Estudos de biologia da multiresistência a antimaláricos em Plasmodium falciparum: transportadores ABC e genes de resposta ao stress oxidativo

Ma ia de Fá ima Ca alho Noguei a Es udos de biologia da mul i esis ência a an imalá icos em Plasmodium alcipa um: anspo ado es ABC e genes de espos a ao s ess oxida i o Uni e sidade No a de Lisboa Lisboa 2007 Ma ia de Fá ima Ca alho Noguei a Assis en e de In es igação do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical (UEI Malá ia) Uni e sidade No a de Lisboa Es udos de biologia da mul i esis ência a an imalá icos em Plasmodium alcipa um: anspo ado es ABC e genes de espos a ao s ess oxida i o Disse ação pa a ob enção do g au de Dou o Ramo das Ciências Biomédicas Especialidade Pa asi ologia Uni e sidade No a de Lisboa Lisboa 2007 À minha amília, amigos e às populações de Angola, São Tomé e P íncipe e Tailândia I Ag adecimen os Es e abalho oi ealizado no Cen o de Malá ia e ou as Doenças T opicais LA (IHMT) e oi inanciado pelos p ojec os ”Busca de no os ma cado es de esis ência a an imalá icos” (PRAXIS/P/SAU/14070/98) e “RESMALSHIP – De elopmen o a mala ia esis ance DNA chip as a public heal h ool o managmen o Plasmodium alcipa um mala ia d ug esis ance” (QLK2-CT-2002-01503). Pa a que a sua ealização osse possí el, além das e e idas en idades, oi undamen al pode con a com o apoio e colabo ação de di e sas pessoas, às quais que o aqui exp essa os meus since os ag adecimen os: Ao P o esso Dou o Vi gílio do Rosá io, Di ec o da UEI Malá ia e memb o do CMDT LA, P o esso Ca ed á ico do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, pela o ien ação des e abalho bem como pelo apoio e disponibilidade que semp e demons ou no es abelecimen o de colabo ações com ou as ins i uições de o ma a o na possí el a ealização de algumas ases des e abalho. Ao Dou o José Ped o Gil (ago a no Ins i u o Ka olinska, Suécia) pela ajuda écnica e cien í ica, a qual oi undamen al pa a o inicio do p esen e abalho de dou o amen o. À Dou o a Dino a Lopes, pelo apoio pessoal, colabo ação em especial no abalho em equipa ealizado na República Democ á ica de São Tomé e P íncipe e República de Angola e pela lei u a e co ecções des e documen o. Ao P o esso D . Luís Be na dino e à D a. Ca la Benchimol do Hospi al Pediá ico Da id Be na dino de Luanda e a oda a equipa do se iço de u gências daquele hospi al, pelo apoio e disponibilidade demons ados pa a o desen ol imen o das ac i idades na República de Angola. Ao P o esso Dou o Luís Va andas da UEI Clínica de Doenças T opicais/CMDT- LA/IHMT, quem mui o con ibuiu pa a o desen ol imen o do abalho de equipa ealizado no Hospi al Pediá ico Da id Be na dino de Luanda. À D a. Conceição Fe ei a e aos écnicos do Cen o Nacional de Endemias da República Democ á ica de São Tomé e P íncipe, odo o apoio dado du an e o pe íodo de colhei as. À P o esso a Dou o a Sosd i Thai hong e D a. Kanchana Rungsihi un a , Uni e sidade de Chulalongko n, Bangkok, Tailândia, pelo en io de isolados de P. alcipa um u ilizados nes e es udo. Ao P o esso Dou o José Bau is a, Ca ed á ico da Uni e sidade Complu ense de Mad id, pelo apoio cien í ico e écnico e pela possibilidade de ealiza pa e des e abalho no Labo a ó io de Bioquímica e Biologia Molecula IV, da mesma Uni e sidade. Ao P o esso Dou o Hans-Pe e Beck pela opo unidade que me deu de ealiza no seu labo a ó io pa e des e abalho no Molecula Pa asi ology and Molecula Epidemiology Depa men do Swiss T opical Ins i u e em Basileia. Ao P o esso Dou o Celso Cunha e P o esso Dou o Ped o C a o, do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, pela disponibilidade enquan o elemen os da comissão u o ial. Em especial ao P o esso Dou o Celso Cunha pela ajuda écnica e cien í ica. II À UEI de P o ozoá ios Opo unis as/VIH e Ou as P o ozooses na pessoa da P o esso a Dou o a Olga Ma os pela disponibilização de equipamen o o og á ico e de mic oscopia. À Mes e Ca a ina Al es, pelo apoio pessoal, pela ines imá el ajuda no p ocessamen o (PCR) de alguns isolados de P. alcipa um e pela lei u a e co ecções des e documen o. À equipa do Labo a ó io de Bioquímica e Biologia Molecula IV, da Uni e sidade Complu ense de Mad id, em especial à Amália pelas p odu i as discussões, ao An ónio, ao Ra a, à Ma a, à Ma ia (po me dispensa os seus empos de PCR), à Aza e em especial à Susana pela paciência e disponibilidade com que semp e me ajudou no labo a ó io. Ao Ma ias, à Co nélia e à Diana, colegas do labo a ó io Molecula Pa asi ology and Molecula Epidemiology Depa men do Swiss T opical Ins i u e em Basileia, pelo apoio cien i ico e pessoal. Às amigas Luísa Lobo, Susana Ramos, Isabel Fe ei a e Paula Figuei edo pelo apoio a ní el de abalho e amizade semp e demons ado. E a oda a equipa do CMDT LA, em especial à D. Enca nação Ho a pelo excelen e apoio écnico e à Celes e Figuei edo, pela an ecipação e disponibilidade pa a me ajuda a esol e os p oblemas bu oc á icos insolú eis. Ao meu Pai e Mãe, po me e em mandado p ocu a o signi icado das pala as no dicioná io em ez de simplesmen e mo dize em. À Mila, Zeca, Xana, Manel, Lino, Miguel, Ma ia, A onso e Zé que o ag adece a amizade, o apoio e o enco ajamen o nos bons e maus momen os. III A pa i do conjun o de esul ados, ap esen ados nes a disse ação, o am e ec uadas ap esen ações em cong essos e o am publicados ou es ão em p epa ação os seguin es a igos cien í icos: A igos cien í icos Noguei a F, Gil, JP., do Rosá io, VE. (2006) E lux pumps o an imala ial- esis ance in Plasmodium alcipa um. An ibio iques. 8: 85 – 92. Fe ei a ID, Noguei a F, Bo ges ST, do Rosa io VE, C a o P. (2004) Is he exp ession o genes encoding enzymes o glu a hione (GSH) me abolism in ol ed in chlo oquine esis ance in Plasmodium chabaudi pa asi es? Molecula & Biochemical Pa asi ology. 136:43-50. Lopes D, Noguei a F, Gil JP, Fe ei a C, do Rosa io VE, C a o P. (2002) p c and p md 1 mu a ions and chlo oquine esis ance in Plasmodium alcipa um om São Tomé and P íncipe, Wes A ica. Annals o T opical Medicine and Pa asi ology. 96:831-4. Lopes D, Rungsihi un a K, Noguei a F, Seugo n A, Gil JP, do Rosa io VE, C a o P. (2002) Molecula cha ac e isa ion o d ug- esis an Plasmodium alcipa um om Thailand. Mala ia Jou nal. 1:12 (doi:10.1186/1475-2875-1-12). Noguei a F., Diez A., Rad a A., Pé ez-Bena en e S., do Rosa io V.E. and Bau is a J.M.. Dynamic ansc ip ional esponse o chlo oquine in he an ioxidan de ense sys em ac oss he in ae y h ocy ic cycle o sensi i e and esis an s ains o Plasmodium alcipa um. em p epa ação Ap esen ações O ais Noguei a, F., Lopes, D. Mé odos Labo a o iais de A aliação da Suscep ibilidade aos An imalá icos. I Seminá io de Te apêu ica da Malá ia nos dos Países de Língua Po uguesa – CPLP. IHMT/CMDT; Lisboa, Po ugal (Ou ob o 2006). IV Noguei a, F., do Rosá io, V.R. Labo a o y Resea ch Resea ch and Field Da a in Rla ion o D ug Resis ance. 7 h Eu opean Cong ess o Chemo he apy and In ec ion. Flo ênça, I alia (Ou ub o 2005). Noguei a, F., do Rosá io, V.R. Aspec os ge ais sob e esis ência aos an imalá icos (An imala ial d ug esis ance – o e all iew). V Simpósio NECF doenças In ecciosas. Núcleo de Es udan es de Ciências Fa macêu icas do Ins i u o Supe io de Ciências da Saúde – Sul. Lisboa, Po ugal (Ab il 2005). Noguei a, F., Lopes, D., Gil, J.P., do Rosá io, VE; C a o, P. E lux pumps o an imala ial- esis an Plasmodium alcipa um. 6 h Eu opean Cong ess o Chemo he apy and In ec ion ECC & RICAI 2004, Pa is, F ança (Dezemb o 2004). Noguei a, F., Lopes, D.; Gil, J.P.; Rosá io, VE; & C a o, P. Pu a i e MRP-like (Mul id ug Resis ance P o ein) genes in Plasmodium alcipa um. The Thi d MIM Pan-A ican Mala ia Con e ence. A usha, Tanzânia (No emb o 2002). P émios Segundo p émio pa a pos e s no XLIII Cong esso da Sociedade B asilei a de Medicina T opical, II Encon o de Medicina opical dos Países de Língua Po uguesa I Encon o da Sociedade B asilei a de Medicina de Viagem. Campos do Jo dão, B asil (Ma ço 2007), com o Pos e : Noguei a, F., Pimen el, S., Figuei edo, P., Lopes, D., Benchimol, C., Va andas, L., do Rosá io, V.E., Be na dino, L.. Molecula epidemiology o an imala ial esis ance in Luanda, Angola. P e alence o P md 1, p c , p dh , p dhps and p cy b mu a ions associa ed wi h d ug esis ance. P émio do Anuá io do Hospi al Dona Es e ânia – Medicina. 2006 com o abalho: Pimen el, S., Noguei a, F., Benchimol, C., Quinhen os, V., Bom, J., Va andas, L., do Rosá io, V., Be na dino, L. De ec ion o a o aquone-p oguanil esis ance con e ing mu a ions in Plasmodium alcipa um cy och ome b gene in Luanda, Angola. V Sumá io A malá ia causada po Plasmodium alcipa um é, em conjun o com a ube culose e o HIV/SIDA, a maio causa de mo alidade mundial en e as doenças in ecciosas. Nas úl imas décadas, o con olo e a amen o da malá ia êm sido bas an e di icul ados pelo su gimen o e disseminação da esis ência pa asi á ia aos an imalá icos mais u ilizados, nomeadamen e às quinoleínas. O pa asi a encon a-se em ase de ele ada ac i idade me abólica, nos es adios sensí eis às quinoleínas, co esponden e à deg adação da hemoglobina no acúolo diges i o, a qual ge a e ip o opo i ina IX (FP-IX) e espécies eac i as de Oxigénio (ROS). A des oxi icação des es g upos é e ec uada po enzimas de espos a ao s ess oxida i o, como a supe oxidodismu ase e as enzimas dos sis emas dependen es da io edoxina e do glu a ião (GSH). Os compos os esul an es são demasiado hid o ílicos pa a di undi a a és da memb ana ci oplasmá ica, necessi ando de anspo ado es especí icos da supe - amília de p o eínas ABC. O ac o de P. alcipa um ap esen a esis ência a di e en es an imalá icos e a elação exis en e en e as p o eínas ABC (nomeadamen e das sub- amílias MDR/TAP e MRP/CFTR) e os enó ipos de mul i- esis ência, jus i ica am es a in es igação. No genoma de P. alcipa um o am iden i icadas 18 no as ABCs e posicionadas em 8 sub- amílias. A suscep ibilidade in i o de isolados de P. alcipa um ( eco endo a es es O.M.S.), p o enien es de São Tomé e P íncipe, Tailândia e Angola demons ou esis ência simul ânea a mais de um á maco e ní eis dis in os de suscep ibilidade en e aquelas egiões. Aa e ec ua um es udo de associação das al e ações de sequência nos genes p m p1 e p m p2 (iden i icadas no deco e des e abalho), os esul ados demons a am uma co elação posi i a apenas na Tailândia, no espei an e à me loquina, pa a os polimo ismos de p m p1 (191Y e 347A) e pa a a p esença de inse ções/delecções nos codões 779 e 3591em de p m p2. Usando PCR em empo eal e pa a os mesmos isolados, oi de e minado o núme o de cópias dos anspo ado es ABC p md 1, p m p1 e p m p2. Pa a os dois úl imos apenas oi de ec ada uma cópia, mas pa a p md 1 oi iden i icado aumen o do núme o de cópias (mais de 2) associado a meno suscep ibilidade ao mesmo á maco, no mesmo País. Em es udos de exp essão dos genes codi ican es de enzimas de espos a ao s ess oxida i o (p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR e p 2-CysPx) e de anspo ado es XII RPMIinc – Meio de cul u a incomple o RNA – Ácido ibonucleico ibossomal RT-PCR – Re e se ansc ip ase – polyme ase chain eac ion S – Sensí el SDS – Dodecil sul a o de sódio STP – República Democ á ica de São Tomé e P íncipe T - Timidina TAMRA - 6- ca boxi e ame il odamina TBE – Tampão cons i uído po T is, ácido bó ico e EDTA TCTP – T ansla ionally con olled umo p o ein TE – Tampão de eluição cons i uído po T is EDTA TEMED – N,N,N’,N’ e ame ile ilenodiamina T is - i-(hid oxime il)-aminome ano TRIS – T is (hid oxime il) aminome ano U – Unidades UEI – Unidade de In es igação e Ensino UNL – Uni e sidade No a de Lisboa UV – ul a iole a V – Vol V/V – olume/ olume XIII Índice Ge al Ag adecimen os A igos cien í icos Ap esen ações O ais P émios Sumá io Abs ac Lis a de Ab e ia u as Índice Ge al Índice de Figu as Índice de Tabelas I – INTRODUÇÃO I.1 - Dis ibuição geog á ica e condições de ansmissão da malá ia I.1.1 - Ciclo de ida e ansmissão dos pa asi as do géne o Plasmodium I.1.2 - Mo ologia de Plasmodium alcipa um e dos e i óci os in ec ados I.2 - A esis ência aos an imalá icos I.2.1 - Focos e o igem da esis ência a an imalá icos e sua p opagação I.2.2 - Mul i esis ência I.2.3- Modo de acção dos an imalá icos e mecanismos de esis ência associados I.2.3.1 - An imalá icos do g upo das quinoleínas I.2.4 - Aspec os me abólicos de P. alcipa um associados à suscep ibilidade a an imalá icos do g upo das quinoleínas I.2.4.1 - S ess oxida i o em Plasmodium alcipa um, esul an e da inges ão e me abolização da hemoglobina no acúolo diges i o do pa asi a I.2.4.2 - Sis emas an ioxidan es em Plasmodium alcipa um I.2.4.3 - Con ibuição da mi ocônd ia e apicoplas o pa a o equilíb io edox em Plasmodium alcipa um I.3 - Impo ância das p o eínas ABC, no enó ipo de mul i esis ência I.3.1 - Resis ência a múl iplos á macos mediada po anspo ado es ABC I III III IV V VII IX XIII XX XXIII 1 2 3 6 8 10 11 11 12 16 16 18 29 30 33 XIV I.3.1.1 - Sub- amília MDR/TAP (ABCD) I.3.1.2 - Sub- amília MRP/CFTR (ABCC) I.3.1.3 - Sub- amília Whi e (ABCG) I.3.2 - O papel das p o eínas ABC, no enó ipo de esis ência de com a espos a ao s ess oxida i o I.3.3 - MRPs na de esa celula em Plasmodium alcipa um, elação com a espos a ao s ess oxida i o I.4 - Objec i os ge ais II – MATERIAL E MÉTODOS II.1 - Ma e ial Biológico II.1.1 - Isolados e clones de Plasmodium alcipa um II.1.2 - Isolados de Plasmodium alcipa um II.1.3 - Es i pes de Esche ichia coli II.1.4 - Vec o de clonagem; plasmídeo pGEX-6P-1-His II.2 - Desc ição das écnicas II.2.1 - Cul u a in i o de Plasmodium alcipa um II.2.2 - Ex acção de ácidos nucleicos II.2.2.1 - Ex acção DNA II.2.2.2 - Ex acção de RNA II.2.3 - Sín ese de DNA complemen a (cDNA) II.2.4 - PCR - Polime ase Chain Reac ion II.2.5 - Desenho de p ime s II.2.6 - Elec o o ese de DNA em gel de Aga ose II.2.7 - PCR em empo eal (RT-PCR) II.2.8 - P epa ação de bac é ias E. coli JM 109/SURE® E. coli BL21 elec ocompe en es II.2.9 - Ex acção e quan i icação de p o eínas (mé odo B ad o d) de Plasmodium alcipa um a pa i de cul u a in i o II.2.10 - Elec o o ese de p o eínas em gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sul a e Polyc ylamide Gel Elec opho esis) II.2.11 - P epa ação de lâminas de cul u a in i o de Plasmodium alcipa um, pa a imuno luo escência IFA II.3 – Me odologia 34 35 36 37 39 42 44 45 45 45 45 45 47 47 48 48 50 50 51 52 52 52 55 55 56 57 58 XV II.3.1 – Selecção da g elha abe a de lei u a ORF (Open Reading F ame) pa a cada gene II.3.2 - Sequenciação dos genes p m p1 e p m p2 a pa i de cDNA II.3.3 - Iden i icação po PCR das inse ções/delecções na sequência do gene p m p2 II.3.4 - Iden i icação das mu ações pon uais nos genes p m p1 e p m p2 po PCR-RFLP II.3.4 - De ecção po PCR das epe ições na sequência do gene p γ-gcs II.3.5 - Iden i icação do núme o de cópias do genes p m p1, p m p2 e p md 1 II.3.6 - Es udo in i o, da suscep ibilidade, de isolados de P. alcipa um aos á macos clo oquina, me loquina, amodiaquina e quinino II.3.6.1 - Selecção de isolados de P. alcipa um II.3.6.2 - Colhei a e a mazenamen o de isolados de Plasmodium alcipa um II.3.6.3 - A aliação da suscep ibilidade in i o de isolados de Plasmodium alcipa um II.3.7 - Es udo da associação dos polimo ismos dos genes p γ-gcs, p md 1, p m p1 e p m p2 e a espos a in i o de isolados de pacien es in ec ados com Plasmodium alcipa um aos á macos clo oquina, me loquina, amodiaquina e quinino II.3.8 - Exp essão de p m p1 e p m p2 e de genes codi ican es de enzimas en ol idas na espos a ao s ess oxida i o ao longo do ciclo in a- e i oci á io de P. alcipa um na p esença e ausência de á maco II.3.8.1 - Quan i icação ela i a da exp essão dos genes po RT-PCR usando o mé odo dos CTs compa a i os (2-∆∆C ) II.3.8.1.1 - Análise de esul ados ela i os à exp essão génica a) Cálculo do coe icien e de co elação de Pea son en e os pe ís de exp essão ob idos pa a os clones 3D7 e Dd2 dos genes de enzimas de espos a ao s ess p m p1 e p m p2 b) Regulação dos genes em es udo no ciclo in a-e i oci á io de P. alcipa um II.3.8.2 - Análise da es abilidade do mRNA dos genes em es udo 58 58 60 61 62 63 63 64 64 66 67 68 72 72 73 73 XVI II.3.9 - P odução de so os hipe imunes pa a de ecção das p o eínas codi icadas pelos genes p m p1 e p m p2 II.3.9.1 - Iden i icação in silico e ampli icação po PCR dos agmen os a clona pa a cada gene II.3.9.2 - Clonagem dos agmen os no ec o pGEX-6P-1-His po CRL II.3.9.3 - T ans o mação de E. coli JM 109/SURE® e selecção po PCR, das colónias con endo o inse o na o ien ação co ec a II.3.9.4 - Selecção das colónias con endo o inse o na o ien ação co ec a, po PCR II.3.9.5 – T ans o mação de E. coli BL21 com o DNA plasmídico e selecção dos clones que exp essa am as p o eínas ecombinan es MRP1A / MRP1B / MRP1C e MRP2A/MRP2B/MRP2 II.3.9.6 - Pu i icação das p o eínas ecombinan es a pa i de cul u a dos clones E. coli BL21 seleccionados II.3.9.7 - Inoculação de a inhos pa a a p odução de so o hipe himune imune con a as p o eínas ecombinan es II.3.9.8 - De ecção das p o eínas P MRP1 e P MRP2 III – RESULTADOS III.1 – Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC, nomeadamen e da sub- amília MRP/CFTR no genoma de Plasmodium alcipa um III.1.1 - Iden i icação in silico de sequências de genes candida os a p o eínas da amília ABC no genoma de P. alcipa um III.1.2 - Pesquisa de homologias das sequências das p o eínas P MRP1 e P MRP2 com p o eínas da sub- amília MRP/CFTR de ou os o ganismos III.1.3 - Sequenciação dos genes p m p1 e p m p2 em P. alcipa um III.1.4 - Análise de sequências III.2 - Es udo da associação dos polimo ismos dos genes p γ-gcs, p md 1, p m p1 e p m p2 e a espos a in i o de isolados de pacien es in ec ados com Plasmodium alcipa um aos á macos clo oquina, me loquina, amodiaquina e quinino III.2.1 - Ca ac e ização eno ípica dos isolados de Plasmodium 74 74 75 76 77 77 78 78 78 81 82 82 85 89 90 93 XVII alcipa um ecolhidos na STP, Angola e Tailândia III.2.2 - Ca ac e ização geno ípica dos isolados em elação aos genes p m p1, p m p2, p γ-gcs e p md 1 e a sua elação com o enó ipo de isolados de P. alcipa um p o enien es de egiões geog á icas di e en es III.2.3 - Associação das al e ações pon uais e inse ções/delecções dos genes p m p1, p m p2 e p γ-gcs com o enó ipo de amos as de P. alcipa um p o enien es das egiões geog á icas di e en es III.2.4 - Es udo da associação do núme o de cópias dos genes p m p1, p m p2 e p md 1 com a suscep ibilidade in i o de isolados de P. alcipa um a an imalá icos III.3 - Exp essão dos anspo ado es p m p1 e p m p2 e de genes codi ican es de enzimas en ol idas na espos a ao s ess oxida i o ao longo do ciclo in a-e i oci á io de Plasmodium alcipa um na p esença e ausência de á maco nos clones 3D7 e Dd2 III.3.1 - De e minação do alo de IC50 ela i o aos clones 3D7 e Dd2 em espos a à clo oquina III.3.2 - Op imização das condições de PCR em empo eal pa a os es udos de exp essão génica em P. alcipa um III.3.3 - A aliação do desen ol imen o e sinc onização das mic o- cul u as de pa asi as dos clones 3D7 e Dd2, ao longo do ciclo in a-e i oci á io de P. alcipa um III.3.4.1 - Exp essão dos anspo ado es p m p1 e p m p2 e de genes codi ican es de enzimas en ol idas na espos a ao s ess oxida i o ao longo do ciclo in a-e i oci á io de nos clones 3D7 e Dd2 III.3.4.1.1 - Regulação dos genes em es udo, no ciclo in a- e i oci á io de P. alcipa um III.3.4.1.2 - Co elação dos pe is de exp essão de cada gene em ambos os clones 3D7 e Dd2 ao longo do ciclo in a-e i oci á io de III.3.4.2 - Al e ação da exp essão dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o e anspo ado es (p m p1 e p m p2) ao longo do ciclo in a- e i oci á io nos clones 3D7 e Dd2 na p esença de clo oquina III.3.4.3 - E ei o da clo oquina na egulação da ansc ição dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o e dos anspo ado es p m p1 e 93 95 100 101 105 105 106 108 110 114 117 118 XVIII p m p2 nos clones 3D7 e Dd2 III.4 - De ecção e localização celula das p o eínas codi icadas pelos genes p m p1 e p m p2 nos clones 3D7 e Dd2 de P. alcipa um III.4.1 - Clonagem dos agmen os de cada um dos genes p m p1 e p m p2 no ec o de exp essão pGEX-6P-1-His III.4.2 - Exp essão das p o eínas ecombinan es em E. coli (BL21) III.4.3 - De ecção de P. alcipa um em e i óci os in ec ados pela écnica de imuno luo escência IFA (immuno luo escence assay) com os so os MRP1A e MRP2A III.4.4 - De ecção das p o eínas p m p1 e p m p2 po Wes e n Blo com os so os hipe imunies MRP1A e MRP2A, espec i amen e IV – DISCUSSÃO IV.1 - Genes candida os a p o eínas da amília ABC no genoma de P. alcipa um IV.2 - Associação dos polimo ismos dos genes p γ-gcs, p md 1, p m p1 e p m p2 e a espos a in i o de isolados de P. alcipa um aos á macos clo oquina, me loquina, amodiaquina e quinino a) P e alência da esis ência in i o de isolados de P. alcipa um a an imalá icos b) Associação das al e ações pon uais nos genes p m p1 e p m p2 e a espos a in i o de isolados de P. alcipa um c) Associação das inse ções/delecções no gene p γ-gcs e p m p2 e a espos a in i o de isolados de P. alcipa um d) Associação do núme o de cópias dos genes p md 1, p m p1 e p m p2 e a espos a in i o de isolados IV.3 - Exp essão dos anspo ado es p m p1 e p m p2 e de genes codi ican es de enzimas en ol idas na espos a ao s ess oxida i o ao longo do ciclo in a-e i oci á io na p esença e ausência de á maco nos clones 3D7 e Dd2 IV.3.1. Co elação en e os pe is de exp essão basal dos genes em 3D7 e Dd2 - es udo em condições no mais de cul u a IV.3.2. Regulação da exp essão génica na p esença de CQ IV.3.3 - E ei o da clo oquina na egulação da ansc ição dos genes em 124 128 128 129 130 132 133 134 142 143 144 146 147 148 150 155 XIX es udo IV.4 – De ecção e localização celula das p o eínas P MRP1 e P MRP2 codi icadas pelos genes p m p1 e p m p2 V – PRINCIPAIS CONCLUSÕES VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO 1 ANEXO 2 ANEXO 3 ANEXO 4 ANEXO 5 ANEXO 6 ANEXO 7 ANEXO 8 ANEXO 9 ANEXO 10 ANEXO 11 ANEXO 12 ANEXO 13 ANEXO 14 ANEXO 15 ANEXO 16 ANEXO 17 VIII – GLOSSÁRIO 158 159 161 166 203 204 205 206 207 214 227 229 239 248 249 250 251 252 253 255 256 258 XX Índice de Figu as Figu a I.1 – Mapa da dis ibuição geog á ica da malá ia e dos á macos aos quais Plasmodium alcipa um ap esen a esis ência. Figu a I.2 - Ciclo de ida de Plasmodium alcipa um. Figu a I.3 - Es adios de desen ol imen o in a-e i oci á io de Plasmodium alcipa um. Figu a I.4 - In asão de um e i óci o po um me ozoí o de Plasmodium alcipa um. Figu a I.5 - Rep esen ação simpli icada dos á ios p ocessos bioquímicos que pa icipam na espos a ao s ess oxida i o na ase in a-e i oci á ia de Plasmodium alcipa um. Figu a I.6 - Modelos bidimensionais dos a anjos molecula es hipo é icos de p o eínas ABC. Figu a I.7 - Modelo ilus ando a in e - elação en e uma p o eína do ipo MRP e o glu a ião (GSH). Figu a II.1 - Esquema ep esen a i o do ec o de clonagem, o plasmídeo pGEX-6P-1-His. Figu a II.2 - Rep esen ação g á ica do aumen o da concen ação de DNA du an e uma eacção de PCR. Figu a II.3 - Emissão de luo escência du an e a eacção de PCR em empo eal pelos 3 mé odos usados nes e abalho. Figu a II.4 - Fo og a ia de go as espessas ealizadas a pa i da mic ocul u a in i o pa a a aliação da suscep ibilidade a an imalá icos segundo o es e MARK III da OMS. Figu a II.5 - Validação da aplicação do mé odo 2 -∆∆C . Figu a II.6 - P og ama e componen es da mis u a de CRL (Cycle Res ic ion Liga ion) usados na clonagem de cada agmen o no plasmídeo pGEX-6P-1- His. Figu a III.1 - Compa ação da sequência de a.a. dos NBDs de P MRP1 de P. alcipa um, com as seis p o eínas com o maio g au de semelhança ao ní el da es u u a p imá ia iden i icadas pelo BLAST. Figu a III.2 - Compa ação da sequência de a.a. dos NBDs de P MRP2 de P. alcipa um, com as seis p o eínas com o maio g au de semelhança ao ní el da 3 4 5 6 19 32 40 46 53 55 65 72 76 87 88 XXI es u u a p imá ia iden i icadas pelo BLAST. Figu a III.3 - Resul ado da ampli icação po PCR a pa i de cDNA, após pu i icação, dos agmen os dos genes p m p1 e p m p2 a sequencia . Figu a III.4 - De ecção po PCR das inse ções/delecções nos genes p m p2 e p γ-gcs em clones e isolados eno ipados de P. alcipa um. Figu a III.5 - Fo og a ias de géis exempli ica i os da elec o o ese dos agmen os ob idos po PCR-RFLP pa a a iden i icação dos polimo ismos de p m p1. Figu a III.6 - Iden i icação do polimo ismo de p m p2 po diges ão com BccI, nos clones 3D7 e Dd2 e em isolados. Figu a III.7 - Núme o de cópias dos genes p md 1, p m p1 e p m p2, de e minado po RT-PCR usando SYBR G een. Figu a III.8 - Núme o de cópias dos genes p m p1, p m p2 e p md 1 nos isolados p o enien es da Tailândia de Angola. Figu a III.9 - Cu as de dose- espos a esul an es dos es es de suscep ibilidade pa a a de e minação dos IC50 dos clones 3D7 e Dd2 pa a a clo oquina. Figu a III.10 - Fo og a ia do gel co esponden e à elec o o ese dos p odu os dos 10 genes ampli icados po PCR em empo eal. Figu a III.11 - Moni o ização da sinc onia das cul u as in i o de P. alcipa um. Figu a III.12 - Pe il de exp essão dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-cysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in a- e i oci á io do clone 3D7 de P. alcipa um. Figu a III.13 - Pe il de exp essão dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-cysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in a- e i oci á io do clone Dd2 de P. alcipa um. Figu a III.14 - Al e ação da ampli ude de exp essão dos di e en es genes en e es adios in a-e i oci á ios do clone 3D7 de P. alcipa um. Figu a III.15 - Al e ação da ampli ude de exp essão dos di e en es genes en e es adios in a-e i oci á ios do clone Dd2 de P. alcipa um. Figu a III.16 - Al e ação da exp essão dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in a-e i oci á io do clone 3D7 na p esença de clo oquina. 