Interacção parasita-hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

Uni e sidade No a de Lisboa Ins i u o de Higiene e Medicina T opical In e acção Pa asi a-Hospedei o e suscep ibilidade de Leishmania in an um a á macos Ca la Alexand a Soa es Maia Lisboa 2008 Disse ação de Candida u a ao G au de Dou o no Ramo das Ciências Biomédicas, especialidade de Pa asi ologia, pela Uni e sidade No a de Lisboa, Ins i u o de Higiene e Medicina T opical. Es e abalho oi ealizado na Unidade de Leishmanioses, Cen o de Malá ia e Ou as Doenças T opicais, do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical da Uni e sidade No a de Lisboa, sob o ien ação da P o esso a Dou o a Dou o a Lenea Campino. O inanciamen o oi concedido pela Fundação pa a a Ciência e Tecnologia, Minis é io da Ciência, Tecnologia e Ensino Supe io a a és da bolsa de dou o amen o SFRH / BD / 12523 / 2003 do p og ama POCI 2010- Fo mação A ançada pa a a Ciência e do p ojec o POCI/CVT/56357/2004 ap o ado pela FCT e pelo POCI, compa icipado pelo undo comuni á io eu opeu FEDER. A odos os animais de expe imen ação que de am a sua ida à Ciência e, em especial, aos “meus” beagles que ize am com que udo alesse a pena Pa a se g ande, sê in ei o: nada Teu exage a ou exclui. Sê odo em cada coisa. Põe quan o és No mínimo que azes. Assim em cada lago a lua oda B ilha, po que al a i e. ‘Pa a se G ande’ Odes de Rica do Reis 4.1.2. In ecção de lebó omos com p omas igo as de L. in an um a ados ou não com an o e icina B 175 4.1.2.1. Pa asi as 175 4.1.2.2. Flebó omos 176 4.1.2.3. In ecção dos lebó omos po alimen ação a i icial 176 4.1.3. De e minação da pe cen agem e in ensidade da in ecção 176 4.2. Resul ados 177 4.2.1. Pe cen agem e in ensidade da in ecção dois dias após e eição a i icial 177 4.2.2. Pe cen agem e in ensidade da in ecção dez dias após e eição a i icial 180 4.3. Discussão 184 CAPÍTULO V – Es udos de suscep ibilidade de Leishmania a á macos 5.1. Ma e ial e Mé odos 189 5.1.1. Fá macos u ilizados 189 5.1.2. Es i pes de Leishmania u ilizadas 189 5.1.3. Op imização do sis ema de p omas igo as axénicos 190 5.1.3.1. Con agem po mic oscopia óp ica do núme o de p omas igo as iá eis 190 5.1.3.2. Ac i idade da os a ase ácida 190 5.1.3.3. Ac i idade da lac a o desid ogenase 191 5.1.3.4. XTT 191 5.1.3.5. Ac i idade do PicoG een® 191 5.1.4. De e minação da suscep ibilidade in i o dos p omas igo as axénicos aos á macos em es udo 192 5.1.5. Op imização do sis ema amas igo a-mac ó ago 193 5.1.5.1. Selecção do sis ema de mac ó agos 193 5.1.5.1.1. Di e enciação de monóci os em mac ó agos a pa i do sangue pe i é ico canino e humano 193 5.1.5.1.2. Di e enciação de monóci os em mac ó agos a pa i de células p ecu so as da medula óssea de mu ganhos (BMDM) 193 5.1.5.1.3. Mac ó agos pe i oneais de i ados de mu ganhos 194 5.1.5.1.4. Di e enciação das células da linha monoci á ia U-937 em mac ó agos 194 5.1.5.1.5. Mac ó agos de i ados da linha canina his ioci á ia DH82 195 5.1.5.2. In ecção de mac ó agos in i o 196 5.1.5.3. De e minação de dose máxima ole ada pela linha U-937 aos á macos 196 5.1.6. De e minação da suscep ibilidade in i o dos amas igo as in amac o ágicos aos á macos 196 5.1.7. Apop ose nos amas igo as in amac o ágicos po acção dos á macos 197 5.1.8. P odução in i o de ci ocinas 198 5.1.9. Mecanismos de quimio esis ência: iden i icação de al e ações gené icas e pad ões de esis ência c uzada 199 5.1.9.1. Selecção in i o de pa asi as de L. in an um esis en es ao Fungizone® e a aliação de pad ões de esis ência c uzada (mul i esis ência) 199 5.1.9.2. A aliação da es abilidade do enó ipo de esis ência 199 5.1.9.3. Co elação en e enó ipos de esis ência e al e ações no gene md 199 5.1.10. Análise es a ís ica 201 5.2. Resul ados 201 5.2.1. Sis ema p omas igo as axénicos 201 5.2.2. De e minação da suscep ibilidade in i o dos p omas igo as axénicos aos á macos 203 5.2.3. Sis ema amas igo a-mac ó ago 204 5.2.3.1. Selecção do sis ema de mac ó agos 204 5.2.3.2. De e minação de dose máxima ole ada pela linha U-937 aos á macos 206 5.2.3.3. De e minação da suscep ibilidade in i o dos amas igo as in amac o ágicos aos á macos 207 5.2.4. Mecanismos de quimio esis ência: iden i icação de al e ações gené icas e pad ões de esis ência c uzada 208 5.2.4.1. Selecção in i o de pa asi as de Leishmania esis en es ao Fungizone® e a aliação de pad ões de esis ência c uzada 208 5.2.4.1.1. Fo mas p omas igo as 208 5.2.4.1.2. Fo mas amas igo as 210 5.2.4.2. A aliação da es abilidade do enó ipo de esis ência 210 5.2.4.3. Fenó ipos de esis ência e al e ações do gene md 211 5.2.5. A aliação da oco ência de apop ose nos amas igo as in amac o ágicos 214 5.2.6. A aliação da p odução in i o de ci ocinas 216 5.2.6.1. P odução de IL-10 216 5.2.6.2. P odução de TNF-α 218 5.3. Discussão 220 CAPÍTULO VI – CONCLUSÕES 233 CAPÍTULO VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 239 Ag adecimen os ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ XX AGRADECIMENTOS À minha o ien ado a cien í ica, P o esso a Lenea Campino, Di ec o a da Unidade de Leishmanioses, pelo es ímulo e expe iência pa ilhados e pela esponsabilidade que me con iou, con ibuindo assim pa a a minha o mação écnico-cien í ica e pa a o meu c escimen o in elec ual. Um ob igada mui o especial po e ac edi ado em mim, nas minhas “loucu as” e nos meus “speeds”. Foi uma g ande e inigualá el lição de ida. À minha comissão u o ial, P o esso Hen ique Sil ei a, da Unidade de Malá ia do IHMT e P o esso Ped o C a o, da Unidade de Biologia Molecula do IHMT, o meu since o ap eço pela o ma c í ica e cons u i a como acompanha am es e abalho. Ao Theo, à Ca he ine, ao Nick e ao João pela con iança deposi ada na minha pessoa ao pe mi i em que ac uasse como in es igado a e médica e e iná ia esponsá el pelo es udo expe imen al e bem-es a animal num es udo clínico ão impo an e. Um ob igada especial ao Theo (e ao João pelo “ o cing”) po me pe mi i a di ulgação dos esul ados ob idos. Não posso deixa de ag adece à Ca he ine po oda a ajuda (a é al as ho as da mad ugada) na execução des e p ojec o e pelos incon á eis “no es o ile” que p eenchemos jun as. Ao P o esso Dou o Pe Vol pelos conhecimen os ansmi idos e pela opo unidade que me deu de ealiza a in ecção expe imen al dos lebó omos no seu labo a ó io de Pa asi ologia, na Facul y o Science Cha les Uni e si y, P aga, República Checa. Um ob igada especial à Dou o a Ve a Vo ipka, Dou o a Jo ana Sadlo á, D ª Ji ka Hos omska e D ª Lucie Jecna. Um ab aço calo oso aos es an es memb os da equipa po esponde em às inúme as ques ões po mim colocadas e po me aze em sen i uma “sand ly gi l”. Ao P o esso Luís Tá o a Ta i a, pela disponibilidade e simpa ia semp e mani es adas e como Coo denado do Cen o de Malá ia e ou as Doenças T opicais, pelo apoio ma e ial concedido. Ag adecimen os ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ XXI À P o esso a Ca ed ádica de Pa asi ologia Mon se a Po ús e ao P o esso Jaume Ca ió do Labo a ó io de Pa asi ologia da Faculdade de Fa mácia, Uni e sidade de Ba celona, Espanha pela disponibilidade demons ada pa a a ap endizagem de écnicas que pe mi i am inicia o es udo da suscep ibilidade aos á macos. À Mes e Te esa Ba is a Fe nandes, ao Dou o José Ma oso e à P o esso a Te esa Ma ques do Se iço de Mic obiologia do Se iço de Pa ologia Clínica do Hospi al de San a C uz pela disponibilidade pa a me ecebe em e ensina em a manu enção e u ilização de linhas celula es. Ao Dou o Ja ie Mo eno e P o esso a Ca men Caña a e do Ins i u o de Salud Ca los III, Espanha pela cedência da linha celula DH82 assim como po odo o in e câmbio cien í ico. À P o esso a Esme alda Delgado, da Faculdade de Medicina Ve e iná ia da Uni e sidade Técnica de Lisboa, a quem ag adeço a p eciosa colabo ação no exame o almológico dos Beagle. À P o esso a Ca ed á ica Conceição Pele ei o da Faculdade de Medicina Ve e iná ia da Uni e sidade Técnica de Lisboa, a quem ag adeço a p eciosa colabo ação na análise his opa ológica dos ó gãos ob idos aquando a nec ópsia dos Beagle. Ao Nuno Rolão a sua disponibilidade no acompanhamen o des e es udo e pelos seus conhecimen os, os quais con ibuí am pa a a conc e ização dos objec i os p opos os. À Mónica Nunes, a ajuda indispensá el que deu à sua “che inha” na execução de milha es de PCR e milhen os géis de aga ose e às meninas “ esis en es” Élia Cab i a, Mónica Ma ques e So ia Hen iques po oda o auxílio no es udo in i o e in i o elacionado com a quimio- esis ência. Ao Dou o Clemen Bo die , Bo die A ini y P oduc s SA, Suíça, pela o e a do ki de ELISA e do es e p o ó ipo “La e al- low es o he diagnosis o dog isce al leishmaniosis” e ao Dou o Henk Schalling, KIT Biomedical Resea ch, Holanda, pela o e a do an igénio lio ilizado pa a a DAT. Ag adecimen os ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ XXII Ao Manu Vanae scho pelas ho as que passámos online a “no maliza ” genes. À Zen a is, Alemanha pela o e a do Mil e osine; à B is on Mye s Squibb, Po ugal, peloa o e a do Fungizone®; à Rhône Mé ieux, Po ugal pela o e a do Glucan ime® e à A al-Cipan, Po ugal, pela o e a do Alopu inol. Aos écnicos da Unidade de Leishmanioses, especialmen e ao José Manuel C is ó ão pelo companhei ismo e po odo a apoio p es ado na ecolha e p ocessamen o das in indá eis amos as, e à auxilia de labo a ó io, A minda Ba bosa, pelo seu amo aos animais e pela o e a das colo idas iole inhas. Aos meus colegas e e iná ios, Ped o Se a, Ma alda Lou enço, Ma ga ida Al es, Ped o Sil a, Esme alda Delgado po odo o ca inho e AMIZADE (e em alguns casos pelos mui os quilóme os pe co idos) demons ados nos momen os mais di íceis des e p ojec o. Aos meus amigos de semp e: João Alho, B uno Bap is a e Miguel Pa ício. Aos meus “meninos” Cla a, Apolo e A las pelo “ olun a iado à o ça” pa a op imização de algumas das écnicas u ilizadas nes e es udo. À P o esso a Gab iela San os Gomes e às minhas colegas “leishmaníacas” So ia Co es, Olí ia Rod igues, Cláudia Ma ques, Ma a Clemen e, Ca ina Es e es e Ana Fa inha po odos os momen os cien í icos e não cien í icos que pa ilhamos. À P o esso Ma ia Ode e A onso da Unidade de En omologia Médica/UPMM po me ajuda a sedimen a o meu gos o pela en omologia e po me inicia no es udo da in e acção pa asi a- ec o . Ag adeço ambém ao P o esso Ca ed á ico An ónio G ácio, Di ec o da Unidade de En omologia pela disponibilidade mani es ada e apoio logís ico. À P o esso a Luzia Gonçal es, da Unidade de Epidemiologia e Bioes a ís ica, pela ajuda na análise es a ís ica. Ag adecimen os ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ XXIII À minha MÃE e ao Ped o pelo apoio e incen i o incondicionais du an e odo o meu pe cu so e, uma ez mais, o meu ob igada in ini o a odos os animais de expe imen ação u ilizados nes e abalho. Aos es an es colegas, amigos e amilia es (a ó, onde que que es ejas, um beijinho) po es a em p esen es. Resumo ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ XXIV RESUMO As leishmanioses são doenças causadas po um p o ozoá io in acelula pe encen e à o dem Kine oplas ida, da amília T ypanosoma idae, do géne o Leishmania. Os pa asi as são ansmi idos aos hospedei os e eb ados po díp e os pe encen es à sub- amília Phlebo ominae. De ido à inexis ência de acinas a quimio e apêu ica con inua a ep esen a o único mecanismo de p e enção e con olo. Os á macos de p imei a linha pa a o a amen o da leishmaniose isce al con inuam a se os an imoniais pen a alen es e a an o e icina B (AMB). A AMB lipossómica es á a se cada ez mais u ilizada como 1ª linha. O conhecimen o do(s) mecanismo(s) u ilizados pelos pa asi as, esponsá eis pela esis ência, é undamen al de modo a pe mi i o desen ol imen o de no os á macos an i-Leishmania que possam subs i ui e/ou complemen a os á macos exis en es, de uma o ma e icaz assim como con ibui pa a o desen ol imen o de me odologias pa a a alia e moni o iza a esis ência. Espe a-se do modelo animal a ep odução da in ecção na Na u eza. Os modelos canino e mu ino êm ajudado na comp eensão dos mecanismos esponsá eis pela pa ogénese e pela espos a imuni á ia à in ecção po Leishmania. Sendo o cão o p incipal hospedei o da in ecção po L. in an um e o p incipal ese a ó io domés ico da leishmaniose isce al humana, p ocedeu-se à ca ac e ização da e olução da in ecção expe imen al em canídeos de aça Beagle a a és da análise clínica, hema ológica, his opa ológica, pa asi á ia, assim com a a és da espos a imuni á ia desen ol ida. As al e ações hema ológicas obse adas o am as associadas à leishmaniose isce al: anemia, leucopenia, omboci openia com aumen o das p o eínas o ais e da acção gama-globulina, e diminuição da albumina. His ologicamen e obse ou-se nos ó gãos isce ais uma eacção in lama ó ia c ónica, acompanhada po ezes da o mação de g anulomas icos em mac ó agos. Apesa de odos os animais e em icado in ec ados (con i mado pela p esença do pa asi a nos á ios ecidos e ó gãos ecolhidos na nec ópsia), os únicos sinais clínicos obse ados ansi o iamen e o am adenopa ia e alopécia. As écnicas molecula es o am signi ica i amen e mais e icazes na de ecção do pa asi a do que os mé odos pa asi ológicos con encionais. As amos as não in asi as (sangue pe i é ico Resumo ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ XXV e conjun i a) mos a am se signi ica i amen e menos e icazes na de ecção de leishmanias. No nosso modelo expe imen al não se obse ou a sup essão da espos a celula ao an igénio pa asi á io e con i mou-se que, apesa de não p o ec o a, a espos a humo al especí ica é p onunciada e p ecoce. A bipola ização da espos a imuni á ia Th1 ou Th2, amplamen e desc i a nas in ecções expe imen ais po L. majo no modelo mu ino, não o am obse adas nes e es udo. O ac o dos animais não e idencia em doença apesa do ele ado pa asi ismo nos ó gãos isce ais pode á es a elacionado com a exp essão simul ânea de ci ocinas de ambos os ipos Th1 e T eg, no baço, ígado, gânglio, medula óssea e sangue pe i é ico. Nes e es udo ambém se ca ac e izou o e ei o da sali a do ec o Phlebo omus pe niciosus na in ecção expe imen al de mu ganhos BALB/c com es i pes de L. in an um sel agem e a ada com AMB, inoculadas po ia in adé mica. A isce alização da in ecção oco eu após a u ilização da ia de adminis ação do inóculo que mais se assemelha ao que oco e na Na u eza. Apesa da disseminação dos pa asi as nos animais co-inoculados com ex ac o de uma glândula sali a e sido an e io à do g upo inoculado apenas com pa asi as, não se de ec a am di e enças signi ica i as na ca ga pa asi á ia, en e os ês g upos, ao longo do pe íodo de obse ação pelo que, embo a a sali a do ec o es eja desc i a como esponsá el pela exace bação da in ecção, al não oi obse ado no nosso es udo. O aumen o de exp essão de ci ocinas es e e elacionado com o aumen o do pa asi ismo mas, al como no modelo canino, não se obse ou bipola ização da espos a imuni á ia. Os animais dos ês g upos in ec ados pa ecem e desen ol ido nos di e en es ó gãos uma espos a mis a dos ipos Th1 e Th2/T eg. Con udo, e i icou-se a p edominância da exp essão Th1 (TNF-α), no im do pe íodo de obse ação, o que pode es a elacionado com a esolução da in ecção. Po ou o lado, a p esença de pa asi as na pele dos animais inoculados com a es i pe L. in an um a ada com AMB pe mi e coloca a hipó ese da exis ência de pa asi as esis en es na Na u eza e des es pode em se ansmi idos. Após se e e i icado que a es i pe de L. in an um a ada com AMB inha a capacidade de in ec a e isce aliza no modelo mu ino, analisou-se o seu compo amen o em dois dos p incipais ec o es de L. in an um, Lu zomyia longipalpis e P. pe niciosus. Os pa asi as a ados com AMB ap esen a am uma Resumo ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ XXVI meno capacidade de pe manece em no in e io do ec o assim como um desen ol imen o mais len o apon ando pa a uma meno capacidade de ansmissão das es i pes esis en es a es e á maco, pelo que o a amen o com AMB pode á se a o á el à p e enção e con olo a a és da in e upção do ciclo de ida do pa asi a. De modo a de e mina in i o a suscep ibilidade de Leishmania aos di e en es á macos u ilizados na e apêu ica da leishmaniose humana e canina (Glucan ime®, Fungizone®, mil e osine e alopu inol) compa ou-se o sis ema de p omas igo as axénicos com o sis ema ama igo a-mac ó ago. Ve i icou-se que, pa a as es i pes es udadas, os esul ados de ambos os sis emas não ap esen a am di e enças signi ica i as sendo a u ilização do p imei o mais an ajosa ao se menos mo oso e de mais ácil execução. Selecciona am-se es i pes quimio- esis en es in i o, po exposição p olongada a doses c escen es de AMB, endo-se e i icado que os pa asi as a ados, ap esen a am uma meno suscep ibilidade do que os não a ados à acção dos á macos es udados, com excepção do alopu inol. A diminuição da suscep ibilidade das es i pes aos á macos u ilizados pode á acili a a dispe são de pa asi as mul i esis en es. Sendo a apop ose um dos mecanismos u ilizados pelos pa asi as pa a e i a a indução de uma espos a imune po acção de compos os an i- Leishmania, de e minou-se o núme o de amas igo as apop ó icos assim como a p odução de TNF-α e IL-10 pelos mac ó agos a ados. Concluiu-se que os compos os consegui am sup imi a p odução de IL-10, inibido a da ac i ação dos mac ó agos, con udo nem a p odução da ci ocina p o-in lama ó ia TNF- α nem a apop ose pa ece am se os p incipais mecanismos esponsá eis à sob e i ência dos pa asi as ao con ac o com os á macos. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3 As leishmanioses são doenças causadas po um p o ozoá io in acelula pe encen e à o dem Kine oplas ida, da amília T ypanosoma idae, do géne o Leishmania Ross, 1903 (Lainson & Shaw, 1987). 1. Pa asi a Como odos os memb os da amília Kine oplas ida, o p o ozoá io Leishmania ap esen a um cine oplas o, um núcleo e um único lagelo. Todas as espécies do géne o Leishmania êm duas o mas no seu ciclo de ida: uma o ma p omas igo a, no insec o ec o , e uma o ma amas igo a, no hospedei o e eb ado (Figu a 1.1). Figu a 1. 1. Fo mas amas igo as (a.) e p omas igo as (b.) de Leishmania spp. C. Maia C. Maia As o mas p omas igo as são as o mas encon adas no apa elho diges i o do ec o e que podem ambém se ob idas em cul u as in i o, a pa i de ecidos pa asi ados dos hospedei os e eb ados. Es as o mas mó eis, com 10-20 µm de comp imen o e 1.5-3.0 µm de la gu a, possuem um lagelo li e, de comp imen o a iá el, que eme ge do co po basal na ex emidade an e io da célula, con e indo mobilidade ao pa asi a. O núcleo encon a-se numa posição cen al e o cine oplas o localiza-se en e o núcleo e a ex emidade an e io da célula. a. b. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4 No hospedei o e eb ado, as o mas amas igo as su gem como o mações o óides ou a edondadas, com 2.5 a 6.8 µm de comp imen o, sem lagelo li e. São o mas ob iga o iamen e in acelula es, pa asi ando as células agocí icas mononuclea es. Em p epa ações co adas pelo mé odo de Giemsa dis ingue-se um ci oplasma azul pálido limi ado po uma memb ana. No meio do ci oplasma obse am-se dois o ganelos co ados de e melho: o núcleo, ela i amen e g ande e si uado no polo pos e io da célula, e o cine oplas o, mais pequeno, em o ma de bas one e e em posição an e io ela i amen e ao núcleo. O cine oplas o con ém uma quan idade impo an e de DNA (kDNA) e p olonga a única mi ocônd ia celula . 2. Hospedei o 2.1. Hospedei o e eb ado A ecologia de Leishmania spp. es á ine i a elmen e associada aos hospedei os em que se encon a, de modo que odos os ac o es que a ec em a sob e i ência e o compo amen o desses hospedei os podem in e e i no ciclo de ansmissão do pa asi a. Um hospedei o e eb ado pode se classi icado como ese a ó io se o a on e da in ecção humana (Deane, 1956) e se pe mi i que o pa asi a se mul iplique inde inidamen e (Ash o d & Be ini, 1987), pelo que, pa a cada espécie de Leishmania exis e um ou um núme o eduzido de ese a ó ios. Das ce ca de 30 espécies de Leishmania iden i icadas, 21 espécies in ec am o Homem (Shaw, 1994). Es as in ecções são maio i a iamen e zoonoses, endo como hospedei os p incipais mamí e os sil á icos ou domés icos. Nem odos os animais suscep í eis à in ecção cons i uem bons ese a ó ios de Leishmania. Um animal que desen ol a uma doença aguda e ecupe e ou mo a após alguns dias é conside ado um “Mau” ese a ó io. Pa a que cons i ua um “Bom” ese a ó io é impo an e que a in ecção que p o oca seja de ca ác e c ónico, is o é, que supo e a p esença do pa asi a po um longo pe íodo de empo an es da mo e ou da cu a (Killick-Kend ick & Wa d, 1981; B ay, 1982). Pa a além da c onicidade B ay (1982) es abeleceu ou os c i é ios que ca ac e izam um “Bom” ese a ó io: o animal em de es a em es ei o con ac o com o homem a a és do ec o , de e á ap esen a o pa asi a ao ec o em quan idade su icien e e no es ado adequado pa a que lhe cause in ecção. O ese a ó io de e á epousa e p oc ia numa si uação clima é ica a o á el à alimen ação sanguínea do ec o . O animal ese a ó io de e á cons i ui In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 5 a p incipal on e de alimen ação pa a o ec o . De e á ambém, de p e e ência pe ence a uma espécie de animal que gos e de i e em ag egados (Ash o d, 2000). Rioux e al. (1969) conside am dois ipos undamen ais de ese a ó io animal: ese a ó io habi ual e ese a ó io aciden al. Des es, só o p imei o pode se acei e como e dadei o ese a ó io de endo-se chama hospedei o aciden al ao segundo (Ab anches, 1989). No ese a ó io habi ual há que dis ingui , um ese a ó io p imá io ou na u al (animais sil á icos) de um ese a ó io secundá io (cão). Os ese a ó ios na u ais são animais que há mui o empo es ão em con ac o com o pa asi a e po isso exis e já um equilíb io en e o hospedei o e o pa asi a, o que az com que as in ecções sejam, em ge al, assin omá icas ou oligossin omá icas, com uma e olução longa. Pelo con á io nos ese a ó ios secundá ios a doença é a eg a (Ga nham, 1965; Ab anches, 1989; Campino, 1998). Nos hospedei os aciden ais a pa asi ose só se desen ol e em condições excepcionais e a as e não desempenham papel signi ica i o na epidemiologia das leishmanioses (Ab anches, 1984; 1989). São exemplos de hospedei os aciden ais o u so, no Cu dis ão, (ci ado po Ga nham, 1965), o po co-espinho, no Tu quis ão (WHO, 1980), o guaxinim na China (Zhi-Biao e al., 1984), o ca alo, encon ado pa asi ado po L. in an um no Uganda, I ália, Alemanha, Espanha e Po ugal e o mo cego in ec ado po L. chagasi na Venezuela (Richa dson, 1926; Koehle e al., 2002; Solano-Gallego e al., 2003; Rolão e al., 2005; Lima e al., 2008). O p imei o caso de leishmaniose elina oi desc i o na Algé ia, em 1912, numa casa onde o animal co-habi a a com uma c iança e um cão com in ecção isce al (Se gen e al., 1912). Nos úl imos anos um núme o signi ica i o de casos de leishmaniose elina p o ocada po L. in an um êm sido desc i os em I ália, F ança, Espanha, Suiça, Po ugal e B asil (Du ão e al., 1994; Pennisi e al., 1998; Ozon e al., 1998; He ás e al., 1999; 2001; Simões-Ma os e al., 2001a; 2001b; Pennisi, 2002; Pennisi e al., 2004; Poli e al., 2002; Sa ani e al., 2004; G e o e al., 2005; Lei a e al., 2005; Ru enach e al., 2005; Vi a e al., 2005; Ma ín-Sánchez e al., 2007; Solano-Gallego e al., 2007a; Maia e al., 2008; Taba e al., 2008) mos ando a ampla dis ibuição geog á ica e a p e alência da in ecção nos ga os domés icos e pe idomés icos. Se se i e em con a que, na maio ia dos casos, os elinos não ap esen a am sinais clínicos e a p odução de an ico pos an i-Leishmania e sido baixa ou inexis en e, o e dadei o núme o de animais in ec ados pode es a In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 6 subes imado, acili ando a disseminação e ansmissão do pa asi a po es es animais (Po ús e al., 2002). Apesa de alguns au o es conside a em os ga os como hospedei os aciden ais, exis em o es e idências que apon am pa a os ga os ac ua em como ese a ó ios secundá ios (G amiccia & G adoni, 2005; Ma in-Sánchez e al., 2007¸ Solano- Gallego e al., 2007a; Maia e al., 2008). Num es udo ealizado em Espanha ace ca das p e e ências do ec o Phlebo omus pe niciosus, e i icou-se que em odas as localidades p ospec adas, os ga os se i am de on e alimen a (Colmena es e al., 1995a). Johnson e al. (1993) e Ogosuku e al. (1994) ambém obse a am que os ga os são mais a aen es/a ac i os pa a os lebó omos do que os cães. Recen emen e, Ma oli e al., (2007) subme e am à écnica de xenodiagnós ico um ga o in ec ado c onicamen e po L. in an um e a axa de P. pe niciosus in ec ados oi semelhan e à ob ida com cães sin omá icos es ados nas mesmas condições. Casos a os de leishmaniose elina causada po L. amazonensis (Souza e al., 2005), L. enezuelensis (Bon an e-Ga ido e al., 1991; 1996), L. b aziliensis (Passos e al., 1996; Schubach e al., 2004) e L. mexicana (C aig e al., 1986; Ba nes e al., 1993) ambém êm sido desc i os. Pa a se de e mina o e dadei o papel dos ga os na epidemiologia da leishmaniose zoonó ica são necessá ios es udos mais ap o undados e em maio escala. 