Efeito da dieta na expressão adipogénica e nos neurotransmissores monoaminérgicos da corvina (Argyrosomus regius, Asso, 1801)

Efeito da dieta na expressão adipogénica e nos neurotransmissores monoaminérgicos da corvina (Argyrosomus regius, Asso, 1801). Francisca Isabel da Silva Brito Dissertação de Mestrado em Ciências do Mar - Recursos Marinhos - Especialização em Aquacultura e Pescas 2014 Francisca Isabel da Silva Brito Efeito da dieta na expressão adipogénica e nos neurotransmissores monoaminérgicos da corvina (Argyrosomus regius, Asso, 1801). Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Ciências do Mar - Recursos Marinhos – Especialização em Aquacultura e Pescas submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador – José Fernando Magalhães Gonçalves Categoria – Professor auxiliar Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. Co-orientador – Rodrigo Otávio de Almeida Ozório Categoria – Investigador auxiliar Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. Co-orientador – Alfredo Damasceno-Oliveira Categoria – Investigador Afiliação – Centro interdisplinar de Investigação Marinha e Ambiental. i Agradecimentos A conclusão desta dissertação de mestrado contou com importantes contributos, sem os quais a realização deste trabalho não teria sido possível. Estou certa de que esta seção de agradecimentos não será suficiente para expressar o meu agradecimento a todas as pessoas que, de uma forma direta ou indirecta, contribuiram, não só para o meu crescimento académico, como também para o meu crescimento como indivíduo que trabalha e contacta com os outros, em contexto de trabalho e fora dele. Desta forma, deixo poucas palavras, mas com um um sentido e profundo sentimento de reconhecido agradecimento. Ao Professor Doutor José Fernando Gonçalves que me proporcionou esta oportunidade de trabalho e que desde o início depositou em mim a sua confiança. O meu profundo agradecimento pela orientação e apoio incondicionais que muito contribuiram para o meu enriquecimento científico. Obrigada ainda pela oportunidade que me proporcionou de participar em ações de formação de forma a complementar a minha formação. Ao Professor Doutor Rodrigo Ozório que me recebeu na sua casa, que me orientou, que me consolou e que nunca deixou de estar atento ao que se passava não só comigo, como com os meus colegas. Foi desde início um grande coordenador de trabalho. Expresso aqui o meu profundo agradecimento pela co-orientação e apoio incondicionais que elevaram os meus conhecimentos científicos e o meu sentido de responsabilidade. Agradeço também a oportunidade que me deu de me integrar no seu Grupo de Investigação. Ao Professor Doutor Alfredo Damasceno-Oliveira o meu sincero agradecimento pela coorientação neste Projeto. Muito obrigada pela total disponibilidade que sempre revelou para comigo. Foi sem dúvida um elemento fundamental na conclusão deste projeto. Ao Sthelio que permitiu que esta tese de Mestrado fosse integrada no seu trabalho de Doutoramento. Não posso deixar de agradecer toda a amizade, atenção e carinho que me prestou, não só enquanto esteve em Portugal, bem como depois de ter partido para o Brasil. Obrigada! Ao Professor Doutor Filipe Castro que se disponibilizou a partilhar os seus conhecimentos na área. Obrigada pela colaboração e disponibilização do seu laboratório, para que dessa forma pudéssemos desenvolver este trabalho. Sempre que precisamos ii esteve disposto a reunir-se connosco e explicar-nos com toda a paciência todas as nossas dúvidas. Foi, desde o início, um elemento fulcral no desenvolvimento deste trabalho. À Professora Doutora Isabel Cunha, que nos momentos críticos deste trabalho nos brindou com a sua sabedoria. Obrigada pelo seu contributo neste trabalho, não