Células gliais satélite de gânglios sensitivos: o seu papel na dor

Mestrado Integrado em Medicina Área: Histologia e Embriologia Trabalho efetuado sob a Orientação de: Professora Doutora Fani Neto Trabalho organizado de acordo com as normas da revista: Revista Brasileira de Anestesiologia Filipa Alexandra Leite Costa Células gliais satélite de gânglios sensitivos: o seu papel na dor setembro, 2012 Dedicatória Desejo expressar os meus agradecimentos à Professora Doutora Fani pelo acompanhamento, correções e sugestões durante o desenvolvimento da monografia. Reconheço que a sua disponibilidade, generosidade, apoio incondicional e incentivo foram cruciais para enfrentar e resolver todas as contrariedades que foram surgindo. Agradeço, acima de tudo, pela amizade que me deu a oportunidade de crescer académica e pessoalmente. 1 Células gliais satélite de gânglios sensitivos: o seu papel na dor Satellite glial cells of sensory ganglia: Their role in pain Filipa Alexandra Leite Costa1, Fani Lourença Moreira Neto2,3 1 Faculdade de Medicina, Universidade do Porto 2 Departamento de Biologia Experimental, Centro de Investigação Médica da Faculdade de Medicina do Porto (CIM-FMUP), Universidade do Porto 3 Grupo de Morfofisiologia do Sistema Nervoso, Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC), Universidade do Porto Local de realização do estudo: Departamento de Biologia Experimental, Centro de Investigação Médica da Faculdade de Medicina do Porto (CIM-FMUP), Universidade do Porto Correspondência para : Fani Lourença Moreira Neto, PhD Departamento de Biologia Experimental, Centro de Investigação Médica da Faculdade de Medicina do Porto (CIM-FMUP), Universidade do Porto, Alameda Prof. Hernâni Monteiro, 4200-319 Porto Tel.: 00 351 2204 26769 Fax: 00 351 22 5513655 Email: [email protected] Endereço do autor: Filipa Costa Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Al. Professor Hernâni Monteiro, 4200-319, Porto, Portugal Email: [email protected] 2 Resumo Justificativa e objetivos: As células gliais satélite de gânglios sensitivos são um alvo recente de pesquisa na área da dor, pelo que nesta revisão pretende-se reunir os conhecimentos existentes sobre as caraterísticas morfológicas e fisiológicas destas células e sobre o seu papel no desenvolvimento da dor crónica. Conteúdo: Nos gânglios sensitivos cada corpo neuronal é envolvido por células gliais satélite, formando unidades funcionais distintas. Esta íntima relação possibilita a comunicação bidirecional, via sinalização parácrina, entre estes dois tipos de células. Existe um número crescente de evidências de que as células gliais satélite sofrem alterações estruturais e bioquímicas, após lesão nervosa, que influenciam a excitabilidade neuronal e consequentemente o desenvolvimento e/ou manutenção da dor, em diferentes modelos animais de dor crónica. Conclusões: As células gliais satélite são importantes no estabelecimento da dor patológica e constituem um potencial alvo para o desenvolvimento de novos tratamentos da dor. Contudo, são necessárias novas pesquisas para o esclarecimento do(s) mecanismo(s) subjacente(s) à influência destas células na dor crónica. Uni termos: células gliais satélite, gânglio sensitivo, dor 3 Abstract Background and Objectives: The satellite glial cells of sensory ganglia are a recent target of research in the area of pain. Thus, this review intends to gather the available knowledge about the physiological and morphological characteristics of these cells and about their role in the development of chronic pain. Contents: In sensory ganglia each neuronal body is enveloped by satellite glial cells, forming discrete functional units. This close relationship enables bidirectional communication, via paracrine mechanisms, between these two cell types. There is growing evidence that these cells are altered structurally and biochemically, after nerve damage, and that these changes influence neuronal excitability and therefore the development and/or maintenance of pain, in animal models of chronic pain. Conclusions: Satellite glial cells play an important role in the establishment of pathological pain and are a potential target for the development of new pain treatments. However, more research is needed to clarify the mechanism(s) underneath the influence of these cells in chronic pain. Key Words: Satellite glial cells; sensory ganglia; pain. 4 Introdução A dor foi definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP, International Association for the Study of Pain), como uma experiência emocional e sensorial desagradável associada a uma lesão tecidular concreta ou potencial, ou descrita em função dessa lesão. A dor nocicetiva (também denominada aguda) é adaptativa, transitória e tem um papel fisiológico protetor, ao funcionar como um sinal de alerta de ameaça à integridade física do organismo, e resulta da ativação dos nocicetores por lesão ou ameaça de lesão