Estudo do efeito do Palbociclib e do Tipifarnib em linhas celulares de carcinomas anaplásicos da tiróide

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL ESTUDO DO EFEITO DO PALBOCICLIB E DO TIPIFARNIB EM LINHAS CELULARES DE CARCINOMAS ANAPLÁSICOS DA TIRÓIDE SARA PATRÍCIA LOPES VENTURA DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS (OUTUBRO, 2016) Uni e sidade No a de Lisboa Ins i u o de Higiene e Medicina T opical Es udo do e ei o do Palbociclib e do Tipi a nib em linhas celula es de ca cinomas anaplásicos da i óide Au o : Sa a Pa ícia Lopes Ven u a O ien ado : Dou o a B anca Ca aco Disse ação ap esen ada pa a cump imen o dos equisi os necessá ios à ob enção do g au de Mes e em Ciências Biomédicas A p esen e disse ação oi esc i a ao ab igo do an igo aco do o og á ico. Ag adecimen os i Ag adecimen os Em conclusão des e abalho que o, an es de mais, ag adece a odos aqueles que de alguma o ma con ibuí am e pe mi i am a sua conc e ização. Um ag adecimen o especial à minha o ien ado a, Dou o a B anca Ca aco, po me e acei e no g upo de Endoc inologia Molecula do IPO-Lisboa e po me e dado a opo unidade de desen ol e es e p ojec o. Pelos seus ensinamen os, con iança e incen i o que pe mi i am desen ol e melho as minhas compe ências na ciência. Ao Dou o Vale iano Lei e pela sua cu iosidade, disponibilidade e in e esse no desen ola do p ojec o. Ag adeço à Mes e Ana Ma ias, po odos os ensinamen os, pelo conhecimen o ansmi ido, pela excelen e in eg ação e pela boa disposição. Que o ag adece ambém aos meus colegas de g upo, Dou o as Ma ga ida Mou a e Ana Luísa Sil a pela ajuda que disponibiliza am semp e ao longo des e ano. À Dou o anda Inês Ma ques pela sua p eocupação cons an e em ajuda e acima de udo, à minha colega de Mes ado Inês Gomes, po es a p esen e nos momen os mais di íceis e po comp eende odas as di iculdades. Que o ag adece ambém às Dou o as Ana Pin o e Joana Pe ei a pelo seu acompanhamen o e um especial ag adecimen o à Dou o a Ma a Pojo pelo seu apoio incansá el e às no as ideias que conseguiu implemen a . Ag adeço ainda à So ia Nunes, So ia Gou eia e Filipa Coelho po es a em semp e disponí eis pa a ajuda e aos es an es elemen os da UIPM, ag adeço a con i ência e boa disposição i ida dia iamen e. A odos os amigos que pe mi i am de alguma o ma descomplica os momen os di íceis e c ia momen os de di e são ao longo do ano, aos colegas de abalho pela boa disposição e aleg ia i ida dia iamen e e ao meu che e po oda a comp eensão. Aos elemen os essenciais da minha ida, pelo apoio cons an e, incen i o, o ça, comp eensão e acima de udo paciência nos momen os mais di íceis e que con ibuí am pa a o na os obs áculos áceis de ul apassa . Po úl imo, mas não menos impo an e, um ag adecimen o especial ao meu i mão e ao meu pai po odo o apoio incondicional du an e odo o meu pe cu so académico e à melho mãe do mundo pelo apoio, ca inho, incen i o, paciência e comp eensão. Sem eles nada dis o se ia possí el. A odos, um eno me ob igado. Resumo iii Resumo O canc o da i óide é a neoplasia mais comum do sis ema endóc ino. Os ca cinomas da i óide que de i am das células olicula es englobam os ca cinomas bem-di e enciados (WDTC), os ca cinomas pouco di e enciados (PDTC) e os ca cinomas indi e enciados ou anaplásicos (ATC). Os WDTC subdi idem-se em ca cinomas papila es (PTC) e olicula es (FTC). Os ATC ep esen am 2-3 % dos ca cinomas da i óide, sendo conside ados os umo es mais ag essi os da i óide, pa a os quais não exis em ac ualmen e e apêu icas e icazes. O nosso g upo iden i icou, em es udos an e io es, os genes TP53, RAS, CDKN2A (p14ARF/p16INK4A) e CDKN2B e (p15INK4B) e ias elacionadas, como desempenhando papéis essenciais no desen ol imen o de ATC. As p o eínas p15INK4B e p16 INK4A uncionam como sup esso es umo ais inibindo as CDK4/6 e le ando à pa agem do ciclo celula . O Palbociclib inibe as CDK4/6, sendo espe ado que a sua acção compense a pe da uncional dos genes CDKN2A e CDKN2B. Po ou o lado, mu ações no gene HRAS conduzem à ac i ação cons i u i a da ia MAPK- ERK e, consequen emen e, ao desen ol imen o umo al. A iso o ma HRAS em de se a nesilada pa a adqui i ac i idade oncogénica, ep esen ando um al o molecula do compos o Tipi a nib, um inibido da a nesil ans e ase (FTI). O objec i o p incipal des e p ojec o oi iden i ica no as e apêu icas di eccionadas pa a al os molecula es especí icos en ol idos no desen ol imen o de ATC, endo sido es udados dois no os compos os, o Palbociclib e o Tipi a nib. Pa a es udo do seu e ei o nas di e en es linhas celula es o am ealizados ensaios de iabilidade me abólica celula (pelo mé odo MTS), ensaios de ciclo e mo e celula (po ci ome ia de luxo) e iabilidade celula (pelo mé odo de exclusão com azul de ipano). Fo am usadas ês linhas celula es de ATC: C643 (mu ações nos genes TP53, HRAS e delecção dos genes CDKN2A e CDKN2B), T238 (mu ações nos genes TP53, CDKN2A, BRAF e PIK3CA) e T235 (mu ação no gene BRAF); uma linha celula de PTC designada BCPAP (mu ações nos genes BRAF e TP53); e células no mais de i óide PCCL3. Nos ensaios de ciclo celula e de iabilidade celula ealizados com o Palbociclib obse ou-se, espec i amen e, um aumen o signi ica i o de células na ase G0/G1 do ciclo celula e uma diminuição do núme o de células iá eis ao longo do empo, nas linhas celula es de ATC e PTC, mas não nas células no mais de i óide. Nos ensaios ealizados com o Tipi a nib obse ou-se um e ei o do compos o apenas na linha celula de ATC, com mu ação no gene HRAS, que consis iu no aumen o signi ica i o de células na ase G2/M e na diminuição do núme o de células iá eis ao longo do empo. Os esul ados p elimina es do Tipi a nib quan o à exp essão do mRNA de genes en ol idos na egulação do ciclo celula suge i am, em conco dância com os esul ados dos ensaios de ciclo celula , que es e compos o le ou à pa agem do ciclo na ansição G2/M, pelo aumen o obse ado na exp essão dos genes CCNA2, CDK2 e CDC2. Os esul ados des e es udo suge em que o Palbociclib e o Tipi a nib pode ão e um papel impo an e na inibição da p og essão umo al. A con inuação des e abalho pode á con ibui pa a cla i ica quais os mecanismos de acção e a ele ância des es compos os como e apêu icas pa a os ATC. Pala as-cha e: ca cinoma anaplásico da i óide (ATC), al os molecula es, Palbociclib, Tipi a nib, linhas celula es. Abs ac Abs ac Thy oid cance is he mos common malignancy o he endoc ine sys em. Thy oid ca cinomas, which de i a e om ollicula cells include well-di e en ia ed ca cinomas (WDTC), poo ly di e en ia ed ca cinomas (PDTC) and undi e en ia ed o anaplas ic ca cinomas (ATC). The WDTC a e subdi ided in o papilla y ca cinomas (PTC) and ollicula ca cinomas (FTC). ATC ep esen 2-3% o hy oid ca cinomas, being conside ed he mos agg essi e hy oid umou s, o which he e a e cu en ly no e ec i e he apies. In p e ious s udies, ou g oup iden i ied he genes TP53, RAS, CDKN2A (p14ARF/p16INK4A), CDKN2B, (p15INK4B) and ela ed pa hways as playing essen ial oles in he de elopmen o ATC. The p15INK4B and p16 INK4A p o eins ac as umou supp esso s by inhibi ing CDK4/6 and leading o cell cycle a es . Palbociclib inhibi s CDK4/6, so i is expec ed ha i s ac ion compensa es he unc ional loss o CDKN2A and CDKN2B genes. On he o he hand, HRAS gene mu a ions lead o cons i u i e ac i a ion o he MAPK-ERK pa hway, and hus o umou de elopmen . The HRAS iso o m ha e o be a nesyla ed o acqui e oncogenic ac i i y, ep esen ing a molecula a ge o Tipi a nib compound, a a nesyl ans e ase inhibi o (FTI). The main objec i e o his p ojec was o iden i y no el he apies di ec ed a speci ic molecula a ge s in ol ed in he de elopmen o ATC. In pa icula , we aimed o s udy he e ec o wo compounds, Palbociclib and Tipi a nib, in ATC cell lines. Me abolic cell iabili y (MTS assay), cell cycle and dea h ( low cy ome y) and cell iabili y ( ypan blue exclusion me hod) we e assessed o s udy he e ec o hese compounds on he di e en cell lines. Th ee ATC cell lines we e used: C643 (wi h TP53 and HRAS gene mu a ions and dele ion o CDKN2A and CDKN2B genes), T238 (wi h TP53, CDKN2A, BRAF and PIK3CA gene mu a ions) and T235 (wi h BRAF gene mu a ion); one PTC cell line designa ed BCPAP (wi h BRAF and TP53 gene mu a ions); and no mal hy oid cells (PCCL3 cells). In he cell cycle and iabili y assays pe o med wi h Palbociclib, a signi ican cell a es in he G0/G1 phase and a dec eased numbe o iable cells h ough ime, we e obse ed in ATC and PTC cell lines. These e ec s we e no obse ed in no mal hy oid cells. In he s udy o Tipi a nib, signi ican e ec s we e only obse ed in he ATC cell line wi h an HRAS mu a ion, which consis ed in an a es in he G2/M phase o cell cycle, and in a dec ease in he numbe o iable cells h ough ime. P elimina y esul s o he s udy o Tipi a nib e ec in mRNA exp ession o genes in ol ed in cell cycle egula ion (CCNA2, CDK2 and CDC2 genes), we e in ag eemen wi h he esul s ob ained in he cell cycle assays, sugges ing ha his compound led o cycle a es in he G2/M ansi ion. The esul s o his s udy sugges ha Palbociclib and Tipi a nib may play a majo ole in inhibi ing umou p og ession. The con inua ion o his wo k may help o cla i y he mechanisms o ac ion and he ele ance o hese compounds as he apies o ATC. Key wo ds: anaplas ic hy oid ca cinoma (ATC), molecula a ge s, Palbociclib, Tipi a nib, cell lines. Índice de igu as xii Figu a 29 – Resul ados dos 3 ensaios de iabilidade celula independen es ob idos às 24, 48 e 72 h após incubação da linha celula T238 com 0,1 µM de Tipi a nib ........... 63 Figu a 30 – G á icos ep esen a i os dos esul ados dos ensaios de ciclo e mo e celula ealizados pa a a linha celula T235 com di e en es concen ações de Tipi a nib ........ 65 Figu a 31 – Resul ados dos 3 ensaios de iabilidade celula independen es ob idos às 24, 48 e 72 h após incubação da linha celula T235 com 0,1 µM de Tipi a nib ........... 66 Figu a 32 – Resul ados dos ensaios de qRT-PCR ob idos a pa i de RNA ex aído das linha celula es C643, T238 e T235, após incubação com 0,1 µM de Tipi a nib du an e 48 h ................................................................................................................................ 68 Figu a 33 – Esquema ep esen a i o da acção do Palbociclib na ia ciclina D1/CDK4/6/Rb du an e o ciclo celula ......................................................................... 74 Figu a 34 – Esquema ep esen a i o da elação en e ciclinas e CDK du an e o ciclo celula .............................................................................................................................. 81 Figu a 35 – Concen ação ela i a das di e en es ciclinas ao longo do ciclo celula ... 81 Figu a A.1 – Exemplo de esquema de dis ibuição de di e en es concen ações do compos o e con olos em placas de 96 poços usadas nos ensaios de iabilidade .......... 95 Figu a A.2 – Va iação da quan idade de DNA na célula ao longo do ciclo celula ..... 96 Figu a A.3 – Rep esen ação esquemá ica da de ecção de células apop ó icas po ligação da Anexina-V à os a idilse ina ...................................................................................... 97 Figu a A.4 – Rep esen ação de um hemoci óme o ....................................................... 98 Índice de abelas xiii Índice de abelas Tabela I – Classi icação das neoplasias da i óide ........................................................... 4 Tabela II – Al e ações gené icas mais p esen es em umo es a ançados da i óide, PDTC e ATC, numa sé ie de 117 umo es ................................................................................. 10 Tabela III – Al e ações molecula es somá icas pa ogénicas de ec adas nas linhas celula es C643, T238, T235, BCPAP e nas células PCCL3 ........................................... 25 Tabela IV – Núme o de células plaqueadas pa a cada linha celula , em cada ipo de placa ........................................................................................................................................ 30 Tabela V – P ime s u ilizados nas eacções de qRT-PCR ............................................ 39 Tabela A.I – Volumes dos eagen es usados na cul u a de células e nos ensaios de aco do com o amanho do asco/placa ...................................................................................... 93 Tabela A.II – In o mações de massa, solubilidade e concen ações dos s ocks de Palbociclib e Tipi a nib .................................................................................................. 94 Tabela A.III – Tampões u ilizados na ex acção de RNA e espec i a unção ............. 99 Tabela A.IV – P epa ação da solução de PI (50 µg/mL) ............................................. 103 Tabela A.V – P epa ação da solução de PBS-BSA 0,2 % (p/ ) .................................. 103 Tabela A.VI – P epa ação do ampão de anexina-V ................................................... 