só ao nível intelectual como ao nível da disponibilização de materiais. À Professora Doutora Luísa Valente que me recebeu no seu grupo de trabalho, que teve para comigo um comportamento de cordialidade e sempre disposta a ajudar em todos os momentos. Aos meus colegas de laboratório, Maria João, Andreia, Luís, Augusto, Ivone e Mónica. Obrigada pela vossa amizade, companheirismo e ajuda. Vocês foram o meu suporte diário. Foi convosco que partilhei todos os bons e menos bons momentos no laboratório. Obrigada por tudo o que me ensinaram dentro e fora do laboratório. Vocês foram muito importantes para que eu encarasse o trabalho com especial motivação! Aos restantes elementos do LANUCE que sempre tinham uma palavra amiga e que em algum momento todos me ensinaram algo! Obrigada Vera, Sónia, Emílio, Marta e Nicole. O meu agradecimento ao Fernando e ao Eloi que estiveram sempre presentes nos dias das amostragens e cuja ajuda foi indispensável. Agradeço aos restante elementos do CIIMAR, que de alguma forma, numa ou outra ocasião deste percurso foram prestáveis comigo e estiveram sempre dispostos a prestarme ajuda! Ao Coordenador do Mestrado em Ciências do Mar e Recursos Marinhos-Especialidade em Aquacultura e Pescas, Professor Doutor Eduardo Rocha, agradeço a oportunidade que tive em frequentar este Mestrado, que foi muito importante para a minha formação académica e científica. À minha família, em especial à minha mãe e à minha irmã que desde sempre apoiaram todas as minhas decisões e que sem dúvida, sem o seu suporte eu não teria tido a oportunidade de concluir este mestrado! Desejo que a finalização desta etapa da minha iii vida possa de alguma forma retribuir tudo o que me ofereceram durante anos. A vocês dedico esta tese! Ao Pedro que me acompanhou desde início neste percurso e que se revelou um excelente companheiro. Aos meus amigos, que sempre tiveram um momento para ouvir as minhas dúvidas e me aconselharam sempre que precisei. Obrigada, Rita, Juliana, Catarina, Ana Sofia, Luís, Bruno e Jerusa. iv Resumo Os óleos de peixe são uma fonte de ácidos gordos altamente insaturados da série n-3 (HUFA n-3) muito importante para os humanos. Uma vez que a pesca se encontra estagnada, o fornecimento de HUFA n-3 é garantido pela aquacultura que, por sua vez, está dependente dos óleos de peixe provindos destas capturas. Uma alternativa à utilização dos óleos de peixe são os óleos de origem vegetal. Porém os óleos vegetais são ricos em ácidos gordos polinsaturados da série n-3 (PUFA n-3), como o ácido linoleico (LA) e o ácido-α-linoleico (ALA) e pobres em HUFA n-3, como o ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA), abundante nos óleos de peixe. Além disso, a capacidade dos peixes converterem os PUFA C18 em EPA e DHA é diferente. Os peixes de água doce, que têm naturalmente uma dieta pobre em HUFA, são mais eficientes a biossintetizar HUFA comparativamente com as espécies marinhas, que têm uma dieta rica em HUFA e são normalmente carnívoros. O DHA e o EPA são ácidos gordos essenciais que estão envolvidos na manutenção da estrutura da membrana celular, na atividade das proteínas membranares, no sistema monoaminérgico do cérebro, entre outras funções. Estes ácidos gordos são tão importantes que representam mais de metade do peso seco do cérebro. Porém, o aumento do grau de saturação dos ácidos gordos aumenta a suscetibilidade das membranas celulares sofreram a peroxidação lipídica. A peroxidação lipídica ocorre pela ação dos radicais livres sobre as membranas celulares e por isso, a suplementação da dieta com antioxidantes, como é o caso do selénio, poderá ser importante no combate a este evento, que prejudica as membranas celulares. Portanto, de forma a verificarmos a capacidade de biossíntese