Relação entre a concentração hepática de ferro e a quantidade Total de ferro removida por flebotomias em doentes com hemocromatose

TRABALHO ACADÉMICO DE INVESTIGAÇÃO RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA (MIM) DO ICBAS/UP E HSA/CHP DISCIPLINA DE INICIAÇÃO A INVESTIGAÇÃO CLÍNICA (DIIC) Responsável: Prof. Doutora Margarida Lima, HSA/CHP e ICBAS/UP ALUNO: Bruno Miguel Ferreira Loureiro ÁREA DE INVESTIGAÇÃO: Hematologia Clínica ORIENTADOR: Prof. Doutora Graça Porto, HSA/CHP e ICBAS/UP CO-ORIENTADOR: Dr. José Fraga, CHVNG/E Dr. Pedro Varzim, HSA/CHP ANOS LECTIVOS: 2011/2012 e 2012/2013 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 2 PREÂMBULO Este trabalho, apresentado para fins de obtenção do grau de Mestre em Medicina, integra um projeto desenvolvido no âmbito da Disciplina de Iniciação à Investigação Científica (DIIC) do Curso de Mestrado Integrado em Medicina (MIM) do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto (ICBAS/UP) e do Centro Hospitalar do Porto (CHP) e está estruturado em duas partes: proposta de projeto de investigação e respetivo relatório de execução. A proposta de projeto foi elaborada durante o ano letivo 2011/2012 e o projeto foi executado durante o ano letivo 2012/2013 no âmbito da consulta de hemocromatose (CH) do serviço de hematologia clínica (SHC) do hospital de Santo António (HSA), pertencente ao centro hospitalar do porto (CHP). A orientação foi realizada pela Prof. Doutora Graça Porto, chefe do serviço de imunohemoterapia do CHP, com colaboração do Dr. José Fraga, chefe de serviço do departamento de Gastrenterologia do CHVNG/E, e do Dr. Pedro Varzim, radiologista do CHP. A preparação e execução do projeto foram ainda supervisionadas pela Prof. Doutora Margarida Lima, responsável pela DIIC. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 3 AGRADECIMENTOS A realização deste projeto de mestrado contou com importantes apoios e incentivos sem os quais não se teria tornado realidade e aos quais deixo um especial agradecimento. À Professora Doutora Graça Porto, pela sua orientação, total apoio e disponibilidade, saber claramente transmitido, pelas opiniões e críticas e por todas as palavras de incentivo. Realço ainda a sua boa disposição e simpatia, características na minha opinião fundamentais para uma boa relação entre orientador e orientando. À Professora Doutora Margarida Lima, pela sua supervisão sempre clara, rigorosa e pela sua total disponibilidade para o esclarecimento de dúvidas e resolução de problemas. Ao Dr. José Fraga e Dr. Pedro Varzim, pelo conhecimento que transmitiram relacionado com as suas áreas de competência, uma ajuda preciosa para a realização deste trabalho. À equipa de funcionários do Arquivo do HSA-CHP, pela sua disponibilidade, eficácia e sem a qual a execução deste projeto teria sido comprometida. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 4 SUMÁRIO Introdução O ferro é um elemento de capital importância nos sistemas biológicos. No entanto a sua acumulação excessiva é tóxica pois promove reacções de oxidação-redução com produção de espécies reactivas de oxigénio e, consequentemente, stress oxidativo. A hemocromatose hereditária HFE é o protótipo deste cenário: resulta da mutação do gene HFE (C282Y) que, em homozigotia, determina um estado de constante absorção dietética de ferro, independente do estado das suas reservas corporais. É tratada de uma forma simples, barata e eficaz: remoção periódica de sangue, procedimento conhecido por flebotomia periódica. Após o tratamento é possível determinar qual foi a massa de ferro removida durante o mesmo, conhecida como total body iron stores (TBIS). Este parâmetro corresponde ao grau de sobrecarga de ferro prévia ao tratamento, e será usado neste estudo para avaliar o desempenho de testes diagnósticos. A concentração hepática de ferro (CHF) parece relacionar-se directamente com o TBIS, daí a sua importância na gestão pré-terapêutica dos doentes. Pode ser obtida através de biópsia hepática, procedimento invasivo com riscos inerentes, ou através de algoritmos matemáticos baseados em imagens de ressonância magnética (RM). O algoritmo mais usado atualmente foi proposto por Gandon et al, existindo outro método potencialmente mais eficaz descrito por Alustiza et al. Embora exista já bastante evidência que sustente a aplicação destas técnicas em doentes com hemocromatose hereditária, o mesmo não se pode afirmar relativamente às sobrecargas adquiridas de ferro. Estas são normalmente consequência de diversas patologias de onde se destacam doenças hepáticas crónicas, como a esteatose hepática alcoólica e não-alcoólica, certas anemias crónicas e transfusões repetidas. Este estudo lidará unicamente com casos de sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/nãoeritropoiética. Objectivos É objectivo deste estudo determinar se há uma relação entre a CHF determinada por RM e o TBIS. Também é objectivo estudar as diferenças entre doentes com hemocromatose hereditária e adquirida quanto aos diversos meios complementares de diagnóstico, no sentido de avaliar se a actual gestão das sobrecargas adquiridas de ferro é a mais apropriada. O estudo dos resultados das RM terá como propósito identificar um algoritmo mais eficaz para estimar a CHF nos casos de hemocromatose adquirida caso o método actualmente usado se mostre ineficaz. Material e Métodos Trata-se de um estudo analítico que usou dados retrospectivos de doentes com hemocromatose hereditária e adquirida. As variáveis estudadas foram características individuais (idade, sexo, TBIS, patologia responsável pela hemocromatose adquirida, genotipagem HFE) e resultados de exames complementares (ferritina sérica, saturação da transferrina, CHF por RM (quando ajustada à idade origina o IHF)). Foi estudada a relação entre a CHF e o TBIS na amostra total e por tipo de hemocromatose. Foram também estudados os valores de referência para todos os testes de diagnóstico, bem como o seu desempenho na RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 5 identificação de sobrecarga de ferro com base no TBIS e mais uma vez prestando particular atenção às diferenças entre os dois tipos de sobrecargas de ferro. A revisão das ressonâncias magnéticas foi conseguida pela consulta das imagens digitais presentes no sistema informático hospitalar e das imagens em película armazenadas no arquivo do HGSA. A análise de dados foi realizada no programa informático Statistical Package for the Social Sciences (SPSS). Resultados A CHF por RM demonstrou uma correlação forte e positiva com o TBIS, bem como a ferritina sérica. As melhores correlações para a ferritina, saturação da transferrina e CHF por RM são vistas na hemocromatose hereditária. Este grupo revelou níveis em média superiores de saturação de transferrina, CHF por RM, IHF e TBIS relativamente aos indivíduos com hemocromatose adquirida. Apenas a ferritina sérica se mostrou sobreponível nos dois grupos. O teste com maior desempenho na distinção entre casos com e sem sobrecarga de ferro foi a ferritina sérica, enquanto a CHF por RM demonstrou ter desempenho minimamente satisfatório. Pelo contrário, a RM revelou ter óptimo desempenho na distinção entre sobrecarga ligeira/intermédia de sobrecarga severa de ferro. Quanto ao tipo de hemocromatose, a ferritina e a CHF por RM têm melhor desempenho nas sobrecargas hereditárias de ferro, sendo o segundo método mesmo ineficaz na hemocromatose adquirida. Mais uma vez o desempenho da RM sobe em ambos os grupos se o objectivo for identificar sobrecarga severa de ferro. A ferritina e a saturação de transferrina são os melhores métodos para identificar sobrecarga de ferro na hemocromatose adquirida. A revisão das RMs demonstrou que o método de Alustiza et al tem melhor correlação com o TBIS do que o método usado actualmente (Gandon et al), independentemente do tipo de hemocromatose. A correlação é mais forte na hemocromatose hereditária em ambas as técnicas. Conclusões Há efectivamente uma correlação positiva forte entre a CHF por RM e o TBIS, e esta é mais forte nos casos de sobrecarga hereditária de ferro. Este achado, juntamente com o mau desempenho da CHF por RM na hemocromatose adquirida, permite concluir que este método não é eficaz nos casos com suspeita de sobrecarga de ferro não-transfusional/nãoeritropoiética. No entanto, se o objectivo for a identificação de sobrecarga severa de ferro, a RM assume um óptimo desempenho. Tendo em conta os elevados valores de ferritina na hemocromatose adquirida, e uma vez que o desempenho da saturação de transferrina se revelou o melhor nestes doentes, elevações de ferritina num doente com saturação de transferrina inalterada poderá ser considerado um marcador não de sobrecarga de ferro mas de esteatose hepática. Conclui-se ainda que é ponderável o uso do algoritmo de Alustiza et al em substituição do método usado actualmente, principalmente nos casos de sobrecarga adquirida de ferro. Palavras-chave: metabolismo do ferro; toxicidade do ferro; sobrecarga de ferro; hemocromatose hereditária; hemocromatose adquirida; concentração hepática de ferro; esteatose hepática; esteatose hepática não alcoólica; doença hepática alcoólica. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 6 ABSTRACT Introduction Iron is a central element in biologic systems. Nevertheless, its excessive accumulation is toxic due to redox reactions which form oxygen reactive species and consequently oxidative stress. Hereditary hemochromatosis is a prototype of this mechanism: a biallelic mutation in HFE gene (C282Y) causes a tendency to constant iron enteric absorption, regardless of its body stores. Treatment is simple, inexpensive and effective: periodic blood removal by a procedure called phlebotomy. Total body iron stores (TBIS) can be established after treatment. It reveals the precise severity of pre-treatment iron overload and is used in this study to assess the performance of diagnostic tests. Hepatic iron concentration (HIC) directly correlates with TBIS and is therefore important in pre-therapeutic management of patients. It can be obtained through liver biopsy, invasive procedure with inherent risks, or through mathematical algorithms based on magnetic resonance images (MRI). Gandon et al proposed the algorithm currently used by most centers, but a second supposedly superior method was described by Alustiza et al. Strong scientific evidence supports the use of these techniques in hereditary hemochromatosis patients. However, the same can’t be stated for acquired iron overload patients. Generally classified as acquired hemochromatosis, these forms of iron overload may be caused by several diseases processes. Liver chronic diseases, namely liver alcoholic and non-alcoholic steatosis and steatohepatitis, chronic anemias and repeated transfusions are among its main causes. This study deals only with non-transfusional/non-erithropoietic forms of acquired hemochromatosis. Goals This study’s main goal is determining if a correlation exists between HIC by