2.2. Hospedei o in e eb ado – Vec o Os pa asi as são ansmi idos aos hospedei os e eb ados po díp e os pe encen es a dois di e en es géne os da amília Psycodidae: Lu zomyia F ança, 1924 no No o Mundo e Phlebo omus Ronda i, 1843 no Velho Mundo (Quad o 1.1). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 7 Quad o 1.1. Pa ologia, ec o es, ese a ó ios, dis ibuição geog á ica e ansmissão das leishmanioses (Killick-Kend ick, 1999; Sádlo á, 1999; Ash o d, 2000; G amiccia & G adoni, 2005; Ba es, 2007). Pa ologia habi ual Pa ologia a a Leishmania majo LCL ; LCD* No e, Es e e Oes e de Á ica; P. papa asi Roedo es Zoonó ica P óximo e Médio O ien e; P. duboscqi Ru al Ásia Cen al; P. salehi Índia P. alexand i P. ansa ii P. caucasius Leishmania opica LCL ; LV Médio O ien e; Paquis ão; P. se gen i Homem An oponó ica Índia; No e de Á ica; Quénia; Região Medi e ânea P. guggisbe gi Canídeos (?) U bana P. aculea us Hi axes (?) Leishmania ae hiopica LCL ; LCD E iópia; Quénia P. longipes Hi axes Zoonó ica P. pedi e Ru al Leishmania dono ani LV Índia; Nepal; Bangladesh; Paquis ão; China; P. a gen ipes Homem An oponó ica LCL Quénia; E iópia; Sudão P. o ien alis Roedo es (?) LMC P. ma ini Canídeos (?) P. celiae P. alexand i P. caucasius Leishmania in an um LV Região Medi e ânea; Balcãs; P. pe niciosus Canídeos Zoonó ica LCL Médio O ien e; P. a iasi Pe idomés ica LCD* Ásia Cen al; China; P. obbi LMC* Á ica O ien al P. neglec us P. pe iliewi P. kandelakii P. lange oni P. longicuspis P. smi no i P. anscaucasicus P. chinensis P. longiduc us Leishmania chagasi LV Amé ica Cen al e do Sul L. longipalpis Canídeos Zoonó ica LCL; LCD L. e ansi Pe idomés ica Leishmania mexicana LCL Amé ica Cen al e do Sul L. olmeca olmeca Roedo es Zoonó ica LCD L. ayacuchensis Canídeos Sil á ica LV* L. ylephile o L. an hopho a Leishmania amazonensis LCL ; LDC Amé ica do Sul L. la iscu ella a Roedo es Zoonó ica MCL L. olmeca noci a Ma supiais Sil á ica VL* L. educ a Leishmania enezuelensis LCL ; LDL Venezuela e República Dominicana L. olmeca bicolo Ga os (?) Zoonó ica (?) Leishmania pe u iana LCL Pe ú L. pe uensis Canídeos (?) Zoonó ica L. e uca um Homem (?) L. a acuchensis Leishmania panamensis LCL Amé ica Cen al e do Sul L. apidoi P eguiças Zoonó ica LCD* L. gomezi Roedo es Sil á ica LMC* L. panamensis Ma supiais L. ylephile o Canídeos Leishmania guyanensis LCL Amé ica do Sul L. umb a ilis P eguiças Zoonó ica LMC* L. whi mani Roedo es Sil á ica L. anduzei Ma supiais Leishmania lainsoni LCL B asil e Pe ú L. ubiqui alis Roedo es Zoonó ica Leishmania nai i LCL B asil L. squami en is Desden ados Zoonó ica Guiana F ancesa L. pa aensis Sil á ica Leishmania shawi LCL B asil L. whi mani P ima as; P eguiças Zoonó ica Leishmania b aziliensis LCL Amé ica do Sul L. wellcomei Roedo es Zoonó ica LMC L. complexus Canídeos Sil á ica LCD L. ca e ai Equinos LV* L. whi mani L. o allesi P. - Phlebo omus; L. - Lu zomyia; LV - Leishmaniose isce al; LCL - Leishmaniose cu ânea localizada; LCD - Leishmaniose cu ânea disseminada; LMC - Leishmnaiose mucocu ênea; * em es adios de imunodep essão No o Mundo Espécie Dis ibuição geog á ica Vec o es Rese a ó ios T ansmissão Velho Mundo In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 8 A iden i icação dos insec os ec o es esponsá eis pela ansmissão de Leishmania necessi a a eunião de á ias e idências, ais como, a de ecção de lebó omos na u almen e in ec ados, as in ecções expe imen ais se em bem sucedidas e e i ica -se p e e ência alimen a dos ec o es pelos ese a ó ios desc i os. Em mui os casos, uma de e minada espécie de Leishmania é ansmi ida p incipal ou unicamen e po uma dada espécie de ec o numa egião especí ica. A e iciência de ansmissão do pa asi a pelos lebó omos é um p ocesso que ap esen a g ande a iabilidade e complexidade (Dye, 1992) e que depende da longe idade, das p e e ências ó icas e da densidade dos ec o es. Ou os ac o es que podem in e e i no sucesso da ansmissão do pa asi a elacionam-se com a in e acção ec o e ese a ó io, nomeadamen e, a sob eposição de habi a s, o ca ác e endo ílico ou exo ílico e o g au de an opo ilia ou zoo ilia dos ec o es e as axas de in ecção no ese a ó io. Assim, populações de ec o es que ocupem “habi a s” jun o a um “Bom” ese a ó io e ão p o a elmen e uma maio capacidade de ansmissão do pa asi a. No en an o, es a elação em indo a se modi icada ao longo de milhões de anos po p essões ecológicas que, em úl ima análise, são a p incipal causa da a iação gené ica das leishmanias. 3. Ciclo Biológico O ciclo de ida de Leishmania é um p ocesso complexo que en ol e al e ações compo amen ais, mo ológicas e bioquímicas, sendo idên ico pa a odas as espécies de Leishmania. As êmeas dos insec os ec o es, pe encen es à O dem Dip e a, Família Psychodidae, Sub amília Phlebo ominae, géne os Phlebo omus (Velho Mundo) e Lu zomyia (No o Mundo), e ec uam e eições sanguíneas pa a que se possa ealiza a ma u ação o á ica e a pos u a. Assim, quando um lebo omíneo êmea (Figu a 1.2) e ec ua uma e eição hema ó aga num hospedei o e eb ado in ec ado po Leishmania e com pa asi as no ecido cu âneo ou sanguíneo, inge e os p o ozoá ios na o ma amas igo a. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 9 Figu a 1.2. Fêmea de Phlebo omus pe niciosus após e eição sanguínea. C. Maia Os pa asi as, inge idos jun amen e com o sangue, passam di ec amen e pa a o segmen o abdominal do es ômago do ec o , onde são en ol idos pela memb ana pe i ó ica (Figu a 1.3). Es a memb ana, cons i uída po qui ina e glicop o eínas sin e izadas pelas células epi eliais do ubo diges i o do lebó omo, em espos a ao es ímulo sanguíneo, p o ege o epi élio do es ômago do con eúdo da e eição sanguínea e ac ua como uma ba ei a que egula a di usão de enzimas diges i as seg egadas pelas células epi eliais (Pimen a e al., 1997), encon ando-se comple amen e o mada ao im de 24 ho as após a inges ão do sangue (Blackbu n e al., 1988; Wal e s e al., 1993; Secundino e al., 2005). A diges ão da e eição sanguínea ica comple a em qua o a cinco dias. Pa a que o ciclo de ida de Leishmania no insec o seja bem sucedido, is o é, pa a que possa oco e ansmissão, os pa asi as êm que sob e i e à acção das enzimas diges i as do hospedei o in e eb ado, e i a se em expulsos do in es ino du an e a diu ese e numa ase inal, mig a pa a a zona an e io do es ômago do ec o e libe a em-se do epi élio in es inal. Pa a a ingi em es e objec i o os pa asi as so em á ias ases, nomeadamen e mul iplicação e al e ações mo ológicas. Segundo Ba es (1994, 2007), du an e o desen ol imen o in a ec o ial do pa asi a podem dis ingui -se á ias o mas: p omas igo as p ocíclicos, nec omonas, lep omonas, hap omonas e p omas igo as me acíclicos que di e em não só mo ologicamen e, mas ambém na capacidade de di isão celula , mobilidade, ligação aos ecidos e g au de in ec i idade. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 10 Figu a 1.3. Ciclo de ida de Leishmania no ec o ilus ando as di e en es o mas mo ológicas dos p omas igo as (adap ado de Kamhawi, 2006). Região an e io do apa elho diges i o Vál ula es emodeal Es ômago o ácico Es ômago abdominal Região pos e io do apa elho diges i o Memb ana pe i ó ica P ocíclicos 24-48 h Nec omonas 48-72h Lep omonas4-7dias Me acíclicos5-7 dias Hap omonas 5-7 dias Gel sec e o dos p omas igo as Com o p og edi da diges ão, as o mas amas igo as ans o mam-se em p omas igo as p ocíclicos. Es as o mas pouco mó eis (pequeno lagelo) mul iplicam- se ac i amen e e, passados 3 ou 4 dias após a e eição sanguínea, ans o mam-se em p omas igo as longos e lagelados, denominados po nec omonas. A memb ana pe i ó ica começa en ão a desin eg a -se, po acção de qui inases seg egadas pelo ec o e pelo pa asi a (Schlein e al., 1991; Schlein, 1993; Ramalho-O igão e al., 2005), libe ando os p omas igo as li es pa a o es ômago abdominal, no caso dos lebó omos ec o es do subgéne o Viannia, ou pa a o es ômago o ácico, no caso dos lebó omos ec o es do subgéne o Leishmania. A capacidade das nec omonas pe sis i em após diges ão da e eição sanguínea e de se ixa em ao epi élio do es ômago a a és do lagelo, e i ando des e modo a sua exc eção, é de e minan e na classi icação de uma espécie lebo omínica como ec o a (Ba es, 2007). Dá-se en ão início a uma ase de mul iplicação ac i a e p osseguem a sua mig ação em di ecção ao segmen o an e io do es ômago. Ao im de 5 ou 6 dias após a inges ão, a e eição sanguínea encon a-se comple amen e dige ida e as nec omonas a ingem a ál ula es emodeal, di e enciando-se em lep omonas (Gossage e al., 2003). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 11 Es as o mas sec e am o gel sec e o dos p omas igo as (PSG), uma glicop o eína ilamen osa que o ma uma ma iz gela inosa (Roge s e al., 2002). Algumas das nec omonas/lep omonas ade em à supe ície da á ula e di e enciam-se em hap omonas (Killick-Kend ick e al., 1974). Finalmen e algumas das lep omonas di e enciam-se nos p omas igo as me acíclicos (Roge s e al., 2002). As hap omonas posicionam-se na egião da ál ula es omodeal, ade indo en e si e à cu ícula da ál ula, o mando-se um aglome ado de pa asi as e es idos pelo PSG (Wal e s e al., 1987; Killick-Kend ick e al., 1988; S ie ho e al., 1999; Roge s e al., 2002; Ba es, 2007). Pensa-se que o PSG jun amen e com as hap omonas êm como unção bloquea pa cialmen e a ál ula es omodeal, di icul ando a en ada de sangue du an e a e eição sanguínea. O insec o é, assim, ob igado a ealiza á ias picadas, acili ando a expulsão das o mas me acíclicas in ec an es (Killick-Kend ick & Wa d, 1981; Killick-Kend ick, 1990; Killick-Kend ick e al., 1997b). No desen ol imen o das o mas me acíclicas, ês moléculas pa ecem e impo ância na in ecciosidade do pa asi a: o lipo os oglicano (LPG), a glicop o eína de 63 kDa (gp63) e a os a ase ácida (B yceson, 1996). As modi icações ul aes u u ais no LPG da supe ície dos pa asi as, que causam al e ações uncionais como a pe da da ligação às mic o ilosidades do in es ino (Sacks e al., 1985) pe mi em que as o mas me acíclicas se mo am li emen e e se posicionem jun o à ál ula es omodeal, possibili ando a sua expulsão do apa elho bucal quando o insec o e ec ua no a e eição sanguínea. Os pa asi as do subgéne o Viannia di e em dos pa asi as do subgéne o Leishmania po ap esen a em uma ase adicional de desen ol imen o, ixos à supe ície do es ômago médio. O ciclo do pa asi a nas di e en es espécies lebo omínicas pode e uma du ação de 4 a 17 dias após a e eição sanguínea da êmea ec o a, dependendo da espécie de Leishmania e da empe a u a ambien al (Molyneux & Killick-Kend ick, 1987). Os p omas igo as me acíclicos são ansmi idos a a és da picada elmo ágica na pele do hospedei o e eb ado jun amen e com o PSG e a sali a do ec o . O PSG é esponsá el pelo aumen o do núme o de p omas igo as me acíclicos inoculados (Roge s e al., 2004, Ba es, 2007). A sali a do lebó omo pa ece exe ce á ias unções imunomodulado as e pode an agoniza ce os componen es do sis ema de de esa do hospedei o (Wa bu g & Wai umbi, 1997; Wai umbi & Wa bu g, 1998). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 12 Es udos expe imen ais e ec uados em modelo mu ino, in ec ado po di e en es espécies de Leishmania (L. majo , L. chagasi, L. mexicana, L. amazonensis e L. b aziliensis), indicam que a sali a do ec o induz um aumen o do pode in ec an e do pa asi a (Ti us & Ribei o, 1988; Samuelson e al., 1991; Theodos e al., 1991; Wa bu g e al., 1994; Lima & Ti us, 1996; Belkaid e al., 2000). Apa en emen e, o e ei o da sali a não se ica a de e à sua acção di ec a sob e o pa asi a, mas sim sob e o hospedei o, pois con ém um po en e asodila ado que, além de acili a a e eição sanguínea do ec o , pa ece inibi a acção leishmanicida do mac ó ago (Ti us & Ribei o, 1988; Lima & Ti us, 1996). Po ou o lado, es udos mais ecen es demons a am que a exposição p é ia de mu ganhos BALB/c a picadas de lebó omos, não in ec ados, con e ia imunidade a uma pos e io in ecção po Leishmania (Belkaid e al., 1998; Kamhawi e al., 2000). Também a acinação com acções p o eicas da sali a de L. longipalpis impediu a e olução a é à mo e em hams e s in ec ados po L. dono ani (Gomes e al., 2008). Es es esul ados não o am ep oduzidos po Mou a e al. (2007) ao p é-imuniza em mu ganhos BALB/c com sali a de L. in e media, apesa do apa ecimen o da lesão e sido mais a dio, no local de inoculação e nos gânglios egionais oco eu mul iplicação pa asi á ia. Es es esul ados, em conjun o com a ele ada imunogenicidade demons ada po p o eínas da sali a dos lebó omos, e o çam a impo ância da sali a no es abelecimen o da in ecção po Leishmania no mamí e o hospedei o (And ade e al., 2007). Os p omas igo as me acíclicos são agoci ados pelos mac ó agos da pele, onde se ans o mam em amas igo as. As o mas amas igo as iniciam um p ocesso de mul iplicação ac i a, acabando po p o oca a des uição da memb ana da célula hospedei a e subsequen e libe ação dos pa asi as que ão in ec a no os mac ó agos. Os pa asi as agoci ados podem pe manece no ecido subcu âneo, dando o igem às o mas clínicas de leishmaniose cu ânea, ou in adi as células do sis ema mononuclea agocí ico, como o baço, ígado, medula óssea, gânglios lin á icos e ou os ó gãos lin óides (B yceson, 1996), causando a leishmaniose isce al. Se a in ecção o bem sucedida no hospedei o e eb ado o ciclo in a ec o ial ecomeça quando o lebó omo êmea, suscep í el ao pa asi a, az uma no a e eição sanguínea, inge indo mac ó agos in ec ados. Vá ios es udos êm demons ado que a ansmissão do pa asi a se pode p ocessa sem in e e ência do insec o ec o . Es ão desc i os casos de ansmissão congéni a (Mi al e al., 1987; Nyakundi e al., 1988; Yada e al., 1989; El oum e In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 19 iden i icado ambém como po encial ese a ó io de es i pes causa i as da in ecção isce al, podendo a é desempenha um papel impo an e na ansmissão da in ecção (Be ini e al., 1980; Pozio e al., 1981). Na LV, o pa asi a in ade pa icula men e o baço, o ígado, a medula óssea e os gânglios lin á icos. A doença ap esen a aspec os clínicos e biológicos homogéneos nos di e en es ocos, ca ac e izando-se po eb e, hepa oesplenomegalia e hipe p o einemia. A anemia e a leucopenia cons i uem ou os pa âme os biológicos equen es. A e olução da doença é p og essi a, podendo se a al, se não o a ada. No subcon inen e indiano e Á ica O ien al, nomeadamen e no Sudão, podem po ezes su gi lesões cu âneas, meses ou anos após a cu a clínica da doença sis émica. Es as lesões leishmanóides dé micas pós kala-aza , po con e em pa asi as são impo an es na manu enção da endemia da an oponose. Ou o ac o a e em con a na pe pe uação do ciclo an oponó ico é a p esença equen e do pa asi a no sangue du an e a doença. Na maio ia dos ocos clássicos, a LV mani es a-se de o ma endémica. Po ezes, con udo, a in ecção po L. dono ani pode esul a em g a es epidemias com uma axa de mo alidade ele ada; no Sudão êm-se e i icado g a es epidemias desde o início da década de 90 (Ash o d e al., 1992), onde ce ca de 100 mil indi íduos mo e am (WHO, 2000). Po ou o lado, em alguns países da bacia medi e ânea (Espanha, F ança, I ália e Po ugal), apesa de não se e i ica em epidemias, o su gimen o de no os ac o es imunossup esso es, dos quais a in ecção pelo HIV é o mais impo an e, em con ibuído signi ica i amen e pa a o aumen o do núme o de casos de in ecção po L. in an um, p incipalmen e em adul os (WHO, 1995; Desjeux, 1996). Nos casos de LV em si uações de imunodep essão, as mani es ações clínicas a ípicas são equen es, com o en ol imen o de ecidos e ó gãos que não são usualmen e a ingidos, ais como a pele, sangue pe i é ico, apa elho diges i o. Adicionalmen e, indi íduos in ec ados pelo HIV e c ianças imunocompe en es mas, p o a elmen e, com uma maio suscep ibilidade gené ica, podem desen ol e uma doença isce al mesmo quando in ec ados po es i pes de mo ópicas (Campino e al., 1994; Benikhle e al., 2001). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 20 4.4. Leishmanioses em Po ugal Em Po ugal, o p imei o caso de leishmaniose oi desc i o po Dionisio Al a es em 1910, numa c iança de 9 anos de idade, esiden e em Lisboa. No ano seguin e, Al a es & Sil a ap esen a am o esul ado de um inqué i o em 300 cães da egião de Lisboa, dos quais oi o ap esen a am leishmanias (Al a es & Sil a, 1911). A pa i de 1951, de ido ao aumen o da incidência da leishmaniose po odo o país (1616 casos), o kala-aza passou a aze pa e das doenças de no i icação ob iga ó ia (Aze edo, 1960). Em 1952, Ramos & Fa inho e ap esen a am um abalho de e isão em que o am e idenciadas duas zonas endémicas, o Al o Dou o e o Vale do Sado. En e os anos 50 e o im dos anos 70, F aga de Aze edo e os seus colabo ado es ealiza am di e sos es udos epidemiológicos, que ealça am a impo ância do cão e do lébo omo no ciclo biológico do pa asi a (Aze edo & Teixei a, 1947; Aze edo & Ne es, 1963). A pa i de 1980, Ab anches e Pi es dão con inuidade àqueles es udos, ealizando inqué i os, ocados no ese a ó io e no ec o , em ês egiões: Alcáce do Sal, Região Me opoli ana de Lisboa e Região do Al o Dou o. Des es es udos essal a-se o conhecimen o de ex inção do oco endémico de Alcáce do Sal (Ab anches e al., 1983), onde o núme o de casos humanos inha indo a diminui desde os anos 50, após a aplicação de insec icidas clo ados nas campanhas de lu a con a os ec o es da malá ia que p o oca am ambém a diminuição da densidade dos lebó omos. Em 1986, é desc i a a oco ência de casos de leishmaniose isce al na Região do Alga e desde 1980 (Maio e al., 1986). A Região do Al o Dou o, em sido o oco mais ac i o da in ecção humana e da in ecção canina. Es udos e ec uados nes a Região, apon a am pa a uma p e alência da in ecção canina en e 10% e 12.4%, com a localidade de Vale de Mendiz, no concelho de Alijó, a ap esen a 37.8% de animais in ec ados, o alo mais ele ado obse ado nos ês inqué i os epidemiológicos ealizados en e 1986 a 1989 (Ab anches e al., 1992; Ab anches e al., 1993; Sampaio-Sil a e al., 1993). Em 2000, Ca doso e al. (2004) ob i e am uma se op e alência de 18.7%, sendo a localidade de Cas edo a mais a ingida (81.1%). Os isolados caninos de Leishmania o am iden i icados po análise isoenzimá ica, e i icando a a -se de L. in an um zimodemo MON-1 sendo o único encon ado na leishmaniose canina (Campino, 1998) a é 2002, ano em que oi isolado o zimodemo MON-98 num cão da Região do In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 21 Al o Dou o (Ca doso e al., 2002). Quan o ao ec o , an o P. pe niciosus como P. a iasi o am encon ados pa asi ados, sendo P. a iasi qua o ezes mais abundan e. As es i pes isoladas do ec o o am iden i icadas como L. in an um zimodemos MON-1 e MON-24 (Pi es e al., 1991). Na Região Me opoli ana de Lisboa e i icam-se mais casos de in ecções humanas nas zonas u banas do que nas á eas u ais. Es udos epidemiológicos de leishmaniose ealizados nes a egião indica am uma maio p e alência da in ecção canina na á ea u al (8.8 %) do que na á ea u bana/subu bana (3.8 %) e uma si uação in e sa na p e alência da in ecção humana. Es e enómeno, conhecido po “des io ó ico em meio u al”, pode es a associado à u banização ou domes icação de ocos zoonó icos na u ais. Sendo o ec o p edominan emen e zoo ílico, o meno núme o de animais disponí eis nas á eas u banas o na a população humana mais ulne á el à in ecção aciden al (Ab anches e al., 1983). O Pa que Na u al da Se a da A ábida ap esen a a o alo mais ele ado com ce ca de 10.9% de animais in ec ados (Ab anches e al., 1987). Num es udo em aposas, ealizado nesse mesmo local, o am encon ados in ec ados 5.6 % de um o al de 71 animais es udados, jus i icando a exis ência de ciclo sil á ico semi-au ónomo nes a á ea geog á ica (Ab anches e al., 1984). Os ec o es encon ados nes a egião o am P. pe niciosus e P. a iasi (Pi es, 1984). Mais ecen emen e, Co es e al. (2007) ealiza am um inqué i o epidemiológico canino na á ea u bana da G ande Lisboa ob endo uma p e alência de 19.2%. Na cidade de Lisboa, Maia e al. (2008) ealiza am o p imei o inqué i o de leishmaniose elina ealizado em Po ugal e, encon a am DNA de L. in an um no sangue pe i é ico em 30.4% dos 23 ga os analisados. Na Região do Alga e, o am diagnos icados casos pediá icos desde a década de oi en a, sendo a maio ia dos diagnós icos posi i os da doença egis ados no concelho de Loulé (Maio e al., 1986; Vicen e, 1990). Nos úl imos anos não hou e nenhum caso egis ado no se iço de pedia ia do Hospi al Dis i al de Fa o. A p e alência da in ecção canina encon ada nes e concelho do Alga e oi de 7 %, cons i uindo o segundo oco mais impo an e do país em leishmaniose canina (Campino e al., 1995). Os es udos de Sch ey e al. (1989) na egião alga ia e ela am a p esença de exempla es de P. pe niciosus in ec ados po leishmanias. Pos e io men e, a iden i icação de L. in an um MON-1 num ou o exempla in ec ado (Pi es, 2000), eunida à baixa p e alência de P. a iasi (Pi es, 1979), em con i ma que P. pe niciosus é a espécie esponsá el pela ansmissão do pa asi a nes a egião. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 22 Em 2006 ealizou-se um as eio nes a egião pa a de e mina a se op e alência da leishmaniose canina e a abundância e papel ec o ial dos lebó omos. De ec a am-se 28.78% (28 em 132) de cães com alo es signi ica i os de an ico pos an i-Leishmania e com a écnica de PCR de ec ou-se uma êmea de P. pe niciosus in ec ada com L. in an um (Maia e al., 2007a). Ainda que exis am ês egiões endémicas mais ele an es, obse am-se em odo o país casos espo ádicos de leishmaniose (Ne es e al., 2007). Num as eio se ológico e ec uado à população canina em 14 aldeias do dis i o de É o a (Alen ejo) oi iden i icado 3.9% de animais in ec ados (Semião-San os e al., 1995). Em Po ugal, al como nos ou os países da bacia medi e ânea, L. in an um zimodemo MON-1 é o p incipal agen e esponsá el pela LV (Campino e al., 2006). No nosso país, a doença em sido conside ada p edominan emen e in an il, mas e i ica-se uma endência pa a a diminuição do núme o de casos em c ianças e o aumen o da in ecção em adul os, p incipalmen e associada a casos de HIV (Campino, 1998). En e 2000 e 2006 o am diagnos icados labo a o ialmen e, na Unidade de Leishmanioses do IHMT, 127 no os casos de LV humana, 40 (30 c ianças e 10 adul os) dos quais em indi íduos imunocompe en es e 87 (adul os) em doen es imunodep imidos. Na di ecção ge al de Saúde (DGS) nos mesmos 7 anos apenas oi decla ado um o al de 73 casos (34 c ianças e 39 adul os) de leishmaniose isce al dos quais 52 pe encem à Região Me opoli ana de Lisboa. Es es núme os p o am a sub- no i icação da doença, já que, apesa de se de decla ação ob iga ó ia desde os anos 50, os núme os o iciais dos úl imos anos não ul apassam uma dezena de casos po ano em odo o País. O núme o de casos de leishmaniose canina em indo a aumen a no nosso País, es ando incluída, desde 2002, no g upo das in ecções de no i icação ob iga ó ia du an e as campanhas de acinação an i- ábica De um modo ge al, a LC é uma doença desconhecida em Po ugal, mas êm sido desc i os casos, desde os anos 40, nas bacias hid og á icas dos ios Dou o, Tejo e Sado (Ramos & Fa inho e, 1952; Aguia , 1970; Manso e al., 1998). No en an o, apenas em dois casos au óc ones oi iden i icada a espécie causado a das lesões como L. in an um MON-1 e MON-29 (Campino & Ab anches, 2002; Campino e al., 2005). Segundo aqueles au o es, embo a a LC não seja ão equen e em Po ugal como em I ália ou Espanha, onde se e i icam ocos endémicos (Be ini e al., 1990; Sanchez e al., 1996), es a doença de e á deixa de se enca ada como uma doença mui o a a. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 23 Embo a os pa asi as do géne o Leishmania enham uma es u u a de população clonal, ecen emen e isola am-se em Po ugal híb idos en e espécies de ilogenia di e gen e, L. in an um e L. majo em indi íduos imunodep imidos. Es as oco ências êm le an a ques ões ela i amen e à equência dos c uzamen os gené icos en e es i pes em condições na u ais e sob e a impo ância epidemiológica dos seus enó ipos na pa ogenicidade da in ecção e esis ência aos á macos (Ra el e al., 2006). As al e ações climá icas que se es ão a e i ica , nomeadamen e o aumen o da empe a u a com in e nos menos igo osos, pode á e como consequência uma ac i idade lebo omínica du an e um maio núme o de meses po ano, aumen ando o pe íodo de ansmissão do pa asi a, que ao Homem, que aos animais, e concomi an emen e, a incidência da doença (Calhei os e al., 2006; Duja din e al., 2008). Es as al e ações climá icas e a inda de imig an es do No e de Á ica e do subcon inen e indiano, in ec ados com L. opica e L. majo , a é à da a, não iden i icadas no nosso país, pode conduzi à in odução des as in ecções no País. Em Po ugal exis em os ec o es esponsá eis pela sua ansmissão, P. se gen i no caso da L. opica (A onso e al., 2005), e P. papa asi no caso de L. majo (Pi es, 1979). 5. In e acção Pa asi a-Hospedei o Ve eb ado O la go espec o eno ípico das leishmanioses es á dependen e da espécie (ou sub-espécie) in ec an e e da espos a imuni á ia, que po sua ez depende das ca ac e ís icas gené icas do hospedei o. A in asão do hospedei o e eb ado po Leishmania en ol e odas as componen es de de esa do sis ema imune humo al e celula . Sendo o pa asi a ob iga o iamen e in acelula , o seu al o é o mac ó ago e, apesa dos mac ó agos se em células especializadas na agoci ose e des uição de agen es pa ogénicos, as leishmanias possuem uma sé ie de es a égias que pe mi em con a ia a ac i idade dos mac ó agos e esis i ao sis ema de ensi o do hospedei o (Bogdan e al., 1990b). 5.1. Resis ência aos componen es ci o óxicos do so o e in asão do mac ó ago An es de en a no mac ó ago, os p omas igo as inoculados pelo ec o en am em con ac o com o so o do hospedei o, icando sujei os à sua acção ci o óxica, po ac i ação do complemen o. As o mas p omas igo as de cul u a em ase loga í mica In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 24 de c escimen o, não in ecciosas, ac i am o complemen o e são apidamen e lisadas pelo so o não imune (Puen es e al., 1988). Pelo con á io, as o mas p omas igo as me acíclicas, in ecciosas, desen ol em mecanismos que lhes pe mi em não só bloquea a ac i idade lí ica do complemen o, como ainda explo a a capacidade de opsonização e quimio axia do mesmo (Zamb ano-Villa e al., 2002). A ac i ação do complemen o le a à o mação do componen e C5a, o qual a ai os mac ó agos pa a a á ea da in ecção, a a és de um g adien e quimio ác ico (B ay, 1983). Ou o e ei o da ac i ação do complemen o é a opsonização do pa asi a po ixação da p o eína C3b do complemen o. O C3b pode unciona como ligando pa a os ecep o es do complemen o nos mac ó agos (CR), a o ecendo assim a en ada do pa asi a pa a as células agocí icas. O C3b pode ambém a o ece a o mação dos complexos C5b-C9, que medeiam a lise da memb ana dos pa asi as (Mosse & Edelson, 1984). Todas as espécies e es i pes de Leishmania es udadas a é ao momen o ac i am o complemen o, que pela ia clássica (Pea son & S eigbigel, 1980; Puen es e al., 1988), que pela ia al e na i a (Mosse & Edelson, 1984), e es a ac i ação esul a no aumen o da in e nalização dos pa asi as no mac ó ago (B i ingham & Mosse , 1996). De ac o, a capacidade de esis ência das o mas p omas igo as me acíclicas à lise pelo complemen o não é de ida à ausência de ligação e ac i ação do mesmo, pa ecendo an es es a elacionada com a exp essão an igénica de supe ície do pa asi a (Sil a e al., 1989). Duas das p o eínas mais abundan es na memb ana do pa asi a desempenham um papel c ucial nes a esis ência: a glicop o eína de 63 kD (gp63) e o lipo os oglicano (LPG). A gp63 p omo e a con e são p o eolí ica do C3b à sua o ma inac i a (iC3b), a qual se man ém opsoní ica, mas pe de a capacidade de induzi a o mação do complexo C5b-C9 (B i ingham & Mosse , 1996). A unção do LPG pa ece se essencialmen e mecânica: a sua o ma alongada nos p omas igo as me acíclicos pa ece unciona como uma ba ei a ísica, e i ando a inse ção dos complexos C5b-C9 (Puen es e al., 1990). Adicionalmen e, oi já demons ado que as leishmanias possuem p o eínas cinases que inac i am as acções do complemen o, po os o ilação (He moso e al., 1991; Sace do i-Sie a e al., 1997). Em conclusão, a agoci ose de Leishmania pelos mac ó agos é mediada po p o eínas de supe ície do pa asi a, po ac o es do so o do hospedei o e po di e sos ecep o es dos mac ó agos (Mosse & B i ingham, 1997). Os ecep o es do complemen o CR3 e CR1 pa ecem se os mais impo an es (Blackwell, 1985; Sil a e In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 25 al., 1989; B i ingham e al., 1995) e embo a ambos os ecep o es pa icipem na adesão p omas igo a-mac ó ago mediada pelo complemen o, o CR3 pa ece desempenha um papel mais impo an e nes e p ocesso sendo p o a elmen e o ecep o p edominan e na in e nalização das o mas p omas igo as me acíclicas nos mac ó agos (Rosen hal e al., 1996). Con udo, a obse ação de que mu ganhos de icien es em CR3 podem se in ec ados po Leishmania suge e a oco ência de mecanismos de ligação di ec a, possi elmen e en ol endo moléculas do pa asi a e ecep o es de lec ina nos mac ó agos (Mosse & B i ingham, 1997). 5.2. Apop ose A apop ose ou mo e celula p og amada (MCP) oi inicialmen e desc i a no início dos anos se en a (Ke e al., 1972), sendo de inida pela mo ologia celula , com condensação da c oma ina, agmen ação nuclea , pe ca de olume e decomposição celula com o mação de co pos apop ó icos des inados a se em eliminados po agoci ose, p e enindo des e modo o desen ol imen o de uma espos a in lama ó ia. Apesa da MCP es a elacionada com a homeos ase ecidual, o seu papel o na-se ele an e na pa ogénese das doenças ao elimina células sem despe a uma espos a imune (Ry e e al., 2007). No caso da leishmaniose, a MCP é conside ada um compo amen o al uís ico ap esen ado po uma subpopulação de pa asi as e indispensá el pa a o es abelecimen o e manu enção da in ecção (Wande ley e al., 2005; Ge i e al., 2008); a inges ão pelos mac ó agos de pa asi as (p omas igo as/amas igo as) em apop ose, os quais ap esen am à supe ície os a idilse ina (PS), le a à libe ação de TGF-β e IL-10 e inibe a p odução de TNF-α e IL-12 (Holzmulle e al., 2006; Zandbe gen e al., 2007), sup imindo a ac i ação dos mecanismos e ec o es da célula hospedei a. A MCP pe mi e ainda con ola o núme o de leishmanias no in e io do mac ó ago (assim como no ec o ), de modo a e i a a al a de nu ien es e p e eni a mo e dos pa asi as (Zangge e al., 2002; Wande ley e al., 2005; Shaha, 2006; Zandbe gen e al., 2006; Ca men & Sinai, 2007). A apop ose ambém pa ece se uma al e na i a das leishmanias quando expos as a di e en es á macos (Se eno e al., 2001b; Lee e al., 2002; Sudhandi an & Shaha, 2003; Jayana ayan & Dey, 2005; Meh a & Shaha, 2004; Pa is e al., 2004; Ve ma & Dey, 2004; Alza e e al., 2008). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 26 5.3. In asão de neu ó ilos e de células com capacidade leishmanicida eduzida Desde a p imei a desc ição de mul iplicação de leishmanias em células agocí icas mononuclea es (Chang & Dwye , 1976), inúme os es udos p o a am que os mac ó agos são as células hospedei as de Leishmania po excelência. Con udo, nos úl imos anos e i icou-se a impo ância dos neu ó ilos (PMN) no início da in ecção; es as células in ec adas sec e am IL-8, ec u ando um maio núme o de neu ó ilos pa a o local de in ecção, sendo es as células ambém a aídas pelo ac o quimio ác ico de Leishmania (LCF) (Zandbe gen e al., 2002). Uma ez no in e io do neu ó ilo, os p omas igo as sob e i em à acção do anião supe óxido (O 2- ) bloqueando a espos a oxida i a (Lau s e al., 2002). Po ou o lado, a apop ose dos neu ó ilos in ec ados é e a dada pela inibição da acção da caspase-3 (Aga e al., 2002). Em condições no mais, o empo médio de ida dos neu ó ilos é de 6 a 10 ho as (Squie e al., 1995), enquan o que as células in ec adas po Leishmania sob e i em ce ca de 42 ho as. Es e a aso na apop ose, jun amen e com a sec eção de quimiocinas in lama ó ias dos mac ó agos 1α (MIP-1α) e 1β (MIP-1β), pe mi e a mig ação das células hospedei as pa a o local de in ecção (Sunde kö e e al., 1993; Zandbe gen e al., 2004). A inges ão dos PMN apop ó icos pa asi ados pelos mac ó agos (Voll e al., 1997; Fadok e al., 1998; Henson, 2004) acili a a sob e i ência e mul iplicação de Leishmania a a és de dois mecanismos: (i) os pa asi as in acelula es dos PMN não in e agem di ec amen e com os ecep o es do mac ó ago, e i ando que es e econheça o an igénio e se ac i e; (ii) a agoci ose das células apop ó icas silencia em pa e a unção de agoci ose, a a és da inibição da p odução de ci ocinas p ó-in lama ó ias: TNF, IL-1 e IL-12 e a a és do aumen o da sec eção das ci ocinas an i-in lama ó ias: ac o ans o mado de c escimen o be a (TGF-β) e IL-10 (Laskay e al., 2003; Zandbe gen e al., 2004; 2007; Laskay e al., 2008). Po ou o lado, Pe e s e al. (2008) de endem que uma ou a es a égia pa asi á ia é e i a que os mac ó agos ac i em as suas unções mic obicidas sob eca egando-os com a eliminação de PMN em apop ose. Con udo, a capacidade de agoci ose dos mamí e os não é es i a às p incipais células agocí icas (mac ó agos, monóci os, neu ó ilos), não sendo su p eenden e a iden i icação de ou os ipos celula es in ec ados po Leishmania (Ri ig & Bogdan, 2000). Po exemplo, oi já demons ado que as células dend í icas da pele (células de Lange hans) são pe missí eis à p esença do pa asi a, ainda que não pe mi am a sua mul iplicação (Blank e al., 1996) enquan o que os ib oblas os são impo an es na In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 27 ase c ónica da in ecção (Bogdan e al., 2000). A capacidade das leishmanias pe manece em nes e ipo de células pode á con ibui pa a a p esença de um núme o eduzido de pa asi as no hospedei o e eb ado, uncionando como mais uma es a égia de de esa (Bogdan & Röllingho , 1998). 5.4. Sob e i ência e mul iplicação nos mac ó agos Du an e o p ocesso clássico da agoci ose, os lisossomas, que con êm hid olases, undem-se com o agossoma (pa asi ó o o), que con ém o pa asi a, o mando o agolisossoma. No caso da leishmaniose, á ios es udos demons a am que os p omas igo as podem inibi a usão agossoma-lisossoma, po acção do LPG (Desja din & Desco eaux, 1997). A passagem da o ma p omas igo a pa a a o ma amas igo a é acompanhada po uma diminuição da exp essão do LPG, es abelecendo-se a usão agossoma-lisossoma, pelo que as o mas amas igo as êm que esis i ao meio ácido ico em p o eases do pa asi ó o o. Um desses mecanismos é a indução de al e ações na homeos ase do mac ó ago. Os pa asi as p omo em o aumen o da concen ação de Ca 2+ den o do mac ó ago, al e ando assim as suas ias de sinalização dependen es do Ca 2+ . Como consequência, os mac ó agos icam com os mecanismos de espos a a es ímulos in e nos al e ados, a ec ando unções de comba e ao pa asi a, como o choque oxida i o (“oxida i e bu s ”) e a exp essão de moléculas do complexo majo de his ocompa ibilidade (MHC) da classe II (Eilam e al., 1985; Oli ie e al., 1992; G ego y & Oli ie , 2005). Con a iamen e às o mas p omas igo as não in ecciosas, as o mas me acíclicas não es imulam o choque oxida i o, p incipalmen e de ido a dois ac o es: (1) u ilização do ecep o CR3 pa a in e nalização no mac ó ago, um p ocesso que não es imula o choque oxida i o (Mosse & Edelson, 1987); (2) a ele ada capacidade do LPG na inibição da p o eína cinase C do mac ó ago, a qual é essencial pa a a p odução de me aboli os oxida i os no mac ó ago (McNeely & Tu co, 1990). As o mas amas igo as possuem ainda subs âncias, como a os a ase ácida, e ou as enzimas (como a supe óxido dismu ase), que neu alizam os me aboli os oxida i os (Ghosh e al., 2003; Oli ie e al., 2005; Kima, 2007). Um ou o mecanismo u ilizado pelo mac ó ago pa a des uição dos pa asi as é a p odução de óxido ní ico (NO) pela enzima NO sin e ase (iNOS). P oud oo e al. (1995; 1996) desc e e am que a sín ese de NO pode se inibida po moléculas de glicoinosi ol os olípidos (GIPL) e pelo LPG p esen es na memb ana celula de In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 28 Leishmania. Es as duas moléculas, jun amen e com a gp63, medeiam a esis ência do pa asi a à acção das hid olases lisossomais (So ensen e al., 1994; Opa e al., 1996; Seay e al., 1996). As o mas amas igo as es ão pe ei amen e adap adas ao meio ácido dos agolisossomas: a en ada de me aboli os essenciais, como a p olina, a glucose e as bases pi imidínicas, sendo dependen e do anspo e de p o ões (H + ) pa a o ex e io , é óp ima a um pH ácido (4.0 – 5.5). Assim, apesa de i e em no meio ácido dos agolisossomas, os pa asi as conseguem man e um pH neu o no seu in e io (Bu chmo e & Ba e , 2001). A mul iplicação dos pa asi as é seguida de up u a da célula pa asi ada, sendo as o mas amas igo as agoci adas po ou os mac ó agos. A in ecção po Leishmania induz a exp essão de MIP-1α e MIP-1β, as quais induzem o ec u amen o de mais monóci os/mac ó agos pa a o local da in ecção, possibili ando, assim, a disseminação do pa asi a (Bua es & Ma lashewski, 2001). Ou os es udos demons a am ainda que o pa asi a em a capacidade de inibi a apop ose dos mac ó agos in ec ados, con ibuindo assim pa a a sua p óp ia sob e i ência (Moo e & Ma lashewski, 1994; Lüde e al., 2001). 5.5. Modulação da espos a imune As leishmanioses êm sido e e idas como modelo da espos a imuni á ia con a as in ecções p o ocadas po pa asi as in acelula es (Roi e al., 1996). As in e acções Leishmania-mac ó ago de e minam a espos a imuni á ia e êm um o e impac o no desen ol imen o ou na sup essão da doença. Mac ó agos ac i ados, células “na u al kille ” (NK) e lin óci os T desempenham um papel c ucial na de esa do hospedei o con a a in ecção po Leishmania. A ac i ação des as células e ec o as es á dependen e da p esença de ci ocinas es imulado as ou inibi ó ias. As leishmanias êm a capacidade de al e a a p odução das ci ocinas, a ec ando, des e modo, o desen ol imen o de uma espos a imune p o ec o a pelo hospedei o. A in ecção po Leishmania pode esul a em dois ipos de espos as imuni á ias, associadas à ac i idade dos lin óci os: a espos a humo al, não p o ec o a, associada com a suscep ibilidade à doença, e a espos a celula , p omo o a da esis ência à in ecção. Na LV obse a-se uma ma cada espos a humo al, com p odução de ele ados ní eis de gamaglobulinas, p incipalmen e IgG e IgM. Algumas delas ep esen am In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 35 no B asil, Ka plus e al. (2002) associa am-nos ao desen ol imen o de doença po L. chagasi. No Sudão, Mohamed e al. (2003) e Blackwell e al. (2004) encon a am associações en e polimo ismos nos genes codi ican es da IL4 e o apa ecimen o da LV e en e polimo ismos no ecep o do IFN-γ e o desen ol imen o de lesões leishmanóides dé micas pós kala-aza . Mais ecen emen e, El-Sa i e al. (2006) associa am o locus 22q12 com desen ol imen o de LV. A suscep ibilidade do hospedei o é ainda in luenciada po ac o es não- gené icos ais como o g au de nu ição, a p esença de in ecções concomi an es e a p é ia exposição à in ecção po Leihsmania (Bane h e al., 2008). 6. Mé odos de Diagnós ico Labo a o ial das Leishmanioses O diagnós ico p ecoce da leishmaniose é de ele ada impo ância, de o ma a e i a o desen ol imen o de lesões g a es ou mesmo a mo e do doen e (Schallig & Oskam, 2002) e como medida de con olo. O diagnós ico de ini i o da doença é e ec uado pela iden i icação do pa asi a nas lesões de pele e nos ó gãos icos em células do sis ema mononuclea agocí ico, espec i amen e nos casos de LC e de LV. O diagnós ico clínico da LV é complexo, de ido à oco ência, nas mesmas á eas geog á icas, de ou as doenças que ap esen am quad os clínicos semelhan es, ais como a ipanossomose, a ube culose e doenças lin op oli e a i as. Algumas des as doenças podem cu sa concomi an emen e com a LV e a seques ação do pa asi a no baço, no ígado, na medula óssea e nos gânglios lin á icos di icul a o diagnós ico (Sunda & Rai, 2002). Os mé odos de diagnós ico são, basicamen e os mesmos, que se a e da doença humana ou canina. 6.1. Diagnós ico pa asi ológico Os mé odos clássicos do diagnós ico pa asi ológico da leishmaniose consis em na pesquisa dos pa asi as po exame di ec o ou po exame cul u al, e ec uados a pa i do ma e ial biológico in ec ado. Na maio pa e dos casos de LV, é e ec uado a pa i de biópsia da medula óssea, e, no caso do cão, ambém a pa i de punção dos gânglios lin á icos. Em alguns casos são u ilizadas amos as biológicas de biópsias aspi a i as hepá icas e esplénicas, no en an o a ecolha de ma e ial ap esen a maio In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 36 di iculdade e um isco ac escido pa a o doen e (Gue in e al., 2002). Os exames de pele ambém são u ilizados pa a diagnós ico, mas sob e udo na LC. O exame di ec o consis e na obse ação, ao mic oscópio óp ico, de p epa ações do ma e ial biológico, após colo ação. A isualização de uma só célula pa asi ada é pa ognomónica da in ecção po Leishmania. O exame cul u al é mais sensí el que o exame di ec o, aumen ando assim a p obabilidade de sucesso do diagnós ico (Figu a 1.5). Figu a 1.5. Meio de cul u a NNN. C. Maia Apesa de ap esen a 100% de especi icidade, a ob enção do esul ado é demo ada e condicionada pela ausência de con aminação bac e iana ou úngica das cul u as. É ambém necessá io e em con a que nem odos os isolados c escem em meio de cul u a e que um esul ado nega i o com suspei a clínica não signi ica que o animal não se encon e in ec ado pois a dis ibuição dos pa asi as nos ecidos e nos di e en es ó gãos não é homogénea. Po ém, o isolamen o da es i pe em meio de cul u a possibili a: (1) a iden i icação da es i pe po ipagem isoenzimá ica ou molecula , dado que as espécies de Leishmania são mo ologicamen e indis inguí eis; (2) a ob enção de um núme o su icien emen e ele ado de o ganismos pa a inoculações em in ecções expe imen ais e pa a ob enção de an igénios; (3) es udos in i o da e iciência de á macos. Assim se comp eende que es e exame não seja u ilizado sis ema icamen e pa a a alia a espos a e apêu ica e os esul ados de p og amas de con olo e e adicação da doença (Amb oise-Thomas, 1976). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 37 Ainda que a isualização de um único pa asi a seja su icien e pa a o diagnós ico de ini i o da doença, a sensibilidade dos es es pa asi ológicos é baixa. 6.2. Diagnós ico se oimunológico Como acima e e ido, o diagnós ico de ini i o da LV é ge almen e baseado na de ecção do pa asi a. No en an o, o p ocesso de colhei a é in asi o e as écnicas pouco sensí eis (Coppola e al., 1994; Pia oux e al., 1994; Schallig & Oskam, 2002; Sunda & Rai, 2002). De ido a es as limi ações, o am desen ol idos mé odos se oimunológicos pa a diagnós ico da in ecção, os quais i am pa ido da ele ada p odução de an ico pos na leishmaniose isce al (Sunda & Rai, 2002), p incipalmen e em indi íduos imunocompe en es e nos cães. Os mé odos se oimunológicos não êm alo p á ico no diagnós ico das LC. Com excepção da LMC, os an ico pos ap esen am alo es baixos. 6.2.1. Imunidade humo al O es e se oimunológico que em sido uni e salmen e u ilizado no es udo da LV é a imuno luo escência indi ec a (IFI) (Oddo & Cascio, 1963; Ab anches, 1984). Es a écnica semi-quan i a i a pe mi e ambém segui a in ecção, disc iminando a ase aguda duma ase de emissão após a amen o, po de ecção da diminuição de an ico pos ci culan es (Millesimo e al., 1996¸ G adoni, 2002; Mancia i e al., 2002; Al a e al., 2004). Ba bosa e al. desen ol e am em 1973 a écnica de con aimunoelec o o ese (CIE) que, apesa de não se quan i a i a, em as an agens de ap esen a ele ada sensibilidade e especi icidade, u iliza quan idades mínimas de an igénio, pe mi i a ob enção do esul ado em pouco empo e de não necessi a de an ico po especí ico, podendo se es ada em di e en es espécies de hospedei os. Pelas ca ac e ís icas des e es e, é ci ado como complemen o da IFI em es udos epidemiológicos (Mansue o e al., 1982; Dunan e al., 1987; Ab anches e al., 1991; Campino, 1991). Apesa de e ela uma ele ada sensibilidade (100%) e especi icidade (90.5%) em indi íduos imunocompe en es, a ins abilidade dos eagen es, associado a uma ep odu ibilidade pouco sa is a ó ia e ao ac o de não pe mi i dis ingui en e a ase aguda e a ase emissi a da doença (Millesimo e al., 1996; Baleei o e al., 2006) o na-a pouco adequada ao diagnós ico, mas bas an e ú il no as eio de casos em In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 38 es udos epidemiológicos, em que habi ualmen e se é con on ado com ele ado núme o de amos as (Sa i & E ans, 1989). Ha i h e al. (1986, 1987, 1989), desen ol e am um es e de aglu inação di ec a (DAT) com eagen es es á eis, que ambém pode se u ilizada em g ande escala e que ap esen a esul ados de ácil lei u a e in e p e ação. A sensibilidade a ia de 70.6 % (Mohebali e al., 2004b) e 100% (Sil a e al., 2006) enquan o que a especi icidade encon a-se en e 84.9% (Mohebali e al., 2004b) e 100% (Neogy e al., 1992; Schallig e al., 2002a). Uma des an agem da écnica de DAT é não pe mi i uma boa dis inção en e indi íduos saudá eis e indi íduos em ase de emissão (Millesimo e al., 1996). Apesa de do passado o an igénio u ilizado e que se man ido a +4ºC, a sua lio ilização eio colma a es e p oblema, pe mi indo a sua manu enção a empe a u as ele adas e a sua u ilização em es udos de campo (Neogy e al., 1992; Me edi h e al., 1995; Schallig e al., 2002a; 2002b). Schallig e al. (2002b; 2004) desen ol e am o es e ápido de aglu inação (FAST), que eque uma única diluição de so o e cuja lei u a do esul ado é ei a após ês ho as de incubação ap esen ando uma sensibilidade e especi icidade de 93.6% a 97.7% e de 89.0% a 93.0%, espec i amen e. Todas es as écnicas ap esen am ele adas sensibilidades quando aplicadas a so os de indi íduos imunocompe en es com LV. No en an o, com o apa ecimen o de casos de leishmaniose em indi íduos imunocomp ome idos, es as écnicas e ela am- se pouco sensí eis, uma ez que es es pacien es ap esen am uma espos a humo al eduzida ou mesmo ausência de an ico pos ci culan es (Rosen hal e al., 1995; Campino e al., 1997). Assim, nos anos 90 oi aplicada a écnica de Wes e n-blo no diagnós ico da LV em doen es imunocomp ome idos apesa de não ha e consenso quan o ao pad ão de econhecimen o das acções p o eicas do pa asi a pelos an ico pos (Ma y e al., 1992; Rolland e al., 1994; Ma y e al., 1995; Cos a e al., 1996; San os-Gomes e al., 2000b). A al a de ep odu ibilidade dos esul ados en e di e en es labo a ó ios ambém obse ada no diagnós ico da leishmaniose canina (Ab anches e al., 1991; Ca e a e al., 1996; Fe nández-Pé ez e al., 2003), associada ao ele ado cus o e à necessidade de se execu ada po écnicos expe ien es, limi a a sua u ilização à in es igação (Fe oglio e al., 2007). