Phytolacca Americana L.: Potencial das Bagas de uma Planta Invasora

Vanessa Alexandra Pinho de Sousa Guedes Phytolacca americana L.: potencial das bagas de uma planta invasora Dissertação de Mestrado em Controlo de Qualidade Especialidade em Água e Alimentos Trabalho desenvolvido sobre a orientação de: Prof. Doutora Ana Cristina M. Ferreira da Vinha Prof. Doutora Maria Beatriz Prior Pinto de Oliveira Setembro, 2015 ii É autorizada a reprodução integral desta dissertação apenas para efeitos de investigação, mediante declaração escrita do interessado que a tal se compromete. iii Agradecimentos Antes de mais gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuíram para a elaboração deste trabalho, e que de certa forma fizeram parte desta etapa da minha vida. À Professora Doutora Ana Vinha, Orientadora deste trabalho, por estar sempre disponível, disposta a cooperar no meu bom desempenho e valiosa revisão critica desta tese. À Professora Doutora Beatriz Oliveira pela sua orientação e por me ter disponibilizado todas as condições necessárias à realização deste projeto. Ao Serviço de Bioquímica do Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, em particular ao Professor Doutor Elísio Costa pelo acolhimento e pela colaboração. À minha mãe pelo exemplo de mulher, mãe e amiga. Onde quer que estejas sei que estás sempre presente. Ao meu pai pela confiança e apoio que me deu nesta e em outras fases da minha vida. Ao meu irmão, cunhada, sobrinhos, Zeza, To-zé e amigos, pelo amor, amizade e apoio. Ao Carlos por todo o amor, carinho, incentivo e principalmente paciência nos momentos mais difíceis deste trabalho. A todos, muito obrigada. iv Resumo A Phytolacca americana L., conhecida como uva-de-rato ou tintureira, é uma planta herbácea, da família Phytolaccaceae, ordem Caryophyllales. Esta espécie, de propagação acidental, encontra-se amplamente distribuída em regiões temperadas, particularmente nas regiões de clima mediterrânico. Portugal não é exceção e, atualmente, a proliferação desta espécie ocorre não só no território continental mas também nos arquipélagos da Madeira e dos Açores. Morfologicamente esta espécie é uma planta de porte médio, de aparência agradável, com caules quadrangulares avermelhados e frutos redondos pretos-azulados, agrupados em cacho. Tem sido utilizada em medicina tradicional no tratamento de distúrbios gastrointestinais, processos inflamatórios e erupções cutâneas. Recentemente têm sido atribuídas propriedades anticancerígenas e antivíricas. A maceração das bagas origina um corante vermelho intenso, em tempos valorizado pelas indústrias tintureiras ou utilizada como adulterante de vinhos tintos desprovidos de cor. O estudo desenvolvido nesta dissertação visou a valorização das bagas de Phytolacca americana L.. Trata-se de uma planta abundante no ecossistema e há pouca informação quanto às suas propriedades biológicas. A partir de extratos hidroalcoólicos determinaram-se os teores de saponinas, fenólicos totais, flavonoides e carotenoides. Foram usados vários métodos para avaliar a atividade antioxidante (DPPH, FRAP e Redução da Hemólise). Os resultados obtidos mostraram que as bagas de Phytolacca americana são ricas em saponinas e compostos fenólicos e, relativamente rica em flavonoides. A predominância das clorofilas a e b em detrimento do -caroteno e licopeno indicam que os pigmentos naturais deste fruto são betalaínas, compostos descritos apenas em espécies vegetais da ordem Caryophyllales. A atividade antioxidante foi confirmada em ambos os métodos estudados (DPPH e FRAP) e a percentagem de redução de hemólise em eritrócitos humanos demonstrou a possível valorização deste fruto em aplicações na área alimentar. Este estudo preliminar mostrou a necessidade de uma caracterização química mais exaustiva para a possível valorização desta planta invasora. De acordo com o nosso conhecimento esse estudo não foi ainda realizado. Palavras-Chave: Phytolacca americana L.; Bagas; Compostos bioativos; Atividade antioxidante; Atividade hemolítica. v Abstract Phytolacca americana L., known as grape rat or dyer plant, is a herbaceous plant from Phytolaccaceae family, order Caryophyllales. This specie has an accidental propagation, and it is widely distributed in temperate regions, particularly in Mediterranean climates. Portugal is no exception and currently the proliferation of this specie occurs not only on the mainland territory but also in the archipelagos of Madeira and Azores. Morphologically this specie is a handsome medium-sized plant, with quadrangular red stems and blackblue round fruits, grouped in a cluster. It has been used in traditional medicine in the treatment of gastrointestinal disorders, inflammation, and skin eruptions. Recently, they have been associated with anticancer and antiviral properties. The maceration of berries gives a strong red dye commonly used in food industries or used as a natural adulterant to pale red wines. The study developed in this work aimed at enhancement Phytolacca americana L. berries. It is an abundant plant in the ecosystem and there is little information about their biological properties. From hydroalcoholic extracts we determined the total saponins, total phenolics, carotenoids and flavonoids contents. Several methods were used to evaluate the antioxidant activity (DPPH, FRAP and reduction of hemolysis). The results showed that Phytolacca americana berries are rich in saponins and phenolic compounds, and relatively rich in flavonoids content. The predominance of chlorophylls a and b at the expense of -carotene and lycopene indicate that the natural pigments of this fruit are betalains, compounds only described in plant species from order Caryophyllales. The antioxidant activity was confirmed in both studied methods (DPPH and FRAP) and the percentage of hemolysis inhibition in human erythrocytes showed a possible valuation of this fruit in applications in the food industry. This preliminary study showed the need for a more comprehensive chemical characterization of this plant and also for its valorization. According to our knowledge this study has not yet been done. Keyword: Phytolacca americana L., berries, bioactive compounds, antioxidant activity, hemolysis activity. vi Índice Agradecimentos ............................................................................................................. iii Resumo ........................................................................................................................... iv Abstract ........................................................................................................................... v Índice............................................................................................................................... vi Índice de Figuras ............................................................................................................ ix Índice de Tabelas ............................................................................................................ x Lista de Abreviaturas ........................................................................................................ xi 1. Revisão Bibliográfica ............................................................................................... 1 1.1. Espécies invasoras ............................................................................................. 2 1.2. Phytolacca americana L. ..................................................................................... 3 1.2.1. Raiz ............................................................................................................. 6 1.2.2. Folha ............................................................................................................ 7 1.2.3. Bagas........................................................................................................... 8 1.3. Composição fitoquímica ...................................................................................... 9 1.3.1. Saponinas .................................................................................................. 10 1.3.2. Ácidos fenólicos e flavonoides ................................................................... 12 1.3.3. Pigmentos naturais .................................................................................... 15 1.3.3.1. Betalaínas ................................................................................................ 15 1.3.3.2. Clorofilas .................................................................................................. 18 1.3.3.3. Carotenoides ........................................................................................... 19 1.4. Interesse farmacológico .................................................................................... 21 1.5. Toxicidade......................................................................................................... 22 2. Objetivos................................................................................................................. 23 2.1. Objetivo geral .................................................................................................... 