Desenvolvimento e Validação de um Método de HPLC-DAD-FLD para a Determinação de Inibidores da Enzima Fosfodiesterase Tipo-5 (PDE-5) em Suplementos Alimentares à Base de Plantas

Tiago André Marinho Caldeira da Rocha Desenvolvimento e validação de um método de HPLC-DAD-FLD para a determinação de inibidores da enzima fosfodiesterase tipo-5 (PDE-5) em suplementos alimentares à base de plantas Dissertação do 2º Ciclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre em Controlo de Qualidade Especialidade em Águas e Alimentos Trabalho desenvolvido sobre a orientação: Professora Doutora Maria Beatriz Prior Pinto de Oliveira Professora Doutora Joana Andrêa Soares Amaral Doutora Joana Manuela Silva Santos Outubro, 2015 Mestrado em Controlo de Qualidade II De acordo com a legislação em vigor, não é permitida a reprodução de qualquer parte desta dissertação/tese. Mestrado em Controlo de Qualidade III Este trabalho foi financiado pela União Europeia (fundos FEDER através do COMPETE) e pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), através de projeto de EXPL/DTPSAP/1438/2013 (Segurança de suplementos alimentares com base em plantas: pesquisa de adulterantes farmacêuticos e plantas) e LAQV UID/QUI/50006/2013. Mestrado em Controlo de Qualidade IV Agradecimentos Ao finalizar esta dissertação sinto o dever e a necessidade de expressar os meus mais sinceros agradecimentos a todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram com o seu apoio e incentivo para que conseguisse alcançar o final desta etapa na minha formação. Deste modo agradeço: Á Professora Doutora Beatriz Oliveira, dirijo o mais especial agradecimento pela orientação, pela simpatia e pela disponibilidade com que me recebeu desde o início. Bem como pela sua compreensão e pelos conhecimentos transmitidos ao longo destes dois anos. Á Professora Doutora Joana Amaral, pela ajuda prestada durante a orientação destes dois anos de trabalho, principalmente nesta fase final de entrega da dissertação. Á Doutora Joana Santos, um agradecimento muito especial, por todo o acompanhamento, empenho, paciência e por me ajudar a melhor continuadamente as minhas competências. Ao departamento de Bromatologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, em especial à Mestre Anabela Costa, por ser sempre tão prestável, principalmente nas alturas mais difíceis deste trabalho. Por fim, agradeço à minha família e aos meus amigos pela compreensão e apoio durante este ano de dissertação. Um muito obrigado a todos. Mestrado em Controlo de Qualidade V Resumo Na última década, tem-se assistido a um consumo crescente de suplementos alimentares pela população mundial, especialmente, no que diz respeito ao consumo de suplementos alimentares à base de plantas (SABP). Estes produtos, utilizados com diversas finalidades, são frequentemente rotulados como “naturais” transmitindo uma falsa sensação de segurança aos consumidores. Contudo, recentemente tem sido referida a ocorrência de adulterações nestes produtos, o que compromete a sua segurança. Entre os casos de fraude detetados destaca-se a adição ilegal de substâncias ativas. Atualmente os inibidores da enzima fosfodiesterase tipo-5 (PDE-5) constituem um dos principais adulterantes encontrados em suplementos alimentares à base de plantas, que alegam um aumento do desempenho sexual. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um método de cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a um detetor de díodos e um detetor de fluorescência (HPLC-DAD-FLD), para a determinação de inibidores da enzima fosfodiesterase tipo-5 (PDE-5) em suplementos alimentares à base de plantas. A separação foi efetuada numa coluna de fase reversa à temperatura de 31˚C, em modo de gradiente, usando dois eluentes, um composto pela mistura de ACN:MeOH (50:50 v/v) e outro composto por uma solução de acetato de amónio 50mM (pH 7). O tempo de corrida foi de 35 minutos e a deteção dos cromatogramas por DAD foi registada a 290 nm. Depois de otimizado o método procedeu-se ao estudo dos parâmetros de validação, tais como a gama de trabalho, linearidade, precisão e exatidão (ensaios de recuperação), limite de deteção e limite de quantificação. Após validação, o método foi aplicado na avaliação de 12 amostras de SABP provenientes do mercado Português, tendo-se detetado a presença de inibidores da PDE-5 em 7 SABP, nomeadamente sildenafil, tadalafil, tiosildenafil e um possível análogo do sildenafil. Em 5 das amostras adulteradas, verificou-se a presença simultânea de mais do que um inibidor da PDE-5. Os resultados obtidos demonstram a necessidade de um maior controlo deste tipo de produtos, de forma a assegurar a segurança do consumidor. Palavras-chave: Suplementos à Base de Plantas, adulterantes, HPLC-DAD-FLD, otimização analítica. Mestrado em Controlo de Qualidade VI Abstract In the last decade has been an increase in the consumption of food supplements by global population, specially concerning plant food supplements (PFS). These products, which have many uses, are frequently labelled as “naturals” causing a false sense of security in the consumer. Recently, however, the occurrence of adulterations in these products has been brought up, compromising security. The illegal adding of active substances stands out across fraud cases. Currently, the phosphodiesterase type-5 enzyme (PDE-5) inhibitors constitute one of the main adulterants found in plant food supplements which allegedly enhance sexual performance. This paper’s goal was to develop and validate a high-performance liquid chromatography method coupled to a diode array detector and a fluorescence detector (HPLC-DAD-FLD) in order to detect phosphodiesterase type-5 enzyme (PDE-5) inhibitors in plant food supplements. The separation was made in a reverse phase column at 31ºC, in gradient mode using two eluents. One of them was a ACN:MeOH (50:50 v/v) mixture and the other a 50mM ammonium acetate solution (pH 7). The running time was 35 minutes and the DAD chromatographic detection was registered a 290 nm. After reaching the method’s optimized level, its validation was established through parameters, such as range, linearity, accuracy and precision (recovery testing), detection limit and quantification limit. After validation, the method was applied to the evaluation of 12 samples of PFS from the Portuguese market. The PDE-5 inhibitors were detected in 7 SABP, namely sildenafil, tadalafil and tiosildenafil and another possible sildenafil analog. In 5 adulterated samples, the simultaneous presence of more than a PDE-5 inhibitor was detected. The obtained results show the need of a bigger control over these kind of products in order to secure consumer’s safety. Keywords: Plant Food Supplements, adulterants, HPLC-DAD-FLD, analytical optimization. Mestrado em Controlo de Qualidade VII Publicações e Comunicações Publicações em jornais científicos: 1. Tiago Rocha, Joana S. Amaral, Maria Beatriz P.P. Oliveira, Adulteration of Dietary Supplements by the Illegal Addition of Synthetic drugs: A Review, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, in press. Comunicações Orais em encontros científicos: 1. T. Rocha, J. Santos, J.S. Amaral, M. B. P.P. Oliveira, Development and validation of HPLC-DAD-FL method for the determination of food supplements adulteration with undeclared phosphodiesterase type-5 inhibitor drugs, 8º Encontro da Investigação Jovem da Universidade do Porto (IJUP), 14th May 2015, Porto, Portugal. Comunicações escritas em forma de Poster em encontros científicos: 1. T. Rocha, J.S. Amaral, M. B. P.P. Oliveira. Safety concerns regarding Plant Food Supplements. 7º Encontro da Investigação Jovem da Universidade do Porto (IJUP), 13th February 2014, Porto, Portugal. 2. T. Rocha, J.S. Amaral, M. B. P. P. Oliveira, Food Supplements adulteration with undeclared synthetic phosphodiesterase type-5 drugs (PDE-5) inhibitors, XX Encontro Luso-Galego de Química, 26th-28th November 2014, Porto, Portugal. 3. T. Rocha, J. Santos, J.S. Amaral, M. B. P.P. Oliveira. Monitorização da adulteração de suplementos alimentares à base de plantas comercializados em Portugal com inibidores de fosfodiesterase tipo 5 (PDE-5). 2º Simpósio Nacional “Promoção de uma Alimentação Saudável e Segura - Qualidade Nutricional & Processamento Alimentar”, 26th November 2015, Lisbon, Portugal. Mestrado em Controlo de Qualidade VIII Índice AGRADECIMENTOS ....................................................................................................... IV RESUMO .......................................................................................................................... V ABSTRACT ..................................................................................................................... VI PUBLICAÇÕES E COMUNICAÇÕES ............................................................................ VII ÍNDICE ........................................................................................................................... VIII LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... X LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... XI LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................... XII 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1 1.1 REGULAMENTAÇÃO DE SUPLEMENTOS ALIMENTARES À BASE DE PLANTAS ..................... 3 1.2 CONSUMO DE SUPLEMENTOS ALIMENTARES À BASE DE PLANTAS .................................. 5 1.3 ADULTERAÇÃO DE SUPLEMENTOS ALIMENTARES À BASE DE PLANTAS ............................ 6 1.4 ADULTERAÇÃO DE SUPLEMENTOS ALIMENTARES À BASE DE PLANTAS COM INIBIDORES DA ENZIMA FOSFODIESTERASE TIPO-5 (PDE-5) ...................................................................... 8 1.5 METODOLOGIAS DE DETEÇÃO DE SUPLEMENTOS ALIMENTARES À BASE DE PLANTAS ADULTERADOS COM INIBIDORES DE FOSFODIESTERASE TIPO 5 ......................................... 10 1.5.1 Métodos cromatográficos ................................................................................ 11 1.6 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) .............................................. 13 1.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO ........................................................................... 15 1.7.1 Especificidade e seletividade ........................................................................... 15 1.7.2 Precisão .......................................................................................................... 16 1.7.3 Exatidão .......................................................................................................... 18 1.7.4 Linearidade ..................................................................................................... 18 1.7.5 Gama de trabalho ............................................................................................ 19 1.7.6 Limite de deteção ............................................................................................ 19 1.7.7 Limite de quantificação .................................................................................... 