Contributo para a caracterização molecular de Echinococcus granulosus em Portugal

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS, Especialidade de Biologia Molecula em Medicina T opical e In e nacional CONTRIBUTO PARA A CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EM PORTUGAL SÍLVIA FILIPA ALVES BEATO 2008 UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL CONTRIBUTO PARA A CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EM PORTUGAL SÍLVIA FILIPA ALVES BEATO Tese ap esen ada pa a a ob enção do g au de Mes e em Ciências Biomédicas, especialidade de Biologia Molecula em Medicina T opical e In e nacional ORIENTADORA: PROFª DOUTORA MARIA AMÉLIA A. GRÁCIO CO-ORIENTADORA: PROF.ª DOUTORA MARIA MANUELA CALADO 2008 UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL Publicações no âmbi o des e abalho: SÍLVIA BEATO, MARIA MANUELA CALADO, ISABEL CLEMENTE & MARIA AMÉLIA AFONSO GRÁCIO. 2008. Molecula cha ac e iza ion o Echinococcus g anulosus s ains in Po ugal. Comunicação O al ap esen ada no X h Eu opean Mul icolloquim o Pa asi ology, 24-29 Agos o. Pa is. Abs ac n . SY20/0201, page 103. SÍLVIA BEATO, MARIA MANUELA CALADO, ISABEL CLEMENTE & MARIA AMÉLIA AFONSO GRÁCIO. 2008. Ca ac e ização molecula de es i pes de Echinococcus g anulosus exis en es em Po ugal. Comunicação O al ap esen ada no Cong esso Nacional de Doenças In ecciosas e Mic obiologia Clínica, Sida e Pa asi ologia, 8-11 Ou ub o. Vilamou a. Resumo nº OC03, página 33. Resumo Es es úl imos dois anos êm sido mui o impo an es na minha o mação cien í ica e p o issional, pois i e o p i ilégio de me c uza com pessoas ex ao diná ias que pe mi i am que eu pudesse ealiza es e p ojec o a é ao inal. A odas elas o meu since o ag adecimen o: À minha o ien ado a, P o esso a Dou o a Ma ia Amélia G ácio pelo conhecimen o pa ilhado comigo ao longo da ealização des e abalho e pela sua disponibilidade. À P o esso a Dou o a Ma ia Manuela Calado pelos ensinamen os no labo a ó io e ajuda semp e que necessi ei. À Técnica P incipal Isabel Clemen e incansá el nos ensinamen os e na ajuda p es ada, es ando semp e pacien emen e disponí el desde o p imei o momen o. À In es igado a Auxilia Alcione T inca pelos aliosos conselhos e momen os de aleg ia pa ilhados. A oda a Unidade de Helmin ologia e Malacologia Médicas pelo acolhimen o que demons a am azendo-me sen i em casa. Aos Mes es Ped o Fe ei a e Cá ia Fe ei a pela paciência que i e am em me ajuda quando e a necessá io. À Pa ícia e à Ma iana pelas nossas inúme as ho as de abalho e en eajuda que o am undamen ais e acima de udo à amizade que daqui nasceu. Às colegas de mes ado, e acima de udo amigas, Jacin a, Ana Ca ina e Ana Isabel, po e em es ado p esen es em odos os momen os. Ao Dou o Ba ei a Júnio pela disponibilidade em ajuda a ob e as au o izações necessá ias pa a e acesso às amos as. Resumo Aos se iços e e iná ios na pessoa da Dou o a Ana, Dou o a O ília e Dou o Hen ique pela disponibilidade pa a a ecolha das amos as necessá ias pa a a ealização do es udo. Ao P o esso P e o Ribei o e a odos os uncioná ios da Escola Supe io de Saúde D . Lopes Dias pela disponibilidade e paciência que demons a am e pelo apoio que me de am. À Liliana pela ajuda e apoio que me deu quando e a necessá io. A odos os meus amigos e colegas que de alguma o ma me ajuda am com conselhos e amizade e mui as ezes i e am de a u a o meu mau ei io. Ao casal Helena e Jo ge Mon ei o pelos conselhos, amizade e disponibilidade pa a me ou i em. Aos meus pais po semp e es a em quando é necessá io e pelo que ep esen am pa a mim. A odos aqueles que de modo di ec o ou indi ec o me de am apoio e o ça pa a con inua a lu a pelos meus sonhos sabendo que o im das coisas em semp e um sabo melho quando emos os amigos e dadei os ao nosso lado. E po im, mas sendo o mais impo an e, a Deus que sem Ele não se ia possí el pois se não me gua dasse nas mui as iagens que iz nes es anos e não me desse in eligência e disce nimen o pa a le a a bom e mo es e abalho isicamen e e ia desis ido. Resumo A Equinococose/hida idose – doença causada pela ase la a (hidá ide – ulga men e conhecida como quis o hidá ico) do ces ode Echinococcus g anulosus – é uma das zoonoses mais comuns e encon a-se en e as de maio impo ância médica e e e iná ia. Tem uma oco ência em ecossis emas a iados e a boa adap ação do pa asi a a di e sos hospedei os con ibui pa a a biodi e sidade, com o apa ecimen o de a iações gené icas in aespecí icas ou “es i pes”. De ac o, á ios es udos demons a am a exis ência de dez di e en es es i pes/genó ipos (G1 a G10) indo, assim, con i ma a di e enciação e ec uada po c i é ios mo ológicos, biológicos e bioquímicos. A ca ac e ização molecula em pe mi ido cla i ica a epidemiologia e melho a o con olo des a zoonose, em di e en es países. A maio ia das es i pes conhecidas de E. g anulosus pode in ec a os humanos (p incipalmen e a G1, mas ambém G2, G5, G6, G7, G8 e G9) com maio ou meno g a idade. O p incipal objec i o des e es udo é iden i ica os genó ipos de E. g anulosus ci culan es nos hospedei os in e mediá ios, em Po ugal, dado que não exis e ainda nenhum es udo molecula sob e iden i icação de es i pes des e pa asi a, em Po ugal. As amos as o am isoladas de ígados e pulmões, ecolhidos em ma adou os, a pa i de animais domés icos, como o inos e bo inos, na egião cen o de Po ugal. Foi ei a a ex acção de DNA de odas as amos as e, es e, oi subme ido a écnicas molecula es com base na ampli icação da egião ITS-1 (ITS1-PCR), Eg9-PCR e Eg16-PCR, às quais o am aplicadas di e en es enzimas ais como a Rsa I, a C o I, a Msp I e a Taq I. Pa a con i mação oi ei a, pos e io men e, a sequenciação de uma egião do genoma mi ocond ial que codi ica o gene ci oc omo oxidase c sub- unidade 1 (COI). Os esul ados ob idos mos a am que o genó ipo p esen e nas amos as es udadas (de o inos e bo inos) é o G1 (es i pe o ina). De ido ao econhecimen o des a es i pe como in ecciosa pa a os humanos, a p esença da mesma em Po ugal demons a a impo ância que a hida idose pode assumi como p oblema de saúde pública. Abs ac Cys ic echinococcosis – caused by he la al s age (hyda ic cys ) o he ces ode Echinococcus g anulosus - is one o he mos widesp ead zoonoses o e e ina y and medical impo ance. Nume ous s udies ha e shown ha E. g anulosus exis s as a complex o s ains di e ing in a wide a ie y o c i e ia. Ten dis inc geno ypes (G1-G10) ha e been iden i ied wi h impac on pa hology, epidemiology and con ol o cys ic hyda ic disease. Ou main objec i e was o iden i y Po uguese geno ypes o E. g anulosus. In Po ugal, no molecula gene ic yping s udy has been ca ied ou o clea ly iden i y he pu a i e s ains ansmi ed. Pa asi e samples we e isola ed om li e and lung, in slaugh e houses, om domes ic animals such as sheep and ca le, om many egions o Po ugal. The samples we e submi ed o molecula echnics using ITS1-PCR, Eg9-PCR, Eg16-PCR and Eg9-PCR linked es ic ion agmen leng h polymo phism (RFLP). Some samples we e submi ed o he sequencia ion using p ime s o COI gene. The only s ain iden i ied was G1 (Sheep s ain). Since his is he mos in ec ious s ain o humans we a e in on o public heal h p oblem. Índice Ag adecimen os……………………………………………………………………………. i Resumo……………………………………………………………………………………... i Abs ac …………………………………………………………………………………….. ii Índice ge al……………………………………………………………………………….... iii Índice de Figu as………………………………………………………………………….... xi Índice de Tabelas…………………………………………………………………….…….. xi Ab e ia u as ……………………………………………………………………………..…x Capí ulo I - In odução 1 1.1 – Dis ibuição Geog á ica 2 No Mundo 2 Em Po ugal 7 1.2 – O Pa asi a 9 1.2.1 – Sis emá ica 9 1.2.2 - Mo ologia 10 1.2.3 - Especiação 14 1.2.4 – Sub-Especiação 15 1.3 – Ciclo de Vida 17 1.4 – Pa ologia 21 Índice 1.5 – Diagnós ico 22 1.5.1 – Clímico 22 1.5.2 – Imagiologia 24 1.5.3 – Diagnós ico Labo a o ial T adicional 25 1.5.4 – Diagnós ico Molecula 26 1.6 – T a amen o 32 Capí ulo II – Objec i os 33 Objec i os 34 Capí ulo III – Ma e ial e Mé odos 35 3.1 - Ob enção e anspo e do ma e ial biológico pa asi ado 36 3.2 - Ob enção dos p o oescólices 36 3.3 – Análise molecula das amos as pa asi adas 39 3.3.1 – Ampli icação dos p odu os ex aídos 40 3.3.2 – Elec o o ese em gel de aga ose 43 3.3.3 - Enzimas de Res ição 44 3.3.4 – Pu i icação e sequenciação dos p odu os ampli icados 46 Capí ulo IV – Resul ados 47 4.1 – Análise das amos as pa asi adas 48 4.2 – Análise molecula das amos as pa asi adas 53 4.2.1 – Ampli icação da Região ITS-1 53 4.2.2 – Aplicação de enzimas de es ição à egião ITS-1 57 Capí ulo I - In odução Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de 1.1 – Dis ibuição geog á ica No mundo: Desde há mui os anos que se sabe que o capacidade de adap ação a hospedei os, que de ini i os que a cons an e in odução de animais domés icos da Eu opa nou as pa es do mundo ice- e sa, em ei o com que a dis ibuição des e pa asi a seja ala (Romig, 2003). Assim, podemos encon a e idências da sua p esença desde o no e do Á c ico a é ao sul da Te a do Fogo, na A gen ina, ap esen ando uma dis ibuição cosmopoli a com di e sos ní eis de p e alência que no homem que nos anima (Zanini e al., 2006a e Zanini dissemina po ou as zonas do globo onde an e io men e não e a encon ado que a hida idose/equinococose endo sido co nside ada ambém uma doença de i Hänel, 2003). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Dis ibuição geog á ica Desde há mui os anos que se sabe que o E.g anulosus em uma ele ada capacidade de adap ação a hospedei os, que de ini i os que in e mediá ios e, po isso, a cons an e in odução de animais domés icos da Eu opa nou as pa es do mundo em ei o com que a dis ibuição des e pa asi a seja ala gada Assim, podemos encon a e idências da sua p esença desde o no e do Á c ico a é ao sul da Te a do Fogo, na A gen ina, ap esen ando uma dis ibuição cosmopoli a com di e sos ní eis de p e alência que no homem que nos anima Zanini e al., 2006b). O pa asi a ap esen a uma endência em se dissemina po ou as zonas do globo onde an e io men e não e a encon ado , le ando a hida idose/equinococose seja bem conhecida nos di e en es con inen es da nside ada ambém uma doença de i mig an es (Ch ieki, 2002 e em Po ugal In odução 2 em uma ele ada in e mediá ios e, po isso, a cons an e in odução de animais domés icos da Eu opa nou as pa es do mundo e (Figu a 1) Assim, podemos encon a e idências da sua p esença desde o no e do Á c ico a é ao sul da Te a do Fogo, na A gen ina, ap esen ando uma dis ibuição cosmopoli a com di e sos ní eis de p e alência que no homem que nos anima is uma endência em se , le ando a bem conhecida nos di e en es con inen es da e a, Rae he & Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 3 Na Aus ália ac edi a-se que enha sido in oduzido a a és da impo ação de milha es de o elhas me inas o iundas da egião de Espanha em meados de 1800. De ido à comple a igno ância da população ace ca do pad ão de ansmissão e da impo ância pa a a saúde pública do E.g anulosus e, ainda, da abundância de po enciais hospedei os, o pa asi a disseminou-se apidamen e no gado e cães aus alianos e po ol a de 1860, a hida idose humana e a conside ada o maio p oblema de saúde pública na egião (Jenkins, 2006). Um dos ac os de g ande impo ância pa a o es abelecimen o e pe pe uação do E.g anulosus na Aus ália oi a capacidade do pa asi a pa a se inco po a nos animais na i os sel agens exis en es na Aus ália, pe mi indo a sua ansmissão e manu enção do ciclo de ida (Jenkins, 2006). Em elação ao con inen e Ame icano, a hida idise/equinococose oco e de o ma disseminada desde o Alasca, na Amé ica do No e, a é à Pa agónia, na Amé ica do Sul. No No e da Amé ica há casos de hida idose desc i os no Canadá, Alasca e ou as egiões p o ocados pela es i pe dos ce ídeos (G8), ou es i pe sil á ica do No e (Thompson e al., 2006). O pa asi a man ém o seu ciclo de ida a a és de cães e lobos, como hospedei os de ini i os, e alces (Alces alces), ca ibus (Rangi e a andus) e ou os ce ídeos, não in ec ando ungulados domés icos. Nos USA (excep o Alasca), o am diagnos icados casos de hida idose em imig an es que adqui i am a doença nos seus países de o igem, exis indo ocos au óc onos que en ol iam a ansmissão a a és de a iados animais domés icos e sil á icos, exis en es nes as egiões (Mo o & Schan z, 2006). Di e sos ocos de ansmissão de E.g anulosus pa ecem e sido encon ados nos anos 70, do século XX, nos es ados do Oes e dos USA (Cali ó nia, U ah, No o México Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 4 e A izona), le ando os in es igado es a conclui que es es ocos es a iam associados unicamen e às p á icas cul u ais que en ol iam o aba e de o inos e o acesso dos cães às ísce as dos mesmos (Mo o & Schan z, 2006). Di e sos genó ipos de E.g anulosus pa ecem e sido in oduzidos a a és de gado impo ado, como no caso dos genó ipos dos o inos e dos suínos, endo-se es abelecido e adap ado ao gado local. No México e Amé ica Cen al pouca in o mação exis e ace ca da dispe são des a pa asi ose e suas ias de ansmissão, ha endo alguns es udos no México que apon am pa a uma baixa p e alência des a doença (Palacio-Ruiz e al., 2003 e Ma a-Mi anda e al., 2007) e ambém pa a o apa ecimen o de casos au óc onos (Ma a illa e al., 2004). Na Amé ica do Sul, a hida idose é uma doença la gamen e disseminada em di e sos países como Chile, B asil, A gen ina (Kamene zky e al., 2002 e Pie angeli, e al., 2007), en e ou os. Na A gen ina es ão desc i as qua o es i pes capazes de in ec a humanos: es i pe dos o inos (G1), es i pe da o elha da Tasmânia (G2), es i pe bo ina (G5) e a es i pe do camelo (G6). A es i pe dos suínos (G7) a ec a apenas po cos e cães, não endo sido desc i o nenhum caso em humanos (Kamene zky e al., 2002). Em países como o Pe ú (Almeida e al., 2007), Bolí ia, U uguai (Cab e a e al., 1995), Colômbia, Equado e Venezuela, es a pa asi ose não em sido conside ada um p oblema de saúde pública, ha endo apenas alguns casos epo ados, que podem se impo ados (Mo o & Schan z, 2006). Em elação à si uação p esen e na Ásia Cen al, conside a-se a hida idose /equinococose como uma doença e-eme gen e, pois de ido ao colapso da ex-URSS hou e di e sas ees u u ações. Nes as ees u u ações oi diminuído o con olo e e iná io nos ma adou os, podendo passa ó gãos pa asi ados pa a o me cado. A população canina aumen ou bas an e an o nas á eas u ais como u banas. Es es ac o es Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 5 mais a lacuna na a aliação dos p oblemas de saúde pública exis en es le a am a um aumen o na ansmissão da hida idose em oda es a egião (To ge son e al., 2006). No es o do con inen e Asiá ico a hida idose encon a-se bas an e disseminada ha endo es udos ace ca de es i pes ci culan es na China, que pa ecem se apenas a G1 e G6, não es ando escla ecida a o ma de disseminação (McManus e al., 1994; Zhang e al., 1998; Yang e al., 2005; Ba e al., 2006; Zhang e al., 2006 e Li e al., 2008). No con inen e A icano e Médio O ien e a hida idose é uma doença al amen e endémica, em e mos ge ais (Magambo e al., 2006 e Sadjjadi, 2006), es ando desc i a desde países da Á ica O ien al a é à Á ica Ociden al e sendo, no en an o, conside ada algo a a ou não documen ada em países da Á ica Cen al e Sudoes e a icano. Pelo menos cinco das dez es i pes de E.g anulosus (G1-G10) são in ecciosas pa a humanos na Á ica Sub-Saha iana, sendo que as mais comuns são a es i pe o ina (G1) e a es i pe do camelo (G6). A es i pe do ca alo (G4 ou E.equinus), es i pe bo ina (G5 ou E.o leppi) e, p o a elmen e, a es i pe do leão ambém são encon adas nes a egião (Hü ne e al., 2008 e Magambo e al., 2006). Exis e a possibilidade de na egião sub- saha iana co-exis i em ou as es i pes de E.g anulosus nos animais sel agens/domés icos e humanos (Magambo e al., 2006). Nos países do No e de Á ica e Médio O ien e o E.g anulosus ap esen a uma ele ada axa de p e alência (Ba donne e al., 2003, Azla & Dakkak, 2006 e Ok e al., 2007), sendo a hida idose al eola menos p e alen e que a hida idose hepá ica (Oudni e al., 2004). Di e sos es udos indicam que os quis os hidá icos são encon ados em o inos, bo inos e cap inos, sendo desc i as di e sas es i pes nes a egião, como po exemplo: as es i pes o ina (G1), equina (G4) e do camelo (G6), en e ou as (Sadjjadi, 2006). No Médio O ien e es á documen ada a exis ência de pelo menos duas es i pes (G1 e G6) no I ão Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 6 (Zhang e al., 1998), al como no I aque, Líbano, Sí ia, en e ou os países (Sadjjadi, 2006). Na Eu opa, a hida idose encon a-se com uma p e alência mui o baixa em de e minadas egiões (No e e Cen o) mas com uma p e alência média a ele ada nas egiões do Sul, Sudes e e O ien e (Ecke e al., 2001). Casos humanos de hida idose oco em de o ma espo ádica, localizados no sul da Eu opa e alguns casos na zona de pas o eio do Reino Unido (Ecke & Depplazes, 2004), ainda que no País de Gales haja e e ência pa a a eeme gência de E.g anulosus no hospedei o de ini i o (cão) (Buishi e al., 2005). Es es ocos pa ecem coincidi com a dis ibuição da es i pe das o elhas (G1), o que em supo a a hipó ese de que es a é a es i pe com maio in ecciosidade pa a os humanos (Jenkins e al., 2005 e Romig e al., 2006). No cen o da Eu opa es ão p esen es as es i pes G6-G10, sendo que a mais comum é a es i pe do po co (G6), e e enciada como não in ecciosa pa a humanos, apesa de já ha e dados a con a ia em es a in o mação (Pawlowski & S e aniak, 2003). Na Bulgá ia, segundo B eye e al. (2004), ambém es á p esen e a es i pe G1. No No e da Eu opa oi desc i a uma no a es i pe que in ec a os ce ídeos (G10) (La ikainen e al., 2003 e Hi el-Koski e al., 2003), pa ecendo e uma baixa in ecciosidade em humanos (Romig, e al., 2006). As ou as es i pes de E.g anulosus podem se encon adas de o ma mais ou menos alea ó ia, mas não há ocos desc i os pa a as mesmas. Toda a egião medi e ânica é conside ada como de ele ada endemicidade ha endo mais que um genó ipo em ci culação (Euzéby, 1991; Siles-Lucas e al., 1996; Mwambe e e al., 2004, Ga ippa, 2006, Capuano e al., 2006, Va casia e al., 2006, Va casia e al 2007, Casulli e al., 2008, Rinaldi e al., 2008, Ca mena e al., 2008 e Va casia e al., 2008). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 7 Em Po ugal: O p imei o caso de hida idose em Po ugal oi desc i o no Séc. XIX, po Filipe F ança, em e as alen ejanas (T inca, 2001) e, desde aquela al u a que a hida idose em sido al o de di e sos es udos pelos in es igado es po ugueses. Nos anos 30, do Séc. XX, oi publicado um es udo po Cabeça & Vila em que oi ei o um le an amen o dos casos humanos de hida idose egis ados em alguns hospi ais nacionais, no pe íodo comp eendido en e o inal do Séc. XIX e a al u a da publicação do mesmo (Jo ge, 2000 e T inca, 2001). Nos anos seguin es ou os es udos o am ealizados com o in ui o de conhece melho a ealidade em elação à hida idose an o em animais como em humanos. Pa a al, in es igado es como T opa & Pego (1938), Fe ei a e al. (1945) e Lei ão (1960) ap esen a am es udos quan o à p esença do pa asi a em cães, desc e endo-a de o ma mais po meno izada e ecendo algumas conside ações epidemiológicas (Jo ge, 2000). Bo ges Fe ei a (1980) conside ou que do pon o de is a epidemiológico, o ciclo cão/o ino e a o maio esponsá el pela hida idose humana, não só pela equência mas ambém po que os quis os de o inos e am quase semp e é eis, enquan o os quis os p o enien es do ciclo cão/bo ino e am ge almen e in é eis (Da id de Mo ais, 1998, T inca, 2001). No deco e do Séc.XX mui os in es igado es po ugueses o am con ibuindo pa a o conhecimen o da hida idose em Po ugal, p incipalmen e no campo da epidemiologia. Apesa de nunca e sido ealizado um es udo epidemiológico que englobasse odo o país, di e sos es udos o am ealizados em algumas egiões con inen ais, dos quais e e i emos os que conside amos impo an es nes e con ex o. Em 1985, Da id de Mo ais e al., eali a am um es udo se o-epidemiológico, na egião do Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 8 Al o Alen ejo, endo ob ido uma p e alência de ce ca de 3% de posi i idade pa a hida idose. Jo ge (2000) ealizou um es udo epidemiológico no dis i o de Cas elo B anco e concluiu que a egião sul do dis i o e a conside ada uma zona hipe endémica pa a a hida idose humana, segundo as no mas da OMS, pois a pe cen agem de amilia es e/ou indi íduos izinhos de pacien es ope ados ou com p o as se ológicas posi i as pa a hida idose e a de ap oximadamen e 3%. Da id de Mo ais (2007) ap esen ou um es udo epidemiológico ela i o ao dis i o de É o a, e e en e ao pe íodo 1979/2003, no qual concluiu que es e dis i o e a, de ac o, hipe endémico pa a a hida idose, endo ambém e e ido as zonas No e e Cen o de Po ugal como hipoendémicas e a Região de Lisboa e Vale do Tejo como mesoendémica. Em elação à hida idose animal, Da id de Mo ais (1998) ap esen ou índices hidá icos em o inos, bo inos e suínos aba idos em di e sos ma adou os nacionais e com hida idose, num pe íodo comp eendido en e 1944/1968, os quais a ia am en e 0,3% no dis i o de Cas elo B anco e 6,2% no dis i o do Po o (não endo sido incluídos os ma adou os municipais de Lisboa e do Po o). Em e mos de equinococose êm sido e e idas di e en es axas de p e alência a iando en e 0% e 40%, e e en es a di e sos es udos ealizados a ní el de Po ugal con inen al, sendo que os mé odos u ilizados o am di e en es (T inca, 2001). Da id de Mo ais (1998) ap esen ou uma e isão bibliog á ica dos abalhos sob e hida idose ealizados em Po ugal nas á ias e en es: clínica, se ológica, epidemiológica (humana e animal), e c. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 9 Pe an e os á ios abalhos já publicados em e sob e Po ugal con inen al, pode- se dize que a hida idose es á p esen e de no e a sul do país ap esen ando uma maio p e alência no Alen ejo. 1.2 - O Pa asi a 1.2.1 - Sis emá ica Em 1801, Rudolphi es abeleceu de o ma de ini i a o géne o Echinococcus, pala a de o igem g ega em que “echinos” signi ica ou iço e “kókkos” esícula (Ande sen e al., 1997 e Jo ge, 2000). Filo Pla helmyn hes Classe Ces oda O dem Cyclophyllidea Família Taeniidae Géne o Echinococcus Espécie Echinococcus g anulosus, Ba sch, 1972 Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de 1.2.2 - Mo ologia: O E.g anulosus é o único ce endémicas (Rey, 2001) e aquele que ap esen a meno es dimensões Pa a se p ocede a uma ca ac e ização mais co ec a da mo ologia do pa asi a é necessá io e em con a: o pa asi a adul o, o o o e o quis o hidá ico Pa asi a adul o: O pa asi a adul o ep esen a a mais pequena énia de in e esse comp imen o médio en e 2 a 8 mm, ap esen ando escólex, pescoço e es óbilo 2). O escólex, ó gão de ixação do pa asi a, é pi i o me e ap esen a um ápex. As suas es u u as de ixação são compos as po uma dupla co oa de ganchos os ela es, qui inosos, em núme o a iá el de ixação (Ecke e al ., 2001 Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal é o único ce s ode de impo ância médica na maio ia das zonas endémicas (Rey, 2001) e aquele que ap esen a meno es dimensões (T inca, 2001). Pa a se p ocede a uma ca ac e ização mais co ec a da mo ologia do pa asi a é o pa asi a adul o, o o o e o quis o hidá ico (la a). O pa asi a adul o ep esen a a mais pequena énia de in e esse médico, endo um comp imen o médio en e 2 a 8 mm, ap esen ando escólex, pescoço e es óbilo ó gão de ixação do pa asi a, é pi i o me e ap esen a um ápex. As suas es u u as de ixação são compos as po uma dupla co oa de ganchos os ela es, qui inosos, em núme o a iá el , e po qua o en osas, que são as p incipais es u u as ., 2001 ). em Po ugal In odução 10 s ode de impo ância médica na maio ia das zonas (T inca, 2001). Pa a se p ocede a uma ca ac e ização mais co ec a da mo ologia do pa asi a é médico, endo um comp imen o médio en e 2 a 8 mm, ap esen ando escólex, pescoço e es óbilo (Figu a ó gão de ixação do pa asi a, é pi i o me e ap esen a um ápex. As suas es u u as de ixação são compos as po uma dupla co oa de ganchos os ela es, e po qua o en osas, que são as p incipais es u u as Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 17 Es udos gené icos ecen es ie am con i ma o concei o de di e sidade de es i pes den o do E.g anulosus, o qual an e io men e apenas se basea a em ca ac e ís icas mo ológicas e biológicas. A iden i icação das di e en es es i pes de e á se baseada numa combinação de di e sos c i é ios, nomeadamen e as ca ac e ís icas mo ológicas, biológicas bioquímicas e epidemiológicas e, ainda, como oi demons ado nos úl imos anos, em ca ac e ís icas genómicas, eco endo a écnicas molecula es de análise do DNA (Ecke & Thompson, 1997). A análise ilogné ica dos esul ados ob idos a a és das écnicas molecula es demons ou cla amen e a necessidade da eag upação do es a u o axonómico das es i pes des a espécie (Ecke & Thompson, 1997). Com base no conhecimen o ac ual dos ciclos de ida, a iação in a-especí ica e epidemiologia do E.g anulosus podem-se desen ol e es udos de o ma a ob e ce ezas na localização axonómica de cada es i pe, ou a desc e e no as espécies, se al o comp o ado. Nos úl imos anos em exis ido alguma polémica ace ca da classi icação axonómica de ce as es i pes pois há in es igado es que conside am que são espécies di e en es e ou os que ainda não encon a am e idências pa a al. No en an o, não há consenso pa a uma ou ou a si uação (McManus, 2006 e Thompson, 2008). 