endógena dos HUFA, na corvina, bem como os benefícios que a suplementação das dietas com selénio poderão ter sobre a redução da peroxidação lipídica, propusemos dois objetivos para este trabalho:  Estudar a influência da substituição total de 12% de óleo de peixe por misturas de óleos vegetais (compostos por linhaça, colza e soja), na expressão dos genes, fads2 (que codifica uma dessaturase) e da elovl5 (que codifica uma elongase), bem como sobre a concentração de alguns neurotransmissores, tais como: dopamina (DA), noradrenalina (NA), adrenalina (A) e serotonina (5-HT) bem como de alguns metabolitos destas monoaminas como: ácido 3,4-Dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e ácido 5-Hidroxi-indol-acético (5-HIAA), no cérebro da corvina;  Analisar o efeito do selénio na expressão dos genes fads2 e elovl5 e na concentração de alguns neurotransmissores, tais como: DA, NA, A e 5-HT, bem v como de alguns metabolitos destas monoaminas como: DOPAC, HVA, 5-HIAA, no cérebro da corvina. Para tal, após o respetivo período de ensaio (60 dias para a análise da expressão génica e 90 dias para a quantificação de monoaminas), procedeu-se à análise da expressão génica pela técnica de RT-PCR, e à quantificação da concentração de monoaminas por HPLC-DE. Os nossos resultados permitiram-nos concluir que, a substituição de óleos tem um efeito positivo sobre a expressão génica, principalmente da fads2, que é a enzima envolvida no passo crítico da biossíntese de HUFA. Esta situação também conduziu ao aumento da concentração de monoaminas no cérebro, uma vez que a libertação de monoaminas pelos neurónios poderá ter sido afetada. A suplementação das dietas com selénio favoreceu assim a expressão génica e teve um efeito sobre o sistema monoaminérgico nesta espécie, muito provavelmente pelo seu contributo na diminuição da peroxidação lipídica das membranas celulares. vi Abstract Fish oil is the most important source of n-3 HUFA for humans. With the decline of fisheries, n-3 HUFA is being provided by rapidly expanding aquaculture (FAO, 2012), which is expanding rapidly but depends also of fish oil for growth. The use of vegetable oils (VO) as fish oil alternatives have been widely investigated. Vegetable oils are rich in C18 PUFA, like alpha linoleic acid (ALA) and linoleic acid (LA), but poor of the docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA). The capacity of fish species to thrive on diets containing only the C18 PUFA in EPA and DHA is different. Fresh water fish diets are naturally vegetarian and generally lack HUFA. Despite that, they are able to convert 18:2 n−6 and 18:3 n−3 to HUFA more efficiently than marine species, whose predominantly carnivorous diet is rich in HUFA. DHA and EPA are essential fatty acids involved in the maintenance cell membrane structure, in the activity of membrane proteins, in monoaminergic system of brain, among other essential functions. These fatty acids are so important to the normal functioning of brain, that EPA and DHA represent almost half of the dry weight of the brain. However, the increasing degree of saturation of the fatty acids increases the susceptibility of cellular membranes suffered lipid peroxidation. Lipid peroxidation is the result of the harmful action of free radicals on cell membranes. Therefore, dietary supplementation with antioxidants, such as selenium, may be important in preventing the event that damages the cell membranes. Therefore, in order to verify the ability of HUFA biosynthesis and the benefits of antioxidant supplementation in the reduction of lipid peroxidation, propose two objectives for this study were proposed:  to evaluate the effects of dietary lipid profile on fads2 (fatty acyl desaturase gene) and elovl5 (fatty acyl