SNP's e Resposta à Terapia Neoadjuvante no Carcinoma do Cólon e Reto - Marcadores Genéticos Para Avaliação de Resposta à Terapia

SNP’s E RESPOSTA À TERAPIA NEOADJUVANTE NO CARCINOMA DO CÓLON E RETO Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia. HILDEBERTO EMANUEL LISBOA MOREIRA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR DA UNIVERSIDADE DO PORTO EM ONCOLOGIA HILDEBERTO EMANUEL LISBOA MOREIRA SNP’s e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia. Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre - Especialização em Oncologia Molecular submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Orientador - Professor Doutor Carlos Alberto da Silva Lopes Categoria - Professor Catedrático Jubilado, Especialista em Patologia, Membro da comissão de acompanhamento do Mestrado em Oncologia Afiliação - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Coorientadora – Drª. Marisa D. Santos Categoria - Medicina Afiliação - Grupo de Patologia Coloretal e Cirurgia do Centro Hospitalar do Porto Informação Técnica TÍTULO: SNP’s e resposta à terapia neoadjuvante em carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia. Tese de Candidatura ao Grau de Mestre em Oncologia – Especialização em Oncologia Molecular submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. AUTOR: Hildeberto Emanuel Lisboa Moreira DATA: Setembro de 2015 EDITOR: Hildeberto Emanuel Lisboa Moreira CORREIO ELETRÓNICO: [email protected] 1ª EDIÇÃO: Setembro de 2015 A quem nunca desistiu de acreditar “There is no thrill like that felt by the inventor as he sees his creation unfolding to success. Such emotions make a man forget food, sleep, friends, love, everything.” LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS xviii # ºC – Graus Celsius µL – Microlitro µm – Micrómetro χ2 – Chi-quadrado % - Percentagem A ABCC4 – “ATP-binding cassette subfamily C member 4” AINEs – Anti Inflamatórios Não Esteroides C CCND1 – “Cyclin D1” CCR – Carcinoma do cólon e reto cf. – “Confer” CHP – Centro Hospitalar do Porto CK7 – “Cytokeratin 7” CK20 – “Cytokeratin 20” CM – Centímetro COX-2 – Cicloxigenase 2 D dH2O – Água destilada DII – Doença Inflamatório Intestinal DNA – “Deoxyribonucleic Acid” dNTPs - Desoxirribonucleotidos fosfatados dNDPs - Difosfatos de desoxirribonucleótidos E EGFR – “Epidermal Growth Factor Receptor” EtOH – Etanol F FAP – Polipose Adenomatosa Familiar FFPE – “Formalin Fixed Paraffin Embedded” G g - Força gravítica GIST – “Gastrointestinal Stromal Tumors” H HWE – Equilíbrio de Hardy-Weinberg HPGD – “Hydroxyprostaglandin dehydrogenase 15-(NAD)” I IGF-1 – “Insulin-like growth factor 1” IL-10 – Interleucina-10 IPO – Instituto Português de Oncologia M MgCl2 – Cloreto de Magnésio mL – Mililitro mRNA – “Messenger Ribonucleic Acid” MRP4 – “Multidrug Resistanceassociated Protein 4” N NaCl – Cloreto de Sódio NAT2 – “N-acetyltransferase 2” O OR – “Odds Ratio” P pCRT – quimioradioterapia préoperatória PGs – Prostaglandinas PGDH – “Hidroxyprostaglandin Dehydrogenase” PGT – “Prostaglandin Transporter” xix PRT - Radioterapia pré-operatória R RORENO – Registo Oncológico Regional do Norte S SLCO2A1 – “Solute carrier organic anion transporter family member 2A1” SNP – “Single Nucleotide Polymorphism” SPSS – “Statistical Package for Social Sciences” T Tamb – Temperatura Ambiente TME – Excisão Total do Mesorreto TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α W WHO - “World Health Organization” GERAL FIGURAS TABELAS MATERIAL SUPLEMENTAR ÍNDICE Conteúdos RESUMO .................................................................................................................................... xxxi ABSTRACT ................................................................................................................................ xxxvi 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 1 1.1 Introdução ........................................................................................................................... 3 1.2 Patologia do adenocarcinoma do cólon e do reto .............................................................. 4 1.2.1 Adenomas..................................................................................................................... 5 1.2.2 Adenocarcinoma do cólon e reto ................................................................................. 5 1.3 Epidemiologia e Etiologia .................................................................................................... 7 1.3.1 Fatores etiológicos ....................................................................................................... 8 1.4 Rastreio e Diagnóstico ......................................................................................................... 9 1.5 Terapia neoadjuvante e influência de polimorfismos ......................................................... 9 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 14 2.1 Objetivos gerais ................................................................................................................. 16 2.1.1 Objetivos específicos .................................................................................................. 16 3. MATERIAL & MÉTODOS ........................................................................................................... 18 3.1 População em estudo ........................................................................................................ 20 3.1.1 Perfil Demográfico ...................................................................................................... 20 3.1.2 Resposta do Tumor Primário à Terapia Neoadjuvante .............................................. 21 3.2 Extração e Quantificação de DNA ..................................................................................... 21 3.2.1 Sangue total ............................................................................................................... 21 3.2.2 Tecidos ....................................................................................................................... 22 3.3 Seleção dos Polimorfismos ................................................................................................ 