Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans

1 UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS Especialidade de Biologia Molecula em Medicina T opical e In e nacional Tipagem molecula de isolados clínicos e ambien ais de C yp ococcus neo o mans Inês Filipa Ho a Pancada Lopes da Sil a 2010 2 UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL Tipagem molecula de isolados clínicos e ambien ais de C yp ococcus neo o mans Disse ação de Mes ado em Ciências Biomédicas Inês Filipa Ho a Pancada Lopes da Sil a Tese ap esen ada pa a a ob enção do g au de Mes e em Ciências Biomédicas, especialidade de Biologia Molecula em Medicina T opical e In e nacional O ien ado a: In es igado a Dou o a Ma ia da Luz Ma ins Co-O ien ado : Dou o João Inácio 2010 3 Ag adecimen os A odos aqueles que, de alguma o ma, con ibuí am pa a a execução do abalho ap esen ado nes a disse ação. Ao Dou o João Inácio pela ajuda na escolha do ema e pelo apoio e disponibilidade demons ados du an e es e ano. À minha o ien ado a de ese, In es igado a Dou o a Ma ia da Luz Ma ins, po me e acei e como sua o ien anda, pelos seus sábios ensinamen os que mui o con ibuí am pa a a minha dedicação à Micologia Médica, pelos p eciosos e expe ien es conselhos em ho as mais di íceis da minha ida, pelo cons an e apoio, incen i o e eno me amizade demons ada. Aqui dedico o meu ag adecimen o e econhecimen o à sua disponibilidade, gene osidade, simpa ia, dedicação p o issional à sua pos u a como docen e e, p incipalmen e à an ás ica pessoa que é! Ob igada po udo! Ob igada po não e em desis ido de mim, quando eu p óp ia já não ac edi a a que osse possí el e mina es a ese de ido aos obs áculos e exigências impos as du an e es e empo. Aos meus colegas e p o esso es de Mes ado. Ao Edua do e à Ana So ia pelo companhei ismo e amizade du an e es es anos. À Ma isa pelos bons momen os pa ilhados, amizade… po udo! À Paula um ag adecimen o especial pela disponibilidade e ajuda pa a que udo osse possí el de se ealiza , pela amizade e pelos belos momen os de descon acção pa ilhados. Ag adeço a odos os meus amigos que semp e me apoia am e acompanha am, mesmo nas ho as mais di íceis. Ag adeço ao Ca los pelo apoio incondicional, amo , ca inho, comp eensão, e po udo, pois sem ele o na -se-ia udo ainda mais di ícil. À minha ilha, Ma ga ida, que esol eu ”apa ece ”, no ano cu icula des e mes ado, po odas as minhas ho as de ausência “ o çadas”, pela al a de empo, cansaço, po udo… Fos e a melho coisa que me acon eceu na ida! À minha amília, sem excepção, p incipalmen e ao meu Pai, ao meu Tio Tó-Zé, à minha Tia Lena, às minhas p imas po semp e ac edi a em em mim. Às minhas a ós po udo e po lhes pode da o p aze de me e em a e mina es e ão desejado mes ado. E po úl imo, um ag adecimen o mui o especial à minha Mãe po odo o apoio, ajuda, enco ajamen o cons an e, amizade e comp eensão nas ho as mais di íceis da minha ida! Po udo, sem excepção. A ela dedico odo es e abalho pois, mais uma ez, sem a sua ajuda, odo es e abalho não se ia possí el! 4 Resumo As micoses es ão incluídas en e as doenças in ecciosas mais ubíquas em odo o mundo, a ec ando odos os es a os sociais e odos os g upos e á ios numa a iedade de mani es ações supe iciais, cu âneas, subcu âneas e sis émicas. Um diagnós ico ápido e e icaz des as doenças, com uma co ec a iden i icação da espécie úngica esponsá el pela in ecção, é essencial pa a um planeamen o do a amen o mais e icaz pa a o doen e in ec ado. Tem-se egis ado um aumen o da incidência das in ecções úngicas ambém em consequência do aumen o do núme o de casos de doen es imunodep imidos, de ido pa icula men e à c escen e u ilização de e apêu icas imunossup essi as, p ocedimen os médicos in asi os, p esc ição de a amen os p olongados, en e ou os aspec os. O apa ecimen o da epidemia da Imunode iciência Humana no início da década de 80, causada pelo í us VIH, con ibuiu ambém decisi amen e pa a o aumen o das in ecções úngicas opo unis as. A C ip ococose é uma in ecção úngica, p edominan emen e opo unis a e com uma dis ibuição epidemiológica mundial, causada po le edu as encapsuladas do géne o C yp ococcus. A espécie clinicamen e mais ele an e é C yp ococcus neo o mans, cujas es i pes êm sido adicionalmen e classi icadas em cinco se o ipos elacionados com os an igénios da espec i a cápsula polissacá ida: A (C. neo o mans a . g ubii); D (C. neo o mans a . neo o mans); B e C (ac ualmen e econhecidos como uma espécie dis in a mas ilogene icamen e p óxima, C. ga ii); e AD (es i pes híb idas). O p esen e abalho e e como p incipal objec i o de e mina e ospec i amen e os ipos molecula es de uma colecção ala gada de es i pes de C. neo o mans, isoladas e man idas du an e os úl imos 18 anos no Labo a ó io de Micologia do IHMT/UNL. A maio ia das es i pes oi isolada de doen es imunodep imidos com c ip ococose, exis indo ambém algumas es i pes de o igem ambien al. Foi u ilizada a écnica de PCR-RFLP do gene URA5 pa a di e encia as es i pes de C yp ococcus neo o mans, endo sido de ec ados qua o ipos molecula es: VN1 e VN2 ( elacionados com C. neo o mans a . g ubii, se o ipo A); VN3 ( elacionado com as es i pes híb idas de se o ipo AD); e VN4 ( elacionado com C. neo o mans a . neo o mans, se o ipo D). Não o am encon ados en e os isolados de o igem clínica pe is de es ição co esponden es aos ipos molecula es VG1, VG2, VG3 e VG4 ( elacionados com C. ga ii, se o ipos B e C). O ipo molecula VN1 oi o mais abundan e en e os isolados de o igem clínica (45% dos isolados), seguindo-se o g upo de 5 es i pes híb idas do ipo molecula VN3 (31%). Os ipos molecula es menos abundan es en e os isolados o am o VN2 (12%) e VN4 (12%). A es anda dização do mé odo de ipagem molecula u ilizado nes e abalho pe mi e compa a os esul ados ob idos com os de ou os es udos epidemiológicos semelhan es, ealizados nou as egiões do globo e publicados em anos ecen es, con ibuindo pa a um conhecimen o melho ado da epidemiologia global des e impo an e ungo pa ogénico. Em Po ugal ob e e-se uma pe cen agem mais ele ada de isolados dos g upos molecula es VN1 e VN3 em elação a ou os países da Eu opa e Amé ica La ina, em que os ipos mais abundan es são VN1 e VN2. Nes as mesmas egiões, o ipo molecula VN4, elacionado com as es i pes de C. neo o mans a . neo o mans do se o ipo D, é mui o a o. Es a a iedade é mais comum em zonas medi e âneas e es á mui o associada a casos clínicos de in ecções cu âneas associadas a in ecções do Sis ema Ne oso Cen al. Es e ipo molecula pa ece se ambém signi ica i amen e mais abundan e no nosso país. 6 Abs ac Mycoses a e amongs he in ec ious diseases ha a e e y dange ous a ec ing all social s a us in se e al ways all o e he wo ld. These in ec ious diseases can be supe icial, cu aneous, subcu aneous and in asi e o sys emic, sp eading all o e he body. A as and e icien diagnosis o hese diseases, including a co ec iden i ica ion o he espec i e e iological agen s, is essen ial o plan he bes ea men o be applied o he pa ien s. An inc ease in he numbe o people in ec ed by ungal in ec ions is egis e ed wo ldwide, as a consequence o an inc ease in he numbe o cases o immunocomp omised pa ien s and o immunosupp essi e he apies, in asi e medical p ocedu es and p olonged p esc ibed ea men s, among o he aspec s. The ou come o he human immunode iciency epidemics a he beginning o he 80’s, caused by HIV, has also con ibu ed o he inc ease o he occu ence o oppo unis ic mycoses. C yp ococcosis is a ungal in ec ion caused by se e al species o C yp ococcus and p esen s a wo ldwide epidemiologic dis ibu ion. The mos clinically ele an species is C yp ococcus neo o mans, whose s ains ha e been adi ionally classi ied in o i e se o ypes ela ed wi h he an igens o he espec i e polysaccha ide capsules: se o ype A (C. neo o mans a . g ubii), D (C. neo o mans a . neo o mans); B and C (p esen ly ecognised as a dis inc bu closely ela ed species, C. ga ii); and AD (hyb id s ains). The main objec i e o his wo k was o e ospec i ely de e mine he molecula ypes o a la ge g oup o C. neo o mans s ains ha we e isola ed and main ained o he las 18 yea s in he Mycology lab o IHMT/UNL. Mos o hese s ains we e isola ed om immunocomp omised pa ien s wi h C yp ococcosis. The PCR-RFLP o he URA5 gene was used o di e en ia e he s ains. Fou molecula ypes we e de ec ed among he isola es: VN1 and VN2 ( ela ed o C. neo o mans a . g ubii, se o ype A); VN3 ( ela ed wi h hyb id s ains o he se o ype AD); and VN4 ( ela ed wi h C. neo o mans a . neo o mans, se o ype D). Molecula ypes VG1, VG2, VG3 and VG4, ela ed wi h C. ga ii, we e no ound. VN1 was he mos abundan molecula ype among clinical isola es (45% o he isola es), ollowed by VN3 (31%) and VN2 and VN4, bo h co esponding o 12% o he clinical isola es. The s anda dized yping me hod used in his wo k allowed compa ing ou esul s wi h o he ecen epidemiological s udies on he same subjec . In Po ugal we ha e ound a g ea e pe cen age o C. neo o mans molecula ypes VN1 and VN3 whils in o he Eu opean and La in Ame ican coun ies he mos abundan ypes we e 7 VN1 and VN2. Type VN4 was also ound o be mo e abundan in ou coun y. This ype seems o be common in Medi e anean a