24 2.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 24 3. Material e Métodos ................................................................................................. 25 3.1. Reagentes......................................................................................................... 26 3.2. Equipamentos ................................................................................................... 26 vii 3.3. Amostras ........................................................................................................... 27 3.4. Preparação dos extratos ................................................................................... 28 3.5. Determinação dos compostos bioativos ............................................................ 28 3.5.1. Determinação de teor de saponinas ........................................................... 28 3.5.2. Fenólicos totais .......................................................................................... 29 3.5.3. Flavonoides................................................................................................ 30 3.5.4. Determinação de carotenoides................................................................... 30 3.6. Atividade antioxidante in vitro ............................................................................ 31 3.6.1. Método DPPH ............................................................................................ 31 3.6.2. Método FRAP ............................................................................................ 32 3.6.3. Atividade hemolítica ................................................................................... 33 3.6.3.1. Preparação da suspensão de eritrócitos ............................................. 33 3.6.3.2. Incubação com AAPH ......................................................................... 34 3.6.3.3. Avaliação da percentagem de inibição de hemólise ............................ 35 3.6.3.4. Análise morfológica dos eritrócitos ...................................................... 35 3.7. Tratamento estatístico ....................................................................................... 35 4. Resultados e Discussão ........................................................................................ 36 4.1. Solvente extrator ............................................................................................... 37 4.2. Análise dos compostos bioativos ...................................................................... 37 4.3. Análise da atividade antioxidante ...................................................................... 42 4.3.1. Atividade captora dos radicais DPPH ........................................................ 43 4.3.2. Poder antioxidante por redução do ião férrico (FRAP) ............................... 44 4.3.3. Avaliação da atividade hemolítica induzida pelo AAPH .............................. 46 4.3.4. Análise morfológica dos eritrócitos ............................................................. 48 4.4. Correlação entre as atividades antioxidantes .................................................... 50 4.4.1. Correlação entre a atividade antioxidante (DPPH) e a redução da hemólise ………………………………………………………………………………………………. 50 4.4.2. Correlação entre atividade antioxidante (FRAP) e a redução da hemólise . 51 4.4.3. Correlação entre as atividades antioxidantes DPPH e FRAP ..................... 51 viii 5. Conclusão ............................................................................................................... 53 6. Bibliografia ............................................................................................................. 55 ix Índice de Figuras Figura 1: Morfologia da Phytolacca americana L. .............................................................. 3 Figura 2: Morfologia específica da flor de Phytolacca americana L. .................................. 4 Figura 3: Distribuição geográfica da Phytolacca americana L., em Portugal. .................... 5 Figura 4: Saponinas triterpénicas bioativas de Phytolacca americana L.. ........................ 11 Figura 5: Fórmulas estruturais dos derivados dos ácidos fenólicos. ................................ 12 Figura 6: Estrutura geral dos flavonoides mais comuns. ................................................. 14 Figura 7: Estrutura química do ácido betalâmico. ............................................................ 16 Figura 8: Estruturas químicas das betalaínas. A) betacianinas e B) betaxantinas ........... 16 Figura 9: Estruturas químicas do -caroteno e da xantofila. ............................................ 20 Figura 10: Morfologia da baga de P. americana L. no momento da colheita. .................. 27 Figura 11: Curva de calibração do padrão de saponina. ................................................. 29 Figura 12: Curva de calibração do ácido gálhico. ............................................................ 29 Figura 13: Curva de calibração da catequina. ................................................................. 30 Figura 14: Microplaca usada no método DPPH. .............................................................. 32 Figura 15: Curva de calibração na determinação do poder antioxidante pelo método FRAP. ............................................................................................................................. 33 Figura 16: Representação gráfica dos teores de compostos bioativos da baga .............. 38 Figura 17: Percentagem de inibição do radical DPPH em função das diferentes concentrações dos extratos hidroalcoólicos das bagas ................................................... 43 Figura 18: Determinação da atividade antioxidante pelo método FRAP .......................... 45 Figura 19: Redução de hemólise induzida por AAPH (%)................................................ 47 Figura 20: Visualização microscópica da Inibição hemolítica das bagas de P. americana L.. .................................................................................................................................... 49 Figura 21: Correlação entre a redução da hemólise e a atividade antioxidante (método DPPH). ............................................................................................................................ 50 Figura 22: Correlação entre a redução da hemólise e a atividade antioxidante (método FRAP). ............................................................................................................................ 51 Figura 23: Correlação entre as atividades antioxidantes medidas pelos métodos DPPH e FRAP. ............................................................................................................................. 52 5 erupções cutâneas (Maness et al., 2014; Patra et al., 2014; Iwakiri et al., 2013). Atualmente investigam-se propriedades anticancerígenas e antivirais associadas a esta planta (Maness et al., 2014). Para além das propriedades supracitadas, alguns estudos têm demonstrado que as suas raízes e folhas apresentam elevado potencial na recuperação de solos contaminados com metais pesados, prejudiciais para o organismo (Fu et al., 2011). A presença de Cádmio (Cd) e Manganês (Mn) nos solos, provenientes de fertilizantes fosfatados e da mineralização industrial diminuem quando a P. americana é plantada (Gao et al., 2013; Fu et al., 2011; Zhao et al., 2011). Em Portugal é possível encontrar esta planta em quase todo o território continental, Açores e ilha da Madeira (Figura 3). Figura 3: Distribuição geográfica da Phytolacca americana L., em Portugal (retirado de www.invasoras.pt/gallery/phytolacca-americana). O estudo das plantas tem acompanhado a evolução do homem através dos tempos e o seu uso como agentes terapêuticos data de milhares de anos (Fowler, 2006). A maior parte dos fármacos usados atualmente, derivaram direta ou indiretamente de princípios ativos, que foram isolados de uma planta ou de um órgão específico da mesma. No caso concreto da P. americana, vários estudos sobre as suas propriedades biológicas têm sido publicados, sempre recorrendo aos diferentes órgãos mais representativos da planta, nomeadamente, raiz, folha e fruto. 