103 Lis a de ab e ia u as, siglas ou ac ónimos x Lis a de ab e ia u as, siglas ou ac ónimos AKT V-ak mu ine hymoma i al oncogene homolog 1 AML Leucemia Mieloide Aguda (Acu e Myeloid Leukemia) Ann Anexina-V ARF Al e na e Reading F ame ATC Ca cinoma anaplásico da i óide (Anaplas ic Thy oid Ca cinoma) ATP Adenosina i os a o (Adenosine iphospha e) AXIN1 AXin INhibi o 1 BCL-2 B-Cell Lymphoma 2 BCPAP Linha celula de ca cinoma papila da i óide BAX BCL2-Associa ed X P o ein bp Núme o de pa es de esíduos de nucleó idos (base pai s) BRAF Mu ine sa coma i al ( - a ) oncogene homolog B1 BSA Albumina de so o bo ino (Bo ine se um albumin) C643 Linha celula de ca cinoma anaplásico da i óide Ca2+ Iões de cálcio CaCl2 Clo e o de cálcio CCNA2 Ciclina A2 CCNB1 Ciclina B1 CCND1 Ciclina D1 CCNE2 Ciclina E2 CDK Cinases dependen es de ciclinas (Cyclin-dependen kinase) CDKI Inibido es de cinases dependen es de ciclinas (Cyclin ‐ dependen kinase inhibi o ) CDKN Genes que codi icam inibido es de cinases dependen es de ciclinas cDNA DNA complemen a de caneia simples (complemen a y DNA) cm Cen íme o CO2 Dióxido de ca bono CT Ciclo de eshold (Th eshold cycle) CTNNB1 Ca enin Be a 1 D Aspa a o ou Ácido aspá ico Lis a de ab e ia u as, siglas ou ac ónimos x i DEPC Die il pi oca bona o (die hylpy oca bona e) DMSO Dime il sul óxido (Dime hyl sul oxide) DNA Ácido desoxi ibonucleico (deoxy ibonucleic acid) dNTP T i os a o de desoxi ibonucleico (deoxy ibonucleo ide iphospha e) DO Densidade óp ica DTT Di io ei ol (Di hio h ei ol) E Ácido glu âmico ou glu ama o E2F Família de ac o es de ansc ição EDTA Ácido e ilenodiamino e a-acé ico (E hylenediamine e aace ic acid) EGFR Recep o do ac o de c escimen o epide mal (Epide mal g ow h ac o ecep o ) EIF1AX Euka yo ic ansla ion ini ia ion ac o 1A, X-ch omosomal E bB Família de p o eínas que inclui qua o ecep o es com ac i idade de i osina cinase ERBB2 Recep o Ty osine Kinase 2 ERK Sinais ex acelula es egulado es de cinases (Ex acellula signal ‐ egula ed kinase) FACS Fluo escence-ac i a ed cell so ing Fase G0 Fase não p oli e a i a do ciclo celula Fase G1 In e alo 1 do ciclo celula Fase G2 In e alo 2 do ciclo celula Fase M Mi ose Fase S Fase de sín ese de DNA do ciclo celula FBS So o e al bo ino (Fe al Bo ine Se um) FDA Food and D ug Adminis a ion FITC Fluo escein iso hiocyana e FTA Adenoma olicula da i óide (Follicula Thy oid Adenoma) FTC Ca cinoma olicula da i óide (Follicula Thy oid Ca cinoma) FTI Inibido da a nesil ans e ase (Fa nesyl T ans e ase Inhibi o s) g g amas G Glicina GAPDH Glyce aldehyde 3-phospha e dehyd ogenase Lis a de ab e ia u as, siglas ou ac ónimos x ii GDP Guanosine diphospha e GTP Guanosine 5’- iphospha e GTPases Guanosine 5’- iphospha ase h ho as HEPES 4-(2-hyd oxye hyl)-1-pipe azinee hanesul onic acid HPRT Hypoxan hine-guanine phospho ibosyl ans e ase IC50 Concen ação do compos o pa a a qual se obse a 50 % da inibição da iabilidade celula INK4 Inibido es da CDK4 K Lisina L Leucina LOH Pe da de he e ozigo ia (Loss O He e ozygosi y) Q Glu amina m mili- M Mola MAPK Casca a mi ogénica ac i ada po p o eínas cinase (Mi ogen-Ac i a ed P o ein Kinase) Mdm2 Mouse double minu e 2 homolog MEK Dual speci ici y mi ogen-ac i a ed p o ein kinase kinase 1 Mg2+ Iões de magnésio MgCl2 Clo e o de magnésio min minu os MLH Mu L-Homolog amily o DNA misma ch epai genes MM Mieloma múl iplo mRNA RNA mensagei o MSH DNA misma ch epai MTC Ca cinoma medula da i óide (Medulla y Thy oid Ca cinoma) mTOR Mammalian a ge o apamycin MTS 3-(4,5-dime hyl hiazol-2-yl)-5-(3-ca boxy me hoxyphenyl)-2-(4- sul ophenyl)-2H e azolium n nano- NaCl Clo e o de sódio Lis a de ab e ia u as, siglas ou ac ónimos x iii NF Neu o ib omin NMTC Ca cinoma não-medula da i óide (Non-medulla y Thy oid Ca cinoma) p p- alue p21 Cyclin-dependen kinase inhibi o 1 p27 Cyclin-dependen kinase inhibi o 1B p57 Cyclin-dependen kinase inhibi o 1C PAX8 Pai ed box 8 PBS Tampão os a o salino (Phospha e Bu a ed Saline) PCCL3 Células olicula es de i óide no mal de Ra us no egicus PCR Reacção em cadeia ca alisada pela enzima polime ase (Polime ase Chain Reac ion) PDTC Ca cinoma pouco di e enciado da i óide (Poo ly Di e en ia ed Thy oid Ca cinoma) PI Iode o de p opídio PI3K Fos a idilinosi ol 3-cinase (Phospha idylinosi ol 3 ‐ kinase) PIK3CA Phospha idylinosi ol-4,5-bisphospha e 3-Kinase, Ca aly ic Subuni Alpha PMS Phenazine me hosul a e PPARγ Pe oxisome P oli e a ion-Ac i a ed Recep o ype γ PS Fos a idilse ina PTC Ca cinoma papila da i óide (Papilla y Thy oid Ca cinoma) PTEN Phospha ase and ensin homolog qRT-PCR PCR quan i a i o em empo eal (quan i a i e eal ime PCR) R A ginina RAS Ra sa coma í us homolog RAF Ra -1 p o o-oncogene, se ine/ h eonine kinase Rb Re inoblas oma 1 (gene RB ou RB1) RET REa anged du ing T ans ec ion RET/PTC Rea anjo de c omossomas en ol endo o gene RET RNA Ácido ibonucleico (Ribonucleic acid) RNase Ribonuclease RNaseOu Ribonuclease inhibi o ecombinan pm Ro ações po minu o Lis a de ab e ia u as, siglas ou ac ónimos xix RTK Recep o Ty osine Kinase S Se ina T235 Linha celula de ca cinoma anaplásico da i óide T238 Linha celula de ca cinoma anaplásico da i óide T3 T iiodo i onina T4 Ti oxina TERT Telome ase e e se ansc ip ase TK1 Thymidine Kinase 1 TOP2A DNA Topoisome ase II alpha TP53 Tumo P o ein 53 TSH Ti o opina ou ho mona es imulado a da i óide (Thy oid-S imula ing Ho mone) USH Ushe in UV Ul a iole a V Valina X Codão s op WDTC Ca cinoma bem-di e enciado da i óide (Well Di e en ia ed Thy oid Ca cinoma) WES Whole Exome Sequencing w Wild- ype Y Aspa agina % (p/ ) Concen ação exp essa em peso po olume % ( / ) Concen ação exp essa em olume po olume °C G aus Celsius µ mic o- 1. In odução 1 1. In odução 1.1. A biologia do canc o Canc o é uma doença que en ol e al e ações dinâmicas no genoma que conduzem à ans o mação de células no mais a células neoplásicas. O p ocesso pelo qual se dá a acumulação de al e ações gené icas que conduzem a essa ans o mação celula designa- se umo igénese. Exis em mais de 100 ipos de canc os dis in os e sub ipos de umo es que podem se encon ados em ó gãos especí icos (1, 2). Quando a homeos ase de uma célula no mal é a ec ada po mu ações, são ac i ados mecanismos de p o ecção. A célula é es imulada a exp essa genes en ol idos na inibição da p oli e ação celula , na apop ose e na epa ação de danos no DNA, de o ma a impedi a umo igénese. No en an o, quando as células ul apassam es es mecanismos de p o ecção, a acumulação sucessi a de mu ações pode conduzi à o mação de umo es (3). Após a o mação de umo es, as células umo ais podem adqui i a capacidade de in adi ecidos adjacen es e de en a na co en e sanguínea, podendo a ingi ou os locais do o ganismo e assim o ma me ás ases (4). Na umo igénese es ão equen emen e al e ados dois ipos de genes, os genes sup esso es de umo e os oncogenes. Os genes sup esso es de umo ac uam p incipalmen e na inibição da p oli e ação celula , sendo necessá ia a sua inac i ação pa a que haja c escimen o umo al (5). Pa a se em inac i ados, es es genes eque em, no malmen e, que haja inac i ação de ambos os alelos (6, 7). Pelo con á io, os oncogenes p omo em a p oli e ação celula de o ma descon olada e êm o igem em p o o- oncogenes que so em mu ações ac i ado as e que no malmen e a ec am um único alelo (8, 9). Hanahan e Weinbe g, em 2000, p opuse am 6 ca ac e ís icas que as células umo ais ão adqui indo ao longo do p ocesso de umo igénese e que as di e enciam das células no mais (hallma ks o cance ). Os a anços no conhecimen o dos p ocessos de desen ol imen o umo al êm indo e e idencia que a biologia do canc o já não pode se baseada apenas nas ca ac e ís icas das células umo ais, mas ambém na con ibuição do mic oambien e umo al pa a a umo igénese (3). Ac ualmen e o am já de inidas dez ca ac e ís icas p incipais: esis ência à mo e celula p og amada (apop ose), capacidade 1. In odução 8 olicula es e não espondem a a amen os com iodo adioac i o ou quimio e apia, ap esen ando um c escimen o mui o ápido (10, 27). His ologicamen e, são no malmen e umo es não-encapsulados, com á eas nec ó icas e hemo ágicas, ex emamen e in asi os, local e ascula men e, me as izando equen emen e pa a os ossos e pulmões, sendo a obs ução das ias espi a ó ias uma causa de mo e comum nes es casos (30). À semelhança do PDTC, os ATC podem coexis i e desen ol e -se a pa i de um WDTC ou podem su gi de no o (30). A ní el molecula , os ATC ap esen am ge almen e um núme o maio de mu ações ela i amen e aos PDTC (2). Os ATC ap esen am mu ações adicionais compa a i amen e com os WDTC. As al e ações nos genes PIK3CA (Phospha idylinosi ol-4,5-bisphospha e 3-Kinase, Ca aly ic Subuni Alpha) e PTEN (Pe oxisome P oli e a on-Ac i a ed Recep o sub ype γ), e ec o es p incipais da ia PI3K-AKT-mTOR, são pa icula men e p e alen es em ATC, sendo de ec adas, espec i amen e, en e 10-20 % e 5-15 % des es umo es (19, 27). As mu ações em PIK3CA endem a ap esen a -se em concomi ância com a mu ação BRAF p.V600E. Al e ações no núme o de cópias dos c omossomas são ambém equen es nos ca cinomas da i óide mais a ançados, p incipalmen e em ATC (27). As abo dagens e apêu icas con encionais são pouco e icazes nos umo es mais ag essi os da i óide, que ap esen am uma ele ada axa de mo alidade, sendo po isso necessá io o desen ol imen o de no as e apêu icas. 1.5. Pe is de exp essão génica globais de umo es da i óide O es udo dos pe is de exp essão génica dos ca cinomas da i óide em con ibuindo, signi ica i amen e, pa a o conhecimen o da biologia molecula des es umo es (31). 1.5.1. Pe is de exp essão génica em PDTC e ATC Em es udos an e io es, o nosso g upo analisou os pe is de exp essão globais de i óide no mal, WDTC, PDTC e ATC, u ilizando mic oa ays de oligonucleó idos, pa a comp eende quais as p incipais ias molecula es que con ibuem pa a o 1. In odução 9 desen ol imen o des es umo es, bem como pa a iden i ica no os al os e apêu icos. Es e es udo e elou que genes e ias de sinalização en ol idos na egulação da p oli e ação celula , ciclo celula , adesão e me as ização pode iam es a en ol idos na desdi e enciação dos umo es da i óide (28, 29). 1.6. Al e ações molecula es en ol idas na p og essão e desdi e enciação dos ca cinomas da i óide Os PDTC e ATC podem desen ol e -se de no o, mas equen emen e su gem po desdi e enciação de ca cinomas papila es ou olicula es (32). Vá ios es udos demons a am que os PDTC e ATC ap esen am um ele ado núme o de al e ações genómicas e que essa ins abilidade genómica pode desempenha um papel ulc al na p og essão dos ca cinomas da i óide (10). A p og essão e desdi e enciação dos ca cinomas da i óide pode en ol e acumulação de al e ações gené icas na ia PI3K- AKT-mTOR e nou as ias de sinalização celula (27, 32). Po exemplo, a ac i ação cons i u i a oncogénica da ia de sinalização MAPK pode p omo e a ins abilidade genómica e a oco ência de mu ações somá icas adicionais du an e a p og essão umo al (10). Com base na in o mação ob ida nos es udos de exp essão génica sob e os p ocessos e ias de sinalização celula es mais al e ados em PDTC e ATC, o nosso g upo seleccionou um g upo de genes [HRAS, KRAS, NRAS, BRAF, TP53, CTNNB1 (Ca enin Be a 1), PIK3CA, PTEN, AXIN1 (AXin INhibi o 1) e genes que codi icam inibido es de cinases dependen es de ciclinas (CDKI) [CDKN1A (p21CIP1), CDKN1B (p27KIP1), CDKN2A (p14ARF e p16INK4A), CDKN2B (p15INK4B), CDKN2C (p18INK4C)] pa a análise de mu ações po sequenciação de Sange , numa sé ie de 48 umo es (26 ATC e 22 PDTC) e 6 linhas celula es (4 de i adas de ATC e 2 de PDTC) [6]. Nos umo es analisados, oi de ec ada uma maio equência de mu ações nos genes TP53 (42 % dos ATC; 27 % dos PDTC) e RAS (31 % dos ATC; 18 % dos PDTC), obse ando-se mú ua exclusi idade pa a es as mu ações. Pa a além des es dois genes, os inibido es de cinases dependen es de ciclinas (CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C), ambém es a am equen emen e al e ados nos PDTC (14-20 %) e nos ATC (10-14 %). Po ou o 1. In odução 10 lado, mu ações nos genes BRAF, CTNNB1 e AXIN1 o am a amen e de ec adas nes e es udo (28, 29). Em suma, nes e es udo o am iden i icados os genes RAS, TP53 e os genes codi ican es de CDKI como sendo os mais equen emen e mu ados e que podem se undamen ais pa a o desen ol imen o de PDTC e ATC. Em 2015, Kuns man e o seu g upo de ec a am 2674 mu ações somá icas (121/amos a) po sequenciação global do exoma (WES – Whole Exome Sequencing) em 22 casos de ATC e 4 linhas celula es es abelecidas de ATC, sendo que a análise on ológica e elou que a maio ia das a ian es se encon a am nas ias de sinalização RAS, MAPK e E bB. Fo am encon adas mu ações em genes associados ao canc o, mas que p e iamen e não inha sido associados à umo igénese da i óide, como po exemplo, MTOR (mammalian Ta ge O Rapamycin), NF (neu o ib omin), MLH (Mu L-Homolog amily o DNA misma ch epai genes), MSH (DNA misma ch epai ), ERBB2 (Recep o Ty osine Kinase 2), EIF1AX (Euka yo ic ansla ion ini ia ion ac o 1A, X-ch omosomal) e USH2A (Ushe in). Mu ações somá icas em genes já es abelecidos pa a canc o da i óide o am ambém de ec adas em 64 % dos umo es, incluindo mu ações no BRAF, TP53, genes da amília RAS, PIK3CA, CDKN1B, CDKN2C, CTNNB1 e RET (REa anged du ing T ans ec ion). (33) Mais ecen emen e, Landa e o seu g upo ealiza am um es udo de WES numa sé ie de 84 PDTC e 33 ATC, que pe mi iu iden i ica um g ande espec o de mu ações somá icas, usões génicas e al e ações do núme o de cópias génicas, que di e enciam es es dois ipos de umo es. Nes e es udo, os genes encon ados mais equen emen e mu ados o am o TP53, RAS, BRAF e TERT (Tabela II) (2). Tabela II – Al e ações gené icas mais p esen es em umo es a ançados da i óide, PDTC e ATC, numa sé ie de 117 umo es analisados, com 84 PDTC e 33 ATC [adap ado de (2)]. BRAF RAS NRAS HRAS KRAS EIF1AX PIK3CA PTEN TERT TP53 PI3k/AKT RET/PTC PAX8/PPARγ PDTC 33% 28% 21% 5% 2% 11% 2% 4% 40% 8% 11% 6% 4% ATC 45% 24% 18% 6% 0% 9% 18% 15% 73% 73% 39% 0% 0% Al e ações gené icas 1. In odução 11 O gene EIF1AX oi ecen emen e desc i o como um no o gene associado a ca cinomas da i óide, es ando p esen e em ce ca de 11 e 9% dos PDTC e ATC, espec i amen e, e signi ica i amen e associado com mu ações no RAS, sendo nes e caso p edi i o de uma meno sob e i ência (2). Con o me já oi e e ido, pa e dos PDTC e ATC ap esen am mu ações em genes que ambém es ão en ol idos em PTC e FTC, como po exemplo, RAS e BRAF, o que suge e que es as al e ações podem es a en ol idas no p ocesso de desdi e enciação. No en an o, es es umo es podem adqui i ambém no as mu ações du an e o p ocesso de desdi e enciação, como po exemplo, nos genes TP53, TERT, PTEN, PIK3CA, EIF1AX, CTNNB1 e CDKN (2, 27, 34). Po ou o lado, os ea anjos RET/PTC e PAX8/PPAR a amen e são encon ados nos ca cinomas mais ag essi os, suge indo que es as al e ações gené icas não p edispõem a célula pa a a desdi e enciação (30). Na Figu a 3 encon a-se esquema izado o p ocesso de p og essão umo al na i óide, designadamen e as al e ações molecula es en ol idas no desen ol imen o de WDTC, PDTC e ATC (28, 29). Mu ações encon adas exclusi amen e nas o mas mais ag essi as de umo es da i óide podem es a associadas a es ádios mais a ançados da p og essão umo al e, po ou o lado, mu ações encon adas em WDTC, mas não em PDTC ou ATC, pode ão es a mais associadas a e en os elacionados com iniciação umo al (10). Figu a 3 – Esquema ep esen a i o da p og essão dos ca cinomas da i óide. Des acados a neg i o, es ão os genes mais equen emen e al e ados (>5 %) [adap ado de (2, 10, 29)]. 1. In odução 12 1.7. No os al os molecula es e abo dagens e apêu icas pa a o mas ag essi as de canc o da i óide Nes e p ojec o, p opusemo-nos a es a no os compos os e apêu icos que êm como al o genes e ias de sinalização en ol idas no desen ol imen o dos umo es mais ag essi os da i óide, dado que as e apêu icas con encionais não são e icazes nes e ipo de umo es (35). Ac ualmen e exis e uma as a gama de compos os que êm como al o mu ações em alguns dos genes mais al e ados em PDTC e ATC. No p esen e p ojec o o am seleccionados pa a es udo os al os molecula es RAS, CDKN2A (p16INK4A) e CDKN2B (p15INK4B). Des a o ma, o am es ados compos os di igidos aos e e idos al os: o Tipi a nib é um inibido da a nesil ans e ase, inibindo a a nesilação do HRAS e consequen emen e, ac uando na ia MAPK/MEK/ERK (36); o Palbociclib egula o ciclo celula , uncionando como inibido das CDK4/CDK6 ( eguladas pelos CDKI p15INK4B e p16INK4A) (37). Nas secções que se seguem se á discu ida a selecção dos al os molecula es e compos os es udados nes e abalho. 1.7.1. P ocessos celula es: ciclo celula e p oli e ação celula Tal como oi e e ido an e io men e, os genes encon ados mais equen emen e mu ados em PDTC e ATC es ão en ol idos em p ocessos de egulação do ciclo e p oli e ação celula . Uma célula ep oduz-se a a és de uma sé ie de e en os em que duplica o seu con eúdo celula e se di ide em duas no as células, designados po ciclo e p oli e ação celula , espec i amen e. O ciclo celula é cons i uído po qua o ases dis in as: a ase S em que oco e a sín ese/ eplicação do DNA, duas ou as ases an es e após a ase S, designadas espec i amen e de G1 e G2, e a ase M, em que oco e a di isão em duas células- ilhas idên icas (mi ose e ci ocinese). As ases G1, S e G2 co espondem à in e ase, pe íodo em que a célula aumen a de olume e amanho (38). Ao longo do ciclo celula ão exis indo pon os especí icos de egulação que con olam se a célula es á ap a ou não pa a p ossegui pa a a ase seguin e do ciclo, sendo que a des egulação des e ciclo pode le a à di isão celula excessi a, um dos 1. In odução 13 p ocessos en ol idos na umo igénese. O ciclo celula é egulado po checkpoin s com p o eínas que p omo em a p og essão, ciclinas E, A e D e cinases dependen es de ciclinas (CDK) e po ou as p o eínas que induzem a pa agem do ciclo celula , os inibido es de cinases dependen es de ciclinas (CDKI) (6, 38). Os di e en es complexos ciclina/CDK ac uam em ases di e en es do ciclo celula de o ma a impedi a sua p og essão quando oco em e os no DNA, quando os p ocessos celula es não es ão comple os ou quando o ambien e ex acelula não é a o á el. Quando a célula pe manece no checkpoin da ase G1 po empo su icien e, pode en a numa ase não p oli e a i a (G0) podendo pe manece senescen e po longos pe íodos (Figu a 4) (38). O mecanismo en ol ido no checkpoin em G1 é o mais bem es udado, onde ac ua a p o eína p53, que é egulado a da ansc ição e ac i a a ansc ição de genes que codi icam p o eínas inibido as das CDK. A p esença de danos no DNA p o oca um aumen o na concen ação e na ac i idade das p o eínas p53 e p21 (CDKI), sendo que a p o eína p21 se liga ao complexo ciclina E/CDK2 e p e ine a en ada da célula na ase S (38). Figu a 4 – Checkpoin s do ciclo celula e co esponden es complexos ciclina/CDK [(2, 38, 39)]. 1. In odução 14 A pa agem do ciclo em G1 pe mi e que a célula en e epa a os danos no DNA an es da eplicação. Se o DNA es i e g a emen e al e ado, a p o eína p53 induz a célula a en a em apop ose. Con udo, se a p53 es á ausen e ou al e ada, há eplicação de DNA com ele ada axa de mu ações o que pode conduzi à umo igénese (38). 1.7.2. Al os molecula es p53 e p14ARF – compos os PRIMA-1MET e Nu lin-3 O gene TP53 es á en ol ido em di e sos e en os celula es: pa agem do ciclo celula em G1, apop ose, senescência e en elhecimen o (40). Es e gene es á localizado no c omossoma 17p13 e encon a-se equen emen e inac i ado em di e sos umo es, a a és de mu ação pon ual e pe da de he e ozigo ia (LOH - Loss O He e ozygosi y). A p o eína p53 wild- ype (w ) é capaz de impedi o c escimen o ano mal de células ans o madas, ac uando como sup esso umo al (10, 41). Em condições no mais, os ní eis des a p o eína pe manecem mui o baixos. Em espos a a s ess celula , es a p o eína que ac ua como ac o de ansc ição e é apidamen e acumulada no núcleo da célula a a és de modi icações químicas: os o ilação e ace ilação (41). Um dos egulado es mais impo an es da p o eína p53 é a p o eína Mdm2 (Mouse double minu e 2 homolog), que p omo e a ubiqui inação da p53, le ando à sua expo ação do núcleo pa a deg adação no p o eossoma (40). A p o eína Mdm2 con ola os ní eis de exp essão da p o eína p53 po eedback nega i o (41). A p o eína p14ARF codi icada pelo gene CDKN2A ac ua como sup esso umo al na ia da p53; liga-se à p o eina Mdm2 e bloqueia a sua ac i idade de ligase, p e enindo a deg adação da p53 pela Mdm2 e conduzindo assim à es abilização e acumulação da p53. Es ando a p53 ac i a, po ac i ação da p21, pode á ha e pa agem do ciclo celula se os danos no DNA o em epa á eis (na ase G1) ou indução da apop ose caso não o sejam (40). Assim, a p o eína p53 p e ine a mul iplicação de células com al e ações no DNA e a consequen e a umo igénese (42). A pe da de unção des a p o eína induz ins abilidade genómica esul ando em de iciências nos sis emas de epa ação do DNA e consequen emen e na p og essão umo al (10). Ce ca de 95 % das mu ações encon adas nes e gene es ão localizadas na sequência que codi ica a egião cen al da p o eína esponsá el pela ligação ao DNA, 1. In odução 15 o que induz a pe da de capacidade de se liga aos seus genes-al o e de desempenha a unção de sup essão umo al (41). Os genes-al o da p53 mu ada são di e en es da p53 w , sendo maio i a iamen e oncogénicos ao in és de sup esso es umo ais, ou seja, desempenham unções con á ias às da p53, induzindo p oli e ação celula , sob e i ência e esis ência a á macos, o que acili a a p og essão umo al (43). Ac ualmen e exis em á ios compos os que êm como al o a p o eína p53 mu ada, sendo o PRIMA-1MET (ou APR-246) um deles. PRIMA-1MET é um análogo me ilado de PRIMA-1 e em a capacidade de eac i a mu an es da p53, azendo com que es a adqui a algumas das suas unções w (44, 45). Alguns es udos e elam que es e compos o em conjun o com a quimio e apia pode induzi apop ose das células umo ais, apesa de não se o almen e conhecido o mecanismo molecula en ol ido nessa eac i ação (45). PRIMA-1MET já oi es ado em ensaios p é-clínicos, com esul ados posi i os, em lin oma, canc o da mama, colon e pulmão, em mieloma, a pa i de 2011 em ensaios clínicos de ase II em leucemia mieloide aguda (AML) sem esul ados, em 2013 em ensaios clínicos em doen es com canc o da p ós a a e em 2015 em ensaios ase I/II em canc o colo ec al (46-49). Pa a nosso conhecimen o, es e compos o nunca oi es ado em ca cinomas da i óide. Na ausência de p14ARF, de ido a mu ações inac i ado as no gene que codi ica es a p o eína, a Mdm2 passa a es a semp e ac i a, não ha endo pa agem do ciclo celula , pelas azões e e idas an e io men e. O compos o Nu lin-3, que p o ege a p53 w da deg adação mediada pela p o eína Mdm2, conduz ambém à pa agem do ciclo celula ou à apop ose, (46, 50). Es e compos o “mime iza” a unção da p14ARF ligando-se ao domínio de ligação da Mdm2 à p53, pe mi indo assim que sejam ac i ados os al os p ó-apop ó icos da p53 (Figu a 5). Es e compos o oi es ado isoladamen e em ensaios p é-clínicos em AML, leucemia lin ocí ica c ónica, mieloma múl iplo (MM), canc o da p ós a a e neu oblas oma, com esul ados posi i os (51-55). Foi ambém es ado em combinação com o So a enib, um inibido de ecep o es com ac i idade de i osina cinase, em linhas celula es de AML e ca cinomas enais (56, 57). Em canc o da i óide, o compos o Nu lin-3 oi apenas es ado em linhas celula es e em combinação com Bo ezomib, onde oi obse ado um 1. In odução 16 aumen o dos ní eis de exp essão de genes en ol idos na apop ose e na ci o oxicidade celula (53). Os compos os Nu lin-3 e PRIMA-1MET o am seleccionados pa a es udo em di e en es linhas celula es de ATC, num abalho desen ol ido an e io men e pelo nosso g upo, mas os esul ados p elimina es mos a am não ha e uma espos a signi ica i a com os compos os isolados ou combinados (22). Figu a 5 – Mecanismo de acção simpli icado p opos o pa a os compos os PRIMA-1MET e Nu lin-3 [adap ado de (2, 22)]. 1. In odução 17 1.7.3. Al os molecula es p15INK4B e p16 INK4A – compos o Palbociclib As CDK4 e CDK6 são os egulado es p incipais da ansição da ase G1 pa a a ase S do ciclo celula (58). Po sinais ex e nos há o mação do complexo ciclina D/CDK4/6 que os o ila a p o eína Rb1 ( e inoblas oma 1), inac i ando-a. A p o eína Rb1 ac i a (des os o ilada) unciona como ep esso do ac o de ansc ição E2F ( amily o ansc ip ion ac o s), impedindo que o ciclo celula a ance (Figu a 6). Na ausência des e complexo, a célula consegue p oli e a de ido aos mecanismos edundan es que possui. Nes e caso, o complexo ciclina E/CDK2, unciona ia de igual modo, os o ilando a p o eína Rb1 (58). No en an o, se o DNA da célula es i e dani icado, os CDKI i ão inibi a associação desses complexos pe mi indo que a Rb1 hipo os o ilada se ligue ao ac o de ansc ição E2F e impeça a p og essão do ciclo celula . Os CDKI p15INK4B e p16 INK4A p e inem a os o ilação da p o eína Rb1, uncionando como sup esso es umo ais (10, 58, 59). Figu a 6 – Regulação do checkpoin na ase G1 do ciclo celula [adap ado de (10)]. 