elongase gene) expression in liver and brain of meagre (Argyrosomus regius) and on the concentration of some neurotransmitters, such as dopamine, noradrenaline, adrenaline and serotonin and certain metabolites such as DOPAC, HVA and 5-HIAA;  analyze the effects of selenium on fads2 (fatty acyl desaturase gene) and elovl5 (fatty acyl elongase gene) expression in liver and brain of meagre (Argyrosomus regius) and on the concentration of some neurotransmitters, such as dopamine, norepinephrine and serotonin and certain metabolites such as DOPAC, HVA and 5-HIAA. Thus, after the trial period (60 days for the analysis of gene expression and 90 days for quantification of monoamines), we proceeded to the analysis of gene expression by RT-PCR and quantification of monoamines concentration by HPLC. vii We conclude that substitution of oils has a positive effect on gene expression, especially fads2, which seems to be the rate limiting enzyme in this pathway. This situation also led to increase in the concentration of monoamines in the brain. The selenium supplementation of diets probably also appears to benefit gene expression and monoaminergic system, because reduces lipid peroxidation of cell membranes. xiv Gráfico 8: Efeito das dietas de 12% de óleo de peixe sem selénio (OP-NS) vs dietas de 12% de misturas de óleos vegetais (colza, linhaça e soja) sem selénio (OV-NS) na concentração das monoaminas [dopamina (DA), 5-HT (serotonina), noradrenalina (NA) e adrenalina (A)] e seus metabolitos [(ácido 3,4-Dihidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA)], no cérebro da corvina (Argyrosomus regius). Gráfico 9: Efeito das dietas de 12% de óleo de peixe com 1 mg/kg de selénio (OP-S) vs dietas de 12% de óleo de peixe sem selénio (OP-NS) na concentração das monoaminas [dopamina (DA), 5-HT (serotonina), noradrenalina (NA) e adrenalina (A)] e seus metabolitos [(ácido 3,4-Dihidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA)], no cérebro da corvina (Argyrosomus regius). Gráfico 10: Efeito da suplementação das dietas de misturas de óleos vegetais (colza, linhaça e soja) com 1 mg/kg de selénio na concentração das monoaminas [dopamina (DA), 5-HT (serotonina), noradrenalina (NA) e adrenalina (A)] e seus metabolitos [(ácido 3,4-Dihidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA)], no cérebro da corvina (Argyrosomus regius). xv Abreviaturas 3-MT – Metoxitiramina 5-HIAA – ácido 5-Hidroxi-indol-acético 5-HTP – 5-Hidroxitriptofano 5-HT – Serotonina ou 5-Hidroxitriptamina A - Adrenalina ARA - Ácido araquidónico ACP – Proteína transportadora de acil AD – Aldeído dehidrogenase ADH – Álcool dehidrogenase ALA – Ácido-α-linoleico ALD-D – Aldeído desidrogenase ALR – Aldeído redutase AR – Aldeído redutase cAMP – Adenosina de monofosfato cíclico cDNA – DNA complementar COMT – Catecol- O-metiltransferase DA - Dopamina DHA - Ácido docosahexaenóico DHMA – Ácido 3,4-Dihidroximandelico DHPG – 3,4-Dihidroxifeniglicol DNA – Ácido desoxirribonucleico DOPAC – Ácido 3,4.Dihidroxifenilacético DOPAL – 3,4-Dihidroxifenilacetaldeído DOPEGAL – 3,4-Dihidroxifenilglicolaldeído DOPET – 3,4-Dihidroxifeniletanol Elovl - Elongases EPA - Ácido eicosapentaenóico FAD - Dessaturases Gpx – Glutationa peroxidase HPLC-DE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Deteção Eletroquímica HUFA - Ácidos gordos altamente insaturados HVA – Ácido homovanílico LA – Ácido linoleico LC – Locus coeruleus xvi L-DOPA – L-3,4-Dihidroxifenilalanina MAO – Monoamina oxidase MHPG – 3-Metoxi-4-hidroxifenilglicol MOPEGAL – 3-Metoxi-4-hidroxifenilglicol aldeído MOPET – 3-Metoxi-4-hidroxifeniletanol NA – Noradrenalina NS – Sem selénio OP – Óleo de peixe OV – Óleo vegetal PCR – Reação em cadeia da polimerase PNMT – Feniletanolamina-N-Metiltransferase