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 39 Um dos mais p omisso es an igénios pa a aplicação em es es se oimunológicos é o K39, uma p o eína cons i uída po 39 aminoácidos, p edominan e nas o mas amas igo as do complexo L. dono ani (Bu ns e al., 1993). A p o eína ecombinan e K39 oi inicialmen e u ilizada num es e de ELISA (Qu e al., 1994; Singh e al., 1995; Bada ó e al., 1996; Hough on e al., 1998; Rhalem e al., 1999; Scalone e al., 2002; Me le e al., 2005) e mais a de num es e imunoc oma og á ico de aplicação ápida (“dips ick”) (Sunda e al., 1998). Ambos os es es e ela am ele ada sensibilidade e especi icidade no diagnós ico da LV e os ní eis de an ico pos an i- K39 diminuí am apidamen e após a cu a (Qu e al., 1994; Hough on e al., 1998). T abalhos pos e io es e ela am que o “dips ick” ca ecia de sensibilidade (Jelinek e al., 1999; Zijls a e al., 2001) e especi icidade (Rei hinge e al., 2002; Chappuis e al., 2003). Con udo, num es udo ecen e, oi compa ada a alidade de á ias écnicas de diagnós ico, incluindo a IFI, DAT e “dips ick”, pa a o diagnós ico da LV em doen es do Nepal. Tendo como e e ência os exames pa asi ológicos, o es e do “ K39 dips ick” e elou uma sensibilidade de 87.4 %, bas an e supe io à da IFI (28.4 %) e p óximo do alo ob ido po DAT (95.1 %). Os au o es concluí am que o DAT ou o “dips ick” podem subs i ui os es es pa asi ológicos no diagnós ico da LV no Nepal, possuindo o “ dips ick” a an agem de se de mais ácil u ilização (Boelae e al., 2004). Apesa des es es es imunoc oma og á icos (Figu a 1.6) se em mui o u ilizados no diagnós ico da leishmaniose canina de ido à sua ácil lei u a e u ilização, pe mi indo des a o ma a ápida in e enção do clinico, é necessá io de e mina a sua e icácia (G adoni, 2002). Um mé odo de de ecção de an igénio pa asi á io pode cons i ui uma al e na i a p omisso a às écnicas de de ecção de an ico pos ci culan es, po se mais especí ico (Vinayak e al., 1994; Colmena es e al., 1995b) e po pe mi i o diagnós ico da doença em casos de de icien e p odução de an ico pos (como em indi íduos HIV+ e ou os es ádios de imunossup essão). A de ecção de an igénios de Leishmania na u ina de indi íduos com LV oi ealizada pela p imei a ez po Kohan eb e al. (1987). O es e e elou uma sensibilidade en e 69%, em c ianças com menos de 2 anos de idade e 96 %, em indi íduos imunocomp ome idos, e especi icidade de 100 % com os an igénios a deixa em de se de ec ados ês semanas após a amen o, suge indo que o es e possui um bom alo de p ognós ico (A a e al., 2001; Sa ka i e al., 2002; C uz e al., 2006). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 40 Figu a 1.6. Tes es imunoc oma og á icos: es e p o ó ipo “La e al- low es o he diagnosis o dog isce al leishmaniosis” (a.) e es e K39 (b.). C. Maia C. Maia Em conclusão, nenhum dos mé odos se oimunológicos ac uais é conside ado al amen e e icaz e são de eduzida sensibilidade e especi icidade em doen es imunodep imidos, como nos casos de co-in ecção Leishmania/HIV, de ido à baixa, ou mesmo ausen e, p odução de an ico pos po es es indi íduos (Ma y e al., 1992; Campino, 1998). Tes es com ele ada sensibilidade e especi icidade são necessa ios pa a e i a os alsos nega i os, os quais subes iman o e dadei o núme o de indi íduos in ec ados assim como os alsos posi i os, os quais le am ao a amen o desnecessá io ou, no caso dos canídeos, à sua eu anásia. A u ilização simul ânea de duas écnicas se oimunológicas pe mi e uma maio segu ança do diagnós ico e a de ecção p ecoce da in ecção, eduzindo assim as des an agens ca ac e ís icas do diagnós ico baseado na de ecção de an ico pos (Kagan, 1979; Campino, 1998; Da ies e al., 2003; Campino, 2002). 6.2.2. Imunidade celula Segundo Fe nández-Bellón e al. (2005), a de e minação de uma espos a celula especí ica à in ecção po Leishmania é um indicado de um enó ipo Th1 associado ao con ol e ec i o da in ecção e à sob e i ência do hospedei o canino. Con udo, as écnicas pa a de e minação da imunidade celula não se encon am ão desen ol idas e es anda dizadas como as se ológicas pelo que não são no malmen e u ilizadas no diagnós ico. a. b. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 41 O es e cu âneo da leishmanina ou es e de Mon eneg o (1926) pe mi e a alia a exis ência de imunidade celula especí ica na leishmaniose humana, a a és de uma eacção dé mica de hipe sensibilidade e a dada. A sua aplicação cons i ui um impo an e meio de diagnós ico em es udos epidemiológicos de leishmaniose cu ânea sendo u ilizada em á eas endémicas (Rab & E ans, 1995; B ycesson, 1996; Sa a e al., 1997). Nas LC o es e o na-se posi i o um a ês meses após o apa ecimen o da lesão e pode assim pe manece oda a ida. Na LMC o esul ado é ge almen e posi i o e é conside ado de g ande impo ância pa a o diagnós ico, pois nes a o ma de leishamniose os pa asi as são usualmen e escassos (Hassan e al., 1995). Na LV o es e é ca ac e is icamen e nega i o du an e oda a doença ac i a, o nando-se posi i o, em ce ca de 80% dos casos, dois anos após cu a (Manson-Bah , 1961; Pea son & Sousa, 1996). O signi icado do es e posi i o não é cla o, e lec e que há uma espos a imuni á ia e a dada ipo IV, mas desconhece-se se o hospedei o es á p o egido da in ecção (Zijls a & El-Hassan, 1993). Nos úl imos anos, o am ei as á ias en a i as no sen ido de aplica es e es e à in ecção canina (Pinelli e al., 1994; Ca doso e al., 1998; Solano-Gallego e al., 2001a; Fe nández-Bellón e al., 2005; Ca doso e al., 2007; Rod íguez-Co es e al., 2007a; 2007b). Apesa da ácil execução e baixo p eço, as duas p incipais des an agens são a lei u a 48 a 72 ho as após inoculação da leishmanina e os alsos posi i os po acção ia ogénica ou po aplicações epe idas no mesmo animal (Fe nández-Bellón e al., 2005). O es e da p oli a ação lin oci á ia pe mi e a de ecção da imunidade celula in i o, a a és da es imulação dos lin óci os, com an igénios especí icos. O es e em sido u ilizado pa a ca ac e iza o ipo de espos a imunocelula à in ecção po Leishmania na população humana (Ca alho e al., 1992; Roh agi e al., 1996; Med ano e al., 1997) e canina (Ab anches e al., 1991; Pinelli e al., 1994; Cab al e al., 1992; 1998; Ca doso e al., 1998; Leand o e al., 2001; Quinnell e al., 2001; Solano-Gallego e al., 2001a; San os-Gomes e al., 2003; Fe nández-Bellón e al., 2005; Ca doso e al., 2007; Rod íguez-Co es e al., 2007a; 2007b). Apesa da espos a imunop oli e a i a e sido obse ada em cães na u al e expe imen almen e in ec ados, assin omá icos ou com sinais clínicos, com ou sem In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 42 a amen o (Bou doiseau e al., 1997; Fe nández-Pé ez e al., 2003; Rhalem e al., 1999; Mo eno e al., 1999), es a pa ece es a in imamen e elacionada com o pe il imuni á io e gené ico do hospedei o e não depende apenas da g a idade da doença. 6.3. Diagnós ico molecula Os mé odos de diagnós ico das leishmanioses a é aqui e e idos es ão sujei os a a iação eno ípica, podendo se quali a i a e quan i a i amen e in luenciados pela exp essão génica ou po ea anjos molecula es. Pelo con á io, o DNA é a única es u u a que ge almen e se man ém inal e ada du an e odo o ciclo de ida do pa asi a (Ba ke , 1989). 6.3.1. Reacção em cadeia da polime ase (PCR) A pa i da década de 80 começa am a se desen ol idas écnicas de de ecção de ácidos nucleicos do pa asi a pa a o diagnós ico da leishmaniose (Me edi h e al., 1993). A écnica de PCR baseia-se na ampli icação do DNA especí ico pelo uso de sequências iniciado as a pa i dos ácidos nucleicos de uma amos a biológica. A PCR em indo a demons a ele ada sensibilidade na de ecção do pa asi a (Smy h e al., 1992; Van Eys e al., 1992; Ramos e al., 1996; Campino e al., 2000a; Co es e al., 2004), sendo um dos mé odos mais u ilizados, não só no diagnós ico, como ambém na iden i icação das espécies de Leishmania de uma o ma ápida, sem eco e à cul u a do pa asi a (Smy h e al., 1992; Me edi h e al., 1993; Schonian e al., 2003). A sensibilidade e especi icidade da écnica depende das sequências iniciado as, do núme o de cópias da sequência al o, do mé odo de ex ação de DNA, do p odu o biológico u ilizado e do p o ocolo de PCR (Al a e al., 2004; Co es e al., 2004; Bane h & A och, 2008). A sua sensibilidade em indo a aumen a com o uso de sequências iniciado as que ampli icam sequências que possuem mais de uma cópia po célula. No caso da leishmaniose, essas sequências incluem os genes do mini-exão (Hassan e al., 1993; Ramos e al., 1996; Ka aku a e al., 1998), os genes que codi icam pa a a pequena subunidade do RNA ibossómico (SSU RNA) (Ba ke e al., 1987; Van Eys e al., 1992), sequências epe i i as do DNA nuclea (Pia oux e al., 1993) e os minicí culos do DNA cine oplas ideal kDNA (Smy h e al., 1992; Campino e al., 2000a; Co es e al., 2004). No p esen e es udo, o am u ilizadas as sequências iniciado as desenhadas pa a ampli ica uma sequência do kDNA de L. in an um (Co es e al., 2004; Rolão e al., In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 43 2004a). O sucesso dos mé odos que u ilizam o kDNA como gene al o de e-se às suas ca ac e ís icas únicas: as leishmanias possuem um núme o limi ado de classes de minicí culos (ge almen e menos de 12). Na maio ia das espécies de Leishmania, ce ca de 80 % dos minicí culos pe encem a qua o, ou menos, classes p incipais, o que signi ica que cada classe é ep esen ada po um núme o ele ado de cópias (> 10 3 ) disponí eis pa a ampli icação po PCR ou hib idação com sondas (Ba ke , 1989). Dos ce ca de 800 pb que cons i uem o minicí culo, ce ca de 120 pb co espondem a uma egião conse ada que con ém a o igem pu a i a de eplicação (50 pb) e a sequência “uni e sal” onde o RNA é cli ado (13 pb). Assim, a egião a iá el (ce ca de 680 pb) pode se u ilizada pa a a disc iminação das espécies de Leishmania (Ba ke , 1987; Smi h e al., 1989; Bozza e al., 1995; Lambson e al., 2000). Apesa do seu alo como mé odo de diagnós ico, em algumas limi ações como a possibilidade de de ec a pa asi as não iá eis e não necessa iamen e in ecções ac i as (Delgado e al., 1996) assim como não se uma écnica quan i a i a. En e os mé odos desen ol idos pa a quan i icação dos p odu os o mados na eacção de PCR des aca-se a PCR em empo eal. 6.3.2. Reacção em cadeia da polime ase em empo eal (qRT-PCR) Na PCR em empo eal, a u ilização de compos os luo escen es pe mi e a quan i icação do p odu o de PCR du an e a ase exponencial da eacção e, assim, a moni o ização em empo eal da eacção de ampli icação. Assim, a qRT-PCR é um mé odo e dadei amen e quan i a i o, pe mi indo quan i ica as moléculas de DNA num in e alo de 6 ou 7 loga í mos. É uma écnica de ápida execução e que não eque manipulação pós-PCR, e i ando po enciais con aminações com p odu os ampli icados, e que pode se aplicada na quan i icação de genomas ou em es udos de exp essão génica (Bell & Ran o d-Ca w igh , 2002; Mo a ino e al., 2004; Rolão e al., 2004a; Gomes e al., 2008). Os sis emas de de ecção po qRT-PCR podem se di ididos em dois g upos p incipais: (1) compos os que se in e calam inespeci icamen e em cadeias duplas de DNA, como o SYBR ® -G een I, e (2) me odologias de de ecção de cadeia simples de DNA, sob a o ma de sondas de hid ólise (como as sondas TaqMan ® ). O sis ema de de ecção com SYBR ® -G een é menos dispendioso do que a u ilização de sondas e possui uma maio lexibilidade de aplicação po pe mi i a aplicação de ensaios de PCR p e iamen e op imizados. A maio limi ação des e In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 44 sis ema eside na possibilidade de o SYBR ® -G een se in e cala , que nas sequências- al o ampli icadas, que em p odu os inespecí icos, ou díme os de sequências inicido as que e en ualmen e se o mem du an e a eacção de PCR, o iginando e os na quan i icação. Os sis emas que emp egam sondas TaqMan ® , moni o izam indi ec amen e a quan idade de amplicão-al o p esen e em cada amos a, em cada ciclo de PCR. Es e sis ema i a pa ido da ac i idade exonuclease 5’ da enzima DNA polime ase, a qual hid olisa a sonda ligada ao amplicão-al o, esul ando na emissão de luo escência. A sonda possui um luo oc omo em cada ex emidade. No seu es ado in ac o, a luo escência ge ada pelo luo oc omo da ex emidade 5’ (“Repo e ”) é abso ida pelo luo oc omo da ex emidade 3’ (“Quenche ”). Du an e a eacção de PCR, a DNA polime ase cli a a sonda hib idada, sepa ando o “Repo e ” do “Quenche ” e a luo escência emi ida pelo “Repo e ” em solução é en ão de ec ada e egis ada no apa elho. Uma ez que as sondas não cli adas (não hib idadas) em solução não emi em luo escência, a quan idade de luo escência egis ada é p opo cional à quan idade de amplicão-al o p esen e em cada ciclo da eacção de PCR. Vá ios ensaios de qRT-PCR êm sido desen ol idos no âmbi o da leishmaniose, que pa a quan i icação dos pa asi as, que pa a di e enciação das á ias espécies. Nicolas e al. (2002a) desen ol e am um sis ema de qRT-PCR com SYBR ® - G een pa a iden i icação das p incipais espécies de Leishmania do Velho Mundo: L. majo , L. dono ani, L. opica e L. in an um. As sequências iniciado as u ilizadas ampli icam uma egião do kDNA cuja sequência a ia de aco do com as espécies analisadas. Da ampli icação do DNA das di e en es espécies esul a am p odu os de PCR de di e en es amanhos e, po an o, com di e en es empe a u as de dissociação. Assim, a di e enciação das espécies oi ealizada pela análise das cu as de dissociação. Nos úl imos anos em-se e i icado um c escen e aumen o do núme o de p o ocolos de quan i icação de leishmanias po qRT-PCR (Nicolas e al., 2002b; S obodo á e al., 2003; B e agne e al., 2001; Bossolasco e al., 2003; Pennisi e al., 2005; F ancino e al., 2006; Manna e al., 2007; Solano-Gallego e al., 2007b). Todos os mé odos pe mi em a quan i icação num in e alo ala gado do núme o de pa asi as. Con udo, a compa ação dos esul ados ob idos nos di e en es es udos é di ícil, uma ez que as unidades de quan i icação do pa asi ismo não se encon am pad onizadas, In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 51 Quad o 1.2. In ecções expe imen ais po Leishmania in an um no modelo canino. 10 10-11 /Kg Se ocon e são N Ab anches e al., 1991 Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a 10 8 /animal Se ocon e são N Binhazim e al., 1993 10 5 /Kg Se ocon e são S Rhalem e al., 1999 5.8 x10 8 /animal Se ocon e são N Ca e a e al., 1996 Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a PCR 10 6 /Kg Isolamen o de pa asi a em cul u a N Leand o e al., 2001 Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a PCR Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a PCR ID 10 11 /Kg Se ocon e são N Ab anches e al., 1991 Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a 10 7-8 /Kg Se ocon e são N Ab anches e al., 1991 5 x 10 7 /animal Se ocon e são S Ma ínez-Mo eno e al., 1995 Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a PCR Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a 10 8 /animal Se ocon e são S Mo eno e al., 2003 Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a PCR Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a PCR Se ocon e são qRT-PCR Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a 10 7 /Kg ND N Leand o e al., 2001 5 x 10 8 /animal Se ocon e são N Mo eno e al., 2003 Isolamen o de pa asi a em cul u a PCR Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a Se ocon e são Isolamen o de pa asi a em cul u a IP ID P omas igo as S auss-Ayali e al., 2004; 2005; 2007S8.6-8.7 x 10 8 /animal EV 5 x 10 7 /animal S Rod íguez-Co és e al ., 2007b EV 10 9 /Kg S Campino e al., 2000b 10 9 /Kg N Campino e al., 2000b 1 x 10 7 - 2 x 10 8 /animal S Rosypal e al., 2005a 5x 10 7 -1.8 x 10 5 /animal N Killick-Kend ick e al., 1994 5 x 10 7 /animal Poo e al., 2005S 1.6 x 10 5 /animal S Pinelli e al., 1994 10 8 /Kg S San os-Gomes e al., 2000a 4 x 10 4 /animal N Pa anhos-Sil a e al., 2003 5x 10 7-9 /animal N Oli ei a e al., 1993 10 8 /animal Pa anhos-Sil a e al., 2003N 5 x 10 7 /animal S Poo e al., 2005 Fo ma pa asi á ia Vía de inoculação Inóculo Diagnós ico da in ecção Sinais clínicos Re e ência S S Nie o e al., 19992-5 x 10 5 /animal 10 8 /Kg N San os-Gomes e al., 2003 San os-Gomes e al., 2003 N - Sem sin oma ologia; S - Com sin oma ologia; EV - Endo enosa; ID - In adé mica; IP - In ape i oneal; ND - Não de e minado; PCR - Reacção em cadeia da polime ase Amas igo as N Oli ei a e al., 199310 6-10 /animal IP 5x 10 7-9 /animal N Oli ei a e al., 1993 2 x 10 9 /Kg ( e-inoculação) In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 52 7.4. Os P ima as Os macacos “ e e ” (Ce copi hecus pyge y h us) são conside ados po alguns au o es um bom modelo expe imen al is o se em ilogene icamen e p óximos do homem, e ap esen a em, al como o se humano, cu a espon ânea após in ecção na u al e expe imen al po L. majo ou pode em não ap esen a sin omas após in ecção po L. dono ani, al como acon ece com o homem nas zonas endémicas. Conside a-se que a esis ência à in ecção, nes es animais, se encon a associada com o aumen o da p odução de IFN-γ e a uma espos a de hipe sensibilidade e a dada. Es a espécie em sido u ilizada como modelo pa a o es udo de candida os acinais an i-L. majo e an i-L. dono ani (Giche u e al., 1997, 2001; Masina e al., 2003). A espécie “langu ” (P esby is en ellus) oi u ilizada pa a o es udo de acinas an i-L. dono ani u ilizando uma associação de L. majo com BCG demons ando ha e p o ecção he e óloga en e algumas es i pes de Leishmania (Dube e al., 1998). A di iculdade de ob e animais, o ele ado cus o de manu enção, o ac o de se em “immunological black boxes” (inexis ência de ma cado es das células T e ele ada a iabilidade indi idual) e p oblemas é icos, az com que a sua u ilização pa a es a acinas seja con o e sa (Hommel e al., 1995; Ga g & Dube, 2006). O ac o da in ecção po Leishmania sp. se exclusi amen e expe imen al ambém diminui o seu po encial como modelo (Requena e al., 2000). 7.5. O Ga o Ki kpa ick e al. (1984) u iliza am o ga o como modelo expe imen al de L. in an um e L. dono ani. Apesa dos animais e em ap esen ado í ulos ele ados de an ico pos, pe manece am assin omá icos du an e odo os seis meses de obse ação. Nos animais inoculados com amas igo as de L. dono ani po ia endo enosa de ec a am-se leishmanias no sangue, ígado e baço uma semana após in ecção, enquan o que nos animais inoculados com L. in an um/L. chagasi o pa asi a só oi de ec ado um mês após in ecção. No g upo de animais inoculados com aquelas espécies, po ia in adé mica, não se obse a am leishmanias du an e odo o pe íodo de obse ação. No en an o, pos e io men e o ga o domés ico oi conside ado e a á io à in ecção expe imen al po L. dono ani. Anjili & Gi hu e, (1993) não de ec a am pa asi as a a és do exame di ec o e cul u al nos 180 dias após in ecção expe imen al po ia endo enosa. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 53 Simões-Ma os e al. (2005) ambém u iliza am o modelo elino pa a es a a sua suscep ibilidade à in ecção po L. b aziliensis. Duas e qua o semanas após inoculação in adé mica de p omas igo as no na iz e na o elha, as p incipais lesões cu âneas obse adas o am pâpulas e nódulos cu âneos na o elha inoculada. A disseminação pa a a ou a o elha e lin oadenomegalia egional oco e am às 10 e 11 semanas, espec i amen e. Os au o es não obse a am co elação en e a p esença de lesões ac i as e os í ulos de an ico pos. As lesões ó icas e nasais acaba am po cica iza 32 e 40 semanas após o início do pe íodo expe imen al. 8. Leishmaniose Canina A leishmaniose canina oi descobe a po Nicolle e Com e, na A gélia em 1908 e desde en ão êm sido encon ados cães in ec ados na maio pa e das á eas onde a leishmaniose humana isce al, pa icula men e o kala-aza in an il, é endémico (Rab & E ans, 1995). Em quase odo o mundo, o cão é conside ado, o ese a ó io mais impo an e da espécie de Leishmania causado a da o ma isce al da doença. Apesa de alguns es udos mos a em uma elação di ec a en e a p e alência da leishmaniose canina e a leishmaniose isce al humana (Ma y e al., 1992), a in ecção no cão ap esen a alo es mui o supe io es e es ende-se po uma á ea mais as a quando compa ada com a in ecção humana (Houin e al., 1977). Embo a nem semp e exis a uma co elação en e as incidências da in ecção canina e da in ecção humana, a p esença de cães in ec ados, desempenha um papel impo an e na manu enção da endemia da leishmaniose isce al humana (Mansue o e al., 1982; Ab anches e al., 1986; 1987; Be ini & G adoni, 1986; Semião-San os e al., 1995). Exis em 3 di e enças undamen ais en e a leishmaniose isce al humana e canina: a c onicidade, que inclui um pe iodo p é-pa en e p olongado; o pa asi ismo isce ocu âneo e o seu pio p ognós ico de ido ao a amen o não se e icaz. Na na u eza nem odos os animais inoculados com p omas igo as desen ol em o quad o clínico. O núme o de in ecções assin omá icas é mui o maio que o núme o de in ecções sin omá icas (Campino, 2002). Es udos epidemiológicos e ec uados em ocos de leishmaniose canina na Eu opa, e ela am que ce ca de me ade dos cães pa asi ados não exibiam sin oma ologia, mas ap esen a am an ico pos an i-Leishmania (G adoni e al., 1980; Ab anches e al., 1991; Solano- In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 54 Galego e al., 2001b) indicando a exis ência de animais assin omá icos, po encialmen e in ec an es pa a o ec o (Lano e e al., 1979; Molina e al., 1994). Po ou o lado, in ecções caninas expe imen ais e idencia am a ausência de an ico pos em animais pa asi ados (Campino e al., 2000b) o que ale a pa a os es udos epidemiológicos, que se baseiam apenas na de ecção de an ico pos ci culan es, podendo subes ima o núme o de cães in ec ados (Cab al e al., 1998; Campino, 1998; Al a e al., 2004; Bane h e al., 2008; Mi ó e al., 2008). 8.1. Epidemiologia Apesa da p e alência da leishmaniose não se encon a elacionada com o sexo (Fe e , 1999; Campino, 2002), num es udo e ec uado no Sul da I ália (Cia amella e al., 1997) com 150 cães na u almen e in ec ados e i ica am que a maio ia dos animais e am do sexo masculino. De igual modo, apesa de em alguns es udos epidemiológicos (Ab anches & Pi es, 1980; Campino e al., 1995), as aças mais a ec adas e em sido o Pas o Alemão, Boxe e Dobe man, não exis e p edisposição acial embo a os animais de caça e de gua da, ao pe manece em no ex e io das casas, es ejam mais expos os aos lebó omos (Cia amella e al., 1997; Kou inas e al., 1999; Bla ie e al., 2001). A doença a inge animais de odas idades mas, de ido ao seu longo pe íodo p é-pa en e, não é equen e em animais com menos de seis meses (Fe e , 1999; Kou inas e al., 1999). O pe iodo de incubação após in ecção expe imen al a ia en e um e doze meses, na in ecção na u al não se sabe qual é a sua du ação is o não se sabe quando oco eu a inoculação (Campino, 2002). 