de tecidos não nervosos. Por oposição, na dor crónica a sensação dolorosa que persiste é recorrente há mais de 3 meses, sendo desprovida de qualquer função biológica e considerada patológica (1). Existem dois tipos de dor patológica, a dor neuropática e a dor inflamatória. A dor neuropática resulta de lesão ou disfunção do sistema nervoso central (SNC) ou periférico (SNP). A dor inflamatória está associada a uma lesão tecidual de que resulta um processo inflamatório. Em alguns casos é uma dor nocicetiva mas, sob determinadas condições, existem evidências de reorganização periférica e central levando à perpetuação da sensação, pelo que, nestes casos, não é considerada uma dor normal mas patológica (2). Durante muito tempo, o estudo do processamento da dor baseou-se no pressuposto que os neurónios eram os únicos intervenientes na modulação da informação nocicetiva. Todavia, nas duas últimas décadas, uma série de pesquisas descobriram que a glia do SNC influencia o funcionamento neuronal, incluindo o processamento da dor normal e patológica (3). A pesquisa centrou-se, sobretudo, no estudo da glia do SNC: astrócitos, oligodendrócitos, e particularmente, microglia. No SNP, as células de Schwann foram as primeiras a serem investigadas, tendo sido a sua biologia extensivamente estudada, particularmente em relação à degeneração e regeneração dos axónios. Existem outras classes de células gliais no SNP, sendo a mais notável as células gliais satélite (CGS), que envolvem o corpo dos neurónios dos gânglios sensoriais e autonómicos (4). As CGS são a principal célula glial no gânglio sensitivo, sendo que a sua disposição em torno do corpo neuronal assegura uma relação única com o corpo dos neurónios sensoriais e possibilita um controlo apertado da atividade neuronal (5). Os neurónios nos gânglios do sistema nervoso autónomo, também são envolvidos por células gliais semelhantes às CGS dos gânglios sensitivos, mas nesses gânglios os neurónios possuem dendritos e estabelecem sinapses, ambos ausentes nos gânglios sensitivos (6). A descrição da existência de uma bainha que envolvia o corpo dos neurónios dos gânglios sensitivos e do sistema nervoso autónomo 5 foi mencionada pela primeira vez por Later Valentim, em 1836, mas só com o advento da microscopia eletrónica se demonstrou tratar-se de uma célula individual com a sua própria membrana citoplasmática. A sua ultrastrutura foi pormenorizadamente descrita pelo Professor Ennio Pannese cuja monografia editada em 1981, marcou definitivamente as pesquisas subsequentes (7). Os primeiros estudos sobre as alterações nestas células, após lesão nervosa, foram realizados em 2002, e nos últimos dez anos o número de artigos sobre o papel destas células na atividade neuronal tem aumentado exponencialmente. As interações entre as CGS e os neurónios, e as consequências destas na excitabilidade neuronal, são um dos focos mais recentes de pesquisa na área do estudo da dor, particularmente pelo seu potencial para se tornarem um alvo terapêutico. Tal pôde ser comprovado no congresso mundial da dor do presente ano em Milão, onde pela primeira vez, o conhecimento sobre estas células foi discutido num simpósio internacional. Neste trabalho pretende-se suscitar o interesse por estas células gliais e mostrar a suas potencialidades. Para tal foram reunidos os conhecimentos sobre as caraterísticas morfológicas e funcionais das CGS, a forma como é realizada a comunicação entre elas e os neurónios, as modificações observadas nestas células nos diferentes modelos de estudo da dor em animais, as suas repercussões na atividade neuronal e a contribuição para os mecanismos da dor crónica. 1. Caraterização da célula glial satélite 1.1. Ultrastrutura As CGS são células de forma laminar, irregulares, com membrana citoplasmática mais fina e menos densa que a do neurónio, e que exibem expansões lamelares e microvilosidades que aumentam a sua área de superfície mas não possuem verdadeiros processos citoplasmáticos (7). Na generalidade, são células mono nucleadas, com núcleo elíptico de localização central, com a cromatina agrupada centralmente e numa banda periférica separada da face interna da membrana nuclear por uma lâmina fibrosa (8). Apresentam polissomas livres, um abundante retículo endoplasmático rugoso, retículo endoplasmático liso com menor relevância e na região justa nuclear localiza-se o aparelho de Golgi e centríolos (7). Dispersos no seu citoplasma foram observadas mitocôndrias e outros organelos envolvidos no processo de catabolismo celular tais como vacúolos autofágicos, lisossomas e peroxissomas (9). Em 12 A lesão ou inflamação do tecido periférico podem alterar as propriedades da via somático-sensitiva, através de mecanismos de sensitização periférica e central, responsáveis por hiperexcitabilidade celular que conduz ao aumento da resposta dos nocicetores, quer a substâncias químicas quer a outros estímulos nóxicos (para