MRI and TBIS. Differences among acquired and hereditary hemochromatosis patients’ diagnostic tests will also be assessed to evaluate the management properness of acquired iron overload patients. If the currently used MRI method proves ineffective on acquired iron overloads, this diagnostic procedure will be reviewed in search of more suitable algorithms to estimate HIC. Material and Methods This is an analytic study based on retrospective data from hemochromatosis patients. Variables studied were individual traits (age, sex, TBIS, cause of acquired hemochromatosis, HFE gene status) and results from diagnostic procedures (serum ferritin, transferrin saturation, HIC by MRI (and its age-adjustment, HII)). The correlation between diagnostic tests and TBIS was studied, with particular interest in HIC by MRI and its difference between hereditary and acquired hemochromatosis cases. The cutoff values of such diagnostic tests were also assessed by contingency tables, as was its performance in identifying iron overload based on TBIS, once more attaining for the type of hemochromatosis. MRI revision was accomplished through manipulation of digital pictures saved in the hospital’s informatics system or physical picture consultation stored on archive. Data analysis was accomplished using Statistical Package for the Social Sciences (SPSS). RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 7 Results HIC by MRI revealed to be strongly and positively correlated with TBIS, as well as serum ferritin. The best correlations of ferritin, transferrin saturation and HIC by MRI were observed in hereditary hemochromatosis. This group showed superior mean values of ferritin, transferrin saturation, HIC by MRI, HII and TBIS in comparison with acquired hemochromatosis patients. Only serum ferritin was similar in both groups. The best performance in separating iron overloaded from healthy individuals (based on TBIS) was achieved by ferritin, while HIC by MRI revealed only minimal satisfactory performance. Inversely, MRI showed optimum performance in distinguishing light/moderate from severe iron overload. The evaluation according to hemochromatosis type revealed that ferritin and HIC by MRI have superior performance in hereditary iron overloads, the last diagnostic test being even ineffective in acquired hemochromatosis. Once more MRI’s performance increases in both groups when the goal is identifying sever iron overload. Ferritin and transferrin saturation are the best diagnostic methods in the management of acquired hemochromatosis patients. Alustiza et al’s method for HIC calculation correlates stronger to TBIS than the technique currently in use (Gandon et al), regardless of hemochromatosis type. Correlation is stronger in hereditary iron overload cases in both methods. Conclusions A strong positive correlation was confirmed between HIC by MRI and TBIS, which is stronger in hereditary hemochromatosis. This fact, combined with MRI’s poor performance in acquired hemochromatosis, suggests that this diagnostic procedure is ineffective in cases of suspected acquired iron overload of non-transfusional/non-erithropoietic cause. Nevertheless, this test has great performance in identifying severe iron overload. Considering the elevated ferritin levels in acquired hemochromatosis, and once transferrin saturation showed the best performance in these cases, an elevated ferritin can be considered a marker not of iron overload but of liver steatosis in a patient with normal transferrin saturation. The MRI method for HIC calculation proposed by Alustiza et al could replace the currently used algorithm of Gandon et al, especially if there is suspicion of an acquired form of hemochromatosis. Key-words: iron metabolism; iron toxicity; iron overload; hereditary hemochromatosis; aquired hemochromatosis; hepatic iron concentration; hepatic steatosis; Non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD; alcoholic liver disease. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 8 ÍNDICE PROPOSTA DE PROJETO DE INVESTIGAÇÃO ............................................................ 10 Introdução .................................................................................................................. 11 Estado da arte ............................................................................................................ 13 Homeostasia do ferro .......................................................................................................... 13 Sobrecarga de ferro ............................................................................................................. 14 Avaliação da sobrecarga de ferro ........................................................................................ 16 Tratamento da sobrecarga de ferro .................................................................................... 18 Fundamentos do estudo ............................................................................................ 20 Problemas ............................................................................................................................ 20 Questões .............................................................................................................................. 20 Objectivos ............................................................................................................................ 20 Intervenientes ............................................................................................................ 22 Instituições, Departamentos e Serviços .............................................................................. 22 Equipa de investigação ........................................................................................................ 22 Metodologia ............................................................................................................... 23 Critérios de revisão da literatura ......................................................................................... 23 Desenho do estudo .............................................................................................................. 23 Universo, população e amostra ........................................................................................... 23 Seleção dos participantes .................................................................................................... 23 Material e Métodos ............................................................................................................. 25 Análise de Dados ................................................................................................................. 27 Calendarização ........................................................................................................... 28 Duração ............................................................................................................................... 28 Datas de início e conclusão ................................................................................................. 28 Cronograma global das actividades desenvolvidas ............................................................. 28 Indicadores de produção ............................................................................................ 29 Comunicações orais e posters ............................................................................................. 29 Trabalhos escritos ................................................................................................................ 29 Questões Éticas .......................................................................................................... 30 Informação e consentimento informado ............................................................................ 30 Outras questões com implicações éticas ............................................................................. 30 Plano Financeiro ......................................................................................................... 31 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 9 Orçamento ........................................................................................................................... 31 Financiamento ..................................................................................................................... 31 Glossário ..................................................................................................................... 32 Abreviaturas ........................................................................................................................ 32 Siglas e acrónimos ............................................................................................................... 32 RELATÓRIO DE EXECUÇÃO...................................................................................... 33 Execução do Projecto ................................................................................................. 34 Metodologia ........................................................................................................................ 34 Resultados .................................................................................................................. 35 Análise descritiva da Amostra ............................................................................................. 35 Análise Inferencial da amostra ............................................................................................ 47 Discussão .................................................................................................................... 60 Análise descritiva da amostra .............................................................................................. 60 Análise inferencial da amostra ............................................................................................ 60 Conclusões .................................................................................................................. 66 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 67 ANEXOS ................................................................................................................. 70 Tabelas relativas à Execução do Projecto .................................................................. 70 Gráficos relativos à Execução do Projecto ................................................................. 