Pesquisa de assinaturas de seleção de malária na região do gene humano TPI (triosefosfato isomerase)

Uni e sidade No a de Lisboa Ins i u o de Higiene e Medicina T opical Pesquisa de assina u as de seleção de malá ia na egião do gene humano TPI ( iose os a o isome ase) Mónica Susana Cos a Gue a DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM PARASITOLOGIA MÉDICA OUTUBRO, 2012 Pesquisa de assina u as de seleção de malá ia na egião do gene humano TPI ( iose os a o isome ase) Mónica Susana Cos a Gue a Licenciada em Ciências Biomédicas pela Uni e sidade do Alga e Disse ação ap esen ada pa a cump imen o dos equisi os necessá ios à ob enção do g au de Mes e em Pa asi ologia Médica, ealizada sob o ien ação cien í ica da In es igado a Dou o a Ana Paula A ez O ien ado a: In es igado a Dou o a Ana Paula A ez Cen o de Malá ia e ou as Doenças T opicais (CMDT) Ins i u o de Higiene e Medicina T opical Co-O ien ado : Dou o Licínio Manco Cen o de In es igação em An opologia e Saúde (CIAS) Faculdade de Ciências e Tecnologias da Uni e sidade de Coimb a OUTUBRO, 2012 Aos meus pais e i mã … iii AGRADECIMENTOS Começo po ag adece a oda a di eção e docência do XI Mes ado em Pa asi ologia Médica, pela excelência como conduzi am es es dois anos, an o a ní el p o issional como pessoal. Um ag adecimen o especial ao P o esso Dou o Paulo Almeida po oda a dedicação p es ada e, à P o esso a Dou o a Lénea Campino pelo en usiasmo que demons a nas suas aulas, o que indi e amen e delibe ou a minha escolha pela á ea da Pa asi ologia. Ag adeço à In es igado a Dou o a Ana Paula A ez po e acei ado o ien a -me nes e abalho e po oda a dedicação, mo i ação, aliosos comen á ios e co eções c uciais na elabo ação des a disse ação. Ag adeço ao Dou o Licínio Manco a coo ien ação des a disse ação, bem como oda a disponibilidade, apoio, acompanhamen o, espi i o c í ico e en usiamo pela emá ica abo dada nes a ese, aduzindo-se em impo an es con ibuições nes e abalho. Um ag adecimen o e nu en o à equipa das “Mixin ec ”, em especial à C is ina Mendes e à Pa ícia Machado po oda a amizade, paciência, dedicação, ajuda e aconselhamen o ao longo des e úl imo ano. Um ag adecimen o especial a odos os meus colegas e amigos de mes ado, Ana Filipa Teixei a, Vasco Go dicho, Má io da Cos a, Lis Coelho, Isa Pi es, A le e T oco Miguel Landum, Idalécia Moiane e Ana Sousa pela g ande cumplicidade e amizade an o nos momen os de “gló ia” como nos de desânimo. Com ocês i i bons momen os da minha ida, ob igada po udo o que pa ilhamos. Ag adeço em especial à Ana Filipa Teixei a, que me em acompanhado ao longo des es 5 anos. Ob igada po oda a amizade. Ag adeço à Raquel San os pela sua amabilidade, disponibilidade e acolhimen o na cidade de Coimb a. Aos meus p imos e companhei os de casa João Mon ei o, Pa ícia Gue a e Liliana Gue a p incipalmen e po me “a u a em” odos os dias, ob igada pela ossa dedicação e g ande mo i ação cons an e. Po úl imo, mas em p imei o luga no meu co ação, aos meus amados pais Fe nando e Fá ima pelo eno me exemplo que são pa a mim, po odos os sac i ícios que i êm ei o, po aquele ab aço inexplicá el que me eca ega “as ba e ias” odos os ins- -de-semana. Espe o um dia consegui se como ocês e ansmi i odo o amo que me êm dedicado. Ag adeço ca inhosamen e “à minha menina”, a minha i mã Ma iana, po exis i na minha ida. Um mui o ob igada! RESUMO Pesquisa de assina u as de seleção de malá ia na egião do gene humano TPI ( iose os a o isome ase) Mónica Susana Cos a Gue a PALAVRAS-CHAVE: Malá ia, população A icana, T iose os a o isome ase (TPI), a ian es do p omo o do gene TPI, mu ação, in eção, e olução humana, me abolismo e i oci á io A malá ia con inua a se a maio causa de doença e mo alidade no Mundo, sob e udo no con inen e A icano. Das cinco espécies do pa asi a causado de malá ia em humanos, Plasmodium alcipa um é a mais le al. Em e mos e olu i os a malá ia é um enómeno ecen e com ce ca de 10 000 anos, pe íodo onde em a uado como impo an e p essão sele i a no genoma humano, con ibuindo pa a a seleção de inúme os polimo ismos que p opiciam maio esis ência ao p o ozoá io pa asi a. Apesa da in e ação en e o pa asi a e o hospedei o se oco de inúme os es udos, é bas an e complexa e ainda es á longe de se o almen e comp eendida, nomeadamen e os a o es de susce ibilidade/ esis ência à in eção ou à doença. Es e es udo e e como p incipal obje i o con ibui pa a o es udo dos polimo ismos e i oci á ios associados à p o eção con a a in eção malá ica g a e, cen ando-se no gene TPI que codi ica uma enzima glicolí ica. Foi selecionada uma amos a populacional A icana (Moçambique) ag upada de aco do com a g a idade da doença (g upos clínicos). Fez-se o as eio dos exões do gene TPI po SSCP, na busca de al e ações no pad ão de mig ação dos p odu os ampli icados, indiciado es de al e ações na sequência nucleo ídica que pudessem se assina u as de e en uais e ei os e olu i os exe cidos pela malá ia; ca ac e iza am-se as a ian es do p omo o do gene TPI: -5A>G, -8G>A e -24T>G; e analisou-se o polimo ismo in ónico 2262 si uado no in ão 5. Es a análise pe mi iu iden i ica o polimo ismo -8G>A como possí el ma cado associado à p o eção con a a malá ia, obse ando-se di e enças es a is icamen e signi ica i as en e doen es com malá ia g a e e não-g a e [P = 0,032; OR = 0,230 (CI95%: 0,049-1,081)], quando associado ao hapló ipo -5G/-8A/2262G. A a és de um es udo de mic ossa éli es nas egiões adjacen es ao gene TPI, es imou-se a an iguidade dos polimo ismos -5G>A e -8G>A, endo-se ob ido a idade de ~20 mil anos e ~14 mil anos, espe i amen e. Ao ní el bioquímico, o polimo ismo -8G>A pode á es a associado à acumulação celula de me ilglioxal ci o óxico, um po en e inibido da p oli e ação pa asi á ia. i ABSTRACT Looking o selec ion signa u es o mala ia in he human TPI ( iosephospha e isome ase) gene egion Mónica Susana Cos a Gue a KEYWORDS: Mala ia, A ican popula ion, T iosephospha e isome ase (TPI), TPI gene p omo e a ian s, mu a ion, in ec ion, human e olu ion, e y h ocy e me abolism Mala ia emains a wo ld majo cause o mo bidi y and mo ali y, especially in A ica. The e a e i e pa asi e species ha cause mala ia in humans, being Plasmodium alcipa um he mos le hal. In e olu iona y e ms, mala ia is a ecen phenomenon wi h abou 10 000 yea s, a pe iod o e which i has ac ed as an impo an selec i e o ce on he human genome, con ibu ing o he selec ion o se e al polymo phisms ha con e g ea e esis ance o he p o ozoan pa asi e. Al hough pa asi e/hos in e ac ion has been in ensely s udied, i is ex emely complex and is a om being o ally unde s ood, pa icula ly he ac o s o suscep ibili y / esis ance o in ec ion. This s udy aimed o con ibu e o he knowledge o e y h ocy e polymo phisms associa ed wi h p o ec ion agains se e e mala ial in ec ion, ocusing on he TPI gene ha encodes a glycoly ic enzyme. An A ican popula ion sample (Mozambique) was g ouped acco ding o he se e i y o disease (clinical g oups). A sc eening o he exons o he TPI gene by SSCP was pe o med o sea ch o mig a ion al e a ion pa e ns o ampli ied p oduc s sugges i e o changes in nucleo ide sequence which could be signa u es o possible e olu i e e ec s exe ed by mala ia; TPI gene p omo e a ian s -5A>G, -8G>A and - 24T>G we e cha ac e ized; and an in agenic polymo phic ma ke 2262 wi hin in on 5 was s udied. This analysis allowed iden i ying a polymo phism -8G>A as a possible ma ke associa ed wi h p o ec ion agains se e e mala ia, as showed by he signi ican di e ences be ween pa ien s wi h se e e and non-se e e mala ial in ec ion [P = 0,032; OR = 0,230 (CI95%: 0,049-1,081)]. This polymo phism was associa ed wi h he haplo ype -5G/-8A/2262G. The age o -5G>A and -8G>A polymo phisms was es ima ed, h ough a s udy o mic osa elli es in adjacen egions o he TPI gene, co esponding o he age o ~20 000 yea s and ~14 000 yea s, espec i ely. Biochemically, -8G>A polymo phism may be associa ed wi h cellula accumula ion o cy o oxic me hylglyoxal, a po en inhibi o o pa asi e p oli e a ion. ii ABREVIATURAS AGEs P odu os a ançados de glicação AgNO3 Ni a o de p a a Ass In eção malá ica assin omá ica ATN1 P o eína a o ina 1 ATP Adenosina- i os a o BSA Albumina de so o bo ino CD Clus e o di e en ia ion CEIHMT Conselho de É ica do IHMT CPE Cap p oximal elemen CR E y h ocy e – complemen ecep o CS P o eínas ci cum-espo ozoí icas DHA Dihid oxiace ona não os o ilada DHAP Fos a o de dihid oxiace ona DNA Ácido desoxi ibonucleico dNTP 3’- deoxinucleósido - 5’- i os a os DRPLA A o ia den a o ub al-pallidoluysian EBA E y h ocy e-binding an igen EDTA Ácido e ilenodiamino e a-acé ico EIR Taxa de inoculação en omológica G In eção malá ica g a e G3P Glice aldeído-3- os a o G3PD Glice aldeído-3- os a o-desid ogenase G6PD Glucose-6- os a o-desid ogenase g.l. G aus de libe dade GSH Glu a iona H0 Hipó ese nula H1 Hipó ese al e na i a Hb Hemoglobina iii HBF Hemoglobina e al He He e ozigo ia espe ada HK Hexocinase Ho He e ozigo ia obse ada HWE Equilíb io de Ha dy-Weinbe g IC50 Concen ação necessá ia pa a a ingi 50% de inibição IC95% In e alo de con iança a 95% IgM Imunoglobulina M IgG Imunoglobulina G IHMT Ins i u o de Higiene e Medicina T opical LDH Lac a o desid ogenase MG Me ilglioxal MgCl2 Clo e o de magnésio NADP Nico inamida adenina dinucleó ido os a o NADPH Nico inamida adenina dinucleó ido os a o eduzido NG In eção malá ica não-g a e OMS O ganização Mundial de Saúde OR Odds a io P. Plasmodium P P obabilidade (P- alue) pb Pa es de bases PCR Polyme ase chain eac ion PCR-RFLP PCR - Res ic ion F agmen Leng h Polymo phism PCR-SSCP PCR- Single-S and Con o ma ional Polymo phism P AQP Aquaglice opo ina de P. alcipa um P EMP P. alcipa um E y ocy e Memb ane P o ein PFK Fos o u ocinase P GAPDH Enzima GAPDH de P. alcipa um PGI Fos oglicose isome ase PGK Fos oglice a o cinase PGM Fos oglice a o mu ase PK Pi u a o cinase x Figu aVI.2: Fo mação, ea i idade e des oxi icação do me ilglioxal em e i óci os pa asi ados. ..................................................................................................................... 69 x i ÍNDICE DE TABELAS Tabela I.1: Ca ac e ís icas das espécies de Plasmodium sp. causado as de malá ia em humanos ............................................................................................................................ 3 Tabela I.2: Fa o es que in luenciam o quad o clínico obse ado na in eção malá ica ... 9 Tabela I.3: Classi icação de endemicidade ................................................................... 12 Tabela I.4: Polimo ismos e i oci á ios associados à p o eção con a a in eção malá ica g a e. ............................................................................................................................... 16 Tabela I.5: Classes da de iciência em G6PD ................................................................. 19 Tabela I.6: Polimo ismos desc i os no gene TPI ......................................................... 24 Tabela II.1: Mis u a de eação pa a ampli icação da egião p omo o a do gene TPI ... 33 Tabela II.2: Condições de ampli icação da egião p omo o a do gene TPI .................. 34 Tabela II.3: Composição da mis u a de eação pa a a es ição enzimá ica com TseI e MscI ................................................................................................................................ 34 Tabela II.4: Composição da mis u a de eação pa a a es ição enzimá ica com S cI .. 35 Tabela II.5: Condições da diges ão enzimá ica das enzimas TseI, MscI e S cI e espe i os amanhos dos agmen os espe ados .............................................................. 35 Tabela II.6: Mis u a de eação pa a ampli icação da egião con endo a mu ação Glu104Asp do gene TPI ................................................................................................. 36 Tabela II.7: Condições de ampli icação da egião con endo a mu ação Glu104Asp do gene TPI .......................................................................................................................... 36 Tabela II.8: Composição da mis u a de eação pa a a es ição enzimá ica com DdeI . 36 Tabela II.9: Condições da diges ão enzimá ica da enzima DdeI, e espe i os amanhos dos agmen os espe ados ............................................................................................... 37 x ii Tabela II.10: Oligonucleó idos especí icos usados pa a a ampli icação dos á ios agmen os do gene TPI, amanho dos agmen os ampli icados e empe a u a de hib idação no PCR .......................................................................................................... 38 Tabela II.11: Mis u a de eação pa a ampli icação dos agmen os especí icos do gene TPI .................................................................................................................................. 