Aplicação de enxertos vasculares artificiais de polímeros biodegradáveis num modelo animal.

1 Nuno Miguel Lourenço Alexandre APLICAÇÃO DE ENXERTOS VASCULARES ARTIFICIAIS DE POLIMEROS BIODEGRADÁVEIS NUM MODELO ANIMAL Tese de Candidatura ao grau de Doutor em Ciências Veterinárias submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador – Ana Lúcia Luís Categoria – Professora Auxiliar Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Co-orientador – Ana Colette Maurício Categoria –Professora Associada com agregação Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. Co-orientador – José Domingos Santos Categoria – Professor Associado com agregação Afiliação – Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto 2 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 3 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Declaração: As conclusões apresentadas nesta dissertação são baseadas nos artigos científicos: ARTIGOS PUBLICADOS OU EM PUBLICAÇÃO, NO ÂMBITO DESTA DISSERTAÇÃO, EM REVISTAS NACIONAIS OU INTERNACIONAIS COM ARBITRAGEM CIENTIFICA: Andrade, F.K., Alexandre, N., Amorim, I., Gärtner, F., Mauricio, A.C., Luis, A.L., Gama, F.M. (2013). Studies on the biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 28(1), 97-112. Alexandre, N., Ribeiro, J., Gärtner, A., Pereira, T., Amorim, I., Fragoso, J., Lopes, A., Fernandes J., Costa E.,Santos-Silva A., Santos J.D., Maurício A.C., Luís A.L. (2014). Biocompatibility and hemocompatibility of polyvinyl alcohol hydrogel used for vascular grafting—In vitro and in vivo studies. Journall of Biomedical Materials Research Part A, (in press). 4 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 5 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP COMUNICAÇÕES E PAINÉS EM REUNIÕES NACIONAIS E INTERNACIONAIS: Alexandre, N., Gärtner, A., Amorim, I., Santos, J.D., Lopes, A., Maurício, A.C., Luís, A.L. (2010). Application of artificial vascular polyvinyl alcohol hydrogel grafts in sheep - our experience to date. II Jornadas Científicas do CECA – ICETA, Vairão, Portugal. (Comunicação oral). Alexandre, N., Lopes, A., Nunes, N., Amorim, I., Maurício, A.C., Santos, J.D., Luís A.L. (2013). Application of Vascular grafts of polyvinyl alcohol hydrogel associated to mesenchymal stem cells from Whartons jelly in an animal model. MATERIAIS 2013, International Conference, Sociedade Portuguesa de Materiais, Coimbra, Portugal (Comunicação oral). Alexandre, N., Nunes, N., Lopes, A., Rodrigues, M., Maurício, A.C., Santos, J.D., Luís, A,L. (2013). The in vitro mechanical properties of small diameter poly(vinyl) alcohol hydrogel (PVA) plus dextran (Dx) based vascular grafts. 5th International conference on Mechanics of Biomaterials and Tissues, Stiges, Spain (Painel). Alexandre, N., Lopes, A., Rodrigues, M., Amorim, I., Pereira, T., Gärtner, A., Maurício, A.C., Santos, J.D., Luís, A.L. (2013). In vivo evaluation of the potencial of mesenchymal stem cells (MSCs) from whartons jelly (WJ) to improve the biocompatibility of poly(vinyl) alcohol hydrogel (PVA) membranes in animal model (sheep). 8th International Meeting of the Portuguese Society for Stem Cells and Cell Therapies, Faro, Portugal. (Painel). 6 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 7 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP No cumprimento do disposto no n.º 2 do artigo 8º do Decreto-lei n.º 388/70, como autora desta dissertação, declaro que participei na concepção, execução e interpretação dos resultados que estiveram na base destes artigos. Retenho todos os direitos de autor relativos a esta dissertação e o direito de a usar em trabalhos futuros (como artigos e livros). 8 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 9 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP AGRADECIMENTOS A realização deste trabalho permitiu-me descobrir que em investigação o trabalho resulta de um esforço conjunto e o resultado final só é possível com a colaboração de uma equipa alargada. Em primeiro lugar um especial agradecimento á minha orientadora Professora Doutora Ana Lúcia Luís que desde o primeiro momento se mostrou disponível para ajudar no que fosse necessário, por toda a amizade, empenho demonstrado para que este trabalho chegasse á sua conclusão e por me fazer sentir em casa. O agradecimento especial á minha co-orientadora Professora Doutora Ana Colette Maurício por me ter aberto a porta do ICBAS, por ter colocado à disposição todos os recursos necessários para que este trabalho chegasse a bom porto, por acreditar em mim e neste trabalho e pelo rigor imposto na revisão dos artigos. Um agradecimento também ao meu co-orientador Professor Doutor José Domingos Santos pela sua sabedoria na área dos biomateriais, pelo entusiasmo que coloca nos projectos onde participa e por colocar à disposição todos os recursos necessários da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto. Á Dra. Irina Amorim pela preciosa ajuda e colaboração na realização e análise das amostras histopatológicas. Á Professora Doutora Ascensão Lopes e Dr. Miguel Rodrigues por todo o auxílio no fabrico dos biomateriais e por estarem sempre disponíveis para fazerem mais. Ao Dr. Guilherme Valadares por toda a colaboração na parte das ecografias, por partilhar a sua imensa sabedoria na área da imagiologia, pela amizade de mais de 20 anos o meu agradecimento. Aos Professores Elísio Costa e Alice Santos-Silva por me terem aberto a porta da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, pela excelente colaboração dos testes in vitro, por todo o esforço e empenho demonstrados sem os quais não seria possível concluir este trabalho. 16 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 17 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESUMO Com este trabalho pretendeu-se estudar pré-clinicamente a utilização de uma prótese vascular do polímero hidrófilico polivinil álcool hidrogel (PVA) e do polissacárido dextrano num modelo animal anatomicamente e fisiologicamente próximo do homem. A prótese vascular foi produzida com um baixo diâmetro (diâmetro interno igual a 5 mm) com o objectivo de se anastomosar com uma artéria de diâmetro equivalente para simular os procedimentos de revascularização que se encontram na prática clinica. Historicamente, as próteses sintéticas de baixo diâmetro sempre apresentaram piores resultados funcionais do que os enxertos autólogos de diâmetro equivalente por diversas razões de ordem biológica, mecânica e estrutural. Pretendeu-se caracterizar a biocompatibilidade e as interacções sangue-material in vitro e in vivo da prótese de PVA/Dx antes de proceder à sua testagem funcional e estrutural no modelo animal. Paralelamente investigou-se a influência da associação de um sistema celular, as células estaminais mesenquimatosas (MSCs) obtidas a partir da geleia de Warton do cordão umbilical no desempenho funcional, estrutural e na sua biocompatibilidade em relação aos tecidos envolventes. O co-polímero polivinil álcool hidrogel e dextrano nunca antes testado nesta aplicação e foi produzido na relação de 90:10 através de um processo de reticulações física pelo método de congelação/descongelação. Com o objectivo de reforçar a reticulação as próteses foram sujeitas a um processo de annealing para melhorar as características mecânicas com o objectivo de resistir ao ambiente físico adverso colocado pela pressão arterial pulsátil. O modelo animal escolhido para a experimentação in vivo foi a ovelha (Ovis aries). Foi realizado um estudo de biocompatibilidade na ovelha com uma duração máxima de 32 semanas. Um grupo de animais (grupo 1) foi implantado por via subcutânea, com os discos de PVA com 15,5 mm de diâmetro e um segundo grupo (grupo 2) foi implantado por via subcutânea, com os discos de PVA cobertos com uma monocultura confluente de MSCs humanas derivadas de geleia de Wharton. O terceiro grupo foi implantado com membranas PVA/Dx com o mesmo diâmetro. Foi também incluído um grupo de controlo negativo de 6 animais, conforme exigido pela norma ISO 10993-6. O grupo controlo positivo (Grupo 5) foi implantado por via subcutânea, com amostras de discos de politetrafluoretileno expandido (MAXIFLOTM, ePTFE Vascular Prótese, Vascutek Ltda, Escócia), com uma área equivalente ao das membranas implantadas de PVA. As membranas foram recolhidas com os tecidos envolventes em diversos pontos temporais até ao período máximo de 32 semanas. As amostras foram posteriormente estudadas para a reacção inflamatória seguindo as linhas orientadoras da norma ISO 10993-6 (anexo E). Após análise de resultados o PVA/Dx demonstrou 18 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP ser um biomaterial com potencial para ser utilizado na reconstrução vascular. Em relação á biocompatibilidade, os resultados demonstraram que o PVA, o PVA com dextrano e o PVA coberto por MSCs humanas isoladas da geleia de Wharton do cordão umbilical são apenas ligeiramente irritantes para os tecidos circundantes de acordo com a norma ISO 10993-6 (Anexo E). Em relação ao estudo da interacção sangue-biomaterial foram utilizadas membranas de PVA/Dx nas dimensões referidas anteriormente, como controlo positivo foram utilizadas esferas ou lâminas de vidro e como controlo negativo membranas de polipropileno. Estas amostras foram testadas in vitro com sangue total, plasma rico em plaquetas e com plasma pobre em plaquetas obtidos de ovelha e humanos. A determinação do índice de hemólise evidenciou o PVA/Dx como um biomaterial não hemolítico (0,014%) sendo seguro para aplicações que contactem com o sangue. A trombogenicidade de PVA/Dx foi avaliada pela quantificação de adesão/activação através dos ensaios de: medição da actividade de lactato de desidrogenase; citometria de fluxo e da quantificação do tempo de coagulação do sangue total. Adicionalmente, a morfologia das plaquetas foi observada por microscopia electrónica de varrimento (MEV) após contacto com as diferentes superfícies utilizadas no estudo. Os resultados destes ensaios permitiram concluir que activação e adesão plaquetária foram muito satisfatórios sendo até inferiores aos resultados do controlo positivo. Os resultados destes parâmetros foram depois confirmados pela análise de imagens de SEM, onde morfologicamente as plaquetas adsorvidas nas membranas de PVA/Dx apresentavam um fenótipo de fraca activação. A activação da cascata de coagulação foi igualmente avaliada no âmbito das interacções sangue-material, tendo-se recorrido á medição dos perfis de recalcificação do plasma e dos níveis de formação do complexo trombinaantitrombina confirmando-se o PVA/Dx como um biomaterial que induz uma fraca activação da cascata de coagulação. Posteriormente avaliou-se a hemocompatibilidade do biomaterial PVA/Dx in vivo em dois grupos de ovelhas implantados respectivamente com próteses vasculares de PVA/Dx de 5 e 7 cm com seis animais cada. O sangue foi recolhido em diversos pontos temporais até a um máximo de 16 semanas, tendo-se avaliado diversos parâmetros hematológicos e da coagulação, confirmando os resultados obtidos in vitro e reforçando à aptidão do PVA/Dx enquanto material para aplicações biomédicas que contactam com o sangue. Na fase final da caracterização funcional do PVA/Dx procedeu-se à sua implantação na artéria carótida comum esquerda através de uma anastomose topo a topo. Vinte e quatro ovelhas adultas foram utilizadas neste ensaio funcional. Dezoito animais foram alocados aos grupos que utilizaram próteses de PVA/Dx. Um grupo de seis animais para além da prótese vascular recebeu também uma injecção perivascular MSCs no 19 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP local das anastomoses. Um outro grupo de seis animais foi medicado com um protocolo de anticoagulação. Adicionalmente, um grupo de ovelhas foi implantado com enxertos de PVA/Dx sem administração de anticoagulantes e MSCs. Finalmente, no grupo de controlo utilizaram-se próteses de ePTFE. A avaliação funcional foi realizada utilizando ecografia em modo B e Doppler em diversos pontos temporais, começando às 24 horas pós-cirurgia até as 24 semanas. Os resultados da taxa de permeabilidade evidenciaram o grupo controlo (84.28±24.66%) como aquele que apresentou a taxa de permeabilidade mais elevada durante o período experimental logo seguido pelo grupo PVA/Dx/MSCs (68.33±27.39%). No entanto, conseguiu-se pela primeira vez manter permeável uma prótese vascular de PVA/Dx durante um período máximo de 24 semanas com a superfície luminal revestido por um endotélio funcional. 20 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP ABSTRACT This study was intended to preclinical studying a vascular prosthesis made with a hydrophilic polymer, polyvinyl alcohol hydrogel (PVA) and a polysaccharide, dextran (Dx) in an animal model anatomically and physiologically closer to humans. The vascular prosthesis was produced with a low diameter (inner diameter of 5 mm) in order to anastomose with an artery of equivalent diameter to simulate revascularization procedures done in clinical practice. Historically, low diameter synthetic prostheses always showed worse functional outcomes than autologous grafts of equivalent diameter for several reasons of biological, mechanical and structural origin. It was also our objective to characterize the biocompatibility and blood - materials interactions PVA/Dx graft in vitro and in vivo settings before proceeding with its functional and structural testing in an animal model. At the same time, we investigated the influence of the association of a cellular system, mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the Wharton jelly of the umbilical cord in the functional/structural performance and biocompatibility of PVA/Dx graft to the surrounding tissues. The copolymer polyvinyl alcohol and dextran were never been tested before in this application. This copolymer was produced in the ratio of 90:10 (PVA/Dx) through a process of physical crosslinking by the method of freeze / thawing. With the aim of enhancing the crosslinking process, grafts were subjected to an annealing process to improve the mechanical characteristics in order to withstand adverse physical environment posed by the pulsatile blood pressure. The animal model chosen for the in vivo experiments was the sheep (Ovis aries). Biocompatibility study was performed in sheep with a maximum duration of 32 weeks. One group of animals (group 1) was implanted subcutaneously with PVA disks with 15.5 mm diameter and a second group (group 2) was implanted subcutaneously with PVA discs covered with a confluent monoculture of human MSCs derived from Wharton's jelly. The third group was implanted with membranes PVA /DX with the same diameter. It was also included a negative control group (sham surgery) of 6 animals as required by the ISO 10993-6 standard. The positive control group (Group 5) was implanted subcutaneously with disks of expanded polytetrafluoroethylene with an area equivalent to the implanted PVA membranes. The membranes were retrieved with the surrounding tissues at various time points up to a maximum period of 32 weeks. The samples were subsequently analyzed for inflammatory reaction following the guidelines of the ISO 10993-6 standard (Annex E). After analyzing the results, PVA/Dx proved to be a biomaterial with potential to be used in vascular reconstruction. Concerning the biocompatibility, the results showed that the PVA, the PVA and dextran covered by human MSCs isolated from Wharton's jelly of the umbilical cord PVA are 21 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP only slightly irritating to the surrounding tissues in accordance with ISO 10993-6 (standard Annex E) . In the study of blood - biomaterial interactions, membranes of PVA/Dx with dimensions equal to mentioned above, were used. As a positive control glass beads or slides were used. For negative control polypropylene membranes were chosen. These samples were tested in vitro with whole blood, platelet-rich plasma and platelet poor plasma obtained from sheep and humans. The determination of the hemolysis index showed that PVA/Dx as a non-hemolytic biomaterial (0.014 %) being safe for application to contact with blood. The thrombogenicity of PVA/Dx was evaluated by quantitation of platelet adhesion/activation through several tests: lactate dehydrogenase activity measurement, flow cytometry and quantification of whole blood clotting time. Additionally, platelet morphology was observed by scanning electron microscopy (SEM) after contact with different surfaces used in the study. The results of these tests showed that platelet activation and adherence were very satisfactory being even lower than those of the positive control. The results of these parameters were then confirmed by analysis of SEM images, where morphologically platelets adsorbed on the membranes of PVA/Dx had a phenotype of low activation. Activation of the coagulation cascade was also evaluated in the context of blood - materials interactions, through the measurement of plasma recalcification profiles and levels of generated thrombin - antithrombin complex confirming the PVA / Dx is a biomaterial that induces a weak activation of the coagulation cascade. The hemocompatibility of biomaterial PVA/ Dx was subsequently evaluated in vivo in two groups of sheep implanted with 5 and 7 cm PVA/Dx vascular prostheses respectively with six animals each. Blood was collected at various time points up to a maximum of 16 weeks, having evaluated several hematologic and coagulation parameters, reinforcing the results obtained in vitro. These results confirmed the capability of the PVA/Dx as a material for biomedical applications contact the blood. In the final phase of functional characterization of PVA/Dx grafts, we proceeded to its implantation in the left common carotid artery through an end-to-end anastomosis. Twenty-four sheep were used in this functional assay. Eighteen animals were allocated to groups using PVA/Dx grafts. A group of six animals in addition to the vascular graft was also given a perivascular MSCs injection at the site of anastomosis. Another group of six animals was treated with anticoagulation protocol. Additionally, a group of sheep was implanted with grafts of PVA/Dx without administration of anticoagulants and MSCs. Finally, in the control group were used ePTFE grafts. Functional assessment was performed using ultrasound on B and Doppler mode at several time points, beginning at 24 hours postsurgery and ending at 24th week. The results of the 22 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP patency rates showed that the control group (84.28 ± 24.66%) had the highest patency rate during the trial period followed by the patency rate of PVA/Dx/MSCs (68.33± 27.39%) group. However, if it was possible to maintain permeable the first vascular PVA/Dx graft for a period of 24 weeks with the luminal surface coated with a functional endothelium. 23 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RÉSUMÉ Avec ce travail il a été prétendu que nous etudiams pré-cliniquement l’utilization d’une prothèse vasculaire de polímere hidrofilique polivinil álcool hidrogel (PVA) et de polissacaride de dextrane (fait à partir d’un modele animal dontl’anatomie et la phisiologie est près de l’homme). La prothèse vasculaire à été produit avec un bas diamètre (diamètre interne égual a 5mm). Comme objectif d’assembler avec une artère de diamètre equivalente pour pouvoir proceder a la revascularization que nous recontrans dans la partie clinique.Historiquement les prothèses sinthétiques de bas diamètre ant toujours présenté les peus résultats fonctionnels de que les autogreffes de diamètre equivalente pour diverses raisons d’ordre biologique, mecanique et d’ordre structurel.Il s’est préntedu étudié les caractéristiques de la biocompatibilité e les intéractions sangmatériel in vitro et in vivo de la prothèse de PVA/Dx avant da proceder à son test functionnel e structural do modele animal.Parallélement nous avons examine l’influence de l’association d’un sistème celulaire, les cèlules, souches mésenchymateuses (MSCs) obtenues à partir d’une gelée de Wharton du cordon embilical afin de représenter fonctionnelement, structurelement et dans la biocompatibité en relation aux tissus enveloppés.Le co-polimère polivinil álcool hidrogel e dextrane jamais avant reste dans aplication a été produit de 90:10 atrávers un procès de réticulations physiques par la méthode de congélation/ décongèlation.Visant à améliorer la rèticulation, les prothèses ant été soumises à un traitement de annealing pous améliorer les caractéristiques mécaniques avec le objectif de résister à l’environnement physique dèfavorable posé par la pression artérielle pulsatile. Le modele animal choisit pour l’expérience in vivo a été le mouton (Ovis aries). Il à été realisé une étude de biocompatibilité chez les ovins d’une durée maximale de 32 semaines. Un groupe de animaux (groupe 1) a été implante en souscutané, avec les disques de PVA/DX avec le même diâmètre. Il a ègalement été inclus en tant que groupe contrôle nègatif de 6 animaux comme requis par la norme ISSO 10993-6. Le groupe contrôle positif (groupe 5) a eu une implantation sous-cutanée avec des échantillons de disques polytétrafluoroéthylène expansé (Maxiflorm ePTFE vasculaire prothèses, Vascutek Ltd, Ecósse) avec une superfície equivalente aux membranes implantées de PVA. Les membranes ont été recueivellies avec le tissu enveloppé à divers moments sur une période maximale de 32 semaines. Les échantillons ont ensuite été analysés pour la réaction inflammatoire en suivant les lignes directrices de la norme ISO 10993-6 (anexe E).Après l’analyse des résultats PVA/Dx il a été demontré être un biomatériau potentiel pour être utilisé dans la reconstruction vasculaire. 24 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP En relation à la biocompatibilité, les résultats démontret que la PVA, le PVA avec dextrame e le PVA couvert par des MSCs humaines sont légèrement irritantes pour les tissus environnants selon l’accord ISO 10993-6 (anexe E). En ce qui concerne l’étude d’intéraction sang-biomatériel il a été utilisé des membranes de PVA/Dx dans les dimensions mentionnées précédement, ont été utilisées comme controle nègatif des membranes de polypropylène. Ces échantillons ant été testes in vitro avec du sang total, plasma riche en plaquetes e avec du plasma pauvre en plaquetes provenant de moutons et humains. La détermination de l’hémolyse démantre que la PVA/Dx est un biomatériau non hémolytique (0,014%) évant sècuritaire pour les aplications venant en contact avec le sang. La thrombogénieité du PVA/Dx a été evaluée par la quantification de l’adhésion/activation au moyen d’essais: mesure de lactate déshydrogenase; cytométrie en flux et la quantification du temps de coagulation du sang total. En outre la morphologie des plaquetes a été observée par microscopie électronique (SEM) après contact avec diferentes superfícies utilisées dans l’étude. Les rèsultats de ces tests ont montré que l’activation des plaquetes et l’adhérence sant des résultats três satisfaisants étant même plus bas que le controle positif.Les resultats de ces paramètres ont ensuite été confirmes par l’analyse des images SEM oú morphologiquement les plaquetes absorbées dans les membranes de PVA/Dx présentaient un phénotype de faible activation.L’activation de la cascade de la coagulation a été evaluée dans le cadre des interactions du sang-matériel, avec le recours à la mesure de profils de recalcification du plasma et des niveaux de formation du complexe trombine-antithrombine.Nous confirmons le PVA/Dx comme biomaterial qui induit une faible cascade d’activation et de coagulation. Par la suite nous avons èvalué l’hémocompatibilité de biomatériau PVA/Dx in vivo en deux groupes de moutons avec implantations de prothèse vascularies de PVA/Dx de 5 a 7cm avec respectivament six animaux chacun.Le sang a été recueilli à divers points temporels, jusqu’a un maximum de 16 semaines en estimant différents paramètres hèmatologiques et de la coagulation, ce qui confirme les résultats obtenus in vitro et qui renforçe lá capacite du PVA/Dx en tant que matériau pour des applications biomédicales qui sant en contact avec le sang.Dans la phase finale de la caractérisation fonctionnelle du PVA/Dx nous avons procédé à son implantation dans l’artère carótide commune gauche par une anastomose haut de gamme e vingt quatre moutons adultes ont été utilisés pour cet essai fonctionnel. Dix huit animaux ont été repartis aux groupes qui ont utilize des prothèses de PVA/Dx.Au delá de la greffe vasculaire un groupe de six animaux ont reçu ègalement un MSC périvasculaire à l’endroit des anastomoses. Un outre groupe de six animaux a 25 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP été traite avec un protocole d’anticoagulation.En outre, un groupe de moutons a été implante avec des greffes de PVA/Dx sans administration d’anticoagulants et de MSCs. Enfin, dans le groupe contôle, nous avons utilisé des greffes en ePTFE. L’évaluation fonctionnele a été effectuée en utilisant l’échographie Doppler en mode B en divers points temporels, en commençant à 24 heures apès l’intervention chirurgicale jusqu’à la semaine 24. Les résultats des taux de perméabilité au cours de la période d’essai tout de suite suivi par le groupe PDA/Dx/MCSc (68,33±27,39%). Cependant nous avans réussi pour la première fois de maintenir perméable une prothèse vasculaire PVA/Dx durant une période máximum de 24 semaines avec la superfície luminale revêtue d’un endothéluim fonctionnel. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 32 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP capilares possuem uma só chamada de células musculares. Os miócitos não formam uma camada contínua mas apenas grupos de miócitos dispostos em anel formando um esfíncter pré-capilar que regula o fluxo e o acesso do sangue à rede capilar(Junqueira & Carneiro, 2008). A adventícia está reduzida a uma fina rede de fibras de colagénio acompanhadas de fibroblastos. 