20 1.7.8 Sensibilidade ................................................................................................... 22 1.7.9 Recuperação ................................................................................................... 22 1.8 OBJETIVOS DO TRABALHO ........................................................................................ 23 2. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 24 Mestrado em Controlo de Qualidade IX 2.1 REAGENTES E PADRÕES ........................................................................................... 25 2.2 AMOSTRAS .............................................................................................................. 26 2.3 PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES .................................................................................... 26 2.3.1 Solução padrão individual ............................................................................... 26 2.3.2 Solução padrão de trabalho............................................................................. 26 2.3.3 PREPARAÇÃO DA FASE MÓVEL USADA NA TÉCNICA ANALÍTICA DE HPLC-DAD-FLD ... 27 2.4 EXTRAÇÃO DAS AMOSTRAS ...................................................................................... 27 2.5 CONDIÇÕES DE FLUORESCÊNCIA DOS INIBIDORES DA PDE-5 ...................................... 30 2.6 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA ..................................................................................... 30 2.6.1 Condições cromatográficas ............................................................................. 31 2.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ........................................................................................... 32 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 33 3.1. IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS ADULTERANTES NAS AMOSTRAS DE SABP ...... 34 3.2 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES ANALÍTICAS ................................................................. 37 3.2.1 Otimização do gradiente dos eluentes ............................................................. 37 3.2.2 Otimização das condições de fluorescência .................................................... 40 3.2.3 Otimização do processo de extração das amostras ........................................ 42 3.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ........................................................................................... 43 3.3.1 Gama de Trabalho .......................................................................................... 43 3.3.2 Linearidade ..................................................................................................... 43 3.3.3 Limite de deteção e de quantificação .............................................................. 45 3.3.4 Precisão .......................................................................................................... 46 3.3.5 Ensaio de Recuperação .................................................................................. 50 3.4 ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE SUPLEMENTOS ALIMENTARES À BASE DE PLANTAS .......... 51 4. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 59 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 62 Mestrado em Controlo de Qualidade 3 1.1 Regulamentação de suplementos alimentares à base de plantas Na UE, os suplementos alimentares (os quais incluem os SABP) estão regulamentados pela Diretiva 2002/46/CE que define estes produtos como sendo “…géneros alimentícios que se destinam a complementar o regime alimentar normal e que constituem fontes concentradas de determinados nutrientes ou outras substâncias com efeito nutricional ou fisiológico, estremes ou combinados, comercializados em forma doseada, ou seja, as formas de apresentação como cápsulas, pastilhas, comprimidos, pílulas e outras formas semelhantes, saquetas de pó, ampolas de líquido, frascos com conta-gotas e outras formas similares de líquidos ou pós que se destinam a ser tomados em quantidades reduzidas”. Esta diretiva também especifica “nutrientes” como sendo vitaminas e minerais, e estabelece os limites máximos e mínimos em que estes podem ser encontrados nestes produtos. Não especificando contudo, do que se pode entender com “outras substâncias com efeito nutricional ou fisiológico”. Assim, várias substâncias diferentes são geralmente aceites como estando incluídas nesta definição tais como, aminoácidos, enzimas, prebióticos e probióticos, ácidos gordos essenciais e plantas e seus extratos, sendo que o uso destas substâncias depende frequentemente da legislação nacional de cada país (Silano et al., 2011). A falta de harmonização e especificação entre os diferentes países da UE no que respeita à utilização de plantas medicinais e seus extratos nos suplementos alimentares, resulta em discrepâncias entre os países dos estados membros. Pelo que, certos produtos botânicos são autorizados em determinados países e proibidos, ou não regulamentados, noutros. Adicionalmente, com base na legislação atual da UE, as plantas medicinais e seus extratos podem ser usadas tanto na produção de SABP, como de medicamentos tradicionais à base de plantas (regulados pela Diretiva 2004/24/CE). No entanto, a distinção entre ambos é de algum modo confusa, com a fronteira entre “alimentação” e “uso medicinal” muitas vezes sendo definida pelos hábitos da população e interpretação das disposições legais (Silano et al., 2011). Sendo considerados como alimentos na UE, os SABP estão ainda sujeitos às disposições legais do Regulamento (CE) 178/2002, que determina os princípios e normas gerais da legislação alimentar, segundo o qual a responsabilidade no que concerne à segurança alimentar recai sobre os operadores das empresas do sector alimentar. De igual forma, os SABP devem de obedecer à restante legislação do âmbito alimentar tal como, regras de higiene alimentar (Regulamento (CE) 852/2004), níveis máximos de contaminantes (Regulamento (CE) 1881/2006), novos alimentos e ingredientes alimentares (Regulamento (CE) 258/97), entre outros. Mestrado em Controlo de Qualidade 4 Apesar da abrangente regulamentação, diferentes problemas de segurança alimentar podem mesmo assim acontecer nos diferentes estados membros, o que conduziu à criação, por parte da UE, do Sistema de Alerta Rápido para os Géneros Alimentícios e Alimentos de Animais (RASFF). O RASFF proporciona às autoridades uma ferramenta de alerta rápida e eficiente para as notificações emitidas pelos diferentes estados membros da UE, sempre que um alimento apresente um elevado risco para a saúde pública devido a contaminações, adulterações ou não se encontre dentro das leis acima mencionadas. Esta informação, permite que os diferentes estados membros tomem uma ação imediata no que concerne ao alerta aos consumidores e à retirada do produto do mercado (Petroczi et al., 2011). Na base de dados do RASFF podemos efetuar uma pesquisa por género alimentício ou categoria de produto na qual se inclui a opção “Dietetic foods, food supplements, fortified foods”. Nos EUA, os suplementos alimentares (nos quais estão incluídos os SABP) e seus ingredientes são regulados pela Food and Drug Administration (FDA). Segundo a lei DSHEA de 1994, os suplementos alimentares são reconhecidos como sendo alimentos, colocando-os contudo numa categoria diferente destes, obedecendo a requisitos de segurança e rotulagem específicos. A referida legislação define um suplemento alimentar como um produto (outro que não tabaco) com intenção de suplementar a dieta normal, desde que contenha um ou mais dos seguintes ingredientes dietéticos: vitaminas; minerais; plantas medicinais ou outro tipo de produto botânico; aminoácidos; substâncias dietéticas usadas pelo Homem para suplementar a dieta através do aumento do seu consumo diário; concentrados, metabolitos, extratos, ou uma combinação dos mesmos, com a intenção de serem consumidos por via oral na forma de comprimido, cápsula, pílula ou líquido (USA, 1994). Mais ainda, segundo a DSHEA, este tipo de produtos não deve substituir a alimentação convencional, não podendo assim ser vendidos como alimento ou dieta alimentar, devendo estar rotulados como suplementos alimentares (USA, 1994). Adicionalmente, segundo esta legislação, a responsabilidade em determinar se os suplementos alimentares são seguros e se o efeito revindicado é suportado por evidências comprovadas recai sobre a empresa (sejam produtores ou distribuidores) (Silano et al., 2011). Nos EUA, semelhante ao que acontece na UE, os suplementos alimentares não precisam de uma aprovação prévia das autoridades de regulamentação antes da sua entrada no mercado, e os produtores também não necessitam de apresentar provas sobre a segurança e eficácia dos produtos, sendo contudo proibida a comercialização de produtos que não se enquadrem dentro da regulamentação ou que sejam perigosos ou ineficientes (Rapaka e Coates, 2006). Não obstante, um suplemento alimentar com uma Mestrado em Controlo de Qualidade 5 formulação ou ingrediente não comercializado antes de 1994, é considerando como “novo alimento”, pelo que o produtor deve notificar a FDA e fornecer informação relevante que demonstre a segurança do produto para o consumo humano (Rapaka e Coates, 2006). Segundo Wheatley e Spink (2013), a legislação DSHEA enfraquece a autoridade da FDA sobre os suplementos alimentares, principalmente no que concerne aos produtos importados. 