3. Ma e iais e Mé odos 25 3. Ma e iais e Mé odos 3.1. Cul u a de células Nes e es udo, o am usadas linhas celula es humanas de ATC: C643 (disponí el come cialmen e) e T238 e T235 (cedidas gen ilmen e pela Dou o a Lúcia Roque da UIPM-IPOLFG). Foi ambém u ilizada uma linha celula de ca cinoma papila da i óide humano, BCPAP (cedida gen ilmen e pela Dou o a Paula Soa es do IPATIMUP - Ins i u o de Pa ologia e Imunologia Molecula da Uni e sidade do Po o) e células PCCL3, p o enien es da clonagem de células olicula es de i óide no mal de Ra us no egicus (gen ilmen e cedidas pelo P o esso Dumon do Ins i u de Reche che In e disciplinai e en Biologie Humaine e Moléculai e, Facul é de Médecine, Uni e si é Lib e de B uxelles, Bélgica). Cada linha celula ap esen a al e ações molecula es somá icas pa ogénicas, p e iamen e iden i icadas ( abela III). Tabela III – Al e ações molecula es somá icas pa ogénicas de ec adas nas linhas celula es C643, T238, T235, BCPAP e nas células PCCL3 [adap ado de (28, 29, 70, 71)]. Legenda: LOH – pe da de he e ozigo ia (Loss o He e ozygosi y) ne – não es udado. Linhas celula es HRAS BRAF CDKN2A CDKN2B TP53 PIK3CA C643 p.G13R (he e ozigo ia) - delecção homozigó ica (sem adução) delecção homozigó ica (sem adução) p.R248Q (hemizigo ia) - T238 - p.V600E p.L63R - p.S183X (LOH) p.E542K T235 - p.V600E - - - - B-CPAP - p.V600E (homozigo ia e he e ozigo ia) ne ne p.D259Y - PCCL3 - - - - - - Genes com al e ações molecula es pa ogénicas 3. Ma e iais e Mé odos 26 3.1.1. Descongelação das células As células o am c iop ese adas em azo o líquido, numa solução de congelação con endo FBS (so o e al bo ino) com 10 % ( / ) de DMSO (Dime il sul óxido) (Sigma-Ald ich). As ampolas o am e i adas do azo o líquido e passadas pa a gelo, sendo pos e io men e descongeladas. Após oda a suspensão es a descongelada, ans e iu- se odo o con eúdo com uma se inga de 1mL pa a um ubo com 20 mL de meio de cul u a suplemen ando com FBS 10 % ( / ), L-glu amina 1X e an ibió ico- an imicó ico 1X. O meio de cul u a u ilizado oi o co esponden e a cada linha celula . Cen i ugou-se o ubo du an e 5 minu os a 1200 pm ( o ações po minu o) (Labo uge 400, He aeus Ins umen s, aio do o o = 170 mm) e e i ou-se o sob enadan e de o ma a elimina o DMSO. Ressupendeu-se o pelle em 10 mL de meio de cul u a suplemen ado e ans e iu-se a suspensão celula pa a um asco de cul u a com o es an e olume de meio de cul u a. Os olumes de meio de cul u a u ilizados pa a cada ipo de asco e placas de cul u a encon am-se desc i os na abela A.I do anexo I). No dia seguin e à descongelação, eno ou-se o meio de cul u a. 3.1.2. C iop ese ação das células A c iop ese ação das células oi ei a a pa i de ascos de cul u a de 75 cm3 com uma con luência celula de ce ca de 90-100 %. Após des aca as células do asco com ipsina-EDTA (Ácido e ilenodiamino e a-acé ico) ( e secção 3.1.3) p ocedeu-se à cen i ugação da suspensão celula (1200 pm, 5 min), emo eu-se o sob enadan e e pos e io men e, essuspendeu-se o pelle em 2 mL de uma solução de congelação e ans e iu-se pa a uma ampola de congelação de 2 mL. A ampola oi p imei amen e colocada a -70 °C e pos e io men e em azo o líquido (-196 °C). 3. Ma e iais e Mé odos 27 3.1.3. P opagação e expansão das células Todas as linhas celula es o am p opagadas numa es u a com 5 % de CO2, em ascos de 75 cm3 no meio de cul u a ap op iado, sendo es e eno ado cada 3 a 4 dias pa a eno ação dos nu ien es. As linhas celula es C643 e BCPAP o am man idas e p opagadas em meio de cul u a RPMI-1640 (LonzaTM, Suiça) e as linhas celula es T238 e T235 em meio de cul u a RPMI-1640 modi icado, com HEPES [4-(2-hyd oxye hyl)-1- pipe azinee hanesul onic acid] (Sigma, EUA). Ambos os meios o am suplemen ados com L-Glu amina (GIBCOTM, EUA) 1X, An ibió ico-An imicó ico (GIBCOTM) 1X e com so o e al bo ino (FBS – Fe al Bo ine Se um) (GIBCOTM; Bioch omTM, UK) 2 % ( / ) ou 10 % ( / ), de aco do com o p ocedimen o a ealiza . Po ou o lado, as células PCCL3 o am man idas e p opagadas em meio de cul u a Hams F-12 Coon’s Modi ica ion wi h L-Glu amine (Eu oclone, I ália), suplemen ado com FBS (GIBCOTM, EUA) 5 % ( / ), insulina 1 mg/L (Sigma-Ald ich, EUA), ho mona es imulado a da i óide (TSH) 1 mUI/ml (Sigma-Ald ich, EUA), apo ans e ina 1 mg/ml (Sigma-Ald ich), L-Glu amina (GIBCOTM, EUA) 1X e an ibió ico- an imicó ico (GIBCOTM, EUA) 1X. Todas as linhas celula es u ilizadas são ade en es e pelo menos, duas ezes po semana, quando as células a ingiam uma con luência en e 85 e 100 %, e am di ididas e no amen e colocadas em cul u a. Pa a a passagem das células, após emoção de odo o meio de cul u a me abolizado, as células e am la adas com PBS 1X sem magnésio e sem cálcio (Phospha e Bu a ed Saline -Mg2+/Ca2+; GIBCOTM, EUA) e des acadas pela incubação com ipsina-EDTA (In i ogenTM, EUA) 1X a 37 °C du an e 30-45 segundos no caso das C643 e T238 e 60-90 segundos no caso das T235, BCPAP e PCCL3. A ipsina e a pos e io men e neu alizada po adição de meio de cul u a co esponden e a cada linha celula , suplemen ado com FBS 10 % ( / ). Ce ca de 1/3 da suspensão celula e a en ão ans e ido pa a um no o asco de cul u a e as células essuspendidas no olume inal de meio de cul u a adequado. 3. Ma e iais e Mé odos 28 Ou as in o mações sob e a descongelação, c iop ese ação e p opagação de células es ão desc i as na secção 8.1 do anexo I. Os olumes de meio de cul u a e de eagen es usados es ão desc i os na abela A.I do anexo I. 3.2. Compos os es ados 3.2.1. P epa ação das soluções s ock As soluções s ock concen adas de cada compos o, PD-0332991/Palbociclib (Selleckchem, EUA) e R115777/Tipi a nib (Selleckchem, EUA), o am p epa adas em DMSO (Sigma-Ald ich, EUA) de aco do com a sua solubilidade em água e em DMSO a 25 ºC ( abela A.II, anexo I), em ambien e es é il. Vis o se ecomendado e i a a congelação e descongelação das soluções s ock, as mesmas o am p epa adas em á ias alíquo as de o ma a se em u ilizadas apenas uma ez, e o am pos e io men e congeladas a -80 ºC, como ecomendado pela emp esa (Selleckchem’s Inhibi o Handling Ins uc ions). 3.2.2. Diluições se iadas dos compos os As di e en es concen ações de cada compos o o am p epa adas em ubos de 50 mL es é eis, em diluições se iadas, com olumes de meio de cul u a e compos o ap op iados. Nas diluições, man e e-se a pe cen agem de DMSO en e 0,01 % e 0,3 % em odos os ensaios e pa a odas as linhas celula es de o ma a ep oduzi a pe cen agem de DMSO nas di e en es condições de cada ensaio com compos o e nos ensaios con olo (sem compos o). Fo am man idas concen ações baixas de DMSO, is o se um compos o que pode ia causa di e enciação celula ou a é mesmo mo e celula (72). As diluições se iadas o am p epa adas imedia amen e an es de p ocede à adição do meio às células de o ma a p e eni qualque al e ação ou deg adação do compos o. Pa a as diluições oi u ilizado meio de cul u a suplemen ado com FBS 2 % ( / ). 3. Ma e iais e Mé odos 29 3.3. Es udo da iabilidade me abólica celula po ensaio de MTS Os ensaios de iabilidade me abólica celula o am ealizados pa a ob e a cu a dose- espos a de cada compos o, pa a cada linha celula . O MTS é um mé odo colo imé ico que pe mi e ob e uma es ima i a da iabilidade me abólica de um g upo de células condicionadas, em elação a um con olo não a ado. Fo am usadas as seguin es soluções: MTS [3-(4,5-dime hyl hiazol-2-yl)-5-(3- ca boxyme hoxyphenyl)-2-(4-sul ophenyl)-2H- e azolium], compos o de e azólio (P omega, EUA) e PMS (phenazine me hosul a e) (AppliChem, EUA), um mediado da ans e ência de elec ões. O MTS é bio eduzido po enzimas desid ogenases, p esen es em células me abolicamen e ac i as, em o mazano, p odu o que é solú el no meio de cul u a (Figu a 10). A quan idade de o mazano é medida num espec o o óme o a 490 nm, sendo o alo da abso ância di ec amen e p opo cional à ac i idade me abólica das células e consequen emen e, di ec amen e elacionado com o núme o de células i as em cul u a. Es e ensaio oi ambém usado inicialmen e pa a de e mina o núme o de células ideal a plaquea em cada ensaio. Nes es ensaios o am usadas apenas 3 linhas celula es: C643, T238 e T235 com ambos os compos os Palbociclib e Tipi a nib. Figu a 10 – Esquema ep esen a i o da eacção que oco e no ensaio MTS [adap ado de (73)]. 3. Ma e iais e Mé odos 30 U ilizando células ob idas a pa i de ascos T-75, com uma con luência óp ica de 85- 100 %, plaquea am-se as células em placas de 96 poços (Falcon, EUA), num olume inal de 100 µL. A concen ação celula po poço, pa a cada linha celula , encon a-se desc i a na abela IV. As di e en es condições dos ensaios, designadamen e as di e sas concen ações dos di e en es compos os, o am es adas em iplicado, excep o pa a os con olos não a ados, pa a os quais o am ei as 8 éplicas po placa. Os b ancos o am ambém ei os em iplicado, sem meio e sem células (esquema da placa na Figu a A.1 do anexo I). Após adesão das células à placa ( =0), o meio de cul u a oi emo ido de odos os poços e oi adicionado no o meio suplemen ado com FBS 2 % ( / ), com as espec i as diluições dos compos os. Nos poços con olo, o meio de cul u a oi apenas subs i uído po meio com FBS 2 % ( / ) sem compos o. Após 48 h de exposição das células ao compos o ealizou-se o ensaio MTS pa a a alia o e ei o de cada compos o na iabilidade celula me abólica. Imedia amen e an es da adição do eagen e do MTS a cada poço da placa de 96 poços (Falcon, EUA) com as células, o con eúdo da alíquo a de PMS (95 µL) oi mis u ado com a alíquo a de MTS (1900 µL). Vin e mic oli os dessa mis u a PMS/MTS o am adicionados a cada poço con endo ~100 µL de meio de cul u a, assim como aos poços con olo e aos poços que co espondem aos b ancos. A placa oi incubada a 37 °C num ambien e húmido, com 5 % de CO2. Tabela IV – Núme o de células plaqueadas pa a cada linha celula , em cada ipo de placa. Placa de 96 poços (0,36 cm2) Placa de 12 poços (3,6 cm2) Placa de 6 poços (9,5 cm2) C643 0,1x10^4 2x10^4 4x10^4 T238 0,4x10^4 3x10^4 9x10^4 T235 0,5x10^4 5,5x10^4 11x10^4 Núme o de células plaqueadas 3. Ma e iais e Mé odos 31 A lei u a da abso ância das placas oi ei a 2 h após o início da incubação num lei o de placas, Mic opla e Reade iMa k (BioRad, EUA), e usando o so wa e MPM6. Os esul ados ap esen ados co espondem a 2 ho as de incubação com MTS/PMS, pois os ensaios de op imização mos a am se es e o empo de eacção óp imo (os esul ados dos ensaios de op imização não o am ap esen ados nes a ese). A pe cen agem ela i a a um con olo oi assumida como co espondendo a 100 % de iabilidade e os dados ob idos o am analisados u ilizando o Mic oso Excel e o G aphPad P ism 6.0. 3.4. Es udo do ciclo celula po ci ome ia de luxo Tes ou-se o e ei o dos compos os Palbociclib e Tipi a nib no ciclo celula . Nes es ensaios o am usadas as linhas celula es C643, T238 e T235. As células o am plaqueadas em placas de 12 poços (VWR In e na ional) num olume de 1 mL de meio suplemen ado com FBS 10 % ( / ) po poço, endo em con a a espec i a concen ação celula pa a cada linha celula ( abela IV) e man idas a 37 °C num ambien e húmido com 5 % de CO2. Cada condição de a amen o oi es ada em duplicado, ha endo 6 con olos, dis ibuídos pelas á ias placas. Após adesão celula , o meio de cul u a oi subs i uído po no o meio suplemen ado com FBS 2 % ( / ) de o ma a man e as células em s a a ion mode ada, pa a a sinc onização do ciclo celula com o espec i o compos o a es a ( =0). Nos con olos não a ados, o meio de cul u a oi apenas subs i uído po meio no o, suplemen ado com FBS 2 % ( / ). Após 48 h, as células o am ecolhidas. Nes e ensaio, o sob enadan e não é necessá io, sendo desca ado. As células o am la adas com 500 µL de PBS 1X sem magnésio e sem cálcio, des acadas com 150 µL de ipsina-EDTA 1X e neu alizadas com 250 µL de meio de cul u a co esponden e, suplemen ado com FBS 10 % ( / ). As células o am ecolhidas pa a ubos de 1,5 mL, p e iamen e iden i icados, e cen i ugadas a 1300 pm du an e 3 minu os (eppendo Cen i uge 5810R, aio do o o = 180 mm). O sob enadan e oi desca ado e o pelle essuspendido em 300 µL de PBS 1X. P ocedeu-se a no a cen i ugação a 1300 pm du an e 3 minu os, desca ou-se o sob enadan e e essuspendeu- se o pelle de células em 1 mL de e anol a 70 % ( / ) [100 % ( / ), Me ck, Alemanha] pa a ixa as células e pe meabiliza a memb ana. Os ubos o am gua dados a 4 °C, du an e pelo menos 6 h e no máximo 1 semana. Após esse pe íodo, as células o am 3. Ma e iais e Mé odos 32 cen i ugadas a 1300 pm du an e 5 minu os, o sob enadan e desca ado e as células ma cadas com 100 µL de solução de iode o de p opídio 1X (1:50) (PI s ock, 500 µg/mL, Sigma, EUA) (p epa ação da solução desc i a na abela A.IV do anexo II) e incubadas du an e 40 minu os a 37 °C (banho-ma ia). Após incubação, sem desca a o sob enandan e, oi adicionado 1 mL de PBS 1X e as células o am cen i ugadas a 1300 pm du an e 10 minu os a 4 °C (eppendo Cen i uge 5810R, aio do o o = 180 mm). Po im, o sob enadan e oi desca ado e as células essuspendidas em 100 µL de PBS 1X - Bo ine Se um Albumin (BSA) (≥99 %, Sigma, Po ugal) [0,2 % (p/ )] (p epa ação da solução desc i a na abela A.V do anexo II) no momen o da análise po ci ome ia de luxo (FACScalibu TM – Bec on Dickinson). A aquisição oi ob ida pelo so wa e BD Cell Ques TM e os his og amas de ciclo celula ob idos o am analisados usando o p og ama FlowJo_V10 (T ee S a Inc, EUA), endo-se excluído os ag egados e as células mo as. Os his og amas pe mi i am-nos iden i ica as di e en es ases do ciclo celula , assim como sabe o núme o de células p esen e em cada ase (Figu a 11). In o mação mais de alhada sob e a análise do ciclo celula encon a-se desc i a na