22 3.3.1 Genotipagem .............................................................................................................. 24 3.4 Análise Estatística .............................................................................................................. 26 4. RESULTADOS ........................................................................................................................... 28 4.1 Frequência dos Genótipos e Risco .................................................................................... 30 4.2. Análise de Sobrevivência .................................................................................................. 31 4.2.2 Avaliação do Risco de Recidiva ................................................................................... 34 5. Discussão ................................................................................................................................. 37 6. CONCLUSÕES GERAIS & PERSPETIVAS FUTURAS .................................................................... 44 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................... 49 7. MATERIAL SUPLEMENTAR ....................................................................................................... 56 xxv FIGURAS Figura 1 - Carcinogénese em Cólon e Reto (adaptado de: Kutz H et al. 2004)[4] ........................ 3 Figura 2 - Adenocarcinoma do Cólon (adaptado de: Wong et al.,2012)[9] ................................. 6 Figura 3 - CK20 com positividade difusa em células tumorais (adaptado de: Wong et al.,2012)[9] .................................................................................................................................... 6 Figura 4 - Incidência, Mortalidade e Prevalência Mundial em 2012 (adaptado de: Globocan)[13] ....................................................................................................................................................... 7 Figura 5 - % de casos de tumores malignos em Portugal em 2008 (adaptado de: RORENO)[1] .. 8 Figura 6 - Tumores mais frequentes em Portugal em 2008 (adaptado de: RORENO)[1] ............ 8 Figura 7 - Efeitos biológicos dos polimorfismos (adaptado de: Monzo et al., 2008)[57] ........... 12 Figura 8 - Fases da técnica Sequenom iPLEX Gold (adaptado de: Genotyping with Sequenom) 24 Figura 9 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs9821091 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante .............................................................................................................................. 31 Figura 10 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs9834412 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante ............................................................................................................... 32 Figura 11 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs7340717 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante ............................................................................................................... 32 Figura 12 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram uma correlação que não é estatisticamente significativa entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs4148421 ........................................................................................................................ 33 Figura 13 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs8002180 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante ............................................................................................................... 33 Figura 14 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram uma correlação que não é estatisticamente significativa entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs869951 .......................................................................................................................... 34 Figura 15 - Transportadores de Fármacos em Humanos (adaptado de: Genomics in Drug Discovery and Development)[75] ............................................................................................... 40 xxxiii O adenocarcinoma do cólon e reto é um grave problema de saúde pública. É a terceira malignidade mais comum e a quarta mais mortal, a nível mundial e a segunda causa de morte por malignidade a nível nacional, em ambos os sexos. Esta neoplasia é mais comum das regiões desenvolvidas, reflexo do crescimento populacional, envelhecimento e também do aumento da adoção de um estilo de vida de risco. Não obstante o facto de ser um dos tipos de neoplasia em que podem ser aplicadas medidas preventivas, a aplicação de medidas mais eficazes de rastreio e diagnóstico nem sempre e exequível o que implica ainda estarmos longe do impacto positivo desejado. O objetivo principal deste trabalho foi compreender a base molecular de suscetibilidade individual à carcinogénese cólon-retal e determinar como esta pode influenciar a capacidade de resposta ou resistência a agentes anti-tumorais através do estudo de 61 SNPs associados aos genes COX-2, HPGD, SLCO2A1, ABCC4, IL-10, EGFR, TNF, CCND1, NAT2 e IGF-1. Foi desenvolvido um estudo coorte retrospetivo envolvendo 167 participantes diagnosticados com CCR recrutados pelo departamento de Cirurgia do Centro Hospitalar do Porto (CHP). Os polimorfismos escolhidos foram caracterizados recorrendo a espectrofotometria de massa (Sequenom) pelo Serviço de Genética do Instituto Gulbenkian de Ciência. Os nossos resultados indicam que quatro polimorfismos genéticos estão implicados na sobrevida livre de doença e na possibilidade de recidiva: rs9821091, rs9834412 e rs7340717 no gene SLCO2A1 e o rs8002180 no gene ABCC4. Doentes com genótipo AA (OR: 4,32 p < 0,01) do rs9821091 e genótipo AA (OR: 7,65 p < 0,01) do rs9834412 têm um risco de recidiva, quatro e sete vezes superior, respetivamente, para além do facto de se apresentarem como os indivíduos mais comprometidos a nível da sobrevida livre de doença (p = 0,001 e p = 0,039, respetivamente). Indivíduos com genótipo GG do rs7340717 (p = 0,039) encontram-se comprometidos a nível da sobrevida livre de doença. Apesar de não ser uma associação estatisticamente significativa, existe