6 1.2.1. Raiz A raiz da P. americana L. tem grandes dimensões, uma forma cónica e carnuda e é coberta por uma casca fina de cor castanha (Ravikiran et al., 2011). As raízes secas são utilizadas na fitoterapia e na medicina popular Chinesa no tratamento de tumores, bronquites e processos inflamatórios (Wang et al., 2008). Também estão descritas propriedades expetorantes e aplicações no tratamento de infeções do trato respiratório. No entanto, em doses elevadas ou tratamentos prolongados podem conferir toxicidade ao organismo. Da sua composição química salienta-se a presença de saponinas triterpénicas (Wang et al., 2008) e glicoproteínas (Yamaguchi et al., 2004; Aron e Irvin, 1980) com propriedades biológicas reconhecidas. As raízes podem ser utilizadas no tratamento da dor, inquietação, prostração e no tratamento de inchaços glandulares. Maness et al. (2014) demonstrou que os extratos etanólicos e aquosos da raiz promovem alterações na expressão genética em células do cancro do colon, sugerindo um possível tratamento e cura do mesmo. Segundo Aron e Irvin (1980) a raiz desta planta contém uma proteína com propriedades antivíricas capaz de inibir diferentes vírus. Ryan e Ray (2004) observaram capacidade inibitória na multiplicação do vírus Herpes Simplex (HSV), espécie da família Herpsviridae, responsável por causar infeções em humanos. Num outro estudo foi verificado que a mesma proteína tinha capacidade de inibir 90% da síntese do ADN do HSV (Teltow et al., 1983). As glicoproteínas presentes na raiz, concretamente as lectinas, também são descritas pelas suas propriedades mutagénicas em linfócitos T e B (Ahmad et al., 2009; Yamaguchi et al., 2004; Kino et al., 1995). De facto, foi na década de sessenta que se iniciaram os estudos sobre a capacidade das lectinas aglutinarem células neoplásicas (Aub et al., 1963). A raiz da P. americana L. tem sido amplamente estudada para avaliar o seu efeito em diversos sistemas biológicos. O conhecimento aprofundado da função biológica das saponinas, das lectinas e de outros compostos minoritários no reconhecimento e nas interações celulares, poderão servir de suporte no diagnóstico e no tratamento de muitas doenças. 7 1.2.2. Folha As folhas da P. americana L. são alternas, elíptico-ovais, pontiagudas, inteiras, de cor verde clara, com 10 a 40 cm de comprimento e com pecíolos curtos (Ravikiran et al., 2011). Tal como na raiz, as folhas têm sido alvo de vários estudos. Um dos motivos pelo interesse acrescido do conhecimento dos compostos químicos detetados e consequentes efeitos biológicos a eles associados prende-se com o facto de os compostos bioativos distribuem-se heterogeneamente durante o desenvolvimento e crescimento da planta, podendo encontrar-se em maiores quantidades num órgão específico da mesma. As proteínas inativadoras dos ribossomas (RIP) são proteínas vegetais taxonomicamente não relacionadas, capazes de inativar irreversivelmente a síntese de proteínas em ribossomas de animais, apresentando propriedades antivíricas. A primeira RIP tipo 1 a ser caracterizada foi isolada das folhas da P. americana L., o que suscitou maior interesse pelo estudo desta planta (Günhan et al., 2008; Zhang e Halaweish, 2007; Barbieri et al., 1993). No entanto, as RIP também apresentam atividade abortiva (Barbieri et al., 1993). Embora esta planta seja reconhecida pela sua elevada toxicidade, muitos estudos potenciam o seu uso tanto na área farmacêutica como na medicina. A título de exemplo cita-se o estudo realizado por Patra et al. (2014) que observou uma elevada atividade antibacteriana exercida pelos extratos da folha contra agentes patogénicos associados às doenças periodontais inflamatórias e cáries dentárias. Segundo os mesmos autores, estas folhas podem contribuir para o desenvolvimento de novos produtos terapêuticos naturais, com elevada atividade antimicrobiana e isentos de efeitos secundários na flora natural da cavidade oral. Ding et al. (2013) também descreveu atividade acaricida nas folhas, através do isolamento do esculentósido E (triterpeno glicosilado). Embora esta espécie vegetal possa ser utilizada como planta ornamental, alguns estudos referem o consumo das suas folhas enquanto jovens, após processos de cocção e/ou branqueamento (Karami et al., 2010; Nabavi et al., 2009), mostrando que existe alguma controvérsia sobre a sua toxicidade (Heinrich et al., 2004; Harkness et al., 2003). A atividade antioxidante e anti-inflamatória está intimamente relacionada com a presença de compostos fenólicos, metabolitos secundários sintetizados pelas plantas. Bylka e Matlawska (2001) identificaram diferentes ácidos fenólicos e flavonoides nos extratos metanólicos das folhas de P. americana L.. De entre os ácidos fenólicos foram 8 identificados os ácidos sinápico, p-cumárico, vanílico, cafeico, ferúlico e phidroxibenzoico, enquanto os flavonoides descritos foram o campferol 3-O--D- glucopiranósido, campferol 3-O--D-xilopiranosil (12) --D-glucopiranósido, campferol 3-O--L-ramnopiranosil (12) --D-glucopiranósido, campferol 3-O-diglucósido e quercetina 3-O-glucósido. 1.2.3. Bagas Os frutos da P. americana L. florescem entre julho e setembro em aglomerados de 5 pétalas esbranquiçadas com centros verdes (Ravikiran et al., 2011). Os longos cachos de flores brancas germinam, originando frutos negros azulados, esféricos e achatados, ligados a um pequeno pedúnculo rosa escuro (Figura 1) (Ravikiran et al., 2011). Alguns estudos consideram os frutos edíveis e o seu uso em medicina tradicional (Burrows e Tyrl, 2001; Huang, 1999). Como já referido anteriormente, esta planta é conhecida popularmente por vários nomes comuns, tais como baga-moira, baga-noiva, erva-dos-cachos-da-índia, erva-dos- cântaros, erva-dos-tintureiros, erva-tintureira, gaia-moça, uva-da-américa, vermelhão, vinagreira, tintureira, uva-dos-tintureiros, erva-dos-cancros, tintureira, uva-de-cão, uva-de- rato, todos eles diretamente relacionados com as bagas características desta planta. As atividade biológicas das bagas são muitos semelhantes às já descritas na raiz e nas folhas, caracterizadas por um elevado teor em saponinas e lectinas. A atividade moluscicida foi descrita neste fruto, no controlo de pragas de caracóis (Karunamoorthi et al., 2008). Num estudo realizado em mais de 100 plantas, Kloos e McCullough (1984) reportaram que as bagas imaturas (verdes) da P. americana L. eram as que possuíam maior atividade moluscicida. A toxicidade da baga foi já descrita (Karunamoorthi et al., 2008; Wang et al., 2008) no entanto, alguns estudos referem o seu consumo sem problemas, bem como o das raízes e das folhas jovens (Burrows e Tyrl, 2001; Huang, 1999). A atividade anticarcinogénica foi também descrita, principalmente devido aos efeitos antitumorais e anti-inflamatórios, bem como o estímulo do sistema imunitário. Este efeito parece associado com a presença de uma toxina produzida pela planta, a toxina phytolacca (Ravikiran et al., 2011). As propriedades antioxidantes de determinados compostos também permitem associar esta planta à prevenção do cancro. Compostos como o ácido ascórbico, -caroteno, ácido oleanólico, quercetina e taninos estão descritos como anticarcinogénicos, antitumorais ou antileucémicos (Rangarajan et al., 9 2014; Shanmugam et al., 2014; Chen et al., 2013; Pertino et al., 2013; Cui et al., 2012; Harleva et al., 2012; Kuno et al., 2012; Gomes de Melo et al., 2010; Lee, 2009; Albanes et al., 1995). A morfologia e coloração das bagas também é um fator importante a considerar, não só a nível ornamental como nas possíveis aplicações. Alguns estudos referem que a intensidade da cor negra azulada desta baga está diretamente ligada a um grupo de pigmentos naturais, as betalaínas que podem ser amarelas ou violetas e que substituem as antocianinas em espécies vegetais pertencentes à ordem Caryophyllales (Pavokovi e Krsnik-Rasol, 2011; Tanaka et al., 2008). Segundo Clement e Mabry (1996), a mútua exclusividade de antocianinas e/ou de betalaínas em Caryophyllales levou a vários estudos taxonómicos das referidas plantas (Brockington et al., 2011). Pela presença dos corantes referidos, as bagas apresentam propriedades pigmentantes interessantes para a indústria têxtil (tinturarias) (Liu et al., 2014; Ravikiran et al., 2011) e na indústria vinícola e alimentar, como adulterante em vinhos tintos ou corante doutros alimentos (Ogzewalia et al., 1962). A presença de betalaínas nas bagas também confere propriedades antioxidantes (Zheleva-Dimitrova, 2013; Ravikiran et al., 2011; Nabavi et al., 2010). 1.3. Composição fitoquímica O potencial medicinal da P. americana L. tem sido associado aos diferentes fitoquímicos presentes na mesma (Patra et al., 2014). Muitos estudos demonstram que a maioria das ações terapêuticas exibidas pelas plantas está associada à diversidade de compostos bioativos presentes nas mesmas. Várias classes de compostos de origem vegetal conferem proteção contra doenças degenerativas cerebrais, como Alzheimer, doenças cardiovasculares, vários tipos de cancro, infeções e alterações no sistema imunitário, doenças ósseas, envelhecimento precoce, entre outras, uma vez que estes compostos atuam como antioxidantes, prevenindo ou retardando os danos provocados pelos radicais livres (Liu, 2013; Liu, 2004; Willett, 2002). Acresce o facto de muitas destas biomoléculas serem induzidas pelas plantas como elementos de defesa contra predadores e pragas, razão que justifica o seu amargor. Estes compostos são também capazes de inibir alguns sistemas enzimáticos e de quelatar metais, conferindo-lhes propriedades antibacterianas, antivirais, antifúngicas, moluscicida e inseticida. 10 Estes fitoquímicos precisam de ser isolados e identificados, de forma a possibilitar um melhor entendimento sobre os seus metabolismos de síntese e, consequentemente, os seus potenciais benefícios para a saúde (Liu, 2003). Pelos motivos supracitados, serão referidos alguns grupos de compostos bioativos descritos na P. americana L. para melhor se avaliar a possibilidade de valorização desta planta. 