eas and is associa ed o cu aneous mani es a ions o in ec ions o he cen al ne ous sys em. 8 Lis a de ab e ia u as A Adenina AFLP Ampli ied agmen leng h polymo phism C Ci osina C. C yp ococcus DNA Ácido desoxi ibonucleico DNAses Desoxi ibonucleases dNTP Desoxi ibonucleó ido- i os a o EDTA Acido e ilenoamino e aacé ico E B B ome o de e ídio G Guanina GXM Glucu onoxilomanano IGS In e -Genic Space ITS In e nal T ansc ibed Space Regions LBA La ado b onco-al eola LCR Líquido ce alo aquidiano MS-PCR Mic o-sa elli e p imed PCR NASBA Nucleic acid sequence-based ampli ica ion NaCl Clo e o de sódio pb Pa es de bases PBS Tampão salino de os a o PCR Polyme ase chain eac ion RAPD Random ampli ica ion o polymo phic DNA DNA Ácido desoxi ibonucleico ibossómico RFLP Res ic ion agmen leng h polymo phism RNA Ácido ibonucleico pm Ro ações po minu o RNA Ácido ibonucleico ibossómico SIDA Sínd ome da imunode iciência adqui ida SNC Sis ema ne oso cen al sp. Espécie spp. Espécies T Timina Taq The mus aqua icus TBE Tampão T is, ácido bó ico e EDTA a . Va iedade VIH Ví us da imunode iciência adqui ida 9 Índice de ma é ias Ag adecimen os i Resumo ii Abs ac i Lis a de ab e ia u as i Índice de ma é ias ii Índice de igu as iii Índice de abelas ix 1. In odução ge al 1 1.1. Ca ac e ís icas ge ais dos ungos 2 1.2. Taxonomia 4 1.3. Impo ância clínica das micoses humanas 5 1.4. Diagnós ico labo a o ial das micoses 6 1.4.1. Diagnós ico con encional 6 1.4.2. Diagnós ico molecula 8 1.5. Objec i os do abalho e plano da disse ação 9 2. C yp ococcus neo o mans e a c ip ococose 10 2.1. Taxonomia de C yp ococcus neo o mans 10 2.2. Ecologia e epidemiologia de C yp ococcus neo o mans 12 2.3. Fac o es de i ulência de C yp ococcus neo o mans 13 2.4. Impo ância clínica e mani es ações da c ip ococose 16 3. Mé odos de diagnós ico labo a o ial e iden i icação de C yp ococcus neo o mans 19 3.1. Diagnós ico con encional 19 3.1.1. Exame di ec o das amos as 19 3.1.2. De ecção do an igénio c ip ococócico 21 3.1.3. Isolamen o em cul u a e iden i icação 22 3.1.4. Ou os mé odos de diagnós ico 24 3.1.5. Se o ipagem 25 3.2. Diagnós ico molecula de C yp ococcus neo o mans 25 3.3. Epidemiologia molecula de C yp ococcus neo o mans 27 4. Ma e iais e mé odos 29 4.1. Es i pes es udadas 29 4.2. Ex acção de DNA genómico 29 4.3. RFLP do gene URA5 30 4.4. Análise dos pe is elec o o é icos e dend og amas 31 5. Resul ados 32 5.1. Es i pes es udadas 32 5.2. RFLP do gene URA5 40 6. Discussão de esul ados e conside ações inais 46 7. Re e ências bibiog á icas 50 16 Ascomice as são ungos que ap esen am um micélio cons i uído po hi as sep adas. Es es ungos ep oduzem-se assexuadamen e po in e médio de conidióspo os e sexuadamen e po in e médio da o mação de ascóspo os, que são espo os haplóides exis en es em es u u as designadas de ascos. Milha es de ascos podem o ma um ascoca po. Ce ca de 90% dos ungos ou o a classi icados como Deu e omice as, ou ungos impe ei os, assim designados po não e em, ou não e sido ainda obse ada, uma ase sexuada de ep odução, o am eclassi icados como Ascomice as após o seu es udo com ecu so a écnicas de biologia molecula . É dis o um bom exemplo a le edu a pa ogénica opo unis a Candida albicans. Po úl imo, os Basidiomice as ap esen am ambém hi as sep adas. Es es ungos p oduzem um ipo de espo os sexuados, os basidióspo os, supo ados po uma es u u a ca ac e ís ica, com o ma de dedos, o basídio, p oduzido na ex emidade dis al de uma hi a binucleada. A maio pa e dos ungos basidiomice as são sap ó i as e decompõem ma é ia o gânica. Nes e g upo inclui-se a le edu a C yp ococcus neo o mans, um impo an e agen e pa ogénico em humanos esponsá el pela c ip ococose, objec o de es udo nes a disse ação, e que co esponde ao es ado anamó ico de Filobasidiella neo o mans. 1.3. Impo ância clínica das micoses humanas Denominam-se micoses às in ecções humanas ou animais o iginadas po ungos. Em Micologia Médica a classi icação das micoses elaciona-se com a sua localização no o ganismo humano. As micoses di idem-se em supe iciais, cu âneas, subcu âneas e sis émicas e, den o des as, as micoses opo unis as. Na Figu a 1.2. es ão ag upadas as micoses mais ele an es de aco do com a sua classi icação clínica. As micoses es ão a su gi , de uma o ma ge al, com cada ez com maio equência e g a idade. Es e ac o em o igem, como já a ás oi ealçado, não só no aumen o do núme o e equência das doenças c ónicas nos úl imos anos, mas ambém na c escen e u ilização de p á icas médicas e e apêu icas mais ag essi as e in asi as e na manu enção de doen es em es ados cada ez mais debili ados. Es as in ecções cons i uem cada ez mais um g a e p oblema de saúde pública, p incipalmen e em elação às micoses opo unis as. Nes as incluem-se igualmen e as que são adqui idas no p óp io ambien e hospi ala (in ecções nosocomiais), sob e as quais exis e ac ualmen e uma c escen e consciência e p eocupação is o induzi em mo bilidade e mo alidade ele adas. 17 Figu a 1.2. Classi icação clínica das p incipais in ecções úngicas Ac ualmen e, o maio desa io pa a os clínicos consis e, não só na a aliação do núme o e g a idade dos casos de in ecção, como ambém no acesso a um diagnós ico ápido e especí ico pa a o maio núme o possí el de micoses. 1.4. Diagnós ico labo a o ial das micoses 1.4.1. Diagnós ico con encional O diagnós ico labo a o ial é essencial pa a o conhecimen o da e iologia das doenças in ecciosas, a a és da iden i icação do agen e e iológico em causa. Ac ualmen e, o diagnós ico labo a o ial pode ambém inclui a a aliação da suscep ibilidade aos an imic obianos e a u ilização de écnicas molecula es de ipagem de mic o ganismos, pois es as são écnicas mui o mais sensí eis pa a a sua di e enciação in aspecí ica. Um diagnós ico micológico ápido possibili a a p esc ição a empada do a amen o an i úngico especí ico mais adequado, pe mi indo igualmen e o uso acional da e apêu ica e, des e modo, en e ou os ac o es, a p e enção do desen ol imen o de esis ências po pa e dos agen es e iológicos. Não obs an e a expe iência do micologis a, é p eciso e em con a que o isolamen o e iden i icação co ec a do ungo pa ogénico a pa i de ma e ial biológico só se ão possí eis se a colhei a e o anspo e das amos as biológicas o em adequadamen e ealizados. Tendo em con a que as micoses podem oco e em qualque localização do o ganismo 18 humano, é necessá io es abelece a me odologia de colhei a mais ap op iada pa a cada ipo de p odu o biológico. O ma e ial de e á se colhido, de p e e ência, no labo a ó io. No en an o, caso não seja possí el, es e de e á se apidamen e en iado pa a o mesmo, de modo a e i a possí eis con aminações ou pe da de iabilidade celula . Todas as amos as de em se anspo adas em ecipien es es e ilizados e p ocessadas o mais apidamen e possí el. Se o seu p ocessamen o não se ealiza a é no máximo ês ho as, as amos as de em se man idas a 4 ºC e nunca de em se congeladas. A amos a de e á se colhida an es do início de qualque e apêu ica, p incipalmen e de e apêu ica an i úngica, pa a não al e a a sin oma ologia e o aspec o das lesões e se ob e alsos esul ados labo a o iais. Caso o doen e já enha iniciado a aplicação de medicação ópica, que es a enha acção an i úngica ou não, de e á suspendê-la pelo menos uma semana an es da ealização da colhei a, uma ez que aquela pode di icul a a obse ação mic oscópica (exame di ec o) ou mesmo impedi o desen ol imen o do ungo em cul u a. Po úl imo, a colhei a de e con empla uma quan idade de ma e ial su icien e pa a a ealização de á ios exames, como sejam um ou mais exames di ec os, a ealização de mais do que um inóculo em di e en es meios de cul u a e em di e en es empe a u as de incubação e, e en ualmen e e cada ez mais equen e, pa a a ealização de es es molecula es. O esul ado do exame di ec o é mui o ápido, dado no malmen e no p óp io dia e, se o posi i o, pode o nece esul ados mui o an es das cul u as que le am dias ou semanas (B asil e al. 2003). No caso da le edu a C yp ococcus neo o mans, a ealização do exame di ec o com Tin a-da-China pe mi e a obse ação da p esença de cápsula ex acelula polissaca ídea p oduzida po es e mic o ganismo e, em poucos minu os, pode-se in o ma os clínicos da exis ência de in ecção (Ma ins, 2001). A p incipal limi ação do exame di ec o é o de se pouco sensí el ou incapaz, na maio ia dos casos, de possibili a a iden i icação do ungo ao ní el da espécie. Pa a esse e ei o é imp escindí el a ealização do exame cul u al, sendo essencial a escolha do meio de cul u a mais ap op iado que pe mi a o desen ol imen o de odo e qualque ungo que exis a nela. Es e de e se adicionado de ce os compos os que melho em o isolamen o dos ungos pa ogénicos, como po exemplo, o clo an enicol e a cicloheximida que inibem o c escimen o de ou os mic o ganismos, como as bac é ias e ou os ungos sap ó i as ilamen osos, espec i amen e. A empe a u a óp ima pa a o c escimen o da maio ia dos ungos pa ogénicos é de 30 ºC, apesa dos ungos ambém c esce em bem à empe a u a ambien e. A du ação da 19 incubação a ia mui o consoan e a espécie em causa. As le edu as necessi am en e 2 a 5 dias de incubação enquan o os ungos ilamen osos pa ogénicos podem exigi