90 96 98 99 101 103 106 107 109 112 113 115 116 120 121 In odução ______________________________________________________________________ 4 O ciclo de ida inclui duas ases: a ase espo ogónica, com mul iplicação do pa asi a no hospedei o de ini i o, in e eb ado (géne o Anopheles), e a ase esquizogónica, com mul iplicação no hospedei o in e mediá io e eb ado (Homo sapiens) (Gilles, 1989; Knell, 1988; B uce-Chwa e al., 1970). Figu a I.2 - Ciclo de ida de Plasmodium alcipa um. (adap ado de (Knell, 1988)). O pa asi a é ansmi ido ao ec o , após uma e eição sanguínea de um mosqui o êmea num hospedei o in e mediá io in ec ado e com pa asi as no es adio de game óci os. Após a ma u ação dos game óci os no es ômago do mosqui o, oco e a e ilização. O zigo o o mado ans o ma-se num oocine o mó el e in asi o que pene a o epi élio do es ômago do mosqui o, ixando-se nes e. Inicia-se aí o desen ol imen o do oocís o. Es e so e uma di isão meió ica, seguida de múl iplas di isões mi ó icas que o iginam inúme os espo ozoí os. Quando ma u o, o oocís o libe a, após eben amen o, os espo ozoí os mó eis, pa a o hemocélio do mosqui o. Es es deslocam-se pa a as glândulas sali a es, acumulando-se nos duc os sali a es. Quando o mosqui o in ec ado se alimen a no hospedei o e eb ado, os espo ozoí os inoculados du an e a picada do mosqui o, en am na co en e sanguínea. Alguns des es espo ozoí os pene am nos hepa óci os iniciando a esquizogonia hepá ica ou ex a- e i oci á ia. Em P. i ax e P. o ale, es e desen ol imen o não se p ocessa de imedia o, exis indo o mas hepá icas la en es ou hipnozoí os. Após ma u ação dos esquizon es In odução ______________________________________________________________________ 5 hepá icos oco e a sua up u a, sendo os me ozoí os libe ados pa a a co en e sanguínea. Figu e I.3 - Es adios de desen ol imen o in a-e i oci á io de Plasmodium alcipa um. A ase de anel, a se a assinala um pa asi a com dupla c oma ina; B ase de o ozoí o; C ase de esquizon e, a se a assinala um dos me ozoí os; D game óci o (Fo og a ias de mic oscopia de ansmissão de pa i de es egaços de cul u a co ados com giemsa, ampliação 100X). Os me ozoí os in adem e i óci os, iniciando-se a esquizogonia sanguínea ou in ae i oci á ia. Du an e a ase in ae i oci á ia do pa asi a, os me ozoí os so em di e enciação o iginando es adios de desen ol imen o: anel, o ozoí o e esquizon e (Figu a I.3). A é à ase de di isão nuclea é designado o ozoí o. Quando o núcleo en a em di isão, oco e a esquizogonia, o iginando me ozoí os - o ma-se o esquizon e (cada esquizon e o igina 16 a 32 me ozoí os). Os me ozoí os são libe ados po o u a do esquizon e in adindo no os e i óci os. Es e ciclo oco e de uma o ma pe iódica de ap oximadamen e 48 h, sendo esponsá el pelos picos eb ís ípicos de uma in ecção de malá ia. Alguns dos me ozoí os di e enciam-se em game óci os (Figu a I.3), as o mas in ec an es pa a o ec o . A ma u ação dos game óci os, inicia-se no hospedei o In odução ______________________________________________________________________ 6 e eb ado e é comple ada no mosqui o após e eição sanguínea, dando início a um no o ciclo espo ogónico (Gilles, 1989; Knell, 1988; B uce-Chwa e al., 1970). I.1.2 - Mo ologia de Plasmodium alcipa um e dos e i óci os in ec ados P. alcipa um é um pa asi a in acelula ob iga ó io, que in ade ac i amen e o e i óci o hospedei o, onde se desen ol e no in e io do acúolo do pa asi ó o o (PV) (Figu a.I.4) o mado du an e a in asão. A in asão do e i óci o pelos me ozoí os oco e apidamen e (≈30s) (Fowle e al., 1998). Es udos mo ológicos ealizados po mic oscopia elec ónica e de ansmissão, e elam que a in asão se p ocessa de o ma sequencial (Fowle e al., 1998) (Bannis e & Dluzewski, 1990; Aikawa e al., 1978; Mille e al., 1973). Figu a I.4 - In asão de um e i óci o po um me ozoí o de Plasmodium alcipa um. a - o me ozoí o ade e ao e i óci o pela egião apical (se a), R= op ia, N = nucleo; b - a memb ana do e i óci o so e in aginação (se a) e engloba o me ozoí o; c - o pa asi a (es adio de anel) odeado pela memb ana do acúolo do pa asi ó o o; VP = acúolo do pa asi ó o o, PVM = memb ana do acúolo do pa asi ó o o VD = acúolo diges i o. Ba a = 0.5 µm adap ado de (Akaki e al., 2002). Após con ac o com um e i óci o, o me ozoí o ade e à memb ana des e (Aikawa e al., 1978); pene a no e i óci o onde so e desen ol imen o no in e io de um compa imen o chamado acúolo do pa asi ó o o (VP), o mado a pa i da memb ana do e i óci o. A memb ana que odeia o me ozoí o nes a ase, em o igem no e i óci o e oma o nome de memb ana do acúolo do pa asi ó o o (PVM) (Figu a I.4 b e c). O pa asi a desen ol e-se no in e io do VP (Figu a I.4 c). A memb ana do acúolo do pa asi ó o o cons i ui a in e ace en e o pa asi a e o ci oplasma do e i óci o. A In odução ______________________________________________________________________ 7 hemoglobina p o enien e do e i óci o hospedei o, é dige ida no acúolo diges i o do pa asi a (Akaki e al., 2002). O p ocesso de diges ão inicia-se com a o mação do ci os oma, uma in aginação das memb anas pa asi á ias plasmá ica e do acúolo do pa asi ó o o, o mando esículas de pinoci ose as quais anspo am o ci oplasma do e i óci o. Es as esículas coalescem com o acúolo diges i o onde libe am o seu con eúdo (maio i a iamen e cons i uído po hemoglobina), no VP as p o eases deg adam a hemoglobina em pequenos pép idos e aminoácidos (Ra ho e e al., 2005b; Lew e al., 2003). A deg adação da hemoglobina libe a compos os lipo ílicos e osos os quais são oxidados a é e ip o opo i ina-IX (FP-IX) (Ayad e al., 2001). Os g upos heme li es são polime izados o iginando a subs ância c is alina denominada hemozoína (Egan e al., 2002; K ugliak e al., 2002; Lo ia e al., 1999). a) Al e ações mo ológicas do e i óci o in ec ado O pa asi a comple a a ase assexuada do seu ciclo de desen ol imen o no in e io do acúolo do pa asi ó o o (VP). As p o eínas de o igem e i oci á ia são excluídas da PVM e subs i uídas po p o eínas de o igem pa asi á ia, enquan o que os lípidos de i am na sua maio pa e da memb ana plasmá ica do e i óci o (Pou elle e al., 1994; Wa d e al., 1993). À medida que o pa asi a se desen ol e e eplica den o do VP, oco em a ias al e ações no ci oplasma do e i óci o in ec ado (Das e al., 1994; Beha i & Halda , 1994; Elmendo & Halda , 1993). Nos es adios ma u os do pa asi a (esquizon es) a al e ação mais e iden e da supe ície do e i óci o in ec ado é causada pelas p o ube âncias denominadas knobs. Es es são consequência da deposição e inse ção de p o eínas de o igem pa asi á ia1 na supe ície in e na da memb ana do e i óci o, o iginando uma de o mação na memb ana e i oci á ia (Luse & Mille , 1971). É a a és dos knobs que os e i óci os in ec ados se ligam à supe ície de e i óci os não in ec ados (ex. o mação de ose as) e ou as células (ex. endo élio ascula ce eb al), con ibuindo pa a a o ma mais g a e da doença, a malá ia ce eb al (Aikawa, 1988; Aley e al., 1984). 1 O p incipal componen e dos knobs é a p o eína ica em his idina associada aos knobs (KAHRP), a qual o ma o p incipal elemen o es u u al des as p o ube âncias (T iglia e al., 1987; Pologe e al., 1987; Kilejian e al., 1986). Ou os componen es são a P EMP-1 uma p o eína in eg al de memb ana e ac ua como ligando na adesão aos ecep o es celula es do endo élio ascula (Smi h & Fo nace, 1995; Ba uch e al., 1995) e a P EMP3 (Pasloske e al., 1993) cuja unção se pensa es a associada ao anspo e da P EMP1 (Wa e keyn e al., 2000). In odução ______________________________________________________________________ 8 b) Al e ações isiológicas do e i óci o in ec ado No e i óci o in ec ado a memb ana do acúolo do pa asi ó o o (PVM) o ma uma ba ei a en e o ci oplasma da célula hospedei a e a supe ície do pa asi a. É a a és da PVM que o pa asi a ecebe nu ien es do meio ex a celula , que incluem aminoácidos, ácidos go dos e pu inas. Ao con á io dos mamí e os, os p o ozoá ios (Be ens e al., 1998), em pa icula Plasmodium spp. (Ge o e al., 1984), não possuem a capacidade sin e iza de no o pu inas. Assim, dependem o almen e do hospedei o pa a ob e es e nu ien e essencial à sín ese de DNA. Os nu ien es êm de se anspo ados a a és de 3 memb anas: a memb ana plasmá ica do e i óci o, a memb ana do acúolo do pa asi ó o o e a memb ana plasmá ica do pa asi a (Figu a I.4). O anspo e de nu ien es en ol e p o eínas anspo ado as, canais e as memb anas ubo isicula es (Saliba & Ki k, 2001; Saliba & Ki k, 1999; Laue e al., 1997; Ups on & Ge o, 1995; Beha i & Halda , 1994). À medida que o pa asi a se desen ol e den o do e i óci o, são associadas ao ci oesquele o do e i óci o ou inse idas na sua memb ana, di e sas p o eínas com o igem pa asi á ia. Is o esul a em modi icações a ní el do ci oplasma e da memb ana do e i óci o (Foley & Tilley, 1995; Lingelbach, 1993). Exis em e idências de que os e i óci os in ec ados possuem uma pe meabilidade aumen ada ( ela i amen e aos e i óci os não in ec ados) pa a um de e minado núme o de subs âncias de baixo peso molecula , com ele ância pa a as moléculas aniónicas (Penny e al., 1998; Ginsbu g & A amna, 1994c). I.2 - A esis ência aos an imalá icos Nas úl imas décadas, o con olo e a amen o da malá ia êm sido bas an e di icul ados pelo su gimen o e disseminação da esis ência pa asi á ia aos an imalá icos mais u ilizados, nomeadamen e à clo oquina (Talisuna e al., 2003a). No con ex o des e abalho adop a emos a de inição da O ganização Mundial de Saúde que e e e esis ência como “a capacidade que uma dada população de pa asi as em pa a se mul iplica ou sob e i e , na p esença de concen ações de á maco, que habi ualmen e des ui iam pa asi as da mesma espécie ou impedi iam a sua mul iplicação” (www.mala iasi e.com/mala ia/D ugResis ance). A e icácia e apêu ica dos á macos, baseia-se na capacidade des es inibi em ou des uí em os pa asi as in i o. In odução ______________________________________________________________________ 9 Os acon ecimen os que pe mi em aos pa asi as da malá ia sob e i e na p esença de um de e minado an imalá ico são espon aneos, a os e independen es do á maco usado (Whi e, 2004). Es es acon ecimen os es ão associados a mu ações ou al e ação do núme o de cópias de genes codi ican es do al o de de e minado á maco ou de anspo ado es (bombas) cuja unção a ec a a concen ação in a- pa asi á ia do á maco. São di e sos os ac o es que pode ão in luencia a selecção de esis ência aos an imalá icos, incluindo ca ac e ís icas do pa asi a, do hospedei o, do ec o e do agen e an imalá ico u ilizado. a) Fac o es associados ao pa asi a - A equência com que su gem espon aneamen e mu ações no genoma e a e iciência dos mecanismos de epa ação do DNA (T o a e al., 2004). - A i ness2 con e ida pelas mu ações em elação à p esença de an imalá icos, em elação a pa asi as po ado es do alelo sel agem (Osman e al., 2007; Wallike e al., 2005; Pe e s e al., 2002). - O g au de suscep ibilidade/ esis ência ( elação dose espos a) que de e minada mu ação con e e ao pa asi a em elação a um ou mais an imalá icos (We nsdo e & Noedl, 2003a; Le B as & Du and, 2003a; Ecks ein-Ludwig e al., 2003; Wongs ichanalai e al., 2002; Ko sinczky e al., 2000). - O núme o de pa asi as expos os ao á maco3 e a p obabilidade de oco e em in ecções mis as (p esença de di e en es es i pes de pa asi as no mesmo hospedei o) êm um e ei o adi i o na selecção de pa asi as esis en es ( e Kuile e al., 1995). b) Fac o es associados ao hospedei o humano - O sis ema imuni á io do indi iduo (imunidade especi ica4 e não especi ica), con ibui pa a a eliminação dos pa asi as. A má nu ição, in ecções concomi an es ou ou os a o ecem a imunodep essão, aumen ando a p obabilidade de sob e i ência dos pa asi as não eliminados pelo á maco (Whi e, 2004; Djimde e al., 2003; Whi e, 2003; We nsdo e , 1991b). 2 Van agem adap a i a con e ida a um o ganismo, po uma de e minada mu ação, em elação as o ganismos po ado es do alelo sel agem. 3 Em á eas de ansmissão mode ada ou al a, as pa asi émias ole adas sem sin omas de doença, podem a ingi mais de 10,000 pa asi as po µl de sangue (en e 1010 e 1011 pa asi as o ais no sangue de um adul o). 4 A imunidade especi ica é meno em a eas de baixa ansmissão do que em a eas de ele ada ansmissão. In odução ______________________________________________________________________ 10 - A me abolização dos an imalá icos pelo o ganismo humano a ia en e indi íduos, de ido à acção de enzimas maio i a iamen e memb os da supe amília dos ci oc omos P4505 (Giao & de V ies, 2001). A me abolização mais ápida do á maco, con ibui pa a a exposição do pa asi a a doses sub- e apêu icas (Venne s om e al., 2000). Nos indi íduos ou populações em que is o se e i ica, a concen ação de compos o é insu icien e pa a ealiza uma p o ecção p o ilá ica ou e apêu ica, no en an o é mui as ezes su icien e pa a exe ce p essão selec i a sob e os pa asi as, con ibuindo pa a a selecção de pa asi as esis en es (Whi e, 2004; We nsdo e , 1991a). c) Fac o es associados ao á maco - Exposições sucessi as a concen ações sub- e apêu icas de á maco pe mi em a selecção de pa asi as cada ez mais esis en es, al como a adminis ação inde ida dos an imalá icos, pa a a amen o de ou as pa ologias, cujos sin omas iniciais podem se con undidos com os de uma in ecção po Plasmodium (We nsdo e , 1991a; E ling e al., 1989; Payne, 1988). - A esis ência c uzada a di e en es á macos, su ge pelo ac o de alguns an imalá icos se em quimicamen e semelhan es, pe mi e que a esis ência es abelecida a um deles acili e a selecção de esis ência ao ou o an imalá ico quimicamen e elacionado (Hall e al., 1975) (Basco & Le B as, 1991). I.2.1 - Focos e o igem da esis ência a an imalá icos e sua p opagação Em e mos ge ais o enómeno de esis ência a an imalá icos, em sido desc i o pa a duas das qua o espécies de Plasmodium que in ec am o Homem: P. i ax e P. alcipa um, sendo que es e úl imo em demons ado capacidade de esis i a quase odos os á macos em uso (Looa eesuwan e al., 1997; Mu phy & Lewis, 1993), excep uando a a emisinina e seus de i ados. Ac ualmen e pa asi as esis en es a um ou mais á macos podem se encon ados em odas as egiões onde a mala ia é endémica, com excepções da Amé ica Cen al e algumas do Médio O ien e e Ásia Cen al (Figu a I.1). Uma e isão de alhada sob e o igem da esis ência a an imalá icos e sua p opagação pode se encon ada em (Whi e, 2004). 5 Os genes que codi icam es as enzimas são polimó icos, o iginando enzimas com capacidades ca alí icas a iá eis esul ando em ciné icas de me abolização di e en es de indi íduo pa a indi íduo. In odução ______________________________________________________________________ 11 I.2.2 – Mul i esis ência A designação de mul i esis ência a an imalá icos e e e-se ao enó ipo de esis ência a dois ou mais á macos, enómeno es e que em sido obse ado em P. alcipa um. A esis ência a á ios an imalá icos em simul âneo esul a da u ilização equen e e simul ânea dos mesmos, p o ocando uma p essão selec i a que culmina no apa ecimen o des e enómeno de mul i esis ência; a esis ência c uzada en e an imalá icos es á elacionada com os aspec os comuns dos seus mecanismos de acção, bem como dos mecanismos de esis ência que lhes es ão associados (Le B as & Du and, 2003a). Habi ualmen e, e e e-se à esis ência à clo oquina e à combinação pi ime amina/sul adoxina (SP), mediada po mu ações nos genes p c , p dh e p dhps, espec i amen e. No en an o, es i pes esis en es à clo oquina, SP, me loquina e com suscep ibilidade diminuída ao quinino o am já desc i as (Sya uddin e al., 2006; Sya uddin e al., 2005; Sya uddin e al., 2003). Ac ualmen e, a egião do globo mais a ec ada po es e enómeno de mul i esis ência é o Sudes e Asiá ico (Figu a I.1). I.2.3- Modo de acção dos an imalá icos e mecanismos de esis ência associados A e icácia e especi icidade dos compos os usados pa a a amen o das doenças in ecciosas, assen a na capacidade des es in e e i em com aspec os do me abolismo do agen e, que di e em signi ica i amen e dos do hospedei o humano. A ase sin omá ica da in ecção po P. alcipa um é in a-e i oci á ia. As adap ações me abólicas e mesmo ias biossin é icas o almen e dis in as, necessá ias pa a o seu desen ol imen o, cons i uem assim po enciais al os e apêu icos. Is o é álido não só pa a os á macos exis en es mas ambém, pa a o desenho de no os compos os. Na p o ilaxia e a amen o da malá ia, os g upos de compos os com maio exp essão são os á macos an agonis as da sín ese do ácido ólico (ex. pi ime amina e sul adoxina), os de i ados do Quinghaosu (ex. a emisinina) e os á macos an imalá icos da classe das quinoleínas (ex. quinino, me loquina, clo oquina e p imaquina) (A a -Boge & Shapi o, 2005; Cowman & Foo e, 1990). Nes a secção, se ão abo dados os aspec os me abólicos do pa asi a, modos de acção e mecanismos ine en es à esis ência aos an imalá icos, com especial des aque pa a a classe das quinoleínas, po se em os an imalá icos objec o de es udo des e abalho. In odução ______________________________________________________________________ 12 I.2.3.1 - An imalá icos do g upo das quinoleínas Fo am os Jesuí as que in oduzi am na Eu opa a u ilização da casca da quina pa a comba e a malá ia. No século XIX (1820), o alcalóide quinino é isolado a pa i da cinchona (Cinchona succi ub a), Chinchona spp., pelos químicos anceses Pie e Pelle ie e Joseph Ca en ou (Kwas e al., 2002). A pa i da es u u a do quinino o am desen ol idos á ios análogos como a clo oquina a me loquina ou a amodiaquina (Rieckmann e al., 1987; Pe o & Gilks, 1986). Es e é o g upo de an imalá icos, com maio exp essão no a amen o e p o ilaxia da malá ia, que em mono e apia (ex.: quinino) ou em combinação e apêu ica com compos os quimicamen e não elacionados (ex.: me loquina/a eme e ). As quinoleínas ap esen am uma acção selec i a em elação aos es adios in ae i oci á ios do pa asi a du an e os quais se p oduz hemozoína: o ozoí os madu os e esquizon es (O jih, 1997; Skinne e al., 1996; Gea y e al., 1989). O seu mecanismo de acção ainda não se encon a escla ecido. Sendo consensual que in e e em com a des oxi icação dos p odu os de deg adação da hemoglobina, no acúolo diges i o do pa asi a (Becke e al., 2004c; Ginsbu g, 2003; Famin & Ginsbu g, 2002). A simila idade da es u u a química des es compos os, aumen a a p obabilidade de exis i em ac o es comuns en e os espec i os mecanismos de acção e esis ência. a) Clo oquina A clo oquina é uma 4-aminoquinolina, a sua u ilização e a já gene alizada du an e os anos 40. Os es udos e ec uados nas di e en es ases do ciclo de ida in a-e i oci á io de P. alcipa um, apon a am o acúolo diges i o, como o local de ac uação des e an imalá ico (K ogs ad e al., 1992; Za chin e al., 1986). A clo oquina, bem como ou os á macos quimicamen e elacionados, ac ua po acumulação em concen ações ele adas no acúolo diges i o do pa asi a, podendo a ingi mais de 100 ezes as do plasma (Gligo ije ic e al., 2006; Sulli an e al., 1996a; Yayon e al., 1984b; Aikawa e al., 1972). No acúolo in e e e com a des oxi icação dos g upos heme e a polime ização da hemozoína (Sulli an e al., 1996a). Es udos ealizados com pa asi as de malá ia mu ina e P. alcipa um mos a am que, a acumulação de clo oquina no acúolo é meno em es i pes esis en es (U sos e al., 2000), que não se e i ica In odução ______________________________________________________________________ 13 esis ência c uzada com quinino e me loquina (Gea y & Jensen, 1983), que a meno acumulação se de e ao aumen o do e luxo e não à diminuição da acumulação (Sanchez e al., 2003; K ogs ad e al., 1987), e ainda que o e apamil6 e e e (pa cialmen e) a acumulação no acúolo e a sensibilidade à clo oquina (Ma in e al., 1987). As duas ap oximações expe imen ais, ealizadas na en a i a de explica os di e en es ní eis de acumulação da clo oquina no acúolo do pa asi a, esul a am na iden i icação de dois mecanismos gené icos dis in os pa a explica a acumulação da clo oquina na célula. Um é baseado em mu ações no gene p c (P. alcipa um chlo oquine- esis ance anspo e ) (Fidock e al., 2000b). O ou o em como base mu ações gene p md 1 (P. alcipa um mul id ug- esis ance 1) (Wellems e al., 1990), p o a elmen e um modelado dos ní eis de esis ência (A a -Boge & Shapi o, 2005). A análise do mapa de linkage da descendência do c uzamen o de dois clones de P. alcipa um HB3 X Dd2 (HB3 sensí el à clo oquina e Dd2 esis en e) ealizado po Wellems e seus colabo ado es (Wellems e al., 1990), localizou o de e minan e de esis ência à clo oquina no c omossoma 7. Pos e io men e e i icou-se que es a associação se de ia a pelo menos uma mu ação pon ual na sequência do gene p c (Fidock e al., 2000b). Es udos pos e io es iden i ica am a ias mu ações7 no gene p c , associadas à esis ência a es e an imalá ico (Labbe e al., 2001; Adagu & Wa hu s , 2001; Du and & Le B as, 2001; Fidock e al., 2000b; Du aisingh e al., 2000). A adução da sequência que codi ica o gene p c esul ou numa p o eína, com dez segmen os ansmemb ana es. Es a localiza-se na memb ana do acúolo diges i o, onde o ma um canal de Clo o que eduz os ní eis de clo oquina no acúolo. Reduzindo des a o ma a acumulação de g upos heme li es e a ci o oxicidade (A a -Boge & Shapi o, 2005; Walle e al., 2003). O mecanismo pelo qual o p odu o de p c eduz os ní eis de clo oquina no acúolo não se encon a ainda escla ecido. O gene homólogo de p c em P. i ax, não es á associado ao enó ipo de esis ência à clo oquiona (Nomu a e al., 2001). O mecanismo que en ol e o gene p md 1 é baseado na obse ação de que o e apamil pode e e e a esis ência à clo oquina impedindo o e luxo do á maco (K ogs ad e al., 6 Ve apamil inibido da calmodulina, compe e com os á macos pelos ecep o es do anspo ado . 7 Es ão iden i icadas 11 mu ações no gene p c elacionadas com esis ência à clo oquina, codões 72, 74, 75, 76, 144, 160, 220, 271, 326, 356 e 371. In odução ______________________________________________________________________ 20 Em sín ese os sis emas an ioxidan es em Plasmodium alcipa um englobam: Supe oxidodismu ases, Des oxi icação dependen e de glu a ião e Des oxi icação dependen e de io edoxinas. I.2.4.2.1 – Supe oxidodismu ases As supe oxidismu ases (SODs) ca alisam a dismu ação dos aniões supe óxido (O2-) pa a o ma pe óxido de hid ogénio (H2O2) e oxigénio O2 (Schwa z e al., 1999). Os pa asi as da mala ia êm uma Fe-SOD (G a epanche e al., 2002) e uma Mn-SOD (Ranz & Meshnick, 1989)(Figu a I.5). Es e ac o ans o ma as SODs em po enciais al os e apêu icos (Tu ens, 2004). O ac o do seu subs a o se uma molécula bas an e pequena (O2-), em di icul ado a iden i icação de análogos que pe mi am a inibição selec i a, apenas das SODs dos pa asi as (Mulle , 2004b; Schwa z e al., 1999). Dado que a Fe-SOD é uma p o eína ci osólica, é pouco p o á el que ac ue sob e os aniões supe óxido ge ados den o do acúolo diges i o du an e a diges ão da hemoglobina. As SODs do hospedei o pa ecem con inua uncionan es mesmo no in e io do acúolo diges i o do pa asi a (Fai ield e al., 1988; Fai ield e al., 1988; S ocke e al., 1985). No en an o, o papel des as SODs na des oxi icação de O2- de e se negligenciá el (Ginsbu g & A amna, 1994a). A segunda supe oxidodismu ase de P. alcipa um, uma Mn-SOD localiza-se na mi ocônd ia (Sienkiewicz e al., 2004; Ranz & Meshnick, 1989). A exis ência de uma cadeia espi a ó ia ac i a (Ki a e al., 2002) a qual ge a iões supe óxido, o na impe a i a a exis ência de uma SOD na mi ocônd ia do pa asi a, pa a e i a danos nas unções me abólicas, nos ácidos nucleicos, nas p o eínas e memb anas do o ganelo (Inoue e al., 2003). I.2.4.2.2 - Des oxi icação dependen e de glu a ião A des oxi icação do H2O2 o iginado pelas supe oxidodismu ases de P. alcipa um é exclusi amen e ealizada pelas pe oxidases dependen es de io edoxina e pela glu a ião S- ans e ese, pois es e pa asi a não possui ca alase nem pe oxidases dependen es de glu a ião (Flohe e al., 2003; Becke e al., 2003). In odução ______________________________________________________________________ 21 O ipép ido glu a ião (GSH ou glu amil cis ainil glicina), é uma das moléculas que mais con ibui pa a a manu enção do equilíb io edox in acelula em células ae óbias (Clai mon e al., 1999). Pa a além do seu e ei o ampão, ac ua ambém como co ac o de á ias de enzimas (ex. glu a ião educ ase, glu a ião S- ans e ase) (Clai mon e al., 1999). A azão en e a sua o ma eduzida (GSH) e oxidada (GSSG- dissul i o de glu a ião) ou seja; [GSH]/[GSSG] é ele ada (en e 10:1 e 100:1) e undamen al pa a man e o equilíb io edox in acelula . A inac i ação po eacção com glu a ião11, cons i ui uma ia essencial em Plasmodium spp. pa a minimiza os e ei os óxicos dos FP-IX (Figu a I.5) (Flohe e al., 2003; Ginsbu g & Golense , 2003) (Becke e al., 2003) (Ginsbu g & Golense , 1999). Em P. alcipa um, es a azão pa ece se dependen e da sín ese de no o de GSH, do e luxo de GSSG pa a o a do pa asi a e da acção conce ada da glu a ião educ ase (P GR) com o ciclo das pen oses de os a o (Figu a I.5) (Lue sen e al., 2000; Ayi e al., 1998; A amna & Ginsbu g, 1997). Sín ese de no o e anspo e de glu a ião Os e i óci os in ec ados com P. alcipa um pe dem a capacidade de ealiza sín ese de no o do ipép ido glu a ião (GSH), de ido à pe da do in e mediá io γ-glu amil cis eina, o qual di unde pa a o a da célula (A amna & Ginsbu g, 1997). Pe dem ainda apidamen e o seu glu a ião na o ma oxidada (GSSG) de ido à acção de bombas de e luxo de GSSG (Ayi e al., 1998; A amna & Ginsbu g, 1997) (Meie johann e al., 2002b; Lue sen e al., 2000; Ginsbu g e al., 1998). Is o é compensado pelo anspo e ac i o de GSSG a a és da memb ana do pa asi a, e ec uado pelas designadas bombas de e luxo de GSSG (Figu a I.5) ( anspo ado es ABC do ipo MRP-mul id ug esis ance associa ed p o ein (Homolya e al., 2003; Bo s , 1999; K au h-Siegel e al., 1996; Smi e al., 1990), e I.6.2.1). No ci oplasma do e i óci o o GSSG é eduzido a GSH pela acção da glu a ião educ ase do hospedei o. a) γ-glu amil cis eína sin e ase P. alcipa um possui a capacidade de ealiza sín ese de no o de GSH, o que con ibui la gamen e pa a man e em equilíb io as concen ações ela i as de GSH/GSSG 11 A ligação de FP-IX a p o einas como a HRP2 e HRP3 em ambem indo a se p opoos o como mecanismo adicional (Mashima e al., 2002; Papalexis e al., 2001b; Choi e al., 1999; Sulli an e al., 1996a). In odução ______________________________________________________________________ 22 (Lue sen e al., 2000; Ayi e al., 1998; A amna & Ginsbu g, 1997). A γ-glu amil cis eina sin e ase (P γ-GCS) ca aliza o passo limi an e da sín ese de GSH em P. alcipa um (Meie johann e al., 2002a; Lue sen e al., 2000) e ca aliza a ligação do glu ama o à cis eína (Figu a I.5). Uma segunda enzima, a glu a ião sin e ase (P GS), ca aliza a adição de glicina pa a o igina GSH (Meie johann e al., 2002c; Lue sen e al., 1999). Na sequência nucleo ídica dos genes que codi icam a P γ-GCS de di e en es clones de P. alcipa um, oi iden i icado um núme o a iá el de epe ições, as quais não oco em em ou as espécies, como no gene que codi ica a γ-GCS de P. be ghei (espécie que in ec a oedo es) (Lue sen e al., 1999; Bi ago e al., 1999). Apa en emen e es as a iações não es ão associadas à esis ência a an imalá icos nem à p o eniência geog á ica das amos as. A sua unção não es á ainda iden i icada (Lue sen e al., 1999). b) Glu a ião educ ase A elação GSH/GSSG (10:1 a 100:1), é man ida sob e udo pela acção da glu a ião educ ase (P GR), enzima esponsá el po man e o glu a ião no seu es ado eduzido (GSH) (Figu a I.5) (Sa ides e al., 2002). O GSSG é eduzido a GSH pela acção da P GR usando NADPH como dado de elec ões. O NADP+ esul an e é eduzido a NADPH po enzimas do ciclo das pen oses de os a o como a glucose-6- os a o desid ogenase (Figu a I.5) (Bohme e al., 2000). A es u u a p imá ia da P GR con ém inse ções no domínio de ligação ao FAD (a.a 123–134), no domínio cen al (a.a 314–347) e no domínio de in e ace dos domínio (a.a 496–499), que são especi icas do pa asi a. A delecção expe imen al das duas p imei as inse ções, a ec a cla amen e a ligação ao g upo p os é ico-FAD e a es abilidade da p o eína, espec i amen e (Gilbe ge e al., 2000). As es u u as da P GR e da GR humana são simila es. No en an o, a di e ença ao ní el do domínio de in e ace dos díme os pode pe mi i o desenho de inibido es que se liguem especi icamen e nes e local da p o eína do pa asi a (Becke e al., 2004b; Sa ma e al., 2003). Mesmo assim inúme os es udos clínicos e epidemiológicos suge em que a GR de P. alcipa um cons i ui um po encial al o pa a o desen ol imen o de no os an imalá icos (G ellie e In odução ______________________________________________________________________ 23 al., 2001; Da ioud-Cha e e al., 2001; Becke e al., 1999; Mulle e al., 1995; Zhang e al., 1988). c) Glu a ião pe oxidase A p o eína de P. alcipa um iden i icada como glu a ião pe oxidase (P GPX) (Gamain e al., 1996b; Gamain e al., 1996a) u iliza a io edoxina como dado de elec ões em ez de glu a ião, na edução de pe óxidos. No en an o, não é um memb o da amília das pe oxi edoxinas (Sz aje e al., 2001) ( e I.2.4.2.3 4). A sua eacção com o H2O2 e o GSH é meno do que a das pe oxidases. O en ol imen o do GSH na edução de pe óxidos em P. alcipa um, necessi a assim de mecanismos al e na i os como po exemplo a enzima glu a ião S- ans e ase (P GST) (cuja ac i idade pe oxidásica dependen e do GSH) (Ha wald e al., 2002). d) Glu a ião S- ans e ase Em ge al, a glu a ião S- ans e ase (GST), conjuga subs âncias elec o ílicas endógenas ou á macos com GSH, po o ma a se em anspo ados a a és da memb ana po bombas de e luxo do ipo MRP (mul id ug esis ance associa ed p o ein), pa a o a da célula (Homolya e al., 2003; Bo s e al., 1999). Es e ipo de bombas anspo a ambém GSSG (Sha ma e al., 2000; Suzuki & Sugiyama, 1998). A ac i idade da GST depende di ec amen e da disponibilidade de GSH. Duma manei a ge al em pa asi as, as unções das GSTs incluem; (1) a ligação mais ou menos especí ica de subs âncias elec o ílicas ao GSH, (2) a unção como ligandinas12 e (3) a edução de hid ope óxidos dependen e de GSH. As GSTs ca alizam a conjugação de GSH ao cen o elec o ílico de compos os hid o óbicos, des oxi icando uma a iedade de mu agénios, ca cinogénios, moléculas a macologicamen e ac i as e moléculas endógenas esul an es do s ess oxida i o (ex. p odu os da pe oxidação de lípidos). Ao con a io do hospedei o (humano), e mesmo de ou os pa asi as como Leishmania spp. e T ypanosoma c uzi, os quais con êm a ias GST, P. alcipa um apenas possui um gene que codi ica uma GST (p gs ) (Nebe & Vasiliou, 2004; Renzoni e al., 2004; Klokouzas e al., 2003). Em P. alcipa um, as unções isiológicas da P GST não es ão 12 Ligandinas são ans e ases que ca alisam a adição de adicais ali á icos, a omá icos he e ocíclicos e epóxidos ao glu a ião (Mukanganyama e al., 2002; Mukanganyama e al., 2001). In odução ______________________________________________________________________ 24 comple amen e ca ac e izadas (S i as a a e al., 1999). Es a enzima, ep esen a mais de 1% o al das p o eínas celula es, podendo unciona como e ei o ampão in i o, pa a p e eni os e ei os óxicos dos FP-IX (Liebau e al., 2002; Ha wald e al., 2002). Na p esença de GSH, a P GST unciona como ligandina pa a os g upos FP-IX. A P GST possui ambém ac i idade pe oxidásica, o que pode con ibui pa a a ac i idade pe oxidásica dependen e de GSH de ec ada em pa asi as da mala ia (F i z-Wol e al., 2003; Ha wald e al., 2002). A es u u a p imá ia da GST de P. alcipa um (P GST) ap esen a semelhanças com as GSTs da classe Mu de mamí e os 13 (ce ca de 37%) (Pe band e al., 2004; F i z-Wol e al., 2003). A es u u a idimensional, e elou uma po ção C- e minal mais pequena em elação às GSTs da classe Mu de mamí e os, esul ando numa maio acessibilidade dos subs a os ao cen o ac i o14 cen o ac i o hid o óbico H-si e (hyd ophobic binding pocke , H-si e) (F i z-Wol e al., 2003). Assim, assume-se que a especi icidade da GST de P. alcipa um seja meno , pe mi indo a des oxi icação duma maio gama de moléculas. Is o explica ia (em pa e) o ac o des e pa asi a apenas possui um gene codi ican e de GST (p gs ). Es as di e enças êm indo a se explo adas no desenho de inibido es especí icos, com e ei o algumas moléculas (ex. S-hexilglu a ião) baseadas em pép idos, o am já es adas mas sem g ande sucesso (F i z-Wol e al., 2003). I.2.4.2.3 - Des oxi icação dependen e de io edoxinas O sis ema de des oxi icação dependen e da io edoxina em Plasmodium alcipa um inclui: 1- as p o eínas da supe - amília das io edoxinas (Rahl s e al., 2002c; K najski e al., 2001a; Kanzok e al., 2000); 2 - a io edoxina educ ase (P T xR); 3 - e as pe oxi edoxinas (Flohe e al., 2003; K najski e al., 2001b; Rahl s & Becke , 2001; Kawazu e al., 2001; Kawazu e al., 2000). 