1.3.1. Saponinas A investigação desenvolvida na P. americana L. é bastante limitada no que se refere aos diferentes fitoquímicos existentes, encontrando-se maioritariamente direcionada para o estudo dos saponósidos. De facto, as diferentes partes desta espécie botânica são, atualmente, consideradas excelentes fontes de saponinas triterpénicas, abundantes nos tecidos mais vulneráveis à contaminação por fungos, bactérias, insetos e predadores, intervindo assim no mecanismo de defesa da planta (Cheok et al., 2014; Manase, 2013). Para além de conferirem proteção à planta, estes compostos possuem outras propriedades biológicas que permitem a sua utilização na medicina tradicional (Manase, 2013). A composição qualitativa e quantitativa das saponinas varia com as condições edafoclimáticas, fase de maturação e parte da planta de onde são extraídas (Dini et al., 2009). As saponinas encontram-se no reino vegetal e são compostos não voláteis e surfatantes (Manase, 2013). Possuem uma estrutura anfipática formada por resíduos hidrofílicos de açúcares ligados a uma aglicona hidrofóbica. A aglicona é composta por átomos de carbono organizados em forma de anéis, denominada sapogenina. Na indústria farmacêutica, cosmética, química e alimentar as saponinas são muito utilizadas, dado a sua facilidade de dissolução em água, originando soluções afrógenas (espumantes), por diminuição da tensão superficial do líquido. Apresentam ainda propriedades emulsionante e de hemólise. Esta última deve-se à capacidade do glicósido se combinar com moléculas de colesterol presentes na membrana dos eritrócitos, perturbando o equilíbrio interno-externo, promovendo a rutura da célula e consequente libertação da hemoglobina (Manase, 2013). Devido ao elevado número de saponinas já identificadas, a P. americana L., traz benefícios na área agrícola, sendo um excelente aliado na descontaminação de solos cultivados e pela sua ação pesticida natural (Manase, 2013). 11 Já foram identificadas 12 saponinas nesta espécie vegetal, mas 7 foram descritas por um único autor (Yi, 1992; 1991; 1990). Mais recentemente, Wang et al. (2008) identificaram mais 5 saponinas (Figura 4), atribuindo-lhes propriedades expetorantes e diuréticas. Estes autores sugerem que possam ser utilizadas como adjuvantes para aumentar a absorção de medicamentos, pelo aumento da solubilidade ou interferência nos mecanismos de absorção e, como adjuvantes para aumentar a resposta imunológica. Também devido às suas propriedades detergentes, estas podem ser usadas na indústria química na preparação de emulsões para filmes fotográficos e na indústria de cosméticos na formulação de batons e champôs (Cheeke, 2000). As saponinas triterpénicas encontram-se em muitas leguminosas, como a soja, feijão, ervilha e podem ser utilizadas pela indústria alimentar como aditivos, nomeadamente, aromatizantes e agentes espumantes e conservantes (Cheok et al., 2014). A sua atuação nas diferentes fases do desenvolvimento tumoral, principalmente no caso da próstata, mama e colon, intensificaram a busca de saponinas no reino vegetal (Cheok et al., 2014; Dini et al., 2009). Dini et al. (2009), mencionaram ainda propriedades antioxidantes, antirreumáticas, cardioprotetoras, anti-trombóticas, anti-inflamatórias, hepatoprotetoras e antidiabéticas. Phytolaccagenina Ácido phytolaccagénico -D-glucopiranosil -D-glucopiranosil-(14)--D-xilopiranosil -D-glucopiranosil-(12)--D-glucopiranosil-(14)--D-xilopiranosil Figura 4: Saponinas triterpénicas bioativas extraídas da P. americana L. (adaptado de Wang et al., 2008). 12 1.3.2. Ácidos fenólicos e flavonoides A presença dos compostos fenólicos nas plantas tem sido muito estudada devido às suas atividades farmacológica e antinutricional, capazes de inibir a oxidação lipídica e a proliferação de fungos (Baskaran et al., 2014; Kumar e Pandey, 2013; Yao et al., 2004; Heim et al., 2002), além de participarem nos processos metabólicos responsáveis pela cor, adstringência e aroma das plantas (Harborne e Williams, 2000). Diversos trabalhos científicos têm sido realizados no sentido de efetuar a separação, identificação, quantificação e utilização dos compostos fenólicos em espécies vegetais, uma vez que este grupo engloba uma gama enorme de substâncias (fenóis simples, ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides, taninos e ligninas). Alguns compostos fenólicos não se apresentam na forma livre, mas sim sob a forma de polímeros, nomeadamente taninos e ligninas. Os ácidos fenólicos (Figura 5) dividem-se em três grupos distintos. O primeiro é composto pelos ácidos benzóicos, que possuem sete átomos de carbono (C6-C1) sendo os ácidos fenólicos mais simples encontrados na natureza; o segundo é formado pelos ácidos cinâmicos com nove átomos de carbono (C6-C3), sendo estes os comumente encontrados no reino vegetal e, por último, as cumarinas que derivam do ácido cinâmico por ciclização da cadeia lateral do ácido o-cumárico. Figura 5: Fórmulas estruturais dos derivados dos ácidos fenólicos. Os ácidos fenólicos caracterizam-se pela presença de um anel benzénico, um grupo carboxílico e um ou mais grupos de hidroxilos e/ou metoxilos na molécula, conferindo-lhe 13 propriedades antioxidantes, tanto para as plantas como para o organismo humano, sendo, por isso, indicados para o tratamento e prevenção do cancro e doenças cardiovasculares, entre outras. Até à data existem poucos estudos sobre a caracterização do perfil de ácidos fenólicos na P. americana L.. Bylka e Matlawska (2001) identificaram os ácidos sinápico, p-hidroxibenzóico, vanílico, p-cumárico, ferúlico e cafeico nas folhas da planta. Posteriormente, foram identificados os ácidos cinâmico, clorogénico, gálhico e protocatéquico (Kim et al., 2005). Embora estes estudos reportem a presença destes compostos nas folhas, é do conhecimento geral que a sua distribuição ao longo dos diferentes órgãos é muito heterogénea, encontrando-se maioritariamente nos órgãos superiores da mesma, uma vez que conferem proteção. Muitos estudos destacam as propriedades dos fitoquímicos como substâncias antioxidantes sequestradoras de radicais livres. Parece que os efeitos biológicos desses antioxidantes são diversos e envolvem respostas mediadas pelas células e a modulação de várias vias de sinalização celular. As hipóteses sobre os mecanismos de ação dos fitoquímicos resultam, frequentemente, do conhecimento das suas estruturas químicas e das suas propriedades físico-químicas. Presentemente, o desafio está em interpretar as complexas relações entre os fitoquímicos presentes nas plantas e a saúde, tendo em conta, quer a diversidade das suas estruturas químicas, quer a complexidade dos seus efeitos metabólicos, bem como a sua biodisponibilidade e absorção no metabolismo humano (Manach et al., 2009). Devido às suas propriedades biológicas, especificamente antioxidantes, alguns estudos já mencionaram o teor de fenólicos totais nas raízes, folhas e bagas da P. americana L. (Zheleva-Dimitrova, 2013; Nabavi et al., 2009; Hosseinimehr et al., 2007; Kim et al., 2005). Os flavonoides integram o grupo dos compostos fenólicos, sendo constituídos por estruturas polifenólicas. Estão presentes habitualmente nas folhas, flores, raízes e frutos das plantas. As suas principais classes são os flavonóis, flavonas, flavanonas, flavanas, isoflavonoides e antocianinas. Estes compostos são quimicamente constituídos por um núcleo de três anéis fenólicos (Tapas et al., 2008). O primeiro anel benzeno (Anel A) é condensado com o sexto carbono do terceiro anel (Anel C), que na posição 2 carrega um grupo fenil como substituinte (Anel B) (Sandhar et al., 2011). Devido ao facto deste terceiro anel se apresentar na forma de um anel pirona, torna-se responsável pela formação da maioria das diferentes classes destes compostos, recebendo a denominação do núcleo 4–oxo (Figura 6) (Sandhar et al., 2011). 14 Figura 6: Estrutura geral dos flavonoides mais comuns com anéis e posições numeradas (retirado de Sandhar et al., 2011). No que respeita à estrutura química, os flavonoides podem ocorrer como agliconas, glicósidos ou como parte de outras estruturas que contenham flavonoides, como por exemplo as flavoligninas. No entanto, as formas maioritárias no reino vegetal são as glicosiladas. Os flavonoides são antioxidantes eficazes devido às suas propriedades quelantes de radicais livres e iões metálicos, conferindo proteção aos tecidos celulares e atuando contra a peroxidação lipídica (Kandaswami e Middleton, 1994). De uma forma geral, a propriedade antioxidante está direcionada para o radical hidroxilo (OH) e anião superóxido (O2-), ambos espécies altamente reativas envolvidas na iniciação da peroxidação lipídica. Para além desta ação, os flavonoides apresentam propriedades estabilizadoras de membrana, podendo afetar alguns processos do metabolismo intermediário (Formica e Regelson, 1995). Embora os flavonoides apresentem propriedades antioxidantes importantes na prevenção de doenças crónicas, alguns estudos têm vindo a demonstrar atividade pró-oxidante in vitro (Procházková et al., 2011; Simić et al., 2007; Sakihama et al., 2002; Dičkancaitė et al., 1998). Na P. americana L. foram identificados os campferol 3-O--D-glucopiranósido, campferol 3-O--D-xilopiranosil (12)--D-glucopiranósido, campferol 3-O--L- ramnopiranosil (12) --D-glucopiranósido, campferol 3-O-diglucósido e quercetina 3-O- glucósido (Bylka e Matlawska, 2001). Poucos estudos procuraram a identificação destes compostos nos diferentes órgãos da planta. Sugere-se o desenvolvimento de mais estudos, para a na identificação do perfil completo dos diferentes órgãos vegetais, visando relacioná-los com as propriedades biológicas anteriormente referidas. 