72 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 16 à progressão para a segunda fase da doença. Além disso, a deposição de ferro foi já associada ao agravamento da resistência hepática à insulina [19]. Foi também investigada a associação entre o genótipo homozigótico HFE-C282Y e a progressão da doença hepática em doentes com NAFLD [20]. Os resultados mostraram que a progressão da doença se associa não à presença deste genótipo, mas sim à presença de ferro em excesso no fígado. Uma explicação para este resultado pode residir na baixa penetrância HFE-C282Y, isto é, apenas uma pequena percentagem dos indivíduos com esta variante genética desenvolve acumulação de ferro. A hemocromatose adquirida a doença hepática será o principal alvo deste estudo, uma vez que as patologias que promovem esteatose hepática são de longe as mais frequentes causas de sobrecarga de ferro adquirida. Por esta razão estes casos serão descritos ao longo deste trabalho como sobrecargas de ferro adquiridas não-transfusionais/não-eritropoiéticas. Avaliação da sobrecarga de ferro Existem diversos meios complementares de diagnóstico que permitem avaliar qualitativa e quantitativamente a quantidade total de ferro no organismo. A determinação da concentração sérica de ferritina tem alguma utilidade na avaliação qualitativa das reservas de ferro. É também uma proteína de fase aguda, já que a sua produção e libertação se amplificam na presença de inflamação [21]. É considerada sugestiva de sobrecarga de ferro uma ferritina sérica superior a 300µg/L no homem e a 200µg/L na mulher [22]. Embora seja um marcador sensível, isto é, capaz de detectar eficazmente indivíduos com sobrecarga de ferro, carece de especificidade. A maioria das elevações da ferritina não se associa a sobrecarga subjacente mas sim a outras alterações como inflamação ou cancro [23]. O consumo de álcool também promove a elevação da ferritina sérica. Torna-se por isso importante reajustar os valores de referência em populações com consumo de álcool prevalente. Um estudo investigou o efeito do consumo de álcool nos níveis de ferritina na população Portuguesa, mostrando uma tendência para valores elevados devido à alta taxa de consumo alcoólico manifestada por ambos os sexos [24]. É provável que os valores de referência mencionados sejam inadequados para a população portuguesa, e por essa razão torna-se necessário excluir o álcool como causa da elevação da ferritina sérica, sendo para isso realizada uma prova de abstinência alcoólica com posterior reavaliação deste parâmetro. A saturação da transferrina é outro método auxiliar de diagnóstico que permite inferir sobre a quantidade corporal de ferro, sendo considerada normal entre os 15 e 45%. Valores fora deste intervalo sugerem deficiência ou sobrecarga, respectivamente [4]. Embora seja um marcador mais específico para a identificação de reservas aumentadas de ferro do que os níveis séricos da ferritina, é alvo de uma grande variabilidade biológica. Como já foi dito, o fígado é o primeiro órgão a acumular o ferro em excesso no organismo. Por essa razão, a determinação da concentração hepática de ferro (CHF) através de biópsia hepática é considerada a técnica de eleição para verificar se há ou não sobrecarga, e qual o seu grau de gravidade [25]. Esta é dada em micromoles de ferro por grama de fígado seco (µmol/g) e é considerada normal se for menor de 36µmol/g. Uma CHF entre 36-80µmol/g sugere sobrecarga moderada, enquanto um valor superior a 80µmol/g é compatível com sobrecarga severa [26]. A biópsia hepática documenta ainda se há fibrose ou cirrose, avalia a arquitectura do parênquima e classifica a deposição de ferro em parênquimatosa, reticulo- RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 17 endotelial ou mista [27]. É também considerada o método gold standard no diagnóstico e caracterização da esteatose hepática. A determinação do grau de esteatose baseia-se no número de hepatócitos que contêm inclusões lipídicas, o que corresponde a uma avaliação semi-quantitativa. Possibilita ainda determinar se já existe NASH pela presença de células inflamatórias, necrose hepatocelular e distorção arquitectural por fibrose [28]. No entanto, a biópsia tem algumas desvantagens. É um método invasivo com um pequeno risco de complicações e alguma variabilidade de resultados, principalmente se existir cirrose [29, 30]. Além disso o volume de tecido avaliado corresponde a uma percentagem mínima do total de parênquima, o que dá lugar a erros quando a distribuição de ferro e/ou de gordura não é homogénea. A ressonância magnética (RM) é uma alternativa não invasiva para o cálculo da CHF. O princípio na qual se baseia esta técnica centra-se nas propriedades paramagnéticas do ferro: a sua presença em excesso no parênquima hepático promove um decréscimo na intensidade do sinal detectado pela RM, principalmente em sequências ponderadas em T2 [31]. Este efeito é devido a um decréscimo no tempo de relaxamento T2 e a heterogeneidades no campo magnético induzidas pelos átomos de ferro. As sequências em gradiente de eco (GRE), devido à sua maior sensibilidade para detectar heterogeneidades de campo, mostraram ser as mais sensíveis para detectar sobrecargas de ferro [32]. Um estudo por Gandon et al (2004) permitiu a criação de um algoritmo matemático capaz de calcular a CHF com base nas imagens de RM. Este método foi criado com base no grau de atenuação de sinal hepático observado em cinco sequências de RM (ponderação variável em T2) e em biópsias hepáticas para confirmação da CHF [31]. Este algoritmo encontra-se informatizado na página da Universidade de Rennes e, devido à sua reprodutibilidade, é usado por diversos centros de referência [33]. Em cada sequência é obtido um quociente entre a intensidade de sinal hepático e a intensidade de sinal de um tecido de referência, sendo o mais utilizado o tecido dos músculos para-espinhais. Este quociente designa-se por razão fígado para músculo (F/M) (do inglês liver to muscle ratio) e está indirectamente relacionado com a CHF. Após introdução das intensidades de sinal obtidas em cada tecido, o software vai determinar qual a sequência mais sensível aplicável ao caso, calcula a razão fígado/músculo dessa sequência e seleciona a CHF correspondente a essa razão, expressa em micromoles por grama. A classificação da sobrecarga em ausente, moderada ou severa respeita os mesmos intervalos utilizados na biópsia hepática. Uma desvantagem desta técnica é o facto de não permitir dosear concentrações hepáticas de ferro superiores a 350µmol/g uma vez que a intensidade de sinal correspondente é inferior ao nível de ruído da imagem. Também não permite avaliar morfologicamente o parênquima hepático e por essa razão não é sensível à presença de fibrose, cirrose ou esteatose. Um estudo demonstrou que esta técnica é particularmente eficaz na exclusão de hemocromatose para valores de CHF até 60µmol/g assim como na determinação de sobrecargas de ferro importantes (> 170µmol/g); no entanto valores intermédios tendem a ser sobrestimados [34]. Um outro estudo por Alústiza et al (2004) avaliou a eficácia da RM na quantificação da CHF. Foram aplicadas as sequências padrão sugeridas por Gandon et al para a obtenção das imagens de RM e respectivas razões fígado-músculo. Os indivíduos foram também sujeitos a biópsia hepática, o método de referência na avaliação da CHF. Foi criado um novo algoritmo RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 18 matemático que mostrou uma óptima correlação com a verdadeira CHF, determinada por biópsia [26]. Este é baseado nas razões fígado/músculo das duas sequências com melhor correlação com a CHF: sequência GRE ponderada em densidade protónica (DP) e sequência GRE ponderada em T2+. Foi ainda aplicado o modelo informático criado por Gandon et al que também se mostrou bastante eficaz na previsão da CHF. Independentemente do método usado para a determinação da CHF, esta pode ser usada no cálculo de um marcador clínico de gravidade de sobrecarga designado índice hepático de ferro (IHF). Este é obtido através do quociente entre a CHF e a idade do doente. Considera-se que um doente não tem excesso de ferro quando o seu IHF é inferior a 1,9. Valores entre 2 e 4 sugerem sobrecarga de ferro moderada e valores superiores a 5 sobrecarga de ferro severa. A capacidade preditiva deste marcador carece de validação científica. Tratamento da sobrecarga de ferro Depois de quantificar o grau de sobrecarga de ferro pela determinação da sua concentração hepática, deve ser tomada uma decisão quanto à abordagem terapêutica. O excesso de ferro no organismo é tratado classicamente através da remoção periódica de sangue por punção venosa, um procedimento designado por flebotomia. Este procedimento apenas é aplicado a doentes capazes de repor os eritrócitos removidos, ou seja, com eritropoiese normal. Caso contrário a anemia é uma complicação inevitável. É por essa razão que alguns doentes com hemocromatose adquirida a anemias causadas por alterações da eritropoiese não estão habilitados a esta forma de tratamento. Nestes casos existem outros métodos como os fármacos quelantes do ferro (deferoxamina e deferasirox). No entanto estes têm custos consideráveis e podem promover toxicidade. Embora se considere a flebotomia periódica a única abordagem terapêutica capaz de reverter a fibrose hepática [35], um estudo recente revelou que o tratamento com deferasirox durante pelo menos três anos era capaz de reverter a fibrose hepática em doentes com β-Talassemia [36]. Este efeito mostrou-se também em doentes que não obtiveram redução significativa da CHF, sugerindo que a reversão da fibrose é independente da capacidade quelante deste fármaco. Em doentes com HH, as recomendações actuais sobre quando iniciar a terapia por flebotomia são empíricas, mostrando a evidência que quanto mais cedo esta for iniciada melhor será o prognóstico. Estes doentes removem uma unidade de sangue (400ml) por semana, o que corresponde à remoção aproximada de 200-250mg de ferro. Esta etapa corresponde à fase de tratamento intensivo e tem como objectivo remover o ferro em excesso no organismo. O final do tratamento intensivo é determinado pela concentração sérica de ferritina, considerando-se que o doente removeu todo o excesso de ferro quando a sua ferritina desceu para os 50-100µg/L. Infelizmente, a maioria dos doentes tem tendência para voltar a acumular ferro no organismo. Por essa razão é necessário um tratamento de manutenção para manter os níveis séricos de ferritina inferiores as 100µg/L. Este objectivo é normalmente alcançado pela remoção de uma unidade de sangue a cada 3 ou 6 meses [8, 37]. Após o tratamento intensivo é possível calcular a massa total de ferro que foi removida (TBIS). Para tal é utilizada uma fórmula matemática que inclui a concentração média de hemoglobina (g/dL), o número de flebotomias, o volume médio de sangue removido por flebotomia e a duração do tratamento (dias). Objectivamente, a quantidade de ferro removida RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 19 é directamente proporcional à hemoglobina média, volume e número de flebotomias. A duração do tratamento permite estimar a quantidade de ferro que entrou no corpo através da alimentação, entrando no cálculo com um sinal inverso aos outros parâmetros. Considera-se que a massa de ferro removida pelo tratamento intensivo é próxima da quantidade total de ferro em excesso no organismo. Infelizmente não existem ainda indicações objectivas que condicionem o tratamento de sobrecargas adquiridas não-transfusionais/não-eritropoiéticas. Embora seja do conhecimento geral que a doença hepática alcoólica e a NAFLD se associam frequentemente a retenção de ferro, e que o tratamento por flebotomias parece ter impacto na progressão destas patologias [15, 38], não existem ainda protocolos clínicos que determinem qual a CHF a partir da qual é vantajoso tratar estes doentes. Para tentar resolver este problema é fundamental estudar se a CHF é um valor com capacidade preditiva da quantidade de ferro no organismo. Um estudo mostrou que existe uma associação entre a quantidade de ferro removido por flebotomias e a redução na CHF em doentes com Talassemia major submetidos a transplante de medula óssea [39]. Embora se considere empiricamente que existe uma associação entre a CHF pré-terapêutica e a quantidade de ferro removida por flebotomias [37], não há estudos que provem esta relação em doentes com HH ou sobrecargas adquiridas nãotransfusionais/não-eritropoiéticas. É também importante verificar se esta associação mostra diferenças significativas entre doentes com sobrecarga primária (HH) e doentes com sobrecarga adquirida. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 20 Fundamentos do estudo Problemas A consulta especializada de Hemocromatose do Centro Hospitalar do Porto (CHP), vocacionada para o diagnóstico e tratamento da HH, é frequentemente confrontada com a gestão de casos de hemocromatose adquirida não-transfusional/não-eritropoética, maioritariamente constituída por casos de esteatose hepática alcoólica e NAFLD. A abordagem destes doentes começa pelo diagnóstico da patologia de base, seguida da confirmação e caracterização da sobrecarga. Tem sido prática tratar estes doentes com flebotomias periódicas para a remoção do excesso de ferro. No entanto, esta prática não passa de uma abordagem empírica devido à ausência de evidência científica que estratifique os doentes e recomende o melhor tratamento para os diferentes casos. Por outro lado, não está demonstrado que a concentração hepática de ferro determinada por RM prediz fiavelmente a existência de sobrecarga deste metal em doentes com sobrecargas adquiridas não-transfusionais/não-eritropoéticas, ao contrário do que acontece em doentes com HH por homozigotia do gene C282Y. Questões Em face destes problemas, colocam-se quatro questões fundamentais: 1. Estará a concentração hepática de ferro, determinada por RM antes do tratamento, relacionada com a quantidade de ferro removida por flebotomias (quantidade total de ferro em excesso no organismo) em doentes com hemocromatose hereditária e doentes com sobrecargas adquiridas nãotransfusionais/não-eritropoéticas? 2. Será que o cálculo actualmente usado para determinar a CHF através das várias ponderações de RM é o que mostra melhor relação com a quantidade total de ferro em excesso no organismo? E será este cálculo igualmente adequado para doentes com HH e doentes com sobrecargas adquiridas não-transfusionais/nãoeritropoéticas? 3. Haverá vantagens na aplicação clínica do índice hepático de ferro em relação à CHF? 4. Serão os valores de corte usados actualmente para a ferritina, saturação da transferrina e CHF por RM apropriados para seleccionar os doentes que vão realizar tratamento por flebotomias? Objectivos O objectivo geral deste trabalho passa pela obtenção de alguma evidência científica que auxilie os clínicos a tomar decisões relativamente ao tratamento de sobrecargas de ferro adquiridas não-transfusionais/não-eritropoéticas, sendo estas fundamentalmente causadas pela esteatose hepática (alcoólica e não-alcoólica). Os objectivos específicos centram-se na resposta às questões acima referida e são os seguintes: RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 21 1. Validar o método de RM na previsão da sobrecarga de ferro relacionada com sobrecargas de ferro adquiridas não-transfusionais/não-eritropoéticas, através da comparação de doentes com HH (homozigóticos C282Y) e doentes com este tipo de sobrecargas de ferro (Questão 1 e 2); 2. Procurar valores de corte analíticos para a ferritina sérica e saturação da transferrina preditivos de sobrecargas de ferro adquiridas não-transfusionais/nãoeritropoéticas que indiquem a realização de RM para cálculo da CHF (Questão 3 e 4); 3. Estabelecer grupos de risco para sobrecargas de ferro adquiridas nãotransfusionais/não-eritropoéticas baseados no cálculo da CHF por RM possibilitando a estratificação de indivíduos e o tratamento apenas dos de alto risco (Questão 3 e 4). RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 22 Intervenientes Instituições, Departamentos e Serviços Universidade do Porto (UP); Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS). Centro Hospitalar do Porto (CHP); Hospital de Santo António (HSA); Departamento de Medicina (DM); Serviço de Hematologia Clínica (SHC); Consulta de Hemocromatose (CH). Equipa de investigação Constituição Aluno Bruno Loureiro: Aluno da Disciplina de Iniciação à Investigação Clínica (DIIC) do Curso de Mestrado Integrado em Medicina (MIM) do ICBAS/UP. Orientadores do projecto Graça Porto: Médica, Chefe de serviço do departamento de Imunohemoterapia do CHP, Professora catedrática convidada ICBAS (Orientador). José Fraga: Médico, Chefe de serviço do departamento de Gastrenterologia do CHVNG/E (Co-orientador). Supervisor da DIIC Margarida Lima: Médica, Imunohemoterapeuta, Assistente Hospitalar Graduada, SHC do HSA/CHP; Professora Auxiliar Convidada do ICBAS/UP; Regente da DIIC. Funções e responsabilidades 1. A concepção e elaboração da proposta e a execução do projecto são da responsabilidade do Aluno; 2. Os Orientadores acompanharão o aluno na elaboração de proposta, na execução do projecto e na análise e interpretação dos resultados; 3. A Regente da DIIC supervisionará todas as fases do projecto, desde a sua concepção até à apresentação dos resultados, passando pela sua execução e análise/interpretação dos dados; 4. Os restantes investigadores colaborarão em aspectos específicos do projecto, conforme especificado adiante. Tempo dedicado ao projecto Nome e apelido Função % Tempo Nº meses Pessoas* Mês Bruno Loureiro Aluno 10% 22 2,20 Graça Porto Orientador 2,5% 22 0,55 José Fraga Co-orientador 2,5% 22 0,55 Margarida Lima Supervisor 2,5% 22 0,55 Total 3,85 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 23 Metodologia Critérios de revisão da literatura A revisão bibliográfica que enquadra este projecto foi realizada com o apoio das ferramentas electrónicas PubMed, B-On e Google Académico. O motor de busca usado foi o Google. As palavras-chave escolhidas para a pesquisa bibliográfica foram: iron metabolism; iron toxicity; iron overload; hereditary hemochromatosis; secondary hemochromatosis; hepatic iron concentration; hepatic steatosis; Non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD; alcoholic liver disease. Foram usados fundamentalmente artigos de revisão publicados nos últimos 10 anos, escritos em língua inglesa. Para além da pesquisa informática foram-me facultados artigos pela Dra. Graça Porto. Desenho do estudo Este estudo será realizado em Portugal e unicamente no Centro Hospitalar do Porto (nacional, unicêntrico). Consiste na análise de dados provenientes de registos hospitalares referentes a doentes da consulta de Hemocromatose do serviço de hematologia clínica no sentido de obter uma conclusão estatisticamente significativa, sendo por isso um estudo analítico. Tem o objectivo de auxiliar na tomada de decisões clínicas, caindo no âmbito da investigação aplicada. Universo, população e amostra Universo Serão obtidas duas amostras independentes, pelo que cada uma diz respeito a um universo diferente. O primeiro corresponde aos doentes adultos com sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/não-eritropoética, já o segundo engloba os doentes adultos com hemocromatose hereditária homozigóticos C282Y. População Tendo em conta a obtenção de duas amostras independentes, duas populações estão em causa: doentes adultos com sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/nãoeritropoética que foram ou são actualmente seguidos na Consulta de Hematologia do CHP e doentes adultos com hemocromatose hereditária por homozigotia C282Y que foram ou são actualmente seguidos na Consulta de Hematologia do CHP. Amostra Método de amostragem para ambas as amostras: selecção não aleatória (por conveniência) a partir de uma base de trabalho. Serão introduzidos em cada amostra todos os doentes com hemocromatose hereditária por homozigotia C282Y ou sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/não-eritropoética que se enquadrem nos critérios de elegibilidade. Seleção dos participantes Para estudar a validade do método de determinação da CHF por RM em doentes com sobrecargas de ferro adquiridas não-transfusionais/não-eritropoéticas, serão incluídos todos RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 24 os doentes da consulta de hematologia clínica do CHP submetidos a estudo de sobrecarga de ferro por RM e posteriormente a flebotomias periódicas com determinação da quantidade total de ferro em excesso no organismo. Os doentes serão distribuídos por dois grupos de acordo com o seu diagnóstico: hemocromatose hereditária (homozigóticos C282Y) ou sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/não-eritropoética. Para verificar se o algoritmo usado na determinação da CHF através de várias ponderações de RM é o que melhor prediz o grau de sobrecarga de ferro serão seleccionados todos os doentes que realizaram a RM no Serviço de Radiologia do CHP, com excepção dos casos cujo acesso às imagens seja impossível. Critérios de elegibilidade Critérios de inclusão Doentes com sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/não-eritropoética: 1. Ser/Ter sido doente da Consulta de Hematologia do CHP, mais especificamente da Consulta de Hemocromatose; 2. Ter idade superior a 18 anos; 3. Ter sido diagnosticado com esteatose hepática por biópsia/ecografia; 4. Ter sido diagnosticado com NASH por biópsia hepática; 5. Ter sido diagnosticado com síndrome metabólica; 6. Ter realizado doseamento da CHF por RM e posteriormente tratamento intensivo por flebotomias periódicas com cálculo da quantidade de ferro removida. Doentes com hemocromatose hereditária: 1. Ser/ter sido doente da Consulta de Hematologia do CHP, mais especificamente da Consulta de Hemocromatose; 2. Ter idade superior a 18 anos; 3. Ter sido diagnosticado com hemocromatose hereditária por homozigotia C282Y através de teste genético; 4. Ter realizado doseamento da CHF por RM e posteriormente tratamento intensivo por flebotomias periódicas com cálculo da quantidade de ferro removida. Critérios de exclusão Doentes com sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/não-eritropoética: 1. Ser portador de genótipo associado a hemocromatose hereditária HFE (homozigotia C282Y) ou não-HFE; 2. Ter sido diagnosticado com sobrecarga de ferro adquirida de causa transfusional ou eritropoiética. Doentes com hemocromatose hereditária: 1. Ter sido diagnosticado com sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/nãoeritropoética ou qualquer outra causa de HA. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 25     1000 )(3)(º)/(34 diasDuraçãomlVolumesFlebotomiaNdLgaHemoglobin TBIS   Material e Métodos De acordo com os critérios de elegibilidade descritos anteriormente, serão estabelecidas duas amostras independentes: doentes com hemocromatose hereditária (C282Y) e doentes com sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/não-eritropoiética. Todos os dados envolvidos neste estudo serão devidamente anonimizados. Primeira fase Cada amostra será estudada independentemente. As variáveis de destaque são a CHF calculada por RM (µmol/g) e a quantidade total de ferro em excesso no organismo (TBIS) obtida após o tratamento intensivo com flebotomias periódicas até a estabilização da ferritina sérica por volta dos 50µg/L. O cálculo desta última variável depende da hemoglobina média, volume de sangue removido, número de flebotomias e duração do tratamento de acordo com a seguinte fórmula: Será estudada a relação entre estas duas variáveis por regressão linear: em ambas as amostras será analisado o coeficiente de correlação (r) e o coeficiente de determinação (R2). O IHF será também alvo de análise nesta fase: a sua distribuição será correlacionada com o TBIS no sentido de apurar diferenças relativamente ao uso isolado da CHF por RM. Outras variáveis serão avaliadas por regressão linear: dados relativos ao doseamento da ferritina e saturação da transferrina serão também cruzados com o TBIS para avaliar a presença de uma correlação. Posteriormente, os resultados obtidos da análise independente das amostras serão comparados com o objectivo de estabelecer diferenças ou semelhanças no perfil clinicoanalítico dos doentes com hemocromatose hereditária e com sobrecarga de ferro adquirida não-transfusional/não-eritropoiética. Esta tarefa passará pela comparação dos coeficientes de correlação e coeficientes de determinação das duas amostras. Tabela 3: Testes de diagnóstico e respectivos valores de referência usados para a construção de tabelas de contingência. Saturação da transferrina <62/59* % - ausência de sobrecarga de ferro ≥62/59* % - sobrecarga de ferro Concentração sérica de ferritina <483/387* µg/L – ausência de sobrecarga de ferro ≥483/387* µg/L – sobrecarga de ferro CHF por RM ≤36 µmol/g – ausência de sobrecarga de ferro; 36-80 µmol/g – sobrecarga moderada de ferro; ≥80 µmol/g – sobrecarga severa de ferro. TBIS <2 g – ausência de sobrecarga de ferro; 2-4 g – sobrecarga moderada de ferro; ≥4 g – sobrecarga severa de ferro. *Valor de referência no homem/valor de referência na mulher RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 32 Glossário Abreviaturas ALD, Alcoholic Liver Disease. AP, Ângulo de Pulso. AUC, Area Under the Curve. CHF, Concentração Hepática de Ferro. DP, Densidade Protónica. GRE, Gradiente de Eco. HH, Hemocromatose Hereditária. HA, hemocromatose Adquirida. IHF, Índice Hepático de Ferro. MHC, Major Histocompatibility Complex. NAFLD, Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. NASH, Non-Alcoholic Steatohepatitis. RM, Ressonância Magnética. ROC, Receiver-Operating Characteristics. TBIS, Total Body Iron Stores. TE, Tempo de Eco. Tf, Transferrina. TR, Tempo de Repetição. VPN, Valor Preditivo Negativo. VPP, Valor Preditivo Positivo. Siglas e acrónimos CH, Consulta de Hemocromatose. CHP, Centro Hospitalar do Porto. CHVNG/E, Centro Hospitalar de Vila Nova de Gaia/Espinho. DIIC, Disciplina de Iniciação à Investigação Clínica. HSA, Hospital de Santo António. IBMC, Instituto de Biologia Molecular e Celular. ICBAS, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar. JIIC, Jornadas de Iniciação à Investigação Clínica. MIM, Mestrado Integrado em Medicina. SHC, Serviço de Hematologia Clínica. UP, Universidade do Porto. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 33 RELATÓRIO DE EXECUÇÃO RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 34 Execução do Projecto Metodologia Para a análise descritiva da amostra foram usados parâmetros estatísticos específicos. Para as variáveis contínuas foram determinados média, mediana, desvio padrão, mínimo, máximo e quartis (percentil 25, 50 e 75). As variáveis discretas foram caracterizadas unicamente pela sua distribuição de frequências. A análise inferencial da amostra baseou-se na comparação de distribuições com recurso a testes estatísticos, estudo de correlações e obtenção de rectas por regressão linear (representadas nos gráficos) e determinação do desempenho de testes diagnósticos através de curvas receiver operating characteristic (ROC). Para comparação de médias entre variáveis independentes com distribuição normal foi usado o teste t. Para comparar medianas entre variáveis independentes com distribuição assimétrica (não normal) foi usado o teste de Mann-Whitney (M-W). A determinação da normalidade de uma distribuição foi realizada com recurso ao teste de Kolmogorov–Smirnov (K-S). As variáveis categóricas foram estudadas através do teste qui-quadrado (QQ). O cutoff de significância estatística usado nos valores de prova (p) foi de 0,05. A revisão das ressonâncias magnéticas foi possível através do “sistema de apoio ao médico” (SAM), programa informático do CHP onde é possível visualizar e manipular as imagens de RM. Para os casos sem dados no SAM foi necessário o recurso às películas arquivadas no HGSA, de onde foram extraídos os parâmetros de interesse. Através das intensidades de sinal obtidas das várias sequências de RM foram calculadas as CHF pelo método de Gandon et al [31], através do recurso ao endereço electrónico que o faz automaticamente [33], e também pelo método descrito por Alustiza et al [26] que usa apenas os dados de duas sequências (DP e T2) através da seguinte fórmula: Relativamente às correlações, uma vez que a massa de ferro removida após o tratamento intensivo é um indicador objectivo do grau de sobrecarga de ferro, o TBIS foi usado como variável independente e correlacionado com todos os outros parâmetros (ferritina, saturação de transferrina, CHF por RM e IHF). De acordo com o valor de R (coeficiente de correlação), a correlação foi classificada como nula (R=0), fraca (0<R<0.3), regular (0.3<R<0.6), forte (0.6<R<0.9), muito forte (0.9<R<1) ou plena (R=1). A significância estatística das correlações obtidas foi determinada pelo teste de Pearson (P). O cutoff de significância estatística usado nos valores de prova foi de 0,05. Foram construídas tabelas de contingência para os vários testes de diagnóstico (CHF por RM, IHF, ferritina e saturação de transferrina) tendo como indicador de referência o TBIS: os casos que removeram duas ou mais gramas de ferro são considerados doentes. Os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) foram determinados para cada método diagnóstico. A construção de curvas ROC permitiu estudar a capacidade dos testes em distinguir indivíduos com e sem sobrecarga de ferro. Os parâmetros estatísticos avaliados foram a área sob a curva (do inglês area under the curve - AUC) e o respectivo valor de prova. O cutoff de significância estatística mais uma vez usado foi de 0,05. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 35 Resultados Análise descritiva da Amostra A amostra obtida é constituída por um total de 99 indivíduos. A sua caracterização baseou-se nas variáveis idade ao diagnóstico, sexo, forma de apresentação (o que motivou o estudo e seguimento em consulta externa), genótipo HFE, TBIS, CHF por RM, ferritina sérica ao diagnóstico, saturação de transferrina ao diagnóstico e IHF. Não foi possível obter os valores de ferritina e saturação de transferrina de um indivíduo e o genótipo de dois casos é indeterminado. A amostra foi também classificada quanto à natureza da sobrecarga de ferro em hereditária (HH) ou adquirida (HA), de acordo com o genótipo HFE. O grupo da hemocromatose hereditária é constituído por 46 indivíduos, enquanto 53 casos foram classificados com sobrecarga adquirida de ferro. Cada grupo formado foi também alvo de caracterização pelas mesmas variáveis descritas acima. Quanto à revisão das ressonâncias magnéticas apenas foi possível recalcular a CHF de 36 casos (do total de 99), onde 13 indivíduos revelam hemocromatose hereditária e os restantes 23 apresentam sobrecarga adquirida de ferro. Idade ao diagnóstico A média de idade ao diagnóstico foi de aproximadamente 47 anos (tabela 1). O caso mais jovem tem 22 anos e a idade mais avançada é de 76 anos. A representação gráfica das idades parece seguir uma distribuição normal (gráfico 1). A maioria dos indivíduos tem idade compreendida entre os 41 e 60 anos. Na subamostra com hemocromatose hereditária a média da idade ao diagnóstico é cerca de 45 anos, inferior ao que se verifica no grupo com hemocromatose adquirida onde a média de idades ronda os 48 anos (tabela 2 e 3). Tabela 1: Distribuição das variáveis idade, ferritina, saturação da transferrina, CHF por RM, IHF e TBIS na amostra total. Idade ao diagnóstico Ferritina Saturação da Transferrina CHF por RM IHF TBIS N 99 98 98 99 99 99 Média 46,71 1534,13 66,83 183,23 4,11 4,53 Mediana 46,00 916,00 71,50 180,00 3,57 2,99 Desvio Padrão 11,88 1566,63 23,82 87,92 2,11 3,75 Mínimo 22,00 67,00 14,00 45,00 ,90 ,59 Máximo 76,00 7685,00 100,00 350,00 8,57 18,10 Percentis 25 38,00 610,75 50,00 100,00 2,30 1,90 50 46,00 916,00 71,50 180,00 3,57 2,99 75 56,00 1958,75 87,00 280,00 5,45 5,60 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 36 Tabela 2: Distribuição das variáveis idade, ferritina, saturação da transferrina, CHF por RM, IHF e TBIS nos indivíduos com hemocromatose hereditária. Idade ao diagnóstico Ferritina Saturação da Transferrina CHF por RM IHF TBIS N 46 46 46 46 46 46 Média 45,20 1993,63 84,09 246,96 5,75 6,51 Mediana 45,00 1215,00 86,50 280,00 6,11 5,50 Desvio Padrão 11,84 1930,81 12,21 70,36 1,81 4,57 Mínimo 22,00 67,00 55,00 90,00 1,88 1,10 Máximo 70,00 7685,00 100,00 350,00 8,57 18,10 Percentis 25 36,75 351,00 74,00 200,00 4,53 2,40 50 45,00 1215,00 86,50 280,00 6,11 5,50 75 56,00 3270,75 93,75 300,00 7,23 10,13 Tabela 3: Distribuição das variáveis idade, ferritina, saturação da transferrina, CHF por RM, IHF e TBIS nos indivíduos com hemocromatose adquirida. Idade ao diagnóstico Ferritina Saturação da Transferrina CHF por RM IHF TBIS N 53 52 52 53 53 53 Média 48,02 1127,65 51,56 127,92 2,69 2,80 Mediana 49,00 857,50 51,50 110,00 2,44 2,60 Desvio Padrão 11,87 1009,79 21,01 59,79 1,06 1,39 Mínimo 25,00 117,00 14,00 45,00 0,90 0,59 Máximo 76,00 5745,00 100,00 300,00 5,45 7,60 Percentis 25 38,50 634,00 33,00 82,50 1,83 1,80 50 49,00 857,50 51,50 110,00 2,44 2,60 75 56,00 1245,25 64,75 165,00 3,39 3,25 Gráfico 1: Distribuição das idades ao diagnóstico. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 37 Sexo A maioria dos indivíduos da amostra é do sexo masculino, numa percentagem de 77.8% (tabela 4). Esta diferença é mais acentuada no grupo da hemocromatose adquirida onde 92.5% dos casos são homens. Tabela 4: Distribuição do sexo na amostra total e por tipo de hemocromatose (HH - Hemocromatose hereditária; HA - Hemocromatose Adquirida). Amostra total HH HA N % N % N % Masculino 77 77,8 28 60,9 39 92,5 Feminino 22 22,2 18 39,1 4 7,5 Total 99 100 46 100 53 100 Forma de apresentação A apresentação refere-se ao primeiro sinal de sobrecarga de ferro objectivado nos doentes. Para além do desenvolvimento de sinais e sintomas de hemocromatose, a apresentação pode também corresponder a um resultado analítico anormal. Uma situação específica, e por isso avaliada separadamente, é a identificação de casos no contexto de rastreio familiar. A maioria dos indivíduos da amostra foi identificada devido a níveis séricos anormais de ferritina (36.4%) (tabela 5, gráfico 2). Elevação da ferritina associada a anormalidade na saturação da transferrina também é frequente (31.3%). 18.2% Dos casos foi identificado por rastreio familiar e apenas 13.1% foi diagnosticado por manifestar sinais e sintomas de hemocromatose. Nas sobrecargas de ferro hereditárias, os sinais e sintomas de hemocromatose foram uma forma de apresentação frequente (26.1%), bem como anormalidades da ferritina e saturação de transferrina (34.8%) (tabela 5, gráfico 3). A maioria dos doentes foi identificada através de rastreio familiar (37%), como é espectável. Já os indivíduos com hemocromatose adquirida manifestaram a sua patologia maioritariamente através da elevação isolada da concentração de ferritina (68%). A segunda forma de apresentação mais frequente foi a elevação concomitante da saturação de transferrina e ferritina (28.3%), sendo as restantes formas menos comuns. Assim sendo, a primeira manifestação da hemocromatose parece depender da sua natureza. Tabela 5: Distribuição da apresentação clínica na amostra total e por tipo de hemocromatose. Amostra total HH HA N % N % N % Manifestações clínicas de hemocromatose 13 13,1 12 26,1 1 1,9 Saturação da transferrina e ferritina 31 31,3 16 34,8 15 28,3 Ferritina isolada 37 37,4 1 2,2 36 67,9 Rastreio Familiar 18 18,2 17 37,0 1 1,9 Total 99 100,0 46 100,0 53 100,0 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 38 Gráfico 2: Distribuição da forma de apresentação na amostra total. Gráfico 3: Distribuição da forma de apresentação por tipo de hemocromatose. Genótipo HFE A genotipagem HFE mostra que 46.5% dos indivíduos da amostra apresentam homozigotia para o alelo C282Y (hemocromatose hereditária tipo 1). Este alelo surge em heterozigotia em 18.2% da amostra e está ausente em 33.3%. Como já foi referido, 2 p<0.001 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 39 indivíduos não foram alvo de genotipagem e por isso cerca de 2% da amostra tem genótipo indeterminado. A categorização dos indivíduos da amostra é baseada no seu genótipo HFE. Indivíduos homozigóticos para a mutação C282Y são incluídos no grupo da hemocromatose hereditária enquanto os restantes (heterozigóticos para a mesma mutação ou com genótipo selvagem) são classificados como tendo hemocromatose adquirida (gráfico 4). Gráfico 4: Distribuição da amostra por tipo de hemocromatose com base no genótipo HFE. Ferritina sérica ao diagnóstico A média da ferritina sérica é de 1534.13 µg/L, com um desvio padrão de 1566.63 µg/L. A avaliação dos quartis demonstrou que 50% dos indivíduos apresenta valores entre 67 µg/L (mínimo) e 916 µg/L. A maioria dos casos (75%) mostra valores de ferritina até 1958.75 µg/L. Os restantes casos apresentam valores mais elevados, e apenas 9 doentes tem níveis de ferritina superiores a 4000 µg/L (máximo de 7685 µg/L) (tabela 1). A aparente distribuição assimétrica desta variável foi convertida numa distribuição normal por conversão logarítmica (gráfico 5), possibilitando a realização de testes estatísticos por comparação de médias. No âmbito deste estudo, valores iguais ou superiores a 387 e 483 µg/L são indicativos de sobrecarga de ferro em mulheres e homens, respectivamente. Com estes pontos de corte verificou-se que 89.5% dos homens e 50% das mulheres apresenta hemocromatose. A distribuição da ferritina sérica de acordo com o tipo de hemocromatose revelou uma média superior na hemocromatose hereditária (1993.63 µg/L). 75% Dos doentes com hemocromatose adquirida tem valores de ferritina até 1245.25 µg/L, enquanto a mesma percentagem de indivíduos com sobrecarga hereditária de ferro atinge valores até 3270.75 µg/L (tabelas 2 e 3, gráfico 6). RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 40 Gráfico 5: Representação gráfica da ferritina após transformação logarítmica. Gráfico 6: Distribuição da ferritina por tipo de hemocromatose. Saturação da transferrina ao diagnóstico A média da saturação de transferrina sérica é de 66.83%, com um desvio padrão de 23.82%. A avaliação dos quartis demonstrou que 75% dos indivíduos apresenta valores entre 50% e 100%. Apenas um quarto dos casos demonstrou valores de saturação da transferrina inferiores a 50% (mínimo de 14%) (tabela 1). No âmbito deste estudo, valores iguais ou superiores a 59 e 61% são indicativos de sobrecarga de ferro em mulheres e homens, respectivamente. Usando como valor de corte p=0.181 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 41 uma saturação de transferrina de 60% para ambos os sexos, um total de 64.3% da amostra apresenta hemocromatose. O grupo com hemocromatose hereditária tem uma saturação de transferrina média de 84%, muito superior aos 51,6% vistos nos indivíduos com hemocromatose adquirida. Para além disso, a saturação mínima é 55% na HH e apenas 14% na HA (tabelas 2 e 3, gráfico 7). Gráfico 7: Distribuição da saturação de transferrina por tipo de hemocromatose. CHF por RM Relativamente à concentração hepática de ferro determinada por ressonância magnética, a média da amostra é de 183.23 µmol/g, com um desvio padrão de 87.92 µmol/g. A avaliação dos quartis revelou que 75% dos doentes apresenta valores entre 45 (mínimo) e 280 µmol/g. Os restantes 25% apresentam valores superiores até um máximo de 350 µmol/g, o limite de detecção da RM (tabela 1). O valor de corte usado na prática clínica estabelece que valores iguais ou superiores a 80 µmol/g são indicativos de sobrecarga severa de ferro. Sendo assim 92% dos casos da amostra apresentam hemocromatose severa. Não existe nenhum indivíduo com CHF normal uma vez que o valor de corte mínimo é de 36 µmol/g. O grupo com hemocromatose hereditária revela uma CHF média de 246.96 µmol/g, sendo que 75% da amostra tem valores entre 90 µmol/g (mínimo) e 300 µmol/g. Na amostra com sobrecarga adquirida de ferro, a média é 127.92 µmol/g e 75% dos indivíduos apresenta CHF compreendida entre 45 µmol/g (mínimo) e 165 µmol/g (tabelas 2 e 3, gráfico 8). p<0.001 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 48 Os valores dos coeficientes de correlação, determinação bem como os valores de prova são apresentados discriminadamente na tabela 8. O principal objectivo da presente tese é o estudo da relação entre a CHF por RM e o TBIS, tendo sido demonstrada uma correlação positiva forte (R=0.706) e significativa (teste P: p<0.001) entre estas variáveis (gráfico 14). O coeficiente de determinação (R2) revela que aproximadamente 50% da variabilidade demonstrada no parâmetro dependente (CHF por RM) é explicada pela variável independente (TBIS). Quando são excluídos os casos com TBIS igual ou superior a 12 gramas, para os quais seria de esperar uma CHF superior a 300 µmol/g, a correlação torna-se ligeiramente mais forte (R=0.712). Esta análise tem como objectivo eliminar um factor de viés introduzido por limitações da técnica de RM, como será explicado na secção “discussão”. Gráfico 14: Correlação e regressão linear entre a CHF por RM e o TBIS. A correlação entre a ferritina ao diagnóstico e o TBIS demonstrou ser forte (R=0.720), positiva e com significância estatística (teste P: p<0.001) (gráfico 15). Cerca de 52% da variabilidade da ferritina é explicada pelo TBIS, uma percentagem considerável para uma única variável. A saturação da transferrina revelou uma correlação mais fraca (R=0.537) mas também positiva e estatisticamente significativa (teste P: p<0,001). Quanto ao IHF, o estudo da sua relação com o TBIS também provou uma associação positiva regular (R=0.524). Ao eliminar da análise os casos com TBIS igual ou superior a 12 gramas a correlação torna-se ligeiramente mais forte (R=0.574), com 33% da variabilidade no IHF explicada pelo TBIS. R=0.706 R2=0.499 p<0.001 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 49 Gráfico 15: Correlação e regressão linear entre a ferritina e o TBIS. Comparação de correlações: hemocromatose hereditária e secundária Mais uma vez, todos os parâmetros estatísticos das correlações para cada tipo de hemocromatose são apresentadas na tabela 8. No grupo de indivíduos com hemocromatose hereditária verificou-se uma correlação positiva estatisticamente significativa entre o TBIS e as seguintes variáveis: CHF por RM (forte, R=0.699), ferritina sérica (forte, R=0.756) e saturação da transferrina (regular, R=0.453) (gráficos 16 e 17). No estudo da correlação CHF-TBIS foram também excluídos os casos com TBIS igual ou superior a 12 gramas, tendo-se obtido a correlação mais forte entre estes dois parâmetros (R=0.740), onde perto de 55% da variação na CHF é explicada pelo TBIS. A correlação com o IHF não se mostrou estatisticamente significativa (teste P: p=0.073), sugerindo que este índice não é apropriado para avaliar o grau de sobrecarga de ferro na hemocromatose hereditária. Apenas se forem excluídos os casos com TBIS superior a 12 gramas é possível obter uma correlação estatisticamente significativa (R=0.402; teste P: p=0.009). Já no grupo de indivíduos com hemocromatose adquirida as correlações com significância estatística estabeleceram-se entre o TBIS e CHF por RM (regular, R=0.426), ferritina sérica (regular, R=0.465), saturação da transferrina (regular, R=0.395) e, ao contrário do grupo com hemocromatose hereditária, com o IHF (regular, R=0.369) (gráficos 18 e 19). As correlações com as variáveis CHF por RM, ferritina sérica e saturação da transferrina revelaram ser mais fortes no grupo da hemocromatose hereditária. Neste grupo de indivíduos 49% da variabilidade da CHF, 57% da variabilidade da ferritina e 21% da variação na saturação da transferrina são explicadas pelo TBIS. O único parâmetro que mostrou melhor correlação com o TBIS no grupo da hemocromatose adquirida foi o IHF. No entanto, removendo o factor de enviesamento da RM (TBIS=>12 g), a correlação entre o IHF e o TBIS torna-se superior na hemocromatose hereditária (R=0.402). R=0.720 R2=0.519 p<0.001 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 50 Gráfico 16: Correlação e regressão linear entre a CHF por RM e o TBIS na hemocromatose hereditária. Gráfico 17: Correlação e regressão linear entre a ferritina e o TBIS na hemocromatose hereditária. R=0.699 R2=0.488 p<0.001 R=0.756 R2=0.572 p<0.001 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 51 Gráfico 18: Correlação e regressão