1.3 - Ciclo de ida O hospedei o de ini i o, econhecido como sendo o mais impo an e, na epidemiologia do E.g anulosus, na Península Ibé ica pa ece se o cão domés ico (Canis lupus amilia is), pois não oi encon ado em aposas (Vulpes ulpes) (Da id de Mo ais, 1998, T inca, 2001). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 18 Apesa de quase odos os mamí e os pode em se hospedei os in e mediá ios, uma ez que o am encon ados pa asi ados animais como o inos, bo inos, equinos, cap inos, suínos, e c., os mais impo an es são os o inos, pa ecendo se os hospedei os ideais. Também o am encon ados animais sel agens pa asi ados, em algumas pa es do globo e es e (Dalimi e al., 2006 e Zanini e al., 2006b). Em elação ao homem, es a pa asi ose o na-se comum em egiões onde exis am g andes c iações de gado e, consequen emen e, ele ado núme o de cães pa a gua da os ebanhos, mas o homem é conside ado um hospedei o aciden al. Quando o homem se inse e no ciclo de ida do pa asi a, a hida idose, que é uma zoonose es i a, é ans o mada numa an opozoonose (Da id de Mo ais, 1998). Ao inge i ísce as pa asi adas (com me acés odes) de hospedei os in e mediá ios, o cão (hospedei o de ini i o) ica pa asi ado indo a elimina pa a o meio ex e io , dia iamen e, os p ogló es g á idos, de E.g anulsosus, a a és das suas ezes. Os o os podem se disseminados pa a o ex e io de di e en es o mas como: - Os p ogló es após se libe a em do es óbilo i ão a a essa o in es ino a é chega ao ânus p o ocando p u ido local. O cão, ao coça -se, eben a es es p ogló es e ao lambe -se le a à disseminação dos o os po oda a supe ície do co po. - Os p ogló es podem i , sem se ompe em, pa a o ex e io con idos nas ezes e se em pos e io men e inge idos pelo hospedei o in e mediá io ou, uma ez no ex e io , eben a em e libe a em os o os que se podem espalha um pouco po odo o lado. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 19 - Os p ogló es podem-se desag ega ainda no in e io do in es ino, libe ando os o os, sendo expulsos pa a o ex e io com as ezes (T inca, 2001 e Da id Mo ais, 1998). Es es o os podem se encon ados um pouco po odos os ambien es, como o solo, a água, a el a, en e ou os, e ainda no pelo do p óp io cão. Todos os hospedei os in e mediá ios se in ec am ao pas a em ou bebe em água con aminada, is o ala mos de animais uminan es. Em elação aos humanos, es es podem se in ec ados de di e sas o mas, sendo a p incipal o con ac o p óximo com o cão, uma ez que os o os se podem espalha po odo o pêlo do animal. Um simples ges o de passa a mão pelo pêlo do cão (ou se lambido po es e) le a a que os o os adi am às mãos. Se as mãos não o em la adas, ao se em le adas à boca conspu cadas, o Homem pode inge i os o os e o na -se num hospedei o aciden al. Os homens ambém pode se in ec ado de o ma indi ec a, ao inge i alimen os que es ejam conspu cados com os o os ou inge indo bebidas se idas em ecipien es con aminados (Ande sen e al., 1997). Que aciden almen e no homem ou nou os hospedei os in e mediá ios, após a inges ão dos o os, é dada con inuidade ao ciclo de ida do pa asi a (Figu a 6), pois os emb iões hexacan os i ão da o igem ao quis o hidá ico ou hidá ide ( o ma la a ) (T inca, 2001). Pa a se consegui p e eni a in ecção humana ou animal, numa de e minada egião, é necessá io conhece pe ei amen e o ciclo global do pa asi a e analisa o seu aspec o uncional, es udando as elações ecológicas de cada hospedei o com ou as espécies hospedei as, nessa mesma egião. Assim, o am desc i os, na li e a u a, di e en es ciclos epidemiológicos onde baseiam a dinâmica da ansmissão humana: Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de 1. O ciclo sil á ico que oco e en e he bí o os/ca ní o os sel agens ciclo ances al pode e sido a o igem de um cicl domés i cos que podem inge i os animais sel agens. 2. O ciclo u al que oco e en e animais domés icos/cão e aciden almen e o homem. 3. O ciclo u bano que oco e en e homem/cão, podendo se um p oblema de saúde pública em mui o s países (Da id de Mo ais, 1998 e Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal O ciclo sil á ico que oco e en e he bí o os/ca ní o os sel agens ciclo ances al pode e sido a o igem de um cicl o u al clássico a a és dos cãe cos que podem inge i os animais sel agens. O ciclo u al que oco e en e animais domés icos/cão e aciden almen e o O ciclo u bano que oco e en e homem/cão, podendo se um p oblema s países (Da id de Mo ais, 1998 e T inca, 2000) em Po ugal In odução 20 O ciclo sil á ico que oco e en e he bí o os/ca ní o os sel agens . Es e o u al clássico a a és dos cãe s O ciclo u al que oco e en e animais domés icos/cão e aciden almen e o O ciclo u bano que oco e en e homem/cão, podendo se um p oblema Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 21 1.4 - Pa ologia A hida idose é uma pa ologia de desen ol imen o c ónico (C aig e al., 2007) em que os danos que o pa asi a, na o ma adul a, pode causa limi am-se à zona a que es e se ixa no in es ino do hospedei o de ini i o, onde pode á le a à nec ose das células às quais as en osas ade em, ou à up u a do epi élio da c ip a de Liebe kühn. Em in ecções massi as pode ha e a p odução excessi a de muco, mas em ge al não se cos umam obse a danos impo an es nem eacções celula es con a o pa asi a (Ponce Go do, 1995). No que conce ne à ase la a , nenhum ou o pa asi a p o oca lesões em an as localizações ana ómicas como as que o E.g anulosus p oduz. No en an o, na maio ia das ezes a localização é hepá ica e/ou pulmona , ha endo sido epo ados casos de localização no cé eb o, no músculo, no osso, en e ou os (G ácio e al., 2002 e Vicidomini e al., 2007). Os p incipais p oblemas causados pela hida idose são do ipo mecânico, de ido ao amanho e c escimen o dos quis os. Assim, po exemplo, a maio ia dos quis os hepá icos são assin omá icos (Figu a 7), não ap esen ando sin oma ologia clínica a é a ingi em um amanho de ce ca de 10cm (Ponce Go do, 1995). No Homem o quis o hidá ico ao se ins ala em di e en es ó gãos e ecidos, o na possí el o seu desen ol imen o, ainda que de o ma len a, podendo alcança dimensões na o dem dos 20 cm (Jo ge, 2000). A up u a dos quis os pode oco e em qualque localização, podendo p o oca in ecções bac e ianas secundá ias e/ou a disseminação das p o oescólices po odo o o ganismo, o iginando uma hida idose secundá ia múl ipla, eacções ana ilá icas de in ensidade a iá el e inclusi e a mo e do hospedei o (Ande sen, 1997 e T inca, 2001). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de A ní el bioquímico e me abólico podem exis i mudanças em á ios sis emas enzimá icos e no me abolismo p o eico al e ações uncionais do ó gão 1.5 - Diagnós ico 1.5.1 - Clínico O diagnós ico clínico do quis o hidá ico é conside ado mui o di ícil no inicio do pa asi ismo, pois a eacção p o ocada pela en ada do pa asi a no o ganismo é inapa en e e assin omá ica . Quando o quis o a inge um ce o olume o na se econhecido, caso seja supe icial. quaisque umo es do ó gão a ec ado (Rey, 2001 e Quando a localização dos quis os hidá icos não o em locais que possam causa lesões g a es, mesmo que o indi íduo enha sido in ec ado na in ância, o diagnós ico se á ei o mui o mais a de, a maio pa e das e i o como um achado aciden al (Rey, 2001). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal A ní el bioquímico e me abólico podem exis i mudanças em á ios sis emas e no me abolismo p o eico do hospedei o , indicando a exis ência de al e ações uncionais do ó gão pa asi ado (Rad a & I anya , 2004). O diagnós ico clínico do quis o hidá ico é conside ado mui o di ícil no inicio do pa asi ismo, pois a eacção p o ocada pela en ada do pa asi a no o ganismo é . Quando o quis o a inge um ce o olume o na - se possí el se econhecido, caso seja supe icial. Se o quis o é p o undo pode ha e con usão com es do ó gão a ec ado (Rey, 2001 e T inca, 2001). Quando a localização dos quis os hidá icos não o em locais que possam causa lesões g a es, mesmo que o indi íduo enha sido in ec ado na in ância, o diagnós ico a maio pa e das ezes apenas na idade adul a ou en ão se á i o como um achado aciden al (Rey, 2001). em Po ugal In odução 22 A ní el bioquímico e me abólico podem exis i mudanças em á ios sis emas , indicando a exis ência de O diagnós ico clínico do quis o hidá ico é conside ado mui o di ícil no inicio do pa asi ismo, pois a eacção p o ocada pela en ada do pa asi a no o ganismo é se possí el p o undo pode ha e con usão com Quando a localização dos quis os hidá icos não o em locais que possam causa lesões g a es, mesmo que o indi íduo enha sido in ec ado na in ância, o diagnós ico ezes apenas na idade adul a ou en ão se á Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 23 Em elação à sin oma ologia, a hida idose pode ap esen a um quad o pob e de sinais e sin omas ou en ão pode-se e ela polimo a e p oduzi di e sas sínd omes sem ca ac e ís icas especí icas. Na maio ia dos casos o diagnós ico di e encial az-se com algumas doenças umo ais, sob e udo as que a ec am o pulmão e o ígado. Nas á eas conside adas endémicas, assim como em cen os de a endimen o aos doen es, a possibilidade de uma e iologia hidá ica de e á es a bas an e p esen e na abo dagem clínica pa a se comp o ada ou excluída pelos mé odos adequados, pois se não se e i ica , o diagnós ico pode á o na -se mais di ícil e su gi como uma su p esa, po ocasião de um exame adiológico, du an e uma in e enção ci ú gica ou ainda po um choque ana ilá ico po up u a de um ou mais quis os (Rey, 2001). Em alguns casos o diagnós ico clínico pode á se imedia o, nomeadamen e quando o doen e, após um a aque de osse, expulsa agmen os de memb anas quís icas ou esículas mu chas ou ú gidas, com a expec o ação. Nas punções explo a ó ias ou e acuado as, e ec uadas de ido à suspei a de ou as pa ologias, o exame pa asi ológico pode ambém e ela a p esença de a eia hidá ica e assim pe mi i o diagnós ico co ec o da hida idose (T inca, 2001). Na maio ia dos casos con ibui pa a o diagnós ico clínico des a pa asi ose, o conhecimen o da zona de esidência/p ocedência dos doen es, da sua ac i idade p o issional, dos seus hábi os de ida e da exis ência de ou os casos diagnos icados na amília, bem como em alguns izinhos (T inca, 2001 e Jo ge, 2000). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de 1.5.2 – Imagiologia A adiologia é um dos p incipais ecu sos pa a diagnos ica quis os localizados nos pulmões, em especial quis os que sejam pequenos e assin omá icos. O de imagens ci cula es homogéneas e de con o nos bas an e ní idos, são mui o suges i as, mas a somb a adiológica não se á su icien e pa a assegu a um diagnós ico especí ico (Lewall, 1998) (Figu a 8) Em quis os hepá icos localizados na egi exame adiológico ambém é impo an e, pois p ojec a a sua somb a po cima do con o no do dia agma. Po ém, nos quis os hidá icos p o undos apenas os que ap esen am uma memb ana ad en ícia calci icada pode ão se isu es e um ac o indicado de que o pa asi a es eja inac i o Quando a hidá ide se localiza nos ossos o es udo adiológico é o elemen o básico pa a o diagnós ico da doença. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Imagiologia A adiologia é um dos p incipais ecu sos pa a diagnos ica quis os localizados nos pulmões, em especial quis os que sejam pequenos e assin omá icos. O apa ecimen o de imagens ci cula es homogéneas e de con o nos bas an e ní idos, são mui o suges i as, mas a somb a adiológica não se á su icien e pa a assegu a um diagnós ico (Figu a 8) . Em quis os hepá icos localizados na egi ão supe icial e supe io do ígado, o exame adiológico ambém é impo an e, pois p ojec a a sua somb a po cima do con o no do dia agma. Po ém, nos quis os hidá icos p o undos apenas os que ap esen am uma memb ana ad en ícia calci icada pode ão se isu alizados, não sendo es e um ac o indicado de que o pa asi a es eja inac i o (Lewall, 1998 e Rey, 2001) se localiza nos ossos o es udo adiológico é o elemen o básico em Po ugal In odução 24 A adiologia é um dos p incipais ecu sos pa a diagnos ica quis os localizados apa ecimen o de imagens ci cula es homogéneas e de con o nos bas an e ní idos, são mui o suges i as, mas a somb a adiológica não se á su icien e pa a assegu a um diagnós ico ão supe icial e supe io do ígado, o exame adiológico ambém é impo an e, pois p ojec a a sua somb a po cima do con o no do dia agma. Po ém, nos quis os hidá icos p o undos apenas os que alizados, não sendo Rey, 2001) . se localiza nos ossos o es udo adiológico é o elemen o básico Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Exis em di e en es exames imagiológicos hida idose humana ais como a cin ilig a ia, a omog a ia axial compu o izada, a essonância magné ica, a ecog a ia posi ões ( Lewall, 1998 e Yuksel 1.5.3 – Diagnós ico Os exames labo a o iais de o ina não pe mi em, po si só, o diagnós ico da hida idose, pois, no malmen e, não se encon am al e ações na unção hepá ica. En ão, ao aze um diagnós ico labo a o ial de e hospedei o ou pa a o pa asi a. Pode- se ealiza um diagnós ico pa asi ológico di ec o, o qual consis e na iden i icação mic ocópica dos elemen os pa asi á ios. Es e ipo de diagnós ico só de e á se ei o a segui a uma o u a ou issu ação do quis o hidá ico, pois uma punção da hidá ide, em condições no mais, es á con a an e io men e e e idos, o diagnós ico pa asi ológico di ec o da hida idose é impossí el. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Exis em di e en es exames imagiológicos que pode ão melho a o diagnós ico da hida idose humana ais como a cin ilig a ia, a omog a ia axial compu o izada, a a ecog a ia (Figu a 9) ou ul assonog a ia e a emissão de Lewall, 1998 e Yuksel e al., 2007). Diagnós ico labo a o ial adicional Os exames labo a o iais de o ina não pe mi em, po si só, o diagnós ico da hida idose, pois, no malmen e, não se encon am al e ações na unção hepá ica. En ão, ao aze um diagnós ico labo a o ial de e -se e em a enção se es e é di igido pa a o hospedei o ou pa a o pa asi a. se ealiza um diagnós ico pa asi ológico di ec o, o qual consis e na iden i icação mic ocópica dos elemen os pa asi á ios. Es e ipo de diagnós ico só de e á uma o u a ou issu ação do quis o hidá ico, pois uma punção da hidá ide, em condições no mais, es á con a - indicada. Excep uando es es casos, an e io men e e e idos, o diagnós ico pa asi ológico di ec o da hida idose é impossí el. em Po ugal In odução 25 que pode ão melho a o diagnós ico da hida idose humana ais como a cin ilig a ia, a omog a ia axial compu o izada, a ou ul assonog a ia e a emissão de Os exames labo a o iais de o ina não pe mi em, po si só, o diagnós ico da hida idose, pois, no malmen e, não se encon am al e ações na unção hepá ica. En ão, em a enção se es e é di igido pa a o se ealiza um diagnós ico pa asi ológico di ec o, o qual consis e na iden i icação mic ocópica dos elemen os pa asi á ios. Es e ipo de diagnós ico só de e á uma o u a ou issu ação do quis o hidá ico, pois uma punção da indicada. Excep uando es es casos, an e io men e e e idos, o diagnós ico pa asi ológico di ec o da hida idose é impossí el. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal In odução 26 Ou o mé odo de diagnós ico se á o imunológico, o qual se ai basea na e idenciação da eacção an igénio/an ico po in i o, pesquisa de an igénios e an i- co pos ci culan es (Suni a e al., 2007), en e ou os. Es e é o mé odo mais u ilizado no diagnós ico da hida idose, embo a as no as écnicas na á ea da imagiologia sejam de g ande auxílio pa a o diagnós ico. As écnicas u ilizadas no imunodiagnós ico da hida idose êm sido a p o a de Casoni (caída em desuso), o es e de ixação do complemen o, imuno luo escência, di usão dupla, imunoelec o o ese, aglu inação em lá ex, hemaglu inação indi ec a, “imunoblo ing” e ELISA, en e ou as, ainda que nem odas se enham mos ado su icien emen e sensí eis e especí icas (Go s ein, 1992; Ponce Go do, 1995; Bia a e al., 2001 e Zhang e al., 2003). No que diz espei o ao imunodiagnós ico da hida idose animal, são poucos os esul ados conseguidos, pois os in es igado es semp e i e am p oblemas de ido à baixa sensibilidade das écnicas emp egues e/ou de ido a eacções c uzadas com ou as pa asi oses (Ponce Go do, 1995 e Da id de Mo ais, 1998). 1.5.4 - Diagnós ico Molecula O mé odos molecula es baseiam-se na análise de DNA, examinando o genoma do pa asi a di ec amen e, logo não são con undidos com ac o es de a iabilidade induzida pelo ambien e ou pelo hospedei o, nem com ac o es associados ao ciclo de ida ou modi icações pós anslaccionais (Go s ein, 1992; Bowles & McManus, 1993a e Singh, 1997). A a iação gené ica pode se in es igada an o no genoma mi ocond ial como no genoma nuclea . O DNA mi ocond ial (m DNA) é ú il pa a a disc iminação de Capí ulo II Capí ulo II Capí ulo II Capí ulo II - -- - Objec i os Objec i osObjec i os Objec i os Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Objec i os 34 Dada a impo ância da hida idose na saúde pública em de e minadas egiões geog á icas, sendo que algumas egiões de Po ugal se encon am den o des e g upo, o na-se necessá io a ealização de es udos que e i am a p e alência de E.g anulosus e a consequen e ca ac e ização molecula pa a uma melho a aliação da pa ologia e sua e olução no hospedei o in e mediá io. De ido à inexis ência de in o mação em Po ugal em elação aos ipos de genó ipos exis en es, oi p opos o nes e abalho inicia um es udo de ca ac e ização molecula do E.g anulosus em Po ugal. Os p incipais objec i os des e es udo são: - Es uda mo ologicamen e os quis os de E.g anulosus p o enien es de ma adou os da Região da Bei a In e io , Po ugal; - Es uda e ca ac e iza molecula men e das es i pes de E.g anulosus exis en es na egião da Bei a In e io , Po ugal; - Aplica a écnica de PCR-RFLP ao es udo da hida idose, usando “p ime s” di e en es pa a as mesmas enzimas; - Sequencia as amos as que susci a em dú idas após a aplicação da PCR-RFLP. Capí ulo III Capí ulo III Capí ulo III Capí ulo III – –– – Ma e ial e Mé odos Ma e ial e Mé odosMa e ial e Mé odos Ma e ial e Mé odos Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Ma e ial e Mé odos 36 3.1 - Ob enção e anspo e do ma e ial biológico pa asi ado As amos as do pa asi a consis em em quis os hidá icos p o enien es de qualque localização o gânica, p incipalmen e ígado e pulmão, desen ol idos em o inos e bo inos. Todas as amos as o am ob idas en e Ou ub o de 2007 e Maio de 2008, sendo os quis os o necidos po ma adou os municipais e p i ados da egião da Bei a In e io . As ísce as dos animais con endo as amos as do pa asi a o am na sua maio ia ecolhidas nos espec i os ma adou os no mesmo dia do sac i ício do animal, ou num p azo máximo de ês dias após o mesmo, endo sido conse adas du an e es e empo e ige adas, a uma empe a u a en e 5 e 10 ºC. O anspo e oi ealizado em con en o es de amanho adequado, sem e ige ação, sendo ei a num espaço de empo máximo de 3 ho as. No labo a ó io o am p ocessadas imedia amen e, ou man idas em câma a ia a 4ºC du an e um pe íodo máximo de 24 ho as an es do seu p ocessamen o. 3.2 - Ob enção dos p o oescólices As di e en es amos as biológicas, cons i uídas pelas ísce as pa asi adas o am deposi adas em bandejas de amanho adequado, sendo manipuladas seguindo o p o ocolo desc i o po Ponce Go do (1995), que indica que a supe ície dos quis os e a zona adjacen e do ó gão pa asi ado sejam p e iamen e desin ec adas com solução de Lugol. Seguidamen e, com a ajuda de se ingas es é eis de 10 ml, ex aiu-se ce ca de me ade do líquido hidá ico (Figu a 10A e 10B), ab indo o quis o a segui e ex aindo o es o do líquido e a eia hidá ica (Figu a 11). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de La a am-se bem as pa edes do quis o hidá ico objec i o desp ende as p o oescólices e/ou cápsulas p olíge as que pudessem es a ag egadas a memb ana. Es e líquido e a eia hidá ica o am ecolhidos em ubos es é eis de cen í uga, endo sido adicionado so o isiológico es é il e pos e io men e cen i ugados, num espaço de empo máximo de 4 ho as. Quando as memb anas ge mina i as ap esen a am ele ada quan idade de p o oescólices na sua pa ede in e na, es es quis os e am colocados em caixas de pe i es é eis Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal bem as pa edes do quis o hidá ico com so o isiológico es e ilizado, endo como objec i o desp ende as p o oescólices e/ou cápsulas p olíge as que pudessem es a ag egadas a memb ana. Es e líquido e a eia hidá ica o am ecolhidos em ubos es é eis de cen í uga, endo sido o isiológico es é il e pos e io men e cen i ugados, num espaço de empo máximo de Quando as memb anas ge mina i as ap esen a am ele ada quan idade de p o oescólices na sua pa ede in e na, es es quis os e am colocados em caixas de pe i es é eis e la adas com so o em Po ugal Ma e ial e Mé odos 37 com so o isiológico es e ilizado, endo como objec i o desp ende as p o oescólices e/ou cápsulas p olíge as que pudessem es a ag egadas a memb ana. Es e líquido e a eia hidá ica o am ecolhidos em ubos es é eis de cen í uga, endo sido o isiológico es é il e pos e io men e cen i ugados, num espaço de empo máximo de Quando as memb anas ge mina i as ap esen a am ele ada quan idade de p o oescólices na e la adas com so o Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de isiológico (Figu a 12). Em odo o momen o oi man ido iden i icado e sepa ado odo o ma e ial dos di e en es quis os analisados. Após cen i ugação, 1500 .p.m. ( o ações po minu o) du an e 3 minu os, desca ou sob enadan e ( líquido hidá ico) e obse ou ma e ial gené ico do pa asi a (p o oescólices, cápsulas p olíge as, ganchos, e c.), endo iden i icado e gua dado as amos as que o am posi i as, Se o aspec o da memb ana e/ou líquido hidá ico indica am degene ação (memb ana gela inosa, liquido hidá ico u o), ou o liquído hidá ico ap esen a a sinais de con aminação, o Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Em odo o momen o oi man ido iden i icado e sepa ado odo o ma e ial dos Após cen i ugação, 1500 .p.m. ( o ações po minu o) du an e 3 minu os, desca ou líquido hidá ico) e obse ou - se ao mic oscópio óp ico a p esença ou ausência de ma e ial gené ico do pa asi a (p o oescólices, cápsulas p olíge as, ganchos, e c.), endo iden i icado e gua dado as amos as que o am posi i as, em e anol absolu o e conge Se o aspec o da memb ana e/ou líquido hidá ico indica am degene ação (memb ana gela inosa, liquido hidá ico u o), ou o liquído hidá ico ap esen a a sinais de con aminação, o em Po ugal Ma e ial e Mé odos 38 Em odo o momen o oi man ido iden i icado e sepa ado odo o ma e ial dos Após cen i ugação, 1500 .p.m. ( o ações po minu o) du an e 3 minu os, desca ou -se o se ao mic oscópio óp ico a p esença ou ausência de ma e ial gené ico do pa asi a (p o oescólices, cápsulas p olíge as, ganchos, e c.), endo -se e anol absolu o e conge ladas a -20ºC. Se o aspec o da memb ana e/ou líquido hidá ico indica am degene ação (memb ana gela inosa, liquido hidá ico u o), ou o liquído hidá ico ap esen a a sinais de con aminação, o Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de quis o hidá ico e a excluído (Figu a 13) es ejam p esen es es ão em ele ado 3.3 – Análise molecula das amos as pa asi adas Na análise molecula oi ei a, inicialmen e, a ex acção do DNA do ki “High pu e PCR empla e p epa a ion ki ” ( ab ican e. As amos as que es a am a cen i ugadas a 1500 pm du an e 5 minu os e la ad e i a o e anol em que es a am conse adas (3 ou mais ezes). Caso o sedimen o apa en e e um olume in e io a 200 µl de e -se- ia adiciona PBS es é il a é pe aze o olume p e endido. Num ubo es é il de 1, 5 ml adiciona am bu e ) e 40 µl de p o einase, homogeneizou Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal (Figu a 13) . Nes es casos não cos um am exis i p o oescólices ou caso es ado degene a i o e com baixa pe cen agem de iabilidade. Análise molecula das amos as pa asi adas Na análise molecula oi ei a, inicialmen e, a ex acção do DNA do E.g anulosus ki “High pu e PCR empla e p epa a ion ki ” ( Roche, Po ugal ), seguindo as ins uções do ab ican e. As amos as que es a am a - 20ºC o am e i adas, descongeladas e, pos e io men e, cen i ugadas a 1500 pm du an e 5 minu os e la ad as em PBS (Phospha e Bu e Solu ion), pa a e i a o e anol em que es a am conse adas (3 ou mais ezes). Caso o sedimen o apa en e e um ia adiciona PBS es é il a é pe aze o olume p e endido. 