revisão ler (58, 59)). Esta hipersensibilidade traduz-se no aparecimento de hiperalgesia, que consiste numa resposta aumentada a um estímulo normalmente doloroso, e alodínia, correspondente à ocorrência de dor perante um estímulo normalmente inócuo (1). O estudo da dor crónica mostrou que a dor patológica está relacionada com alterações a nível celular e molecular do sistema nervoso periférico, medula espinhal e no encéfalo. Existindo evidências de que fenómenos de hiperalgesia e alodínia, observados após lesão nervosa periférica, refletem alterações na excitabilidade dos neurónios aferentes primários (60). Nomeadamente, as alterações das propriedades intrínsecas do pericário, localizado nos gânglios sensitivos, podem conduzir a uma hiperexcitabilidade caraterizada por aumento da incidência de atividade espontânea e pela redução do limiar de ativação por estímulos periféricos (61). 4.2. Resposta das CGS à lesão nervosa e a repercussão na nociceção A pesquisa em modelos de estudo da dor, a maioria realizados em roedores e baseados essencialmente, em lesões periféricas por axotomia, inflamação ou constrição indicam que a lesão nervosa não induz apenas modificações nos neurónios mas também, nas CGS do gânglio sensitivo que podem influenciar a excitabilidade neuronal e consequentemente o desenvolvimento e manutenção da dor crónica. Portanto, tal como as células gliais do SNC estas células são ativadas, o conceito de ativação baseia-se na noção de que, em condições normais, as células gliais são espectadores do processo nociceptivo mas, após lesão periférica, reagem exibindo alterações morfológicas e libertação de mediadores gliais (3) A ativação das CGS é caracterizada por proliferação, hipertrofia, aumento da densidade das junções de hiato e aumento da produção de várias moléculas nomeadamente, mediadores pró-inflamatórios (quimocinas e citocinas) e proteínas citoplasmáticas (4, 12, 21). 4.2.1. Expressão de GFAP Os primeiros indícios da existência desta “ativação” surgiram com a observação de que as CGS sofrem alterações morfológicas e funcionais, após axotomia, nomeadamente o aumento da expressão de GFAP, hipertrofia e maior grau de acoplamento (7, 28, 29). 13 Num modelo induzido pela exposição de GRD a fio de sutura cromado derivado de intestino de gato, foi demonstrado que a fonte primária de GFAP no GRD são as CGS (62), enquanto estudos no GT, correlacionaram as alterações na imunorreatividade a GFAP destas células com as propriedades da resposta dos neurónios (63). Em condições normais, as CGS exibem níveis baixos de GFAP, praticamente indetetáveis por imunohistoquímica, pelo que a constatação em diversos trabalhos do aumento da sua expressão após lesão, tornou-a o marcador essencial na avaliação da ativação das CGS (15, 63-68). O significado desse aumento de expressão permanece por esclarecer. Esta proteína é também um marcador de ativação dos astrócitos no SNC, nestes uma das explicações avançadas relaciona-se com a comunicação entre astrócitos e neurónios via glutamato. De acordo com essa hipótese, o aumento extracelular deste neurotransmissor desencadearia o aumento de GFAP necessário para suportar o aumento de expressão de GLAST, uma vez que este filamento é essencial para ancorar o GLAST à membrana plasmática dos astrócitos (69, 70). Baseando-se nestes achados, foi levantada a hipótese de que tal como nos astrócitos, o glutamato libertado no gânglio sensorial, pudesse despoletar o aumento de expressão de GFAP nas CGS, mas até ao momento ainda não foi comprovado (4). De qualquer forma, a avaliação do padrão de GFAP é o grande marcador de ativação das CGS. A sua utilidade pôde ser comprovada num estudo, com um modelo de dor neuropática induzido por ligação do quinto nervo espinhal lombar, em que a avaliação da reatividade da GFAP foi utilizada para demonstrar que a ativação das CGS contribui para a manutenção, no período inicial, de sintomas de dor neuropática, mais precisamente o aparecimento de alodínia mecânica (71). 4.2.2. Canais de potássio Nas primeiras pesquisas, foram enumerados vários mecanismos possíveis para a interferência das CGS ativadas na atividade dos neurónios, que incluíam a concentração iónica nomeadamente da concentração de K+ extracelular (64). No SNC são os astrócitos que garantem a manutenção dos níveis ótimos de K+ extracelular, por recaptação pelos canais Kir e dissipação por outros tipos de canais de K+, como canais dependentes de Ca2+, e através das junções de hiato. A identificação de canais de entrada de correntes retificadas de K+ específicos das células gliais, os Kir4.1 (do inglês inward rectifying K+ channels) (15, 16, 72), juntamente a existência de junções de hiato capazes de possibilitarem a passagem de K+ e outras pequenas moléculas entre células adjacentes (52, 73) contribuíram para o reconhecimento do papel das CGS na homeostasia do K+. O impacto deste reconhecimento advém do modelo convencional