incubações de, pelo menos, 4 semanas pa a que se obse a desen ol imen o de colónias (De Hoog e al. 2000). A iden i icação das cul u as a ia ambém consoan e o ipo de ungo. As le edu as são iden i icadas, ge almen e, po mé odos bioquímicos enquan o os ungos ilamen osos são iden i icados po obse ação das suas ca ac e ís icas mac oscópicas e mic oscópicas. Embo a os mé odos con encionais de iden i icação sejam imp escindí eis pa a a iden i icação dos ungos causado es de uma in ecção, es es mé odos são no malmen e mo osos, p incipalmen e quando se a a de ungos ilamen osos. Se o ambém com emplado o empo necessá io pa a a ealização de es es de suscep ibilidade aos an i úngicos, ica se iamen e comp ome ida uma espos a em empo ú il, ão necessá ia pa a a p esc ição do a amen o mais adequado aos doen es. 1.4.2. Diagnós ico molecula O diagnós ico de le edu as pa ogénicas em-se baseado essencialmen e em ca ac e es mo ológicos, isiológicos e bioquímicos, mas não é a o su gi em di iculdades na iden i icação de alguns isolados de ido à a iabilidade na u al das espécies. Os mé odos eno ípicos não são, mui as ezes, su icien emen e iá eis e são, po ou o lado, abalhosos e mo osos. Embo a a in odução de me odologias enzimá icas e se ológicas enha con ibuído, nos úl imos anos, pa a ab e ia e, de ce a o ma, melho a a sensibilidade do diagnós ico labo a o ial, con inua a se essencial um mé odo de iden i icação ainda mais especí ico e sensí el que sa is aça de o ma e icaz as solici ações da clínica médica. O impac o c escen e da aplicação de écnicas molecula es, que na elucidação das elações ilogené icas en e di e en es g upos de o ganismos, que no desen ol imen o de no os mé odos de iden i icação e de ecção dos mesmos, em esul ado numa explosão de abalhos cien í icos e de aplicações come ciais que êm p ocu ado no diagnós ico molecula al e na i as à iden i icação e de ecção eno ípica adicional dos agen es causado es de doenças in ecciosas. O diagnós ico molecula é conside ado mais ápido, sensí el, especí ico e de ácil execução do que os mé odos con encionais, o que o o na undamen al quando há u gência no diagnós ico. No en an o, es es mé odos eque em no malmen e ecnologias mais so is icadas, sendo ambém po es e mo i o mais dispendiosos, pelo que a sua u ilização na o ina labo a o ial es á limi ada a apenas alguns labo a ó ios de diagnós ico (Ca alho e al. 2007; Lucas e al. 2010). 20 Têm sido desc i as á ias aplicações molecula es pa a o diagnós ico e moni o ização de in ecções úngicas, bem como pa a a ipagem dos isolados em es udos epidemiológicos. Es as aplicações u ilizadas na de ecção, iden i icação e ipagem de ungos pa ogénicos são, na sua maio pa e, baseadas na ampli icação de agmen os de DNA po PCR (Polyme ase Chain Reac ion). En e as me odologias mais u ilizadas pa a a iden i icação e ipagem de ungos con am-se a ca io ipagem elec o o é ica em campo pulsado (PFGE - Pulse Field Gel Elec opho esis) (Pe ec e al. 1989) e o es udo de polimo ismos de egiões mic osa éli es do DNA po ampli icação das mesmas com p ime s únicos (MS-PCR, do Inglês Mic o Sa elli e p imed-PCR), en e ou as (Ma ins, 2001). 1.5. Objec i os do abalho e plano da disse ação O p esen e abalho e e como p incipal objec i o ealiza um es udo e ospec i o de uma colecção ala gada de es i pes de C yp ococcus neo o mans, man idas no IHMT/UNL e na sua maio ia isoladas nos úl imos 18 anos a pa i de doen es imunocomp ome idos com c ip ococose, eco endo à sua ca ac e ização a a és da écnica de RFLP do gene URA5. Es a disse ação es á di idida em seis secções. Na p imei a secção é ei a uma in odução ge al à Micologia Médica, onde se des acam as ca ac e ís icas ge ais dos ungos e a sua axonomia, a impo ância clínica das micoses humanas e os mé odos ge ais u ilizados no diagnós ico labo a o ial das micoses. Na segunda secção é ei a uma análise ala gada sob e a c ip ococose e o seu p incipal agen e, a espécie C yp ococcus neo o mans. Os mé odos u ilizados no malmen e no diagnós ico labo a o ial e iden i icação des e agen e são desc i os na e cei a secção des a disse ação. Na qua a secção desc e em-se os ma e iais e mé odos u ilizados nes e abalho. A quin a secção co esponde aos esul ados ob idos e, inalmen e, na sex a e úl ima secção, é ei a uma análise c í ica e discussão dos esul ados e conside ações inais sob e o abalho. 21 2. C yp ococcus neo o mans e a c ip ococose As le edu as de in e esse clínico que causam in ecção no homem pe encem p incipalmen e a dois géne os, Candida e C yp ococcus. Nes e abalho conside amos a espécie C yp ococcus neo o mans no seu sen ido la o, que inclui as espécies ilogene icamen e mui o p óximas C. neo o mans e C. ga ii. C yp ococcus neo o mans é uma le edu a clinicamen e impo an e, causando meningoence ali e po encialmen e a al, podendo dissemina -se a ou os ó gãos ou sis emas. É conside ada uma le edu a pa ogénica opo unis a, sendo uma causa de in ecção mais equen emen e em doen es com de iciência imuni á ia celula (Hull & Hei man, 2002). C. neo o mans oi pela p imei a ez conside ado ungo pa ogénico pa a humanos em 1894. Po ém, só du an e a p imei a me ade do século XX é que oi consolidado o es a u o de C. neo o mans como o ganismo pa ogénico (Casade all & Pe ec , 1998). 2.1. Taxonomia de C yp ococcus neo o mans C yp ococcus neo o mans pe ence ao Filo Basidiomyco a. Possui uma o ma es é ica ou globula ca ac e ís ica, com diâme o ap oximado de dois a oi o mic ome os e com uma cápsula cons i uída po mucopolissacá idos (Figu a 2.1), a qual ce ca de 90% é cons i uída po gluco onoxilomananos (GXM; compos os po ácido glucu ónico, xilose e manose). Figu a 2.1. Células de C yp ococcus neo o mans em exame a esco de LCR de um doen e com c ip ococose, co ado com Tin a-da-China, a qual põe em e idência a cápsula (Fo og a ia do Labo a ó io de Micologia do IHMT). 22 São as di e enças na es u u a dos GXM da cápsula que cons i uem a base pa a a di e enciação de C. neo o mans em qua o se o ipos: A, B, C e D. Algumas es i pes possuem ainda ca ac e ís icas de ambos os se o ipos A e D, sendo classi icados como um quin o se o ipo, o se o ipo híb ido AD. T adicionalmen e, os cinco se o ipos pe enciam a duas a iedades, C. neo o mans a . neo o mans (se o ipos A, D e AD) e C. neo o mans a . ga ii (se o ipos B e C). Pos e io men e, F anzo e al. (1999), com base em ca ac e ís icas clínicas, molecula es e biológicas, p opuse am a subdi isão de C. neo o mans a . neo o mans em duas a iedades: C. neo o mans a . neo o mans (se o ipos D e AD) e C. neo o mans a . g ubii (se o ipo A). C yp ococcus neo o mans a . ga ii oi econhecido pela p imei a ez em 1970 e em sido di e enciado das es an es a iedades po ca ac e ís icas eno ípicas, habi a na u al, epidemiologia, mani es ações clínicas e espos a à e apêu ica an i úngica. Também as di e enças na sequência nucleo ídica do DNA ibossómico ( DNA) des as a iedades podem se i pa a di e enciá- las. Aliás, Boekhou e al. (2001) suge iu que C. neo o mans a . ga ii ep esen a uma espécie dis in a de ido às suas acen uadas di e gências molecula es, endo sido desc i a o malmen e pouco depois a espécie C yp ococcus ga ii (Kwon-Chung e al. 2002). A classi icação axonómica de C. neo o mans baseada em es udos sob e a homologia in e - e in aespecí ica do DNA e da análise de sequências de RNA ibossómico é ac ualmen e a mais acei e pela comunidade cien í ica e encon a-se esquema izada na Tabela 2.1. Tabela 2.1. Espécies e a iedades do complexo C yp ococcus neo o mans Espécies Se o ipos C. neo o mans A ( a iedade g ubii) AD (híb ido) D ( a iedade neo o mans) C. ga ii B C Rela i amen e à sua dis ibuição geog á ica, o se o ipo A (C. neo o mans a . g ubii) possui uma dis ibuição mundial, enquan o o se o ipo D (C. neo o mans a . neo o mans) p edomina nas zonas empe adas do con inen e eu opeu. Os se o ipos B e C (C. ga ii) são conside ados es i os a países de clima opical e sub opical. Di e enças na ole ância 23 é mica das a iedades g ubii e neo o mans ambém o am obse adas, sendo a segunda mais suscep í el às empe a u as mais ele adas. A descobe a do ciclo de ida comple o de C. neo o mans, em 1975, p opo cionou um g ande a anço no conhecimen o des a le edu a. Kwon-Chung e i icou que es e ungo exis ia sob dois ipos sexualmen e compa í eis que, após c uzamen o, p oduziam um basidiomice a eleomó ico (Casade all & Pe ec , 1998). A ase eleomó ica, apenas obse ada em labo a ó io, oi incluída no géne o Filobasidiella. Fo am assim encon ados dois es ados pe ei os, ou eleomó icos, de C. neo o mans nomeadamen e, Filobasidiella neo o mans, associado aos se o ipos A e D (Kwon-Chung, 1975), e Filobasidiella bacillispo a, associada aos se o ipos B e C (Kwon-Chung, 1976). Segundo es es au o es, a g ande di e ença exis en e en e es es dois es ados é que a segunda espécie p oduz basidióspo os de o ma globosa e com pa edes ugosas enquan o que Filobasidiella neo o mans ap esen a basidióspo os com pa edes lisas (Casade all & Pe ec , 1998). 