1.2 Consumo de suplementos alimentares à base de plantas Durante a última década é inegável a existência de um crescimento notório no consumo de suplementos alimentares. Entre estes, o consumo de SABP tem mostrado um aumento significativo, sendo que os records de consumo ocorrem nos EUA e UE (Egan et al., 2011). O aumento da aceitação deste tipo de produtos pelos consumidores tem sido associado a inúmeros fatores, entre os quais (i) a crescente desconfiança na medicina e medicamentos convencionais, (ii) a perceção de que o que é “natural” é saudável e, sendo as plantas de origem natural, é seguro o seu consumo, (iii) a necessidade de um controlo maior sobre a própria saúde e decisões que a podem afetar, aumentado assim a tendência dos consumidores para se automedicar (Ritchie, 2007; Egan et al., 2011; Vargas-Murga et al., 2011). Os suplementos alimentares são geralmente consumidos devido a uma variedade de propósitos, incluindo o equilíbrio da dieta, a compensação de uma falta nutricional resultante de um estilo de vida não saudável, a manutenção da saúde, a prevenção de doenças crónicas, a melhoria da aparência, a melhoria de bem-estar incluindo a condição mental, sexual e desportiva, entre outros (Egan et al., 2011; Petroczi et al., 2011). Até à presente data, diversos estudos têm vindo a ser efetuados relativos ao consumo de suplementos alimentares, normalmente focando um determinado tipo de população tal como crianças, grávidas, idosos, pacientes com doenças crónicas ou cancro, e atletas (Petroczi et al., 2011; Vargas-Murga et al., 2011). Apesar disso, a maior parte da informação referente ao uso e toma de suplementos alimentares, em particular SABP, derivam de dados obtidos por via de inquéritos gerais à população nos EUA, tais como o National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) e o National Health Interview Survey (NHIS) (Egan et al., 2011; Garcia-Alvarez et al., 2014). Com base nos dados obtidos pelo NHANES nos anos de 2003/2004 e de 2005/2006 estima-se que aproximadamente 49% da população nos EUA consome suplementos alimentares, sendo que 14% refere já ter consumido SABP. Já no NHIS de 2007, 18% dos adultos inquiridos alegam o uso de SABP. Em 2002, um estudo sobre o uso de suplementos não- Mestrado em Controlo de Qualidade 6 vitamínicos não-minerais efetuado com 1000 participantes, sendo estes estudantes de uma universidade Norte-Americana, demonstrou que 26% dos inquiridos consome algum tipo de suplementos, sendo os ingredientes mais reportados ginseng, equinácea, proteínas/aminoácidos e ginko biloba (Perkin et al., 2002). Na UE, o projeto PlantLIBRA, financiado pelo 7º Programa-Quadro de Investigação Científica da UE, levou a cabo a realização de um inquérito em 6 países da UE (Alemanha, Espanha, Finlândia, Itália, Reino Unido e Roménia), sobre o tipo e frequência de consumo de SABP (Garcia-Alvarez et al., 2014). O estudo, que incluiu 2359 participantes, mostrou que quase 19% usa pelo menos um SABP, sendo que o valor mais alto é observado na Itália (22,7%) e o valor mais baixo na Finlândia (9,6%). Os SABP referidos como os mais frequentemente usados contêm plantas como, ginko biloba, onagra e alcachofra, sobre a forma de cápsulas ou comprimidos. Apesar dos fatores que levam ao consumo de SABP variarem de acordo com a demografia e saúde, entre outros, a informação proveniente de estudos realizados sobre as características dos consumidores de SABP mostra geralmente um consumo mais elevado por parte de mulheres adultas, consumidores com elevado nível de escolaridade e socioeconómico, fisicamente ativos, não fumadores e que tendem a ter a sua condição de saúde em boa consideração (Schaffer et al., 2003; Radimer et al., 2004; Nielsen et al., 2005; Egan et al., 2011; Garcia-Alvarez et al., 2014). Estudos reportam ainda, um elevado consumo de SABP também por atletas, com vista num aumento de rendimento e performance no treino que efetuam (Petroczi et al., 2008, 2011; Kiertscher e DiMarco, 2013). 1.3 Adulteração de suplementos alimentares à base de plantas Com o crescente aumento do consumo de suplementos alimentares, a segurança na produção e marketing, relativamente à qualidade e níveis de ingredientes fisiologicamente ativos e conformidade de rotulagem, é algo que preocupa globalmente as diferentes partes interessadas, tais como os consumidores, profissionais de saúde e reguladores (Sullivan e Crowley, 2006). Em particular, diferentes questões de segurança em relação aos SABP têm emergido, tais como a sua frequente rotulagem como produto “natural” (devido a serem derivados de plantas), transmitindo uma falsa sensação de segurança ao consumidor (Liang et al., 2006; Di Lorenzo et al., 2014). Entre os problemas relacionados com a adulteração de SABP, a adição de substâncias ilegais e trocas intencionais ou a incorreta identificação do produto botânico utilizado, são as mais preocupantes. Mestrado em Controlo de Qualidade 7 Considerando o valor económico associado ao mercado global de SABP (por exemplo, nos EUA, estima-se que o gasto efetuado pelos consumidores atinja valores na ordem de 20 mil milhões por ano em SABP), este torna-se bastante aliciante à adulteração destes produtos tendo em vista um aumento de lucro (Wheatley e Spink, 2013). Uma das várias adulterações reportadas em SABP passa pela adição de fármacos, realizada por produtores sem escrúpulos que tentam aumentar o efeito (e sua rapidez) dos suplementos que comercializam. De facto, para alguns SABP, como por exemplo os utilizados com a finalidade de melhorar a performance sexual, se o consumidor não verificar que os suplementos tem o efeito desejado, poderão eventualmente deixar de consumir o produto por não alcançar o efeito desejado no tempo pretendido. Pelo contrário, se o consumidor rapidamente atingir os resultados que pretende, o mais provável é que continue a consumir o produto e aconselhe a sua utilização a amigos e familiares, aumentando assim o lucro das empresas produtoras/distribuidoras. Vários estudos ao longo das ultimas décadas demonstram que a adição intencional de fármacos em SABP incluem vários tipos de medicamentos com propriedades farmacológicas distintas, desde supressores de apetite, estimulantes, antidepressivos, ansiolíticos, diuréticos e laxantes no caso dos SABP para emagrecimento, inibidores da enzima fosfodiesterase tipo 5 (PDE-5) no caso dos SABP para aumento do desempenho sexual, e esteroides anabolizantes e pró-hormonas no caso de SABP usados para o aumento da massa muscular/aumento da performance desportiva. Um problema adicional neste tipo de adulteração, passa pelo uso de análogos de fármacos, uma vez que, para muitas destas substâncias, não existem estudos farmacológicos que comprovem a sua segurança, sendo ainda frequente o uso de substâncias contrafeitas de qualidade duvidosa (Geyer et al., 2008; Petroczi et al., 2011; Gilard et al., 2015; Odoardi et al., 2015). Como referido nas secções anteriores, os suplementos alimentares ao serem considerados como alimento em vários países, não necessitam de autorização especial para serem comercializados, sendo que a responsabilidade legal pela sua segurança recai sobre os produtores. Consequentemente, na UE, várias fito-formulações têm sido comercializadas sobre a denominação de SABP, evitando assim os requisitos legais e registo oficial necessário destes produtos se tais fossem considerados como medicamentos tradicionais à base de plantas. Adicionalmente, os SABP estão largamente difundidos no mercado global, facilmente acessíveis aos consumidores, sendo encontrados nos supermercados, farmácias, lojas de produtos naturais, ervanárias, ginásios, entre outros locais, sendo também possível a sua compra através de televendas e sites online. Na última década, a expansão de suplementos provenientes Mestrado em Controlo de Qualidade 8 do mercado negro tem vindo a aumentar significativamente (Geyer et al., 2008; Petroczi et al., 2011; Gilard et al., 2015; Odoardi et al., 2015). 1.4 Adulteração de suplementos alimentares à base de plantas com inibidores da enzima fosfodiesterase tipo-5 (PDE-5) A disfunção eréctil (DE) é uma doença que afeta 150 milhões de homens mundialmente (Schramek et al., 2014), sendo caracterizada pela incapacidade de criar ou manter uma ereção peniana durante a atividade sexual. O tratamento atualmente conhecido para este problema passa pela administração de fármacos contendo como substância ativa inibidores da enzima fosfodiesterase tipo 5 (PDE-5). Estes compostos agem inibindo a enzima referida, responsável pela degradação da guanosina monofosfato cíclica (GMPc), a guanosina monofosfato (GMP), causando um aumento dos níveis de GMPc, resultando no relaxamento das artérias helicinas seguido de um aumento do fluxo sanguíneo para o pénis, melhorando assim a função eréctil (Codevilla et al., 2013). Atualmente, os inibidores da PDE-5 legalmente comercializados a nível mundial são: citrato de sildenafil (Viagra®), tadalafil (Cialis®), hidrocloreto de vardenafil (Levitra®), udenafil (Zydena®), mirodenafil (Mvix®), carbonato de iodenafil (Helleva®) e avanafil (Stendra® nos EUA ou Spedra® na UE) (Patel et al., 2014). Porém, nos EUA e na UE só o sildenafil, tadalafil, vardenafil e avanafil estão aprovados pela FDA e pela Agência Europeia do Medicamento (EMA) para o tratamento da DE (FDA, 2015b; EMA, 2015). Os efeitos secundários devido à interação de inibidores da PDE-5 e outros medicamentos encontram-se documentados. Estes medicamentos podem causar cefaleia, eritemas, dispepsia, congestão nasal e problemas visuais, podendo até mesmo potenciar um efeito hipotensivo quando o uso de inibidores da PDE-5 é administrado concomitantemente com medicamentos como nitratos ou α-bloqueadores (Gur et al., 2013). Além disso, uma vez que o sildenafil, tadalafil e vardenafil são principalmente metabolizados pela via do citocromo P450 3A4, certos medicamentos podem inibir a via de metabolização dos inibidores da PDE-5, aumentando assim a sua concentração no plasma (Schwartz et al., 2010). Nos últimos anos, a procura de inibidores da PDE-5 tem aumentando mundialmente, não só por pacientes que sofrem de DE, mas também em “uso recreativo” por jovens sem DE, de modo a aumentar o seu desempenho sexual, e ocasionalmente associado ao consumo de álcool e drogas (Korkes et al., 2008; Bechara et al., 2010). Apesar da aquisição de inibidores da PDE-5 ser feita apenas com prescrição médica, várias razões tais como o estigma associado à disfunção sexual, falta de confiança em Mestrado em Controlo de Qualidade 9 falar abertamente perante um profissional de saúde, falta de informação, custo, e disponibilidade de obtenção do medicamento por outras vias, sendo estas mais baratas e discretas, tais como a internet, faz com que a procura destes medicamentos sem prescrição médica e fora dos canais oficiais tenha aumentado nos últimos anos (Campbell et al., 2013; Fejos et al., 2014; Patel et al., 2014). Estima-se que só na Europa, mais de 6 milhões de produtos ilegais contendo inibidores da PDE-5 são comprados fora do sistema nacional de saúde (Dorsey et al., 2010; Schnetzler et al., 2010; Venhuis e de Kaste, 2012) e nos EUA, mais de meio milhão de comprimidos sem controlo de qualidade são vendidos todos os meses (Dorsey et al., 2007). Uma vez que os comprimidos contrafeitos não têm nenhum tipo de controlo de qualidade, existe o risco adicional da compra de produtos de baixa qualidade, contendo por exemplo impurezas, não apresentando homogeneidade de produto ou tendo uma dosagem incorreta. Para além da problemática dos medicamentos contrafeitos, estudos recentes têm demonstrado a presença ilegal de inibidores da PDE-5 e seus análogos em SABP. Este tipo de suplemento tem-se tornado popular, sendo publicitado como “produto natural” para o aumento do desempenho sexual, levando a uma falsa sensação de segurança por parte do consumidor (Liang et al., 2006; Singh et al., 2009; Campbell et al., 2013; Fejos et al., 2014). Como geralmente a existência de procura leva a um aumento da oferta, recentemente o número de produtos publicitados como “naturais” para a resolução dos problemas sexuais têm vindo aumentar, sendo frequentemente publicitados através de anúncios de televisão e internet (Liang et al., 2006; Singh et al., 2009; Petroczi et al., 2011; Strano-Rossi et al., 2015). Contudo, de forma a potenciar o desempenho destes produtos, tem-se verificado que produtores inescrupulosos adicionam inibidores da PDE- 5 aos SABP. Desde 2010, a FDA emitiu 229 notificações públicas sobre produtos de desempenho sexual (correspondente a mais de 55% das notificações públicas emitidas nesse mesmo período sobre suplementos alimentares) devido à deteção de inibidores da PDE-5 e seus análogos (sendo principalmente