de equilíbrio iónico neuronal, que prevê que se os níveis de 14 K+ não forem mantidos a excitabilidade dos neurónios aumenta, podendo conduzir a alterações na perceção sensorial (74). Assim, a manutenção de baixas concentrações extracelulares de K+, mediada pelas CGS, poderá ser crucial no controlo do potencial de repouso da membrana e da excitabilidade neuronal (15). Com o intuito de determinar se a resposta da CGS à lesão nervosa envolvia alterações nos canais Kir foram realizados vários estudos. Num modelo de constrição crónica do nervo infra orbitário, observou-se diminuição da expressão de Kir4.1 nas CGS do GT (15, 75). Igualmente, em estudos eletrofisiológicos em preparações in vitro de GRD provenientes de animais sujeitos a compressão crónica desses gânglios, constatou-se que as CGS nos gânglios lesados exibiram uma redução significativa das correntes mediadas pelos Kir (16). Resultados semelhantes foram encontrados, em estudos que investigaram o efeito da inflamação periférica (cutânea da face) sobre as correntes mediadas pelos Kir em ratos in vivo, através de técnicas de imunohistoquímica e de eletrofisiologia (patch clamp). Registando-se um aumento significativamente menor das correntes mediadas pelos Kir nos ratos com inflamação comparativamente ao ocorrido em ratos naïve, acompanhada por diminuição do limiar de ativação a estímulos mecânicos, sugestiva de hiperalgesia (76). Os estudos acima expostos mostraram que a resposta das CGS, a diferentes tipos de lesão, inclui diminuição da expressão dos canais Kir e a diminuição das correntes retificadoras mediadas pelos mesmos. Por outro lado, na ausência de lesão, a diminuição da expressão dos canais Kir tem repercussões na atividade neuronal, como demonstrado pelo silenciamento específico da expressão de Kir4.1, usando ARNi. Esse silenciamento foi suficiente para produzir sinais comportamentais de dor em ratos caracterizados por desenvolvimento de dor espontânea (medida pelo aumento do fecho dos olhos) e evocada (alodínia facial) reforçando a importância das CGS na depuração de K+ e a capacidade destas promoverem alterações na atividade neuronal (75), 4.2.3. Junções de hiato O primeiro indício da modificação funcional das CGS foi a constatação, após lesão do axónio as CGS estendem prolongamentos que estabelecem pontes de conexão entre CGS de unidades distintas, o número de junções de hiato entre as CGS aumenta e ficam extensamente acopladas (28, 29). Posteriormente, estudos de eletrofisiologia e injeção de corantes confirmaram o aumento deste acoplamento após lesão nervosa (14, 73). O aumento da densidade (número) de junções de hiato e do acoplamento entre as CGS dos gânglios sensoriais, após lesão nervosa são um achado consistente em inúmeros estudos 15 da dor. Nas CGS do GRD, esta alteração foi encontrada em diversos modelos de dor: inflamação do colon (73, 77), inflamação da coxa (78), neurite do nervo ciático (79) e compressão crónica do GRD (16). Também os estudos no GT, evidenciaram o aumento deste acoplamento entre CGS em modelos de dor orofacial, nomeadamente axotomia do nervo infra orbitário (14) e constrição crónica do nervo infra orbitário(15). Na globalidade, o aumento do acoplamento intercelular por junções de hiato é o denominador comum em diferentes tipos de dor crónica. Com o intuito de avaliar o significado deste aumento de acoplamento realizou-se um estudo com um potente bloqueador de junções de hiato, a carbenoxolona, que suprimiu o aumento do acoplamento entre as CGS causado pela inflamação, previamente induzida pela injeção de adjuvante completo de Freund´s na coxa, tendo como consequência o aumento do limiar de ativação por estímulos (78). Efeitos analgésicos semelhantes foram observados com outros bloqueadores das junções de hiato como os ácidos meclofenâmico e palmitoleíco (77). Estes estudos com estes bloqueadores reforçaram o papel das junções de hiato na excitabilidade neuronal. A identificação de uma molécula particular constituinte das junções de hiato, a conexina 43 (Cx43), permitiu uma abordagem diferente do papel destas junções nas CGS. Constatou-se que após lesão do nervo infra orbital, ocorre igualmente um aumento da expressão desta conexina (15, 65, 80). Utilizando ARNi para a Cx 43 com o intuito de se alterar as propriedades das junções de hiato, evidenciou-se que uma perturbação na expressão desta proteína é suficiente para causar modificações no limiar de ativação dos neurónios aferentes (15). Para além disso, a inibição da expressão da Cx 43 no GT, num modelo de dor neuropática orofacial induzida por lesão por constrição crónica do nervo infra orbital, foi acompanhada de diminuição do comportamento de dor espontânea e evocada (65). Por outro lado, quando essa inibição foi efetuada em gânglios do trigémeo de ratos naïve, ocorreu uma resposta nocicetiva, idêntica à verificada após lesão nervosa (15, 65). Estes estudos sugerem então que a