2.2. Ecologia e epidemiologia de C yp ococcus neo o mans Se an es de 1980 a c ip ococose e a uma in ecção pouco equen e, no início da década de 90, com o aumen o do núme o de casos de SIDA, já e a uma micose epidémica em algumas egiões do Globo (Ma ins, 2001). Na Aus ália es a micose oco ia em 5,5% dos indi íduos in ec ados com VIH (Speed & Dun 1995) e na F ança em 4,8 a 7,8% dos indi íduos (D ome e al. 1996). No en an o, es a pe cen agem e elou-se bas an e supe io em Á ica, com uma p e alência de 15 a 30% (Clumeck e al. 1984; Desme e al. 1989). Dados epidemiológicos mos am ambém que a doença p edomina em indi íduos do sexo masculino e com idade en e 20 a 50 anos (D ome e al. 1996; Fe nandes e al. 2000; Mi za e al. 2003). Embo a não haja explicação biológica sa is a ó ia pa a o p edomínio da in ecção no sexo masculino, ac edi a-se que o sis ema imuni á io e a isiologia do hospedei o, assim como di e enças ho monais en e homens e mulhe es, possam se esponsá eis po es e p edomínio (Casade all & Pe ec 1998). Além da SIDA, a c ip ococose em sido ambém desc i a em indi íduos com doenças malignas, em a amen o p olongado com co icóides, em ansplan ados de ó gãos, com diabe es e com doenças euma ológicas e pulmona es c ónicas (Mi chell & Pe ec 1995). C yp ococcus neo o mans a . neo o mans é o agen e e iológico da maio pa e das in ecções c ip ococócicas no se humano e da quase o alidade das in ecções em doen es in ec ados pelo VIH, embo a ambas as a iedades de C. neo o mans causem in ecções com quad os 24 clínicos mui o semelhan es. A a iedade C. neo o mans a . ga ii a amen e é causa de in ecção disseminada em doen es com SIDA, mesmo nas á eas onde é endémica (Ab aham e al. 1997; Rozenbaum e al. 1992; Speed & Dun 1995). Ve i icou-se ambém que a mo alidade é mais ele ada nas in ecções causadas pela a iedade neo o mans (Fishe e al. 1993). C yp ococcus neo o mans é conside ada uma espécie cosmopoli a, ha endo e e ência des a a iedade em quase odos os países do mundo. Os seus habi a s na u ais mais impo an es são os exc emen os de pombos e o solo con aminado po eles e po ou as a es (Casade all & Pe ec , 1998; Lin & Hei man, 2006). A espécie C. ga i é encon ada em zonas mais es i as, p edominando em zonas opicais e sub- opicais, ge almen e associada a á ias espécies de eucalip o, nomeadamen e Eucalyp us camaldulensis, E. blakely, e E. e e ico nis, en e ou as espécies, e madei a em decomposição (Casade all & Pe ec , 1998). In ecções humanas com C. neo o mans a . neo o mans (com especial ên ase pa a o se o ipo AD) e C. neo o mans a . g ubii (se o ipo A) êm sido ela adas em odos os con inen es. O se o ipo A é o mais equen e em doen es com SIDA (Mi chell & Pe ec 1995; S eenbe gen & Casade all 2000; S ibu ee e al. 2004), sendo equen emen e encon ado nos Es ados Unidos da Amé ica, enquan o o se o ipo D se encon a com maio equência em de e minadas á eas da Eu opa, nomeadamen e na F ança (D ome e al. 1996) e I ália (G iseo & Gallo 1997; To o ano 1997). Recen emen e um su o de C. ga ii oi desc i o em Vancou e no Canadá, uma egião de clima empe ado (Kidd e al. 2004). Es a espécie es á mais elacionada com in ecção em indi íduos imunocompe en es, ha endo uma p edominância do se o ipo B. A c ip ococose causada po C. ga ii ap esen a- se ge almen e associada a ambien es com uma maio dis ibuição de á o es de Eucalip us calmaldulensis e E. e e ico nis (Ellis & P ei e 1992). Na Aus ália, onde oi ealizado um ex enso es udo sob e a epidemiologia des a espécie, o se o ipo B p edomina en e os isolados clínicos e ambien ais (So el e al. 1996a, 1996b). Cas añon-Oli a es e al. (2000) demons a am ambém a oco ência de ce ca de 10% de C. ga ii en e os isolados de agen es de c ip ococose no México. 2.3. Fac o es de i ulência de C yp ococcus neo o mans Os á ios ac o es que con ibuem pa a o es abelecimen o de uma in ecção são designados po ac o es de i ulência. Pa a que um o ganismo cause doença de e consegui en a no hospedei o, mul iplica -se nos seus ecidos, esis i aos espec i os mecanismos de de esa e 25 causa p ejuízo ao mesmo. A i ulência de um de e minado ungo não de e se a ibuída a um único ac o , mas a um conjun o de ac o es que, em conjun o, causam a in ecção p og essi a. A g a idade da in ecção causada po C. neo o mans em cada indi íduo esul a da combinação dos á ios ac o es de i ulência, da quan idade de inóculo e do es ado de suscep ibilidade imuni á ia do p óp io hospedei o. Como os indi íduos imunodep imidos são mais suscep í eis à in ecção po es a le edu a do que os indi íduos imunocompe en es, a espécie C. neo o mans é conside ada pa ogénica opo unis a. Fo am desc i os inúme os ac o es de i ulência em C. ne o mans, en e eles a p odução da cápsula polissaca ídea (Chang & Kwon-Chung 1994), a sín ese de melanina (Rhodes e al. 1982), a p odução de p o eases ex acelula es (B ueske 1986) e a capacidade de esis i à empe a u a de 37 ºC (Rhodes e al. 1982), en e ou os. As es i pes de C. neo o mans que são isoladas a pa i de doen es in ec ados são capazes de c esce a 37 ºC, de p oduzi a enzima enoloxidase e são, na maio ia das ezes, encapsuladas. Es as se ão as p op iedades essenciais pa a de ini a i ulência da es i pe (Mi chell & Pe ec , 1995). Po ou o lado, C. neo o mans demons a ambém capacidade de mic oe olução e swi ching eno ípico após a passagem de in i o pa a in i o e ice- e sa (Lin & Hei man, 2006). A mic oe olução pode á exp essa -se a a és da modi icação do enó ipo e do genó ipo das es i pes, enquan o o swi ching eno ípico esul a numa mudança e e sí el do enó ipo. Es e úlimo p ocesso inclui di e enças ao ní el da co e mo ologia da colónia, dimensões da cápsula, p odução de melanina, axa de c escimen o, i ulência no hospedei o e sensibilidade aos agen es an i úngicos (Lin & Hei man, 2006). Cápsula polissaca ídea A p odução de cápsula polissaca ídea oi o p imei o ac o de i ulência conhecido, que pe mi e dis ingui as células de C. neo o mans de odas as ou as le edu as de in e esse clínico. Con udo, não há elação en e amanho da cápsula e a i ulência. Têm sido isolados de doen es es i pes com cápsulas mui o eduzidas, pois num indi íduo com o sis ema imunológico su icien emen e debili ado, mesmo as es i pes acapsuladas podem causa doença. No en an o, a p esença de cápsula pe mi e ao ungo dissemina -se pa a o sis ema ne oso cen al e induzi uma espos a celula pulmona mais signi ica i a. A i ulência con e ida à le edu a pela cápsula pode de e -se às suas p op iedades biológicas, sendo a mais impo an e delas a inibição da agoci ose. A cápsula aumen a ainda a ca ga nega i a das células (Nosanchuck & Casade all 1997), inibe a mig ação de leucóci os, inac i a os an ico pos e es imula a o mação de edema ce eb al. A ac i idade 32 3.1.2. De ecção do an igénio c ip ococócico A de ecção do an igénio c ip ococócico é ei a po aglu inação de pa ículas de la ex sensibilizadas com an ico pos especí icos (Figu a 3.2). Há mui os es es come cializados, nomeadamen e os Pas o ex C yp o Plus® - Diagnos ics Pas eu , C yp o-LA Tes ® - Fumouze, e CALAS® - Me idian. Todos es es es es êm uma excelen e sensibilidade e especi icidade, embo a nem odos incluam con olos nega i os e alguns não u ilizem a enzima p o eolí ica p onase, que pe mi e melho a a sensibilidade e a especi icidade a é ce ca de 95% (Ma ins, 2001). Figu a 3.2. Tes e de aglu inação pa a de ecção de an igénio ci culan e de C. neo o mans. Resul ado posi i o (A) e nega i o (B) (Fo og a ia do Labo a ó io de Micologia do IHMT). Os es es que u ilizam a écnica ELISA (Enzyme-Linked Immunoso ben Assay) êm a an agem de pe mi i analisa mais apidamen e um núme o ele ado de amos as. No en an o, es es es es pe dem sensibilidade quando os í ulos dos an igénios são ele ados. Des e modo, em-se e elado mais ú il a alia a p og essão da in ecção s sucesso e apêu ico com es es de aglu inação. Há oda a con eniência que seja u ilizado semp e o mesmo es e no acompanhamen o de um doen e, pois podem e i ica -se a iações an igénicas signi ica i as com uma mesma amos a u ilizando es es di e en es. Exis em a iadas causas que pode ão o igina esul ados alsos posi i os (Ble ins e al. 1995; Engle & Shea 1994; Whi ie e al. 1994). Podem es a elacionadas com a p esença de ac o euma óide, con aminação da pipe a, desin ec an es ou de e gen es u ilizados na limpeza das lâminas de id o ou de idas a in ecções causadas po ou os ungos com eac i idade c uzada, como T ichospo on beigelli e, po encialmen e, ou as espécies de B A 33 C yp ococcus (Ble ins e al. 1995). Os alsos nega i os es ão elacionados com a não u ilização da enzima p onase (Ho mann e al. 1991) ou com os enómenos a os de p ozona que necessi am de uma diluição da amos a pa a objec i a a posi i idade e pa a os quais a p onase é ine icaz (Hamil on e al. 1991). Des e modo, nos casos em que há suspei a de c ip ococose é undamen al aze á ias diluições de odas as amos as nega i as. A não diminuição dos í ulos no LCR ou o seu aumen o du an e um a amen o em ase aguda es ão quase semp e elacionados com a ine icácia da e apêu ica. Do mesmo modo, o aumen o do í ulo du an e uma e apêu ica de manu enção é um o e indicado de ecidi a. Apesa das limi ações da écnica, a pesquisa sis emá ica do an igénio c ip ococócico em-se e elado ú il no diagnós ico p ecoce de c ip ococose nos doen es com SIDA. Nes es doen es, o an igénio c ip ococócico pode se de ec ado em p a icamen e 100% dos casos. Con udo, nos doen es imunocompe en es a de ecção do an igénio só é posi i a em ce ca de 60% dos casos de in ecção c ip ococócica con i mada po ou os mé odos. Sob o pon o de is a e apêu ico, Powde ly e al. (1994) conside am que a impo ância de uma modi icação dos í ulos an igénicos du an e o cu so de uma in ecção é mui o discu í el. Pa a es es au o es, as modi icações obse adas no so o dos doen es com SIDA não se co elacionam com a e olução da in ecção. 