13 Com base na sua sequência aminoacídica e especi icidade de subs a os, as glu a ião S- ans e ases ci osólicas dos mamí e os o am di ididas em se e classes: Al a, Mu, Pi, Te a, Ze a, Sigma e Omega. A GST mi ocônd ial designa-se Kappa. Es udos e ec uados em o ganismos não mami e os e ela am exis ência de mais classes dis in as como a Be a em bac e ias, a Phi e Tau em plan as, e a Del a em insec os (Sheehan e al., 2003; Salinas & Wong, 1999). 14 É a po ção C- e minal da p o eína quem es inge es u u almen e o acesso dos subs a os ao cen o ac i o das enzimas da classe Mu em mami e os. In odução ______________________________________________________________________ 25 1 - P o eínas da supe - amília das Tio edoxinas Es a é uma supe - amília de p o eínas pequenas (ce ca de 13 kDa), ca ac e izadas po possuí em o ípico mo i o Cys-X-X-Cys (em que X ep esen a qualque a.a.) (Rahl s e al., 2003; Rahl s e al., 2002c). A ní el da sua es u u a p imá ia, são pouco semelhan es en e si, sendo no en an o es u u almen e elacionadas e endo unções simila es na célula (Fe nandes e al., 2004; P ie o-Alamo e al., 2000). São conside ados mensagei os edox, que in e ac uam com di e sas p o eínas implicadas na espos a ao s ess oxida i o, como as ibonucleó ido educ ase15, ac o es de ansc ição, pe oxidases, ciclo ilinas16 e iois de baixo peso molecula (ex.: glu a ião ou A N-ace il- L-cis eína17 (Fe nandes e al., 2004; Kolaczkowski e al., 2003; P ie o-Alamo e al., 2000). Em P. alcipa um es ão ca ac e izadas 3 p o eínas da supe - amília das io edoxinas, a io edoxina (P T x1), a glu a edoxina (P G x1), e a plasmo edoxina (Pl x); es ão ainda iden i icados 6 ou os genes que codi icam pa a hipo é icas p o eínas des a supe - amília. a) Tio edoxina A io edoxina (P T x-1) de P. alcipa um possui o mo i o Cys-Gly-P o-Cys, ípico das io edoxinas (Rahl s e al., 2002b; K najski e al., 2001a; Kanzok e al., 2000). Es ão ainda iden i icados 4 genes que codi icam pa a hipo é icas p o eínas do ipo io edoxina (Thio edoxin-like p o eins)18 nes e pa asi a. A p o eína P T x-1 o nece equi alen es edu o es pa a as pe oxidases e ibonucleó ido educ ases e é ainda eduzida pela io edoxina educ ase (P T xR, e I.2.4.2.3 2). Foi de ec ada a edução não enzimá ica de GSSG pela P T x-1. Com base nes a obse ação, demons ou-se que es e sis ema não enzimá ico dependen e de P T x-1, supo a ele ados luxos de GSSG (Kanzok e al., 2000), o que o o na pa icula men e e icien e em pa asi as da mala ia (Kanzok e al., 15 Um complexo p o eico que con e e ibonucleo idos di os a o em dexoxi ibonucleo idos di os a o. Es e complexo eque io edoxina, io edoxina educ ase, e NADPH, e é c ucial na sin ese de DNA. 16 Ciclo ilinas são uma amilia de isome ases, que se ligam à ciclospo ina (an ibio ico com ac i idade egulado as do sis ema imuni á io; imunosup essup esso ) Em P. alcipa um inibem o c escimen o in ae i oci a io dos o ozoi os (Kuma e al., 2005; Ga igan e al., 2003). 17 NAC é um iól de baixo peso molecula , p odu o endógeno do me abolismo da cis eina. 18 P T x-1, gene p x1, PF14_0545; mo i o Cys-Gly-P o-Cys, localização ci osólica; P Tlp-1, Thio edoxin-like p o ein-1, gene lp-1, PF14_0590, mo i o Cys-Gly-P o-Cys, localização ci osólica; P Tlp-2, Thio edoxin-like p o ein-2, gene lp-2, PFI1250w, mo i o Cys-Ala-P o-Cys, localização ci osólica; P Tlp-3, Thio edoxin-like p o ein-3, gene lp-3, Ch .13 (MAL13P1.225), mo i o Cys-Gln-Ala-Cys, localização não de inida; P Tlp-4, Thio edoxin-like p o ein-4, gene lp-4, PFI0790w, mo i o Cys-Lys-P o-Cys, localização ci osólica). In odução ______________________________________________________________________ 26 2002). A P T x-1 es á di ec amen e en ol ida no e ei o ampão sob e os ROS (ex.: edução não enzimá ica de H2O2) (Rahl s e al., 2003), con ibuindo des a o ma pa a a de esa an ioxidan e do pa asi a, o qual não possui uma pe oxidase dependen e de glu a ião nem ca alase (Becke e al., 2004c). b) Glu a edoxinas Em ge al as glu a edoxinas possuem o mo i o Cys-P o-Ty -Cys, con ibuem pa a a de esa celula do s ess oxida i o, con olo da ansc ição po ia edox, apop ose (Collinson e al., 2002; P ie o-Alamo e al., 2000) e edução de GSSG (Dand ea e al., 2002). Em P. alcipa um es á desc i a uma 2-Cys glu a edoxina (P G x-1), e duas 1-Cys glu a edoxinas (P Glp-1 e P Glp-2)19, es as úl imas, apenas possuem uma cis eína no mo i o ca ac e ís ico da supe - amília das io edoxinas (Rahl s & Becke , 2001). P G x- 1 possui o mo i o ípico Cys-P o-Ty -Cys (Rahl s & Becke , 2001), a sua unção é dependen e de glu a ião, o nece equi alen es edu o es à ibonucleó ido educ ase (Rahl s & Becke , 2001) e ac ua como um e icien e educ o da plasmo edoxina (I.2.4.2.3 c)) (Nickel e al., 2005). Po compa ação com a unção de 1-Cys glu a edoxinas de ou os o ganismos, em P. alcipa um em sido suge ido que es as pa icipem na sín ese de p o eínas do g upo das p o eínas con endo Fe o (Fe) e Enxo e (S) (Balle ini e al., 2002) e na edução das pon es de dissul i o de p o eínas, con e endo GSH em GSSG (Wang e al., 2003; Shen on e al., 2002). Os memb os do g upo das 1-Cys glu a edoxinas possuem apenas uma cis eina conse ada (Rod iguez-Manzaneque e al., 1999) e al como a 1-Cys G x de humanos é p o á el que in e ajam com a p o eína cinase C. Os memb os des e g upo são designados p o eínas PICOT (p o ein kinase C in e ac ing cousin o hio edoxin) e o am ambém desc i os em bac é ias, ou os pa asi as e plan as (Rahl s & Becke , 2001; Isako e al., 2000). c) Plasmo edoxina 19 1-Cys Glu a edoxinas (glu a edoxin-like p o ein-1, P Glp-1, gene glp-1, Ch .3 (MAL3P2.10), mo i o Cys-Gly-Phe-Se , localização mi ocônd ial); 1-Cys glu a edoxina-2 (glu a edoxin-like p o ein-2, P Glp-2, gene glp-2, Ch .6 (MAL6P1.72), mo i o Cys-Lys-Phe-Se , localização ci osólica). In odução ______________________________________________________________________ 27 A plasmo edoxina (Pl x)20 (Becke e al., 2003), ou o memb o da supe - amília das io edoxinas, é bas an e conse ada e apenas oi iden i icada em pa asi as da malá ia, sendo apa en emen e exclusi a de Plasmodium spp. (Becke e al., 2003; Becke e al., 2003; Rahl s e al., 2003; Rahl s & Becke , 2001). Es a p o eína pode se eduzida pelo glu a ião, mas é eduzida mais apidamen e po di ióis como no caso da io edoxina ou glu a edoxina. À semelhança das ou as p o eínas da supe - amília das io edoxinas iden i icadas em Plasmodium spp., es a p o eína eduz ambém a ibonucleó ido educ ase, mas a sua unção exac a não se encon a de inida (Nickel e al., 2005; Becke e al., 2003). 2 - Tio edoxina educ ase Tal como na io edoxina educ ase de mamí e os21 (Williams e al., 2000), a unção do cen o ac i o da io edoxina educ ase de P. alcipa um (P T xR) (Becke e al., 1996; Mulle e al., 1995), localizado na ex emidade C- e minal da p o eína, oi ca ac e izado como possuindo ac i idade edox (Williams e al., 2000; K najski e al., 2000; Gilbe ge e al., 1998). O ac o de a ac i idade da P T xR não se dependen e de Selénio (Se) e di e i no seu cen o ac i o C- e minal (CGGGKC) da T xR humana (Cys-Sec) ep esen a uma boa possibilidade pa a o desenho de compos os com ac i idade an i- pa asi á ia di igida pa a o seu cen o ac i o (G ome & G oss, 2002; Williams e al., 2000; Becke e al., 2000). Es udos de “knock ou ”22, demons a am que P T xR é essencial pa a a sob e i ência dos es adios in a-e i oci á ios de P. alcipa um (K najski e al., 2002). A inac i ação da enzima esul a na mo e do pa asi a, o que a o na num al o po encial pa a an imalá icos (K najski e al., 2002). Nes e sen ido o am seleccionadas de en e 350 000 compos os as bases insa u adas Mannich23, como p omisso es inibido es da P T xR (Da ioud-Cha e e al., 2003). 20 Plasmo edoxina, gene p pl x, PFC0166w, mo i o Cys-Lys-Ty -Cys, localização ci osólica. 21 A ioxedoxina educ ase em bac é ias, ungos, plan as e em alguns p o ozoá ios pa asi as como T ichomonas aginalis, a p o eína possui 35 kDa; enquan o que em mamí e os, insec os e Plasmodium alcipa um, a ioxedoxina educ ase possui en e 55 e 60 kDa (Coombs e al., 2001; Williams e al., 2000). As análises ilogené icas e ela am que os dois g upos de p o eínas não são e olu i amen e elacionados. As io edoxina educ ase de ele ado peso molecula (55 a 60 kDa) são mais p óximas das glu a ião educ ases (dos co esponden es o ganismos) do que das de baixo peso molecula (35 kDa) (Hi e al., 2002). Os mecanisnos ca alí icos de ambos os g upos são ambém dis in os (Williams e al., 2000). 22 Te mo in o mal, mas gene alizadamen e usado pa a e e i a c iação de um o ganismo mu an e no qual, a unção de um gene em pa icula oi comple amen e eliminada. 23 Aminas ce ónicas p epa adas po condensação de uma ce ona com o maldeido e amónia ou com uma amina p imá ia ou secundá ia ( esul ado da eacção química de Manich). Uma se ie de bases de Manich de 4-aminoquinolinas o am sin e isadas com base na amodiaquina. A sua ac i idade con a o mas in ae i oci a ias de P. alcipa um in i o e de P. be ghei in i o, oi ambém es ada (Raynes e al., 1999). In odução ______________________________________________________________________ 28 3 – Pe oxi edoxinas As pe oxi edoxinas são enzimas ubiqui á ias que exe cem a sua ac i idade educ o a a a és das Cis eínas (Cys) do seu cen o ac i o. O núme o de Cys p esen es no cen o ac i o sepa a es as p o eínas em classes: as 2-Cys pe oxi edoxinas ípicas, as 2-Cys pe oxi edoxinas a ípicas e as 1-Cys pe oxi edoxinas(Wood e al., 2003). G ande pa e da capacidade de des oxi icação po pe oxidação em Plasmodium spp. pa ece de e -se à acção das pe oxi edoxinas (Nickel e al., 2005; Kawazu e al., 2005). Em P. alcipa um oi desc i a pelo menos uma 1-Cys pe oxi edoxina (K najski e al., 2001b; Kawazu e al., 2000) e duas pe oxi edoxinas da amília das 2-Cys pe oxi edoxinas ípicas (uma ci osólica e ou a mi ocônd ial) (K najski e al., 2001b; Kawazu e al., 2001) (Rahl s & Becke , 2001). a) 2-Cys pe oxi edoxina ci osólica A 2-Cys pe oxi edoxina ci osólica (P 2-CysPx) é dependen e da io edoxina. (Figu a I.5). Os pa âme os ciné icos da edução de H2O2 in i o des a enzima, suge em um papel c ucial como pe oxidase de hid ope óxidos in i o (Ake man & Mulle , 2003). A sua e iciência na edução de H2O2 quali ica-a como uma das pe oxi edoxinas mais e icien es. Is o é consis en e com o ac o de P. alcipa um não possui uma glu a ião pe oxidase ípica ( e I.2.4.2.2 c) nem uma ca alase. Na ausência des as enzimas, e a p e isí el que o pa asi a dependesse em g ande pa e das pe oxi edoxinas pa a eduzi os ROS. No en an o, es udos de knock ou , indicam que pa asi as com o gene que codi ica a P 2-CysPx inac i ado, são iá eis e apenas ligei amen e mais suscep í eis ao s ess oxida i o, do que os pa asi as com o gene não inac i ado (Komaki-Yasuda e al., 2003). b) 1-Cys pe oxi edoxina A 1-Cys pe oxi edoxina (P 1-CysPx) é dependen e da io edoxina ( e I.2.4.2.3 a)) (Rahl s & Becke , 2001). Localizada no ci osol, a impo ância des a enzima na espos a ao s ess oxida i o em P. alcipa um, é dúbia. Embo a se enha de ec ado, um ele ado ní el de exp essão do gene (p 1-CysPx) co esponden e ao longo do ciclo In odução ______________________________________________________________________ 29 in ae i oci á io (Le Roch e al., 2003a), a sua unção e ec i a na edução de ROS pe manece desconhecida. É ambém desconhecido o agen e edu o des a pe oxi edoxina, embo a exis am obse ações indicando que, em concen ações ele adas o glu a ião pode ac ua como dado de elec ões (Kawazu e al., 2000). Alguns es udos suge em as ciclo ilinas, e o glu a ião como dado es de elec ões pa a p o eínas homólogas em ou os euca ió as (A acena e al., 2005; Akseno e al., 1998; Ho mann & Handschumache , 1995). I.2.4.3 - Con ibuição da mi ocônd ia e apicoplas o pa a o equilíb io edox em Plasmodium alcipa um As o mas asexuadas dos es adios in ae i oci á ios de P. alcipa um, i em num ambien e pob e em oxigénio e dependem da glicólise pa a p odução de ATP (Jacobasch e al., 1990). A sua mi ocônd ia não em ac i idade de os o ilação oxida i a e a cadeia anspo ado a de elec ões é incomple a; no en an o o nece eacções edox com ele ância me abólica (Bannis e e al., 2000). Uma delas é a ligação do ci oc omo c educ ase (complexo ci oc omo b/ci oc omo c1) à dihid oo oa o desid ogenase, uma enzima cha e na sín ese de nucleó idos. É nes e pon o que ac ua a a o aquona24 inibindo o anspo e de elec ões (F y & Beesley, 1991). Embo a a cadeia espi a ó ia do pa asi a seja menos ac i a do que a de células de mamí e os (F y & Beesley, 1991), ge a iões supe óxido (O2-). Es es necessi am de se des oxi icados. Em P. alcipa um es á iden i icada uma supe oxidodismu ase dependen e de Manganês (Mn-SOD). Não se encon a desc i a a o ma como é eduzido o H2O2 esul an e da sua ac i idade den o da mi ocônd ia. No en an o es á desc i a um pe oxi edoxina localizada na mi ocônd ia a 2-Cys pe oxi edoxina (Rahl s & Becke , 2001) e encon a-se ano ado nas bases de dados PlasmoDB e NCBI (MAL13P1.225 e AAQ05974) um gene codi ican e de uma possí el io edoxina mi ocônd ial. Alguns au o es e e em que o ácido lipóico pode ambém o nece equi alen es edu o es pa a a des oxi icação do H2O2 dependen e da io edoxina (Pe elman e al., 2003), à semelhança do que se e i ica em Mycobac e ium spp. (Byun e al., 2005). Em conco dância, oi desc i a a ia biossin é ica do ácido lipóico localizada no apicoplas o (Walle e al., 1998) de P. alcipa um. 24 A o aquona an imalá ico que em conjun o com o p oguanil cons i uem a associação de dose ixa conhecida come cialmen e como Mala one, usado no a amen o e p o ilaxia da malá ia. In odução ______________________________________________________________________ 36 al., 1999; Hip ne e al., 1999; Flens e al., 1994). Os MRPs di idem-se em dois g upos; os que possuem um TMD adicional, a ní el da ex emidade N-p oximal (MRP1, MRP2, MRP3, MRP6 e MRP7, indicado como TMD0 na Figu a I.6.V), e os que não ap esen am TMD0 (MRP4, MRP5, MRP8 e MRP9, Figu a I.6.V) ((Bo s & Genes , 2006). O TMD0 con e e especi icidade no anspo e de alguns subs a os34 (Hip ne e al., 1997). I.3.1.3 - Sub- amília Whi e (ABCG) As p o eínas do ipo Whi e possuem um a anjo molecula pouco equen e, com o NBD numa posição N-p oximal em elação à egião ansmemb ana (Figu a I.6, IV). Foi assim designado Whi e po se o a anjo co esponden e ao gene Whi e de D osophila melanogas e . Em D. melanogas e a p o eína co esponden e, es á en ol ida no anspo e dos pe cu so es do pigmen o do olho (Mo gan, T.H., 191035). Em humanos encon am-se iden i icadas duas p o eínas des e ipo: a ABCG136 (ABC8/hwhi e) (C oop e al., 1997; Chen e al., 1996) e a ABCG2 (BCRP/MXR/ABC) (Doyle e al., 1998) (Miyake e al., 1999b; Miyake e al., 1999a; Allikme s e al., 1999). A ABC8/hwhi e desempenha um papel undamen al no anspo e de ip o ano e guanina. As designações da p o eína ABCG2 humana BCRP (b eas cance esis ance p o ein), MXR (mi oxan one esis ance p o ein), ABCP (placen a-speci ic ABC gene), esul am das di e en es ap oximações que esul a am na sua iden i icação. Es a p o eína es á associada à esis ência clínica à mi oxan ona. Vá ias linhas celula es humanas37 ap esen am aumen o de exp essão da ABCG2 quando seleccionadas po p essão da mi oxan ona. A análise do genoma de uma des as linhas (MCF-7), e elou ampli icação do gene que codi ica ABCG2 (Ross e al., 1999). Expe iências de ans ecção usando es a mesma linha celula , demons a am a associação de ABCG2 a enó ipos de 34 Nomeadamen eo anspo e de leuko ieno C4 pelo MRP1 humao (Hip ne e al., 1997). 35 Mo gan, T.H., Sex limi ed inhe i ance in D osophila, Science 32 (1910) 120-122. 36 A HUGO (Human Gene Numencla u e Commi e) (Ou ub o de 1999) p opõe uma nomencla u a em código que a ibui uma le a a cada uma das oi o sub- amílias de p o eínas ABC humanas e de oedo es, e um núme o indi idual a cada p o eína (ex. ABCG2 pe ence à sub- amília Whi e e é a p o eina BCRP/MXR/ABC). A nomencla u a p opos a po es e comi é não é unanimemen e acei e. Pa a uma e isão ac ualizada da nomencla u a consul a (h p:/ /www.med. ug.nl/Mdlhumanabc.h m). 37 MCF-7 - ca cinoma da mama, S1 e HT29 – ca cinoma do cólon, EPG85-257 - ca cinoma gás ico, EPF86-079 – ib osa coma e 8226 – mieloma In odução ______________________________________________________________________ 37 esis ência à mi oxan ona, dauno ubicina e doxo ubicina (Doyle e al., 1998), o que indica um enó ipo de MDR. I.3.2 - O papel das p o eínas ABC, no enó ipo de esis ência de Plasmodium alcipa um A demons ação de que a espos a a alguns an imalá icos do g upo das quinoleínas (como a clo oquina, a me loquina ou o quinino), pode se modulada pelo e apamil (Singh & Pu i, 2000; Kyle e al., 1990; Ma in e al., 1987)suge e semelhanças com o enó ipo de mul i esis ência (MDR) obse ado em células umo ais. Genes homólogos ao que codi ica a P-gp humana êm sido iden i icados em á ios euca io as unicelula es como En amoeba his oly ica (ehpgp), Leishmania a en olae (l pgpA), Plasmodium alcipa um (p md 1) ou Schizosaccha omyces pombe (s e6)) en e ou os (Tabela I.1). O aumen o da exp essão de genes homólogos ao gene que codi ica a Pgp humana, em pa asi as unicelula es elaciona-se com equência à esis ência a agen es ci o óxicos (ex. a sénico, imblas ina) (Bo s & Ouelle e, 1995). In odução ______________________________________________________________________ 38 Tabela I.1 - Alguns exemplos de anspo ado es de memb ana da supe - amília ABC e as espec i as unções celula es. P o eína Sub- amília ABC Espécie Re . Função Ehpgp1 MDR/TAP E. his oly ica (Desco eaux e al., 1995) Resis ência à heme ina ( á maco usado no a amen o da amebíase in es inal) L pgpA MRP/CFTR L. a en olae (Ouelle e e al., 1990) Resis ência a me ais pesados PFGCN20 WHITE P. alcipa um (Bozdech e al., 1996) P o a elmen e associada à egulação da adução38 Pgh139 MDR/TAP P. alcipa um (Foo e e al., 1989) Associado à esis ência à clo oquina Pgh2 MDR/TAP P. alcipa um (Rosenbe g e al., 2006; Zalis e al., 1993) Resis ência ao Cádmio STE6 MDR/TAP S. pombe (Hughes e al., 1990) T anspo e de ac o es de conjugação YCF1 MRP/CFTR S. ce e isiae (Kolaczkowski e al., 1996) Resis ência ao cádmio, mul i esis ência e bomba de conjugados de glu a ião BPT1 MRP/CFTR S. ce e isiae (Pu nelle & Go eau, 1997) T anspo e acuola de bili ubina dependen e de ATP YBT1 MRP/CFTR S. ce e isiae (Kolaczkowski e al., 1996) T anspo e de ácidos bilia es MRP1 MRP/CFTR H. sapiens (Cole & Deeley, 1998) T anspo e de quimios á icos hid ó obos e conjugados de á macos MRP2 MRP/CFTR H. sapiens (Wada e al., 1998; Paulusma e al., 1997) Exc eção hepa obilia de conjugados de o gânicos (sínd oma de Dubin Johnson) CFTR MRP/CFTR H. sapiens (Rio dan e al., 1989) Canal de cálcio dependen e de cAMP (Fib ose Quis ica) MDR1 MDR/TAP H. sapiens (Roninson e al., 1986; Shen e al., 1986) T anspo e de compos os hid ó obos óxicos a a és da memb ana plasmá ica No a: Apenas se encon am lis adas as p incipais unções de cada p o eína, conside adas ele an es no âmbi o do p esen e es udo. A é à da a de início do p esen e abalho encon a am-se iden i icadas e ca ac e izadas 4 p o eínas ABC em P. alcipa um. 1 - A p o eína Pgh1 codi icada pelo gene p md 1 (Foo e e al., 1989) em indo a se associada à esis ência a di e sos an imalá icos, nomeadamen e da classe das quinoleínas. O gene p md 1 é homólogo dos MDR de mamí e os. A pa icipação de 38 Bozdecch e colabo ado es em 1998 classi ica am es a p o eína como um bom candida o a exe ce uma unção na complexa ede de anspo e que pe mi e a sob e i ência in acelula de P. alcipa um. 39 P odu o do gene p md 1, ecen emen e Reed e colabo ado es (2000) e e em que de e minadas mu ações nes a p o eína con e em ambém esis ência ao quinino, me loquina e halo an ina e in luenciam a sensibilidade à a emisinina. In odução ______________________________________________________________________ 39 p md 1 no enó ipo de esis ência a an imalá icos é desc i o em de alhe na secção I.2.3.1 a). 2 - A p o eína Pgh2 codi icada pelo gene p md 2 (Zalis e al., 1993), a é à da a sem unção cla amen e a ibuída. O gene é ambém homólogo dos MDRs de mamí e os. Es udos independen es, mos a am que Pgh2 não es á elaccionada com esis ência à clo oquina (Zalis e al., 1993) mas sim aos me ais pesados, nomeadamen e ao Cádmio (Rosenbe g e al., 2006; Rubio & Cowman, 1994). 3 - A p o eína PFGCN20 codi icada pelo gene p gcn20 (Bozdech e al., 1996) p o a elmen e associada à egulação da adução40 não possui qualque elação p e isí el com esis ência a an imalá icos, é um homólogo da p o eína Gcn20 de le edu as(Vazquez de Aldana e al., 1995). 4 - No deco e do p esen e abalho Klokouzas A. e colabo ado es publica am a ca ac e ização de uma p o eína codi icada pelo gene p m p1 (Klokouzas e al., 2004). O gene é homólogo dos MRP de mamí e os. Com a conclusão da sequenciação o al do genoma de P. alcipa um (Ou ub o de 2002) o am ano adas au oma icamen e 11 sequências candida as a genes codi ican es de anspo ado es ABC (Ga dne e al., 2002b). Em P. alcipa um, apenas uma das qua o p o eínas ABC ca ac e izadas (Pgh1) es á comp o adamen e elaccionada com a esis ência a á macos an imalá icos, nomeadamen e do g upo das quinoleínas. G ande pa e dos pa asi as que possuem o mesmo alelo de p md 1 e p c , espondem de o ma di e en e à clo oquina e ao quinino (Coope e al., 2002; Djimde e al., 2001; Fidock e al., 2000a), indicando que ou os genes es ão implicados na modulação da esis ência a es es á macos. I.3.3 – MRPs na de esa celula em Plasmodium alcipa um, elação com a espos a ao s ess oxida i o A sequência me abólica, da des oxi icação de subs âncias lipo ílicas endógenas e de xenobió icos é concep ualmen e cons i uída po : oxidação, conjugação com glu a ião ou 40 Bozdecch e colabo ado es em 1998 classi ica am es a p o eína como um bom candida o a exe ce uma unção na complexa ede de anspo e de moleculas, que pe mi e a sob e i ência in acelula de P. alcipa um. In odução ______________________________________________________________________ 40 g upos aniónicos al e na i os e anspo e dependen e de ATP pa a o ex e io da célula (Kepple e al., 1999). Es a úl ima, é de i al impo ância na homeos ase celula (Ishikawa, 1992a). O anspo e de conjugados de glu a ião, gluco ona o, ou sul a o pa a o a da célula depende de ATP e é mediado po memb os da sub- amília MRP/CFTR (Buchle e al., 1996). As p o eínas MRP encon am-se localizadas na memb ana plasmá ica, uma localização compa í el com a sua acção na eliminação de á macos e ou os compos os xenobió icos, ou p odu os do me abolismo celula (Konig e al., 1999; Hip ne e al., 1999). Os subs a os des es anspo ado es são aniões o gânicos, de que são exemplo á macos conjugados com glu a ião41, ou sul a o42 (Mulle e al., 1994; Leie e al., 1994))(Konig e al., 1999; Hip ne e al., 1999; Leie e al., 1996). Alguns á macos, podem se conjugados com o GSH pela glu a ião-S- ans e ase (GST) e seguidamen e expo ados pelas p o eínas do ipo MRP (ex. Y na Figu a I.7); ou os são co- anspo ados com o GSH43 (ex. X na Figu a I.7). Em ambos os casos, o anspo e é dependen e da sín ese con ínua de GSH, sendo o passo limi an e des a sín ese ca alisado pela γ-glu amil cis eína sin e ase (γ-GCS) (Hoppe e al., 2001). Figu a I.7 - Modelo ilus ando a in e - elação en e uma p o eína do ipo MRP e o glu a ião (GSH). Alguns á macos (X), podem se conjugados com o GSH (GS-X) pela glu a ião- S- ans e ase (GST) e seguidamen e expo ados pelas p o eínas do ipo MRP, ou os (Y) são co- anspo ados com o GSH. Em ambos os casos, o anspo e é dependen e da sín ese con inua de GSH, sendo o passo limi an e des a sín ese ca alisado pela γ-glu amil cis eína sin e ase (γ-GCS). 