detetada a presença de sildenafil, mas também tadalafil e análogos como sulfoaildenafil, aminotadalafil, hidroxitiohomosildenafil, sulfosildenafil; dimetilsildenafil, sulfohidroxihomosildenafil, dimetilacetildenafil, noraacetildenafil, desmetil carbodenafil, sulfosildenafil and propoxifenildenafil). No mesmo período, 81 notificações foram emitidas pelo RASSF quanto à presença de inibidores da PDE-5 e análogos em suplementos dietéticos, suplementos alimentares e alimentos fortificados. A adulteração de SABP para o desempenho sexual impõem um elevado risco à saúde do consumidor, já que estes compram e consomem produtos que podem causar efeitos adversos na sua saúde, especialmente em pessoas com doenças cardiovasculares Mestrado em Controlo de Qualidade 10 medicadas com nitratos e α-bloqueadores (Champagne e Emmel, 2011; Venhuis e de Kaste, 2012). Não sendo aconselhada a toma de inibidores da PDE-5 por parte dessas pessoas, estas podem recorrer a outras alternativas de tratamento, tais como produtos publicitados como “naturais” e que inadvertidamente podem colocar as suas vidas em risco devido à interação de medicamentos causada pela adulteração de SABP. Além disso, de acordo com Venhuis et al. (2012), os SABP são frequentemente adulterados com análogos de inibidores da PDE-5. Estes análogos são geralmente sintetizados com base nas moléculas de inibidores da PDE-5, apresentando pequenas alterações estruturais, sendo que alguns destes análogos correspondem a substâncias descritas nas patentes de companhias farmacêuticas (Venhuis et al., 2012). Estes análogos não aprovados, levantam preocupações de segurança adicionais no que diz respeito à sua farmacocinética e farmacodinâmica, sendo que o seu perfil de segurança é normalmente desconhecido. Por outro lado, do ponto de vista dos produtores que realizam as adulterações de SABP, o uso de análogos novos e exóticos reduz substancialmente a probabilidade de serem detetados em inspeções de rotina pelas autoridades que aplicam metodologias protocolares (Patel et al., 2014). Dentro dos inúmeros métodos utilizados para a deteção de adulterantes em SABP, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é um dos métodos mais referidos para a separação de matrizes complexas, como a dos SABP adulterados com inibidores da PDE-5. Podendo esta metodologia ser acoplada com diferentes tipos de detetores (tais como UV-VIS, fluorescência, espetrometria de massa, etc.) (Patel et al., 2014). 1.5 Metodologias de deteção de suplementos alimentares à base de plantas adulterados com inibidores de fosfodiesterase tipo 5 De modo a controlar a qualidade dos SABP, é fundamental a aplicação de técnicas analíticas para a deteção de adulterações. Vários fatores devem ser considerados na escolha do método para a deteção de adulterantes em SABP, tais como o tipo de formulação, tipo de adulterante expectável, sensibilidade pretendida, e a complexidade da matriz dos SABP. Devido à complexidade da matriz da maioria dos SABP, por estes frequentemente apresentarem misturas de plantas medicinais na sua composição, a utilização de métodos cromatográficos que permitam realizar a separação dos analitos de interesse, previamente à sua deteção/identificação, é de elevada importância na análise deste tipo de produtos (Vaclavik et al., 2014b). Mestrado em Controlo de Qualidade 11 1.5.1 Métodos cromatográficos Cromatografia em camada fina (TLC) é uma técnica há muito tempo usada para a caraterização de plantas com componentes farmacologicamente ativos, tanto nos extratos como em formulações botânicas, podendo também ser usada para a identificação preliminar de produtos botânicos adulterados com fármacos (Cai et al., 2010; Zou et al., 2008). A TLC é considerada como um método simples, de fácil manipulação, rápido e económico para o teste preliminar de adulterações em SABP contendo inibidores da PDE-5. No entanto, apresenta como desvantagens a necessidade de ter os padrões dos adulterantes a determinar, e sobretudo de ser um método que apresenta uma baixa sensibilidade (Ariburnu et al., 2012; Sanzini et al., 2011; Singh et al., 2009). O uso da cromatografia em camada fina de alta eficiência (HPTLC) permite melhorar a sensibilidade do método comparativamente à TLC, pelo que é descrita como um possível método de rastreio da adulteração de produtos botânicos com inibidores da PDE-5 (Abourashed et al., 2005; Sanzini et al., 2011). Apesar da técnica HPTLC apresentar uma maior sensibilidade comparativamente à TLC, ambas requerem obrigatoriamente a utilização de padrões de referência para uma identificação positiva, não sendo por isso considerados métodos apropriados para o rastreio de adulterações com novos fármacos ou análogos de inibidores da PDE-5. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica bem estabelecida e difundida para análise quotidiana de diferentes compostos por todo o mundo. No caso de matrizes complexas, como as que encontramos em SABP, um passo cromatográfico antes da deteção/identificação do adulterante, permite uma melhor separação de compostos fitoquímicos presentes na matriz principal, os quais podem interferir ou suprimir o sinal do composto de interesse (Vaclavik et al., 2014a). A utilização de HPLC e mais recentemente de cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC), têm sido frequentemente reportadas na separação de adulterantes em SABP utilizados para aumento do desempenho sexual (Gratz et al., 2004; Ng et al., 2010; Savaliya et al., 2010; Zhang et al., 2010; Ren et al., 2012; Campbell et al., 2013; Poplawska et al., 2013; Jankovics et al., 2013; Lee et al., 2013a; Lee et al., 2013b; Reeuwijk et al., 2013; Strano- Rossi et al., 2013; Zhang et al., 2014, Schramek et al., 2014; Lebel et al., 2014; Fejos et al., 2014; Damiano et al., 2014). O uso da técnica de HPLC acoplada a um detetor de díodos (DAD), tem sido referida como um método preliminar de identificação e rastreio de Mestrado em Controlo de Qualidade 12 adulterantes em SABP contendo inibidores da PDE-5 (Singh et al., 2009; Ortiz e Linden, 2010; Savaliya et al., 2010; Sacré et al., 2011; Venhuis et al., 2011a, 2011b; Wollein et al., 2011; Jankovics et al., 2013; Fejos et al., 2014; Zhang et al., 2014). A técnica de HPLC-UV também pode ser usada na cromatografia semi-preparativa para isolamento de compostos desconhecidos (Lee et al., 2011). No método de HPLC-DAD, o rastreio e deteção de compostos é baseado na informação fornecida pelo especto UV e tempo de retenção, a qual é comparada com os valores obtidos para os padrões puros de referência. Apesar de ser um método simples e económico comparativamente a outras técnicas, o HPLC-DAD tem um limite de aplicabilidade, em específico quando se trata de novos inibidores da PDE-5 e os seus análogos para a maioria dos quais não existem padrões de referência. No entanto, em alguns casos, esta técnica pode auxiliar os investigadores na deteção preliminar de inibidores da PDE-5, principalmente no caso de análogos que apresentem uma estrutura semelhante à dos compostos originais, podendo neste caso variar o tempo de retenção, apresentando contudo um espectro UV idêntico (Hou et al., 2006). Na última década, a cromatografia líquida (LC) acoplada a um detetor de espetrometria de massa (MS), tem-se tornado a técnica principal para a análise de inibidores da PDE-5 em SABP, uma vez que combina o método de separação por LC com a sensibilidade e seletividade da deteção por MS, permitindo uma identificação ao nível molecular (Patterson et al., 2012; Vaclavik et al., 2014). Quando os padrões de referência estão disponíveis, o uso da cromatografia líquida precedendo a análise por MS pode contribuir para a identificação de compostos baseados no seu tempo de retenção. Atualmente, a utilização de LC-MS é considerada por muitos investigadores como sendo o método de eleição para determinar inibidores da PDE-5 em SABP (Gratz et al., 2004; Chen et al., 2009; Ng et al., 2010; Savaliya et al., 2010; Zhang et al., 2010; Toomey et al., 2012; Ren et al., 2012; Vaysse et al., 2012; Jankovics et al., 2013; Lee et al., 2013a, 2013b; Reeuwijik et al., 2013, Schramek et al., 2014; Lebel et al., 2014; Damiano et al., 2014; Strano-Rossi et al., 2015). Cromatografia gasosa (GC). Apesar de ser um método quantitativo, sensível, reprodutível, exato e bastante adequado para análise de misturas, sendo considerado de baixo custo comparativamente a outros métodos tais como LC-MS, um critério importante para o uso da metodologia de GC passa pela volatilidade e estabilidade térmica dos compostos em estudo. Por este motivo, a técnica de GC raramente é usada para a deteção de inibidores da PDE-5 em SABP pois estes são considerados termicamente instáveis e de difícil derivatização utilizando reações de sililação (Patel et al., 2014). No Mestrado em Controlo de Qualidade 19  𝑥 - Valor da concentração da amostra;  𝑏 - Valor de interceção da reta com a ordenada na origem. A determinação matemática da linearidade pode ser determinada pela estimativa dos coeficientes (𝑥 e 𝑏) obtidos pela regressão linear efetuada na equação da reta. A partir destes coeficientes podemos determinar matematicamente o coeficiente de correlação (R2), que indica a estimativa da qualidade linear obtida pela curva de calibração. Quanto mais próximo de 1 for o valor do R2, menor será a dispersão dos pontos experimentais presente na curva de calibração e menor será a incerteza associada aos coeficientes de regressão (Huber, 2010; Ribani et al., 2004). É aceitável que um método apresente uma linearidade com um coeficiente de correlação na ordem dos 0,99 (Ribani et al., 2004). A determinação da linearidade deve ser realizada recorrendo a 5 concentrações diferentes do padrão do analito em estudo, replicadas pelo menos 5 a 6 vezes (Huber, 2010). 1.7.5 Gama de trabalho Define-se gama de trabalho como o intervalo existente entre a concentração máxima e mínima de um dado analito de uma amostra, para o qual se demostra existir num determinado procedimento analítico, um nível aceitável de linearidade, precisão e exatidão. Normalmente a gama de trabalho está dependente do tipo de metodologia analítica aplicada, sendo muitas das vezes escolhida através do estudo gráfico da linearidade. Para a validação de um procedimento analítico a ICH exige que a gama de trabalho ronde os 80-120% da percentagem de concentração em teste (ICH, 2005). 1.7.6 Limite de deteção A ICH define limite de deteção (LOD) como “a menor concentração do analito em estudo, que pode ser detetada e distinguida do nível de ruído do sistema, mas que não é necessariamente quantificada“ (ICH, 2005). O LOD pode ser determinado através dos seguintes métodos: 1. Baseado na avaliação visual. Este método consiste na determinação do LOD através da análise de amostras com concentrações conhecidas do Mestrado em Controlo de Qualidade 20 analito em estudo, estabelecendo um nível mínimo para o qual o analito é detetado através da observação dada pelo sistema (e.g. cromatograma). 