3.1.3. Isolamen o em cul u a e iden i icação Após a obse ação do exame di ec o da amos a biológica, o es an e sedimen o ob ido da cen i ugação do LCR é inoculado em meio de Sabou aud em ubo e incubado a 30 – 35 ºC. A cul u a des a le edu a é ela i amen e ácil de ob e em odos os meios habi ualmen e u ilizados pa a ungos (Ma ins, 2001), como o meio de Sabou aud dex ose aga , onde o ma colónias c emosas, mucóides, esb anquiçadas ou de co c eme, em ês a cinco dias após a inoculação (Figu a 3.3A), excep o na p esença de cicloheximida. O c escimen o de C yp ococcus é impedido em meios com cicloheximida, pois concen ações acima de 25 µg/ml inibem a maio ia dos isolados (Casade all & Pe ec , 1998). Segundo Ma ins (2001), pa a o isolamen o de C. neo o mans a pa i de p odu os biológicos habi ualmen e con aminados (p.e. expec o ação, u ina) é con enien e a adição de compos os an ibac e ianos (clo an enicol e/ou gen amicina) ao meio de cul u a pa a inibi o c escimen o de bac é ias. A mucosidade da colónia depende da cápsula da es i pe: quan o maio o a cápsula, mais mucóide é a colónia. 34 Pa a o isolamen o de C. neo o mans a pa i de p odu os biológicos habi ualmen e con aminados, como amos as do ac o espi a ó io, u ina ou amos as ambien ais, são usados meios especiais, que são selec i os e di e enciais, como é o caso do meio de “S aib” ou “Nige seed” aga (Guizo ia abyssinica) (Figu a 3.3B), con endo ácido ca eico, ou o meio de “Pal”, que u iliza um ex ac o aquoso de semen es de gi assol (Helian hus annuus). Nes es meios, C. neo o mans é capaz de sin e iza a enzima enoloxidase que ca alisa a oxidação de subs a os di enólicos em p odu os semelhan es à melanina. Es es meios azem com que as colónias des a le edu a adqui am uma co acas anhada, pe mi indo a sua di e enciação de ou as le edu as ais como Candida spp., ou mesmo de ou as espécies de C yp ococcus como C. lau en ii. É ambém con enien e a adição de compos os an ibac e ianos (clo am enicol e/ou gen amicina) ao meio de cul u a pa a impedi o c escimen o de bac é ias. Rela i amen e ao ipo de p odu o biológico passí el de se analisado po es e meio, a im de se ob e o isolamen o do ungo, somen e o sangue cons i ui excepção, como aliás acon ece pa a as ou as micoses p o undas. É de ealça que as hemocul u as posi i as co espondem a um mau p ognós ico e es ão associadas a uma mo alidade mui o ele ada. Figu a 3.3. (A) Colónias c emosas e mucóides de C. neo o mans em cul u a após 5 dias de incubação em meio de Sabou aud; (B) Cul u a mis a de Candida sp. e C. neo o mans em meio de S aib. As colónias acas anhadas são de C. neo o mans pois somen e es a espécie p oduz melanina (Fo og a ias do Labo a ó io de Micologia do IHMT).. De uma o ma ge al, C. neo o mans em capacidade de se mul iplica a 25 ºC e a 37 ºC e as colónias o nam-se isí eis ao im de 48 a 72 ho as de incubação em meio de aga de Sabou aud. Nas p imocul u as, o pe íodo pode se mais longo, chegando a 12 a 14 dias ou A B 35 mesmo a é ês semanas. A inoculação do sedimen o ob ido após cen i ugação de um olume signi ica i o de LCR (3 - 5 ml) aumen a a p obabilidade de ob enção de cul u as posi i as. No caso de C. ga ii, as cul u as são habi ualmen e de c escimen o mais len o pois eque em ce ca de 5 a 7 dias à empe a u a de 25 - 30ºC pa a as colónias se o na em isí eis. À empe a u a da 37 ºC es a a iedade c esce com di iculdade. Uma cul u a só de e se desca ada como nega i a após 15 dias de incubação. A sensibilidade e i icada na cul u a é de 75% pois em ce as si uações, como po exemplo na meningi e c ip ococócica c ónica, o LCR pode esul a em cul u a nega i a de ido à pequena ca ga de mic o ganismos iá eis. A baixa na concen ação de mic o ganismos iá eis é de ida, nes es casos, a a amen o p é io e o na-se um p oblema na moni o ização dos doen es c ónicos. A iden i icação da es i pe pu i icada é ei a com base em es es de assimilação de di e en es compos os e no es e da u ease. Pa a es e e ei o são habi ualmen e usados ki s come ciais (como po exemplo as gale ias API) ou mesmo sis emas au oma izados u ilizados na iden i icação das es an es le edu as de in e esse clínico. Mas, enquan o que nos labo a ó ios de diagnós ico dos hospi ais com g ande núme o de amos as po dia, se u ilizam meios au oma izados, nos labo a ó ios mais pequenos é mais comum a u ilização de ki s come ciais que se baseiam na análise das p op iedades isiológicas des a le edu a pa a a di e encia das es an es. 3.1.4. Ou os mé odos de diagnós ico A isualização in i o de C. neo o mans nos ecidos, ais como, biópsias de pele, pulmão e osso, pode se ei a a a és de colo ação, seguida da isualização mic oscópica. As écnicas de colo ação mais u ilizadas são Gomo i-G oco , PAS (Pe iodic Acid Schi ), hema oxilina-eosina, G am e mucica mina. Habi ualmen e, as células de C. neo o mans êm o ma globosa nos ecidos, podendo e en ualmen e ap esen a -se com o ma o al, e não induzem eacção ecidula . As células de C. ga ii êm em ge al o ma mais alongada. No en an o, du an e os p ocessos de colo ação as amos as são desid a adas, ixadas ao calo e co adas e as células podem eben a ou diminui de amanho o que di icul a a sua iden i icação. A al e ação da mo ologia das células é equen e nas p epa ações his ológicas e o na-se possí el con undi as células de C. neo o mans com as de ou os ungos, nomeadamen e com as de Blas omyces de ma i idis. 36 As écnicas imagiológicas, omog a ia axial compu ado izada (TAC) e essonância magné ica nuclea (RMN), podem se usadas no diagnós ico do en ol imen o meningoence álico, nomeadamen e pa a a de ecção de complicações como a hid oce alia, lesão ocupando espaço, a o ia co ical di usa ou edema ce eb al. Quando há suspei a clínica, a adiog a ia do ó ax pe mi e o diagnós ico em mais de 50% dos casos, apesa da ausência de especi icidade das lesões obse adas. Espécies do géne o C yp ococcus são, ge almen e, conside adas como le edu as não e men a i as, que assimilam inosi ol e p oduzem u ease. A p odução de u ease é uma p o a bioquímica u ilizada pa a iden i icação do géne o, pois as espécies de C yp ococcus são capazes de ealiza hid ólise da u eia. Es e ungo em a capacidade de p oduzi u ease em 15 min, enquan o ou as le edu as u ease posi i as necessi am de mais de ês ho as pa a que demons em essa ac i idade (Casade all & Pe ec , 1998). Embo a es a ca ac e ís ica enha indo a se u ilizada no diagnós ico ápido des a le edu a, apenas a a iedade neo o mans em uma eacção posi i a ao im desse empo, sendo C. ga ii mais len a (Ma ins, 2001). A u ease é inibida pela p esença de EDTA em C. ga ii, mas não em C. neo o mans. 3.1.5. Se o ipagem A classi icação dos se o ipos baseia-se nas di e enças an igénicas das es i pes de C. neo o mans quando as células são colocadas em p esença de an ico pos especí icos (Ikeda e al. 1985). A de inição dos ês p imei os se o ipos (A, B e C) oi baseada em eacções de aglu inação e p ecipi ação em so o imunizado de coelho (E ans 1949, 1950; E ans & Kessell 1951). Mais a de, Wilson e al. (1968) desc e e am o se o ipo D. O quin o se o ipo (AD) oi desc i o po Ikeda e al. (1985) e inclui o conjun o de es i pes que êm de e minan es an igénicos comuns aos se o ipos A e D. Fo am desen ol idos di e en es mé odos pa a a de e minação dos se o ipos de C. neo o mans, ais como os que en ol iam eacções de aglu inação, eacções capsula es, imunop ecipi ação e imuno luo escência (E ans 1960; Ikeda e al. 1996; Kaplan e al. 1981; Wilson e al. 1968). 