21 efeito protetor contra algumas doenças crónicas. Por exemplo, foi observado um efeito sinérgico entre o β-caroteno e as vitaminas C e E (antioxidantes naturais) na proteção celular, provavelmente decorrente da capacidade do β-caroteno destruir radicais livres e reparar os radicais de tocoferol produzidos pela ação do αtocoferol (Delgado-Vargas et al., 2000). Não estão descritos carotenoides na P. americana L., no entanto, carotenoides como a zeaxantina, violaxantina e luteína são, invariavelmente, encontrados em folhas e hastes das plantas em geral. Em contraste, os carotenoides em tecidos não-verdes mostram composições distintas que dependem das espécies vegetais (Tanaka et al., 2008). Por exemplo, a Bixa orellana é a única planta que acumula bixina (também conhecida como anato, e usada em alimentos e cosméticos como um aditivo de cor vermelha) nas suas sementes (Bouvier et al., 2003). Assim torna-se importante estudar os carotenoides das bagas de P. americana L. para caracterizar exaustivamente este fruto e promover a sua utilização. 1.4. Interesse farmacológico Durante o decurso desta revisão bibliográfica foram referidas diferentes atividades biológicas associadas à P. americana L. Independentemente dos diferentes órgãos estudados, e de uma maneira geral, as propriedades biológicas atribuídas advêm de diferentes grupos de compostos bioativos presentes em todas as partes da planta. Muitos estudos realizados até à data mencionam benefícios no tratamento de tumores (Das et al., 2014; Maness et al., 2014; Patra et al., 2014; Ding et al., 2012), atividade antiinflamatória (Patra et al., 2014; Ding et al., 2012; Ravikiran et al., 2011; Nabavi et al., 2009),utilidade em tratamentos dermatológicos, nomeadamente em doenças cutâneas, incluindo acne e erupções escamosas (Ravikiran et al., 2011), regeneração dos tecidos ósseos e dos tecidos moles e tratamento de dores de garganta e amigdalites (Ravikiran et al., 2011). A atividade antimicrobiana também foi descrita na raiz, folhas e bagas da Phytolacca americana L. (Patra et al., 2014; Boo et al., 2012; Ding et al., 2012; Nabavi et al., 2009). A atividade antioxidante é uma das propriedades biológicas mais estudadas no reino vegetal. Devido à sua importância no metabolismo humano, já foram realizados estudos em plantas inteiras ou em órgãos específicos. Os benefícios do uso de plantas com ação antioxidante já são do conhecimento geral e sabe-se que auxiliam na eliminação de espécies reativas de oxigénio (ERO), e espécies não radicalares do oxigénio, sendo as 22 mais relevantes os radicais superóxido (O2-), hidroxilo (OH), peroxilo (ROO), alcoxilo (RO), peróxido de hidrogénio (H2O2), ácido hipocloroso (HOCl) e o oxigénio singleto (1O2) (Kunwar e Priyadarsini, 2011; Lobo et al., 2010; Valko et al., 2007). A descoberta de compostos antioxidantes eficazes na eliminação de radicais livres, naturais, isentos de toxicidade e com boa biodisponibilidade para atravessar os tecidos e a barreira hemato-encefálica é uma mais vaila. Zheleva-Dimitrova (2013) estudou a atividade antioxidante das folhas e bagas de P. americana L. através de diversos métodos Já Nabavi et al. (2009), também avaliaram o poder antioxidante destas bagas, verificando um elevado potencial. Mais estudos deverão ser levados a cabo, recorrendo a diferentes metodologias analíticas para avaliar a atividade antioxidante desta planta. 1.5. Toxicidade Vários estudos mencionam a P. americana L. como um espécie tóxica (Park et al., 2014; Nabavi et al., 2009; Wang et al., 2008; Ogzewalla et al., 1963), devido a perturbações gastrointestinais, como náuseas, vómitos e diarreia após o seu consumo. Segundo Ogzewalla et al. (1963), a administração de doses elevadas podem inclusive promover estados de sonolência, vertigens, perda de visão, prostração e, por vezes, convulsões, seguidas de morte por paralisia respiratória. Park et al. (2014) salientaram que a ingestão das bagas de P. americana L. promove distúrbios gastrointestinais, acompanhados por pulso e respiração enfraquecida, observados em bovinos e aves. Já Barnett, em 1975, mencionou que muitas aves consomem bagas de P. americana L. e não manifestaram os efeitos tóxicos supracitados. As bagas, concretamente o sumo das bagas é usado como aditivo alimentar, por exemplo como corante alimentar vermelho natural (E162) (Esatbeyoglu et al., 2015) e como adulterante do vinho tinto na indústria vinícola, o que permite subentender que não existe toxicidade nas bagas. Segundo Ogzewalla et al. (1963) a toxicidade da baga é devida às sementes e não à polpa. 23 2. Objetivos 24 2.1. Objetivo geral Esta dissertação teve o intuito de valorizar as bagas da espécie Phytolacca americana L., planta herbácea invasora, cuja aplicação nas indústrias alimentar e farmacêutica ainda é escassa. O objetivo primordial foi determinar o teor em compostos bioativos e a atividade antioxidante das bagas, como estudo piloto. Pretende-se a sua futura utilização nas indústrias alimentar (aplicação em suplementos alimentares/alimentos funcionais) e farmacêutica (por ex. suplementos, cosmética, entre outros), respondendo às questões emergentes de sustentabilidade ambiental, social e económica. 2.2. Objetivos específicos Foi desenvolvido um conjunto de tarefas laboratoriais, articuladas entre si, procurando respostas sequenciais e cumulativas para os seguintes objetivos específicos: - Obtenção de extratos hidroalcoólicos, a partir de um processo de extração sólido/líquido. - Quantificação do teor de fenólicos totais, flavonoides, saponinas e carotenoides. - Avaliação da atividade antioxidante in vitro dos extratos obtidos, recorrendo a duas metodologias diferentes e complementares (DPPH· e FRAP). - Avaliação da percentagem de inibição de hemólise em eritrócitos humanos recorrendo ao método de adição do oxidante AAPH. 25 3. Material e Métodos 26 A realização do trabalho laboratorial decorreu no Departamento de Ciências Químicas e no Departamento de Ciências Biológicas (Serviço de Bioquímica), da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. 3.1. Reagentes AAPH (2,2'- azo-bis(2-amidinopropano)) (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) Acetato de sódio (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) Acetona (Merck, Hohenbrum, Germany) Ácido gálhico - padrão (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) Ácido Sulfúrico (Merck, Darmstadt, Germany) Carbonato de sódio (Merck, Darmstadt, Germany) Catequina - padrão (SIGMA Aldrich, Inc., St. Louis, U.S.A.) Cloreto de alumínio (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) Cloreto férrico (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) DPPH• (radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo) (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) Etanol absoluto (Fisher Chemical, Loughborough, U.K.) Hidróxido de sódio (Merck, Darmstadt, Germany) Nitrito de sódio (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) n-Hexano (Merck, Darmstadt, Germany) Reagente de Folin-Ciocalteau (Merck, Darmstadt, Germany) Saponina - padrão (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) Sulfato ferroso (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) TPTZ (2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazina) (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) Vanilina (SIGMA Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) 3.2. Equipamentos Câmara de Azoto (Stuart – SBHCONC/1, Biocote, U.K.) Centrífuga (Heraeus Sepatech - Megafuge 1.0, Germany) 27 Espetrofotómetro (SHIMADZU, UV-1800, Japan) Incubadora (Binder, Germany) Leitor microplacas (BioTek Instruments, Synergy HT GENS5, U.S.A.) Liofilizador (Telstar – Cryodos, Spain) Microscópio (Nikon DS – Eclipse CI, Japan) Moinho (GM 200, RETSCH, Haan, Germany) Placa de agitação (VARIOMAG, TELEMODUL 40 CT, H+P Labortechnik, Germany) Vortex (VWR INTERNATIONAL, Darmstadt, Germany) 3.3. Amostras A amostra estudada neste trabalho corresponde às bagas maduras da espécie Phytolacca americana L. (Figura 10). Os frutos foram colhidos no litoral norte de Portugal, concelho de Amarante, freguesia de S. Simão de Gouveia, Lugar de Friande (41º 13’ 1’’ N, 8º 4’ 11’’ O) em agosto de 2014. Durante a seleção e preparação da amostra mantiveram-se controlados diversos fatores, tais como região de colheita, estado de maturação do fruto e exposição à radiação solar. Figura 10: Morfologia da baga da P. americana L. no momento da colheita. Após receção das bagas, as mesmas foram congeladas a - 80 ºC, liofilizadas e, posteriormente, trituradas para garantir maior homogeneização da amostra. A amostra pulverizada foi conservada em frascos hermeticamente selados e mantida ao abrigo da luz, antes de ser utilizada para as determinações analíticas. 