1.3. Sistema venoso. O sistema venoso apresenta uma capacidade de acomodação do sangue quatro vezes superior ao do sistema arterial. O sangue circula a uma velocidade mais baixa e com uma pressão igualmente mais baixa; o que determina as particularidades da estrutura e conformação das veias. Em geral, o sistema venoso apresenta uma topografia semelhante ao sistema arterial(Dyce et al., 2009). A maior parte das veias têm uma parede fina, compressível e de aspecto fibroso. As veias quando vazias são flácidas e aplanadas. No entanto em estado de replecção são cilíndricas e moldam-se sobre os órgãos vizinhos. Externamente podem observa-se constrições anulares determinadas internamente pela presença internamente das válvulas (Dyce et al., 2009). As válvulas são pregas da túnica interna suportadas por um fino prolongamento fibroso da túnica média(Junqueira & Carneiro, 2008). A face parietal da válvula e a parede adjacente da veia delimita o seio da válvula. De acordo com a localização, reconhecemse dois tipos de válvulas, as ostiais situadas na confluência de uma veia com o seu afluente, e as válvulas parietais, as mais numerosas situadas ao longo do lúmen da veia (Junqueira & Carneiro, 2008; Dyce et al., 2009). Estas últimas válvulas são geminadas ou seja colocadas em pares enquanto as primeiras existem isoladamente ou pelo contrário agrupadas em conjuntos de três. Nem todas as veias têm válvulas: as veias pulmonares em todo o seu trajecto, as pequenas veias periféricas e as veias cavas caudal e cranial são totalmente desprovidas de válvulas (Dyce et al., 2009). Na maior parte das espécies, as válvulas são rudimentares ou ausentes na veia porta e veias ázigos. Nas veias dos membros onde o sangue circula contra a força da gravidade; as válvulas são pelo contrário numerosas e completas (Dyce et al., 2009). REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 33 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP As veias de maior calibre apresentam um trajecto rectilíneo enquanto aquelas de calibre médio tem um trajecto mais flexuoso. Existe um tipo específico de veias, os seios venosos da dura-máter, irregulares e inextensíveis e desprovidos de válvulas, são alojados na espessura desta meninge que substitui a adventícia (Dyce et al., 2009). As veias de grande calibre são divididas em dois sistemas, um profundo e outro superficial. As veias profundas são as mais numerosas e são satélites das artérias do mesmo calibre partilhando as suas relações topográficas. Apenas a veia cava caudal não tem um equivalente arterial. Nos membros, as artérias principais são muitas vezes acompanhadas por duas ou três veias anastomosadas entre si (Dyce et al., 2009). Em geral, este conjunto está alojado dentro de uma bainha conjuntiva comum. Em diversas regiões as veias formam uma rede de anastomoses densa em torno das artérias como uma verdadeira bainha. Ao nível dos órgãos estas redes permitem trocas em contracorrente. Entre estas trocas destacam-se as permutas térmicas entre o sangue venoso proveniente de zonas de temperatura mais baixas em relação á temperatura do sangue arterial (seios venosos da base do crânio e rede venosa do cordão espermático), trocas iónicas (veia renal direita), trocas hormonais (pedículo ovárico). As pulsações arteriais têm ainda uma acção mecânica sobre a circulação venosa (Dyce et al., 2009; Budras, 2007). As veias superficiais ou subcutâneas não têm equivalente arterial mas as de maior calibre são satélites dos ramos nervosos dos membros(Dyce et al., 2009). Entre o sistema venoso superficial e o sistema venoso profundo existem anastomoses que permitem uma derivação de sangue em caso de obstrução momentânea em situações normais ou em caso de obstrução durável por condições patológicas. A parede das veias tal como as artérias comporta três túnicas(Junqueira & Carneiro, 2008). A túnica interna ou íntima também designada de endoveia é um endotélio continuado que repousa sobre uma lâmina basal formada por fibras de colagénio dispostas longitudinalmente. Nas veias, a camada sub-endotelial comporta numerosas REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 34 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP fibras de colagénio e fibras elásticas que são mais frequentes em veias de maior calibre(Junqueira & Carneiro, 2008). A túnica média ou média surge nas veias de armazenamento ou de colecção sob a forma de uma camada incompleta de fibras musculares lisas transversais. Esta camada não está representada verdadeiramente nas veias propriamente ditas. Na túnica média, encontra-se uma ou mais camadas de fibras musculares lisas revestida externamente por fibras de colagénio e elásticas (Junqueira & Carneiro, 2008). A quantidade de fibras musculares varia com as necessidades funcionais locais da veia. As veias da extremidade distal dos membros apresentam 5 a 6 camadas de fibras musculares dispostas circularmente que permitem manter o fluxo de sangue contra a gravidade (Dyce et al., 2009). Estas veias são classificadas como veias musculares. Uma musculatura circular similar mas menos desenvolvida existe nas veias da pele e intestino grosso. Nas veias do ovário, do útero e dos corpos cavernosos do pénis as fibras musculares dispõem-se longitudinalmente (Budras, 2007). As veias de maior calibre e em particular as veias cavas são do tipo fibroso. Neste tipo de veias, a túnica média é muito fina. As fibras musculares lisas são raras ou ausentes e as fibras de colagénio predominam fortemente. A túnica média está ausente nas veias: do tecido ósseo, da retina, das meninges, da placenta e nos seios da dura-máter (Dyce et al., 2009) A túnica externa ou adventícia nas pequenas veias é uma bainha conjuntiva rica em fibras de colagénio e elastina (Junqueira & Carneiro, 2008). A separação entre fibras de colagénio e elásticas torna-se mais nítida, nas veias de maior calibre (Junqueira & Carneiro, 2008). Nas veias de calibre médio, as fibras elásticas tem uma orientação longitudinal dominante por outro lado as fibras de colagénio formam feixes com orientação oblíqua para unir a túnica média á bainha conjuntiva periférica. Nas grandes veias, a túnica externa é mais espessa que a túnica média, estando preenchida por fibras musculares lisas organizadas em feixes cada vez mais fortes com disposição espiraloide (Junqueira & Carneiro, 2008). Estes feixes são particularmente desenvolvidos na veia cava caudal, na veia porta, nas veias renais e hepáticas (Junqueira & Carneiro, 2008). Alguns feixes de fibras miocárdicas prolongam-se à superfície da parte terminal das veias cava caudal e das veias cardíacas (Junqueira & Carneiro, 2008). REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 35 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 1.3.1. Vénulas. O sistema venoso tem origem pelas incontáveis vénulas pós-capilares que como o nome indica tem origem directamente na rede capilar. Estes vasos têm cerca de 20 a 25 µm de diâmetro e absorvem parte do plasma intersticial e confluem para as vénulas de armazenamento (venulae colligentes) que fazem a transição para as veias propriamente ditas (Junqueira & Carneiro, 2008). A parede das vénulas é formada apenas pela íntima suportada por numerosos pericitos sendo particularmente permeável a linfócitos. 1.4. Capilares. A parede dos capilares apresenta um vestígio da túnica íntima, nomeadamente um endotélio, uma lâmina basal e uma camada descontínua de pericitos (Budras, 2007). Podem ter três classificações segundo o seu endotélio e funções específicas: capilares com células endoteliais não fenestradas, com células endoteliais fenestradas e com aberturas intracelulares(Dyce et al., 2009; Budras, 2007). 1.5. Anastomoses. Uma anastomose coloca em comunicação os vasos vizinhos e permite trocas e equilíbrios de pressão. No que concerne as artérias existem dois tipos de anastomoses bem diferentes para a estrutura e função: anastomoses inter-arteriais e anastomoses arterio-venosas. 1.5.1. Anastomoses arterio-venosas. A anastomose arterio-venosa é um órgão regulador da circulação local em função da actividade desse órgão. Estas anastomoses observam-se em vasos de pequeno calibre. As anastomoses arterio-venosas propriamente ditas encontram-se na pele, na mucosa nasal, na língua, nas vísceras digestivas, nos pulmões, nos órgãos erécteis do aparelho genital, na glândula tiróide e provavelmente em outros órgãos(Junqueira & Carneiro, 2008). Esta estrutura apresenta uma forma de novelo, alimentada por uma curta e fina arteríola aferente que tem origem em ângulo recto a partir de uma arteríola vulgar ou REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 36 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP outro vaso pré-capilar. A arteríola aferente dilata-se e ramifica-se em duas ou três ansas e apresentam uma parede espessa por desenvolvimento de uma manga de células musculares epitelioides dispostas em várias camadas às quais estão associados uma rede de fibrilhas nervosas (Junqueira & Carneiro, 2008). À saída deste novelo de ansas, os vasos diminuem de calibre e dão origem a uma vénula que entrará na rede de veias(Junqueira & Carneiro, 2008). A contracção da parede produz oclusão das ansas e o seu relaxamento permite em razão da diferença da pressão, a passagem de sangue da artéria para a veia. Esta derivação reduz o afluxo de sangue para órgão em repouso. Assim que entram em actividade ocorre oclusão provocando um rápido aumento de sangue arterial. 1.5.2. Anastomoses inter-arteriais. Relativamente pouco numerosas ao nível das artérias de médio calibre tornam-se mais abundantes em artérias periféricas de pequeno calibre, entre as quais se estabelecem verdadeiras redes. As anastomoses de maiores diâmetros são visíveis a olho nu e apresentam-se sob diversas formas. Consideram-se anastomoses de convergência quando duas artérias se unem em ângulo agudo para formar um novo vaso em geral de maior diâmetro. Na face ventral do tronco cerebral, a artéria basilar é assim formada pela convergência de duas artérias vertebrais (Junqueira & Carneiro, 2008). Nas anastomoses em arco, dois vasos de igual calibre unem-se para formar um arco arterial de onde procedem numerosos vasos mais pequenos(Junqueira & Carneiro, 2008). Ao longo do tubo digestivo existem inúmeras arcadas vasculares assim como nas extremidades dos membros. As anastomoses transversas constituem-se pela comunicação entre dois vasos dispostos paralelamente em relação ao outro, encontram-se nas artérias metacarpianas, metatarsianas ou digitais de numerosas espécies(Dyce et al., 2009). As anastomoses mistas combinam os vários tipos de anastomoses precedentes. São múltiplas e levam á formação de redes vasculares destinadas à assegurar o suprimento vascular em regiões de grande mobilidade como são as articulações. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 37 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Outras estruturas importantes com funções semelhantes às anastomoses são as artérias colaterais, ramos que após um certo trajecto, juntam-se de novo ao tronco arterial que lhes deu origem (Budras, 2007). Uma rede mirabilis é um plexo de aspecto rendilhado formado pelas divisões de uma artéria, do qual o sangue é drenado sem interposição de capilares por uma ou várias artérias. Este tipo de plexo não existe em todas as espécies e parece ter funções definidas como: reserva sanguínea, regulação circulatória, trocas térmicas e protecção de órgãos frágeis. Formações venosas importantes estão por vezes associadas a esta estrutura. 2. Fisiologia dos vasos sanguíneos. A parte arterial da circulação fornece sangue de forma continuada aos tecidos em condições de elevada pressão hidroestática. As artérias são estruturas pouco complacentes devido à sua parede espessa (i.e não distendem facilmente com aumentos na pressão sanguínea) e por essa razão a pressão arterial mantém-se elevada com o coração ao ejectar sangue para as artérias. A regulação da pressão arterial é um processo complexo que envolve respostas autonómicas, reflexos neurais, hormonas e substâncias parácrinas. As arteríolas constituem a parte terminal da rede arterial de vasos. Devido à sua localização constituem uma válvula unidireccional que regula o fluxo sanguíneo entre as artérias e a rede capilar. Os nervos simpáticos (indutores de vasoconstricção) que enervam o músculo liso da parede das arteríolas constituem um mecanismo de regulação do fluxo sanguíneo. No entanto, o grau de vasodilatação ou vasoconstrição é regulado por diversas substâncias vasoactivas. Estes agentes podem ser produzidos localmente (acção parácrina) ou podem chegar pela circulação sistémica. Entre as substâncias com acção parácrina encontra-se o dióxido de carbono, o àcido láctico e a adenosina que são tipicamente vasodilatadoras. A produção destas substâncias aumenta quando o metabolismo celular local de determinada área se eleva emparelhando o aumento da taxa metabólica com a elevação do fluxo vascular. O processo através do qual os mecanismos locais regulam o fluxo sanguíneo localmente designa-se de auto-regulação. A pressão arterial resulta do produto do output cardíaco pela resistência vascular total. Para compreendermos melhor esta função, a pressão depende da quantidade de sangue REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 38 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP que o coração ejecta para o sistema vascular e da taxa a que o sangue consegue fluir através deste sistema. A resistência das arteríolas é o factor que mais contribui para a resistência vascular total, regulando o volume de sangue que sai das artérias. O trabalho cardíaco e o grau de constrição arteriolar são os dois principais determinantes da pressão arterial média (PAM). Alterações na PAM, ocorrem por variação de um destes factores ou da combinação dos dois. Qualquer substância (hormona ou agente parácrino) ou reflexo neural que tenha actividade sobre a função cardíaca ou a contracção do músculo liso das arteríolas tem o potencial de alterar a PAM. Em situações normais o volume sanguíneo e a pressão arterial estão directamente relacionadas. Alterações no volume cardíaco produzem variações no output cardíaco e consequentemente na PAM. 2.1.Controlo humoral da circulação. O controlo humoral da circulação refere-se ao controlo da circulação através de substâncias secretadas ou absorvidas pelo fluídos orgânicos como hormonas e iões. Algumas destes compostos são sintetizadas por glândulas e transportados através do sangue por todo o organismo (acção endócrina). Outros são sintetizados localmente e causam efeitos vasculares locais (acção parácrina e autócrina). Os factores com acção na função circulatória dividem-se em dois grupos; os que causam vasodilatação e os que causam vasoconstrição. 2.1.1. Vasodilatadores. 2.1.1.1. Péptidos com acção na regulação vascular. Os péptidos natriuréticos (PN) são uma família de hormonas derivadas do coração e vasos que desempenham um papel relevante na homeostasia cardiovascular através da regulação do volume e pressão sanguínea. A actividade fisiológica destes péptidos vai para além da clássica acção endócrina regulando a pressão sanguínea. Estes péptidos exercem também um efeito autócrino e parácrino na circulação em situações patológicas e normais, regulando a secreção de renina, a libertação de progesterona, a secreção de endotelina e de vasopressina(Barrett, Barman, Boitano, & Brooks, 2012). Os mamíferos produzem 4 tipos de péptidos natriuréticos: o péptido natriurético atrial (PNA), o péptido natriurético do cérebro (PNC), o péptido natriurético do tipo C e o péptido natriurético do REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 39 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP tipo dendoaspis. Os PN exercem os seus efeitos fisiológicos pela ocupação de três receptores membranários: NPR-A, NPR-B e NPR-C. Os dois primeiros sub-tipos, são receptores associados à enzima guanilato ciclase que converte guanosina trifostato em guanosina monofosfato cíclica (cGMP), considerando-se esta molécula a efectora intracelular das acções dos PN. Adicionalmente os péptidos natriuréticos tem acções em células não-vasculares envolvendo acções nos túbulos renais e células mesangiais, inibição de libertação da renina, vasopressina e aldosterona(Barrett et al., 2012). Um número importante de acções sistémicas atribuídas aos PN leva a uma redução da resistência vascular periférica. Estes efeitos ocorrem por uma acção directa na parede dos vasos como o efeito vasodilatador dos PN nas arteríolas renais aferentes, que leva a um aumento da filtração glomerular com subsequente diurese. Os efeitos vasculares destes péptidos podem também ser mediados pela regulação do tónus simpático e libertação de catecolaminas pelos neurónios simpáticos periféricos(Barrett et al., 2012). As acções vasodilatadoras directas dos PN são medidas pela acção da enzima cinase associada a cGMP. Esta enzima leva à abertura de canais iónicos nas células musculares lisas induzindo hiperpolarização e relaxamento vascular. O cGMP interfere na homeastasia do cálcio reduzindo ca2+ intracelular através da diminuição da libertação das reservas intracelulares de cálcio e através da remoção do cálcio pela sequestração nas reservas intracelulares e pelo aumento da extrusão através membrana citoplasmática(Barrett et al., 2012). Outro mecanismo para a vasodilatação induzida pelos PN, baseia-se na activação das fosfodiesterases. As referidas enzimas diminuem as concentrações intracelulares de adenosina monofosfato cíclica (cAMP) e consequentemente inibem as acções medidas por este mensageiro tais como o aumento do cálcio intracelular e respectiva contracção das células musculares lisas (Barrett et al. 2012). Ao nível do coração para além dos efeitos inotrópicos cardíacos, todos os PN induzem efeitos vasorelaxantes na circulação coronária(Supaporn et al., 1996). Os estudos focaram-se na administração de PNA em modelos caninos e felinos onde exerceu uma acção vasodilatora coronária dependente da dose (Chu, et al., 1989) (Yanagisawa, et al., 1987; Yanagisawa & Lefer, 1988). REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 40 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Os PN, através do péptido natriurético do tipo C inibem a proliferação e o crescimento de células musculares através da ocupação do receptor NPR-B (Porter, et al., 1992). Os efeitos antiproliferativos deste péptido foram demonstrados in vivo, inibindo o espessamento da túnica íntima induzida pela proliferação de músculo liso vascular característica das lesões vasculares (Brown, Chen, & Hong, 1997). As cininas incluem dois péptidos a bradicinina e a lisilbradicinina. A lisilbradicinina podese converter em bradicinina por uma aminopeptidase. As cininas resultam da activação de duas proteínas percursoras o cininogénio de alto peso molecular (CAM) e o cininogénio de baixo peso molecular (CBM) pela acção de um grupo de protéases designado de calicreínas(Sharma, 2013). O calicreína tecidular existe na membrana apical das células em diversos tecidos (ex: pâncreas, rim, glândulas salivares, intestino e próstata) e a calicreína plasmática que circula de forma inactiva no sangue(Tang, Leung, & Lai, 2011). A calicreína tecidular actua sobre o CBM e CAM para forma lisilbradicinina enquanto a calicreína plasmática quando activada actua sobre o CAM formando bradicinina. Por sua vez as calicreínas resultado da activação de um percursor, a precalicreína pela acção do factor XII da via intrínseca de coagulação que inicia uma ansa activadora de feedback positivo, já que a calicreína também activa o factor XII e o CMA também apresenta uma acção activadora sobre este factor da coagulação. A acção das cininas é semelhante à da histamina sendo essencialmente hormonas tecidulares embora também sejam detectadas em pequenas concentrações no plasma. Estes compostos embora causem contracção muscular lisa em diversas vísceras contrariamente induzem o relaxamento músculo liso vascular através da síntese do óxido nitroso (NO) baixando a pressão arterial. Adicionalmente aumentam a permeabilidade capilar, induzem a quimiotaxia de leucócitos e causam dor. As acções vasculares das cininas são mediadas pela acção no receptor B2, enquanto que as acções de estímulo da dor passam pela mediação do receptor B1. 2.1.1.2. Derivados do ácido araquidónico. As epoxigenases do citocromo P-450 (CYP) metabolizam o ácido araquidónico (AA) em ácidos epoxieicosatrienoicos (AEC). Na última década, os AEC foram considerados por vários laboratórios como sendo moléculas que se enquadram num grupo mais lato, os factores hiperpolarizantes derivados do endotélio (FHDE) com propriedades de relaxamento do músculo liso vascular em várias espécies, incluindo o homem. Contudo, na aorta e artérias mesentéricas do coelho e em diversas artérias de outras espécies tais REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 41 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP como o cão, o rato e porco, a produção de AEC está ausente em condições fisiológicas normais. Ainda assim, o AA produz vasodilatação sugerindo que existem outros metabólitos do AA para além dos AEC possam actuar como FHDE. Estes metabólitos foram identificados como produtos da via metabólica da lipoxigenase. A hidrólise do grupo epóxido dos AEC por epoxihidrolases leva a formação de ácidos dihidroxieicosatrienoicos (DAEC)(Larsen et al., 2006). Os AEC são metabolicamente mais activos que os seus metabolitos e funcionam não só como vasodilatadores e mas também como agentes de protecção vascular. Estes metabólitos, inibem a adesão plaquetária(Krötz et al., 2004), a proliferação de células musculares lisas(Sun et al., 2002) e reduzem a inflamação da parede do vaso(Node et al., 1999). O seu mecanismo de acção baseia-se na abertura de canais de potássio activados por cálcio (Larsen et al., 2006). 2.1.1.3. Outros autacoides com acção vascular. O endotélio desempenha um papel principal na homeostasia vascular através da libertação de autacoides vasoactivos como o óxido nítrico (NO) e a prostaciclina (PGI2)(Hecker, 2000). A síntese basal destes autacoides é aumentada pela presença de receptores dependente de agonistas como a acetilcolina, a bradicina e a histamina bem como por estímulos independentes de receptores como a hipoxia,o aumento da tensão tangencial ou a deformação celular. A tensão tangencial induz do aumento do NO que é independente do aumento do cálcio intracelular (Hecker, 2000). O aumento da concentração intracelular de Ca2+ é um denominador comum da produção endotelial de autacoides porque a fosfolipase A2 (enzima implicada na síntese de PGI2) e a NO sintetase são enzimas dependentes de Ca2+. O endotélio pode iniciar a vasodilatação pela actividade da NO sintetase sobre o aminoácido L- arginina, produzindo NO. O relaxamento muscular dá-se pelo aumento intra-celular de potássio. Ao contrário dos factores hiperpolarizantes derivados do ácido araquidónico, nos autacoides os efeitos hiperpolarizantes na célula são mediados por canais de potássio (CK) activados por ATP, CK activados por cálcio e igualmente por CK de rectificação tardia (Hecker, 2000). O anandamina foi descrito como sendo um factor derivado do metabolismo do ácido araquidónico (Chataigneau et al., 1998). Estudos subsequentes demonstraram que este metabólito é um fraco factor hiperpolarizante e os seus efeitos nos canais de potássio das células musculares lisas podem diferencia-los claramente de outros FHDE (Chataigneau REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 48 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP uma actividade tónica. Na maioria dos tecidos, a vasodilatação é produzida pela diminuição da taxa de despolarização nas fibras vasoconstrictoras. Contudo, no músculoesquelético a vasodilatação também pode ser induzida pela activação do sistema vasodilatador simpático(Barrett et al., 2012). Existem também polipéptidos nas terminações nervosas encontradas nas paredes dos vasos com propriedades vasodilatadoras ou vasoconstrictoras. As fibras colinérgicas contem vasoactive intestinal polipeptide (VIP) que causa vasodilatação(Barrett et al., 2012). Os nervos simpáticos noradrenérgicos posganglionares também contêm o neuropéptido Y que apresenta uma acção vasoconstrictora(Barrett et al., 2012). Outras substâncias vasodilatadoras como a substância P ou calcitonin gene-related peptide (CGRPa)(Brain, et al., 1993) são encontradas nas fibras sensitivas de nervos sensoriais que se encontram próximos de vasos sanguíneos (Brain et al., 1993). 2.1.3.1. Controlo vasomotor. Os nervos simpáticos através dos respectivos neurotransmissores induzem vasoconstrição das arteríolas e veias, aumentam o volume de ejecção cardíaco e a frequência cardíaca. Os impulsos nervosos destas fibras ocorrem de uma forma tónica e a pressão sanguínea é ajustada por variações na frequência da taxa de despolarização. A actividade espinhal reflexa também afecta a pressão sanguínea mas o controlo principal da pressão sanguínea é exercido por um grupo de neurónios localizado na medulla oblongata, a área ou centro vasomotor(Barrett et al., 2012). Os neurónios que medeiam o impulso simpático para os vasos sanguíneos e coração projectam-se directamente dos neurónios simpáticos pré-ganglionares na coluna intermediolateral da substância cinzenta da espinal medula. De cada lado, os corpos celulares destes neurónios localizam-se junto a superfície meníngea da espinal medula rostral ventrolateral. Os axónios localizam-se dorsalmente e medialmente e descendo na coluna lateral da espinal medula até a coluna intermediolateral. Estes neurónios secretam como neurotransmissor excitatório o glutamato. Quando a frequência de despolarização vasoconstrictora aumenta, dá-se um aumento na vasoconstrição arteriolar que por sua vez aumenta a pressão sanguínea. Paralelamente ocorre venoconstrição e uma diminuição do armazenamento do sangue na circulação venosa. A frequência cardíaca e o volume de ejecção também activam por aumento de actividade dos mesmos nervos simpáticos no coração. A este aumento de actividade do REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 49 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP sistema simpático está associado uma diminuição da actividade tónica de despolarização das fibras vagais no coração. Por outro lado, uma diminuição da actividade do centro vasomotor causa vasodilatação, uma queda na pressão sanguínea e um aumento de armazenamento de sangue na circulação venosa. Concomitantemente é acompanhado por uma diminuição na frequência cardíaca que se deve à estimulação da inervação vagal do coração. 2.1.3.2. Aferentes do centro vasomotor. As vias aferentes que convergem para o centro vasomotor incluem fibras dos baroreceptores arteriais e venosos, fibras dos quimiorreceptores carotídeos e aórticos e de outros locais do SNC. Adicionalmente, existem estímulos que actuam directamente no centro vasomotor como a hipoxia e o CO2. Entre o hipotálamo e o centro vasomotor existem conecções que são recíprocas, com aferentes do tronco cerebral a fechar o circuito. A dilatação dos pulmões aquando da inspiração causa vasodilatação e uma diminuição da pressão arterial através de vias aferentes vagais do pulmão que inibem o tónus vasomotor. A dor é outro estímulo que causa aumento na pressão arterial por impulsos aferentes da formação reticular que convergem para o centro vasomotor. O reflexo somatosimpatético reflecte a resposta pressora de estímulos provenientes dos nervos aferentes somáticos cutâneos através de estímulos dolorosos. Impulsos aferentes chegam a medulla rostral ventro-lateral causando um aumento da pressão arterial. A dor visceral por sua vez produz uma resposta depressora da pressão arterial devido à estimulação dos nervos aferentes parasimpáticos vagais e pélvicos. Por sua vez o intestino grosso apresenta uma abundante inervação simpática e pode produzir uma resposta pressora quando estimulado. 2.1.3.3. Baroreceptores. Os baroreceptores são receptores de tensão que existem nas paredes dos vasos sanguíneos e coração(Barrett et al., 2012). Os receptores do arco aórtico e seio carotídeo monitorizam a pressão arterial e a frequência cardíaca. Existem também receptores localizados nos átrios esquerdo e direito, no início da veia cava caudal e cranial e nas veias pulmonares assim como na circulação pulmonar. Estes últimos receptores que existem na chamada circulação de baixa pressão são designados em conjunto como receptores de cardiopulmonares. Os baroreceptores são estimulados pela distensão das estruturas nos quais se encontram e assim despolarizam a uma taxa mais elevada REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 50 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP quando a pressão nestas estruturas aumentam. As fibras aferentes provenientes dos baroreceptores passam através do nervo glossofaríngeo e vago para o centro vasomotor. Quando a frequência despolarização dos baroreceptores aumenta dá-se uma inibição da despolarização tónica dos nervos vasoconstricores e uma excitação da inervação vagal do coração, produzindo vasodilatação, venodilatação, queda na pressão sanguínea, bradicardia e uma diminuição no volume de ejecção cardíaco. 