inibição da Cx 43 pode ter efeito pró nocicetivo em animais normais ou anti nocicetivo após lesão nervosa. Desta forma, independentemente da abordagem, parece que o acoplamento entre SGC, que implica as junções de hiato e consequentemente a Cx 43, pode estar associado ao desenvolvimento e manutenção de dor neuropática. Os mecanismos subjacentes ainda são desconhecidos, mas várias hipóteses têm sido apontadas, nomeadamente o seu papel na manutenção do gradiente eletroquímico e tamponamento do K+ ao permitir uma rápida redistribuição de K+ após lesão nervosa (14); a contribuição para a sensitização dos 16 nocicetores por aumentar a difusão de mediadores inflamatórios e/ou de substâncias alogénicas (como ATP, Ca2+) do local da lesão para áreas adjacentes, conduzindo assim a uma amplificação da agressão primária (77) ou a sua ação na reciclagem do glutamato (65). Em relação ao glutamato, no gânglio foram identificados todos os elementos intervenientes no ciclo glutamina-glutamato, incluindo o glutamato, os seus recetores, o transportador glial do glutamato – aspartato (GLAST, do inglês glutamate aspartate transporter), bem como as enzimas gliais de reciclagem do glutamato, tais como a GS (4). Ao bloquearem a expressão do GLAST, usando ARNi, nas CGS do GT de ratos sem lesão nervosa, alguns autores observaram uma redução no limiar de ativação por estimulação mecânica da face (81). Para além disto, quando a expressão de GLAST regressou a valores normais, também o comportamento nocicetivo retornou a valores normais. Estes dados indicam a existência de libertação basal de glutamato no gânglio sensorial normal, ou seja, de neurotransmissão glutamatérgica. Para além disso sugerem também que, hipoteticamente, alterações nos níveis de glutamato, devidas a uma interrupção da sua recaptação pelas CGS, podem alterar a excitabilidade neuronal e assim levar a alterações comportamentais evidenciadas nos limiares nociceptivos. Essa hipótese foi testada bloqueando a síntese de GS com ARNi, assim diminuindo-se a sua atividade. Observou-se uma diminuição da libertação de glutamina pelas CGS e consequente diminuição da glutamina disponível para recaptação pelo neurónio, logo uma redução da conversão desta em glutamato (80). Simultaneamente, os animais evidenciaram um comportamento nocicetivo reduzido em resposta a estimulação da face com injeção de formalina (80). Todavia, não se obtiveram evidências que permitissem inferir se o aumento de glutamato no interior das CGS, associado à inibição da GS, e que seria de esperar tendo em conta o transporte reverso pelos transportadores de glutamato, será prónociceptivo. Na sua globalidade, os estudos descritos sugerem que a redução do GLAST e alterações no ciclo glutamina – glutamato no gânglio modificam os sinais comportamentais de dor, mas ainda não está compreendida a sua contribuição para a alteração dos limiares de resposta à informação nocicetiva (80). 4.2.4. ATP O ATP é o mediador por excelência na interação entre o neurónio e a CGS, como exposto no subcapítulo da comunicação intraganglionar. Nesta parte será abordada a contribuição dessa sinalização para a dor. Um estudo recente, acerca do papel da CGS na dor crónica, propõe um modelo preliminar que tenta explicar como o aumento das junções de hiato e a elevada sensibilidade 17 ao ATP podem conduzir a atividade neuronal anormal, nos neurónios lesados mas também em neurónios não afetados. Este modelo assenta nos conhecimentos de que uma lesão nervosa periférica, ao aumentar a excitabilidade dos neurónios sensitivos, aumenta também os sinais excitatórios dos neurónios lesados para as CGS que os rodeiam, e que estas células, comunicando com CGS de unidades adjacentes, irão por sua vez influenciar o seu neurónio (82). Esta hipótese utiliza conhecimentos recentes sobre o aumento de sensibilidade ao ATP em modelos de dor inflamatória. Essa sensibilidade aumentada foi encontrada utilizando-se microfluorometria para determinar a concentração citosólica de Ca2+, em cultura de GT de ratos aos quais foi induzida inflamação cutânea facial. Observações similares foram encontradas na análise, in vitro, de GT intacto, proveniente de ratos sujeitos a axotomia do nervo infraorbitário, com o registo de um aumento de 100 vezes na sensibilidade das CGS ao ATP. Para além disso, com ferramentas farmacológicas, constataram uma inversão no subtipo de recetor purinérgico nas células da cultura de GT, sendo que nos ratos normais a resposta ao ATP era mediada por recetores P2Y, ao passo que nos ratos com inflamação era predominantemente mediada por P2X (55). Este modelo preliminar integra, ainda, a capacidade exibida pelas CGS de libertarem ATP (31, 32, 54), mas ainda não se conhece o mecanismo subjacente a esta libertação. Aparentemente, é cálcio dependente, e hipoteticamente efetuada através hemicanais formados pelo complexo P2X7 – panexina 1 (82). O modelo mencionado propõe alterações no