uma tendência para que doentes com genótipo GG (OR: 2,27 p = 0,056) apresentem um risco de recidiva superior. Índividuos com genótipo TC do rs8002180 também têm uma sobrevida livre de doença comprometida em relação aos restantes genótipos (p = 0,030). Estas associações verificam-se em doentes que aguardaram entre o inicio da terapia neoadjuvante e a data de cirurgia, um período inferior a 3 meses. Estes resultados reforçam a importância da via da PGE2 na carcinogénese cólon-retal mostrando que ainda é necessária uma melhor compreensão xxxiv farmacocinética em relação aos transportadores de fármacos em humanos e mais estudos que elucidem a função biológica destes SNPs que não ainda não se encontram descritos na literatura. O estabelecimento de SNPs como biomarcadores é importante tanto para estratégias de rastreio como para a caracterização de subgrupos de indivíduos em risco de desenvolver a doença e que poderão beneficiar de estratégias neoadjuvantes traduzindo assim o seu efeito biológico para o uso na prática clínica. Palavras-chave: CCR, SNPs, cirurgia, terapia neoadjuvante ABSTRACT xxxviii Adenocarcinoma of the colon and rectum is a serious public health issue. It is the third most common malignancy and fourth most deadly, worldwide and the second leading cause of death from malignancy nationwide, in both sexes. It is more common in developed regions, reflecting population growth, aging and also increasing adoption of a risky lifestyle. Notwithstanding the fact that it is one kind of malignancy in which preventive measures can be applied, the screening and diagnosis is not always enforceable what implies that we are still far away from desired positive impact. The main objective of this study was to understand the molecular basis of individual susceptibility to colorectal carcinogenesis and to determine how this may affect the responsiveness or resistance to anti-tumor agents by studying 61 SNPs associated with COX-2, HPGD, SLCO2A1, ABCC4, IL-10, EGFR, TNF, CCND1, NAT2 and IGF-1 genes. This study was designed as a retrospective cohort involving 167 participants diagnosed with CRC recruited from the department of surgery of the Centro Hospitalar do Porto (CHP). Polymorphisms were characterized using mass spectrometry (Sequenom) by the Genetics Department at the Gulbenkian Institute of Science. Our results indicate that four genetic polymorphisms are implicated in diseasefree survival and the possibility of relapse: rs9821091, rs9834412 and rs7340717 in SLCO2A1 gene and rs8002180 in ABCC4 gene. Patients with AA genotype (OR: 4.32 p <0.01) of the rs9821091 and AA genotype (OR: 7.65 p <0.01) of the rs9834412 have a risk of recurrence, four and seven times higher, respectively, besides the fact that they present themselves as the most committed individuals in terms of disease-free survival (p = 0.001 and p = 0.039, respectively). Individuals with GG genotype of the rs7340717 (p = 0.039) are committed in terms of disease-free survival. Although not a statistically significant association, there is a tendency for patients with GG genotype (OR: 2.27 p = 0.056) presenting a risk of relapse. Individuals with CT genotype of the rs8002180 also have a disease-free survival committed in comparison to the remaining genotypes (p = 0.030). These associations occur in patients who waited a period inferior to 3 months between the start of neoadjuvant therapy and surgery date. Our results reinforce the importance of the PGE2 pathway in colorectal carcinogenesis showing that a better understanding of pharmacokinetics is still needed in relation to drug carriers in humans and further studies are required to elucidate the biological function of these SNPs that have not yet been described in literature. Establishing SNPs as biomarkers is important for both screening strategies as well as to characterize subgroups of individuals at risk of developing the disease and xxxix may benefit from neoadjuvant strategies thus highlighting its biological effect for use in clinical practice. Key words: CRC, SNP’s, surgery, neoadjuvant therapy 1. INTRODUÇÃO 8 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia ultrapassado pela próstata e mama, verificando-se que os tumores do reto são menos frequentes que os do cólon [1]. 1.3.1 Fatores etiológicos Como referido anteriormente o adenocarcinoma do cólon e reto tem origem devido a fatores ambientais e hereditários. Como tal é um dos principais tipos de cancro em que algumas das causas podem ser identificadas e em teoria prevenidas [15]. Figura 5 - % de casos de tumores malignos em Portugal em 2008 (adaptado de: RORENO)[1] Figura 6 - Tumores mais frequentes em Portugal em 2008 (adaptado de: RORENO)[1] 9 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia Tabela 2 - Fatores etiológicos em carcinoma do cólon e reto Fatores Ambientais Fatores genéticos Dieta [18] Pólipos neoplásicos são lesões percursoras de carcinoma [19, 20] Hábitos tabágicos [21, 22] Doenças inflamatórias intestinais (DII) - colite ulcerativa e doença de Crohn [23] Alcoolismo [24] História familiar [25-27]. Atividade física [20, 28, 29] 1.4 Rastreio e Diagnóstico O curso lento de crescimento desde pólipos pré-neoplásicos a carcinoma invasivo oferece uma janela de oportunidade para a prevenção e deteção precoce de doença [30]. Como referido anteriormente a deteção e remoção de pólipos num estadío inicial vai permitir uma terapia com melhores taxas de sucesso, resultando na redução da mortalidade por diminuição da taxa de incidência da doença e aumento da taxa de sobrevivência. O rastreio é recomendado a homens e mulheres com 50 anos de idade, embora pessoas com maior risco devido a história familiar ou outros fatores de risco devem começar o plano de rastreio mais cedo. A probabilidade de diagnóstico de cancro do cólon e reto aumenta progressivamente após os 40 anos de idade, no entanto, novos dados tentem a sugerir um aumento entre os jovens [25, 31-33]. A colonoscopia é o procedimento recomendado para a maioria dos pacientes neste grupo de risco [34]. 