39 Tabela II.12: Condição da ele o o ese da eação de SSCP, consoan e o agmen o a analisa ............................................................................................................................ 39 Tabela II.13: Ca ac e ís icas dos STRs em es udo ........................................................ 40 Tabela II.14: Oligonucleó idos especí icos pa a cada STR e espec i as empe a u as de hib idização ................................................................................................................ 41 Tabela II.15: Condições da eação de PCR, u ilizando o ki Mul iplex PCR Qiagen ... 41 Tabela II.16: Exemplo de uma abela 2  2 usada no cálculo do odds a io. ................. 45 Tabela III.1: Ca ac e ís icas dos SNPs analisados nes e es udo p esen es no gene TPI ....................................................................................................................................... .47 Tabela III.2: Dis ibuição geno ípica das a ian es do p omo o da TPI na amos a o al e nos á ios g upos clínicos de malá ia .......................................................................... 48 Tabela III.3: F equências alélicas dos SNPs em es udo no gene TPI em doen es de malá ia ............................................................................................................................ 52 Tabela III.4: F equências haplo ípicas en e os SNPs em es udo no gene TPI em doen es de malá ia .......................................................................................................... 53 Tabela III.5: Desequilíb io de linkage en e os SNPs es udados nos di e en es g upos clínicos de malá ia .......................................................................................................... 53 Tabela III.6: Hapló ipos, ge ados pela associação do mic ossa éli e (CTTTT)n e os polimo ismos -5 e -8 da egião p omo o a do gene TPI e espe i as equências absolu as. ......................................................................................................................... 54 Tabela III.7: Hapló ipos, ge ados pela associação do mic ossa éli e (CAG)n e os polimo ismos -5 e -8 da egião p omo o a do gene TPI e espe i as equências absolu as .......................................................................................................................... 55 x iii Tabela III.8: Hapló ipos, ge ados pela associação do mic ossa éli e (CTA)n e os polimo ismos -5 e -8 da egião p omo o a do gene TPI e espe i as equências absolu as. ......................................................................................................................... 56 Tabela III.9: Desequilíb io de linkage en e SNPs e STRs nos di e en es g upos clínicos de malá ia .......................................................................................................... 57 Tabela III.10: Es udo da di e sidade gené ica de cada mic ossa éli e a a és do alo de equilíb io de Ha dy-Weinbe g e espe i os alo es de he e ozigo ia obse ada e espe ada .......................................................................................................................... 57 Tabela III.11: An iguidade es imada pa a os polimo ismos -5 e -8 (nos backg ounds -5A-8G e -5G-8G) e espe i os des ios-pad ão, com base na a iação acumulada pa a cada mic ossa éli e (CTTTT)n e (CAG)n, e a média en e es as idades calculadas em ge ações e anos. Foi conside ado o alo de 25 anos po ge ação. ................................. 58 1 I - INTRODUÇÃO In odução ____________________________________________________________________________________ 2 1. Malá ia 1.1 Con ex ualização Também conhecida como paludismo, es a pa ologia já emon a à e a p é-C is ã, endo sido p imei amen e ci ada po Hipóc a es que desc e eu alguns sin omas. No en an o, oi somen e no início do século XIX que o e mo malá ia e e o igem. A malá ia em sido a doença in eciosa com maio impac o na his ó ia mundial, pois, com exceção da ube culose, a malá ia ma a mais do que qualque ou a doença ansmissí el no Mundo. Segundo o ela ó io da O ganização Mundial de Saúde (OMS) (WHO, 2011), que eúne dados de 106 países onde a malá ia é endémica (99 países ou á eas onde oco e ansmissão de malá ia e 7 países que se encon am na ase de p e enção da ein odução), em 2010 o am es imados 216 milhões de casos em odo o Mundo, dos quais 655 000 esul a am em óbi os, p incipalmen e no con inen e A icano (91%), seguindo-se o sudoes e Asiá ico (6%) e a egião do Medi e âneo O ien al (3%), a e ando sob e udo c ianças com idade in e io a 5 anos (86%). 1.2 De inição A malá ia é uma pa asi ose causada po p o ozoá ios unicelula es do géne o Plasmodium, ansmi idos po êmeas do mosqui o Anopheles sp.. É ca ac e izada po um quad o eb il de pad ão pa oxís ico e in e mi en e, cujo desen ol imen o em humanos depende da espécie do pa asi a e es i pe in e an e, da idade, do es ado imuni á io, e da cons i uição gené ica e nu icional do indi íduo a e ado (Mendis, e al., 2001; Ne es, e al., 2005). 1.3 Agen e e iológico Os pa asi as causado es de malá ia pe encem ao Filo Apicomplexa, Classe Haema ozoea, O dem Haemospo ida, Família Plasmodiidae e Géne o Plasmodium (Chiodini, e al., 2001). Du an e ce ca de 80 anos apenas qua o espécies de Plasmodium o am conside adas capazes de in e a humanos: Plasmodium alcipa um (Welch, 1898), Plasmodium i ax (G assi e File i, 1889), Plasmodium o ale (S ephens, 1922) e Plasmodium mala iae (La e an, 1881). Po ém, ecen emen e oi econhecida uma quin a espécie causado a de malá ia nos humanos, Plasmodium knowlesi (Sin on e In odução ____________________________________________________________________________________ 3 Mulligan, 1933), que e a an e io men e associada p incipalmen e à in eção em macacos (Kan ele, e al, 2011 e Dhangadamajhi, e al., 2010). Cada espécie ap esen a uma dis ibuição geog á ica e pa ogénese singula (Tabela I.1), sendo as espécies P. alcipa um e, numa dimensão mui o meno , P. i ax (Mendis, e al., 2001) as p incipais esponsá eis pelos casos de doença e de mo e po malá ia. Tabela I.1: Ca ac e ís icas das espécies de Plasmodium sp. causado as de malá ia em humanos (adap ado de Kan ele, e al., 2011). 1.3.1 Ciclo biológico do pa asi a Plasmodium sp. Biologicamen e, as espécies de Plasmodium sp. são simila es, ap esen ando no seu ciclo biológico duas ases: assexual ou esquizógonica e sexual ou espo ogónica (Figu a I.1). A ase assexual desen ol e-se em humanos, p imei o no ígado ( ase exo- e i oci á ia) e depois nos e i óci os ci culan es ( ase e i oci á ia). A ase sexual oco e no mosqui o (Despommie , e al., 2005 e Ne es, e al., 2005). Ca ac e ís icas Plasmodium alcipa um Plasmodium knowlesi Plasmodium i ax Plasmodium o ale Plasmodium mala iae Dis ibuição, incidência na á ea endémica (%) Global, mais comum no con inen e A icano (80-90) Malásia e zonas adjacen es (1-60) Maio i a iamen e na Ásia (50-80) Con inen e A icano (5-8) Global (0,5-3) Pa asi émia Pode se ele ada Pode se ele ada < 2% < 2% < 2% Risco de ida Sim Sim Sim Não Não Ciclo de eb e (dias) 2 1 2 2 3 In ec a e i óci os Todos Todos Re iculóci os Re iculóci os E i óci os ma u os Hipnozoí os no ígado Não P o a elmen e não Sim Sim Não In odução ____________________________________________________________________________________ 4 Hospedei o e eb ado – Humano Fase exo-e i oci á ia A in eção inicia-se du an e uma e eição sanguínea de êmeas de Anopheles in e adas em humano, inoculando des a o ma espo ozoí os in e an es (ce ca de 15 a 200 po e eição sanguínea) que a ingem a ci culação sanguínea em poucos minu os. Desp o idos de cílios ou lagelos, os espo ozoí os mo imen am-se a é ao ígado, a a és da eo ien ação de p o eínas à supe ície do pa asi a, nomeadamen e as p o eínas ci cum-espo ozoí icas (CS) e a p o eína adesi a elacionada com a ombospondina (TRAP), essenciais pa a a in asão das células hospedei as. Após in adi o hepa óci o, os espo ozoí os di e enciam-se em o ozoí os p é-e i oci á ios que se ão mul iplica po ep odução assexuada do ipo esquizogónica, o iginando esquizon es eciduais e pos e io men e milha es de me ozoí os que in adi ão os e i óci os (Despommie , e al., 2005 e Ne es, e al., 2005). A ma u ação nos hepa óci os eque 5 a 7 dias pa a P. alcipa um, e cada espo ozoí o p oduz ce ca de 40 000 me ozoí os. Pa a P. i ax, es es alo es são 6 a 8 dias e 10 000 me ozoí os; pa a P. o ale, 9 dias e 15 000 me ozoí os; e pa a P. mala iae, 12 a 16 dias e 2000 me ozoí os. Nas in eções po P. i ax e P. o ale, o mosqui o e o inocula ambém populações gene icamen e dis in as de espo ozoí os (Despommie , e al., 2005), que não iniciam imedia amen e o seu desen ol imen o exo-e i ocí ico no ígado e pe manecem em es ado de la ência no hepa óci o, sendo po isso denominadas hipnozoí os (do g ego hypnos, sono) (Ne es, e al., 2005). O enómeno de eincidência ou elapso de ce as malá ias, após pe íodos a iá eis de incubação, é de ido à esquizogonia a dia dos hipnozoí os no in e io dos hepa óci os, podendo es es pe manece quiescen es no ígado po um pe íodo de ap oximadamen e 5 anos. (Despommie , e al., 2005 e Ne es, e al., 2005). As espécies P. alcipa um e P. mala iae não desen ol em hipnozoí os, como al não ap esen am eincidências. No en an o, P. alcipa um pode ec udesce po 1 a 2 anos a a és da con inuação da ase e i ocí ica, cujos pe íodos pe manecem subclínicos e assin omá icos; pa a P. mala iae es e pe íodo pode es ende -se po 30 anos ou mais (Despommie , e al., 2005 e Ne es, e al., 2005). In odução ____________________________________________________________________________________ 5 Fase e i oci á ia Quando os me ozoí os são libe ados dos esquizon es hepá icos, chegam à co en e sanguínea, in adem os e i óci os e iniciam a ase e i oci á ia da in eção. A in e ação dos me ozoí os com o e i óci o en ol e uma sequência complexa de acon ecimen os que começa no econhecimen o de ece o es especí icos p esen es na memb ana e i oci á ia. Pa a P. alcipa um, o p incipal ece o são as glico o inas e pa a P. i ax, a glicop o eína do g upo sanguíneo Du y. Além disso, P. i ax in ade apenas e iculóci os, enquan o P. alcipa um in ade hemácias de odas as idades. Já P. mala iae in ade p e e encialmen e hemácias madu as. Es as ca ac e ís icas êm implicações di e as sob e as pa asi émias e i icadas nas in eções causadas pelas di e en es espécies de plasmódios (Tabela I.1). Uma ez no in e io da célula, o pa asi a começa po se di e encia . P imei o, o mando o ozoí os em o ma de anel ( o ozoí os jo ens) e, pos e io men e, o ozoí os ma u os. Seguidamen e, o desen ol imen o in a-e i ocí ico do pa asi a oco e po esquizogonia, o mando esquizon es compos os de me ozoí os. Es e es adio e mina na u u a dos e i óci os e consequen e libe ação de me ozoí os pa a a co en e sanguínea, que in adi ão no os e i óci os. A ase e i oci á ia do ciclo do Plasmodium é ipicamen e sínc ona e pe iódica. As espécies P. alcipa um, P. i ax e P. o ale comple am o p ocesso de in asão do e i óci o po me ozoí os a é à sua u u a, a cada 48 ho as, obse ando-se uma pe iocidade “ e çã”. Plasmodium mala iae p oduz uma malá ia “qua ã”, que eque 72 ho as pa a comple a o seu ciclo, e P. knowlesi pa ece ap esen a uma pe iocidade diá ia (Dhangadamajhi, e al., 2010). Nem odos os me ozoí os são subme idos à di isão assexual, po quan o, depois de algumas ge ações, oco e a di e enciação em es adios sexuados, os game óci os, que p osseguem o seu desen ol imen o no mosqui o e o (Despommie , e al., 2005 e Ne es, e al., 2005). Hospedei o in e eb ado – Mosqui o Du an e a e eição sanguínea, a êmea Anopheles inge e as o mas sanguíneas do pa asi a, mas somen e os game óci os são capazes de e olui no inse o, iniciando o ciclo espo ogónico. É no in es ino médio do mosqui o que o pa asi a encon a as condições In odução ____________________________________________________________________________________ 6 necessá ias à game ogénese, onde o game óci o eminino o igina um mac ogâme a e o game óci o masculino, po ex lagelação, dá o igem a oi o mic ogâme as, em que cada um deles pode e en ualmen e e iliza um mac ogâme a, o mando o o o ou zigo o ( o ma diplóide). Após a ecundação, es e so e meiose e di e enciação, o iginando um oocine o mó el, que in ade a pa ede do in es ino médio a é à camada epi elial, onde enquis a o mando o oocis o. Inicia-se o p ocesso de di isão espo ogónica, o mando espo ozoí os, que após alguns dias p o ocam a u u a da pa ede do oocis o, sendo disseminados po odo o co po do inse o a a és da hemolin a a é a ingi as glândulas sali a es. Des a o ma, quando o mosqui o êmea e e ua uma no a e eição sanguínea, jun amen e com a sali a se ão inje ados, no no o hospedei o, espo ozoí os in e an es, iniciando um no o ciclo (Despommie , e al., 2005 e Ne es, e al., 