Contribuição para o estudo da caracterização molecular de uma colónia de Glossina morsitans morsitans Westwood 1850, (Díptera: Glossinidae).

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM PARASITOLOGIA MÉDICA CONTRIBUIÇÃO PARA O ESTUDO DA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UMA COLÓNIA DE Glossina mo si ans mo si ans, Wes wood 1850 (Díp e a: Glossinidae). MARIA CLARA GAGO DA CÂMARA MIRANTE 2009 UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL CONTRIBUIÇÃO PARA O ESTUDO DA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UMA COLÓNIA DE Glossina mo si ans mo si ans Wes wood 1850, (Díp e a: Glossinidae). MARIA CLARA GAGO DA CÂMARA MIRANTE Tese ap esen ada pa a a ob enção do g au de Mes e em Pa asi ologia Médica. O ien ado : P o esso Dou o An ónio José dos San os G ácio 2009 AGRADECIMENTOS A ealização des e abalho oi possí el g aças ao apoio e incen i o de amigos e amilia es. No en an o gos a ia de e e i os que mais con ibuí am pa a a conc e ização do mesmo. À P o esso a Dou o a Ma ia Amélia G ácio, P esiden e do Conselho Cien í ico e Di ec o a da Unidade de Helmin ologia e Macologia Médicas, o ag adecimen o especial pela sua disponibilidade que semp e p es ou e ambém pelas acilidades logís icas e de equipamen o que me o am cedidas pa a a ealização de uma pa e des e abalho. Ao meu O ien ado , P o esso Dou o An ónio José dos San os G ácio, Di ec o da Unidade de En omologia Médica, pelo conhecimen o pa ilhado ao longo da ealização da minha Tese em Pa asi ologia Médica, pela sua semp e disponibilidade na elabo ação, co ecção e aliosas suges ões, sem as quais es ou ce a que es e abalho não a ingi ia o ní el de qualidade cien í ica p e endido. À P o esso a Dou o a Ma ia Manuela Calado, da Unidade de Helmin ologia e Macologia Médicas, pelos ines imá eis ensinamen os ansmi idos e colabo ação que gen il e desin e essadamen e p es ou pa a que es a disse ação omasse o ma. À S ª D. Síl ia Nunes, Auxilia de Labo a ó io da Unidade de En omologia Médica e esponsá el pela manu enção da colónia de Glossina mo si ans mo si ans ag adeço p o undamen e odo o abalho e paciência que me dedicou na o mação da colónia que i ia se al o de alguns es udos na ealização des a Tese. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ i ÍNDICE GERAL Ag adecimen os…………………………………………………………………………iii Índice Ge al……………………………………………………………………………..i Índice de Figu as…………………………………………………….………………….ix Índice de Tabelas, G á icos e Quad os………………………………………………...xi Siglas e Ab e ia u as…………………………………………………………………..x i Resumo…………………………………………………………………………….....x iii Abs a …………………………………………………………………………….........xx 1- INTRODUÇÃO………………………………………………………………………………1 1.1 - Mosca Tsé sé, Doença do Sono e Nagana………………………………………..2 1.1.1 - B e e his ó ia da Glossina e da doença do sono…………………………………3 1.1.2 - O Papel de Po ugal no es udo da doença e das glossinas……………………….5 1.1.3 - O papel da O ganização Mundial da Saúde e do Mundo na ac ualidade-O eg esso da doença do sono…………………………………...8 1.2 - Sis emá ica das Glossinas……………………………………………………….11 1.2.1 - Posição Sis emá ica do Géne o Glossina Wiedeman, 1830……………………11 1.2.2 - C onog ama da Posição Sis emá ica do Géne o Glossina Wiedeman, 1830…………………………………………….13 1.2.3 - Géne o Glossina Wiedeman, 1830……………………………………………..14 1.2.3.1 - Espécies e Subespécies………………………………………………………..14 1.2.3.1.1 - Subgéne o Nemo hina Robineu-Des oidy, 1830…………………………...14 1.2.3.1.2 - Subgéne o Glossina s.s . Zump , 1935…………………………………….15 1.2.3.1.3 - Subgéne o Aus enina Townsend, 1921……………………………………..16 1.2.4 - E olução dos ês G upos do Géne o Glossina………………………………....17 Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ 1.3 - Dis ibuição Geog á ica das Glossinas………………………………………....19 1.3.1 - Alguns ac o es condicionan es…………………………………………………19 1.3.2 - Dis ibuição Geog á ica do G upo Glossina mo si ans………………………...20 1.3.2.1 - Dis ibuição de algumas subespécies do G upo mo si ans …………………...20 1.3.3 - Habi a …………………………………………………………………………..23 1.3.4 - Compo amen o ó ico da Glossina mo si ans mo si ans……………………...26 1.4 - Mo ologia, Fisiologia e Biologia das Glossina………………………………...29 1.4.1 - Mo ologia Ex e na dos Adul os………………………………………………..29 1.4.1.1 – Ca ac e ís icas ge ais…………………………………………………………29 1.4.2 - Ana omia In e na das Glossinas Adul as……………………………………….41 1.4.2.1 - Sis ema Diges i o……………………………………………………………..41 1.4.2.1.1 - Picada, Inges ão de sangue, diges ão e assimilação sanguínea……………..44 1.4.2.2 - Ciclo Alimen a ……………………………………………………………….46 1.4.2.3 - Sis ema ci cula ó io…………………………………………………………...49 1.4.2.4 - Sis ema neu o-endóc ino……………………………………………………...49 1.4.2.5 - Apa elho ep odu o …………………………………………………………..49 1.5 - Relação Endosibion e com a Glossina……………………………………….…51 1.6 - O Ciclo de Vida…………………………………………………………………..52 1.6.1 – C iadou os……………………………………………………………………...58 1.6.2 - Fase de Adul o…………………………………………………………………..59 1.6.3 - Du ação da ida…………………………………………………………………60 1.6.4 - P opo ção sexual………………………………………………………………..60 1.6.5 - Causas de mo e………………………………………………………………...61 1.7 - In e esse pa a a Medicina……………………………………………………….62 Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ i 1.7.1 - Doença do sono ou T ipanossomíase Humana A icana……………………….62 1.7.2 - Sis emá ica do T ipanossoma b ucei…………………………………………...63 1.7.3 - Ca ac e ís icas do T ipanossoma b ucei………………………………………..63 1.7.4 - Va iação An igénica das Glicop o eínas “Va ian Su ace Glycop o ein” (VSG)………………………………………...64 1.7.5 - Ciclo de Vida Do T ipanossoma spp…………………………………………...66 1.7.6 - Con ac o Glossina-Homem……………………………………………………..68 1.7.7 – Epidemiologia…………………………………………………………………..69 1.7.8 - Pa ologia da doença-causas, incidência e ac o es de isco…………………….72 1.7.8.1 - P og essão e sin omas………………………………………………………...72 1.7.8.2 - Diagnós ico e a amen o……………………………………………………...74 1-9 - Incidência da T ipanossomíase na P odução Animal em Á ica…………….76 1.10 - Rec udescência das T ipanossomíases a icanas…………………………….77 1.11 - Es a égia de Con olo e P e enção …………………………………………..78 1.11.1 - Telas e A madilhas…………………………………………………………….82 1.11.2 - P e enção e Es a égias………………………………………………………..83 1.12 – Objec i os do abalho…………………………………………………………..85 2 - MATERIAL E MÉTODOS……………………………………………………….86 2.2 - MODELO EXPERIMENTAL UTILIZADO………………………………….87 2.2.1 - Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae)…………………………………………………………87 2.3 - P incipais écnicos de manu enção da colónia de G. m. mo si ans …………...88 2.3.1 - Ins alações e condições ambien ais……………………………………………..88 2.3.2 - Técnicas de alimen ação………………………………………………………...88 2.3.3 - Técnicas de engaiolamen o dos adul os e ecolha das pupas…………………...89 Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ ii 2.3.4 - Técnica de acondicionamen o das pupas……………………………………….90 2.3.5 - Técnica da ecolha dos adul os eclodidos………………………………………91 2.3.6 - Reg as de higiene e segu ança pa a a manu enção da colónia………………….92 2.4 – Amos a………………………………………………………………………….94 2.4.1 - Colónia de Glossina mo si ans mo si ans u ilizada como amos a no es udo………………………………...94 2.4.2 – Me odologia u ilizada na o mação das ês ge ações………………………….95 2.4.3 – Me odologia u ilizada pa a o es udo do sex a io da “Colónia Expe imen al” de glossinas……..…………………………96 2.4.4 – Me odologia u ilizada pa a ecolha de amos as de glossinas a u iliza no es udo da análise molecula ………………………….96 2.5 - Análise molecula dos exempla es de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850……………………....97 2.5.1. – Amos as u ilizadas…………………………………………………………….97 2.5.2. – Ex acção do ADN genómico………………………………………………….97 2.5.2.1 – P incipio do mé odo………………………………………………..…………97 2.5.2.2 – Me odologia ……………………………….…………………………………98 2.5.3. – Ampli icação do ADN genómico……………………………………………...99 2.5.4. – Elec o o ese em gel de aga ose……………………………………………...100 2.5.5. – Pu i icação e sequenciação dos p odu os ampli icados……………………....101 2.5.6 - Análise das sequências………………………………………………………...101 3-RESULTADOS…………………………………………………………………….102 3.1 – In odução……………………………………………………………………...103 3.2 - Es udos de glossinas eclodidas macho e êmea po ge ação…………………104 3.2.1 – P imei a ge ação……………………………………………………………....104 3.2.2 – Segunda ge ação………………………………………………………………106 Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ iii 3.2.3- Te cei a ge ação………………………………………………………………..107 3.3 – Es udo das glossinas macho e êmea eclodidas e de pupas não eclodidas po ge ação…………………………………………..109 3.3.1 – Relação de glossinas macho eclodidas po ge ação…………….…………….109 3.3.2 – Relação de glossinas êmeas eclodidas po ge ação…………………………..110 3.3.3 - Relação de pupas não eclodidas po ge ações…………………………………111 3.3.4 – Relação das glossinas macho e êmea eclodidas e pupas não eclodidas nas ês ge ações es udadas…………………………….112 3.3.5 – Cálculos pa a as glossinas machos e êmeas eclodidas……………………….113 3.4 – Es udos da análise molecula das Glossinas mo si ans mo si ans Wes wood, 1850……………………………114 3.5. – Selecção das amos as………………………………………………………….114 3.6. – Análise molecula das amos as ……………………………………………..114 3.6.1. – Ampli icação do gene COI do ADN mi ocond ial (m DNA)………………..114 3.6.2. – Sequenciação das amos as ampli icadas…………………………………….115 4 – CONCLUSÕES…………………………………………………………………..122 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………..126 ANEXOS……………………………………………………………………………...140 Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ ix INDÍCE DE FIGURAS I – INTRODUÇÃO: FIGURA 1 - Dis ibuição geog á ica do G upo palpali (www.medicalecology.o g).......................................................................14 FIGURA 2 - Dis ibuição geog á ica do G upo usca (www.medicalecology.o g).......................................................................16 FIGURA 3 - Mapa da dis ibuição geog á ica da Glossina mo si ans (p e o) (FAO Co po a e Documen e Reposi o y)...................................................20 FIGURA 4 - Rep esen ação de alguns ipos de ege ação, que se em de habi a p e e encial das glossinas (Pa que Nacional da Go ongosa – Moçambique)………….23 FIGURA 5 - Ve sa ilidade de mamí e os p opícios pa a uma e eição sanguínea da Glossina mo si ans (Pa que Nacional da Go ongosa- Moçambique)………………27 FIGURAS 6 e 7 - Glossina mo si ans mo si ans (colónia do IHMT - Fo os da au o a)………………………………30 FIGURA 8 - Cabeça da glossina (www.answe s.com)..................................................31 FIGURA 9 - Diag ama da cabeça (FAO Co p. Doc. Reposi o y)……………………..31 FIGURA 10 - A is a da glossina (www.answe s.com)..................................................32 FIGURA 11 - A is a e p obóscis (Fo o da au o a)…………………………………….32 FIGURA 12 - Rep esen ação da a madu a bucal (FAO Co p. Doc. Reposi o y)……..33 Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ x i LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS µg - Mic og ama µl – Mic oli o ADN - Ácido Desoxi ibonucleico COI – Ci oc omo C oxidase sub-unidade 1 BLAST - Basic Local Aligmen Sea ch Tool FAO - Food and Ag icul u e O ganiza ion o he Uni ed Na ions IHMT – Ins i u o de Higiene e de Medicina T opical MCT – Missão de Comba e às T ipanosomíases MHS – Means Hunge S age – es ado alimen a médio LCR - Líquido Ce alo aquidiano m DNA – DNA mi ocond ial NT - .Não ene al OMS - O ganização Mundial de Saúde PCR - Polyme ase Chain Rea ion PTI – Tse se Th obin Inhibi o pm – Ro ações po minu o SI – Sis ema Imuni á io RS - .Re eição sanguínea TAA – T ipanossomíase Animal A icana TAE - T is-Ace a o TE - T is-EDTA THA - T ipanossomíase Humana A icana Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ x ii UEM – Unidade de En omologia Médica UV – Ul a iole a VAT - Va iable An igen Type VSG - Va iable Su ace Glicop o ein WHO - Wo ld Heal h O ganiza ion Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ x iii RESUMO Com es a disse ação, p e endemos con ibui pa a um melho conhecimen o dos aspec os en omológicos da Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850, exis en e no insec á io da Unidade de En omologia Médica do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical (UEM/IHMT), e pa a o início do es udo da sua análise molecula . A disse ação es á di idida em qua o pa es e inclui ainda uma lis a de siglas, ab e ia u as, índices de igu as, abelas, g á icos e quad os, assim como anexos que se julgou pe inen e inclui . A INTRODUÇÃO, consis e na p imei a pa e do abalho, azendo-se nela uma abo dagem sob e o his o ial da mosca sé sé, a nagana, a T ipanossomíase Humana A icana (THA) e a con ibuição po uguesa pa a o seu es udo e ambém pa a o comba e an o da doença como pa a o comba e do ec o . Re e imo-nos aos aspec os da sis emá ica, da dis ibuição geog á ica e de alguns ac o es condicionan es, como o habi a , o compo amen o ó ico das glossinas, a mo ologia, a isiologia e a bioecologia dos ec o es. São ambém abo dados alguns aspec os de in e esse em medicina dos agen es pa ogénicos e as suas elações in e hospedei os e eb ados e modo de ansmissão. Ainda nes e capí ulo e e imos a impo ância da me odologia na lu a con a os ec o es, in eg ada no con olo das ipanossomíases a icanas. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ xix Na segunda pa e, MATERIAL E MÉTODOS, desc e emos o modelo expe imen al u ilizado na nossa amos a, des acando a o igem, as ca ac e ís icas e as écnicas de manu enção. São desc i os os ma e iais, as écnicas e as me odologias u ilizadas pa a a ex acção e ampli icação do Ácido Desoxi ibonucleico (ADN) genómico, seguindo-se a pu i icação e sequenciação dos p odu os ampli icados. Na e cei a pa e, RESULTADOS, ap esen amos os di e en es es udos ealizados e esul ados ob idos, du an e a o mação da colónia de glossinas que são u ilizadas como amos a pa a o es udo, podendo ap esen a a elação sex a io, o núme o de glossinas adul as eclodidas macho e êmea, assim como o núme o de pupas. Ainda nes e capí ulo ap esen amos a análise molecula das amos as e a sua sequenciação. Na qua a pa e, desc e emos as CONCLUSÕES, ge ais do abalho, onde se demons a que o sex a io das Glossinas mo si ans mo si ans, c iadas em colónia é idên ico ao exis en e no seu habi a na u al e que a sua di e sidade haplo ipica é ex emamen e baixa. A úl ima pa e, é cons i uída pelas REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS consul adas pa a es a disse ação Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ xx ABSTRAT Wi h his essay we y o con ibu e o a be e knowledge o he en omological aspec s pe aining o he Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850, exis ing in he UEM/IHMT insec a iums, and he beginning o he s udy o i s molecula analysis. The essay is di ided in ou pa s and includes a lis o ini ialisms, abb e ia ions, igu e indexes, ables and g aphics as well as annexes ha we e deemed impo an o include. The INTRODUCTION is he i s pa o his pape , and on i , an app oach is made abou he Tse se ly, he “nagana”, he Human A ican T ypanosomiasis (HAT) and he his o ical Po uguese con ibu ion o i s s udy and also o he comba no only agains he disease bu also agains i s ec o . We e e he sys ema ics aspec s, he geog aphic dis ibu ion and some condi ioning ac o s such as, habi a glossinae’s ophic beha iou , he mo phology, he physiology and he ec o s bioecology. Some in e es ing aspec s o medicine a e also app oached, in wha conce ns he pa hogenic agen s and hei e eb a e hos s as well as means o ansmission. S ill in his chap e we men ion he impo ance o me hodology on he s uggle agains he ec o s, in eg a ed on he con ol o A ican ypanosomiasis. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) ______________________________________________________________________________________________ xxi On he second pa , MATERIAL AND METHODS, we desc ibe he expe imen al me hod ha i was used on ou specimen, highligh ing he o igin, h cha ac e is ics and main enance echniques. I is also desc ibed he ma e ials, echniques and me hodologies ha we e used o he ex ac ion and ampli ica ion o he genomic DNA (Deoxy ibonucleic Acid), ollowing i up wi h he pu i ica ion and sequencing o he ampli ied p oduc s. On he hi d pa , RESULTS, we p esen he di e en s udies ha we e done and he esul s ob ained, du ing he o ma ion o he glossinae’s colony ha is used as specimen o he s udy, being able o p esen he sex a io as well as he numbe o ha ched adul glossinae, male and emale, and he numbe o pupae. S ill on his chap e we p esen he specimens molecula analysis and i s sequencing. On he ou h pa , we men ion he gene al CONCLUSIONS aken om his wo k, we e i is demons a ed ha he Glossina mo si ans mo si ans sex a io, b ed in colony, is iden ical o he exis ing one on i s na u al habi a and ha i s haplo ipical di e si y is ex emely low. The las pa consis on he BIBLIOGRAPHIC REFERENCES consul ed o his essay. 1 I – INTRODUÇÃO: Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 2 1.1 - Mosca Tsé-Tsé, Doença do Sono e Nagana. Mosca Tsé sé, no dialec o ban o na Á ica Equa o ial, é o nome de uma mosca que ansmi e a doença do sono ao homem, a T ipanossomose Humana A icana (THA) e a doença, conhecida como Nagana, quando a ec a os animais, doenças es as, causadas pelo pa asi a: T ipanosoma spp. Apesa do e mo mosca Tsé sé e a sua o igem na Á ica Equa o ial, oi ansmi ido ao longo dos empos po odos os po os a icanos que se de on a am com os mesmos p oblemas nas suas aldeias, an o po p o oca a doença nos seus habi an es, como nos animais domés icos, icando a é aos dias de hoje como nome usual nas gen es daquele con inen e. É ambém mui o conhecida po odos os po os a icanos como a mosca de “caça”e ou “mosca das sa anas”. Na linguagem cien í ica é denominada po Glossina, com di e en es ca ac e ís icas quan o ao G upo, Géne o e Subgéne o. Tsé sé, mosca de caça, mosca de sa ana ou simplesmen e glossina é um lagelo g a e que assola mui os países a icanos e é um dos p incipais esponsá eis pela doença e pela economia p ecá ia nas zonas u ais onde a sua p esença é no ó ia. Es a si uação é p o ocada pela ansmissão do pa asi a aos seus hospedei os (homem ou animal), no momen o da sua e eição sanguínea, azão pa a g andes deslocações de populações de á eas onde a doença g assa a pa a á eas que pode iam es a menos in es adas. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 3 1.1.1 - B e e his ó ia da Glossina e da doença do sono: Es a mosca e a já há mui o conhecida po odos os po os a icanos, e as p imei as e e ências são ei as po um geóg a o á abe Abu Yaqu du an e a sua iagem em Á ica, no Século XII. No en an o, oi só no séc. XIV que um esc i o á abe Ibn Khaldun menciona a mo e len a e dolo osa do sul ão Mali Ja a po e sido picado po uma mosca, julgando-se assim que ha e ia uma elação en e a doença e a mosca (De K ui , P. 1926) A chegada dos eu opeus a Á ica e a consequen e explo ação em zonas in es adas po es a mosca, ez com que John A kins, em meados do séc XVIII, denominasse a doença exis en e como “Neg o le a gi”, sem con udo iden i ica a sua pa ogenia. Anos mais a de, em 1830, é que Wideman desc e e a mosca conhecida po sé sé como glossina, passando en ão es a a aze pa e do Géne o Glossina. Em 1880, apesa de se já conhecido o Géne o T ypanosoma e de que es e e a o causado da doença en ão chamada “su a” dos ca alos e ou os animais domés icos, não e a no en an o uma doença que es i esse elacionada com a glossina. De ido a descobe as pos e io es des e pa asi a no sangue de bo inos, po B uce e Ma y B uce em 1894, na Á ica do Sul, deu-se início a di e en es in es igações Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 4 cien í icas e, em 1897, B uce obse ando ipanossomas no es ômago de glossinas, ez a p imei a associação en e Nagana, a T ipanossomíase nos animais e o insec o Glossina. Em 1898, a doença e a mo e começou a espalha -se pela Á ica Cen al, jun o ao Lago Vic o ia Nyanza e, p incipalmen e, no Uganda a é ao início do século XX. Cen enas de milha es de homens e mulhe es mo e am de ido à doença do sono a icana, sendo es a da a conside ada como a p imei a epidemia. Em 1899, Plimme e B ad o d, po e em obse ado o pa asi a lagelado num cão, de am-lhe en ão o nome de T ypanosoma b ucei Em 1901, Robe Michael Fo de ez a p imei a obse ação de ipanossomas em sangue humano, que inha indo da Gâmbia. Em 1903, Aldo Cas ellani elacionou que os ipanossomas que obse ou (T ipanosoma gambiense) num pacien e, es a iam implicados na pa ógenese da doença do sono, sem con udo a elaciona com a picada da glossina ou que es a osse o ec o do pa asi a. Con udo, es a am já dados os p imei os passos pa a que, obse ações ei as du an e os anos seguin es, concluíssem inalmen e que a doença do sono ou T ipanossomíase Humana A icana (THA) osse en ão conside ada e econhecida. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 11 1.2 - SISTEMÁTICA DAS GLOSSINAS. 1.2.1-Posição Sis emá ica do Géne o Glossina Wiedeman, 1830: Segundo F ede ik To p Pe e sen, (2007), num a igo sob e Filogenia Molecula e E olução, a Supe amília Hippoboscoidea, é compos a po qua o Famílias: Família Glossinidae Família Hipoboscidae Família S eblidae Família Nyc e ibidae Es as Famílias exibem um g ande núme o de adap ações únicas e impo an es que mo ológica que isiológica, es ão associadas ao seu es ilo de ida ec opa asi á io (Henning, 1973;McAlpine,1989). O concei o mode no da Hippoboscoidea é de e minado e comp o ado po análises gené icas, usando dados sequenciais de ADN. (Ni mala e al; 2001, Di ma e al, 2006). Família Glossinidae: Du an e á ios anos, e segundo in es igado es como Vande planK (1949), conside a am que o Géne o Glossina pe encia à Família Muscidae e na Sub amília S omoxyinae ou a uma ou a Sub amilia Glossininae. Foi a pa i dos anos cinquen a que as glossinas o am conside adas como uma amília monogené ica e pe encen es à Família Glossinidae (A onso, 2000). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 12 As Glossinidae são de odas as Famílias a que ap esen a um núme o meno de espécies, mas é ambém a mais conhecida de ido à sua no o iedade como ec o dos pa asi as ipanosomas, esponsá el pela doença do sono em humanos e Nagana em animais (K insky, 2002) Mo ologicamen e é a menos modi icada da Supe amília Hippoboscoidea, embo a man endo mui as das ca ac e ís icas ances ais das Calyp a ae. A mono ilia das Glossinas é acei e, (Hennig 1973) e ea i mada po um núme o de sinapomo ias em McAlpine (McAlpine, 1989: e.g. a is a com longas plúmulas, palpos alongados e p obóscis). As ca ac e ís icas mais impo an es, que as di e em das ou as ês amílias, são que as glossinas êm ida li e e só en am em con ac o com o hospedei o du an e as e eições sanguíneas. A mais no á el de odas é a sua i ipa idade adeno ó ica Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 13 1.2.2 - C onog ama da Posição Sis emá ica do Géne o Glossina, Wiedeman, 1830: Reino ANIMALIA Filo ARTHROPODA Sub ilo MANDIBULATA Classe INSECTA Subclasse PTERYGOTA TA Di isão ENDOPTERYGOTA O dem DIPTERA Subo dem BRACHYCERA In ao dem CYCLORRAPHA Supe amília HIPPOBOSCOIDEA Familia GLOSSINIDAE Géne o Glossina Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 14 1.2.3 - Géne o Glossina Wiedeman, 1830: 1.2.3.1-Espécies e Subespécies: No âmbi o do es udo de espécies e subespécies, depa amo-nos com ês g andes Subgéne os, de que i emos apenas aze uma pequena abo dagem, unicamen e pa a que possamos localiza e comp eende melho a espécie e subespécie que nos impo a pa a es e es udo. Assim, e emos e segundo os au o es, (Machado, 1970; Glasgow, 1970; Pon , 1980; WHO, 1986; WHO, 1998 e A onso, 2000): 1.2.3.1.1- Subgéne o Nemo hina Robineu-Des oidy, 1830: (G upo palpalis) Espécie e subespécie Glossina palpalis palpalis Glossina palpalis gambiensis Glossina achinoides Glossina uscipes uscipes Fig nº1-Dis ibuição geog á ica do G upo palpalis (www.medicalecology.o g) Nes e g upo encon am-se algumas das glossinas cuja p incipal ca ac e ís ica é a sua dis ibuição se em zonas mui o húmidas da Á ica Ociden al e Cen al. O habi a des as glossinas é a lo es a opical húmida, onde es e g upo de glossinas pode se encon ado e es ão associadas à ege ação ípica nas ma gens de ios, lagos, pân anos, dis ibuindo-se ao longo dos cu sos de água nas chamadas gale ias lo es ais. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 15 Du an e a época seca podem se encon adas em e úgios mais húmidos jun o ao solo onde epousam, pe mi indo assim a sua sob e i ência. Es as glossinas são conside adas espécies hig ó ilas, não só pela p esença da água, mas ambém pela necessidade da ege ação ípica que lhes dá ab igo. 1.2.3.1.2 - Subgéne o Glossina s.s . Zump , 1935: (G upo mo si ans) Espécie e subespécie Au o e da a Glossina longipalpis Wideman, 1830 Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 Glossina mo si ans cen alis Machado, 1970 Glossina mo si ans submo si ans News ead, 1910 Glossina pallidipes Aus en, 1903 Glossina aus eni News ead,1912 Glossina swynne oni Aus en, 1923 Es e é o G upo al o do nosso es udo, sendo a Espécie a Glossina mo si ans mo si ans, cujas ca ac e ís icas se ão es udadas po meno izadamen e ao longo de odos os capí ulos seguin es. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 16 1.2.3.1.3 - Subgéne o Aus enina Townsend, 1921: (G upo usca) Espécie e subespécie Glossina usca usca Glossina usca congolensis Glossina longipennis Glossina b e ipalpis Fig nº2 - Dis ibuição geog á ica do G upo usca (www.medicalecology.o g) Es e g upo em como ca ac e ís ica e o seu habi a ge almen e associado a lo es a plu ial ou as ma gens lo es ais da Á ica Ociden al, coincidindo mui as ezes com a á ea de dis ibuição do G upo palpalis. No en an o, nes e g upo há glossinas que ocupam á eas semi-á idas e mesmo á idas, como po exemplo a Glossina longipennis, e Glossina b e ipalpis podendo se encon adas em zonas secas de sa ana da Á ica O ien al e Me idional. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 17 1.2.4 - E olução dos ês G upos do Géne o Glossina: A e olução dos ês g upos de glossinas ( usca, mo si ans, palpalis), segundo Bu sell, nos anos cinquen a e à luz da eo ia ecológica, ep esen a o cu so e olu i o das espécies do Géne o Glossina. O G upo usca e a ido como sendo o g upo mais p imi i o, uma ez que as espécies des e g upo es ão ge almen e associadas a lo es a plu ial e po se conside ado esse o seu habi a ances al. O G upo mo si ans e ia sido o úl imo a e olui , adqui indo uma capacidade de adap ação ao apa ecimen o da ege ação de sa ana (Fo d, 1970). No en an o, exis em á ias ou as eo ias ace ca da e olução dos ês G upos de Glossinas. As eo ias quan o à o igem, habi a e G upo a que pe encem as glossinas o am ao longo dos anos, al o da e olução de á ios es udos cien í icos: ecológicos, mo ológicos e gené icos. A sua classi icação na sis emá ica oi ambém e oluindo ao longo do empo de ido ao a anço da ciência, sendo ac ualmen e os es udos a a és da gené ica a maio e mais impo an e e amen a ao se iço dos en omologis as. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 18 Apesa da ciência e e oluído pa a uma melho comp eensão e es udos das di e en es espécies, há ainda mui as dú idas, não só quan o à e olução, como quan o ao G upo em que de em se colocadas algumas espécies. Exemplos dis o é o caso da Glossina aus eni, que con inua em deba e se pe ence ao G upo mo si ans ou se de e ia se incluída no G upo palpalis (News ead, 1912 e A onso, 2000). É ambém e no âmbi o da dis ância gené ica en e as di e en es espécies de Glossinas (Gooding, 1996), assim como análises molecula es dos di e en es endossimbion es (Aksoy e al., 1997 e Dale & Maudlin, 1999), que o es udo pa ece indica a seguin e e olução: P imei o, espécies do G upo usca, seguidas do G upo mo si ans e inalmen e as do G upo palpalis Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 19 1.3 - DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DAS GLOSSINAS. 1.3.1 - Alguns ac o es condicionan es: As glossinas, como o am e e idas, ocupam exclusi amen e o con inen e a icano ao Sul do Saa a, endo como limi e da sua p esença a No e (15º de la i ude No e) e o limi e me idional (ce ca de 20º de la i ude Sul). A sua dis ibuição de e-se a ac o es abió icos, como o dé ice hig omé ico e ele adas empe a u as egis adas no dese o do Saa a. A Sul, a sua dis ibuição é limi ada pelo dese o do Namibe, onde se e i icam empe a u as mui o baixas, condições es as incompa í eis com a sob e i ência das glossinas. As g andes al i udes (2000 me os), são ambém ac o que não a o ece a sob e i ência das glossinas, de ido ao abaixamen o acen uado da empe a u a. Há ou os ac o es limi an es como po exemplo os ac o es bió icos: 1- A ege ação, que é já uma condicionan e do clima e do solo e que po sua ez c ia e egula condições ísicas e biológicas de empe a u a e humidade, in luencia a qualidade das supe ícies em que a mosca pousa, a o ma e dimensões dos espaços de oo, e c. 2- Ou o ac o não menos impo an e pa a a p esença ou ausência das glossinas numa de e minada á ea são os hospedei os on es de alimen ação. 3- Fac o es condicionan es e limi an es da dis ibuição das espécies e subespécies, são as ba ei as ana ómicas, isiológicas, biológicas e a a acção sexual das glossinas (Machado 1954 e Aze edo, 1967). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 20 1.3.2 - Dis ibuição Geog á ica do G upo e Espécies da Glossina mo si ans: Fig.nº3 - Mapa da dis ibuição geog á ica da Glossina mo si ans (p e o) (FAO Co po a e Documen e Reposi o y) O G upo Glossina mo si ans, encon am-se po odo o lado na sa ana a icana, sendo conside adas glossinas xe ó ilas. A sua dis ibuição no en an o pa ece se limi ada pelas condições clima é icas de in e nos ios no Sul (Zimbabwe, Bo swana) e po condições clima é icas de calo seco no No des e e Á ica Cen al. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 27 Fig. nº 5 - Ve sa ilidade de mamí e os p opícios pa a uma e eição sanguínea da Glossina mo si ans (Pa que Nacional da Go ongosa- Moçambique) Apesa das glossinas e em uma g ande capacidade de adap ação alimen a , êm p e e ência em g andes mamí e os po es es lhes o nece em o epas o sanguíneo egula e necessá io à sua sob e i ência, do que de pequenos mamí e os, que êm hábi os ge almen e noc u nos e que po ou o lado não lhes o necem nem assegu am uma alimen ação egula . A í ulo de cu iosidade, sabe-se que apesa da zeb a (Equus bu chelli) habi a a sa ana a icana, o sangue des e mamí e o não é encon ado na Glossina mo si ans (Wei z, 1963). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 28 De ido a uma eg essão na auna de sa ana, e i ica-se uma eo ien ação das p e e ências ó icas das glossinas pa a o gado e mesmo pa a o homem, po ezes os únicos hospedei os disponí eis. As in luências climá icas, como e e ido, p incipalmen e a empe a u a e humidade, desempenham um papel impo an e na dis ibuição das glossinas, mas não são o ac o de maio ele ância da sua p esença. Es udos ealizados em g andes e di e en es á eas geog á icas com uma ce a p oximidade (Pe ei a Lapa 1917), demons a am, que embo a mui o idên icas ela i amen e aos ac o es climá icos, podem ap esen a di e enças em elação à p esença de glossinas. Uma delas pode á encon a -se in es adíssima e uma ou a o almen e isen a de glossinas. Es e ac o de e-se às ca ac e ís icas do e eno. Numa, exis e uma g ande planície (sa ana) po oada de caça, e na ou a, com e eno mui o aciden ado, a caça é a a e logo a incidência da glossina é mui o in e io . No mesmo es udo icou p o ado que a glossina não escolhe pa a seu habi a as egiões mon anhosas, ambém po se em á eas onde a caça escasseia, p incipalmen e os animais de g ande po e. Ainda elacionado com as p e e ências da glossina, o es udo em egiões onde a sua p esença e a uma cons an e, concluiu-se que os pupá ios da sé sé e am p incipalmen e abundan es jun o das e edas equen adas pelos animais de g ande po e. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 29 1.4 -MORFOLOGIA, FISIOLOGIA E BIOLOGIA DAS GLOSSINAS. 1.4.1 - Mo ologia Ex e na dos Adul os: 1.4.1.1 - Ca ac e ís icas ge ais: As glossinas, conhecidas po mosca Tsé sé, são díp e os ciclo a os pe encen es à Família Glossinidae, que se ca ac e iza po ap esen a apenas um géne o, o Géne o Glossina, que po sua ez é ca ac e izada po ap esen a uma mo ologia na cabeça (a lúmula e a su u a p ilineal), e em an enas cu as com ês segmen os, sendo o e cei o p o ido de uma a is a. Os adul os ap esen am uma mo ologia ex e na idên ica a odos os ou os G upos do Géne o Glossina. São moscas alongadas e maio es que a mosca comum, e o seu co po é cons i uído po ês pa es p incipais: cabeça, ó ax e abdómen. Têm uma colo ação cas anha mui o escu a, podendo ambém ap esen a uma colo ação cas anha mais cla a. Em epouso, as glossinas êm uma ca ac e ís ica única de ido ao ac o de as asas c uza em uma sob e a ou a e sob e o abdómen, ul apassando a ex emidade pos e io des e, coincidindo os dois ápices ala es. Ap esen am um aspec o obus o, p incipalmen e as de idade mais a ançada, de ido à o e qui ina gene alizada e à muscula u a ala bem desen ol ida. Após uma e eição sanguínea (RS) comple a, que no caso da Glossina mo si ans e segundo Machado 1958, em a du ação de escassos minu os (1 a 2), podendo suga uma quan idade de sangue que pese mais do que ela p óp ia, o abdómen ap esen a-se bas an e dis endido, olumoso e de colo ação e melha. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 30 O p obóscis é longo, ec ilíneo e, em epouso, p ojec a-se pa a dian e da cabeça. Os machos são mais pequenos que as êmeas, mas pe ei amen e dis inguí eis a a és das geni álias. Uma ou a ca ac e ís ica única das glossinas é a malha discal cen al das asas em o ma de machado. Fig.nºs. 6 e 7 – Glossina mo si ans mo si ans (colónia do IHMT - Fo os da au o a) Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 31 A Cabeça: . Fig.nº8 - Cabeça da glossina Fig. nº9 - Diag ama da cabeça (www.answe s.com) (FAO Co p. Doc. Reposi o y) Olhos compos os Ap esen a um pa , de g andes dimensões, bem sepa ado e de co cas anho- escu o. São compos os po milha es de pequenas unidades, chamadas no seu conjun o oma ídeos. Pe mi em de ec a objec os em mo imen o a é 137 m e de ec a simul aneamen e pequenos e p óximos mo imen os. Olhos simples ou ocelos Possuem ês ocelos, dispos os em iângulo no cimo da cabeça. Pe mi em de ec a a iações de luminosidade e po encia es ímulos ecebidos pelos olhos compos os Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 32 An enas – um pa , si uadas na egião on al da cabeça e inse idas em pequenas dep essões en e os olhos compos os. Cada an ena é cons i uída po ês a ículos, sendo o 3º alongado e ap esen ando uma a is a plumosa. Fig. nº 10 - A is a da glossina ( www.answe s.com) Fig nº 11 - A is a e p obóscis (Fo o da au o a) Pa a além disso e ainda no 3º a ículo, jun o à ligação com o 2º a ículo e na base da a is a encon a-se um pa de c ip as ol ac i as com nume osas sedas senso iais que es ão adap adas pa a a capacidade ác il e ol ac i a (mecano ecep o es, e mo ecep o es e químio ecep o es). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 33 A a madu a bucal é o mada po : - um pa de palpos maxila es - um p obóscis. Fig. nº 12- Rep esen ação da a madu a bucal (FAO Co p. Doc. Reposi o y) O p obóscis encon a-se na base da cabeça, o mado e p o egido ex e namen e pelos palpos maxila es dispos os la e almen e. O p obóscis é longo, ec ilíneo e p ojec ado ho izon almen e pa a a en e quando a glossina se encon a em epouso. É cons i uído po : - lábio (labium), com den ículos na sua ex emidade; - láb o epi a ígico (lab um); - hipoga inge. Es as ês peças o mam o canal alimen a , an o nos machos como nas êmeas. O lábio é conside ado o e dadei o ó gão picado e é o mado po es u u as que no seu conjun o êm, como p imei a unção, dilace a a pele do hospedei o. O lab o ap esen a ambém es u u as especializadas de modo a o ma um canal – o canal alimen a , a a és do qual o sangue é aspi ado du an e a e eição sanguínea. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 34 A hipo a inge é um longo ubo ex emamen e ino e a sua unção é a de pe mi i a saída da sali a. No momen o da picada o p obóscis baixa e icalmen e e a glossina in odu-lo nos ecidos do hospedei o, pe manecendo os palpos maxila es no ex e io e em posição ho izon al. É nes a al u a que se dá a lace ação e, como consequência, o apa ecimen o de mic ohema omas dos asos sanguíneos. O p ocesso da e eição sanguínea é um mecanismo mui o di e enciado, pois é ambém acompanhado pela inoculação da sali a que em p op iedades asodila ado as e an icoagulan es, pe mi indo assim que os ipanossomas pe maneçam po algum empo no local de inoculação. Tó ax: O ó ax em uma o ma quad angula , com uma su u a ans e sa que sepa a duas á eas bem qui inizadas: - P ono o; - Mesono o; Es a su u a é designada po su u a Mesono al. Pos e io men e, o ó ax ap esen a o escu elo, com sedas escu ela es que podem se de di e en es amanhos. La e almen e, es á di idido em: - Mesopleu a; - P eu opleu a, onde se podem obse a dois pa es de espi áculos que êm como unção a espi ação aqueal. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 35 Acima do pon o de inse ção das pa as an e io es encon a-se o 1º pa de espi áculos, es ando o 2º pa de espi áculos jun o aos hal e es ou balancei os. Os hal e es ou balancei os encon am-se po de ás da base das asas e são es u u as que auxiliam o insec o no equilíb io e di ecção do ôo. Ainda la e almen e pode-se obse a longas e o es sedas, que são impo an es pa a a classi icação axonómicas das glossinas. Asas: Um pa de asas que ap esen am uma ca ac e ís ica mui o impo an e pa a a iden i icação do Géne o Glossina Fig. nº13 - Rep esen ação de uma asa de glossina (www.answe s.com). Ap esen am uma célula cen al delimi ada pela 4ª e 5ª ne u as em o ma de machado. Cada asa ap esen a na sua base ês es u u as: - álula; - esquama ala ; - esquama o áxica. Ap esen am ambém uma ne u a cos al e uma ne u a subcos al, bem como seis ne u as longi udinais. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 36 Pa as: Como qualque Díp e o em ês pa es de pa as. As suas ca ac e ís icas p incipais são o de se em inas e o madas po di e sos segmen os: - coxa que se encon a ixada ao ó ax; - ocan e ; - ému ; - íbia; - a so, com 5 a ículos. No úl imo a ículo encon am-se 2 ga as e 2 pol ilhos. Os ému es, íbias e a sos ap esen am sedas mecano ecep o as e quimio ecep o as. Os a sos ap esen am e mo ecep o es, que são es u u as que pe mi em es a a empe a u a dos seus luga es de epouso (D’Amico e al., 1992). Fig. nº 14 - Pa a de uma glossina. (FAO Co p. Doc. Reposi o y) ocan e Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 43 - in e i no deco e da in ecção ipanossómica da sé sé , nomeadamen e, na ins alação dos ipomas igo as in es inais (A onso, 2000, Wille ,1966 & Langley,1975b). Di e ículo eso ágico Ó gão ecep o do epas o sanguíneo, que se dis ende pa a ecebe o sangue, ocupando quase odo o abdómen, que aumen a igualmen e de olume. In es ino médio É um longo ubo que es á di idido em ês segmen os (an e io , médio e pos e io ) e es ende-se desde da ace do sal do p o en ículo a é à inse ção dos ubos de Malpighi É no in es ino médio que o sangue se encon a en ol ido po uma memb ana - a memb ana pe i ó ica. In es ino pos e io Começa no local onde os ubos de Malpighi a ingem o in es ino a é ao ânus e é nele que se mis u am os alimen os não dige idos e o p odu o da exc eção dos ubos de Malpighi. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 44 1.4.2.1.1 - Picada, Inges ão de sangue, diges ão e assimilação sanguínea: As glossinas, como já e e ido, são moscas hema ó agas e causam lesões nos capila es do hospedei o quando azem a sua e eição sanguínea. Quando pica, o sangue não é sugado di ec amen e dos capila es, mas de pequenas acumulações hemo ágicas que se o mam na espessu a da de me. Nessas acumulações, a glossina injec a uma ce a quan idade de sali a a a és da hipo a inge. O p imei o ela o da ac i idade an icoagulan e na mosca sé- sé oi ei o em 1966 po Hawkins, que de ec ou um ac i ado de plasminogénio na glândula sali a e uma ac i idade an icoagulan e a ibuída a um inibido da ombina Fo am ambém encon adas duas acções com inibido es da ag egação plaque á ia. Es a molécula, o TTI (Tse se Th ombin Inhibi o ), é um pequeno pép ido com g ande ac i idade inibi ó ia sob e a ombina. Es udos pos e io es mos a am que o gene que codi ica o TTI é exp esso na glândula sali a e no in es ino e a exp essão é induzida pela alimen ação. Esse an icoagulan e ap esen a uma unção dupla: e i a a coagulação sanguínea no local de lesão no hospedei o, pe mi indo o sangue luído pa a a ealização da e eição sanguínea e no a o diges i o do pa asi a. (Song Li, Xiaqai Chen;1998). Após a chegada do sangue ao es ômago, aquele so e al e ação da cô , o nando- se escu o, sob a acção de enzimas esponsá eis que são seg egadas pelo segmen o médio e po ha e uma abso ção de água e iões pelas células in es inais do segmen o an e io , o nando o p odu o sanguíneo que se encon a no espaço endope i ó ico mui o mais neg o e pas oso. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 45 No segmen o pos e io do in es ino médio dá-se a abso ção dos p odu os esul an es da diges ão: aminoácidos, açúca es e lípidos. Os aminoácidos são mui o impo an es pa a a sín ese das p o eínas essenciais, an o pa a as glossinas jo ens como pa a as glossinas adul as e p incipalmen e pa a as êmeas na ep odução. Fig. nº19 - Rep esen ação de duas glossinas A - glossina após e eição sanguínea, B - glossina em jejum ou amin a (Adap ado de FAO Co p. Doc. Reposi o y) Du an e e após a inges ão, a água con ida no sangue em excesso é exc e ada a a és dos ubos de Malpighi, que são cons i uídos po dois pa es de longos ubos de colo ação esb anquiçada ou ama elada. Os ubos de Malpighi são conside ados um ó gão exc e o . Também há uma ce a pe da de água pela ia espi a ó ia, mas es a es á mui o dependen e das condições climá icas, como já oi e e ido. Todo es e mecanismo é egulado e e ec uado a a és dos espi áculos. . Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 46 1.4.2.2 - Ciclo Alimen a : O conhecimen o do es ado de ela i a a u a ou ca ência alimen a de uma dada população de glossinas in e essa sob mui os aspec os, eó icos e p á icos. Pode o nece -nos indicações ace ca da in luência das modi icações climá icas, da ege ação ou das inundações, ace ca do e ei o de ce as medidas de comba e (que elas incidam sob e os hospedei os, que sob e o habi a da mosca); pode da -nos ambém a ideia da equência com que as glossinas se alimen am (o que em g ande in luência epidemiológica). Pa a acili a o es udo do ciclo alimen a das Glossinas dis inguem-se 4 es ados de nu ição, classi icados de I a IV: I - Fa a II – Cheia III – In e média IV – Famin a Fig. nº 20 - Apa ência do abdómen nos di e en es es ados de ome, na esque da is a la e al, na di ei a is a abdominal (Adap ado de FAO Co p. Doc. Reposi o y). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 47 Segundo Jackson (1933) a ca ac e ização des es es ados é a seguin e: a) uma glossina encon a-se no es ado I ou II quando o seu abdómen não es á en ugado, nem cônca o, do lado en al; não em co de palha e é opaco, pelo menos em dois e ços do comp imen o, quando se examina con a a luz; b) no es ado IV o abdómen de e se ancamen e cônca o ou acha ado e ama elo quando obse ado à luz; c) no es ado III, ou seja o es ado in e médio, quando o abdómen não co esponde às condições an e io es. Pa a es udos de nu ição de uma colónia de em-se e algumas conside ações, pa a que, alo es que possam in laciona os esul ados, não sejam conside ados, como po exemplo as glossinas em es ado de g a idez. Eliminam-se ambém das de e minações as moscas jo ens que não enham ei o a sua p imei a e eição, as chamadas “mosca em jejum” (mosca ene al), o que em um signi icado não só isiológico mas ambém c onológico e que con ém não con undi com “moscas es omeadas” (es ado IV). De ido a es es ac o es de e-se apenas aze os es udos com adul os machos. O “es ado alimen a médio” (means hunge s age, M.H.S.) de e mina-se mul iplicando po 2 o núme o de moscas no es ado II, po 3 o de moscas no es ado III, po 4 o de moscas no es ado IV e a soma des es p odu os é di idida pelo o al das moscas dos espec i os es ados. De e minações des e ipo êm sido ei as sob e udo no G upo mo si ans, (Jackson, 1937). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 48 Do g upo das Glossinas mo si ans, as moscas es omeadas ao pousa em sob e um se humano, colocam-se de cabeça pa a cima, ao passo que as que se encon am cheias icam de cabeça pa a baixo (FAO Co p. Doc. Reposi o y). O ciclo alimen a do G upo das mo si ans é ce ca de 4 dias, alongando-se na es ação ia pa a 8-10 dias, endo a du ação do ciclo alimen a a iações es acionais, que es ão elacionadas possi elmen e com a empe a u a e com a humidade. Tene al Não Tene al Re eição Sanguínea Quando obse ada à luz não se ê á ea escu a no abdómen. Vê-se á ea escu a no abdómen, indicando úl ima RS. Cô B anco - acinzen ado na pa e in e io do abdómen. B anco – c eme pálido na pa e in e io do abdómen. Tó ax Tó ax mole, quando ape ado sua emen e, en e os dedos. Tó ax mais i me, quando ape ado sua emen e, en e os dedos. P ilinium Quando se ape a os lados da cabeça, o p ilinium é acilmen e empu ado pa a o a. Quando se ape a os lados da cabeça, o p ilinium não é acilmen e empu ado pa a o a. Tabela nº 1 - Di e en es ca ac e ís icas pa a o econhecimen o da mosca ene al e não ene al Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 49 1.4.2.3 - Sis ema ci cula ó io: Os p odu os esul an es da diges ão e que são abso idos, chegam aos es an es ó gãos e ecidos a a és do sis ema ci cula ó io, a a és de um simples ubo com unções ca díacas a que se dá o nome de ao a, localizada ao longo do lado do sal do co po. O sis ema ci cula ó io da glossina é cons i uído po um líquido a hemolin a (“sangue”), mui o ico em aminoácidos, assim como de células que azem pa e do sis ema imuni á io do insec o. Não anspo a oxigénio. Do mesmo modo são expelidos, a a és dos ubos de Malpighi, os p odu os inais do me abolismo. 1.4.2.4 - Sis ema neu o-endóc ino: Todas as capacidades sensi i as e compo amen ais, assim como os es ímulos isuais, ol ac i os, é micos e ou os das sé sé, são con olados pelo sis ema ne oso. 1.4.2.5 - Apa elho ep odu o : Glossina macho: O apa elho ep odu o é cons i uído po : - Um pa de es ículos que são longos ubos en olados em espi al, en ol idos po uma memb ana acas anhada e p eenchidos com espe ma ozóides. - Canais de e en es que pa em dos es ículos e ligam-se a duas glândulas anexas, cuja sec eção dilui o líquido seminal e in e êm na o mação dos espe ma ozóides. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 50 - Canal de e en e comum que é um canal que pa e da junção dos canais de e en es e das glândulas anexas, con o na o ec o e pene a no apa elho álico (A onso, 2000). Glossina êmea: As glossinas são la ípa as sendo o seu apa elho ep odu o cons i uído po : - Dois o á ios com g andes dimensões, assimé icos e do ipo poli ó ico, endo cada um deles dois o a íolos, um in e no e ou o ex e no. - Dois o iduc os; - Duas espe ma ecas es é icas, com co cas anha e mui o qui inizadas. O espe ma de um macho é a mazenado nos ecep áculos da êmea. Ela pode se inseminada mais do que uma ez e po di e en es machos. No en an o es udos ealizados demons a am que a maio ia das e ilizações (75%) são o iginá ias da p imei a inseminação (Langley, 1977., A onso, 2000). - Uma glândula u e ina cons i uída po ubos ami icados que pe mi e a alimen ação in a-u e ina da la a; - Ú e o é uma es u u a muscula e mui o ex ensí el e ica si uado na egião pos e o- en al do abdómen. Te mina no ex e io , pela agina, abaixo das placas geni ais. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 51 1.5 - Relação Endossibion e com a Glossina: É ambém in e essan e e e i , e como cu iosidade, que a glossina, pa a além de possui um mecanismo de hemos ase, em uma elação endossimbion e com algumas bac é ias in acelula es. A glossina, em uma die a es i a, cons i uída exclusi amen e de sangue de mamí e os e como consequência, ca ece de ou os componen es me abólicos, mui o necessá ios pa a a sua sob e i ência e longe idade assim como pa a a e ilidade das glossinas êmeas. Há algumas bac é ias endossimbion es com p esumí eis e di e en es unções nas glossinas: A - Wiggleswo hia glossinidia uma bac é ia endossimbion e, in acelula , do es ômago an e io da glossina. A p incipal unção é a de codi ica as ias da biosín ese das i aminas, que suplemen am a die a es i a da glossina. Es a hipó ese é ambém sus en ada, pelo ac o, de que, as glossinas icam es é eis na ausência da Wiggleswo hia glossinidia. (MacFaddin, 1980). Fig. nº 21 - Es ômago de uma glossina com Wiggleswo hia glossinidia (Fo o de S. Aksoy) B – Soldalis glossinidius. É ambém uma bac é ia endosimbion e, encon ada exclusi amen e na glossina, é in e e in acelula em á ios ecidos do hospedei o, incluindo o in es ino médio e hemolin a. O papel simbió ico, des a bac é ia, ainda es á pouco escla ecido. No en an o, p o ou-se se di ícil eliminá-la selec i amen e sem induzi a es e ilidade no hospedei o (Da by, 2005). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 52 1.6 - O Ciclo de Vida: O conhecimen o do ciclo de ida das glossinas esul a, de nume osos es udos e ec uados em colónias man idas em labo a ó io e ambém es udos ealizados no e eno po di e sos in es igado es. Fig. nº 22 - Cliclo de ida da Glossina spp Fig.nº 23 - Pupas e glossinas ene ais (FAO Co p. Doc. Reposi o y). (Fo o da au o a). A g ande maio ia das êmeas é ecundada an es de e ec ua a p imei a e eição sanguínea, ou pouco empo depois mas, só no 3º dia de ida no es ado de imago a ingem a capacidade máxima de acasalamen o e de e ilização. A cópula du a ge almen e pouco mais de uma ho a (Jo dan, 1958). Du an e o coi o, o edeago pene a na agina e a sua po ção e minal adap a-se à abe u a do canal das espe ma ecas, deposi ando o espe ma ó o o (massa gela inosa con endo espe ma ozóides). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 59 1.6.2 - Fase de Adul o: Fig. nº 28 e Fig. 29 - Glossina adul a (IHMT) (Fo os da au o a). Uma ez saída da casca pupal, a glossina ecolhe o p ilinium, es ende as pa as e as asas an es que o egumen o seque e ica en ão no es ado chamado de “jejum”, ou seja é uma glossina ene al, em que abdómen es á azio e se mos a lei oso à anspa ência. O egumen o é mole e o p ilinium sai com acilidade quando se comp ime ligei amen e a cabeça en e os dedos. Na colónia exis en e em labo a ó io es a ase (a mais bem de inida de odas), e po se uma me odologia aplicada, a glossina ene al ica ce ca de 12-24 ho as, sem a p imei a e eição sanguínea. Na na u eza no en an o, não se sabe qual o empo em que a glossina ene al le a a p ocu a a sua p imei a e eição. Des a ase em dian e é mui o di ícil dis ingui a idade das glossina adul as. Pa a es udos das populações po idades, êm-se es abelecido escalas de idade das Tsé ses, sendo a mais usada a de Jackson (1946), que dis ingue 6 idades, ca ac e izadas pelo g au de desgas e do bo do das asas. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 60 1.6.3 - Du ação da ida: A du ação de ida das glossinas é de in e esse ela i o, uma ez que, an o o habi a , clima e ou as di iculdades ine en es ao abalho de campo, só nos pe mi e e uma ideia ap oximada desse ac o e nunca uma quan i icação exac a. Alguns dados ob idos a a és da manu enção de glossinas em ambien e labo a o ial são ine i a elmen e inexac os, quan o à du ação da ida das glossinas, pelo a i icialismo, em pa e a o á el, em pa e des a o á el. No en an o, es udos de Vande plank ( ide Bux on, 1955), Geigy (1948), e Nash & Page (1953), e i ica am que as êmeas êm um empo de ida supe io ao dos machos 1.6.4 - P opo ção sexual: A p opo ção sexual, sex- a io, ou elação en e o núme o de machos e o de êmeas, é sensí el a di e sas acções: climá icas e biológicas. Es e dado é impo an e, pa a es udos epidemiológicos nas populações na u ais, assim como, pa a es udos do modo como uma população de glossinas pode se modi icada. Em es udos ealizados em labo a ó io, e i icou-se que, à nascença, o sex- a io, em ap oximadamen e uma p opo ção de 1/1 (Ba os Machado, 1958). Na colónia do IHMT em Lisboa e i icou-se que o núme o de glossinas que eclodem êm ambém uma p opo ção idên ica, embo a po ezes se enha e i icado um maio núme o de glossinas êmeas eclodidas num dia. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 61 No en an o, o núme o de glossinas êmeas na colónia é mui o supe io ao dos machos, sendo es e dado ambém e i icado na na u eza (Machado, A. Ba os 1958). A explicação des e ac o , segundo á ios es udos e e idos, é de que as glossinas êmeas du am ancamen e mais empo do que os machos. Na na u eza, a es ação do ano e o ipo de ege ação, po exemplo, são ac o es de a iações do sex- a io. Sabe-se ambém que os machos são mais a ec ados pelas empe a u as ele adas do que as êmeas. 1.6.5 - Causas de mo e: As azões de maio suscep ibilidade de causa a mo e mais ou menos ápida das glossinas na na u eza são: - as condições climá icas des a o á eis em de e minados pe íodos do ano; - a al a de alimen o su icien e; - as queimadas; - as inundações (que a ec am a pupa); - os p edado es e - os pa asi as. Os p edado es são mui o a iados e ão desde o homem às o migas, passando pelas a es, ba áquios, a anhas e c. Os pa asi as, são nume osos, a ec ando uns, as glossinas no es ado adul o, ou os, a pupa e a la a. Os mais equen es são: Nemá odes, Himenóp e os, Díp e os, Fungos, Hemog ega inas, Bac é ias, e c. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 62 1.7 - INTERESSE EM MEDICINA. 1.7.1- Doença do sono ou T ipanossomíase A icana: O in e esse em medicina de es udos sob e a Glossina spp, e em especial a Glossina mo si ans mo si ans é po se em o ec o de uma das doenças opicais endémicas mais complexas, p o ocadas po um pa asi a unicelula que ansmi e ao Homem uma doença g a e a “doença do sono” ou T ipanossomíase Humana A icana (THA), ou “Nagana”, em animais. Es a doença a ec a uma quan idade es imada de 60 milhões de pessoas em 35 países a icanos (OMS, 2005). A THA é uma doença equen emen e a al, causada pelo pa asi a unicelula T ypanosoma b ucei. Há dois ipos de pa asi a que a ec am o se humano: o T ypanosoma b ucei gambiense, comum na Á ica Ociden al e T ypanosoma b ucei hodesiense, na Á ica O ien al. Fig. nº 30 – Mapa da ep esen ação geog á ica da p esença do T ipanosoma b ucei (www.medicalecology.o g). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 63 1.7.2 - Sis emá ica do T ypanosoma b ucei: Sis emá ica Reino: P o is a Filo: Euglenozoa Classe: Kine oplas ea O dem: T ypanosoma ida Géne o: T ypanosoma Espécie: T. b ucei Subespécie: T. b ucei b ucei T. b uce hodesiense Fig. nº 31 - T ipanosoma b ucei T. b ucei gambiense (www.dpd cdc.go ) 1.7.3- Ca ac e ís icas do T ypanosoma b ucei: O T ipanosoma b ucei ap esen a as seguin es o mas: • Epimas igo a – o co po basal encon a-se na posição an e io ao núcleo com um lagelo la go ligado ao longo do co po celula . • T ipamas igo a – o co po basal é pos e io ao núcleo, com um lagelo la go ligado ao longo do co po celula . Fig. nº 32 - Rep esen ação de o mas do T ipanossoma (FAO Co p. Doc. Reposi o y). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 64 O T. b ucei encon a-se, no hospedei o no malmen e, na o ma T ipomas igo a e di e encia-se em Epimas igo a p oli e a i a nas glândulas sali a es da glossina. O ipomas igo a, a o ma ac i a no sangue do hospedei o, em núcleo cen al, uma única e g ande mi ocônd ia alongada que con em o cine oplas o, zona com ADN mi ocond ial. Tem um lagelo que lhe dá mobilidade e a sua memb ana celula ondulan e é ecobe a po glicop o eínas mui o imunogénicas, pe mi indo assim e i a a espos a imune do hospedei o. As o mas epimas igo a e p omas igo a, são as o mas encon adas na mosca Tsé sé quando in ec ada, são meno es e mais la gas; con êm glicossoma, g ânulos icos em glicogénio. 1.7.4 - Va iação An igénica das Glicop o eínas “Va ian Su ace Glycop o ein” (VSG): A supe ície da célula do ipanossoma em como componen e, um e es imen o uni o me de glicop o eínas a ian es, o que lhe con e e uma Va iação An igénica “Va ian Su ace Glycop o ein” (VSG). Es e e es imen o em duas unções: 1- Como ba ei a ísica que bloqueia o econhecimen o da célula pelo Sis ema Imuni á io especí ico do hospedei o, ocul ando as p o eínas in a iá eis da supe ície, como po exemplo: canais iónicos, ecep o es, e c., ao econhecimen o do sis ema imunológico 2- Como uma supe ície a iá el pa a a célula, o que lhe pe mi e a a iação e adap ação especí ica pa a e i a o sis ema imunológico. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 65 Ac edi a-se que es e e es imen o, al amen e a iá el, é codi icado po á ias cen enas de cópias al e na i as de um gene do genoma. É pois um mecanismo al amen e e icien e pa a iludi o sis ema imunológico, uma ez que o pa asi a subs i ui o seu e es imen o com uma ou a a iação de glicop o eínas. Fig. nº 33 – Esquema g á ico do e ei o da VSG numa in ecção po ipanossoma Após a in ecção, o ipanossoma exp essa uma de e minada VSG. Nessa al u a o sis ema imuni á io do hospedei o ge a uma espos a conc e a a essa supe ície de p o eínas. Nes a ase da in ecção ha e á uma diminuição da população de ipanossomas. É nes a al u a que uma célula que exp esse uma VSG al e na i a se á o emen e seleccionada, essu gindo a in ecção. O e ei o ge al des e ciclo de p oli e ação e ecidi a da população, de ido ao ciclo da elação p edado /p esa com o sis ema imuni á io do hospedei o, dá luga a uma sucessão de episódios de in ecção, cada uma de ido a uma população com di e en es exp essões da supe ície VSG. Tempo em semanas Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 66 1.7.5 - Ciclo de Vida do T ipanossoma spp: Os ipanossomas são pa asi as que ap esen am um ciclo de ida monoxênico. O pa asi a exis e na sali a das moscas Tsé sé e é injec ado du an e a sua e eição sanguínea. A o ma ipomas igo a, mul iplica-se e in ade odos os luídos co po ais, incluindo sangue e luído ex acelula nos ecidos. Uma glossina é in ec ada quando se alimen a de um indi íduo doen e (in ec ado). Ao longo de um de e minado empo, ce ca de um mês, o pa asi a assume á ias o mas (p incipalmen e epimas igo a), enquan o se mul iplica no co po da mosca, in adindo inalmen e as suas glândulas sali a es. Fig. nº 34 – Ciclo de ida do T ipanossoma spp Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 67 E apas no hospedei o: Du an e a e eição sanguínea no hospedei o mamí e o, uma glossina in ec ada injec a o pa asi a em o ma de ipomas igo a me acíclicos no luxo sanguíneo. O pa asi a en a no sis ema lin á ico e passa pa a a ci culação sanguínea Den o do hospedei o, ans o mam-se em ipomas igo as sanguíneos Es es, a ingem odos os ou os luidos do sangue (lin a, liquido ce alo aquidiano (LCR), mul iplicando-se po usão biná ia E apas nas glossinas: O ciclo de ida comple o do ipanossoma a icano é ep esen ado pelas ases ex acelula es. A mosca sé sé, an e io men e in ec ada de ido à p esença no sangue do hospedei o, (quando se alimen a), de ipomas igo as, passam pa a o sis ema diges i o da mosca, ans o mando-se em ipomas igo as p ocíclicos e mul iplicando-se po usão biná ia Deixam o es ômago da mosca e ans o mam-se em epimas igo as Os epimas igo as mul iplicam-se nas glândulas sali a es e po con ínuas mul iplicações, ans o mam-se em ipomas igo as. O ciclo do pa asi a na mosca em ap oximadamen e a du ação de ês semanas. Os humanos são o p incipal ese a ó io do T ypanosoma b ucei gambiense, mas es a espécie pode ambém se encon ada em animais. Animais sel agens são o p incipal ese a ó io do T ypanosoma b ucei. hodesiense, que pode ambém se ansmi ido ao homem em de e minadas ci cuns âncias. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 68 1.7.6 - O Con ac o Glossina – Homem: Fig..nº35 - Na Á ica O ien al, as glossinas do G upo mo si ans são o ec o do pa asi a T b. hodesian pa a o homem e animais. (adap ado de FAO Co p. Doc. Reposi o y) Em zonas húmidas e sub-húmidas do Es e A icano, os pa asi as ipanossomas, que p o ocam a doença an o nos humanos, como nos animais es ão es i amen e associados às glossinas. Es as, são ec o es des es pa asi as, mas no en an o é necessá io e em compe ência ec o ial, is o é, êm que e a capacidade de se in ec a em, pe mi i a ma u ação dos ipanossomas e de os ansmi i a ou os mamí e os. A Glossina mo si ans mo si ans, ec o do pa asi a da THA em como habi a p incipal a sa ana a icana e lo es as de “miombo”, zonas onde a população é escassa ou mesmo inexis en e. Po es as azões a doença é a amen e ansmi ida ao homem, mas no en an o po ezes es e é con aminado quando associado a de e minadas p o issões (caçado , ag icul o ). Há um con ac o com o homem quando es e en a nas zonas onde a glossina habi a. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 75 Na ase aguda, o a amen o com Pen amidina é e icaz con a T.b.gambiense e a Su amina con a T.b. hodesiense. No en an o, a esis ência é c escen e a es es á macos. Na ase ce eb al, já pode á ha e danos i e e sí eis. É necessá io usa um medicamen o, o Mela sop ol, mui o óxico pa a os doen es que pode p o oca a mo e a ce ca de 1-10%.dos doen es. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 76 1.9 - Incidência da T ipanossomíase na P odução Animal em Á ica: A doença do sono, ou T ipanossomíase A icana nos Animais (TAA), é ansmi ida pela Glossina spp di icul ando assim o desen ol imen o ag ícola de uma g ande pa e da Á ica. A Glossina mo si ans mo si ans, é o ec o esponsá el pela ipanossomíase animal ao ansmi i o T ipanossoma b ucei b ucei, quando es a e ec ua a sua e eição sanguínea. Com o c escimen o demog á ico as populações u ais, i e am necessidade de p ocu a em e aumen a em as zonas pa a a ag icul u a e pa a o desen ol imen o pecuá io, ocupando assim á eas onde e a densa a p esença da mosca Tsé sé. Fig nº 37 - A T ipanossomíase A icana Animal (FAO/IAEA P og ame). As ipanossomíases dos animais domés icos aumen a am de al o ma que, não só impossibili am a c iação des e, em á ias á eas, como causam g a es pe das na p odução, de ido ao aco c escimen o, diminuição de peso e de lei e, in e ilidade e abo o. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 77 A á ea ocupada pelas glossinas é de ap oximadamen e de 10 milhões de Km2 na Á ica Subsa iana, o nando-se um dos maio es impedimen os pa a o desen ol imen o ag ícola des e con inen e. O p oblema de i ado das doenças ansmi idas pela Tsé sé aos animais domés icos – nagana – sob ele a em impo ância o da ipanossomíase humana. Es a enzoo ia exis e em odas as á eas in es adas de sé sé, seja qual o a espécie em causa. Além disso odas as espécies de Glossinas são po en es ec o es das ipanossomíases animais, se bem que a G. mo si ans seja a mais pe igosa, logo seguida pela G. pallidipes (And ade e Sil a, 1956) 1.10 - Rec udescência das T ipanossomíases a icanas: A ipanossomíase humana e a ipanossomíase animal ica am sob con olo no início da década de 60 do século passado, quando a sua p e alência oi d as icamen e eduzida pa a ní eis mui o baixos (OMS, 2005), com a de ecção ac i a de no os casos e a amen o, e ambém com aplicação de medidas na lu a an i- ec o ial, u ilizando equipas mó eis. In elizmen e, não oi possí el sus en a os esul ados de sucesso do passado de ido a ac o es que se al e a am. Exemplos são a igilância egula e sis emá ica, que é ped a angula do con olo da ipanossomíase, abandonada de ido à al a cada ez maio de pessoal quali icado, a deslocação de populações na sequência de pe u bações polí icas e c ises económicas e as mudanças de p io idades nas polí icas nacionais, esul a am na a ec ação de menos ecu sos ao sec o da saúde pública. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 78 Todos es es ac o es e ainda uma pe cen agem subs ancial dos habi an es nos ocos da endemia que deixa am de pa icipa nas ac i idades de despis agem e a al a de medicamen os, con ibuí am pa a a eeme gência da doença, a é ní eis epidémicos. 1.11- Es a égia de Con olo e P e enção: Segundo a OMS (2005), o p og ama de es a égia pa a o con olo e eliminação da glossina em como objec i o e adica a doença como p oblema de Saúde Pública em Á ica a é ao ano de 2015. A me a a a ingi é a edução da mo bidez e mo alidade a ibuídas à doença do sono, sendo o seu p incipal objec i o apoia os go e nos na elabo ação e execução de planos e p og amas pa a con olo da doença, p opondo uma abo dagem in eg ada que consis e na igilância epidemiológica con ínua das populações em isco, na de ecção passi a e ac i a de casos e no seu a amen o, na edução dos ese a ó ios animais po meio de a amen o selec i o ou em massa do gado, e na lu a an i- ec o ial in ensi a da mosca sé sé nas zonas com ní eis ele ados de endemia ou de epidemia. A escolha do mé odo de con olo depende mui o da espécie de glossina, bem como do comp omisso e inanciamen o do go e no en ol ido e/ou da comunidade a ec ada. Con udo, pa a um e icaz con olo da doença, além do con olo das glossinas, há ambém que e em con a o con olo nos hospedei os, eduzindo a ca ga pa asi á ia. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 79 Uma das ques ões p incipais, é o econhecimen o e de inição do exac o p oblema numa de e minada egião, o ganizando es udos de campo, com objec i os bem de inidos elacionados com o local (ex ensão, a se e idade, a p e alência e a incidência da doença). Uma a aliação sócio-económica de e se ambém ealizada, local a local pa a uma omada de decisões, an o a ní el de me odologias a usa como a ní el económico. A es a égia de p og amas in o ma i os e educacionais às populações sob e saúde e me odologias possí eis de u ilização nas aldeias u ais, o seu en ol imen o pa icipa i o ao longo de odo o p ocesso, são ques ões impo an es a e em con a. Finalmen e, a e icácia des as in e enções só pode ão e êxi o com a a aliação con ínua no e eno. A igilância médica egula das populações expos as cons i ui a base do mé odo de lu a, uma ez que se iden i icam os doen es num es ado p ecoce, aumen ando as p obabilidades de cu a, eduz os ese a ó ios e unciona como um dos indicado es epidemiológicos, pe mi indo p e eni si uações epidémicas. No con olo de populações de glossinas, de em se u ilizadas á ias me odologias, ais como: a madilhas, elas imp egnadas com insec icidas, iscas i as com animais de g ande po e, aspe são sequencial aé eo, ca os pa ulha, libe ação de machos es é eis e ou as. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 80 Mé odos adicionais incluem a eliminação de a bus os pa a des ui o habi a da sé sé e a pul e ização com insec icidas pelo a ou sob e o solo, mé odos que êm sido al o de c í icas de ido aos e ei os p ejudiciais i e e sí eis no ambien e. Mé odos menos p ejudiciais ao ambien e incluem o uso de a madilhas, como po exemplo as chamadas iscas i as, onde o insec icida é imp egnado sob e animais, cujo objec i o é o de a elimina , quando es a en a em con ac o com os animais pa a se alimen a . Um ou o mé odo, pa a cap ação de glossinas, o chamado “man ly- ound” (She eni, 1984), que aduzi emos po ondas de cap u a. Uma onda de cap u a, consis e na u ilização de uma ela imp egnada com insec icida, que se ai deslocando po caminhos conhecidos da p esença da glossina. Fig. nº 38 - A madilha i a u ilizando animais. Fig. nº39 - Ronda de cap u a. (Tse se.FAQ). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 81 O eículo pa ulha é ambém uma ou a écnica que oi an e io men e u ilizada como o ma semi-quan i a i a O mé odo consis e na u ilização de um eículo que pe co e á eas de glossina, u ilizando uma a madilha de ede elec i icada (Vale, 1974). Fig. nº 40 - Veículo pa ulha (Tse se FAQ). Quan o ao de ube, ac ualmen e, as acções sob e a ege ação, de em se selec i as em locais mui o especí icos, ais como à ol a de ce as plan ações e aldeias. As de ubas o ais, de g andes dimensões, assim como a eliminação da auna local, p esen emen e, po azões ecológicas, não são acei á eis. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 82 1.11.1-Telas e A madilhas: Cons i uem sis emas de cap u a a i icial de glossinas, isando a a acção e a e enção das mesmas A Fig. nª 41 - Di e en es ipos de a madilhas pa a a cap u a de glossinas (Tse se FAQ). Fundamen am-se essencialmen e em ês opismos conhecidos: Es e eo opismo – a acção pelo ul o Escio opismo – a acção pela somb a Fo o opismo – a acção pela luz (T a assos San os Dias, 1992). As a madilhas êm di e en es unções: podem cap u a glossinas, pe mi indo amos as pa a di e sos es udos, ou cap u a e ma a , quando imp egnadas com insec icidas. Biconical Tela Épsilon Nzi A madilha de Challie Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 83 1.11.2 – P e enção da doença e es a égias no con olo das glossinas: Pa a a p e enção da ipanossomose humana e ou animal, e como já oi e e ido, são ambém, necessá ias omadas de a i ude pelas populações en ol idas; elabo ando, o mação adequada, campanhas de sensibilização e mobilização das comunidades en ol idas e expos as, pa a que, possam colabo a e comp eende a doença. Fig. nº 42 - Fo mação (Tse se FAQ) A u ilização de a madilhas casei as p opos a pelo Tea und In e na ional Lea ning Zone, u ilizando ga a as plás icas na cons ução de a madilhas pa a glossinas e colocando-as em cí culo à ol a da aldeia, é uma medida que pode se u ilizada pelas comunidades u ais. Fig. nº 43 - Di e en es ipos de a madilhas a esanais. (Tea und In . Lea ning Zone) Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 84 As glossinas, ao con á io de quase odos os ou os insec os que picam humanos, são mais ac i as de dia, logo do mi sob edes, apesa de aconselhado, não é p o ecção e icaz. É necessá io usa oupas que cub am a maio pa e da pele e “sp ays” epelen es de insec os. O uso de apa elhos colo idos eléc icos, que a aem e ma am as moscas é ambém um ipo de a madilha ú il, embo a não seja possí el o seu uso em g ande pa e das zonas u ais de Á ica. A doença do sono pode ambém se p e enida a a és de um con olo e icaz da mosca sé sé. A êmea des a mosca p oduz apenas ce ca de 10 la as du an e o seu cu o pe íodo de ida. Em eo ia, p e eni a disseminação da doença do sono a a és do con olo de moscas sé sé de e ia se uma al e na i a e icaz, uma ez que a des uição das populações das glossinas é undamen al pa a a e adicação da doença. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 91 Fig.nº 48 - La as e pupas. Fig.nº 49 - Acondicionamen o de pupas. (Fo os da au o a - IHMT). Fig. nº50 - F ascos com pupas pa a a o mação da “Colónia Expe imen al”. (Fo o da au o a – IHMT). 2.3.5 - Técnica da ecolha dos adul os eclodidos: Após a eclosão, as glossinas adul as ão sendo e i adas pa a as gaiolas espec i as. Re i a as glossinas dos ascos onde eclodi am é uma écnica simples mas que eque habilidade do écnico, assim como conhecimen os cien í icos pa a, numa p imei a ase, sepa a po sexo as glossinas e colocá-las nas espec i as gaiolas. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 92 Es as glossinas são alimen adas, como já e e ido, e após ês a qua o dias os adul os macho são ans e idos, se possí el em igual núme o, pa a gaiolas de co b anca onde se encon am as glossinas êmea pa a acasalamen o. Fig. nº 51 - Eclosão de glossinas.. Fig. nº 52 - T ans e ência pa a uma gaiola de uma glossina ene al, u ilizando um ubo de ensaio. (Fo os da au o a - IHMT). 2.3.6 - Reg as de higiene e segu ança pa a a manu enção da colónia: Man e uma colónia saudá el eque p ocedimen os me iculosos pa a a longe idade e ep odução das glossinas. Tan o a higiene da sala, das gaiolas, inas, ascos, ubos de ensaio ou de qualque ou o ma e ial que seja manuseado, de e se cuidadosa pa a e i a o desen ol imen o, po exemplo, de ungos. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 93 Ou os cuidados que ambém são mui o impo an es pa a a manu enção da colónia são as condições ambien ais. Um ou o ac o a e em con a é não manipula p odu os óxicos den o da sala, como po exemplo, o uso de p odu os de limpeza com amónia e lixí ia. Ainda ou o ac o pa a uma e icaz manu enção da colónia, são os cuidados de higiene e de saúde com os cobaios u ilizados pa a a alimen ação sanguínea que de em es a em boas condições nu icionais e não de e ão nunca es a sujei os a an ibió icos ou ou os á macos. Es es cobaios são c iados e man idos no bio é io do IHMT. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 94 2.4 - Amos a: 2.4.1 - Colónia de Glossina mo si ans mo si ans u ilizada como amos a no es udo: A amos a u ilizada, pa a o es udo des e abalho, oi e i ada da “Colónia Expe imen al” de Glossina mo si ans mo si ans, c iada a pa i da colónia já exis en e no IHMT cujas ca ac e ís icas o am desc i as an e io men e. Inicia e con ibui , com uma p imei a abo dagem, pa a o es udo da ca ac e ização molecula das Glossinas mo si ans mo si ans Wes wood, 1850, da colónia que se encon a no IHMT, é um dos objec i os da nossa disse ação. Assim e nesse âmbi o, a amos a u ilizada pa a a análise molecula é de exempla es de di e en es ge ações. O abalho ealizado na colónia pa a es a disse ação, iniciou-se em meados do mês de Maio a Agos o de 2008. Du an e odo esse pe íodo, e pa a além de odos os p ocedimen os de con olo já mencionados, as di e en es ge ações o am sepa adas e os exempla es de cada ge ação o am de idamen e con ados. Es e p ocedimen o deu a opo unidade de ealiza um es udo sob e o sex a io nas ês ge ações da “Colónia Expe imen al”. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 95 134 pupas (1ª ge ação) glossinas eclodidas acasalamen o pupas (2ªge ação) acasalamen o pupas (3ªge ação) glossinas eclodidas glossinas eclodidas Pa a a o mação da “Colónia Expe imen al”, o am colec adas da colónia o iginal, um o al de (134) pupas, que o am colocadas em ascos p óp ios de idamen e o ulados e da ados. Es as p imei as 134 pupas o am conside adas a p imei a ge ação. Fig.nº 53 – A o mação da “Colónia Expe imen al”. Gaiolas com glossinas e ascos com pupas de 1ª ge ação em baixo e 2ª ge ação (pupas) em cima (Fo o da Au o a - IHMT). 2.4.2 – Me odologia u ilizada na o mação das ês ge ações da “Colónia Expe imen al”: Me odologia u ilizada, na o mação das di e en es ge ações de glossinas da “Colónia Expe imen al”, pa a pos e io es es udos e segundo o esquema: Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 96 2.4.3 – Me odologia u ilizada pa a o es udo do sex a io da “Colónia Expe imen al” de glossinas: Pa a a ealização e a aliação da p opo ção sexual, sex a io, ou elação en e o núme o de machos e o de êmeas, elabo a am-se g á icos e abelas. Pa a es e es udo o am con ados odos os exempla es eclodidos, êmeas e machos, e de pupas não eclodidas po ge ação. Foi ei o o cálculo do Qui-quad ado aplicado às ês ge ações em es udo, assim como aos in e alos de con iança com a aplicação do p og ama P ime 92. 2.4.4 – Me odologia u ilizada pa a ecolha de amos as de glossinas a u iliza no es udo da análise molecula : Pa a es e es udo o am colec adas de cada ge ação de glossinas êmea e macho eclodidas sem ealiza em a p imei a e eição sanguínea (glossinas ene ais), pa a pos e io análise molecula . Os exempla es ecolhidos e am conse ados em ecipien es de id o, con endo e anol, de idamen e o ulados e da ados. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 97 2.5 - Análise molecula dos exempla es de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850: 2.5.1. – Amos as u ilizadas: A amos a é cons i uída, como e e ido, po glossinas ene ais, êmea e macho das di e en es ge ações que pos e io men e se ão dissecadas. O p ocesso de amos agem oi alea ó io simples. Fo am u ilizadas Glossinas mo si ans mo si ans, ob idas a pa i da 1ª, 2ª e 3ªs, ge ações, da “Colónia Expe imen al”, man idas no insec á io da UEM/IHMT. Após a dissecção da glossina, es a oi sepa ada em di e en es pa es: - cabeça, ó ax e abdómen, se ão u ilizados pa a a ex acção do Ácido Desoxi ibonucleico (ADN) genómico. - as pa as e asas o am desp ezadas. 