1.5 Terapia neoadjuvante e influência de polimorfismos Como com os demais cancros, existem várias formas de tratar o cancro cólonretal: a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia são formas convencionais e clássicas. Mais recentemente, a identificação de algumas mutações nos genes KRas e EGFR do genoma de alguns tumores, tem trazido novos esquemas de tratamento dirigido, personalizado, “inteligente”, com resultados muito animadores. Durante muito tempo a cirurgia foi a primeira arma de tratamento, mesmo para cancro cólon-retal avançado, com as consequências inerentes e indesejáveis, nomeadamente a exérese do esfíncter anal e a procura de situações de ânus artificial, de carácter permanente ou transitório. A procura de soluções adequadas para manter o funcionamento do esfíncter anal acabou por dar prioridade de ação à radioterapia e à quimioterapia convencional que, 10 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia diminuindo o tamanho do tumor, facilitam que a cirurgia, como adjuvante, possa intervir numa segunda fase sem os efeitos devastadores no funcionamento do esfíncter anal. Por isso é tão importante conhecer cada vez melhor os factores que intervêm na qualidade da resposta à terapia neoadjuvante. A cirurgia continua a ser a principal terapia no tratamento do cancro do cólon e reto [35-38]. Com base em ensaios clínicos randomizados, o padrão de tratamento para o adenocarcinoma retal localmente avançado é a terapia neoadjuvante - quer como radioterapia pré-operatória (PRT) ou quimioradioterapia (pCRT) - seguido da excisão total do mesorreto (TME) [46-49]. Vantagens da terapia neoadjuvante incluem melhor controlo local, aumento da sobrevivência e redução do tamanho do tumor, que, em teoria, pode aumentar a possibilidade de se realizar uma cirurgia de poupança do esfíncter em tumores de baixo grau. Esta hipótese tem sido investigada em vários ensaios com diferentes regimes de tratamento pré-operatório [39-47]. No entanto, esta abordagem tem sido associada a uma elevada taxa de morbilidade e pode ter um impacto negativo na qualidade de vida (QV): disfunção intestinal/sexual e incontinência fecal [48, 49]. Nos últimos anos foram propostos diferentes regimes de PRT e pCRT de acordo com a fase clínica da doença e num cenário em que várias abordagens estão disponíveis, as vantagens de cada tratamento específico devem ser ponderadas contra o impacto que têm sobre a morbilidade global e sobre a qualidade de vida dos doentes. Terapia a curto e longo prazo foram comparadas em dois estudos randomizados:  Segundo Bujko et al. em estadíos T3/T4 em médio-baixo reto foram encontradas melhores taxas de resposta patológica completa em terapia de longa duração (16%) do que na de curta duração (1%) [50];  Ngan et al. relataram recentemente que em pacientes com tumores distais, a terapia de longo curso parece estar associada a menores taxas de recorrência local [51]. Com base nas evidências disponíveis, pCRT de longa duração parece ser preferível em pacientes com tumores distais ou margens radiais ameaçadas. Para pacientes com tumores pequenos, relativamente proximais para os quais a duração da terapia é uma consideração importante, radiação pré-operatória de curta duração parece ser uma alternativa segura e não compromete os resultados a longo prazo. 11 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia Certas variações polimórficas podem influenciar a estabilidade do RNA mensageiro (mRNA), tradução e interações entre proteínas conduzindo a uma função subótima e a uma expressão de diferentes graus de sensibilidade à radiação [52]. A carcinogénese do cólon e reto está associada a diferentes características genéticas, mas os dados, ainda controversos, não são suficientes para suportar a sua biologia molecular distinta. Embora a suscetibilidade genética seja responsável por quase 35% do risco de desenvolver um adenocarcinoma do cólon e reto, mutações em genes de predisposição conhecidos não explicam todos os casos de malignidade. Pelo menos uma parte desta suscetibilidade pode ser encontrada sob a forma de variantes comuns de baixo risco em genes que, individualmente e indiretamente conferem um efeito no risco de doença. A resposta do tumor à radioterapia neoadjuvante varia amplamente entre os indivíduos e em cancro do cólon e reto pode ser ineficaz em 50% dos casos. A seleção dos pacientes é atualmente baseada em parâmetros clínicos, endossonografia retal e TAC, mas estes parâmetros não são preditores de resposta. A identificação de marcadores preditivos de resposta tem importância clínica passível de permitir uma terapia dirigida [53]. Uma abordagem promissora é o estabelecimento de biomarcadores como é o caso dos polimorfismos genéticos [54, 55]. Os polimorfismos genéticos são definidos como a ocorrência simultânea, numa população, de duas ou mais formas alternativas de um gene ou de uma sequência de DNA em que a variante menos frequente está presentes em pelo menos 1% da população [56]. Os polimorfismos mais frequentes que ocorrem no genoma humano são os chamados SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), que são caracterizados pela alteração de apenas um único nucleótido. Estima-se que ocorra um SNP a cada 200- 300 pares de bases [57]. Os SNPs constituem a principal fonte de diversidade uma vez que cada indivíduo é portador de um vasto grupo de polimorfismos que lhe confere um património genético único [58]. Podem ocorrer em qualquer uma das regiões do genoma localizando-se na região promotora, exões e intrões e exercer efeitos na expressão dos genes (Figura 7) [59-61]:  Quando localizados em regiões promotoras podem aumentar, diminuir ou não afetar a expressão genética; 12 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia  Quando ocorrem em exões, estes polimorfismos podem levar à mudança de aminoácido e consequentemente afetar a proteína ou serem silenciosos, não afetando a proteína;  Quando ocorrem em intrões podem alterar a sequência proteica se estiverem localizados numa zona de splicing ou alterar a expressão genética se estiverem localizados numa zona codificadora de microRNAs. Figura 7 - Efeitos biológicos dos polimorfismos (adaptado de: Monzo et al., 2008)[57] 2. OBJETIVOS 16 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia 2.1 Objetivos gerais Complementar a compreensão da base molecular de suscetibilidade individual à carcinogénese cólon-retal e determinar como esta pode influenciar a capacidade de resposta ou resistência à terapia antineoplásica. 