2.1.3.4. Reflexo baroreceptores do seio carotídeo e arco aórtico. O seio carotídeo é uma pequena dilatação da artéria carótida interna imediatamente cranial à bifurcação da artéria carótida comum. O baroreceptor localiza-se nesta dilatação e encontra-se também na parede do arco aórtico. Estes baroreceptores situam-se na adventícia e as fibras nervosas aferentes do seio carotídeo formam um ramo distinto do nervo glosso-faríngeo, o nervo do seio carotídeo. Enquanto no baroreceptor situado no arco aórtico, as fibras com origem neste baroreceptor formam um nervo distinto do nervo vago apenas no coelho. Os baroreceptores respondem a estímulos de pressão pulsátil e pressão média. Uma descida na pressão pulsátil registada no seio carotídeo sem alterações na pressão arterial média diminui a taxa de despolarização do baroreceptor e provoca um aumento na pressão sanguínea e taquicardia (Barrett, et al., 2012). Estes receptores também respondem a flutuações na pressão média, despolarizando com maior frequência nas subidas e permanecendo inactivo nas quedas de pressão média. Os receptores aórticos não foram estudados com tanto detalhe mas pensa-se que as respostas aos estímulos funcionam de forma similar aos baroreceptores do seio carotídeo formando com este último uma unidade funcional. Pela organização funcional dos baroreceptores na porção arterial da circulação, podemos afirmar que este conjunto de receptores constituem um mecanismo reflexo de feedback que tem como objectivo estabilizar a pressão arterial e a frequência cardíaca. Assim sendo, uma queda na pressão arterial sistémica diminui a taxa de despolarização destes dois receptores conduzindo a um aumento compensatório na frequência cardíaca e volume de ejecção. A um aumento na pressão produz-se dilatação das arteríolas e diminui-se o volume de ejecção até que a pressão arterial retorne a um nível previamente normal. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 51 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 2.1.3.5.Reflexo dos baroreceptores cardiopulmonares. Os receptores localizados nos átrios, ventrículos e vasos pulmonares. Estes receptores protegem contra alterações rápidas no volume intravascular, variando a sua frequência de despolarização exercendo uma acção inibidora sobre o centro vasomotor e adicionalmente também controlam a frequência cardíaca. Os receptores atriais são de dois tipos: tipo A, que despolarizam durante a sístole e tipo B, que despolarizam no final da diástole, no momento do pico de enchimento atrial(Barrett et al., 2012). A frequência de despolarização dos baroreceptores de tipo B aumenta quando aumenta o retorno venoso e diminui pela diminuição do retorno venoso, o que indica que estes receptores respondem principalmente á distensão das paredes atriais. O reflexo que se inicia pela estimulação destes receptores inclui vasodilatação e uma diminuição na pressão sanguínea. Contudo neste reflexo, a frequência aumenta em lugar de diminuir. Os baroreceptores localizados no ventrículo esquerdo, são estimulados quando são distendidos. Nesta situação ocorre uma queda na pressão arterial e na frequência cardíaca. Para ocorrer esta resposta é necessário que ocorra uma distensão considerável do ventrículo e o seu significado fisiológico é incerto. Contudo, os baroreceptores do ventrículo esquerdo podem desempenhar uma função na manutenção do tónus vagal que mantém o coração em baixas frequências no estado de repouso. O reflexo de Bainbridge, descrito pelo fisiologista inglês com o mesmo nome em 1915, referia um aumento da frequência cardíaca em resposta a uma infusão intravascular rápida de fluídos em animais anestesiados. Este reflexo seria mediado pelos receptores de tensão localizados nos átrios. O ramo aferente deste reflexo pertenceria ao vago enquanto o ramo eferente pertenceria aos nervos simpáticos que terminam no nodo sinoatrial. A frequência cardíaca seria influenciada por duas acções opostas; o reflexo baroreceptor arterial e o reflexo de Bainbridge. O factor que determina se a frequência cardíaca sobe ou desce em resposta a um aumento no volume intravascular será provavelmente a frequência cardíaca inicial. Se inicialmente está elevada, tende a descer por acção do reflexo baroreceptor arterial; se pelo contrário de a frequência cardíaca inicial é baixa aumenta por acção do reflexo de Bainbridge. Os baroreceptores pulmonares apesar de mais relacionados com o controlo da respiração quando estimulados também inibem o centro vasomotor quando estimulados (Barrett et al., 2012). Através da dilatação dos pulmões aquando da inspiração, ocorre vasodilatação e uma diminuição na pressão cardíaca. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 52 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 2.1.3.6. Interacção dos baroreceptores com o sistema endócrino na regulação do volume extracelular. A diminuição do volume do fluido extracelular conduz a uma diminuição da pressão venosa central com consequente diminuição da frequência de despolarização dos receptores de tensão atriais que leva a uma secreção aumentada de vasopressina. Nesta situação a actividade simpática está aumentada o que leva a um aumento na secreção da renina. Esta elevação da renina conduz a um aumento da secreção da aldosterona que por sua aumenta a reabsorção renal de sódio com retenção de fluídos. Quando a perda de volume é muito severa, os baroreceptores arteriais despolarizam com menor frequência contribuindo para a elevação da pressão arterial. 2.1.3.7. Reflexos quimioreceptores. Os reflexos dos quimiorreceptores são mediados centralmente por receptores no tronco cerebral e por receptores periféricos nos corpos aórticos e carotídeos. Os quimiorreceptores respondem a parâmetros que reflectem hipoxia, hipercapnia, acidemia e isquémia. Os reflexos dos quimiorreceptores são principalmente dirigidos ao controlo respiratório mas também exercem influência sobre parâmetros cardiovasculares. As vias aferentes destes arcos reflexos serão encaminhadas através do nervo vago e glossofaríngeo. 2.1.3.7.1 Reflexo quimiorreceptor periférico. Aferentes dos corpos carotídeos e aórticos exercem convergem para o centro vasomotor. A resposta cardiovascular à estimulação quimioreceptora consiste na vasoconstrição periférica e bradicardia. A hipoxia também produz hiperpneia e aumento da secreção das catecolaminas da medula adrenal, estas duas acções produzem taquicardia e aumento do volume de ejecção cardíaco. A hemorragia que produz hipotensão, estimula os quimiorreceptores. Esta estimulação deve-se à diminuição do fluxo sanguíneo nos quimiorreceptores e consequente anoxia por estagnação. A estimulação dos quimiorreceptores, também contribui para produzir as chamadas ondas de Mayer (Barrett et al., 2012). As ondas de Mayer são oscilações regulares lentas na pressão arterial que ocorrem à frequência de uma a cada 20-40 segundos durante a hipotensão. Nestas condições, a hipoxia estimula os quimiorreceptores. A estimulação eleva a pressão REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 53 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP arterial que por sua vez aumenta o fluxo sanguíneo para os órgãos e elemina o estímulo dos receptores. A pressão diminui e um novo ciclo é iniciado. 2.1.3.7.2. Reflexo quimiorreceptor central. O centro vasomotor e outros receptores localizados no tronco cerebral respondem a alterações na pressão arterial de CO2 (PaCO2) e no pH. Os reflexos centrais predominam sobre os reflexos dos receptores periféricos estimulando o centro respiratório e causando um aumento na pressão arterial e uma diminuição na frequência cardíaca após um aumento na PaCO2 ou diminuição do pH (Barrett et al., 2012). Os quimiorreceptores centrais são relativamente insensíveis à hipoxia. Os reflexos hipóxicos são mediados primariamente pelos quimiorreceptores periféricos (corpos aórticos e carotídeos) (Barrett et al., 2012). Concomitantemente, como resposta periférica directa à elevação da PaCO2 ocorre vasodilatação o que anula os efeitos vasopressores centrais. 2.1.3.7.3. Reflexo quimiorreceptor de Cushing. A hipoxia e a hipercapnia estimulam o centro vasomotor directamente. No entanto, o efeito directo da hipoxia é menor. Quando a pressão intracraniana aumenta, o fluxo sanguíneo para o centro vasomotor fica comprometido(Barrett et al., 2012). A hipoxia e a hipercapnia que se geram localmente aumentam a frequência de despolarização deste centro. O resultante aumento na pressão arterial causa uma diminuição reflexa na frequência cardíaca através dos baroreceptores arteriais. 2.1.3.7.4. Reflexo quimiorreceptor de Bezold-Jarisch. Em resposta á isquemia registada nos quimiorreceptores das artérias coronárias, ocorre hipotensão e bradicardia. Paralelamente existe um aumento fluxo sanguíneo coronário (Barrett et al., 2012). 2.1.3.7.5. Sistema vasodilatador simpático. As fibras simpáticas colinérgicas vasodilatadoras fazem parte do sistema regulador que se origina no córtex cerebral passa no tronco cerebral e passa igualmente sem REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 54 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP interrupção através da coluna intermédio-lateral através da espinal medula. Os neurónios pré-ganglionares activam os neurónios pós-ganglionares que inervam os vasos sanguíneos do músculo-esquelético Estes neurónios apesar de anatomicamente pertencerem ao sistema simpático secretam acetilcolina. A estimulação deste sistema causa vasodilatação no músculo-esquelético. A secreção de adrenalina e noradrenalina é aumentada quando este sistema é estimulado reforçando a dilatação dos vasos do músculo-esquelético. 3. Biomecânica dos vasos e fluxo sanguíneo. 3.1.Biomecânica vascular. Num sistema circulatório fechado como ocorre nos mamíferos, as grandes artérias tornam-se um componente importante da função cardíaca funcionando como reservatórios elásticos permitindo que o sistema arterial sofra grandes alterações no volume com pequenas alterações na pressão. Sem vasos elásticos, a ejecção de sangue que ocorre após a sístole elevaria demasiado a pressão. Por outro lado na diástole a pressão cairia tão rapidamente para níveis tão baixos que não permitiria o retorno de sangue ao coração. As grandes artérias elásticas são capazes de armazenarem uma porção do volume de ejecção em cada sístole para esvaziarem esse referido volume durante a diástole. Este fenómeno é conhecido como efeito de windkessel (Dobrin, 1978). Desta forma diminui-se a pós-carga no coração, minimiza-se o fluxo sistólico e maximizase o fluxo diastólico nas arteríolas. O resultado deste fenómeno é um fluxo distal mais constante durante o ciclo cardíaco. O que torna este fenómeno possível é umas paredes arteriais que contem uma matriz extracelular especializada com características que permitem uma reserva elástica. Os componentes da parede arterial dos vertebrados que contribuem para a maioria das propriedades mecânicas dos vasos são as fibras de colagénio e elastina depositas pelas células musculares lisas na túnica média. As fibras de elastina estão entrelaçadas numa rede tridimensional de lamelas desenhadas para transferir a tensão através da parede arterial. Entre estas lamelas de elastina localizamse feixes de colagénio (principalmente colagénio tipo I e III) que não apresentam uma disposição definitiva em baixas pressões mas que apresentam um alinhamento circunferencial quando a pressão sobre a parede do vaso sobe (Wagenseil & Mecham, 2009). Estudos prévios indicam que menos de 10% das fibras são recrutadas a valores de pressão fisiológicos(Greenwald, et al., 1997). Enquanto que a altas pressões arteriais, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 55 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP o vaso torna-se progressivamente menos distensível á medida que são recrutadas mais fibras de colagénio para suportar a tensão passiva na parede e restringir a distensão arterial. Com aumentos adicionais na tensão da parede, o diâmetro do vaso altera-se ligeiramente devido ao recrutamento adicional de feixes de colagénio confirmando a natureza não linear da elasticidade vascular. A parede das artérias actua como um material de duas fases com um módulo de elasticidade similar à elastina a baixas pressões e um módulo de elasticidade semelhante aos feixes de colagénio a tensões mais elevadas(Shadwick, 1999). Em todas as artérias de vertebrados e invertebrados existem artérias com um comportamento mecânico não linear(Shadwick, 1999). 3.2.Fluxo laminar e turbulento. O sangue é um fluido viscoso e heterogéneo contendo na sua constituição células e solutos que geram uma tensão tangencial na parede do vaso. Esta força cria um atrito na superfície luminal dos vasos que pode danificar o endotélio. Se compararmos o fluxo sanguíneo de sangue com o fluxo de um fluido num tubo não ramificado constatamos que um fluxo laminar irá minimizar o dano potencial da tensão tangencial (Wagenseil & Mecham, 2009). O fluxo laminar ocorre quando há uma relação parabólica para a velocidade de fluxo no tubo. O centro do tubo tem uma maior taxa de fluxo e a área do fluxo próxima das paredes apresenta uma taxa de fluxo igual a zero. Neste modelo de fluxo laminar praticamente não existe mistura da solução de modo que nas paredes a velocidade do fluxo é próximo de 0 e não se irá produzir quase nenhuma tensão tangencial. Esse sistema também é muito eficiente sendo que muito pouca energia cinética é perdida como turbulência, no entanto um sistema não-ramificado para a irrigação dos tecidos é impraticável e não é compatível com a manutenção da vida. Por outro lado o fluxo turbulento perde grande parte da energia cinética produzida a partir do fluxo sanguíneo e pode gerar uma substancial tensão tangencial sobre as paredes dos vasos sanguíneos causando danos no epitélio. A energia perdida pela turbulência também pode produzir som. O som de fluxo turbulento por vezes pode ser ouvido a partir de vasos com paredes lesionadas causando estenose tal como ocorre na aterosclerose. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 56 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 3.3.Dinâmica do fluxo e sua influência na hemocompatibilidade. A dinâmica do fluxo afecta a deposição de fibrina e a consequente formação do trombo. O fluxo determina as taxas de transporte das células e proteínas para a superfície e também pode alterar o nível de expressão dos receptores nas plaquetas e leucócitos(Hanson & Sakariassen, 1998). Um fluxo com uma elevada tensão tangencial resulta em maior deposição de plaquetas e menor deposição de trombina. Por outro lado um fluxo com baixa tensão tangencial determina o inverso. Tal facto explica a diferença que ocorre na constituição dos trombos arteriais e venosos, sendo os primeiros formados por plaquetas e os segundos essencialmente por fibrina. No que concerne ao efeito do fluxo na activação da coagulação, o conhecimento actual centra-se na formação do factor Xa (FXa) pela via extrínseca e a formação de trombina pela via intrínseca. Foi estudado que a formação de FXa pelo complexo factor tecidular-factor VIIa aumenta em situações de tensão tangencial aumentada e taxas de fluxo mais elevadas(Gemmell, Nemerson, & Turitto, 1990). Por sua vez para a formação de trombina pela via intrínseca (por contacto com biomateriais) foram identificados três tipos de modelos(Basmadjian, Sefton, & Baldwin, 1997): em baixo fluxo há uma produção substancial de trombina após um tempo lag longo (10 horas); em fluxos moderados dá-se uma formação de trombina em quantidades significativas num curto período de tempo (em poucos minutos) e em fluxos elevados, em segundos são produzidos baixos níveis de trombina. O fluxo turbulento observado nas anastomoses, bifurcações e articulações dos diversos dispositivos cardiovasculares contribui para a os eventos trombóticos observados nestas localizações(Bluestein, Rambod, & Gharib, 2000). O fluxo turbulento resulta também em hemólise e activação das plaquetas mas os mecanismos que levam à formação dos trombos ainda são pouco conhecidos. As zonas de estagnação ou recirculação de sangue com ou sem características de fluxo turbulento devem ser evitadas na construção de próteses e noutros dispositivos por serem locais ideais para a formação de pequenos coágulos que crescem rapidamente obstruindo o lúmen das próteses vasculares(Bluestein et al., 2000). Quanto ao efeito do fluxo na adesão dos leucócitos aos dispositivos cardiovasculares, os resultados têm sido contraditórios. O fluxo elevado demonstrou que pode induzir uma redução, um aumento ou até deixar inalterado a adesão dos leucócitos a diferentes superfícies. Esta contradição de resultados deve-se às condições experimentais utilizadas nos ensaios de investigação, particularmente a presença de eritrócitos que desempenham um papel fundamental na adesão dos REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 57 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP leucócitos em condições de alto fluxo(Melder, Yuan, Munn, & Jain, 2000; Melder, et al., 1995). 3.4. Relação fluxo e hiperplasia da íntima A hiperplasia da íntima e a formação de trombos são as principais complicações de longo e curto prazo respectivamente que levam numa primeira fase a estenose e posteriormente à oclusão do lúmen das próteses vasculares. No homem, a hiperplasia da íntima é um fenómeno que ocorre na região peri-anastomótica devido ao facto de proliferação da íntima poder ocorrer apenas na presença de tecido subendotelial (Zilla, Bezuidenhout, & Human, 2007). Nesta espécie, a grande maioria da superfície da prótese que contacta com o sangue permanece sem cobertura por qualquer tecido durante toda a sua vida útil por inexistência de uma cobertura endotelial. No entanto, a hiperplasia da íntima também ocorre quando são utilizados enxertos venosos autólogos estendendo-se nesta situação a todo o seu comprimento(Lemson, et al., 2000). A etiologia e a patogénese desta proliferação tecidular são consideradas multifactoriais desde o trauma cirúrgico à falta de endotélio, passando pela discordância na complacência entre prótese e artéria hospedeira até às condições de fluxo. Destas, a discordância de complacência e as variações no fluxo parecem ser as principais determinantes na redução ou aumento da espessura do tecido subendotelial. Histologicamente, a hiperplasia da íntima (Figura 2) é composta por 20 % de células musculares lisas que migraram da íntima perianastomótica (no caso especifico das próteses vasculares), proliferaram e sintetizaram matriz extracelular que corresponde aos restantes 80% da íntima. Outros componentes da íntima hiperplásica incluem macrófagos e linfócitos podendo a sua superfície apresentar um endotélio dependendo da extensão da lesão e do tempo que passou desde a lesão inicial (Kraiss & Clowes, 1997). A proliferação da íntima inicia-se em resposta a lesões do endotélio por alterações hemodinâmicas e segue uma sequência de eventos amplamente conhecida (Watase et al., 1992). Watase et al(Watase et al., 1992), descreveram seis fases da proliferação da íntima em artérias lesionadas: 1- Formação inicial de trombo 2- Fagocitose do trombo 3- Surgem fibroblastos e inicia-se a sua proliferação na íntima 4- Aparecem células endoteliais que proliferam REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 64 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 4. Angiogénese e vasculogénese Os vasos sanguíneos originam-se através de dois processos: a angiogénese, em que se formam capilares a partir de vasos pré-existentes e a vasculogénese que consiste na formação de capilares que tem origem em células endoteliais (EC) indeferenciadas ou células progenitoras endoteliais (Nomi, et al., 2002). A formação dos primeiros capilares tem lugar durante as primeiras fases da embriogénese(Folkman, 1997). Os plexos vasculares do saco vitelino originam-se da medoserme por diferenciação dos angioblastos, que subsequentemente originam vasos sanguíneos primitivos(Risau, 1997). A angiogénese é um processo morfogénico em que novos capilares se originam a partir de vasos pré-existentes. Estão descritos seis passos na angiogénese(Nomi et al., 2002): i) vasodilatação do vaso progenitor, reduzindo o contacto entre as (EC), ii) degradação da membrana basal do vaso progenitor por enzimas proteolíticas, iii) migração e proliferação de EC para formar um neoendotélio no novo capilar, iiii) formação de um lúmen capilar e respectiva estrutura tubular, iiiii) síntese da membrana basal, iiiii) recrutamento de perocitos e células musculares lisas. A angiogénese desempenha um papel importante na cicatrização de feridas, formação de vasos colaterais e nas variações cíclicas da estrutura do tecido do sistema reprodutor feminino(Nomi et al., 2002). No coração, a formação de vasos colaterais a partir de capilares pré-existentes é um processo importante para proteger o órgão de danos isquémicos(Witzenbichler et al., 1998). Para além de importante em processos fisiológicos, a angiogénése é fundamental em situações patológicas nomeadamente no crescimento tumoral e na formação de metástases(Folkman & Hanahan, 1991). O processo de vasculogénese pode ser dividido em 5 passos fundamentais(Drake, 2003; Nomi et al., 2002): i) EC são originadas de células percursoras designadas de angioblastos, ii) EC formam o vaso primordial e agregam-se para estabelecer um contacto célula a célula, iii) formação de uma estrutura tubular composto de EC, iiii) formação de uma rede vascular composta de tubos endoteliais em formação, iiiii) o recrutamento de pericitos e células musculares lisas. As EC encontram-se em circulação no sangue periférico de indivíduos adultos. Estas EC originam-se por sua vez nas células endoteliais progenitoras da médula óssea e são mobilizadas para a circulação(Asahara & Kawamoto, 2004). Subsequentemente, as células progenitoras endoteliais são mobilizadas para a corrente sanguínea onde participam no processo angiogénico. Esta evidência sugere que a neovascularização pós-natal não reside exclusivamente na angiogénese e que a vascularização tecidular pode ser auxiliada pelas células REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 65 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP progenitoras endoteliais através de um processo de vasculogénese pósnascimento(Asahara et al., 1997; Asahara & Kawamoto, 2004). No individuo adulto, as EC dos grandes vasos encontram-se no estado quiescente devido a inibição celular por contacto. Quando estimuladas para a fase angiogénica, as EC adquirem propriedades que facilitam a neovascularização tecidular(Folkman & Hanahan, 1991). A conversão do estado quiescente para o estado angiogénico pode ser estimulada por diversas condições tais como hipoxia. Ao alterar o seu fenótipo para o estado angiogénico aumenta-se a sua sensibilidade para factores angiogénicos por modulação da expressão de receptores. Quando expostas aos factores angiogénicos, as EC sofrem um processo de desenvolvimento que passa pela formação de tubos endoteliais que se ramificam e finalmente formam uma rede vascular (Asahara, et al., 1995; Kalka, et al., 1999). Entre os principais factores angiogénicos destacam-se o factor de crescimento vascular endotelial, o factor de crescimento dos fibroblastos e o factor de crescimento dos hepatócitos. Estes factores exercem a sua acção directamente nas EC por acção em receptores superficiais que existem nas membranas celulares. Todos estes factores são mitogenos potentes que exercem a sua acção em processos fisiológicos e patológicos. Adicionalmente, existe um grande grupo de compostos que não induzem a proliferação ou migração de EC in vitro mas que induzem angiogenése in vivo. Estes factores são considerados factores angiogénicos indirectos e incluem o factor de crescimento derivado das palquetas, a angiopoietina e o factor de crescimento transformador beta(Nomi et al., 2002). 5. Interacção dos mecanismos de coagulação com biomateriais e dispositivos cardiovasculares. A hemocompatibilidade dos dispositivos e mais especificamente dos biomateriais que contactam com o sangue relaciona-se directamente com a resposta trombótica induzida pelos biomateriais e é vital para o seu desempenho funcional. As manifestações clínicas ou funcionais de bioincompatibilidade de dispositivos cardiovasculares são numerosas desde: i) obstrução de completa de stents semanas após a sua colocação(Bittl, 1996); ii) oclusão aguda ou sub-aguda de próteses vasculares de baixo a médio calibre (4-6 mm de diâmetro interno)(Hoffman et al., 1987); iii) complicações embólicas de válvulas cardíacas(Edmunds, Jr., 1996; Edmunds, Jr., 2001) e cateteres venosos centrais REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 66 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP (Eberhart & Clagett, 1991). As próteses vasculares de maior calibre (> 8mm) mantém-se trombogénicas durante muitos anos. No entanto, nas próteses deste calibre as complicações trombóticas são menos frequentes devido ao inerente fluxo elevado que dilui os factores de coagulação. Além de que este tipo de próteses mantêm-se patentes durante períodos mais longos porque a oclusão apesar de ser possível é mais lenta devido ao maior diâmetro interno (ID). Nas próteses vasculares de baixo diâmetro (PVDB) pode ocorrer uma obstrução aguda apesar do uso de protocolos terapêuticos profilácticos com anticoagulantes (Gorbet & Sefton, 2004a). Esta complicação apresenta uma elevada prevalência e até ao presente apesar de intensa pesquisa ainda não foi produzido um biomaterial com um perfil de hemocompatibilidade adequado para o fabrico de PVDB. Daí que o objectivo principal deste trabalho seja a produção de uma prótese vascular de baixo diâmetro utilizando uma combinação de polivinil álcool hidrogel com dextrano. 