linear entre a CHF por RM e o TBIS na hemocromatose adquirida. Gráfico 19: Correlação e regressão linear entre a ferritina e o TBIS na hemocromatose adquirida. Correlações e regressão linear: revisão das ressonâncias magnéticas (RMs) Os métodos propostos por Gandon et al e Alustiza et al para calcular a CHF foram também correlacionados com o TBIS para tentar apurar qual a técnica que oferece melhor correlação com o ferro corporal total. No estudo da amostra total a correlação mostrou-se mais forte no método de Alustiza et al, onde o coeficiente de correlação e determinação foram 0.828 e 0.686, respectivamente. Na CHF determinada pelo método de Gandon et al estes coeficientes revelaram-se inferiores (R=0.780 e R2=0.608) (tabela 9, gráficos 20 e 21). R=0.426 R2=0.181 p=0.001 R=0.465 R2=0.216 p=0.001 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 52 Gráfico 20: Correlação e regressão linear entre a CHF (Alustiza et al) e o TBIS (amostra total). Gráfico 21: Correlação e regressão linear entre a CHF (Gandon et al) e o TBIS (amostra total). Estudando a amostra por tipo de sobrecarga de ferro, as correlações entre a CHF calculada pelo método de Alustiza et al e o TBIS são estatisticamente significativas para a hemocromatose hereditária e adquirida, mas a maior força de correlação é vista na primeira (R=0.856/R2=0.733 e R=0.730/R2=0.532, respectivamente). O método de Gandon et al revelou intensidades de correlação um pouco inferiores às verificadas no método de Alustiza et al (R=0.829/R2=0.688 na hemocromatose hereditária e R=0.663/R2=0.439 na hemocromatose adquirida), embora também estatisticamente significativas. R=0.828 R2=0.686 p<0.001 R=0.780 R2=0.608 p<0.001 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 53 Tabela 9: Coeficiente de correlação, determinação e valor de prova das correlações entre a CHF determinada pelas diferentes técnicas (Gandon et al e Alustiza et al) com o TBIS na amostra total e por tipo de hemocromatose. Amostra total HH HA R R2 p R R2 p R R2 p CHF por RM (Gandon et al) 0,780 0,608 0,000 0.829 0.688 0,000 0.663 0.439 0,001 CHF por RM (Alustiza et al) 0,828 0,686 0,000 0.856 0.733 0.000 0.730 0.532 0,000 Desempenho dos testes de diagnóstico Tabelas de contingência Tabela 10: Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo para cada método diagnóstico na amostra total e por tipo de hemocromatose (%). A - amostra não tem saudáveis (TBIS<2 g); B - amostra pequena demais para análise; C – amostra não tem testes negativos (CHF<80 µmol/g). Amostra total HH HA S E VPP VPN S E VPP VPN S E VPP VPN Ferritina (H) 91,9 21,4 83,8 37,5 A A A A 91,2 21,4 73,8 50 Ferritina (M) 72,7 72,7 72,7 72,7 70 87,5 87,5 70 B B B B SatTf 72,6 60 84,1 42,9 100 12,5 84,4 100 42,9 82,4 83,3 41,2 CHF por RM 95,9 20 78 62,5 C C C C 91,7 29,3 73,3 62,5 IHF 87,8 28 78,3 43,8 97,4 0 82,2 0 77,8 41,2 73,7 46,7 Os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) para cada método diagnóstico são apresentados na tabela 10. Os testes com maior sensibilidade foram a CHF por RM (95.9%), ferritina sérica (91.9% para os homens) e IHF (87,8%). A saturação da transferrina (72.6%) e a ferritina no sexo feminino (72.7%) foram os testes menos sensíveis. A ferritina no sexo feminino teve a maior especificidade (72.7%), seguida da saturação da transferrina (60%). A CHF por RM e o IHF, bem como a ferritina no sexo masculino, demonstraram especificidades inferiores a 30%. O valor preditivo positivo revelou-se semelhante em todos os métodos, com 83.8% e 72.7% para a ferritina (homens e mulheres, respectivamente), 84.1% para a saturação de transferrina, 78% para a CHF por RM e 78.3% no IHF. Também o valor preditivo negativo se mostrou sub-óptimo em todos os testes. As percentagens mais elevadas foram observadas no doseamento de ferritina (72.7%, no sexo feminino) e na CHF por RM (62.5%). Curvas ROC Os parâmetros estatísticos relativos às curvas ROC (área sob a curva (AUC) e valor de prova) estão descritos na tabela 11. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 54 Todos os exames complementares estudados revelaram ter bom desempenho, isto é, todas as curvas mostraram AUC superior a 0.5 com 95% de probabilidade estatística. O melhor desempenho foi constatado na ferritina sérica (AUC=0.81), independentemente do sexo (gráfico 22). Quando estudada por sexo a ferritina demonstrou ser mais eficiente nas mulheres do que nos homens (AUC=0.83 e 0.73, respectivamente). Os restantes exames com desempenho satisfatório (AUC=>0.7) foram a saturação de transferrina (AUC=0.74) e o IHF (AUC=0.70). A CHF por RM revelou ser o teste com pior desempenho, embora esteja muito perto do limiar satisfatório (AUC=0.68) (gráfico 23). A exclusão dos casos com grande sobrecarga de ferro (TBIS=>12g) demonstrou não ter impacto no desempenho da CHF e IHF. Mais uma vez, esta análise pretende tentar eliminar um possível viés relacionado com limitações da técnica de RM (ver secção “discussão”). Tabela 11: Áreas sob a curva (AUC) e valores de prova relativos ao desempenho dos testes de diagnóstico na amostra total e por tipo de hemocromatose. Na variável CHF por RM com exclusão dos casos saudáveis (TBIS<2g) são considerados doentes apenas os que demonstraram TBIS=>4g. Amostra total HH HA AUC p AUC p AUC p Ferritina (homens) 0,725 0,009 - - - - Ferritina (mulheres) 0,826 0,009 - - - - Ferritina (ambos os sexos) 0,806 0,000 0,941 0,000 0,697 0,022 SatTf 0,741 0,000 0,722 0,050 0,757 0,003 CHF por RM 0,683 0,006 0,780 0,014 0,611 0,195 CHF por RM (exclusão: TBIS=>4g) 0,483 0,820 0,381 0,399 0,571 0,426 CHF por RM (exclusão: TBIS<2g) 0,926 0,000 0,918 0,000 0,783 0,022 IHF 0,700 0,003 0,730 0,042 0,678 0,038 Gráfico 22: Curva ROC relativa ao desempenho da ferritina sérica na amostra total. AUC=0.806 p<0.001 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 55 Gráfico 23: Curva ROC relativa ao desempenho da CHF por RM na amostra total. Para determinar especificamente qual o desempenho da RM na distinção entre indivíduos saudáveis e doentes com sobrecarga ligeira/intermédia de ferro foram analisados apenas os casos com TBIS inferior a 4 gramas (ilustração 1). Neste contexto a RM demonstrou ter mau desempenho na amostra total (p=0.820) (gráfico 24). Se pelo contrário for estudado o desempenho da RM em distinguir sobrecargas de ferro severas de sobrecargas ligeiras/intermédias, considerando como indivíduo “doente” aquele que removeu 4 ou mais gramas de ferro após tratamento intensivo, obtém-se um valor de AUC estatisticamente significativo e satisfatório (=0.926) (gráfico 25). Nesta análise apenas os indivíduos com sobrecarga de ferro (TBIS=>2g) foram considerados (ilustração 2). Ilustração 1: Categorização da amostra por grau de sobrecarga de ferro e seleção dos casos sem sobrecarga severa de ferro (TBIS<4g). Ilustração 2: Categorização da amostra por grau de sobrecarga de ferro e seleção dos casos não saudáveis (TBIS=>2g). AUC=0.683 p=0.006 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 56 Gráfico 24: Curva ROC relativa ao desempenho da CHF por RM na distinção entre saudável de sobrecarga ligeira/moderada, com exclusão dos casos com sobrecarga de ferro severa (TBIS=>4g) (amostra total). Gráfico 25: Curva ROC relativa ao desempenho da CHF por RM na distinção entre sobrecarga ligeira/moderada de severa, com exclusão dos casos saudáveis (TBIS<2g) (amostra total). Comparação do desempenho dos testes de diagnóstico: HH e HA Tabelas de contingência Os testes com maior sensibilidade na hemocromatose hereditária foram a saturação de transferrina (100%) e o IHF (97.4%). Todos os testes revelaram VPP superior a 80%. O exame mais específico foi a ferritina no sexo feminino (87.5%), sendo importante realçar que o IHF demonstrou especificidade nula. No entanto apenas um indivíduo obteve IHF normal, o AUC=0.483 p=0.820 P = AUC=0.926 p<0.001 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 57 que compromete a interpretação deste achado. A saturação da transferrina obteve VPN de 100%, ou seja, todos os testes negativos (saturação de transferrina < 60%) correspondem a indivíduos que removeram menos de 2 gramas de ferro no tratamento intensivo. Quanto à subamostra com hemocromatose adquirida, os exames complementares mais sensíveis foram a ferritina (homens) (91.2%) e a CHF por RM (91.7%). Também aqui todos os testes revelaram VPP superior a 70%. O teste com maior especificidade foi a saturação da transferrina (82.4%) enquanto a ferritina (homens) mostrou ser o exame menos específico (21%). A saturação de transferrina foi sensível mas pouco específica na hemocromatose hereditária enquanto o contrário se verificou na hemocromatose adquirida. O maior VPN foi demonstrado pela CHF por RM (62.5%), com pequena vantagem sobre os restantes exames complementares. Curvas ROC A avaliação do desempenho da ferritina sérica demonstrou superioridade nos doentes com hemocromatose hereditária (AUC=0.94) relativamente aos indivíduos com hemocromatose adquirida (AUC = 0.70) (gráfico 26). A saturação de transferrina mostrou-se capaz de distinguir indivíduos com sobrecarga de ferro de indivíduos saudáveis apenas no grupo da hemocromatose adquirida (AUC=0.76) (gráfico 27). O desempenho da CHF por RM foi melhor na hemocromatose hereditária (AUC=0.78) já que a AUC não revelou ser estatisticamente diferente de 0.5 na hemocromatose adquirida (gráfico 28). O desempenho do IHF foi bastante semelhante ao uso isolado da CHF por RM (AUC=0.73 para a hemocromatose hereditária). Ao contrário do que se verifica na CHF, o IHF tem um desempenho estatisticamente significativo na hemocromatose adquirida (AUC=0.68; p=0.038), sendo ligeiramente inferior ao desempenho demonstrado nas sobrecargas primárias de ferro. Gráfico 26: Curva ROC relativa ao desempenho da ferritina na hemocromatose hereditária (esquerda) e adquirida (direita). AUC=0.941 p<0.001 P = AUC=0.697 p=0.022 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 64 existem outros parâmetros com melhor desempenho como a saturação de transferrina e ferritina. Para tentar esclarecer onde a RM falha na sua capacidade em classificar indivíduos de acordo com o seu grau de sobrecarga de ferro, o seu desempenho foi avaliado em duas vertentes: capacidade em distinguir casos saudáveis de sobrecargas ligeiras/moderadas de ferro e capacidade em separar sobrecargas de ferro ligeiras/moderadas de severas. A RM demonstrou um desempenho não satisfatório na primeira situação e verificou-se o contrário no segundo cenário. Assim sendo pode concluir-se que este exame complementar atinge o seu máximo potencial quando o objectivo é identificar os casos que irão remover 4 ou mais gramas de ferro (sobrecarga severa de ferro). Pelo contrário o seu valor preditivo é mínimo quando o propósito é realçar as sobrecargas ligeiras/moderadas de ferro (isto é, com TBIS entre 2 e 4 gramas) o que poderá implicar o tratamento inapropriado de indivíduos que removem baixas quantidades de ferro (<2 gramas) e por isso não teriam hemocromatose à priori. Esta característica da RM é