3.2. Diagnós ico molecula de C yp ococcus neo o mans A maio ia dos mé odos molecula es de diagnós ico e de ipagem de C. neo o mans em po base a écnica de PCR, pois pa a além des a écnica se mui o álida p incipalmen e na sua acilidade, apidez, e sa ilidade e sensibilidade, é pa icula men e ú il em es udos 37 gené ico-molecula es pe mi indo es uda um g ande núme o de amos as. Es a écnica pe mi e a sín ese enzimá ica in i o de milhões de cópias de um segmen o especí ico de DNA na p esença da enzima polime ase de DNA e de p ime s especí icos (An onini e al. 2004; Ra on, 2004). Vá ios mé odos molecula es baseados em PCR êm sido u ilizados na ca ac e ização e iden i icação de C. neo o mans assim como em es udos epidemiológicos: PCR mul iplex, nes ed PCR, PCR em empo eal, AFLP (Ampli ied F agmen Leng h Polimo phism), RAPD ( andom ampli ied polymo phic DNA) e RFLP (Res ic ion F agmen Leng h Polimo phisms, baseado no gene URA5 e PLB1), en e mui as ou as écnicas (Ma ins, 2001). Mui as des as écnicas pe mi em ge a di e en es pad ões de ampli icação os quais possibili am, no caso especí ico de C. neo o mans, disc imina a iedades e ipos molecula es. Tanaka e al. (1996) iden i ica am C. neo o mans a pa i de amos as clínicas de doen es com c ip ococose pulmona a a és de um mé odo en ol endo duas eacções de PCR sucessi as (nes ed PCR), que pe mi em a ampli icação de DNA que es eja numa concen ação ela i amen e baixa. Rappelli e colabo ado es (1998) desen ol e am um mé odo que pe mi iu a iden i icação de C. neo o mans a pa i de LCR de doen es com meningi e c ip ococócica. Es a me odologia e elou-se bas an e sensí el, pois pe mi iu de ec a DNA de C. neo o mans no p odu o in ec ado com um eduzido núme o de células le edu i o mes po milili o. A escolha dos p ime s e a sua localização podem pe mi i uma ampli icação ca ac e ís ica de uma única espécie, g upo de espécies p óximas ou géne o. Também a u ilização de ecnologias iso é micas de ampli icação de DNA, como o LAMP (Loop-Media ed Iso he mal DNA Ampli ica ion) êm sido desen ol idas pa a a iden i icação de C. neo o mans (Lucas e al. 2010). Pa a além dos mé odos de de ecção di ec a de C. neo o mans po PCR, á ios ou os mé odos êm sido desc i os que azem uso de PCR em combinação com ou as écnicas, em que o p odu o de ampli icação é u ilizado como sonda pa a uma hib idação especí ica (Coglia i e al. 2000; E e sson e al. 2000) ou é sujei o à acção de enzimas de es ição que conduzem a pe is especí icos (Chen e al. 2000; Hop e e al. 1993). São ambém u ilizadas na ca ac e ização e iden i icação molecula de C. neo o mans, a hib idação po Sou he n blo com sondas de sequências epe i i as de DNA do mic o ganismo (Va ma e al. 1995) e hib idação in si u que, u ilizando sondas de DNA luo escen es (FISH – Fluo escence In Si u Hyb idiza ion), possibili a a de ecção de sequências al o localizadas no RNA de células in ac as (Ma ins e al. 2010). 38 Embo a es as écnicas molecula es pe mi am a ealização de um diagnós ico simples, ápido e ep odu í el, es as me odologias em a des an agem de di icilmen e se em quan i a i as, de apenas pe mi i em a de ecção dos mic o ganismos pa a os quais se u ilizam p ime s ou sondas especí icos, pa a além de ou os p oblemas associados à e icácia na ampli icação di ec a do DNA po PCR a pa i de amos as biológicas. Des e modo, os mé odos con encionais e os molecula es de em se enca ados como complemen a es en e si no diagnós ico de ungos pa ogénicos, incluindo da c ip ococose. 3.3. Epidemiologia molecula de C yp ococcus neo o mans Os p ocedimen os de ipagem molecula êm sido ú eis na ca ac e ização molecula de di e en es mic o ganismos in ecciosos no se humano e no conhecimen o da ecologia e epidemiologia da in ecção c ip ocócica, na en a i a de esponde ques ões elacionadas com a pa ogénese do ungo, com a de ecção de epidemias, com a dis inção de in ecção p imá ia ou ecidi a e a en a i a de elaciona o isolado com a on e de in ecção. A a iabilidade gené ica exis en e en e os isolados de uma de e minada espécie é impo an e po que pode in e e i com a a iabilidade eno ípica, com a di e ença na i ulência ou na suscep ibilidade aos agen es e apêu icos (F anzo e al. 1997). Mé odos de ipagem molecula , incluindo Random ampli ica ion o polymo phic DNA (RAPD), Polyme ase chain eac ion (PCR) inge p in ing, Res ic ion agmen leng h polymo phism (RFLPs), hib idização po Sou he n blo , ca io ipagem ele o o é ica do DNA en e ou os, êm sido u ilizados com o in ui o de ca ac e iza isolados de C. neo o mans em es udos epidemiológicos (Pe ec , e al. 1993; D ome e al. 1994; Va ma e al. 1995; B and e al. 1996; F anzo e al. 1997; Coglia i e al. 2000; Ga cia-He moso e al. 2001; Boekhou e al. 2001). Cada uma des as écnicas em mos ado uma e iden e he e ogenidade gené ica en e os isolados clínicos e ambien ais de C. neo o mans den o de uma á ea geog á ica es i a. A écnica de RFLP é u ilizada pa a di e encia mic o ganismos pelos pad ões de i ados da cli agem de seu DNA, cujos comp imen os dos agmen os p oduzidos podem di e i quando o DNA é dige ido com di e en es enzimas de es ição. A simila idade dos pad ões ob idos pode se usada pa a di e encia espécies e, a é, es i pes de uma mesma espécie. A aplicação da écnica de RFLP oi po exemplo u ilizada po F anzo e al. (1997) pa a ca ac e iza 51 isolados ambien ais e clínicos de C. neo o mans em duas cidades do B asil e ambém isolados de No a Io que. Es es in es igado es mos a am que alguns isolados do 39 B asil e de No a Io que es ão es ei amen e elacionados, suge indo uma dispe são global de ce os isolados. Numa e são de PCR inge p in ing, são u ilizados oligonucleo ídeos iniciado es que são especí icos pa a sequências mic ossa éli es/minissa éli es ou pa a sequências epe i i as hipe a iá eis de C. neo o mans, pe mi indo que os isolados sejam ipados com sensibilidade su icien e pa a de ec a di e enças in e - e in a- a iedades. U ilizando po exemplo os oligonucleó idos iniciado es (GACA)4, pa a egiões mic ossa éli es, e M13, pa a uma egião minissa éli e, a ampli icação do DNA de C. neo o mans esul a em p odu os que a iam de 500 a 2500 pb em amanho (Meye e al. 1999). Meye e al. 2003 u iliza am es es dois p ime s pa a in es iga a di e sidade global de C. neo o mans e seus esul ados pe mi i am ag upa os isolados clínicos e ambien ais em oi o ipos de pad ões molecula es p incipais: VNI (co esponden e a C. neo o mans a . g ubii, se ó ipo A); VNII ( ambém co esponden e a C. neo o mans a . g ubii, se ó ipo A); VNIII (es i pes híb idas de se ó ipo A/D); VNIV (co esponden e a C. neo o mans a . neo o mans, se ó ipo D); e VGI, VGII, VGIII e VGIV (co esponden es a C. neo o mans a . ga ii, se ó ipos B e C). Es es ipos molecula es o am ambém con i mados po análise de RFLP u ilizando os genes URA 5 e PLB1 (La ouche e al. 2003; Meye e al. 2003). Os genó ipos VNI e VGI são p edominan es mundialmen e pa a C. neo o mans a . g ubii e C. neo o mans a . ga ii, espec i amen e. Em in ecções em pacien es com VIH e i ica-se um p edomínio dos genó ipos VNI e VNIV. 40 4. Ma e iais e mé odos 4.1. Es i pes es udadas Nes e es udo o am es udadas 177 es i pes de C. neo o mans de á ias p o eniências, incluindo um conjun o de oi o es i pes de e e ência ep esen a i as de cada ipo molecula de C. neo o mans e de C. ga ii (de aco do com Meye e . al. 2003). Es as es i pes de e e ência o am as seguin es: WM 148 (Se o ipo A, ipo molecula VNI), WM 626 (Se o ipo A, VNII), WM 628 (Se o ipo AD, VNIII), WM 629 (Se o ipo D, VNIV), WM 179 (Se o ipo B, VGI), WM 178 (Se o ipo B, VGII), WM 161 (Se o ipo B, VGIII), e WM 779 (Se o ipo C, VGIV) (Tabela 5.1). Adicionalmen e, o am es udadas mais se e es i pes de e e ência ob idas da Po uguese Yeas Cul u e Collec ion (PYCC, Capa ica, Po ugal), incluindo a es i pe ipo de C. neo o mans (Tabela 5.1). Fo am es udados 135 isolados clínicos de C. neo o mans ob idos a pa i de amos as biológicas, p incipalmen e de LCR e de hemocul u as, p o enien es de doen es dis in os com c ip ococose in e nados em Unidades de In ecciologia de á ias unidades hospi ala es, p incipalmen e Po uguesas e da egião da G ande Lisboa (Tabela 5.2). Es as es i pes o am isoladas no pe íodo de 1991 a 2007 no Labo a ó io de Micologia do IHMT/UNL a pa i dos p odu os biológicos in ec ados p o enien es do Hospi al de Egas Moniz, Hospi al Mili a de Belém, Hospi al P isional de Caxias, Hospi al de Cascais, Hospi al Cu y Cab al, Hospi al San a Ma ia, Hospi al San o An ónio, Cen o Hospi ala de Coimb a, República da Guiné-Bissau e República de Angola. Fo am ambém incluídos nes e es udo 27 isolados ambien ais ob idos a pa i de ezes de pombo e de ma e ial ege al (Tabela 5.3). Todos os isolados o am man idos a 4 ºC em Sabou aud dex ose aga a é à ealização do es udo. Pa a pe íodos de a mazenamen o mais longos das cul u as, as mesmas o am congeladas em meio com glice ol a - 70ºC. Todos os isolados o am p e iamen e iden i icados como C. neo o mans a a és de mé odos con encionais de diagnós ico no labo a ó io de Micologia do IHMT/UNL. As es i pes são ambém man idas nes e labo a ó io. 4.2. Ex acção de DNA genómico Os isolados de C. neo o mans o am c escidos du an e 2 - 5 dias a 25 ºC em meio Sabou aud. Em seguida, pa indo de um inóculo o e, as células o am la adas, cen i ugadas e pos e io men e congeladas a – 80 ºC du an e 45 minu os, ou a – 20 ºC du an e 60 minu os, de modo a eben a as células. São adicionados ao sedimen o 250 µl 41 de TE Fenol (solução sa u ada com 10 ml T is-HCl, pH8; EDTA 1mM; a ase de enol es á a pH 6.7), 250 µl de clo o ó mio e 500 µl ampão de lise (NaCl 1 M, T is-HCl 1 M, pH8, EDTA 10 mM, pH8, SDS 10%, T i on X-100). A suspensão é agi ada no o ex, cen i ugando-se no amen e em seguida. Adiciona-se 400 µl do sob enadan e ob ido a 1 ml de e anol absolu o (pa a p ecipi a o DNA). Os ubos são colocados a - 80ºC du an e 45 minu os, após o que se cen i uga, desca a-se o sob enadan e e seca-se o sedimen o pa a emoção de odo o e anol. Finalmen e, o sedimen o é dissol ido em TE (T is-HCl 1 M, EDTA 10 mM, pH8) a 55 ºC du an e 15 minu os. Pos e io men e, o DNA assim ex aído oi diluído (1:50) em água bides ilada es e ilizada pa a se p ocede às eacções de PCR. 4.3. RFLP do gene URA5 A écnica de RFLP do gene URA5 oi ealizada de aco do com o desc i o po Meye e al. (2003). B e emen e, pa a a ampli icação do gene URA5 po PCR, as mis u as eaccionais