8.2. Pa ogenia e sinais clínicos A di e sidade dos sin omas es á elacionada com os á ios mecanismos pa ogénicos desencadeados pelo pa asi a e pela a iação indi idual das espos as imuni á ias. Exis em desde o mas ané gicas com disseminação gene alizada dos pa asi as oligossin omá ica ou mesmo sem mani es ações clínicas, a é o mas hipe - eac i as nas quais as leishmanias não são de ec adas mas os animais ap esen am lesões o gânicas signi ica i as e uma sin oma ologia g a e (Al a e al., 2004). Os mecanismos pa ogénicos pelos quais os pa asi as de Leishmania p o oca lesões nos di e en es ó gãos incluem in il ados in lama ó ios não supu a i os, uma espos a In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 55 humo al exage ada e não p o ec o a, e a p odução de complexos imunes ci culan es (Al a e al., 2004; Na anjo e al., 2005). No pe íodo p é-pa en e, as p imei as al e ações inespecí icas obse adas são: eb e, apa ia, as enia, al e ações no ape i e, pe da ligei a e cons an e de peso, conjun i i e, depilações pe io bi á ias e au icula es e adenomegalia passagei a (Ca doso & Cab al, 1998; Al a e al., 2004). Num quad o clínico ípico de leishmaniose canina, o animal ap esen a-se aba ido, mui as das ezes caqué ico, anémico, com a o ia dos c o á i as, hipe o ia ungueal, adenomegalia e equen es al e ações cu âneas. Os sin omas ap esen am uma e olução len a e p og essi a com pouca ou nenhuma espos a aos an ibió icos e glucoco icóides. A imunosup essão p o ocada pela in ecção pe mi e o apa ecimen o de doenças concomi an es ais como Eh lichia canis, Demodex canis, Sa cop es scabiei e Hepa ozoon canis (Cia amella e al., 1997). A inoculação dos pa asi as na pele, desencadeia uma espos a in lama ó ia local ca ac e izada po uma in il ado de células mononucleadas (p edominan emen e mac ó agos e em meno g au lin óci os e plasmóci os), neu ó ilos e eosinó ilos (Fe e , 1999; dos-San os e al., 2004; Sa idomichelakis e al., 2007). Nos animais esis en es, a espos a aduz-se na exp essão de moléculas MHC-II pelas células de Lange hans e que a inóci os, pela p esença de células T, de mac ó agos e de pa asi as na de me (Fonde ila e al., 1997; Ta u i e al., 2004). Alguns cães desen ol em uma espos a imuni á ia e icaz com p odução de IFN-γ, TNF-α e IL-2 (Fe e , 1999) e apesa de es a em in ec ados pe manecem assin omá icos podendo ap esen a con udo uns pequenos nódulos cu âneos no local de inoculação (Figu a 1.7a); es es “canc os de inoculação” localizam-se no malmen e no na iz ou nas o elhas desapa ecendo en e 1 a 6 meses de o ma espon ânea (Fe e , 1999; Bla ie e al., 2001). Mais ecen emen e, O deix e al. (2005) obse a am em cinco cães múl iplas lesões papula es e i ema osas e i mes dispe sas pela cabeça e abdómen. A análise ci ológica das pápulas mos ou que o núme o de pa asi as e a eduzido, p o a elmen e de ido ao desen ol imen o de uma imunidade celula e icien e capaz de con ola a mul iplicação pa asi á ia. Como es as lesões cu âneas e am as únicas al e ações mani es adas pelos animais, os au o es suge i am que es a e a uma o ma benigna da doença, eo ia supo ada pelo ac o de que os animais não ap esen a em sinais sis émicos nem ec udescências após a amen o. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 56 Nos animais suscep í eis, as lesões ca ac e izam-se pela ausência de células ap esen ado as de an igénio na de me e po um ele ado núme o de leishmanias no in e io dos mac ó agos (Fonde ila e al., 1997; Ta u i e al., 2004). A p oli e ação exage ada de células in lama ó ias in ensamen e pa asi adas ambém oi obse ada po Fon e al. (1996) em nódulos nas mucosas o al e geni al. Os animais com sinais cu âneos se e os e com uma ca ga pa asi á ia ele ada na pele, ap esen am uma espos a local do ipo Th2 (B achelen e e al., 2005). As al e ações da pele são as mani es ações mais equen es na leishmaniose canina. As lesões são simé icas, c ónicas, não p u iginosas (Slappendel, 1988; Fe e , 1999). A alopécia localiza-se inicialmen e na cabeça, p incipalmen e na egião pe io bi al, ocinho e pa ilhões au icula es e pos e io men e no pescoço, ó ax, ube osidades ósseas e cauda. Es a alopécia é acompanhada de de ma i e u u ácea com dis ibuição localizada no bo do do pa ilhão au icula , egião pe io bi al e ocinho e de sebo eia seca, com início na cabeça es endendo-se pa a o es o do co po (Figu a 1.7b). O aumen o da espessu a da pele que se o na seca, du a, ugosa, com pe da de elas icidade adqui e o aspec o de “paquide me”. Ulce ações que acilmen e sang am, com localização na cabeça, no bo do do pa ilhão au icula , egião pe io bi al, ocinho e nos memb os (pa icula men e nas a iculações) são ou as das al e ações cu âneas obse adas (Figu a 1.7c). Embo a menos equen es, êm sido desc i os casos de de ma i e pus ula es é il, de de ma i e nodula , a qual se ca ac e iza pela p esença de múl iplos nódulos cu âneos (com menos de 2cm de diâme o), dolo osos, não ulce ados e não p u iginosos dis ibuidos po odo o co po (Cia amella e al., 1997; Fe e , 1999; Kou inas e al., 1999; Bla ie e al., 2001) e de de ma i e papula (O deix e al., 2005). As memb anas mucosas (o al, nasal e geni al) são ocasionalmen e a ec adas (Fon e al., 1996; Cia amella e al., 1997). Nos animais in ec ados que e oluem pa a a doença, a disseminação do pa asi a pelos ó gão pa ece se sequencial, iniciando-se no gânglio lin á ico, seguindo-se o ígado e a ingindo pos e io men e o baço. A pele dos cães, al como no caso dos humanos, é a ec ada numa ase mais a ançada (T a i e al., 2001; Ta u i e al., 2004). Es a disseminação pelos ó gãos desencadeia uma espos a in lama ó ia g anuloma osa, acompanhada no malmen e po um núme o eduzido de amas igo as (Bou doiseau e al., 1997). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 57 A esplenomegalia assim como as adenopa ias dos gânglios ce icais, submaxila es, p é-escapula es, axila es e poplí eos são dos sinais mais equen es e cons an es (Slappendel, 1988; Ab anches e al., 1991; Cia amella e al., 1997). Os gânglios, à palpação, ap esen am um aumen o conside á el de amanho e consis ência du a. São indolo es, não ade en es, lisos e não ap esen am sinais in lama ó ios. Os seus cen os ge mina i os co icais e medula es, p odu o es de lin óci os B, encon am-se hipe plásicos e com um ele ado núme o de mac ó agos enquan o que a zona pa aco ical, p odu o a de lin óci os T, ap esen a-se depaupe ada. Al e ações semelhan es são obse adas no baço. A leishmaniose canina p o oca a deso ganização da polpa b anca, com poucos lin óci os ao edo da a e íola cen al e a polpa e melha ap esen a-se hipe celula , com plasmóci os e mac ó agos pa asi ados na zona ma ginal, e com p oli e ação das células endo eliais (Ta u i e al., 2001). No es udo ealizado po Alexand e-Pi es e al. (2006), os au o es e i ica am que as al e ações his ológicas esplénicas e am esponsá eis pela edução da elocidade do luxo sanguíneo a a és do baço, pe mi indo que as células en ol idas nos p ocessos imunológicos i essem empo de p oli e a e de se di e encia , acili ando ambém a cap ação de lin óci os. Rela i amen e à mo ologia hepá ica es a ap esen a-se modi icada pela o mação de g anulomas e pela hipe plasia e hipe o ia das células de Kup e ; numa ase mais a ançada de in ecção, o pad ão obse ado é de uma in lamação po al lin oplasmocí ica, acompanhada de á eas de nec ose e ib ose compa í eis com uma hepa i e c ónica g anuloma osa (Fe e , 2002; Rallis e al., 2005). Es as al e ações aduzem-se no inc emen o dos alo es sé icos da os a ase alcalina e da alanina amino ans e ase (Slappendel, 1988). Ou o sinal equen e é c escimen o con ínuo das unhas (onicog i ose) acompanhado de hipe sensibilidade das almo adas plan a es e, po ezes, oco ência de hipe que a ose. A pe da de peso e do ape i e es ão p esen es em maio ou menos g au assim como a a o ia dos músculos, p incipalmen e dos c aneanos, que se aduz num en elhecimen o p ecoce denominado “Cabeça de Velha”. Mais a de oco e emaciação da egião do solomba que e olui pa a um es ado inal de caquexia. A a o ia e nec ose muscula es á associada à p esença de o mas amas igo as nas ib as muscula es e à deposição de IgG (Paciello e al., 2006). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 58 O desen ol imen o de uma espos a humo al não p o ec o a ca ac e izada pelo apa ecimen o de ele ados alo es de an ico pos no sangue ci culan e p o oca uma disp o einemia, com aumen o das p o einas o ais sé icas, hipe globulinémia e hipoalbuminemia (Slappendel, 1988). A diminuição sé ica da albumina ambém pode es a elacionada com a ne opa ia e consequen e pe da de p o einas ou po má nu ição (Ikeda-Ga cía e al., 2007). As IgG jun amen e com as acções C1, C2 e C4 do complemen o o mam imunocomplexos ci culan es que se deposi am nos di e en es ó gãos e ecidos (Al a e al., 2004; Na anjo e al., 2005). A deposição de imunocomplexos no im le a ao apa ecimen o de lesões a ní el ubula e glome ula (Bende i e e al., 1988). No es udo ealizado po Cos a e al. (2003) os 55 cães na u almen e in ec ados ap esen a am ne i e in e s icial, glome ulone i e (memb anop oli e a i a, mesângiop oli e a i a e glome uloescle ó ica), degene ação acuola , a o ia ubula e ib ose. Es as lesões al e am a unção enal, a ec ando a e olução da doença. Os animais com ne opa ia ap esen am ní eis sé icos ele ados de u eia, c ea inina e coles e ol e p o einu ia associada à p esença de e i óci os, leucóci os e células epi eliais no sedimen o u iná io (Kou inas e al., 1999; Cos a e al., 2003). A insu iciência enal é uma das p incipais causas de mo e dos cães com leishmaniose (Fe e , 1999; Al a e al., 2004; Roze, 2005). Os imunocomplexos ac i am localmen e o complemen o e ac o es quimio á icos, a aindo neu ó ilos, os quais p oduzem enzimas hid olí icas esponsá eis po p ocessos de asculi e e aumen o da pe meabilidade ascula (Agu e al., 2003; Cia amella e al., 2004) al e ando a capacidade de de esa do o ganismo, o sis ema de coagulação e o luxo sanguíneo (Fon e al., 1994). A leishmaniose canina p o oca no hospedei o uma al e ação pe sis en e dos componen es do sangue e nas unções da hemos ase. No início da in ecção a anemia é mode ada, no mocí ica e no moc ómica e hipo egene a i a. Os animais ap esen am ainda omboci openia e leucoci ose com neu o ilia. Apesa de na ase incial da doença se e i ica na medula óssea uma o e eacção g anuloma osa p oli e a i a, as al e ações i e e sí eis, que oco em po esgo amen o (E ans & Rebêlo, 1996), conduzem a uma panci openia gene alizada. A epis axis obse ada en e 5% a 10% dos cães é de ida à acen uada omboci opénia, ao aumen o da iscosidade do so o p o ocada pela hipe globulinémia, às al e ações da elocidade de coagulação e à expansão das In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 59 ulce ações às ossas nasais com lesão da mucosa e pe da da in eg idade dos ecidos nasais (Figu a 1.7d) (Fon e al., 1994; Co ona e al., 2004; Pe anides e al., 2008). Figu a 1.7. Sinais clínicos obse ados na leishmaniose canina: canc os de inoculação na o elha (a.); de ma i e u u ácea (b.); ulce ações nas a iculações (c.) e hipe que a ose nasal acompanhada de ulce ação da mucosa (d.). Mani es ações ocula es causadas pela leishmaniose em animais sin omá icos a iam en e 16 e 80.5% (Na anjo e al., 2005). Das á ias lesões ocula es obse adas, a ble a i e associada à de ma i e acial é a mais equen e. A conjun i i e pu ulen a e mucopu ulen a, assim como a que a oconjun i i e seca bila e al são ambém ulga es. Mais a amen e obse am-se u eí es associadas a edema da có nea. His ologicamen e es as u eí es são do ipo g anuloma oso com in il ação de plasmóci os e mac ó agos pa asi ados ou lin op oli e a i as com deposição de an ico pos e equen emen e conduzem ao apa ecimen o de glaucomas (E ans & Rebêlo, 1996; Cia amella e al., 1997; Na anjo e al., 2005; Roze, 2005). a. b. c. d. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 60 O sis ema ne oso pode se a ingido nas ases mais a ançadas da doença, p o ocando emo es, al e ações locomo o as e pa alisia dos memb os pos e io es. Viñuelas e al. (2001) e McKonkey e al. (2002) obse a am imunocomplexos e pa asi as nos líquidos ce alo aquidiano e sino ial, espec i amen e. A polia i e, a os eomieli e os eolí ica assim como lesões de os eolise e os eop oli e a i as ambém êm sido documen adas (Tu el & Pool; 1982; Bu acco e al., 1997; Viñuelas e al., 2001; Agu e al., 2003; Souza e al., 2005; San os e al., 2006). Um núme o eduzido de animais (menos de 5%) ap esen am ainda asci e, dia eia c ónica do in es ino g osso com melenas (po ulce ação da pa ede in es inal), sinais espi a ó ios ( ini e, pneumonia) e al e ações au o-imunes (Slappendel, 1988; Fe e , 1999; Kou inas e al., 1999). 9. T a amen o e Quimio- esis ência das Leishmanioses De ido à inexis ência de acinas e icazes pa a as o mas de leishmaniose humana (cu ânea, muco-cu ânea e isce al) ou canina, a e apêu ica, apesa de limi ada, é one osa e em e ei os cola e ais pe niciosos, con inua a ep esen a o único mecanismo de con olo quando as medidas p o ilác icas alham. A al a de e icácia dos á macos exis en es, a al a de ensaios clínicos de no os agen es e apêu icos e o apa ecimen o de esis ências apo am um p oblema pa a a Saúde Pública (Gangneux, 1999; C o , 2001; Ouelle e, 2001). À luz do conhecimen o ac ual, o aumen o do núme o de casos de esis ência adqui ida aos á macos é um ac o a e em conside ação na in ecção po L. in an um, ansmi ida po agulhas (nos oxicodependen es) e nas á eas geog á icas onde o ese a ó io canino é a ado (C o , 2001). A quimio e apêu ica de in ecção canina, que u iliza os á macos da medicina humana, em uma e icácia mui o eduzida, sendo equen es as ec udescências especialmen e em animais com in ecções sin omá icas (Mancian i e al., 1988; Al a e al., 1994). Os egimes e apêu icos ( ipo de á maco(s) e me odologia) u ilizados na leishmaniose canina são mui o a iados, o que p omo e o apa ecimen o de quimio- esis ência do pa asi a a a és da o e p essão selec i a exe cida pelos di e sos á macos. Di e sos ac o es são esponsá eis pela esis ência aos á macos: (i) a di e ença de sensibilidade das espécies/es i pes de Leishmania aos di e en es á macos seja po adap ação isiológica, po selecção pa asi as esis en es de uma In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 67 en ie ii (Chow e al., 1993), do ldmd 1 em L. dono ani (Ka aku a e al., 1999) e do lamd 1 em L. amazonensis (Guei os-Filho e al., 1995) esis en es à inblas ina. Pé ez-Vic o ia e al. (2001) e i ica am um aumen o na exp essão do md 1 em cul u as de p omas igo as de L. opica expos as du an e longo empo ao mil e osine e edel osine. 10. Medidas de Con olo das Leishmanioses A eme gência e/ou e-eme gência das doenças pa asi á ias, incluindo as leishmanioses, oco ida nos úl imos anos cons i ui um g a e p oblema de Saúde Pública. Es a si uação de e-se a uma mul iplicidade de ac o es, de en e os quais se des acam as modi icações ambien ais, as condições sócio-económicas, e a esis ência dos agen es pa ogénicos e dos ec o es aos á macos e insec icidas exis en es (Tesh, 1995; Rei hinge & Da ies, 2002). No con olo da leishmaniose é necessá io e p esen es os dois elos da cadeia epidemiológica, o ec o e o hospedei o e de p e e ência p og ama es a égias in eg adas. Segunda a O ganização Mundial de Saúde (WHO, 1990), as es a égias de con olo de em incidi sob e: os ec o es, ela i amen e às e en es biológicas, ecológicas e químicas; o pa asi a, e adicando-o nos hospedei os a a és do a amen o dos doen es e dos ese a ó ios semp e que possí el; e, a p o ecção indi idual e colec i a da população humana e canina. Adicionalmen e, o desen ol imen o de p odu os acinais de e se enco ajado uma ez que a acinação é uma das medidas de con olo mais p omisso as (Tesh, 1995; Dye, 1996). No con olo do ec o , o uso local/ egional de insec icidas é um dos possí eis meios de eliminação dos insec os. Em egiões onde oco a ansmissão pe i-u bana e os ec o es sejam acessí eis, os insec icidas esiduais (a u ilização do DDT, du an e as campanhas an imalá icas, le ou a uma diminuição conside á el na população dos lebó omos) podem eduzi com êxi o a incidência da leishmaniose humana e canina. No en an o, de ido à esis ência demons ada pelos lebó omos em algumas egiões (Kaul e al., 1978; Mukhopadhyay e al., 1996; Kisho e e al., 2006), assim como aos ele ados cus os e às implicações do seu uso sob e o meio ambien e e o Homem (Singh e al., 2001; Te eaul e al., 2001), a O ganização Mundial de Saúde só ecomenda a sua aplicação em casos de epidemias g a es. In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 68 O con olo biológico do ec o a a és da u ilização de pa asi as dos lebó omos como áca os (Ma inez-O ega e al., 1983; Sheha a & Bake , 1996) e nemá odes (Killick-Kend ick e al., 1989; Pi es e al., 1997b), assim como algumas bac é ias (Yu al & Wa bu g, 1989; Pene & Wilamowski, 1996; Robe e al., 1997) pode á ambém con ibui pa a uma diminuição da densidade ec o ial. A modi icação do habi a do ec o a a és da subs i uição do ipo de cul u as exis en es e da cons ução de aldeias em que as on es alimen a es e po enciais ab igos es ejam eduzidos, pode á con ibui pa a uma edução na axa de ansmissão da doença a longo p azo (WHO, 1990). O con olo zoop o ilác ico a a és da u ilização de animais pa a des ia os ec o es dos humanos oi es ado no abalho ealizado po Chelbi e al. (2008). Es es au o es e i ica am que o núme o de Phlebo omus papa asi ecolhidos no in e io das habi ações e na egião pe idomés ica oi signi ica i amen e in e io nos locais com coelhei as cons uídas ao edo das casas. A p o ecção do Homem da picada dos lebó omos em sido es ada a a és do uso de edes mosqui ei as ap op iadas e de co inas imp egnadas com insec icida (Elnaiem e al., 1999a; 1999b; Os yn e al., 2008). Em á ios es udos, e i icou-se edução na abundância de á ias espécies de lebó omos endo ílicos, uncionando o insec icida como epelen e do ec o (Majo i e al., 1989; Mu inga e al., 1992; 1993). No en an o, o sucesso des a medida es á limi ado a uma zona es i a, e depende do compo amen o endo ílico ou exo ílico do ec o . A aplicação indi idual de epelen es pode á p o ege o Homem da picada dos lebó omos, con udo o empo de ac i idade é eduzido e os seus e ei os a iam com a espécie de Phlebo omus es ada (Coleman e al., 1993; Kalyanasunda am e al., 1994). O desen ol imen o de no as écnicas de diagnós ico que pe mi am a de ecção p ecoce da in ecção em indi íduos imunocompe en es e imunodep imidos, u ilizando amos as de colhei a não in asi a, ais como a u ina ou a sali a, que sejam de simples execução e que possam se u ilizadas em egiões emo as, são ou as das medidas necessá ias pa a o con olo da doença (Gue in e al., 2002). As no as me odologias de e ão ainda e alo p ognós ico e de ec a casos de ec udescência assim como dis ingui as es i pes de Leishmania esis en es à e apêu ica (Da ies e al., 2003). Po ou o lado, os esquemas de e apêu ica disponí eis pa a es a pa asi ose nem semp e são e icazes, nem de ácil adminis ação e, em de e minadas egiões, a esis ência aos á macos de p imei a linha são uma ealidade (Li a e al., 1999). No In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 69 u u o, a p e enção e o con olo da leishmaniose dependem do desen ol imen o de agen es e apêu icos não óxicos, de adminis ação o al, com ele ada axa de e icácia após um cu o a amen o (com cu as supe io es a 95% em odas as á eas geog á icas), con a odas as espécies do pa asi a, e de em pode se adminis ados a indi íduos de odos os escalões e á ios, a g á idas e nos imunocomp ome idos (Zilbe s ein & Eph os, 2002). A combinação de á macos de e á p e eni ou a asa o apa ecimen o de esis ências além de encu a o pe íodo de a amen o (Gangneux, 1999; Sunda , 2001; Gue in e al., 2002). A es au ação da imunidade nos imunocomp ome idos em associação com a p o ilaxia secundá ia p o a elmen e o na á o a amen o mais e ec i o e diminui á o núme o de ecidi as, p incipalmen e nos indi íduos co-in ec ados com o HIV (Gangneux, 1999; Gue in e al., 2002; Da ies e al., 2003). O con olo da in ecção no cão, sendo es e animal um ese a ó io do pa asi a, pe mi i ia ambém eduzi o isco de in ecção da população humana. O aba e de cães domés icos sin omá icos já e ec uado na China (Zhi-Biao e al., 1984), no B asil (Nascimen o e al., 1996; Die ze e al., 1997; Ash o d e al., 1998; Nunes e al., 2008) e em I ália, não oi o almen e e icaz uma ez que os cães assin omá icos, cons i uem um bom ese a ó io da doença e são on e de in ecção do lebó omo (Killick- Kend ick e al., 1994; Molina e al., 1994; Campino, 1998). No B asil, ao con á io do que e a espe ado, e i icou-se, após aba e dos cães se opos i os, um aumen o da incidência da leishmaniose isce al humana, (Die ze e al., 1995; 1997). Se ia aconselhá el que se e ec uasse anualmen e, an es da época de ansmissão, o as eio se ológico ob iga ó io dos cães pa a de ecção dos cães in ec ados assin omá icos, de modo a se em a ados e p e eni a ansmissão (Tesh, 1995; Al a e al., 1994). Dado que o aba e de cães domés icos se depa a com esis ências de o dem e ec i a, é ica e económica, o con olo da doença ica la gamen e dependen e do êxi o do a amen o. A leishmaniose no cão é mais esis en e à e apia do que no homem, sendo equen es as ec udescências após o a amen o, especialmen e em animais com in ecções sin omá icas (Mancia i e al., 1988; Al a e al., 1994). Po ou o lado, que o a amen o que a ex e minação dos ese a ó ios sil á icos ( oedo es, aposas, e c.), não são exequí eis, pelo que o ciclo sil á ico se man ém ac i o (Capela, 2002). O ecolhimen o dos animais an es do escu ece du an e a época de ansmissão (Da idson, 1999), assim como a u ilização de sp ays, colei as e champôs insec icidas nos cães é uma o ma de diminui a in e ação ec o /hospedei o, conduzindo a uma In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 70 edução na axa de ansmissão da leishmaniose en e animais e humanos (Asche e al., 1997; Pi es e al., 1997a; Killick-Kendick e al., 1997a; Ma oli e al., 2001; Molina e al., 2001; 2006; Halbig e al., 2000; Da id e al., 2001; Ga gani e al., 2002; Mencke e al., 2003; Mi ó e al., 2007a). Ou as medidas de con olo da leishmaniose, que englobem a edução ou ex e mínio dos ec o es e de ou os ese a ó ios, são di íceis de aplica ou mesmo imp a icá eis. Uma ez que a p e enção da doença no cão é a o ma mais e ec i a de in e upção do ciclo de ansmissão domés ico de L. in an um, a es a égia de con olo mais e icaz a longo p azo se á o desen ol imen o de uma acina canina an i- Leishmania (Tesh, 1995; Mo eno & Al a , 2002). A acina de e á induzi uma espos a do ipo Th1, o nece uma imunidade es é il eliminando os amas igo as que esidem na pele apa en emen e saudá el, ac ua nos dois es ádios do ciclo do pa asi a, se es á el, ba a a e con e i imunidade de longa du ação (Ja e, 1999). Po ém, o sucesso de uma acina não depende única e exclusi amen e do p odu o acinal, mas ambém do p o ocolo de acinação u ilizado (dosagem, núme o de doses, in e alo de empo en e doses), da ia de adminis ação e do ipo de adju an e (Capela, 2002). A expe imen ação no cão de p odu os candida