41 MRP1 expo a conjugados de GSH com Me o exa o. 42 MRP4 expo a p e e encialmen e conjugados de sul a o. 43 Alcaloides da Vinca e as an aciclinas, anspo e pelo MRP2 (E e s e al., 2000) e co- anspo e do sal bilia au ocola o com GSH pelo MRP4 (Rius e al., 2003). In odução ______________________________________________________________________ 41 Vá ios memb os da sub- amília MRP (ex. MRP1 humano e YCFI de le edu a), são econhecidos anspo ado es de conjugados de GSH com xenobion es, o mados na designada ase 2 (conjugação) do p ocesso me abólico de des oxi icação (Kepple e al., 1999; Kepple e al., 1998). Em di e en es sis emas biológicos, o GSH em um impo an e papel na de esa celula ace ao s ess oxida i o (Leie e al., 1996; Kepple e al., 1996). Em Plasmodium spp., o GSH es á po encialmen e en ol ido na inac i ação de compos os elec o ílicos, a a és da o mação de conjugados de glu a ião po uma eacção ca alisada pela glu a ião S- ans e ase (GST). O GSH se e ambém de agen e edu o nas eacções ca alisadas pelas pe oxidases de glu a ião dos pe óxido de hid ogénio e hid ope óxidos o gânicos (Figu a I.5),. A oxidação do GSH a GSSG, sendo es e exc e ado pa a o meio ex a celula (Eklow e al., 1984; Eklow e al., 1981). Os memb os da sub- amília dos MRP êm um papel undamen al na egulação dos ní eis in acelula es de GSSG e cons i uem um p o á el mecanismo de compensação do s ess oxida i o in acelula (Figu a I.5 e Figu a I.7) (Kepple , 1999). Objec i os ______________________________________________________________________ 42 I.4 - Objec i os ge ais O objec i o ge al des a in es igação é con ibui pa a o conhecimen o dos mecanismos de esis ência dos plasmódios (P. alcipa um) ao ní el molecula , de o ma a di ecciona o desenho de no os compos os ou associações de compos os con a al os e apêu icos aqui es udados. Se ão implemen adas écnicas de cul u a in i o do pa asi a, adequando a mesma a es udos de exp essão. Se ão adap adas écnicas á ias de biologia molecula ao modelo da malá ia, mais conc e amen e no es udo das esis ências. I.4.1 - Objec i os especí icos Objec i o 1 - Iden i icação de sequências candida as a genes codi ican es de p o eínas ABC, no genoma de Plasmodium alcipa um Nos di e en es o ganismos onde os es udos em p o eínas ABC o am mais ap o undados, encon ou-se semp e um núme o ela i amen e ele ado des as p o eínas. Assim sendo, e a endendo à complexidade do ciclo de ida e das al e ações mo ológicas do P. alcipa um, é concebí el que as p o eínas ABC desc i as a é ao momen o no pa asi a ep esen em apenas uma mino ia. Objec i o 2 - Clona e ca ac e iza cDNAs candida os a genes codi ican es de anspo ado es ABC, nomeadamen e da sub- amília MRP/CFTR, e iden i ica as espec i as p o eínas em P. alcipa um. a) Es uda a associação de al e ações na sequência (mu ações pon uais, inse ções/delecções e ampli icação génica) de genes iden i icados no p esen e abalho aos enó ipos de esis ência. b) Es uda a exp essão e localização das p o eínas codi icadas pelos genes isolados. Os conjugados de GSH (GS-X), o GSSG e as subs âncias xenobió icas (ou não) são demasiado hid o ílicos pa a di undi a a és das memb anas, necessi ando de anspo ado es especí icos. Es a unção de expo ação é desempenhada pelos Objec i os ______________________________________________________________________ 43 anspo ado es da sub- amília MRP/CFTR. A exp essão aumen ada bem como a p esença de mu ações, em anspo ado es des a sub- amília, em sido associada em ou os o ganismos a enó ipos de esis ência ou/e mul i esis ência. Objec i o 3 - Ca ac e iza a espos a in i o de P. alcipa um, a á macos de u ilização egula e pos e io men e, elaciona os esul ados ob idos com al e ações dos genes p γgcs, p m p1, p m p2 e p md 1 nas mesmas (núme o de cópias dos genes, mu ações pon uais e inse ções/delecções de sequências de nucleó idos. a) Iden i icação do g au de suscep ibilidade in i o de isolados de pacien es (in ec ados com P. alcipa um) aos á macos: clo oquina, me loquina, amodiaquina e quinino, u ilizando os c i é ios da O ganização Mundial de Saúde (O.M.S.), pa a a classi icação das amos as den o dos g upos “sensí el” ou “ esis en e”. Es e es udo pe mi e e ec ua uma associação en e al e ações nas sequências dos genes es udados e a espos a aos á macos an imalá icos. Objec i o 4 - A alia a exp essão de genes codi ican es de enzimas en ol idas na espos a ao s ess oxida i o (com ele ância pa a o me abolismo do glu a ião) e dos genes codi ican es de anspo ado es da sub- amília MRP/CFTR iden i icados no p esen e abalho em elação à espos a aos an imalá icos. Fo am es udados os seguin es genes: p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-cysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2 ( e Figu a I.6) ao longo do ciclo in a-e i oci á io dos clones 3D7 e Dd2 de P. alcipa um. a) De e mina o pe il de exp essão dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-cysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in a-e i oci á io dos clones 3D7 e Dd2 de P. alcipa um. b) A alia a egulação da exp essão de cada gene ao longo do ciclo in a- e i oci á io dos clones 3D7 e Dd2 de P. alcipa um. c) Iden i ica a co-exp essão de cada gene. Ma e ial e Mé odos _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 44 II – MATERIAL E MÉTODOS Ma e ial Biológico _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 45 No a: O capí ulo sob e Ma e ial e Mé odos é ap esen ado em secções: 1) ma e ial biológico u ilizado na in es igação; 2) desc ição das écnicas, com de alhes labo a o iais; 3) me odologia da in es igação ealizada, complemen ando o pon o 2. II.1 - Ma e ial Biológico II.1.1 - Isolados e clones clones de Plasmodium alcipa um Nes e abalho, o pa asi a Plasmodium alcipa um oi man ido em cul u a in i o como modelo expe imen al. Os clones, p e iamen e ca ac e izados quan o à espos a a an imalá icos (Tabela II.1), a mazenados na colecção c io-p ese ada do Labo a ó io da UEI Malá ia/ Cen o de Malá ia e Ou as Doenças T opicais, o am os seguin es: HB3, 3D7, K1 e Dd2. Tabela II.1 - Ca ac e ís icas dos clones de P. alcipa um 3D7, Dd2, HB3 e K1. CQ – clo oquina, Me – me loquina, QN – quinino, S - sensí el, R – esis en e, IC50 – concen ação que inibe o c escimen o de 50% dos pa asi as, ? - Não es á iden i icada a p o eniência geog á ica des e clone. Fenó ipo Clone O igem Re e ência S R HB3 Hondu as (Bhasin & T age , 1984) CQ, Me e QN - 3D7 ? (Rosa io, 1981) CQ, Me e QN - Dd2 Asiá ico (Oduola e al., 1988) - CQ, Me e QN K1 Tailândia (Thai hong & Beale, 1981) Me e QN CQ II.1.2 - Isolados de Plasmodium alcipa um Os isolados de P. alcipa um, conside ados no es udo da epidemiologia molecula dos genes p γ-gcs, p md 1, p m p1 e p m p2, o am colhidos em di e en es zonas endémicas de malá ia: República Democ á ica de São Tomé e P íncipe, República de Angola e Tailândia. II.1.3 - Es i pes de Esche ichia coli As es i pes de bac é ias u ilizadas nes e abalho, pa a a ealização de clonagens o am as seguin es: E. coli JM 109/SURE® - pe mi e a eplicação de DNA euca ió ico de o ma p ecisa, p oduzindo DNA de ele ada qualidade pa a mini p epa ações. P incipais Técnicas Usadas _____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 52 com ela i a acilidade isualiza (po ex. po elec o o ese em gel) o DNA sin e izado, concluindo assim, da p esença ou não do DNA molde especí ico que p ocu amos na amos a o iginal. II.2.5 - Desenho de p ime s O desenho de p ime s adequados é essencial pa a ga an i a sensibilidade e especi icidade da eacção de PCR. Um dos pa âme os c í icos da eacção de PCR, eside na escolha co ec a dos p ime s. Fo am omadas em conside ação os seguin es pa âme os: a) Tempe a u a de dissociação do pa p ime /sequência al o; b) Con eúdo em Guanina/Ci osina (G/C); c) Complemen a idade da sequência do p ime – com ecu so ao OligoAnalyze (www.id dna.com/h ml/analysis/). II.2.6 Elec o o ese de DNA em gel de Aga ose Ao DNA ampli icado de cada amos a adicionou-se 1/10 do olume inal de ampão de aplicação (ANEXO 2), endo sido aplicados em cada “poço” do gel de aga ose (Gibco, BRL). Fo am usados géis com di e en es concen ações de aga ose, con o me o peso molecula dos agmen os que se p e endiam esol e (ANEXO 3). A elec o o ese ealizou-se em ampão TBE (ANEXO 2) a 4 V/cm. O b ome o de e ídio (Sigma) oi inco po ado no gel de aga ose, numa concen ação inal de 0,1 µg/ml, pa a pe mi i a isualização do DNA sob luz ul a iole a. Os géis o am obse ados e o og a ados num ansiluminado Eagle Eye II (S a agene). II.2.7 - PCR em empo eal (RT-PCR) O PCR em empo eal (Real- ime PCR) consis e numa eacção de PCR ( e II.2.4) onde é de ec ada e a aliada a acumulação de p odu o ampli icado ao longo da eacção, ou seja, em cada ciclo é egis ada a quan idade de p odu o ampli icado (DNA). Quan o à ciné ica da eacção, podemos dis ingui ases numa eacção de PCR (Figu a II.2); Fase exponencial – em que o núme o de cópias do DNA molde duplica em cada ciclo (assumindo que a e iciência da eacção é de 100%). Fase Linea – em que os componen es da mis u a de eacção es ão a se consumidos, a elocidade da eacção es á a diminui e os p odu os de PCR começam a se deg adados. Fase es acioná ia (end-poin ) – em que a eacção cessa, não sendo sin e izados mais p odu os de PCR. P incipais Técnicas Usadas _____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 53 Em Real- ime PCR os esul ados são medidos du an e a ase exponencial, em que a quan idade de DNA medida, e lec e o núme o de cópias de DNA inicialmen e p esen es na amos a, seguindo uma exponencial de base 2 ( e II.2.4). Pelo con a io, num PCR con encional (end-poin PCR) es a a aliação só é ealizada na ase es acioná ia do ensaio, sendo apenas a aliada a quan idade de p odu o inal acumulado (end-poin analysis). Figu a II.2 - Rep esen ação g á ica do aumen o da concen ação de DNA du an e uma eacção de PCR. CT (cycle h eshol) ep esen a o ciclo a pa i do qual é de ec ado um aumen o, es a is icamen e signi ica i o, no sinal de luo escência; ∆Rn alo co esponde á di e ença en e o alo máximo de núme o de cópias de DNA e o alo do mesmo pa âme o a pa i do qual a luo escência emi ida ul apassa um dado limi e ( luo escência acima do con olo nega i o). No deco e des e abalho o am u ilizados mé odos de de ecção do p odu o ampli icado em empo eal; 1. Sondas TaqMan, 2. SYBR G een e 3. Molecula Beacons: a) Sondas TaqMan Es e mé odo, explo a a ac i idade 5’nucleásica da enzima Taq Gold DNA polime ase pa a deg ada a sonda TaqMan. A sonda é cons i uída po um oligonucleó ido ma cado no e minal 5’ com uma molécula epó e luo escen e e no e minal 3’ uma molécula quenche . Quando p óximos, o quenche eduz a emissão de luo escência do epó e (Figu a II.3 1A) A sonda, híb ida especi icamen e na sequencia al o. Du an e a ampli icação po PCR, a sonda é deg adada pela polime ase a as ando o quenche do P incipais Técnicas Usadas _____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 54 epó e (Figu a II.3 1B), esul ando num aumen o da luo escência de ec ada pelo sis ema, co esponden e à acumulação de p odu o de PCR. b) SYBR G een Es e c omó o o emi e luo escência (exci ado po um eixe de luz) quando ligado à ca idade meno do DNA em cadeia dupla (Figu a II.3 2A). Assim, quan o maio a quan idade de DNA em cadeia dupla mais luo escência é emi ida (Figu a II.3 2B). Es e mé odo é menos especí ico do que as sondas TaqMan, mas possui a an agem de se mais económico. c) Molecula Beacons Os beacons são pequenas moléculas de DNA de cadeia simples. Numa ex emidade possuem 6 a 9 bases que são complemen a es com as 6 a 9 bases na ex emidade opos a. Es a complemen a idade pe mi e á molécula o ma uma es u u a em o ma de al ine e (Figu a II.3 3A). A ansa des a es u u a é necessa iamen e complemen a à sequência al o a ampli ica . As ex emidades complemen a es do beacon, podem aze pa e da sequencia al o ou se ac escen adas du an e o desenho des e. O beacon é ma cado numa ex emidade com uma molécula epó e luo escen e e na ou a com uma molécula quenche . Quando p óximos, o quenche impede a emissão de luo escência do epó e (Figu a II.3 3A). Quando a ansa do beacon híb ida especi icamen e na sequencia al o, o quenche e o epó e icam a as ados, esul ando num aumen o da luo escência de ec ada pelo sis ema, co esponden e à acumulação de p odu o de PCR (Figu a II.3 3B). P incipais Técnicas Usadas _____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 55 Figu a II.3 - Emissão de luo escência du an e a eacção de PCR em empo eal pelos 3 mé odos usados nes e abalho. 1. Sondas TaqMan: A-hib idação especi ica da sonda, B-ampli icação e deg adação da sonda pela Taq-polime ase, aumen o da luo escência; 2. SYBR G een: B- SYBR G een in e calado no DNA em cadeia dupla, emissão de luo escência; 3. Beacons: A-Beacon echado a) ansa, b) ex emidades complemen a es, B- hib idação do Beacon ao DNA al o, emissão de luo escência. II.2.8 – P epa ação de bac é ias E.coli JM 109/SURE® E. coli BL21 elec ocompe en es Es e p ocedimen o oi ealizado com as E.coli JM 109/SURE® e com as E. coli BL21. As bac é ias o am cul i adas em meio Lu ia B o h (LB) (Sigma) liquido (ANEXO 1) a 37ºC com agi ação a é a ingi densidade de O.D.600 = 0,5. Es a suspensão oi man ida em gelo du an e 30 min seguida de cen i ugação a 4000 x g, 4ºC, du an e 15 min. O sob enadan e oi desca ado e o pelle essuspendido em 1,25 ml de H2O ia com 10% de glice ol e cen i ugado (4000 x g, 4ºC, du an e 15 min). Es a suspensão oi di idida em aliquo as de 90µl e gua dada a -80ºC. II.2.9 - Ex acção e quan i icação de p o eínas (mé odo B ad o d) de Plasmodium alcipa um a pa i de cul u a in i o Cul u as (con o me desc i o em II.2.1) com pa asi émia supe io a 10%, o am cen i ugadas a 5000 pm du an e 5 min à empe a u a ambien e, e o sob enadan e P incipais Técnicas Usadas _____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 56 desca ado; oi adicionado PBS gelado ao pelle , e a mis u a oi de no o cen i ugada a 5000 pm du an e 5 min à empe a u a ambien e. Desca ou-se o sob enadan e e os e i óci os deposi ados o am lisados po adição de igual olume de uma solução de 0,2% de saponina em PBS, e incubação 20 min a 37ºC. Es a mis u a oi cen i ugada a 10 000 pm a 4ºC du an e 10 min, o sob enadan e desca ado e os pa asi as la ados 3 ezes com PBS gelado, seguindo-se no a cen i ugação a 10 000 pm, 4ºC, 10 min. Pa a lisa os pa asi as, o am adicionados 4 olumes de uma solução gelada de 1% de T i om X-100 e inibido es de p o eases (1 pas ilha em 100ml de PBS). A mis u a oi incubada em gelo, sonicada e congelada a -70ºC, descongelada apidamen e a 37ºC/ 5 min e cen i ugada a 10 000 pm du an e 30 min. As p o eínas do sob enadan e o am quan i icadas segundo o mé odo de B ad o d ( e II.2.10) e a mazenadas a -70ºC em aliquo as. Quan i icação de p o eínas mé odo B ad o d P epa a am-se 5 amos as com di e en es concen ações de albumina (BSA, BioRad) 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0µg/µl e eagen e de B ad o d 1X (BioRad®). Em pa alelo, o am p epa adas 3 diluições se iadas de cada amos a de p o eínas nas mesmas condições da ec a pad ão. As espec i as abso âncias o am lidas em espec o o óme o a 595nm. A concen ação das amos as oi de e minada a pa i da equação da ec a pad ão (calculada com base nos alo es de densidade óp ica (OD) ob idos). II.2.10 Elec o o ese de p o eínas em gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sul a e Polyc ylamide Gel Elec opho esis ) Às amos as de p o eína a aplica em gel, é adicionado ampão de aplicação (ANEXO 2) com β-me cap oe anol (que ac ua como agen e edu o e desna u an e queb ando as ligações dissul i o das p o eínas), expondo-se pos e io men e as amos as a 96ºC du an e 5 min, sendo depois aplicadas no gel con endo SDS. O SDS desna u a a p o eína, is o é, con e e a p o eína numa es u u a linea (a sua o ma na i a é, ge almen e, globula ) e con e indo-lhe densidade de ca ga uni o me, des a o ma as p o eínas podem se sepa adas po elec o o ese, somen e, em unção do amanho (massa molecula ). Quando colocadas nes e gel de poliac ilamida (políme o de monóme os de ac ilamida) e subme idas a um campo eléc ico, as p o eínas desna u adas mo em-se pa a o pólo posi i o, pe co endo uma dis ancia no gel P incipais Técnicas Usadas _____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 57 p opo cional ao seu amanhos (massa molecula ). Quan o meno o a concen ação de ac ilamida no gel (ANEXO 3) maio se á a dis ancia de mig ação en e as p o eínas. Após a elec o o ese, o gel é ixado e co ado com uma solução de Azul de Coomasie (ANEXO 2). Pa a isualiza as bandas, o gel é desco ado com uma solução con endo me anol (ANEXO 2). II.2.11 – P epa ação de lâminas de cul u a in i o de Plasmodium alcipa um, pa a imuno luo escência IFA. a) ixação com ace ona Fo am p epa ados es egaços de cul u a ( e II.2.1) não sinc onizada, secos à empe a u a ambien e, e ixados po ime são em ace ona du an e uns minu os (QBiogen) e a mazenados a 4ºC, após egis o. b) ixação com pa a o maldeido Fo am ecolhidas aliquo as de 1 ml de cul u a ( e II.2.1) não sinc onizada, com pa asi émia supe io a 10%, cen i ugadas a 2000 pm, 5 min, à empe a u a ambien e. O sob enadan e oi desca ado, as células la adas duas ezes com meio RPMI incomple o (ANEXO 1) e essuspendidas em 250 µl RPMI incomple o. A 10 µl des a mis u a o am adicionados 25 µl de solução de ixação com pa a o maldeido (ANEXO 2). Aliquo as (10µl) des a suspensão de células o am dispensadas em lâminas e man idas em câma a húmida, à empe a u a ambien e du an e 30 min. Seguidamen e o excesso de suspensão oi aspi ado, e as lâminas con endo um depósi o com e i óci os , pa asi adas, a mazenadas a -20ºC. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 58 II.3 – Me odologia II.3.1 – Selecção da g elha abe a de lei u aORF (Open Reading F ame) pa a cada gene 1 - BLAST (Basic Local Alignmen Sequence Tools) A es a égia de pesquisa consis iu em eco e à aplicação BLAST e e ec ua buscas nas bases de dados de li e acesso, S an o d Genome Technology Cen e (www- sequence.s an o d.edu/) e PlasmoDB (www.plasmodb.o g/plasmo/home.jsp), onde es ão deposi adas as sequências do p ojec o de sequenciação de P. alcipa um, usando como sondas as sequências dos Walke A, Walke B e Assina u a ABC da p o eína Pgh1 (PFE1150w) de P. alcipa um. 2- Com as sequências seleccionadas po BLAST, u ilizou-se o CDART Conse ed Domain A chi ec u e Re ie al Tool no NCBI (www.ncbi.nlm.nih.go /) pa a iden i ica os domínios conse ados disponí eis na mesma. Quando ambiguidades e am de ec adas, as sequências o am posicionadas nas sub- amílias ABC, pa a pesquisa po analogia na base de p o eínas com unção a ibuída da SwissP o (www.expasy.o g/sp o ). 3- SOSUI, TMHMM e HMMTOP A p e isão do núme o e localização das hélices ansmemb ana es nas sequências de P MRP1 e P MRP2, oi e ec uada eco endo a 3 aplicações dis in as SOSUI (www.bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/), TMHMM (www.cbs.d u.dk/se ices/TMHMM/) e HMMTOP (www.enzim.hu/hmm op/). Adicionamos à análise p o eínas das quais exis e in o mação expe imen al, ace ca da sua opologia memb ana , pa a pe mi i um e mo de compa ação. II.3.2 - Sequenciação dos genes p m p1 e p m p2 a pa i de cDNA a) Ampli icação po PCR dos agmen os dos genes a sequencia Pa a a sequenciação o al dos genes p m p1 e p m p2, o am desenhados 11 e 12 pa es de p ime s espec i amen e (Tabela II.2). Os p ime s o am desenhados com base na sequência do clone 3D7, decla ada no PlasmoDB (www.plasmoDB.o g) pa a cada gene. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 59 Os agmen os (11 pa a p m p1 e 12 pa a p m p2) de ce ca de 600 pa es de bases (bp) cada, o am ampli icados po PCR com os p ime s e condições de ampli icação desc i os na Tabela II.2. Os p ime s o am sin e izados pela MWG Genomic Syn hesis (USA), con o me sequencia o necida po nós. Tabela II.2 - Sequência dos p ime s e condições de ampli icação po PCR dos agmen os dos genes p m p1 e p m p2. PF - p ime di ec o; PR – p ime e e so. p m p1 Sequência dos P ime s (5’-3’) Mis u a de eacção S1m p1F ATGACGACATATAAAGAAAATGTTGG S1m p1R GAAGCTCTTTTGCATTTTTATTTTC S2m p1F GTGGTAGTGATGATAATGTTTTTCC S2m p1R TTGAATTTTTACCAAGTTTATTTAAAAG S3m p1F GCTTTATACAGTGCAATGATAC S3m p1R CTTCTCATGATGATGGTACATC S4m p1F GTAGTGGATAAGACATTTTTACAAAATG S4m p1R GAGATTTTAATATGACACATGGTAATTTG H2O…………a é 20 µ l Tampão…………..1X MgCl………23,5 mM dNTP’s……...200 µ M PF……………300nM PR……………300nM TaqPol………025U/ µ l cDNA ------ S5m p1F ATCAGGAAAAAGTGCATTTTTCCATTC Condições de PCR S5m p1R GATATATTTACATCTTTAGATCCTTCC S6m p1F GAAAATTACCTTCAAAAATGTTTAATGG S6m p1R GGAGCATATGAATAAAAATAATAAGG S7m p1F GGGAATACGGAGAGTGTTTCC S7m p1R GTCTTTTTAACTATGATGAGTATTATTTC S8m p1F CTTCAGTAGTAATATTTATGCTTATATC S8m p1R CATCTATAGTAATGCATTGTCTGG S9m p1F CAAAGGCTGTATTTATCATGTCATAC S9m p1R GGATAAGATATCTGCAATTGTCG S10m p1F GGAAAATGAATTAAATGTAATAACAACAC S10m p1R GTTCATGCTCTAAAATTGAATGG S11m p1F GATCCATATAATAATTTCACAGATGATG S11m p1R TTAGTCGTCCATTTCTAACAAATGTG p m p2 S1m p2F ATGATGAGACGGAGAAGCG S1m p2R GCCCTCCTTTGCTATTATGAT S2m p2F GTGTTGTTCGGATTTATAGTCAT S2m p2R CGACATGTTTAACGTGTACAG S3m p2F GCTCCGAATTTAATAAAGAAGAAAAACA S3m p2R GTTCTTTAATCACACCCCT S4m p2F GTGAATTAAAGAGTAATAAAACCG S4m p2R CAAGACAGAAAAGGGTGGTAT S5m p2F GTAGGTGAAAGTAATAATTCACTAT S5m p2R CTGCACAGAGGTCTAATGAT S6m p2F CTGCACAGAGGTCTAATGAT S6m p2R GGAACTATATGCACCGTGTAA S7m p2F GAACAAGTCAAATCTATGTTAAGTC S7m p2R CCATTTACTCGTTCAATACAGAAGAA S8m p2F GCGGAGATATAAAATACCACAAAT S8m p2R GGAAGACCTCTAATTATTGTTATTATT S9m p2F GGAAATATCAAGTTAGAAACATTTTG S9m p2R GCATCACATGCACCCTTAT S10m p2F GATGTAAAGAAGCACAAAGAGG S10m p2R CCTGGTTCGTATGATCCGA S11m p2F GCAGGATGCAAATTTATTTAAATCTG S11m p2R GGAATATTAGAACATTTATAGATCCAT S12m p2F GGTGTATTACCACAATCATCTTTTG S12m p2R GCTTCAAGAAAAACAATTAAATTGA 92ºC - 3 min 92°C – 1 min sec 50°C - 30 sec 35 x 72°C – 1min sec 72ºC – 3 min Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 60 b) Análise de sequências Os agmen os esul an es das ampli icações po PCR o am isualizados em gel de aga ose a 2% (II.2.6) pa a e i ica a p esença de banda única. Pa a ga an i a qualidade da sequenciação, os p odu os de PCR o am pu i icados com o ki Quiaquick PCR Pu i ica ion (Qiagen), cujo p incípio consis e em e e o DNA numa coluna de esina, libe ando-o dos es an es componen es da mis u a, nomeadamen e das pequenas sequências dos p ime s. Es e DNA é eluído da esina a a és da passagem de água na coluna induzida po cen i ugação. Os p odu os assim ob idos o am diluídos e sequenciados. As eacções de sequenciação o am e ec uadas pela Mac ogen DNA Sequencing Se ice (www.nucleics.com/DNA_sequencing_suppo /sequencing-se ice/mac ogen) na Co eia. Todos os agmen os o am sequenciados que na cadeia codi ican e 5’→3’, que na sua complemen a , pa a con i mação dos esul ados.A análise das sequências nucleo ídicas ob idas oi e ec uada a a és de alinhamen os en e a sequência esul an e e a sequência disponí el, no PlasmoDB (WWW.plasmoDB.o g) endo es a análise sido e ec uada com apoio da aplicação Mul Alin (www.bioin o.genopole- oulouse.p d. /mul alin) g a ui amen e disponí el on line. II.3.3 – Iden i icação po PCR das inse ções/delecções na sequência do gene p m p2 Pa a de ec a a p esença das inse ções/delecções, o am ampli icados po PCR agmen os da sequência do gene. Os p ime s desenhados hib idam em locais que lanqueiam es a egião (Tabela II.3). Os p odu os de PCR ob idos, o am isualizados em gel de aga ose 2% (nas condições desc i as em II.2.6). A p esença das inse ções/delecções oi de e minada po compa ação com os agmen os de PCR ob idos a pa i dos clones 3D7 e Dd2. Tabela II.3 - Sequência dos p ime s e condições de PCR pa a ampli icação do agmen o do gene p m p2 que inclui as inse ções/delecções. bps - pa es de bases. Inse ção/Delecção* Localização* P ime s Mis u a de eacção Condições de PCR inse ção de 18 bps 779 S2m p2F S2m p2R inse ção de 72 bps 1947 S4m p2F S4m p2R delecção de 15 bps 3573 S7m p2F S7m p2R H2O…..….a é 20 µl Tampão………..1X MgCl2…...23,5 mM dNTPs……200 µM p gcsF ……300 nM p gcsR ……300 nM TaqPol.....0,025U/µl DNA……………ng 92ºC - 3 min 92°C – 1min 50°C – 1min 35X 72°C – 1min 72ºC – 3min * ela i amen e à sequência do gene no clone 3D7 Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 61 II.3.4 - Iden i icação das mu ações pon uais nos genes p m p1 e p m p2 po PCR- RFLP O PCR-RFLP (PCR-Res ic ion F agmen Leng h Polymo phism), consis e em ampli ica o agmen o de DNA que con em a mu ação, dige i o agmen o com uma endonuclease (enzima de es icção) que econheça especi icamen e o palind oma45 que inclui a mu ação. Pa a a iden i icação de cada uma das mu ações, oi ampli icado po PCR o co esponden e agmen o do gene, os p ime s e condições de PCR encon am-se desc i os na Tabela II.4. As mu ações con idas em cada um dos agmen os ampli icados po PCR, o am iden i icados pela diges ão dos mesmos com enzimas de es ição, que econhecem especi icamen e os palind omas o iginados ou eliminados po de e minada mu ação (Tabela II.4). Tabela II.4 - F agmen os ampli icados e enzimas de es ição, pa a iden i icação das mu ações pon uais dos genes p m p1 e p m p2. Gene Al e ação P ime * Enzima Palind oma C573T S2m p1F S2m p1R HpyCH4V5'... T G C A ... 3' 3'... A C G T ... 5' T1311G S3m p1F S3m p1R HpyCH4V5'... T G C A ... 3' 3'... A C G T ... 5' p m p1 T4170A S9m p1F S9m p1R D aI 5'... T T T A A A ... 3' 3'... A A A T T T ... 5' p m p2 A1910G S4m p2F S4m p2R BccI 5'... C C A T C (N)4 ... 3' 3'... G G T A G (N)5 ... 5' *Os p ime s e condições de PCR usados, o am idên icos aos desc i os pa a a sequenciação o al do gene ( e Tabela II.3); HpyCH4V e BccI, New England BioLabs; D aI, Fe men as. Todas as diges ões enzimá icas o am ealizadas de aco do com os p o ocolos dos o necedo es dos eagen es. Usualmen e, es es consis i am na adição de 1 unidade de enzima pa a a diges ão de ap oximadamen e 50 ng/µl de DNA com o espec i o ampão, numa diluição inal de 1/10. A incubação da mis u a de eacção oi e ec uada du an e 4 a 12 ho as, dependendo da e iciência de co e de cada enzima. Os p odu os de diges ão o am isualizados em gel de aga ose (con o me II.2.6). 45 Palind oma - sequencia de nucleo idos econhecida especi icamen e po de e minada endonuclease, que pe mi e es icção nesse local do DNA Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 68 e ec uado um es egaço o qual oi ixado e co ado com giemsa e com DAPI, pa a a aliação do desen ol imen o dos pa asi as. O p ocesso, oi epe ido pa a cada um dos dois clones, em 3 ensaios. Es a pa e do abalho oi ealizada em Lisboa no Labo a ó io de Malá ia do CMDT LA/IHMT. d) Ex acção de mRNA e sín ese de cDNA A ex acção de mRNA, sín ese de cDNA e eacções de PCR em empo eal o am ealizadas no Labo a ó io de Bioquimica e Biologia Molecula IV da Uni e sidade Complu ense de Mad id, Espanha. A ex acção de mRNA e sín ese de cDNA das 318 amos as p ocessadas em III.4.4.5.6., oi ealizada usando o equipamen o ABI PRISM 6100 Nucleic Acid P eps a ion (Applied Biosys ems) com placas To al RNA Pu i ica ion T ay (Applied Biosys ems) e a solução de ex acção de mRNA Absolu eRNA Wash Solu ion (Applied Biosys ems), seguindo as ins uções do ab ican e. O mRNA oi e o ansc i o, usando andom p ime s46 e o conjun o de eagen es High-Capaci y cDNA A chi e Ki (Applied Biosys ems) segundo as ins uções do ab ican e. II.3.8.1 - Quan i icação ela i a da exp essão dos genes po RT-PCR usando o mé odo dos CTs compa a i os (2-∆∆C ) As eacções de PCR em empo eal o am ealizadas num equipamen o ABI PRISM 7000 Sequence De ec o da PE Applied Biosys ems eco endo ao ki de ampli icação TaqMan uni e sal PCR Mas e Mix, No AmpE ase® UNG (Applied Biosys ems). Fo am ealizados ensaios independen es e cada um deles em iplicado. As condições de eacção, os p ime s e os beacons encon am-se na Tabela II.11. A quan i icação ela i a da exp essão dos genes es udados nes e abalho oi e ec uada pelo mé odo 2 -∆∆CT. A quan i icação ela i a, desc e e a al e ação da exp essão de um de e minado gene em ci cuns ancias di e en es. Pode se em elação a um con olo não a ado ou ao longo do empo. Não sendo necessá io de e mina o núme o de ansc i os do gene mas apenas a a iação da quan idade de ansc i os do gene em condições 46 Random p ime s - e e e-se a oligonuclo idos (p ime s) de 6 a 8 bps com sequencia alea ó ia, assim odos os ansc i os êm iden ica p obabilidade se i de molde à sin ese de cDNA (Li ak & Schmi gen, 2001). De g ande u ilidade na sin ese de cDNA pa a es udos exp essão ela i a de genes, de o ma a e i a o en iezamen o da es ima i a das quan idades ela i as de mRNA. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 69 di e en es (Li ak & Schmi gen, 2001; Schmi gen & Zak ajsek, 2000; Wine e al., 1999). Como con olo in e no da quan idade o al de mRNA, o am u ilizados genes de exp essão cons i u i a, p β-ac inI (Tabela II.6) e 18S (Tabela II.11). Es a abo dagem oi assim conside ada adequada aos objec i os do p esen e es udo e o modelo ma emá ico escolhido oi 2-∆∆C , desc i o em po meno em (Li ak & Schmi gen, 2001). Es e modelo pe mi e de e mina a a iação de exp essão (N) de um gene pela equação A; N =2−∆∆C (equação A) em que; ∆∆C = (C ,al o− C , con olo in e no)χ− (C ,al o− C , con olo in e no)γ (equação B) onde χ amos a (na qual se es á es uda a a iação de exp essão do gene al o) e γ amos a calib ado (em elação á qual se es á es uda a a iação de exp essão do gene al o). A aplicação des e modelo implica o cump imen o dos seguin es p essupos os: a) a eacção de PCR de cada gene de e e e iciência p óxima de 100%. b) a e iciência das eacções de PCR do gene al o e con olo in e no de em se idên icas. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 70 Tabela II.11 - Sequência dos p ime s e beacons pa a es udo da exp essão dos genes de espos a ao s ess oxida i o e p m p1 e p m p2. Gene código de acesso* Sequência dos P ime s e Beacons (5’-3’) Mis u a de eacção p γ-gcs PFI0925w PF - AGATGCTATGTTTTTTGGTATGAGTATGT PR -ACTAGCCGTTATTGCACCACTT B-AACAATTAACCATGTCTTTTCCAAC p g PF14_0192 PF -AGTGGAGGAATGGCTGCAG PR -TGTCGAAAAATCCCGTTTAGG B-AGCAAGGCATAACGCAA p gs PF14_0187 PF -AACGGTGATGCTTTTGTTGAA PR -AATTGGAGATTTGATATTAGCTCA B-AAGAAAAGGATACTCCTTTTGAGCAAGTA H2O……..….….5µl Mas e Mix…12.5µl PF…….……300nM PR…….……300nM Beacon..........200nM cDNA………..…5µl p gpx PFL0595c PF -AATTGTGATTCGATGCATGATG PR -TTGGAAAATTTCTCGTCGATAAA B-CGTTAAAAAGTATCGGATGGAATT Condições de PCR p m p1 PFA0590w PF -AAGAAAGTCACTGGGGTTATTC PR -TCGTAAAAGGGAATACGGAGA B-TGTTTGATGAAGTGGAACTTAATCATGTTAAACA p m p2 PFL1410c PF -AGCCACATAAACGATTTGTCAA PR -TTAACGTGTACAGGCTCCGA B-TGTTTCGAGCATGGATAGCAACACC p x PFI1170c PF -TTGTACTAATATTCCTTCAATATTT PR -AATTAGCGCCCGTGGC B-GCTGTAGGAGACGTAGCTGAAAATGTCCC** p 2-CysPx PF14_0368 PF -TGCTGTACAACACCACGAACA PR -AGGTAGCCATGAAACCATCAGA B-GAGATGTTTGCCCAGCAAACTGG p g6pd PF14_0511 PF -GAACTCCAGGAAAAACAAGTCAAG PR -AAAGAGGTATTTGGACTTGTCAAAA B-TCTTAAATATTCTTTTGGATCATCAGGCCC p Fe-sod PF08_0071 PF -CAACGCTGCTCAAATATGGA PR -TGTGGTGGTGAGCCTCATG B-TACTTTTTACTGGGATTCTATGGGACCT 18S M19172 PF -TGACTACGTCCCTGCCCTT PR -CCGATTGAAAGATATGATGAATTGT B-ACACCGCCCGTCGCTCC 50ºC - 2 min 95ºC - 10 min 57°C – 1min 95°C – 30sec 29 X 45°C – 29sec *código de acesso da sequência egis ada no PlasmoDB; ** os nucleó idos sublinhados co espondem a al e ações à sequência do gene in oduzidas pa a aumen a a e iciência do beacon. PF - p ime di ec o, PR – p ime e e so, B - beacon) a) Cálculo da e iciência da eacção de RT-PCR de cada gene O calculo da e iciência das eacções de PCR em empo eal pa a cada gene, oi ealizado com bases na a iação dos alo es de CT em unção da diluição da amos a, o am usadas as seguin es diluições se iadas de DNA: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Foi cons uída uma cu a de calib ação pa a cada gene (exempli icada na Figu a II.9), Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 71 calculado o seu decli e (m) e a pa i des e a e iciência (E) pela equação: E=10(−1/m), em que E=2 co esponde a uma e iciência de 100% (Li ak & Schmi gen, 2001). As concen ações dos p ime s, o am sujei as a uma e apa p é ia de op imização. Nos mé odos em que o am usadas sondas TaqMan e beacons oi ixada a concen ação da sonda ou beacon em 200nM47 e es adas as seguin es concen ações de p ime s: 50, 100 e 300nM. As mesmas concen ações de p ime s o am es adas no caso em que oi usado o mé odo SYBR G een. Fo am escolhidas as concen ações de p ime s e sonda a que co espondiam os meno es alo es de CT e os maio es alo es de ∆Rn (Figu a II.2). Após a decisão sob e as concen ações óp imas dos p ime s, p ocedeu-se à op imização da concen ação da sonda. Fo am es adas as seguin es concen ações: 50, 100 e 200nM. b) Cálculo da e iciência da eacção de RT-PCR do gene al o e em elação ao gene con olo in e no O segundo p essupos o pa a aplicação do mé odo 2-∆∆C , e e e-se à semelhança en e as e iciências de eacção de ampli icação, dos genes al o e de e e ência. A pa i da cu a de calib ação de ambos os genes, al o e con olo ( e e ida em II.3.7.4.1), oi calculada a media dos CT e de e minada a di e ença de CT pela equação: ∆CT (CT, gene al o− CT, gene con olo). O alo de m da ec a de eg essão, associada à ep esen ação g á ica dos alo es ∆CT s diluições da amos a (Figu a II.5), de e se in e io a 0,1 (conside amos acei á eis alo es de m en e 0 e 0,1) pa a que as e iciências das eacções de PCR em empo eal do gene al o e con olo in e no sejam conside adas simila es. 47 A escolha da concen ação da sonda e beacon em 200nM pa a o ensaio da op imização dos p ime s oi ei a de aco do com as ecomendações do p o ocolo: Sequence De ec ion Sys ems Quan i a i e Assay Design and Op imiza ion, PE Biosys ems. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 72 II.3.8.1.1 - Análise de esul ados ela i os à exp essão Conside ando que os alo es u ilizados no a amen o dos esul ados co espondem à média dos iplicados ealizados, a p ecisão e a ep odu ibilidade in a-ensaio do PCR em empo eal é undamen al. Es es pa âme os o am a aliados pela de e minação do des io pad ão (DP), ap esen ado pelas 3 éplicas de cada ensaio, ela i amen e à média dos alo es de CT . O des io pad ão associado a cada conjun o de iplicados, não pode ap esen a um alo supe io a 0,38 (Li ak & Schmi gen, 2001) sendo eliminadas as de e minações cujo des io pad ão seja supe io a es e alo . a) Cálculo do coe icien e de co elação de Pea son en e os pe is de exp essão ob idos pa a os clones 3D7 e Dd2 dos genes de enzimas de espos a ao s ess p m p1 e p m p2. À semelhança de ou os au o es (Llinas e al., 2006a; Le Roch e al., 2003a; Bozdech e al., 2003) e pa a amos as de dimensões e condições expe imen ais compa á eis, assumimos que a nossa amos a segue uma dis ibuição ap oximada à Gaussiana (es a ap oximação oi ambém e i icada pelo es e de K uskal-Wallis). O coe icien e de Figu a II.5 - Validação da aplicação do me odo 2-∆∆C . A- ep esen ação g a ica da ampli icação po PCR das á ias diluições de DNA, B-cu a pad ão pa a de e minação da e iciencia do PCR, C-e iciência ela i a das eacções de PCR do gene al o e con olo in e no. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 73 Pea son, oi de e minado eco endo à aplicação G aphPad PRISM® e são 4.0, dado que não assumimos p e iamen e qual o sen ido (posi i a ou nega i a) da co elação, usamos o es e wo- ail P alue pa a de e mina o alo do coe icien e de Pea son e P. b) Regulação dos genes em es udo no ciclo in a-e i oci á io de P. alcipa um Conside amos que o gene é egulado quando os alo es de p da ANOVA o am P< 0,050 (pa a α=0,05) e se e i icou al e ação da ampli ude de exp essão de pelo menos 1,5 eses (N old ≥ 1,5) en e es adios (c i é ios iden icos aplicados po (Le Roch e al., 2003a). Os pa âme os da ANOVA o am de e minados eco endo à aplicação G aphPad PRISM® e são 4.0. II.3.8.2 - Análise da es abilidade do mRNA dos genes em es udo Es a pa e do abalho oi ealizada no Labo a ó io de Bioquimica e Biologia Molecula IV da Uni e sidade Complu ense de Mad id, Espanha, sob o ien ação do P o esso Dou o José Manuel Bau is a. a) Mic o-cul u a de pa asi as na p esença e ausência de clo oquina ao longo do ciclo in a-e i oci á io de P. alcipa um Os clones de P. alcipa um 3D7 e Dd2 o am man idos em cul u a nas condições desc i as em II.2.1. Seguidamen e, o am es abelecidas 39 mic ocul u as (assinc ónicas) de 240 µl cada com 1% de pa asi émia, em placas de 96 poços, man idas du an e 8h. Pa a cada clones u ilizou-se uma placa dis in a. Recolhe am-se 3 amos as da mic ocul u a/clone, às 0h, cen i ugadas a 900xg, emo idos 140µl de sob enadan e, adicionados 100µl de PBS e 200µl do ampão Nucleic Acid Pu i ica ion Lysis Solu ion (Applied Biosys ems) congeladas sepa adamen e a -80ºC. Logo a segui , oi adicionada Ac inomicina D (20 µg/ml) às 36 mic ocul u as es an es, e 7,5 µl de uma solução de clo oquina (CQ) - dis in a, que co esponde ao alo de IC50 da cada um dos clones u ilizados - a apenas 18 des as. As cul u as o am incubadas nas condições desc i as em II.2.1. Deco idas a 1, 2, 4, 6 e 8h de incubação, oi ecolhida uma amos a, em iplicado, de cada mic ocul u a - a ada ou não com CQ – e a adas Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 74 como acima mencionado e congeladas a -80ºC. O p ocesso, oi epe ido pa a cada um dos dois clones, em 3 ensaios. b) Ex acção de mRNA e sín ese de cDNA A ex acção de mRNA, sín ese de cDNA oi ealizada con o me desc i o em II.3.8 d). c) Análise da es abilidade do mRNA dos genes em es udo A quan i icação ela i a da exp essão dos genes po RT-PCR usando o mé odo dos CTs compa a i os (2 -∆∆CT) oi ealizada con o me desc i o em II.3.8.4. As cu as de deg adação do mRNA o am ob idas conside ando 100% a quan idade de mRNA de cada gene no empo 0h (ou seja, imedia amen e an es da adição de Ac inomicina D), as es an es medições ealizadas (1, 2, 4 e 8h após adição de Ac inomicina D) o am ans o madas em pe cen agens ela i as ao empo 0h. Aos alo es em % oi ajus ada uma cu a do ipo exponencial de decaimen o de uma ase, pa a de e mina o alo da cons an e de decaimen o K. A semi- ida do mRNA pa a cada gene na p esença e ausência de clo oquina oi de e minada pela o mula 1/2=Ln(2/K). II.3.9 – P odução de so os hipe imunes pa a de ecção das p o eínas codi icadas pelos genes p m p1 e p m p2 Es a pa e do abalho oi ealizada no Molecula Pa asi ology and Molecula Epidemiology Depa men do Swiss T opical Ins i u e na Basileia, Suiça, sob supe isão do P o esso Hans-Pe e Beck. II.3.9.1 – Iden i icação in silico e ampli icação po PCR dos agmen os a clona pa a cada gene A análise in silico, eco endo a 3 algo i mos e e idos em II.3.1, pe mi iu ge a os pe is de hid o obicidade espe ados pa a as p o eínas codi icadas pelos genes p m p1 e p m p2. Os p ime s (Tabela II.12) o am desenhados de o ma a ampli ica 3 agmen os (inse os a clona ) de cada gene, em locais onde não oi p e is o po nenhum dos algo i mos a exis ência de egiões ansmemb ana es das p o eínas codi icadas nem o am de ec adas al e ações da sequência. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 75 Tabela II.12 - Sequência dos p ime s e condições de PCR pa a ampli icação dos agmen os a clona do gene p m p1 - MRP1A / MRP1B / MRP1C e de p m p2 - MRP2A / MRP2B / MRP2C. F agmen o Sequência dos P ime s* Mis u a de eacção** p m p1 3’ – 5’ Cm p1AF G.ATG ACG ACA TAT AAA GAA AAT G MRP1A Cm p1AR CC AAT TGA CCA TAA AAT ATT ATG Cm p1BF G ATA AAA AAT TAT TTT ATG TAC CG MRP1B Cm p1BR CC ATG GTC ATT ATC ACA TTT ATT ATC Cm p1CF G TTT GCT AAA ATT TCT AAT AAA G MRP1C Cm p1CR CC GTT TAT TAC TTT TGA TG ddH2O………..a é 25 µl Tampão……..……...1X dNTPs……...…200 µM PF…............…..300 nM PR…............…..300 nM P u pol…..…..0,025U/µl cDNA……………….ng p m p2 3’ – 5’ Condições de PCR Cm p2AF G ATC AGA ATG AGC AAA GCG ATT TAC MRP2A Cm p 2AR CCA TAT TAT ATA TAC TAA TAT CGA ATA C Cm p 2BF G AT GTT GTA GGT GAA AGT AAT AAT TC MRP1B Cm p 2BR CC A TGT CCT TTT TCT TAA AGG ATA T Cm p 2CF G TGC TCC AAG ATG ATT AAA GAC MRP1C Cm p 2CR CCT TCA TAT TTA TTA TTT TTT CTA TC Plasmídeo 3’ – 5’ pGEXF GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG pGEXR CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 94ºC - 3 min 94°C – 1min 52°C – 1min 29 ciclos 68°C – 1min Os agmen os o am ampli icados com P u-Polyme ase, uma polime ase que pe mi e ob e ex emidades blun (não coesi as), necessá ias à clonagem po ciclos sucessi os de ligação e es ição (Cycle Res ic ion Liga ion) (Figu a II.6). II.3.9.2 - Clonagem dos agmen os no ec o pGEX-6P-1-His po CRL Os p odu os de PCR ob idos em II.3.6.1, o am pu i icados com o ki Quiaquick PCR Pu i ica ion (Qiagen) e ligados ao ec o po CRL. A CRL oi ealizada em e mociclado (Eppendo ), a mis u a de eacção e as condições de es ição e ligação encon am-se desc i as na Figu a II.6. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 76 Figu a II.6 - P og ama e componen es da mis u a de CRL (Cycle Res ic ion Liga ion) usados na clonagem de cada agmen o no plasmídeo pGEX-6P-1-His. PEG – polie ileno glicol; DTT – di io ei iol;* á excepção da H2O bides ilada (ddH2O) e PEG (Sigma) odos os componen es da mis u a são da NewEngland Biolabs. A écnica de CRL, pe mi e ob e uma maio p opo ção de plasmídeos com o inse o ligado. Os plasmídeos, são linea isados po es ição do único local econhecido pela SmaI, é aqui que se liga o inse o, inac i ado o local de co e. Nos ciclos seguin es os plasmídeos com inse o não so em es ição mas aqueles sem inse o ol am a se co ados, aumen ando as p obabilidades de ob e plasmídeos com inse o. Depois do ul imo ciclo as enzimas SmaI e T4DNA ligase são inac i adas pela empe a u a (65ºC - 15min). II.3.9.3 – T ans o mação de E.coli JM 109/SURE® e selecção po PCR, das colónias con endo o inse o na o ien ação co ec a As bac é ias elec ocompe en es (desc i o em II.2.8) o am descongeladas em gelo e 40µl de células mis u adas gen ilmen e com 1µl de p odu o de CRL (desc i o em II.3.6.2), es a mis u a oi ans e ida pa a a cu e e de elec opo ação e incubada em gelo ce ca de 1 min. A elec opo ação oi ealizada num elec opo ado (EasyjecT® Equib io) e aplicado um pulso de 2,5 kV, 25µF, 5msec e 201Ω. Imedia amen e depois do pulso, as células o am ans e idas pa a 1ml de LB liquido e incubadas a 37ºC com agi ação o bi al a 225 pm du an e 30 min, pa a pe mi i a exp essão do gene de esis ência à ampicilina. A pa i des a cul u a 100µl o am plaqueados em LB aga com ampicilina (100 µg/ml) e incubados a 37ºC du an e a noi e. Apenas as células ans o madas com o plasmídeo o ma am colónias. Me odologia _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 77 II.3.9.4 – Selecção das colónias con endo o inse o na o ien ação co ec a, po PCR Cada colónia de bac é ias ob ida em II.3.6.3 oi ecolhida com um pali o es é il. Uma pa e oi ans e ida pa a placa de LB aga com ampicilina (e incubada 37ºC) e o es o da colónia, usado di ec amen e pa a PCR. A o ien ação co ec a do inse o oi e i icada usando o p ime di ec o (pGEXF) do plasmídeo e o p ime e e so de cada agmen o. As condições de PCR e os p ime s encon am-se desc i as na Tabela II.12. Os agmen os esul an es o am e i icados em gel de aga ose nas condições desc i as em II.2.6. Os p odu os de PCR com o amanho espe ado o am pu i icados com o ki Quiaquick PCR Pu i ica ion (Qiagen) e sequenciados nos dois sen idos, pa a ga an i que co espondiam à sequencia nucleo ídica espe ada. a) Ex acção de DNA plasmídico dos clones E.coli JM 109/SURE® con endo o inse o na o ien ação co ec a Após con i mação da o ien ação e sequência co ec as do inse o, os clones o am cul i ados du an e a noi e em meio LB líquido com ampicilina (ANEXO 1) (37ºC com agi ação). A cul u a ob ida oi cen i ugada a 4000 x g, 4ºC, du an e 15 min e o DNA plasmídico ex aído com o ki CONCERT™ Rapid Plasmid Minip ep Sys em (Qiagen) de aco do com o p o ocolo do ab ican e. Suma iamen e, consis e na lise da célula bac e iana e adso ção do DNA plasmídico à memb ana de sílica das colunas o necidas em conjun o com o ki , o DNA é depois eluído da memb ana a a és da passagem de água na coluna po cen i ugação. II.3.9.5 – T ans o mação de E. coli BL21 com o DNA plasmídico e selecção dos clones que exp essa am as p o eínas ecombinan es MRP1A / MRP1B / MRP1C e MRP2A / MRP2B / MRP2 O DNA plasmídico ex aído de cada clone (III.3.6.4) oi usado pa a ans o ma po elec opo ação E. coli BL21 (con o me desc i o em II.3.6.3), a es i pe de bac é ias onde o am exp essadas as co esponden es p o eínas ecombinan es. Cada clone oi cul i ado em 500ml de LB liquido com ampicilina (ANEXO 1), a 37ºC com agi ação a é a ingi densidade O.D.600 = 1,0. A exp essão da p o eína ecombinan e oi induzida po adição de 4ml de IPTG48, (100mM), du an e 4 h a 37ºC com agi ação. Uma aliquo a de cada cul u a oi ecolhida e cul i ada em condições idên icas mas sem adição de IPTG pa a se i de con olo nega i o de exp essão. 48 O IPTG é um indu o da ansc ição gené ica que aumen a a quan idade da enzima T7 RNA polime ase, a qual se liga ao p omo o T7, iniciando a ansc ição do cDNA de in e esse. Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 84 Tabela III.1 - Sequências de genes candida os a p o eínas da amília ABC no genoma de Plasmodium alcipa um. Na p imei a coluna e e e-se a designação co esponden e à classi icação HUGO50- A, B, C, D, E e F (Dean & Allikme s, 2001a) ID, código de acesso à sequência na base de dados; a.a. núme o de aminoácidos da sequência e Ch ., C omossoma. *Non-in insic ABC p o ein. Sub- amília ABC Domínios conse ados51 P o eína (ID) a.a. Topologia Ch . ABCA ABC1 T anspo ado de di e sos compos os lipídicos (memb ana plasmá ica). P ABC1 PFC0875w 3133 [TMD-ABC]2 III Pgh1 PFE1150w 1419 [TMD-ABC]2 V P MDR3 PF11_0466 872 TMD-ABC XI P MDR4 PFC0125w 1366 TMD-ABC III MTABC3 ( ambém designado ABCB6) anspo ado exp esso (ge almen e) na memb ana mi ocônd ial cuja unção isiológica en ol e a homeos ase do Fe o. P MDR5 PFL0495c 855 TMD-ABC XII Pgh2 PF14_0455 1024 TMD-ABC XIV ATM1 T anspo ado exp esso na memb ana mi ocônd ial, cuja inac i ação esul a na acumulação excessi a de Fe o na mi ocônd ia, inac i ação dos ci oc omos, lesões po oxidação no DNA mi ocônd ial e ní eis diminuídos de p o eínas com Fe no ci oplasma. P MDR6 PF13_0271 1049 TMD-ABC XIII ABCB (MDR/TAP) MsbA T anspo ado de açúca es, iões, pép idos, os olípidos e moléculas mais complexas (como lipopolissaca idos e subs âncias bac e icidas em bac é ias) (memb ana plasmá ica). P MDR7 PF13_0218 925 TMD-ABC XIII P MRP1 PFA0590w 1822 TMD0-[TMD-ABC]2 I ABCC (MRP/CFTR) MRP (mul id ug essis ance associa ed p o ein), anspo ado es de GSSG e di e sas subs âncias xenobió icas conjugadas ou não com GSH (ex. á macos) (memb ana plasmá ica). P MRP2 PFL1410c 2109* TMD0-[TMD-ABC]2 XII ABCE Inibido da RNAse L (RLI) Pa e do complexo ibossómico adução (ci oplasma). P RLI MAL13P1.344 619 [ABC]2 XIII P GCN20 PF11_0225 815 [ABC]2 XI ABCF (GCN20) EF-3 Fac o de egulação da adução; egula a sín ese p o eica ao ní el do alongamen o da cadeia de pép idos no ibossoma (ci oplasma). P ABCF1 PF08_0078 1419 [ABC]2 VIII ABCG (Whi e) EPDR T anspo e de p ecu so es do pigmen o do olho e de alguns me aboli os da clo o ila. Es á ambém associado à egulação dos mecanismos de anspo e de lípidos e à esis ência pleio ópica a á macos (memb ana plasmá ica). P ABCG1 PF14_0244 660 ABC-TMD XIV P SMC1 F11_0317 1818 ABC XI P SMC2 MAL13P1.96 1218 ABC XIII P SMC3 PFD0685c 1193 ABC IV P SMC4 PFE0450w 1708 ABC V P SMC5 PF11_0249 1268 ABC XI SMC SMC Manu enção da es u u a e coesão dos c omossomas du an e a eplicação e epa ação de lesões no DNA (núcleo). P SMC6 PFE1255w 1849 ABC V Su C pa e do complexo mul ip o eico Su ABCDES en ol ido na sín ese das p o eínas de e o/enxo e (Fe/S); em p oca ió as associado à memb ana ci oplasmá ica; em pa asi as e plan as associado às memb anas in e nas dos plas ídeos) P Yc 16 PF14_0133 347 ABC XIV NAP* CbiO componen e de ligação ao ATP do complexo mul ip o eico CbiMNQO en ol ido no anspo e de Cobal o, em bac é ias, a chaea e euca ió as. Associado à memb ana ci oplasmá ica. P CbiO PF14_0321 171 ABC XIV 50 The Human Genome O ganisa ion em www.hugo-in e na ional.o g. 51 Dominios conse ados iden i icados po Blas nas bases Conse ed Domain e CDART: Conse ed Domain A chi ec u e Re ie al Tool ou po homologia com as p o einas da base SwissP o . Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 85 III.1.2 – Pesquisa de homologias das sequências das p o eínas P MRP1 e P MRP2 com p o eínas da sub- amília MRP/CFTR de ou os o ganismos Fo am iden i icadas duas sequências de p o eínas, p esumi elmen e codi icando anspo ado es da sub- amília MRP/CFTR, P MRP1 e P MRP2. A sequência comple a de a.a. des as p o eínas, oi compa ada po BLAST com a base de dados SwissP o . (acedida em 15/01/07). Des a pesquisa esul ou uma lis agem de a ias p o eínas, classi icadas como anspo ado es ABC, o denadas pelo g au dec escen e de semelhança com cada uma das duas p o eínas em es udo. Es a lis agem, inclui p o eínas da sub- amília MRP/CFRT de o ganismos ilogene icamen e ão dis an es como: Homem (Hommo sapiens), le edu as (Sacha omices ce e isiae), mu ganhos (Mus musculus), plan as (A abidopsis haliana) ou a ú (Dasypus no emcinc us). Da e e ida lis agem seleccionamos as seis p o eínas com maio g au de semelhança com P MRP1 (ATMRP2, YBT1, MRP8, BPT1, YCF1 e MRP1) e com P MRP2 (ATMRP11, MRP8, YOR1, YBT1, CFTR e MRP2), das quais se conhece a unção (Tabela III.2). As duas sequências nas quais o am de ec ados domínios uncionais compa í eis com as p o eínas da sub- amília MRP/CFTR (ABCC) em P. alcipa um, o am analisadas ao ní el da es u u a p imá ia no sen ido de: a) es abelece o g au de semelhança en e as p o eínas codi icadas pelos genes p m p1 (P MRP1) e p m p2 (P MRP2) e p o eínas de ou os o ganismos, já iden i icadas e ca ac e izadas uncionalmen e; b) iden i ica ca ac e ís icas p óp ias da sub- amília MRP/CFTR. Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 86 Tabela III.2 - Compa ação da sequência comple a de aminoácidos de P MRP1 e P MRP2, com p o eínas da base de dados SwissP o . As 6 p o eínas lis adas, co espondem àquelas com maio g au de semelhança com a sequência em es udo, po o dem dec escen e de homologia. P o eína P o eínas Sub- amília P . alcipa um semelhan es ABC Função52 O ganismo a.a. P o . ID A MRP2 MRP/CFTR T anspo e de conjugados de GSH e GSSH acúolo onoplas o (Geisle e al., 2004) A. haliana 1623 Q42093 YBT1 MRP/CFTR T anspo e de ácidos bilia es acuola (Kolaczkowski e al., 1996) S. ce e isiae 1661 P32386 A MRP1 MRP/CFTR T anspo e de conjugados de GSH e GSSG. Localiza-se na memb ana do acúolo ( onoplas o) (Li e al., 1997) H. sapiens 1622 Q96J66 BPT1 MRP/CFTR T anspo ado de bili ubina não conjugada e des oxi icação de me ais pesados po conjugação com glu a ião (Sha ma e al., 2002; Pe o ic e al., 2000) S. ce e isiae 1559 P14772 YCFI MRP/CFTR T anspo e subs âncias o gânicas conjugadas com GSH (Tommasini e al., 1996; Li e al., 1996) e me ais pesados (ex. Cádmio) conjugados com GSH (Li e al., 1997) S. ce e isiae 1515 P39109 P MRP1 (1822 a.a.) MRP1 MRP/CFTR T anspo e de aniões o gânicos conjugados com GSH, GSSG e espos a celula ao s ess oxida i o (Cole e al., 1992b). Não es á comple amen e escla ecido o mecanismo pelo qual a p esença de GSH po encia o anspo e de conjugados pela MRP1 (Deeley e al., 2006). H. sapiens 1531 P33527 ATMRP11 MRP/CFTR T anspo e de conjugados de GSH e GSSH (Kolukisaoglu e al., 2002) A. haliana 1194 Q9SKX0 YOR1 MRP/CFTR Pe mease associada à esis ência pleio ópica a á macos (ex. oligomicina) (Le C om e al., 2002; Ka zmann e al., 1995). S. ce e isiae 1477 P53049 YBT1 MRP/CFTR T anspo e de ácidos bilia es (Go eau e al., 1996). S. ce e isiae 1661 P32386 MRP8 MRP/CFTR T anspo e de ácidos bilia es e impo ação de conjugados lipo ílicos de glu a ião (Tammu e al., 2001) H. sapiens 1382 Q96J66 MmCFTR MRP/CFTR Canal de Clo o (Ta a e al., 1991). M. musculus 1476 P26361 P MRP2 (2109 a.a.) DnCFTR* MRP/CFTR Canal de Clo o (An onellis, A. e al 2006) D. no emcinc us 1482 Q07E42 As egiões de ligação ao ATP (NBD1 e NBD2) em P MRP1 e P MRP2 o am iden i icadas compa ando, po alinhamen o, cada uma das sequências com as seis p o eínas de di e en es o ganismos que lhes e am mais semelhan es (ANEXO 6). Os esul ados de cada alinhamen o encon am-se na Figu a III.1 e Figu a III.2, onde es ão assinaladas ca ac e ís icas da supe - amília ABC como, a assina u a ABC, os Walke A e WalKe B, Q-loop, D-loop e H-loop. As sequências o am uncadas, sendo ap esen ados apenas os NBD1 e NBD2 de cada p o eína. 52 Função biológica a ibuída po algumas publicações Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 87 P MRP1 Walke A Q-loop A MRP2 GSTGEGKTSLISAILGELPATSD---------------AIVTLRGSVAYVPQVSWIFNAT A MRP1 GSTGEGKTSLISAMLGELPARSD---------------ATVTLRGSVAYVPQVSWIFNAT BPT1 GRVGAGKSTFLKAILGQLPCMSGSRDSIPP--------KLIIRSSSVAYCSQESWIMNAS YCFI GKVGSGKTALLSCMLGDLFRVKG----------------FATVHGSVAYVSQVPWIMNGT MRP1 GSVGSGKTSLISAILGQMTLLEG----------------SIAVSGTFAYVAQQAWILNAT YBT1 GPTGSGKTSLLMALLGEMYLLNGKVVVPALEPRQELIVDANGTTNSIAYCSQAAWLLNDT P MRP1 GNVGSGKSAFFHSILGDFNMTHGN-----------LYIENFFKKMPILYVPQNSWLFMGN Assina u a ABC A MRP2 VRDNILFGSPFDREKYERAIDVTSLKHDLELLPGGDLTEIGERGVNISGGQKQRVSMARA A MRP1 VRDNILFGAPFDQEKYERVIDVTALQHDLELLPGGDLTEIGERGVNISGGQKQRVSMARA BPT1 VRENILFGHKFDQDYYDLTIKACQLLPDLKILPDGDETLVGEKGISLSGGQKARLSLARA YCFI VKENILFGHRYDAEFYEKTIKACALTIDLAILMDGDKTLVGEKGISLSGGQKARLSLARA MRP1 LRDNILFGKEFDEERYNSVLNSCCLRPDLAILPNSDLTEIGERGANLSGGQRQRISLARA YBT1 VKNNILFNSPFNEARYKAVVEACGLKRDFEILKAGDLTEIGEKGITLSGGQKQRVSLARA P MRP1 IRSMILFGNEYNPLIYKYTILQSELLNDLSTIEHGDMKYIN-DDHNLSKGQKVRICLARA Walke B D-loop H-loop A MRP2 VYSNSDVYIFDDPLSALDAHVGQ/EKCIKRELGQKTRVLVTNQLHFLSQVDRIVLVHEGT A MRP1 VYSNSDVCILDDPLSALDAHVGQ/EKCIKRELGQTTRVLVTNQLHFLSQVDKILLVHEGT BPT1 VYSRADIYLLDDILSAVDAEVSK/EYVLIGKTALLKNKTIILTTNT-----VSILKHSQM YCFI VYARADTYLLDDPLAAVDEHVAR/EHVLG----------------------PNGLLHTKT MRP1 LYSDRSIYILDDPLSALDAHVGN/NSAIRKRLKSKTVLFVTHQLQYLVDCDEVIFMHEGC YBT1 LYSNARHVLLDDCLSAVDSHTAS/DNCITGPLME--------------DRTCILVSHNIA P MRP1 LYE/FYLYLLDDIFTSLDPSISK/NLNITKESHWGYSNLNTIDYTRIKLFDEVELNHVKH ____________________________________________________________ NBD1 Walke A A MRP2 DVVLRYRPQLPPV------------LHGVSFFIHPTDKVGIVGRTGAGKSSLLNALFRIV A MRP1 DVVLRYRPELPPV------------LHGVSFLISPMDKVGIVGRTGAGKSSLLNALFRIV BPT1 NYSTKYRENLDPV------------LNNINVKIEPCEKVGIVGRTGAGKSTLSLALFRIL YCFI NYSTRYRPELDLV------------LKHINIHIKPNEKVGIVGRTGAGKSSLTLALFRMI MRP1 NAEMRYRENLPLV------------LKKVSFTIKPKEKIGIVGRTGSGKSSLGMALFRLV YBT1 DLSLRYAPNLPRV------------IKNVSFSVDAQSKIGIVGRTGAGKSTIITALFRFL P MRP1 NVYVSYKKKIPLVNGTYKYIDEEPSLKNINMYALKNQKIGIVGKSGAGKSTILLSILGLI Q-loop A MRP2 EVEKGRILIDDCDVGKFGLMDLRKVLGIIPQSPVLFS-GTVRFNLDPFGEHNDADLWESL A MRP1 ELEKGRILIDECDIGRFGLMDLRKVLGIIPQAPVLFS-GTVRFNLDPFSEHNDADLWESL BPT1 EPTEGKIIIDGIDISDIGLFDLRSHLAIIPQDAQAFE-GTVKTNLDPFNRYSEDELKRAV YCFI EASEGNIVIDNIAINEIGLYDLRHKLSIIPQDSQVFE-GTVRENIDPINQYTDEAIWRAL MRP1 ELSGGCIKIDGVRISDIGLADLRSKLTIIPQEPVLFS-GTVRSNLDPFNQYTEEQIWDAL YBT1 EPETGHIKIDNIDISGVDLQRLRRSITIIPQDPTLFS-GTIKTNLDPYDEFSDRQIFEAL P MRP1 NISQGKITVEGRDIRTYNRKGEDSIIGILAQSSFVFYNWNIRTFIDPYNNFTDDEIVHAL Assina u a ABC A MRP2 ERAHLKDTIRRNPLG---------------------LDAEVSEAGENFSVGQRQLLSLSR A MRP1 ERAHLKDTIRRNPLG---------------------LDAEVTEAGENFSVGQRQLLSLAR BPT1 EQAHLKPHLEKMLHSKPRGD----DSNEEDGNVNDILDVKINENGSNLSVGQRQLLCLAR YCFI ELSHLKEHVLSMSN--------------------DGLDAQLTEGGGNLSVGQRQLLCLAR MRP1 ERTHMKECIAQLPLK---------------------LESEVMENGDNFSVGERQLLCIAR YBT1 KRVNLISEEQLQQGATRETSNEASSTNSENVNKFLDLSSEISEGGSNLSQGQRQLMCLAR P MRP1 KLNGINLGKNDLYKYMHKQDMKS---NYKKIIQTSKVINQSNDNTILLTNDCIRYLSLVR Walke B D-loop H-loop A MRP2 ALLRRSKILVLDEATAAVDVRTDALIQKTIREEFKSCTMLIIAHRLNTIIDCDKILVLDS A MRP1 ALLRRSKILVLDEATAAVDVRTDVLIQKTIREEFKSCTMLIIAHRLNTIIDCDKVLVLDS BPT1 ALLNRSKILVLDEATASVDMETDKIIQDTIRREFKDRTILTIAHRIDTVLDSDKIIVLDQ YCFI AMLVPSKILVLDEATAAVDVETDKVVQETIRTAFKDRTILTIAHRLNTIMDSDRIIVLDN MRP1 ALLRHCKILILDEATAAMDTETDLLIQETIREAFADCTMLTIAHRLHTVLGSDRIMVLAQ YBT1 SLLRSPKIILLDEATASIDYSSDAKIQETIRKEFQGSTILTIAHRLRSVIDYDKILVMDA P MRP1 LYL/KYKIILIDEI/SVHDELNSFLIG/IIRNHFPNNTVLIISHHANTLSCCDYIRTFFQN _____________________________________________________________ NBD2 Figu a III.1 - Compa ação da sequência de a.a. dos NBDs de P MRP1 de P. alcipa um, com as seis p o eínas com o maio g au de semelhança ao ní el da es u u a p imá ia iden i icadas pelo BLAST. As sequências o am uncadas nos locais assinalados com aços oblíquos a e melho. O alinhamen o das sequências dos NBD (nucleo ide binding domain) 1 e 2 oi ge ado pelo Clus alW. Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 88 P MRP2 Walke A MmCFTR ----------SDENNVSFSHLCLVGNPVLKNINLNIEKGEMLAITGSTGSGKTSLLMLIL DnCFTR ----------NVDNSLFFSNFSLLGTPVLKDINFKIERGQLLAVAGSTGAGKTSLLMMIM MRP8 ----------PNSPDYTLS-----------GINLEIKPGSVVAVIGLTGSGKSSLIQAIL A MRP11 ----------QVS--------------------LRVPKGSFVAVIGEVGSGKTSLLNSLL YOR1 STNKAKRLDNMLKDRDGPEDLEKTSFRGFKDLNFDIKKGEFIMITGPIGTGKSSLLNAMA YBT1 ---------------------------------IEFKTGKLNVVIGPTGSGKTSLLMALL P MRP2 PKNKHFKDNIVINMKNCYFSSKNNDDYILKNINLTLKNNSVVIILGNVGSGKTIFFYSLL Q-loop MmCFTR GELEASEGIIKHSGR----------------VSFCSQFSWIMPGTIKENIIFGVSYDEYR DnCFTR GELEPSEGKIKHSGR----------------ISFCSQFSWIMPGTIKENIIFGVCYDEYR MRP8 GELKANSGQLQVNGS----------------LSYTSQESWLFSGTVRQNILFGQPMDSQR A MRP11 GEMRCVHGSILLNGS----------------VAYVPQVPWLLSGTVRENILFGKPFDSKR YOR1 GSMRKTDGKVEVNGD----------------LLMCG-YPWIQNASVRDNIIFGSPFNKEK YBT1 GEMYLLNGKVVVPALEPRQELIVDANGTTNSIAYCSQAAWLLNDTVKNNILFNSPFNEAR P MRP2 GQFKLSCGSFYLKNYIYKYMP----------ILYVPQFNWISLGTIRSMILFGNKYDESI Assina u a ABC Walke B MmCFTR YKSVVKACQLQQDITKFAEQDNTVLGEGGVTLSGGQRARISLARAVYKDADLYLLDSPFG DnCFTR YRSVIKACQLVEDISKFAEKDNTVLGEGGITLSGGQRARISLARAVYKDADLYLLDSPFG MRP8 YEEVVKKCALERDFDLLPLRDNTIVGERGATLSGGQKARISLARSVYRKASIYLLDDPLS A MRP11 YFETLSACALDVDISLMVGGDMACIGDKGLNLSGGQRARFALARAVYHGSDMYLLDDVLS YOR1 YDEVVRVCSLKADLDILPAGDMTEIGERGITLSGGQKARINLARSVYKKKDIYLFDDVLS YBT1 YKAVVEACGLKRDFEILKAGDLTEIGEKGITLSGGQKQRVSLARALYSNARHVLLDDCLS P MRP2 YYDVIVKSELFHDIISFKKKDMRYIS-DEHSLSKGQKARICLARALY/ISYLYLFDDLF/ D-loop H-loop MmCFTR YLDVFTEEQVFESCVCK------LMANKTRILVTSKMEHLRKADKILILHQGSSYFYGTF DnCFTR YLDVLTEKEIFESCVCK------LMANKTRILVTSKMEHLKKADKILILHEGSSYFYGTF MRP8 AVDASVARHLFDQCVRG------HLRGSTVVLVTHQEQFLPHVDQIVILANGQIKALGDY A MRP11 AVDSQVGCWILQRALLGP-----LLNKKTRVMCTHNIQAISCADMIVVMDKGKVNWSG-- YOR1 AVDSRVGKHIMDECLTG------MLANKTRILATHQLSLIERASRVIVLGTDGQVDIGTV YBT1 AVDSHTASWIYDNCITGP-----LMEDRTCILVSHNIALTLRNAELVVLLEDGRVKDQGD P MRP2 SLDPCISKDIFYNLFCDKEKIQHFKKNSSFILSISEIILNSFISSNCILNNMQYDVLIYK _________________________________________________________ NBD1 MmCFTR ------------------------------------DGNAVLENISFSISPGQRVGLLGR DnCFTR ------------------------------------GGNAILENISFSISPGQRVGLLGR MRP8 -----------------------------------AKAENVLKSLSFVIQPREKVGIVGR A MRP11 ------------------------------------TLPPALTQISFTIQGGMHVGVIGR YOR1 ------------------------------------GLPIVLKNLNLNIKSGEKIGICGR YBT1 ------------------------------------NLPRVIKNVSFSVDAQSKIGIVGR P MRP2 HIDINKIKYGICFERVFVSYKKKICVDRKNNKYEYVNEKSCLKNINIYALKNQKIGIVGK Walke A Q-loop MmCFTR TGSGKSTLLSAFLRMLNIKG-DIEIDGVSWNSVTLQEWRKAFGVITQK-VFIFSGTFRQN DnCFTR TGSGKSTLLSAFLRLLNTKG-EIQIDGVSWDSITLQEWRKAFGVIPQK-VFIFSGTFRKN MRP8 TGAGKSSLINALFRLSYTDG-SVLIDTRDTRQMGLHDLRRQISIIPQE-PVLFSGTMRYN A MRP11 TGAGKSSILNALFRLTPVCSGEILVDGKNISHLPIRELRSCLAVVPQS-PFLFQGSLRDN YOR1 TGAGKSTIMSALYRLNELTAGKILIDNVDISQLGLFDLRRKLAIIPQD-PVLFRGTIRKN YBT1 TGAGKSTIITALFRFLEPETGHIKIDNIDISGVDLQRLRRSITIIPQD-PTLFSGTIKTN P MRP2 SGAGKSTMILSILGLIGTTRGRITIEGQDIKTLTLDERKNMIGVLPQSSFVFFHWNIRTF Assina u a ABC Walke B D-loop H-loop MmCFTR GYVLSHGHKQLMCL--ARSVLSKAKIILLDEPSAHLDPITYQVIRRVLKQAFAGCTVILCEH DnCFTR GYVLSHGHKQLMCL--ARSVLSKAKILLLDEPSAHLDPITYQIIRRTLKQAFADCTVILCEH MRP8 GTNFSVGQRQLVCL--ARAILRENRILVMDEATANVDPQTDGLIQATIRSKFRDCTVLTIAH A MRP11 GCSFSVGQRQLLCL--ARALLKSSKILCLDECTANIDVHTASLLHNTISSECKGVTVITIAH YOR1 GSNFSLGERQLLAL--TRALVRQSKILILDEATSSVDYETDGKIQTRIVEEFGDCTILCIAH YBT1 GSNLSQGQRQLMCL--ARSLLRSPKIILLDEATASIDYSSDAKIQETIRKEFQGSTILTIAH P MRP2 /ISLSDECIRYLSLVRLFLNRHKYKLILIDEIP/TTDIKSFDYI---IRTFFQNTTVLIIAH ____________________________________________________________ NBD2 Figu a III.2 - Compa ação da sequência de a.a. dos NBDs de P MRP2 de P. alcipa um, com as seis p o eínas com o maio g au de semelhança ao ní el da es u u a p imá ia iden i icadas pelo BLAST. As sequências o am uncadas nos locais assinalados com aços oblíquos a e melho. O alinhamen o das sequências dos NBD (nucleo ide binding domain) 1 e 2 oi ge ado pelo Clus alW. Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 89 Nos anspo ado es MDR/TAP os dois NBDs são semelhan es en e si, enquan o que no os NBDs dos memb os da sub- amília MRP/CFTR são dis in os (Bo s & Genes , 2006). Es a ca ac e ís ica oi iden i icada nas sequências em es udo P MRP1 e P MRP2 e na sequência da Pgh1 de P. alcipa um. Os alo es de sco esul an es da compa ação das sequências aminoacídicas dos NBD1 e NBD2 de P MRP1 oi 17,0732 pa a P MRP2 14,0097 e pa a Pgh1 22,4176 (ANEXO 7). A p e isão do núme o e localização das hélices ansmemb ana es nas sequências de P MRP1 e P MRP2, oi e ec uada eco endo a 3 aplicações dis in as SOSUI, TMHMM e HMMTOP. Adicionámos à análise, p o eínas das quais exis e in o mação expe imen al ace ca da sua opologia memb ana , pa a pe mi i um e mo de compa ação (Tabela III.3). Os esul ados das aplicações di e em en e si, são no en an o o ien a i os pa a o desen ol imen o do nosso abalho, nomeadamen e na escolha dos agmen os a usa pos e io men e pa a a p odução de an ico pos pa a es udos de localização celula e Wes e n Blo ( e secção III.4.4 dos Resul ados). A aplicação HMMTOP pe mi e in oduzi condições como po ex. o NBD da p o eína de e e localização in acelula (ou luminal). Es a condição oi impos a nes a análise pe mi indo p e e a localização da po ção N-p oximal da p o eína, que no caso da sub- amília MDR/TAP é in a-celula e no caso da MRP/CFTR é na maio pa e dos casos ex a- celula o que oi conco dan e com a nossa análise pa a P MRP1 e P MRP2 (Tabela III.3). Tabela III.3 - P e isão do núme o e o ien ação das hélices ansmemb ana es, nas sequências de P MRP1 e P MRP2. (TM – hélice ansmemb ana ;* p o eínas de H. sapiens). SOSUI TMHMM HMMTOP P o eína TM TM Ex emidade N-p oximal TM Ex emidade N-p oximal P MRP1 13 11 Ex e na 13 Ex e na P MRP2 11 11 Ex e na 9 Ex e na MRP1* 17 16 Ex e na 17 Ex e na Pgh1 10 11 In e na 11 In e na MDR1* 11 10 In e na 12 In e na III.1.3 - Sequenciação dos genes p m p1 e p m p2 em P. alcipa um Os genes p m p1 e p m p2 o am sequenciados a pa i de cDNA dos clones 3D7 e Dd2. Todos os agmen os esul an es das ampli icações po PCR o am pu i icados e Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 90 isualizados em gel de aga ose (2%) an es de se em en iados pa a sequenciação. O esul ado des e p ocedimen o es á exempli icado na Figu a III.3. Figu a III.3 - Resul ado da ampli icação po PCR a pa i de cDNA, após pu i icação, dos agmen os dos genes p m p1 e p m p2 a sequencia . III.1.4 - Análise de sequências As sequências dos di e en es agmen os sequenciados, o am alinhadas e compa adas com a sequência das ORFs PFA0590w (p m p1) e PFL1410c (p m p2) co esponden es ao clone 3D7, deposi adas em www.plasmodb.o g . p m p1 (PFA0590w) A ORF co esponden e a p m p1 possui apenas um exão de 5 469 pa es de bases. A composição em AT da ORF é de ap oximadamen e 78%, pe cen agem p óxima da composição genómica em bases do P. alcipa um (82%) (Pollack e al., 1982). A egião a mon an e (ups ea m) do codão de iniciação (ATG), ap esen a múl iplos codões STOP em odas as g elhas de lei u a, o que indica que es a egião mui o p o a elmen e não é aduzida e que a ORF ep esen a um gene. Es e codi ica uma p o eína ABC de 1822 a.a, com uma massa molecula p e is a de 214.5 kDa. Fo am iden i icadas qua o al e ações pon uais (apenas um nucleó ido) en e as sequências do gene p m p1 dos clones 3D7 e Dd2, os esul ados encon am-se na Tabela III.4. As 4 al e ações esul am em al e ação do a.a. codi icado (ANEXO 8). Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 91 Tabela III.4 - Al e ações iden i icadas na sequência do gene p m p1 nos clones 3D7 e Dd2. a.a aminoácido. p m p1 3D7 Dd2 nucleó ido a.a nucleó ido a.a 571c 191H 571 191Y 1309 437S 1309g 437A 2626a 876V 2626g 876I al e ações pon uais 4167 1390I 4167a 1390F p m p2 (PFL1410c) A ORF co esponden e a p m p2, possui apenas um exão de 6331bp em 3D7 e 6525 bp em Dd2 a sua composição em AT (76,4% em 3D7 e 76,4% em Dd2) é ambém p óxima da composição genómica em bases do P. alcipa um (82%) (Pollack e al., 1982). A egião a mon an e (ups ea m) do codão de iniciação (ATG), ap esen a múl iplos codões STOP em odas as g elhas de lei u a, o que indica que es a egião mui o p o a elmen e não é aduzida e que as ORFs ep esen am um gene. Es as codi icam p o eínas ABC de 1109 a.a, no clone 3D7 e 2133 a.a. no clone Dd2, com uma massa molecula p e is a53 de 248,33 kDa e 251,37 kDa, espec i amen e. Fo am iden i icadas po sequenciação, na sequência do gene p m p2 do clone 3D7 e Dd2, oi o al e ações pon uais (apenas um nucleó ido), esul ados na Tabela III.5 e inse ções/delecções esul ados na Tabela III.5. Duas al e ações pon uais são sinónimas, não se aduzindo em al e ação do a.a. e as es an es seis al e am o a.a. codi icado (ANEXO 9). 53 Massa molecula calculada em h p://www.ualbe a.ca/~s o ha d/ja asc ip / Iden i icação e clonagem de genes codi ican es de anspo ado es ABC _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 92 Tabela III.5 - Al e ações pon uais iden i icadas na sequência do gene p m p2 nos clones 3D7 e Dd2. a.a. aminoácido p m p2 3D7 Dd2 al e ação nucleó ido a.a nucleó ido a.a a → g D →G 1892a 631D 1910g 637G a → g N → D 1936a 646N 1954g 652D a → K → I 2141a 714K 2231 744I a → g T → T 2940a 980T* 3012g 1004T* → c D → D 3414 1138D* 3597c 1168D* g → a D → N 3550g 1184D 3640a 1214N → a S → T 4579 1527S 4654a 1551T c → a L → I 4591c 1531L 4666a 1556I As inse ções/delecções não esul am em al e ação da g elha de lei u a e co espondem a a iações do núme o de epe ições de de e minada sequência (ANEXO 10). A sequência, o núme o de a.a. e o núme o de ezes que cada sequência se epe e no gene p m p2 nos clones 3D7 e Dd2, encon am-se desc i as na Tabela III.6. Tabela III.6 - Núme o de epe ições de cada sequência inse ida/delec ada na sequência do gene p m p2 nos clones 3D7 e Dd2. a.a. aminoácido em que se encon a a al e ação na sequência. № núme o de epe ições da sequência. p m p2 3D7 Dd2 Sequência epe ida nucleó ido a.a. № nucleó ido a.a. № NDENDQ 779 260 1 779 260 2 NDYVDDYV 1947 649 1 1965 655 4 DNNN 3591 1197 9 3663 1221 8 Po de inição, um polimo ismo co esponde à oco ência simul ânea de a iações alélicas nos genomas de uma dada população (Lewin, 1989). Conside ando os genomas dos clones 3D7 e Dd2 como pe encen es à população de P. alcipa um, u iliza emos o e mo polimo ismo pa a designa as di e enças de ec adas nas sequências dos genes em es udo en e os dois clones. Associação dos polimo ismos e espos a in i o a an imalá icos _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 93 III.2 - Es udo da associação dos polimo ismos dos genes p γ-gcs, p md 1, p m p1 e p m p2 e a espos a in i o de isolados de pacien es in ec ados com Plasmodium alcipa um aos á macos clo oquina, me loquina, amodiaquina e quinino. Fo am es udadas amos as de sangue de pacien es com malá ia po P. alcipa um, ecolhidas em República Democ á ica de São Tomé e P íncipe (STP), República de Angola e Tailândia. III.2.1 - Ca ac e ização eno ípica dos isolados de Plasmodium alcipa um ecolhidos na STP, Angola e Tailândia Os esul ados ela i os à espos a in i o a an imalá icos, cons i uem pa e de um es udo ala gado que incluiu a análise da espos a in i o a an imalá icos, e a sua elação com ou os ma cado es molecula es de esis ência (p c e p md 1)54. Os es es de suscep ibilidade in i o à clo oquina, me loquina, quinino e amodiaquina ealizados aos isolados colhidos nas egiões em es udo, Angola, São Tomé e P íncipe e Tailândia, pe mi i am iden i ica os isolados sensí eis e esis en es. A p e alência de esis ência in i o a cada á maco em cada egião, encon a-se desc i a na Tabela III.7. Tabela III.7 - P e alência de isolados esis en es in i o aos di e en es an imalá icos em Angola, Tailândia e STP. CQ – clo oquina, MEF– me loquina, QN – quinino, AMQ – amodiaquina. CQ MEF QN AMQ Angola 96% (65/68) 34% (14/41) 33% (14/43) - Tailândia 96% (50/52) 62% (32/52) 0% 58% (18/31) STP* 92% (60/65) - - - *Em STP, apenas oi es ado um á maco, po di iculdades écnicas, e e en es à p epa ação dos á macos. Angola 54 (Lopes e al., 2002b; Lopes e al., 2002a) e a disse ação pa a ob enção do g au de Dou o da Dou o a Dino a Ma ia da Sil a Lopes com o í ulo “Resis ência a An imalá icos em Plasmodium alcipa um: en ol imen o dos genes p c e p md 1”, Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, Uni e sidade No a de Lisboa, Lisboa. Associação dos polimo ismos e espos a in i o a an imalá icos _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 100 III.2.3 - Associação das al e ações pon uais e inse ções/delecções dos genes p m p1, p m p2 e p γ-gcs com o enó ipo de amos as de P. alcipa um p o enien es das egiões geog á icas di e en es Os esul ados do es udo da associação das al e ações pon uais e inse ções/delecções dos genes p m p1, p m p2 e p γ-gcs com o enó ipo de isolados de P. alcipa um p o enien es das egiões geog á icas di e en es es ão suma iados na Tabela III.9. Tabela III.9 - Associação das equências das mu ações pon uais dos genes p m p1 e p m p2 e das inse ções/delecções dos genes p m p2 e p γ-gcs com a espos a in i o a di e en es á macos em isolados de P. alcipa um p o enien es da Tailândia, Angola e STP. CQ - clo oquina, MEF - me loquina, AMQ - amodiaquina QN – quinino. n – núme o de isolados es udados. Al e ações Pon uais Inse ções/Delecções p m p1 p m p2 p γ-gcs Fá maco H191Y S347A I1390F D631G 779* 1947* 3591* 1542 CQ (n=47) 1 1 1 1 1 1 1 1 MEF (n=47) 0,013 0,047 1 0,340 0,001 0,517 <0,001 1 QN (n=47) 1 1 1 1 1 1 1 1 Tailândia AMQ (n=10) 1 0,799 1 1 1 1 1 1 CQ (n=44) 1 1 0,533 0,570 1 0,248 0,599 1 MEF (n=39) 1 1 1 1 1 0,511 0,525 1 Angola QN (n=40) 1 1 0,527 1 0,299 0,156 0,315 1 STP CQ (n=35) 0,256 1 0,127 1 1 0,355 1 1 * e e en e à sequência do gene p m p2 no clone 3D7 Nos esul ados ob idos na análise global das 3 á eas endémicas es udadas, oi encon ada associação en e a espos a dos isolados p o enien es da Tailândia à me loquina e as mu ações pon uais nos codões 191 (H191Y) e 347 (S347A) de p m p1 Associação dos polimo ismos e espos a in i o a an imalá icos _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 101 com alo es de p=0,013 e P=0,047 espec i amen e. Nos mesmos isolados e no que espei a ao gene p m p2 oi ambém encon ada associação en e a esis ência in i o à me loquina e a p esença de apenas 1 epe ição da sequência NDQNEQ a ní el do codão 779 (p=0,001) e de 8 epe ições da sequência DNNN a ní el do codão 3591 (p<0,001). III.2.4 - Es udo da associação do núme o de cópias dos genes p m p1, p m p2 e p md 1 com a suscep ibilidade in i o de isolados de P. alcipa um a an imalá icos a) Iden i icação do núme o de cópias dos genes p m p1, p m p2 e p md 1 A a aliação da especi icidade das eacções de PCR oi e ec uada a a és da ampli icação dos agmen os dos genes p m p1, p m p2, p md 1 e p β-ac inaI, u ilizando os p ime s especí icos pa a cada um deles. Es a ampli icação o iginou agmen os únicos com o amanho espe ado, quando isualizados em gel de aga ose (Figu a III.7 A). A Figu a III.7 B exempli ica as cu as ob idas po RT-PCR pa a o gene p md 1 nos os clones 3D7, Dd2 e pa a um dos isolados p o enien es da Tailândia. Fo am ealizados ensaios independen es, pa a a de e minação do núme o de cópias de cada gene em cada isolado. Figu a III.7 - Núme o de cópias dos genes p md 1, p m p1 e p m p2, de e minado po RT-PCR usando SYBR G een. A o og a ia do gel de aga ose 3% co esponden e à elec o o ese dos p odu os dos genes p m p1, p m p2, p md 1 e p β-ac inaI ampli icados po RT-PCR. B cu as de RT-PCR exempli ica i as dos esul ados ob idos pa a a de e minação do núme o de cópias de p md 1 nos clones 3D7, Dd2 e em um dos isolados p o enien es da Tailândia. Associação dos polimo ismos e espos a in i o a an imalá icos _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 102 A aliação da aplicabilidade do mé odo dos CTs compa a i os (2-∆∆C ) pa a a quan i icação ela i a dos genes p m p1, p m p2 e p md 1. Os alo es das e iciências das eacções E, calculados pa a a ampli icação de agmen os dos genes em es udo, encon am-se acima de 90%. O módulo dos alo es do decli e das ec as de co elação ob idos o am de 0,013 ± 0,007, 0,040 ± 0,001 e 0,020 ± 0,005 pa a p m p1, p m p2 e p md 1 espec i amen e (Tabela III.10), encon am-se den o do in e alo de 0,0 a 0,1, sendo assim álido u iliza o gene p β -ac inaI como con olo in e no, pa a no maliza os esul ados da quan i icação ela i a dos e e idos genes pelo mé odo 2 -∆∆C . Tabela III.10 - Pa âme os da ampli icação po PCR em empo eal e e en es à alidação da u ilização do mé odo 2-∆∆C pa a a quan i icação ela i a dos genes p m p1, p m p2 e p md 1 endo como con olo in e no o gene p β-ac inaI. E= (10(-1/m))- 1; * modulo do alo do decli e (m) da ec a de eg essão, associada à ep esen ação g á ica dos alo es ∆CT (gene al o/gene con olo in e no) s diluições da amos a. E iciência da eacção de PCR E iciência ela i a Gene Decli e (-3,60<m<-3,10) E Decli e (0<m<0,1) p m p1 -3,501 ± 0,152 93% 0,013 ± 0,007 p m p2 -3,440 ± 0,038 95% 0,040 ± 0,001 p md 1 -3,435 ± 0,110 96% 0,020 ± 0,005 p β-ac inaI -3,370 ± 0,010 98% - b) Associação do núme o de cópias dos genes p m p1, p m p2 e p md 1 com a suscep ibilidade de isolados de P. alcipa um à me loquina, amodiaquina, quinino e clo oquina Nos clones 3D7 e Dd2 bem como nos 30 isolados incluídos no es udo da associação do núme o de cópias dos genes com o enó ipo in i o, odos possuíam apenas uma cópia dos genes p m p1 e p m p2. Pa a o gene p md 1 o am de ec ados di e en es núme os de cópias do gene. Os esul ados encon am-se nos g á icos da Figu a III.9 e ANEXO 14. A linha descon inua dos g á icos da Figu a III.8 pe mi e sepa a isualmen e, os isolados em que oi de ec ada mais de uma cópia (Nº de cópias ≥1,5 indica mais de uma cópia) do gene. Na gene alidade e no que espei a ao gene p md 1, 9 (30%) isolados Associação dos polimo ismos e espos a in i o a an imalá icos _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 103 inham uma cópia, 17 (57%) inham en e 2 a 4 cópias e 4 (13%) isolados inham en e 5 a 6 cópias. 1,50 1 2 3 4 5 6 71,5 p md 1 p m p1 p m p2 A Nº de cópias 1,5012345671,5 3D7 Dd2 MEF S MEF R AQ S AQ R MEF S MEF R QN S QN R Tailândia Angola Clones B Nº de cópias Figu a III.8 - Núme o de cópias dos genes p m p1, p m p2 e p md 1 nos isolados p o enien es da Tailândia e de Angola. e melho esis en es; e de sensí el; AQ – amodiaquina; MEF – me loquina; QN – quinino; S – sensí el; R – esis en e. Angola Nos isolados p o enien es de Angola 8 (53%) inham apenas uma cópia de P md 1. Qua o (26% ) inham en e 2 a 4 cópias e 3 (20%) inham en e 5 a 6 cópias. Da análise es a ís ica ealizada eco endo ao es e de Fishe (www.physics.csbsju.edu/s a s/ ishe . o m), Associação dos polimo ismos e espos a in i o a an imalá icos _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 104 não se de ec ou associação en e o núme o de cópias do gene p md 1 e a espos a aos á macos me loquina, quinino nem clo oquina, nes as amos a. Tailândia Nos isolados p o enien es da Tailândia apenas um inha uma cópia de p md 1, 13 (87%) inham en e 2 a 4 cópias e um en e 5 e 6 cópias do gene. Foi de ec ada associação signi ica i a (p=0,007) en e a p esença de 2 ou mais cópias do gene p md 1 e a esis ência in i o à me loquina. O mesmo não se e i icou pa a os es an es á macos es ados. Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 105 III.3 - Exp essão dos anspo ado es p m p1 e p m p2 e de genes codi ican es de enzimas en ol idas na espos a ao s ess oxida i o ao longo do ciclo in a- e i oci á io de Plasmodium alcipa um na p esença e ausência de á maco nos clones 3D7 e Dd2 Es a pa e do abalho e e como objec i o es uda o pe il de exp essão dos genes p m p1 e p m p2 que codi icam pa a p o eínas do ipo MRP (cuja ca ac e ização cons i uiu um dos objec i os des e abalho) e de genes codi ican es de enzimas en ol idas na espos a ao s ess oxida i o em P. alcipa um, lis adas seguidamen e: p γ- gcs (gama-glu amilcis eina sin e ase), p g (glu a ião educ ase), p g6pd (glucose-6- os a o desid ogenase), p gpx (glu a ião pe oxidase), p gs (glu a ião S- ans e ase), p xR ( io edoxina educ ase), p 2-CysPx ( io edoxina pe oxidase 1) e p Fe-sod (Fe- supe oxidismu ase). Es a ase do abalho e e como objec i os es uda o pe il de exp essão dos 10 genes e e idos, ao longo do ciclo in a-e i oci á io de P. alcipa um. Iden i ica e en uais di e enças ao ní el da exp essão dos mesmos genes, compa ando pa asi as sensí eis (3D7) e pa asi as com suscep ibilidade diminuída Dd257 na p esença e ausência de clo oquina (em concen ação co esponden e ao IC50). Foi ambém a aliada a al e ação da exp essão de p m p1 e p m p2 na ase de o ozoí o madu o na p esença e ausência de me loquina (em concen ação co esponden e ao IC50). III.3.1 - De e minação do alo de IC50 ela i o aos clones 3D7 e Dd2 em espos a à clo oquina e me loquina Tal como desc i o no capí ulo ela i o aos ma e iais e mé odos, pa a a ealização dos es udos de exp essão dos di e en es genes, o am u ilizados os clones 3D7 e Dd2, seleccionados de aco do com o seu pe il de suscep ibilidade aos á macos clo oquina e me loquina ( e Tabela II.2). Pa a os dois clones o am de e minados os alo es dos IC50, is o é, a dose de á maco que inibe o desen ol imen o de 50% do o al de pa asi as. 57 Du an e a ap esen ação e análise dos nossos esul ados, pa a simpli ica a linguagem e e i emos o clone Dd2 como “ esis en e”. Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 106 Os alo es, ep esen ados nos g á icos da Figu a III.9, são esul an es da média de pelo menos dois ensaios de mic o- es es (seguindo a me odologia MARK III, OMS) pa a cada á maco e clone. Pa a cada ensaio o am e ec uadas lei u as independen es. Figu a III.9 - Cu as de dose- espos a esul an es dos es es de suscep ibilidade pa a a de e minação dos IC50 dos clones 3D7 e Dd2 pa a a clo oquina. Es ão ep esen ados os alo es, em pe cen agem, de pa asi as sob e i en es, ela i os a cada clone e á maco. A linha a p e o co esponde à cu a de eg essão não linea a pa i da qual o am es imados os alo es de IC50 espec i os. Os alo es de IC50 de e minados pa a cada clone o am: clo oquina Dd2 - 200 nM com in e alo de a iação de 168,5 a 240,7 nM, pa a α=0,05 e 2 = 0,99; clo oquina - 3D7 14 nM com in e alo de a iação pa a α=0,05 de 12,4 a 16,3 nM e 2 = 0,99. Pa a o p esen e abalho, conside a emos Dd2 como um clone esis en e à clo oquina, dado que ap esen a um IC50 mui o supe io a 3D7. III.3.2 - Op imização das condições de PCR em empo eal pa a os es udos de exp essão génica em P. alcipa um a) A aliação da especi icidade das eacções A a aliação da especi icidade das eacções de PCR oi e ec uada a a és da ampli icação dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-CysPx p g6pd, p m p1, p m p2 e do gene da sub-unidade ibossomal 18S (con olo in e no) de P. Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 107 alcipa um u ilizando os p ime s especí icos pa a cada um deles. Es a ampli icação o iginou agmen os únicos com o amanho espe ado, quando isualizados em gel de aga ose (Figu a III.10). Figu a III.10 - Fo og a ia do gel co esponden e à elec o o ese dos p odu os dos 10 genes ampli icados po PCR em empo eal. Gel aga ose (3%). Poços 1,9, e 14 ma cado de peso molecula ; 2 p gpx, 3 p g6pd, 4 p 2-CysPx, 5 p g , 6 p m p2, 7 p m p1, 8 p Fe-sod, 10 p γ-gcs, 11 p gs , 12 p xR e 13 p 18S. bp-pa es de bases. b) A aliação da aplicabilidade do mé odo dos CTs compa a i os (2-∆∆C ) pa a a quan i icação ela i a da exp essão dos di e en es genes Pa a a quan i icação ela i a da exp essão dos di e en es genes, oi escolhido o mé odo de calculo 2-∆∆C ( e II.3.8.1 Ma e ial e Mé odos), a a aliação da aplicabilidade do mé odo oi ealizada de o ma idên ica ao desc i o an e io men e na página 102 dos esul ados. Os esul ados ob idos ela i amen e ao es udo da e iciência das eacções de ampli icação dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-CysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2 e à u ilização do gene p RNA18S, como con olo in e no, encon am- se na Tabela III.11. Os alo es das e iciências das eacções E, calculados pa a a ampli icação de agmen os dos genes em es udo, encon am-se acima de 90% (Tabela IIII.11), assim a u ilização des as condições de PCR pa a a ealização dos es udos de exp essão é álida. Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 108 Tabela III.11 - Pa âme os da ampli icação po PCR em empo eal e e en es à alidação da u ilização do mé odo 2-∆∆C pa a o es udo da exp essão dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-CysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2, endo como con olo in e no o gene p RNA18S. E iciência da eacção de PCR Gene Decli e (-3,60 ≥ m ≤ -3,10) E (E= (10(-1/m))-1) p Fe-sod* -3,187 ± 0,0983 103 (%) p γ-gcs* -3,128 ± 0,1093 104 (%) p g * -3,440 ± 0,1657 98 (%) p gs * -3,310 ± 0,1208 100 (%) p gpx* -3,375 ± 0,2307 99(%) p xR* -3,686 ± 0,1610 93 (%) p 2-CysPx* -3,161 ± 0,1104 103 (%) p g6pd* -3,123 ± 0,1857 104 (%) p m p1 -3,408 ± 0,030 97% p m p2 -3,418 ± 0,121 96% p RNA18S* -3,361 ± 0,025 98% * Os alo es de e iciência e e en es à ampli icação des es genes o am e i ados de Bus aman e L., 2005, ese de Dou o amen o ealizada no Labo a ó io de Bioquímica e Biologia Molecula IV da Uni e sidade Complu ense de Mad id. III.3.3 - A aliação do desen ol imen o e sinc onização das mic o-cul u as de pa asi as dos clones 3D7 e Dd2, ao longo do ciclo in a-e i oci á io de P. alcipa um Tendo-se e ec uado a op imização das eacções e alidado o mé odo de a amen o dos esul ados, e ec uou-se o es udo do pe il de exp essão dos 10 genes ao longo do ciclo in a-e i oci á io, a pa i de cul u as in i o de P. alcipa um (clones 3D7 e Dd2) sinc onizadas (ANEXO 15). P ocedemos ambém à a aliação do pe il de exp essão dos mesmos genes, nos e e idos clones, na p esença de clo oquina (ANEXO 15), de o ma a a alia uma possí el al e ação nos ní eis de exp essão, induzida pela p esença do an imalá ico. A Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 109 sinc onização man e e-se ela i amen e cons an e du an e os pe íodos em que es es ensaios deco e am (mais de 85% de pa asi as em sinc onia, ou seja, em idên ico es adio de desen ol imen o). No deco e do p esen e abalho conside a emos que du an e o ciclo in a-e i oci á io do pa asi a, os me ozoí os so em di e enciação o iginando es adios de desen ol imen o: anel (0-22 h após in asão), o ozoí o (22-34 h após in asão) e esquizon e (34-46 h após in asão). A pa i das cul u as in i o dos clones 3D7 e Dd2 sinc onizadas, o am e ec uadas ecolhas de ma e ial pa a ex acção de RNA, de duas em duas ho as, das 0h às 52h. Os pa asi as o am cul i ados em pa alelo na p esença e ausência de clo oquina. A obse ação po mic oscopia óp ica, dos es egaços sanguíneos ealizados no momen o de cada colhei a, pe mi iu a alia o g au de sinc onização dos es adios do pa asi a. A Figu a III.11 ilus a o g au de desen ol imen o dos pa asi as em cul u a, em cada um dos 27 momen os de colhei a (0h às 52h). Figu a III.11 - Moni o ização da sinc onia das cul u as in i o de P. alcipa um. As o og a ias ep esen am um dos momen o de colhei a no início e inal de cada es adio. T o o. o ozoí o; Esqui. Esquizon e; Me o. me ozoí o; Colo ação com DAPI e obse ação po mic oscopia óp ica de luo escência (Olympus BX41) com luz ul a iole a ( il o U-RFL-T2-200) e com objec i a de ime são (ampliação 100x). 8 / 12h 10 / 14h Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 116 1,5 p Fe-sod A T E M 1 2 4 1,5 p=0,018 2=0,85 N old 1,5 p γ -gcs A T E M 1 2 4 1,5 p=0,009 2=0,93 1,5 p g A T E M 1 2 1,5 p<0,0001 2=0,94 N old 1,5 p gs A T E M 1 2 4 1,5 p=0,013 2=0,82 1,5 p gpx A T E M 1 2 4 1,5 p<0,0001 2=0,99 N old 1,5 p xR A T E M 1 2 4 8 1,5 p=0,001 2=0,98 1,5 p 2-CysPx A T E M 1 2 4 8 1,5 p<0,0001 2=0,88 N old 1,5 p g6pd A T E M 1 2 1,5 p=0,92 2=0,06 1,5 p m p1 A T E M 0.5 1 2 4 8 1,5 p<0,0001 2=0,98 es adios N old 1,5 p m p2 A T E M 1 2 4 1,5 p=0,001 2=0,92 es adios Dd2 Figu a III.15 - Al e ação da ampli ude de exp essão dos di e en es genes en e es adios in a-e i oci á ios do clone Dd2 de P. alcipa um. N old exp essão de mRNA (ampli ude de a iação da exp essão génica) em escala semi-loga í mica. Anéis A 4 e 6h após in asão, o ozoí os T 28 e 30h, esquizon es E 38 e 40h e me ozoí os M 44 e 46h. A linha acejada indica a a iação de exp essão de 1,5 ezes. Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 117 Os pa âme os da ANOVA (p e 2) o am ambém calculados endo em con a os 27 pon os do ciclo in a-e i oci á io pa a cada gene e em cada clone (ANEXO 16). Os alo es o am conco dan es (na gene alidade) com os pa âme os de e minados na análise en e es adios, excep o nos genes p Fe-sod e p γ-gcs no clone Dd2 (p Fe-sod p=0,427, 2= 0,34 e p γ-gcs p=0,771, 2=0,269). Es as excepções são conco dan es com os maio es alo es de p (p Fe-sod p=0,043 e p γ-gcs p=0,007) e meno es alo es de 2 (p Fe-sod 2= 0,84 e p γ-gcs 2=0,94) de e minados en e es adios (Figu a III.14 e Figu a III.15). No que se e e e ao gene p g6pd, os alo es de e minados endo em con a os 27 pon os de colhei a, ge a am alo es de p=0,0272 ( 2=0,4729) den o dos limi es dos c i é ios pa a conside a o gene egulado, mas mais ele ados do que pa a os es an es genes. III.3.4.1.2 - Co elação dos pe is de exp essão de cada gene em ambos os clones 3D7 e Dd2 ao longo do ciclo in a-e i oci á io de P. alcipa um Foi de e minado o coe icien e de co elação de Pea son em cada pon o de colhei a pa a cada gene em ambos os clones 3D7 e Dd2, pe mi indo a alia de o ma indi ec a o g au de sinc onia en e os ciclos de ambos os clones. Is o, pe mi iu que as medições e ec uadas ossem ealizadas no mesmo es adio do pa asi a em ambos os ciclos. Bem como es abelece compa ações com dados de ou os au o es. Os alo es des a co elação en e os clones 3D7 e Dd2 encon am-se na Tabela III.12 e os alo es da co elação com ou os au o es no ANEXO 17. Pa a amos as de dimensões e condições expe imen ais compa á eis, assumimos que a nossa amos a segue uma dis ibuição ap oximada à Gaussiana. Dado que não assumimos p e iamen e qual o sen ido (posi i a ou nega i a) da co elação, usamos o es e wo- ail P alue pa a de e mina o alo do coe icien e de Pea son e P. A co elação en e os pe is de exp essão ob idos pa a os clones 3D7 e Dd2, oi acei á el pa a odos os genes excep o pa a p γ-gcs e p 2-CysPx. Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 118 Tabela III.12 - Co elação en e os pe is de exp essão ob idos pa a os clones 3D7 e Dd2 dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o e anspo ado es (p m p1 e p m p2). + co elação posi i a; a. c. ausência de co elação. 3D7 / Dd2 P* Signi icância (α=0,05) p Fe-sod 0,0263 + p γ-gcs 0,5919 a. c. p g 0,0024 + p gs 0,0290 + p gpx 0,0081 + p xR 0,0001 + p 2-CysPx 0,9393 a. c. p g6pd 0,0032 + p m p1 0,0001 + p m p2 0,0001 + *Pa a alo es de P< 0,05 conside amos exis ência de co elação pa a α=0,05 Na gene alidade exis iu co elação posi i a en e os pe is de exp essão dos dois clones 3D7 e Dd2, no que espei a à abundância ela i a de mRNA po PCR em empo eal. Is o con ibui pa a o e o ço da con iança de que as de e minações e lec em condições biológicas. III.3.4.2 - Al e ação da exp essão dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o e anspo ado es (p m p1 e p m p2) ao longo do ciclo in a-e i oci á io nos clones 3D7 e Dd2 na p esença de clo oquina Es a ase do abalho e e como objec i os iden i ica e en uais di e enças ao ní el da exp essão dos genes de espos a ao s ess oxida i o e das p o á eis bombas de e luxo codi icadas pelos genes p m p1 e p m p2, compa ando pa asi as sensí eis (3D7 CQS) e esis en es (Dd2 CQR) na p esença (em concen ação co esponden e ao IC50 de cada clone) e ausência de CQ. A di e ença de exp essão dos genes em cul u a sem CQ e na p esença de CQ é dada pelo alo de N old (de e minado segundo a equação N=2−(C ,al o− C , con olo in e no)χ− (C ,al o− C , con olo in e no)γ onde χ co esponde à amos a a ada com CQ (IC50) e γ à amos a não a ada), nos clones 3D7 e Dd2. N old co esponde ao núme o de ezes que de e minado gene se exp essa mais ou menos, na amos a a ada do que Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 119 na amos a não a ada com a CQ. Pa a o p esen e es udo conside amos que exis iu di e ença de exp essão quando o alo de N old é supe io a 1,5. Os esul ados dos alo es de N old e os espec i os des ios pad ão, encon am-se na Figu a III 16 e Figu a III 17 Pa a os 10 genes em es udo e em ambos os clones, oco eu aumen o signi ica i o da exp essão na p esença de CQ. Sendo que a ampli ude de a iação de exp essão dos genes é signi ica i amen e mais ele ada no clone 3D7 (CQS) do que no Dd2 (CQR). Não oi e i icada em ge al diminuição signi ica i a da exp essão dos genes em p esença de CQ. A a iação da ampli ude de exp essão induzida pela CQ em ambos os clones pa ece segui 4 pad ões dis in os; con ínua (CT), descon ínua (DT), di ásica (DF) e i ásica (TF). Seguindo es e pad ão ag upamos os genes da seguin e o ma: CT - p gpx e p m p2; DT - p xR; DF - p Fe-sod, p gs , p 2-cysPx e p m p1; TF - p γ-gcs, p g , p g6pd. No clone Dd2, p g6pd compo a-se como con ínua pois apesa de se em obse á eis 3 ases dis in as (em que a exp essão aumen a), a ampli ude de a iação não a inge o ní el de signi icância p e iamen e es abelecido de 1,5 ezes. a) p Fe-sod Pa a o clone 3D7 (CQS) os alo es de N old indicam um aumen o da exp essão de p Fe- sod na ase de anel, o qual se man ém du an e a ase de o ozoí o, dec escendo à medida que os o ozoí os passam ao es adio de esquizon e, onde ob i emos os alo es mais baixos de al e ação de exp essão des e gene, na p esença de CQ. A exp essão aumen a de no o à medida que o pa asi a passa pa a o es adio de me ozoí o (Figu a III.16). Os alo es de exp essão a iam en e 1,6 e ≈ 9 ezes mais na p esença de CQ. Pelo con á io no clone Dd2 (CQR), não oi de ec ada al e ação signi ica i a da exp essão de p Fe-sod em espos a à p esença de CQ Figu a III.17. Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 120 1,5 p Fesod 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 8 1,5 H s N old 1,5 p γ -GCS 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 8 1,5 H s N old 0,6 1,5 p g 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 H s N old 1,5 p gs 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 1,5 h s N old 1,5 p gpx 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 8 1,5 TP N old 0,6 1,5 p xR 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.125 0.25 0.5 1 2 4 0,6 1,5 H s N old 0,6 1,5 p 2-CysPx 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 H s N old 1,5 p g6pd 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 8 16 1,5 TP N old 0,6 1,5 p m p1 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 8 0,6 1,5 H s N old 1,5 p m p2 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 8 1,5 H s N old 3D7 Figu a III.16 - Al e ação da exp essão dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in a-e i oci á io do clone 3D7 na p esença de clo oquina. No eixo dos Y es á ep esen ado em escala semi-loga í mica o alo de N old ( a iação da exp essão génica) ao longo do ciclo na p esença de CQ. O alo 1 indica ausência de al e ação da exp essão po e ei o da CQ. Os alo es o a das linhas a acejado (en e 0,6 e 1,5) indicam aumen o ou diminuição da exp essão. H s ep esen a a ho a após in asão. Anel (0-22 h), T o o. o ozoí o (22-34 h), Esqui. esquizon e (34-42h). Me o. me ozoí o (44-46h). Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 121 0,6 1,5 p Fe-SOD 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 0,6 1,5 H s N old 1,5 p γ -GCS 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 1,5 H s N old 0,6 1,5 p GR 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 H s N old 0,6 1,5 p GST 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 0,6 1,5 H s N old 0,6 1,5 p GPX 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 0,6 1,5 H s N old 0,6 1,5 p T xR 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 8 0,6 1,5 H s N old 1,5 p 2-CysPx 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 1,5 H s N old 0,6 1,5 p G6PD 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 H s N old 0,6 1,5 p MRP1 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.25 0.5 1 2 4 0,6 1,5 H s N old 0,6 1,5 p MRP2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 H s N old Dd2 Figu a III.17 - Al e ação da exp essão dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in a-e i oci á io do clone Dd2 na p esença de clo oquina. No eixo dos Y es á ep esen ado em escala semi-loga í mica o alo de N old ( a iação da exp essão génica) ao longo do ciclo na p esença de CQ. O alo 1 indica ausência de al e ação da exp essão po e ei o da CQ. Os alo es o a das linhas a acejado (en e 0,6 e 1,5) indicam aumen o ou diminuição da exp essão. H s ep esen a a ho a após in asão. Anel (0-22 h), T o o. o ozoí o (22-34 h), Esqui. esquizon e (34-42h). Me o. me ozoí o (44-46h). Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 122 b) p γ-gcs Em ambos os clones os alo es de N old indicam um aumen o da exp essão de p γ-gcs ao longo de odo o ciclo in a-e i oci á io, excep o na ase de anel em Dd2 (Figu a III.17). Embo a a endência seja a mesma, de aumen o de exp essão na p esença de á maco, a ampli ude de a iação é maio em 3D7 (≈ 4 ezes) (Figu a III.16) do que em Dd2 onde es a a iação apenas ul apassa pon ualmen e as duas ezes mais. c) p g Os alo es de N old indicam um aumen o da exp essão des e gene com um pad ão idên ico ao de p γ-gcs pa a o clone 3D7 (Figu a III.16), embo a com meno ampli ude. Pa a o clone Dd2 as a iações de exp essão a ingem alo es signi ica i os apenas pon ualmen e, na ase de anel (Figu a III.17). Embo a se e i ique uma endência pa a o aumen o de exp essão na p esença de á maco, a ampli ude de a iação é maio em 3D7 (≈ 3 ezes) do que em Dd2, onde es a a iação ul apassa as duas ezes mais, apenas pon ualmen e. d) p gs Pa a o clone 3D7 os alo es de N old indicam um aumen o da exp essão de p gs na ase de anel, o qual se man ém du an e a ase de o ozoí o, dec escendo à medida que os o ozoí os passam ao es adio de esquizon e onde o am ob idos os alo es mais baixos de al e ação de exp essão des e gene na p esença de CQ. A exp essão aumen ou de no o à medida que o pa asi a passa pa a o es adio de me ozoí o (Figu a III.16). Os alo es N old a iam a é ≈ 3 ezes, mas na gene alidade não ul apassam as duas ezes. Pelo con á io, no clone Dd2, não oi de ec ada al e ação signi ica i a da exp essão de p gs em espos a à p esença de CQ (Figu a III.17). e) p gpx Os alo es de N old indicam um aumen o da exp essão de p gpx na ase de anel, o qual se man ém du an e a ase de o ozoí o, dec escendo à medida que os o ozoí os passam ao es adio de esquizon e onde ob i emos a meno ampli ude de a iação de exp essão do e e ido gene na p esença de CQ. A endência da a iação da exp essão pa ece se Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 123 dec escen e à medida que o pa asi a se desen ol e a ingindo um máximo na ase de anel de ≈ 9, dec escendo pa a alo es não signi ica i os (≤1,5) no inal do ciclo in a- e i oci á io (Figu a III.16). Pelo con á io no clone Dd2, não oi de ec ada al e ação signi ica i a da exp essão de p gpx em espos a à p esença de CQ (Figu a III.17). ) p xR Pa a p xR, o pad ão de exp essão, bem como a ampli ude de a iação de N old é idên ica na ase de anel (a é às 18h) em ambos os clones 3D7 e Dd2. Sendo maio a ampli ude no início e dec escendo pa a o inal da ase de anel (Figu a III.16 e Figu a III.17). Em 3D7 es e dec éscimo é mais acen uado pa ecendo indica uma inibição da exp essão do gene, endência que se in e e (sem a ingi ní eis de signi icância) na ase de esquizon e madu o e me ozoí o (Figu a III.16). Em Dd2 a exp essão de p xR so e ambém uma diminuição signi ica i a du an e as p imei as ho as de o ozoí o, aumen ando depois du an e a es an e ase de o ozoí o (≈ 4 ezes) e esquizon e (≈ 2 ezes), no es adio de me ozoí o a exp essão do gene baixa pa a ní eis basais (Figu a III.17). g) p 2-cysPx No clone Dd2 a exp essão de p 2-cysPx es á aumen ada a é ≈ 3 ezes, na ase de anel dec escendo à medida que os anéis se desen ol em em o ozoí os. Na ase de o ozoí o os alo es de N old man êm-se en e 1,5 e 2. À medida que o pa asi a passa ao es adio de esquizon e a exp essão aumen a pa a alo es de N ≈ 3 ezes e man ém-se du an e a ase de esquizon e a é ao inal do ciclo (Figu a III.17). No clone 3D7, apenas se egis a um aumen o de exp essão da o dem das 2 ezes na ase de esquizon e, as a iações de exp essão nos es an es es adios man êm-se abaixo do limia de signi icância (Figu a III.16). h) p g6pd Pa a o clone 3D7 os alo es de N old indicam um aumen o da exp essão de p g6pd na ase de anel que se man ém em alo es N old ≈ 3, du an e odo o es adio. Du an e a ase de o ozoí o e esquizon e, ambém se egis a um aumen o de exp essão ela i amen e cons an e e com alo es de N old ≈ 4 (Figu a III.16). No clone Dd2 a exp essão des e Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 124 gene aumen a à medida que os esquizon es se desen ol em, a ingindo alo es de N old ≈ 2 e dec esce à medida que os esquizon es icam ma u os (Figu a III.17). i) p m p1 Pa a o clone 3D7 os alo es de N old indicam um aumen o da exp essão de p m p1 du an e o desen ol imen o dos anéis em o ozoí os. À medida que os o ozoí os se desen ol em a exp essão dec esce a ní eis de N old < 1,5 e ol a a subi quando os pa asi as se di e enciam em esquizon es a ingindo alo es de N old ≈ 4. A exp essão baixa du an e a di e enciação em me ozoí os (Figu a III.16). No clone Dd2 a exp essão de p m p1 man ém-se em alo es de N old < 1,5 (não a ia pela p esença de CQ) du an e a ase de anel e o ozoí o jo em, quando os o ozoí os se desen ol em, os ní eis de exp essão aumen am a é os pa asi as a ingi em o es adio de esquizon e man endo-se cons an es (N old ≈ 4) (Figu a III.17). j) p m p2 Na ase de anel do clone Dd2, não se egis a aumen o de exp essão a é se inicia a di e enciação pa a o ozoí o, enquan o que no clone 3D7 na ase de anel a exp essão es á aumen ada dec escendo de N old ≈ 4 pa a ≈ 3 (Figu a III.16 e Figu a III.17 espec i amen e). A pa i da ase de anel e em ambos os clones, embo a a endência de a iação seja a mesma, a ampli ude de a iação é maio em 3D7 (en e ≈ 3 a 4 na ase de o ozoí o e en e ≈ 4 a 6 na ase de esquizon e) do que em Dd2 (en e ≈ 1,5 a 2 na ase de o ozoí o e en e ≈ 2 a 3 na ase de esquizon e) (Figu a III.16 e Figu a III.17 espec i amen e). III.3.4.3 - E ei o da clo oquina na egulação da ansc ição dos genes de enzimas de espos a ao s ess oxida i o e dos anspo ado es p m p1 e p m p2 nos clones 3D7 e Dd2 Pa a es a o e ei o da clo oquina (CQ) na ansc ição e consequen e aumen o da exp essão, dos e e idos genes, oi es ada a in luência da Ac inomicina D (Ac .D inibido da ansc ição) no e ei o da CQ sob e a ansc ição. Fo am ealizadas cul u as de P. alcipa um com Ac .D, na p esença e ausência de CQ. Na p esença da Ac .D, não Exp essão dos genes p m p1, p m p2 e genes de espos a ao s ess oxida i o ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 125 se e i icou a indução da exp essão dos genes pela CQ ( e Figu a III.16 e Figu a III.17), como podemos con i ma pela obse ação dos g á icos da Figu a III.18 e Figu a III.19. A exp essão de cada gene e pa a cada clone, oi idên ica na p esença de Ac .D, ou Ac .D + CQ. O que suge e que o e ei o de egulação da CQ se p ocessa a ní el ansc ipcional. Es es esul ados o am obse ados pa a odos os genes e em ambos os clones 3D7 e Dd2. Es as obse ações indicam que a CQ não modi ica a elocidade de deg adação do mRNA des es genes, ou seja, não aumen a a es abilidade do mRNA. Anexos _____________________________________________________________________________________ 228 Compa ação da sequência de a.a. do NBD1 e NBD2 de Pgh1 Sequencia 1: Pgh1_NBD1 455 a.a. Sequencia 2: Pgh1_NBD2 460 a.a. Sequências (1:2) Sco e: 22.4176 Pgh1_NBD1 -------------------------------------------------------------------------------- 0 Pgh1_NBD2 ekkenmssg a ssddem kdps liqea ynmh inygledy cnliekaidyknkgqk ii naalwg sqsaql 80 Pgh1_NBD1 -----------------------------------------------------a nslyeiin kpl ennddge lpn- 26 Pgh1_NBD2 ins ayw gs lik g il dd mksl i gsyagklmslkgdsenakls ekyyplmi ksnid ddggi ink 160 Pgh1_NBD1 ---ikkie kn hyd kd eiykdls lkegk ya gesgcgks ilklie lydp egdii ndshnlkdinlk 103 Pgh1_NBD2 nlikgk dikd n yis pn piyknls cdskk ai ge gsgks mnlll ydlkndhiilkn--dm n qdy 238 Pgh1_NBD1 ww skig sqdpll snsiknnikyslyslkdleamenyyeen nd yenkn slisns---m snellemkkeyq ik 180 Pgh1_NBD2 qnnnnnsl lkn ne snqsgsaedy nnngeillddinicdynl dl nl si sqepml nmsiyenik g eda 318 Pgh1_NBD1 dsd d skk lihd sslpdkyd l gsnasklsggqkq isia aim npkilildea ssldnkseyl qk innl 260 Pgh1_NBD2 led k sk aaide ieslpnkyd n gpygkslsggqkq iaia all epkillldea ssldsnsekliek i di 398 Pgh1_NBD1 kgnen i iiiah ls i yan i lsn e sdnnnnnnnddnnnnnnnnnnkinnegsyiieqg hdslmknkngiyh 340 Pgh1_NBD2 kdkadk ii iah iasik sdki nnpd n-------------------------g qshg hdellsaqdgiyk 453 Pgh1_NBD1 lminnqkissnkssnngndngsdnkssaykdsd gndadnmnslsihenenisnn nckn aenekeek p k m k 420 Pgh1_NBD2 ky klak------------------------------------------------------------------------- 460 Pgh1_NBD1 kkapnnl iiykei sykkd ii sil aggly 455 Pgh1_NBD2 ----------------------------------- 460 Anexos _____________________________________________________________________________________ 229 ANEXO 8 Alinhamen o das sequências de nucleó idos e de a.a. de P MRP1, esul an es sequenciação e adução da o alidade dos agmen os do gene p m p1 dos clones Dd2 e 3D7. Di e enças pon uais e inse ções/delecções iden i icadas en e os clones( e melho), nucleó idos e a.a. assinalados, co espondem à sequência de 3D7; Sequências ca ac e ís icas de p o eínas ABC (azul); Hélices ansmemb ana es p e is as pelo SOSUI (cinzen o); Sequência dos agmen os a clona pa a p odução de p o eínas ecombinan es ( e de). 1 50 Dd2 ATGACGACAT ATAAAGAAAA TGTTGGAATA TCAAATAAAG GAAATAAAAA 3D7 ATGACGACAT ATAAAGAAAA TGTTGGAATA TCAAATAAAG GAAATAAAAA 51 100 Dd2 AAAAAAAAGT TGTCAAAATA TATCATTTTT AAATTTTTTA TCTTTTGATT 3D7 AAAAAAAAGT TGTCAAAATA TATCATTTTT AAATTTTTTA TCTTTTGATT 101 150 Dd2 GGATAAGACC GTTAATAAAT GATTTAATAA AAGGAGATAT TCAAGAACTT 3D7 GGATAAGACC GTTAATAAAT GATTTAATAA AAGGAGATAT TCAAGAACTT 151 200 Dd2 CCTAATATAT GTCGGAACTT CGATGTGCCA TATTATGCAT CTAAATTAGA 3D7 CCTAATATAT GTCGGAACTT CGATGTGCCA TATTATGCAT CTAAATTAGA 201 250 Dd2 AGAGAATTTA AGAGATATAG AAGTAGAAGA CTCCGAATTT TACAGTGAAA 3D7 AGAGAATTTA AGAGATATAG AAGTAGAAGA CTCCGAATTT TACAGTGAAA 251 300 Dd2 AAAATTCATC TAACGAACAT GTATTACACC ATTGTAATTC AAATGATGCA 3D7 AAAATTCATC TAACGAACAT GTATTACACC ATTGTAATTC AAATGATGCA 301 350 Dd2 AGTGAAAAGA AAGTGTATAA TGTTTATTAC CATAATATTT TATGGTCAAT 3D7 AGTGAAAAGA AAGTGTATAA TGTTTATTAC CATAATATTT TATGGTCAAT 351 400 Dd2 TTTGAAAACA TTTAAGTTTC GAATAATTTT AATAATAAGT TTTTATATTT 3D7 TTTGAAAACA TTTAAGTTTC GAATAATTTT AATAATAAGT TTTTATATTT 401 450 Dd2 TAGAGACATT AATTGTTACC TTGGGGGGGA AATTCATAGA TTACTATATG 3D7 TAGAGACATT AATTGTTACC TTGGGGGGGA AATTCATAGA TTACTATATG 451 500 Dd2 CGTATTTTAG AAGGTCAAAA GATTCCTGTA TATATTTCAT TCTTAAAAGA 3D7 CGTATTTTAG AAGGTCAAAA GATTCCTGTA TATATTTCAT TCTTAAAAGA 501 550 Dd2 TTTCAAAGTA TTCAGTGGGT TAGTGGTAGT GATGATAATG TTTTTCCATT 3D7 TTTCAAAGTA TTCAGTGGGT TAGTGGTAGT GATGATAATG TTTTTCCATT 551 T571C 600 Dd2 TGTTTTTTGA AGCTCTTTTG TATTTTTATT TTCATCTCTT TACAATAAAT 3D7 TGTTTTTTGA AGCTCTTTTG CATTTTTATT TTCATCTCTT TACAATAAAT 601 650 Dd2 TTAAAAGTAT CACTAATGTA TTTTTTGTAT AAAATTAATT TATGCAGTAA 3D7 TTAAAAGTAT CACTAATGTA TTTTTTGTAT AAAATTAATT TATGCAGTAA Anexos _____________________________________________________________________________________ 230 651 700 Dd2 TAACAATCAT TTACAAAATC CAGATGCATT TTATAATACA TATAGAAAAT 3D7 TAACAATCAT TTACAAAATC CAGATGCATT TTATAATACA TATAGAAAAT 701 750 Dd2 TTTCTTCACA AACAGAAATT GATGAGATAA GCAGAGATTT TTTAAGTATT 3D7 TTTCTTCACA AACAGAAATT GATGAGATAA GCAGAGATTT TTTAAGTATT 751 800 Dd2 GGTAAGAATG CATCCTCCTC TTCATCAGGA ATAAAAAATA ATAATAAAAA 3D7 GGTAAGAATG CATCCTCCTC TTCATCAGGA ATAAAAAATA ATAATAAAAA 801 850 Dd2 TATCGATAAT AATAAATTTG TGGAAAATGA TTATATAATT AATTTTATAA 3D7 TATCGATAAT AATAAATTTG TGGAAAATGA TTATATAATT AATTTTATAA 851 900 Dd2 AAAGTACAAA GAAAATGGAA AAAGATTCAT TAAATGAAAA TAGGAGTTTA 3D7 AAAGTACAAA GAAAATGGAA AAAGATTCAT TAAATGAAAA TAGGAGTTTA 901 950 Dd2 CCTAATGTGA ACATTTATAA TATTATGTTT TCTGATGTAC CGTCTGTAAC 3D7 CCTAATGTGA ACATTTATAA TATTATGTTT TCTGATGTAC CGTCTGTAAC 951 1000 Dd2 ATTTTTTGTT ACTTCTTGTA TTAATTTGTT TAATGTATTT GTTAAAATTT 3D7 ATTTTTTGTT ACTTCTTGTA TTAATTTGTT TAATGTATTT GTTAAAATTT 1001 1050 Dd2 TTATGTCTTT TTATGTGTTT CATATAAAGA TTGGGTCCAA TTCAGTTGGA 3D7 TTATGTCTTT TTATGTGTTT CATATAAAGA TTGGGTCCAA TTCAGTTGGA 1051 1100 Dd2 ATTGCAATAT GGTTGTCCAT TGCTTTATAC AGTGCAATGA TACTATTTGA 3D7 ATTGCAATAT GGTTGTCCAT TGCTTTATAC AGTGCAATGA TACTATTTGA 1101 1150 Dd2 ATTTTTACCA AGTTTATTTA AAAGTAAATA TTTAATTTAT CGAGATAAAA 3D7 ATTTTTACCA AGTTTATTTA AAAGTAAATA TTTAATTTAT CGAGATAAAA 1151 1200 Dd2 GAATTGATAA CATGCATCAT GTATTAAAAG AATTCAAATT GATAAAAATG 3D7 GAATTGATAA CATGCATCAT GTATTAAAAG AATTCAAATT GATAAAAATG 1201 1250 Dd2 TTTAATTGGG AATCATTTGC TTTTAAATAC ATAAATATAT TTCGAATGAA 3D7 TTTAATTGGG AATCATTTGC TTTTAAATAC ATAAATATAT TTCGAATGAA 1251 1300 Dd2 AGAAATGAAA TATTGTAAAA TAAGACTTTA TTTGAGTAAC ATAGGAGTTT 3D7 AGAAATGAAA TATTGTAAAA TAAGACTTTA TTTGAGTAAC ATAGGAGTTT 1301 G1309T 1350 Dd2 TTATAAGTGC AATTTCCTCT GATATAGTTG AAGTGGTTAT ATTCTTTATT 3D7 TTATAAGTTC AATTTCCTCT GATATAGTTG AAGTGGTTAT ATTCTTTATT 1351 1400 Dd2 TATTTAAAAG ATAGATTAAA TAAGAAAGAA GAAATTAAAT TTACATCAAT 3D7 TATTTAAAAG ATAGATTAAA TAAGAAAGAA GAAATTAAAT TTACATCAAT Anexos _____________________________________________________________________________________ 231 1401 1450 Dd2 TATTATGCCC TTATATGTAT ATAAGATATT AATTTCGAAT GTAGCAAATT 3D7 TATTATGCCC TTATATGTAT ATAAGATATT AATTTCGAAT GTAGCAAATT 1451 1500 Dd2 TTCCAAACTT AGTTAATAAT GTTATGGAAG GTATAGTAAA TATTAAACGT 3D7 TTCCAAACTT AGTTAATAAT GTTATGGAAG GTATAGTAAA TATTAAACGT 1501 1550 Dd2 TTAAATAATT ATATTAATGA TCATTTATAT TATAATGATA TAAAAAATTA 3D7 TTAAATAATT ATATTAATGA TCATTTATAT TATAATGATA TAAAAAATTA 1551 1600 Dd2 TTTTATGTAC CGTACAAGAT ATAATGAAGA TTATAATATT GTAGTGGATA 3D7 TTTTATGTAC CGTACAAGAT ATAATGAAGA TTATAATATT GTAGTGGATA 1601 1650 Dd2 AGACATTTTT ACAAAATGAA AATATAACTT CTCATGATGA TGGTACATCA 3D7 AGACATTTTT ACAAAATGAA AATATAACTT CTCATGATGA TGGTACATCA 1651 1700 Dd2 CATAATTTGA AACATTTAAA AAACGTAATA AAAAATAAAT TAACAAATAT 3D7 CATAATTTGA AACATTTAAA AAACGTAATA AAAAATAAAT TAACAAATAT 1701 1750 Dd2 GTTTAAATAT TTTTTCTTTT ATCATAAGAT GAATTATCAT AAGAATATAA 3D7 GTTTAAATAT TTTTTCTTTT ATCATAAGAT GAATTATCAT AAGAATATAA 1751 1800 Dd2 TAAATAAACA AATATTATCT GGTTTACTTA AGAACGTAGA TGATAATACG 3D7 TAAATAAACA AATATTATCT GGTTTACTTA AGAACGTAGA TGATAATACG 1801 1850 Dd2 AATAAAAAAA TATGTTTCCA GGAACATAAA AGTAATTCTA CATATAATTA 3D7 AATAAAAAAA TATGTTTCCA GGAACATAAA AGTAATTCTA CATATAATTA 1851 1900 Dd2 TAATAGTAGT CATATACATG AAAAAAAAGA AGAATATGAA AATATTCACA 3D7 TAATAGTAGT CATATACATG AAAAAAAAGA AGAATATGAA AATATTCACA 1901 1950 Dd2 ATAGTAGTAA TAGCACAATG AGTAATGAAT TCAAAGAAAA AAAAAAGAAT 3D7 ATAGTAGTAA TAGCACAATG AGTAATGAAT TCAAAGAAAA AAAAAAGAAT 1951 2000 Dd2 AATGAATACA TTATAAAATT AGAAAATTGT AGTTTTGGTT TATCATATGA 3D7 AATGAATACA TTATAAAATT AGAAAATTGT AGTTTTGGTT TATCATATGA 2001 2050 Dd2 TAATAAATGT GATAATGACC ATATTTTAAA AAACATAAAT TTTAATTTAA 3D7 TAATAAATGT GATAATGACC ATATTTTAAA AAACATAAAT TTTAATTTAA 2051 2100 Dd2 AAAGGAATTC ATTAGCAATA ATTATAGGAA ATGTTGGATC AGGAAAAAGT 3D7 AAAGGAATTC ATTAGCAATA ATTATAGGAA ATGTTGGATC AGGAAAAAGT 2101 2150 Dd2 GCATTTTTCC ATTCTATATT AGGAGATTTT AATATGACAC ATGGTAATTT 3D7 GCATTTTTCC ATTCTATATT AGGAGATTTT AATATGACAC ATGGTAATTT 2151 2200 Dd2 GTATATTGAA AATTTTTTCA AAAAAATGCC AATCTTATAT GTTCCTCAAA 3D7 GTATATTGAA AATTTTTTCA AAAAAATGCC AATCTTATAT GTTCCTCAAA Anexos _____________________________________________________________________________________ 232 2201 2250 Dd2 ATAGTTGGTT ATTTATGGGA AATATTAGAT CAATGATTTT ATTTGGAAAT 3D7 ATAGTTGGTT ATTTATGGGA AATATTAGAT CAATGATTTT ATTTGGAAAT 2251 2300 Dd2 GAATATAATC CATTAATTTA TAAATATACT ATATTACAAA GTGAATTATT 3D7 GAATATAATC CATTAATTTA TAAATATACT ATATTACAAA GTGAATTATT 2301 2350 Dd2 GAATGATTTG AGTACCATAG AACATGGAGA TATGAAATAT ATTAATGATG 3D7 GAATGATTTG AGTACCATAG AACATGGAGA TATGAAATAT ATTAATGATG 2351 2400 Dd2 ATCATAATTT AAGTAAAGGA CAAAAAGTAA GAATATGTTT AGCTAGAGCA 3D7 ATCATAATTT AAGTAAAGGA CAAAAAGTAA GAATATGTTT AGCTAGAGCA 2401 2450 Dd2 TTATATGAGC ATTATATTCA TATGCACAAA TTATGTACAG ATTATGAAAA 3D7 TTATATGAGC ATTATATTCA TATGCACAAA TTATGTACAG ATTATGAAAA 2451 2500 Dd2 AAAGCTTATA CAACCTAATG AAATATTAGA TAAGGATTTA ATAAATAATA 3D7 AAAGCTTATA CAACCTAATG AAATATTAGA TAAGGATTTA ATAAATAATA 2501 2550 Dd2 AAAACATTTC TTCATATAAT AATAAAAAAA GTAAATTAGT TAACTATAAT 3D7 AAAACATTTC TTCATATAAT AATAAAAAAA GTAAATTAGT TAACTATAAT 2551 2600 Dd2 ATTCCATTCA ATGAAAATTA CCTTCAAAAA TGTTTAATGG ATGATAATAA 3D7 ATTCCATTCA ATGAAAATTA CCTTCAAAAA TGTTTAATGG ATGATAATAA 2601 G2626A 2650 Dd2 TTTTTATTTG TATTTACTTG ATGATGTATT TACATCTTTA GATCCTTCCA 3D7 TTTTTATTTG TATTTACTTG ATGATATATT TACATCTTTA GATCCTTCCA 2651 2700 Dd2 TATCTAAAAA GATATTTTCT AATTTATTTT GTAAAGAAGA CAATATAAGT 3D7 TATCTAAAAA GATATTTTCT AATTTATTTT GTAAAGAAGA CAATATAAGT 2701 2750 Dd2 TTTAAAGATA ATTGTAGTTT TATTATCTCA ATGAATAAAA GTACGTTGGA 3D7 TTTAAAGATA ATTGTAGTTT TATTATCTCA ATGAATAAAA GTACGTTGGA 2751 2800 Dd2 TAATTTTCTT ATTGAAGATA TTCTTGATAA TGTTCAATAT GAAGTAAACA 3D7 TAATTTTCTT ATTGAAGATA TTCTTGATAA TGTTCAATAT GAAGTAAACA 2801 2850 Dd2 TTTTTGAAAT TCAGGATAAA ACTTTAAAAT ATAGAGGAAA TATATCAGAA 3D7 TTTTTGAAAT TCAGGATAAA ACTTTAAAAT ATAGAGGAAA TATATCAGAA 2851 2900 Dd2 TATATGGAAA AGAACAATTT AAATATAACT AAAGAAAGTC ACTGGGGTTA 3D7 TATATGGAAA AGAACAATTT AAATATAACT AAAGAAAGTC ACTGGGGTTA 2901 2950 Dd2 TTCAAACTTA AATACAATAG ATTATACCAG AATAAAATTG TTTGATGAAG 3D7 TTCAAACTTA AATACAATAG ATTATACCAG AATAAAATTG TTTGATGAAG 2951 3000 Dd2 TGGAACTTAA TCATGTTAAA CATAGTAATA AAATGATATA TAAGGAAGCT 3D7 TGGAACTTAA TCATGTTAAA CATAGTAATA AAATGATATA TAAGGAAGCT Anexos _____________________________________________________________________________________ 233 3001 3050 Dd2 TATTTCGTAA AAGGGAATAC GGAGAGTGTT TCCTTTGAAA TTGATAGTAT 3D7 TATTTCGTAA AAGGGAATAC GGAGAGTGTT TCCTTTGAAA TTGATAGTAT 3051 3100 Dd2 AAATAAGGAG TATATTAAGA AAATGAAAAA GAAAAATTAT AAAAAGGAGC 3D7 AAATAAGGAG TATATTAAGA AAATGAAAAA GAAAAATTAT AAAAAGGAGC 3101 3150 Dd2 ATATGAATAA AAATAATAAG GACAACAATA ATAATAATAA TAATAGTAAC 3D7 ATATGAATAA AAATAATAAG GACAACAATA ATAATAATAA TAATAGTAAC 3151 3200 Dd2 AAGGACGACC ATATTAATAT TAATATGAAT GATAACCATA GAAACTATAA 3D7 AAGGACGACC ATATTAATAT TAATATGAAT GATAACCATA GAAACTATAA 3201 3250 Dd2 TGACATTAAT TTGGGGCCTA ATTCTACAGA TGATAGTCCA ACTGTTTCTT 3D7 TGACATTAAT TTGGGGCCTA ATTCTACAGA TGATAGTCCA ACTGTTTCTT 3251 3300 Dd2 CGTTAGGAAA TGAATATACG CTTGATACCT ATACTAGTAA TAATTCTGAT 3D7 CGTTAGGAAA TGAATATACG CTTGATACCT ATACTAGTAA TAATTCTGAT 3301 3350 Dd2 AAGGAAGAAA TTGTAAAACC TTTATATAAA GATACACATG AAGAATTCAA 3D7 AAGGAAGAAA TTGTAAAACC TTTATATAAA GATACACATG AAGAATTCAA 3351 3400 Dd2 TAAAAGTTCA TCAATGCCTT TTGTCAAAAG TTCAAGTAAT ATGATAAATA 3D7 TAAAAGTTCA TCAATGCCTT TTGTCAAAAG TTCAAGTAAT ATGATAAATA 3401 3450 Dd2 ATCCAAGTAA TTTTAAATAT GAAGATAACT CATCCAGTTT TAAGGGTTCC 3D7 ATCCAAGTAA TTTTAAATAT GAAGATAACT CATCCAGTTT TAAGGGTTCC 3451 3500 Dd2 ATAAGTTTAG AAACGTATTT ATGGTATTTT CAACAGGTTG GATTTGTTTT 3D7 ATAAGTTTAG AAACGTATTT ATGGTATTTT CAACAGGTTG GATTTGTTTT 3501 3550 Dd2 ATTAACTTCA GTAGTAATAT TTATGCTTAT ATCTATTTTT ACAGATGAAA 3D7 ATTAACTTCA GTAGTAATAT TTATGCTTAT ATCTATTTTT ACAGATGAAA 3551 3600 Dd2 TAAAGTTTGT CTTTTTAACT ATGATGAGTA TTATTTCTAA AAATAATAAA 3D7 TAAAGTTTGT CTTTTTAACT ATGATGAGTA TTATTTCTAA AAATAATAAA 3601 3650 Dd2 GAACATTCAG ACACAATATT ACAAAAGCAA GTAAGATATT TGGAATATTT 3D7 GAACATTCAG ACACAATATT ACAAAAGCAA GTAAGATATT TGGAATATTT 3651 3700 Dd2 TGTAATATTA CCAATAATAT CATTAGTAAC ATCAGGTATA TGTTTTTCTA 3D7 TGTAATATTA CCAATAATAT CATTAGTAAC ATCAGGTATA TGTTTTTCTA 3701 3750 Dd2 TGATCATATA TGGAAATATT ACATCAGCAA TAAAAGTACA TAATAATATA 3D7 TGATCATATA TGGAAATATT ACATCAGCAA TAAAAGTACA TAATAATATA 3751 3800 Dd2 TTATATAGCA TATTAAATGC ACCATTGTAT ATATTTTATA ATAATAATTT 3D7 TTATATAGCA TATTAAATGC ACCATTGTAT ATATTTTATA ATAATAATTT Anexos _____________________________________________________________________________________ 234 3801 3850 Dd2 AGGGAATATA ATAAATCGAT TTATTATTGA TATATCTGCT TTTGATTATG 3D7 AGGGAATATA ATAAATCGAT TTATTATTGA TATATCTGCT TTTGATTATG 3851 3900 Dd2 GATTTTTAAA GAGAATATAT AAAGCCTTTT TCATTTTTTT TCGTTGTATC 3D7 GATTTTTAAA GAGAATATAT AAAGCCTTTT TCATTTTTTT TCGTTGTATC 3901 3950 Dd2 TTATCATCCT TATTAATTAT ATATATGATA AGAGATTGTA TTTTTATTTT 3D7 TTATCATCCT TATTAATTAT ATATATGATA AGAGATTGTA TTTTTATTTT 3951 4000 Dd2 CCCTTTTGTA ATTATATTAA TATATTTTTT TGTTTTCAAA AGATTTTCGA 3D7 CCCTTTTGTA ATTATATTAA TATATTTTTT TGTTTTCAAA AGATTTTCGA 4001 4050 Dd2 GAGGTTGTAA AGAAGCACAA AGGCTGTATT TATCATGTCA TACTCCTTTA 3D7 GAGGTTGTAA AGAAGCACAA AGGCTGTATT TATCATGTCA TACTCCTTTA 4051 4100 Dd2 TGTAACATCT ATAGTAATGC ATTGTCTGGA AAAAACATTA TTAATATATA 3D7 TGTAACATCT ATAGTAATGC ATTGTCTGGA AAAAACATTA TTAATATATA 4101 4150 Dd2 TAAAAAAAAT ACATATCATT TGGATGTATA TGAGCATTAT ATAAACAATT 3D7 TAAAAAAAAT ACATATCATT TGGATGTATA TGAGCATTAT ATAAACAATT 4151 A4167T 4200 Dd2 TTCGAATTAG TTATTTTATT AAATGGCTTA TAAATATTTG GGCATCTCTT 3D7 TTCGAATTAG TTATTTTTTT AAATGGCTTA TAAATATTTG GGCATCTCTT 4201 4250 Dd2 TATATTAAGA TTTTTATATT GTTATTAACT ACTTACATTA TTATGCATCC 3D7 TATATTAAGA TTTTTATATT GTTATTAACT ACTTACATTA TTATGCATCC 4251 4300 Dd2 TCATTTATAT GCAAGTGGAA TAATCAAATT ATATAAAGAA AAAAATTATG 3D7 TCATTTATAT GCAAGTGGAA TAATCAAATT ATATAAAGAA AAAAATTATG 4301 4350 Dd2 TTCGAATTTT GAGTACCCTT GGATACTGTA TATCGTTTTC TGCTAGACTA 3D7 TTCGAATTTT GAGTACCCTT GGATACTGTA TATCGTTTTC TGCTAGACTA 4351 4400 Dd2 GGTGTTATTA TAAAATTTCT TTTATGTGAT TATACTCACA TAGAAAAAGA 3D7 GGTGTTATTA TAAAATTTCT TTTATGTGAT TATACTCACA TAGAAAAAGA 4401 4450 Dd2 AATGTGCTGT GTTCAAAGAT TAGAAGAATT TGCTAAAATT TCTAATAAAG 3D7 AATGTGCTGT GTTCAAAGAT TAGAAGAATT TGCTAAAATT TCTAATAAAG 4451 4500 Dd2 AAAATGCTTC TATGAATAAG GAAAATGAAT TAAATGTAAT AACAACACAA 3D7 AAAATGCTTC TATGAATAAG GAAAATGAAT TAAATGTAAT AACAACACAA 4501 4550 Dd2 ACATATAAGG AAAAAAATGA AAATATCTCG GATAAGATAT CTGCAATTGT 3D7 ACATATAAGG AAAAAAATGA AAATATCTCG GATAAGATAT CTGCAATTGT 4551 4600 Dd2 CGAATATAAA AATGTATCGT TATCTTCAAT TATAAATAGT TCTCAGGATG 3D7 CGAATATAAA AATGTATCGT TATCTTCAAT TATAAATAGT TCTCAGGATG Anexos _____________________________________________________________________________________ 235 4601 4650 Dd2 ATGAATCAAA AAAAAAGTAT GGTATTAAAT TTGAGAATGT ATATGTAAGT 3D7 ATGAATCAAA AAAAAAGTAT GGTATTAAAT TTGAGAATGT ATATGTAAGT 4651 4700 Dd2 TATAAAAAAA AAATTCCTTT AGTTAATGGT ACATATAAAT ACATAGATGA 3D7 TATAAAAAAA AAATTCCTTT AGTTAATGGT ACATATAAAT ACATAGATGA 4701 4750 Dd2 AGAACCATCA TTAAAAAATA TTAATATGTA TGCTTTAAAA AATCAAAAAA 3D7 AGAACCATCA TTAAAAAATA TTAATATGTA TGCTTTAAAA AATCAAAAAA 4751 4800 Dd2 TTGGGATAGT AGGAAAATCA GGCGCAGGAA AAAGTACTAT ACTTTTATCT 3D7 TTGGGATAGT AGGAAAATCA GGCGCAGGAA AAAGTACTAT ACTTTTATCT 4801 4850 Dd2 ATCTTAGGAT TAATTAATAT TTCACAAGGA AAAATAACAG TAGAAGGAAG 3D7 ATCTTAGGAT TAATTAATAT TTCACAAGGA AAAATAACAG TAGAAGGAAG 4851 4900 Dd2 AGACATTCGA ACATATAATA GAAAAGGAGA AGATAGTATT ATTGGTATTT 3D7 AGACATTCGA ACATATAATA GAAAAGGAGA AGATAGTATT ATTGGTATTT C4167T 4901 4950 Dd2 TAGCCCAATC TTCTTTTGTT TTTTATAATT GGAATATAAG AACTTTTATT 3D7 TAGCTCAATC TTCTTTTGTT TTTTATAATT GGAATATAAG AACTTTTATT 4951 5000 Dd2 GATCCATATA ATAATTTCAC AGATGATGAA ATTGTTCATG CTCTAAAATT 3D7 GATCCATATA ATAATTTCAC AGATGATGAA ATTGTTCATG CTCTAAAATT 5001 5050 Dd2 GAATGGTATA AATTTAGGTA AAAACGATTT ATATAAATAT ATGCATAAAC 3D7 GAATGGTATA AATTTAGGTA AAAACGATTT ATATAAATAT ATGCATAAAC 5051 5100 Dd2 AAGATATGAA ATCAAATTAT AAAAAAATAA TACAAACATC AAAAGTAATA 3D7 AAGATATGAA ATCAAATTAT AAAAAAATAA TACAAACATC AAAAGTAATA 5101 5150 Dd2 AACCAATCAA ATGATAATAC TATTCTATTA ACAAATGATT GTATAAGATA 3D7 AACCAATCAA ATGATAATAC TATTCTATTA ACAAATGATT GTATAAGATA 5151 5200 Dd2 TCTATCTTTA GTTAGACTTT ATTTAAATCG ACATAAATAT AAAATCATAT 3D7 TCTATCTTTA GTTAGACTTT ATTTAAATCG ACATAAATAT AAAATCATAT 5201 5250 Dd2 TAATAGATGA AATTCCTATT TTTAATTTAA ACAATTCTGT TCATGACGAA 3D7 TAATAGATGA AATTCCTATT TTTAATTTAA ACAATTCTGT TCATGACGAA 5251 5300 Dd2 TTAAATAGTT TTTTAATTGG TAAAGCAAAG TCATTTAATT ATATAATAAG 3D7 TTAAATAGTT TTTTAATTGG TAAAGCAAAG TCATTTAATT ATATAATAAG 5301 5350 Dd2 AAATCATTTT CCAAATAATA CAGTCCTAAT TATTTCACAT CATGCAAATA 3D7 AAATCATTTT CCAAATAATA CAGTCCTAAT TATTTCACAT CATGCAAATA 5351 5400 Dd2 CTTTGTCTTG TTGTGACTAT ATTTATGTAT TAAGAAAGGG AGAAATAACT 3D7 CTTTGTCTTG TTGTGACTAT ATTTATGTAT TAAGAAAGGG AGAAATAACT Anexos _____________________________________________________________________________________ 236 5401 5450 Dd2 TATCGTTGTA GTTACGAAGA TGTAAAAACG CAATCTGAAT TATCACATTT 3D7 TATCGTTGTA GTTACGAAGA TGTAAAAACG CAATCTGAAT TATCACATTT 5451 5469 Dd2 GTTAGAAATG GACGACTAA 3D7 GTTAGAAATG GACGACTAA Sequencia da p o eína esul an e da adução do gene p m p1. 