2.5.2. – Ex acção do ADN genómico: 2.5.2.1 – P incipio do mé odo: A ex acção do ADN genómico oi ealizada, com base no mé odo de CTAB (K a su & Wohl o d, 1999, S o ha d, 1996) com algumas modi icações. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 98 2.5.2.2 – Me odologia: Os exempla es (cabeça, ó ax e abdómen) de G. mo si ans mo si ans, o am colocados indi idualmen e em ubos “Eppendo ” de 1,5 ml e oi-lhes adicionado 600 µl de ampão de ex acção (CTAB – Ce yl h ime hylaminomium B omide) ao qual se adiciona am 10 µl de P o einase K. P ocedeu-se à homogeneização das amos as a a és de mace ação u ilizando pa a isso ma e ial p óp io chamado de “esmagado ” Depois de mui o bem homogeneizadas, as amos as o am deixadas na es u a à empe a u a de 60º C du an e 60 minu os, sendo agi adas á ias ezes pa a uma boa homogeneização. Fig. nº 54 – Homogeneização das amos as Em seguida e após um pe íodo de incubação, adicionou-se 750 ml de Chlo o o m/Isoamyalcoohol (24:1), mis u ando-se sua emen e du an e dois minu os. Cen i ugou-se apidamen e, pa a que haja a sepa ação da zona aquosa da zona o gânica, sepa ando o sob enadan e (zona aquosa) pa a no os ubos de “Eppendo ”, Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 99 adicionando 1ml de e anol absolu o io a cada uma das amos as, mis u ando-se sua emen e. As amos as são no amen e cen i ugadas du an e 15 minu os a 14 000 pm. O sob enadan e ob ido oi desp ezado po decan ação, adicionou-se a cada amos a 0,5 ml de e anol a 70% pa a a la agem das “pelle s”, sendo as amos as cen i ugadas mais uma ez nas mesmas condições já e e idas. Rejei a-se no amen e odo o sob enadan e e deixa-se e apo a odo o excesso de e anol. Após a e apo ação o al do e anol, adicionou-se 50 µl de ampão T is-EDTA (TE). As amos as são gua dadas a -20ºC a é pos e io es u ilizações. 2.5.3. – Ampli icação do ADN genómico: A ampli icação do ADN genómico das glossinas oi ealizada po eacção de PCR (Polyme ase Chain Reac ion), aplicada ao gene mi ocond ial COI (Cy och ome Oxidase sub-uni 1). Os agmen os do gene COI o am ampli icados u ilizando os oligonucleó idos uni e sais desc i os po Folme e al (1999) com as seguin es sequências (Tabela nº 3): Gene al o Oligonucleo idos Sequência nucleo ídica COI 1 5’gg caacaaa ca aaaga a gg 3’ COI 2 5’ aaac caggg gaccaaaaaa ca 3’ COI Tabela nº 3 - Sequência nucleo ídica e o gene al o u ilizados no p esen e abalho. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 100 As eacções de ampli icação do gene COI o am e ec uadas em olumes de 25µl u ilizando o ki “PuReTaq™ eady-To-Go™ PCR beads” come cializado pela “GE Heal hca e”. Em cada eacção de PCR oi ambém incluída uma amos a nega i a (sem ADN) que se iu de con olo nega i o. As eacções de ampli icação o am e ec uadas num e mociclado “AVISO®, GmbH Mecha onic Sys ems). As ampli icações o am ealizadas da seguin e manei a: 1 - um passo de desna u ação a 95ºC du an e 5 minu os, 2 - seguindo-se 37 ciclos de ampli icação a 95ºC du an e 15 segundos, e a 58º C du an e 30 segundos, 3 - 72ºC du an e 90 segundos e, 4 - uma ex ensão inal de 72ºC du an e 5 minu os. 2.5.4. – Elec o o ese em gel de aga ose: Após a ampli icação, os agmen os de ADN o am subme idos a elec o o ese em gel de aga ose a 1% em ampão TAE (T is-Ace a o 40 mM EDTA 1mM: pH:8,3), onde oi inco po ado b ome o de e ídio, numa concen ação de 0,5 µg/ml. Jun amen e com os p odu os de PCR, oi ambém adicionado um ma cado de massa molecula “Hype Ladde II” (Bioline). As amos as o am p epa adas com 6 µl de p odu o de PCR ao qual se adicionou 1µl de ampão (Azul de B omo enol com glice ol). A mig ação oi ealizada a 120 V du an e, ap oximadamen e 30 minu os. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 107 Como pode se e i icado no quad o nº2, há ambém um maio núme o de glossinas êmea eclodidas, sendo a elação sex a io à nascença des a ge ação de 1:1,1. 3.2.3- Te cei a ge ação: Du an e e ao longo dos meses de Julho de 2008 a meados de Agos o de 2008 deu-se inicio à 3ª ge ação Pa a o es udo des a ge ação a amos agem é de N=132, con o me Anexo 3, dando o igem ao seguin e g á ico: 3ª Ge ação 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 F ascos Nº glossinas eclodidas e pupas não eclodidas não eclod Machos Fêmeas G á ico nº 3 - Rep esen ação g á ica de glossinas macho e êmea eclodidas e de pupas não eclodidas na 3ª ge ação. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 108 Ve i icou-se no amen e que as glossinas êmea que eclodi am na 3ª ge ação são em núme o supe io às das glossinas macho eclodidas, como se e i ica no seguin e quad o: Núme o de glossinas macho eclodidas = 57; (43,2) Núme o de glossinas êmea eclodidas = 66; (50%) Núme o de pupas não eclodidas = 9; (6,8%) Quad o nº3 - To ais e pe cen agens de glossinas e pupas na 3º ge ação A e cei a ge ação de glossinas macho e êmea man ém o mesmo pad ão das ge ações an e io es, sendo a elação do sex a io des a ge ação de 1:1,2. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 109 55 37 57 0 10 20 30 40 50 60 To al de glossinas eclodidas 1ª ge ação 2ª ge ação 3ª ge ação Ge ações Glossinas machos eclodidas/ge ações glossinas machos 3.3 – Es udo das glossinas macho e êmea eclodidas e de pupas não eclodidas po ge ação: Com es e es udo, p e endemos mos a , ela i amen e às ês ge ações, qual a que ap esen a um maio núme o e pe cen agem de glossinas eclodidas macho, êmea e de pupas não eclodidas po ge ação. 3.3.1 – Relação de glossinas macho eclodidas po ge ação: Legenda: G á ico nº4 - Rep esen ação g á ica das glossinas macho eclodidos nas ês ge ações. O g á ico nº 4, mos a-nos, em cada ge ação es udada, os alo es ob idos, an o em núme o de glossinas eclodidas como as espec i as pe cen agens, em elação às amos as. Assim na 1ª ge ação eclodi am 55 machos (41%), numa amos a de N=134. Ge ações G.macho eclodidas 1ª 55; (41%) 2ª 37; (43,5%) 3ª 57; (43,2%) Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 110 69 40 66 0 10 20 30 40 50 60 70 To al de glossinas eclodidas 1ª ge ação 2ª ge ação 3ª ge ação Glossinas êmeas eclodidas/ge ação glossinas êmeas Na 2ª ge ação apenas eclodi am 37 machos (43,5%), em N=85, sendo a e cei a ge ação aquela onde se ob i e am o maio núme o de machos eclodidos 57 (43,2%). Con udo, nes e es udo ambém se e i icou que em e mos pe cen uais oi na 2ª ge ação que se ob e e maio amos a de machos eclodidos. 3.3.2 – Relação de glossinas êmea eclodidas po ge ação: Legenda G á ico nº5 - Rep esen ação g á ica das glossinas êmea eclodidas nas ês ge ações. O G á ico nº 5 ep esen a o o al de glossinas êmea eclodidas po ge ação. Com a ap esen ação des a elação de glossinas êmea eclodidas po ge ação, podemos e i ica que a pe cen agem en e a 1ª ge ação e a 3ª ge ação é mui o idên ica, sendo a 2ª ge ação a que ob e e meno pe cen agem de glossinas êmea eclodidas. Ge ações G. êmea eclodidas 1ª 69; (51,5%) 2ª 40; (47%) 3ª 66; (50%) Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 111 10 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Núme o de pupas não eclodidas 1ª ge ação 2ª ge ação 3ª ge ação Ge ações Pupas não eclodidas/ge ação pupas 3.3.3 - Relação de pupas não eclodidas po ge ações: Legenda G á ico nº6 - Rep esen ação g á ica de pupas não eclodidas nas ês ge ações. O g á ico nº 6, ep esen a as pupas não eclodidas nas ês ge ações. É na 2ª ge ação onde a pe cen agem de pupas não eclodidas oi maio (9.4%). Ge ações Pupas não eclodidas 1ª 10; 7,4% 2ª 8; 9,4% 3ª 9; 6,8% Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 112 3.3.4 – Relação das glossinas macho e êmea eclodidas e pupas não eclodidas nas ês ge ações es udadas: 1ª ge ação 69;(51,5%) 2ª ge ação 40;(47%) 3ª ge ação 66;(50%) 1ª ge ação 55;(41%) 2ª ge ação 37;/43,5%) 3ª ge ação 57;(43,2%) 1ª ge ação 10;(7,4%) 2ª ge ação 8;(9,4%) 3ª ge ação 9;(6,8%) 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% êmeas machos pupas G á ico nº 7 – Rep esen ação das ês ge ações de glossinas êmea e macho eclodidas e de pupas não eclodidas. Nes e g á ico es ão ep esen adas as ês ge ações es udadas, as glossinas êmea eclodidas, as glossinas macho eclodidas e as pupas não eclodidas, com os núme os o ais e pe cen agens de cada ge ação. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 113 3.3.5 – Cálculos da p opo ção das glossinas macho e êmea eclodidas nas ês ge ações: Do núme o o al de glossinas macho e de glossinas êmea eclodidas, das ge ações em es udo, ize am-se alguns cálculos, assim: - A pe cen agem de cada g upo de glossinas êmea eclodidas é de 54%; - A pe cen agem pa a o g upo de glossinas macho eclodidas é de 46%, como se pode e i ica na abela seguin e. Ge ações Machos Fêmeas 1ª 55 69 2ª 37 40 3ª 57 66 To al 149 175 324 Pe cen agem 46% 54% Tabela nº 4 – To al e pe cen agem das glossinas nas ês ge ações. A p opo ção de êmeas (54%), com um in e alo de con iança de 95%, é de 48,5% a 59,5%, com um e o pad ão da es ima i a de 2,8%. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 114 3.4 – Es udos da análise molecula das Glossinas mo si ans mo si ans Wes wood, 1850: 3.5. – Selecção das amos as: Pa a o p esen e es udo o am u ilizados 50 exempla es de Glossina mo si ans mo si ans ene ais (do insec á io da Unidade de En omologia Médica do IHMT), ob idas du an e ês ge ações. 3.6. – Análise molecula das amos as: 3.6.1. – Ampli icação do gene COI do ADN mi ocond ial (m DNA): Em odas as amos as es udadas, obse ou-se um agmen o com um peso molecula de ap oximadamen e de 680 pb. (Figu a 55). Fig. nº 55 - Visualização do gel de aga ose a 1% dos p odu os da PCR pa a o gene COI de …..algumas das amos as da população de G. mo si ans mo si ans. CN- con olo nega i o; ……………1-12 amos as da população de G. m mo si ans. ~ 680 pb CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 115 3.6.2. – Sequenciação das amos as ampli icadas As sequências nucleo ídicas ob idas, ainda que pa ciais pa a as di e en es amos as, o am alinhadas e ag upadas, com a in odução de ajus es in oduzidos manualmen e (Figu a 56). Fig. nº 56 - Alinhamen o das sequências nucleó idicas pa ciais analisadas pa a o gene COI do ADN mi ocond ial. G.m. mo si ans1 AAC CTC TTT AAG AAT TTT AGT ACG AGC TGA ATT AGG GCA TC CAG GAG C G.m.mo si ans 2 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 3 C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 4 T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 5 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 6 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 7 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 8 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 9 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 10 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 11 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... . G.m.mo si ans 1 AT TAA TTG GAG ATG ATC AAA TTT ATA ATG TAA TTG TTA CAG CTC ATG C G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 AT TCG TTA TAA TTT TTT TTA TAG TAA TAC CTA TTA TAA TTG GAG GTT T G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 TG GAA ATT GAT TAG TTC CTT TAA TGC TAG GAG CTC CTG ATA TAG CAT T G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 116 Fig. nº56 – Con . - Alinhamen o das sequências nucleó idicas pa ciais analisadas pa a o gene COI do ADN mi ocond ial. G.m.mo si ans 1 TC CTC GAA TAA ATA ATA TAA GAT TTT GAT TAC TTC CTC CTG CTT TAT C G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 TC TCC TTT TGA TGA GAA GAA TAG TAG AAA ATG GAG CTG GAA CTG GAT G G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 AA CTG TAT ACC CCC CAC TTT CAT CTA TTA TTG CTC ATG GAG GAG CTT C G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 AG TAG ATT TAG CTA TTT TTT CTT TAC ACC TGG CAG GAA TTT CCT CAA T G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 TC TAG GGG CAG TAA ATT TTA TTA CTA CTG TTA TTA ATA TAC GAT CAA C G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 GG GAA TTT CCT TTG ATC GAA TAC CTT TAT TTG TTT GAT CTG TAG TGA T G.m.mo si ans 2 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 3 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 4 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 5 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 6 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 7 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 8 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 9 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 10 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 11 .