os a acina não é de ácil execução e é dispendiosa. Po es as azões, quase odos os p odu os acinais desen ol idos o am es ados em modelo oedo , na maio pa e das ezes com sucesso. Con udo, quando aplicadas a olun á ios humanos os esul ados o am inconsis en es, e no cão, não con e i am imunidade, aumen ando em alguns casos, a suscep ibilidade dos animais à in ecção po Leishmania (Dunan e al., 1989). Vá ios g upos de in es igado es êm p ocu ado induzi imunidade p o ec o a nos canídeos (Quad o 1.3) com pa asi as i os ou mo os, ( acinas de 1ª ge ação), com es i pes gene icamen e modi icas ou com subunidades p o eicas pu i icadas ( acinas de 2ª ge ação) ou com acinas de DNA (3ª ge ação). Es as acinas consis em na inoculação de um plasmídeo que con ém o(s) gene(s) al o clonado(s) e cuja exp essão in si u induz uma espos a an igénica especí ica. A es abilidade, o baixo cus o, a não necessidade de adju an es e, a exp essão pe sis en e do(s) an igénio(s) pa asi á ios, que pe mi e a es imulação con ínua da imunidade humo al e celula são as suas p incipais an agens (Mo & Eliza, 2001; Gu una han e al., 2000; G adoni, 2001). In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 71 Quad o 1.3. Re isão dos ensaios ealizados com p odu os acinais candida os à p o ecção da leishmaniose canina. Fase I 100% segu a Fase II 90% e icaz Fase III não e icaz Fase I e II segu o e e icaz Fase I Fase III 69.3% p o ecção Fase I 100% e icaz Fase I Fase III sem p o ecção Fase III 92% p o ecção Fase III 95% p o ecção Fase II 100% p o ecção Fase III 92% p o ecção Fase II 90% e icaz Fase II não conclusi o Fase III sem p o ecção Fase I 100% segu a Fase II 50% e icaz Fase II 60% e icaz Fase II 100% e icaz Fase II Fase I 100% segu a Fase II sem p o ecção Fase II L- Leishmania; BCG- Bacilo Calme e-Gue in; ALM - L. majo au ocla ada; SGE -Ex ac o de glândula sali a ; WPV - acina p oduzida com a o alidade do pa asi a; Li F2 - F acção 2 de L. in an um; FML- Ligando da ucose manose; QuilA - Saponina Quillaja sapona ia; LiESAp - An igénios exc e ados e sec e ados po p omas igo as de L. in an um; MDP - Dipép ido mu amil; p o eina Q - L. in an um p o eina mul icomponen e quimé ica; Lip2a - P o eina 2a de L. in an um; Lip2b - P o eína 2b de L. in an um; P0 - P o eína ácida ibossómica, H2A - His ona 2a; MML - Polip o eína compos a pelos an igénios TSA, LeIF e LmST11 ; MPL-SE - adju an e; AdjuP ime - adju an e; TSA - An ioxidan e especí ico do iol de L. majo ;LeIF -Fac o iniciado de elongação de L. b aziliens s; LmST11 - P o eina de L. majo indu o a de s ess ; H1 - His ona 1 ; HASPB1 - P o eina de supe icie B1 ace ilada e hid o ílica; Mpn anide 720 - adju an e; LACK - Recep o de Leishmania pa a a quinase C ac i ada; VV - Vi us Vaccinia ecombinan e; pCB6 - ec o de exp essão; CPA - P o einases de cis eina de L. in an um ipo I; CPB - P o einases de cis eina de L. in an um ipo II; CpG-ODN - adju an e; H2B - His ona 2b; H3- His ona 3; H4 - His ona 4; PSA2 - an igénio pa asi á io de supe ície 2; ST11 - P o eina 1 indu o a de s ess de L. majo ; ARP1 - P o eina 1 elacionada com a ac ina; KMP-1 -P o eina 11 da memb ana do cine oplas o; gp63 - glicop o eina 63; IL12 -In e leucina 12; GM-CSF - Fac o es imulado de colónias de mac ó agos e g anulóci os; MVA -Vi us Anka a modi icado P odu o acinal An igénios Cães imunizados Resul ados Re e ência May ink e al., 1996L. b aziliensis (me iola o)L. b aziliensis + BCG Mohebali e al., 2004aL. majo (au ocla agem)L. majo + BCG + aluminio 12 10 L. majo (au ocla agem) Gena o e al., 1996L. b aziliensis + BCG L. b aziliensis (me iola o) 1763 Mohebali e al., 1998 16 ALM + BCG MML + MPL-SE/AdjuP ime 10 TSA, LeIF, LmSTI1 Fujiwa a e al., 2005 LiF2 Sil a e al., 2000 58 L. dono aniFML 44 Bo ja-Cab e a e al., 2002FML+saponina QuilA L. dono ani An igénios ecombinan es F acções pu i icadas Molano e al., 2003p o eína Q+BCG Lip2a, Lip2b, P0, H2A 10 L. in an um Li ESApLi ESAp-MDP 9Lemes e e al., 2005 Lemes e e al., 2007L. in an um Li ESApLi ESAp-MDP 205 Dunan e al., 1989L. in an um Li F2 Vacinas de ADN Rami o e al., 2003 5 LACKLACK + VV ADN mul icomponen e + IL2 + GM-CSF L. dono ani LACK, H1, H2A, H2B, H3, H4, PSA2, TSA, ST11, ARP1 8 Salda iaga e al., 2006 100% e icaz Rod íguez-Co és e al ., 2007bADN mul igénica ALM + BCG / saponina 182 Ra a i e al., 2005 pCB6-CpB e/ou pCB6-CpA + CpG-ODN + Mon anide720 L. in an um CPB e CPA 10 H1 e HASPB1 G adoni e al., 2005MML + MPL-SE/AdjuP ime 30 TSA, LeIF, LmSTI1 H1 + HASPB1+ Mon anide720 Mo eno e al., 2007 40 H1/HASPB1 + Mon anide720 386 5 Es imulação imunidade Las i e al. , 1999 18 L. majo (au ocla agem) MVA-LACK/ VV-LACK Ramos e al., 2008 Pa asi as mo os L. in an um KMP-1, TSA, LACK, gp63 6 Es imulação espos a Th18 LACK Giunche i e al., 2008bL.b aziliensis + L. amazonensisWPV + BCG 5Es imulação imunidade Giunche i e al., 2008aL. b aziliensis L. b aziliensis + saponina + SGE In odução ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 72 Apesa dos esul ados desenco ajado es ob idos com os p odu os acinais es ados, o desen ol imen o espon âneo de esis ência em cães in ec ados (Cab al e al., 1992; Ca doso e al., 1998; Pinelli e al., 1994; Solano-Gallego e al., 2000) incen i a a con inuação de es udos sob e acinas con a a leishmaniose canina, que indi ec amen e pode ão con ibui pa a o con olo da leishmaniose zoonó ica humana (Ab anches e al., 1998; Rei hinge & Da ies, 2002). Ac ualmen e exis e un acina egis ada no B asil pa a a p e enção da leishmaniose canina (Leishmune ® ). Es e p odu o acinal, além de bloquea a ansmissão da in ecção (Noguei a e al., 2005; Sa ai a e al., 2006), mos ou se e icaz quando u ilizado como agen e imuno e apêu ico (Bo ja-Cab e a e al., 2004). A sua p incipal des an agem é o ele ado cus o (ce ca de 120 eu os po animal). Pa a o seu uso se gene alizado é necessá io es anda iza a sua p odução e e ec ua mais ensaios clínicos, não só em ou as egiões do B asil como em ou os países onde a in ecção é endémica (Dan as- To es, 2006). Rela i amen e ao se humano, só duas acinas de 1ª ge ação se encon am licenciadas: uma acina i a imunop o ilác ica, no Uzbequis ão pa a con olo da L. majo , e uma acina mo a imuno e apêu ica pa a o a amen o de L. b aziliensis, no B asil (Pala nik-de-Sousa, 2008). CAPÍTULO II CARACTERIZAÇÃO DE UMA INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR Leishmania in an um NO CÃO Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 75 2. Ca ac e ização de uma in ecção po Leishmania in an um no cão A leishmaniose causada po Leishmania in an um (sin. L. chagasi), é uma zoonose endémica na Bacia Medi e ânica a ec ando milhões de cães na Eu opa, no No e de Á ica, na Ásia e na Amé ica do Sul, cons i uindo ainda uma doença eme gen e na Amé ica do No e (Rosypal e al., 2003; Dup ey e al., 2006). O cão (Canis amilia is), sendo o p incipal hospedei o da in ecção e o p incipal ese a ó io domés ico da leishmaniose isce al humana, oi p opos o como o melho modelo animal pa a o es udo da espos a imuni á ia, pa a a aliação de no os compos os e apêu icos assim como de candida os a p odu os acinais (Vallada es e al., 2001; Ash o d e al., 1998; Ga g & Dube, 2006). Espe a-se de um modelo animal a ep odução dos aspec os pa ológicos e das espos as imunológicas obse adas nos humanos quando es es são expos os à in ecção po Leishmania. Têm-se desen ol ido á ios modelos mas nenhum ep esen a ão bem as ca ac e ís icas da in ecção na u al, obse adas na leishmaniose isce al humana e canina, como acon ece com o modelo canino (Hommel e al., 1995; Cab al e al., 1998; Campino, 1998; Campino e al., 2000b). A maio di e ença en e as in ecções na u al e expe imen al es á elacionada com o inóculo pa asi á io. Em condições no mais, o ec o in oduz uma a á ias cen enas de p omas igo as me acíclicos na de me do hospedei o, enquan o que nas in ecções expe imen ais o inóculo é in oduzido ge almen e po injecção (in adé mica ou endo enosa) e con ém milhões de p omas igo as p o enien es de cul u as in i o ou amas igo as e i ados de ecidos in ec ados (Homel e al., 1995). 2.1. Ma e ial e Mé odos 2.1.1. Animais Fo am u ilizados nes e es udo 12 exempla es (6 machos e 6 êmeas) da espécie Canis amilia is aça Beagle, o necidos po c iado licenciado (Ma shall Bio esou ces, No a Io que, USA) com ce ca de doze semanas. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 76 Todos os animais o am despa asi ados com an i-helmín icos de la go espec o (pamoa o de pi an el e i e mec ina) e coccidios á icos (amp olio e sul adime oxina) e acinados con a a esgana, pa o i ose, hepa i e, adeno í us ipos 1 e 2, Lep ospi a canicola e L. ic e ohaemo hagiae, pa ain luenza, Bo de ella b onchisep ica, papiloma ose o al canina e ai a. Es es animais o am man idos no Canil do IHMT em condições climá icas e de nu ição adequadas e de aco do com as no mas comuni á ias (86/609/CEE) ela i as ao bem-es a dos animais de expe iência anspos as pa a a lei nacional (D.R. DL129/92 e po a ia 1005/92 de 23 de Ou ub o, DR I sé ie-B nº245). O canil encon a a-se o almen e p o egido com uma ede mosqui ei a de malha in e io às dimensões do lebó omo e com insec ocu o es no seu in e io de modo a e i a a ansmissão na u al da in ecção. Todos os p ocedimen os execu ados nes e es udo o am ealizados seguindo as boas p á icas clínicas de “The VICH guideline (GL9) on good clinical p ac ices o e e ina y medicinal p oduc s” VICH S ee ing Commi ee, Junho de 2000. O es udo, com du ação de se e meses (o p imei o mês co espondeu ao pe íodo de qua en ena dec e ado pela no mas acima mencionadas), oi ap o ado pelas comissões de é ica da Di ecção Ge al de Ve e iná ia e do IHMT. 2.1.2. Pa asi as Pa a a p epa ação de an igénio pa a as écnicas de imuno luo escência indi ec a e con aimunoelec o o ese, p oli e ação lin oci á ia e in ecção in i o dos mac ó agos o am u ilizadas o mas p omas igo as da es i pe MHOM/PT/88/IMT151 de Leishmania in an um MON-1. De o ma a ob e um núme o ele ado de o mas p omas igo as, os pa asi as o am cul i ados em meio líquido de al o endimen o, incubado a +24 ºC (Memme , Alemanha): meio Schneide (Sigma, USA), suplemen ado com so o e al bo ino (FCS; Bioch om, Alemanha) a 20 % ( / ), p e iamen e inac i ado pelo calo (30 minu os a +56 ºC) e gen amicina 50 mg/ml (Sigma). Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 77 2.1.2.1. P omas igo as P epa ação de an igénio o al de L. in an um O an igénio oi p epa ado a pa i das cul u as a uma concen ação de 10 8 -10 9 pa asi as/ml. A con agem de pa asi as oi e ec uada em hemaci óme o de Neubaue (Sigma) ao mic oscópio óp ico e os p omas igo as o am ecolhidos na ase es acioná ia de c escimen o e cen i ugados a 925 g (cen í uga 5810R, Eppendo AG, Alemanha) du an e 15 minu os a +4 ºC. O sedimen o de p omas igo as oi la ado ês ezes com so o isiológico a 0.9 %, com cen i ugações a 925 g du an e 15 minu os a +4 ºC. Após a e cei a la agem, o sob enadan e oi ejei ado e essuspendeu-se o sedimen o em 500 µl de água ul apu a. Foi de seguida iniciado o p ocesso de lise celula a a és de seis ciclos sucessi os de congelação e descongelação (-20 ºC, -80 ºC, empe a u a ambien e), no im do qual se p ocedeu a cen i ugação a 925 g du an e 15 minu os e ecolha do sob enadan e. A concen ação p o eica oi de e minada po espec o o ome ia (Gene Quan II; Ame sham Pha macia Bio ech Inc., Pisca away, USA) e o an igénio oi conse ado a -20ºC a é à sua u ilização. 2.1.2.2. Amas igo as Pa a a ob enção das o mas amas igo as, e i a am-se, após eu anásia, o baço e o ígado de cães in ec ados, os quais o am la ados em so o isiológico penicilado (100 U/ml) e homogeneizados. O p odu o oi colocado em ubos de cen í uga de 50 ml (Del aLab, Espanha) e cen i ugado a 129 g, du an e 5 minu os a +4ºC. O sob enadan e oi ans e ido pa a ubos de 50 ml, endo-se ejei ado o sedimen o. Lisa am-se os e i óci os u ilizando saponina (Sigma) numa p opo ção de 25 µg de saponina pa a 20 ml de sob enadan e. Após 5 minu os à empe a u a ambien e, cen i ugou-se a 1934 g, du an e 10 minu os a +4ºC. Após cen i ugação a 1021 g du an e 10 minu os a 4ºC, em 20 ml de meio “Roswell Pa k Memo ial Ins i u e” [RPMI 1640 (Bioch om), penicilina 100 U/ml, es ep omicina 100 µg/ml], supplemen ado com 10 mM HEPES (ácido pipe azinea anilsul ónico 4-(2- hyd oxie ilo)-1-) (Sigma), o sedimen o oi diluído em 5 ml de RPMI e as células o am desag egadas a a és de ês passagens da suspensão a a és de uma se inga. Após mais duas cen i ugações a 1934 g du an e 10 minu os a +4ºC, o sob enadan e oi ejei ado e essuspendeu-se o sedimen o em 20 ml de RPMI. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 84 2.1.8.1. Imuno luo escência Indi ec a P epa ação de an igénio igu ado de L. in an um O an igénio igu ado oi p epa ado a pa i de o mas p omas igo as de L. in an um em cul u a como desc i o em 2.1.2. Re i a am-se 50 ml da cul u a e cen i uga am-se a 425 g du an e 10 minu os a +4ºC. O sob enadan e oi ejei ado e la a am-se os p omas igo as com so o isiológico 0.9%. Os pa asi as o am con ados em hemaci óme o de Neubaue e a suspensão oi ajus ada de modo a se ob e uma concen ação de 2x10 6 p omas igo as/ml. O an igénio 10 µl/cí culo oi deposi ado nas lâminas com 10 cí culos (Bio Mé ieux Po uguesa, Po ugal), que se coloca am em es u a a +37ºC na p esença de um en ilado , pa a acili a a e apo ação ápida do líquido, man endo a dis ibuição uni o me dos p omas igo as no cí culo. Após secagem o an igénio oi conse ado a -80ºC. Técnica de Imuno luo escência Indi ec a A IFI oi ealizada segundo o mé odo desc i o po Ab anches, 1984. As lâminas com an igénio conse adas a -80ºC o am colocadas à empe a u a ambien e, e após secagem ixou-se o an igénio com ace ona. Os so os a es a o am diluídos em p og essão geomé ica em PBS a pH 7.2, aplicados a cada cí culo (25 µl) e incubados a + 37ºC, em câma a húmida, du an e 30 minu os. Após o empo de incubação, as lâminas o am e i adas da câma a e, após ejeição do excesso de so o, colocadas em PBS a pH 7.2, du an e 30 minu os. Depois de seca colocou-se 25 µl de conjugado (gama-globulinas an i-IgG de cão; Sigma) diluído em solução de azul de E ans (Sigma) (1:100000 de azul de E ans em PBS). P ocedeu-se a la agem e incubação em câma a húmida, du an e meia ho a, inda a qual se ejei ou o excesso de conjugado e colocou-se em PBS du an e 10 minu os. Após mon agem com glice ina amponada (1:10) e lamela, p ocedeu-se à lei u a em mic oscópio de luo escência, no comp imen o de onda 475. Conside a am-se posi i os os so os com luo escência em diluições iguais ou supe io es a 1/64. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 85 2.1.8.2. Con aimunoelec o o ese P epa ação de an igénio solú el de L. in an um O an igénio solú el oi p epa ado a pa i de o mas p omas igo as de L. in an um em cul u a como desc i o em 2.1.2.1. Técnica de Con aimunoelec o o ese A CIE oi ealizada segundo o mé odo desc i o po Monjou e al. (1978) e Campino (1998). P ocedeu-se à elec o o ese em ampão ba bi al sódico 0.08 M, pH 8.2 (16 g ba bi al sódico (Me ck), 1000ml de água des ilada, HCL 1N), u ilizando i as de ace a o de celulose geli icado (Cellogel, I ália), e uma co en e de 75 V/cm, du an e duas ho as a +4ºC (equipamen o Sebia), O so o a es a (15 µl) oi deposi ado nas i as no lado do ânodo e 15 µl de an igénio (50 mg/ml) no lado do cá odo, dis ando 1,5 cm en e ambos. Após la agem com so o isiológico a 0.9%, as i as o am co adas numa solução de azul b ilhan e de Coomassie (Sigma) (5 g de azul b ilhan e de Coomassie + 1000 ml de solução desco an e, cons i uída po 500 ml de me anol p.a. (Me ck), 400 ml da água des ilada e 100 ml de ácido acé ico glacial p.a.) du an e 10 minu os, e pos e io men e, colocadas na solução desco an e, a é ao apa ecimen o dos a cos de p ecipi ação. Conside a am-se posi i os odos os so os que, e ela am pelo menos, um a co de p ecipi ação (Campino, 1991; 1998). 2.1.8.3. Tes es Imunoc oma og á icos Rápidos Tes e ápido com K39 O an igénio ecombinan e K39, consis e numa p o eína p edominan emen e exp essa pela o ma amas igo a, a quinesina, al amen e conse ada no complexo L. dono ani pelo que a sua u ilização como molécula de diagnós ico ap esen a uma ele ada sensibilidade e enha alo p edic i o no apa ecimen o da ase sin omá ica da doença (Bada ó e al.,1996; Gomes e al.,2008). O es e K39 oi ealizado segundo o mé odo desc i o pelo ep esen an e (Inbios In e na ional, USA). Após a adição, no local com as se as indicado as, de 20 µl do so o a es a , colocou-se a i a na posição e ical, no in e io de um poço de mic oplacas undo em U, com as se as di igidas pa a baixo. A lei u a do es e ez-se nos 10 minu os subsequen es à adição de 100-150 µl do ampão do “ki ”. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 86 Tes e p o ó ipo “La e al- low es o he diagnosis o dog isce al leishmanio- sis” O es e oi ealizado segundo o mé odo desc i o pelo ep esen an e (Bo die A ini y P oduc s SA, Suiça). T in a segundos após a adição de 5 µl do so o a es a , na janela da plaque a coloca am-se duas go as do ampão de eluição. Uma no a go a oi adicionada qua o minu os mais a de. A lei u a do es e ez-se 10 minu os após. 2.1.8.4. Técnica de ELISA A écnica de “enzyme-linked immunoso ben assay” (ELISA) oi ealizada de aco do com as ins uções o necidas (Bo die A ini y P oduc s SA). An es de se aplica em os so os a es a , p ocedeu-se à la agem, du an e 15 minu os à empe a u a ambien e, dos 96 poços de undo plano da placa p e iamen e sensibilizada com an igénio solú el de L. in an um. O ampão de la agem TBS-Tween oi p e iamen e diluído 1:10. Após emoção do ampão o am adicionados 100 µl das amos as- pad ão (con olo nega i o, con olo com aca posi i idade e con olo o emen e posi i o o necidos pelo ab ican e) e das amos as a es a diluídas 1:200 em TBS- Tween. Todas as amos as o am es adas em duplicado e incubadas du an e 30 minu os a +37ºC. Depois de 4 la agens, o am adicionados 100 µl/poço de p o eína alcalina A, diluída a 1:50 em TBS-Tween ma cada com os a ase. Após incubação du an e 30 minu os a +37ºC, p ocedeu-se a 4 la agens e à adição e incubação du an e 30 minu os do subs a o. A eacção oi en ão bloqueada com a adição de 100 µl de solução de bloqueio (K 3 PO 4 ) e a abso ância lida a 405 nm em espec o o óme o de mic oplacas. Conside ou-se como limia de signi icância a abso ância do con olo com aca posi i idade. 2.1.8.5. Tes e de Aglu inação Di ec a Ao an igénio lio ilizado (5x10 7 pa asi as/ml) (KIT Biomedical Resea ch, Holanda) adicionou-se 5 ml da solução de diluição: so o isiológico a 0.9% con endo 0.1M β-me cap o-e hanol (Sigma). Fo am colocados 100 µl/poço da solução de diluição na p imei a coluna de mic oplacas de 96 poços, undo em V (Del aLab, Espanha), e 50 µl/poço nas colunas seguin es. Após adicção de 1 µl do so o a es a no p imei o poço de cada linha (diluição 1:100) ealiza am-se diluições se iadas de 1:2 a é à 11ª coluna. Os poços da Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 87 12ª coluna o am u ilizados como con olo nega i o. Em cada poço colocou-se 50 µl do an igénio econs i uído. Incubou-se à empe a u a ambien e du an e 18 ho as. No inal da incubação ez-se a lei u a, a olho nú, sob e um undo b anco. Conside a am-se posi i os os so os com eacção de aglu inação na diluição igual ou supe io a 1:400. 2.1.9. Es udos da Imunidade Celula 2.1.9.1. P oli e ação Lin oci á ia Isolamen o de leucóci os mononucleados P ocedeu-se à sepa ação das células leucoci á ias mononucleadas a a és de um g adien e de densidade u ilizando um meio de sepa ação celula (Ficoll; GibcoBRL), o qual possui uma densidade in e io à dos e i óci os e g anulóci os e supe io à das células leucoci á ias mononucleadas. Nos D0 e D180, 10 ml de sangue pe i é ico o am diluídos a 1:2 em PBS e p ocessados pa a isolamen o de células mononucleadas leucoci á ias po g adien e de densidade. O sangue oi colocado sob e o meio de sepa ação de Ficoll, numa p opo ção de 15 ml sangue diluído pa a 10 ml de Ficoll, e cen i ugado a 520 g du an e 25 minu os à empe a u a ambien e. Após cen i ugação, os e i óci os e células polimo onuclea es ica am e idos no sedimen o, enquan o que na in e ace en e o Ficoll e o so o icou um anel cons i uído po uma população de células mononucleadas ica em lin óci os. Es e anel oi ecolhido e subme ido a 3 la agens com solução de HBBS, a 290 g du an e 10 minu os à empe a u a ambien e. Po im, o sedimen o oi essuspendido em meio RPMI/FCS 10 % e o núme o e iabilidade celula o am de e minados po colo ação com azul de T ipan (Sigma), que con e e co azul às células não iá eis. A con agem das células iá eis ealizou-se em hemaci óme o de Neubaue ao mic oscópio óp ico, endo sido ajus ada pa a 2x10 6 células mononucleadas/ml. Cul u a in i o de lin óci os Fo am ealizadas cul u as in i o das células mononucleadas ob idas do sangue. As cul u as celula es o am incubadas sem es imulação, com es imulação do mi ogénio concana alina A (conA, Sigma) ou com es imulação pelo an igénio (Ag) pa asi á io especí ico. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 88 Em placas de 96 poços de undo em U (Del aLab, Espanha), o am colocados 150 µl das suspensões celula es po poço. Nos poços des inados às células es imuladas o am adicionados, po poço, 10 µg/ml de an igénio o al de Leishmania, p epa ado como desc i o em 2.1.2.1.) ou 5 µg/ml de uma solução de conA. Nos poços de células não es imuladas adiciona am-se 50 µl de meio RPMI/FCS 10 %, pe azendo assim um o al de 200 µl em cada poço da placa. As células o am incubadas du an e 72 ho as a +37 ºC, 5 % CO 2 em a mos e a húmida (Jouan/Lab Mechanics, USA). Cada amos a oi p ocessada em iplicado pa a o es udo da p oli e ação lin oci á ia, pa a a análise da p odução de ci ocinas po ELISA (2.1.9.2.) e exp essão de ci ocinas pela écnica de RT-PCR ( ansc ição e e sa da eacção em cadeia da polime ase) (2.1.9.3.). Técnica de P oli e ação Lin oci á ia Nes e mé odo as células mononucleadas são colocadas em cul u a na p esença de agen es es imulado es seleccionados, como mi ogénios e an igénios. Nes e es udo, a écnica de p oli e ação lin oci á ia u ilizada oi adap ada de Maluish & S ong (1986). Ao im das 72 ho as de incubação adiciona am-se 25 µl de [ 3 H] imidina (Ame sham Li e Sciences, UK) em cada poço, numa concen ação inal de 12.5 µCi/ml. Após 14 a 16 ho as de incubação nas mesmas condições as células o am ans e idas pa a discos de papel de il o (Ska on, No uega), com o auxílio de um colec o de células (PHD TM Cell Ha es e , Camb idge, Technology Inc., USA). Os discos o am depois ecolhidos pa a ubos de cin ilação (Packa d, Holanda), aos quais o am adicionados 2.5 ml de líquido de cin ilação (Packa d). De seguida os ubos o am colocados o denadamen e num apa elho con ado de cin ilações (Beckman Ls 6500, Packa d), o qual e ec ua a medição da adioac i idade emi ida pelas células em di isão. Os esul ados são exp essos em núme o de cin ilações po minu o (cpm), sendo o Índice de Es imulação (IE) de e minado pela azão en e o alo médio de cpm dos iplicados das células es imuladas (conA ou Ag) e o alo médio das células não es imuladas. No p esen e es udo, endo em con a os esul ados do IE ob idos an es da inoculação em espos a ao an igénio (IE máximo de 1,49) conside ou-se posi i o um esul ado de IE ≥ 2. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 89 2.1.9.2. P odução in i o de ci ocinas Foi analisada a p odução das ci ocinas in e e ão gama (IFN-γ), in e leucina 10 (IL-10) e ac o ans o mado de c escimen o be a (TGF-β) pelos lin óci os do sangue (na ausência e na p esença de es imulação com conA e com an igénio do pa asi a) assim como nos mac ó agos in ec ados in i o. A análise das ci ocinas oi e ec uada nos sob enadan es das cul u as celula es, ob idos con o me desc i o em 2.2.9.1. O mé odo u ilizado pa a a quan i icação das ci ocinas libe adas pelas células em cul u a oi a ELISA em “sandwich”. A combinação de dois an ico pos an i- ci ocina em es udo – um de cap u a e um de de ecção - con e e ele ada sensibilidade e especi icidade à écnica, possibili ando a de ecção de quan idades eduzidas da p o eína, na o dem dos picog amas (Huang, 2004). Quan i icação de ci ocinas po ELISA O ensaio de ELISA em “sandwich” oi ealizado em placas de 96 poços de undo plano (Maxiso p; Nunc, USA), as quais o am sensibilizadas com o an ico po de cap u a (RD Sys ems, USA), diluído em PBS. Após incubação du an e 16 ho as à empe a u a ambien e, p ocedeu-se a la agem com ampão [(PBS/Tween 20 0.05 % ( / ) (Sigma)] e bloqueio a a és da adição e incubação du an e 1 ho a à empe a u a ambien e de 200 µl/poço de ampão de bloqueio [PBS/BSA 0.05 % (p/ )]. Após no a la agem, o am adicionados nos espec i os poços 100 µl das amos as-pad ão (as quais possuem concen ações conhecidas da ci ocina ecombinan e, diluídas a 1:2) e das amos as de concen ação desconhecida. Todas as amos as o am es adas em duplicado, endo sido incubadas du an e 2 ho as à empe a u a ambien e. Depois de 4 la agens, o am adicionados 100 µl/poço do an ico po de de ecção, ma cado com bio ina, especí ico pa a cada ci ocina (RD Sys ems). Após no a incubação de 2 ho as à empe a u a ambien e, p ocedeu-se a 4 la agens e à adição e incubação du an e 20 minu os da enzima pe oxidase ma cada com es ep oa idina (RD Sys em) diluída a 1:200 em ampão [(PBS/BSA 0.05 %, Tween 20 0.05 %) (100 µl/poço)]. Depois de 4 no as la agens, o am adicionados 80 µl/poço do subs a o e ame ilbenzidina (TMB; Sigma) e incubou-se no escu o du an e um pe íodo máximo de 30 minu os. A eacção oi en ão bloqueada com a Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 90 adição de 40 µl de ácido sul ú ico a 0.25 M e a abso ância lida a 450 nm em espec o o óme o de mic oplacas (Ti e ek Mul iskan Plus MK II). Os alo es de abso ância ob idos com os pad ões da ci ocina ecombinan e o am u ilizados pa a a cons ução de uma cu a de calib ação pa a cada ci ocina, a pa i da qual se de e mina am as concen ações das amos as em es udo. No quad o 2.1 encon am-se esumidas as concen ações dos an ico pos de cap u a e de de ecção u ilizadas pa a cada ci ocina e os limi es supe io e in e io de concen ação de ci ocina ecombinan e das amos as-pad ão. Quad o 2.1. Ci ocinas es udadas po ELISA "sandwich". Ci ocina An ico po de cap u a (µg/ml) Ci ocina ecombinan e (pg /ml) An ico po de de ecção (ng/ml) IFN-γ2 4000 a 7.8 200 IL-10 2 8000 a 15.6 100 TGF-β1 2000 a 3.9 300 2.1.9.3. Es udo da exp essão de ci ocinas a a és do RNA mensagei o, po RT- PCR O mé odo de RT-PCR é um mé odo semiquan i a i o, que pe mi e de ec a pequenas quan idades de ci ocinas exp essas pelas di e en es populações celula es du an e a espos a imuni á ia a uma de e minada in eccção (Mu phy e al., 1993). O ácido ibonucleico mensagei o (mRNA) ex aído das células é e e samen e ansc i o pa a ácido desoxi ibonucleico complemen a (cDNA) e pos e io men e ampli icado pela écnica de PCR. 2.1.9.3.1. Ex acção de RNA Pa a a ex acção de RNA das amos as de baço, ígado, pele, gânglio, medula óssea, sangue e dos leucóci os mononucleadas o am u ilizados dois mé odos ápidos come ciais (“High Pu e RNA isola ion ki ” pa a as amos as de gânglio, medula, sangue e células mononucleadas, e “High Pu e RNA issue ki ” pa a as amos as de baço, ígado e pele, Roche Diagnos ics GmbH), de aco do com as ins uções do ab ican e. Es e mé odo possibili a a ealização de uma ex acção ápida de um núme o ele ado de amos as, eliminando a necessidade da u ilização de sol en es o gânicos. Todo o ma e ial u ilizado pa a a amen o das amos as, bem como as bancadas, o am subme idos a um a amen o p é io com “RNase OUT” (Gibco). Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 91 Após a ex acção, a concen ação de RNA das amos as oi de e minada po espec o o ome ia (Gene Quan II). As amos as o am conse adas a –80 ºC a é pos e io . Amos as de medula óssea e de sangue o al As amos as de medula óssea (2.2.5.2) e sangue o al (2.2.5.1.) conse adas a - 80ºC no “RNA/DNA s abiliza ion eagen o blood/bone ma ow” o am descongeladas no io. Um ml do lisado celula oi ans e ido pa a as colunas de ex acção (incluídas no es e ápido) e cons i uídas po um disco de ib a de id o, onde ica selec i amen e e ido o RNA após cen i ugação du an e 30 segundos a 13000 g à empe a u a ambien e. Após ejeição do sob enadan e, seguiu-se um a amen o com 100 µl desoxi ibonuclease (DNase) pa a a emoção comple a de DNA con aminan e du an e 15 minu os à empe a u a ambien e. Segui am-se uma la agem com 500 µl de ampão de ampão de la agem I (5 M guanidina-HCl, 20 mM T is-HCl, pH 6.6) e duas com o ampão de la agem II (20 mM NaCl, 2 mM T is- HCl, pH 7.5), a 8000 g du an e 15 segundos. Após as la agens, ez-se uma cen i ugação a 13000 g ( elocidade máxima) du an e 2 minu os, pa a a emoção de possí eis es ígios de ampão de la agem. Po im, o RNA oi eluído das ib as de id o po adição de 100 µl de ampão de eluição (H 2 O ul apu a sem nucleases) e cen i ugado a 8000 g du an e 1 minu o. Também se p ocedeu à ex acção de RNA a pa i dos leucóci os (5 x 10 5 ) ob idos como desc i o em 2.1.9.1. As células o am esuspendidas em 200 µl de PBS aos quais se adiciona am 400µl de ampão de lise. A ex acção de RNA oi p ocessada com desc i o em 2.1.9.3.1 Amos as de baço, de ígado e de pele Aos agmen os de baço, de ígado e de pele (25 mg) colocados em aliquo as adicionou-se 400 µl de ampão de lise (4.5 M guanidina-HCl, 100 mM NaPO 4 , pH 6.6). O lisado celula oi en ão ans e ido pa a as colunas de ex acção e p ocedeu-se à ex acção de RNA como desc i o em 2.1.9.3.1. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 92 Amos as de gânglio O RNA oi ex aído a pa i de 200 µl de aspi ado gangliona aos quais se adiciona am 400µl de ampão de lise. A ex acção de RNA oi p ocessada com desc i o em 2.1.9.3.1 2.1.9.3.2. T ansc ição Re e sa do RNA O RNA oi ans o mado po ansc ição e e sa em cDNA, usando 16.5 µl de RNA da amos a na p esença de 200 U da enzima ansc ip ase e e sa (M-MLVRT - “Moloney Mu ine Leukemia Vi us Re e se T ansc ip ase”; P omega, EUA) em ampão da eacção, a 37ºC du an e 60 minu os. Tampão da eacção: 0.5 mM dNTPs (P omega), 10X Oligo (dT)15 (P omega), 10 mM albumina sé ica bo ina (BSA) (Roche Diagnos ics GmbH) e 40 U RNAsin (P omega) em ampão 3 mM “MMVL- RT Bu e ” 5X (250 mM T is-HCl pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2; P omega). As amos as o am aquecidas a +95ºC, du an e 5 minu os, pa a a inac i ação da enzima ansc ip ase e e sa e a e ecidas pa a +4ºC. As eacções o am p ocessadas num e mociclado Px2 The mal Cycle (The mo Elec on Co po a ion, USA). Em cada sé ie de eacções, uma amos a de RNA sem adição da enzima ansc ip ase e e sa oi u ilizada como con olo nega i o. 2.1.9.3.3. Ampli icação do cDNA po PCR Pa a ampli icação do cDNA u iliza am-se as sequências iniciado as pa a os genes da hipoxan ina-guanina os o ibozil ans e ase (HPRT), IFN-γ, in e leucina 4 (IL-4), IL-10, ac o de nec ose umo al al a (TNF-α), TGF-β e sin e ase induzida do óxido ní ico (iNOS) (G öne e al., 1998; 1999; Wang e al., 1998; Johnson e al., 2004) (Quad o 2.2) e as condições de aplicação de cada gene encon am-se desc i as no quad o 2.3. P epa ou-se pa a cada amos a de cDNA a ampli ica , 25 µl de uma solução em H 2 O ul apu a com 1X ampão de enzima (com 1.5µM de MgCl2), 0.25 µM de cada dNTP e 0.4 µM de sequências iniciado as pa a os genes em es udo, 1 U de Taq DNA polime ase (P omega) e 2.5 µl de cDNA. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 93 Quad o 2.2. Sequências inciado as e amanho dos p odu os de ampli icação pa a os genes de HPRT, iNOS, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 and IL-10. Gene Tamanho do p odu o (pb) "Fo wa d" a) "Re e se" b) HPRT 329 5’- TCAAGGGAGGCTATAAATTC -3’ 5’- GTCAGGTTTATAGCCAAC -3’ iNOS 661 5’- AGAAACAACAGGAACCTACCA -3’ 5’- CTCCAGGATGTTGTAGCGC -3’ IFN-γ274 5’- CCAGATGTATCGGACGGTGG -3’ 5’- TTATCGCCTTGCGCTGGACC -3’ TNF-α 274 5′- CCAAGTGACAAGCCAGTAGC -3′5’- TCTTGATGGCAGAGAGTAGG -3’ TGF-β393 5’- TTCCTGCTCCTCATGGCCAC -3’ 5’- GCAGGAGCGCACGATCATGT -3’ IL-4 399 5’- ATGGGTCTCACCTCCCAACTG -3’ 5’- TCAATGCCTGTAGTATTTCTTC - IL-10 516 5’- TACCTGGGTTGCCAAGCCCT -3’ 5’- TTCACAGAGAAGCTCAGTAAAT -3’ b) " e e se": sequência a mon an e da egião a es uda a) " o wa d": sequência a jusan e da egião a es uda pb: pa es de bases Quad o 2.3. Condições de ampli icação pa a os genes HPRT, iNOS, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 and IL-10. Gene Desna u ação inicial Desna u ação Ligação Alongação Núme o de ciclos Alongação inal HPRT 95ºC, 3 min 94ºC, 45 seg 58ºC, 45 ses 72ºC, 105 seg 38 72ºC, 8 min iNOS 94ºC, 3 min 94ºC, 40 seg 61ºC, 60 seg 72ºC, 120 seg 35 72ºC,10 min IFN-γ; TNF-α; TGF-β94ºC, 1 min 94ºC, 60 seg 57ºC, 135 seg 72ºC, 1.30 min 40 72ºC, 6 min IL-4 ; IL-10 94ºC, 1 min 94ºC, 30 seg 67ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 5 94ºC, 30 seg 65ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 5 94ºC, 30 seg 60ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 5 94ºC, 30 seg 55ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 5 94ºC, 30 seg 50ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 10 94ºC, 30 seg 45ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 10 72ºC, 5 min Como con olo posi i o da execução écnica usou-se um gene que é exp esso cons i u i amen e, a um ní el cons an e e em odos os ecidos de um o ganismo, o gene da HPRT, uma das enzimas en ol idas na cadeia de sín ese de nucleó idos. Como con olo de amos as posi i as, o am u ilizadas células mononucleadas de sangue pe i é ico de cães saudá eis ob idas como desc i o em 2.1.9.1. e es imuladas con conA de modo a induzi a exp essão das ci ocinas em es udo e da iNOS; 4 ho as após incubação com conA, ecolhe am-se as células e p ocedeu-se à ex acção de RNA, ansc ição e e sa em cDNA e ampli icação pela PCR. Os p odu os de ampli icação o am isualizados num gel de aga ose a 1.5 % em 1X ampão is-ace a o-EDTA (TAE) (Sigma) co ado com 0.5 µg/ml de b ome o de e ídio. Foi aplicado no gel um ma cado molecula de 100 pb de DNA (Bio-Rad, Po ugal). Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 100 e os di e en es exames pa asi ológicos ao longo da in ecção e pa a compa a a exp essão de ci ocinas pelos di e en es ó gãos no im do pe íodo de obse ação. Quando a hipó ese nula oi ejei ada, múl iplas compa ações de F iedman o am ealizadas pa a de e mina qual a écnica se ológica que oi es a ís icamen e di e en e, u ilizando um ní el de signi icância de 5% (Sheskin, 2000). O es e de “Wilcoxon” oi ambém ealizado pa a compa a a p oli e ação lin oci á ia assim como a p odução de ci ocinas pelas células mononucleadas leucoci á ias do sangue, na ausência e na p esença de es imulação com mi ogénio e com an igénio do pa asi a assim como nos mac ó agos in ec ados in i o ou não in ec ados. O es e de Spea man oi u ilizado pa a de e mina o coe icien e de co elação en e a ca ga pa asi á ia dos di e en es ecidos. 2.2. Resul ados Os esul ados des a expe iência o am ap esen ados no wo kshop “T aining cou se on GIS and en i onmen al con ol” incluido no p ojec o Eu opeu “Moni o ing isk ac o s o sp eading o leishmaniasis a ound he Medi e anean basin” (Tunes, Se emb o 2007) e no colóquio ealizado pela Facul y o Science, da Cha les Uni e si y (P aga, Ab il 2008). 2.2.1. Obse ação Clínica 2.2.1.1. Exame Físico/Clínico Todos os animais se man i e am i os du an e o pe íodo de obse ação. Obse ou-se, du an e o exame mensal, e ao longo dos seis meses após a inoculação de Leishmania, o aumen o do olume dos gânglios poplí eos e p é- escapula es num animal, de modo cons an e e em se e de manei a ansi ó ia. Pa a além da lin oadenomegalia, a única mani es ação clínica obse ada oi alopécia ansi ó ia, localizada na egião do sal do co po, em dois dos cães. Qua o dos cães man i e am-se sem nenhum sinal clínico du an e odo o pe íodo de obse ação. A única al e ação ana omo-pa ológica mac oscópica egis ada na nec ópsia oi o aumen o do olume no baço em odos os animais. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 101 2.2.1.2. Exame O almológico No exame o almológico ealizado dois dias an es do im do pe íodo de obse ação, seis cães ap esen a am uma p essão in aocula (13 e 14 mmHg) in e io à de e e ência e em no e a p odução lac imal encon a a-se diminuida (10-17 mm/min) (Quad o 2.4). Quad o 2.4. Exame o almológico ealizado nos 12 cães no D178. OD OE OD OE 1 12 10 13 17 2 25 21 16 17 3 17 15 17 17 4 23 21 15 17 5 15 15 14 17 6 15 15 14 16 7 15 17 14 14 8 17 17 14 15 9 17 15 17 15 10 22 20 14 24 11 17 20 19 19 12 17 20 15 18 Cão Schi me PIO Análise His opa ológica C. Lin oplasmoci á ia C. Lin oplasmoci á ia ( PCR conjun i a + ) C. Folicula C. Lin oplasmoci á ia s.a. s.a. OD: Olho di ei o; OE: Olho esque do; PIO: P essão in aocula ; C. Conjun i i e PCR: Reacção em cadeia da polime ase s.a. Sem al e ações C. Folicula C. Folicula C. Lin oplasmoci á ia s.a. C. Folicula C. Folicula O exame das es u u as ocula es de ec ou dois cães com conjun i i e e um com epí o a ligei a. Um qua o animal ap esen a a quemose palpeb al in e io bila e al assim como hipe émia conjun i al em ambos os olhos (Figu a 2.1). Figu a 2.1. Quemose palpeb al e hipe émia conjun i al in e io obse ada num cão no inal do pe íodo de obse ação. C. Maia Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 102 2.2.1.3. Pa âme os Hema ológicos e P o einog ama Nos dias D90 e D180 a média dos alo es dos leucóci os, e i óci os e plaque as so e am uma diminuição signi ica i a (p<0.001) em elação aos alo es de e e ência (D0) (Figu a 2.2). No e dos cães e ela am leucopenia e oi o omboci openia. Cinco dos animais ap esen a am anemia com diminuição do hema óc i o e da concen ação de hemoglobina em elação aos alo es de e e ência (p<0.001). Figu a 2.2. Média dos alo es de plaque as (a.), leucóci os (b.) e e i óci os (c.) dos 12 cães ao longo do pe íodo expe imen al. 0,00E+00 5,00E+04 1,00E+05 1,50E+05 2,00E+05 2,50E+05 3,00E+05 3,50E+05 4,00E+05 4,50E+05 D0 D90 D180 Plaque as (103/µl) 0,00E+00 2,00E+03 4,00E+03 6,00E+03 8,00E+03 1,00E+04 1,20E+04 1,40E+04 1,60E+04 1,80E+04 D0 D90 D180 Leucóci os (103/µl) a. b. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 103 0,00E+00 1,00E+06 2,00E+06 3,00E+06 4,00E+06 5,00E+06 6,00E+06 7,00E+06 8,00E+06 D0 D90 D180 E i óci os (10 6/ µl) Apesa de ês meses após in ecção apenas um dos animais ap esen a in e são no ácio albumina/globulina, es a al e ação na concen ação sé ica das p o eínas oi de ec ada em odos os cães no D180 (p<0.001) (Figu a 2.3). A in e são no ácio de eu-se ao aumen o da acção das γ globulinas. Figu a 2.3. E olução do ácio albumina/globulina nos 12 animais ao longo do pe íodo expe imen al. 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 D0 D90 D180 Rácio Albumina/Globulina c. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 104 2.2.2. Es udos Pa asi ológicos 2.2.2.1. Exame Di ec o Na nec ópsia (D180) pela obse ação mic oscópica dos decalques do baço, ou ígado ou gânglio lin á ico, de ec ou-se a p esença das o mas amas igo as de Leishmania em oi o cães. O pa asi a oi obse ado em cinco (41.6%) animais nas p epa ações de ecido esplénico, em qua o (33,3%) de ecido hepá ico e em ês (25,0%) de aspi ado gangliona . A de ecção dos amas igo as nos decalques dos ês ó gãos não ap esen a am di e enças signi ica i as (p=0.903). Os esul ados do exame di ec o das amos as ob idas de cada animal do D180 encon am-se desc i os no quad o 2.5. 2.2.2.2. Exame Cul u al O exame cul u al do sangue pe i é ico e do aspi ado de medula óssea e ec uado nos D0 e D90 oi nega i o. No D180, nas cul u as em meio NNN obse a am-se o mas p omas igo as de Leishmania em dez dos cães (Quad o 2.5). Os pa asi as o am isolados em oi o (72,72%) das amos as de ecido esplénico, em cinco (41,6%) de ecido hepá ico, em ês (25,0%) de aspi ado gangliona , em duas (16,6%) de aspi ado medula e em uma (8,33%) de pele lesionada. Não se isola am pa asi as no sangue pe i é ico nem da pele sã. O núme o de cul u as posi i as a pa i do ecido esplénico oi supe io ao núme o de cul u as de medula, de pele e do gânglio (Q( 5 ) = 18,099, p<0.001 em elação ao sangue, medula e pele; p<0.05 em elação ao gânglio). Nos ês animais em que se isolou o pa asi a po cul u a do aspi ado gangliona , ambém se iden i ica am as o mas amas igo as po obse ação mic oscópia dos espec i os decalques. Dois dos animais ap esen a am lin oadenomegalia. Du an e odo o es udo apenas uma cul u a oi con aminada po bac é ias. A amos a, de mace ado esplénico, pe encia a um cão conside ado in ec ado pois a obse ação mic oscópica do decalque pe mi iu a de ecção de o mas amas igo as. Num dos cães, a a és do exame cul u al e/ou di ec o no D180, não o am obse adas o mas pa asi á ias nos di e en es ecidos e ó gãos. As cul u as de medula e sangue pe i é ico des e animal ambém o am nega i as nos D0 e D90. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 105 Quad o 2.5. Resul ados do exame cul u al e do exame di ec o aplicados em di e en es ecidos e ó gãos no D180. Sangue Fígado Medula Baço Pele Gânglio Fígado Baço Gânglio 1 Neg Neg Neg Con Neg Neg Neg Pos Neg 2 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg 3 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg 4 Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos Pos Neg 5 Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos Neg Neg 6 Neg Pos Pos Neg Neg Neg Pos Pos Neg 7 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg 8 Neg Pos Pos Neg Neg Pos Neg Pos Pos 9 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg 10 Neg Pos Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos 11 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Pos Neg Neg 12 Neg Neg Neg Pos Pos Pos Neg Pos Pos Con . Amos a con aminada Cul u as Decalques Cão Pos. Amos a onde se de ec ou pa asi as Neg. Amos a onde não se de ec ou pa asi as 2.2.3. Es udos de Imunidade 2.2.3.1. Imunidade Humo al As écnicas u ilizadas pa a a de e minação de an ico pos an i-Leishmania o am: IFI, CIE, DAT, ELISA e es es imunoc oma og á icos ápidos: K39 e “La e al- low es o he diagnosis o dog isce al leishmaniosis” (Figu a 2.4). Figu a 2.4. De ecção de an ico pos an i-Leishmania po DAT, K39, CIE, IFI, es e imunoc oma og á ico p o ó ipo e ELISA, ao longo do pe íodo expe imen al. 0 2 4 6 8 10 12 14 D0 D30 D60 D90 D120 D150 D180 Núme o de animais Dias de obse ação DAT K39 CIE IFI Tes e Imunoc oma og á ico ELISA Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 106 Todos os animais p oduzi am an ico pos an i-Leishmania du an e o pe íodo de obse ação após a inoculação (Quad o 2.6). No D0, a CIE oi posi i a nos so os de ês animais; um deles ambém o oi po ELISA, não só nes e dia mas ao longo de odo o pe íodo de expe imen ação. No D30 os so os de cinco cães ap esen a am í ulos signi ica i os na écnica de ELISA e um na DAT. O es e K39 e a CIE de ec a am animais com an ico pos especí icos a pa i do D60 enquan o que o es e imunoc oma og á ico e a IFI a pa i do D90. Todos os cães ap esen a am an ico pos especí icos, pelo menos a a és de uma écnica, a pa i do e cei o mês após in ecção. No D120 a écnica de ELISA oi a única posi i a em odos os animais ap esen ando di e enças signi ica i as em elação à DAT, CIE e IFI (p<0.05); o K39 e o es e imunoc oma og á ico ambém ap esen a am di e enças em elação à écnica de imuno luo escência (p<0.05). Todas as écnicas ap esen a am esul ados posi i os a pa i do D150. O p imei o animal a ap esen a um alo ele ado de an ico pos luo escen es (1/2048) oi o cão que ap esen ou adenopa ia poplí ea pe sis en e desde o p imei o mês após in ecção. O pico de an ico pos de ec ado pela écnica de IFI oi no 5º mês pa a ês dos cães (1/256 em dois animais e 1/2048 em um) enquan o que em oi o animais só oco eu no mês seguin e. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 107 Quad o 2.6. Resul ados das di e en es écnicas se ológicas nos 12 animais en e os dias D0 e D180. D R C I P E D R C I P E D R C I P E D R C I P E D R C I P E D R C I P E D R C I P E 1 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 2 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 3 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 4 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 5 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 6 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 7 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 8 Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 9 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 10 Neg Neg Pos Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 11 Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 12 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos D180 Cão D0 D30 D60 Neg. Amos a onde não se de ec ou alo es signi ica i os de an ico pos an i-Leishmania Pos. Amos a onde se de ec ou alo es signi ica i os de an ico pos an i-Leishmania D90 D120 D150 I: Imuno luo escência indi ec a P : P o ó ipo de es e imunoc oma og á ico E: ELISA D: Tes e de aglu inação di ec a R: Tes e ápido K39 C: Con aimunoelec o o ese Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 108 2.2.3.2. Imunidade Celula 2.2.3.2.1. P oli e ação Lin oci á ia A espos a celula dos cães à in ecção po Leishmania oi a aliada a a és da capacidade dos lin óci os do sangue pe i é ico p oli e a em em p esença do an igénio pa asi á io. A espos a p oli e a i a das células ao mi ogénio (conA) oi posi i a. Ve i icou-se que no D180 as células de no e cães esponde am à es imulação com o an igénio de Leishmania (IE 2-3.8) (Figu a 2.5). Figu a 2.5. Respos a p oli e a i a ao an igénio pa asi á io dos lin óci os ex aídos do sangue pe i é ico dos cães, nos D0 e D180. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Índice de Es imulação (IE) Animais D0 D180 No D0 não oi possí el ob e células do cão nº3 pa a a ealização des a écnica. 2.2.3.2.2. Quan i icação de ci ocinas p oduzidas po lin óci os e mac ó agos No D180 a p odução das ci ocinas IFN-γ, IL-10 e TGF-β pelos lin óci os do sangue pe i é ico (es imulados com mi ogénio, an igénio ou sem es imulação) encon a a-se diminuída em elação aos alo es de e e ência (D0) (p<0.05) (Figu a 2.6). A única excepção o am as células es imuladas com conA do D180, que p oduzi am mais IL-10 do que no D0 (p=0.012). Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 109 Figu a 2.6. P odução média das ci ocinas IFN-γ, IL-10 e TGF-β pelos lin óci os do sangue pe i é ico dos 12 cães, na ausência de es ímulo, após es imulação com mi ogénio (conA) ou com an igénio de Leishmania (Ag), nos D0 e D180. 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 D0 D180 D0 D180 D0 D180 IFN-γ IL-10 TGF-β pg/ml Células s/es imulação ConA Ag Nos mac ó agos dos dias Do e D180 in ec ados in i o po L. in an um, não hou e p odução de IFN-γ. A IL-10 só oi de ec ada an es da inoculação dos cães enquan o que a TGF-β e e a sua p odução máxima nos mac ó agos do D180 (p<0.05). 