corpo neuronal, em resposta à lesão periférica, induzindo assim a libertação de ATP pelo neurónio. Este ATP vai ativar os recetores P2 nas SGC circundantes e no próprio neurónio, causando um aumento da concentração intracelular de Ca2+ em ambos, e consequentemente libertação de ATP pelos neurónios e também pelas SGC (cujo nível de sensibilidade ao Ca2+ aumenta após lesão). Este aumento do ATP, aliado ao aumento do número de junções de hiato entre CGS de bainhas perineuronais vizinhas, possibilita a propagação de ondas de Ca2+ para as CGS dessas bainhas e para os neurónios vizinhos, influenciando a excitabilidade de neurónios não afetados diretamente pela lesão, tal como ilustrado na Figura 2 (Entra Figura 2 – Modelo de interação entre neurónios via células gliais satélite). Esta pode constituir uma das explicações de como uma lesão periférica pode afetar um grande número de neurónios sensoriais, contribuindo para a propagação do sinal e para a dor crónica (32, 55). 18 4.2.5. Citocinas A ativação das CGS cursa, ainda, com a produção de citocinas pró inflamatórias como TNF-α, IL-1β e IL6 (22, 83, 84). As citocinas são um dos mediadores da interação entre neurónio e CGS, existindo cada vez mais evidências sobre o papel das citocinas com origem nos gânglios sensitivos, na indução e manutenção da dor neuropática (85). Num estudo em GRD, usando três modelos de dor no nervo ciático (ligação parcial unilateral, ligação do nervo espinhal e transeção) foram demonstradas por imunofluorescência um aumento de expressão de TNF-α e do recetor TNF-α-1 nos neurónios e nas suas CGS. Este estudo ainda sugeriu que, tal como inúmeras células do SNP (macrófagos, células Schawnn, fibroblastos e células endoteliais), os neurónios sensitivos aferentes e as CGS também têm capacidade de sintetizar TNF- α em resposta a uma lesão periférica (22). Os macrófagos e as CGS do gânglio estão, anatomicamente, bem posicionados para regular a atividade neuronal via TNF-α, no entanto, não foi ainda esclarecido qual a fonte principal desta citocina responsável pelo aumento da excitabilidade neuronal. Se são os macrófagos, as CGS ou ambos (22). Um estudo da mesma altura, num modelo adaptado de lesão na faceta articular da coluna lombar de ratos, também verificou aumento da imunorreatividade para o TNF-α nas CGS em torno do pericário dos neurónios afetados (67). A ativação das CGS integra, ainda, a produção de IL-1β. O papel desta citocina e das CGS no mecanismo subjacente ao desenvolvimento de hiperalgesia e alodínia, após inflamação periférica, tem sido exaustivamente investigado em modelos animais de inflamação cutânea na face. Estes investigadores recorreram a um modelo de dor orofacial em ratos, aos quais foi induzida inflamação cutânea facial e testada a sensação anormal de dor, tendo verificado uma redução do limiar de ativação ao estímulo mecânico nos ratos com inflamação. A análise imunohistoquímica dos gânglios, correspondentes à inervação da área inflamada, evidenciou a ativação das CGS (por aumento de expressão de GFAP), o aumento de produção de IL-1β por estas células, e o aumento de expressão de IL-1RI nos neurónios. Para verificarem o efeito da IL-1β no potencial de repouso membranar da célula nervosa, recorreram, ainda, à aplicação de IL-1β, tendo observado um aumento da taxa de disparo dos potenciais de ação superior nos ratos inflamados, comparativamente aos ratos normais. Desta forma, demostraram que as CGS modulam a excitabilidade dos neurónios nocicetivos do GT via IL-1β, induzindo despolarização membranar e aumento da expressão de IL-1RI no corpo neuronal, e que este mecanismo pode estar subjacente à hiperalgesia inflamatória (83). Esta conclusão foi suportada por um trabalho posterior com o mesmo modelo de dor orofacial. Observaram um aumento, duas vezes superior, da atividade espontânea nos neurónios Aδ nos 19 ratos com inflamação, relativamente ao grupo controlo. Depois, avaliaram o efeito da administração iontoforética local de antagonista dos IL-1RI e de IL-1β sobre a atividade espontânea nos dois grupos de neurónios, tendo verificado, em relação à aplicação do antagonista, uma diminuição significativa da atividade espontânea apenas nos neurónios de ratos inflamados, enquanto a aplicação local de IL-1β aumentou em ambos essa atividade. Estes dados indicaram que a libertação desta citocina pela CGS modula a excitabilidade dos neurónios nocicetivos Aδ (86). Num outro estudo de dor infamatória orofacial demonstraram, in vitro, que a IL1-β suprime as correntes de K+ dos canais dependentes da voltagem nos neurónios de pequeno diâmetro (caraterística correspondente com neurónios nocicetivos C e Aδ), sugerindo que a IL1-β libertada pelas CGS ativadas, após inflamação, potencia a excitabilidade dos neurónios nocicetivos por supressão das correntes de K+ (87). Todas estas evidências permitiram propor um mecanismo associado à comunicação entre neurónios aferentes