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . G.m.mo si ans 1 TA CAG CTT TAT TAT TAC TCT TAT CTT TAC CTG TAT TAG CCG GAG CAA T Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 123 Como e e ido nos nossos objec i os pa a es e abalho, o mou-se uma “Colónia Expe imen al” a pa i da colónia de Glossinas mo si ans mo s ans Wes wwod, 1850 (Dip e a Glossinidae) da UEM/IHMT. Ob i e am-se ês ge ações nes a colónia que o am es udadas pa a os seguin es objec i os: - Con ibui pa a uma p imei a abo dagem pa a a ca ac e ização molecula da Glossina mo si ans mo si ans Wes wood 1850 (Díp e a, Glossinidae), - Es uda o sex a io das glossinas macho e êmea eclodidas à nascença. Du an e a o mação da colónia e ao longo de cada ge ação, oi possí el obse a a elação macho/ êmea das glossinas eclodidas à nascença, podendo es a elação se de inida como sendo o núme o de machos pa a cem êmeas. Pa a de e mina essa elação o am con adas odas as glossinas eclodidas à nascença e que po de inição co esponde ao sex a io secundá io (Pa lík, 1990). Na na u eza, Fishe , 1930., e F aga de Aze edo, 1964, a i ma am que a elação de sex a io en e machos e êmeas é de 1/1. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 124 A elação sex a io en e glossinas macho e êmea eclodidas na colónia em es udo po ge ação oi a seguin e: Na 1ª ge ação a elação sex a io é de 1:1,3. Na 2ª ge ação a elação sex a io é de 1:1,1. Na 3ª ge ação a elação sex a io é de 1:1,2. Pode-se, pe an e os esul ados e i icados, a i ma que a colónia de Glossina mo si ans mo si ans do IHMT ap esen a um sex a io idên ico ao es udado em glossinas que i em no seu habi a na u al. O Qui-quad ado aplicado às ês ge ações demons a que as di e enças de p opo ções en e elas, não são signi ica i as (Qui-quad ado=0,271, G aus de libe dade=2, p=0,873). Pode-se, po isso, u iliza a p opo ção o al de 54% de glossinas êmea (E o Pad ão da es ima i a=2,8%). O in e alo de con iança de 95% pa a essa p opo ção é de 54,0% +/- 1,96 x 2,8 (Limi e in e io = 48,5%, Limi e supe io = 59,5%). Como o in e alo inclui os 50% ( alo desc i o nou os es udos), não há di e ença es a is icamen e signi ica i a, ela i amen e aos nossos dados (54%). Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 125 O p esen e abalho pe mi iu ambém ap esen a as p imei as sequências, ainda que pa ciais, do gene COI do ADN mi ocond ial de uma população de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 man ida há á ias ge ações, no insec á io da UEM do IHMT. Nes e es udo o am de ec ados ês haplo ipos en e as sequências das amos as de labo a ó io, e qua o haplo ipos quando o am compa adas as sequências com a sequência encon ada na base de dados. Conside ando que a di e sidade haplo ipica é um índice que e lec e a p obabilidade de dois haplo ipos, escolhidos ao acaso numa população, se em di e en es, enquan o que a di e sidade nucleo ídica e lec e a p obabilidade de dois nucleó idos homólogos escolhidos ao acaso se em di e en es numa população (Nei & Li, 1979). Assim, a média da di e sidade haplo ipica encon ada pa a o gene COI oi de 0,006 ± 0,003, e de 0,0084 ± 0,0063, espec i amen e, ap esen ando uma baixíssima di e sidade. Wohl o d e al (1999) ao compa a em duas populações de G. mo si ans mo si ans c iadas em labo a ó io, e i ica am que uma das populações ap esen a a uma di e sidade mais ele ada, ela i amen e à ou a população. A jus i icação ap esen ada pelos au o es es a ia elacionada com o empo de manu enção das populações em labo a ó io, ou seja, quan o maio o a manu enção das populações em labo a ó io, meno se ia a di e sidade en e elas. 126 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 127 AFONSO, M. O., 2000. Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a,Glossinidae) e T ypanosoma b ucei b ucei Plimme & B ad o d, 1899 (Kine oplas ida, T ypanosoma idae). U ilização de um modelo expe imen al pa a es udo das in e elações ec o -pa asi a. Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, Unidade de En omologia Tese de Dou o amen o. ALLSOPP, R., 1972. The ole o game animals in he main enance o endemic and enzoo ic ypanosomiases in h Lambwe Valley, Sou h Nyanza Dis ic , Kenya. Bulle in o he Wo ld Heal h O ganisa ion, 47: 735-746. ANDRADE E SILVA, M. A., 1936. A Tsé sé em Moçambique, a nossa acção con a a mosca e doenças que ela ansmi e Missão de Comba e às T ipanossomíases. AKSOY, S., 2003. Con ol o se se lies and ypanosomes using molecula gene ics. Ve e ina y Pa asi ology, 115: 125-145. AKSOY, S., GIBSON, W. C. & LEHANE, M. J., 2003. In e a ions be ween se se and ypanosomes wi h implica ions o he con ol o ypanosomiasis. Ad ances in Pa asi ology, 53: 1-83. AKSOY, SERAP., BERRIMAN, MATT., HALL, NEIL., HATTORI, M., HIDE, WINSTON. & LEHANE, MAICHAEL., 2005. A case o Glossina genome p ojec . T ends in Pa asi ology, 21. ASHCROFT, M. T., 1959. The impo ance o A ican wild animals as ese oi s o ypanosomiases. Eas A ican Medical Jou nal, 36: 289-297. AZEVEDO, J. F., PINHÃO, R. C., 1964. The main enance o labo a o y colony o Glossina mo si ans. Bull.O g. Mond. San é, 31: 835-841. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 128 BAKER, M. D. & KRAFUR, E, S., 2001. Iden i ica ion and p ope ies o mic osa elli e ma ke s in se se lies Glossina mo si ans mo si ans sensu la o (Dip e a: Glossinidae). Mol Ecol No es, 1 (4): 234-236. [PubMed: 11137738]. BEARD, C. B., DURVASSULA, R. V.,& RICHARDS, F.F.,1998. Bac e ial symbiosis in a h opods and he con ol o disease ansmission. Eme g In ec . Dis, 4: 581- -91. [PubMed: 9866734]. BERGHE, L. & LAMBRECHT, F. L., 1963. The Epidemiology and Con olo Human T ypanosomiasis in Glossina mo si ans ly-bel s. Am. J. T op. Med. Hyg., 12 (2), 129-164. BERRIMAN, MATTHEW., GHEDIN, ELODIE., HERTZ-FOWLER, CHRISTIANE., BLANDIN, GAELLE & RENAULD, HUBERT., 2005. The Genome o he A ican T ypanosome T ypanosoma b ucei. Science:Vol. 309. no. 5733, pp. 416 – 422; DOI: 10.1126/science.1112642. BISOFFI, ZENO., BELTRAME, ANNA., MONTEIRO, GERALDO., ARZESE, ALEXANDRA., MAROCCO, STEFANIA., RORATO, G., ANSELMI, M. & VIALE, PIERLUIGI., 2005. A ican T ypanosomiasis Gambiense, I aly, CDC., .11, nº-11. BLANCHETOT, A. & GOODING, R. H., 1993. Gene ic analysis by DNA inge p in ing in se se ly genomes. Insec Biochem Mol Biol.,23 (8):937-44. BLANCHETOT, A. & GOODING, R. H., 1993.Gene ic a iabili y and seg ega ion analysis I Glossina mo si ans mo si ans (Dip e a: Glossinidae) using DNA inge p in ing. Genome, 37: 289-295. BOSSCHE, P VAN DEN. & STAAK, C., 1997. The impo ance o ca le as a ood sou ce o Glossina mo si ans mo si ans in Ka e e dis ic , Eas e n P o ince, Zambia. Ac a T opica, 65: 105-109. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 129 BROCK, TIM CLUTTON., & LANGLEY, PETER., 1997. Pe sis en cou ship educes male and emale longe i y in cap i e se se lies Glossina mo si ans mo si ans Wes wood (Dip e a Glossinidae). In . Socie y o Beha io al Ecology, 8 (4): 392-395. BRUCE, D., 1895. P elimina y epo on he se se ly disease o Nagana in Zuzuland. Bene and Da is, Du ban, 29 pp. BRUCE, D., 1896. Fu he epo in he se se ly disease o nagani in Zululand. Ha ision and Sons, London. BUXTON, P., 1955. The Na u al His o y o Tse se Flies: An Accoun o he Biology o he Genus Glossina (Dip e a). London UK: H. K. Lewis & Co. CAPPELLO, M., BERGUM, P. W., VLASUK, G. P., FURMIDGE, B. A., PRITCHARD, D. L. & AKSOY, S., 1996. Isola ion and cha ac e iza ion o he se se ombin inhibi o : a po en an i h ombo ic pep ide om he sali a o Glossina mo si ans mo si ans”. Am J. T op. Med. Hyg., 54, (5); 475-80. CHADENGA, V., 1994. Epidemiology and con ol o ipanosomosis. Onde s epoo Jou nal o Ve e ina y Rese ch, 61: 385-390. CHALLIER, A. & LAVEISSIERE, C., 1973. Un non eau piege la cap eu des glossines (Glossina: Dip e a Muscidae). Desc ip ion e essays su le e ain. Cahie s ORSTOM. Se ie En omologie Medicale e Pa asi ologie. 11, 251-262. CHEN, X., LI, S., & AKSOY, S., 1999. Conco dan e olu ion o a symbion wi h i s hos insec s species: molecula phylogeny o genus Glossina and i s bac e iome- associa ed endosymbion , Wiggleswo hia glossinidia. J. Mol E ol, 48: 49-58. [PubMed: 9873076]. CIPRANDI, ALESSANDRA., HORN, FABIANA., & TERMIGNONI, CARLOS, 2003. Sali a de animais hema ó agos: on e de no os an icoagulan es. Re ..B as. Hema ologia e Hemos ase, 25 (4): 250-262. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 130 CIPRANDI, A., HORN, F. & TERMIGNONI, C., 2003. Sali a de animais hema o agos: on e de no os an icoagulan es. Re . B . Hema ol. Hemo e ., 25 (4): 250-262. COURTIN, D., BERTHIER, D., THEVENON, S., DAYO, C. K., GARCIA, A. & BUCHETON, B., 2008. Hos Gene ics in A ican T ypanosomiasis. In ec . Gene ic. E ol,. 8 (3): 229-238. COX, F., 2004. His o y o sleeping sickness (A ican ypanosomiasis). In ec . Dis. Clin. N Am., 18: 231-145. CROSS, NICHOLAS C. P., DOVER. & GABRIEL A., 1986. Tse se ly DNA: an analysis o s uc u e and sequence. Depa men o Gene ics, Uni e si y o Camb idge-UK, 15: nº 1. DALE, C. & MAUDLIN, I., 2001. The endosybion s o se se lies: manipula ing hos pa asi e in e ac ions. In ena ional Jou nal o Pa asi ology, 111: 187-191. DALE, COLIN., YONG, SIMON., HAYDON, DANIEL.,& WELBURN, SUSAN., 2001. The insec endosymbion Sodalis glossinidius u ilizes a ype III sec e ion sys em o cell in asion. PNAS, 98 (4): 1883-1888. DARBY, A. C., J. LAGNEL., MATTHEW, C. Z., BOURTZIS, K., MAUDLIN, I. & WELBURN, S. C., 2005. Ex ach omosomal DNA o he Symbion Soldalis glossinidus. Jou nal o Bac e iology, 187 (14): 5003-5007. DE KRUIT, P., 1926. MICROBE HUNTERS. New Yo k: HARCOURT, BRACE. & HIDE, G., 1999. His o y o sleeping in Eas A ica. Clin. Mic obiol. Re ., 12 (1): 112-125. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 131 DIAS, J. A., TRAVASSOS SANTOS, 1987. Con ibuição pa a o es udo da sis emá ica do géne o Glossina Wiedemann, 1830 (Insec a, B achyce a, Cyclo hapha, Glossinidae). P opos a pa a a c iação de um no o subgéne o . Ga cia O a Se Zool Lisboa, 14: 67-78. DONELSON, JOHN., 2003. An igenic a ia ion and he A ican ypanosome genome. Ac a T opica, 85: 391-404. FAO Food and Ag icul u e O ganisa ion o he Uni ed Na ions., 1992. Co po a e Documen Reposi o y; Tse se biology, sys ema ics and dis ibu ion. Ag icul u e and Consume P o ec ion. FOLMER, O., BLACK, M., HOEH, W., LUTZ, R. & VRIJENHOEK, R, 1994. DNA p ime s o ampli ica ion o mi ochonclial cy ich ome C oxidae subuni -1 om di e se me azoan in e eb a es. Molecula Ma in Biology and Bio echnology, 3 (5): 294-299. FORD, J., 1963. The Dis ibu ion o he Vec o s o A ican Pa hogenic T ypanosomes. Bull. O g. mond. San é, 28: 653-669. FORD, J. & LEGATTE, B. M, 1961. The geog aphical and clima ic dis ibu ion o ypanosome in ec ions a es in Glossina mo si ans g oup o se se lies (Glossina Weid, Dip e a). T ansac ions o he Royal Socie y o T opical Medicine and Hygiene, 55: 383-397. FRAGA DE AZEVEDO., 1967. Geog a ia Médica da Doença do Sono. Re . Ins . Med. T op. São Paulo, 9 (4): 239-294. FRANÇA, C., 1905. Sob e as glossinas da Á ica O ien al exis en es no Museu de Lisboa. Jo nal de Sciencias Ma hema icas Physicas e Na u ais, 7 (2ª sé ie): 137- -140. Con ibu o pa a a Ca ac e ização molecula de uma colónia de Glossina mo si ans mo si ans Wes wood, 1850 (Díp e a, Glossinidae) _____________________________________________________________________________________________ 132 GEIGER, ANNE., CUNY, G., & FRUTOS R., 2005. Two Tse se Fly Species, Glossina palpalis gambiensis and Glossina mo si ans mo si ans, Ca y Gene ically Dis inc Popula ions o he Seconda y Symbion Sodalis glossinidus. Ame ican Soci y o Mic obiology, 71 (12): 8941-8943. GEIGY, R. & KAUFFMAN, M., 1973. Sleeping sickness su ey in he Se enge i á ea (Tanzania),1971. I. Examina ion o la ge mammals o ypanosomes. Ac a T ópica, 30: 12-23. GIDUDU, A. M., CUISANCE, D., REIFENBERG, J. M. & FRESIL, J. L., 1995 Con ibuison à l’e ude de lemission de T ypanosoma congolense pa Glossina mo si ans mo si ans (Díp e a, Glossinidae) au labo a oi e. Re ue. Ele . Méd. Ve . Pays op, 48 (3): 264-270. GOODING, R. H., 1990. Gene ic aspec s o quali y con ol in se se colonies. Insec Sci, 11: 385-98. GOODING, R. H., 1984. Tse se gene ics: a e iew. Quaes . En omol., 20: 89- -128. GOODING, R. H. & KRAFSUR, E. S., 2005. Tse se Gene ics: Con ibu ions o Biology, Sys ema ic and Con ol o Tse se Flies. Na ional Ins i u e o Hea h Annu Re En omol., 50:101-123. GREEN, C. H., 1986. E ec s o colou s and syn he ic odou s on he a ac ion o Glossina pallidipes and Glossina mo si ans o aps and sc eens. Physiological En omology, 11, 411-421. GREEN, C. H., 1994. Bai s me hods o se se ly con ol. Ad ances in Pa asi ology, 34, 229-291.