5.1. Interacções sangue-biomaterial. Em condições fisiológicas, o sangue contacta com o endotélio que apresenta propriedades anticoagulantes e antitrombóticas. O uso de próteses vasculares representa a introdução de uma superfície estranha na circulação que interactua com o sangue desencadeando uma série complexa de eventos que inclui entre outros: a adsorção de proteínas plasmáticas, a adesão activação de plaquetas e leucócitos e a activação da cascata de coagulação e do complemento. A adsorção de proteínas é o primeiro evento a ocorrer quando o biomaterial entra em contacto com o sangue. Esta adesão e acumulação no interface sangue-biomaterial ocorre dentro de segundos, [29]. As chamadas proteínas de fase de contacto do plasma envolvidas na adsorção inicial são a albumina, imunoglobulinas, fibrinogénio, a fibronectina, o FXII e o CMA(Hanson & Tucker, 2013). Esta camada pode induzir a coagulação, a activação e adesão celular, a activação do complemento, e ao induzir a conversão de fibrinogénio em fibrina, induz também a resposta fibrinolítica. As proteínas que aderem em primeiro lugar às superfícies (albumina, globulinas e fibrinogénio) são substituídas ao longo do tempo (efeito de Vroman) por CPMA, FXII e precalicreína. No que concerne à interacção do biomaterial com a cascata de coagulação, o factor XII (FXII) será o primeiro a factor a ser activado na presença de uma prótese vascular(Zhuo, et al., 2005). Classicamente, o FXII é activado por adsorção ou contacto com uma superfície que apresenta uma carga negativa em FXIIa. FXIIa converte a précalicreína REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 67 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP em calicreína que com o cininogénio de alto peso molecular (CAPM) como cofactor activa o factor XI (Zhuo et al., 2005). Iniciando-se a partir deste último factor a restante activação da via intrínseca. No entanto devido à falta de relevância do FXII para activação da via intrínseca em condições fisiológicas, pensa-se que o cininogénio de alto peso molecular (CAPM) desempenhará o principal papel de activação da via intrínseca da coagulação no que concerne às interacções sangue-biomateriais (Zhuo et al., 2005; Horbett, 1993). O FXII tem sido observado em quantidades moderadas na superfície de biomateriais usados em próteses vasculares(Ziats, Pankowsky, Tierney, Ratnoff, & Anderson, 1990) e em membranas de hemodiálise(Mulzer & Brash, 1989) embora não tenha sido detectado na forma activada (Cornelius & Brash, 1993). Outra evidência que sugere a irrelevância do FXII na activação da coagulação é a inexistência de uma correlacção entre altos níveis de FXII e calicreína na superfície de biomateriais e formação de complexos trombina-antitrombina (TAT)(Chen, Yuan, Song, Wu, & Li, 2008; van der Kamp, Hauch, Feijen, & Horbett, 1995). Recentemente, a investigação na interacção entre sangue e biomateriais tem mudado o seu foco de pesquisa para a activação da via extrínseca da coagulação. Hong et al sugere que a interacção dos biomateriais com os leucócitos induziria a expressão de factor tecidular (FT) e desta forma representaria o principal estímulo na activação da coagulação. A célula, nomeadamente o monócito tem sido o principal implicado na expressão FT por leucócitos quando o sangue contacta com o biomaterial(Hong, Nilsson, Reynolds, Larsson, & Nilsson, 1999). Este facto foi demonstrado in vivo na expressão de FT por monócitos em pacientes sujeitos a bypass cardiopulmonar,tendo sido doseado o FT antes e depois deste procedimento. Outra via de aumento de expressão ou libertação de FT será aquando da realização de procedimentos de cirurgia vascular, nomeadamente quando se coloca uma prótese vascular para a realização de bypass vasculares ou fístula arteriovenosa em que ocorre dano do endotélio e libertando-se FT, colagénio e Factor de von Willebrand (FvW) (de Mel, Cousins, & Seifalian, 2012). A formação TAT em polivinil cloreto (PVC) foi dada como negligenciável quando este biomaterial contacta com plasma ou plasma rico em plaquetas (PRP), por outro lado quando o mesmo biomaterial contacta com sangue total os níveis de TAT sobem significativamente sugerindo que a presença de leucócitos é o factor diferenciador na subida de TAT. O sistema de complemento consiste em mais de 20 proteínas que funcionam como enzimas ou proteínas de ligação. A activação do complemento é iniciada através da via clássica ou alternativa existindo igualmente uma via terminal que é comum às duas vias REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 68 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP anteriores. Ambas as vias contem uma enzima inicial que catalisa a formação de C3 convertase que por sua vez gera C5 convertase permitindo a formação do complexo terminal completo. A activação do complemento liberta C3a, C4a e C4a, péptidos que se ligam a receptores de neutrófilos, monócitos, mastócitos e células musculares lisas. Estes péptidos induzem uma variedade de respostas celulares nas quais se incluem a activação e adesão celular. Na presença de um biomaterial é convencionalmente definido que o complemento é activado pela via alternativa. As superfícies dos biomateriais são usualmente classificadas em dois grupos, superfícies activadoras ou não-activadoras do complemento(Gorbet & Sefton, 2004b). Nas superfícies ditas activadoras ocorrem geralmente os grupos amina e hidroxilo, estes grupos promovem a formação de C3 e C5 convertase(Bittl, 1996).Entre as superfícies não activadoras encontram-se aquelas que apresentam grupos com carga negativa como os carboxilos, os sulfatos, o ácido siálico e a heparina que aparentemente promovem uma elevada afinidade de associação entre C3b e o factor H, inactivando-se o efeito amplificador de C3b na activação do complemento (Bittl, 1996). A activação e adesão de plaquetas é uma das componentes da interacção do sangue com os biomateriais dos dispositivos cardiovasculares. As plaquetas através da interacção com a fibrina formam o trombo, que é um evento de bioimcompatibilidade a evitar em dispositivos médicos que contactam com o sangue. A activação e adesão plaquetária foram descritas em membranas de hemodiálise, próteses vasculares, cateteres venosos e nos aparelhos de bypass cardiopulmonar(Hanson & Tucker, 2013; Heijnen, et al., 1999). A trombogenicidade destes dispositivos está estreitamente relacionada com a capacidade dos biomateriais em activarem as plaquetas. Existem vários tipos de interacção das plaquetas com os biomateriais. A activação de plaquetas sem adesão conduz a um elevado consumo com formação de microtrombos. Têm sido descritas diversas situações em que a activação de plaquetas manifestada pela formação de micropartículas plaquetárias (MPP), não se concretizou em adesão plaquetária. Este facto verificou-se com o polivinil álcool hidrogel in vitro (Godo & Sefton, 1999) e ex vivo (Gemmell, Yeo, & Sefton, 1997). Estes estudos verificaram que após a activação das plaquetas não aderentes ocorre a sua remoção da circulação e aumento do seu consumo. Após o contacto com a camada de proteínas adsorvidas na superfície do biomaterial pode ocorrer adesão ou arrastamento pelo fluxo sanguíneo. O tipo de interacção depende do estado de activação e os receptores presentes no interface do biomaterial. Nesta situação é necessário a interacção entre o fibrinogénio e a expressão REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 69 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP do respectivo receptor GPIIb/IIIa (CD41/CD61) e/ou a adesão entre o receptor GPIb/IIa e FvW(Bailly et al., 1996; Sheppard, McClung, & Feuerstein, 1994; Hanson & Tucker, 2013; Grunkemeier, et al., 2000). A expressão da P-selectina, uma glicoproteína de superfície que pertence à família das selectinas e desempenha um papel importante na mediação da adesão de plaquetas activadas a neutrófilos, monócitos e a linfócitos (Gorbet & Sefton, 2001). Esta associação ocorre na presença de próteses vasculares e outros dispositivos e tem sido utilizada como parâmetro para quantificar a hemocompatibilidade(Sinn, Scheuermann, Deichelbohrer, Ziemer, & Wendel, 2011). Possivelmente, esta associação pode contribuir para a formação de trombina através da expressão do FT pelos monócitos quando em contacto com as plaquetas(Gorbet & Sefton, 2001; Gorbet & Sefton, 2004a). A interacção das plaquetas com os leucócitos através da P-selectina pode auxiliar á remoção das plaquetas activadas da circulação. Os outros mecanismos de interacção nomeadamente a activação da coagulação através da geração de trombina levarão também à activação das plaquetas. Outro agonista das plaquetas, o ADP é também libertado pelos eritrócitos e/ou plaquetas fragmentados(Gorbet & Sefton, 2004a). A activação do sistema de complemento pode também levar à activação das plaquetas, especificamente através do receptor plaquetário para C1q que demonstrou a capacidade de induzir a expressão de: GPIIb/IIIa, a P- selectina e a actividade procoagulante das plaquetas (Peerschke & Ghebrehiwet, 1998). 5.2. Estratégias de melhoria da biocompatibilidade dos biomateriais. A modificação das superfícies dos biomateriais com o objectivo de melhorar a biocompatibilidade das próteses vasculares segue duas abordagens. A primeira estratégia segue o fabrico de uma prótese vascular com características físicas compatíveis que permitam a existência de uma superfície inerte, antiaderente e antiagregante. A outra estratégia para a melhoria da biocompatibilidade passa pela biofuncionalização das superfícies que consiste na incorporação de moléculas bioactivas com o objectivo de desencadear respostas específicas que conduzem à biocompatibilidade. Todas estas estratégias têm como objectivo principal limitar eventos trombogénicos que reduzem a taxa de permeabilidade de próteses vasculares a curto e a longo prazo. Foi também esse o nosso objectivo quando copolimerizamos o polissacárido dextrano com efeitos sobre a activação da coagulação sobre a activação com o polímero PVA no fabrico de próteses vasculares. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 70 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 5.3.Modificação físico-química. A topografia das superfícies à escala do mícron ou nanometro é uma importante propriedade física que influencia a adsorção de proteínas, a adesão plaquetária e a trombogenicidade(Lord, et al., 2011). A inclusão de poros e sulcos é um facto inevitável no fabrico de próteses vasculares especialmente na superfície que contacta com o sangue. As proteínas de fase de contacto como o fibrinogénio, albumina e fibronectina aderem a nanoestruturas de forma mais eficiente e ligam-se aos receptores plaquetários mais facilmente do que em superfícies planas(Yaseen, et al., 2010). A porosidade é outro factor crucial na topografia das superfícies das próteses vasculares. Um estudo recente revelou que as EC proliferam melhor em superfícies com poros de menor diâmetro (5-10 µm) e com menor espaço entre poros(Ahmed, et al., 2011). Com o objectivo de tornar as superfícies das próteses não incrustantes para prevenir a adsorção de proteínas e adesão a plaquetária. Grande parte do esforço de investigação tem sido dirigido para a modificação química das superfícies combinando polímeros que causam a passivação dos materiais. Diversos polímeros têm sido utilizados como o dextrano que foi utilizado no presente trabalho experimental, o polietilenoglicol, óxido de polietileno limitando a formação de trombos e melhorando até a adesão de EC(Llanos & Sefton, 1993a; Llanos & Sefton, 1993b; Shen et al., 2002; Chen, et al., 2005). Estes mesmos polímeros podem também ser modificados para conter péptidos que facilitam selectivamente a adesão de EC. Recentemente, próteses de ePTFE foram revestidas com um elastómero biodegradável poli(1,8-octanediol citrato) demonstrando in vitro não só a redução de formação de trombos mas também uma maior adesão de EC em ensaios in vivo (Kibbe et al., 2010).O revestimento em carbono foi extensivamente estudado e é utilizado comercialmente em próteses de vasculares de PET e ePTFE (Kakkos, et al., 2011; Akers, Du, & Kempczinski, 1993; Titushkin et al., 2001). Nestas próteses, foi demonstrado que a impregnação de carbono confere electronegatividade à superfície reduz a adsorção de proteínas e consequentemente dá-se também uma redução na adesão de plaquetas(Sbarbati et al., 1991). Estes resultados in vitro foram depois confirmados no contexto clínico através de uma taxa de permeabilidade superior quando comparados com as mesmas próteses mas sem revestimento de carbono(Kapfer, Meichelboeck, & Groegler, 2006; Sbarbati et al., 1991) . REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 71 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 5.4.Biofuncionalização de superfícies. A biofuncionalização das superfícies das próteses vasculares tem seguindo duas vias, nomeadamente a estimulação da endotelização dos dispositivos que contactam com o sangue e a produção de superfícies antitrombogénicas através da adsorção de moléculas com propriedades anticoagulantes e/ou antiplaquetárias. O endotélio é por excelência a superfície antitrombogénica e a endotelização de dispositivos cardiovasculares tem sido considerada a estratégia mais favorável para melhorar a função a longo prazo destes dispositivos. As primeiras tentativas de indução da endotelização ex situ em próteses vasculares num contexto clinico foram iniciadas por Meinhart et al (Meinhart et al., 1997). Os resultados desta estratégia foram encorajadores conseguindo-se taxas de permeabilidade a longo prazo (8 anos) semelhantes a enxertos vasculares com veias autólogas (Meinhart et al., 1997). No entanto, este procedimento não pode ser utilizado em situações de urgência porque é necessário realizar previamente a endotelização da prótese com células endoteliais autólogas em banho de tecidos. A endotelização in situ através do recrutamento de células endoteliais progenitoras (EPC) pelas próteses vasculares é um processo complexo que requer várias fases e incluem: i) a promoção da mobilização de EPC pela medula óssea, ii) estimular o alojamento de células específicas (EC, EPC e/ou células estaminais),iii) colocação de péptidos na prótese vascular que facilitam adesão celular, iiii) modulação das células após adesão para formar rapidamente uma camada funcional de células endoteliais com capacidade para se autoreparar. A mobilização de EPC pela medula óssea é a primeira etapa da endotelização das superfícies. As EPC derivam dos hemangioblastos que são igualmente as células percursoras das células de linhagem hematopoiética e são CD34 positivas (Rafii & Lyden, 2003). Ao contrário das células estaminais hematopoiéticas apresentam uma capacidade limitada multiplicação(Rafii & Lyden, 2003). Existem diversos estímulos que param ou estimulam a mobilização de EPC. A libertação de EPC pela medula óssea é mediada pelo óxido nitroso (NO) produzido pelos componentes reguladores do microambiente da medula óssea (osteoblastos e EC) na presença de factores mobilizadores como o factor de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o factor de crescimento placentário(Aicher et al., 2003) (Leone et al., 2009). Existem em circulação diversas substâncias que aumentam a disponibilidade de NO como a hormona de crescimento (GH), o factor de crescimento de insulina-1 (IGF-1), o VEGF e o factor de crescimento placentário que REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 72 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP consequentemente aumentarão os níveis de EPC circulantes(Li et al., 2006; Thum et al., 2007). Outros factores humorais implicados em outros processos fisiológicos como o factor estimulador das colónias de granulócitos (G-CSF), o factor estimulador das colónias de monócitos, o factor derivado do estroma (SDF-1α) e a eritropoietina(Heeschen et al., 2003) (através da via de activação das cinases) demonstraram a capacidade de estimular a mobilização, proliferação e migração de EPC. Em contraste, altos níveis de subtâncias endógenas que limitam a disponibilidade de NO como dimetilarginina assimétrica (ADMA) estão associados e níveis mais baixos de EPC circulantes(Thum et al., 2005). A mobilização de EPC depende também de factores fisiológicos e patológicos. No que se refere a factores fisiológicos, verificou-se que o exercício mobiliza as EPC dos seus nichos da medula óssea através dos mecanismos mediados pelo NO e VEGF. Os estrogénios mobilizam as EPC actuando directamente nos receptores α e β, que tem influência nos mecanismos de NO e metaloproteínase 9 de libertação de EPC. Este facto pode ajudar a justificar a baixa prevalência de doenças cardiovasculares nas mulheres no período pré-menopausa quando comparada com os homens. Foi também verificado que a idade tem uma influência negativa no número de EPC circulantes. De facto, em indivíduos idosos ou de meia-idade as EPC circulam em menor número e apresentam uma função reduzida. Esta evidência potencialmente estará relacionada com a redução dos níveis de IGF-1 ao longo da idade. O mesmo pode acontecer com a redução dos mecanismos de regeneração vascular por EPC e com a redução das concentrações plasmáticas de VEGF o que pode limitar a mobilização de EPC na medula óssea. Em condições fisiopatológicas, o número de EPC circulantes pode estar aumentado ou diminuído em diversas afecções. A lesão vascular em diferentes modelos de isquémia do miocárdio e periférica demonstrou que consegue mobilizar com eficiência as EPC circulantes que se alojam no local da lesão onde se dividem, proliferam e aderem à íntima lesionada para promover o crescimento de um novo endotélio(He et al., 2004). A diabetes mellitus, a insuficiência renal crónica, a hipertensão arterial e a hipercolesterolémia entre outras afecções crónicas causam uma diminuição da EPC circulantes sendo provavelmente esta alteração a responsável pela deficiente regeneração vascular observada nestas patologias. Com o objectivo de melhorar o alojamento da EPC, as próteses têm sido revestidas com moléculas que capturam as células EPC directamente da circulação após a implantação, mimetizando uma superfície potenciadora de alojamento. Estas células tem o potencial REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 73 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP de cobrir totalmente a superfície interna com um endotélio que mantem uma homeostasia óptima de coagulação minimizando a forma de trombos e o risco de estenose (Avci-Adali et al., 2013; Avci-Adali, Ziemer, & Wendel, 2010; Avci-Adali, et al., 2008). O recrutamento das células estaminais/EPC pelas próteses vasculares foi investigado através da adsorção de anticorpos monoclonais. As EC e EPC são positivos para o receptor CD34 e por essa razão anticorpos monoclonais CD34 podem ser ligados á superfície de próteses vasculares facilitando a adesão de EPC(Rotmans et al., 2005). Anticorpos monoclonais CD34 anti-humanos foram já adsorvidos a ePTFE em próteses vasculares. Experimentalmente foi tentado in vitro a adsorção de células endoteliais magnetizadas de suíno a próteses vasculares de Dacron previamente magnetizadas (Pislaru et al., 2006). As EPC de suíno foram colhidas do sangue periférico, separadas pelo gradiente de densidade de Ficoll e cultivadas durante 7-10 dias. Estas células foram posteriormente marcadas com microsferas de óxido de magnetizado e colocadas em contacto com as próteses. Apesar de neste estudo ter sido demonstrado que as forças magnéticas podem induzir rapidamente o revestimento das próteses por EPC magnetizadas na presença de fluxo sanguíneo; é uma metodologia que requer várias etapas realizadas em meio de cultura sendo por isso dispendiosa e demorada. Hoffman e colaboradores seguiram uma abordagem molecular ao produzir aptameros com uma alta afinidade para EPC de modo a conseguir endotelização mais rápida e eficaz(Hoffmann et al., 2008). Aptameros são oligonucleótidos de cadeia simples de ADN ou ARN com 70 a 80 nucleótidos de extensão que se podem ligar com alta afinidade e especificidade a um elevado número de moléculas como péptidos, proteínas, fármacos e até células(Nimjee, Rusconi, & Sullenger, 2005). Aplicando a tecnologia SELEX três aptameros de cadeia simples de ADN foram fabricados contra uma subpopulação de células de suíno positivas para a integrina CD31, tendo 72% destas células sido selectivamente ligadas por estes aptameros(Hristov, Erl, & Weber, 2003). Estes aptameros foram também testados in vitro ligando-os de forma covalente a discos de ePTFE e polidimetilsiloxano (PDMS) para avaliar a sua capacidade de se ligarem a EC/EPC em condições de fluxo (Hoffmann et al., 2006).Os referidos aptameros foram ligados às próteses através de um revestimento hemocompatível de polietilenoglicol (PEG) para garantir a ligação específica de EPC e para prevenir interacções bioincompatíveis entre o sangue e os polímeros (PTFE e PDMS). Este revestimento criou uma matriz antitrombogénica e desta forma aumentou a janela temporal para uma completa endotelização através da ligação de um número suficiente de EPC. Os resultados in vitro para o alojamento de EPC utilizando olinucleótidos específicos para CD31 mostraram um maior número de EC aderentes. No REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 80 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP artérias que irrigam os membros superiores(Hills, et al., 2009). DAP é um termo usado para descrever o comprometimento do fluxo sanguíneo para as extremidades geralmente como resultado de doença oclusiva aterosclerótica. De um modo geral, a presença de sintomas na DAP depende das necessidades metabólicas do tecido isquémico durante o exercício, o grau de circulação colateral e do tamanho e localização da artéria afectada(Schirmang, et al., 2009). A incidência de DAP na população em geral de 3 a 10% em pessoas com idade inferior a 70 anos para 15-20% em pessoas com idade superior a 70 anos(Fowkes et al., 1991). No entanto, 40% dos pacientes com DAP são assintomáticos, enquanto apenas 10% deles apresentam com claudicação intermitente típica(Fowkes et al., 1991). Um terço dos pacientes afectados por DAP terá uma oclusão completa de uma artéria principal para a perna na primeira apresentação(Fowkes et al., 1991). A patofisiologia e os factores de risco da DAP resultam de qualquer doença que cause estenose ou oclusão das artérias do membro inferior sendo a doença aterosclerótica a etiologia mais comum de DAP(Selvin & Erlinger, 2004). Todo o processo de formação da aterosclerose segue as mesmas etapas descritas anteriormente para a DAC. Existe no entanto particularidades quanto à localização das oclusões na DAP, sendo as bifurcações arteriais o local preferencial devido ao efeito da perturbação do fluxo nos mecanismos de protecção do endotélio essenciais para a formação de placas ateroscleróticas. Para além da causa aterosclerótica existem múltiplas causas não relacionadas com a formação de placas ateroscleróticas mas que provocam igualmente oclusão da artéria. Diversos factores de risco foram implicados na DAP que incluem raça, idade avançada, sexo, tabagismo, hipertensão arterial, hipercolesterolémia, insuficiência rena crónica, condições inflamatórias sistémicas e tabagismo(Norgren et al., 2007). A escolha da terapêutica para a DAP depende essencialmente da apresentação clínica do paciente. A revascularização do segmento arterial obstruído está indicada em pacientes com isquemia aguda do membro ou claudicação intermitente. Paralelamente é realizada terapêutica com anticoagulantes e anti-agregantes plaquetários para reduzir o risco de doença cardiovascular relacionada com DAP sendo igualmente controladas as comorbilidades como a hipertensão e o diabetes mellitus(Norgren et al., 2007). Os procedimentos de revascularização dividem-se: em técnicas endovasculares que incluem a colocação de vários tipos de stents (ex:revestidos com PTFE ou com libertação prologada de fármacos) em revascularizações supra-inguinais e infra-inguinais; e técnicas abertas que incluem a realização de um bypass em diversas localizações anatómicas nomeadamente aorto-femoral, femoro-femoral e femoro-poplitea (Abdulhannan et al., 2012). Para os procedimentos cirúrgicos de bypass estão REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 81 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP disponíveis vários tipos de próteses artificiais de ePTFE e poliéster (Dacron) bem como enxertos autólogos de veias e artérias periféricas. Sendo largamente aceite que os enxertos autólogos apresentam uma melhor taxa de permeabilidade a longo prazo e um melhor perfil de infecção quando comparados com as próteses sintéticas em bypass proximais e distais ao joelho (Klinkert, et al, 2004). Uma alternativa a estas técnicas referidas anteriormente, passa pela remoção directa da placa que obstrui a artéria através de dispositivos de aterectomia (Mia & McKinsey, 2008). Existem vários tipos destes dispositivos nomeadamente direccionais (SilverHawk), orbitais, rotacionais (Rotablator) e dispositivos de aterectomia por laser (Excimer laser). Não existindo no entanto estudos que comprovem a superioridade desta técnica em relação às anteriormente referidas 6.4. Aneurisma da aorta abdominal Um aneurisma arterial é definido como uma dilatação focal de um vaso sanguíneo em relação ao diâmetro original da artéria(Aggarwal,et al., 2011). Um aneurisma aórtico abdominal (AAA) é definido como um diâmetro da aorta, de pelo menos, uma vez e meia o diâmetro normal ao nível das artérias renais, o que é aproximadamente 2,0 cm. Assim, em geral, um segmento de aorta abdominal com um diâmetro maior do que 3,0 cm é considerado um aneurisma da aorta (Ouriel et al., 1992; Hirsch et al., 2006). Aproximadamente 80% dos aneurismas da aorta ocorrem entre as artérias renais e a bifurcação aórtica. Os aneurismas da aorta constituem a décima causa de morte nos Estados Unidos da América (EUA) (Silverberg, Boring, & Squires, 1990). A cada ano nos Estados Unidos, a ruptura do AAA provoca 4500 mortes, as quais se juntam 1400 mortes adicionais resultantes de complicações dos 45000 procedimentos cirúrgicos realizados para evitar a ruptura (McPhee, Hill, & Eslami, 2007). O desenvolvimento do AAA está associado a diversos factores de risco: hipertensão; tabagismo; idade em que o risco de AAA aumenta dramaticamente após os 60 anos(Singh,et al., 2001) e o sexo, sendo que o risco de desenvolvimento de AAA é 4 a 6 vezes superior no homem quando comparado com a mulher(Lederle, Johnson, & Wilson, 2001). Existem outros factores predisponentes: os factores genéticos, uma história familiar de AAA aumenta o risco de desenvolvimento de aneurisma em quatro vezes (Salo, et al., 1999) e a presença concomitante de doença arterial aterosclerótica aumenta para o dobro o risco de desenvolvimento de AAA nestes pacientes (Cabellon S Jr, et al., 1983). A maioria dos AAAs são assintomáticos e são frequentemente diagnosticados como um achado REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 82 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP acidental em ultra-sonografia (USG), tomografia computadorizada (TC) abdominal ou ressonância magnética realizada para outros fins(Aggarwal et al., 2011). A maioria das AAAs é silenciosa, até que roturam, embora alguns sejam diagnosticados durante a avaliação de sintomas abdominais. Quando os aneurismas produzem sintomas, ocorre principalmente dor e sensibilidade à palpação, estando nestes casos em maior risco de ruptura. Os casos de aneurismas de pequena e média dimensão poderão ser tratados de forma médicamente (Isselbacher, 2005). As directrizes internacionais do American College of Cardiology recomendam a correcção cirúrgica de AAA com diâmetro igual ou superior a 5,5 cm em pacientes assintomáticos (Hirsch et al., 2006). Os pacientes com aneurismas sintomáticos e em que houve um aumento de diâmetro superior ou igual a 0,5 cm no diâmetro em seis meses deve também ser tratados cirurgicamente independentemente do diâmetro do aneurisma(Hirsch et al., 2006). As opções para terapêutica cirúrgica incluem a reparação cirúrgica aberta (incluindo a via transabdominal ou a via retroperitoneal) (Mitchell, et al., 1995) ou a abordagem endovascular, o qual envolve a inserção de uma endoprótese no lúmen, que exclui o aneurisma do fluxo sanguíneo, minimizando o risco de ruptura. Na abordagem aberta o segmento arterial é removido e substituído por uma prótese que é posteriormente fixada através de uma anastomose termino-terminal por sutura. As próteses podem ser tubulares no caso anastomoses término-terminais restritas à aorta ou bifurcadas quando se realiza uma anastomose entre a aorta e as artérias ilíacas(Mitchell. et al., 1995). A reparação endovascular de aneurisma de aorta abdominal é uma alternativa menos invasiva e menos dispendiosa em relação à cirurgia aberta. A taxa de sucesso de curto prazo para a correcção de aneurisma pela técnica endovascular varia entre 83% e 95%(Greenhalgh, et al., 2004). As taxas de morbidade e mortalidade a curto prazo da terapêutica cirúrgica endovascular apresenta, em muitos estudos melhores resultados do que a cirurgia abdominal aberta (Prinssen et al., 2004). Para os pacientes que apresentam um elevado risco para a cirurgia aberta, a taxa de mortalidade a curto prazo é significativamente menor com o tratamento endovascular (Teufelsbauer et al., 2002). 