con inham ce ca de 50 ng de DNA, ampão de PCR 1x, 0,2 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl2, uma unidade de Taq polime ase e 50 ng de cada um dos p ime s (URA5 , 5-ATG TCC TCC CAA GCC CTC GAC TCC G-3´; e URA5 , 5´-TTA AGA CCT CTG AAC ACC GTA CTC-3´). As eacções de ampli icação comp eende am os seguin es passos: desna u ação inicial a 94 ºC du an e 3 minu os, seguido de 35 ciclos de 45 segundos a 94 ºC, 1 minu o a 61 ºC e 2 minu os a 72 ºC, seguido de um passo de ex ensão inal a 72 ºC du an e 10 minu os. As eacções o am ealizadas num e mociclado UnoII The mal Cycle (Biome a). Após as eacções de ampli icação oi ei a a con i mação da exis ência de p odu o ampli icado po meio de uma elec o o ese em gel de aga ose (Gibco, BRL, Reino Unido) a 1%, co ado com GelRed® inco po ado de aco do com as ins uções do ab ican e. Ao p odu o da eacção de PCR oi adicionada solução de deposição – ampão azul de b omo enol (30% p/ glice ol, 0,25% azul de b omo enol, 2 mM de EDTA). Em cada gel oi usado o ma cado de pesos molecula es GeneRule TM 100 bp (FERMENTAS, Canada). A elec o o ese deco eu a 100 V em ampão TBE 0,5x, du an e 30 minu os, u ilizando-se o Aga ose Gel Elec opho esis Sys em (BIORAD, F anca) pa a o e ei o. As bandas de DNA o am isualizadas num ansiluminado de luz UV e as imagens cap adas num apa elho UVIdoc (U iTec, Reino Unido). Os p odu os de PCR o am dige idos simul aneamen e com duas enzimas de es ição, a 37 ºC du an e oda a noi e: SAU96I e HhaI (New England BioLabs), de aco do com as ins uções do ab ican e. Os agmen os dige idos o am sepa ados em gel de elec o o ese a 3% a 50 V du an e 270 minu os. Os 48 Tabela 5.2. (Con .) Nº. Es i pe Amos a Sexo Idade Hospi al Da a1 Se ó ipo2 Tipo Molecula 3 253 LCR M 36 HSM 2004 - VN1 255 Sangue M 42 HSM 2005 - VN3 256 LCR M 39 HSM 2005 - VN1 258 Sangue M 58 HSM 2005 - VN2 259 LCR M 47 HSM 2006 - VN1 260 LCR M 26 HSM 2006 - VN3 262 Sangue M 32 HSM 2006 - VN2 264 LCR M 49 HSM 2006 - VN3 265 LCR M 50 HPC 2006 - VN1 267 LCR M 36 HSM 2006 - VN1 269 LCR M 41 HSM 2006 - VN3 270 LCR F 48 HEM 2006 - VN1 272 LCR M 37 HSM 2007 - VN1 274 Sangue F 47 HSM 2007 - VN1 275 LCR M 37 HSM 2007 - VN1 278 LCR M 47 HSM 2007 - VN3 311 LCR - - Vila Real 2007 - VN2 1Da a de en ada do isolado na colecção do Labo a ó io de Micologia do IHMT/UNL; 2De aco do com Ma ins (2001); 3De e minado po RFLP do gene URA5, de aco do com Meye e al. (2003); LCR – Líquido ce alo aquidiano; HEM - Hospi al de Egas Moniz, Lisboa; HMB - Hospi al Mili a de Belém, Lisboa; HPC - Hospi al P isional de Caxias, Lisboa; HC - Hospi al de Cascais, Cascais; HCC - Hospi al Cu y Cab al, Lisboa; HSM - Hospi al San a Ma ia, Lisboa; HSA - Hospi al San o An ónio; CHC - Cen o Hospi ala de Coimb a, Coimb a; IPO – Ins i u o Po uguês de Oncologia, Lisboa; IHMT – Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, Lisboa [No a: Pa e dos ipos molecula es ap esen ados nes a abela o am de e minados pela D a. Ana Paula Madu o, IHMT/UNL] 49 Tabela 5.3. Es i pes de o igem ambien al u ilizadas e espec i as amos as e locais de o igem, da a de isolamen o e ipo molecula Nº. Es i pe Amos a e local Da a Tipo molecula 1 113 Fezes de pombo, Lisboa 1997 VN1 114 Fezes de pombo, Lisboa 1997 VN1 115 Fezes de pombo, Lisboa 1997 VN1 116 Fezes de pombo, Lisboa 1997 VN1 279 Ma e ial Vege al, Vila Real 2007 VN1 281 Ma e ial Vege al, Vila Real 2007 VN1 282 Ma e ial Vege al, Vila Real 2007 VN1 283 Ma e ial Vege al, Vila Real 2007 VN1 284 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 285 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 286 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 287 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 288 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 289 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN3 290 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN3 292 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN1 293 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN1 295 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 296 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 297 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 298 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN1 299 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 302 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 303 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 304 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 305 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN1 307 Fezes de Pombo, Vila Real 2007 VN4 1De e minado po RFLP do gene URA5, de aco do com Meye e al. (2003); [No a: Pa e dos ipos molecula es ap esen ados nes a abela o am de e minados pela D a. Ana Paula Madu o, IHMT/UNL] 50 Das es i pes clínicas com o igem em p odu os biológicos in ec ados, na sua esmagado a maio ia ob idas de doen es in ec ados pelo í us da imunode iciência humana adqui ida, ce ca de 82% o am isoladas a pa i de líquido ce alo aquidiano (LCR) e apenas ce ca de 15% co espondiam a hemocul u as (Figu a 5.1A). Ce ca de 85% dos isolados clínicos o am ob idos a pa i de pacien es do sexo masculino (Figu a 5.1B). Ce ca de 40% dos doen es in ec ados com C. ne o mans inha idades comp eendidas en e 30 e 39 anos e ce ca de 22% inham idades in e io es a 30 anos (Figu a 5.1C). Ce ca de me ade das es i pes o am isoladas no pe íodo en e os anos de 1991 a 1999 e as es an es no pe íodo comp eendido en e 2000 e 2007 (Figu a 5.1D). Dos isolados ambien ais, ce ca de 85% das es i pes o am isoladas a pa i de ezes de pombos. 0 20 40 60 80 100 120 LCR Sangue Pele 108 (82%) 20 (15%) 4 (3%) Nº. de isolados Amos a biológica A 0 20 40 60 80 100 120 Masculino Feminino 113 (85%) 17 (13%) Nº. de isolados Sexo dos doen es B 0 10 20 30 40 50 60 < 30 30 -39 40 -49 50 -59 > 60 28 (22%) 51 (40%) 26 (20%) 16 (12%) 8 (6%) Nº. de isolados Idade dos doen es (anos) C 0 20 40 60 80 100 120 1991 -1999 2000 -2007 67 (50%) 68 (50%) Nº. de isolados Ano de en ada dos isolados na colecção D Figu a 5.1. Dis ibuição dos isolados clínicos de C. ne o mans es udados po amos a de o igem (A), sexo (B), idade dos doen es in ec ados (C) e ano de en ada da es i pe na colecção de cul u as do IHMT (D). 51 5.2. RFLP do gene URA5 Como se p e endia es uda o pe il genómico de isolados clínicos e ambien ais de C. neo o mans e compa á-los aos esul ados ob idos em ou os es udos ealizados nou as egiões do globo, po ou os au o es, o mé odo de ipagem molecula u ilizado nes e abalho oi idên ico ao po eles adop ado (RFLP do gene URA5, de aco do com Meye e al. 2003). Os pe is de es ição das es i pes de e e ência no malmen e u ilizadas nes a me odologia (es i pes “WM”, e Tabela 5.1), e ambém u ilizadas nes e abalho, encon am-se ilus ados na Figu a 5.2. Figu a 5.2. Pe is de es ição do gene URA5 com as enzimas Sau96I e HhaI das es i pes de e e ência ep esen an es dos á ios ipos molecula es desc i os de C. neo o mans (imagem adap ada de T illes e al. 2008) Ob i e am-se pe is de es ição do gene URA5 dis in os pa a cada isolado de o igem clínica e ambien al, que o am conco dan es com um dos pe is das es i pes de e e ência u ilizadas, pe mi indo uma ápida iden i icação do ipo molecula espec i o. As es i pes de e e ência u ilizadas como con olo demons a am ambém pe is idên icos aos desc i os na li e a u a pa a as mesmas. Na Figu a 5.3 encon am-se ilus ados os esul ados ob idos pa a alguns dos isolados clínicos e ambien ais de C. neo o mans es ados. Os pe is de RFLP de odos os isolados clínicos e ambien ais, e das es i pes de e e ência, o am combinados num dend og ama (Figu a 5.4). Os esul ados de alhados da de e minação dos 52 ipos molecula es pa a odas as es i pes de e e ência, clínicas e ambien ais encon am-se nas Tabelas 5.1, 5.2 e 5.3, espec i amen e. CN 5 (VN1) CN 26 (VN1) CN 58 (VN1) CN 63 (VN1) CN 199 (VN1) CN 274 (VN1) CN 161 (VN1) CN 182 (VN1) CN 4 (VN1) CN 7 (VN1) CN 10 (VN1) CN 15 (VN1) CN 18 (VN1) CN 20 (VN1) CN 27 (VN1) CN 31 (VN1) CN 33 (VN1) CN 113 (VN1) CN 279 (VN1) CN 283 (VN1) CN 292 (VN1) CN 293 (VN1) CN 135 (VN1) CN 114 (VN1) WM 148 (VN1) CN 68 (VN4) CN 146 (VN4) CN 1 (VN4) CN 11 (VN4) CN 11 (VN4) CN 36 (VN4) CN 53 (VN4) CN 54 (VN4) CN 11 (VN4) CN 284 (VN4) CN 48 (VN3) CN 73 (VN3) CN 61 (VN3) CN 86 (VN3) CN 165 (VN3) CN 213 (VN3) CN 229 (VN3) CN 71 (VN3) CN 255 (VN3) CN 289 (VN3) CN 290 (VN3) CN 137T (VN3) CN 47 (VN3) CN 278 (VN3) CN 269 (VN3) CN 260 (VN3) CN 241 (VN3) CN 238 (VN3) CN 211 (VN3) CN 209 (VN3) CN 193 (VN3) CN 190 (VN3) WM 628 (VN3) CN 240 (VN2) CN 262 (VN2) CN 122 (VN2) WM 626 (VN2) CN 236 (VN3) CN 179 (VN3) CN 139 (VG3) CN 149 (VG3) CN 139 (VG3) CN 149 (VG3) WM 178 (VG2) MM M M M M M Figu a 5.3. Ilus ação dos pe is de es ição do gene URA5 com as enzimas Sau96I e HhaI pa a alguns dos isolados clínicos, ambien ais e de e e ência de C. neo o mans es ados; M – Ma cado de pesos molecula es GeneRule TM 100 bp (FERMENTAS) 53 VN IV VG I VN III VN II VG II VG IV VG III VN I CN48 CN86 CN218 CN260 CN16 CN47 CN73 CN213 CN255 CN25 CN91 CN178 CN269 CN21 CN49 CN90 CN264 CN43 CN71 CN165 CN241 CN12 WM628 CN70 CN211 CN117 CN190 CN229 CN289 CN29 CN51 CN179 CN278 CN64 CN61 CN125 CN193 CN290 