5 ml adiciona am - se 200 µl de amos a, 200 µl de ampão ( ) e 40 µl de p o einase, homogeneizou -se e incubou- se a mis u a a 72ºC du an e 10 minu os e em Po ugal Ma e ial e Mé odos 39 am exis i p o oescólices ou caso e com baixa pe cen agem de iabilidade. E.g anulosus usando o ), seguindo as ins uções do 20ºC o am e i adas, descongeladas e, pos e io men e, as em PBS (Phospha e Bu e Solu ion), pa a e i a o e anol em que es a am conse adas (3 ou mais ezes). Caso o sedimen o apa en e e um ia adiciona PBS es é il a é pe aze o olume p e endido. se 200 µl de amos a, 200 µl de ampão ( binding se a mis u a a 72ºC du an e 10 minu os e Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Ma e ial e Mé odos 40 adicionou-se 100 µl de isop opanol, homogeneizou-se e ans e iu-se o con eúdo pa a um ubo com il o (high pu e il e ube), o qual es a a inse ido num ubo colec o . Cen i ugou-se a 8000 pm du an e um minu o e ejei ou-se o ubo colec o com o con eúdo, passando o il o pa a ou o ubo colec o . Adicionou-se 500 µl de ampão “ emo al inhibi o s” e cen i ugou-se a 8000 pm du an e um minu o, adicionando, seguidamen e, 500 µl de ampão “washe ” e cen i ugou-se do mesmo modo, desca ando-se o ubo colec o e o con eúdo e colocando o il o nou o ubo colec o . Vol ou-se a adiciona ampão “washe ” na mesma quan idade e p ocedeu-se de igual o ma, endo seguidamen e ei o uma cen i ugação ápida (10 segundos a 13000 pm) e desca ou-se o ubo colec o com o con eúdo. Inse iu-se o ubo com il o num ubo es é il de 1,5 ml, adicionando 200 µl ampão de eluição, o qual oi p e iamen e aquecido a 70ºC, cen i ugando a 8000 pm du an e um minu o. Iden i icou-se o ubo com núme o e da a de ex acção e gua dou-se po ce ca de 2 ho as en e 2-8ºC e, pos e io men e, congelou-se a -20ºC. 3.3.1 – Ampli icação dos p odu os ex aídos Após ex acção p ocedeu-se à ampli icação dos p odu os usando pa a al o ki Illus aTm puReTaq Ready- o-go PCR Beads (GE Heal hca e, UK), o qual ap esen a a os ubos com uma mis u a à qual apenas se ia necessá io adiciona a amos a, os oligonucleó idos e pe aze o olume inal com água des ilada. Fo am usados ês pa es de oligonucleó idos (Tabela 2), os quais e am di eccionados pa a ampli ica a egião ITS-1 (Figu a 14): Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Tabela 2 – Sequências dos “p ime s” Nome Sequência BD1 5’ – GTCGTAACAAGGTTTCCGTA 4S 5’ – TCTAGATGCGTTCGAA(G/A)TGTCGATG PEg9 F1 5’ – ATGGCATGGGTAGCACGGAGAG PEg9 R1 5’ – GGTTTGGAATGGCGATGTTGA PEg16 F1 5’ – CGCGCTATCGACCCACCAACAG PEg16 R1 5’ – ACTCCGTCCCGCTACTCCACTCC Ti e am- se odos os cuidados com a assepsia, no uso des es ubos pois as con aminações podem se uma on e de g andes p oblemas em biologia molecula . Após se e e i icado que os ubos con inham a mis u a lio ilizada nas p opo ções que o ab ican e egião ITS-1, oi adicionado 1,1 µl de oligonucleó ido concen ação dos “p ime s” oi de 3 água des ilada, de o ma a pe aze um olume inal de 25 µl. Homogeneizou e colocou- se o mesmo em gelo a é se Sys ems) . Foi necessá io p og ama o e mociclado ampli icada, o que oi ei o de aco do com as seguin es condições: Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal “p ime s” u ilizados pa a es udo da egião ITS-1 Sequência Au o GTCGTAACAAGGTTTCCGTA – 3’ Bowles & McManus (1993) TCTAGATGCGTTCGAA(G/A)TGTCGATG – 3’ ATGGCATGGGTAGCACGGAGAG – 3’ González, L.M (2002) GGTTTGGAATGGCGATGTTGA – 3’ CGCGCTATCGACCCACCAACAG – 3’ González, L.M (2002) ACTCCGTCCCGCTACTCCACTCC – 3’ se odos os cuidados com a assepsia, no uso des es ubos pois as con aminações podem se uma on e de g andes p oblemas em biologia molecula . Após se e e i icado que os ubos con inham a mis u a lio ilizada nas p opo ções que o ab ican e indica, pa a ampli icação da µl de oligonucleó ido BD1, 1,1 µl de oligonucleó ido 4S oi de 3 0 ρ mol), 10,0 µl de amos a e pe ez- se o es an e olume com água des ilada, de o ma a pe aze um olume inal de 25 µl. Homogeneizou - se o con eúdo do ubo se o mesmo em gelo a é se coloca no e mociclado (AVISO ® , GmbH Mecha onic . Foi necessá io p og ama o e mociclado pa a que a mis u a e m ques ão ei o de aco do com as seguin es condições: 95ºC du an e em Po ugal Ma e ial e Mé odos 41 Bowles & McManus González, L.M González, L.M se odos os cuidados com a assepsia, no uso des es ubos pois as con aminações podem se uma on e de g andes p oblemas em biologia molecula . Após se e e i icado que os pa a ampli icação da µl de oligonucleó ido 4S (a se o es an e olume com se o con eúdo do ubo , GmbH Mecha onic m ques ão pudesse se du an e 2 minu os, Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Ma e ial e Mé odos 42 seguindo-se 35 ciclos com as condições de 95ºC du an e 1 minu o, seguidos de 50ºC du an e 1 minu o e 72ºC du an e 1 minu o, e minando com 72ºC du an e 7 minu os. Pa a a ampli icação com os “p ime s” EgF1 e EgR1 o am adicionados 2,2 µl de oligonucleó ido PEg9F1, 3,0 µl de oligonucleó ido PEg9R1 (a concen ação dos “p ime s” oi de 50 ρmol), 6,0 µl de amos a e pe ez-se o es an e olume com água des ilada, de o ma a ob e um olume inal de 25 µl. Homogeneizou-se o con eúdo do ubo e colocou-se o mesmo em gelo a é se coloca no e mociclado . As condições de PCR u ilizadas o am: 94ºC du an e 5 minu os, seguindo-se 35 ciclos com as condições de 94ºC du an e 1 minu o, seguidos de 60ºC du an e 30 segundos e 72ºC du an e 30 segundos, e minando com 72ºC du an e 10 minu os. Pa a a ampli icação com os “p ime s” Eg16F1 e Eg16R1 o am adicionados 2,2 µl de oligonucleó ido PEg16F1, 2,0 µl de oligonucleó ido PEg16R1 (a concen ação dos “p ime s” oi de 50 ρmol), 6,0 µl de amos a e pe ez-se o es an e olume com água des ilada, de o ma a pe aze um olume inal de 25 µl. Homogeneizou-se o con eúdo do ubo e colocou-se o mesmo em gelo a é se coloca no e mociclado . As condições de PCR u ilizadas o am: 94ºC du an e 5 minu os, seguindo-se 35 ciclos com as condições de 94ºC du an e 1 minu o, seguidos de 60ºC du an e 30 segundos e 72ºC du an e 30 segundos, e minando com 72ºC du an e 10 minu os. Pa a mais a de se p ocede à sequenciação, o am usados “p ime s” pa a ampli ica o gene ci oc omo c oxidase sub-unidade 1 (Figu a 15) e, pa a al, o am aplicados os “p ime s” JB3 (5' - TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT - 3') e JB4.5 (5' - TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG - 3'), desc i os po Bowles e al., (1992). Pa a a ampli icação o am adicionados 2,1 µl de oligonucleó ido JB3, 3,7 µl de oligonucleó ido JB4.5 (a concen ação dos “p ime s” oi de 50 ρmol), 5,0 µl de amos a e pe ez-se o es an e olume com água des ilada, de o ma a pe aze um olume inal de 25 µl. Homogeneizou-se o con eúdo do ubo e colocou-se o mesmo em gelo a é se coloca no e mociclado . As condições de PCR u ilizadas o am: 95ºC du an e 5 minu os, Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Resul ados 49 Em elação à idade dos animais, odos os o inos ap esen a am uma idade supe io a 18 meses, não sendo especi icada a idade de cada animal. Em elação aos bo inos, as idades es ão especi icadas na abela abaixo: Tabela 6 – Dis ibuição das amos as po idade, dos bo inos Idades (meses) BOVINO 35 1 130 2 216 2 As amos as de bo inos que o am analisadas ap esen a am uma idade mui o di e si icada que ia desde 35 meses (ap oximadamen e 3 anos) a e aos 216 meses (18 anos). Como apenas o am ob idas 5 amos as de bo inos elas dis ibuem-se como o ap esen ado na abela an e io , apenas uma amos a de um animal com 35 meses, duas amos as de animais com 130 meses (ap oximadamen e 11 anos) e duas amos as de animais com 216 meses. Uma análise da e ilidade dos quis os ambém implica ala dos quis os que es a am calci icados ou en ão das amos as que po azões di e sas es a am con aminadas. Es es esul ados es ão especi icados na abela abaixo: Tabela 7 - Dis ibuição das amos as ob idas po e ilidade, calci icação e con aminação, po espécie AMOSTRA OVINO (%) BOVINO (%) TOTAL (%) FERTILIDADE FÉRTIL 29 (50) 1 (1,7) 30 (51,7) INFÉRTIL 7 ( 12,1 ) 0 7 ( 12,1 ) CALCIFICADAS 11 (19) 4 (6,9) 15 (25,9) CONTAMINADAS 6 (10,3) 0 6 (10,3) TOTAL 53 ( 91,4 ) 5 ( 8,6 ) 58 Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Resul ados 50 No o al de 58 amos as colhidas, 91,4% o am em o inos. Des as, 10,3% ap esen a am-se con aminadas e 19% es a am calci icadas. Em elação à e ilidade das amos as colhidas nos o inos, 50% do o al e am amos as é eis, e elando a p esença de p o oescólices e/ou ganchos no liquido hidá ico, enquan o apenas 12,1% das amos as colhidas em o inos e am in é eis. Das cinco amos as de bo inos colhidas, ce ca de 8,6 % do o al de amos as ecolhidas, 4 (6,9%) encon a am-se calci icadas e apenas uma (1,7%) e a é il. Ao e ec ua as colhei as, iu-se que pa a além de apenas ha e quis os em o inos e bo inos, es es ambém es a am apenas dis ibuídos po dois ó gãos, o ígado e os pulmões. Mas exis em di e enças em e mos de e ilidade, calci icação e con aminação an o en e as espécies como nos ó gãos pa asi ados, al como é indicado na seguin e abela: Tabela 8 - Dis ibuição das amos as ob idas po e ilidade, calci icação e con aminação po ó gão, em cada espécie OVINO BOVINO TOTAL Pulmão (%) Fígado (%) Pulmão (%) Fígado (%) Pulmão (%) Fígado (%) FERTILIDADE FÉRTIL 12 (52,2) 17 (56,7) 1 (33,3) - 13 (50) 17 (53,1) INFÉRTIL 3 (13) 4 (13,3) - - 3 (11,5) 4 (12,5) CALCIFICADAS 6 (26,1) 5 (16,7) 2 (66,7) 2 (100) 8 (30,8) 7 (21,9) CONTAMINADAS 2 (8,7) 4 (13,3) - - 2 (7,7) 4 (12,5) TOTAL 23 30 3 2 26 32 Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Nos o inos, animais em que o am encon adas mais amos as de ó gãos pa asi ados, 23 amos as de pulmões e 30 de ígado pa asi ados, o am encon adas 11 amos as calci icadas, sendo 6 nos pulmões e 5 no ígado e 6 amos as con aminadas sendo duas p o enie ígados. Em elação à e ilidade, apenas 7 amos as não e am é eis, sendo que 3 e am p o enien es de pulmões e 4 de ígados, odas as ou as amos as e am é eis, endo 12 nos pulmões e 17 no ígado. De bo inos, o am ob idas apenas 5 amos as pa asi adas sendo que 3 e am p o enien es de pulmões e 2 de ígado. Des as apenas uma e a é il e e a p o enien e de pulmões, as ou as 4 amos as es a am calci icadas. Figu a Como mos ado no g á ico an e io , a maio pa e das amos as abalhadas são é eis, an o nos pulmões como no ígado, ha endo poucas amos as in é eis, calci icadas e/ou con aminadas. As amos as in é eis, calci icadas e /ou con aminadas não e am iá eis ejei adas, mas o núme o de amos as iá eis e não iá eis e a mui o FÉRTIL INFÉRTIL FERTILIDADE 13(22%) 17 (30%) Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Nos o inos, animais em que o am encon adas mais amos as de ó gãos pa asi ados, 23 amos as de pulmões e 30 de ígado pa asi ados, o am encon adas 11 amos as calci icadas, sendo 6 nos pulmões e 5 no ígado e 6 amos as con aminadas sendo duas p o enie n es de pulmões e 4 de ígados. Em elação à e ilidade, apenas 7 amos as não e am é eis, sendo que 3 e am p o enien es de pulmões e 4 de ígados, odas as ou as amos as e am é eis, endo o am ob idas apenas 5 amos as pa asi adas sendo que 3 e am p o enien es de pulmões e 2 de ígado. Des as apenas uma e a é il e e a p o enien e de pulmões, as ou as 4 Figu a 16 – Dis ibuição das amos as po ó gão mos ado no g á ico an e io , a maio pa e das amos as abalhadas são é eis, an o nos pulmões como no ígado, ha endo poucas amos as in é eis, calci icadas e/ou con aminadas. As amos as in é eis, calci icadas e /ou con aminadas não e am iá eis pa a o es udo, logo o am ejei adas, mas o núme o de amos as iá eis e não iá eis e a mui o semelhan e (Figu a 16). INFÉRTIL CALCIFICADAS CONTAMINADAS 3(5%) 8(14%) 2(3%) 4(7%) 7(12%) 4(7%) Pulmão Fígado em Po ugal Resul ados 51 Nos o inos, animais em que o am encon adas mais amos as de ó gãos pa asi ados, 23 amos as de pulmões e 30 de ígado pa asi ados, o am encon adas 11 amos as calci icadas, sendo n es de pulmões e 4 de ígados. Em elação à e ilidade, apenas 7 amos as não e am é eis, sendo que 3 e am p o enien es de pulmões e 4 de ígados, odas as ou as amos as e am é eis, endo -se encon ado o am ob idas apenas 5 amos as pa asi adas sendo que 3 e am p o enien es de pulmões e 2 de ígado. Des as apenas uma e a é il e e a p o enien e de pulmões, as ou as 4 mos ado no g á ico an e io , a maio pa e das amos as abalhadas são é eis, an o nos pulmões como no ígado, ha endo poucas amos as in é eis, calci icadas e/ou con aminadas. pa a o es udo, logo o am semelhan e (Figu a 16). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Figu a 17 - Viabilidade das amos as dis ibuídas po ó gão Em elação às amos as iá eis po ó gão não há di e enças pois das no pulmão, o núme o de amos as iá eis é igual ao de amos as não iá eis. Nas amos as de ígados o núme o de amos as iá eis (17) é ligei amen e supe io ao de amos as não iá eis (15), mas a di e ença é mui o pequena (Figu a 17). As amos as abalhadas e am p o enien es de di e en es zonas ais como Beja, Cas elo B anco, El as, Idanha-a-No a e Pon e de So (Figu a 18). Figu a 18 - Mapa da p ocedência das amos as u ilizadas pa a o es udo Pulmão 13 Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Viabilidade das amos as dis ibuídas po ó gão Em elação às amos as iá eis po ó gão não há di e enças pois das amos as encon adas no pulmão, o núme o de amos as iá eis é igual ao de amos as não iá eis. Nas amos as de ígados o núme o de amos as iá eis (17) é ligei amen e supe io ao de amos as não iá eis (15), mas a di e ença é mui o pequena (Figu a 17). As amos as abalhadas e am p o enien es de di e en es zonas ais como Beja, Cas elo Pon e de So (Figu a 18). Mapa da p ocedência das amos as u ilizadas pa a o es udo Pulmão Fígado 17 13 15 Viá eis Não iá eis em Po ugal Resul ados 52 amos as encon adas no pulmão, o núme o de amos as iá eis é igual ao de amos as não iá eis. Nas amos as de ígados o núme o de amos as iá eis (17) é ligei amen e supe io ao de amos as não iá eis (15), As amos as abalhadas e am p o enien es de di e en es zonas ais como Beja, Cas elo Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de A g ande maio ia das amos as e a seguindo- se El as, Cas elo B anco, Idanha como endo di e sos ag upamen os, ou seja, p op iedades onde exis em animais p o enien es de di e sos pequenos p o du o es, nes e caso de p ocedência alen ejana. 