7.Enxertos vasculares. Um enxerto vascular tem como finalidade substituir um segmento de um vaso ou contornar o seu fluxo através de um procedimento de bypass ou revascularização. Outra aplicação muito comum dos enxertos vasculares prende-se com a realização de fístulas REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 83 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP arteriovenosas em pacientes sujeitos a hemodiálise. A maioria dos enxertos são produzidas sinteticamente (próteses), mas os enxertos autólogos e alloenxertos são utilizadas frequentemente em aplicações clínicas (Teebken & Haverich, 2002). Os polímeros sintéticos ideais (Tabela 1) para esta aplicação devem apresentar propriedades químicas e mecânicas próximas do tecido nativo, assim como demonstrar resistência à biodegradação e trombose. Os materiais mais comumente utilizados incluem o polietileno de tereftalato (comercializado com a denominação DacronTM), o politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), e mais recentemente, de poliuretano (van Lith R & Ameer, 2011). O DacronTM e o ePTFE têm sido bem sucedidos em próteses vasculares de grande (ID> 10 mm) e médio ( ID = 6-10 mm) diâmetro interno (ID) (Walpoth & Bowlin, 2005). No entanto, nas próteses de pequeno diâmetro (ID <6 mm) fabricadas com os mesmos materiais falham 5-10 anos após a implantação(Lytle, 2004), devido à estenose do lúmen provocado por trombose (Gorbet & Sefton, 2004a) e hiperplasia da íntima (Lytle, 2004). Actualmente, os autoenxertos são a primeira escolha para a realização de anastomoses vasculares em vasos de pequeno calibre, mas há cerca de 30 % de casos em que esta opção cirúrgica não pode ser realizada devido a cirurgia anterior, a doença arterial periférica ou a variações anatómicas individuais(Nomi et al., 2002). O grande foco da investigação actual em cirurgia vascular está a ser conduzida pela necessidade de enxertos vasculares de pequeno diâmetro (< 6mm) altamente resistentes tanto a trombose e hiperplasia da íntima. 7.1. Enxertos vasculares autólogos. Os enxertos vasculares autólogos incluem enxertos venosos e arteriais. A utilização de enxertos venosos foi testada experimentalmente pela primeira vez por Carel e Guthrie em 1906(Carrel A & Guthrie CC, 1906). Apesar dos excelentes resultados na reconstrução arterial em termos de taxa de permeabilidade, o seu uso enquanto enxerto só foi retomado a partir do final da década de 40 do século XX. Os enxertos venosos utilizam preferencialmente a veia safena magna, sendo o procedimento padrão para revascularização do membro inferior, distalmente ao joelho. Para bypass coronários os enxertos venosos baseados na veia safena são apenas superados pelos enxertos arteriais autólogos (ex: artéria mamária interna esquerda) por apresentarem uma taxa de oclusão superior aos enxertos arteriais(Desai, Cohen, Naylor, & Fremes, 2004b; Goldman et al., 2004). Os enxertos venosos quando comparados com as próteses vasculares sintéticas na revascularização distal ao joelho apresentam uma taxa de permeabilidade de 73%, bastante superior aos resultados observados para prótese de ePTFE (47%) e REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 84 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Dacron (54%)(Mamode & Scott, 2000). Proximalmente ao joelho, os enxertos venosos são utilizados para revascularização femuro-poplítea com resultados de taxa de permeabilidade de longo prazo superiores às próteses artificiais(Twine & McLain, 2010). As veias quando implantadas na circulação arterial sofrem uma adaptação funcional e estrutural que se caracteriza por um espessamento compensatório de todas as camadas da parede, por síntese de matriz extracelular em resposta ao aumento da tensão tangencial que a longo prazo podem levar a obstrução por hiperplasia da íntima (Dobrin et al., 1989; Morinaga et al., 1985). A hiperplasia da íntima a par da fibrose causada pela aterosclerose são complicações de longo prazo que podem levar à estenose com uma incidência de 20 a 25% ao fim de 8 a 15 anos de implantação(Berceli , 2010). A formação de aneurisma é outra das complicações que pode ocorrer a longo prazo com uma incidência de 10 a 20%(Berceli , 2010). Com o objectivo de suportar a parede externa dos enxertos venosos foram desenvolvidas redes permanentes ou biodegradáveis (Longchamp et al., 2014; Blakemore & Voorhees, 1954). Os enxertos arteriais autólogos apresentam as melhores performances funcionais e estruturais para a substituição vascular arterial. No entanto, em alguns pacientes ou em determinadas situações clínicas não estão disponíveis segmentos arteriais com um diâmetro e comprimento suficientes para reconstruir defeitos, concretamente em reconstruções arteriais de grande calibre. No procedimento de bypass aorto-coronário, o uso de enxertos arteriais representa o estado da arte e estão descritas a utilização da artéria mamária interna (Goldman et al., 2004), da artéria radial (Desai, et al., 2004a) e da artéria torácica interna(Sabik, et al., 2005). Em todos os estudos de longo e curto prazo os enxertos arteriais apresentam taxas de permeabilidade mais elevadas do que enxertos venosos autólogos e próteses sintéticas(Hanna et al., 1983; Desai et al., 2004b; Sabik, et al., 2005; Goldman et al., 2004; Lytle, 2004). Existem outros enxertos autólogos derivados de pele, pericárdio, fáscia e intestinos que foram testados experimentalmente em animais. No entanto, durante o período experimental foram evidenciados duas complicações que desencorajaram o seu uso em condições de pressão e fluxo elevado, nomeadamente a trombose precoce (48 horas pós-implantação) e a formação de aneurismas com subsequente rotura a longo prazo (Teebken & Haverich, 2002). REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 85 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 7.2. Enxertos vasculares homólogos (alloenxertos) e heterólogos (xenoenxertos). A utilização de enxertos vasculares heterólogos ou xenoenxertos foi inicialmente tentada por Rosenberg et al em 1963(Rosenberg et al., 1966). Um elevado número de complicações como trombose, aneurismas e infecções foram reportadas, desencorajando o seu uso para reconstruções arteriais. Os enxertos heterólogos de suínos e bovinos foram os únicos até ao momento a ser utilizados. Pretende-se com estes enxertos implantar uma estrutura descelularizada com a arquitectura de matriz extracelular que progressivamente vai ser repovoada com células nativas dando-se a biointegração. Para ultrapassar a rejeição por parte do sistema imunitário do receptor, estes enxertos eram sujeitos a procedimentos de descelularização. Na transplantação de tecidos de suíno para humanos, para o seu sucesso, considerou-se necessário a diminuição do principal antigénio, o epítopo 1-3 α-galactosil. A modificação genética de células ou tecidos, a imunossupressão temporária e a repopulação in vitro com células autólogas são estratégias adoptadas para melhorar a sobrevivência do enxerto. Os xenoenxertos preparados a partir da artéria carótida, veia mesentérica ou ureter de bovinos têm sido utilizados para a preparação de fístulas arteriovenosas de acesso a hemodiálise e para a revascularização femuro-poplítea. Contudo, os resultados funcionais obtidos até ao presente evidenciaram taxas de permeabilidade muito baixas (16% e 26%, 1 mês e 14 meses pós-implantação respectivamente), uma incidência de 6% para aneurismas e uma incidência de infecções do enxerto de 6% a 7%, quando utilizados para procedimentos de revascularização infrainguinal tem limitado a sua utilização a pacientes de baixo risco [41]. As taxas de permeabilidade primária utilizando a veia mesentérica bovina (Procol) enxerto utilizado para a reconstrução infrainguinal foi de 0% a 3 meses numa pequena série de pacientes relatados por Kovalic et al.(Kovalic, Beattie, & Davies, 2002). A utilização de xenoenxertos bovinos incluiu também o uso de ureteres bovinos descelularizados. Actualmente, este xenoenxerto tem sido utilizado para a realização de fístulas arteriovenosas (SynerGraft model 100) para acesso a hemodiálise(Chemla & Morsy, 2009). Os resultados da avaliação funcional são inferiores às próteses artificiais, existindo estudos onde as taxas de permeabilidade são baixas (28% e 29% ao fim de um ano)(Chemla & Morsy, 2009; Darby, et al., 2006) contrariando os resultados obtidos em REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 86 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP cenários experimentais(Matsuura et al., 2004). Nos ureteres bovinos enquanto xenoenxertos os resultados funcionais pobres devem-se em parte, a uma incompleta descelularização que pode estimular a sua rejeição pelo sistema imunitário levando à formação de aneurismas, trombos vasculares e estenose(Kingston, Darby, & Roberts, 2009; Spark, et al., 2008). Clinicamente, este tipo de enxertos falhou também em procedimentos de revascularização infra-inguinais apresentando uma elevada formação de aneurismas (Tolva et al., 2007). O uso de xenoenxertos de artéria carótida de bovinos para fístulas arteriovenosas de hemodiálise tem diversas vantagens tais como a sua disponibilidade, facilidade de implantação e adequação para acesso imediato após a implantação. Os xenoenxertos bovinos demonstraram taxas de permeabilidade de 76%, 69%, 63% e 51% em 1 a 4 anos (Brems, Castaneda, & Garvin, 1986). Em contraste, Mehta relatou uma taxa de permeabilidade primária de 16% e uma taxa de permeabilidade secundária de 39% para artéria carótida bovina num período de 3 anos(Mehta, 1991). Os enxertos vasculares homólogos ou alloenxertos estão disponíveis para utilização clínica na forma criopreservada ou como veia umbilical humana descelularizada. Os enxertos venosos e arteriais criopreservados são actualmente utilizados para substituição arterial na ausência de enxertos autólogos ou na presença de infecção. Os tecidos venosos e arteriais recuperados a partir de dadores de órgãos são esterilizados com antibióticos em meio de cultura e armazenados em azoto líquido a -120°C a -196°C imersos em solução de dimetilsulfóxido a 15%-20%. A criopreservação não altera a integridade estrutural, a capacidade de crescer em meios de cultura de células, ou a capacidade de produzir prostaciclina nos vasos criopreservados. O reconhecimento da imunogenicidade dos enxertos criopreservados levou ao desenvolvimento de versões descelularizadas deste tipo de enxertos que induzem a produção de níveis mais baixos de anticorpos contra o antigénio leucocitário humano (ALH) da classe I e II(Hawkins et al., 2003). Os enxertos criopreservados na versão arterial ou venosa têm sido usados em diversas aplicações. No entanto, na prática clínica os enxertos arteriais criopreservados (EAC) utilizam-se principalmente para a reconstrução arterial em locais infectados onde previamente estavam próteses artificiais(Berger et al., 2012). Esta utilização concreta aplica-se a localizações periféricas(Castier et al., 2005) ou aórticas(Leséche et al., 2001; REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 87 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Khaladj et al., 2013). Outra da utilização dos EAC está relacionada com a criação de fístulas arteriovenosas em pacientes hemodialisados, onde os resultados obtidos para taxas de permeabilidade e complicações associadas não foram superiores aos materiais correntemente utilizados (ePTFE) (Madden, et al., 2005). Os enxertos venosos criopreservados foram também utilizados para revascularizações arteriais infra-inguinais quando os enxertos venosos autólogos (EVA) não estavam disponíveis (Farber & Major, 2004). A taxa de permeabilidade dos EVA é no entanto demasiado baixa (30% ao fim de um ano) para uma utilização corrente devendo-se utilizar este recurso terapêutico quando estiverem cumpridos dois critérios; ausência de enxertos autólogos e infecção do local de implantação (Farber et al., 2003). A veia umbilical humana (VUH) é preparada a partir de cordões umbilicais colhidas na sala de parto e preparado e reticulada com glutaraldeído(Schoen & Padera, 2013). As proteínas solúveis e excesso de gel de Wharton, são extraídos com etanol, uma malha de Dacron pode ser aplicada na superfície externa servindo de suporte para reduzir o risco de dilatação aneurismal. Os enxertos de HUV são actualmente usados para revascularizações femuro-poplíteas(Neufang et al., 2007a) ou tibiais(Neufang et al., 2007b; Nevelsteen, et al., 1986) sendo também utilizadas para a formação de fístulas arterio-venosas de acesso à diálise(Dardik, Ibrahim, & Dardik, 1976; Berardinelli, 2006). Os enxertos de HUV podem igualmente serem utilizados para reconstrução de segmentos arteriais ou venosas (Khodadadi, Golcman, & Milleritzky, 1980) em situações traumáticas ou relacionadas com excisão de tumores abdominais(Gunasekaran, Mosna, & Savino, 2013). Relativamente, às fístulas arterio-venosas os resultados das taxas de permeabilidade e de infecção exibidos pela VUH não demonstraram uma superioridade funcional relativamente às próteses artificiais sendo o seu uso abandonado(Wellington, 1981). No que diz respeito as revascularizações, os resultados obtidos por estudos recentes em larga escala demonstraram que nesta função particular as taxas de permeabilidade primárias ao fim de um ano são semelhantes (74% vs 84%) ás das próteses sintéticas de ePTFE e Dacron apresentando-se como uma alternativa viável ao uso de enxertos autólogos de veia safena (Scharn et al., 2008; Neufang et al., 2007b). Uma das principais complicações relacionadas com a utilização de VUH está relacionada com a formação de aneurismas (Strobel, et al., 1996). No entanto a introdução de malhas de Dacron nestes enxertos e uma fixação melhorada com gluteraldeído estabilizaram a parede reduzindo a REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 88 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP incidência desta complicação de valores na ordem de 37% (Sommeling, Buth, & Jakimowicz, 1990) para uma incidência de 17%(Strobel et al., 1996). 7.3. Próteses vasculares sintéticas. A ideia de um substituto sintético dos vasos sanguíneos tem mais de 500 anos desde que Vesalius substituiu experimentalmente segmentos arteriais em animais por segmentos de caules vegetais. No início do século XX foram desenvolvidas numerosas tentativas utilizando diversos materiais para a produção de uma prótese vascular sintética sem sucesso. A limitada disponibilidade de enxertos homólogos e autólogos levou a desenvolvimento de próteses vasculares sintéticas a partir da 2ª metade do século XX. Apesar de haver uma multiplicidade de materiais testados para o uso de próteses sintéticas apenas três biomateriais atingiram na actualidade a fase comercial da produção o politereftalato de etileno (PET) também conhecido pelo seu nome comercial Dacron, o politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) e o poliuretano (PU). Como já referido anteriormente, a performance funcional destes biomateriais em próteses vasculares de pequeno diâmetro (< 6mm) é inferior aos enxertos vasculares autólogos, daí que não sejam as primeiras escolhas terapêuticas. Apesar de ainda não ter sido desenvolvida uma prótese vascular sintética com um desempenho superior às próteses, as propriedades ideias de uma prótese vascular foram definidas ao nível da interacção com o sangue, ao nível das características mecânicas e de biocompatibilidade (Tabela 1). Tabela 1 – Características ideias de uma prótese vascular sintética (adaptado de (Teebken & Haverich, 2002) Não tóxico Resistente a hiperplasia da neoíntima Fácil de fabricar Resistente à infecção Não carcinogénico Facilmente disponível em vários diâmetros e comprimentos Não trombogénico Complacente Flexível,elástico e resistente á compressão Não irritante para os tecidos Opcionalmente poderá ter a capacidade e libertar fármacos Fácil de suturar REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 89 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 7.3.1. Politetrafluoroetileno expandido (ePTFE). O PTFE foi inicialmente patenteado em 1937 pela empresa DuPont como Teflon para o isolamento eléctrico. Em 1969, Gore patenteou o ePTFE (Gore-Tex®) que é o material utilizado no fabrico de próteses vasculares. O ePTFE é fabricado por processos de fusão, de estiramento e extrusão que resulta num biomaterial material microporoso mais compatível com adesão firme dos tecidos envolventes quando implantado. A molécula ePTFE é bioestável e não sofre degradação biológica no corpo(Xue & Greisler, 2003). Em 1973, o ePTFE foi o primeiro material sintético a ser utilizado especificamente a ser utilizado para o acesso vascular (Matsumoto, Hasegawa, Fuse, Yamamoto, & Saigusa, 1973). Estruturalmente, as próteses de ePTFE consistem em membranas sólidas, finas de forma irregular alinhadas circunferencialmente, designadas por nós (nodes) ligados entre si por uma dense rede de fibrilhas com um comprimento que varia entre 1 e 100 µm. A porosidade das próteses de ePTFE é definida com base na distância entre os nós e existem dois tipos de próteses com base neste critério, ePTFE de baixa porosidade como distância entre poros de 30 µm e de alta porosidade de 60 µm (Zilla, et al., 2007). Nas próteses de alta porosidade é permitida um crescimento transmural de capilares dos tecidos envolventes em toda a sua espessura(Davids, et al., 1999) As próteses vasculares de ePTFE podem ser fabricadas com parede fina (0,4 µm) ou espessa (0,6 µm). São quimicamente inertes, impermeáveis, resistentes à dilatação circunferencial e apresentam um bom poder de retenção de suturas. Actualmente, existem no mercado diversas próteses vasculares de ePTFE das quais de destacam: a Gore-Tex® que apresenta um envelope externo densamente fabricado com o objectivo de reforçar a parede e reduzir a dilatação pós-implantação. A Impra Carboflo® é a outra prótese de ePTFE que apresenta um revestimento de carbono que aumenta a electronegatividade da superfície luminal, repelindo a adesão plaquetária e diminuindo a formação de trombos. Apesar dos resultados experimentais in vitro e in vivo (Akers et al., 1993; Wang et al., 2009; Tsuchida, et al., 1992) apontarem para um melhor desempenho funcional deste tipo particular de próteses. Os resultados da aplicação clínica são contraditórios. Em procedimentos de revascularização do membro inferior proximais em relação ao joelho demonstrou-se uma taxa de permeabilidade superior das próteses revestidas por carbono em relação às convencionais (Groegler, Kapfer, & Meichelboeck, 2002). No entanto, em revascularizações mais distais dos membros, as próteses revestidas não demonstraram ser estatisticamente superiores às próteses não revestidas relativamente às taxas de permeabilidade primária (33% vs. 30%) e secundária (43 % vs. 38%) ((Kapfer REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 96 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP & Jr., 1970). O ângulo de anastomose deve ser igual a 90º ou mais agudo ainda no sentido do fluxo. Em relação ao ângulo de entrada, embora a esmagadora maioria dos autores considere preferível um ângulo o mais agudo possível, estudos efectuados por Nam e Acland não encontraram diferenças significativas no fluxo em anastomoses T-L efectuadas a 45º e 90º no cão(Nam, et al., 1978). Quanto à forma da arteriotomia a abordagem pode ser por uma fenda longitudinal, transversal, periforme ou elíptica(MacDonald, 2005). Esta última apresenta a vantagem técnica de permitir a identificação e separação dos bordos da arteriotomia resultando numa menor probabilidade de transfixação da parede inferior a quando da sutura. A arteriotomia realizada por fenda longitudinal apresenta algumas vantagens em relação às outras técnicas. O procedimento é simples podendo ser executado com microbisturi num ângulo de 15º a 30º; a fenda pode ser aumentada se necessário ou reparada se demasiado longa já que nenhuma porção da parede arterial é excisada como na técnica clássica(Gu, et al., 2006). Na anastomose T-L, a colocação dos clamps vasculares na artéria receptora obedece a uma sequência, colocando-se o primeiro o clamp distal e só depois o proximal no sentido de promover uma dilatação arterial facilitando o seu manuseamento. Seguidamente procede-se à preensão da parede vascular com uma pinça de microcirurgia e realiza-se uma arteriotomia elíptica ou longitudinal no vaso receptor com microtesoura. A sutura deste tipo de anastomoses segue duas abordagens, sendo a mais vulgarmente utilizada a que consiste na colocação de duas suturas de referência nos dois extremos da arteriotomia suturando posteriormente de forma contínua a parede posterior e anterior; a outra opção consiste na sutura por pontos interrompidos colocados no sentido dos ponteiros de relógio, completando o perímetro da anastomose(Hsu & Hsieh , 2003). A anastomose término-terminal com interdigitação telescópica (Figura 5) (sleeve anastomosis) foi inicialmente descrita por Lauritzen em 1978 consiste em ligar a adventícia do vaso dador (extremidade proximal do vaso) ao bordo do vaso receptor (topo distal do vaso) introduzindo-se no lúmen do vaso como um telescópio sendo a sua fixação efectuada somente por dois pontos de sutura colocados em planos verticais (Lauritzen, 1978). Este trabalho foi realizado inicialmente em artérias femorais de ratos(Lauritzen, 1978) utilizando duas alças de sutura que foram utilizadas como guia e cola de fibrina para reforçar a anastomose. No entanto, em grandes artérias com alto fluxo existe o risco de haver separação da anastomose e mais suturas são necessárias aumentado o risco de estenose Os apoiantes desta técnica evocam várias vantagens: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 97 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP mais rápida de executar, menor dissecção da íntima, altas taxas de permeabilidade, um número baixo de aneurismas repostados no local da anastomose e maior resistência a tensão circunferencial (Zhong, Vaughan , & Bowen , 2003). Recentemente foi reportado uma modificação desta técnica excutada experimentalmente nas artérias carótidas em ovelhas que facilita a sua execução e reduz as complicações verificadas na técnica inicial(Peirovi et al., 2005). Figura 5 – Etapas de realização da anastomose término-terminal com interdigitação telescópica (adaptado de Peirovi et al., 2005). A anastomose término-terminal com ramificação é uma modificação da anastomose término-terminal no qual uma ramificação arterial ou uma veia tributária presente no local da anastomose seleccionado é utilizado como vaso receptor. O vaso dador é anastomosado com a ramificação venosa ou arterial através da técnica de anastomose T- T(Zhong T et al., 2003). As técnicas de cuffing, inicialmente foram adoptadas para prevenir o derrame na área anastomosada. Actualmente porém, temos o conhecimento que as pequenas hemorragias se resolvem sem intervenção do cirurgião e hemorragias maiores podem ser resolvidas com a adição de suturas na camada adventícia(Zhong T et al., 2003). 