2.1.1 Objetivos específicos Estudo de 61 SNPs associados a 10 genes - COX-2, HPGD, SLCO2A1, ABCC4, IL-10, EGFR, TNF, CCND1, NAT2 e IGF-1 - de modo a avaliar a influência destes polimorfismos na sobrevida livre de doença, recidiva e resposta do paciente à radioterapia neoadjuvante. 24 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia 3.3.1 Genotipagem Figura 8 - Fases da técnica Sequenom iPLEX Gold (adaptado de: Genotyping with Sequenom) A genotipagem foi realizada utilizando a tecnologia “MassARRAY Iplex Gold (Sequenom, San Diego, CA)”. Esta técnica permite analisar diversos SNPs simultaneamente num mesmo ensaio. Para tal, é necessário desenhar primers específicos para cada fragmento de interesse e garantir que, nem as sequencias dos primers nem as massas moleculares dos fragmentos se sobrepõe. A utilização do software SEQUENOM’s Assay Design facilita esta tarefa. A primeira fase da técnica é um PCR convencional, no qual os fragmentos com os SNPs de interesse são amplificados. Através do MassARRAY Liquid Handler (Sequenom, San Diego, Califórnia) a mistura de reação é distribuída pelas placas de 384 poços previamente preparadas com DNA e de seguida, num termociclador convencional, sujeitam-se as amostras a um programa específico de amplificação. Após a amplificação dos fragmentos é necessário proceder à neutralização dos desoxirribonucleotidos fosfatados (dNTPs) que não foram incorporados nas cadeias de DNA sintetizadas, convertendo-os em difosfatos de desoxirribonucleótidos (dNDPs), de modo a torna-los inativos em reações futuras. Assim, aos produtos de PCR adiciona-se, 25 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia recorrendo ao MassARRAY Liquid Handler (Sequenom, San Diego, Califórnia), uma solução contendo a enzima SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) e incubam-se as placas. Neutralizados os dNTPs, procede-se à reação de extensão iPLEX Gold. Uma nova mistura de reação é preparada e distribuída pelas placas contendo o produto de PCR e neutralização. Novamente as amostras são sujeitas a um procedimento semelhante ao PCR, mas no qual ocorre um annealing de sondas de extensão (que complementam o fragmento amplificado até ao nucleótido imediatamente anterior ao locus do SNP em análise), em vez dos tradicionais primers. A etapa da extensão difere igualmente do PCR convencional, na medida em que apenas um nucleótido é incorporado. Este é um nucleótido de terminação que marca o final do fragmento e permite a sua deteção. Antes de proceder à deteção dos alelos por espectroscopia de massa, é necessário dessalinizar os produtos de extensão e transferi-los para um SpectroCHIP® array, recorrendo ao MassARRAY nanodispenser (Sequenom, San Diego, Califórnia). O SpectroCHIP® array é então analisado pelo MassARRAY analyzer (Sequenom, San Diego, Califórnia), um espectrómetro de massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight) desenhado especificamente para análise genómica. Por fim, os resultados são analisados através do software TyperAnalyzer. O controlo de qualidade do ensaio foi efetuado através da utilização de indivíduos de genótipo conhecido (HapMap) como controlos positivos; amostras duplicadas na mesma e entre as várias placas como controlos inter-ensaio; amostras de água, sem DNA como controlos negativos e verificação do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) - permite inferir acerca da estabilidade da distribuição das frequências alélicas e genotípicas do SNP na população em geral entre gerações. Sempre que os seus valores são maiores que 0,05 existe evidência da referida estabilidade e, no contexto de genotipagem, uma certeza de que não ocorreu nenhum erro no processo. Esta técnica foi, gentilmente, realizada pela Unidade de Genómica/Serviço de Genotipagem do Instituto Gulbenkian de Ciência de Oeiras em Portugal, ao qual expresso novamente os meus agradecimentos. 3.3.1.1 Controlo de Qualidade Os genótipos foram excluídos da análise por não respeitarem os seguintes critérios:  “Call rate”, definida como a fração de SNPs por amostra sobre o número total de SNPs no conjunto de dados, inferior a 0,90; 26 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia  “Concordance rate”, definida como a taxa de probabilidade de que duas pessoas com genes partilhados desenvolvam a mesma doença, inferior a 0,95;  Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) P<0,05;  Interpretação do genótipo a nível informático e também por um investigador de forma independente. 3.4 Análise Estatística A análise de sobrevivência foi realizada utilizando o software “IBM Statistical Package for Social Sciences - SPSS (IBM Corp., Armonk, Nova Iorque , EUA) (versão 20.0)”. Para análise da distribuição genética, o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado pelo teste de chi-quadrado de Pearson (χ2) para comparar a distribuição de genótipos observada [67]. Os cálculos foram confirmados com recurso a folha de cálculo desenvolvida por Michael H.Court (2005-2008). Odds ratio (OR) e o intervalo de confiança de 95 % (IC) foram calculados com recurso ao programa “Epi Info 7TM“ e confirmados com o “IBM Statistical Package for Social Sciences - SPSS (IBM Corp., Armonk, Nova Iorque , EUA) (versão 20.0)” como uma medida da associação entre as variantes genéticas e a análise de recidiva. 