2.2.3.2.3. Exp essão de ci ocinas nos di e en es ecidos in ec ados No im do pe íodo expe imen al a exp essão de IL-4 não oi de ec ada em nenhum dos ecidos enquan o IL-10 e TGF-β o am as ci ocinas com maio exp essão, a p imei a nos aspi ados de medula óssea e de gânglio e a segunda na medula e sangue pe i é ico (Figu a 2.7). O TNF-α oi de ec ado nos aspi ados de medula e de gânglio e no sangue pe i é ico enquan o que o IFN-γ oi no ígado, baço e medula. A iNOS oi exp essa em no e dos doze aspi ados medula es e exp essa em meno pe cen agem pelos esplenóci os, hepa óci os e células gangliona es. Não oi de ec ada exp essão de ci ocinas em nenhuma das doze amos as de pele. A não de ecção de IL-4 em nenhum dos ó gãos assim com a ausência de exp essão na pele não se de eu a p oblemas écnicos pois a amos a u ilizada como con olo de exp essão de IL-4 assim como o gene cons i u i o HRPT, o am posi i os nas eacções de PCR. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 116 Quad o 2.9. Resul ados dos exames pa asi ológicos, molecula es e da p oli e ação lin oci á ia ob idos nos doze cães no D180. PL -Ag Sangue Fígado Medula Baço Pele Gânglio Fígado Baço Gânglio Sangue Fígado Medula Baço Pele Gânglio "B. coa " Conjun i a Sangue Fígado Medula Baço Pele Gânglio "B. coa " Conjun i a I.E. 1 Neg Neg Neg Con Neg Neg Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 2,0 2 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 2,2 3 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 2,9 4 Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos Pos Neg Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 2,5 5 Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 3,8 6 Neg Pos Pos Neg Neg Neg Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 1,7 7 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 2,2 8 Neg Pos Pos Neg Neg Pos Neg Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 3,3 9 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 2,2 10 Neg Pos Neg Pos Neg Pos Neg Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg 2,3 11 Neg Neg Neg Pos Neg Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 1,1 12 Neg Neg Neg Pos Pos Pos Neg Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg 1,6 Neg: Amos a onde não se de ec ou alo es signi ica i os de an ico pos an i-Leishmania ou onde não se de ec ou/isolou/quan i icou pa asi as Pos: Amos a onde se de ec ou alo es signi ica i os de an ico pos an i-Leishmania ou onde não se de ec ou/isolou/quan i icou pa asi as Con : Amos a con aminada PCR: Reacção em cadeia da polime ase qRT-PCR: Reacção em cadeia da polime ase em empo eal "B. coa ": Bu y coa PL-Ag: P oli e ação lin oci á ia com es imulação das células mononuclea es com an igénio de Leishmania Cão PCR qRT-PCRCul u as Decalques Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 117 2.2.5. Análise His opa ológica O exame his opa ológico não de ec ou al e ações signi ica i as nos olhos dos animais em es udo. Todos os olhos ap esen a am conges ão disc e a a mode ada dos asos co oidais, p o a elmen e deco en e do p ocesso de eu anásia. A e cei a pálpeb a oi a es u u a ocula anexa mais a ec ada. No e dos doze cães ap esen a am in il ação de células in lama ó ias, lin óci os e plasmóci os, com localização subepi elial na ace bulba . Em cinco des es animais, de ido à g a idade das lesões, hou e o mação de olículos lin óides (conjun i i e olicula ). A p incipal al e ação obse ada nas pálpeb as oi a in il ação pe i olicula po células mononucleadas com in asão e des uição ocasional das glândulas sebáceas (adeni e sebácea). A a o ia disc e a das glândulas de Meibom oi obse ada em apenas um cão. A dispe são dos ácinos des as glândulas oi egis ada em dois ou os animais. Somen e em ês animais se de ec a am al e ações cu âneas com p esença de in il ação pe i olicula disc e a po celulas mononucleadas a ec ando, ocasionalmen e, as glândulas sebáceas (adeni e sebácea). A análise his opa ológica do ígado pe mi iu conclui que os doze cães ap esen a am hepa i e in e s icial g anuloma osa di usa, ca ac e izada po uma acen uada in il ação pe ipo al ica em plasmóci os ( equen es células de Mo ), mac ó agos e lin óci os, po ezes acompanhada de dis ensão mode ada dos asos lin á icos, e po um ele ado núme o de pequenos g anulomas in alobula es icos em células mac o ágicas e lin oblas os (Figu a 2.8). A acuolização mode ada e gene alizada dos hepa óci os oi de ec ada em cinco animais. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 118 Figu a 2.8. In il ação pe ipo al de células in lama ó ias e pequenos g anulomas no ígado (H&E, 40x). Onze dos animais ap esen a am espleni e g anuloma osa di usa (Figu a 2.9). Os g anulomas, maio es que os do ígado, p eenchiam signi ica i amen e a polpa e melha. A única al e ação p esen e no baço do animal sem g anulomas, oi a hemo agia di usa da polpa e melha. T ês ou os animais ambém ap esen a am es a al e ação. Na maio ia dos animais obse ou-se ainda a p esença de pigmen o hemá ico e de megaca ioblas os, indicando hema opoiese ex amedula . Figu a 2.9. G anulomas dispe sos pela polpa e melha do baço (a. H&E, 40x; b. H&E, 100x). a . Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 119 Em seis animais obse ou-se hipe plasia lin óide mode ada da co ical e a p esença de edema na zona medula no gânglio mesen ê ico. Não oi de ec ada a p esença de o mas amas igo as de Leishmania em nenhum dos ó gãos analisados. 2.3. Discussão A ca ac e ização da e olução da in ecção po L. in an um no p incipal hospedei o e ese a ó io da leishmaniose na Bacia Medi e ânica é de g ande ele ância de ido ao cão se o p incipal al o pa a a aplicação de compos os imuno e apêu icos e/ou imunop o ilá icos, pois a in e upção do ciclo biológico do pa asi a con ibui á pa a o con olo da leishmaniose isce al humana em á eas endémicas de leishmaniose zoonó ica (Hommel e al., 1995; Mo eno & Al a , 2002). Em á eas endémicas apenas uma pequena pe cen agem da população canina expos a à in ecção ap esen a mani es ações clínicas de doença (Bane h e al., 2008). Num es udo ealizado em Espanha, apenas 13% dos 100 cães as eados ap esen a am sin oma ologia compa í el com a in ecção embo a enha sido possí el em 63% dos animais ampli ica DNA pa asi á io a pa i de amos as de medula, de conjun i a e/ou de pele (Solano-Gallego e al., 2001b). Es a ausência de sin oma ologia pode ep esen a a ase p é-pa en e da in ecção ou a exis ência de um equilíb io en e o pa asi a e o hospedei o (Campino, 1998). Con udo, es e equilíb io pode se pe u bado, sendo p o á el que, al como acon ece nos humanos, a diminuição da esis ência imuni á ia dos cães (p o ocadas po de iciências b. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 120 alimen a es, doenças concomi an es, idade a ançada, g a idez, lac ação), al e e a elação es abelecida en e o hospedei o e o pa asi a e desencadeie a doença (Pozio e al., 1981). Apesa de odos os animais des e es udo e em icado in ec ados (con i mado pela de ecção de DNA pa asi á io nos á ios ecidos e ó gãos ecolhidos na nec ópsia), os únicos sinais clínicos obse ados o am lin oadenomegalia e alopécia. Qua o dos cães man i e am-se odo o empo assin omá icos, um ap esen ou adenomegalia pe sis en e e os ou os se e exibi am sinais ansi ó ios ao longo do pe íodo de obse ação. O apa ecimen o da ase sin omá ica em cu o in e alo de empo pode esul a do inóculo se cons i uído po amas igo as, conside ado mais i ulen o que o inóculo de o mas p omas igo as de cul u a (Ab anches e al., 1991; Campino e al., 2000b; Capela, 2002). As mani es ações ocula es obse adas em no e dos doze cães (75.0%) u ilizados nes e es udo encon am-se en e as p e alências de 16 e 80.5% ob idas po ou os au o es (Cia amella e al., 1997; Kou inas e al., 1999; Na anjo e al., 2005; Peña e al., 2008). A al e ação mais equen e oi a diminuição da sec eção lac imal, a aliada a a és do es e de Schi me . No exame his opa ológico, a e cei a pálpeb a de oi o dos no e cães ap esen a a in il ação de células in lama ó ias com localização subepi elial na ace bulba co obo ando as al e ações obse adas po Roze (1986) e Na anjo e al. (2005). Es es au o es e i ica am que a de iciência na p odução de lág imas nos cães com leishmaniose de ia-se, não à des uição dos ácinos das glândulas de Meibom, mas ao in il ado in lama ó io de células mononucleadas que oco e nas glândulas lac imais, po acção di ec a do pa asi a, assim como à obs ução dos duc os sec e o es pelo p ocesso in lama ó io das es u u as adjacen es. Cu iosamen e, no único animal em que a conjun i i e lin oplasmoci á ia da e cei a pálpeb a não se encon a a associada a uma diminuição da p odução lac imal, a p esença do DNA pa asi á io oi de ec ado nas células conjun i ais ob idas pela passagem de uma za aga oa nas aces in e nas das pálpeb as in e io es. A leishmaniose canina ca ac e iza-se ambém po al e ações hema ológicas como anemia, leucopenia, omboci openia e ele ada elocidade de sedimen ação. As p o eínas plasmá icas ambém so em al e ação e i icando-se o aumen o das p o eínas o ais e da acção gama-globulina com diminuição acen uada do ácio albumina/globulinas (Ab anches, 1984; Campino e al., 2000b, S auss-Ayali e al., Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 121 2007). Es as al e ações nos pa âme os hema ológicos e no p o einog ama o am de ec adas nos animais des e es udo seis meses após a inoculação dos pa asi as. O es ado de panci openia ge al pode es a elacionado com as al e ações do sis ema hema opoié ico (aplasia da medula óssea) que oco em nas ases a ançadas da in ecção (Keenan e al., 1984; Vallada es e al., 1998) enquan o que a ele ada concen ação das gama-globulinas de e -se-à, p o a elmen e, à es imulação policlonal das células B, a qual é esponsá el pela in ensa espos a humo al associada à leishmaniose canina (Gal ão-Cas o e al., 1984; Bunn-Mo eno e al., 1985; Al a e al., 2004). A possibilidade de se ob e uma maio quan idade de ma e ial de di e en es ó gãos e assim analisa um maio núme o de amos as nas colhei as pos mo em (E ans, 1989) oi p o a elmen e a azão da de ecção do pa asi a e sido mais e icaz na nec ópsia do que du an e o pe íodo de obse ação. A obse ação mic oscópica dos decalques do baço, ígado e gânglio lin á ico, pe mi iu de ec a a p esença de leishmanias em oi o cães. Embo a a de ecção enha sido mais e icaz nas p epa ações de ecido esplénico e hepá ico não se e i ica am di e enças signi ica i as em elação aos gânglio poplí eo pelo que, ao se o menos in asi o, es e se ia o ecido de eleição pa a a ealização do exame pa asi ológico di ec o. Con udo, a dis ibuição das o mas amas igo as nos ecidos in ec ados não é homogénea, pelo que es e mé odo em alguns incon enien es, sob e udo quando o núme o de pa asi as na amos a é mui o escasso, podendo não se isualizados apesa de uma obse ação cuidada (Ha i h e al., 1987). O exame cul u al, al como o exame di ec o, é la gamen e usado no diagnós ico da leishmaniose e, no nosso es udo, pe mi iu isola o mas p omas igo as de Leishmania em dez dos cães. Embo a os mé odos de cul u a aumen em a sensibilidade dos exames pa asi ológicos, a di e ença não oi signi ica i a em elação aos decalques dos ecidos. Das 72 cul u as ealizadas no dia da nec ópsia, apenas uma (1,4%), de mace ado esplénico, oi sujei a a con aminação bac e iana. Apesa de não e isolado pa asi as nos es an es ecidos des e animal, a obse ação mic oscópica do seu decalque esplénico pe mi iu conside á-lo in ec ado, pelo que a execução dos dois mé odos pode se uma manei a de aumen a a sensibilidade do exame pa asi ológico. Embo a no nosso es udo a pe cen agem de con aminações mic obianas das cul u as e sido mui o baixa es e é um dos obs áculos a es e ipo de es e de diagnós ico. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 122 Ou a das suas des an agens é a mo osidade do esul ado, sendo po ezes necessá io agua da á ias semanas (cinco semanas). Con udo, a cul u a de ecidos p o enien es de animais in ec ados pe mi e ob e pa asi as pa a p odução de an ico pos, pa a análise in i o da suscep ibilidade a á macos, pa a in ecção de modelos animais assim como pa a ipagem isoenzimá ica e a é molecula do isolado. A de ecção do pa asi a a pa i das amos as esplénicas oi signi ica i amen e supe io à dos ou os ó gãos, com excepção do ígado. Embo a a biópsia esplénica seja apon ada po alguns au o es como o ma e ial de eleição pa a o diagnós ico da LV humana (Pia oux e al., 1994) e canina (Ba ouin-Melo e al., 2004; 2005; Rosypal e al., 2005a), a manei a in asi a da colhei a associada ao isco de hemo agias in e nas são azões álidas pa a não se execu ada na o ina clínica. Apesa da colhei a de sangue se a écnica menos in asi a pa a ob enção de ma e ial, não oi possí el isola em cul u a pa asi as a pa i des e ecido em nenhum dos animais ao longo de odo o pe íodo de obse ação, p o a elmen e de ido ao eduzido núme o de pa asi as ci culan es ou à p esença no sangue canino de inibido es de c escimen o pa asi á io (Fisa e al., 2001). Tendo em con a a sensibilidade da cul u a de aspi ados gangliona es e medula es ob idas nes e es udo assim com nos inqué i os epidemiológicos ealizados po Madei a e al. (2006) e Maia e al. (2007b), cons i uem boas al e na i as pa a o diagnós ico pa asi ológico a biópsia do gânglio poplí eo, ou no caso do animal não ap esen a adenopa ia, a de medula óssea. As écnica molecula es o am signi ica i amen e mais e icazes na de ecção do pa asi a do que os mé odos pa asi ológicos con encionais. A aplicação da écnica de qRT-PCR é de g ande u ilidade no diagnós ico da leishmaniose canina assim como na moni o ização da ca ga pa asi á ia du an e e após a amen o de modo a a alia a sua e icácia e p e eni ecidi as associadas à pe manência esidual de pa asi as após e apêu ica (Mo a ino e al., 2004; Pennisi e al., 2005; F ancino e al., 2006; Manna e al., 2007; Solano-Gallego e al., 2007b). De ido à sua ele ada sensibilidade oi possi el quan i ica os pa asi as exis en es na medula óssea de dois cães no e cei o mês após inoculação e no sangue pe i é ico de ês dos animais no im do pe íodo de obse ação, ap esen ando di e enças signi ica i as em elação à écnica de PCR con encional, naquelas amos as. Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 123 A p esença de componen es inibido es da ampli icação de DNA no sangue o al (Fisa e al., 2001; Rei hinge e al., 2002) se á p o a elmen e a azão pela qual oi mais e icaz a ampli icação do DNA do pa asi a nas amos as do anel de células mononucleadas (“bu y coa ”) do que no sangue o al. A de ecção e quan i icação do DNA do pa asi a a a és das duas écnicas molecula es oi signi ica i amen e in e io nas amos as de sangue pe i é ico e nas de células conjun i ais em elação a odas as demais amos as. Segundo Manna e al. (2004) a ca ga pa asi á ia exis en e na ci culação sanguínea é mui o in e io à exis en e nos ó gãos in e nos (medula, gânglio, ígado). É ambém impo an e ealça que a exis ência de pa asi as ci culan es não é conside ada comum na in ecção causada pela espécie L. in an um e, de aco do com alguns au o es (Fichoux e al., 1999), a pa asi émia, pa a além de a dia, é in e mi en e sendo esponsá el po esul ados de alsos nega i os, especialmen e em cães assin omá icos (Maia & Campino, 2008). Concluindo, a pe sis ência e signi icado da pa asi émia na leishmaniose canina ainda pe manece pouco escla ecido. Con udo, a ampli icação do pa asi a em amos as de sangue imp egnadas em papel de il o como complemen o do esul ado das écnicas se ológicas, pode se mui o ú il em es udos epidemiológicos de amos a de g ande dimensão, onde não é exequí el ob e um ele ado núme o de aspi ados gangliona es e/ou medula es (Maia e al., 2007b). Nes e es udo, as écnicas molecula es aplicadas ao DNA ex aído das conjun i as o am posi i as apenas num animal (8.33%). Es a écnica não in asi a de de ecção do pa asi a em sido u ilizada em in ecções expe imen ais e na u ais ap esen ando sensibilidades en e 52.2% e 92.0% e especi icidade de 100% (S auss- Ayali e al., 2004; Fe ei a e al., 2008). Apesa de ês meses após inoculação apenas em dois animais se de ec a DNA pa asi á io na medula óssea, no inal do es udo, a de ecção do pa asi a nos á ios ó gãos e ecidos demos am que os canídeos não o am capazes de e i a a disseminação e a mul iplicação pa asi á ia. A maio ia das in ecções expe imen ais suge em o baço como o ó gão mais suscep í el à mul iplicação pelas di e en es espécies de Leishmania isce o ópicas (Engwe da e al., 1998; Wilson e al., 1998; Ahmed e al., 2003; Riça-Capela e al., 2003; Rolão e al., 2007). Dos nossos esul ados pode-se conclui que o pa asi a ap esen ou um opismo pelos ó gãos in e nos, com o baço a se o ó gão mais pa asi ado seguido da medula óssea e ígado, Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 124 e que a disseminação pa a a pele pa ece acon ece em es ádios mais a dios da in ecção (T a i e al., 2001). Manna e al. (2006) a alia am a ca ga pa asi á ia de cães na u almen e in ec ados po L. in an um ap esen ando di e en es quad os clínicos ao longo dos dois anos de obse ação. Os au o es encon a am uma ele ada ca ga pa asi á ia em biópsias de pele de animais assin omá icos. A p esença de pa asi as na pele de cães assin omá icos e idencia a sua impo ância na di usão da pa asi ose uma ez que, ao não ap esen a em sinais de doença, não se ão subme idos a qualque medida de con olo (Campino, 1998). Apesa de assin omá icos os cães po ado es são in ecciosos pa a os lebó omos ec o es (Molina e al., 1994) embo a cons i uam um isco meno que os sin omá icos (Campino, 2002). O en ol imen o isce al é ca ac e izado po uma espos a humo al in ensa (Ca alho e al., 1981). O nosso modelo expe imen al con i mou que, apesa de não p o ec o a, a espos a humo al especí ica é p onunciada e p ecoce (Campino, 1998; Ca illo e al., 2007). As écnicas de ELISA e de DAT pe mi i am a de ecção de an ico pos an i- Leishmania no p imei o mês após in ecção. Apesa de ambas se em quan i a i as e de pode em analisa simul aneamen e um ele ado núme o de amos as, a DAT ap esen a como p incipal des an agem a necessidade de se ealiza em diluições se iadas dos so os a es a e, no caso da ELISA, o ac o da lei u a dos esul ados e que se e ec uada num espec o o óme o. A ELISA oi signi ica i amen e a mais sensí el na de ecção dos animais se oposi i os ao e ela logo no p imei o mês cinco so os com an ico pos especí icos e es e núme o e ido aumen ando ao longo dos meses seguin es. Também e e a pa icula idade de, no D60, cinco dos seis cães se oposi i os co esponde em a animais que ap esen a am lin oadenomegalia e/ou alopécia. Es a co elação en e os animais com sin oma ologia e a posi i idade da écnica pode á e um alo p edi i o na e olução da in ecção. Con udo, é impo an e essal a que, apesa de ap esen a uma sensibilidade signi ica i amen e supe io às demais écnicas, a ELISA de ec ou an ico pos em um animal an es des e e sido in ec ado. Es e animal man e e-se posi i o po es a écnica ao longo de odo o pe íodo de obse ação. Apesa da p ecocidade da écnica de CIE em de ec a so os com imunoglobulinas an i-Leishmania (Ab anches e al., 1991; Campino, 1998; Campino Ca ac e ização de uma in ecção expe imen al po Leishmania in an um no cão ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 125 e al., 2000b), al como oco eu no nosso es udo a pa i do segundo mês de obse ação, a sua p incipal des an agem oi conside a se ologicamen e in ec ados ês animais an es da inoculação. A possibilidade dos animais se encon a em in ec ados an es do início do es udo é ín ima endo em con a que o am impo ados de um país conside ado não endémico (USA) e man idos, no IHMT, num canil com uma ede mosqui ei a de malha in e io às dimensões do lebó omo e com insec ocu o es no seu in e io . O ac o de um mês após a inoculação dos pa asi as odos os animais e em sido se onega i os a a és de a écnica, e o ça o ac o des a posi i idade ansi ó ia, ambém obse ada em in ecções expe imen ais an e io men e ealizadas no nosso labo a ó io (Campino, comunicação pessoal), e sido de ida a eacções c uzadas com os p odu os acinais e despa asi an es u ilizados an e io men e à inoculação. Nes e es udo ambém se p ocedeu à análise de um es e ápido de imunoc oma og a ia p o ó ipo e de um es e come cializado como e amen as de diagnós ico. Ambas as écnicas ap esen a am uma sensibilidade de 84.61% a pa i do D120. Es es es es ap esen am como an agens a ácil e ápida execução e lei u a, e, no caso do K39, um alo p edic i o no apa ecimen o da ase aguda da doença (Bada ó e al., 1996; Gomes e al., 2008) pelo que a sua u ilização não se de e es ingi ao diagnós ico clínico mas se ala gada aos as eios se oepidemiológicos. A IFI, apesa de se conside ada a écnica de e e ência no diagnós ico se ológico da leishmaniose isce al (G adoni, 2002; Mancian i e al., 2002; Al a e al., 2004), no nosso es udo oi uma das écnicas que mais demo ou a de ec a í ulos signi ica i os de an ico pos. Fe nández-Pé ez e al. (1999) compa ou os esul ados ob idos com a IFI u ilizando amas igo as axénicos com os ob idos com p omas igo as e e i icou que, a o ma exis en e no hospedei o e eb ado, ap esen a a uma maio sensibilidade, sem pe da de especi icidade, na de ecção de cães assin omá icos. Cinco meses após a in ecção odas os animais e am se oposi i os pa a as seis écnicas se ológicas u ilizadas, o que con i ma que, embo a não seja ele an e no con olo da in ecção, a imunidade humo al é de g ande alo no diagnós ico da pa asi ose. A oco ência de eacções c uzadas com ou os agen es pa ogénicos ais como T ypanosoma c uzi ou Eh lichia canis (Fe ei a e al., 2007) assim como a pe sis ência de í ulos ele ados de an ico pos após esolução da in ecção são algumas Conclusões ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 235 A he e ogeneidade obse ada nos IC50 das cinco es i pes analisadas, em elação aos qua o á macos, pode á es a elacionado com as ca ac e ís icas in ínsecas de cada es i pe. Con udo, endo em con a os esul ados ob idos pode-se conclui que (i) as es i pes caninas isoladas de animais não a ados são pouco sucep í eis à acção dos an imoniais e o çando a ideia de que es e á maco não se á o mais indicado pa a o a amen o da leishmaniose canina ao não elimina po comple o o pa asi a acili ando o apa ecimen o de es i pes esis en es e (ii) a diminuição da suscep ibilidade das es i pes isoladas de indi íduos imunodep imidos aos á macos u ilizados na 1ª linha de a amen o pode á acili a a dispe são de pa asi as mul i esis en es. Apesa de não e ha ido eliminação o al dos pa asi as, a p odução da IL-10 oi meno nas células a adas mos ando que os compos os conseguem sup imi a p odução des a ci ocina inibido a da ac i ação dos mac ó agos pelo que a imuno e apia com compos os que neu alizem ou bloqueiem os mecanismos sup esso es da acção dos mac ó agos pode á se uma es a égia a u iliza u u amen e de modo a aumen a a e icácia do a amen o. A selecção de es i pes quimio- esis en es in i o in e e iu com a suscep ibilidade do pa asi a à acção dos á macos, e i icando-se uma meno e icácia dos compos os. A única excepção oi o Alopu inol. A al e ação da memb ana pe mi iu que es a icasse mais pe meá el à en ada des e á maco. A e i icação da exis ência de esis ência c uzada en e os á macos u ilizados na 1ª linha de a amen o e o ça a necessidade de se es a em combinações e apêu icas e de se desen ol e em no as moléculas an i-Leishmania. CAPÍTULO VII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Re e ências Bibliog á icas ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 239 7. Re e ências Bibliog á icas Abbas A., Mu phy K., She A. 1996. Func ional di e si y o helpe T lymphocy es. Na u e, 383: 787-79 Ab anches P., San os-Gomes G., Campino L. 1993. Epidemiology o leishmaniasis in Po ugal. 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