8.2. Métodos de fixação ou coaptação. Diversos métodos de fixação das anastomoses têm sido descritos na bibliografia ao longo das últimas décadas. Os principais objectivos dos diversos métodos de fixação prendemse com a rapidez, simplicidade de execução sem baixar as taxas de permeabilidade reduzindo por isso o risco de trombose intravascular. Os métodos de fixação devem ter REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 98 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP em conta os três principais factores (tríade de Virchow) que levam á trombose vascular nomeadamente o baixo fluxo sanguíneo, a lesão na parede vascular e as alterações nos constituintes celulares do sangue de modo a reduzir ao mínimo as complicação associadas a estas metodologias. Os métodos de fixação das anastomoses dividem-se: anastomoses por sutura, técnicas de laser, electrocoaptação, dispositivos mecânicos e colas e adesivos anastomóticos. As anastomoses por sutura são o método de fixação mais utilizado existindo no entanto variações no material de sutura utilizado e nos métodos de colocação das suturas. Os materiais de sutura têm evoluído ao longo dos anos com o refinamento das técnicas de anastomose tornando-se cada vez mais finos. Os biomateriais Nylon (nome genérico que incluem a família dos polímeros poliamidas) a par do polipropileno e do Dacron são os mais utilizados em anastomoses vasculares devido á sua facilidade de uso, a força tênsil satisfatória para aguentar a tensão circunferencial provocada pelo pressão arterial pulsátil e pela baixa reacção inflamatória desencadeada por estes biomateriais. As desvantagens destes materiais de sutura relacionam-se com a segurança dos nós que são considerados menos seguros, quando comparados com os fios de sutura multifilamentosos(Zhong, et al., 2003). Outro aspecto de importância na selecção e desenvolvimento dos materiais de sutura vasculares, é a dimensão da agulha que deve ser o menor possível para não provocar um orifício demasiado grande que gera maior hemorragia e que causa igualmente mais danos na íntima promovendo a trombose vascular(Pitt & Humphries, 1982). Adicionalmente, a agulha deve ter uma ponta aguçada, um corpo de secção circular e a transição para o fio deve ser suave. Antecedendo a sutura, os topos de anastomose devem ser aproximados até se tocarem sem tensão para que os tecidos entrepostos entre as suturas não fiquem estrangulados (Zhong, et al., 2003).Em relação a técnica de sutura, esta deve ser executada com o menor número de suturas possível para assegurar a impermeabilização da anastomose. O espaçamento aconselhado entre suturas deve ser uniforme e não dever ser inferior a 0,3 mm(Hayhurst & O'Brien, 1975). A adesão a este princípio reduz a incidência de necrose da média e de oclusão do vaso. A sutura deve passar por todas as camadas porque causa menos danos na média e íntima do que as suturas colocadas parcialmente na parede do vasos. A técnica de sutura é um factor critico para a taxa de permeabilidade da anastomose. Uma má técnica de sutura pode causar estenose do lúmen no local de anastomose, distorcendo a parede do vaso e aumentado a probabilidade de trombose vascular. Para contornar o problema da distorção durante a sutura, Harashina reparou que duas ou três últimas suturas são fundamentais para o sucesso da anastomose pela influência que tem REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 99 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP na distorção do vaso deixando por isso estas suturas sem nó até que as suturas estejam colocadas na totalidade(Harashina, 1977). O fio de sutura utilizando em anastomoses vasculares deve ter o menor diâmetro possível, recorrendo-se ao fio 10/0 ou 9/0 USP para microanastomoses vasculares e 7/0 e 6/0 para vasos de médio e grande calibre respectivamente(Zhong T et al., 2003). O laser foi outra das técnicas utilizadas para a fixação de anastomoses vasculares. Os feixes de laser induzem necrose de coagulação por energia térmica nos locais de anastomose evitando o recurso a suturas. Estudos histológicos referem que o processo de cicatrização não é diferente de outras técnicas de anastomose(Bailes, et al., 1987). Apresenta também outras vantagens em relação às suturas nomeadamente a rapidez no uso, a ausência de trauma pela passagem da agulha, a ausência de suturas no local da sutura previne a formação de reacção de corpo estranho e menos variação de resultados por diferentes níveis de experiência dos cirurgiões(Zhong, et al., 2003). Diversos tipos de feixes de laser tem sido investigados para aplicação em anastomoses de artérias de pequeno calibre sendo os mais utilizados o Neodymium: yitrio-alumínio-garnet (YAG)(Jain, 1990) e o laser de CO2 (Wolf-de Jonge, et al., 2008)com resultados comparáveis as anastomoses por sutura (Basu et al., 1988; Quigley, et al., 1986). Uma das principais desvantagens pela utilização de laser consiste na formação de aneurismas no local da anastomose(Wolf-de Jonge et al., 2008; Wolf-de Jonge, Beek, & Balm, 2004). A electrocoaptação é uma técnica de anastomose em que o princípio subjacente consiste em provocar uma aderência por coágulos localizados na anastomose através da passagem de corrente eléctrica de alta frequência no tecido com fórceps eléctricos bipolares(Zhong et al., 2003). A grande desvantagem desta técnica prende-se com a determinação da corrente necessária para provocar a quantidade certa de coagulação(Zhong et al., 2003). Por essa razão o seu uso permanece restrito a cenários experimentais. Os dispositivos mecânicos de anastomose têm sido investigados como alternativa as suturas vasculares clássicas com o intuito de evitar as consequências no crescimento e distensão vascular após a anastomose. O uso destes dispositivos mecânicos ainda não foi generalizado à prática cirúrgica. Em estudos experimentais o seu uso demonstrou a capacidade de produzir anastomoses vasculares com rapidez e com segurança. No entanto, o seu uso é tecnicamente difícil e requere treino e uma aprendizagem lenta. No REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 100 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP caso particular dos dispositivos acopladores, estes são demasiados grandes para serem manipulados por baixo do microscópio cirúrgico. Outra das desvantagens é que necessitam de demasiado tecido vascular para uma boa eversão na anastomose. Este sistema pode ser adequado para anastomoses venosas T-T mas, para as anastomoses arteriais, revela-se pouco eficaz, já que a maior parte da espessura da parede arterial e consequente dificuldade de eversão apresenta-se como a principal desvantagem para o seu uso. Existe apenas um dispositivo acoplador disponível comercialmente da empresa 3M, tendo sido reportado o seu uso com sucesso em anastomoses microvasculares (Shindo, et al., 1996; Ahn, et al., 1994) e em anastomoses venosas (Denk, et al., 1995). De entre os dispositivos mecânicos, os agrafes vasculares são os que apresentam melhor facilidade de exequibilidade para substituir as suturas clássicas mas apenas para vasos de maior calibre, pois não estão adaptados para pequenas artérias. Outras desvantagens incluem a necessidade de vasos normais com segmentos livres relativamente longos para permitir a eversão dos topos vasculares e com o facto de serem demasiado largos para permitir as anastomoses sob o microscópio cirúrgico(Leppaniemi et al., 2000). Experimentalmente têm sido testados clips vasculares com objectivo de reduzir o tempo da sutura das anastomoses. Estes dispositivos demonstraram uma performance funcional e estrutural semelhante às suturas de polipropileno em anastomoses vasculares(Caiati, et al., 2000; Calles-Vazquez, et al., 2007). Para minimizar as tromboses vasculares decorrentes da hiperplasia da íntima que ocorre no local de anastomose por suturas foram desenvolvidos anéis vasculares em titânio que são suturados em conjunto com os topos vasculares aumentado o diâmetro do lúmen entre 20% a 50%(Wei, et al., 2009).Em anastomoses arteriovenosas realizadas com este tipo de técnica em coelhos verificou-se uma melhor taxa de permeabilidade (100%) às 12 semanas quando comparado com a anastomose por sutura clássica (75%) O exame histológico revelou também que a espessura da íntima era menor no grupo experimental que recebeu o anel de titânio inferindo-se que a interposição deste anel causando a dilatação da anastomose T-T previne a estenose do lúmen a longo prazo (Karamursel et al., 2001). Na prática clínica este dispositivo foi já introduzido em anastomoses aorta-aórtica e aorta-coronária com bons resultados(Wei, et al., 2009). Um grande número de colas e adesivos tecidulares tem sido desenvolvidos para aplicação em microcirurgia. Entre os adesivos e colas tecidulares mais utilizados encontramos as resinas de poliuretano, o cianoacrilato (Saba, et al., 2007; Gürhan Ulusoy, et al., 2009; Akhtar, 2010; Lumsden & Heyman, 2006) e a cola de fibrina (Cho & REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 101 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Júnior, 2008; Cho, et al., 2009). A cola de fibrina mimetiza as etapas finais da cascata de coagulação para produzir um coágulo de fibrina fisiológico (Spotnitz, 2001) O uso da cola de fibrina em anastomoses microvasculares foi iniciado por Pear et al em 1977 (Pearl, et al., 1977). O seu uso apresenta diversas vantagens como a simplicidade da técnica, a rapidez na execução com consequente redução no tempo da anastomose e permite reduzir o número de suturas a colocar na microanastomose (Cho & Júnior, 2008). Apesar das vantagens, as taxas de permeabilidade são semelhantes nas anastomoses produzidas por técnicas convencionais de sutura (Cho & Júnior, 2008). Os cianoacrilatos são adesivos formados pela polimerização de monómeros de cianoacrilato, quando em contacto com a água, soro fisiológico ou uma base fraca(Zhong T et al., 2003). Apesar de serem eficazes na fixação de anastomoses vasculares (Lumsden & Heyman, 2006; Saba et al., 2007; Gürhan Ulusoy et al., 2009; Akhtar, 2010), o seu uso clinico mais generalizado, tem sido evitado devido a dados controversos no que diz respeito à sua biocompatibilidade e consequente capacidade para gerar reacções inflamatórias(Zhong, et al., 2003). No entanto, têm sido desenvolvidos cianoacrilatos como o etilo 2-cianoacrilato com melhor perfil de biocompatibilidade (Kaplan, et al., 2004; Kaplan, et al., 2004; Kaplan & Baysal, 2005) 9. Engenharia de tecidos em investigação de cirurgia vascular. Ao fim de décadas de investigação, ainda não foi desenvolvida uma prótese sintética de baixo diâmetro (PSBD)( <6 mm) com uma performance funcional e estrutural que consiga ultrapassar os principais problemas colocados pela implantação destas próteses, nomeadamente a trombose vascular aguda, a hiperplasia da íntima nos locais de anastomose, a formação de aneurisma e a infecção(Kakisis, et al., 2005). A velocidade do fluxo sanguíneo nos vasos de pequeno calibre coloca uma série de desafios no desenho de próteses biológicas ou sintéticas não encontrados na produção de substitutos arteriais de elevado calibre (ID=10 mm), onde as próteses sintéticas de Dacron e ePTFE obtiveram um elevado sucesso. Embora os enxertos venosos e arteriais autólogos sejam a primeira escolha terapêutica, muitos pacientes não apresentam vasos adequados por doença arterial periférica, por amputação ou por colheita prévia. Adicionalmente, esta estratégia terapêutica requere uma segunda intervenção cirúrgica para obter o enxerto autólogo. Daí que a engenharia REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 102 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP de tecidos (ET) tenha emergido como uma opção para a produção de vasos de pequeno diâmetro que apresentem características que ultrapassem os problemas referidos anteriormente para as próteses sintéticas. O objectivo da engenharia de tecidos consiste na produção de um vaso sanguíneo artificial estável e funcional que não contém qualquer material sintético (Isenberg, Williams, & Tranquillo, 2006). Para conseguir este objectivo, diversos investigadores exploraram o uso de células de tecido arterial ou venoso combinada com vários tipos de matrizes de origem biológica ou sintética para construir estruturas tubulares e sujeitá-las a estímulos mecânicos e químicos numa tentativa de desenvolver um enxerto vascular de baixo diâmetro apto para substituir segmentos de vasos com sucesso (Isenberg et al., 2006). A primeira tentativa para o fabrico de um vaso sanguíneo foi conseguida por Weisenberg e Bell em 1986 em que se construiu um tubo de colagénio onde foram cultivadas células endoteliais e musculares lisas que se organizaram respectivamente num endotélio e uma camada muscular funcionais (Weinberg & Bell, 1986). No entanto só doze anos depois, L’Heureux (L'Heureux, et al., 1998) conseguiu produzir um vaso sanguíneo completo, com três camadas funcionais e com a capacidade para suportar uma pressão interna superior a 2000 mmHg, sendo implantado num modelo animal por um período de tempo curto. Mais recentemente, em 2006,(L'Heureux et al., 2006) o mesmo autor conseguiu produzir por ET um vaso completamente funcional com células colhidas em pacientes humanos e testado num modelo animal durante 8 meses com sucesso. Em 2007, o mesmo autor consegui produzir um enxerto arterial autólogo através de ET, para a realização de uma fístula arteriovenosa com o objectivo de construir um acesso vascular de hemodiálise(L'Heureux et al., 2007). Os ensaios clínicos realizados num pequeno número de pacientes (três) demonstraram que é possível manter um vaso produzido por ET permeável por um período superior a 1 ano sem complicações maiores(L'Heureux et al., 2007). No entanto, o primeiro uso clínico de uma construção vascular produzida in vitro utilizando um copolímero de policaprolactona-ácido poliláctico semeado com células (células endoteliais e musculares lisas) colhida de uma veia periférica, foi descrita por Shin'oka et al.(Shin'oka, Imai, & Ikada, 2001) Com o objectivo de reconstruir uma via de saída pulmonar de baixa pressão em pacientes pediátricos com defeito cardíaco congénito na artéria pulmonar. Diversas técnicas foram empregues para o desenvolvimento in vitro, ex vivo (ou in situ) e até in vivo (Daly, Campbell, Walker, & Campbell, 2004) de vasos sanguíneos (Figura 6). REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 103 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP No entanto apenas as técnicas in vitro ou ex vivo (in situ) permitirão uma produção em grande escala Para a produção de vasos sanguíneos por engenharia de tecidos (VSET) foram estabelecidos critérios de design com o objectivo dos vasos produzidos suportarem o exigente ambiente mecânico do sistema cardiovascular. Independentemente do método ou técnica de produção foram estabelecidos os seguintes 3 componentes para que esses critérios se cumpram(Mitchell & Niklason, 2003; Niklason, 1999): i) apresentarem um componente biocompatível com elevada força tênsil que proporciona um suporte mecânico (fibras de colagénio ou análogos); ii) apresentarem um componente elástico biocompatível que proporcione reserva elástica e previna a formação de aneurismas (fibras de elastina); iii) apresentarem um endotélio confluente não activado que previna a trombose intravascular. Existem outros componentes secundários que convêm referir nomeadamente: uma capacidade de regeneração aceitável que não resulte em hiperplasia, em inflamação ou cápsula fibrosa espessa; uma capacidade de biointegração de modo a que o enxerto se torne indistinguível do vaso receptor e exiba propriedades fisiológicas básicas como a vasodilatação e a vasoconstrição e por último a capacidade de suportar uma pressão de burst superior a 1700 mmHg(L'Heureux et al., 2007). Outro aspecto desejável é a disponibilidade “off the shelf”, uma vez que muitos pacientes apresentam afecções que ameaçam a vida e não podem esperar demasiado tempo por estes recursos terapêuticos. Actualmente existem três abordagens principais (Tranquillo, 2002) que permitem produzir VSET que cumprem os critérios acima referidos: tecidos descelularizados, camadas de células ou de tecidos através do método de self assembly e matrizes de hidrogéis ou biopolímeros. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 104 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Figura 6 – Diagrama representativo das diferentes abordagens da engenharia de tecidos para o fabrico de vasos sanguíneos (adaptado de Li, et al., 2014). 9.1.Tecidos descelularizados. Os tecidos descelularizados tem a vantagem de serem inteiramente compostos de matriz extracelular (MEC) dando-lhe numerosas vantagens em termos de biocompatibilidade e propriedades biomecânicas. Ao contrário das outras abordagens, os enxertos vasculares construídos desta forma são implantados sem células partindo-se do pressuposto que são posteriormente colonizados por células autólogas. Estes tecidos podem ter origem vascular ou não vascular. A remoção das células é conseguida através de uma combinação de detergentes, inibidores de enzimas e tampões. Este processo tem impacto na arquitectura do tecido, resultando em diminuição da força tênsil e da complacência(Dahl, et al., 2003a). Uma retracção em relação ao volume original é também observada provavelmente como resultado da remoção dos proteoglicanos pelos detergentes(Dahl, et al., 2003b). Como referido anteriormente, os xenoenxertos processados desta forma tem uma elevada prevalência de formação de aneurismas, infecções e tromboses vasculares sendo o seu uso abandonado(Tolva et al., 2007). Os REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 105 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP enxertos homólogos produzidos por este processo apresentam igualmente uma performance funcional inferior a dos enxertos autólogos e próteses tendo por isso um uso muito restrito(Farber & Major, 2004; Farber et al., 2003) Adicionalmente, a presença de antigenicidade residual pode impedir a sua reendotelização (Sung et al., 1997). Um outro tecido acelular usado em ET com sucesso é a matriz derivada da submucosa do intestino delgado (SIT). A SIT é preparada mecanicamente removendo camadas de mucosa e músculo do intestino delgado, as células são lizadas com uma solução hipotónica para posterior remoção com ácido paracético e um tampão salino(Badylak, et al., 1998). Este processo resulta num material de matriz extracelular composto por aproximadamente 90% de colagénio do tipo I, fibronectina, factores de crescimento, glicosaminoglicanos, proteoglicanos e glicoproteínas(Badylak et al., 1998). A principal vantagem deste material é que promove remodelação e regeneração específica por parte do hospedeiro. Após a implantação ocorre uma rápida neovascularização e infiltração celular pelo hospedeiro, seguido de uma remodelação estrutura e composicional da SIT que pode estender-se até aos 6 meses(Robotin-Johnson, et al., 1998; Padalino et al., 2012). Experimentalmente, num modelo murino foi possível demonstrar uma completa endotelização ao fim de 30 dias pós-implantação(Padalino et al., 2012). A reacção inflamatória produzida pela implantação deste implante é negligenciável considerando-se que os enxertos baseados em SIT são biocompatíveis (Padalino et al., 2012). Uma das principais preocupações relacionadas com utilização deste material para o fabrico de enxertos vasculares prendese com a resistência mecânica in vivo. No referido estudo de Paladino et al(Padalino et al., 2012) observou-se uma ausência de fibras elásticas durante todo o processo de remodelação e integração do enxerto de SIT. A sua ausência é bastante frequente em VSET ou quando presentes não se encontram organizadas possivelmente pela dificuldade das células musculares lisas em sintetizarem fibras de elastina in vitro (Lee, Stolz, & Wang, 2011). As fibras de elastina desempenham um papel fundamental na elasticidade e complacência do vaso e por conseguinte nas propriedades mecânicas dos vasos sanguíneos. Apesar de no modelo murino não se ter observado a formação de aneurismas. Existem relatos de implantação de VSET construídos com SIT em artérias de grande calibre no cão sem formação de aneurismas e com elevadas taxas de permeabilidade(Lantz et al., 1993; Lantz, et al., 1992; Sandusky, Lantz, & Badylak, 1995; Sandusky, et al., 1992; Huynh et al., 1999). Em modelos animais de grande porte (ovelha) pelo contrário foi observado a formação de aneurismas a longo prazo (6 meses) em VSET construídos com SIT por síntese insuficiente de fibras de elastina (Opitz et al., 2004). Tal facto questiona a segurança a longo prazo destas construções para REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 112 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP copolímero de ɛ-caprolactona e L-láctico semeadas com células autólogas colhidas da medula óssea para implantação como um enxerto vascular biodegradável entre a artéria pulmonar e a veia cava superior(Shinoka & Breuer, 2008). Os resultados clínicos da implantação de 23 destes dispositivos demonstraram uma elevada taxa de permeabilidade, registando-se apenas um caso de estenose durante um período de 6 anos. Adicionalmente observou-se uma completa reabsorção do polímero e a sua substituição por neovaso autólogo funcional(Shinoka & Breuer, 2008). 9.4.2.Matrizes de biopolímeros e hidrogéis. O trabalho pioneiro de Weinberg and Bell (Weinberg & Bell, 1986) motivou o desenvolvimento de um enxerto vascular completamente biológico. O conceito de artéria bioartificial(L'Heureux et al., 1993) inclui a formação de um tubo de um biopolímero abundante (o colagénio tipo I ou a fibrina) no organismo compactado com células musculares lisas (CML), onde na superfície luminal são semeadas células endoteliais autólogas. Ambos os biopolímeros, permitem o acolhimento de células durante a fibrilhogénese também conhecido como gelificação tal como ocorre em condições fisiológicas. Como sugerido por L’Heureux é possível condicionar o alinhamento das fibrilhas e das CML aplicando uma restrição mecânica causando compactação. Esta força de compactação produz um alinhamento de circunferencial das fibrilhas e das células comparáveis ao encontrado nas artérias nativas(Barocas, Girton, & Tranquillo, 1998). Para a produção da artéria bioartificial, uma solução de monómeros de colagénio com CML é injectada num bioreactor onde é comprimida em torno de um mandril ou molde tubular. O gel de colagénio semeado com CML comprimido em torno de um mandril não aderente (Teflon) é sujeito a forças de tracção para formar uma construção equivalente à média que pode ser subsequentemente endotelizada para formar a artéria bioartificial. No entanto, o alinhamento circunferencial das fibras não conseguiu produzir um vaso bioartificial com uma força mecânica para suportar uma pressão arterial fisiológica (Hirai & Matsuda, 1995). Devido à facilidade de fabrico foram criados hidrogéis usando fibrina (Grassl, Oegema, & Tranquillo, 2003) ou uma mistura de fibrina e colagénio(Rowe, Lee, & Stegemann, 2007; Rowe & Stegemann, 2006) resultando numa melhoria da resistência mecânica da construção e no aumento da produção de colagénio pelas CML e fibroblastos encapsulados neste hidrogel ao contrário do que acontece no hidrogel de colagénio(Clark, et al., 1995). Apesar do tecido vascular baseado na fibrina apresentar REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 113 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP propriedades mecânicas superiores é necessário a incorporação de ácido ɛaminocaproico para prevenir a degradação proteolítica, para melhorar a compactação e a resistência deste hidrogel(Rowe et al., 2007). Devido à falta de capacidade dos hidrogéis para suportarem a pressão arterial diversas estratégias foram adoptadas para melhorar as suas propriedades mecânicas. A incorporação de membranas de Dacron na construção do hidrogel(Weinberg & Bell, 1986) e a reticulação através de agentes não citotóxicos(Orban et al., 2004) foram usadas para melhorar a resistência mecânica dos hidrogéis. 10. Modelos experimentais e métodos de pesquisa em cirurgia vascular. Os modelos animais que utilizam grandes animais domésticos têm sido utilizados para a avaliação funcional de dispositivos cardiovasculares e respectivos biomateriais, porque apresentam uma maior semelhança com a anatomia e fisiologia ao contrário do que ocorre com outros modelos experimentais que utilizam animais de pequeno porte como ratos e coelhos. Classicamente, os modelos experimentais em cirurgia vascular utilizavam grandes animais de espécies como o babuíno, a ovelha, o porco e o cão. Estas espécies apresentam grandes vasos com um calibre que permitem a implantação vascular de próteses vasculares de 3 a 6 mm de ID podendo chegar-se até a implantarse próteses com um calibre de 8 mm na aorta abdominal.(Byrom, et al., 2010). Os modelos animais são extremamente úteis na avaliação pré-clínica dos biomateriais e respectivos dispositivos cardiovasculares e são a última etapa da investigação antes dos estudos clínicos em humanos. O objectivo dos ensaios pré-clínicos das próteses vasculares é avaliar as características da prótese que são difíceis senão impossíveis de conseguir utilizando os testes in vitro. A capacidade da prótese manter a sua permeabilidade, a biocompatibilidade da prótese e as características de manuseamento (ex: facilidade de sutura) são aspectos que são apenas possíveis de avaliar nos ensaios pré-clínicos in vivo. Os ensaios pré-clínicos podem ser de curta duração (menos de 20 semanas) ou de longa duração(Bianco et al., 2013a). Os critérios internacionalmente aceites param testagem in vivo de próteses vasculares estão reunidos em normas. Sendo as normas ISO as mais consensualmente aceites pela comunidade científica. Estas normas conferem linhas orientadoras para os ensaios in vivo. Destas linhas orientadoras destacam-se a necessidade de utilizar pelo menos 6 animais em ensaios não inferiores a REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 114 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 20 semanas e a obrigatoriedade de utilização de um grupo controlo onde se implanta um biomaterial de referência (ISO, 1994). A permeabilidade das próteses dever ser avaliada utilizando angiografia ou ecografia em modo Doppler (Figura 7), (ISO, 1994). Posteriormente deve haver um estudo patológico das próteses explantadas (ISO, 1994). Figura 7 – (A) Monitorização funcional da prótese vascular de PVA/Dx em ovelha, (B) aspecto de ecografia modo Doppler da prótese de PVA/Dx implantada na artéria carótida comum. O porco e o cão foram inicialmente muito utilizados em investigação relacionada com a cirurgia vascular devido a vários factores anatómicos e fisiológicos. Nomeadamente, o porco apresenta uma circulação coronária semelhante ao homem o que faz deste animal um modelo ideal para estudar a lesões de isquémia/reperfusão do miocárdio e a colocação de diversos modelos de stents coronários (Bianco et al., 2013b). No entanto, apesar da morfologia arterial ser semelhante ao homem, a sua utilização para testagem in vivo de próteses vasculares tem sido abandonada pela menor dimensão dos vasos e pela maior fragilidade dos mesmos. Adicionalmente são animais difíceis de manterem devido à sua agressividade e ao facto de atingirem aos 6 meses pesos na ordem dos 80- 100 Kg(Bianco et al., 2013b). Devido aos factos referidos anteriormente, o porco tem vindo a ser substituído pela ovelha como modelo de testagem de próteses vasculares. Historicamente, o cão foi muito utlizado como modelo experimental em cirurgia vascular. O cão é um animal geralmente familiarizado com os seres humanos, tornando-os fáceis de manusear, adicionalmente a sua manutenção é fácil e barata. A fisiologia cardiovascular é semelhante à dos seres humanos, e possuem uma baixa quantidade de gordura corporal o que torna o acesso vascular relativamente simples. As artérias periféricas neste animal estão disponíveis em diâmetros de 3 a 5 mm, e a aorta pode A B REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 115 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP acomodar enxertos vasculares de interposição até 8 mm de diâmetro (Bianco et al., 2013b). Os cães também são tolerantes a anestesia prolongada. O cão enquanto modelo para testagem de próteses vasculares tem apresentando desvantagens do ponto de vista anatómico e fisiológico que tem levado a sua substituição pela ovelha. Nomeadamente, ao nível das propriedades visco-elásticas dos vasos, as artérias são mais elásticas do que no homem e não demonstram o aumento da rigidez da parede que se verifica no homem com o avançar da idade. É também observada uma grande variabilidade entre indivíduos no que concerne a interacção das plaquetas com os biomateriais (Jones et al., 1991). Relativamente ao seu sistema de coagulação verificou-se que este se apresenta fisiologicamente mais afastado dos mecanismos de coagulação do homem, relativamente a outros modelos animais (ovelha e porco)(Byrom et al., 2010). Também os motivos éticos relacionados pela forma diferente com que o cão é visto na sociedade levaram a que o cão fosse progressivamente substituído por outros modelos experimentais. O babuíno é o modelo animal que filogeneticamente mais se aproxima do homem e por essa razão é o animal mais utilizado para estudos de hemocompatibilidade de superfícies. Este modelo animal é utilizado especificamente para estudos de avaliação de endotelização de próteses vasculares colocadas nas artérias ilíacas e aorta(Clowes et al., 1985; Clowes, Kirkman, & Clowes, 1986) e também para os estudos de trombogenicidade aguda através de estudo de imagem das plaquetas radiomarcadas que aderem á superfície(Christenson et al., 1983). O babuíno tal como outras modelos animais de grande porte (ovelha, porco e cão) foi utilizado para estudar a patogénese da hiperplasia da íntima (Sarkar, et al., 2006). A ovelha é um dos modelos animais mais amplamente utilizados para a avaliação de dispositivos cardiovasculares e serviu durante décadas como modelo experimental padrão para a investigação utilizando válvulas cardíacas bioartificiais. A ovelha enquanto modelo experimental apresenta numerosas vantagens que incluem um baixo custo de manutenção, a facilidade no manuseamento do animal, apresenta um tamanho adequado e estável ao contrário do suíno bem como vasos periféricos (artéria carótida e femoral) com 4 a 6 mm de ID que podem ser facilmente utilizados para implantação e monitorização funcional de próteses artificiais. A terapêutica de anticoagulação utilizada na ovelha sujeita a cirurgia vascular segue protocolos idênticos aos utilizados em medicina humana. A ovelha pode ser anticoagulada com warfarina e heparin(Park et al., 2003; Connell et al., 2007). No entanto são utilizadas doses mais elevadas devido ao REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 