2. Baseado na relação entre o sinal-ruído. O LOD é determinado pelo rácio entre o sinal e o ruído, isto é, medindo os sinais obtidos através de amostras contendo baixas concentrações de analito, e analisando-as comparativamente ao sinal obtido por amostras em branco (amostras que não contêm o analito de interesse), estabelecendo posteriormente uma concentração mínima com a qual o analito pode ser determinado. A razão entre o sinal e o ruído deve estar compreendida num rácio de 3:1 ou 2:1. 3. Baseado na relação entre o desvio padrão da resposta e a curva de calibração. Este método expressa o LOD através da seguinte expressão: 𝐿𝑂𝐷 = 3,3 × 𝜎 𝑚 Sendo, 𝑚 – declive da curva de calibração referente ao coeficiente de regressão do analito de interesse e 𝜎 a estimativa do desvio padrão do sinal detetado, que pode ser determinado através da:  Amostra em branco, calculando o desvio padrão do sinal dado relativamente a um número de amostras em branco;  Do estudo da curva de calibração específica do analito, constituída por amostras com uma gama dentro do LOD. Que posteriormente são utilizados os valores do desvio padrão relativo referentes à regressão linear ou ao desvio padrão da interceção com o eixo dos Y. No caso da determinação do LOD através dos métodos baseados na avaliação visual ou relação entre sinal e ruído é aceitável a apresentação de cromatogramas, para comprovar a veracidade dos factos (ICH, 2005) 1.7.7 Limite de quantificação A ICH define limite de quantificação (LOQ) como “a concentração mais baixa de determinado analito que pode ser quantificada através do método analítico, com um nível Mestrado em Controlo de Qualidade 21 de precisão e exatidão aceitável“ (ICH, 2005). O LOQ pode ser determinado através dos seguintes métodos: 1. Baseado na avaliação visual. Consiste na determinação do LOQ através da análise de amostras com concentrações conhecidas do analito em estudo, estabelecendo um nível mínimo para o qual o analito é quantificado através da observação dada pelo sistema (e.g. cromatograma). 2. Baseado na relação entre o sinal-ruído. O LOQ é determinado pelo rácio entre o sinal e o ruído, isto é, medindo os sinais obtidos através de amostras contendo baixas concentrações de analito, e analisando-as comparativamente ao sinal obtido por amostras em branco, estabelece-se uma concentração mínima para a qual o analito pode ser quantificado. A razão típica entre o sinal e o ruído está depreendida num rácio de 10:1. 3. Baseado na relação entre o desvio padrão da resposta e a curva de calibração. Este método expressa o LOQ através da expressão: 𝐿𝑂𝑄 = 10 × 𝜎 𝑚 Sendo, 𝑚 – declive da curva de calibração referente ao coeficiente de regressão do analito de interesse e 𝜎 a estimativa do desvio padrão do sinal detetado baseado:  Na amostra em branco, calculando o desvio padrão do sinal dado relativamente a um número de amostras em branco;  No estudo numa curva de calibração específica, constituída por amostras com uma gama dentro do LOQ. Que posteriormente são utilizadas os valores do desvio padrão relativo referente à regressão linear ou ao desvio padrão da interceção com o eixo dos Y. Mestrado em Controlo de Qualidade 22 1.7.8 Sensibilidade A sensibilidade de um método é muitas vezes confundida com o limite de deteção, sendo que a ICH define sensibilidade como “a capacidade do método analítico para diferenciar pequenas alterações na concentração do analito em estudo” (ICH, 2015). A sensibilidade é normalmente representada pelo declive, correspondente ao coeficiente de regressão da curva de calibração, do analito em estudo. 1.7.9 Recuperação A recuperação é definida como a relação da quantidade de analito de interesse, que é extraída e passivelmente de ser quantificada em função da quantidade de analito de interesse presente ou adicionado na amostra. Através da realização de testes de recuperação é possível verificar se a concentração do analito de interesse presente na amostra é afetada pelo procedimento de extração utilizado. O teste de recuperação deve ser realizado recorrendo a 3 concentrações conhecidas do analito em estudo, distribuídas equitativamente entre o limite de quantificação e a concentração mais elevada da gama de trabalho utilizada para o dado analito. A ICH recomenda que a recuperação de um dado analito deve ser avaliada usando um mínimo de 9 determinações, sobre um nível mínimo correspondente a 3 concentrações definidas dentro da gama de trabalho do analito em estudo (e.g. 3 concentrações replicadas 3 vezes). Através da quantificação do analito na amostra fortificada, e sabendo a quantidade de analito adicionado verifica-se os níveis recuperação ou perda provocados pelo procedimento extrativo através da seguinte expressão: 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜(%)=𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝐹𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎 − 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝐴𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑎 ∗100 Sendo: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝐹𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎, corresponde à concentração medida na amostra fortificada; 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥, concentração medida na amostra não fortificada; 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝐴𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑎 , concentração de analito adicionada. Mestrado em Controlo de Qualidade 23 1.8 Objetivos do trabalho Pelo exposto, e dado que a presença de adulterantes sintéticos em SABP é um risco de saúde pública que tem causado preocupações crescentes dado o aumento do número de casos descritos na bibliografia, o presente trabalho visou o desenvolvimento de uma técnica analítica que permita a análise precisa, rápida, eficiente e economicamente viável, para o rastreio de inibidores da PDE-5 adicionados aos SABP. Refira-se que os inibidores da PDE-5 são utilizados como medicamento para o tratamento da disfunção eréctil, pelo que a sua presença em SABP é considerada como adulteração, sendo assim ilegal segundo a Diretiva 2002/46/EC da União Europeia. Assim, este trabalho teve como objetivos:  A otimização e validação de um método de HPLC-DAD-FLD, para a análise de inibidores da PDE-5 adicionados ilegalmente aos SABP;  Aplicação da metodologia desenvolvida a amostras comercializadas em Portugal. Em particular, proceder à deteção e quantificação de possíveis inibidores da PDE- 5 presentes em 12 SABP que alegam a melhoria do desempenho sexual, disponíveis no mercado português. Mestrado em Controlo de Qualidade 24 2. Materiais e Métodos Mestrado em Controlo de Qualidade 25 2.1 Reagentes e padrões Para este estudo foram utilizados cinco padrões de inibidores da PDE-5 (Citrato de Sildenafil (SIL); Hidrocloreto de Vardenafil (VAR); Tadalafil (TAD); Acetildenafil (ACE); Tiosildenafil (THS), sendo que dois destes correspondem a análogos do Sildenafil (Acetildenafil e Tiosildenafil). Foi também adquirido o padrão de Hidrocloreto de Iohimbina (YOH) (substância ativa encontrada na planta tradicionalmente conhecida por pau-de-cabinda), devido a alegações sobre a semelhança do efeito farmacológico desta com os inibidores da PDE-5. As características e origem dos padrões utilizados encontram-se descritas na Tabela 1. a CRS - Substância Química de Referência b Número CAS- Chemical abstracts service Os reagentes utilizados para este estudo foram: metanol (chromasolv®, HPLC grade ≥ 99.9%, Sigma-Aldrich, EUA), acetonitrilo (chromasolv®, HPLC grade ≥ 99.9%, Sigma- Aldrich, EUA) e acetato de amónio (ACS-Reag., ≥ 98%, Carlo Erba, França). A água ultrapura usada proveio de um sistema de purificação de água Seralpur PRO 90 CN. Tabela 1 – Características dos padrões utilizados neste trabalho Nome Fórmula Molecular Número CASa Grau de Pureza (%) Fornecedor Citrato de Sildenafil (CRS)b C28H38N6O11S 171599-83-0 ≥98,8% European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare, France Hidrocloreto de Vardenafil (CRS)b C23H33ClN6O4S 330808-88-3 ≥90,5% European Directorate for the quality of medicines e Healthcare, France Tadalafil (CRS)b C22H19N3O4 171596-29-5 ≥99,9% European Directorate for the quality of medicines e Healthcare, France Hidrocloreto de Iohimbina C21H27ClN2O3 65-19-0 ≥98% Sigma-Aldrich, USA Acetildenafil C25H34N6O3 831217-01-7 ≥98% Cayman Chemical, USA Tiosildenafil C22H30N6O3S2 479073-79-5 ≥98% Cayman Chemical, USA Mestrado em Controlo de Qualidade 26 2.2 Amostras No mercado português os SABP para a melhoria do desempenho sexual, são comercializados essencialmente em supermercados, ervanárias, lojas de produtos naturais, farmácias, na internet e através das televendas. As amostras utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pela Autoridade de Segurança Alimentar e Económica (ASAE), devidamente seladas e identificadas. Por razões legais os nomes das amostras, independentemente do resultado, não serão divulgados, procedendo-se assim à codificação do nome das amostras (SA1-SA12). Na Tabela 2 encontram-se descritas as caraterísticas dos 12 SABP que foram analisados durante este trabalho. 2.3 Preparação de soluções 2.3.1 Solução padrão individual Foram preparadas 6 soluções padrão individuais correspondentes aos 6 padrões de inibidores da PDE-5 adquiridos, com uma concentração de 2mg/mL. As soluções foram feitas pesando 10mg de cada padrão de inibidores da PDE-5 numa balança analítica (AG204, Mettler Toledo), onde individualmente foram transferidos para vials de 10mL âmbar, dissolvendo-se em seguida em 5 mL de uma solução de acetonitrilo (ACN)/ metanol (MeOH) na proporção de 50:50 v/v, obtendo-se assim uma concentração de 2mg/mL. Todas as 6 soluções padrão individual foram armazenadas no congelador a uma temperatura de -20ºC até à sua utilização. 2.3.2 Solução padrão de trabalho Para a preparação da solução padrão de trabalho, retirou-se 200µL de cada solução padrão individual para um único vial âmbar de 10 mL, diluindo posteriormente com um volume de 800µL de ACN/MeOH (50:50 v/v), preparando assim uma solução com a mistura de todos os padrões de inibidores da PDE-5 (SIL; VAR; TAD; ACE; THS; YOH) com uma concentração de 200µg/mL. A solução padrão de trabalho foi também armazenada no congelador a uma temperatura de -20ºC até à sua utilização. A partir desta solução foram preparadas as restantes diluições sucessivas em ACN/MeOH (50:50 v/v), correspondentes à gama de concentrações (5; 10; 25; 50; 100; 150; 200 µg/mL) Mestrado em Controlo de Qualidade 27 utilizadas para a verificação dos parâmetros de linearidade do método analítico em estudo. 