2005). A ansmissão na u al da malá ia ao homem oco e quando êmeas de Anopheles in e adas, com espo ozoí os nas suas glândulas sali a es, e e uam uma e eição sanguínea capaz de inocula es as o mas in e an es ( e secção I.1.3.1). Na úl ima década, em me ecido especial a enção a ansmissão congéni a / ansmissão ansplacen á ia, de inida, segundo Uneke, (2011), pela p esença de o mas assexuadas do pa asi a em es egaços sanguíneos do co dão umbilical ob ido du an e o pa o, ou do sangue pe i é ico do bebé nos p imei os se e dias de ida, independen emen e do quad o clínico; uma ez que a g a idez es á implicada na dep essão da espos a imune, é um ac o de isco subs ancial pa a a mãe, o e o e o ecém-nascido. Es ima-se que, na egião subsa iana de Á ica, a malá ia a e e 24 milhões de mulhe es g á idas e po ano oco am, na globalidade, 75 000 a 200 000 mil óbi os de c ianças in e adas du an e a g a idez. A ansmissão des a in eção, apesa de pouco equen e, ambém pode oco e aciden almen e, po ans usão sanguínea, ansplan ação, pa ilha de se ingas con aminadas en e oxicodependen es e em aciden es nosocomiais e labo a o iais (Despommie , e al., 2005; Ne es, e al., 2005 e Ba oloni, e al., 2012). In odução ____________________________________________________________________________________ 13 Na in eção po P. i ax e P. o ale, o ciclo esquizogónico começa a se sinc ónico após 5 a 7 dias, causando pe iódicos pa oxismos eb is. O pa oxismo clássico da malá ia ap esen a ês ases: cala ios, eb e e exaus ão. A p imei a ase esul a do enómeno de in ensa asocons ição pe i é ica, causando a sensação de io ex emo no doen e du an e 10 a 15 minu os. Logo após es e pe íodo, a empe a u a começa a aumen a g adualmen e a é a ingi um pico de eb e, ge almen e, en e os 39 a 41ºC, iniciando a ase eb il que se man ém po um pe íodo de 2 a 6 ho as. A úl ima ase, com uma du ação de 2 a 3 ho as, é ca ac e izada pela de e escência da eb e com sin omas de dia o ese e aqueza in ensa (Despommie , e al., 2005 e Ne es, e al., 2005). O pa oxismo eb il comple o, nas in eções po P. i ax e P. o ale, oco e a cada ês dias (malá ia e çã), consequência da pe iocidade do ciclo esquizogónico a cada 48 ho as. Quan o à in eção po P. mala iae, es a ap esen a um pa oxismo eb il ipicamen e sepa ado po 72 ho as (malá ia qua ã). Numa in eção po P. alcipa um, a eb e em início nos úl imos dias do pe íodo de incubação (en e 9 a 14 dias). As c ises eb is podem se , nes e caso, in e mi en es ou con ínuas, não mani es ando sinais de pe iocidade a é que a doença pe du e po uma semana ou mais. Quando oco e um pa oxismo eb il, pode se diá io, a cada ês dias (malá ia e çã) ou com in e alos de 36 ho as (malá ia sub e çã). Os sin omas p od ómicos pe sis em e aumen am com a in eção, obse ando-se ambém ano exia e sin omas gas oin es inais. Também se obse am sinais ísicos não-especí icos como hepa oesplenomegalia, hipo ensão o os á ica e indícios de ic e ícia (Ba oloni, e al., 2012 e Ca e , e al., 2002). Embo a os ciclos e olu i os das espécies causado as sejam simila es, do pon o de is a pa ológico a in eção malá ica ap esen a di e enciações que podem de e mina as a iações na e olução clínica da doença. Em indi íduos não-imunes, a in eção po P. alcipa um é a que ge almen e ap esen a o mas mais g a es da doença, ca ac e izada pelo acome imen o e dis unção de á ios ó gãos e sis emas: ne oso cen al, hema opoié ico, espi a ó io, ci cula ó io, enal e dis unções hepá icas (Ba oloni, e al., 2012 e Ca e , e al., 2002). Assim, embo a a eb e seja um sin oma c ucial da in eção, independen emen e da espécie de Plasmodium, os sinais clínicos são di e sos e ap esen am di e en es g aus In odução ____________________________________________________________________________________ 14 de g a idade, podendo a ia en e uma le e ce aleia a se e as complicações, le ando à mo e pa icula men e na in eção po P. alcipa um. O diagnós ico p ecoce e um a amen o adequado são de e minan es na p e enção da mo bilidade e i á el e consequências a ais. A ausência de pa âme os clínicos especí icos que pe mi am con i ma a in eção jus i ica a necessidade de mé odos labo a o iais pa a o diagnós ico da malá ia (Ba oloni, e al., 2012 e Ne es, e al., 2005). 1.5.1.1 In eção malá ica assin omá ica (Ass) Segundo a OMS, é classi icada como assin omá ica uma in eção malá ica que ap esen e pa asi émia con i mada labo a o ialmen e (no p esen e abalho, esul ado posi i o após de eção po PCR) pa a qualque espécie de Plasmodium, com ausência e sem his ó ia ecen e de eb e e de ou os sin omas indicado es de malá ia (WHO, 2007). Apesa de se ele ada a quan idade de es udos sob e a g a idade clínica da doença, as in eções assin omá icas de malá ia não es ão ainda bem comp eendidas. O maio obs áculo no es udo des as in eções é a ca ência de um c i é io de diagnós ico pad onizado. O diagnós ico des as in eções pode acon ece du an e o pe íodo p é- sin omá ico da in eção, ase que an ecede o apa ecimen o de pa asi émia no sangue e de mani es ações clínicas. Po ou o lado, podem oco e ambém diagnós icos que não con emplam a his ó ia clínica do doen e, endo es e ap esen ado sin omas du an e um b e e pe íodo de empo, mas que pos e io men e o am sup imidos, an o os sin omas como a pa asi émia, pela medicação p esc i a. Es as duas si uações comp ome em um co e o diagnós ico, que apenas é solucionado pela inclusão de ou os c i é ios, obse ados em alguns es udos, como o acompanhamen o longi udinal do doen e, c ucial pa a di e encia in eções que apa en am se assin omá icas du an e a de eção, mas podem o na -se sin omá icas pos e io men e; e a quan i icação pa asi á ia, que ambém é necessá ia, pois ce ca de 2/3 dos diagnós icos nega i os po mic oscópia pa a es a in eção ap esen am ní eis sub-pa en es de pa asi émia diagnos icados po PCR (Bo ius, e al., 1996 e Laish am, e al., 2012). Es es mé odos de diagnós ico en ol em uma logís ica complexa, an o ao ní el de ecu sos humanos como em e mos mone á ios, o que os o na imp a icá eis na maio ia das egiões endémicas pa a a malá ia. Pa adoxalmen e, o diagnós ico e o a amen o des as in eções são de ex ema impo ância, pois êm sido e e idas como um In odução ____________________________________________________________________________________ 15 g ande obs áculo à eliminação da malá ia, uma ez que es es doen es são conside ados ese a ó ios silenciosos. 1.5.1.2 In eção malá ica não – g a e (NG) Conside a-se uma in eção não-g a e quando o doen e ap esen a pa asi émia (no p esen e abalho, esul ado posi i o após de eção po PCR) pa a qualque espécie de Plasmodium, eb e ( empe a u a axila  37,5ºC) e um ní el de hemoglobina de Hb>5 g/dL. 1.5.1.3 In eção malá ica g a e (G) Os c i é ios que de inem a malá ia-g a e são: pa asi émia pa a qualque espécie de Plasmodium (no p esen e abalho, esul ado posi i o após de eção po PCR), eb e ( empe a u a axila  37,5ºC), o ní el de hemoglobina de Hb  5 g/dL e/ou ou os sin omas, al como coma, p os ação ou con ulsões (WHO, 2000). 1.6 Fa o es do hospedei o associados à susce ibilidade / esis ência à in eção Em e mos e olu i os, a malá ia é um enómeno ecen e com ce ca de 10 000 anos, e os mecanismos que a o ecem a sob e i ência de uns indi íduos e o desen ol imen o de in eções malá icas po encialmen e le ais nou os é uma ques ão que em me ecido impo an e ele ância na in es igação cien í ica (Du and, e al., 2008). O g ande impac o a ní el mundial que a malá ia omen a, nomeadamen e em e mos de mo bilidade, e de mo alidade in an il, em le ado a comunidade cien í ica a explo a a elação en e a p o eção con a a malá ia ou os seus sin omas e as condições de he edi a iedade. Es a associação e idenciou a malá ia como uma impo an e o ça sele i a no genoma humano, esul ando na seleção na u al de nume osos polimo ismos gené icos (Tabela I.4), como as hemoglobinopa ias, as alassémias, o an igénio Du y, o sis ema ABO e as enzimopa ias: de iciência em glucose-6- os a o-desid ogenase (G6PD) e a mais ecen emen e es udada, de iciência em pi u a o cinase (PK). Es as a ian es gené icas, em homozigo ia, aca e am ou as doenças, o que pode ia des a o ece a sua seleção na e olução humana, endo sido esse e ei o con a iado pela ação da malá ia, exe cendo uma seleção posi i a balanceado a (Du and, e al., 2008, Min-Oo, e al., 2005 e Dhangadamajhi, e al., 2010). In odução ____________________________________________________________________________________ 16 Tabela I.4: Polimo ismos e i oci á ios associados à p o eção con a a in eção malá ica g a e (adap ado de Dhangadamajhi, e al., 2010). Va ian es gené icas Mecanismos de p o eção Re e ências P o eínas memb ana es An igénio Du y E i óci os Du y-nega i os, inibem a junção apical impossibili ando a in asão de P. i ax e P. knowlesi. Ge o, e al., (1994) De iciência em glico o ina C P o eção con a a in asão pa asi á ia. A glico o ina C medeia a ligação do ligando EBA-140 de P. alcipa um ao e i óci o, sendo es a junção anulada pela deleção. Maie , e al., (2003) e Williams, (2006) P o eína banda 3 Resis ência à in asão do pa asi a. Aumen a a adesão dos o alóci os (e i óci os o ais) in e ados po P. alcipa um ao CD36, eduzindo assim a in e ação neu o ascula dos e i óci os in e ados no cé eb o. Williams, (2006) P o eínas CR Nos e i óci os de icien es em p o eínas CR é eduzida a capacidade de P. alcipa um na o mação de ose as. S ou e, (2005) Sis ema ABO Indi íduos do g upo sanguíneo O não ap esen am a glico an e ase e minal, o que p e ine a o mação de ose as. F y, e al., (2008) Enzimopa ias De iciência em G6PD Po encia a agoci ose dos e i óci os in e ados num es ado p ecoce do desen ol imen o pa asi á io esul an e dos danos oxida i os mani es ados nas células de icien es em G6PD. Cappellini, e al., (2008) De iciência em PK Reduz a axa de eplicação pa asi á ia nos e i óci os e p omo e a agoci ose. Ayi, e al., (2008) Hemoglobinopa ias HbS Aumen a a de o midade dos e i óci os pa asi ados e p omo e a emoção de células alci o mes pelo baço. Reduz a in asão e i oci á ia, po encia a agoci ose e inibe o c escimen o pa asi á io em condições de hipóxia nos mic o asos enosos. Al e ações no ligando P EMP-1 eduz a ci oade ência dos e i óci os pa asi ados. Desen ol e a imunidade ina a e adqui ida. Chole a, e al., (2008) e Wellems, e al., (2009) HbC Al e ações no ligando P EMP-1 eduz a ci oade ência dos e i óci os pa asi ados. Fai hu s , e al. (2005) HbE Uma ano malidade memb ana não iden i icada o na os e i óci os esis en es à in asão pa asi á ia. Oli ie i, e al., (2008) α- alassémia Reduz a exp essão de CR1, o ece o que medeia a ligação dos e i óci os não-pa asi ados aos pa asi ados, con e indo p o eção con a a in eção malá ica g a e. Aumen a a quan idade de mic oe i óci os em homozigó icos es au ando a quan idade de hemoglobina pe dida, concedendo p o eção con a a anemia g a e. Wellems, e al., (2009) In odução ____________________________________________________________________________________ 17 1.6.1 Enzimopa ias e i oci á ias Os e i óci os, du an e a sua ma u ação, pe dem o núcleo, as mi ocônd ias e os ibossomas, impossibili ando es as células de ealiza as ias me abólicas que en ol am es es o ganelos, como a os o ilação oxida i a e a sín ese p o eica. Assim, pa a assegu a em a in eg idade da memb ana plasmá ica e o es ado uncional da hemoglobina, possibili ando o anspo e adequado de oxigénio, es as células u ilizam um me abolismo dependen e das enzimas e i oci á ias, que ca alisam duas das p incipais cadeias me abólicas: a glicólise e a ia das pen ose- os a o (Figu a I.4). Uma de iciência enzimá ica em alguma des as ias pode comp ome e a p odução de ATP (adenosina- i os a o) e/ou de NADPH (nico inamida adenina dinucleó ido os a o eduzido), desencadeando al e ações ao ní el da memb ana plasmá ica com consequen e emoção celula (Jacobasch, e al., 1996, Çaki , e al., 2004 e Mohandas, e al., 2008). São á ias as enzimopa ias he edi á ias já ela adas nes as ias me abólicas, onde se pode obse a uma dispa idade de equências, a iando de aco do com a enzima a e ada e sob e udo com a dis ibuição geog á ica. As de iciências em G6PD e em PK são a p incipal causa de anemia hemolí ica não-es e ocí ica he edi á ia (Min-Oo, e al., Figu a I.4: Me abolismo da glucose no e i óci o HK, hexocinase; PGI, os oglicose isome ase; PFK, os o u ocinase; G6PD, glucose-6- os a o-desid ogenase; TPI, T iose os a o isome ase; G3PD, glice aldeído-3- os a o-desid ogenase; PGK, os oglice a o cinase; PGM, os oglice a o mu ase (adap ado de Zwe schke, e al., 2003). In odução ____________________________________________________________________________________ 18 2005; Cappellini, e al., 2008 e Ayi, e al., 2008) e, na li e a u a, êm sido associadas a um e en ual e ei o p o e o con a a malá ia (Jacobasch, G., e al., 1996), ap esen ando a de iciência em G6PD ele