e CGS para a hiperalgesia inflamatória, segundo o qual, uma excitabilidade aumentada dos neurónios nocicetivos Aδ poderá ocorrer como consequência da ativação das CGS em condições inflamatórias. De acordo com esta hipótese, os neurónios aferentes primários nocicetivos, ativados pela lesão periférica/inflamação, libertam no gânglio substância P (37); esta atua sobre os recetores NK1, e de alguma forma vai potenciar a síntese e/ou libertação de IL-1β pelas SGC. A IL-1β vai suprimir os canais de K+ dependentes de voltagem dos neurónios contribuindo assim para a sensitização central responsável pela hiperalgesia e alodínia pós inflamação (21). Por fim, a IL-6 parece também estar envolvida na resposta das CGS à neuroinflamação, tendo sido observado um aumento bilateral da expressão de IL-6 nas CGS do GRD e do seu recetor no gânglio ipsilateral, após lesão do nervo ciático por constrição crónica (84). 5. Ativação das células gliais satélite As CGS raramente são danificadas diretamente, sendo os neurónios o alvo da lesão. Por isso, as alterações observadas nas CGS são secundárias a alterações neuronais e implicam ativação de mecanismos de sinalização entre neurónios e estas células gliais. O evento iniciador destas modificações parece estar relacionado com o aumento do disparo neuronal induzido pela lesão nervosa (71). 20 Esta hipótese apoia-se em várias premissas. Primeiro, experiências com diferentes modelos de dor e métodos de bloqueio da atividade neuronal demonstraram que o bloqueio da atividade espontânea previne o desenvolvimento de comportamentos associados à dor patológica. Um dos estudos desta relação consistiu na utilização de dois modelos de dor em roedores (constrição crónica do nervo ciático e axotomia e ligação dos nervos tibial e peronial comum) nos quais foi testado o efeito de dois bloqueadores de potenciais de ação nervosa, tetrodotoxina e a bupivacaina, usados independentemente, nos ratos lesados e nos normais. Depois, a realização nesses ratos de testes comportamentais, de hiperalgesia térmica e alodínia mecânica, permitiu a observação de uma diminuição dos sinais comportamentais de dor. No mesmo estudo, a avaliação eletrofisiológica do efeito da aplicação dos bloqueadores antes e depois dos animais serem sujeitos à lesão nervosa, demonstrou que a aplicação desses bloqueadores prevenia a subsequente atividade espontânea no nervo ciático lesado (88). Segundo, a ativação das CGS do GRD, após lesão do nervo ciático, foi evitada por bloqueio da condução nervosa local. Nesse trabalho, realizado num modelo de axotomia do nervo espinhal L4, foi implantada uma bomba de perfusão de tetrodotoxina, verificando-se uma redução marcada da ativação das CGS (por deteção imunohistoquímica dos níveis de GFAP). Este resultado foi confirmado, neste mesmo estudo, por aplicação local de outro bloqueador de canais de sódio, a bupivacaina, em ratos com lesão mais periférica, induzida por ligação do nervo peronial e tibial (68). Apesar destas evidências, a atividade neuronal espontânea anormal é apenas um candidato a evento iniciador. Na verdade esta questão tem sido um foco de pesquisa muito recente não existindo ainda estudos esclarecedores de como são desencadeados os mecanismos responsáveis pela ativação das CGS. 6. Considerações finais O progresso no conhecimento da biologia das CGS, e o reconhecimento da sua interação com os neurónios sensitivos, despoletou a atenção da comunidade científica sobre o papel destas células no processo nocicetivo. Tendo subjacente a possibilidade de constituírem um alvo potencial de novas estratégias para o tratamento da dor crónica. Diversos estudos observaram, após lesão nervosa periférica, modificações estruturais e bioquímicas nas CGS e demonstraram, em diferentes modelos de dor em animais, que essas alterações podem contribuir para a dor crónica (4, 16, 21, 55, 71, 76, 78, 82, 83, 86). Contudo, 21 ainda não se conhece(m) o(s) mecanismo(s) pelo(s) qual(is) as alterações nas CGS têm repercussões na função neuronal ou na perceção sensitiva. A comunicação bidirecional evidenciada entre as CGS e o neurónio parece ser o elemento fundamental nesta influência. Os estudos sugerem que é mediada por junções de hiato e recetores de neurotransmissores, sendo plausível considerar os elementos envolvidos nesta interação como possíveis alvos terapêuticos (4, 21, 31, 32, 80). Tendo como base o modelo de modulação da hiperalgesia inflamatória via IL-1β, e a demonstração de que o aumento de expressão dos IL-1RI nos neurónios é acompanhado de supressão dos seus canais de K+ dependentes da voltagem, foi sugerido que as moléculas desencadeadoras da abertura de canais de K+ dependentes de voltagem e os antagonistas dos IL-1RI possam ser futuros agentes no tratamento da hiperalgesia inflamatória (21). Do mesmo modo, a constatação do efeito das alterações da expressão dos canais Kir das CGS na atividade neuronal, conduziu os