116 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP efeito diluidor que o rúmen exerce sobre os fármacos administrados per os. Nesta espécie a resposta ao clopidogrel(Connell et al., 2007) é modesta e a aspirina só eficaz em inibir a agregação plaquetária se administrada por via endovenosa(Soldani et al., 2010). Hematologicamente, as ovelhas apresentam um sistema de coagulação mais próximo do homem do que o próprio suíno. No entanto há uma tendência para a hipercoagubilidade nos ovinos relativamente aos humanos. Existem igualmente diferenças, nomeadamente as ovelhas apresentam uma concentração superior de plaquetas por unidade de volume de sangue quando comparadas com outras espécies utilizadas em experimentação animal (ex: suíno) e a capacidade de adesão destes elementos celulares é superior na ovelha(Tillman, Carson, & Talken, 1981). O sistema fibrinolítico da ovelha é também menos eficaz do que nas restantes espécies(Karges, Funk, & Ronneberger, 1994). Todos estes factores conjugados conferem uma tendência para a hipercoagubilidade neste modelo animal. Em relação aos outros elementos celulares, os eritrócitos de ovelha são de menores dimensões relativamente aos humanos e a outros modelos animais(Weiss & Wardrop, 2011). Adicionalmente a sua taxa de sedimentação é igualmente inferior devido a ausência de formação de rouleaux nos ovinos. Outra particularidade dos eritrócitos de ovinos é que são osmoticamente mais frágeis do que os correspondentes humanos. Em ovinos, a hemólise inicia-se quando em contacto com soro fisiológico a 0,65% e é total quando contacta com soro fisiológico a 0,40%(Didisheim, 1985) O modelo experimental de interposição de próteses vasculares na artéria carótida em ovinos (Figura 8) apresenta vantagens em relação a outras localizações. A artéria carótida nos ovinos apresenta um diâmetro similar ao dos vasos periféricos em humanos. A localização cervical desta artéria é vantajosa porque é bem tolerada pelo animal e a monitorização funcional da prótese é igualmente fácil devido á posição superficial deste vaso (Soldani et al., 2010; Sardelic, et al., 1994). REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 117 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Figura 8 - Aspecto das estruturas anatómicas identificadas no acesso cirúrgico à artéria carótida comum esquerda (C-carótida, Ca – caudal, Cr - cranial, E-esófago, ET-musculo esterno-cefálico, G-glândula tiróide, T-traqueia, V-nervo vago). Além do mais se ocorrer uma oclusão bilateral das artérias carótidas comuns como complicação da implantação de uma prótese raramente surgem sinais neurológicas devido á particular circulação cerebral da ovelha. Ao contrário da maioria das outras espécies utilizadas em cirurgia experimental, a artéria basilar na ovelha apresenta apenas ligações ténues com as artérias vertebrais que em vez disso comunicam com a porção mais cranial das artérias carótidas comuns por uma anastomose occipitovertebral bem desenvolvida(Baldwin & Bell, 1963b). A partir daqui, o sangue flui cranialmente através da artéria carótida comum externa em cada lado para, eventualmente, atingir o círculo de Willis. O sangue de cada a artéria carótida comum é distribuído unilateralmente pela respectiva área encefálica(Baldwin & Bell, 1963a). A oclusão de uma artéria carótida comum resulta distribuição sanguínea bilateral devido ao fluxo que ocorrer através das anastomoses disponíveis. A oclusão de uma ou ambas as artérias carótidas comuns provoca aumentos de fluxo e pressão na restante artéria carótida comum ou artérias REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 118 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP vertebrais, ou nestas duas estruturas anatómicas(Baldwin & Bell, 1963c; Baldwin & Bell, 1963d). O fluxo da artéria carótida é muito superior (325 ±108 vs 160±70 mL/min) ao fluxo da artéria femoral apesar de apresentarem um diâmetro semelhante(Dunn et al., 1996). Foi também evidenciado que quando se implanta uma prótese na artéria carótida, a redução do fluxo que decorre deste procedimento é superior a que ocorre na artéria femoral, provavelmente devido a maior intensidade do vasoespasmo que ocorre numa artéria muscular como a carótida (Dunn et al., 1996). Adicionalmente, também poderá ocorrer uma maior discordância nos diâmetros quando se aplicam próteses de diâmetro muito reduzido (4 mm) na artéria carótida resultando numa maior redução de fluxo (Dunn et al., 1996). O grau de redução no fluxo que ocorre na artéria carótida tem influência no grau de deposição de fibrinogénio e plaquetas o que pode influenciar negativamente taxa de permeabilidade (Lundell, Bergqvist, & Lindblad, 1993). Por essa razão para este modelo experimental ser válido o fluxo deve ser o mais próximo possível dos valores fisiológicos. A ovelha para além de ser utilizada como modelo experimental para avaliação da trombogenicidade aguda e da taxa de permeabilidade de próteses sintéticas. É também utilizada frequentemente como modelo de desenvolvimento de hiperplasia da íntima através da interposição de próteses vasculares na artéria carótida (Taylor, Fletcher, & Ao, 1996) ou da colocação de remendos(Hawthorne, et al., 2002) de diferentes polímeros sintéticos na artéria carótida por uma técnica de arteriotomia. Uma outra forma de avaliar o desenvolvimento da íntima foi conseguida pela criação de fístula arteriovenosa entre artéria carótida e a veia jugular externa utilizando próteses de diferentes biomateriais. Pretende-se com este modelo (Kohler & Kirkman, 1999) avaliar a hiperplasia da íntima que ocorre rapidamente (em 4 semanas) na porção venosa da fístula de acesso vascular em hemodiálise. A artéria femoral apesar de ter um diâmetro inferior a artéria carótida foi utilizada com sucesso como modelo de avaliação de trombogenicidade aguda (Nazzal, Owunwanne, & Christenson, 1991) e das taxas de permeabilidade(Christenson, et al., 1991). Esta artéria foi também utilizada como modelo experimental, com objectivo avaliar o efeito dos cuffs venosos(Cabrera Fischer et al., 2005) na redução da hiperplasia da íntima na anastomose arteriovenosa que se realizam nas revascularizações femorais. Existem dificuldades inerentes à utilização do modelo da artéria femoral tais como: maior dificuldade no acesso cirúrgico ao vaso pela presença de maiores massas musculares no REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 119 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP local e maior dificuldade de realização de anastomoses com próteses com diâmetro superior a 5 mm(Byrom et al., 2010). 11. Polivinil álcool hidrogel. O polivinil álcool hidrogel (PVA) é um polímero sintético com grupos pendentes - OH. É formado através da hidrólise de grupos de acetato de polivinil acetato que por sua vez é polimerizado a partir de monómeros de acetato de vinil. As principais características que definem o comportamento do PVA são o grau de hidrólise e o grau de polimerização. Ele pode ser utilizado para formar películas, membranas, espumas e hidrogéis na área de engenharia de tecidos, mas também tem várias outras funções, como surfactante ou selante. É solúvel em água sendo a solubilidade dependente do seu peso molecular(Hassan & Peppas, 2000).O PVA pode formar hidrogéis com elevado teor de água através de diferentes métodos de reticulação: na reticulação química utilizam-se agentes químicos como glutarealdeído, formolaldeído, acetaldeído e outros monoaldeídos; a reticulação física dá-se por ciclos de congelamento/descongelamento, irradiação γ e por fotopolimerização (Hassan & Peppas, 2000). Os hidrogéis de PVA apresentam propriedades mecânicas, ópticas e um elevado grau de dilatação na água que os tornam adequados para a engenharia de tecidos(Mangiapia et al., 2007). Apesar de terem a capacidade de reter água, os hidrogéis permanecem insolúveis devido à reticulação física. O método de congelação /descongelação tem uma vantagem importante sobre os métodos químicos de reticulação. Devido à sua natureza puramente física não há risco de libertação dos produtos químicos remanescentes que possam comprometer a biocompatibilidade do hidrogel final. Além disso, os géis formados com este método são altamente elásticos e duráveis, propriedades importantes para o seu uso em engenharia de tecidos. Contudo as propriedades mecânicas dos hidrogéis formados por reticulação física dependem do peso molecular do polímero, da concentração da solução, da temperatura de congelamento e descongelamento e do número de ciclos de congelamento/ descongelamento. No entanto, os hidrogéis de PVA obtidos por reticulação física apresentam algumas desvantagens, como a necessidade de esterilização, o que não é necessário no caso de hidrogéis reticulados por irradiação γ que estão inerentemente estéreis (Hassan & Peppas, 2000). Além disso, na presença dos aditivos macromoleculares naturais, tais REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 120 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP como o quitosano, o dextrano e a celulose bacteriana, o processo de gelificação é diferente porque geralmente esses aditivos não são tão propensos a gelificação como as cadeias de PVA(Liu, et al., 2009a). Isto faz com que a heterogeneidade da estrutura e também a perda rápida dos aditivos que o núcleo de PVA(Mathews, et al., 2008). O PVA tem mostrado ser biocompatível, provocando uma resposta inflamatória mínima após a implantação (Stammen, et al., 2001) como demonstrado pela avaliação de biocompatibilidade realizada no presente trabalho. 10.1. Aplicações biomédicas do PVA. Devido às suas propriedades mecânicas e excelente biocompatibilidade, os hidrogéis de PVA tem diversas aplicações na indústria biomédica e farmacêutica. No que diz respeito as aplicações biomédicas, os hidrogéis foram utilizadas no fabrico de lentes de contacto (Hyon et al., 1994) e também como matriz de material de pensos (Gonzalez, et al., 2014; Kokabi, Sirousazar, & Hassan, 2007; Liu, et al., 2009b). A capacidade do hidrogel de PVA em reter água a par das suas propriedades viscoelásticas torna este biomaterial semelhante a estruturas anatómicas como o disco intervertebral e o menisco. Aproveitando estas características intrínsecas o PVA foi testado em condições experimentais para a síntese do núcleo polposo de disco intervertebrais prostéticos (Thomas, et al., 2004; Joshi et al., 2006) e meniscos (Kobayashi, Toguchida, & Oka, 2001). No que se refere a aplicações no sistema músculo-esquelético, devido as suas propriedades hidrofilicas e elevada biocompatibilidade foi utilizado para envolver tenodesis de tendões com o objectivo de reduzir as adesões aos tecidos envolventes (Kobayashi, Chang, & Oka, 2005). Outra das aplicações musculo-esqueléticas do PVA prende-se com o seu uso como matriz para a biosíntese de cartilagem(Qu et al., 2011) ou até para substituir defeitos condrais in situ (Sciarretta, 2013). A utilização do PVA como matriz para a manutenção de condrócitos foi também explorada para o fabrico de próteses de septo nasal(Bichara et al., 2010; Bichara DA et al., 2011) Como já referido anteriormente, o PVA é um biomaterial inerte para os tecidos que o envolvem sendo considerado por diversos autores como não irritante(Lamponi et al., 2012; Wang et al., 2008; de Souza Costa-Júnior, Pereira, & Mansur, 2009; Burczak, Gamian, & Kochman, 1996; Elakkiya, et al., 2013), desta forma este hidrogel foi igualmente testado in vitro como substituto do humor vítreo (Lamponi et al., 2012). No que concerne a aplicações experimentais para o sistema cardiovascular pelas suas propriedades viscoelásticas muito semelhantes á matriz extracelular dos tecidos moles foi testada para a produção de REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 121 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP válvulas cardíacas (Wan, et al., 2002) e próteses vasculares (Chaouat et al., 2008). As aplicações farmacêuticas do hidrogel de PVA tem-se concentrado no desenvolvimento de dispositivos de libertação lenta de fármacos tirando partido elevada biocompatibilidade do hidrogel que estimula uma fraca reacção de corpo estranho permitindo esta função (Guowei, et al., 2007; Marcilli & de Oliveira, ). Apesar de existir um grande número de aplicações, os dispositivos médicos fabricados com PVA isoladamente ou em copolimerização ainda não atingiram a fase comercial do seu desenvolvimento. 11. Dextrano. O dextrano é um polissacarídeo sintetizado a partir da sacarose durante o crescimento das bactérias pertencentes ao género Lactobacillus, Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans e Pediococcus pentosaceus(Patel, et al., 2010). Este é um polímero altamente solúvel em água, não tóxico, biodegradável e biocompatível. Está comercialmente disponível em diferentes pesos moleculares. No entanto, o dextrano utilizado preferencialmente em aplicações biomédicas tem baixo peso molecular (40000 a 70000g/mol), uma vez que tem um tempo de semi-vida mais curto do que o dextrano de elevado peso molecular. Este polímero possui um grande número de grupos hidroxilo que permitindo que sofra reticulação física e química. 11.1 Aplicações biomédicas do dextrano O dextrano sendo um polímero biocompatível e biodegradável apresenta um grande potencial para a inclusão em diversos dispositivos biomédicos. O dextrano é utilizado há mais de 50 anos como expansor do volume plasmático(Bowman, 1953; Leonsins, 1952). Ao nível da coagulação apresenta múltiplos efeitos incluindo inibição da activação plaquetária(Zeerleder, et al., 2002), diminuição da polimerização da fibrina(Abir, Barkhordarian, & Sumpio, 2004), diminuição da viscosidade sanguínea(Burke, et al., 1979) e diminuição da formação de rouleaux eritrocitário(Neu, Wenby, & Meiselman, 2008) que pode ser usados como solução de perfusão em cirurgia reconstructiva e vascular para prevenir a formação de tromboses em anastomoses vasculares(Foster, et al., 1966). Outra das aplicações do dextrano diz respeito a sua utilização como matriz libertadora de fármacos, conjugando-se o composto com o dextrano através de diversas técnicas formando uma pró-droga que será regenerada exclusivamente através de uma hidrólise regulada pelo pH libertando o composto para os tecidos alvo. A incorporação na ESTADO DA ARTE E OBJECTIVOS DO ESTUDO 128 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP biomaterial tem sido utilizado como substituto temporário de pele(Hiraizumi, et al., 1995), como matriz de cartilagem (Grant et al., 2006) e como dispositivo de libertação controlada de fármacos(Hassan & Peppas, 2000) entre outras aplicações já referidas anteriormente. O PVA apresenta propriedades de biocompatibilidade como uma reacção de corpo estranho negligenciável e tem também propriedades viscoelásticas como boa resistência a cargas cíclicas rápidas e resistência à compressão devido ao elevado teor em água(Elshazly, 2004). Todas estas propriedades mecânicas e de biocompatibilidade tornam o PVA um biomaterial com características ideais para utilização em enxertos vasculares cuja performance funcional e estrutural necessitou de ser investigada in vitro e in vivo(Elshazly, 2004). Com o objectivo de melhorarmos as características de hemocompatibilidade e biocompatibilidade, co-polimerizamos o PVA com o polissacárido dextrano na tentativa de melhor a performance funcional da prótese por nós fabricada. Este polissacárido é um polímero biocompatível e biodegradável que apresenta múltiplos acções fisiológicas ao nível da coagulação incluindo inibição da activação plaquetária(Zeerleder et al., 2002),diminuição da polimerização da fibrina(Abir et al., 2004), diminuição da viscosidade sanguínea(Burke et al., 1979) e diminuição da formação de rouleaux eritrocitário(Neu et al., 2008) podendo ser usado como solução de perfusão em cirurgia reconstructiva e vascular para prevenir a formação de tromboses em anastomoses vasculares(Foster et al., 1966) . A associação de biomateriais a um sistema celular capaz de produzir localmente os factores tróficos potenciadores da regeneração da parede do vaso ou com capacidade de se diferenciar em células endoteliais (ou em outra camada do vaso) tem sido uma linha experimental seguida em outras áreas da regeneração de tecidos nomeadamente na neuroregeneração (Amado et al., 2008; Luis et al., 2008b; Luis et al., 2008a). As potencialidades das células estaminais devem por isso ser estudadas e testadas em associação com os enxertos vasculares de PVA. O tecido embrionário gelatinoso (geleia de Wharton) do cordão umbilical (CU), localizado entre o epitélio amniótico e os vasos umbilicais, o qual tem como principal função a protecção dos vasos e o impedimento do seu colapso, é uma fonte rica em células estaminais multipotentes e uma pequena percentagem de células estaminais pluripotentes e que podem ser utilizadas em variadas terapias. O material matricial do ESTADO DA ARTE E OBJECTIVOS DO ESTUDO 129 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP cordão deriva do mesênquima primitivo que é encontrado no estado de transição para o mesênquima encontrado na medula adulta(Weiss et al., 2008). Dois tipos de células têm sido encontrados no cordão umbilical: células estaminais hematopoieticas e mesenquimatosas. As células provenientes do cordão têm merecido muita atenção devido a vários factores: 1) o CU tem mais células primitivas por unidade de volume do que a medula óssea; 2) a taxa de rejeição de tais células é menor; 3) não é necessária compatibilidade antigénica ao contrário da medula óssea; contrariamente às da medula óssea, não necessitam compatibilidade antigénica e 4) são mais fáceis de obter, processar e armazenar(Bax, McKenzie, Bilek, & Weiss, 2011). As células estaminais mesenquimatosas humanas, isoladas da Geleia de Wharton do CU têm a capacidade de se diferenciar, in vitro, em células osteogénicas, condrogénicas, adiposas e miogénicas(Yang et al., 2008). Estas células apresentam uma vantagem interessante: não só são MHC Classe II negativas, tendo um fenótipo em termos imunitários privilegiado, como os seus níveis de expressão MHC Classe I podem ser manipulados, fazendo delas uma potencial fonte de células mesenquimatosas para terapia celular (Baksh, Yao, & Tuan, 2007). ESTADO DA ARTE E OBJECTIVOS DO ESTUDO 130 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP OBJECTIVOS DO ESTUDO Pretende-se testar um biomaterial, o polivinil álcool hidrogel em co-polimerização com o dextrano (Dx), para o fabrico de próteses vasculares associado a um sistema celular (células estaminais mesenquimatosas da geleia de Wharton do cordão umbilical) de forma a melhorar a biointegração do biomaterial. Foi então idealizado um modelo animal e estabelecidos alguns objectivos numa tentativa de contribuir para o estudo da bioengenharia aplicada ao desenvolvimento de uma nova prótese vascular sintética. Com este estudo pretendeu-se igualmente investigar e conseguir ultrapassar algumas das limitações anteriormente referidas para as próteses vasculares sintéticas: a) Formação de trombos e/ou hiperplasia da íntima b) Formação de pseudo-aneurismas c) Insuficiente biointegração e endotelização o interior das próteses vasculares. Pretende-se com este trabalho atingir os seguintes objectivos específicos: a) Através da implantação subcutânea (Figura 9) de membranas de PVA/Dx no modelo animal 1. Avaliar a biocompatibilidade do co-polímero PVA/Dx seguindo a norma ISO10993-6 Figura 9 – Implantação subcutânea de membranas de PVA/Dx para avaliação da biocompatibilidade. b) Através do contacto in vitro de membranas de PVA/Dx com o sangue e seus derivados (plasma rico em plaquetas e plasma pobre em plaquetas) ESTADO DA ARTE E OBJECTIVOS DO ESTUDO 131 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 1. Avaliar a hemocompatibilidade através da determinação do índice de hemólise 2. Avaliar a trombogenicidade in vitro pela quantificação da adesão/ activação plaquetária e pela medição do tempo de coagulação do sangue total 3. Avaliar a activação in vitro do sistema coagulação pela medição dos perfis de recalcifição do plasma e pela medição do complexo trombina-antitrombina c) Através da implantação de próteses vasculares de PVA/Dx com 5 cm de comprimento e 5 mm de diâmetro interno (Figura 10) na artéria carótida comum esquerda do modelo animal Figura 10 – Prótese vascular de PVA/Dx. Figura 11 – Prótese vascular de PVA/Dx implantada na artéria carótida comum esquerda de um ovino. ESTADO DA ARTE E OBJECTIVOS DO ESTUDO 132 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 1. Testar in vivo, em termos de biointegração e trombogenicidade, o biomaterial PVA em anastomoses vasculares utilizando enxertos vasculares de PVA/Dx (com ou sem células estaminais mesenquimatosas). 2. Testar in vivo, os enxertos de PVA/Dx: a) funcionalmente (Figura11)., em termos de manutenção e velocidade do fluxo sanguíneo; e b) estruturalmente, em termos de manutenção do diâmetro interno e externo através de ecografia em modo B e Doppler 3.Testar in vivo as interacções do sangue com o biomaterial pela determinação de vários parâmetros hematológicos e da coagulação durante 16 semanas do período experimental. 4. Testar in vivo, o sistema celular na promoção da biointegração dos enxertos de PVA/Dx. 5. Demonstrar in vivo, que os enxertos vasculares de PVA/Dx com comprimento superior a 20 mm, mantém propriedades funcionais e de biointegração compatíveis com a sua utilização clínica. 6. Avaliar exvivo através de análise histopatológica e imunohistoquimica o desempenho estrutural dos enxertos vasculares de PVA/Dx (Figura 12). Figura 12 – (A) Prótese de PVA/Dx recolhida de um ovino às 12 semanas pósimplantação, (B) Imagem microscópica de prótese vascular de PVA/Dx e tecido envolvente (40x, H&E). A B ESTADO DA ARTE E OBJECTIVOS DO ESTUDO 133 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Tabela 4 - Esquematização dos grupos para a realização do trabalho experimental Identificação do animal Tipo de prótese Comprimento/ID Tempo de implantação G1.1 PVA/Dx 5 cm/ 5 mm 4 semanas G1.2 PVA/Dx 5 cm/ 5 mm 8 semanas G1.3 PVA/Dx 5 cm/ 5 mm 12 semanas G1.4 PVA/Dx 5 cm/ 5 mm 16 semanas G1.5 PVA/Dx 5 cm/ 5 mm 20 semanas G1.6 PVA/Dx 5 cm/ 5 mm 24 semanas G2.1 PVA/Dx + MSCs + anticoagulante 5 cm/5 mm 4 semanas G2.2 PVA/Dx + MSCs + anticoagulante 5 cm/5 mm 8 semanas G2.3 PVA/Dx + MSCs + anticoagulante 5 cm/5 mm 12 semanas G2.4 PVA/Dx + MSCs + anticoagulante 5 cm/5 mm 16 semanas G2.5 PVA/Dx + MSCs + anticoagulante 5 cm/5 mm 20 semanas G2.6 PVA/Dx + MSCs + anticoagulante 5 cm/5 mm 24 semanas G3.1 PVA/Dx + MSCs 5 cm/5 mm 4 semanas G3.2 PVA/Dx + MSCs 5 cm/5 mm 8 semanas G3.3 PVA/Dx + MSCs 5 cm/5 mm 12 semanas G3.4 PVA/Dx + MSCs 5 cm/5 mm 16 semanas G3.5 PVA/Dx + MSCs 5 cm/5 mm 20 semanas G3.6 PVA/Dx + MSCs 5 cm/5 mm 24 semanas G4.1 ePTFE 5 cm/5 mm 4 semanas G4.2 ePTFE 5 cm/5 mm 8 semanas G4.3 ePTFE 5 cm/5 mm 12 semanas G4.4 ePTFE 5 cm/5 mm 16 semanas G4.5 ePTFE 5 cm/5 mm 20 semanas G4.6 ePTFE 5 cm/5 mm 24 semanas RESULTADOS 134 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP CAPITULO III RESULTADOS RESULTADOS 135 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 1. Avaliação da biocompatibilidade, hemocompatibilidade e trombogenicidade RESULTADOS 136 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP 1.1. Introdução A avaliação da biocompatibilidade de um biomaterial antes da sua aplicação em ensaios pré-clínicos é uma etapa fundamental do desenvolvimento de uma prótese vascular sintética. Permite avaliar a severidade a reacção inflamatória que determinado biomaterial causa nos tecidos que envolvem e eventualmente permite também a sua modificação da sua composição química, processo de fabrico e estrutura física antes de se aplicar num modelo animal pré-clínico. De modo a quantificar e a objectivar a biocompatibilidade através da graduação da reacção inflamatória seguiram-se as linhas orientadoras fornecidas pelo anexo E da norma ISO 10993-6. O parâmetro resultante da quantificação da reacção inflamatória permite a classificação dos biomateriais em nãoirritante ou inerte, ligeiramente irritante, moderadamente irritante e severamente irritante. Não se aconselha a utilização de biomateriais considerados moderadamente irritantes ou severamente irritantes no fabrico de próteses vasculares. A caracterização da hemocompatibilidade e trombogenicidade dos biomateriais que entram na composição de dispositivos que contactam com o sangue são dois factores críticos para prever o seu desempenho funcional in vivo. A determinação de hemólise clássica seguiu a norma da American Society for Testing on Materials (ASTM F756-00, 2000). O índice de hemólise é um indicador da interacção do material com os eritrócitos(Fernandes et al., 2008) e poderá classificar o biomaterial em não hemolítico (<2%), ligeiramente hemolítico (2-5%) e moderadamente hemolítico (>5%). A interacção do biomaterial com o sangue é também caracterizada pela determinação da trombogenicidade que compreende parâmetros de adesão e activação plaquetária bem como parâmetros de activação do sistema de coagulação. A trombogenicidade Para quantificação da adesão recorreu-se ao ensaio de actividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) (Tamada, Kulik, & Ikada, 1995). A activação plaquetária foi avaliada qualitativamente através da observação do fenótipo das plaquetas aquando do contacto com as superfícies pela análise de imagens de SEM. Uma avaliação mais objectiva da activação plaquetária foi realizada por citometria de fluxo onde a expressão do receptor CD62P foi usada para identificar plaquetas activadas. O tempo de coagulação de sangue total tem sido utilizado por diversos autores também como um indicador da trombogenicidade de biomateriais (Motlagh, et al., 2006). A activação da via intrínseca pelos biomateriais tem sido quantificada por diversos autores (Motlagh et al., 2006) da coagulação foi quantificada pela medição do perfil de recalcificação do plasma. Outro indicador da activação da coagulação por nós utilizado mede de forma indirecta a formação de trombina pelo doseamento do complexo trombina-antitrombina. Um baixo RESULTADOS 137 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP nível de activação da trombina pelo biomaterial é indicador de boa hemocompatibilidade. Os resultados de todos estes parâmetros avaliadores da hemocompatibilidade in vitro são um bom indicador do desempenho funcional dos biomateriais que contactam com o sangue e ausência de resultados satisfatórios aconselha a sua não utilização em ensaios pré-clínicos. RESULTADOS 144 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 145 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 146 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 147 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 148 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 149 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 150 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 151 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 152 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 153 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 256 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 257 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 258 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 259 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 260 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 