ada p e alência em Á ica. 1.6.1.1 Glucose-6-Fos a o-Desid ogenase (G6PD) A p imei a enzima da ia das pen ose- os a o é a G6PD, que ca alisa a oxidação da glucose-6- os a o a 6- os ogluconolac ona (Figu a I.4), com edução de NADP a NADPH, que pe mi e a egene ação da glu a iona (GSH). A glu a iona exe ce um papel impo an e na de esa an ioxidan e, pela edução de adicais e espécies ea i as de oxigénio, e pela manu enção da hemoglobina e ou as p o eínas do e i óci o no seu es ado eduzido. Qualque de iciência na p odução de NADPH pode aca e a g a es consequências na capacidade de espos a das células ao s ess oxida i o (Quin as, e al., 2008). A de iciência em G6PD, ambém denominada de a ismo, é a enzimopa ia mais comum, com mais de 400 milhões de indi íduos a e ados a ní el global. São epo adas ele adas p e alências em Á ica, Sul da Eu opa, Médio O ien e, Sudes e Asiá ico e no cen o e sul das ilhas do Pací ico. Recen emen e ambém o am egis adas ele adas p e alências na Amé ica do No e e do Sul e em algumas egiões da Eu opa do No e, de ido essencialmen e à ecen e mig ação (Sco o, 2010). Os sin omas dependem do g au da de iciência, mas a maio ia dos indi íduos são assin omá icos a é se em expos os a a o es causado es de s ess oxida i o, como á macos (incluindo alguns an imalá icos como a p imaquina), ce os alimen os (como a as, o iginando o e mo a ismo) ou in eções. Nes a si uação podem ap esen a um quad o de anemia hemolí ica e ic e ícia (Sco o, 2010 e Cappellini, e al., 2008). O gene que codi ica a G6PD encon a-se na egião c omossómica Xq28, é cons i uído po 13 exões e 12 in ões, em ap oximadamen e 20kb no o al, codi ica 515 aminoácidos e ap esen a uma egião p omo o a ica em CG (mais de 70%). O locus G6PD é al ez um dos loci mais polimó icos nos humanos, com ce ca de 400 a ian es alélicos já desc i os (Nkhoma, e al., 2009). Es as a ian es são ag upadas em cinco classes (Tabela I.5) baseadas na a i idade enzimá ica e nas mani es ações clínicas obse adas na de iciência em G6PD. Ce ca de 140 mu ações já o am epo adas, sendo na maio ia mu ações pon uais não-sinónimas. Es as a ian es ão in luencia o g au de de iciência enzimá ica e consequen emen e o quad o clínico do doen e. In odução ____________________________________________________________________________________ 19 Tabela I.5: Classes da de iciência em G6PD (adap ado de Cappellini, e al., 2008). Escalões De inição Classe I De iciência g a e, associada com anemia hemolí ica não-es e ocí ica c ónica Classe II De iciência g a e (1-10% da a i idade enzimá ica no mal), associada com anemia hemolí ica aguda Classe III De iciência mode ada (10-60% da a i idade enzimá ica no mal) Classe IV A i idade enzimá ica no mal (60-150%) Classe V Aumen o da a i idade enzimá ica (> 150%) A he edi a iedade des a pa ologia es á ligada ao c omossoma Xq28. Po conseguin e, sendo os homens hemizigó icos pa a o gene G6PD, pode ão ap esen a uma exp essão no mal ou de icien e des e gene, enquan o as mulhe es, ap esen ando duas cópias do gene, ge almen e p ecisam da homozigo ia dos alelos associados à de iciência pa a os en a uma exp essão de icien e. Se he e ozigó icas, as mulhe es exibem exp essão in e média do gene, de ido à ina i ação alea ó ia de um dos c omossomas X nas di e en es células (e ei o de mosaico gené ico) (Cappellini, e al., 2008). A a i idade enzimá ica no mal é con e ida pelo alelo ances al G6PD B, que ap esen a uma dis ibuição mundial, em con as e com as a ian es que causam a de iciência enzimá ica, ap esen ando uma dis ibuição geog á ica mais localizada. Em Á ica, exis em ês alelos polimó icos p incipais: o alelo ances al G6PD B, com uma equência de 60 a 80%; o alelo G6PD A, que es ando associado a uma a i idade enzimá ica de ce ca de 85% da a i idade enzimá ica no mal, a e a ce ca de 15 a 40% da população; e, po im, o alelo G6PD A-, que es ando associado a apenas 12% da a i idade enzimá ica no mal, em uma equência que a ia de 0 a 25%. A segunda a ian e alélica mais comum é a G6PD Med, encon ada nos países ci cundan es do Ma Medi e âneo, da Índia e da Indonésia, es ando associada a ce ca de 3% da a i idade enzimá ica no mal e cuja equência a ia en e 2 a 20%. No sudes e Asiá ico, oi obse ado ambém o alelo G6PD Mahidol que, associado a uma a i idade de 5 a 32% In odução ____________________________________________________________________________________ 20 da no mal, ap esen a uma p e alência de 24% (Hed ick, P., 2011 e Cappellini, e al., 2008). É no á el a simila idade en e a dis ibuição geog á ica da de iciência em G6PD e as á eas endémicas da in eção malá ica, o que suge e a hipó ese da edução da a i idade enzimá ica con e i p o eção pa cial con a a malá ia (Hed ick, 2011). Os mecanismos en ol idos nes a p o eção con a a malá ia em doen es de icien es em G6PD ainda não são o almen e comp eendidos. No en an o, sabe-se que e i óci os de indi íduos doen es são pa icula men e sensí eis ao s ess oxida i o e es a esis ência pa ece esidi no en aquecimen o da memb ana celula dos mesmos, com consequen e hemólise e agoci ose, o que conduz a que o pa asi a não consiga comple a o seu ciclo de ida e mul iplica -se (Quin as, e al., 2008; Hed ick, 2011; Ro h, e al., 1983 e Cappado o, e al., 1998). Es udos epidemiológicos ambém o am le ados a cabo na en a i a de comp eensão da “hipó ese malá ia/G6PD”, no en an o não êm sido consis en es. Um es udo ealizado na Gâmbia e no Quénia po Ruwende, e al. (1995), concluiu que a edução do isco de desen ol e malá ia g a e po P. alcipa um em homens hemizigó icos (G6PD A-) oi de 58%, enquan o que nas mulhe es he e ozigó icas (G6PD BA-) oi de 46%. Já na egião do Mali, Guindo e al. (2007) obse ou uma diminuição do isco de desen ol e malá ia g a e de 58% pa a homens hemizigó icos (G6PD A-), enquan o nas mulhe es he e ozigó icas (G6PD BA-) não obse ou qualque e ei o p o e o . Aumen ando es a con o é sia de esul ados, Johnson, e al. (2009) e e ua am um es udo na população do Uganda onde demons a am a ausência de um e ei o p o e o em homens hemizigó icos e em mulhe es he e ozigó icas, associando alguma p o eção con a a malá ia apenas nas mulhe es homozigó icas de icien es (G6PD A-A-). A in es igação ao ní el da da ação de a ian es des a de iciência em e idenciado a hipó ese de ambos os pa asi as, P. alcipa um e P. i ax, isolados ou em conjun o desencadea am a seleção des a de iciência na população A icana (Ca e , e al., 2002 e Leslie, e al., 2010). 1.6.1.2 Pi u a o Cinase (PK) A enzima pi u a o cinase ca alisa o úl imo passo da cadeia glicolí ica, uma eação de des os o ilação- os o ilação que con e e os oenolpi u a o em pi u a o e In odução ____________________________________________________________________________________ 21 ATP (Figu a I.4). O con olo da a i idade des a enzima é de g ande impo ância de ido ao papel cen al que desempenha no me abolismo ge al da célula, nomeadamen e nos ajus es à elocidade a que deco e a glicólise. As a ian es pa ogénicas da enzima al e am a sua con o mação, po modi icação do local de ligação do subs a o, ou a a és do con ac o en e subunidades, diminuindo assim a a i idade enzimá ica e o luxo da ia glicolí ica. Des a o ma, diminui a sín ese de ATP, p incipalmen e nos e i óci os (que dependem exclusi amen e des a ia me abólica pa a ob e ATP), causando a sua lise (Quin as, e al., 2008). A de iciência em PK ap esen a uma dis ibuição cosmopoli a e é conside ada a enzimopa ia glicolí ica mais comum. É uma doença au ossómica ecessi a, ca ac e izada po um quad o clínico de anemia hemolí ica não-es e ocí ica, de g a idade a iá el, sendo necessá ia, na o ma mais se e a, a ans usão sanguínea logo à nascença (Ayi, e al., 2008). Na composição genómica dos mamí e os es ão englobados dois genes dis in os da PK, PKLR e PKM, que o iginam qua o isoenzimas, PKL, PKR, PKM1 e PKM2, exp essas em ecidos di e en es, dependendo da ação dos p omo o es especí icos de cada ecido (Zanella, e al., 2007). O gene PKLR p esen e no c omossoma 1q21 codi ica as isoenzimas PKL e PKR. PKL é exp essa no ígado, in es ino delgado e có ex enal, enquan o que PKR é exp essa exclusi amen e po e i óci os. PKM1 encon a-se no co ação, cé eb o e músculo-esquelé ico, e PKM2 es á p esen e nas células e ais e em ecidos umo ais (Min-Oo, e al., 2005 e Ch is o k, e al., 2008). O gene PKLR, com ap oximadamen e 8,6kb, é compos o po 12 exões e 11 in ões, ap esen ando o exão 1 e 2 especi icidade pa a as isoenzimas PKR e PKL, espe i amen e, sendo os es an es exões pa ilhados (Jacobasch, e al., 1996). Exis em mais de 180 mu ações desc i as no gene humano PKL e os sin omas clínicos apa ecem nos indi íduos homozigó icos ou he e ozigó icos compos os pa a o alelo mu ado. A equência des a pa ologia é al amen e a iá el. Es udos de p e alência ealizados na Amé ica do No e, na Eu opa e em algumas egiões da Ásia obse a am que a p e alência de he e ozigó icos a ia en e de 1% a 3,6% nes as egiões. Um es udo ealizado em A oame icanos suge e que a equência de he e ozigó icos é 2,4 ezes mais comum em A icanos do que em Caucasianos (Du and, e al., 2008). In odução ____________________________________________________________________________________ 22 Es udos gené icos in i o iden i ica am a de iciência em PK no modelo mu ino, como indu o a de p o eção con a a malá ia (Min-Oo, e al., 2003), podendo es e enómeno es ende -se aos humanos. Du and, e al. (2008) demos a am que e i óci os humanos de icien es em PK são esis en es à in eção malá ica po P. alcipa um in i o, apoiando assim os esul ados ob idos in i o em modelo mu ino. Os mecanismos en ol idos nes e e ei o p o e o são ainda desconhecidos, no en an o são suge idas algumas hipó eses, baseadas na depleção de ATP celula . A diminuição de ATP na célula induz o c oss-linking das p o eínas memb ana es (Palek, e al., 1978), comp ome endo a in asão, eplicação e saída do pa asi a. Um es udo populacional, en ol endo a pesquisa de assina u as de seleção da malá ia no gene PKLR, em duas populações A icanas de Angola e Moçambique, suge e que a p essão sele i a da malá ia es á a a ua nes a egião genómica, eo ia supo ada, en e ou os sinais, po um signi ica i o desequilíb io de linkage des a egião em indi íduos com in eção malá ica não-g a e (Machado, e al., 2010; Machado, e al., In p ess), apoiando assim, os esul ados an e io es. Embo a exis am e idências que a o ecem a hipó ese associa i a des a pa ologia com a malá ia de ido a uma p essão sele i a, são necessá ios es udos adicionais, gené icos e epidemiológicos, que pe mi am elucida es a possibilidade (Manco, e al., 2001; Min-Oo, e al., 2008; Machado, e al., 2010). 2. T iose os a o isome ase (TPI) 2.1 Gene O gene TPI localiza-se na egião c omossómica 12p13 com um amanho molecula o al de 3,5kb. A sequência uncional do gene es á di idida em 7 exões e 6 in ões, ap esen ando ambém, sem unção apa en e, 3 pseudogenes p ocessados, ausen es de in ões e in eg ados em loci c omossómicos di e en es (B own, e al., 1985). A egião p omo o a do gene é ex emamen e ica em GC (73%), sendo cons i uída po uma a ípica caixa TATA (5’-TATATAA-3’; -22 a -28) e um singula Cap p oximal elemen (CPE; -6 a -12) (B own, e al., 1985 e Boye , e al., 1990). 29 II - MATERIAIS E MÉTODOS Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 30 1. Á ea de es udo Nes e es udo o am u ilizadas amos as de sangue pe i é ico ecolhidas maio i a iamen e no Hospi al Cen al de Mapu o, e em meno núme o, na cidade de Manhiça, po busca a i a. Mapu o é a capi al de Moçambique, si uada no ex emo sul do país, ap esen a uma á ea de 346 77 km2 e em ap oximadamen e 1 094 315 de habi an es (Pe il Es a ís ico do Município de Mapu o, 2007-2008). Es a cidade ap esen a um clima opical e húmido, p opício à p opagação da malá ia, que a inge o seu pico de ansmissão após a época chu osa de dezemb o a ab il (Po al do Go e no de Moçambique e Documen o Es a égico pa a o Con olo da Malá ia em Moçambique, PNCM, Julho 2006-2009). Segundo o Minis é io da Saúde de Moçambique, a malá ia con inua a se o p incipal desa io pa a a saúde pública e pa a o desen ol imen o sus en á el do país, egis ando-se no pe íodo de janei o a junho de 2011 um o al de 2 065 618 casos de malá ia e 1266 óbi os (Bole im Epidemiológico Nº 2/2011, Minis é io da Saúde de Moçambique). Es a pa ologia é o p incipal mo i o de consul a ex e na (40%) e de in e namen o no se iço de pedia ia (60%), ap esen ando a p incipal causa de mo alidade nos hospi ais de Moçambique, ap oximadamen e 30% dos óbi os egis ados (Documen o Es a égico pa a o Con olo da Malá ia em Moçambique, PNCM, Julho 2006-2009). 