen o a 60-65ºC, com agi ação. De ido ao iociana o de guanidina
so e decomposição é mica a empe a u as supe io es a 115ºC, o ampão não pode se
au ocla ado, sendo a sua es e ilização e ec uada po il ação com il o Wha man nº1 ou
equi alen e. A solução é es á el à empe a u a ambien e, no escu o, du an e pelo menos
3 semanas.
Suspensão aquosa de sílica em pó (1% pH 2,0; SIGMA) (30 ml)
(Adap ado de Boom e al. 1990)
Colocam-se 30 g de sílica (SIGMA) numa p o e a de 250 ml. Pe az-se o olume com água
des ilada, agi a-se igo osamen e e deixa-se sedimen a du an e 24 ho as à empe a u a
ambien e. Desp ezam-se ce ca de 215 ml de sob enadan e e ol a-se a adiciona água
des ilada a é pe aze o olume de 250 ml. Agi a-se o emen e e deixa-se sedimen a
du an e 5 ho as à empe a u a ambien e. Desp ezam-se 220 ml de sob enadan e e
adicionam-se 300 µl de ácido clo íd ico concen ado (Me ck) aos 30 ml de suspensão inal,
de o ma a acidi ica a é pH 2. Di idi alíquo as de ce ca de 5 ml po á ios ascos.
Após au ocla agem, a solução é es á el du an e pelo menos 6 meses, quando a mazenada
no escu o, a 4ºC.
Tampão de la agem ( iociana o de guanidina 7 M; T is-HCl 50 mM ph 6,4) (200 ml)
(Adap ado de Boom e al. 1990)
A 120 g de iociana o de guanidina (SIGMA), jun am-se 100 ml de T is-HCl
(0,1M, pH 6,4). O olume inal é p eenchido com água des ilada. A dissolução do
iociana o de guanidina é acili ada po aquecimen o a 60-65ºC, com agi ação. De ido ao
iociana o de guanidina so e decomposição é mica a empe a u as supe io es a 115ºC, o
ampão não pode se au ocla ado, sendo a es e ilização ei a po il ação com il o
Wha man nº1 ou equi alen e. A solução é es á el à empe a u a ambien e, no escu o,
du an e pelo menos 3 semanas.
P epa ação de um gel de ac ilamida a 10%
Os id os de sequenciação são cuidadosamen e la ados com alconox 1% e água des ilada.
Após es a em secos, são colocados en e os id os sepa ado es com 0,5 mm de espessu a,
p ocedendo-se à selagem com i a adesi a. O gel é p epa ado po adição de 8,75 ml de
ac ilamida líquida (SIGMA), 17,5g de u eia (Me ck), 3,5 ml de ampão TBE 10x,
pe azendo-se o olume inal (35 ml) com água des ilada. A solução é agi ada a é
ap esen a um aspec o homogéneo e anslúcido, sendo il ada com il os Millipo e 0,22
µm e desgasei icada du an e 10 minu os, eco endo-se a uma bomba de ácuo. De seguida
são adicionados à solução 175 µl de pe sul a o de amónio (SIGMA) e 19,68 µl de TEMED
(N,N,N,N- e ame ile ilenodiamina) (SIGMA), que uncionam como agen es
polime izan es da ac ilamida. A mis u a é cuidadosamen e adicionada en e os id os de
sequenciação, e, no inal, é colocado um pen e de 24 poços. Após polime ização, a pa e
ex e io dos id os é la ada com água des ilada e o gel é colocado no apa elho DNA Gene
Scanne 373 (Applied Biosys ems).
Anexo III
Anexo IV
Tes e combina ó io d1
Numa dada população, o cálculo da ex ensão da sob e- ep esen ação de de e minados
genó ipos pode se quan i icada pelo cálculo da p obabilidade (P) de obse a an os ou
mais indi íduos, com um de e minado genó ipo, do que aquilo que ealmen e é espe ado,
quando se es á pe an e uma população com dis ibuição panmí ica:
∑
=
−
−⋅
−⋅⋅
=
n
mi
ini
ini
xxn
P)!(!
)1(!
Onde x é a p obabilidade da oco ência do MLG, conside ando a hipó ese nula, com
ecombinação alea ó ia de ma e ial gené ico en e o ganismos da mesma população,
calculada pela mul iplicação das equências obse adas de cada um dos genó ipos simples,
que compõem o MLG; n co esponde ao núme o de indi íduos na amos a; m co esponde
ao núme o de indi íduos da amos a em que o MLG oi de ec ado.