261 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 262 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 263 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 264 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP RESULTADOS 265 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 272 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP DISCUSSÃO GERAL A investigação na área de desenvolvimento de próteses sintéticas vasculares de baixo diâmetro tal como referido anteriormente é um tema de grande importância devido à elevada incidência de doenças cardiovasculares que necessitam de cirurgias de bypass ou de revascularização recorrendo-se num grande número destes casos à implantação de próteses vasculares sintéticas. A ovelha é das espécies mais utilizadas como modelo para a investigação e testagem funcional de dispositivos cardiovasculares nos quais se incluem as próteses vasculares de pequeno diâmetro(Byrom et al., 2010). Existem várias razões que tornam esta espécie um modelo experimental ideal, de entre as quais destacamos a presença de vasos periféricos com diâmetro compatível com próteses de pequeno diâmetro, um sistema de coagulação similar ao do humano e a sua facilidade de manutenção por longos períodos experimentais. A interposição de um enxerto vascular num segmento da artéria carótida comum é um modelo amplamente utilizado pelos investigadores desta área (Soldani et al., 2010; Peirovi et al., 2005; Pavcnik et al., 2009). A avaliação da biocompatibilidade, hemocompatibilidade e trombogenicidade in vitro dos biomateriais uma prótese vascular são etapas fundamentais no desenvolvimento deste dispositivo. De modo a uniformizar procedimentos, o desenho experimental e os critérios de classificação é consensualmente aceite que os investigadores desta área devem seguir as linhas orientadoras das normas ISO que existem para esta área de investigação (10 993-4, 10993-6, 7198-1 e 7198-2). Em relação à avaliação in vivo da biocompatibilidade, apenas alguns estudos foram publicados até ao presente avaliando o PVA isoladamente ou associado a outros biomateriais. Principalmente, foram realizados estudos in vitro para avaliar a biocompatibilidade, o que têm limitações óbvias em extrapolar os resultados para sistemas mais complexos. Noguchi et al testou a biocompatibilidade do PVA sob a forma de cartilagem articular artificial no ambiente intra-articular e intra-muscular(Noguchi et al., 1991). A reacção inflamatória nos tecidos cartilagíneos, osso, membrana sinovial e músculo foi analisada histologicamente. Nos tecidos em que PVA foi implantado, a reação inflamatória local foi muito leve, confirmando os resultados descritos no nosso trabalho de ligeira irritação para os tecidos circundantes nos grupos experimentais 1, 2, 3 e sham. Seo et al também estudaram a biocompatibilidade do PVA em combinação com gelatina, implantando o biomaterial no tecido muscular de coelhos(Seo, et al., 2009). Os resultados deste estudo confirmaram igualmente que o PVA induz menor acumulação de DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 273 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP células inflamatórias em relação ao grupo de controlo que foi implantado com poliuretanos. Burczak et al utilizaram o PVA para encapsular ilhotas de Langerhans em macrobags com o objectivo de criar um pâncreas artificial do tipo híbrido (Burczak et al., 1996). A actividade das enzimas fosfatase ácida e alcalina foram medidas no interface tecido - implante. Este estudo teve como objectivo avaliar a actividade das células envolvidas na resposta inflamatória ao implante no longo prazo. Nos períodos experimentais de longo prazo (133 dias) do estudo de Burczak e colaboradores, evidenciou-se uma maior actividade da fosfatase ácida, que é normalmente ligada a uma maior atividade dos macrófagos(Burczak et al., 1996). Pela análise histológica dos diferentes grupos experimentais do nosso trabalho, o número de macrófagos permaneceu estável ou apresentou uma tendência para a diminuir ao longo do período experimental, especialmente no grupo 2 onde o PVA foi associado a um sistema celular. A diferença entre os nossos resultados e os resultados publicados por Burczak e colaboradores podem ser explicados pela utilização de processos diferentes de reticulação que podem influenciar o número de grupos hidroxilo nucleofílicos das macromoléculas de PVA, que interactuam com o componente C3 activando a via alternativa do sistema do complemento que também é responsável pela adesão e activação de macrófagos entre outras células inflamatórias (Sawada, et al., 1993). O grande número de neovasos, capilares e vénulas observados no interface materialtecido nos diversos grupos que foram implantados com PVA/Dx reforçaram a biocompatibilidade do PVA a longo prazo e confirmaram os resultados de citicompatibilidade in vitro descritos por outros autores (Seo et al., 2009). A reacção de corpo estranho (RCA) que envolveu as membranas de PVA foi suave, especialmente no grupo 3 (PVA/Dx). A copolimerização de PVA com polissacáridos é uma associação cada vez mais comum, devido ao efeito de aumento da biocompatibilidade desta associação (Alhosseini et al., 2012). Diversos estudos sugerem que o dextrano reduz RCA ao limitar a adesão de macrófagos e consequentemente reduzem a sua activação (Abed et al., 2011; Cadée et al., 2000). Estas observações suportam os nossos resultados, que mostraram uma diferença estatisticamente significativa para a contagem de macrófagos entre os grupos que receberam membranas de PVA e grupos que receberam PVA/Dx. Os resultados histológicos demonstraram que a resposta inflamatória em relação ao biomaterial PVA é inferior ou semelhante ao de produtos disponíveis comercialmente, como o ePTFE. Essa reacção inflamatória foi ainda mais atenuada nos implantes de PVA/Dx o que pode ser explicado pela influência DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 274 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP positiva de polissacarídeos na biocompatibilidade, devido aos efeitos anti-inflamatórios destas moléculas (Abed et al., 2011; Alauzun et al., 2010; Li et al., 2012). Uma acentuada diminuição na inflamação foi detectado nos diversos grupos experimentais e de controlo após as 8 semanas de implantação. Esta tendência foi mais acentuada no grupo onde o PVA foi associado às MSCs. Este resultado deveu-se provavelmente às propriedades imunomoduladoras de MSCs, que permitiram uma mais rápida biointegração do biomaterial e evitaram uma reacção inflamatória local exuberante (Koh & Atala, 2005; Martino, et al., 2012). Estas propriedades imunomoduladoras incluem a supressão de citoquinas inflamatórias e a indução de fenótipos reguladores e supressores nos linfócitos T (Yagi et al., 2010). Essas acções foram mais eficazes em fases finais de inflamação onde estas células são mais predominantes Durante o período de ensaios in vivo com membranas de PVA ou ePTFE, as amostras recolhidas não apresentaram biodegradação. Embora o PVA seja descrito na literatura como um polímero biodegradável, o processo de biodegradação descrito na bibliografia é um processo mediado por enzimas microbianas o que impede a sua degradação por enzimas de mamíferos(Chiellini, Corti, et al., 2003). A associação de diferentes polímeros com polissacarídeos naturais ou artificiais é uma tendência em ciência de biomateriais. A sua utilização crescente está relacionada com as propriedades imunomoduladoras, anti-coagulantes e anti-inflamatórios que levam a uma melhor biocompatibilidade da associação resultante. No nosso conhecimento PVA nunca foi testado quanto à biocompatibilidade e hemocompatibilidade em associação com dextrano. Os resultados apresentados suportam a utilização desta copolimerização como um enxerto vascular em um modelo animal pré - clínico, também a associação com MSCs a partir de geleia de cordão umbilical de Wharton melhora a biointegração do biomaterial modular a reacção inflamatória local. As membranas de PVA com dextrano apresentaram um valor de índice de hemólise muito baixo o que foi atribuída aos efeitos citoprotectores de dextrano em eritrócitos. O dextrano é um glicosaminoglicano que tem sido utilizado por vários autores como uma substância profiláctica de hemólise, no entanto, o mecanismo que produz este efeito é mal conhecido(Eisenberg, 1969). Este polissacarídeo também afecta a estabilidade da membrana e cria uma carga eléctrica negativa na superfície, criando forças de repulsão DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 275 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP entre os eritrócitos, diminuindo a agregação e hemólise (Fernandes, Cesar, & Barjas- Castro, 2011; Fernandes et al., 2008). A avaliação da trombogenicidade in vitro e in vivo constituiu uma componente fundamental da caracterização das interacções dos materiais com o sangue. Nessa prespectiva realizaram-se várias provas de avaliação para caracterizar a activação das plaquetas e cascata de coagulação. A análise das superfícies incubadas com plasma rico em plaquetas (PRP) por microscopia electrónica de varrimento (MEV) permitiu a avaliação da morfologia das plaquetas pela modificação da forma e pelo desenvolvimento pseupodes para definir a activação destes elementos celulares. Entre outros parâmetros, a forma de plaquetas que adere a superfícies ou seja o grau de activação é uma das características de hemocompatibilidade (Xu et al., 2010). Nas superfícies das membranas de PVA/Dx, observou-se uma predominância de formas discóides ou dendríticas sem agregação plaquetária sugerindo uma fraca activação. A hidrofilicidade da superfície de PVA/Dx pode explicar este resultado pela menor adsorção de fibrinogénio a estas superfícies (Sivaraman & Latour, 2010). Quando o fibrinogénio é adsorvido a uma superfície, ocorre uma modificação da sua estrutura que expõe locais para a adesão dos receptores das plaquetas e consequente activação (Sivaraman & Latour, 2010). No presente trabalho, o número de plaquetas que aderiram a cada superfície testada foi quantificada pela actividade da lactato desidrogenase (LDH). Uma percentagem e um número significativamente (p<0,05) mais baixo de plaquetas aderiram as superfícies de PVA/Dx e polipropileno quando comparadas com o vidro. No ensaio com plasma rico em plaquetas (PRP) de ovino, as membranas de PVA/Dx tinham um número significativamente menor de plaquetas na superfície quando comparados com o polipropileno. Apesar do menor número e percentagem de plaquetas que aderiram à superfície de PVA/Dx, algumas superfícies podem não suportar a adesão de plaquetas mas, por outro lado, podem ainda assim activar as plaquetas (Godo & Sefton, 1999; Hanson & Tucker, 2013). O PVA tem sido descrito como um biomaterial que ativa as plaquetas com uma baixa grau de adesão mesmo com pré-tratamento com fibrinogénio (Godo & Sefton, 1999). DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 276 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP O sangue total foi utilizado para determinar os tempos de coagulação e fornecer informações sobre a trombogenicidade e atividade pró-coagulante de cada biomaterial. Neste teste, o sangue total é deixada a coagular em contacto com o biomaterial. Quando o processo de coagulação ocorre, mais eritrócitos são retidos no coágulo de fibrina e, consequentemente, menos hemoglobina é libertada pela lise de eritrócitos causada pela adição de água destilada. Um material mais hemocompatível manterá um valor de absorção mais elevada ao longo do tempo. Os resultados mostraram que o polipropileno e PVA/Dx eram os materiais menos trombogénicos. Os nossos resultados estão de acordo com outras publicações, que testaram o PVA em combinação com polissacarídeos naturais (como a celulose)(Leitão, et al., 2013). A área de superfície, para além das características intrínsecas dos biomateriais, é outro factor que pode influenciar os valores do tempo de coagulação do sangue total (Andrade et al., 2011). A fim de reduzir a influência desse factor, o polipropileno e amostras de PVA/Dx foram cortadas com o objectivo de cobrir completamente o fundo do poço da placa onde se realizou o teste. No caso de PVA/Dx, quando hidratado apresenta uma estrutura em forma de cúpula. Este facto pode aumentar a superfície de interação sangue - material o que pode afetar negativamente a análise comparativa dos resultados. O perfil de recalcificação plasma é frequentemente utilizado como medida de ativação da via intrínseca (Motlagh et al., 2006; Zhuo, Siedlecki, & Vogler, 2006). O desempenho dos biomateriais neste teste é exclusivamente um indicador da activação fase de contacto. Apesar dos resultados para PVA/Dx terem sido inferiores ao controlo positivo. No entanto, quando em comparação com outros copolímeros que incluem PVA, o tempo de recalcificação (half-max time) de PVA/Dx é superior aos resultados publicados (Leitão et al., 2013) . A geração de trombina foi medida indirectamente através da determinação complexo de trombina-antitrombina (TAT) por ELISA. O TAT é um parâmetro de ativação da coagulação por contacto. Os resultados obtidos para TAT foram mais baixos para PVA/Dx sendo inclusive inferiores aos do controlo negativo. Apesar da via de coagulação intrínseca, a trombina é considerado o principal iniciador da cascata de coagulação sanguínea no caso específico do contacto do sangue com superfícies de biomateriais. O mecanismo pelo qual a trombina é gerada na superfície de polímero do biomaterial não é ainda totalmente conhecido. No entanto, a formação de pequenas quantidades de trombina através da ativação por contato com biomateriais poderia induzir um ciclo de amplificação usando as propriedades de ativação da trombina sobre Fator XI (Minnema, ten Cate, & Hack, 1999). A trombina é responsável pela conversão do fibrinogénio em DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 277 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP fibrina, é igualmente capaz de estimular a activação de plaquetas para a formação de trombos. Por todas estas razões a síntese trombina é um evento-chave nas reações biocompatibilidade/ incompatibilidade. Um valor mais baixo de síntese de trombina é um indicador de hemocompatibilidade Após a cirurgia (em ambos os grupos experimentais) os valores do tempo parcial de tromboplastina activada não subiram como tem sido descrito por vários autores (Boisclair et al., 1993; Irvine et al., 1991). Os dados obtidos evidenciaram que os valores de tempo de protrombina foram constantes durante o período experimental de 16 semanas. Adicionalmente, os valores obtidos antes e após a cirurgia não foram significativamente diferentes. Apesar dos resultados obtidos, não se pode concluir somente com base nas determinações de ambas as vias de coagulação sobre o papel das próteses vasculares de PVA/Dx no processo de trombose in vivo. O D-Dímero é um biomarcador amplamente utilizado na avaliação da fibrinólise endógena. No presente trabalho, houve um aumento estatisticamente significativo dos níveis deste marcador (p<0,05) após a cirurgia em ambos os grupos experimentais. Esta descoberta pode estar relacionado com a formação de trombos ou simplesmente relacionada com o procedimento cirúrgico. A cinética observada nos níveis de D-dímeros estava de acordo com a cinética observada noutros pacientes cirúrgicos, onde o valor mais elevado foi observado nos 7 dias seguintes à cirurgia (Dindo et al., 2009).Este aumento dos níveis de D-dímeros pode estar relacionado com o processo de inflamação induzido pela cirurgia e pelo dano tecidular associado (Iba et al., 2007). Os resultados obtidos para a proteína C-reactiva (PCR) e IL - 6 mostraram que os valores não aumentaram após a cirurgia nem estavam relacionados com um aumento do número de leucócitos. Nos seres humanos, a cinética dos níveis de IL-6 e PCR foram interrelacionados e um aumento no nível de PCR é precedida por um aumento dos níveis de IL - 6 (Cruickshank, et al., 1990). A Invasão do procedimento cirúrgico também é um fator que pode influenciar os níveis e a cinética de PCR e IL- 6 (Cruickshank et al., 1990). Em uma pequena cirurgia ou procedimentos cirúrgicos menos invasivos, como o acesso à artéria carótida cervical, pode produzir-se um nível menor de PCR devido a um menor grau de trauma de tecidos. Por fim, em ambos os grupos e em ambas as medições (PCR e IL-6), os níveis consistentemente diminuíram após a cirurgia facto que pode estar relacionado com o baixo grau de invasão do acesso cirúrgico. DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 278 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Quanto aos resultados da contagem de leucócitos, da contagem de eritrócitos, da concentração de hemoglobina e do hematócrito, todos os valores mantiveram-se entre os valores normais para a espécie durante o período de 16 semanas, com exceção de um grupo no ponto de temporal-12 semanas. No grupo 1, 4 dias após a cirurgia, observou-se uma diminuição nos três primeiros parâmetros referidos, mas ainda assim dentro dos limites normais, o que pode ser atribuído à perda de sangue intra-operatória. A contagem de leucócitos manteve-se dentro dos limites normais, sendo observado um aumento não significativo após a cirurgia (4 dias após a cirurgia). Essa subida é, provavelmente, ligado ao dano tecidual inerente à cirurgia e à inflamação aguda associada. A contagem diferencial de leucócitos também esteve dentro dos limites normais para ovinos (Wilhelmi et al., 2012). A contagem de plaquetas manteve-se igualmente dentre dos limites normais, o que reflecte um fraco consumo de plaquetas pelas próteses vasculares de PVA/Dx. Em relação à avaliação funcional, o principal objetivo deste trabalho experimental foi o de produzir uma prótese vascular funcional de PVA com dextrano. O desempenho estrutural e funcional das próteses de baixo diâmetro de PVA/Dx foi avaliado num estudo préclinico de longo prazo. Neste estudo, a taxa de permeabilidade primária em enxertos de PVA/Dx foi inferior ao registrado no grupo ePTFE. No entanto, nas próteses de PVA/Dx associadas a MSCs, a taxa de permeabilidade atingiu valores semelhantes ao biomaterial de referência. A endotelização da superfície luminal do enxerto é o principal factor que contribui para a baixa trombogenicidade e por consequência para o aumento da taxa de permeabilidade a longo prazo. O uso de MSCs humanas da geleia de Wharton do cordão umbilical para gerar células endoteliais nos vasos sanguíneos da engenharia de tecidos é uma tendência atual da engenharia de tecidos. No entanto, o nosso objectivo com a injecção peri-enxerto de MSCs foi estimular endotelização mediada pelo crescimento tecidular trans-mural e para modular a resposta inflamatória observada após o procedimento cirúrgico a fim de melhorar a regeneração vascular e a biointegração do enxerto. Apesar da melhoria das taxas de permeabilidade no grupo 3, não se observou crescimento transmural de tecido em enxertos explantados do grupo 3 e as células endoteliais detectadas por MEV às 24 semanas pós-implantação devem ser atribuídas à endotelização trans-anatosmótica (TAE) (Zilla et al., 2007). O TAE é um achado comum em ovelhas particularmente em animais jovens mas não em animais adultos. No nosso caso, foram utilizados animais adultos (6 anos de idade), o que mesmo assim permitiu endotelização de superfícies luminais em enxertos de PVA/Dx(Zilla et al., 2007). O uso de protocolos de anticoagulação, semelhantes aos utilizados nos pacientes humanos DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 279 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP submetidos a procedimentos de bypass vascular não resultou numa melhoria da taxa de permeabilidade (43,02±41,80%) no grupo 2. Este facto foi surpreendentemente devido a comprovada alta biodisponibilidade da warfarina quando administrada por via oral em ruminantes. Os implantes ePTFE usados no nosso estudo, apresentavam a superfície luminal revestida por carbono o que diminui a adesão plaquetária e a deposição de fibrina, quando comparados as próteses clássicas de ePTFE. Esta particularidade pode ser responsável pela maior taxa de permeabilidade observada (84,28 ± 24,66%) neste grupo. Os valores de diâmetro interno das próteses de PVA/Dx mantiveram-se constante em relação ao diâmetro interno inicial (5 mm), sugerindo que estes enxertos permanecem estruturalmente estáveis durante o período de 24 semanas. Pelo contrário, os enxertos de ePTFE mostraram uma diminuição no ID especificamente após as oito semanas de implantação. Estes resultados sugerem uma maior resistência à compressão das próteses de PVA/Dx em comparação com as próteses de ePTFE. Em relação às características do fluxo, o índice de resistência (RI) de acordo com Pourcelot é um parâmetro hemodinâmico que reflecte a resistência vascular ao fluxo. Os valores mais elevados do RI foram observados no grupo 2. No âmbito do nosso trabalho experimental, o aumento de RI pode estar relacionado com a estenose do vaso/prótese causada pela hiperplasia da íntima ou pela formação de trombos luminais (Figura 13). A aceleração do fluxo sanguíneo observada em enxertos de ePTFE enxertos implantados pode estar relacionada com a maior discordência de diâmetro entre as próteses e as artérias anastomosadas. Os ID dos enxertos ePTFE apresentaram valores inferiores a quatro milímetros enquanto que a secção transversal das artérias nativas apresentou valores mais baixos sujeitando o fluxo sanguíneo a uma aceleração. Outra característica implicada na aceleração do fluxo é a incompatibilidade de complacência, que é de particular importância na fisiopatologia da hiperplasia da íntima. Nas próteses de PVA/Dx os valores de SPV foram menores quando comparados com os enxertos ePTFE. Como sugerido, as propriedades viscoelásticas das próteses de PVA/Dx assemelham-se a das artérias nativas, o que pode explicar essa observação. Em relação ao desempenho estrutural, não se observou rotura dos enxertos PVA/Dx o que reflecte a capacidade desses enxertos para suportar a pressão arterial e confirma as propriedades mecânicas demonstradas in vitro (Nunes, 2012). Os testes mecânicos in vitro das próteses de PVA/Dx demonstraram que esses podem suportar até 3,8±0,3 bar de pressão na parede, valor que está dentro dos limites suportados pelas artérias nativas (2,7 e 5,6 bar)(Nunes, 2012). De acordo com as observações das amostras através do microscópio electrónico de varrimento, não houve crescimento tecidular trans-mural. O principal factor que contribui para infiltração de células ou tecidos na parede da prótese é a dimensão dos poros ou DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 280 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP dos interstícios da estrutura do biomaterial. Para que este processo seja bem sucedido é necessário haver espaço suficiente para os capilares e as células do tecido conjuntivo se infiltrarem. Na prótese de PVA/Dx, o diâmetro médio observado dos poros foi de 8,15 ± 5,50 µm (intervalo 1-22 µm) o que é insuficiente para um vaso capilar (diâmetro médio de 10 µm) e arteríolas funcionais (diâmetro médio de 23,1±13,1µm) penetrarem nos interstícios. Outras células, como as células musculares lisas e os macrófagos que se seguem e estimulam a migração transmural das células endoteliais não foram observadas na parede da prótese. A presença de células endoteliais na superfície luminal do enxerto de PVA/Dx às 24 semanas (Figura 13) foi atribuída à hidrofilicidade do PVA. Reconhece-se que a adesão e proliferação de diferentes tipos de células em materiais poliméricos dependem em grande medida as características de superfície, tais como a molhabilidade hidrofilicidade/hidrofobicidade, a carga eléctrica da superficie e a rugosidade entre outras caracteristicas. Os achados histopatológicos nas transições da artéria-prótese confirmaram as observações em MEV (Figura 13). A endotelização e a neoíntima de suporte foram restritas à porção mais caudal e cranial das próteses de PVA/Dx e de ePTFE. A endotelização incompleta nos enxertos de PVA/Dx e ePTFE pode ser explicada pelas dificuldades encontradas pelos capilares presentes no tecido peri-enxerto na penetração da estrutura densa da prótese. Um comportamento semelhante foi observado por Izhar et al. com um tipo de prótese de baixo diâmetro implantados na artéria carótida comum de cães, que atribuíram a ausência de células endoteliais e crescimento capilar à baixa porosidade do enxerto(Izhar et al., 2001). Outro aspecto a ter em conta na endotelização incompleta foi o curto período de experimentação do nosso trabalho, quando comparado com o trabalho desenvolvido por Solani et al (Soldani et al., 2010). Este trabalho utilizou ovelhas implantadas com uma prótese biodegradável por um período de 24 meses ao contrário dos 6 meses planeados para o nosso trabalho. No grupo experimental de PVA/Dx que não recebeu a MSCs, a falta de endotelização pode explicar um valor inferior da taxa permeabilidade precoce (às 4 semanas foi de 0%). Os níveis observados de fibrose foram indirectamente relacionados com um menor grau de activação de macrófagos induzida pelo PVA (p<0,05). Os enxertos de PVA/Dx associados a MSCs apresentados resultados inferiores quando comparados com outros grupos. Estas diferenças estatisticamente significativas foram evidentes na região do enxerto na semana 4, semana 12 e na semana 20. O que sugere que, quando MSCs são injetados na interface perienxerto, a fibrose é diminuída. Esta circunstância pode ser explicada pela acção imunossupressora das MSCs em macrófagos que se reflecte na diminuição da síntese de factores de crescimento que são responsáveis pelo crescimento de fibroblastos (expresso histologicamente como fibrose). A marcação das células DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 281 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP endoteliais pelo anticorpo CD31 (Figura 13) não foi eficaz em enxertos previamente observados com células endoteliais por MEV ou microscopia óptica. Tal resultado é explicado pela fraca afinidade deste anticorpo por células previamente fixadas com formoaldeído. A quantificação dos macrófagos foi realizada através da marcação com o anticorpo CD14. Como esperado, o número de células marcadas aumentou desde as 4 semanas até alcançar um pico entre as 8 semanas e 16 semanas em grupos de PVA/Dx. No longo prazo, não houve diferenças estatisticamente significativas (p >0,05 ) na contagem de macrófagos nos tecidos envolventes das próteses de PVA/Dx e ePTFE . Os macrófagos são provavelmente as células mais importantes na inflamação crónica e uma maior contagem no tecido envolvente geralmente evidencia maior antigenicidade e menor biocompatibildade(Brodbeck et al., 2001). Em resumo após a análise conjunta dos dados de biocompatibilidade, hemocompatibilidade, trombogenicidade e da avaliação funcional podemos concluir que as próteses de PVA/Dx apresentaram resultados promissores que merecem um trabalho futuro com o objectivo de se melhorar alguns aspectos do seu desempenho funcional e estrutural nomeadamente a porosidade e a funcionalidade da superfície luminal. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 288 Nuno Miguel Lourenço Alexandre – ICBAS – UP Andukuri, A., Sohn, Y. D., Anakwenze, C. P., Lim, D. J., Brott, B. C., Yoon, Y. S. et al. (2013). 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