2.3.3 Preparação da fase móvel usada na técnica analítica de HPLC-DAD-FLD A fase móvel utilizada no método de HPLC-DAD-FLD tem como base dois eluentes (A e B), sendo o eluente A constituído por uma solução de acetato de amónio em água ultra pura com uma concentração de 50mM a pH 7, e o eluente B constituído por uma solução de ACN/MeOH na proporção de 50:50 (v/v). Todos os eluentes foram desgaseificados num sistema de vácuo com agitação contínua durante 15 minutos antes de serem utilizados no sistema de HPLC. 2.4 Extração das amostras Procedeu-se à extração das amostras pesando o conteúdo de uma cápsula; um comprimido ou uma tira sublingual, numa balança analítica (AG204, Mettler Toledo), para um tubo de falcon, sendo adicionado posteriormente 15 mL solvente, composto por uma mistura de ACN:MeOH (50:50 v/v). As amostras foram agitadas num agitador automático (Edmund Buhler GmBH) durante 30 minutos a cerca de 300 rotações por minuto (rpm) à temperatura ambiente. Após agitação, as amostras foram submetidas a uma extração por ultrassons (Fungilab, Espanha) durante 5 minutos à temperatura ambiente. Seguiu-se uma fase de limpeza da amostra através de centrifugação (Heraeus Megafuge 16, Thermo Scientific) durante 10 minutos a 2400 g. Para finalizar o procedimento de extração, o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,22 µm (FilterBio®) e posteriormente diluído em ACN/MeOH (50:50 v/v) na concentração de 1:50 antes de ser injetado no sistema de HPLC. Todas as amostras foram submetidas a extração em triplicado e cada extrato obtido analisado individualmente. A Figura 1 apresenta o esquema do procedimento de extração realizado nas amostras. Figura 1 – Esquema do procedimento de extração efetuado nas amostras de SABP Pesagem da amostra Adição de 15ml de ACN:MeOH (50:50 v/v) Agitação continua por 30 min a 300 rpm Banho de ultra-sons durante 5 min à temperatura ambiente Centrifugação durante 10 min a uma velocidade de 2400 g Filtração do sobrenadante através de um filtro de 0.22µm Diluição do sobrenadante filtrado nas diluição de 1:50 Mestrado em Controlo de Qualidade 28 Tabela 2 - Características dos SABP em estudo Código da Amostra Tipo de Formulação Quantidade por embalagem Ingredientes descritos no rótulo Validade SA1 Cápsula 12 Extratos de: Bombyx Mori L; Wild Yam; Ginseng da Sibéria; Salgueiro Branco; Jujuba; Pimenta Caiena 04/2017 SA2 Cápsula 10 Extratos de Raiz do Ártico (Rhodiola Rosea); Feno-grego (Trigonella foenum-graecum); Ginseng Siberiano (Elentherococcus Senticosus); Noz moscada (Myrisca Frangrans); Açafrão (Crocus Sativus); Erva-leiteira (Polygala Comosa); Pinheiro (Pinus Estris); Alcaçuz (Glycyyrhiza Glabra); Urtiga comum (Urtica Dioica); Excipientes: gelatina, glicerol, corantes E133 e E171 06/2016 SA3 Cápsula 4 Gelatina: Turnera difusa, Anti-Aglomerante: Maltodextrina de Milho, L-Arginina, Anti- Aglomerante: Fosfato tricálcio, Pausinystalia macroceras, Yohimbe, Tributus terrestris; Ginkgo biloba, L-Lisina; Estabilizador: Amido de Trigo, Óxido de Zinco, Vitamina B3, Extrato seco concentrado de Schisandra chinensis; Anti-Aglomerante: Estereato de Magnésio, Silicato de Magnésio, Vitamina B6 03/2017 SA4 Cápsula 3 Extratos de: Ginseng da Sibéria; Salgueiro Branco; Jujuba; Pimenta Caiena; Urtiga; Semente de Abóbora; Avena Sativa. Celulose e Estearato de Magnésio. 09/2017 SA5 Cápsula 8 Gelatina: Turnera difusa, Damiana; Anti-Aglomerante: Maltodextrina de Milho, L-arginina, Anti-Aglomerante: Fosfato tricálcia, Pausinystalia macróceras, Yohimbe, Tribulus terrestres, Tribulus, Ginkgo biloba, L-Lisina; Estabilizador: Amido de Trigo, Óxido de Zinco, Vitamina B3; Extrato seco concentrado de Schisandra; Anti-Aglomerante: Estereato de Magnésio, Silicato de Magnésio, Vitamina B6 09/2016 Mestrado em Controlo de Qualidade 35 comparados os espetros UV obtidos pelos picos do cromatograma das amostras com os espectros UV correspondentes aos padrões. Posteriormente à identificação, foi realizada a quantificação dos analitos presentes nas amostras, com base na regressão linear das curvas de calibração determinadas pela relação entre as áreas obtidas e as concentrações da solução padrão de trabalho, através dos diferentes tipos de deteção (DAD e FLD). Tabela 6 – Tempos de retenção dos padrões obtidos pelos sistemas de deteção DAD e FLD Padrões Tempo de retenção (min) DAD FLD Tadalafil 10,95 11,18 Iohimbina 12,14 12,29 Acetildenafil 12,81 nd Sildenafil 16,01 nd Vardenafil 17,06 17,16 Tiosildenafil 27,95 nd nd - não determinado Figura 2 - Espectro UV obtido pelo padrão de Sildenafil a 290 nm 223 nm 295 nm Mestrado em Controlo de Qualidade 36 Figura 3 – Espectro de UV obtido pelo padrão de Vardenafil a 290nm Figura 4 - Espectro UV obtido pelo padrão de Tadalafil a 290nm Figura 5 - Espectro UV obtido pelo padrão de Tiosildenafil a 290nm 223 nm 243 nm 223 nm 283 nm 227 nm 355 nm 295 nm Mestrado em Controlo de Qualidade 37 Figura 6 - Espectro UV obtido pelo padrão de Acetildenafil a 290nm Figura 7 - Espectro UV obtido pelo padrão de Iohimbina a 290nm 3.2 Otimização das condições analíticas 3.2.1 Otimização do gradiente dos eluentes Inicialmente foram selecionados os eluentes com base no trabalho descrito na literatura (Fejos et al., 2014). Posteriormente fez-se a otimização do gradiente da fase móvel, visando a separação eficiente de todos os inibidores da PDE-5 em estudo, com base na coluna cromatográfica utilizada. Para isso preparou-se uma solução contendo a mistura dos padrões de SIL, VAR, TAD e YOH, numa concentração de 100µg/mL, que foi injetada no sistema de HPLC-DAD-FLD. 235 nm 279 nm 223 nm 279 nm Mestrado em Controlo de Qualidade 38 Os padrões Acetildenafil e Tiosildenafil não foram incluídos nesta injeção, por motivos de logística, pois ainda não tinham sido entregues no laboratório, tendo sido posteriormente incluídos. A partir da análise do cromatograma (Figura 8), obtido com as condições do gradiente determinado inicialmente, concluiu-se que seria necessário realizar a alteração do gradiente dos eluentes da fase móvel, de modo a permitir a separação dos analitos em estudo dentro de um tempo de corrida aceitável, visando sempre a obtenção da melhor resolução dos picos cromatográficos. Figura 8 – Cromatograma obtido pela aplicação do gradiente determinado inicialmente, para os padrões de SIL, VAR, TAD e YOH Através dos diferentes tempos de retenção obtidos pelos compostos injetados, e analisando comparativamente, ao tempo e percentagem necessária de eluente B, para que estes eluíssem da coluna, desenvolveu-se após algumas tentativas um gradiente X1, constituído de modo a que a percentagem de eluente B (fase orgânica) fosse mantida durante mais tempo na corrida, permitindo que os compostos eluíssem mais rapidamente (com um tempo de retenção menor). Foi assim efetuada uma nova análise dos padrões de SIL, VAR, YOH e TAD na concentração de 100µg/mL, cujo cromatograma pode ser observado na Figura 9. Apesar de se obter uma boa separação de todos os compostos relativamente ao tempo total da corrida, o tempo de retenção para os diferentes compostos não sofreu alterações significativas, comparativamente ao constatado para o gradiente selecionado inicialmente. SIL VAR TAD YOH Mestrado em Controlo de Qualidade 39 Figura 9 - Cromatograma obtido pela aplicação do gradiente X1, para os padrões de SIL, VAR, TAD e YOH (deteção a 290 nm) Com a introdução dos padrões de Acetildenafil e Tiosildenafil, foi necessário introduzir modificações no gradiente que permitissem uma separação eficiente de todos os compostos e ao mesmo tempo reduzisse o tempo total da corrida. Devido à afinidade descrita (Sacré et al., 2011; Fejos et al., 2014) dos padrões em estudo com solventes orgânicos, foi desenvolvido um gradiente X2, com uma percentagem inicial maior de eluente B (fase orgânica), do que a utilizada nos gradientes anteriores, sendo esta percentagem de eluente B inicial aumentada gradualmente ao longo do tempo da corrida para o máximo de 98%, possibilitando que os compostos eluíssem mais rapidamente da coluna cromatográfica. Foram incluídos na injeção de teste do gradiente final, os padrões de ACE e THS, aos restantes padrões (SIL, VAR, TAD e YOH). A solução padrão de trabalho foi injetada com uma concentração de 100µg/mL, podendo o cromatograma ser observado na Figura 10. Verificou-se que o tempo de retenção dos compostos diminuiu significativamente com a aplicação do gradiente X2, sendo que para os compostos TAD, YOH, SIL e VAR o tempo de retenção diminuiu de 24,6 min; 23,8 min; 29,0 min e 29,9 min obtido pelo gradiente inicialmente determinado, para os tempos de retenção de 10,95 min; 12,14 min; 12,81 min e 17,06 min respetivamente, através da aplicação do gradiente X2 (ver capitulo 2.6.1 Tabela 5). No caso dos compostos ACE e THS o tempo de retenção foi de 12,81min e 27,95min, respetivamente. VAR SIL TAD YOH Mestrado em Controlo de Qualidade 40 Figura 10 - Cromatograma obtido pela aplicação do gradiente X2, para os padrões de SIL, VAR, TAD e YOH (deteção a 290 nm) Pela da análise dos diferentes gradientes testados, foi escolhido o gradiente X2, como o gradiente a ser utilizado na metodologia analítica aplicada à análise de inibidores da PDE-5 adicionados ilegalmente aos SABP, pois mostrou-se capaz de separar, com uma boa resolução, os picos de todos os compostos da mistura padrão de trabalho com um tempo de corrida satisfatório de 35min. 3.2.2 Otimização das condições de fluorescência Como foi descrito anteriormente, a deteção por DAD constitui um dos métodos usados para a identificação e quantificação de inibidores da PDE-5 em SABP. A utilização do detetor FLD prendeu-se com a maior sensibilidade e seletividade deste detetor comparativamente com o DAD bem como com a presença de compostos fitoquímicos na matriz dos SABP que poderiam influenciar a deteção por DAD, podendo levar a uma quantificação errada dos analitos em estudo. Desta forma, a elevada sensibilidade e seletividade associadas à deteção por fluorescência poderá ser uma mais-valia na identificação e quantificação dos inibidores da PDE-5. Contudo, como referido, não existem referências bibliográficas que descrevam a utilização da deteção por fluorescência para a determinação de inibidores da PDE-5, exceto para o VAR, em que é descrita a sua deteção e quantificação através da análise de HPLC-FLD para pequenos volumes de plasma de rato e bílis (Cheng et al., 2007). YOH TAD ACE VAR SIL THS Mestrado em Controlo de Qualidade 41 Pretendendo utilizar o detetor de FLD para a identificação e quantificação dos inibidores da PDE-5, foram inicialmente caracterizados os comprimentos de onda de excitação e emissão para os diferentes padrões do estudo, recorrendo ao procedimento descrito no capítulo 2.5 deste trabalho, sendo os valores obtidos posteriormente utilizados para programar as condições de fluorescência usada. Para testar as condições de deteção, foi injetada a solução de trabalho com uma concentração de 100µg/mL no sistema de HPLC-DAD-FLD. Através do cromatograma obtido pela deteção FLD (Figura 11) observou-se a presença de 3 picos, compreendidos no tempo de retenção dos compostos TAD (11,18min), YOH (12,29min) e VAR (17,16min). Constatou-se que para os tempos de retenção para os quais deveriam de estar presentes os picos de SIL, ACE e THS, analisando comparativamente com o cromatograma obtido pela deteção por DAD, para a mesma injeção, verificou-se que este não foram detetados. Figura 11- Cromatograma obtido pela deteção por FLD para as soluções padrão de trabalho nas concentrações de 100µg/mL (à direita) e 200µg/mL (à esquerda) (deteção a 290 nm) Considerando que para a obtenção das condições de fluorescência utilizadas, a concentração usada foi de 1g/mL, será possível que a concentração de 100µg/mL injetada, não seja suficiente para evidenciar um sinal que permita a deteção dos compostos SIL, ACE e THS. Efetuou-se uma nova injeção da solução padrão de trabalho com uma concentração de 200µg/mL, pretendendo que o aumento da concentração evidenciasse a deteção por fluorescência para os padrões de SIL, ACE e THS. No entanto, observando o cromatograma obtido (Figura 11), os compostos SIL, ACE e THS não foram detetados, o que poderá significar que a deteção por fluorescência para o SIL e seus análogos, ACE e THS, requer uma concentração superior à utilizada (> 200 µg/mL). YOH TAD VAR YOH TAD VAR Mestrado em Controlo de Qualidade 42 Apesar dos padrões de SIL, ACE e THS não serem detetados por fluorescência, este tipo de deteção foi adotada para os restantes padrões de inibidores da PDE-5 (VAR, TAD e YOH) utilizando as condições descritas no capítulo 2.6.1 (Tabela 4). 