autores desses estudos a considerar os moduladores da ação dos canais de K+ como candidatos preferenciais no tratamento da designada, pelos mesmos, “gliopathic pain” (4, 15, 75). Recentemente, foi demonstrada que a principal forma de comunicação entre as CGS é a propagação de ondas de cálcio, através das junções de hiato e mediada por recetores purinérgicos, que aumentam após lesão. Aliada ao reconhecimento do ATP como neurotransmissor principal dos neurónios, foi sugerido que o aumento da comunicação entre CGS e entre CGS e neurónios, em resultado de uma lesão, possa contribuir para a dor crónica. Assim, a redução desta comunicação, bloqueando as junções de hiato e os recetores P2X, pode ser considerada uma potencial forma de tratamento da dor crónica (32, 55, 82). Apesar de enumeradas várias hipóteses, qualquer uma delas carece de novas pesquisas que confirmem os pressupostos em que estas se fundamentaram e suportem a sua validade. O conhecimento sobre as CGS e o seu papel na dor está a dar os primeiros passos, e ainda muitas questões permanecem por solucionar. Todavia, o aumento do número de estudos sobre estas células, verificado sobretudo nos últimos 5 anos, permitiu mostrar as potencialidades das CGS e a sua importância no estabelecimento da dor patológica, estabelecendo-as como uma fonte de novas pesquisas 28 85. White FA, Jung H, Miller RJ. Chemokines and the pathophysiology of neuropathic pain. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 18;104(51):20151-8. 86. Takeda M, Takahashi M, Matsumoto S. Contribution of activated interleukin receptors in trigeminal ganglion neurons to hyperalgesia via satellite glial interleukin-1beta paracrine mechanism. Brain Behav Immun. 2008 Oct;22(7):1016-23. 87. Takeda M, Kitagawa J, Takahashi M, Matsumoto S. Activation of interleukin-1beta receptor suppresses the voltage-gated potassium currents in the small-diameter trigeminal ganglion neurons following peripheral inflammation. Pain. 2008 Oct 31;139(3):594-602. 88. Xie W, Strong JA, Meij JT, Zhang JM, Yu L. Neuropathic pain: early spontaneous afferent activity is the trigger. Pain. 2005 Aug;116(3):243-56. 29 Legendas das Figuras Figura1 – Comunicação intraganglionar Após lesão nervosa periférica, ocorre a libertação somática de neurotransmissores, como o peptídeo relacionado com o gene da calcitonina (CGRP, do inglês calcitonin generelated peptide) a substância P, adenosina trifosfato (ATP) e óxido nítrico (NO) no ambiente perineuronal. Estes mediadores vão ativar as células gliais satélite, através dos respetivos recetores localizados na superfície membranar destas células. Esta ativação induz a libertação de citocinas, como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα, do inglês tumour necrosis factor alfa) e a interleucina 1 beta (IL-1β) que, por sua vez podem influenciar a excitabilidade neuronal via recetores específicos (TNFα-RI e IL-1RI) (adaptado a partir da figura 2: Takeda M, Takahashi M, Matsumoto S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 2009 Jun;33(6):784-92) Figura 2 – Modelo de interação entre neurónios via células gliais satélite A lesão nervosa periférica, leva à libertação somática de ATP que irá atuar via recetores purinérgicos nas células gliais satélite (CGS), conduzindo a um aumento significativo da concentração intracelular de cálcio ( [Ca2+] ) nestas células. A comunicação com as células gliais satélite de bainhas perineuronais vizinhas e a propagação das ondas de Ca2+ para essas células vai ocorrer via junções de hiato, o que conduz à libertação de ATP por essas células gliais satélite vizinhas, o qual se irá ligar aos recetores purinérgicos neuronais, influenciando a excitabilidade desse neurónio que não foi afetado pela lesão. Anexo 1 – Figuras Figura 1 Figura 2 Anexo 2 – Lista de abreviaturas Abreviaturas IASP – do inglês International Association for the Study of Pain SNC - Sistema Nervoso Central SNP - Sistema Nervoso Periférico CGS - Células Gliais Satélite GFAP - proteína fibrilar acídica, do inglês Glial Fibrillary Acidic Protein GLAST - transportador glial do glutamato-aspartato, do inglês Glutamate Aspartate Transporter GS – sintetase da glutamina, do inglês Glutamine synthase Kir4.1 - do inglês inward rectifying k+ channels CGRP – Peptídeo Relacionado com Gene da Calcitonina, do inglês Calcitonin Gene- Related Peptide TNFα - Fator de necrose tumoral alfa, do inglês Tumour Necrosis Factor alfa IL-1β – Interleucina 1 beta GRD - Gânglios Raquidianos Dorsais GT - Gânglio do Trigémeo ATP - Adenosina Trifosfato GABA - ácido amino-butírico, do inglês gamma  amino-butyric acid NO - óxido nítrico ARNm - Ácido Ribonucleíco mensageiro iNOS – sintetase do óxido nítrico induzível, do inglês inducible nitric oxide synthase ARNi- Ácido Ribonucleíco de interferência Cx43 - Conexina 43 Anexo 3 - Autorização do Autor para adaptação da Figura 1 APÊNDICE - Normas de Revista Brasileira de Anestesiologia