secção 8.4 do anexo I. Figu a 11 – Exemplo do his og ama ob ido pa a uma amos a con olo, após análise dos esul ados do ensaio de ci ome ia de luxo com o p og ama FlowJo. As di e en es ases do ciclo celula encon am-se ep esen adas. 3. Ma e iais e Mé odos 33 3.5. Es udo da mo e celula po ci ome ia de luxo Tes ou-se o e ei o dos compos os Palbociclib e Tipi a nib na mo e celula (nec ose e/ou apop ose). Nes es ensaios o am usadas as linhas celula es C643, T238 e T235. O p ocedimen o expe imen al pa a os ensaios de mo e celula oi igual ao desc i o pa a os ensaios de ciclo celula (desc i os na secção 3.4) a é ao momen o da ecolha das células após as 48h de incubação. Cada condição de a amen o oi es ada em duplicado. Nos ensaios de mo e celula ecolheu-se o meio de cul u a (sob enadan e) dos poços pa a ubos de 1,5 mL, uma ez que é espe ado que as células mo as se encon em nesse sob enadan e. Após ecolha do sob enadan e, as células ade en es o am la adas, des acadas e essuspendidas, como desc i o na secção 4, e ecolhidas no amen e pa a o ubo co esponden e. P ocedeu-se à cen i ugação a 1300 pm du an e 3 minu os (eppendo Cen i uge 5810R, aio do o o = 180 mm), desca ou-se o sob enadan e e essupendeu-se as células em PBS 1X-BSA [0,2 % (p/ )]. Depois de no a cen i ugação e eliminação do sob enadan e, as amos as co esponden es aos “b ancos” o am ma cadas da seguin e o ma: O b anco oi apenas ma cado com 100 µL de ampão de anexina-V (p epa ação da solução desc i a na abela A.VI do anexo II), o b anco PI oi ma cado com uma solução con endo 100 µL de ampão de anexina-V e 1 µL de PI 500 µg/mL (Sigma) e o b anco anexina-V oi ma cado com uma solução con endo 100 µL de ampão de anexina-V e 1 µL de anexina-V (100 µg/mL) (BioLegend, EUA). As células o am ma cadas com 100 µL de uma solução con endo ampão de anexina-V (Annexin-V binding bu e ), 1 µL de PI (500 µg/mL) e 1 µL de anexina-V (100 µg/mL). Depois de p ocede à incubação das células du an e 15 minu os (ma cação), no escu o e à empe a u a ambien e, es as o am essuspendidas em 100 µL de ampão de anexina-V e analisadas po ci ome ia de luxo (FACScalibu TM – Bec on Dickinson). Os “b ancos” o am usados pa a ajus a os pa âme os de aquisição de células pelo so wa e BD Cell Ques TM. Os dados da aquisição o am no amen e analisados usando o p og ama FlowJo_V10 (T ee S a Inc, EUA) e ob endo-se um g á ico PI/Anexina FITC. As células i as co espondem às células sem ma cação, ep esen adas no quad an e PI-/Ann-; as células em nec ose co espondem ao quad an e Pi+/Ann-, ma cadas apenas com PI; as células p é-apop ó icas ao quad an e Pi-/Ann+, ma cadas com Anexina-V e a mo e o al oi calculada pelo soma ó io de células que se encon a am ma cadas, co espondendo aos quad an es PI+/Ann-, PI-/Ann+ e PI+/Ann+ (Figu a 12). In o mação mais de alhada 3. Ma e iais e Mé odos 40 3.10.2. Cu as de e iciência e cu as de mel ing As cu as pad ão e as e iciências de eacção o am a aliadas pa a odos os genes al o em es udo, assim como pa a os genes housekeeping usados. As cu as de mel ing ambém o am analisadas em cada ensaio pa a a alia a especi icidade da ampli icação. (In o mação mais de alhada na secção 8.10 do anexo I). 3.10.3. Análise de dados do qRT-PCR - Quan i icação ela i a Pa a a análise de dados do qRT-PCR oi u ilizado o Mé odo de Li ak, ambém conhecido po 2-ΔΔCT, que assume que an o o gene e e ência como o gene de in e esse são ampli icados com uma e iciência p óxima de 100 %. A e iciência e a ep odu ibilidade dos ensaios de qRT-PCR são dois c i é ios undamen ais que de e minam a op imização desses ensaios. Pa a isso é necessá io cons ui uma cu a-pad ão a a és de diluições se iadas de uma amos a com concen ação conhecida e que exp esse o gene em es udo. A pa i dessa cu a iden i ica-se uma eg essão linea en e o alo de CT ob ido du an e a ampli icação pa a cada diluição e o loga i mo da quan idade inicial de ácido nucleico al o p esen e em cada amos a. A pa i da eg essão linea , de e mina-se R2, que demons a a linea idade dos esul ados e ob ém-se o decli e da ec a pad ão de o ma a calcula a e iciência da eacção. (In o mação mais de alhada na secção 8.10 do anexo I). Após con i mação da e iciência de eacção, a di e ença ela i a dos ní eis de exp essão do gene de in e esse em di e en es amos as pode se de e minada a pa i da no malização dos CT do gene de in e esse em elação ao gene de e e ência, an o pa a a amos a es e como pa a o calib ado (ΔCT). Pos e io men e o ΔCT da amos a é no malizado com o ΔCT do calib ado (ΔΔCT), ob endo-se um ácio no malizado a pa i da ó mula inicial, 2-ΔΔCT. Pa a co igi a iações na quan idade de DNA p esen e em cada amos a, é ampli icado em pa alelo um gene endógeno (housekeeping) pa a o qual ambém é cons uída uma cu a-pad ão. Inicialmen e oi usado o gene GAPDH (Glyce aldehyde 3-phospha e dehyd ogenase), mas as a iações de CTs e am mui o g andes en e 3. Ma e iais e Mé odos 41 di e en es qRT-PCR, endo passado a usa -se o HPRT (Hypoxan hine-guanine phospho ibosyl ans e ase). (In o mação mais de alhada na secção 8.10 do anexo I). 3.10.4. Análise de exp essão de al os molecula es po qRT-PCR Analisou-se po qRT-PCR a exp essão dos genes CCNA2 (ciclina A2), CCNB1 (ciclina B1), CDC2 (CDK1), CDK2 e CCND1 (ciclina D1) em amos as con olo não a adas e em amos as a adas com Palbociclib ou Tipi a nib das linhas celula es C643, T238 e T235. A exp essão des es genes oi analisada em elação à exp essão do gene HPRT, sendo a cu a de calib ação açada a pa i de 6 concen ações di e en es de uma amos a pad ão (con olo não a ado): 500; 250; 100; 50; 25 e 10 ng. As ampli icações de qRT-PCR pa a cada amos a o am ealizadas em iplicado, ha endo semp e con olos nega i os, ambém em iplicado, pa a cada gene, po cada placa de 96 poços (Mic oAmp Op ical 96-well eac ion pla e, Applied Biosys ems). As eacções de de qRT-PCR com SYBR G een I o am ealizadas no Ligh Cycle 480 II Ins umen (Roche Applied Science, Alemanha), seguindo o p o ocolo ecomendado pelo ab ican e (Roche Applied Science, Alemanha), com algumas al e ações, que de seguida se desc e e: Em gelo, p epa ou-se uma mis u a eaccional pa a cada amos a e po cada gene con endo 0,5 µL de p ime o wa d e p ime e e se 10 pmol/µL (Sigma-Ald ich, EUA) ( abela V), 10 µL de Ligh Cycle R 480 SYBR G een I Mas e 2X concen ada (que con ém o luo ó o o SYBR G een I, dNTPs, Fas S a Taq DNA Polime ase, ampão de eacção e MgCl2) (Roche Applied Science, Alemanha) e 8 µL água bides ilada a ada com DEPC. As eacções de qRT-PCR o am iniciadas com uma desna u ação a 95 ºC du an e 10 minu os, que oi seguida de 35 ciclos de ampli icação. Em cada ciclo oco eu um passo de desna u ação a 95 ºC du an e 15 segundos, um passo de hib idação dos p ime s a 60 ºC du an e 30 segundos, e um passo de ex ensão a 72 ºC du an e 15 segundos. O so wa e Ligh Cycle R 480 SW 1.5 (Roche Applied Science) oi u ilizado na análise dos esul ados ob idos. 3. Ma e iais e Mé odos 42 3.11. Análise es a ís ica Os dados o am ob idos a a és de á ios eplicados em ensaios independen es e nes e abalho, são ep esen ados com a média ± des io-pad ão. Os dados o am analisados u ilizando o so wa e G aphPad P ism 6.0 (G aphPad So wa e, EUA). Os esul ados o am conside ados es a is icamen e signi ica i os quando p < 0,05. Pa a o cálculo do IC50 oi ei a uma eg essão não-linea e açada uma cu a sigmoidal de dose- espos a, endo sido analisados 3 ensaios MTS independen es com 3 éplicas em cada ensaio. Pa a analisa os dados mo e e ciclo celula com 3 e 4 ensaios independen es, espec i amen e, oi u ilizado o es e não pa amé ico -S uden de Mann- Whi ney aplicado pa a duas amos as independen es. Pa a análise dos dados ob idos pa a os ensaios de iabilidade pelo mé odo de azul de ipano, com 3 ensaios independen es e com 2 éplicas po ensaio, oi u ilizado o es e pa amé ico wo-way ANOVA pa a compa a duas a iá eis independen es, mas que ap esen am uma elação en e si. Pa a analisa os dados de qRT-PCR oi u ilizado o es e não pa amé ico -S uden de Mann- Whi ney aplicado pa a duas amos as independen es. 4. Resul ados 43 4. Resul ados 4.1. Es udo do e ei o do Palbociclib em células no mais da i óide e em linhas celula es de ca cinomas da i óide O Palbociclib é um inibido das CDK4/6, en ol idas na egulação dos checkpoin s do ciclo celula , sendo po isso um compos o equen emen e u ilizado em casos com mu ações ou al e ações nos genes esponsá eis po essa inibição (CDKN2A e CDKN2B) (Shmid e Ehab). Nes e abalho, oi es ado o e ei o do Palbociclib em linhas celula es de ATC (C643, T238, T235), PTC (BCPAP) com e sem mu ações em genes que codi icam CDKI e em células no mais de i óide (PCCL3). A linha C643 ap esen a delecção dos genes CDKN2A e CDKN2B e a linha T238 ap esen a mu ação no gene CDKN2A (Tabela III). As linhas T235 e BCPAP e as células PCCL3 não ap esen am mu ações nes es genes. 4.1.1. De e minação do IC50 do Palbociclib em linhas celula es de ATC A im de de e mina o IC50 (concen ação do compos o pa a a qual se obse a 50 % da inibição da iabilidade celula ) pa a o Palbociclib eco emos a ensaios MTS [3- (4,5-dime hyl hiazol-2-yl)-5-(3-ca boxyme hoxyphenyl)-2-(4-sul ophenyl)-2H- e azolium] que medem a iabilidade me abólica celula . Fo am u ilizadas numa p imei a e apa do abalho as linhas celula es de ATC (C643, T238 e T235). Nes es ensaios oi de e minada a cu a dose- espos a des e compos o pa a cada linha celula e o espec i o IC50. Após 48 ho as de exposição ao compos o. Nas 3 linhas celula es de ATC usadas oi obse ado o e ei o dose- espos a, is o é, uma diminuição da iabilidade celula me abólica com o aumen o da concen ação do compos o (Figu a 14). Con udo obse a am-se di e en es IC50 pa a cada linha celula (Figu a 15). Na linha T235, com a concen ação de 17,5 µM, a dose mais al a es ada nas ou as duas linhas, não oi possí el de e mina a concen ação que inibisse 50% do c escimen o celula . Des e modo, pa a es a linha o am ealizados ensaios MTS a é uma concen ação de 25 µM de Palbociclib (Figu a 14). 4. Resul ados 44 Es es ensaios mos a am di e enças en e os IC50 das ês linhas celula es, e elando alo es in e io es pa a as linhas celula es que ap esen a am mu ações nos genes al o e e idos. Nas linhas celula es com mu ações (C643 e T238) a concen ação le al pa a 50 % das células em cul u a oi 14,64 µM e 19,04 µM, espec i amen e, e na linha celula sem mu ação (T235) oi 20,72 µM. Figu a 14 – Cu as dose- espos a ob idas a a és de 3 ensaios MTS independen es ealizados pa a as ês linhas celula es com di e en es concen ações de Palbociclib: 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15 e 20 µM e a é 25 µM pa a a linha T235. Cu a dose- espos a, Palbociclib IC50 = 14,64µM IC50 = 19,04µM IC50 = 20,72µM Figu a 15 – G á ico ep esen a i o da concen ação que diminuiu em 50 % a iabilidade celula (IC50), pa a as ês linhas celula es, após 48 h em cul u a com o Palbociclib. Concen ações de Palbociclib usadas nos 3 ensaios de MTS, ealizados em iplicado: 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20; 25 µM. Compa ação de IC50 do Palbociclib 4. Resul ados 45 4.1.2. E ei o do Palbociclib no ciclo, mo e e iabilidade celula em linhas de ATC Pos e io men e, a aliou-se o e ei o do Palbociclib no ciclo, mo e e iabilidade das células de ATC. Nes es ensaios usa am-se concen ações in e io es aos IC50 de o ma a a alia o mecanismo subjacen e à exposição do compos o sem ob e uma inibição ele ada da iabilidade. Rela i amen e aos ensaios de ciclo celula , na linha celula C643 obse ou-se que a p esença de Palbociclib le ou um aumen o g adual da pe cen agem de células na ase G0/G1 do ciclo celula , ela i amen e ao con olo, com concen ações en e 0,1 e 5 µM. Obse ou-se que o compos o aumen ou a pe cen agem de células em G0/G1 em ap oximadamen e 25 % e diminuiu as ases S e G2/M (~14 e 9 %, espec i amen e). Enquan o que no con olo a pe cen agem de células em G0/G1 oi ap oximadamen e 69 % das células com 5 µM de Palbociclib essa pe cen agem subiu pa a ce ca de 95 % (Figu a 16, A). Con udo com o aumen o da concen ação, supe io es 5 µM, a pe cen agem das células nas ases G0/G1 diminuiu g adualmen e le ando ao aumen o da ase G2/M (Figu a 16, A e C). Es es esul ados podem indica que as concen ações baixas de Palbociclib induzam uma pa agem do ciclo na ase G0/G1 enquan o as concen ações ele adas do compos o podem le a a uma pa agem no ciclo celula na ase G2/M. Com concen ações supe io es, 10 e 15 µM de Palbociclib, oi possí el obse a um aumen o da mo e celula sem signi icado es a ís ico, que pode á esul a da ele ada oxicidade a concen ações mais ele adas. A pe cen agem de mo e celula aumen ou de o ma mais ma cada com 15 µM de Palbociclib. (Figu a 16, B e D). 