4.2 – Análise molecula das amos as pa asi adas 4.2.1 – Ampli icação da Região ITS Pa a a ealização da análise molecula das amos as pa asi adas po es udada a egião ITS-1, endo sid o ei as ês ampli icações di e en es. Ampli icação ITS-1-PCR: A pa i das 30 amos as ob idas oi possí el 11 o am subme idas à acção das enzimas de es ição. agmen os com ce ca de 1000 pb, sendo necessá io, em alguns casos, p ocede a uma a iação do p o ocolo de PCR inicialmen e de inido. Assim, po exemplo, pa a maximiza as hipó eses de Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal A g ande maio ia das amos as e a p oceden e da zona de Pon e de So (Figu a 19), se El as, Cas elo B anco, Idanha -a- No a e Beja. A zona de Pon e de So é conside ada como endo di e sos ag upamen os, ou seja, p op iedades onde exis em animais p o enien es de du o es, nes e caso de p ocedência alen ejana. Análise molecula das amos as pa asi adas Ampli icação da Região ITS -1 Pa a a ealização da análise molecula das amos as pa asi adas po E.g anulosus o ei as ês ampli icações di e en es. A pa i das 30 amos as ob idas oi possí el ampli ica apenas 16 amos as e, des as apenas 11 o am subme idas à acção das enzimas de es ição. Após ampli icação o am ob idos agmen os com ce ca de 1000 pb, sendo necessá io, em alguns casos, p ocede a uma a iação do p o ocolo de PCR inicialmen e de inido. Assim, po exemplo, pa a maximiza as hipó eses de em Po ugal Resul ados 53 p oceden e da zona de Pon e de So (Figu a 19), No a e Beja. A zona de Pon e de So é conside ada como endo di e sos ag upamen os, ou seja, p op iedades onde exis em animais p o enien es de E.g anulosus oi ampli ica apenas 16 amos as e, des as apenas Após ampli icação o am ob idos agmen os com ce ca de 1000 pb, sendo necessá io, em alguns casos, p ocede a uma a iação do p o ocolo de PCR inicialmen e de inido. Assim, po exemplo, pa a maximiza as hipó eses de Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de ampli icação eco eu- se, em algumas s passando de 5µl pa a 8µl ou 10µl. A análise dos p odu os ampli icados e elou, em algumas amos as, a p esença de um agmen o de DNA especí ico com o amanho espe ado, em alguns casos acompanhado po p odu os de meno es dimensões, esul an es de ampli icações impo ância da p esença des es agmen os nas mis u as de PCR não oi ida em conside ação pois como es as amos as o am, pos e io men e, subme idas à acção das en aze p oblemas. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal se, em algumas s i uações, ao aumen o da quan idade de DNA u ilizada A análise dos p odu os ampli icados e elou, em algumas amos as, a p esença de um agmen o de DNA especí ico com o amanho espe ado, em alguns casos acompanhado po odu os de meno es dimensões, esul an es de ampli icações inespecí icas (Figu a impo ância da p esença des es agmen os nas mis u as de PCR não oi ida em conside ação pois como es as amos as o am, pos e io men e, subme idas à acção das en zimas de es ição não i ia em Po ugal Resul ados 54 i uações, ao aumen o da quan idade de DNA u ilizada A análise dos p odu os ampli icados e elou, em algumas amos as, a p esença de um agmen o de DNA especí ico com o amanho espe ado, em alguns casos acompanhado po inespecí icas (Figu a 20 e 21). A impo ância da p esença des es agmen os nas mis u as de PCR não oi ida em conside ação pois zimas de es ição não i ia Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Resul ados 55 Ampli icação Eg16-PCR Fo am subme idas as 30 amos as, conside adas é eis após a obse ação mic oscópica, à ampli icação pelos “p ime s” Eg16, endo ampli icado uma zona da egião ITS-1. Nes a egião ampli icada o am encon ados en e um a ês agmen os, com 400 a 500pb dependendo do isolado analisado (Figu as 22 e 23). Nenhuma das amos as ampli icadas pela Eg16-PCR oi subme ida à acção das enzimas de es ição. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Resul ados 56 Ampli icação com Eg9-PCR: Das amos as ecolhidas, 30 o am subme idas à ampli icação a a és da Eg9-PCR, a a és dos “p ime s” especí icos (Eg9F1 e Eg9R1), endo ampli icado uma zona da egião ITS-1 e ob ido um agmen o com ce ca de 500 pb. Fo am ob idos agmen os de DNA com ce ca de 500 pb (Figu as 24 e 25). Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Resul ados 57 4.2.2 – Aplicação de enzimas de es ição à egião ITS-1 ITS-1-PCR: Pa a a aliação do pad ão de es ição, os agmen os de ce ca de 1000pb, incluídos na egião ITS-1 ob idos po PCR, o am subme idos à acção de di e sas enzimas de es ição (Bowles & McManus, 1993c; Ahmadi & Dalimi, 2006).  Rsa I Ao aplica a enzima de es ição Rsa I, oi ob ido um pad ão ca ac e ís ico e idên ico em odas as amos as (Figu a 26), endo bandas com ce ca de 700, 500, 200 e 100 pb. Figu a 26 – P odu os ITS1-PCR dige idos com Rsa I (Elec o o ese em gel de aga ose a 2,5%) (M – Ma cado Molecula )  MspI Após a aplicação da enzima de es ição Msp I ob i e am-se pad ões de diges ão semelhan es na maio pa e das amos as, ap esen ando co es na egião dos 700, 500 e 100 pb, sendo que apenas uma amos a ap esen a a um agmen o de DNA com ce ca de 1000pb (Figu a 27). 6 8 11 21 23 26 29 M M 5 10 16 22 Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Resul ados 58 Figu a 27 – P odu os ITS1-PCR dige idos com Msp I (Elec o o ese em gel de aga ose a 2,5%) (M – Ma cado Molecula )  Alu I Após aplicação da enzima Alu I o am ob idos pad ões de diges ão semelhan es em odas as amos as (700, 200 e 100 pb) (Figu a 28), exis indo em algumas uma banda com ce ca de 1000 pb, indicando que hou e DNA que não oi dige ido. Figu a 28 – P odu os ITS1-PCR dige idos com Alu I (Elec o o ese em gel de aga ose a 2,5%) (M – Ma cado Molecula ) M 6 8 11 21 23 26 29 6 8 11 21 M 23 26 29 5 10 16 22 M 5 10 16 22 M Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Resul ados 65 Figu a 36 – Compa ação das sequências ob idas com uma sequência con ida no banco de dados (GenBank: ) Capí ulo V Capí ulo V Capí ulo V Capí ulo V – –– – Discussão DiscussãoDiscussão Discussão Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 67 A ex ensa a iação na o mação do complexo de espécies E.g anulosus pode in luencia os pad ões do ciclo de ida, especi icidade do hospedei o, axa de desen ol imen o, an igenicidade, dinâmicas de ansmissão, sensibilidade aos agen es quimio e apêu icos e pa ologia (U uk, e al., 2008). 5.1 - Análise das amos as pa asi adas No uni e so de amos as do p esen e es udo, as mais áceis de ob e o am as de o inos e, ainda, algumas de bo inos, podendo explica -se es a si uação de ido ao ac o da exis ência de um maio núme o des as eses nas quin as, em elação a ou as espécies e, po ou o lado, de ido ao mé odo de c iação (median e o pas o eio com cães de gua da, no caso dos o inos, em sis emas de c iação ex ensi os ou semi-ex ensi os, no caso an o dos o inos como dos bo inos. Em ambos os sis emas, o con ac o do animal com os o os do pa asi a é ela i amen e ácil, dado que ao alimen a -se es as espécies co am o pas o mui o p óximo da base, o que az com que a p obabilidade de inge i o os p esen es no solo seja maio . Po ou o lado, ci culando li emen e pelos campos de pas o eio pode ão inge i di ec amen e a e a dos solos que es ejam con aminados com os o os do pa asi a. As amos as o am odas ecolhidas num ma adou o na Bei a In e io , no Concelho de Cas elo B anco (Alcains), mas e am p o enien es de di e en es zonas do país desde Baixo Alen ejo a é à Bei a In e io . A g ande maio ia das amos as e a p o enien e de um ag upamen o que ecebe animais p o enien es do al o Alen ejo, ou seja, na sua maio ia as amos as es udadas são êm a sua p ocedência no Alen ejo, zona conside ada endémica pa a a hida idose (Da id de Mo ais, 1998). Os dados ob idos no p esen e es udo indicam, pa a as amos as de o inos, uma maio incidência no ígado (56,6% do o al de quis os) do que no pulmão (43,4%). Não o am encon adas g andes di e enças, em e mos pe cen uais, en e os quis os é eis numa ou nou a localização Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 68 (56,7% pa a os quis os hepá icos e 52% pa a os quis os pulmona es), o que nos induz a pensa que as condições isiológicas e mecânicas de cada ó gão não in luenciam no desen ol imen o comple o do quis o (en endido como o mação de p o oescólices, o que pe mi i ia con inua o ciclo no hospedei o de ini i o). Es es esul ados es ão de aco do com alguns dos publicados em Espanha (Ponce Go do, 1995), e e en es a egiões bas an e p óximas da egião onde as amos as o am ecolhidas. No que diz espei o aos dados p o enien es de amos as de bo inos, é de ealça o ac o de ha e um núme o mui o pequeno de quis os iá eis, mas emos que e em con a que as amos as analisadas o am ambém em núme o mui o pequeno. Fo am ob idos dado simila es em Espanha (Llamaza es e a,l 1997 e Ponce Go do, 1995) demons ando a baixa iabilidade dos quis os de bo inos ali exis en es, con as ando com esul ados ap esen ados no Chile po Muñoz & Sie e s (2005) que e e em a p esença de quis os é eis em ce ca de 39% dos bo inos adul os. Em elação às amos as po uguesas ob idas não es á cla i icado o po quê da sua baixa iabilidade e e ilidade, mas pode á se de ida à acção que o sis ema imune do hospedei o exe ce sob e o pa asi a, impedindo o seu desen ol imen o e podendo le a à mo e do mesmo, daí os quis os encon ados se em de pequenas dimensões. Em odas as amos as encon adas a memb ana ge mina i a ap esen a a-se ama elada e com agmen os calci icados que se des aziam ao en a ex aí-la, podendo es e ac o es a associado à adminis ação de medicação de espec o amplo aos animais, de ido ao seu alo económico indi idual, que pode á le a a um e ei o secundá io sob e os quis os hidá icos, conduzindo à da memb ana ge mina i a (Ponce Go do, 1995), ac o que não pode se comp o ado nes e abalho. Também con ém des aca que há uma maio incidência de quis os no pulmão (55% do o al de quis os) a qual é in e ida quando se ala em quis os é eis, pois 57% do o al de quis os é eis são encon ados no ígado. Es es esul ados são coinciden es com os encon ados, na década de 90, Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 69 em Espanha, onde a di e ença na incidência de quis os nos pulmões e ígado não e a mui o di e en e da ob ida nes e abalho (Ponce Go do, 1995). Não são ap esen adas amos as ob idas em cap inos pois es es animais alimen am-se com maio equência de olhagem em amos de a bus os e ou as pequenas á o es endo, po an o, meno p obabilidade de con aminação que as ou as espécies. Po ou o lado, não é cos ume sac i ica cab as com idade su icien e pa a que possam e desen ol ido quis os hidá icos (Ponce Go do, 1995). No que diz espei o à não ob enção de amos as de suínos es e acon ecimen o p ende-se com o ipo de explo ação onde es es animais c escem: cos uma se em quin as com c iação in ensi a, onde es es se desen ol em longe dos cães e das pas agens, sendo alimen ados po ações, endo o con ac o com os o os do pa asi a mui o limi ado. Os animais que se desen ol em em egime ex ensi o ou semi-in ensi o são os que ap esen am maio p obabilidade de con aminação, con udo são em núme o in e io aos an e io es. Em elação a ou os animais que possam es a pa asi ados, como ca alos e ja alis, em Po ugal não há dados e e en es aos mesmos, sendo di ícil a ob enção de amos as no espaço de empo ese ado ao p esen e es udo. 5.2 - Análise molecula das amos as pa asi adas Uma iden i icação de ini i a dos genó ipos de E.g anulosus implica o uso e a combinação de di e sas écnicas pa a ca ac e ização do DNA. Ao longo dos úl imos anos di e sos elemen os de li e a u a êm sido publicados u ilizando es udos molecula es pa a disc imina as es i pes/genó ipos de E.g anulosus (McManus, 2006; C aig e al., 2007 e U uk e al., 2008). O uso da PCR-RFLP e a sequenciação de agmen os do gene mi ocond ial CO1 dá in o mação c edí el ace ca da Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 70 iden i icação e a iabilidade in a-especí ica do E.g anulosus (McManus, 2002). A é à ac ualidade á ios es udos o am ealizados com o ecu so à ca ac e ização molecula de isolados de E.g anulosus eco endo a PCR-RFLP em locais como México (Ma a illa e al., 2004 e Villalobos e al., 2007), Sa dinia (Va casia e al., 2006), I ão (Ha andi e al., 2002 e Ahmadi & Dalimi, 2006), Tunisia (M’ ad e al., 2005), A gen ina (Rosen i z e al., 1999), Aus alia (Gasse & Chil on, 1995), Tu quia (U uk e al., 2008) e Eslo áquia (Snábel e al., 2000), en e ou os. Bowles e McManus (1993) examina am mais de uma cen ena de isolados p o enien es de di e sos hospedei os in e mediá ios usando a PCR-RFLP da egião ibossomal ITS-1 que lhes pe mi i am isualiza di e en es es i pes de o elhas, camelos, ca alos, acas e po cos. Apesa dos di e en es hospedei os e localizações geog á icas odos os isolados da “es i pe da o elha” ap esen a am um pad ão pa a a PCR-RFLP idên ico. Nes e es udo o am desc i os ambém ““p ime s”” pa a ampli ica a egião ITS-1 que são usados a é à ac ualidade. 