28 3.4. Preparação dos extratos Num estudo preliminar, procedeu-se à avaliação da melhor relação entre a massa do fruto (g) e a quantidade de solvente (mL) para garantir a maior recuperação dos compostos. Foram estudadas as relações 1:50 e 1:100 (m/v), tendo-se verificado que a melhor proporção para garantir maior extração dos compostos bioativos era de 1:100 (m/v). Posteriormente foram cumpridas as condições de extração descritas por Costa et al. (2014). Aproximadamente 0,5 g de amostra foi dissolvida em 50 mL de uma mistura hidroalcoólica (50/50, v/v), sendo a extração efetuada em placa de aquecimento (40 ºC) com agitação constante (600 rpm) durante 1 hora. Os extratos foram filtrados por gravimetria e congelados a -25 ºC para posterior análise. 3.5. Determinação dos compostos bioativos 3.5.1. Determinação de teor de saponinas O teor de saponinas seguiu o procedimento experimental descrito por Helaly et al. (2001), com ligeiras modificações. Ao extrato hidroalcoólico (descrito no ponto 3.4.) foram adicionados uma mistura de 0,5 mL de vanilina (8%) em etanol e 5,0 mL de ácido sulfúrico (72%), mantidas em banho de gelo. Após homogeneização da mistura, a mesma foi colocada num banho termostatizado, a 60 ºC durante 20 minutos. Posteriormente, a solução foi arrefecida no mesmo banho de gelo e, seguidamente, efetuaram-se as leituras espetrofotométricas a 544 nm. Para proceder ao cálculo do teor de saponinas, construíu-se uma curva de calibração (Figura 11), recorrendo a um padrão de saponina com concentração inicial de 200 mg/L e os resultados expressos em mg equivalentes saponina (ES)/ g de amostra. 29 y = 0,0008x + 0,1066 R² = 0,999 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 050 100 150 200 250 Abs (544 nm) Concentração de saponina (mg/ L) Figura 11: Curva de calibração do padrão de saponina. 3.5.2. Fenólicos totais A determinação do teor de fenólicos totais dos extratos hidroalcoólicos foi efetuada por um método espetrofotométrico, utilizando o reagente Folin-Ciocalteau (RFC), segundo metodologia previamente descrita por Alves et al. (2010). A 500 µL de extrato adicionaram-se 2,5 mL de RFC diluído em água desionizada (1:10) e 2,0 mL de carbonato de sódio para alcalinizar a solução. A solução final foi colocada em banhomaria a 45 ºC durante 15 minutos ao abrigo da luz e, posteriormente, mantida à temperatura ambiente durante 30 minutos. As leituras foram efetuadas a 765 nm e os resultados finais foram calculados a partir de uma curva de calibração usando o ácido gálhico como padrão (Figura 12). Os ensaios foram efetuados em triplicado e os resultados expressos em mg equivalentes ácido gálhico (EAG)/ g de amostra. y = 0,0054x + 0,0685 R² = 0,9991 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 020 40 60 80 100 120 Abs (765 nm ) Concentração de ácido gálhico (mg/ L) Figura 12: Curva de calibração do ácido gálhico. 30 3.5.3. Flavonoides O método usado para a determinação dos flavonoides seguiu a metodologia previamente descrita por Lin e Tang (2007) com ligeiras modificações. A absorvência foi determinada a 510 nm, correspondendo ao máximo de absorção do complexo AlCl3-flavonoide formado. A catequina foi o padrão utilizado para construir a curva de calibração e quantificação nos extratos estudados (Figura 13). Num tubo de ensaio colocou-se 1,0 mL de extrato, 4,0 mL de água desionizada e 300 µL de nitrito de sódio (5%). Após 5 minutos, adicionaram-se 300 µL de AlCl3 a 10% e, após 1 minuto, adicionaram-se 2,0 mL de solução de hidróxido de sódio (1 mol/ L) e 2,4 mL de água desionizada. Os ensaios foram efetuados em triplicado e os resultados expressos em mg equivalentes catequina (EC)/ g de amostra. y = 0,0002x + 0,0427 R² = 0,9991 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0100 200 300 400 500 AbS (510 nm) Concentração de catequina (mg/ L) Figura 13: Curva de calibração da catequina. 3.5.4. Determinação de carotenoides Os carotenoides foram quantificados por colorimetria, utilizando-se um espetrofotómetro de UV da marca Shimadzu, segundo procedimento publicado por Vinha et al. (2014). Aproximadamente 0,5 g de amostra foram submetidas a um processo de extração com uma mistura apolar de acetona-n-hexano (4:6, v/v). Após centrifugação (30 minutos a 3500 rpm) recolheu-se o sobrenadante para efetuar as leituras das absorvências a diferentes comprimentos de onda, de forma a quantificar os teores de clorofila a, clorofila b, licopeno e β-caroteno, segundo as equações: 37 O interesse em estudar a P. americana L. prende-se com o facto de se tratar de uma espécie adaptada a ambientes humanos e perturbados, como bermas de caminhos e terrenos baldios, comportando-se como invasora. Essa característica aumenta o interesse no seu estudo, uma vez que os encargos agrícolas são inexistentes e a sua distribuição pelo território nacional é elevada. Para além das propriedades biológicas associadas à baga desta planta, já referidas anteriormente, a caracterização química e a avaliação do seu potencial antioxidante ainda não foram estudados na P. americana L. crescida em Portugal. Admitindo-se que as condições edafo-climáticas interferem significativamente no metabolismo secundário das plantas, esta planta pode ser vantajosa como recurso natural e sustentável para futuras aplicações na área alimentar, farmacêutica e cosmética. Assim, neste capítulo serão apresentados e discutidos os teores de compostos bioativos e a avaliação da atividade antioxidante das bagas de P. americana L. colhida numa determinada região de Portugal. 4.1. Solvente extrator Durante a pesquisa bibliográfica verificou-se a existência de inúmeros estudos associados às condições de extração dos compostos bioativos. Contudo, também se verificou que a maior parte desses estudos valoriza apenas a quantidade de compostos extraídos, baseados na natureza dos solventes. Entre alguns solventes descritos, o metanol é o mais utilizado, simples ou em diferentes concentrações aquosas, no entanto, a sua toxicidade e valor económico nunca foi considerado pelos autores. Por esse motivo, neste estudo optou-se por usar uma mistura hidroalcoólica (50%:50%) nas mesmas condições de extração previamente validadas por Costa et al. (2014). Os extratos foram preparados a partir de 0,5 g de amostra em 50 mL de uma solução hidroalcoólica, durante 1 hora, a 40 ºC, com agitação constante. 4.2. Análise dos compostos bioativos Os compostos analisados nos extratos hidroalcoólicos das bagas foram os fenólicos totais, flavonoides e saponinas, recorrendo a técnicas espetrofotométricas. Para a determinação dos teores de carotenoides recorreu-se a uma técnica de extração diferente, usando-se uma mistura de solventes apolares (acetona: n-hexano), sendo posteriormente também quantificados por espetrofotometria. 38 Os resultados obtidos referentes à quantificação dos fenólicos totais, flavonoides e saponinas encontram-se descritos na Tabela 2 e para melhor visualização e interpretação dos resultados, os mesmos estão graficamente representados na Figura 16. Tabela 2. Teores totais dos compostos bioativos da baga de P. americana L... Fenólicos totais* (mg EAG/ g) Flavonoides* (mg EC/ g) Saponinas* (mg S/ g) Extrato da baga 91,0 ± 0,44 52,1 ± 7,04 634,5 ± 39,71 *Valores expressos em média ± desvio padrão, para n=3. 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0 600,0 700,0 Fenólicos Flavonoides Saponinas mg composto/ g amostra Figura 16: Representação gráfica dos teores de compostos bioativos estudados na baga de P. americana L. Pelos resultados (Tabela 2 e Figura 16) verifica-se que os teores de saponinas são significativamente superiores aos teores de flavonoides e de fenólicos totais encontrados no extrato do fruto, respetivamente. Esta ordem de concentrações está em concordância com outros estudos realizados na mesma planta. De facto muitos estudos realçam o teor de saponinas nesta espécie vegetal, não atribuindo tanto ênfase aos fenólicos totais e flavonoides (Ding et al., 2013; Getiya et al., 2011; He et al., 2011; Galarraga et al., 2010; Wang et al., 2008). O teor de fenólicos totais na amostra apresentou um valor 39 ligeiramente inferior aos descritos por outros autores. Zheleva-Dimitrova (2013) e Nabavi et al. (2009) obtiveram concentrações de 174,76 mg (EAG)/ g e de 102,11 mg (EAG)/ g, respetivamente em extratos metanólicos da baga. Esta diferença, principalmente com o valor descrito por Zheleva-Dimitrova (2013), poderá estar associada às condições de extração e condições edafo-climáticas. O metanol é o solvente mais utilizado para extrair compostos fenólicos em matrizes vegetais, considerado por muitos autores como o solvente com maior capacidade extratora (Moran-Palacio et al., 2014; Barros et al., 2011; Ebrahimzadeh et al., 2010). No entanto, face à sua toxicidade e custo elevado, não se adequa o seu uso em matérias que possam ser edíveis. O tempo de extração também pode interferir no rendimento dos teores de compostos obtidos. Por exemplo, Ebrahimzadeh et al. (2010) utilizou 3 dias (25 ºC) para a recuperação dos compostos fenólicos, enquanto no trabalho que se apresenta o tempo de contacto entre o solvente e a matriz foi de 1 h (40 ºC). As condições