CN66 CN238 CN40 CN65 CN130 CN209 CN236 CN122 CN206 CN24 WM626 CN180 CN246 CN155 CN244 CN247 CN220 CN258 CN204 CN249 CN243 CN311 CN240 WM178 CN151 WM779 CN149 WM161 CN139 CN56 CN58 CN44 CN46 CN197 CN253 CN196 CN194 CN245 CN305 CN88 CN182 CN282 CN281 CN222 CN279 CN186 CN298 CN183 CN231 CN292 CN293 CN181 CN227 CN283 CN166 CN274 CN123 CN216 CN219 CN275 CN126 CN5 CN15 CN7 CN10 CN4 CN20 CN26 CN18 CN27 CN31 CN33 CN37 CN39 WM148 CN34 CN113 CN147 CN94 CN135 CN202 CN259 CN114 CN152 CN265 CN93 CN133 CN201 CN89 CN199 CN256 CN116 CN154 CN115 CN157 CN207 CN267 CN121 CN161 CN272 CN118 CN159 CN214 CN270 CN11 CN36 CN53 CN54 CN68 CN72 CN79 CN80 CN1 CN103 CN109 CN120 CN127 CN146 CN162 CN284 CN285 CN286 CN287 CN288 CN295 CN296 CN297 CN299 CN302 CN304 CN307 WM629 CN230 CN303 WM179 Figu a 5.4. Dend og ama baseado no ag upamen o dos pe is de es ição do gene URA5 com as enzimas Sau96I e HhaI dos isolados clínicos, ambien ais e de e e ência de C. neo o mans es ados. As semelhanças en e os á ios pe is elec o o é icos o am es imadas com o coe icien e de Pea son e os ag upamen os o mados u ilizando o mé odo UPGMA (GelCompa , e são 1.01, Applied Ma hs) 54 Ve i icou-se a exis ência de qua o ipos molecula es p incipais en e os isolados clínicos e ambien ais de C. neo o mans es udados: VN1 e VN2, associados a es i pes de se ó ipo A, VN3, associadas ao se ó ipo AD, e VN4, associadas ao se ó ipo D. Não o am encon adas es i pes ep esen an es de C yp ococcus ga ii en e os isolados (co esponden es aos ipos molecula es VG1, VG2, VG3 ou VG4). Globalmen e, o ipo molecula VN1 oi o mais abundan e en e os isolados de o igem clínica (45% dos isolados), seguindo-se o g upo de es i pes híb idas co esponden es ao ipo molecula VN3 (31% dos isolados) (Figu a 5.5A). Os ipos molecula es VN2 e VN4 o am os menos abundan es, co espondendo cada ipo a ce ca de 12% dos isolados (Figu a5.5A). No que espei a especi icamen e às cul u as de C. neo o mans isoladas de amos as de LCR, a dis ibuição dos isolados pelos ipos molecula es é semelhan e à an e io e oi a seguin e: 47% co espondiam ao ipo VN1, 12% ao ipo VN2, 28% ao ipo VN3 e 13% ao ipo VN4 (Figu a 5.5B). Já em elação às hemocul u as analisadas, e i icou-se que os isolados do ipo molecula VN3 o am mais abundan es (45%) que os do ipo VN1 (35%), seguidos dos ipos molecula es VN2 (15%) e VN4 (5%) (Figu a 5.5C). No en an o, oi analisado um núme o eduzido de hemocul u as de C. neo o mans, quando compa ado com o núme o de cul u as p o enien es de LCR. Das qua o cul u as isoladas de biopsias cu âneas, uma co espondia ao ipo molecula VN1, duas ao VN3 e uma ao VN4 (Tabela 5.2). Cu iosamen e, obse a am-se algumas al e ações no pad ão de abundância de alguns ipos molecula es de C. neo o mans nos dois pe íodos 1991-1999 e 2000-2007 (Figu a 5.5D). O ipo molecula VN1 man ém-se mais abundan e em ambos os pe íodos (40% e 50% dos isolados em 1991-1999 e 2000-2007, espec i amen e), seguido pelo ipo molecula VN3 (36% e 26% dos isolados em 1991-1999 e 2000-2007, espec i amen e). Apa en emen e, os isolados de C. neo o mans do ipo VN1 ganha am ainda mais p edominância no segundo, e mais ecen e, pe íodo. Po ou o lado, e i icou-se uma mudança d ás ica nas abundâncias dos ipos molecula es VN2 e VN4 en e os dois pe íodos. O ipo molecula VN4 e a o e cei o mais abundan e no pe íodo 1991-1999 (21% dos isolados), com a de ecção de apenas algumas poucas es i pes do ipo molecula VN2 (3%). Es as posições in e e am-se o almen e no pe íodo 2000-2007, com a de ecção de 21% de isolados do ipo VN2 e apenas 3% do ipo VN4 (Figu a 5.5D). O ipo molecula VN1 de C. neo o mans oi semp e o mais de ec ado em odas as gamas de idades dos doen es in ec ados, com excepção da gama dos 40 aos 49 anos, em que o 55 ipo mais abundan e oi o VN3 (Figu a 5.5E). Também de des aca a ausência de isolados do ipo VN2 nos doen es in ec ados com menos de 30 anos idade (Figu a 5.5E). 1991-1999 2000-2007 0 5 10 15 20 25 30 35 40 VN1 VN2 VN3 VN4 27 (40%) 2 (3%) 24 (36%) 14 (21%) 34 (50%) 14 (21%) 18 (26%) 2 (3%) Nº. de isolados Tipos molecula es 0 10 20 30 40 50 60 70 VN1 VN2 VN3 VN4 61 (45%) 16 (12%) 42 (31%) 16 (12%) Nº. de isolados Tipos molecula es A 0 10 20 30 40 50 60 VN1 VN2 VN3 VN4 51 (47%) 13 (12%) 30 (28%) 14 (13%) Nº. de isolados Tipos molecula es B 0 10 20 30 40 50 60 VN1 VN2 VN3 VN4 7 (35%) 3 (15%) 9 (45%) 1 (5%) Nº. de isolados Tipos molecula es C 0 5 10 15 20 25 < 30 30 -39 40 -49 50 -59 > 60 15 (54%) 21 (41%) 9 (35%) 7 (44%) 7 (88%) 0 7 (14%) 4 (15%) 4 (25%) 0 8 (29%) 16 (31%) 11 (42%) 4 (25%) 0 5 (18%) 7 (14%) 2 (8%) 1 (6%) 1 (12%) Nº. de isolados Gama de idades (anos) VN1 VN2 VN3 VN4 E D Figu a 5.5. Dis ibuição dos ipos molecula es de C yp ococcus neo o mans encon ados en e os isolados de o igem clínica em unção de núme o o al dos isolados (A), dos isolados a pa i de LCR (B) e de sangue (C), dos isolados em unção da da a de en ada na colecção do IHMT (D), co esponden es ambém à sua da a de isolamen o, e em unção da gama de idades dos doen es in ec ados (E) To al das Amos as LCR Sangue 56 Rela i amen e aos isolados de C. neo o mans de o igem ambien al, em que a maio ia é p o enien e de ezes de pombos, 44% co espondiam ao ipo VN1, 7% ao ipo VN3 e 48% ao ipo VN4 (Figu a 5.6). Não oi encon ada nenhuma es i pe de o igem ambien al co esponden e ao ipo molecula VN2 ou aos ipos associados a C. ga ii. É de ealça a apa en e abundância dos isolados do ipo molecula VN4 nas amos as ambien ais de ezes de pombos, apesa des e ipo de C. neo o mans se dos menos abundan es en e os isolados de amos as de doen es in ec ados. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 VN1 VN2 VN3 VN4 12 (44%) 0 2 (7%) 13 (48%) Nº. de isolados Tipos molecula es Figu a 5.6. Dis ibuição dos ipos molecula es encon ados en e os isolados ambien ais de C yp ococcus neo o mans Ambien ais 57 6. Discussão de esul ados e conside ações inais O aumen o do núme o de casos de micoses in asi as nos úl imos anos, ambém de ido ao aumen o do núme o de doen es imunodep imidos, como é o caso dos doen es in ec ados com o í us VIH e doen es ansplan ados, en e ou os, em ei o com que es as in ecções se o nem cada ez mais ele an es pa a a saúde pública. A c ip ococose é uma das micoses mais comuns e le ais nos doen es com SIDA, sendo p e alen e em Á ica, nomeadamen e na Á ica Cen al. A le edu a pa ogénica opo unis a C yp ococus neo o mans, no seu sen ido la o (que inclui ambém a espécie elacionada C yp ococcus ga ii), é a p incipal esponsá el po es as in ecções úngicas. Têm sido ealizados á ios es udos de epidemiologia molecula de C. neo o mans e exis em ac ualmen e mé odos de ipagem molecula es minimamen e es anda dizados pa a es es ungos. Um des es mé odos, dos mais u ilizados pa a a ipagem de C. neo o mans, baseia-se na análise dos pe is de es ição enzimá ica do gene URA5, que pe mi e di e encia os isolados em oi o ipos molecula es: VN1, VN2, VN3 e VN4 (sub- ipos de C. neo o mans) e VG1, VG2, VG3 e VG4 (sub- ipos de C. ga ii) (Meye e al. 2003). A aplicação des e mé odo, e de ou os elacionados e compa á eis, po di e sos au o es de á ias egiões do Globo, em con ibuído pa a um conhecimen o melho ado da epidemiologia de C. neo o mans e da c ip ococose. Assim, e como já a ás oi ealçado nes a disse ação, é sabido que o ipo molecula VN1 é o mais encon ado em á ias egiões do globo, com ên ase pa a os países da Amé ica La ina (Meye e al. 1999, 2003), como po exemplo o B asil (And ade-Sil a e al. 2010; Casali e al. 2003; Ig eja e al. 2004; T illes e al. 2008) e a Colômbia (Escandon e al. 2006). Es e ipo molecula VN1 co esponde ambém à esmagado a maio ia dos isolados de C. neo o mans de países asiá icos como Taiwan (Liaw e al. 2009) e a China (Feng e al. 2008). O ipo molecula VN2 é equen emen e o segundo mais abundan e nos países da Amé ica La ina e da Amé ica do No e, Aus ália, en e ou as egiões (Meye e al. 1999). Ou os ipos molecula es são bas an e menos abundan es, incluindo os elacionados com C. ga ii. Aliás, á ios au o es apon am pa a que a maio ia das in ecções po C. neo o mans de em- se à a iedade C. neo o mans a . g ubii, se ó ipo A, cujos isolados se dis ibuem pelos ipos molecula es VN1 e VN2. Es udos mais de alhados sob e a epidemiologia molecula de C. neo o mans em Países Eu opeus são escassos e limi ados, nomeadamen e quan o ao eduzido núme o de es i pes no malmen e es udadas. No en an o, exis em e idências de 64  GUREVITZ, O., GOLDSCHMIED-REUVEN, A., BLOCK, C., KOPOLOVIC, J., FARFEL, Z., HASSIN, D. 1994. C yp ococcus neo o mans e eb al os eomyeli is. J. Med. Ve . Mycol. 32: 315-318.  HAMILTON, J.R., NOBLE, A., DENNING, D.W., STEVENS, D.A. 1991. Pe o mance o C yp ococcus An igen la ex agglu ina ion Ki s on se um and ce eb ospinal luid specimens o AIDS pa ien s be o e and a e p onase ea men . J. Clin. Mic obiol. 29: 333-339.  HOFFMANN, S., STENDERUP, J., MATHIESEN, L. R. 1991. Low yield o sc eening o c yp ococcal an igen by la ex agglu ina ion assay on se um and ce eb ospinal luid om Danish pa ien s wi h AIDS o ARC. Scand. J. In ec . Dis. 23: 697-702.  HOPFER, R.L., WALDEN, P., SETTERQUIST, S., HIGHSMITH, W.E. 1993. 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