4. RESULTADOS 30 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia 4.1 Frequência dos Genótipos e Risco Um total de 61 SNPs foram analisados com o intuito de identificar polimorfismos capazes de influenciar à resposta à terapia neoadjuvante em doentes com CCR. Cinco das amostras utilizadas foram excluídas da análise devido a erros inerentes à técnica de genotipagem. As frequências de todos os SNPs analisados neste estudo encontramse dentro dos valores de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (P > 0.05) De todos os polimorfismos analisados, quatro SNPs pertencentes aos genes SLCO2A1 e ABCC4, respetivamente, encontram-se associados à resposta à terapia neoadjuvante. Na tabela 5 encontram-se descritas as frequências desses mesmo polimorfismos rs9821091, rs9834412, rs7340717 e rs8002180. Tabela 5 - Frequências dos genótipos dos casos Gene/SNP Genótipo Casos n (%) Sem recidiva n (%) Com recidiva n (%) Recidiva Total n (%) SLCO2A1 rs9821091 GG 77 (45.3) 60 (44.4) 12 (44.4) 72 (44.4) GA 69 (40.6) 61 (45.2) 6 (22.2) 67 (41.4) AA 24 (14.1) 14 (10.4) 9 (33.3) 23 (14.2) rs9834412 CC 103 (60.6) 82 (60.7) 14 (51.9) 96 (59.3) CA 60 (35.3) 50 (37.0) 9 (33.3) 59 (36.4) AA 7 (4.1) 3 (2.2) 4 (14.8) 7 (4.3) rs7340717 GG 79 (47.0) 57 (42.9) 17 (63.0) 74 (46.2) GT 76 (45.2) 65 (48.9) 10 (37.0) 75 (46.9) TT 13 (7.7) 11 (8.3) 0 (0) 11 (6.9) rs4148421* CC 43 (25.3) 36 (26.7) 5 (18.5) 41 (25.3) CA 87 (51.2) 69 (51.1) 14 (51.9) 83 (51.2) AA 40 (23.5) 30 (22.2) 8 (29.6) 38 (23.5) ABCC4 rs8002180 TT 78 (45.9) 62 (45.9) 13 (48.1) 75 (46.3) TC 72 (42.4) 53 (39.3) 14 (51.9) 67 (41.4) CC 20 (11.8) 20 (14.8) 0 (0) 20 (12.3) rs869951* GG 52 (31.1) 37 (28.0) 11 (40,7) 48 (30.2) GC 81 (48.5) 64 (48.5) 14 (51.9) 78 (49.1) CC 34 (20.4) 31 (23.5) 2 (7.4) 33 (20.8) Os polimorfismos assinalados na tabela 5 com um (*) – rs4148421 e rs869951 foram escolhidos para exemplificar que as associações que iremos observar posteriormente na Análise de Sobrevivência não são validas para todos os SNPs do mesmo gene. 31 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia 4.2. Análise de Sobrevivência Após estudo da Sobrevida Livre de Doença em doentes submetidos a terapia neoadjuvante observamos que das 15 variações estudadas do gene SLCO2A1, três são estatisticamente significativas: A análise de sobrevivência do rs9821091 demonstra diferenças estatisticamente significativas na Sobrevida Livre de Doença dos diferentes genótipos (GA vs GG vs AA, p = 0,001) Para os genótipos GG, GA e AA, verificamos que os portadores têm uma Sobrevida Livre de Doença de 135, 125 e 124 meses, respetivamente (Figura 9). Figura 9 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs9821091 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante Na análise de sobrevivência do rs9834412 observamos, novamente, diferenças estatisticamente significativas entre a Sobrevida Livre de Doença dos diferentes genótipos (CA vs CC vs AA, p = 0,039). Para os genótipos CC, CA e AA verificamos uma Sobrevida Livre de Doença de 135, 121 e 110 meses, respetivamente (Figura 10). Este padrão de DFS (maior número de meses de sobrevivência para o genótipo CC, mas pior DFS que o genótipo GA), pode ser devido ao tamanho da amostra ou o polimorfismo não ter um impacto acentuado nos genótipos. 32 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia Figura 10 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs9834412 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante A análise de sobrevivência do rs7340717 demonstra diferenças estatisticamente significativas entre a Sobrevida Livre de Doença dos diferentes genótipos (TT vs GT vs GG, p = 0,039). Para os genótipos GG, GT e TT, verificamos que os portadores têm uma Sobrevida Livre de Doença de 126, 124 e 95 meses, respetivamente (Figura 11). Figura 11 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs7340717 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante 33 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia A titulo de exemplo de que estas associações não se verificam para todos os SNPs do gene SLCO2A1 temos o rs4148421, para o qual a análise de correlação dos diferentes genótipos e a DFS não é estatisticamente significativa – p = 0,989 (Figura 12). Figura 12 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram uma correlação que não é estatisticamente significativa entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs4148421 Relativamente ao gene ABCC4, das 31 variações estudadas, uma é estatisticamente significativa: Para o rs8002180 foram demonstradas diferenças estatisticamente significativas entre a Sobrevida Livre de Doença dos diferentes genótipos (CC vs TT vs TC, p = 0,030). Para os genótipos TT, TC e CC, verificamos que os portadores têm uma Sobrevida Livre de Doença de 125, 125 e 126 meses, respetivamente (Figura 13). Figura 13 - Curvas de Kaplan-Meier que demonstram a correlação entre os diferentes genótipos e sobrevida livre de doença (DFS) para o rs8002180 em doentes com CCR tratados com QRT neoadjuvante 40 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia expressa na mucosa normal e é um dos genes downregulated em tumores do cólon e reto, sendo supressor de neoplasia do cólon por diminuição do catabolismo de PGE2 [71, 72]. Os efeitos biológicos das vias COX-2/PGE2 não só são regulados pela síntese de COX-2 ou a degradação da 15-PGDH, mas também pelos níveis de PGE2 no microambiente extracelular. Os níveis de PGE2 são regulados por transportadores importantes neste processo [73, 74]. As proteínas de transporte de fármacos são expressas em diversos tipos de tecido, incluindo cólon, fígado, rim e cérebro. São importantes moduladores da absorção e disposição de fármacos e a variabilidade na expressão ou função das proteínas afeta o perfil farmacocinético do fármaco e portanto a sua eficácia. São, geralmente, classificados em duas categorias (Figura 15): Transportadores de Captação e Transportadores de Efluxo. Figura 15 - Transportadores de Fármacos em Humanos (adaptado de: Genomics in Drug Discovery and Development)[75] *OAT – Transportador de Aniões Orgânico (Organic Anion Transporter); OATP – Proteína Transportadora de Aniões Orgânicos (Organic Anion Transporter Protein); OCT – Transportador de Catiões Orgânico (Organic Cation Transporter); BSEP – Bomba Exportadora de Sais Biliares (Bile Salt Export Pump); MDR – Proteína de Resistência a Múltiplos Fármacos (Multi Drug Resistance Protein); MRP – Proteína Associada a Resistência a Múltiplos Fármacos (Multi Drug associated Resistance Protein); BCRP - Proteína de Resistência em Cancro da Mama (Breast Cancer Resistance Protein). Transportadores de Fármacos em Humanos Transportadores de Captação SLC22A (OAT1-4, OCT1-3) SLCO (OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1) Transportadores de Efluxo ABCB (MDR1-3, BSEP) ABCC (MRP1-9) ABCG (BCRP) 41 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia A família de transportadores ABC esta descrita como tendo 48 membros presentes no ser humano [76] e 12 deles são reconhecidos