5.2.1 – Ampli icação da Região ITS-1 A egião ITS-1, pe encen e ao DNA ibossómico já oi al o de di e en es es udos po pa e de in es igado es que p e endiam geno ipa o E.g anulosus, al como oi e e ido an e io men e, endo es es in es igado es aplicado di e en es écnicas, ais como PCR-RFLP, sequenciação, PCR- SSCP, en e ou as (Dinkel e al., 2004). Pa a al, e usando á ios ipos de PCR com di e en es “p ime s” es udou-se es a zona do genoma do pa asi a. Ampli icação ITS-1-PCR: Na p imei a PCR aplicada, os “p ime s” usados o am desc i os po Bowles & McManus (1993b) e já o am ei os di e sos abalhos no sen ido de ampli ica es a egião genómica, ob endo um agmen o ampli icado com ce ca de 1000 pb (Ba e al., 2004). Nes a PCR oi necessá io aze Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 71 algumas al e ações, pois como ela es á desc i a na li e a u a não oi possí el consegui ampli icação com as amos as po uguesas. Após al e ação da empe a u a de “annealing” e das quan idades de “p ime s” e amos a u ilizados oi possí el ampli ica apenas 16 das 30 amos as, ou seja, ainda se á necessá io modi ica algumas condições na PCR pa a que odas as amos as possam se ampli icadas com es es “p ime s”. Pode ão exis i algumas explicações pa a a não ampli icação de de e minadas amos as como po exemplo a p esença de uma mu ação equen e, nas amos as em es udo, na zona de ligação dos “p ime s”, ou ainda a quan idade de DNA u ilizada não se su icien e ou nem se su icien emen e pu o pa a que haja a ampli icação. Também se sabe que es as écnicas de biologia molecula são bas an es sensí eis à acção de ce os inibido es pelo que pode ia e ha ido algum inibido a in e e i com algumas das amos as. As amos as que ampli ica am ap esen a am um p odu o de ampli icação com ce ca de 1000pb al como oi desc i o po Bowles e al., (1995), Hewe den e al., (2000) e Bha acha ya e al (2008), endo es es in es igado es usado amos as p o enien es de di e sas egiões geog a icamen e dis in as. Segundo Villalobos e al (2007) as amos as ao se em ampli icadas com os “p ime s” 4S e BD1 pode iam ap esen a pad ões especí icos pa a as es i pes G1 (dois p odu os de ampli icação com 900 e 1000pb) e G7 (dois p odu os de ampli icação com 1000 e 1100pb), ac o que nas amos as abalhadas não se e i icou, pois apenas ês amos as ap esen a am dois p odu os de ampli icação isí eis (Amos as 8, 11 e 23) e odas as ou as amos as que ampli ica am apenas um p odu o de ampli icação. Mais uma ez es e ac o pode se de ido a meno e iciência des a PCR, pelos mesmos mo i os que o am mencionados an e io men e. U uk e al (2008), com os mesmos “p ime s”, consegui am ampli ica a egião ITS-1, com amos as p o enien es da Tu quia, endo ob ido dois p odu os de ampli icação, con a iamen e ao ob ido no p esen e es udo, embo a odas as condições pa a a ealização da PCR i essem sido idên icas às u ilizadas com as amos as po uguesas. Assim, o na-se necessá io al e a algumas Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 72 condições de o ma a consegui uma melho ampli icação com as amos as ob idas em Po ugal e, ambém, ala ga a zona de colhei a de amos as pa a pos e io aplicação dos mesmos “p ime s” e e i ica se é man ido o p oblema ou se com es as amos as hou e di iculdade na ampli icação. Possi elmen e, pa a a esolução mais conc e a des e p oblema, o ideal se ia sequencia es a egião ITS-1 pa a as amos as abalhadas e desenha , a pa i da mesma sequenciação, no os “p ime s” e expe imen á-los com as amos as que não ampli ica am. A ampli icação des a egião po si só, e, usando es es “p ime s”, não pe mi e uma ca ac e ização gené ica su icien e pa a de e mina qual a es i pe de E.g anulosus da amos as em ques ão. Assim se á necessá ia a aplicação de ou as écnicas em conjun o com es a pa a essa ca ac e ização, al como a RFLP, pa a ob e aquela ca ac e ização. Ampli icação Eg16-PCR: No p esen e es udo eco eu-se aos “p ime s” e condições de PCR desc i as po González e al (2002) em amos as p o enien es de Espanha, onde o am o am ampli icados en e um a ês agmen os com amanho comp eendido en e 400 e 500pb da egião ITS-1, no caso de se a a de E.g anulosus es i pe da o elha e es i pe do po co. Caso alguma amos a seja de E.mul ilocula is apenas ampli ica ia um agmen o com ce ca de 450pb, al como se o uma amos a da es i pe do ca alo. Assim, pode-se dize que es e p o ocolo oi desen ol ido pa a se pode dis ingui en e E.g anulosus e E.mul ilocula is, endo já sido aplicado po di e sos in es igado es como Man e ola e al (2006), Sob ino e al (2006) e Man e ola e al (2008) e expe imen ado po nós nes e es udo. As condições da PCR u ilizada o am idên icas às que os au o es inicialmen e p econiza am endo apenas sido necessá io ace a a concen ação de “p ime s” ideal e a quan idade de amos a usada. Os esul ados ob idos o am acei á eis e mui o a o á eis aos objec i os p opos os. E ec i amen e, nas 30 amos as es udadas o am ob idos agmen os ampli icados em odas elas, Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 73 podendo-se e e i que es a PCR ap esen a a 100% de sensibilidade. Mas, o am ob idos agmen os com di e en es amanhos e di e en e núme o de agmen os po amos a, a iando desde um a cinco di e en es po amos a. Com excepção das amos as 2 e 27 odas as ou as ap esen am um pad ão de ampli icação coinciden e com o p e is o pa a E.g anulosus, segundo os esul ados e e idos po González e al (2002), ou seja, odas ap esen am en e um a ês agmen os ampli icados na zona co esponden e en e 400-500pb. A amos a 2 em um pad ão di e en e, pois ap esen a um agmen o com maio concen ação na egião dos 400pb e depois ou os com amanho supe io . A amos a 27, única de bo ino, ap esen a um agmen o ampli icado com ce ca de 500pb e ou o que se encon a ligei amen e in e io aos 400pb. Assim, os dados ob idos são conco dan es com os publicados po in es igado es que u iliza am es es mesmos ma cado es em Espanha, país limí o e com Po ugal e com o qual se man ém impo ação e expo ação de animais. Es a PCR não pode dis ingui en e as es i pes da o elha e do po co, logo as amos as que ampli ica am um a ês agmen os en e 400-500pb não nos indicam a es i pe que in ec ou essas amos as. Assim é necessá ia a aplicação de ou a écnica pa a da um esul ado mais conc e o da ca ac e ização gené ica des as amos as. Po isso es as amos as o am sujei as a enzimas de es ição pa a uma melho análise. Segundo o pad ão de ampli icação ob ido não se encon a nas nossas amos as nenhuma de E.mul ilocula is, po ém só com o uso de ou as écnicas se pode ia e uma con i mação. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Discussão 74 Ampli icação com Eg9-PCR: Pa a a aplicação des a PCR o am usados os “p ime s” Eg9F e EG9R desc i os po González e al (2002) que ampli ica am um agmen o, não epe i i o, com ce ca de 500pb da egião ITS-1. Es e p ocedimen o de PCR em sido usado po ou os in es igado es e em amos as de ou as egiões geog a icamen e dis in as do mundo, endo es es ob idos esul ados conco dan es (Sob ino e al., 2006 e Man e ola e al., 2008). No p esen e abalho as condições de PCR desc i as po González e al (2002) o am man idas, com excepção da concen ação de “p ime s” e amos a u ilizada pois as amos as não con inham odas a mesma quan idade de ma e ial gené ico do pa asi a, en ão oi necessá io encon a um alo que pudesse se pad onizado pa a odas as amos as. Fo am sujei as à ampli icação com es es “p ime s” 30 amos as p o enien es de di e en es egiões do país ha endo ampli icação especí ica em odas elas, endo sido ampli icado um agmen o com ce ca de 500pb em odas elas. Os esul ados ob idos es ão de aco do com os mencionados po alguns in es igado es em ou as egiões do mundo. Es a PCR não pe mi e dis ingui as di e en es es i pes de E.g anulosus exis en es pelo que se á necessá io a aplicação de enzimas de es ição pa a e se há di e enças genómicas que possam se de e minadas pela acção des as enzimas. 5.2.2 – Aplicação de enzimas de es ição à egião ITS-1 ITS-1-PCR: Das 16 amos as que ampli ica am com es es “p ime s” apenas 12 o am subme idas à acção das enzimas de es ição, pois ha ia amos as que ap esen a am uma ampli icação mui o aca e que não e a iá el pa a a aplicação das enzimas de es ição. Fo am usadas apenas ês enzimas de Capí ulo VI Capí ulo VI Capí ulo VI Capí ulo VI - -- - Conclusões ConclusõesConclusões Conclusões Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Conclusão 82 O p esen e abalho p ocu ou con ibui pa a a ca ac e ização mo ológica e molecula do E.g anulosus em Po ugal, iniciando-se o es udo com amos as p o enien es da egião in e io do país. Face aos esul ados ob idos nes e abalho podemos conclui que: 1. Das 59 amos as ecolhidas ce ca de 52% e am é eis e po an o podia-se ex ai ma e ial gené ico das mesmas; 2. Hou e uma maio quan idade de amos as de o inos ecolhidas em elação às de bo inos; 3. Não hou e g ande di e ença, em e mos de e ilidade, en e as amos as p o enien es de ígados e as p o enien es de pulmão; 4. A maio pa e das amos as e a p oceden e de Pon e de So (36 amos as); 5. A análise do DNA mi ocond ial pe mi iu, po compa ação com esul ados publicados, con i ma a p esença da es i pe G1 (es i pe da o elha), em Po ugal; 6. Fo am encon ados 3 haplo ipos, os quais ap esen a am baixa a iabilidade gené ica e elada pela análise do DNA mi ocond ial, pois e am quase odos p o enien es do mesmo ipo de hospedei o; 7. O uso de PCR-RFLP não pe mi e, po si só, geno ipa o E.g anulosus, sendo necessá io uma écnica ainda mais especí ica. Re e ências Bibliog á icas Re e ências Bibliog á icasRe e ências Bibliog á icas Re e ências Bibliog á icas Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 84  AHMADI, N. & DALIMI, A. 2006. Cha ac e iza ion o Echinococcus g anulosus isola es om human, sheep and camel in I an. In ec Gene E ol, 6(2): 85-90.  ALMEIDA, F.B., RODRIGUES-SILVA, R., NEVES, R.H., ROMANI, E.L. & MACHADO-SILVA, J.R. 2007. In aspeci ic a ia ion o Echinococcus g anulosus in li es ock om Pe u. Ve Pa asi ol, 143(1): 50-58.  ANDERSEN, F.L., OUHELLI, H. & KACHANI, M., 1997. Compendium On Cys ic Echinococcosis – In A ica And In Middle Eas e n Coun ies Wi h Special Re e ence To Mo occo, 1s Edi ion, B ingham Young Uni e si y, Usa.  AZLAF, R. & DAKKAK, A. 2006. Epidemiological s udy o he cys ic echinococcosis in Mo occo. Ve Pa asi ol, 137(1-2): 83-93.  BADARACO, J.L., AYALA, F.J., BART, J.M., GOTTSTEIN, B. & HAAG, K.L. 2008. Using mi ochond ial and nuclea ma ke s o e alua e he deg ee o gene ic cohesion among Echinococcus popula ions. Exp Pa asi ol, 119(4): 453-459.  BARDONNET, K., BENCHIKH-ELFEGOUN, M.C., BART, J.M., HARRAGA, S., HANNACHE, N., HADDAD, S., DUMON, H., VUITTON, D.A. & PIARROUX, R. 2003. Cys ic echinococcosis in Alge ia: ca le ac as ese oi s o a sheep s ain and may con ibu e o human con amina ion. Ve Pa asi ol, 116(1): 35-44.  BART, J.M., ABDUKADER, M., ZHANG, Y.L., LIN, R.Y., WANG, Y.H., NAKAO, M., ITO, A., CRAIG, P.S., PIARROUX, R., VUITTON, D.A. & WEN, H. 2006. Geno yping o human cys ic echinococcosis in Xinjiang, PR China. Pa asi ology, 133(P 5): 571-579.  BART, J.M., BARDONNET, K., ELFEGOUN, M.C., DUMON, H., DIA, L., VUITTON, D.A. & PIARROUX, R. 2004. Echinococcus g anulosus s ain yping in No h A ica: compa ison o eigh nuclea and mi ochond ial DNA agmen s. Pa asi ology, 128(P 2): 229-234. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 85  BHATTACHARYA, D., BERA, A.K., BERA, B.C., MAITY, A. & DAS, S.K. 2007. Geno ypic cha ac e isa ion o Indian ca le, bu alo and sheep isola es o Echinococcus g anulosus. Ve Pa asi ol, 143(3-4): 371-374.  BHATTACHARYA, D., BERA, A.K., BERA, B.C., PAN, D. & DAS, S.K. 2008. Molecula app aisal o Indian animal isola es o Echinococcus g anulosus. Indian J Med Res, 127(4): 383-387.  BIAVA, M.F., DAO, A. & FORTIER, B. 2001. Labo a o y diagnosis o cys ic hyda ic disease. Wo ld J Su g, 25(1): 10-14.  BORGES FERREIRA, L. D. 1980. As campanhas de lu a con a a Equinococose/Hida idose, em Po ugal. Re is a Po uguesa de Ciências Ve e iná ias, LXXV (453): 1-30.  