edafo-climáticas também exercem uma grande influência no teor de compostos bioativos. Temperaturas elevadas, baixa pluviosidade e condições do solo podem potenciar o stresse hídrico na planta, favorecendo a síntese de metabolitos secundários. As bagas estudadas por Ebrahimzadeh et al. (2010) e por Nabavi et al. (2009) foram colhidas no Irão, mais concretamente na floresta de Mazandaran onde as temperaturas são idênticas às do norte de Portugal. No entanto, as bagas estudadas por Zheleva-Dimitrova (2013) foram colhidas na Bulgária que embora tenham temperaturas médias idênticas a Portugal, as variações climáticas são mais drásticas, podendo interferir na síntese metabólica secundária da planta. Os flavonoides tal como a maioria dos compostos fenólicos exibem diferentes funções biológicas, incluindo ações antialérgicas, antivirais, anti-inflamatórias e vasodilatadoras (Tanaka e Takahashi, 2013; Magrone e Jirillo, 2012; Visioli et al., 2011; Manach et al., 2004; Middletonet et al., 2000). O número de grupos hidroxilo, a natureza dos grupos substituintes e as suas posições específicas na estrutura dos anéis influenciam a função dos flavonoides como moduladores da atividade enzimática ou como antioxidantes in vitro e in vivo. Devido à elevada diversidade de estruturas que este grupo de compostos tem e às muitas propriedades biológicas a eles associadas, a determinação dos flavonoides numa matriz natural revela-se importante. Os teores de flavonoides encontrados nos extratos hidroalcoólicos estudados foram superiores aos descritos por Zheleva-Dimitrova (2013) (24,7 mg EC/ g) e por Nabavi et al. (2009) (15,9 mg EC /g). Todos obtiveram teores de flavonoides inferiores aos teores de fenólicos totais, resultados que estão concordantes com os obtidos neste trabalho. 40 Existem poucos estudos realizados nas bagas de P. americana L., sendo preferencialmente estudadas as folhas e raízes da mesma, o que restringe possíveis comparações entre os teores de fitoquímicos estudados. Outra possível justificação para a diferença dos teores de flavonoides prende-se com a polaridade do solvente extrator. Zheleva-Dimitrova (2013) e Nabavi et al. (2009) quantificaram o teor de flavonoides a partir de extratos metanólicos, enquanto neste trabalho, usou-se uma mistura hidroalcoólica (50:50). O metanol, embora mais polar do que o etanol, apresenta menos polaridade do que a água. Por outro lado, quanto maior a cadeia carbonada de um composto menor a solubilidade em solventes polares. Como neste estudo se utilizou uma mistura hidroalcoólica, o solvente além de ter adquirido maior polaridade, favoreceu assim as ligações intramoleculares e de hidrogénio e, consequentemente promoveu o aumento da extração destes compostos na amostra. Numa perspetiva futura, sugere-se que sejam realizados mais ensaios para identificar e quantificar o teor de flavonoides, recorrendo a técnicas mais rigorosas, como por exemplo, HPLC. As saponinas são o grupo de compostos bioativos mais descritos na bibliografia, presentes nas bagas e raízes da P. americana L.. Contudo não foram encontradas publicações com quantificação de saponinas por espetrofotometria. Os resultados obtidos evidenciam que a sua concentração é significativamente superior aos teores dos outros compostos estudados (Tabela 2 e Figura 16). A importância desta classe de metabolitos secundários é responsável do seu uso a nível industrial, apresentando uma ampla utilização nas áreas alimentares, têxtil e cosmética, além das suas propriedades biológicas já previamente referidas, incluindo ação antiplaquetária, hipocolesterolémica antitumoral, antivírica, imunoadjuvante, antiinflamatória, antibacteriana, antifúngica e leishmanicida (Yendo et al., 2010). Mediante os teores encontrados nas bagas de P. americana L. nacional e pelas propriedades biológicas supracitadas, considera-se que as saponinas e, consequentemente, estas bagas possam ser promissoras para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou nutracêuticos naturais. O teor de carotenoides também foi estudado. Embora não sejam os pigmentos naturais predominantes nas bagas de P. americana L., mas sim as betalaínas, podem estar relacionados com o processo de desenvolvimento e maturação das mesmas, uma vez que são os únicos pigmentos que participam diretamente no processo de fotossíntese da planta (Auldridge et al., 2006). 41 Foram quantificados os teores de clorofila a, clorofila b e os dois carotenos predominantes no reino vegetal (-caroteno e licopeno) e os resultados estão apresentados na tabela 3. Tabela 3. Teores de clorofilas e carotenos da baga de P. americana L.. Carotenoides (mg/ g) Clorofila aClorofila bβ - Caroteno Licopeno 12,9 0,13 6,4 0,01 2,4 0,08 2,2 0,02 *Valoresexpressosem média ±desviopadrão,paran=3. Relativamente ao teor de carotenoides totais, verificou-se existir uma predominância de clorofila a, aproximadamente o dobro do teor de clorofila b. Segundo Streit et al. (2005) as clorofilas a e b encontram-se na natureza numa proporção de 3:1, respetivamente, e diferem nos substituintes de carbono C-3. Os teores de carotenos, - caroteno e licopeno, foram muito similares e bastante inferiores aos obtidos nas clorofilas (a e b). Crê-se que este estudo tenha sido pioneiro, face à inexistência de artigos científicos que descrevam os teores de carotenoides nas bagas de P. americana L.. As clorofilas são os pigmentos naturais mais abundantes presentes nas plantas e ocorrem nos cloroplastos das folhas e noutros tecidos vegetais, incluindo os frutos. A sua ausência é total nas raízes da planta. Alguns estudos realizados em diferentes espécies de plantas caracterizam os pigmentos clorofílicos como predominantes, mas face à sua instabilidade, sofrem hidrólise durante o amadurecimento e maturação dos frutos. As diferenças aparentes na cor de um vegetal são devidas à presença e distribuição variável de outros pigmentos associados (carotenos, xantofilas, antocianinas e betalaínas). Embora já se tenha referido que a coloração das bagas de P. americana L. é devida às betalaínas, é importante estudar os pigmentos fotossintéticos presentes na mesma, uma vez que a sua abundância varia de acordo com a espécie vegetal e também devido ao facto da clorofila a estar presente em todos os organismos que realizem fotossíntese. 42 Por outro lado, as clorofilas exercem efeitos benéficos para a saúde, pelas suas propriedades antimutagénicas e antigenotóxicas (Lila, 2004; Ferruzzi et al., 2002). Os teores de carotenos encontrados nas bagas foram pouco representativos, demonstrando, uma vez mais, que não são os pigmentos naturais predominantes nesta espécie vegetal. Pela análise global do perfil quantitativo dos diferentes bioativos estudados, reforçase a ideia da importância de um estudo mais exaustivo e mais abrangente, isto é, identificar e quantificar mais grupos de compostos bioativos, recorrer a outros solventes para uniformizar a base de dados dos resultados obtidos e dos já publicados noutros estudos e estudar possíveis aplicações da baga não só numa perspetiva alimentar como farmacêutica. 4.3. Análise da atividade antioxidante É do conhecimento geral que os compostos bioativos não possuem a mesma atividade antioxidante, pelo que um aumento da concentração de um determinado composto não significa um aumento proporcional da atividade antioxidante (Sanjust et al., 2008). Quando se procede a uma avaliação de um extrato complexo, independentemente da natureza do solvente extrator, é necessário considerarem-se os efeitos sinérgicos ou antagónicos entre os diversos compostos presentes, o que torna não só, a atividade antioxidante dependente da concentração de cada composto, mas também da interação entre os diferentes compostos. Não se deve excluir a possibilidade de existência de outras moléculas presentes nas bagas de P. americana L. ainda não identificadas que possam afetar a atividade antioxidante, como por exemplo alcaloides, cumarinas, quinonas, taninos, entre outros. Assim, a atividade antioxidante de uma e qualquer matriz vegetal poderá sugerir a contribuição relativa da soma dos seus constituintes com ação antioxidante. Mediante os dados publicados até à data, os polifenóis, os carotenoides e a vitamina C (Egea et al., 2010) parecem ser os melhores indicadores dessas ações. O desenvolvimento de novos métodos analíticos para a determinação da atividade antioxidante ou quantificação de antioxidantes específicos em matrizes complexas, como os extratos vegetais, pode ser justificado pela relevância comercial e farmacológica destes compostos, bem como pela necessidade de metodologias mais simples e económicas (Palanisamy et al., 2011). 