como transportadores de fármacos [77]: incluindo a P-glicoproteína (codificada pelo gene ABCB1), a MDR-1 associated protein ou MRP1 (codificada pelo gene ABCC1) e a Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) que é codificada pelo gene ABCG2 [78]. Pacientes com tumores refratários à quimioterapia têm, geralmente, uma expressão aumentada de um determinado transportador ABC. Estes transportadores estão localizados no citoplasma da membrana das células resistentes, o que resulta num aumento do efluxo do fármaco [79]. Os transportadores pertencentes à família SLC (Solute Carrier Family) não dependem diretamente da hidrólise de ATP e são em grande parte, mas não exclusivamente, transportadores de captação - isto é, absorvem pequenas moléculas (amino ácidos, oligopéptidos, açucares, aniões orgânicos e alguns fármacos). Este processo de absorção, sem contrariar o gradiente de concentração é denominado de Difusão Facilitada. A maior parte dos transportadores de efluxo fazem parte da família ABC e utilizam energia da hidrólise do ATP para transportar substâncias, a favor ou contra o gradiente de concentração – Transporte Ativo [75]. As PGs são sintetizadas a partir do ácido araquidónico libertado pelos fosfolípidos de membrana por ações enzimáticas sequenciais no interior da célula e exercem os seus efeitos autócrinos e parácrinos principalmente por ligação a recetores de membrana extracelulares [80, 81]. As PGs são lípidos, pelo que a sua difusão na membrana é dificultada pela sua carga negativa [74]. Assim o transporte de PGs através da membrana celular é realizado por um membro da família ABC denominado de ABCC4 (também conhecido como MRP4) e um membro da família SCL denominado de SCLO2A1 (também conhecido como PGT ou OATP2A1) [82, 83]. O gene ABCC4 atua no efluxo de PGs a partir da célula (transportador de efluxo) [73, 82, 84, 85]. SLCO2A1 medeia o efluxo ou captação, de acordo com o gradiente de concentração de lactato, mas preferencialmente promove a captação de PGs do espaço extracelular (transportador de captação) [86, 87]. A proteína associada a resistência a múltiplos fármacos 4 (MRP4) é responsável pelo efluxo de PGE2 para o meio extracelular [73]. Por outro lado, a captação ativa para o citoplasma, onde vai PGE2 ser inativada pela 15-HPGD é efetuada pelo transportador da prostaglandina (PGT) [74]. Holla et al., relataram que os níveis de mRNA de PGT e MRP4 são inversamente proporcionais em CCR – PGT sub expresso e MRP4 sobre expresso em tecidos e linhas celulares conduzindo a níveis mais elevados de PGE2 no meio extracelular aumentando assim os efeitos biológicos da via COX-2/PGE2 [88]. 42 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia Embora permaneçam questões em torno da função biológica de cada SNP ou do seu papel cumulativo geral e interação com fatores ambientais, os porlimorfismos estudados, à luz dos resultados obtidos, poderiam ser aplicados numa perspetiva de prática de medicina personalizada. Os resultados obtidos demonstram que para determinados genótipos, os doentes vão apresentar pior sobrevida livre de doença e, em alguns casos, inclusivamente, risco de recidiva. Em termos de tradução para a prática clínica hospitalar, a inclusão do genótipo na estratificação dos doentes seria importante para aferir quais iriam ou não beneficiar mais da terapia neoadjuvante. Não só teríamos uma perspectiva de tratamento animadora em alguns doentes, como doentes com genótipos de risco podiam ser poupados a uma terapia agressiva sem qualquer beneficio, o que também se poderá repercutir nos custos do tratamento. 6. CONCLUSÕES GERAIS & PERSPETIVAS FUTURAS 46 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia A resposta inflamatória anormal está associada a sobre regulação de Cicloxigenase 2 (COX-2). A COX-2 é um gene de resposta precoce, sobre expresso em 40-50% dos adenomas e 85 % dos CCR. É responsável pela acumulação de prostaglandinas (PGs) no microambiente celular [69]. Medeia a síntese de prostaglandina E2 (PGE2) que vai estimular a proliferação celular, invasão, angiogenese, evasão de apoptose e modulação da resposta imune anti tumoral [70]. O envolvimento dos genes SLCO2A1 e ABCC4, que codificam a PGT e MRP4, respetivamente é importante no desenvolvimento da doença. O aumento de COX-2 e MRP4 e repressão de 15-HPGD e PGT está associada a altos níveis de PGE2 no meio extracelular culminando com a ativação de um grande número de vias que potenciam o desenvolvimento do tumor [86, 87]. Neste estudo coorte retrospetivo foi avaliado o envolvimento de 61 SNPs em 10 genes (COX-2, HPGD, SLCO2A1, ABCC4, IL-10, EGFR, TNF, CCND1, NAT2 e IGF-1), em especial o papel chave dos genes SCLO2A1 e ABCC4 na via das Prostaglandinas e como podem contribuir para o desenvolvimento da doença e limitar a resposta a terapia neoadjuvante. Os nossos resultados indicam que quatro polimorfismos genéticos estão implicados na sobrevida livre de doença e na possibilidade de recidiva: rs9821091, rs9834412 e rs7340717 no gene SLCO2A1 e o rs8002180 no gene ABCC4. Doentes com genótipo AA (OR: 4,32 p < 0,01) do rs9821091 e genótipo AA (OR: 7,65 p < 0,01) do rs9834412 têm um risco de recidiva, quatro e sete vezes superior, respetivamente, para além do facto de se apresentarem como os indivíduos mais comprometidos a nível da sobrevida livre de doença (p = 0,001 e p = 0,039, respetivamente). Indivíduos com genótipo GG do rs7340717 (p = 0,039) encontram-se comprometidos a nível da sobrevida livre de doença. Apesar de não ser uma associação estatisticamente significativa, existe uma tendência para que doentes com genótipo GG (OR: 2,27 p = 0,056) apresentem um risco de recidiva superior. Índividuos com genótipo TC do rs8002180 também têm uma sobrevida livre de doença comprometida em relação aos restantes genótipos (p = 0,030). Estas associações verificam-se em doentes que aguardaram entre o inicio da terapia neoadjuvante e a data de cirurgia, um período inferior a 3 meses. O desafio passa por usar SNPs como biomarcadores, que podem ter como alvo as populações de maior risco, tanto em modalidades de quimioradioterapia preventivas traduzindo o seu efeito biológico para a prática clinica, como para rastreio, mas neste caso implicaria um novo