1 50 3D7 MTTYKENVGI SNKGNKKKKS CQNISFLNFL SFDWIRPLIN DLIKGDIQEL Dd2 MTTYKENVGI SNKGNKKKKS CQNISFLNFL SFDWIRPLIN DLIKGDIQEL 51 100 3D7 PNICRNFDVP YYASKLEENL RDIEVEDSEF YSEKNSSNEH VLHHCNSNDA Dd2 PNICRNFDVP YYASKLEENL RDIEVEDSEF YSEKNSSNEH VLHHCNSNDA 101 150 3D7 SEKKVYNVYY HNILWSILKT FKFRIILIIS FYILETLIVT LGGKFIDYYM Dd2 SEKKVYNVYY HNILWSILKT FKFRIILIIS FYILETLIVT LGGKFIDYYM 151 H191Y 200 3D7 RILEGQKIPV YISFLKDFKV FSGLVVVMIM FFHLFFEALL HFYFHLFTIN Dd2 RILEGQKIPV YISFLKDFKV FSGLVVVMIM FFHLFFEALL YFYFHLFTIN 201 250 3D7 LKVSLMYFLY KINLCSNNNH LQNPDAFYNT YRKFSSQTEI DEISRDFLSI Dd2 LKVSLMYFLY KINLCSNNNH LQNPDAFYNT YRKFSSQTEI DEISRDFLSI 251 300 3D7 GKNASSSSSG IKNNNKNIDN NKFVENDYII NFIKSTKKME KDSLNENRSL Dd2 GKNASSSSSG IKNNNKNIDN NKFVENDYII NFIKSTKKME KDSLNENRSL 301 350 3D7 PNVNIYNIMF SDVPSVTFFV TSCINLFNVF VKIFMSFYVF HIKIGSNSVG Dd2 PNVNIYNIMF SDVPSVTFFV TSCINLFNVF VKIFMSFYVF HIKIGSNSVG 351 400 3D7 IAIWLSIALY SAMILFEFLP SLFKSKYLIY RDKRIDNMHH VLKEFKLIKM Dd2 IAIWLSIALY SAMILFEFLP SLFKSKYLIY RDKRIDNMHH VLKEFKLIKM 401 S437A 450 3D7 FNWESFAFKY INIFRMKEMK YCKIRLYLSN IGVFISSISS DIVEVVIFFI Dd2 FNWESFAFKY INIFRMKEMK YCKIRLYLSN IGVFISAISS DIVEVVIFFI 451 500 3D7 YLKDRLNKKE EIKFTSIIMP LYVYKILISN VANFPNLVNN VMEGIVNIKR Dd2 YLKDRLNKKE EIKFTSIIMP LYVYKILISN VANFPNLVNN VMEGIVNIKR 501 550 3D7 LNNYINDHLY YNDIKNYFMY RTRYNEDYNI VVDKTFLQNE NITSHDDGTS Dd2 LNNYINDHLY YNDIKNYFMY RTRYNEDYNI VVDKTFLQNE NITSHDDGTS 551 600 3D7 HNLKHLKNVI KNKLTNMFKY FFFYHKMNYH KNIINKQILS GLLKNVDDNT Dd2 HNLKHLKNVI KNKLTNMFKY FFFYHKMNYH KNIINKQILS GLLKNVDDNT 601 650 3D7 NKKICFQEHK SNSTYNYNSS HIHEKKEEYE NIHNSSNSTM SNEFKEKKKN Dd2 NKKICFQEHK SNSTYNYNSS HIHEKKEEYE NIHNSSNSTM SNEFKEKKKN Anexos _____________________________________________________________________________________ 237 651 700 3D7 NEYIIKLENC SFGLSYDNKC DNDHILKNIN FNLKRNSLAI IIGNVGSGKS Dd2 NEYIIKLENC SFGLSYDNKC DNDHILKNIN FNLKRNSLAI IIGNVGSGKS 701 750 3D7 AFFHSILGDF NMTHGNLYIE NFFKKMPILY VPQNSWLFMG NIRSMILFGN Dd2 AFFHSILGDF NMTHGNLYIE NFFKKMPILY VPQNSWLFMG NIRSMILFGN 751 800 3D7 EYNPLIYKYT ILQSELLNDL STIEHGDMKY INDDHNLSKG QKVRICLARA Dd2 EYNPLIYKYT ILQSELLNDL STIEHGDMKY INDDHNLSKG QKVRICLARA 801 850 3D7 LYEHYIHMHK LCTDYEKKLI QPNEILDKDL INNKNISSYN NKKSKLVNYN Dd2 LYEHYIHMHK LCTDYEKKLI QPNEILDKDL INNKNISSYN NKKSKLVNYN 851 I875V 900 3D7 IPFNENYLQK CLMDDNNFYL YLLDDIFTSL DPSISKKIFS NLFCKEDNIS Dd2 IPFNENYLQK CLMDDNNFYL YLLDDVFTSL DPSISKKIFS NLFCKEDNIS 901 950 3D7 FKDNCSFIIS MNKSTLDNFL IEDILDNVQY EVNIFEIQDK TLKYRGNISE Dd2 FKDNCSFIIS MNKSTLDNFL IEDILDNVQY EVNIFEIQDK TLKYRGNISE 951 1000 3D7 YMEKNNLNIT KESHWGYSNL NTIDYTRIKL FDEVELNHVK HSNKMIYKEA Dd2 YMEKNNLNIT KESHWGYSNL NTIDYTRIKL FDEVELNHVK HSNKMIYKEA 1001 1050 3D7 YFVKGNTESV SFEIDSINKE YIKKMKKKNY KKEHMNKNNK DNNNNNNNSN Dd2 YFVKGNTESV SFEIDSINKE YIKKMKKKNY KKEHMNKNNK DNNNNNNNSN 1051 1100 3D7 KDDHININMN DNHRNYNDIN LGPNSTDDSP TVSSLGNEYT LDTYTSNNSD Dd2 KDDHININMN DNHRNYNDIN LGPNSTDDSP TVSSLGNEYT LDTYTSNNSD 1101 1150 3D7 KEEIVKPLYK DTHEEFNKSS SMPFVKSSSN MINNPSNFKY EDNSSSFKGS Dd2 KEEIVKPLYK DTHEEFNKSS SMPFVKSSSN MINNPSNFKY EDNSSSFKGS 1151 1200 3D7 ISLETYLWYF QQVGFVLLTS VVIFMLISIF TDEIKFVFLT MMSIISKNNK Dd2 ISLETYLWYF QQVGFVLLTS VVIFMLISIF TDEIKFVFLT MMSIISKNNK 1201 1250 3D7 EHSDTILQKQ VRYLEYFVIL PIISLVTSGI CFSMIIYGNI TSAIKVHNNI Dd2 EHSDTILQKQ VRYLEYFVIL PIISLVTSGI CFSMIIYGNI TSAIKVHNNI 1251 1300 3D7 LYSILNAPLY IFYNNNLGNI INRFIIDISA FDYGFLKRIY KAFFIFFRCI Dd2 LYSILNAPLY IFYNNNLGNI INRFIIDISA FDYGFLKRIY KAFFIFFRCI 1301 1350 3D7 LSSLLIIYMI RDCIFIFPFV IILIYFFVFK RFSRGCKEAQ RLYLSCHTPL Dd2 LSSLLIIYMI RDCIFIFPFV IILIYFFVFK RFSRGCKEAQ RLYLSCHTPL 1351 F1390I 1400 3D7 CNIYSNALSG KNIINIYKKN TYHLDVYEHY INNFRISYFF KWLINIWASL Dd2 CNIYSNALSG KNIINIYKKN TYHLDVYEHY INNFRISYFI KWLINIWASL 1401 1450 3D7 YIKIFILLLT TYIIMHPHLY ASGIIKLYKE KNYVRILSTL GYCISFSARL Dd2 YIKIFILLLT TYIIMHPHLY ASGIIKLYKE KNYVRILSTL GYCISFSARL Anexos ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ 244 5301 5400 3D7 TAATAATAAT AATAATAATA ATAATAATGA GCAGGATGCA AATTTATTTA AATCTGTTCC TGGTTCGTAT GATCCGAATG ATAAAGAAAA TATGAGAAAA Dd2 TAATAATAAT AATAATAATA ATAATAATGA GCAGGATGCA AATTTATTTA AATCTGTTCC TGGTTCGTAT GATCCGAATG ATAAAGAAAA TATGAGAAAA 5401 5500 3D7 TACAAAACAG AAATTGTTAA TAATACAAAA GATATGTATT CTATTATAAA TAAGGATGAT ATGTTAACAC ATTCAATTAA TAATAAGAAT AATAAATTAA Dd2 TACAAAACAG AAATTGTTAA TAATACAAAA GATATGTATT CTATTATAAA TAAGGATGAT ATGTTAACAC ATTCAATTAA TAATAAGAAT AATAAATTAA 5501 5600 3D7 AAAAATTATA TACCAGTCCT CATATAGATA TTAATAAAAT AAAGTATGGT ATCTGTTTCG AAAGAGTATT TGTTAGCTAT AAAAAGAAAA TTTGTGTTGA Dd2 AAAAATTATA TACCAGTCCT CATATAGATA TTAATAAAAT AAAGTATGGT ATCTGTTTCG AAAGAGTATT TGTTAGCTAT AAAAAGAAAA TTTGTGTTGA 5601 5700 3D7 TAGAAAAAAT AATAAATATG AATATGTAAA TGAAAAATCA TGCTTAAAAA ATATCAATAT ATATGCTTTA AAAAATCAGA AAATTGGTAT CGTAGGAAAA Dd2 TAGAAAAAAT AATAAATATG AATATGTAAA TGAAAAATCA TGCTTAAAAA ATATCAATAT ATATGCTTTA AAAAATCAGA AAATTGGTAT CGTAGGAAAA 5701 5800 3D7 TCAGGAGCAG GAAAAAGTAC TATGATACTA TCTATTCTAG GTTTAATAGG TACTACTAGA GGAAGAATTA CTATTGAAGG ACAAGATATA AAAACCTTAA Dd2 TCAGGAGCAG GAAAAAGTAC TATGATACTA TCTATTCTAG GTTTAATAGG TACTACTAGA GGAAGAATTA CTATTGAAGG ACAAGATATA AAAACCTTAA 5801 5900 3D7 CGTTAGATGA AAGAAAAAAT ATGATTGGTG TATTACCACA ATCATCTTTT GTATTTTTTC ATTGGAATAT TAGAACATTT ATAGATCCAT ATAAAGATTT Dd2 CGTTAGATGA AAGAAAAAAT ATGATTGGTG TATTACCACA ATCATCTTTT GTATTTTTTC ATTGGAATAT TAGAACATTT ATAGATCCAT ATAAAGATTT 5901 6000 3D7 TACTGATGAT GAAATTGTTG ATGCTTTCAA ATTAATAGGA ATTAATTTAA GTTATGATGA TTTAGATAAA TATATTTATA AACAACAACG ACAACAACAA Dd2 TACTGATGAT GAAATTGTTG ATGCTTTCAA ATTAATAGGA ATTAATTTAA GTTATGATGA TTTAGATAAA TATATTTATA AACAACAACG ACAACAACAA 6001 6100 3D7 AAAAAAAAAA ATAAAAATAC ACATAATTTA TGGAAAAAAA AAAGTTTTAT TGATTTAACG AACTCTATAT CTTTATCAGA TGAATGTATT AGATATTTAT Dd2 AAAAAAAAAA ATAAAAATAC ACATAATTTA TGGAAAAAAA AAAGTTTTAT TGATTTAACG AACTCTATAT CTTTATCAGA TGAATGTATT AGATATTTAT 6101 6200 3D7 CATTAGTACG TCTTTTTTTA AATAGACATA AATATAAACT CATTTTAATC GATGAAATAC CTGTACTTAA TTTCTGTTAT AATACCAAAA AATTAACCAA Dd2 CATTAGTACG TCTTTTTTTA AATAGACATA AATATAAACT CATTTTAATC GATGAAATAC CTGTACTTAA TTTCTGTTAT AATACCAAAA AATTAACCAA 6201 6300 3D7 CTTCTTTACA ACAGATATTA AATCTTTTGA TTATATTATT AGAACATTCT TTCAAAATAC TACAGTCCTC ATTATTGCTC ATGATGCAAG TACACTCTCA Dd2 CTTCTTTACA ACAGATATTA AATCTTTTGA TTATATTATT AGAACATTCT TTCAAAATAC TACAGTCCTC ATTATTGCTC ATGATGCAAG TACACTCTCA 6301 6400 3D7 TGTTGTGATT TTATTTACGT TATCGCAAAG GGAGAAGTTG TATACAAATG TAGTTATAAA GATGTTAAAA CACAAACCGA ATTAGCTAAC TTGCTTCAAG Dd2 TGTTGTGATT TTATTTACGT TATCGCAAAG GGAGAAGTTG TATACAAATG TAGTTATAAA GATGTTAAAA CACAAACCGA ATTAGCTAAC TTGCTTCAAG Anexos ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ 245 6401 6417 3D7 AAAAACAATT AAATTGA Dd2 AAAAACAATT AAATTGA Sequência de aminoacidos esul an e da adução do gene p m p2 pa a os clones 3D7 e Dd2. 1 100 Dd2 MMRRRSVYNF DQGKHGYLMN HISWLNFVSF NWITQLLRCL KNDDFVLPCI EETSSIEHYS TNLNRNVRNI QLRKYNKYNK YKNYCCSKYN DGNKSCSCST 3D7 MMRRRSVYNF DQGKHGYLMN HISWLNFVSF NWITQLLRCL KNDDFVLPCI EETSSIEHYS TNLNRNVRNI QLRKYNKYNK YKNYCCSKYN DGNKSCSCST 101 200 Dd2 KNHTNKFHKR KKEDHFLKSS GITYAVLKTF KYYLSLISFF HIIHTIFLIF VAVCIEKYVL LIKGGSNVVT LPFGFKNSKV LFGFIVISVI FISQFFDALL 3D7 KNHTNKFHKR KKEDHFLKSS GITYAVLKTF KYYLSLISFF HIIHTIFLIF VAVCIEKYVL LIKGGSNVVT LPFGFKNSKV LFGFIVISVI FISQFFDALL 201 MRP2A 300 Dd2 CYYDFRLRVN MEVTVMYFLY KITLGNFNNQ LINRNDIYDD HSEEGKGQHK NQCQYDENDQ NDENDQNDQN EQSDLRDIRH MHDKHVKHND EESKDSTNST 3D7 CYYDFRLRVN MEVTVMYFLY KITLGNFNNQ LINRNDIYDD HSEEGKGQHK NQCQYDENDQ ------NDQN EQSDLRDIRH MHDKHVKHND EESKDSTNST 301 VFDISIYNI 400 Dd2 TYIKNNNNQM SHINDLSITN NMSDVHILSS IKNQDQNNSN NVSSMDSNTN YMSKTTCLTC TGSEFNKEEK DEKKELLEEA KKKDKEVFDI SIYNIMFIDT 3D7 TYIKNNNNQM SHINDLSITN NMSDVHILSS IKNQDQNNSN NVSSMDSNTN YMSKTTCLTC TGSEFNKEEK DEKKELLEEA KKKDKEVFDI SIYNIMFIDT 401 500 Dd2 PFLIYFITAL IELANMIIKF IMSFYMFYYK MGSAAVLNGA LLIIIMYGLM FAFEFSSSLF KLKYLKYRDT RISNMHHILK EFKLMKIFNW ESIAFDYVNM 3D7 PFLIYFITAL IELANMIIKF IMSFYMFYYK MGSAAVLNGA LLIIIMYGLM FAFEFSSSLF KLKYLKYRDT RISNMHHILK EFKLMKIFNW ESIAFDYVNM 501 600 Dd2 FRIKEMKICK IRTYLSSLSN YVNNISVNIV EVAIFFFYIR SELKSNKTVS FSSLITPLFV YKSLISGVSN FPNIINNLIE GAINIKRINK YINYYLFNND 3D7 FRIKEMKICK IRTYLSSLSN YVNNISVNIV EVAIFFFYIR SELKSNKTVS FSSLITPLFV YKSLISGVSN FPNIINNLIE GAINIKRINK YINYYLFNND 601 G631D N646D 700 Dd2 MNDYFKNSLN GMKSNTCNFQ NGNTNNVNGY VDDYVDGYVD DYVDDYVNDY VDDYVNDYVD DYVNDYVDDY VNDYVDDYVD DYMDHMMEYN ININSKNGCS 3D7 MNDYFKNSLN GMKSNTCNFQ NGNTNNVNGY VDDYVDDYVD DYVDDYVNDY VN-------- ---------- ------DYVD DYMDHMMEYN ININSKNGCS 701 I714K MRP2B 800 Dd2 SKSRKNNKSF SKDHFSNHEQ GTMQSFYKFL DTHKNKTKQK SDCIKKCSNN QLSKSNNNNV VGESNNSLFQ DRKGWYPKNK HFKDNIVINM KNCYFSSKNN 3D7 SKSRKNNKSF SKDHFSNHEQ GTMQSFYKFL DTHKNKTKQK SDCKKKCSNN QLSKSNNNNV VGESNNSLFQ DRKGWYPKNK HFKDNIVINM KNCYFSSKNN 801 900 Dd2 DDYILKNINL TLKNNSVVII LGNVGSGKTI FFYSLLGQFK LSCGSFYLKN YIYKYMPILY VPQFNWISLG TIRSMILFGN KYDESIYYDV IVKSELFHDI 3D7 DDYILKNINL TLKNNSVVII LGNVGSGKTI FFYSLLGQFK LSCGSFYLKN YIYKYMPILY VPQFNWISLG TIRSMILFGN KYDESIYYDV IVKSELFHDI 901 1000 Dd2 ISFKKKDMRY ISDEHSLSKG QKARICLARA LYHHYIHMKH MNLYYQKNEL INEKMKKISL KRDDNHTAQR SNDNTPNNNN TDNNNTSDNN NTSNNNNTSD 3D7 ISFKKKDMRY ISDEHSLSKG QKARICLARA LYHHYIHMKH MNLYYQKNEL INEKMKKISL KRDDNHTAQR SNDNTPNNNN TDNNNTSDNN NTSNNNNTSD Anexos ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ 246 T980T 1001 1100 Dd2 NNNTSDNNNT SDNNNTSNNN NTDNNNTSNN KNSCSKNLTE ERNISYLYLF DDLFTSLDPC ISKDIFYNLF CDKEKIQHFK KNSSFILSIS EIILNSFISS 3D7 NNNTSDNNNT SDNNNTSNNN NTDNNNTSNN KNSCSKNLTE ERNISYLYLF DDLFTSLDPC ISKDIFYNLF CDKEKIQHFK KNSSFILSIS EIILNSFISS 1101 D1138D 1200 Dd2 NCILNNMQYD VLIYKLENST LHYEGNLVDY IKKNNIVVKE DIVQTNKQCE KKSLTNEQVK SMLSLNEDWN YMHRVKKKSI TQKETTKNYD NNNDNNNDNN 3D7 NCILNNMQYD VLIYKLENST LHYEGNLVDY IKKNNIVVKE DIVQTNKQCE KKSLTNEQVK SMLSLNEDWN YMHRVKKKSI TQKETTKNYD NNNDNNNDNN 1201 N1184D 1300 Dd2 NDNNNDNNND NNNNNNNDNN N-----NNNN NVNVSKEILS CEIKTQDHYN NIHCSKTNFE KHNNSIYSKK ENETRKIHSG DIKYHKFMVL KQFKTIYSFK 3D7 NDNNNDNNND NNNDNNNDNN NDNNNNNNNN NVNVSKEILS CEIKTQDHYN NIHCSKTNFE KHNNSIYSKK ENETRKIHSG DIKYHKFMVL KQFKTIYSFK 1301 1400 Dd2 TIYSFNTEET NDDEYNKTYY RKYTKVIQNY DNHCLEGKKK SFRNYKSINS YNEILIKENM KVWEDDTYYG NDYIDEYEKI KKNVLSKLKY NYYISCDYNN 3D7 TIYSFNTEET NDDEYNKTYY RKYTKVIQNY DNHCLEGKKK SFRNYKSINS YNEILIKENM KVWEDDTYYG NDYIDEYEKI KKNVLSKLKY NYYISCDYNN 1401 1500 Dd2 SDHFDFNEEL KFKGNIKLET FWWYLKKIGR PLIIVIIIFM LLSIFTDEIK NLILFLASTI LKSGDKKDEE ILNQQLVYLN YFILLPSISL LTTLISFMLI 3D7 SDHFDFNEEL KFKGNIKLET FWWYLKKIGR PLIIVIIIFM LLSIFTDEIK NLILFLASTI LKSGDKKDEE ILNQQLVYLN YFILLPSISL LTTLISFMLI 1501 T1527S I1531L 1600 Dd2 AHGIVKSAIK VHTEVLLSIL YAPIHAFYSN NLGNIINKFI TDVNILDNGI IKRIYKTFYT IFRFLFTLFL LIYMVKYTIV IFPFIMLIIY FFVFNKYSKG 3D7 AHGIVKSAIK VHTEVLLSIL YAPIHAFYSN NLGNIINKFI TDVNILDNGI IKRIYKSFYT LFRFLFTLFL LIYMVKYTIV IFPFIMLIIY FFVFNKYSKG 1601 1700 Dd2 CKEAQRGFLA SHAPLCTIYS NTIIGKDVIN LYKKNNYFLT LYKQKIFDFR NYTIFKWSIT IWASLYVQLI VLALTFFYII YPHFFFKHAK QDHEINYEKE 3D7 CKEAQRGFLA SHAPLCTIYS NTIIGKDVIN LYKKNNYFLT LYKQKIFDFR NYTIFKWSIT IWASLYVQLI VLALTFFYII YPHFFFKHAK QDHEINYEKE 1701 MRP2C 1800 Dd2 ASTIGYCITF SCSLGFVIKS LLYDYTHVEK EMCSTQRLEE CSKMIKDEGY SDDNITLQNN DPTHEDNNNN NNNNNNEQDA NLFKSVPGSY DPNDKENMRK 3D7 ASTIGYCITF SCSLGFVIKS LLYDYTHVEK EMCSTQRLEE CSKMIKDEGY SDDNITLQNN DPTHEDNNNN NNNNNNEQDA NLFKSVPGSY DPNDKENMRK 1801 1900 Dd2 YKTEIVNNTK DMYSIINKDD MLTHSINNKN NKLKKLYTSP HIDINKIKYG ICFERVFVSY KKKICVDRKN NKYEYVNEKS CLKNINIYAL KNQKIGIVGK 3D7 YKTEIVNNTK DMYSIINKDD MLTHSINNKN NKLKKLYTSP HIDINKIKYG ICFERVFVSY KKKICVDRKN NKYEYVNEKS CLKNINIYAL KNQKIGIVGK 1901 2000 Dd2 SGAGKSTMIL SILGLIGTTR GRITIEGQDI KTLTLDERKN MIGVLPQSSF VFFHWNIRTF IDPYKDFTDD EIVDAFKLIG INLSYDDLDK YIYKQQRQQQ 3D7 SGAGKSTMIL SILGLIGTTR GRITIEGQDI KTLTLDERKN MIGVLPQSSF VFFHWNIRTF IDPYKDFTDD EIVDAFKLIG INLSYDDLDK YIYKQQRQQQ 2001 2100 Dd2 KKKNKNTHNL WKKKSFIDLT NSISLSDECI RYLSLVRLFL NRHKYKLILI DEIPVLNFCY NTKKLTNFFT TDIKSFDYII RTFFQNTTVL IIAHDASTLS 3D7 KKKNKNTHNL WKKKSFIDLT NSISLSDECI RYLSLVRLFL NRHKYKLILI DEIPVLNFCY NTKKLTNFFT TDIKSFDYII RTFFQNTTVL IIAHDASTLS Anexos ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ 247 2101 2138 Dd2 CCDFIYVIAK GEVVYKCSYK DVKTQTELAN LLQEKQLN 3D7 CCDFIYVIAK GEVVYKCSYK DVKTQTELAN LLQEKQLN Anexos ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ 248 ANEXO 10 Repe ições na sequência do gene p m p2 nos clones 3D7 e Dd2 de P. alcipa um ( e melho al e ações pon uais, sublinhados os segmen os que se epe em e a ama elo a endonuclease BccI que pe mi e iden i ica o polimo ismo D631G), as sequências o am uncadas nos locais assinalados mas ex emidades Posição 779 3D7 762 a ga gaaaa ga ca------------------gaa ga cagaa gagcaa agcga acg ga a acgaca 822 bps 254 Y D E N D Q------------------ N D Q N E Q S D L R D I R H 274 a.a. Dd2 762 a ga gaaaa ga caaaa ga gaaaa ga cagaa ga cagaa gagcaa agcga acg ga a acgaca 840 bps 254 Y D E N D Q N D E N D Q N D Q N E Q S D L R D I R H 280 a.a D631G BCCI Posição 1947 3D7 1869 a g g ga ga a g gga ga a g g ga ga a g gga ga a g g aa ga a g gaa ga a g g 623 Y V D D Y V D D Y V D D Y V D D Y V N D Y V N D Y V Dd2 1887 a g g ga ga a g gga gg a g g ga ga a g gga ga a g g aa ga a g gga ga a g g 629 Y V D D Y V D G Y V D D Y V D D Y V N D Y V D D Y V 3D7 ------------------------ ------------------------ ------------------------ ga ga 1953 bps ------------------------ ------------------------ ------------------------ D D 651 a.a. D2d aa ga a g gga ga a g g aa ga a g gga ga a g g aa ga a g gga ga a g g ga ga 2043 bps N D Y V D D Y V N D Y V D D Y V N D Y V D D Y V D D 681 a.a. Posição 3591 3D7 3486 bps acccaaaaagaaac accaaaaa a ga aa aa aa ga aacaa aa ga aa aa aa ga aacaa aa ga aacaa aa ga 1162 a.a T Q K E T T K N Y D N N N D N N N D N N N D N N N D N N N D Dd2 3576 bps acccaaaaagaaac accaaaaa a ga aa aa aa ga aacaa aa ga aacaa aa ga aacaa aa ga aacaa aa ga 1192 a.a T Q K E T T K N Y D N N N D N N N D N N N D N N N D N N N D 3D7 aacaa aa ga aacaa aa ga aacaa aa ga aacaa aa aa aa aacaa aa aa g aa g ag aaggaaa ac c ca 3666 bps N N N D N N N D N N N D N N N N N N N N N V N V S K E I L S 1222 a.a. Dd2 aacaa aa aa aacaa aa ga aacaa aa ---------------aa aacaa aa aa g aa g ag aaggaaa ac c ca 3741 bps N N N N N N N D N N N - - - - - N N N N N V N V S K E I L S 1247 a.a. Anexos ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ 249 ANEXO 11 Repe ições na sequência do gene (p γ-gcs) e p o eína (PFI0925w)que codi ica a enzima γ-GCS nos clones 3D7 K1 HB3 e Dd2 de P. alcipa um ( os a.a. sublinhados co espondem a al e ações pon uais) 3D7 810 caacaa accaa cgaa acaacaacaa-------------------------------------------------------------------------- 270 Q Q Y Q S N L Q Q Q -------------------------------------------------------------------------- K1 810 caacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaaca 270 Q Q Y Q S N L Q Q Q Y Q S N L Q Q Q Y Q S N L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q HB3 810 caacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaaca 270 Q Q Y Q S N L Q Q Q Y Q S N L Q Q Q Y Q S N L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q Dd2 810 caacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaaca 270 Q Q Y Q S N L Q Q Q Y Q S N L Q Q R Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q 3d7 -------------------------------------------------------------------------------------------------- K1 accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaaca Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q HB3 accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaaca Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q C Q S D L Q Q Q Dd2 accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaaca Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q Y Q S D L Q Q Q 3d7 ------------------------------------------------ aa g a 836 bps ------------------------------------------------ N V 282 a.a K1 ------------------------------------------------- aa g a 1812 bps ------------------------------------------------- N V 334 a.a HB3 accaa cgaa acaacaacaa -------------------------aa g a 1836 bps Y Q S D L Q Q Q ------------------------- N V 342 a.a. Dd2 accaa cgaa acaacaacaa accaa cgaa acaacaacaa aa g a 1860 bps Y Q S D L Q Q Q C Q S D L Q Q Q N V 350 a.a. Anexos _____________________________________________________________________________________ 250 ANEXO 12 Isolados de P. alcipa um ag upados de aco do com as equências das inse ções/delecções nos genes p m p2 e p γ-gcs e a suscep ibilidade a cada á maco CQ - clo oquina; MEQ - me loquina; QN - quinino; AMQ - amodiaquina; S - sensí el; R – esis en e; Os núme o en e pa ên eses e e em-se ao núme o de isolados que ap esen a am in ecções mis as, não o am conside amos pa a o es udo da associação do genó ipo à espos a ao á maco. p m p2 p γ-gcs 779 1947 3591 1542 Fá maco Fenó ipo 1 2 1 3 4 5 9 8 1 10 8 9 S 4 12 10 2 4 1 14 2 1 5 7 3 MEF (N=47) R 24 7 12(8) 1 9(8) 0 5 26 7(4) 6(2) 6(2) 2(2) S 1 2 1 0 2 0 2 1 0 2 1 0 AMQ (N=10) R 3 4 3 0 4 0 6 1 0 2 3 2 S 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tailândia CQ (N=47) R 29 18 24(8) 0 15(8) 1 19 28 11(4) 12(2) 14(2) 5(2) S 17 7 10(2) 0 14(2) 0 10 14 5(2) 9(2) 4 4 MEF (N=39) R 10 5 7(2) 0 6(2) 0 8 7 3(2) 6(2) 2 2 S 15 11 13(2) 0 11(2) 0 17 11 7(2) 8(2) 5 4 QN (N=40) R 11 3 3 (2) 0 9(2) 0 5 7 1(2) 7(2) 2 2 S 3 0 0 0 3 0 1 2 0 3 0 0 Angola CQ (N=44) R 27 14 17(4) 0 20(4) 0 22 19 8(4) 15(4) 8 6 S 3 2 3 0 1 1 0(1) 3(1) 1 1 2 1 STP CQ (N=35) R 17(4) 9(4) 14(3) 0 1 10(3) 7(4) 20(4) 4(4) 12(4) 5 5 * e e en e ao clone 3D7; ** 5 epe ições da sequência NDYVDDYV. Anexos _____________________________________________________________________________________ 251 ANEXO 13 Isolados ag upados de aco do com a suscep ibilidade a cada á maco e as mu ações pon uais nos genes p m p1 e p m p2 (CQ - clo oquina; MEF - me loquina; QN - quinino; AMQ - amodiaquina; S - sensí el; R – esis en e). p m p1 p m p2 191 347 1390 631 Fá maco Fenó ipo H Y S A I F D G S 4 13 6 12 0 17 1 15 MEF (N=47) R 0 30 0 29 0 30 0 31 S 0 3 0 1 0 12 0 3 AMQ (N=10) R 1 6 2 7 0 25 0 7 S 0 0 0 0 0 0 0 0 Tailândia CQ (N=47) R 4 43 6 41 0 47 1 46 S 24 0 24 0 2 23 25 0 MEF (N=39) R 15 0 15 0 0 14 14 0 S 27 0 25 0 2 24 26 0 QN (N=40) R 13 0 15 0 0 14 14 0 S 0 0 3 0 0 3 3 0 Angola CQ (N=44) R 44 0 41 0 2 39 41 0 S 2 3 5 0 0 4 5 0 STP CQ (N=35) R 5 25 30 0 2 29 30 0 Anexos _____________________________________________________________________________________ 252 ANEXO 14 Núme o de cópias dos genes p md 1, p m p e p m p2 em isolados p o enien es da Tailândia e Angola. MEF - me loquina, AQ - amodiaquina; QN – quinino; S – sensí el; R – esis en e; média - média do núme o de cópias de cada gene; dp - des io pad ão; * - não o am a aliados os enó ipos dos isolados nes a egião, ela i os ao á maco; na – não a aliado o enó ipo do isolado ela i amen e ao á maco. № de cópias dos genes p md 1 p m p1 p m p2 amos a MEF AQ QN média dp média dp média dp 3D7 S S S 1 - 1 - 1 - clone Dd2 R R R 3,95 0,07 0,92 0,54 0,96 0,23 S90 S na S 1,8 0,57 1 0,01 1 0,01 S151 S R S 0,9 0,09 1,1 0,01 0,6 0,14 S152 S R S 2,0 0,39 0,7 0,06 0,7 0,05 S157 S S S 1,5 0,25 1 0,13 0,9 0,07 S160 S S S 3,8 0,50 1,2 0,04 0,7 0,08 CH1 S na S 1,5 0,00 1 0,05 0,6 0,11 TP7 S R S 1,9 0,24 0,6 0,02 0,4 0,04 TP13 S R S 1,5 0,00 1,3 0,01 0,5 0,09 TP20 R R S 2,5 0,01 0,6 0,06 0,8 0,01 RC17 R R S 3,4 0,44 0,9 0,04 0,7 0,03 T115 R na S 2,2 0,01 0,4 0,01 0,4 0,01 T130 R na S 3,5 0,03 0,9 0,3 0,5 0,09 TD14 R R S 2,6 0,23 0,4 0,08 0,5 0,07 TD8 R na S 5,1 0,83 0,8 0,01 0,4 0,11 Tailândia TD79 R S S 4,0 1,61 0,7 0,08 0,6 0,08 16 S * R 0,8 0,01 0,9 0,11 0,9 0,04 17 R * R 6,3 0,81 0,7 0,03 0,7 0,08 18 R * R 3,0 0,19 0,3 0,04 0,3 0,03 19 R * R 6,2 1,11 0,7 0,01 0,6 0,08 20 R * R 1,1 0,10 0,7 0,11 0,6 0,04 21 S * na 2,3 0,02 0,9 0,09 0,6 0,1 22 R * S 1,1 0,01 0,7 0,06 0,8 0,1 23 R * S 0,8 0,01 0,7 0,08 0,8 0,1 24 S * S 1,0 0,15 0,8 0,02 0,5 0,05 25 R * R 1,4 0,01 1,1 0,04 0,7 0,03 26 R * S 1,2 0,00 0,9 0,08 0,9 0,12 27 S * S 0,8 0,00 0,7 0,03 0,7 0,06 28 S * S 4,9 0,02 0,4 0,11 1 0,17 29 S * S 2,6 0,52 0,4 0,1 0,5 0,06 Angola 30 S * S 3,2 0,82 0,6 0,19 0,9 0,23 Anexos _____________________________________________________________________________________ 253 ANEXO 15 Pe is de exp essão dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2-cysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in ae i oci á io de P. alcipa um p esença e ausência de clo oquina. P Fe-sod 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 3.1×10-0 5 6.1×10-0 5 1.2×10-0 4 2.4×10-0 4 4.9×10-0 4 9.8×10-0 4 2.0×10-0 3 3.9×10-0 3 H s P γ-gcs 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 3.8×10-06 7.6×10-06 1.5×10-05 3.1×10-05 6.1×10-05 1.2×10-04 2.4×10-04 4.9×10-04 H s P g 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 1.9×10-0 6 3.8×10-0 6 7.6×10-0 6 1.5×10-0 5 3.1×10-0 5 6.1×10-0 5 1.2×10-0 4 2.4×10-0 4 4.9×10-0 4 H s P gs 04812 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 4.9×10 -0 4 9.8×10 -0 4 2.0×10 -0 3 3.9×10 -0 3 7.8×10 -0 3 0.015625 H s P gpx 04812 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 3.8×10 -0 6 7.6×10 -0 6 1.5×10 -0 5 3.1×10 -0 5 6.1×10 -0 5 1.2×10 -0 4 2.4×10 -0 4 4.9×10 -0 4 H s P T xR 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 1.2×10-0 4 2.4×10-0 4 4.9×10-0 4 9.8×10-0 4 2.0×10-0 3 3.9×10-0 3 H s P 2-Cys-Px 04812 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 4.8×10 -0 7 9.5×10 -0 7 1.9×10 -0 6 3.8×10 -0 6 7.6×10 -0 6 1.5×10 -0 5 3.1×10 -0 5 6.1×10 -0 5 H s P g6pd 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 6.1×10 -05 1.2×10 -04 2.4×10 -04 4.9×10 -04 9.8×10 -04 2.0×10 -03 3.9×10 -03 7.8×10 -03 H s P m p 04812 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 6.1×10 -0 5 1.2×10 -0 4 2.4×10 -0 4 4.9×10 -0 4 9.8×10 -0 4 2.0×10 -0 3 3.9×10 -0 3 7.8×10 -0 3 H s P m p2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 1.2×10-0 4 2.4×10-0 4 4.9×10-0 4 9.8×10-0 4 2.0×10-0 3 3.9×10-0 3 7.8×10-0 3 0.015625 H s Pe il de exp essão dos genes p Fe-sod, p γ-gcs, p g , p gs , p gpx, p xR, p 2- cysPx, p g6pd, p m p1 e p m p2 ao longo do ciclo in ae i oci á io do clone 3D7 de P. alcipa um. No eixo dos Y es á ep esen ada (escala loga í mica de base 2) a quan idade ela i a mRNA de cada gene (em elação ao con olo in e no, p RNA18S) de e minada segundo a equação ∆CT = (CT,al o− CT, con olo in e no); O eixo dos X, H s ep esen a a ho a após in asão em que oi e ec uada a colhei a da amos a. Anel (0-22 h), T o o. o ozoí o (22-34 h), Esqui. esquizon e (34-42h). Me o. me ozoí o (44-46h). As cu as cinzen o co espondem ao ensaio na ausência de clo oquina e a p e o na p esença de clo oquina pa a o mesmo gene. Glossá io _____________________________________________________________________________________ 260 Isolado: Amos a de sangue po Plasmodium alcipa um, colhido po punção enosa de um indi íduo in ec ado. Um isolado pode con e mais do que uma população pa asi á ia, gene icamen e homogénea, aqui denominada clone. Nucleó idos: Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) são o mados po sequências de nucleó idos. Um nucleo ido é uma associação en e uma base (pu ina ou pi imidina), uma ibose ou desoxi ibose (RNA ou DNA espec i amen e) e uma molécula de ácido os ó ico. ORF (open eading ame) sequencia de DNA que inicia com uma me ionina (ATG) e emina com um codão STOP (TAA, TAG ou TGA). Pa asi émia: P esença de pa asi as no sangue. P o eina ecombinan e: P o eina que con êm ligados de o ma co alen e segmen os p o enien es de duas ou pep idos di e en es. Resis ência: Capacidade de uma es i pe de pa asi as pa a sob e i e e se mul iplica em na p esença de um agen e an imalá ico em concen ações que no malmen e des oem ou impedem a mul iplicação dos pa asi as. Vec o es de clonagem – Elemen o gené ico au o- eplican e denominado ec o con endo o gene a se clonado, de o ma a p oduzi uma "molécula de DNA ecombinan e. O plasmídeo é seleccionado pa a uma dada expe iência de aco do com as suas ca ac e ís icas, es e de e anspo a um ou mais genes que lhe con i am p op iedades pa icula es, ais como a esis ência a ce os an ibió icos (Clo an enicol e Ampicilina) que possam se i como indicado es seleccioná eis. De e con e locais de econhecimen o onde as endonucleases o i ão co a de modo a pe mi i a inse ção de no os genes.