4. Resul ados 46 Figu a 16 – G á icos ep esen a i os dos esul ados dos ensaios de ciclo e mo e celula ealizados pa a a linha celula C643 com di e en es concen ações de Palbociclib (0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20; 25 µM). A e B. G á icos de ciclo e mo e celula , espec i amen e, ob idos pela lei u a das amos as no ci óme o de luxo e ep esen a i os de um ensaio. C e D. Resul ados de 4 e 3 ensaios ( ealizados em duplicado) de ciclo e mo e celula , espec i amen e, após 48 h de incubação com Palbociclib. *, p < 0,05. D A B C 4. Resul ados 47 Seguidamen e, pa a in es iga se o aumen o da p opo ção de células na ase G0/G1 es a ia associado com uma edução da p oli e ação celula ealiza am-se ensaios de iabilidade celula pelo mé odo de exclusão do azul de ipano ao longo de 72 ho as. Com es e ensaio oi possí el a alia se o núme o de células iá eis aumen a a ao longo do empo (24 h, 48 h e 72 h), e des a o ma, in e i se as células es a iam a p oli e a . Pa a al u ilizou-se a concen ação de Palbociclib mais baixa pa a a qual se obse ou um e ei o p óximo do máximo na ase G0/G1 nos ensaios de ciclo celula . Com es es dados oi possí el obse a , na igu a 17, uma diminuição da iabilidade celula ela i amen e ao con olo ao longo do empo, sendo essas di e enças es a is icamen e signi ica i as. Figu a 17 – Resul ados dos 3 ensaios de iabilidade celula independen es ob idos às 24 h, 48 h e 72 h, após incubação da linha celula C643 com 0,5 µM de Palbociclib. *, p < 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001. Ensaio de iabilidade, C643 Nº o al de células iá eis 4. Resul ados 48 Rela i amen e à linha celula T238, com a mu ação no gene CDKN2A que a ec a apenas a p o eína p16ARF, obse ou-se uma espos a semelhan e à da linha C643. Con udo es a linha celula de ATC mos ou-se menos sensí el ao Palbociclib ap esen ando um IC50 supe io . Obse ou-se ambém um aumen o g adual da pe cen agem de células em ase G0/G1 do ciclo celula , ela i amen e ao con olo, com concen ações de Palbociclib en e 0,1 e 1 µM, e a pa i de 5 µM o aumen o ela i o oi baixando g adualmen e. O aumen o máximo obse ado oi de ap oximadamen e 20 %, ob ido com a concen ação de 1 µM, sendo que no con olo se obse ou ce ca de 61 % de células na ase G0/G1 e com Palbociclib essa pe cen agem subiu pa a ce ca de 82 % (Figu a 18, A e C). Tal como já oi e e ido pa a a linha C643, a diminuição obse ada a pa i de 5 µM pode á se jus i icada pelo ac o de se obse a um aumen o da mo e celula , ela i amen e ao con olo, com concen ações de Palbociclib ≥ 5 µM (Figu a 18, B e D). 4. Resul ados 49 Figu a 18 – G á icos ep esen a i os dos esul ados dos ensaios de ciclo e mo e celula ealizados pa a a linha celula T238 com di e en es concen ações de Palbociclib (0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20; 25 µM). A e B. G á icos de ciclo e mo e celula , espec i amen e, ob idos pela lei u a das amos as no ci óme o de luxo e ep esen a i os de um ensaio. C e D. Resul ados de 4 e 3 ensaios ( ealizados em duplicado) de ciclo e mo e celula , espec i amen e, após 48 h de incubação com Palbociclib. *, p < 0,05; **, p ≤ 0,01. C D A B 4. Resul ados 56 4.2. Es udo do e ei o do Tipi a nib em linhas celula es de ca cinomas anaplásicos da i óide O Tipi a nib é um inibido do enzima a nesil ans e ase, que ac ua na ia MAPK- ERK e impede a ac i ação da iso o ma HRAS, que quando mu ada pe manece cons i u i amen e ac i a. Es e compos o pode á, po encialmen e, se u ilizado como e apêu ica, nos casos que ap esen em mu ações no gene HRAS. Nes e abalho, oi es ado o e ei o do Tipi a nib em linhas celula es de ATC com e sem mu ação no gene HRAS. A linha C643 ap esen a mu ação nes e gene e as linhas T238 e T235 não ap esen am mu ação. 4.2.1. De e minação do IC50 do Tipi a nib em linhas celula es de ATC Também pa a o Tipi a nib, eco eu-se a ensaios MTS pa a de e mina o IC50 desse compos o pa a as 3 linhas celula es de ATC C643, T238 e T235 e de e mina a cu a dose- espos a pa a cada linha. Os ensaios de iabilidade mos a am que o aumen o das concen ações de Tipi a nib oi le ando p og essi amen e à edução da iabilidade celula me abólica das 3 linhas es adas (Figu a 24). No en an o obse a am-se di e en es IC50 pa a cada linha celula (Figu a 25), sendo que o IC50 meno oi ob ido pa a linha celula (C643) que ap esen a mu ação no gene al o des e compos o (HRAS). Nessa linha, o IC50 oi 15,19 µM e pa a as linhas T238 e T235 oi 20,23 e 20,85 µM, espec i amen e. 4. Resul ados 57 Figu a 24 – Cu as dose- espos a ob idas a a és de 3 ensaios MTS independen es ealizados pa a as ês linhas celula es com di e en es concen ações de Tipi a nib: 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20 e 25 µM. Cu a dose- espos a, Tipi a nib IC50 = 15,19µM IC50 = 20,23µM IC50 = 20,85µM Figu a 25 – G á ico ep esen a i o da concen ação que diminuiu em 50 % a iabilidade celula (IC50), pa a as ês linhas celula es, após 48 h em cul u a com o Tipi a nib. Concen ações de Tipi a nib usadas nos 3 ensaios de MTS ealizados em iplicado: 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20; 25 µM. Compa ação de IC50 do Tipi a nib 4. Resul ados 58 4.2.2. E ei o do Tipi a nib no ciclo, mo e e iabilidade celula em linhas de ATC Após os ensaios MTS, es udou-se o e ei o do Tipi a nib ambém nos ensaios de ciclo, mo e e iabilidade nas ês linhas de ATC. No amen e, as concen ações de compos o usadas nes es ensaios o am in e io es aos IC50. Quan o aos ensaios de ciclo celula e e en es à linha celula C643 pôde obse a - se que na p esença de Tipi a nib hou e um aumen o da pe cen agem de células na ase G2/M do ciclo celula (acompanhado pela diminuição dessa pe cen agem pa a a ase G0/G1), ela i amen e ao con olo. O aumen o máximo obse ado pa a a pe cen agem de células na ase G2/M oi de ap oximadamen e 39 %, sendo que nes e ensaio no con olo se obse ou ce ca de 11 % de células em G2/M e com 0,1 µM de Tipi a nib (concen ação mais baixa es ada com maio e ei o do compos o) essa pe cen agem subiu pa a ce ca de 50 % (Figu a 26, A). A p opo ção de células na ase G2/M diminuiu g adualmen e com concen ações acima de 0,1 µM, man endo-se no en an o supe io ao con olo a é aos 5 µM. A pa i da concen ação de 10 µM obse ou-se o aumen o signi ica i o da pe cen agem de células na ase G0/G1. A pe cen agem de células na ase S não e e al e ações ele an es nas di e en es concen ações de Tipi a nib es adas (Figu a 26, A e C). Dado que a concen ação mais baixa de Tipi a nib es ada, 0,1 µM, co espondeu ao e ei o máximo obse ado pa a es e compos o nos ensaios de ciclo celula , oi subsequen emen e es ada uma no a concen ação, in e io . Realiza am-se ensaios de ciclo celula com 0,01 µM de Tipi a nib. No en an o, es es esul ados mos a am que, apesa de ha e aumen o da pe cen agem de células em ase G2/M com 0,01 µM (~ 20 %), esse aumen o oi in e io ao que inha sido obse ado com 0,1 µM (~ 40 %) (Figu a 26). Rela i amen e à mo e celula , com concen ações supe io es a 10 µM de Tipi a nib, obse ou-se um aumen o da mo e celula em elação à condição não a ada, apesa de não signi ica i o (Figu a 26, B e D). Com 15 µM de Tipi a nib, quase 100 % das células encon a am-se em mo e celula (Figu a 26, D), não sendo ecolhidas células su icien es pa a adqui i nos ensaios de ciclo celula . 4. Resul ados 59 C D A B Figu a 26 – G á icos ep esen a i os dos esul ados dos ensaios de ciclo e mo e celula ealizados pa a a linha celula C643 com di e en es concen ações de Tipi a nib (0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20; 25 µM). A concen ação de 0,01 µM oi apenas es ada nos ensaios de ciclo celula . A e B. G á icos de ciclo e mo e celula , espec i amen e, ob idos pela lei u a das amos as no ci óme o de luxo e ep esen a i os de um ensaio. C e D. Resul ados de 4 e 3 ensaios de ciclo e mo e celula ( ealizados em duplicado), espec i amen e, ob idos após 48h de incubação com Tipi a nib. *, p < 0,05. 4. Resul ados 60 Em seguida, pa a in es iga se o aumen o da pe cen agem de células na ase G2/M co espondia à pa agem do ciclo celula nessa ase e consequen emen e à diminuição da p oli e ação celula , em espos a ao Tipi a nib, ealiza am-se ensaios de iabilidade celula ao longo do empo (24 h, 48 h e 72 h). Nes es ensaios oi u ilizada a concen ação mais baixa de Tipi a nib (0,1 µM). Como é possí el obse a na igu a 27, hou e diminuição es a is icamen e signi ica i a da iabilidade celula ao longo empo ela i amen e ao con olo, o que suge e que hou e uma diminuição da p oli e ação celula a pa i das 24h com Tipi a nib, es ando assim de aco do com a hipó ese colocada da pa agem do ciclo celula na ase G2/M. Figu a 27 – Resul ados dos 3 ensaios de iabilidade celula independen es ob idos às 24 h, 48 h e 72 h após incubação da linha celula C643 com 0,1 µM de Tipi a nib. ***, p ≤ 0,001. Ensaio de iabilidade, C643 Nº o al de células iá eis 4. Resul ados 61 Rela i amen e aos ensaios de ciclo e mo e celula e e en es à linha celula T238, com di e en es concen ações de Tipi a nib, não se obse a am di e enças ela i amen e ao con olo, excep o com a concen ação mais ele ada es ada (Figu a 28, A, B, C e D). Com 15 µM de Tipi a nib, obse ou-se um aumen o da pe cen agem de células na ase G2/M de ce ca de 18 % e diminuição na ase G0/G1 (~25 %) (Figu a 28, C). Es as di e enças na espos a celula pode ão es a elacionadas com o ma cado aumen o da mo e celula que se obse ou com 15 µM de Tipi a nib (Figu a 28, D). 4. Resul ados 62 C D A Figu a 28 – G á icos ep esen a i os dos esul ados dos ensaios de ciclo e mo e celula ealizados pa a a linha celula T238 com di e en es concen ações de Tipi a nib (0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20; 25 µM). A e B. G á icos de ciclo e mo e celula , espec i amen e, ob idos pela lei u a das amos as no ci óme o de luxo e ep esen a i os de um ensaio. C e D. Resul ados de 4 e 3 ensaios ( ealizados em duplicado) de ciclo e mo e celula , espec i amen e, ob idos em duplicado após 48 h de incubação com Tipi a nib. *, p < 0,05. B 4. Resul ados 63 Com es a linha celula , ealiza am-se ambém ensaios de iabilidade pelo mé odo de exclusão do azul de ipano. Nes es ensaios oi u ilizada a concen ação mais baixa de Tipi a nib pa a a qual se obse ou um e ei o máximo nos ensaios de ciclo celula na ase G2/M com a linha celula C643. Como é possí el obse a na igu a 29, não se obse a am di e enças es a is icamen e signi ica i as no núme o o al de células iá eis ao longo do empo ela i amen e ao con olo. Figu a 29 – Resul ados dos 3 ensaios de iabilidade celula independen es ob idos às 24 h, 48 h e 72 h, após incubação da linha celula T238 com 0,1 µM de Tipi a nib. Ensaio de iabilidade, T238 Nº o al de células iá eis 4. Resul ados 64 Analogamen e, pa a a linha celula T235, com as di e en es concen ações de Tipi a nib es adas, não se obse a am di e enças ela i amen e ao con olo, excep o com a concen ação de 10 µM (Figu a 30, A e C). Com es a concen ação obse ou- se uma diminuição da pe cen agem de células em ase G0/G1 e um aumen o de ~10 % de células na ases G2/M (p < 0,05) (Figu a 30, A). Com 15 µM de Tipi a nib obse ou-se um ligei o aumen o da pe cen agem de células na ase G0/G1, que pode á es a elacionado com o aumen o da mo e celula (sem signi icado es a ís ico) (Figu a 30, B e D). Com as es an es concen ações de Tipi a nib, não se obse a am di e enças ele an es na mo e celula , em elação ao con olo (Figu a 30, D). 4. Resul ados 65 C D A B Figu a 30 – G á icos ep esen a i os dos esul ados dos ensaios de ciclo e mo e celula ealizados pa a a linha celula T235 com di e en es concen ações de Tipi a nib (0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15; 20; 25 µM). A e B. G á icos de ciclo e mo e celula , espec i amen e, ob idos pela lei u a das amos as no ci óme o de luxo e ep esen a i os de um ensaio. C e D. Resul ados de 4 e 3 ensaios ( ealizados em duplicado) de ciclo e mo e celula , espec i amen e, ob idos em duplicado após 48 h de incubação com Tipi a nib. *, p < 0,05. 