43 4.3.1. Atividade captora dos radicais DPPH A avaliação da atividade antioxidante nos diferentes métodos usados foi efetuada a partir de diferentes concentrações de extrato (2,6; 1,3; 0,650; 0,325; 0,162; 0,081 e 0,041 mg/ mL) correspondendo aos fatores de diluição de 1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:74, respetivamente. A solução de DPPH (radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo) está disponível comercialmente e apresenta uma cor violeta forte (Karadag et al., 2009). O radical DPPH na presença de antioxidantes dadores de átomos de H, como é o caso dos fenóis, ou eletrões, é reduzido formando um produto amarelo, com consequente diminuição da absorvência. Quando existem compostos antioxidantes na solução, esta coloração perde a sua intensidade ou desaparece. O DPPH é convertido em hidrazina, de cor amarela pálida, resultando numa diminuição da absorvência entre 515 e 528 nm, até valores constantes. Como é possível constatar, através da Figura 17, a atividade antioxidante é diretamente proporcional à concentração de extrato de bagas de P. americana L., sendo que o extratos com maior atividade antioxidante (42,4 e 42,3%) foram os mais concentrados, correspondentes a 2,6 mg/ mL e 1,3 mg/ mL, respetivamente. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 2,6 1,3 0,65 0,325 0,162 0,081 0,041 % Inibição do radical DPPH Concentraçãodo extrato das bagas de Phytolacca americana (mg/ mL) Figura 17: Percentagem de inibição do radical DPPH em função das diferentes concentrações dos extratos hidroalcoólicos das bagas de P. americana L. 44 Devido aos valores obtidos serem inferiores a 50% da percentagem de inibição, não foi possível apresentar os resultados na forma de IC50, que corresponde à concentração do antioxidante necessária para reduzir em 50% o radical DPPH, sendo que quanto menor o IC50, maior a atividade antioxidante da matriz estudada (Negri et al., 2009). Por este motivo, torna-se impossível fazer uma comparação direta com os valores já descritos noutros estudos. Existem poucos estudos sobre a atividade antioxidante da baga de P. americana L. No entanto, para o mesmo método antioxidante, recorrendo a extratos metanólicos, Zheleva-Dimitrova (2013) obteve um IC50 de 412,06 g/ mL no extrato das bagas de P. americana L., substancialmente superior ao ensaio controlo usando o antioxidante sintético BHT (64,76 g/ mL). Já Nabavi et al. (2009) referiram um IC50 de 62,0 µg/ mL para a amostra contra um IC50 de 53,96 µg/ mL obtido no antioxidante sintético BHA. Embora os resultados descritos e os obtidos neste trabalho não demonstrem uma elevada atividade antioxidante, não significa que as bagas não a possuam. Não se deve omitir que o método DPPH apresenta bastantes interferências e, muitas das vezes os resultados não são reprodutíveis quando avaliados apenas por esta metodologia, sendo sempre necessário recorrer a outras metodologias para avaliar a atividade antioxidante. 4.3.2. Poder antioxidante por redução do ião férrico (FRAP) Os métodos de inibição do DPPH● e FRAP, apresentam mecanismos diferentes de ação responsáveis pela determinação da capacidade antioxidante (Huang et al., 2005) e as interações entre os compostos presentes na matriz estudada podem condicionar os resultados finais (Yuksel et al., 2010). O método de FRAP baseia-se na redução, em meio ácido, de um complexo férrico de TPTZ (2,4,6- tripiridil-s-triazina) a um complexo ferroso de TPTZ com uma forte coloração azul escura. Quanto maior for a capacidade antioxidante da amostra, maior será a produção do complexo ferroso de TPTZ, podendo ser monitorizado através da leitura da absorvência a um comprimento de onda de 595 nm (Huang et al., 2005). O poder antioxidante por redução do ião férrico (FRAP) foi avaliado e os resultados apresentam-se na Figura 18. 45 Figura 18: Determinação da atividade antioxidante pelo método FRAP (expresso em M de equivalentes sulfato ferroso). Pela observação da Figura 18 pode-se verificar que existe uma relação proporcional entre a atividade antioxidante e as diferentes concentrações de extrato, ou seja, a atividade antioxidante decresce proporcionalmente com a diminuição de concentração de extrato. Pode ser observado um declive muito pequeno na reta de calibração de sulfato ferroso (Figura 15, Capítulo 3), levando a variações de sinal muito baixas para pequenas diferenças de concentração. Por esse facto, para concentrações muito baixas, cujas absorvências são inferiores a 0,2, não existe uma grande diferença de sinal relativamente a outras concentrações próximas. No entanto, é aplicado um fator de diluição considerável, induzindo a valores de equivalentes de sulfato ferroso muito superiores aos espectáveis e fora da linearidade. Uma vez mais, devido à limitação de publicações sobre esta matriz, mais estudos devem ser efectuados, uma vez que até à data nenhum autor realizou este procedimento analítico. Pelo referido, não parece ser possível comparar a capacidade antioxidante da baga por este método. No entanto, sugere-se que, futuramente, sejam realizados mais estudos sobre a atividade antioxidante, recorrendo a vários métodos, uma vez que, para cada método usado, existem vantagens e desvantagens em recorrer a um só, nomeadamente, à simplicidade da metodologia, instrumentação necessária, mecanismos, método de quantificação, interferências e relevância biológica (Niki, 2010). 46 4.3.3. Avaliação da atividade hemolítica induzida pelo AAPH Os eritrócitos constituem um sistema celular adequado para o estudo in vitro quer dos efeitos de radicais livres e espécies oxidantes nas membranas biológicas, quer para estudar o efeito protetor exercido pelos diferentes compostos bioativos nos mesmos, em virtude da sua simplicidade estrutural, acessibilidade e vulnerabilidade dos constituintes ao processo de oxidação. As principais estruturas eritrocitárias afetadas pelas espécies oxidantes são os constituintes membranares e a hemoglobina. Pretendeu-se assim estudar o papel protetor dos extratos aquosos obtidos das bagas de P. americana L. relativamente aos danos oxidativos induzidos por radicais livres em eritrócitos humanos. O AAPH foi utilizado neste estudo como sistema gerador de radicais livres. Os danos oxidativos foram avaliados pela percentagem de hemólise. A taxa de hemólise de eritrócitos incubados depende do tempo de incubação, da presença de agentes promotores de stresse oxidativo e da presença de agente antioxidantes. Estudou-se o efeito de inibição da hemólise promovida pelo oxidante AAPH em diferentes concentrações de extratos de bagas de P. americana L., após 4h de incubação a 37ºC. As concentrações utilizadas foram 2,6; 1,3; 0,65; 0,325; 0,162; 0,081 e 0,041 mg/ mL, as mesmas usadas nos outros métodos antioxidantes estudados. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4 e Figura 19, respetivamente. Tabela 4. Inibição da hemólise (%) induzida por AAPH. *Os valores são apresentados como média ± desvio padrão (n=5). Concentração do Extrato (mg/ mL) Redução de Hemólise (%) 2,6 68,5 ± 13,4 1,3 82,6 ± 12,8 0,650 94,2 ± 2,84 0,325 89,5 ± 3,47 0,162 51,2 ± 25,7 0,081 32,8 ± 23,3 0,041 32,6 ± 11,0 53 5. Conclusão 54 O stresse oxidativo parece estar envolvido na maioria das doenças crónicas tais como, cancro, doenças degenerativas e doenças cardiovasculares, cuja taxa de mortalidade tem vindo a aumentar. Os antioxidantes, ou compostos bioativos, provenientes de fontes naturais são particularmente importantes na luta contra essas doenças uma vez que conferem proteção contra os danos induzidos pelos radicais livres nas proteínas, lípidos e ADN celular. O planeamento e implementação de planos de gestão de áreas territoriais por plantas invasoras são, frequentemente, processos morosos, muito dispendiosos e por vezes sem sucesso. Por esses motivos, surge o interesse acrescido de estudar e, hipoteticamente valorizar as “indesejadas” plantas invasoras. A Phytolacca americana L. é uma espécie invasora, adaptável ao clima mediterrânico e cuja distribuição em território nacional está bem implementada. Pelos dados bibliográficos obtidos e pela sua riqueza em compostos bioativos, surgiu interesse em efetuar um estudo preliminar de caracterização de alguns compostos bioativos nas bagas desta planta e os seus efeitos como agentes antioxidantes. Os resultados obtidos mostraram que as bagas de P. americana L. são ricas em saponinas, compostos fenólicos e flavonoides. Os carotenoides também foram quantificados, numa perspetiva inovadora, não só pelas suas reconhecidas funções biológicas, mas também numa perspetiva de avaliar o grau de maturação do fruto, como base para estudos futuros. O estudo da atividade antioxidante recorreu a diferentes metodologias. Provou-se que as bagas apresentam uma atividade antioxidante considerável. A percentagem de hemólise foi aqui reportada pela primeira vez, tendo-se concluído que as concentrações de compostos antioxidantes podem influenciar o efeito protetor nos eritrócitos, ou seja, o efeito pró-oxidante dos compostos bioativos pode existir, se ingeridos em elevadas quantidades. São sugeridos mais estudos, nomeadamente na caracterização e avaliação do potencial antioxidante da P. americana L.. No entanto, este trabalho vem dinamizar o interesse de plantas pouco valorizadas, mas que podem ser fontes naturais de compostos fitoquímicos com interesse para a indústria alimentar, farmacêutica e cosmética. 55 6. Bibliografia 56 Ahmad E, Kamranur Rahman S, Masood Khan J, Varshney A, Hasan Khan R. Phytolacca americana lectin (Pa-2; pokeweed mitogen): an intrinsically unordered protein and its conversion into partial order at low pH. Biosci Rep. 2009, 30(2): 125-134. 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