3.2.3 Otimização do processo de extração das amostras A generalidade dos SABP, têm uma matriz bastante complexa composta por uma grande variedade de plantas e/ou extratos de plantas, que podem dificultar a pesquisa de adulterantes adicionados ilegalmente a estes suplementos. A presença de compostos fenólicos, típicos de matrizes vegetais, podem apresentar espectros similares ao dos compostos inibidores da PDE-5 em estudo. A otimização da extração destes compostos dos SABP é por isso, essencial reduzir o efeito causado pela matriz dos suplementos e para permitir a deteção mais eficiente de possíveis adulterantes adicionados. Devido às características dos compostos em estudo, o seu processo de extração passa pelo uso de solventes orgânicos como o metanol e/ou acetonitrilo ou até misturas aquosas dos mesmos. Essa solução ou suspensão é frequentemente submetida a um processo de agitação, sonicação e centrifugação, sendo posteriormente filtrada e diluída (Savaliya et al., 2010; Song et al., 2012; Vaysse et al., 2012; Jankovics et al., 2013; Lebel et al., 2014). Para otimizar o processo de extração de inibidores da PDE-5 em SABP empregue neste trabalho foram testados os seguintes condições: 1. Ensaio de extração com 5 mL ACN/MEOH (50:50) x3 – Uma amostra de SAPB foi extraída 3 vezes consecutivas com 5 mL de solvente orgânico de acordo com o esquema da Figura 1. Após a centrifugação, os sobrenadantes das três extrações foram combinados, filtrados e diluídos antes de serem analisados por HPLC-DAD-FL. Este ensaio foi realizado em duplicado. 2. Ensaio de extração com com 15 mL ACN/MEOH (50:50) x3 - Uma amostra de SAPB foi extraída uma vez com 15 mL do solvente orgânico de acordo com o esquema da Figura 1. Este ensaio foi realizado em duplicado. Todos os extratos obtidos por cada réplica foram injetados em triplicado no método analítico usado já com as condições otimizadas. A identificação do adulterante para as amostras acima descritas, foi realizada com base na deteção por DAD. A quantificação tem como base a curva de calibração referente ao adulterante detetado. Após a observação dos resultados, constatou-se que uma única extração com 15mL era mais eficiente na recuperação do composto em estudo. Os resultados obtidos encontramse descritos na Tabela 7. Mestrado em Controlo de Qualidade 43 Tabela 7 – Recuperação (%) obtida de SIL para os diferentes ensaios de extração Réplica da amostra Volume inicial de solvente orgânico para cada extração (mL) Recuperação 1 ª Extração 2ª Extração 3º Extração Média (%) CV (%) 1 5 5 5 58 7,5 2 15 - - 90 9,8 3.3 Validação do método Como foi referido anteriormente no capítulo 1.7, sempre que são otimizadas as condições de um método analítico ou implementadas alterações significativas ao mesmo, deve ser avaliado o seu desempenho com base em parâmetros definidos, que de uma forma geral pretendem demostrar a qualidade, consistência e fiabilidade dos resultados obtidos pelo método, designando-se assim como validação do método analítico. Por este motivo, procedeu-se assim à validação do método analítico usado para este estudo através da avaliação dos seguintes parâmetros analíticos: gama de trabalho; linearidade; LOD; LOQ; precisão (repetibilidade; precisão intermédia) e ensaios de recuperação. 3.3.1 Gama de Trabalho A gama de trabalho foi constituída a partir de diluições da solução padrão de trabalho, contendo a mistura dos 6 padrões de inibidores da PDE-5, para as concentrações: 200; 150; 100; 50; 25; 10 e 5 µg/mL. A avaliação dos parâmetros de validação do método foi realizada com base nas concentrações descritas da gama de trabalho. 3.3.2 Linearidade A linearidade do método analítico para os 6 inibidores da PDE-5, foi avaliada na gama de trabalho compreendida entre as concentrações 5 - 200µg/mL. Para tal, foram analisadas no sistema de HPLC-DAD-FLD, 5 soluções de diferentes concentrações utilizando a gama de trabalho anteriormente descrita. Para cada substância padrão, foi obtida a respetiva curva de calibração através de regressão linear entre a área do sinal obtido Mestrado em Controlo de Qualidade 44 pelo sistema em função das diferentes concentrações da solução padrão de trabalho, e calculado o coeficiente de correlação quadrático. Na Figura 12 e 13 apresentam-se as curvas de calibração obtidas para os diferentes compostos através de DAD e FLD, onde se pode observar a equação da reta e o coeficiente de correlação quadrático para cada um dos padrões usados. Observando os coeficientes de correlação das curvas de calibração apresentadas para os seis padrões utilizados (Figura 12), para todos os compostos foi obtido um R2 superior a 0,99 demostrando assim a existência de uma relação diretamente proporcional entre as áreas cromatográficas obtidas nas condições utilizadas e a concentração do analito na amostra em estudo. Como foi descrito no capítulo 3.1.2 deste trabalho, os compostos SIL, ACE e THS, demonstraram não ser detetáveis por fluorescência para a gama de trabalho utilizada, pelo que, apenas foi observada a linearidade dos compostos VAR, YOH e TAD obtidos através da deteção por fluorescência na gama de trabalho de trabalho compreendida na concentração de 5 - 150µg/mL. Figura 12 - Curvas de calibração e respetivos coeficiente de correlação, para os compostos em estudo pela deteção por DAD y = 16323x + 47477 R² = 0,991 0 1000000 2000000 3000000 4000000 0 100 200 300 Área do pico cromatográfico Concentração (µg/mL) Sildenafil y = 17347x + 61789 R² = 0,991 0 1000000 2000000 3000000 4000000 0 100 200 300 Área do pico cromatográfico Concentração (µg/mL) Tiosildenafil y = 37932x + 107194 R² = 0,991 0 5000000 10000000 0 100 200 300 Área do pico cromatográfico Concentração (µg/mL) Acetildenafil y = 12316x + 34087 R² = 0,992 0 1000000 2000000 3000000 0 100 200 300 Área do pico cromatográfico Concentração (µg/mL) Iohimbina y = 25566x + 96611 R² = 0,993 0 2000000 4000000 6000000 0 100 200 300 Área do pico cromatográfico Concentração(µg/mL) Tadalafil y = 10551x + 54868 R² = 0,992 0 1000000 2000000 3000000 0 100 200 300 Área do pico cromatográfico Concentração (µg/mL) Vardenafil Mestrado em Controlo de Qualidade 51 3.4 Análise das amostras de Suplementos Alimentares à Base de Plantas Após a otimização e validação do método analítico, procedeu-se à análise das 12 amostras de SABP descritas na Tabela 2. Para cada amostra foram feitas três extrações, sendo que para cada extrato a sua injeção foi realizada em triplicado. A identificação e quantificação de possíveis adulterantes presentes nos 12 SABP foi feita através do procedimento descrito no capítulo 3.1 deste trabalho. Na Tabela 14 apresentam-se os resultados das análises às amostras de SABP que se verificou estarem adulteradas com inibidores da PDE-5 com base na análise de screening proposta por HPLC-DAD-FLD. Para as amostras não incluídas na Tabela 14, não foi detetado nenhuma das substâncias adulterantes em estudo. A partir dos cromatogramas das amostras SA1 e SA5 obtidos pela deteção DAD (Figura 14), foram detetados dois picos cromatográficos com tempos de retenção similares aos tempos de retenção apresentados pelos padrões de SIL e THS. Figura 14 - Exemplo de um cromatograma obtido para amostra SA1 e SA5 (deteção a 290 nm) Observando os espectros de UV obtidos para os diferentes picos cromatográficos das amostras SA1 e SA5, verificou-se que para o pico cromatográfico correspondente ao mesmo tempo de retenção do padrão de SIL em ambas as amostras, os espectros UV (Figura 15), obtiveram a mesma estrutura gráfica, e comprimentos de onda para o qual se observa uma máximo de absorção (λmax), semelhantes aos apresentados pelo espectro UV do padrão do SIL (Figura 2). O mesmo foi observado para os espectros UV (Figura 16) correspondentes ao pico cromatográfico do composto THS, que mais uma vez por THS SIL SIL THS Mestrado em Controlo de Qualidade 52 comparação com o espectro UV do padrão de THS (Figura 5), demonstrou λmax coincidentes. Figura 15 - Exemplo dos espectros UV obtidos para o pico correspondente ao SIL para as amostras SA1 (esquerda) e SA5 (direita) Figura 16 - Exemplo dos espectros UV obtidos para o pico correspondente ao THS para as amostras SA1 (esquerda) e SA5 (direita) Na amostra SA4 foi detetado apenas um pico cromatográfico (Figura 17), tendo este um tempo de retenção (Rt – 23,80 min) diferente de todos os padrões de inibidores da PDE-5 injetados. Na amostra SA11 (Figura 18) este composto também está presente no mesmo tempo de retenção (Rt – 23,80 min) que a amostra SA4 e quando se observa os espectros de UV (Figura 19) correspondente a este pico cromatográfico para ambas as amostras, verificou-se que os espectros de UV têm uma estrutura gráfica muito semelhante ao espectro UV do padrão do THS (Figura 5). Os comprimentos de onda máximos para o composto presente nas amostras SA4 e SA11 não correspondem totalmente aos comprimentos de onda observados no espectro UV do padrão THS, porém existe uma grande semelhança nos valores dos comprimentos de onda e na estrutura gráfica o que poderá sugerir tratar-se de um composto com uma estrutura molecular muito semelhante ao do composto THS. Tendo em conta que o THS é um análogo estrutural do SIL, e o composto presente nas amostras SA4 e SA11 tem um 221 nm 295 nm 222 nm 295 nm 227 nm 295 nm 355 nm 355 nm 295 nm 227 nm Mestrado em Controlo de Qualidade 53 especto UV muito semelhante ao espectro UV do padrão do THS, poderá eventualmente tratar-se também de um análogo do sildenafil (ASIL). Figura 17 - Exemplo de um cromatograma obtido para amostra SA4 (deteção a 290 nm) Figura 18 - Exemplo de um cromatograma obtido para amostra SA11 (deteção a 290 nm) Figura 19 - Exemplo dos espectros UV obtidos para o pico correspondente ao análogo do Sildenafil (ASIL) para as amostras SA4 (esquerda) e SA11 (direita) Provável análogo do Sildenafil THS Provável análogo do sSildenafil 211nm 355 nm 295 nm 211 nm 295 nm 355 nm Mestrado em Controlo de Qualidade 54 Figura 21 - Exemplo dos espectros UV obtidos para o pico correspondentes as amostras SA8 (a), SA9 (b) e SA10 (c) Na amostra SA11 não se deteta apenas um inibidor da PDE-5. Para além do composto não identificado e designado como ASIL, nesta amostra também se detetou um pico cromatográfico com um tempo de retenção e espetro UV semelhante ao do padrão