5. Discussão 72 p og essão do ciclo celula , es udou-se ambém o e ei o des e compos o numa linha celula de ca cinoma di e enciado da i óide (BCPAP), e em células no mais de i óide (PCCL3), ambas sem al e ações epo adas em genes que codi icam CDKI. Após a amen o com 0,5 µM de Palbociclib, às 48h, obse ou-se uma edução de ce ca de 27 % no núme o o al de células iá eis na linha celula BCPAP. Num es udo de Teh e seus colabo ado es, ealizado em 2016, uma linha celula de melanoma com BRAF mu ado e delecção do gene RB1, mas sem mu ação no gene CDKN2A mos ou meno sensibilidade ao Palbociclib, quando compa ada com ou a linha com os genes RB1 e CDKN2A w , suge indo que a in eg idade uncional da p o eína Rb é impo an e pa a a acção des e compos o (80). Po ou o lado, o Palbociclib ambém oi es ado em linhas celula es de glioblas oma, que ap esen am equen emen e al e ações na ia ciclina D1-CDK4/6- Rb, endo sido obse ada uma diminuição da p oli e ação celula , apenas em linhas com a p o eína Rb uncional, independen emen e dos ní eis ele ados de CDK4 e CDK6 (81). Es es es udos mos a am que a acção do Palbociclib pode não se de ida apenas à inibição di ec a dos seus al os, CDK4/6, mas à sua acção indi ec a nou os egulado es do ciclo celula , como as p o eínas Rb e ciclina D1. Embo a a linha BCPAP de i e de um ca cinoma bem di e enciado (papila ), ap esen a um pe il mu acional mais p óximo dos ca cinomas pouco di e enciados e ATC, que inclui em concomi ância a mu ação p.V600E no gene BRAF e uma mu ação missense no gene TP53 (70, 82), o que pode ia jus i ica a espos a ao Palbociclib. Con udo a epos a ao compos o oi conside a elmen e meno do que nas linhas de ATC es adas. Es e esul ado co obo a a hipó ese de que a acção do Palbociclib pode á se mais p onunciada quan o maio o o núme o de al e ações em genes ele an es na egulação do ciclo celula . Os esul ados ob idos com as células de i óide no mal a adas e o çam es a hipó ese, uma ez que não se obse a am di e enças no núme o o al de células iá eis ela i amen e à condição não a ada. Nos es udos de mo e celula obse a am-se di e enças conside á eis ela i amen e à p esença ou ausência de mu ações nas linhas de ATC, após a amen o com o Palbociclib, nas concen ações mais al as es adas. Com 15 µM de Palbociclib a pe cen agem de mo e celula aumen ou ce ca de 60 %, na linha C643, con as ando 5. Discussão 73 com apenas 20 e 5 % nas linhas T238 e T235, espec i amen e. Es es esul ados suge i am que as linhas celula es que ap esen a am menos al e ações nos genes al o des e compos o pode iam se mais esis en es ao mesmo, o que es á de aco do com os esul ados an e io es. Resul ados semelhan es o am ambém ob idos no es udo de Huang e colabo ado es que obse a am, em linhas celula es de canc o gás ico, ambém um aumen o do núme o de células na ase G0/G1 do ciclo celula , mas sem e ei o signi ica i o na mo e celula , com 5 µM de Palbociclib. Nesse es udo, oi demons ada a inibição do c escimen o, e a diminuição da exp essão das p o eínas CDK4 e CDK6, em espos a ao Palbociclib, numa linha celula de canc o gás ico com mu ação no gene CDKN2A, em compa ação com uma linha celula w (83). O Palbociclib p omo e a sub-exp essão de cinases impo an es pa a a p og essão do ciclo celula (84), o que es á de aco do com a pa agem do ciclo celula que se obse ou no p esen e es udo. Es es esul ados são p omisso es uma ez que o Palbociclib pa eceu e um e ei o em linhas celula es de ATC que ap esen am di e sas al e ações em genes egulado es do ciclo celula . Adicionalmen e, suge iu pela p imei a ez que es e compos o pode ia se uma al e na i a no a amen o de doen es com canc o da i óide com al e ações em genes egulado es do ciclo celula . A é ao momen o, o Palbociclib não oi es ado em canc o da i óide, con udo, em sido es ado nou os ipos de canc o, es ando já em ensaios clínicos de ase II em canc o da mama, em ase I na Doença de non-Hodgkin (63) e em ensaios clínicos em di e en es ipos de canc o, ais como pulmão, o á io e p ós a a, com esul ados posi i os, demos ando semp e uma ac i idade an ip oli e a i a (61, 81). Em canc o do pulmão, o am ealizados ensaios clínicos em ase II, em 2015, em doen es com a p o eína Rb w e o gene CDKN2A inac i o, endo-se obse ado uma edução de ~30 % no diâme o das lesões umo ais al o (ClinicalT ials.go ID: NCT01291017). Em 2016, o am iniciados ensaios clínicos em ase II em canc o da p ós a a em doen es sem al e ações na ciclina D1 e na p o eína Rb (ClinicalT ials.go ID: NCT02905318) e ambém em 2016 o am iniciados ensaios clínicos em ase II em doen es com ca cinoma do o á io com a p o eína Rb uncional e baixa exp essão da p16 (ClinicalT ials.go ID: NCT01536743). 5. Discussão 74 Em 2014, num es udo com linhas celula es de ca cinoma colo- ec al, a adas com 1 µM de Palbociclib, oi ambém obse ado um aumen o do núme o de células na ase G0/G1 do ciclo celula e diminuição da exp essão da p o eína Rb os o ilada (85). Num es udo de Rihani e colabo ado es, ealizado em 2015, oi demons ado que o Palbociclib, como inibido das CDK4 e CDK6, p omo ia a inibição da ia ciclina D1- Rb (Figu a 33) e consequen emen e, le a a à indução da pa agem do ciclo celula na ase G0/G1. A p oli e ação celula das linhas de neu oblas oma es udadas diminuiu após o a amen o, ambém com 1 µM de Palbociclib, pela inibição da os o ilação da p o eína Rb. A hipo os o ilação da p o eína Rb de ido à inibição das CDK4/6 pelo Palbociclib le ou à inibição da ac i idade do ac o de ansc ição E2F (Figu a 33), endo-se obse ado uma diminuição da exp essão dos genes al o do E2F (TOP2A – DNA Topoisome ase II alpha, CCNE2 – ciclina E2 e TK1 – Thymidine kinase 1), essenciais pa a a sín ese de DNA e p og essão do ciclo celula . No e e ido abalho, os au o es p opuse am a u ilização do Palbociclib como uma o ma indi ec a de inibi a ciclina D1 e impedi assim, a p og essão umo al (86). Figu a 33 – Esquema ep esen a i o da acção do Palbociclib na ia ciclina D1/CDK4/6/ e inoblas oma du an e o ciclo celula [adap ado de (81)]. M,mi ose; G1, ase G1; S, ase S; G2, ase G2; Rb, e inoblas oma 1; CDK4/6, – cinases dependen es das ciclinas 4/6; P,g upo os a o. 5. Discussão 75 Ac ualmen e êm sido desen ol idos ensaios que isam a ap o ação pela FDA (Food and D ug Adminis a ion) da p imei a linha de a amen o de canc o da mama com Le ozol (inibido da enzima a oma ase) em combinação com o Palbociclib (58). Em doen es com canc o da mama a ançado, oi es ado o Palbociclib em combinação com o Le ozol e obse ou-se uma melho ia na sob e i ência média de ida em compa ação com o Le ozol isolado (87). Em melanomas cu âneos, as mu ações nos genes NRAS e BRAF p omo em a ac i ação das CDK4/CDK6 suge indo que inibido es como o Palbociclib podem esul a em bene ícios e apêu icos em combinação com inibido es do BRAF e/ou MEK (T ame inib), já ap o ados pela FDA. Es udos in i o mos a am que a pe da de unção da p16INK4A es á co elacionada com a sensibilidade ao Palbociclib (80). Em linhas celula es de melanoma com a p o eína p16INK4A não uncional e que ap esen am ele ada exp essão de CDK4 e ciclina D1 oi obse ada esis ência à inibição das CDK4 e CDK6 com o Palbociclib. A os o ilação da p o eína Rb e a exp essão da ciclina A2 diminuí am com a exposição dessas células ao a amen o com 0,5 µM de Palbociclib, ha endo ambém pa agem do ciclo celula em G0/G1, mas não indução de mo e celula . Também nes as linhas, oi es ada a combinação do Palbociclib com o T ame inib pa a es uda o e ei o do Palbociclib na mo e celula e os esul ados demons a am, igualmen e, diminuição da exp essão da p o eína Rb os o ilada, mas sem al e ações signi ica i as em p o eínas p o-apop ó icas (BCL-2) (80). O Palbociclib demons ou se um compos o in e essan e no a amen o do canc o da i óide, mas possi elmen e com um mecanismo de acção nou os al os molecula es, sendo que es udos desen ol idos po ou os g upos ão ao encon o dos esul ados ob idos nes e abalho. Assim, se á necessá io con inua a es uda o mecanismo de ac uação des e compos o nas 4 linhas celula es es adas e p ossegui pa a es udos de exp essão de RNA e de p o eínas essenciais na egulação do ciclo celula e em p ocessos apop ó icos. Se á necessá io a alia a exp essão das p o eínas Rb os o ilada e o al, da ciclina D1, das CDK4/6 e do ac o de ansc ição E2F po Wes e n Blo e a alia a exp essão dos genes al o desse ac o de ansc ição, de o ma a cla i ica qual o mecanismo de acção do Palbociclib que induz a pa agem do ciclo celula na ase G1 em linhas celula es de ATC. É expec á el que o a amen o com Palbociclib induza a hipo os o ilação da p o eína Rb e a sub-exp essão do ac o de ansc ição 5. Discussão 76 E2F, de ido ao bloqueio do ciclo celula obse ado na ansição da ase G1 pa a a ase S (Figu a 33) (63, 88). Nas linhas sem mu ações nos genes CDKN2A e CDKN2B, mas pa a as quais ambém se obse ou e ei o com o Palbociclib, se á necessá io es uda a exp essão de egulado es do complexo CDK4/6/ciclina D1 (p16, p15, p18, p21, p27 e p57), is o que podem es a en ol idos na pa agem do ciclo celula nessas linhas se es i e em sob e-exp essos. 5.2. Es udo do Tipi a nib O Tipi a nib é um dos FTI ( a nesil an e ase inhibi o s) em desen ol imen o, que se encon a em es udos mais a ançados (78), endo sido demons ado no p esen e es udo, que pode á se um compos o impo an e pa a inibição da p og essão umo al em linhas celula es de ATC. As cu as dose- espos a ob idas pelos ensaios MTS pe mi i am calcula o IC50 do Tipi a nib pa a as ês linhas celula es de ATC (C643, T238 e T235) e demons a am que a ci o oxidade do compos o dependia da concen ação u ilizada. Pa a o Tipi a nib, os alo es de IC50 ob idos pa a as linhas C643, T238 e T235 o am 15,2, 20,2 e 20,8 µM, espec i amen e. De aco do com as al e ações a ás desc i as pa a es as linhas celula es, es es esul ados suge i am que os alo es de IC50 es a iam elacionados com as mu ações no gene HRAS. Ou seja, a linha C643, sendo a única que ap esen a mu ação no gene HRAS, gene al o do Tipi a nib, ap esen ou o alo de IC50 mais baixo. Es es esul ados indica am que a linha C643 é mais sensí el à acção des e compos o, quando compa ada com as ou as linhas celula es, sendo necessá ia uma concen ação in e io de Tipi a nib pa a induzi 50% da inibição da iabilidade celula . Es udos ealizados em 2010, em linhas celula es de os eossa coma, ambém ap esen a am di e en es ní eis de sensibilidade ao Tipi a nib com concen ações en e 0,01 e 1 µM. Es a a iabilidade de espos as ao Tipi a nib ambém oi epo ado em canc o do pânc eas (89) e em leucemia mieloide aguda (AML), embo a com linhas celula es com NRAS e KRAS mu ado e com IC50 en e 19 e 134 nM (90). Em 2007 oi ambém es ado numa linha celula de canc o da mama com KRAS mu ado, 5. Discussão 77 ap esen ando um IC50 de 0,4 µM e le ando a uma pa agem do ciclo celula na ase G0/G1 (78). O Tipi a nib como inibido da ac i ação do gene RAS pode se um compos o impo an e na inibição da ia de sinalização RAS-RAF-MEK-ERK. Es a ia desempenha um papel undamen al na umo igénese, p oli e ação celula , apop ose e ambém na esis ência a á macos. Os inibido es des a ia pode ão se p omisso es como opções e apêu icas pa a o canc o (91), especialmen e em ATC que ap esen am mu ações em genes des a ia. As p o eínas Ras são pequenas GTPases que egulam o c escimen o, a di e enciação, a sob e i ência e a mo e celula . Um dos p incipais p ocessos de pós- adução en ol idos na ac i ação do RAS, a p enilação, é necessá ia pa a que oco a ans o mação das células, sendo po isso um al o impo an e pa a o desen ol imen o de no as e apêu icas con a o canc o. Exis em duas o mas de p enilação, a a nesilação e a ge anilge anilação, mediada, espec i amen e, pelos enzimas a nesil an e ase e ge anilge anil ans e ase. Os inibido es de a nesil ans e ase são pequenas moléculas que inibem a p enilação de múl iplas p o eínas, incluindo as p o eínas Ras, bloqueando a sua ac i ação, sendo que o Tipi a nib pe ence a es a classe de inibido es (92). A p o eína Ras depois de se p enilada, associa-se à memb ana celula uncionando numa ia de ansdução de sinal e al e nando en e a o ma ac i a (Ras-GTP) e a o ma inac i a (Ras-GDP). Todas as iso o mas do RAS, HRas, NRas e KRas, podem se a nesiladas. No en an o, as KRas e NRas ambém podem se p eniladas pela ge anilge anil ans e ase. Assim, NRas e KRas podem so e uma p enilação al e na i a pela ge anilge anil ans e ase, quando a a nesilação é inibida (92). As á ias iso o mas do gene RAS es ão en ol idas na ac i ação das ias e ec o as a a és de p ocessos bioquímicas dis in os, le ando po isso ao desen ol imen o de umo es com ca ac e ís icas di e en es e, consequen emen e, a espos as e apêu icas dis in as (93). De aco do com o mecanismo de acção acima desc i o pa a o Tipi a nib, os esul ados do p esen e es udo suge i am que es e compos o podia e um e ei o an i- umo al em células de ATC com HRAS mu ado (C643), que não oi obse ado em células de ATC sem essa mu ação (T238 e T235). 