demonstrada não só na amostra total mas também nos diferentes tipos de hemocromatose, embora o seu desempenho seja maior na hemocromatose hereditária. Valores de corte na CHF por RM que poderão prever um TBIS igual ou superior a 4 gramas (sobrecarga severa de ferro) são 235 µmol/g (sensibilidade de 86% e especificidade de 90%) para a hemocromatose hereditária e 125 µmol/g (sensibilidade de 86% e especificidade de 65%) na hemocromatose adquirida de causa não-eritropoiética/não-transfusional. No entanto estes valores de corte não distinguem os casos de sobrecarga de ferro dos indivíduos saudáveis. Para garantir que apenas os indivíduos com sobrecarga de ferro realizem RM, onde o seu desempenho é máximo, poderá ser usado um marcador analítico com bom desempenho na identificação destes casos. De acordo com este estudo a ferritina sérica é um bom candidato já que revelou um óptimo desempenho (AUC=0.806) na distinção entre casos que removeram mais ou menos que 2 gramas de ferro após tratamento intensivo. Um bom desempenho foi também confirmado na hemocromatose hereditária (AUC=0.941), embora tenha sido razoável na hemocromatose adquirida não-eritropoiética/não transfusional (AUC=0.697). Os valores de corte mais apropriados são 525 μg/L (87% de sensibilidade e 100% de especificidade) para a hemocromatose hereditária e 922,50 μg/L (54.3% de sensibilidade e 76.5% de especificidade) para as sobrecargas adquiridas de ferro. A baixa sensibilidade no segundo grupo garante maior especificidade, isto é, que apenas os casos com TBIS estimado superior a 2 gramas realizem RM, aumentando a fiabilidade da CHF calculada. Na hemocromatose hereditária poderá também ser usada a saturação de transferrina para tentar seleccionar os casos que removerão mais de 2 gramas de ferro, já que o seu desempenho a este nível foi satisfatório (AUC=0.757). Um valor de corte de 52.5% (60% de sensibilidade e 83% de especificidade) garante melhor desempenho na seleção dos casos ideais para realizar RM. Ambos os parâmetros poderão mesmo ser combinados na tentativa de aumentar a sensibilidade sem perder especificidade. Esta abordagem tem a vantagem de reduzir os casos submetidos a tratamento desnecessário, vantagem mais relevante no contexto de hemocromatose adquirida não-eritropoiética/não-transfusional onde as sobrecargas ligeiras a moderadas não beneficiam necessariamente de tratamento por flebotomias mas sim através de medidas dietéticas e exercício físico. Um estudo recente demonstrou mesmo que um programa de 12 semanas de exercício físico isolado foi capaz de reduzir os níveis de ferritina em 25% [41]. Outra vantagem RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 65 é a redução dos custos hospitalares já que limita a realização de RM apenas aos indivíduos com ferritina e/ou saturação de transferrina igual ou superior aos valores de corte referidos. Segundo a amostra usada neste estudo estima-se que seria poupado um custo total aproximado de 42% na realização de RMs, já que segundo os valores de corte na ferritina apresentados acima apenas 42 casos (em 99) realizariam RM pelo seu risco elevado de sobrecarga severa de ferro. Esta poupança deriva essencialmente do grupo com hemocromatose adquirida, onde perto de 57% dos custos teriam sido poupados. De acordo com a conjuntura económica actual, esta é uma vantagem que assume grande importância. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 66 Conclusões De acordo com as questões e objectivos descritos na proposta de projeto, conclui-se que existe efectivamente uma correlação positiva forte entre a CHF por RM e o ferro corporal toral removido após o tratamento intensivo por flebotomias (TBIS). Se forem removidos os indivíduos com sobrecarga extrema de ferro (TBIS=>12g) a correlação torna-se um pouco mais forte pois é eliminado um provável factor de enviesamento, a limitação na sensibilidade da RM no cálculo da CHF. Esta correlação é bastante mais forte no grupo da hemocromatose hereditária relativamente ao grupo com sobrecarga adquirida de ferro, onde a correlação não é forte mas sim regular. No entanto, a avaliação do desempenho da CHF por RM na identificação de sobrecarga de ferro (TBIS>2g) demonstrou-se sub-óptima e inferior à de outros exames complementares como a ferritina sérica e a saturação da transferrina. A RM revelou desempenho máximo na distinção entre sobrecarga ligeira/moderada e severa de ferro, com valores de corte que rondam os 235µmol/g na hemocromatose hereditária e 125µmol/g na hemocromatose adquirida. Para identificar casos com hemocromatose (TBIS>2g) onde a RM terá desempenho máximo poderão ser usados testes como a ferritina sérica, cujos valores de corte poderiam ser 525µg/L e 922,50µg/L respectivamente. Esta abordagem permite reduzir a iatrogenia pela sua elevada especificidade na seleção dos casos, principalmente nos indivíduos com hemocromatose adquirida não-eritropoiética/nãotransfusional, e também reduzir os custos relacionados com a RM pela sua menor utilização. A revisão das RMs permitiu concluir que o método actualmente usado para determinar a CHF (Gandon et al) não é o mais adequado já que a sua correlação com o TBIS é mais fraca do que a demonstrada pelo método de Alustiza et al. No entanto esta técnica calcula uma CHF em média inferior à calculada pelo método convencional, surgindo necessidade de se estabelecerem novos valores de corte para classificar os graus de sobrecarga de ferro. O tamanho da amostra usada nesta revisão de RMs não possibilita a obtenção de tais valores de corte. Apesar das vantagens do método de Alustiza et al este mantém desempenho inferior na hemocromatose adquirida não-eritropoiética/não-transfusional. Quanto à capacidade em prever o grau de sobrecarga de ferro a ferritina sérica e a CHF por RM são de longe os mais úteis pela sua boa correlação com o TBIS. Esta eficácia é mais relevante na hemocromatose hereditária. A aplicação do IHF não mostrou ser superior ao uso isolado da CHF por RM excepto na hemocromatose adquirida onde, embora a correlação com o TBIS seja inferior à demonstrada pela CHF, este parâmetro revelou um desempenho superior na distinção entre indivíduos com ou sem sobrecarga ferro. Mas, se o objectivo for a separação entre sobrecarga de ferro ligeira/intermédia de severa então o uso isolado da CHF por RM deve ser preferido pelo seu desempenho superior. Os resultados deste estudo não aconselham o uso do IHF em nenhuma situação clínica. O ponto forte comum a todos os métodos complementares foi a sensibilidade e o VPP. Todos os exames complementares revelaram boa sensibilidade (>70%), implicando uma boa capacidade em identificar os indivíduos com excesso de ferro. Também o VPP foi satisfatório já que a maioria dos indivíduos classificados positivamente pelos exames complementares demonstrou hemocromatose após o tratamento intensivo (TBIS>2g). Pelo contrário todos os testes revelaram ser pouco específicos e ter baixo VPN, sugerindo sobretratamento de indivíduos sem hemocromatose (iatrogenia). RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 67 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Camaschella, C. and L. Silvestri, Molecular mechanisms regulating hepcidin revealed by hepcidin disorders. TheScientificWorldJOURNAL, 2011. 11: p. 1357-1366. 2. Papanikolaou, G. and K. Pantopoulos, Iron metabolism and toxicity. Toxicol Appl Pharmacol, 2005. 202(2): p. 199-211. 3. Gkouvatsos, K., G. Papanikolaou, and K. Pantopoulos, Regulation of iron transport and the role of transferrin. Biochim Biophys Acta, 2011. 4. Hentze, M.W., et al., Two to tango: regulation of Mammalian iron metabolism. Cell, 2010. 142(1): p. 24-38. 5. Wang, J. and K. Pantopoulos, Regulation of cellular iron metabolism. 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Oh S, T.K., Warabi E, Shoda J., Exercise Reduces Inflammation and Oxidative Stress in Obesity-Related Liver Diseases. Med Sci Sports Exerc., 2013. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 70 ANEXOS Tabelas relativas à Execução do Projecto Tabela 12: Distribuição da ferritina, saturação da transferrina, CHF por RM e TBIS na hemocromatose adquirida relacionada com álcool. Ferritina Saturação da Transferrina CHF por RM IHF TBIS N 25 25 25 25 25 Média 1441,32 61,64 140,80 2,79 3,21 Mediana 1137,00 63,00 120,00 2,67 3,10 Desvio Padrão 1359,71 20,88 68,57 1,10 1,59 Mínimo 117,00 24,00 45,00 0,90 1,10 Máximo 5745,00 100,00 300,00 5,45 7,60 Percentis 25 658,50 48,50 90,00 2,13 2,08 50 1137,00 63,00 120,00 2,67 3,10 75 1603,50 82,00 180,00 3,39 3,60 Tabela 13: Distribuição da ferritina, saturação da transferrina, CHF por RM e TBIS na hemocromatose adquirida não relacionada com álcool. Ferritina Saturação da Transferrina CHF por RM IHF TBIS N 25 25 26 26 26 Média 845,72 42,96 111,92 2,57 2,53 Mediana 791,00 40,00 100,00 2,28 2,54 Desvio Padrão 345,55 17,03 48,06 1,05 1,06 Mínimo 268,00 14,00 65,00 1,41 1,24 Máximo 1591,00 81,00 260,00 5,31 5,60 Percentis 25 613,50 29,50 78,75 1,73 1,63 50 791,00 40,00 100,00 2,28 2,54 75 1203,00 57,00 142,50 3,23 2,85 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 71 Tabela 14: Distribuição da ferritina, saturação da transferrina, CHF por RM, IHF e TBIS nos heterozigóticos HFE-C282Y. Ferritina Saturação da Transferrina CHF por RM IHF TBIS N 17 17 18 18 18 Média 1290,94 55,35 143,33 2,94 3,35 Mediana 1109,00 55,00 130,00 2,61 2,89 Desvio Padrão 1208,63 16,65 64,90 0,96 1,79 Mínimo 362,00 31,00 65,00 1,60 ,59 Máximo 5745,00 93,00 300,00 4,89 7,60 Percentis 25 714,00 41,50 88,75 2,29 2,38 50 1109,00 55,00 130,00 2,61 2,89 75 1289,00 66,00 185,00 3,72 3,83 Tabela 15: Distribuição da ferritina, saturação da transferrina, CHF por RM, IHF e TBIS nos indivíduos com genótipo normal. Ferritina Saturação da Transferrina CHF por RM IHF TBIS N 33 33 33 33 33 Média 1056,18 51,42 119,70 2,59 2,58 Mediana 811,00 52,00 100,00 2,50 2,60 Desvio Padrão 931,23 22,30 57,69 1,13 1,07 Mínimo 117,00 23,00 45,00 0,90 1,10 Máximo 5000,00 100,00 300,00 5,45 5,60 Percentis 25 563,00 30,00 80,00 1,72 1,72 50 811,00 52,00 100,00 2,50 2,60 75 1169,50 69,00 160,00 3,24 3,17 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 72 Gráficos relativos à Execução do Projecto Gráfico 31: Idade ao diagnóstico agrupada por faixas etárias. Gráfico 32: Distribuição da idade ao diagnóstico por tipo de hemocromatose. p=0.240 P = RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 73 Gráfico 33: Distribuição do gene HFE quanto à mutação C282Y na amostra total. Gráfico 34: Classificação da amostra quanto ao grau de hemocromatose com base na CHF por RM. RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO HEPÁTICA DE FERRO E A QUANTIDADE TOTAL DE FERRO REMOVIDA POR FLEBOTOMIAS EM DOENTES COM HEMOCROMATOSE Bruno Loureiro, aluno da DIIC do MIM do ICBAS/UP - 2011/2012 e 2012/2013 80 Gráfico 47: Curva ROC relativa ao desempenho da IHF na hemocromatose hereditária. Gráfico 48: Curva ROC relativa ao desempenho da IHF na hemocromatose adquirida. AUC=0.730 p=0.042 P = AUC=0.678 p=0.038 P =