THS. Nas amostras SA8, SA9 e SA10 (Figura 20) foi detetada a presença de um pico cromatográfico com tempo de retenção e UV similar aos apresentados pelo padrão TAD (Figura 4). Figura 20 - Exemplo de um cromatograma obtido para amostra SA8,SA9 e SA10 (deteção a 290 nm) TAD 224 nm 283 nm (c) (b) (a) 223nm 222nm 283 nm 283 nm Mestrado em Controlo de Qualidade 55 Através da deteção por fluorescência foi obtido um cromatograma semelhante para as amostras SA8, SA9 e SA10. Em ambas as amostras foi possível determinar um pico cromatográfico com um tempo de retenção de 11,18 min, semelhante ao obtido pelo padrão tadalafil determinado pelo detetor de fluorescência nas condições de fluorescência descritas no capítulo 3.1 deste trabalho. Assim, este adulterante foi quantificado com base na reta de calibração obtida pelo padrão de TAD através da deteção por FLD. Através do método analítico aplicado neste trabalho as amostras SA2, SA3, SA6 e SA12, não apresentaram nenhum pico cromatográfico que correspondesse aos inibidores da PDE-5 avaliados neste estudo. Conclui-se assim que estas amostras não se encontram adulteradas com nenhum inibidor da PDE-5 utilizado como padrão neste estudo. Após identificação dos adulterantes presentes nas amostras SA1, SA4, SA5 SA8, SA9, SA10 e SA11, procedeu-se à sua quantificação com base na curva de calibração adequada para cada composto (Tabela 14). No caso das amostras SA4 e SA11, uma vez que o espetro do composto não identificado sugere tratar-se de um análogo do sildenafil, procedeu-se à sua quantificação com base na curva de calibração deste padrão. Observando a Tabela 14 verifica-se que das 12 amostras de SABP analisadas por este método, sete (SA1, SA4, SA5, SA8, SA9, SA10 e SA11) encontram-se adulteradas com inibidores da PDE-5, sendo que em três das sete amostras adulteradas, (SA1,SA5 e SA11) foi detetado mais de que um inibidor da PDE-5. Constatou-se que o SIL, TAD e THS foram os adulterantes predominantes nas 7 amostras para as quais foi detetada a adição ilegal de inibidores da PDE-5. Comparativamente às dosagens existentes para o medicamento Viagra (25, 50 e 100 mg de princípio ativo), as quantidades determinadas do composto SIL nas amostras SA1 e SA5, 26,9 e 32,3 mg/caps, respetivamente, são da ordem de grandeza das utilizadas no medicamento com a dosagem inferior (25mg), o que permitirá obter um efeito farmacológico similar. Por encontrarmos o SIL em quantidades elevadas, podemos descartar a possibilidade de adulteração não intencional. De referir, que dosagens semelhantes de SIL foram também descritas em trabalhos anteriores (Gratz et al., 2004; Abourashed et al., 2007; Chen et al., 2009; Zhang et al., 2010; Fejos et al 2014). A adulteração de SABP com inibidores da PDE-5 impõe elevados risco de saúde para o consumidor, que deste modo desconhecendo a sua adulteração, poderá consumir outros medicamentos que quando são administrados concomitantemente com inibidores da PDE-5 causam efeitos adversos graves como estado de hipotensão que poderá levar a morte. Mestrado em Controlo de Qualidade 56 Tabela 14 – Resultados das análises às amostras de SABP adulteradas com inibidores da PDE-5, através da análise por HPLC-DAD-FLD Código da amostra Amostra Nome do Inibidor da PDE-5 detetado na amostra Quantidade de inibidor da PDE-5 presente, por cápsula ou tira sublingual (mg) DAD FLD SA1 1 Sildenafil (SIL); Tiosildenafil (THS) (SIL) 32,7 ± 0,7 (THS) 71,7 ± 0,8 nd 2 (SIL) 30,9 ± 1,9 (THS) 67,5 ± 4,1 nd 3 (SIL) 32,5 ± 0,5 (THS) 72,3 ± 0,7 nd SA4 1 Análogo do Sildenafil (ASIL) (ASIL) 90,5 ± 2,9 nd 2 (ASIL) 82,2 ± 1,8 nd 3 (ASIL) 91,3 ± 2,4 nd SA5 1 Sildenafil (SIL); Tiosildenafil (THS) (SIL) 27,3 ± 0,7 (THS) 61,5 ±1,4 nd 2 (SIL) 26,9 ± 0,6 (THS) 60,7 ± 1,7 nd 3 (SIL) 30,3 ±1,4 (THS) 64,1 ± 0,4 nd SA8 1 Tadalafil (TAD) (TAD) 2,7 ± 0,2 1,5 ± 0,1 2 (TAD) 2,4 ± 0,1 1,3 ± 0,2 3 (TAD) 2,2 ± 0,7 1,1 ± 0,4 SA9 1 Tadalafil (TAD) (TAD) 24,0 ± 0,8 21,0 ± 0,88 2 (TAD) 13,5 ±0,1 10,9 ± 0,18 3 (TAD) 25,8 ± 0,7 22,2 ± 0,61 SA10 1 Tadalafil (TAD) (TAD) 22,5 ± 0,7 20,2 ± 0,7 2 (TAD) 25,7 ± 1,2 20,1 ± 1,1 SA11 1 Tiosildenafil (THS); Análogo do Sildenafil (ASIL) (THS) 77,2 ± 0,4 (ASIL) 33,4 ± 0,4 nd 2 (THS) 72,1 ± 1,2 (ASIL) 31,5 ± 0,2 nd 3 (THS) 92,0 ± 4,3 (ASIL) 40,3 ± 2,2 nd nd - Valor não determinado Mestrado em Controlo de Qualidade 57 Normalmente os indivíduos que apresentam problemas cardiovasculares para os quais são medicados com nitratos, alfa-bloqueadores ou hipertensivos é desaconselhada a toma de inibidores da PDE-5. Nas amostras SA1 e SA5 e SA11 foi detetado outro tipo de adulterante, correspondente a um dos análogos do Sildenafil, o Tiosildenafil (THS). Ambas as amostras apresentaram quantidades similares (60,7 – 72,3 mg/caps). Considerando que para a maior parte dos análogos dos inibidores da PDE-5 não existem ensaios de farmacocinética e/ou farmacodinâmica, a quantidade presente de THS nas amostras SA1,SA5 e SA11 não pode ser caracterizada com base no efeito que produz, pois não são conhecidos dados sobre a quantidade de composto necessário para se observar o efeito semelhante ao dos medicamentos presentes no mercado. Contudo, verificou-se que a quantidade de THS presente nas amostras SA1, SA5 e SA11 (60,7 – 72,3 mg) é similar a quantidades de THS detetadas em amostras de SABP relatadas por outros autores (Zou et al., 2008). Como referido, nas amostras SA4 e SA11 detetou-se um composto cujo espetro indicia tratar-se de um análogo do SIL, dada a semelhança ao THS. Para confirmação da identidade deste composto, seria necessário proceder a estudos adicionais, tais como proceder ao seu isolamento e avaliação da estrutura química por RMN e/ou espetrometria de massa de alta resolução. Sendo o método de HPLC-DAD-FL proposto neste trabalho um método de screening, refira-se ainda que todos os compostos detetados nas amostras deverão idealmente ser sujeitos a análise por outras técnicas que permitam realizar a sua identificação inequívoca, tal como espetrometria de massa. Para realizar a identificação deste composto seria necessário proceder ao seu isolamento e a aplicação de outras técnicas analíticas como a ressonância magnética nuclear (RMN) e/ou MS, que permitissem avaliar a estrutura química do composto, podendo assim ser identificado corretamente. Em ambas as amostras SA1, SA5 e SA11 foi detetada a presença de mais do que um inibidor da PDE-5. Atendendo que as quantidades determinadas ultrapassam a dosagem terapêutica usada pelo medicamento Viagra®, as dosagens existentes nas amostras poderão ser potencialmente perigosas para quem consome este tipo de SABP. Adicionalmente, não são conhecidos/estudados potenciais efeitos adversos causados pela sinergia existente entre inibidores de PDE-5 e/ou seus análogos. Nas amostras SA9 e SA10 foram determinadas concentrações de TAD na ordem dos 13,5 – 25,8mg/caps. Considerando que o TAD é encontrado em dosagens terapêuticas de 2,5; 5; 10 e 20mg, para o medicamento Cialis® (FDA, 2015a), verifica-se mais uma vez a utilização de quantidades semelhantes às encontradas nas respetivas formulações farmacêuticas, visando a obtenção do efeito fisiológico pretendido pelos consumidores. Mestrado em Controlo de Qualidade 58 Estudos anteriores referem quantidades de TAD ilegalmente adicionadas em SABP similares às detetadas neste trabalho (Gratz et al., 2004; Zhang et al., 2010). Comparativamente às restantes amostras adulteradas com TAD, a amostra SA8 apresenta uma quantidade inferior, o que poderá estar relacionado com o tipo de formulação uma vez que se trata de uma tira sublingual. Considerando as dosagens disponíveis no medicamento Cialis® (compreendidas entre 2,5 – 20mg/ por comprimido) e sabendo que a absorção sublingual é mais eficiente para a administração rápida de fármacos no Homem, a baixa quantidade presente no SABP poderá assim mesmo permitir obter o efeito farmacológico desejado. Mestrado em Controlo de Qualidade 59 4. Conclusão Mestrado em Controlo de Qualidade 60 Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um método analítico por HPLC-DAD-FLD com o intuito de analisar a presença de inibidores da PDE-5 adicionados ilegalmente a suplementos alimentares à base de plantas. Os inibidores da PDE-5 em estudo foram sildenafil, tadalalafil, vardenafil, acetildenafil, tiosildenafil e iohimbina. Desta forma, iniciou-se o estudo com a otimização do gradiente aplicado à fase móvel do sistema, por forma a obter uma boa resolução cromatográfica dos compostos em estudo, num tempo de corrida aceitável. Como foi descrito, não foram encontradas referências bibliográficas que apontem para o uso da deteção por fluorescência na identificação ou quantificação de inibidores da PDE-5 em SABP. Assim, pretendendo-se aplicar este tipo de deteção, procedeu-se à otimização das condições de fluorescência, o qual foi conseguido para os compostos TAD, YOH e VAR. Com base na quantificação dos inibidores da PDE-5 detetados nas amostras que se concluiu estarem adulteradas, verificou-se que os níveis adicionados são da ordem de grandeza da dosagem utilizada nos medicamentos sujeitos a receita médica usados para o tratamento da disfunção eréctil. Desta forma, a utilização do detetor FLD, ao qual está associado uma maior seletividade e sensibilidade, não apresenta vantagens significativas face à utilização do DAD. Contudo, a utilização do detetor FLD poderá eventualmente permitir a deteção destes compostos em níveis vestigiais, quando a presença destes resulte de uma contaminação. Tendo-se procedido ao estudo dos parâmetros de validação do método, tais como a gama de linearidade e curvas de calibração, precisão, exatidão (ensaios de recuperação), limite de deteção e limite de quantificação, verificou-se que de uma forma geral o método demonstrou ser adequado para a deteção e quantificação dos compostos em estudo. Os resultados obtidos pela avaliação dos parâmetros necessários para a validação do método, confirmam a adequabilidade do procedimento analítico para a identificação e quantificação de inibidores da PDE-5 em SABP. Desta forma, posteriormente o método foi aplicado á análise de amostras comerciais. Das 12 amostras de SABP analisadas pelo método de HPLC-DAD-FLD desenvolvido e validado, verificou-se a adulteração de 7 destas amostras, sendo que os principais inibidores da PDE-5 encontrados foram o SIL, TAD e THS. Através desta metodologia analítica foi ainda possível detetar a presença de um composto não identificado, o qual pode eventualmente tratar-se de um análogo do SIL uma vez que apresenta similaridades com o espetro UV do padrão de THS, o qual é também um análogo do sildenafil. Para confirmação da identidade deste composto, seria necessário proceder a estudos adicionais, tais como procedeu ao seu isolamento e Mestrado em Controlo de Qualidade 67 Radimer K, Bindewald B, Hughes J, Ervin B, Swanson C, Picciano MF. Dietary supplement use by US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999–2000. Am J Epidemiol 2004. 160:339-349. Rapaka RS, Coates PM. Dietary supplements and related products: A brief summary. Life Sci 2006. 78:2026-2032. 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