5. Discussão 78 Nes e es udo, quando se a a am as células com 0,1 µM de Tipi a nib obse ou-se, na linha C643, um aumen o de ce ca de 40 % de células na ase G2/M do ciclo celula . No en an o, pa a as es an es duas linhas celula es (T238 e T235) não se obse a am di e enças signi ica i as no ciclo celula , em elação ao con olo, com concen ações en e 0,1 e 10 µM des e compos o. Os ensaios de iabilidade celula con i ma am a espos a especí ica da linha C643 ao Tipi a nib, endo-se obse ado com 0,1 µM des e compos o, às 48 h, uma edução de ap oximadamen e 57 % do núme o de células iá eis, con as ando com a ausência de espos a das linhas T238 e T235. Es es esul ados suge i am que hou e pa agem do ciclo celula na ase G2/M, não se endo obse ado um aumen o da mo e celula . Em es udos ealizados po ou os g upos, oi desc i o que o Tipi a nib p omo ia o aumen o do núme o de células em apop ose em linhas celula es de melanoma com NRAS mu ado e em linhas celula es de mieloma múl iplo com HRAS e NRAS mu ado com concen ações en e 0,01 e 1 µM (90, 94). O Tipi a nib já oi es ado em ensaios clínicos de ase II em AML e de ase III na Doença de Hodgkin’s (68). Mandy Ge yk-Hall e colabo ado es, num es udo ealizado em 2010, em linhas celula es de os eossa coma, ambém obse a am que ha ia inibição do c escimen o celula ma cado po um aumen o do núme o de células em ase G2/M quando a adas com Tipi a nib (linha OS187 – sem mu ação no RAS). Assim, es es esul ados não demons a am especi icidade na espos a do Tipi a nib pa a mu ações no HRAS com concen ações en e 0,01 e 1 µM. Fo am es udadas ou as linhas celula es sem mu ação no RAS, mas com uma espos a in e io ao compos o (92). Em doen es com canc o da i óide (MTC e WDTC), o am es ados os ní eis de oxicidade do Tipi a nib em combinação com So a enib (inibido de ecep o es com ac i idade de i osina cinase) em ensaios clínicos de ase I (66). Es es es udos o am ealizados em doen es com umo es a ançados de PTC e FTC com mu ações somá icas nos genes BRAF e KRAS, espec i amen e, e em MTC com mu ações ge minais no gene RET, endo sido obse ada uma espos a na es abilização da doença, nes e úl imo caso de ido à inibição da p o eína RET pelo So a enib (66). O Ge i inib (inibido de EGFR) em combinação com o Tipi a nib oi es ado na linha C643, po F asca e colabo ado es em 2013, sendo que o Tipi a nib melho ou signi ica i amen e o e ei o 5. Discussão 79 do Ge i inib na iabilidade celula e inibiu quase po comple o a os o ilação da p o eína ERK, con a iamen e ao que oi obse ado com o Ge i inib isolado (69). Fo am ob idos os mesmos esul ados com o Ge i inib isolado pa a a linha BCPAP (com RAS w ), sendo que em combinação com o Tipi a nib não hou e qualque al e ação do e ei o, o que suge e especi icidade do Tipi a nib pa a a amen o de células umo ais com HRAS mu ado (69). Ou os es udos, em ensaios clínicos em ase I com Tipi a nib, e ela am espos as clínicas em adul os com leucemias agudas. Hou e diminuição do c escimen o e da p oli e ação celula , genes en ol idos na p oli e ação celula encon a am-se sub- exp essos após a amen o com o Tipi a nib, an o em amos as de doen es como em linhas celula es e hou e sob e-exp essão de genes en ol idos na adesão celula , ac i ação da apop ose e na espos a imune. No en an o, não hou e dis inção na espos a ao Tipi a nib en e linhas celula es de AML, não endo sido co elacionado o ipo de mu ação no RAS com a sensibilidade a es e compos o (90). Ou o inibido da a nesil ans e ase, o SCS66336, oi ambém es ado an e io men e e e elou-se mais e icaz em linhas celula es com HRAS mu ado, duas delas de ATC (C643 e H h83), compa a i amen e a linhas celula es ambém de ATC com NRAS (H h7) e KRAS (Cal62), que demons a am se mais esis en es. Pa a além de linhas de i óide, es e es udo oi ealizado ambém em linhas celula es de canc o da mama, bexiga e melanoma com HRAS mu ado, obse ando-se ambém inibição do c escimen o celula , mas não ha endo espos a nas linhas de i óide, pulmão e melanoma com mu ações nos genes NRAS e KRAS (18, 67). Es es es udos p é-clínicos demons a am que os inibido es do enzima a nesil ans e ase podem bloquea a acção des e enzima, necessá ia pa a a co ec a localização da p o eína Ras na memb ana da célula e inibi selec i amen e o c escimen o celula (18). Em 2012 o am ealizados ensaios clínicos de ase II em doen es pediá icos com neu o ib oma ose e com o gene RAS cons i u i amen e ac i o (ClinicalT ials.go ID: NCT00021541) e em doen es com leucemia lin ocí ica c ónica, em 2016, obse ando- se ausência de p og essão da doença (ClinicalT ials.go ID: NCT00082888). Os esul ados ob idos no p esen e abalho podem e ido ao encon o do que já oi desc i o em es udos an e io es, onde oi demons ado que, quando a a nesilação do HRAS mu ado é inibida pelo Tipi a nib, a sinalização a jusan e é consequen emen e 5. Discussão 80 inibida, esul ando na diminuição da sob e i ência e p oli e ação celula , sendo que as ou as iso o mas do RAS podem se p eniladas po ou o enzima, a ge anilge anil ans e ase (92), deixando de se inibidas po es e compos o. Os p esen es esul ados suge i am que o Tipi a nib pode se um compos o in e essan e a usa no a amen o de umo es com uma mu ação especí ica no gene HRAS, sendo que umo es com mu ações no NRAS e KRAS pode ão não esponde a esse compos o. Po ou o lado, o Tipi a nib e elou-se um compos o com pouco impac o na mo e celula das linhas es adas de ATC, excep o quando oi u ilizado a concen ação mais ele ada. Numa e apa seguin e, pa a escla ece quais os mecanismos molecula es subjacen es aos e ei os obse ados pa a o Tipi a nib nas linhas celula es de ATC, C643, T238 e T235, es udou-se a exp essão de genes en ol idos na egulação do ciclo celula , nas e e idas linhas. Po quan i icação ela i a (qRT-PCR) oi es udada a exp essão génica de genes en ol idos no con olo dos checkpoin s do ciclo celula na ase G1/S (CDK4, CDK6 e CCND1), S/G2 (CCNA2, CDK2), G2/M (CCNA2, CDC2) e M (CCNB1, CDC2) de o ma a a alia po ou os mé odos o e ei o Tipi a nib no ciclo celula . A selecção des es genes baseou-se em es udos an e io es da egulação dos checkpoin s do ciclo celula na ase G2/M (95-98). O complexo ciclina D/CDK4/CDK6 é ac i ado po ac o es mi ó icos e pe mi e a ansc ição de genes necessá ios pa a a p og essão da ase G1 pa a a ase S, sendo que após a en ada da célula na ase S, es e complexo deixa de se necessá io. Du an e a ansição da ase G1 pa a a ase S, o complexo ciclina E/CDK2 é ac i ado; Na ase S, a ciclina A liga-se à CDK2 pe mi indo a ansição de ase pa a G2. A ciclina A pode liga -se ambém à Cdk1 du an e a ansição da ase G2 pa a a ase M. O complexo ciclina B/CDK1 (Mi osis P omo ing Fac o ) ambém ac ua du an e a ansição da ase G2 pa a a ase M e, se es e complexo es i e sob e-exp esso, as células en am em Mi ose, sendo ambém necessá io ha e deg adação das ciclinas A e B1 pa a oco e essa ansição (Figu a 34) (99). Enquan o que as CDK es ão p esen es ao longo do ciclo celula , a concen ação das ciclinas ai aumen ando e diminuindo, sendo, po ezes, necessá ia a sua deg adação pa a que oco a ansição de ases, excep uando a ciclina D1 (Figu a 35). 5. Discussão 81 Figu a 34 – Esquema ep esen a i o da elação en e ciclinas e CDK du an e o ciclo celula [adap ado de (99)]. Figu a 35 – Concen ação ela i a das di e en es ciclinas ao longo do ciclo celula [adap ado de (100)]. 7. 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Cul u a de células O manuseamen o das células oi semp e ealizado em ambien e es é il, numa câma a de luxo lamina (Mic o low Biological Sa e y Cabine , In e med®) e odas as células o am man idas numa es u a (Nuai eTM US Au o low CO2 Wa e -Jacke ed Incuba o ), num ambien e humidi icado, a 5 % CO2 e à empe a u a de 37 °C. Todos os meios e eagen es (alíquo as de soluções s ock) o am conse ados a 4 °C e, an es de usa , o am aquecidos a 37 °C de o ma a e i a que as a iações de empe a u a causassem s ess celula . Pa a man e a es e ilidade, odos os eagen es o am abe os e echados den o da câma a de luxo lamina . A obse ação das células oi ei a a a és de um mic oscópio in e ido Axio e 135 (Zeiss, Alemanha). 8.1.2. Descongelação das células O DMSO é um c iop o ec o que eduz o con eúdo aquoso das células p e enindo a o mação de c is ais de gelo, que pode iam le a à lise celula du an e o p ocesso de congelação. A descongelação das células de e se um p ocesso ealizado apidamen e de o ma a e i a que oco am danos na memb ana celula . F ascos Reagen es T-75 (mL) 96 poços (µL) 12 poços (µL) 6 poços (µL) PBS 7 - 500 1000 T ipsina-EDTA 1,5 - 150 300 Meio de cul u a suplemen ado com 10% FBS pa a neu aliza a ipsina 8,5 - 250 500 Volume inal 15 100 1000 2000 Placas Tabela A.I – Volumes dos eagen es usados na cul u a de células e nos ensaios de aco do com o amanho do asco/placa. 8. Anexo I 94 8.1.3. C iop ese ação das células A solução de congelação e a compos a po FBS com DMSO 10% ( / ) (Sigma- Ald ich). A congelação oi ei a com a empe a u as de o ma g adual, pa a e i a a mo e celula . 8.1.4. P opagação e expansão das células O PBS é uma solução salina u ilizada na passagem das células com obje i o de man e as células em condições óp imas de pH no cu o pe íodo em que as células são manipuladas. Pa a além des a solução pe mi i a emoção de células mo as e de esíduos de so o que pode iam inibi a ipsina, não con ém ca iões di alen es (como po exemplo, Ca2+ e Mg2+) que ac uam como inibido es da ipsina. Assim, a ipsina- EDTA causa a dissociação das ligações en e as células (ade en es) e das células à supe ície do asco. Pa a além disso, o EDTA (ácido e ilenodiamino e a-acé ico) p esen e na solução de ipsina, sendo um agen e quelan e, pe mi e que oco a inac i ação dos es an es iões di alen es que possam es a p esen es no meio, o que aumen a a e icácia de dissociação das células. 8.2. Compos os es ados Tabela A.II – In o mações de massa, solubilidade e concen ações dos s ocks de Palbociclib e Tipi a nib. Palbociclib Tipi a nib Massa do p odu o (mg) 10 10 Massa molecula (g/mol) 483,99 489,4 Solubilidade a 25°C em água (mM) 61,98 2,04 Solubilidade a 25°C em DMSO (mM) 6,2 28,6 Concen ação da solução s ock (mM) 620 Volume da solução s ock (mL) 3,444 1,022 8. Anexo I 95 8.3. Ensaio de iabilidade me abólica celula Figu a A.1 – Exemplo de esquema de dis ibuição de di e en es concen ações do compos o e con olos em placas de 96 poços usadas nos ensaios de iabilidade, nes e caso pa a o compos o Tipi a nib (Tip) . Os eplicados o am colocados na ho izon al, sequencialmen e pa a uma melho uni o midade en e éplicas. A concen ação do compos o/poço a iou de 0,1 a 25 µM. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Con olo 10 µM Tip 10 µM Tip 10 µM Tip Con olo C 0.1 µM Tip 0.1 µM Tip 0.1 µM Tip Con olo D 0.5 µM Tip 0.5 µM Tip 0.5 µM Tip 15 µM Tip 15 µM Tip 15 µM Tip Con olo E Con olo 20 µM Tip 20 µM Tip 20 µM Tip Con olo F 1 µM Tip 1 µM Tip 1 µM Tip Con olo G 5 µM Tip 5 µM Tip 5 µM Tip 25 µM Tip 25 µM Tip 25 µM Tip Con olo H B anco B anco B anco 8. Anexo I 96 8.4. Es udo do ciclo celula po ci ome ia de luxo A ci ome ia de luxo u iliza p incípios de dispe são da luz em pa ículas que são a a essadas po um eixe de luz. Os luo oc omos ligados a moléculas especí icas nas células podem se exci ados e emi i luo escências com equências di e en es, pe mi indo iden i ica di e en es populações de células, que se encon em em di e en es ases do ciclo celula ou em apop ose ou nec ose (102). A ci ome ia de luxo (FACS – Fluo escence-Ac i a ed Cell So ing) pode se u ilizada pa a a alia a p oli e ação celula a a és da quan i icação da p opo ção de células nas di e en es ases do ciclo celula pa a uma de e minada população de células. O con eúdo de DNA numa célula em ase G0/G1 co esponde ao DNA de células diploides. Po ou o lado, as células an o em ase G2 como em ase M (mi ó icas) êm o dob o da quan idade de DNA que exis e na ase G1, não sendo possí el dis ingui en e a ase G2 e a ase M pelo con eúdo em DNA ( igu a A.2) (103). Na análise po ci ome ia de luxo, as células são pe meabilizadas e ma cadas com iode o de p opídio (PI). O PI é um agen e in e calan e (co an e luo escen e), que se inco po a no DNA, pe mi indo quan i ica o con eúdo de DNA numa população de células nas di e en es ases do ciclo celula . A in ensidade de luo escência das células co adas, com comp imen os de onda especí icos, es á elacionada com a quan idade de DNA. Assim, como a quan idade de DNA duplica du an e a ase S do ciclo celula , a quan idade ela i a de células em G1/G0 e G2/M pode se de e minada, sendo que em G2/M co esponde á ao dob o da quan idade de DNA em G1/G0 (104). Figu a A.2 – Va iação da quan idade de DNA na célula ao longo do ciclo celula . [adap ado de (105)]. 8. Anexo I 97 8.5. Es udo da mo e celula po ci ome ia de luxo A nec ose é a mo e pe manen e das células, causada maio i a iamen e po ac o es ex e nos, ais como, oxinas, hipoxia ou lesões memb ana es (106). Po ou o lado, a apop ose, designada ambém como mo e celula p og amada, az pa e do p ocesso isiológico da célula esul ando em á ias al e ações celula es: condensação do ci oplasma, agmen ação da c oma ina nuclea , pe da de in eg idade e assime ia da memb ana, esul ando consequen emen e na exposição da os a idilse ina (PS) na camada ex e na da bicamada os olipídica da célula. Assim, a PS pode se de ec ada pela anexina-V que se liga especi icamen e a PS na p esença de cálcio ( igu a A.3) (107). O PI é um agen e in e calan e que ma ca as células mo as po ligação aos ácidos nucleicos das células nec ó icas, sendo que as células i as e p é-apop ó icas não são pe meá eis a es e ma cado (108). Figu a A.3 – Rep esen ação esquemá ica da de ecção de células apop ó icas po ligação da anexina-V à os a idilse ina [adap ado de (22)]. 10. Re e ências bibliog á icas suplemen a es 105 10. Re e ências bibliog á icas suplemen a es 102. Ma ah A, Hue O, Galle P-F, Ra inaud M-H. 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