BOWLES, J. & MCMANUS, D.P. 1993a. NADH dehyd ogenase 1 gene sequences compa ed o species and s ains o he genus Echinococcus. In J Pa asi ol, 23(7): 969-972.  BOWLES, J. & MCMANUS, D.P. 1993b. Molecula a ia ion in Echinococcus. Ac a T op, 53(3-4): 291-305.  BOWLES, J. & MCMANUS, D.P. 1993c. Rapid disc imina ion o Echinococcus species and s ains using a polyme ase chain eac ion-based RFLP me hod. Mol Biochem Pa asi ol, 57(2): 231-239.  BOWLES, J., BLAIR, D. & MCMANUS, D.P. 1992. Gene ic a ian s wi hin he genus Echinococcus iden i ied by mi ochond ial DNA sequencing. Mol Biochem Pa asi ol, 54(2): 165- 173.  BOWLES, J., BLAIR, D. & MCMANUS, D.P. 1994. Molecula gene ic cha ac e iza ion o he ce id s ain ('no he n o m') o Echinococcus g anulosus. Pa asi ology, 109 ( P 2): 215-221.  BOWLES, J., BLAIR, D. & MCMANUS, D.P. 1995. A molecula phylogeny o he genus Echinococcus. Pa asi ology, 110 ( P 3): 317-328. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 86  BREYER, I., GEORGIEVA, D., KURDOVA, R. & GOTTSTEIN, B. 2004. Echinococcus g anulosus s ain yping in Bulga ia: he G1 geno ype is p edominan in in e media e and de ini i e wild hos s. Pa asi ol Res, 93(2): 127-130.  BUISHI, I., WALTERS, T., GUILDEA, Z., CRAIG, P. & PALMER, S. 2005. Reeme gence o canine Echinococcus g anulosus in ec ion, Wales. Eme g In ec Dis, 11(4): 568-571.  BUSI, M., SNABEL, V., VARCASIA, A., GARIPPA, G., PERRONE, V., DE LIBERATO, C. & D'AMELIO, S. 2007. Gene ic a ia ion wi hin and be ween G1 and G3 geno ypes o Echinococcus g anulosus in I aly e ealed by mul ilocus DNA sequencing. Ve Pa asi ol, 150(1-2): 75-83.  CABRERA, P.A., HARAN, G., BENAVIDEZ, U., VALLEDOR, S., PERERA, G., LLOYD, S., GEMMELL, M.A., BARAIBAR, M., MORANA, A., MAISSONAVE, J. & ET AL. 1995. T ansmission dynamics o Echinococcus g anulosus, Taenia hyda igena and Taenia o is in sheep in U uguay. In J Pa asi ol, 25(7): 807-813.  CAMICIA, F., PAREDES, R., CHALAR, C., GALANTI, N., KAMENETZKY, L., GUTIERREZ, A. & ROSENZVIT, M.C. 2008. Sequencing, bioin o ma ic cha ac e iza ion and exp ession pa e n o a pu a i e amino acid anspo e om he pa asi ic ces ode Echinococcus g anulosus. Gene, 411(1-2): 1-9.  CAPUANO, F., RINALDI, L., MAURELLI, M.P., PERUGINI, A.G., VENEZIANO, V., GARIPPA, G., GENCHI, C., MUSELLA, V. & CRINGOLI, G. 2006. Cys ic echinococcosis in wa e bu aloes: epidemiological su ey and molecula e idence o o ine (G1) and bu alo (G3) s ains. Ve Pa asi ol, 137(3-4): 262-268.  CARMENA, D., SANCHEZ-SERRANO, L.P. & BARBERO-MARTINEZ, I. 2008. Echinococcus g anulosus in ec ion in Spain. Zoonoses Public Heal h, 55(3): 156-165.  CASULLI, A., MANFREDI, M.T., LA ROSA, G., CERBO, A.R., GENCHI, C. & POZIO, E. 2008. Echinococcus o leppi and E. g anulosus G1, G2 and G3 geno ypes in I alian bo ines. Ve Pa asi ol. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 87  CHRIEKI, M. 2002. Echinococcosis--An Eme ging Pa asi e In The Immig an Popula ion. Am Fam Physician, 66(5): 817-820.  CRAIG, P.S., MCMANUS, D.P., LIGHTOWLERS, M.W., CHABALGOITY, J.A., GARCIA, H.H., GAVIDIA, C.M., GILMAN, R.H., GONZALEZ, A.E., LORCA, M., NAQUIRA, C., NIETO, A. & SCHANTZ, P.M. 2007. P e en ion and con ol o cys ic echinococcosis. Lance In ec Dis, 7(6): 385-394.  CRUZ-REYES, A., CONSTANTINE, C.C., BOXELL, A.C., HOBBS, R.P. & THOMPSON, R.C. 2007. Echinococcus g anulosus om Mexican pigs is he same s ain as ha in Polish pigs. J Helmin hol, 81(3): 287-292.  CUESTA-BANDERA, C., MCMANUS, D.P. & RISHI, A.K. 1988. Cha ac e iza ion o Echinococcus g anulosus o Spanish o igin by DNA es ic ion endonuclease analysis and Sou he n blo hyb idiza ion. In J Pa asi ol, 18(1): 137-141.  DALIMI, A., SATTARI, A. & MOTAMEDI, G. 2006. A s udy on in es inal helmin hes o dogs, oxes and jackals in he wes e n pa o I an. Ve Pa asi ol, 142(1-2): 129-133.  DANIEL MWAMBETE, K., PONCE-GORDO, F. & CUESTA-BANDERA, C. 2004. Gene ic iden i ica ion and hos ange o he Spanish s ains o Echinococcus g anulosus. Ac a T op, 91(2): 87-93.  DANIEL MWAMBETE, K., PONCE-GORDO, F. & CUESTA-BANDERA, C. 2004. Gene ic iden i ica ion and hos ange o he Spanish s ains o Echinococcus g anulosus. Ac a T op, 91(2): 87-93.  DAVID DE MORAIS, J., ROMBERT, P. C. & TRINCA, A. T. 1985. Subsídios pa a o conhecimen o da epidemiologia da hida idose u al no Al o Alen ejo. Inqué i o se o-epidemiológico e ec uado em duas aldeias da eguesia de San iago Maio . Re . Po .de Doenças In ecciosas.8 (1- 4): 83-94.  DAVID DE MORAIS, J.A. 1998. A Hida idologia Em Po ugal. Ed. Fundação Calous e Gulbenkian, Lisboa. 334 Páginas. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 88  DAVID MORAIS, J.A. 2007. Hida idose Humana Es udo Clinic-Epidemiológico no dis i o de É o a du an e um qua o de século. Ac a Med Po , 20: 1-10.  DINKEL, A., NJOROGE, E.M., ZIMMERMANN, A., WALZ, M., ZEYHLE, E., ELMAHDI, I.E., MACKENSTEDT, U. & ROMIG, T. 2004. A PCR sys em o de ec ion o species and geno ypes o he Echinococcus g anulosus-complex, wi h e e ence o he epidemiological si ua ion in eas e n A ica. In J Pa asi ol, 34(5): 645-653.  ECKERT, J. & DEPLAZES, P. 2004. Biological, epidemiological, and clinical aspec s o echinococcosis, a zoonosis o inc easing conce n. Clin Mic obiol Re , 17(1): 107-135.  ECKERT, J. & THOMPSON, R.C. 1997. In aspeci ic a ia ion o Echinococcus g anulosus and ela ed species wi h emphasis on hei in ec i i y o humans. Ac a T op, 64(1-2): 19-34.  ECKERT, J. 1997. Epidemiology o Echinococcus mul ilocula is and E. g anulosus in cen al Eu ope. Pa assi ologia, 39(4): 337-344.  ECKERT, J., GEMMELL, M.A., MESLIN F.-X. & PAWŁOWSKI, Z.S. 2001. Who/Oie Manual On Echinococcosis In Humans And Animals: A Public Heal h P oblem O Global Conce n. Wo ld O ganisa ion Fo Animal Heal h. Pa is. 286 Páginas.  EUZEBY, J. 1991. The epidemiology o hyda idosis wi h special e e ence o he Medi e anean a ea. Pa assi ologia, 33(1): 25-39.  FERREIRA, C., SMÕES, F. & COITO, F. 1945. Ace ca do g au de in es ação helmín ica dos cães de Lisboa. Lisboa: 1ªReunião Biológica Po uguesa: 289-294.  GARIPPA, G. 2006. Upda es on cys ic echinococcosis (CE) in I aly. Pa assi ologia, 48(1- 2): 57-59.  GASSER, R.B. & CHILTON, N.B. 1995. Cha ac e isa ion O Taeniid Ces ode Species By Pc -R lp O I s2 Ribosomal Dna. Ac a T op, 59(1): 31-40. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 89  GONZALEZ, L.M., DANIEL-MWAMBETE, K., MONTERO, E., ROSENZVIT, M.C., MCMANUS, D.P., GARATE, T. & CUESTA-BANDERA, C. 2002. Fu he molecula disc imina ion o Spanish s ains o Echinococcus g anulosus. Exp Pa asi ol, 102(1): 46-56.  GOTTSTEIN, B. 1992. Molecula and immunological diagnosis o echinococcosis. Clin Mic obiol Re , 5(3): 248-261.  GRÁCIO, M.A.A., JORGE, F., TRINCA, A. 2002. Human hyda ic disease in Po ugal: diagnosed cases and a se oepidemiological su ey. Ac a T opica 83(S1): S118  HAAG, K.L., ARAUJO, A.M., GOTTSTEIN, B. & ZAHA, A. 1998. Selec ion, ecombina ion and his o y in a pa asi ic la wo m (Echinococcus) in e ed om nucleo ide sequences. Mem Ins Oswaldo C uz, 93(5): 695-702.  HARANDI, M.F., HOBBS, R.P., ADAMS, P.J., MOBEDI, I., MORGAN-RYAN, U.M. & THOMPSON, R.C. 2002. Molecula and mo phological cha ac e iza ion o Echinococcus g anulosus o human and animal o igin in I an. Pa asi ology, 125(P 4): 367-373.  HIRVELA-KOSKI, V., HAUKISALMI, V., KILPELA, S.S., NYLUND, M. & KOSKI, P. 2003. Echinococcus g anulosus in Finland. Ve Pa asi ol, 111(2-3): 175-192.  HOPE, M., BOWLES, J. & MCMANUS, D.P. 1991. A econside a ion o he Echinococcus g anulosus s ain si ua ion in Aus alia ollowing RFLP analysis o cys ic ma e ial. In J Pa asi ol, 21(4): 471-475.  HUTTNER, M., NAKAO, M., WASSERMANN, T., SIEFERT, L., BOOMKER, J.D., DINKEL, A., SAKO, Y., MACKENSTEDT, U., ROMIG, T. & ITO, A. 2008. Gene ic cha ac e iza ion and phylogene ic posi ion o Echinococcus elidis (Ces oda: Taeniidae) om he A ican lion. In J Pa asi ol, 38(7): 861-868.  JENKINS, D.J. 2006. Echinococcus g anulosus in Aus alia, widesp ead and doing well! Pa asi ol In , 55 Suppl: S203-206.  JENKINS, D.J., ROMIG, T. & THOMPSON, R.C. 2005. Eme gence/ e-eme gence o Echinococcus spp.--a global upda e. In J Pa asi ol, 35(11-12): 1205-1219. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 90  JORGE, F.M. 2000. Hida idose Humana no dis i o de Cas elo B anco con ibuição pa a o seu conhecimen o. Tese De Mes ado. Ihm – Uni e sidade No a De Lisboa. 83 Páginas.  KAMENETZKY, L., GUTIERREZ, A.M., CANOVA, S.G., HAAG, K.L., GUARNERA, E.A., PARRA, A., GARCIA, G.E. & ROSENZVIT, M.C. 2002. Se e al s ains o Echinococcus g anulosus in ec li es ock and humans in A gen ina. In ec Gene E ol, 2(2): 129-136.  LAVIKAINEN, A., LEHTINEN, M.J., LAAKSONEN, S., AGREN, E., OKSANEN, A. & MERI, S. 2006. Molecula cha ac e iza ion o Echinococcus isola es o ce id o igin om Finland and Sweden. Pa asi ology, 133(P 5): 565-570.  LAVIKAINEN, A., LEHTINEN, M.J., MERI, T., HIRVELA-KOSKI, V. & MERI, S. 2003. Molecula gene ic cha ac e iza ion o he Fennoscandian ce id s ain, a new geno ypic g oup (G10) o Echinococcus g anulosus. Pa asi ology, 127(P 3): 207-215.  LE, T.H., PEARSON, M.S., BLAIR, D., DAI, N., ZHANG, L.H. & MCMANUS, D.P. 2002. Comple e mi ochond ial genomes con i m he dis inc i eness o he ho se-dog and sheep-dog s ains o Echinococcus g anulosus. Pa asi ology, 124(P 1): 97-112.  LEITÃO, J. L. 1960. Re e ência à Equinococose em Po ugal. A qui o de Pa ologia do I.P.O. 32: 71-122.  LEWALL, D.B. 1998. Hyda id Disease: Biology, Pa hology, Imaging And Classi ica ion. Clin Radiol, 53(12): 863-874.  LI, T., ITO, A., NAKAYA, K., QIU, J., NAKAO, M., ZHEN, R., XIAO, N., CHEN, X., GIRAUDOUX, P. & CRAIG, P.S. 2008. Species iden i ica ion o human echinococcosis using his opa hology and geno yping in no hwes e n China. T ans R Soc T op Med Hyg, 102(6): 585- 590.  LLAMAZARES, J.L.G., FILIPE, A.I.A., CARDEÑA, P.A.R. & FERNÁNDEZ, J.G.P. 1997. Es udio De La Fe ilidad Y Viabilidad De Quis es Hida ídicos O inos. Re Esp Salud Pública, 71: 445-449. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 97  VICIDOMINI, S., CANCRINI, G., GABRIELLI, S., NASPETTI, R. & BARTOLONI, A. 2007. Muscula cys ic hyda idosis: case epo . BMC In ec Dis, 7: 23.  VILLALOBOS, N., GONZALEZ, L.M., MORALES, J., DE ALUJA, A.S., JIMENEZ, M.I., BLANCO, M.A., HARRISON, L.J., PARKHOUSE, R.M. & GARATE, T. 2007. Molecula iden i ica ion o Echinococcus g anulosus geno ypes (G1 and G7) isola ed om pigs in Mexico. Ve Pa asi ol, 147(1-2): 185-189.  VURAL, G., BACA, A.U., GAUCI, C.G., BAGCI, O., GICIK, Y. & LIGHTOWLERS, M.W. 2008. Va iabili y in he Echinococcus g anulosus Cy och ome C oxidase 1 mi ochond ial gene sequence om li es ock in Tu key and a e-app aisal o he G1-3 geno ype clus e . Ve Pa asi ol, 154(3-4): 347-350.  YANG, Y.R., ROSENZVIT, M.C., ZHANG, L.H., ZHANG, J.Z. & MCMANUS, D.P. 2005. Molecula s udy o Echinococcus in wes -cen al China. Pa asi ology, 131(P 4): 547-555.  YUKSEL, M., DEMIRPOLAT, G., SEVER, A., BAKARIS, S., BULBULOGLU, E. & ELMAS, N. 2007. Hyda id Disease In ol ing Some Ra e Loca ions In The Body: A Pic o ial Essay. Ko ean J Radiol, 8(6): 531-540.  ZANINI, F., GONZALO, R., PEREZ, H., APARICI, I., SOTO, X., GUERRERO, J., CERRONE, G. & ELISSONDO, C. 2006a. Epidemiological su eillance o o ine hyda idosis in Tie a del Fuego, Pa agonia A gen ina, 1997-1999. Ve Pa asi ol, 138(3-4): 377-381.  ZANINI, F., LAFERRARA, M., BITSCH, M., PEREZ, H. & ELISSONDO, M.C. 2006b. Epidemiological s udies on in es inal helmin h pa asi es o he pa agonian g ey ox (Pseudalopex g iseus) in Tie a del Fuego, Pa agonia A gen ina. Ve Pa asi ol, 136(3-4): 329-334.  ZHANG, L., GASSER, R.B., ZHU, X. & MCMANUS, D.P. 1999. Sc eening o di e en geno ypes o Echinococcus g anulosus wi hin China and A gen ina by single-s and con o ma ion polymo phism (SSCP) analysis. T ans R Soc T op Med Hyg, 93(3): 329-334. Con ibu o pa a a ca ac e ização molecula de Echinococcus g anulosus em Po ugal Re e ências Bibliog á icas 98  ZHANG, L.H., CHAI, J.J., JIAO, W., OSMAN, Y. & MCMANUS, D.P. 1998. Mi ochond ial genomic ma ke s con i m he p esence o he camel s ain (G6 geno ype) o Echinococcus g anulosus in no h-wes e n China. Pa asi ology, 116 ( P 1): 29-33.  ZHANG, L.H., CHAI, J.J., JIAO, W., OSMAN, Y. & MCMANUS, D.P. 1998. Mi ochond ial genomic ma ke s con i m he p esence o he camel s ain (G6 geno ype) o Echinococcus g anulosus in no h-wes e n China. Pa asi ology, 116 ( P 1): 29-33.  ZHANG, W., LI, J. & MCMANUS, D.P. 2003. Concep s in immunology and diagnosis o hyda id disease. Clin Mic obiol Re , 16(1): 18-36.  ZHANG, Y., BART, J.M., GIRAUDOUX, P., CRAIG, P., VUITTON, D. & WEN, H. 2006. Mo phological and molecula cha ac e is ics o Echinococcus mul ilocula is and Echinococcus g anulosus mixed in ec ion in a dog om Xinjiang, China. Ve Pa asi ol, 139(1-3): 244-248.