2. Amos as Biológicas O DNA u ilizado nes e es udo p o ém de 112 amos as sanguíneas ecolhidas em Moçambique: 99 no pe íodo de se emb o a no emb o de 2008, no Hospi al Cen al de Mapu o e, as es an es 13 po Ma ques, e al. (2005) no dis i o de Manhiça nas épocas, seca (agos o, 2001) e húmida ( e e ei o, 2002). Es as amos as o am selecionadas de um conjun o de isolados po es a em ca ac e izadas pa a a p esença/ausência de in eção. Es e ensaio engloba apenas indi íduos in e ados, ag upados nos seguin es g upos clínicos: 92 amos as pediá icas (51 com in eção malá ica não-g a e e 41 com in eção malá ica g a e) comp eendendo a aixa e á ia dos 4 meses aos 7 anos de idade; Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 31 7 amos as do banco de sangue (indi íduos assin omá icos) e, 13 amos as ob idas po busca a i a (indi íduos assin omá icos), ab angendo odas as idades. Os g upos clínicos de malá ia g a e e não-g a e englobam apenas indi íduos in e ados com P. alcipa um e o g upo dos indi íduos assin omá icos ap esen a indi íduos in e ados po P. alcipa um (16 in eções simples e 3 in eções mis as: P. alcipa um + P. o ale, P. alcipa um + P. mala iae e, P. alcipa um + P. o ale + P. mala iae) e uma in eção po P. mala iae. 2.1 Colhei a e a mazenamen o das amos as O sangue pe i é ico oi ecolhido po punção digi al e conse ado em papel de il o Schleiche & Schuel, S&S903 pa a pos e io ex ação de DNA. 2.2 Ex ação de DNA O DNA ob ido des as amos as já es a a disponí el pa a es e es udo, endo sido p epa ado a a és de um p o ocolo de ex ação po enol-clo o ó mio. Dado que, no deco e dos á ios ensaios ealizados, algumas des as amos as deixa am de ap esen a quan idade su icien e pa a a conclusão do es udo, oi necessá io p ocede no amen e à ex ação do DNA a pa i do papel de il o a a és da écnica de enol/ enol- clo o ó mio desc i a po Snounou, e al. (1993). Es e p ocedimen o engloba 3 ases: lise, ex ação e p ecipi ação de DNA. Na ase de lise, eco ou-se uma go a de sangue do papel Schleiche & Schuel, S&S903 com uma esou a p e iamen e desin e ada com lixí ia e passada po água. Seguidamen e, colocou-se a mancha de sangue den o de um ubo ipo eppendo , de 1,5mL, de idamen e iden i icado, epe indo-se es es passos cuidadosamen e pa a cada amos a. A im de con ola e en uais con aminações in e -amos as, en e cada cinco, colocou-se um “b anco” – pedaço do mesmo papel de il o sem amos a, pa a o qual se seguiu exa amen e os mesmos p ocedimen os que pa a as es an es amos as. Pos e io men e, oi adicionado 1mL de PBS+Saponina (0,05%), subme e am-se os ubos a uma cen i ugação de 20 200g, du an e 10 minu os, e despe diçou-se o sob enadan e. Adicionou-se 1mL de PBS e ol ou a cen i uga -se os ubos a 20 200g, du an e 10 minu os, e i ou-se o sob enadan e e adicionou-se 30µL de ampão de lise e 75µL de P onase E (2mg/mL). Coloca am-se as amos as a 37ºC du an e a noi e. Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 32 A ase seguin e é a de ex ação de DNA, que se inicia com a adição de 300µL de água ul apu a e 500µL de enol equilib ado a cada ubo com pos e io cen i ugação de 20 200g, du an e 10 minu os. O sob enadan e é ecupe ado e adicionado a um no o ubo con endo 500µL de enol/clo o ó mio equilib ado, cen i ugando-se de seguida. Pa a inaliza , as amos as são subme idas à ase de p ecipi ação de DNA, e i ando-se o sob enadan e que é adicionado a um no o ubo con endo uma solução de 45µL de ace a o de sódio + 1mL de e anol absolu o; seguidamen e, deixam-se as amos as a -20ºC du an e a noi e. Consecu i amen e, são subme idas a uma cen i ugação de 20 200g du an e 15 minu os, ejei a-se o sob enadan e e adiciona-se 800µL de e anol a 80%. Após uma no a cen i ugação e ejeição do sob enadan e, o DNA oi seco numa es u a a 37ºC e pos e io men e eluído em 20µL de ampão TE, de modo a que ap oximadamen e 1l de solução de DNA co esponda a 5l de sangue o al. 2.3 Aspe os é icos Com espei o à pesquisa em Moçambique, a colhei a de isolados humanos oi ap o ada pelo Comi é de É ica local (Comi é Nacional de Bioé ica pa a a Saúde, Minis é io da Saúde de Moçambique, IRB 00002657, e . 226/CNBS/08) e pelo IHMT (Conselho de É ica do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, CEIHMT, 14-2011- PN). O plano de abalho po meno izado, os ques ioná ios e os o mulá ios de consen imen o in o mado o am subme idos aos Comi és de É ica das ins i uições en ol idas nes e es udo, endo sido ob ida a ap o ação da pesquisa. Cada indi íduo, assim como o pa en e/ u o das c ianças oi in o mado da na u eza e dos obje i os do es udo. Todos o am in o mados, po comunicação o al, da pa icipação olun á ia. Foi ob ido, po esc i o, de cada pessoa (ou pa en e/ u o ) o espe i o consen imen o in o mado. A colhei a de amos as sanguíneas seguiu igo osos equisi os es abelecidos pelos Comi és de É ica: oi u ilizado o olume exceden e das amos as de sangue, p e iamen e cole adas pa a o diagnós ico médico das c ianças assis idas no Depa amen o Pediá ico; no Banco de Sangue, du an e a doação de sangue, um pequeno olume oi colocado de pa e num ubo. Des a o ma, não oi necessá io uma colhei a ex a de sangue e o pacien e, a doação sanguínea e a o ina dos se iços de saúde não o am signi ica i amen e pe u bados. Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 33 3. Técnicas molecula es 3.1 Análise dos polimo ismos -5, -8 e -24 do p omo o da TPI 3.1.1 PCR-RFLP (PCR- Res ic ion F agmen Leng h Polymo phism) O p incípio des a écnica baseia-se na diges ão de um agmen o de DNA ampli icado po PCR (Polyme ase Chain Reac ion) com enzimas de es ição ou endonucleases, que ca alisam a cli agem do agmen o em egiões especí icas (zonas al o), de o ma a ob e um pad ão de bandas ca ac e ís ico, quando se subme e o p odu o des a diges ão à elec o o ese em gel de aga ose ou poliac ilamida. A pesquisa dos polimo ismos -5, -8 e -24 na egião p omo o a do gene TPI baseou-se no p ocedimen o de PCR-RFLP desc i o po Schneide , e al. (1998). 3.1.1.1 Reação de PCR Pa a ampli ica a egião p omo o a do gene TPI, u iliza am-se os oligonucleó idos: TPI-PROM F, 5’-GGCCATGGCGGAGGACGGCG-3’ e TPI-PROM R, 5’-GCCAGACCCCTCCTCGGCGA-3’, com a mis u a de eação e condições de ampli icação desc i as nas Tabelas II.1 e II.2, espe i amen e. Cada g upo de eações de ampli icação incluiu um con olo nega i o (sem DNA) e um con olo posi i o. Tabela II.1: Mis u a de eação pa a ampli icação da egião p omo o a do gene TPI. Reagen e Concen ação do s ock Concen ação da mis u a Volume po amos a (µL) Água 27,5 Tampão 5x 1x 10 MgCl2 25mM 3mM 6 dNTP 5mM 0,1mM 1 TPI-PROM F 2,5µM 0,08 µM 1,5 TPI-PROM R 2,5µM 0,08 µM 1,5 Taq 0,5 DNA 2 To al 50 Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 34 Tabela II.2: Condições de ampli icação da egião p omo o a do gene TPI. Fase Tempe a u a (ºC) Tempo Ciclos Desna u ação inicial 94 3min 1x Desna u ação 94 45seg 35x Hib idação dos Oligonucleó idos 62 45seg Ex ensão 72 45seg Ex ensão inal 72 7min 1x Manu enção 4 3.1.1.2 Reação de es ição enzimá ica O agmen o de DNA ampli icado (258pb) oi subme ido a diges ões enzimá icas com di e en es enzimas de es ição: TseI, MscI e S cI, pa a analisa a p esença dos polimo ismos -5, -8 e -24, espe i amen e. As mis u as de eação e condições da diges ão enzimá ica es ão ap esen adas nas Tabelas II.3, II.4 e II.5. Seguidamen e o p odu o da diges ão enzimá ica (20µL) oi subme ido a uma elec o o ese em gel de aga ose a 2%, co ado com b ome o de e ídio (0,05mg/100mL), du an e 1 ho a, a uma ol agem de 120V em ampão TBE 1x (T is 0,1M; Ácido Bó ico 0,1M; EDTA 5mM). A obse ação dos agmen os ob idos (Tabela II.5) oi ei a num ansiluminado sob luz ul a iole a. Foi usado o ma cado molecula de 100bp DNA ladde (Fe men as). Tabela II.3: Composição da mis u a de eação pa a a es ição enzimá ica com TseI e MscI. Reagen es Concen ação do s ock Concen ação da mis u a Volume po amos a (µL) Água 7,8 Tampão NEBu e 4 10x 1x 2 Enzima TseI 5 U/µL 0,05 U/µL 0,2 MscI 5 U/µL 0,05 U/µL DNA ampli icado 10 To al 20 Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 35 Tabela II.4: Composição da mis u a de eação pa a a es ição enzimá ica com S cI. Tabela II.5: Condições da diges ão enzimá ica das enzimas TseI, MscI e S cI e espe i os amanhos dos agmen os espe ados. 3.2 Análise da mu ação Glu104Asp 3.2.1 PCR-RFLP Pa a analisa a p esença da mu ação Glu104Asp, nas amos as em es udo, aplicou-se a écnica de PCR-RFLP an e io men e desc i a, baseada na de Schneide e al. (1995). 3.2.1.1 Reação de PCR Pa a es a ampli icação os oligonucleó idos u ilizados o am: TPI-Glu104Asp F, 5’-AAGGCTTTCTTTAGTCTCAT-3’ e TPI-Glu104Asp R, 5’-TGTGGCCCTGGATA- GGCTCA-3’ nas condições desc i as nas Tabelas II.6 e II.7. 3.2.2.2 Reação de es ição enzimá ica O agmen o de DNA ob ido (617pb) oi, pos e io men e, dige ido com a enzima DdeI, nas condições desc i as nas Tabelas II.8 e II.9. Reagen es Concen ação do s ock Concen ação da mis u a Volume po amos a (µL) Água 7,6 Tampão NEBu e 4 10x 1x 2 S cI 10 U/µL 0,1U/µL 0,2 BSA 1g/mL 100μg/mL 0,2 DNA ampli icado 10 To al 20 Polimo ismo Enzima Tempe a u a (ºC) Tempo F agmen os (pb) -5 (A>G) TseI 65 188 + 70 -8 (G>A) MscI 37 4h 191 + 67 -24 (T>G) S cI 37 204 + 54 Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 36 Tabela II.6: Mis u a de eação pa a ampli icação da egião con endo a mu ação Glu104Asp do gene TPI. Reagen e Concen ação do s ock Concen ação da mis u a Volume po amos a (µL) Água 27,5 Tampão 5x 1x 10 MgCl2 25mM 3mM 6 dNTP 5mM 0,1mM 1 TPI-Glu104Asp F 2,5µM 0,08 µM 1,5 TPI- Glu104Asp R 2,5µM 0,08 µM 1,5 Taq 0,5 DNA 2 To al 50 Tabela II.7: Condições de ampli icação da egião con endo a mu ação Glu104Asp do gene TPI. Fase Tempe a u a (ºC) Tempo Ciclos Desna u ação inicial 94 3min 1x Desna u ação 94 45seg 35x Hib idação dos oligonúcleo idos 56 45seg Ex ensão 72 1min Ex ensão inal 72 7min 1x Manu enção 4 Tabela II.8: Composição da mis u a de eação pa a a es ição enzimá ica com DdeI. Reagen es Concen ação do s ock Concen ação da mis u a Volume po amos a (µL) Água 7,8 Tampão NEBu e 3 10x 1x 2 DdeI 10 U/µL 0,1 U/µL 0,2 DNA ampli icado 10 To al 20 Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 37 Con inuamen e o am aplicados 20µL do p odu o da diges ão enzimá ica num gel de aga ose a 2%, co ado com b ome o de e ídio (0,05mg/100mL), onde oi subme ido a uma co ida elec o o é ica, du an e 1 ho a, a 120V em ampão TBE 1x. A obse ação dos agmen os ob idos (Tabela II.9) oi ei a num ansiluminado sob luz ul a iole a. Foi usado o ma cado molecula de 100bp DNA ladde . Tabela II.9: Condições da diges ão enzimá ica da enzima DdeI, e espe i os amanhos dos agmen os espe ados. Polimo ismo Enzima Tempe a u a (ºC) Tempo F agmen os (pb) Glu104Asp (G>C) DdeI 37 4h 288+205+81+41 3.3 Ras eio de odos exões do gene TPI po PCR-SSCP (PCR- Single-S and Con o ma ional Polymo phism) A de eção de al e ações gené icas po análise de polimo ismos con o macionais de DNA em cadeia simples (SSCP) baseia-se nas di e en es con o mações que os agmen os de DNA de cadeia simples, após desna u ação, adqui em de ido à subs i uição de um ou mais nucleó idos. Es es agmen os ap esen am di e en es es u u as con o macionais, o que az com que mig em de o ma di e en e quando sujei os a elec o o ese em gel de poliac ilamida. Os pad ões de mig ação esul an es são isualizados po colo ação com ni a o de p a a. A sensibilidade e simplicidade do mé odo pe mi e analisa um g ande núme o de amos as e o na-se bas an e ú il na de eção de polimo ismos conhecidos, po compa ação com amos as con olo, já ca ac e izadas, e de polimo ismos desconhecidos, po ap esen a em um pad ão de bandas di e en e (O i a e al., 1989). Fo am as eados os 7 exões do gene TPI nos 112 indi íduos es udados nes e abalho po análise SSCP, de o ma a pesquisa possí eis al e ações gené icas. 3.3.1 Reação de PCR P imei amen e, di idiu-se o gene em 6 agmen os, possibili ando a ampli icação des es sepa adamen e po PCR, écnica baseada no p o ocolo desc i o po Schneide , e al. (1998) (Tabela II.10 e II.11). Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 38 3.3.2 SSCP Pa a a eação de SSCP o am e i ados 3,5µL do p odu o de PCR, de cada amos a sepa adamen e pa a cada agmen o, e adicionou-se o mesmo olume de solução desna u an e [azul de b omo enol e xilenocianol 0,1% (m/ ); EDTA 10 mM; SDS 0,1% e o mamida desionizada 95% ( / )]. Es a mis u a oi aquecida a uma empe a u a de 95ºC, du an e 5 minu os, e pos e io men e oi colocada a 6ºC. Seguidamen e, oi subme ida a uma ele o o ese em gel de poliac ilamida não desna u an e e ical [ac ilamida-bisac ilamida 40%; Glice ol 10% ( / ); TBE 50mM; com os polime izan es: APS 0,1% e Temed 0,1%], com di e en es condições consoan e o agmen o a analisa (Tabela II.12) e p ocedeu-se à ele o o ese em ampão TBE 0,5x. Tabela II.10: Oligonucleó idos especí icos usados pa a a ampli icação dos á ios agmen os do gene TPI, amanho dos agmen os ampli icados e empe a u a de hib idação no PCR. Região do gene TPI Oligonucleó idos (5’→ 3’) F agmen o (pb) Tempe a u a de hib idação (ºC) Exão1 F – GGCCATGGCGGAGGACGGCG R – GCCAGACCCCTCCTCGGCGA 258 62 Exão2 F – AGGGCACTGGTTAGGAATTG R – GAGGGAAGGGTCCCACAC 286 56 Exão 3 F – TGAACCTTGGCTTCATC R – GACATCCCTTATCTTCTCTC 145 56 Exão 4 F – AAGGGATGTCTTTTTCCAAGA R – CCTGACCCTACCCTCTGAGTC 356 56 Exões 5-6 F – TGGCTGGAGAGCTCTTTCTT R – AGCCCACTCCACCTCAGC 544 62 Exão 7 F – CTGAGGACTAGACTGAGC R – CACCATCAGAAGCATATGC 307 56 Ma e iais e Mé odos ____________________________________________________________________________________ 45 Tabela II.16: Exemplo de uma abela 2  2 usada no cálculo do odds a io. Polimo ismo G upos clínicos G NG P esença a b Ausência c d 46 III - RESULTADOS Resul ados ____________________________________________________________________________________ 47 1. SNPs do gene TPI Fo am analisados 5 polimo ismos do gene TPI, cujas ca ac e ís icas es ão suma izadas na Tabela III.1, ês localizados na egião p omo o a do gene, -5 (A>G), - 8 (G>A) e -24 (T>G); um no exão 3, a mu ação c.315 (G>A) (Glu104Asp), conside ada a mu ação mais comum nes e gene; e um polimo ismo in agénico 2262 (G>A) obse ado du an e a pesquisa de ma cado es no gene TPI po SSCP. Tabela III.1: Ca ac e ís icas dos SNPs analisados nes e es udo p esen es no gene TPI. Nucleó ido SNPsa Nome HGVSa Localização c omossómicaa Regiãoa Alelo ances al/ alelo de i adoa (F equências alélicasb) -5 s1800200 g.6976688A>G 12:6976688 P omo o G (0,319)/A (0,681) -8 s1800201 g.6976685G>A 12:6976685 P omo o G (0,858)/A (0,142) -24 s1800202 g.6976669T>G 12:6976669 P omo o Sem dados Glu104Asp s121964845 6978338G>C 12:6978338 Exão 3 Sem dados 2262 s2071069 g.6979010G>A 12:6979010 In ão 5-6 G (0,585)/A (0,415) a A e e ência SNPs, nome HGVS, coo denadas no c omossoma, localização e o es ado ances al dos alelos o am e i ados da base de dados Ensembl. b As equências alélicas são e e en es à população A icana (AFR) da base de dados 1000 Genomes P ojec . 1.1 Polimo ismos da egião p omo o a As a ian es alélicas -5 (A>G), -8 (G>A) e -24 (T>G) o am analisadas pa a o conjun o o al de 112 amos as de DNA de indi íduos in e ados po Plasmodium sp.. Após ampli icação po PCR des a egião do gene, ealiza am-se á ias diges ões enzimá icas de aco do com o polimo ismo a analisa ( e secção II.3.1) (Figu a III.1), de modo a ob e um pe il geno ípico e haplo ípico des as a ian es pa a cada indi íduo. O locus -24 e elou-se monomó ico pa a a o alidade da amos a em análise, odos os indi íduos ap esen am o alelo T em homozigo ia. A dis ibuição geno ípica dos polimo ismos -5 e -8 encon a-se na Tabela III.2, ap esen ando-se ambos os loci em equilíb io de Ha dy-Weinbe g (P > 0,05 [0,26 e 0,44, espe i amen e]). Fo am iden i icados se e genó ipos, qua o deles comuns aos 3 g upos clínicos de malá ia -5AA/-8GG ( equência média o al 46,4%), -5AG/-8GG (35,7%), -5AG/ -8GA (10,7%) e -5GG/-8GG (4,5%); os es an es genó ipos o am singula es, dois no Resul ados ____________________________________________________________________________________ 48 Figu a III.1: Iden i icação das a ian es do p omo o -5, -8 e -24 po es ição enzimá ica. Visualização dos genó ipos em géis de aga ose a 2%. A) Exemplo da ca ac e ização da a ian e -5 (TPI A→G), u ilizando a endonuclease TseI: M – ma cado de peso molecula de 100bp (Fe men as); poços 1 e 3: amos as sem mu ação (258bp); poços 2, 5 e 6: amos as he e ozigó icas (258bp, 188 e 70pb); poço 4: amos a homozigó ica (188 e 70pb); B e C) Exemplo da ca ac e ização da a ian e -8 (TPI G→A), u ilizando a endonuclease MscI: M – ma cado de peso molecula de 100bp (Fe men as); poços B1, B3, B4, B5, B6, C1, C2, C3 e C4: amos as sem mu ação (258pb); poços B2 e B7: amos as he e ozigó icas [258pb, 191 e 67pb (banda impe ce í el pois o amanho é mui o eduzido)]; poço C4: amos a homozigó ica (191 e 67pb); D) Exemplo da ca ac e ização da a ian e -24 (TPI T→G), u ilizando a endonuclease S cI: M – ma cado de peso molecula de 100bp (Fe men as); poços 1, 2 e 3: amos as sem mu ação. g upo dos não-g a es -5GG /-8GA (0,9%), -5GG /-8AA (0,9%) e um no g upo dos assin omá icos -5AA /-8GA (0,9%). Tabela III.2: Dis ibuição geno ípica das a ian es do p omo o da TPI na amos a o al e nos á ios g upos clínicos de malá ia (Ass – assin omá ica, NG –não-g a e, G – g a e) Genó ipos G upos clínicos de malá ia Ass (%) NG (%) G (%) To al -5A -5A /-8G -8G 8 (0,40) 23 (0,45) 21 (0,51) 52 -5A -5G /-8G -8G 7 (0,35) 17 (0,33) 16 (0,39) 40 -5A -5G /-8G -8A 3 (0,10) 7 (0,14) 2 (0,05) 12 -5G -5G /-8G -8G 1 (0,05) 2 (0,04) 2 (0,05) 5 -5A -5A /-8G -8A 1 (0,05) 0 (0,00) 0 (0,00) 1 -5G -5G /-8G -8A 0 (0,00) 1(0,02) 0 (0,00) 1 -5G -5G /-8A -8A 0 (0,00) 1(0,02) 0 (0,00) 1 To al 20 51 41 112 1.2 Análise da mu ação Glu104Asp A egião do exão 3 oi ampli icada po PCR e dige ida com a endonuclease DdeI (con o me desc i o na seção II.3.2) (Schneide , e al., 1995). A diges ão oi obse ada A Resul ados ____________________________________________________________________________________ 49 num gel de aga ose a 2% (Figu aIII.2), endo-se e i icado homozigo ia do alelo G em odos os indi íduos es udados, ou seja nenhum indi íduo ap esen ou al e ações nes e locus. Es es esul ados o am alidados no as eio do exão 3 po SSCP ( e secção III.1.3), onde oi obse ado um pe il elec o o é ico idên ico em odas as amos as analisadas, um pe il wild- ype, con as ando com o pad ão de bandas obse ado no con olo posi i o da mu ação Glu104Asp (Figu a III.3). 1.3 Ras eio dos exões do gene TPI po PCR - SSCP No es udo de pesquisa de ma cado es de seleção de malá ia na egião do gene humano TPI po SSCP ( e seção II.3.3), e i ica am-se al e ações no pe il de mig ação elec o o é ico no exão 7 e no in ão 5. Na análise do exão 7 oi iden i icado um indi íduo he e ozigó ico pa a a mu ação s12692 (G>A) (Figu a III.4). Es e esul ado oi con i mado po sequenciação (Figu a III.5). Apa en emen e, pela análise de PCR-SSCP es a mu ação oi singula na população em es udo, con udo o pad ão mig a ó io obse ado na Figu a III.4 pa a a amos a mu ada nem semp e oi cla o, pondo em causa a no malidade das es an es Figu a III.2: Exemplo dos agmen os ob idos da es ição enzimá ica com a endonuclease DdeI pa a a iden i icação da mu ação Glu104Asp no exão 3 do gene TPI, segundo a écnica desc i a po Schneide e al. (1995). Visualização dos genó ipos em géis de aga ose a 2%. M – ma cado de peso molecula de 100bp (Fe men as); poços 1 a 18: amos as wild- ype pa a a mu ação glu104Asp. (288pb, 205pb, 81pb e 41pb). Figu a III.3: Exemplo dos agmen os ob idos do as eio ao exão 3 do gene TPI po PCR-SSCP. Visualização em géis de poliac ilamida a 14%. Genó ipos da mu ação Glu104Asp (G>C) no gel: poços 1 a 4 e 6: amos as wild- ype pa a a mu ação Glu104Asp; Poço 5: con olo posi i o pa a a mu ação Glu104Asp. Resul ados ____________________________________________________________________________________ 50 amos as pa a es a mu ação. A a és da es ição enzimá ica com a endonuclease BslI con i mou-se a he e ozigo ia da amos a mu ada, en ando-se a a és des e mé odo ob e um pe il geno ípico na população em es udo, con udo sem sucesso pois os esul ados nem semp e o am consis en es en e es ições sucessi as pa a as mesmas amos as. Figu a III.4: Exemplo dos agmen os ob idos do as eio ao exão 7 do gene TPI po PCR-SSCP. Visualização em géis de poliac ilamida a 10%. Genó ipos da mu ação s12692 no gel: poços 1 a 4 e 6 a 7: amos as wild- ype; Poço 5: amos a he e ozigó ica. Figu a III.5: Pa e da sequência gené ica do exão 7 do gene TPI do indi iduo he e ozigó ico pa a a mu ação s12692 (G>A). A sequência oi edi ada pelo so wa e Ch omas Li e e são 2.01. 1.4 Polimo ismo in ónico 2262 Desc i o pela equipa de A ya, R. (Schneide e al., 1996), o polimo ismo no in ão 5, nucleó ido 2262 (G>A), oi ambém obse ado po PCR-SSCP na população em análise (Figu a III.6) e con i mado po sequenciação (Figu a III.7). Figu a III.6: Exemplo dos agmen os ob idos do as eio à ação co esponden e en e os exões 5 e 6, do gene TPI po PCR-SSCP. Visualização em géis de poliac ilamida a 8%. Genó ipos da mu ação 2262 (G>A) no gel: poços 1 e 8: amos as wild- ype; poços 2 a 6 e 10: amos as he e ozigó icas; poços 7 e 9: amos as homozigó icas. Resul ados ____________________________________________________________________________________ 51 As equências alélicas ob idas pa a es e polimo ismo o am de 48% e 52% pa a o alelo A e G, espe i amen e (Tabela III.3), encon ando-se es e locus ambém em equilíb io de Ha dy-Weinbe g (P > 0,05). Figu a III.7: Ca ac e ização da mu ação s12692 (G>A), p esen e no in ão 5 do gene TPI. A: amos a wild- ype (nucleó ido indicado pela se a); B: amos a he e ozigó ica; C: amos a homozigó ica. As sequências o am edi adas pelo so wa e Ch omas Li e e são 2.01. 1.5 Análise es a ís ica 1.5.1 Tes es de associação Uma ez que o polimo ismo -24, na egião p omo o a do gene TPI, e a mu ação Glu104Asp no exão 3 não ap esen a am a iabilidade gené ica pa a o conjun o de amos as em análise, ap esen ando um compo amen o monomó ico, não o am analisados nem conside ados nos es es de associação. Assim, apenas os polimo ismos que se e ela am polimó icos: -5, -8 e 2262 o am analisados. As equências alélicas e haplo ípicas (ap esen adas nas Tabelas III.3 e III.4, espe i amen e) o am analisadas an o na população o al como nos di e en es g upos clínicos de malá ia. No locus -5, embo a o alelo A enha sido o mais comum (70%), ambos os alelos (A e G) e ela am equências semelhan es po g upo clínico de malá ia, sem di e enças es a is icamen e signi ica i as nos es es de associação. No polimo ismo -8 o alelo ances al (G) oi o mais p e alen e no o al da amos a com 93% e alelo mu ado (A) ap esen ou uma p e alência o al de 7%. Os es es de associação e ela am di e enças es a is icamen e signi ica i as na associação do alelo A en e os g upos de malá ia não-g a e e g a e (Tes e exa o de Fishe P = 0,032; OR =0,230; CI95%: 0,049-1,081; Tabela III.3). As equências alélicas do polimo ismo 2262 são semelhan es an o na amos a o al, 48% pa a o alelo A e 52% pa a o G, como en e g upos clínicos. Os es an es Resul ados ____________________________________________________________________________________ 52 es es de associação ealizados não e ela am di e enças es a is icamen e signi ica i as (P < 0,05). Tabela III.3: F equências alélicas dos SNPs em es udo no gene TPI em doen es de malá ia (Ass – assin omá ica, NG –não-g a e, G – g a e). SNPs F equências alélicas Tes e de Associação (P- alue) Ass (2n=40) NG (2n=102) G (2n=82) To al (n=112) Ass s NG Ass s G NG s G -5 ; A 28 (0,70) 70 (0,69) 60 (0,73) 0,70 0,874 0,714 0,501 G 12 (0,30) 32 (0,31) 22 (0,27) 0,30 HWE P- alue 0,62 0,75 0,69 0,26 Ho 0,50 0,47 0,44 0,46 He 0,43 0,44 0,40 0,42 -8 ; G 36 (0,90) 92 (0,90) 80 (0,98) 0,93 0,243a 0,075a 0,032a,b A 4 (0,10) 10 (0,10) 2 (0,02) 0,07 HWE P- alue 1,00 0,38 1,00 0,44 Ho 0,20 0,16 0,05 0,13 He 0,19 0,18 0,05 0,13 2262 ; G 22 (0,55) 51 (0,50) 44 (0,54) 0,52 0,592 1,000 0,622 A 18 (0,45) 51 (0,50) 38 (0,46) 0,48 HWE P- alue 0,65 1,00 0,53 0,85 Ho 0,60 0,49 0,44 0,49 He 0,51 0,51 0,50 0,50 a Tes e exa o de Fishe b OR = 0,230; CI95%: 0,049-1,081 A Tabela III.4 desc e e a análise haplo ípica en e os SNPs do gene TPI em es udo. Obse a am-se seis hapló ipos dis in os, qua o deles comuns a odos os g upos clínicos: -5A/-8G/2262A (AGA), AGG, GGG e GAG; o conjun o AAG obse ado apenas no g upo dos indi íduos assin omá icos e o hapló ipo GGA apenas iden i icado nos g upos de malá ia g a e e não-g a e. A combinação haplo ípica GAG oi ímpa nos es es de associação e e uados en e os di e en es hapló ipos ge ados e os g upos clínicos de malá ia, mos ando uma di e ença es a is icamen e signi ica i a quando compa ada nos g upos de malá ia g a e e não-g a e (Tes e exa o de Fishe P = 0,032; OR =0,230; CI95%: 0,049-1,081; Tabela III.4). Resul ados ____________________________________________________________________________________ 53 Tabela III.4: F equências haplo ípicas en e os SNPs em es udo no gene TPI em doen es de malá ia (Ass – assin omá ica, NG –não-g a e, G – g a e). Hapló ipo -5 -8 2262 F equências haplo ípicas Tes e de Associação (P- alue) Ass NG G To al NG s G G s Ass NG s Ass H1 A G G 0,225 0,225 0,280 0,246 0,392 0,513 1,000 H2 A G A 0,450 0,461 0,452 0,455 1,000 1,000 1,000 H3 A A G 0,025 0,000 0,000 0,004 ------ 0,328a 0,282a H4 G A G 0,075 0,098 0,024 0,067 0,032a, b 0,158a 0,242a H5 G G G 0,225 0,177 0,232 0,205 0,353 1,000 0,507 H6 G G A 0,000 0,039 0,012 0,023 0,209a 0,672a 0,269a a Tes e exa o de Fishe b OR =0,230; CI95%: 0,049-1,081 1.5.2 Desequilíb io de linkage O es udo do desequilíb io de linkage en e as compa ações de loci pa a pa possí eis e os g upos clínicos de malá ia em es udo encon a-se desc i o na Tabela III.5. O g upo de indi íduos com in eção malá ica não-g a e ap esen a desequilíb io de linkage signi ica i o en e odos os pa es: -8 e -5, -8 e 2262, e -5 e 2262. Re ela am ambém