desenho do estudo. Não existe literatura prévia sobre os efeitos destes SNPs a nível molecular nem quaisquer dados elucidativos de como se dá o aumento de expressão de COX-2 e 47 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia consequente aumento da regulação de PGE2 pós irradiação. Estudos anteriores colocam a hipótese de que a sobre regulação de PGE2 como consequência da radiação pode ser explicada, pela observação de que pelo menos duas enzimas da via da cicloxigenase - Fosfolipase A2 e COX-2, são sensíveis ao stress oxidativo e aos radicais livres. Por estas razões e como perspetivas futuras seria interessante replicar este estudo num maior número de doentes com CCR, sendo a amostra uniformizada, e num rácio de um doente para três controlos. É também importante confirmar os resultados obtidos nas genotipagens por Real Time PCR, que não foi possível devido ao período de tempo de trabalho disponível. Reunir o maior número de informações clínicas dos doentes, como a história pessoal e familiar de neoplasia e doenças inflamatórias intestinais, dieta, estilo de vida (alcoolismo e tabagismo), uso de AINEs, para que a análise possa ser estratificada e também abordada como um efeito cumulativo de vários fatores. É importante realizar mais estudos de modo a que seja avaliada a consequência funcional que cada SNP tem na respetiva enzima e também elucidar os mecanismos que regulam a sobre expressão de prostaglandinas após irradiação. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 7. MATERIAL SUPLEMENTAR 57 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia Material & Métodos - Protocolos de Extração de DNA Protocolo 1: Sangue Periférico Fase 1 – Lise Celular 1. O primeiro passo do protocolo foi descongelar cada amostra em banho-maria a 42ºC. 2. De seguida, o conteúdo do eppendorf (sangue total ≈ 1,5 mL) foi transferido para um tubo de Falcon de 15 mL e foram adicionados 4,5 mL de Red Blood Cell Lysis (RCLB) – tampão de lise de eritrócitos que contém 1M de Tris-HCl a pH 7.2, 5M de NaCl e 1M de MgCl2). 3. A solução foi homogeneizada por inversão e incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente. Após este passo a amostra foi centrifugada a 2000 g durante 20 minutos, à temperatura ambiente, usando a centrífuga Heraeus Megafuge 16R (Thermo Scientific). 4. Descartou-se o sobrenadante, deixando apenas o pellet e 0,5 mL de solução residual que, posteriormente, foi agitado no vortex (VM2 Cat) de modo a voltar a suspender as células. 5. Adicionou-se 1,5 mL de Cell Lysis Solution e agitou-se novamente durante 10 segundos. Procede-se então a uma incubação de 2 horas a 37ºC. Fase 2 – Precipitação das proteínas 1. O material previamente incubado foi colocado em gelo durante 5 minutos. 2. Dispensou-se 700 µL de Protein Precipitation em cada tudo, e agitou-se no vortex durante 20 segundos. 3. As amostras foram centrifugadas a 2000 g durante 20 minutos, novamente à temperatura ambiente. Fase 3 – Precipitação do DNA 1. Colocou-se o sobrenadante que continha DNA num Falcon de 15 mL que continha 2 mL de Isopropanol absoluto. 2. Misturou-se a amostra por inversão e o DNA tornou-se visível. Seguiu-se uma centrifugação de 20 minutos (Tamb). 3. Removeu-se o sobrenadante, inverteu-se o tubo e deixou-se secar durante 10 minutos. 58 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia Fase 4 – Hidratação do DNA 1. Ao Falcon, previamente seco, adicionou-se 100 µL de DNA Hydratation Solution e incubou-se a 55ºC durante 1 hora. 2. Após a incubação a amostra foi transferida para um eppendorf, realizou-se o spin down (Pulse Continuous) o DNA estava pronto a ser quantificado. O seu armazenamento pós-quantificação é feito a 4ºC para curto prazo e a -20ºC para conservação a longo prazo. Protocolo 2 - Tecidos Fixados em Parafina Fase 1 – Digestão do Tecido, Lise Celular e Desnaturação das Proteínas 1. Lâminas com cortes com espessura de 10 µm foram incubadas a 55ºC durante 30 minutos, desparafinadas com duas mudanças de xilol e lavadas com uma série decrescente de etanol (Absoluto, 90% e 70%) e água destilada (dH2O). 2. Sem deixar secar, colocou-se o tecido num eppendorf de 1,5 mL com uma ponta de pipeta estéril. 3. O tecido foi digerido com 20 µL de proteinase K (10mg/ml), que é também a responsável pela lise celular e desnaturação das proteínas, e 200 µL de buffer BC2. A incubação foi o passo seguinte – Termomixer, 60ºC, com agitação, overnight. Fase 2 – Ligação seletiva do DNA, Remoção de contaminantes e Eluição do DNA 1. Foram adicionados 200 µL de buffer TC1 à amostra que foi novamente incubada (60ºC, 40 minutos, em agitação). Durante este período incubou-se também o Elution Buffer. Se após a incubação ainda existir material insolúvel realiza-se uma centrifugação (16.000 g durante 2 minutos e 45 segundos) e coloca-se o sobrenadante num novo eppendorf. 2. Adicionou-se 200 µL de Etanol absoluto à amostra e agitou-se vigorosamente durante 10 segundos. 3. Colocou-se a coluna de extração de DNA num tubo de recolha de 2 mL e transferiu-se a amostra, (incluindo o precipitado, se presente) para a coluna. 4. Centrifugou-se a 16.000 g durante 2 minutos e 45 segundos, descartou-se o tubo e colocou-se a coluna num novo tubo de recolha. 59 | SNPs e resposta à terapia neoadjuvante no carcinoma do cólon e reto – Marcadores genéticos para avaliação de resposta à terapia 5. Seguidamente foram realizadas duas lavagens: a primeira com 400 μL de Wash Buffer 1 (centrifugou-se a 16.000 g durante 1 minuto e 45 segundos) e descartouse o conteúdo do tubo de recolha. A segunda lavagem foi feita com 600 μL de Wash Buffer 2 (ao qual foi adicionado etanol previamente), nas mesmas condições. 6. Descartou-se, novamente, o conteúdo do tubo de recolha e centrifugou-se durante 3 minutos e 45 segundos a 16.000 g para secar a matriz da coluna. 7. Transferiu-se a coluna para um eppendorf de 1,5 mL e pipetou-se 30 μL de Elution buffer (solução com baixa concentração de sais) para o centro da coluna, sem tocar nas membranas. 8. A amostra foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos. Por fim, centrifugou-se durante 1 minuto e 45 segundos a 16.000 g para obter DNA. Fluxograma 1 - Esquema de Extração de DNA de Tecidos em Parafina (adaptado de: GRiSP)