desequilíb io de linkage signi ica i o os loci: -5 e 2262 nos g upos da in eção malá ica assin omá ica e g a e. Tabela III.5: Desequilíb io de linkage en e os SNPs es udados nos di e en es g upos clínicos de malá ia (Ass – assin omá ica, NG –não-g a e, G – g a e). SNPs Desequilíb io de linkage (P- alue) Locus 1 Locus 2 Ass NG G -8 -5 0,069 0,000 0,072 -8 2262 0,114 0,001 0,213 -5 2262 0,000 0,000 0,000 2. Mic ossa éli es Fo am es udados ês mic ossa éli es localizados em egiões adjacen es ao gene TPI (Tabela II.13), de o ma a es ima a associação haplo ípica dos polimo ismos do p omo o -5 e -8 aos mic ossa éli es. Nes a análise o am excluídas as amos as que alha am a ampli icação pa a algum locus. Resul ados ____________________________________________________________________________________ 54 2.1 Repe ição pen anucleó idica (CTTTT)n Fo am de e ados onze alelos pa a o mic ossa éli e (CTTTT)n, a iando em amanho de 137 a 187pb. São obse ados 17 hapló ipos associados ao polimo ismo -5 e 16 conjugados com o polimo ismo -8 (Tabela III.6). As duas conjugações haplo ípicas demos am g ande di e sidade gené ica, sendo associados ao alelo ances al G da a ian e -5 se e alelos e dez à a ian e A; enquan o o polimo ismo -8 ap esen a onze alelos associados ao nucleó ido ances al G e cinco conjugados à mu ação -8A, que ap esen a baixas equências haplo ípicas, em compa ação com as demais combinações. Tabela III.6: Hapló ipos, ge ados pela associação do mic ossa éli e (CTTTT)n e os polimo ismos -5 e -8 da egião p omo o a do gene TPI e espe i as equências absolu as. 2.2 Repe ição inucleo ídica (CAG)n O mic ossa éli e (CAG)n oi associado a doze alelos, a iando en e 197 a 239pb. A análise associa i a des e mic ossa éli e com os polimo ismos do p omo o -5 e -8 (Tabela III.7) não ap esen ou uma di e sidade gené ica semelhan e en e as duas Hapló ipo Tamanho do alelo (pb) / -5 n Tamanho do alelo (pb) / -8 n 1 137 A 41 137 G 48 2 167 A 24 167 G 34 3 142 A 19 152 G 21 4 167 G 16 142 G 19 5 152 A 12 162 G 13 6 182 A 10 172 G 11 7 152 G 10 182 G 10 8 137 G 10 147 G 7 9 162 A 9 167 A 6 10 162 G 9 162 A 5 11 172 G 8 157 G 5 12 147 A 6 137 A 3 13 157 A 5 152 A 1 14 172 A 3 187 A 1 15 187 A 2 177 G 1 16 147 G 1 187 G 1 17 177 G 1 Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 61 Os polimo ismos gené icos humanos selecionados pela p essão exe cida pela malá ia en ol em sob e udo p o eínas es u u ais especí icas ( ais como o an igénio Du y e o g upo sanguíneo O), hemoglobinopa ias (como a hemoglobinas S e C, e as alassémias) e enzimas e i oci á ias (como a de iciência em G6PD e, mais ecen emen e desc i a, a de iciência em PK). A de iciência em TPI é uma enzimopa ia que a e a o me abolismo ene gé ico, a ingindo sob e udo os e i óci os que dependem unicamen e da glicólise pa a ge a ATP. Apesa de não exis i na li e a u a uma associação des a pa ologia com a malá ia, a ele ada equência de de e minadas mu ações em indi íduos de o igem A icana, p essupõe essa possibilidade (Schneide , e al., 1998; Humph ies, e al., 1999). As p e alências obse adas nes e es udo pa a cada polimo ismo da egião p omo o a do gene TPI (-5A>G, -8G>A e -24T>G) o am simila es às an e io men e desc i as pa a indi íduos de o igem A icana (Manco, e al., 2009 e Humph ies, e al., 1999), co obo ando a ele ada equência egis ada pa a es as mu ações no con inen e A icano. O polimo ismo no locus -5 ap esen ou uma a iabilidade gené ica supe io ao polimo ismo no locus -8 (He = 0,42 s 0,13, espe i amen e), apoiando os esul ados de Humph ies, e al. (1999), que desc e e uma dis ibuição geog á ica e equências geno ípicas supe io es, nomeadamen e nas populações A icana e O ien al. A a ian e -8A, com uma equência de 7% ( e sus 10% ela ada po Manco, e al., (2009) englobando dados de 3 populações de Á ica subsa iana), oi encon ada em 4 genó ipos dis in os: -5A-5G/-8G-8A; -5G-5G/-8G-8A; -5G-5G/-8A-8A e -5A-5A/ -8G-8A. Es a úl ima dis ibuição geno ípica, obse ada apenas num único indi íduo diagnos icado como assin omá ico pa a a in eção malá ica (po P. alcipa um), apesa de já e sido ela ada po Humph ies, e al. (1999) como um genó ipo a o e apa en emen e con inado à população A icana, não oi encon ado no es udo de Manco, e al. (2009). O locus -24 e elou se monomó ico pa a o alelo T, igualando os esul ados ob idos po Manco, e al. (2009). Es a al e ação mu acional esul a numa diminuição da a i idade da TPI que pode con ibui pa a uma de iciência g a e des a enzimopa ia (Schneide , e al., 1998), o que explica o egis o de baixas, ou mesmo nulas, equências Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 62 pa a es e polimo ismo na população ge al (Schneide , e al., 1998; Humph ies, e al., 1999 e Manco, e al., 2009). Pa a o polimo ismo in ónico 2262 egis ou-se a equência de 0,48 pa a o alelo A, um alo semelhan e ao desc i o na li e a u a pa a a população A icana (41%; 1000 Genomes P ojec ). Os es es de associação ealizados en e os 3 g upos clínicos de malá ia, baseados nas equências alélicas das al e ações -5 e -8 do p omo o da TPI, demons a am di e enças es a is icamen e signi ica i as pa a a mu ação -8A en e os g upos g a e e não-g a e (P = 0,032). Es e esul ado pode se indica i o de uma an agem sele i a associada a es a a ian e polimó ica, apa en ando es a elacionada com a esis ência à se e idade da in eção malá ica. Na população es udada, 53,6% dos indi íduos ap esen am genó ipos com a iações polimó icas na egião p omo o a do gene. Segundo Schneide , e al. (1998) a diminuição da a i idade da TPI em e i óci os pa ece se a ibuída às mu ações -8A e -24G, obse ando-se uma sucessi a diminuição da a i idade enzimá ica associada aos genó ipos -5A-5G/-8G-8G/-24T-24T > -5A-5G/-8G-8A/-24T-24T > -5A-5G/-8G-8A/ -24T-24G > -5G-5G/-8A-8A/-24T-24T. Humph ies, e al. (1999b) demons a am uma cla a associação en e a mu ação -8A e a edução da a i idade da TPI e i oci á ia in i o, de sensi elmen e 10% e 24% pa a indi íduos he e ozigó icos e homozigó icos, espe i amen e. A mu ação -5, isoladamen e, não é esponsá el po di e enças signi ica i as na a i idade des a enzima em e i óci os (Humph ies, e al., 1999b). A análise das equências haplo ípicas encon adas na população em es udo englobando os polimo ismos -5 e -8 do p omo o e a al e ação no nucleó ido 2262 do in ão 5 do gene TPI demons a am di e ença es a is icamen e signi ica i a pa a o hapló ipo GAG (-5, -8, 2262) en e os g upos g a e e não-g a e (P = 0,032), suge indo no amen e uma elação de p o eção con a a in eção malá ica, con e ida pela mu ação -8A quando associada a es e hapló ipo. Schneide , e al. (1998) compa a am g upos haplo ípicos com baixa e al a a i idade da TPI, di ididos po qua is, egis ando maio p opo ção de c omossomas -5G-8A no qua il co esponden e a uma a i idade enzimá ica meno . Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 63 Es e consenso de ideias pe mi e conje u a a hipó ese de que a mu ação -8A, associada à edução da a i idade enzimá ica de TPI em e i óci os, pode con e i p o eção à malá ia, sendo es a an agem sele i a a esponsá el pela disseminação des a a ian e polimó ica nas populações A icanas. A pesquisa dos desequilíb ios de linkage en e os á ios SNPs es udados no gene TPI em apoia es a hipó ese, obse ando-se desequilíb io de linkage en e os loci -8 e -5, e -8 e 2262 apenas no g upo dos indi íduos com malá ia não-g a e. Es es dados supo am a hipó ese da p essão sele i a exe cida pela malá ia no genoma humano sob e a mu ação -8A, sendo no en an o expec á el o alo de desequilíb io signi ica i o en e os loci -5 e -8, uma ez que dis am em ês nucleó idos apenas. Exis e ambém um desequilíb io signi ica i o en e os loci -5 e 2262 em odos os g upos clínicos de malá ia. Es e esul ado de desequilíb io signi ica i o en e os loci sup aci ados oi ambém ob ido po Humph ies, e al. (1999), em odas as populações es udadas e baseando-se no pad ão de hapló ipos ob idos, a ibui-lhes uma o igem ances al comum, possi elmen e em Á ica e an ecedendo a dispe são das populações humanas mode nas. A o igem ances al des es loci (-5 e 2262) é co obo ada pelos alo es de desequilíb io de linkage en e es es loci sepa adamen e e os STRs em es udo (CTTTTn e CAGn), e i icando-se um desequilíb io nas mesmas compa ações den o dos mesmos g upos (Tabela III.9). As compa ações en e a mu ação -8 e os STRs e idencia am signi icância apenas na associação en e os loci -8 e (CAG)n no g upo de indi íduos com in eção malá ica não-g a e. O alelo -8A oi associado somen e a dois dos ca o ze alelos encon ados pa a o mic ossa éli e (CAG)n, aludindo a exis ência de desequilíb io. Cu iosamen e, os loci -8 e (CTTTT)n pa ecem es a em equilíb io de linkage, no en an o es e equilíb io não é obse ado na compa ação en e os loci -5 e (CTTTT)n, o que se ia expec á el, uma ez que apenas 3 nucleó idos sepa am es es SNPs, p essupondo-se um esul ado de desequilíb io de linkage semelhan e en e es as compa ações. A di e sidade de hapló ipos obse ada en e as a ian es do p omo o do gene TPI, e a sua dis ibuição geog á ica cosmopoli a (Humph ies, e al., 1999), ge ou discussão na comunidade cien í ica nomeadamen e ao ní el dos e en os gené icos que pode ão e con ibuído pa a es a a iação haplo ípica. A ecombinação gené ica pa ece pouco p o á el, de ido à cu a dis ância en e os nucleó idos esponsá eis po es a Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 64 a iação no p omo o . Baseando-se nas equências haplo ípicas encon adas, Humph ies e al. (1999) suge i am a hipó ese de e em oco ido mu ações sucessi as no hapló ipo ido como ances al pa a Homo sapiens (-5G-8G-24G), ob ido a a és da sequência gené ica do gene TPI em chimpanzé (C aig, e al., 1991). O mo i o que desencadeou es es e en os mu acionais no genoma humano é ainda con o e so. Schneide , e al. (1998) de endem a hipó ese de an agem sele i a pa a a sob e i ência humana, baseada na associação en e a ele ada incidência polimó ica com a mode ada edução da a i idade da TPI. Toda ia, Humph ies, e al. (1999) sus en am a hipó ese da di e si icação haplo ípica obse ada e p ecedido a sepa ação en e as populações A icanas e não-A icanas, que e á oco ido à ap oximadamen e 100 000 anos (Flin , e al., 1993), baseando-se na ex ensa a iação alélica no locus (CTTTT)n en e os hapló ipos ela ados pa a a egião p omo o a do gene TPI, es ando es e locus em equilíb io de linkage com os á ios hapló ipos que di e gem do ances al. Nes e abalho, p ocedemos ainda a uma en a i a de ob e in o mações sob e a an iguidade dos polimo ismos -5G>A e -8G>A (Tabela III.11). A idade es imada das duas a ian es e elou se in e io ao pe íodo de dispe são das populações humanas mode nas o iginá io de Á ica, ejei ando a hipó ese p opos a po Humph ies, e al. (1999). Ainda assim, a mu ação -5A (idade es imada: ~20 mil anos) mos ou se mais an iga do que a mu ação -8A (idade es imada: ~14 mil anos). As equências haplo ípicas en e os mic ossa éli es es udados e es es dois polimo ismos apoiam es a conclusão, uma ez que a mu ação -5A es á associada a uma a iação in a-alélica supe io (maio idade) pa a os loci (CTTTT)n (0,631 s 0,501) e (CAG)n (0,613 s 0,481). A idade ago a es imada pa a a mu ação -5G>A, que apon a pa a uma o igem da mu ação numa ase pos e io à saída e dispe são do homem mode no pa a o a de Á ica, é di ícil de concilia com a dis ibuição de equências obse ada pa a o alelo -5A em populações não-a icanas, nomeadamen e de o igem Eu opeia (Humph ies e al., 1999; Manco e al., 2008). Não podemos exclui , no en an o, a possibilidade de no cálculo e e uado, as axas de mu ação e/ou ecombinação conside adas pa a os mic ossa éli es se encon a em sob es imadas e po an o a idade da a ian e se supe io . Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 65 A idade da mu ação -8A oi calculada à luz das duas hipó eses possí eis pa a a o igem do hapló ipo -5A-8A (Figu a IV.1). A p imei a hipó ese, e e ida como a menos p o á el, conside a uma o igem única da mu ação no hapló ipo ances al -5G -8G e pos e io ecombinação gené ica en e os loci -5 e -8 nos hapló ipos -5G-8A e -5A-8G. Conside ando es a possibilidade de o igem única, a idade es imada pa a o e en o mu acional -8G>A oi de 14 325 (10 600 - 19 775) anos. A di e ença de idade em núme o ge ações calculada pa a os dois STRs indi idualmen e, é de 378 ge ações, um alo bas an e ele ado que o igina a iações na an iguidade es imada pa a a mu ação -8A, en e 9 600 (7 500 – 12 775) anos quando associada ao mic ossa éli e (CAG)n e 19 050 (14 150 – 26 775) anos quando conside ado o mic ossa éli e (CTTTT)n. Apesa de a hipó ese de uma o igem única pa a es a mu ação e, consequen emen e, um e en o de ecombinação en e es es loci se pouco p o á el dada a sua p oximidade, o desequilíb io de linkage en e os loci -5 e -8 oi apenas obse ado no g upo dos indi íduos com in eção malá ica não-g a e. Dada a con iguidade des es polimo ismos, espe a -se-ia de e a es e desequilíb io na população o al. Ou o ac o que apoia es a hipó ese são os esul ados díspa es de desequilíb io de linkage en e cada locus -5 e -8, conjugados com os STRs, que se espe a iam semelhan es de ido, mais uma ez, à sua p oximidade. A segunda hipó ese suge e a possibilidade de se ob e o hapló ipo -5A-8A po mu ação eco en e e po an o exis i em dois e en os mu acionais -8G>A. A idade es imada pa a o p imei o e en o mu acional -8G>A no hapló ipo ances al -5G-8G oi de ap oximadamen e 13 987 (10 275 – 19 337) anos, quando combinada a in o mação dos dois mic ossa éli es (uma idade ligei amen e in e io à es imada pa a a hipó ese de o igem única, 14 325 anos). Pa a o segundo e en o mu acional, oco ido no hapló ipo -5A-8G, a da ação oi inexequí el, o que indica uma idade mui o ecen e, não endo ha ido empo su icien e pa a acumula a iação ou e en os de ecombinação nos mic ossa éli es. Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 66 Achados his ó icos e a queológicos indicam que a malá ia em ido um impac o signi ica i o nos humanos desde há sensi elmen e 10 000 anos, coinciden e com a o igem e expansão da ag icul u a no Médio-O ien e e em Á ica. Nessa al u a, a população a icana expe imen a a mudanças d amá icas an o a ní el ambien al como compo amen al, passando de caçado es-cole o es a ag icul o es, endo dado início à ansmissão da malá ia ao humano. A in odução da ag icul u a de de ube e queima na egião oes e de Á ica desencadeou a des lo es ação de zonas opicais, c iando des a o ma, condições a o á eis à mul iplicação e expansão de Anopheles gambiae, o p incipal e o de P. alcipa um. A p opagação des a p á ica ag ícola p opo cionou o aumen o de coleções/ ese a ó ios de água expos os à luz sola , c iando po enciais locais de c iadou o pa a o e o , o que e á con ibuído pa a a c escen e densidade populacional des e mosqui o em Á ica. O desen ol imen o ag ícola con ibuiu, po ou o lado, pa a o aumen o da densidade populacional humana, acili ando a expansão da malá ia. (A melagos, e al., 1996; Uneke, 2009 e Tishko , e al., 2001). A idade calculada pa a mu ação -8A (~14 000 anos) excede o pe íodo de 10 000 anos, conside ado como início do impac o da malá ia nas populações humanas, no en an o as idades de 9 600 anos (pa a o igem única) ou 10 600 anos (pa a mu ação eco en e) ob idas pela associação ao locus (CAG)n encon am-se den o des e pe íodo, o que não descu a a hipó ese de e exis ido uma seleção des a mu ação como uma Figu a IV.1: Hipó eses ex apoladas pa a o su gimen o do hapló ipo -5A-8A na egião p omo o a do gene TPI: mu ações eco en es e sus ecombinação gené ica, com base nas equências de cada hapló ipo na população em es udo. Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 67 an agem de sob e i ência humana, nes e caso po um e ei o p o e o con a a malá ia. Do mesmo modo, a idade in e io (~10 000 anos) pa a a média da an iguidade es imada pa a os dois mic ossa éli es, 14 325 (10 600 – 19 775) anos, é ambém compa í el com o apa ecimen o da a ian e -8A du an e a o igem e di usão da ag icul u a em Á ica. A mu ação Glu104Asp, a mais comum na de iciência em TPI, não oi encon ada na amos a analisada. Uma possí el jus i icação é a o igem Eu opeia da maio ia dos casos epo ados pa a es a mu ação, endo sido p opos a uma o igem única pa a es a mu ação na Eu opa ociden al, dispe sando-se pa a ou os con inen es a a és da expansão e mig ação das populações (A ya, e al., 1997). Uma ez não obse ada nes e es udo, a mu ação Glu104Asp pa ece se ainda pouco p e alen e na população de o igem A icana. A análise do mic ossa éli e (CTA)n ap esen ou um dé ice de he e ozigó icos e, consequen emen e um des io signi ica i o (P < 0,05) do equilíb io de Ha dy-Weinbe g. Di e sos a o es podem eduzi a he e ozigo ia, podendo signi ica que es e locus es á sob ação de seleção ou ap esen a alelos nulos, de ido a polimo ismos nos locais de hib idação dos oligonucleó idos. Es e mic ossa éli e es á localizado no gene que codi ica a p o eína- i osina os a ase, não ece o a ipo 6 (PTPN6) da amília das i osinas os a ases (PTP), moléculas de ligação que egulam á ios p ocessos celula es, incluindo a p oli e ação e a di e enciação celula , o ciclo mi ó ico e a ans o mação oncogénica. A p o eína PTPN6 é exp essa p imei amen e nas células hema opoié icas e unciona como um impo an e egulado das múl iplas ias de sinalização nes as células. A me ilação do p omo o do gene PTPN6, com consequen e silenciamen o des e gene, oi de e ada em á ios ipos de leucemias e lin omas. A pe da de he e ozigó icos nos mic ossa éli es analisados jun o ao gene PTPN6 oi epo ada em 79% dos casos de leucemia lin oblás ica aguda, suge indo se um gene sup esso de umo es (Oka, e al., 2002). O locus (CAG)n es á localizado no gene que codi ica a p o eína a o ina 1 (ATN1). Es a p o eína encon a-se no sis ema ne oso e es á associada a uma doença neu odegene a i a, a a o ia den a o ub al-pallidoluysian (DRPLA), ansmi ida de modo au ossómico dominan e, e causada pela sín ese de p o eínas mu an es com ele ado núme o de epe ições do iple o CAG (54-79 epe ições) (Yamada, e al, 2010). A acumulação in acelula des a p o eína mu an e oco e no sis ema ne oso Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 68 cen al, inibindo a a i idade de G3PD (Shiozawa, e al., 2003). O núme o máximo de epe ições des e iple o obse ado na amos agem em es udo oi de 26 epe ições, ap esen ando odos os indi íduos a p o eína ATP1 no mal. A inibição de ias me abólicas ou enzimas en ol idas em p ocessos c uciais pa a a sob e i ência do pa asi a ep esen am po enciais al os pa a o desen ol imen o de á macos an imalá icos. A ca ência de um ciclo dos ácidos ica boxílicos uncional em P. alcipa um o na-o exclusi amen e dependen e da glicólise pa a a ob enção de ATP. O consumo de glucose nos e i óci os pa asi ados é ce ca de 50 a 100 ezes maio compa ando com e i óci os não in e ados (Subbayya, e al., 1997). Ri e , e al. (1993) epo a am a exis ência de uma espos a humo al an i-TPI (IgM), desencadeada du an e a in eção malá ica, esul ando numa anemia hemolí ica c ónica. A p esença des es au o-an ico pos oi obse ada apenas em in eções po P. alcipa um g a es, sendo a p odução des es an ico pos au olimi ada e di e amen e associada com a se e idade da anemia, uma ez que dec esce com a diminuição de lac a o desid ogenase (LDH) e com o aumen o da hemoglobina no so o. Es e ac o suge e a hipó ese da TPI es a localizada na memb ana e i oci á ia encon ando-se pa cialmen e expos a, o que pe mi e a es imulação da p odução de an ico pos an i-TPI. As p op iedades de ligação à memb ana e i oci á ia pelas enzimas glicolí icas é uma ca ac e ís ica que pa ece e um papel impo an e na in ecciosidade de ce os pa asi as, ep esen ando po enciais al os no desenho de no as es a égias de in e enção e apêu ica (Subbayya, e al., 1997). A es imulação de an ico pos an i-TPI du an e a in eção malá ica suge e um papel impo an e des a enzima na pa ogénese da in eção, sendo expec á el que a inibição da me abolização da glucose no e i óci o, po exemplo pela inibição ou pa cial inibição da a i idade da TPI, sem nenhum ou o mecanismo pa a ge a ATP a e e g a emen e a p oli e ação pa asi á ia. A ca ac e ís ica bioquímica mais no á el na de iciência em TPI é a excessi a concen ação celula de DHAP, obse ando-se um aumen o de ce ca de 30 a 40 ezes, compa ado com os alo es egis ados em indi íduos saudá eis (O osz, e al., 1996), endo sido apon ada como a p incipal causa de mo bilidade nes a pa ologia (Ahmed, e al., 2003). Baseando-se nes a ca ac e ís ica, na depleção da GSH eduzida e no s ess Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 69 oxida i o em indi íduos de icien es em TPI, Ahmed, e al. (2003) suge em que a ano mal acumulação de me ilglioxal (MG) possa es a associada a es a de iciência. O MG é um p odu o óxico, mu agénico e um inibido das enzimas glicolí icas. Em condições isiológicas o ma-se não enzima icamen e a pa i dos ioses os a o na glicólise, po uma eação i e e sí el de β-eliminação do g upo os a o do 3- os a o-1,2- enediol in e mediá io. Uma ez o mado, o MG modi ica i e e si elmen e g upos amina em lípidos, ácidos nucleicos e p o eínas o mando p odu os a ançados de glicação (AGEs). O sis ema dos glioxalases dependen e do glu a iono é a p incipal ia de eliminação des e compos o con e endo-o em D-lac a o e egene ando o glu a iono. A dependência do glu a iono como co ac o ca alí ico do sis ema dos glioxalases é obse ada em odas as células euca io as (Figu a IV.2) (Quin as, e al., 2008). Figu aVI.2: Fo mação, ea i idade e des oxi icação do me ilglioxal em e i óci os pa asi ados. Tan o o e i óci o (E) como o Plasmodium sp. (P) necessi am da glucose p o enien e da ia glicolí ica. Nes a ia a con e são do os a o de dihid oxiace ona a glice aldeído 3- os a o pela iose os a o isome ase não é um p ocesso pe ei o. A eliminação do os a o p oduz um in e mediá io 2-oxoaldeído ea i o, o melilglioxal (MG) como um subp odu o. Al amen e elec o ílico, es e compos o eage com ácidos nucleicos e p o eínas, o mando p odu os a ançados de glicação (AGEs). Assim, o MG e ou os 2-oxoaldeídos podem o na -se óxicos e mu agénicos. Pa a e i a ais e ei os, o sis ema dos glioxalases – que consis e na glu a iona (GSH) e em duas enzimas glioxalase I (Glo1) e glioxalase II (Glo2) - con e e os 2-oxoaldeídos óxicos a 2-hid oxica boxílicos não óxicos, ais como o D-lac a o. De ido ao ele ado luxo da ia glicolí ica em e i óci os pa asi ados, a inibição do sis ema de desin oxicação (c uzes cinzen as) esul a na acumulação de AGEs po encialmen e le ais (adap ado de U sche , e al., 2011). Discussão de Resul ados ____________________________________________________________________________________ 70 O aumen o da concen ação de DHAP e o dec éscimo celula de GSH eduzida são condições p opícias à acumulação de MG. Ahmed, e al. (2003) in es iga am o en ol imen o do MG na de iciência em TPI. Es uda am dois i mãos húnga os de icien es em TPI, com genó ipos idên icos: mu ações Glu145S op e Phe240Leu, mas com quad os clínicos dis in os: ambos ap esen a am anemia hemolí ica, mas apenas um desen ol eu al e ações neu ológicas, endo sido egis ada meno concen ação e i oci á ia de MG no pacien e sem al e ações neu ológicas, compa ada com a concen ação de MG obse ada no i mão (com dis ú bios neu ológicos), suge indo que a acumulação des e compos o con ibui di e amen e pa a a pa ogénese da neu odegene ação na de iciência em TPI. Pa lo ic-Dju ano ic, e al. (2006) es a am a pe meabilidade de uma aquaglice opo ina de P. alcipa um (P AQP), um canal bi uncional pe meá el à água e solu os, à passagem da dihid oxiace ona não os o ilada (DHA), uma iose acilmen e me abolizada pela ia glicolí ica em e i óci os humanos; e ao MG e a alia am o e ei o da incubação des es compos os em e i óci os humanos in e ados po P. alcipa um Binh1 e P. alcipa um 3D7 (es i pe sensí el à clo oquina). Os esul ados epo ados nes e es udo demons am que DHA é óxica pa a o pa asi a, ap esen ando um alo de IC50 de 3,3mM pa a a es i pe Binh1 e de 2,6mM pa a a es i pe 3D7. O MG e elou se um po en e inibido da p oli e ação pa asi á ia obse ando-se um IC50 de 223µM e 128µM pa a as es i pes Binh1 e 3D7, espe i amen e. A componen e ci o óxica associada à DHA de e-se ao ac o do genoma do Plasmodium sp. apa en emen e não con empla os mecanismos que possibili am o p ocesso de os o ilação da DHA (genes DHA quinase). Ou a e idência que a i ma a oxicidade des e compos o é a sua capacidade de inibi a enzima GAPDH de P. alcipa um (P GAPDH) numa concen ação de 2,5mM DHA. A inibição do GAPDH le a à acumulação de G3P, o que p omo e a o mação espon ânea de MG ci o óxico. A o mação de MG, óxica ao pa asi a e, em ele adas concen ações ao humano, pa ece es a associada a al e ações na ia glicolí ica, o emen e elacionada com a pe da da a i idade enzimá ica da TPI, indicando uma possí el ia de a enuação do pa asi a associada à a ian e alélica -8A do p omo o des a enzima. Bibliog a ia ____________________________________________________________________________________ 77 Li e a u a: Ahmed, N., Ba ah, S., Ka achalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ho ányi, M., Ba ó i, K., Hollan, S. & Tho nalley, P. (2003) – Inc eased o ma ion o me hylglyoxal and p o ein glyca ion, oxida ion and ni osa ion in iosephospha e isome ase de iciency. Biochimica e Biophysica Ac a, 1639: 121-132. A melagos, G., Ba nes, K. & Lin, J. (1996) – Disease in human e olu ion: he e- eme gence o in ec ious disease in he hi d epidemiological ansi ion. Na ional Museum o Na u al His o y, 18: 1-6. A ya, R., Lalloz, M., Bellingham, A. & Lay on, D. 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