PPAR – Recetor ativado pela proliferação de peroxissomas PPRE – Elemento regulador da proliferação dos peroxissomas PUFA – Ácidos gordos polinsaturados RE – Retículo endoplasmático REα – Recetor de estrogénio α RNA – Ácido ribonucleico ROS – Espécies reativas de oxigénio RT-PCR – Real Time PCR RXR – Recetor X retinóide S – Com selénio Sec – Selenocisteína SREBP – Proteína de ligação ao elemento regulador de esterol TH – Tirosina hidroxilase Trx – Tioredoxina TrxR – Tioredoxina redutase VMA – Ácido vanilimandélico VMAT – Transportador de monoaminas vesicular 1 1. INTRODUÇÃO 1.1. Estado da Aquacultura 1.1.1. Estado da Aquacultura no Mundo Nas últimas três décadas (1980-2010), a produção mundial de peixe, proveniente da aquacultura aumentou a uma taxa média anual de 8,8%, sendo que em 2012 a produção aquícola mundial alcançou um recorde histórico de 66 milhões de toneladas (excluindo plantas aquáticas e produtos não alimentares) (FAO, 2014). Em 2011, o conjunto das capturas da pesca e da produção de pescado em aquacultura atingia já os 154 milhões de toneladas. Deste total, a aquacultura foi responsável por 63,6 milhões de toneladas (Tabela 1). No entanto, interessa referir que a China foi responsável pela maior parte da produção de pescado mundial, pois a sua produção cresceu de 7% em 1961 para 35% em 2010. Concomitantemente com a expansão da produção de peixe oriunda da aquacultura observou-se um aumento no consumo mundial de peixe per capita (FAO, 2012). É de destacar ainda que os 10 maiores países produtores de pescado apresentam um crescimento de produção superior aos restantes países produtores, tanto em peso como em valor, representando cerca de 88% da produção total no mundo (70,1 milhões de toneladas) (Apromar, 2012). Dentro dos organismos produzidos em aquacultura, os peixes de água doce dominam a produção mundial, seguidos pelos moluscos, crustáceos, peixes diádrómicos, peixes marinhos e outros animais aquáticos (FAO, 2012). Tabela 1: Produção em toneladas da pesca e aquacultura no Mundo e utilização do pescado. Fonte: FAO, 2014). 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Produção (Milhões de toneladas) Captura Água Doce 10.1 10.3 10.5 10.3 11.1 11.6 Marinha 80.7 79.9 79.6 77.8 82.6 79.7 Total das capturas 90.8 90.1 90.1 89.1 93.7 91.3 Aquacultura 2 A aquacultura tem assim um impacto cada vez maior no abastecimento de pescado às populações, mas a produção de pescado e crustáceos através da aquacultura está ainda altamente dependente da pesca para a produção de rações, as quais incorporam farinha de peixe e óleo de peixe de baixo valor. Esta dependência de farinha e óleos de peixe é particularmente forte no que concerne à produção de espécies marinhas (Tacon, Hasan & Subasinghe, 2006). Acresce que, além do consumo de 5-6 milhões de toneladas de peixe proveniente do by-catch de diversas pescarias como alimento direto de peixes de viveiro, estima-se que o sector da aquacultura consumiu em 2003 o equivalente a aproximadamente 20-25 milhões de toneladas de peixe no fabrico de rações, para uma produção total de cerca de 30 milhões de toneladas de peixe e crustáceos (Tacon, Hasan & Subasinghe, 2006). Nas últimas décadas as capturas provindas da pesca estabilizaram em redor das 80- 100,000,000 toneladas (FAO, 2012), nível este que é considerado como o limite tendo em conta as atuais tecnologias da pesca e a produção possível pelos oceanos. Assim, e por forma a podermos responder à dicotomia entre o aumento da procura de pescado e a estagnação das capturas da pesca é necessário produzirmos pescado de uma forma mais sustentável. 1.1.2. Estado da aquacultura na Europa e na União Europeia Na Europa, a produção de pescado em água marinha e salobra tem vindo a aumentar nos últimos anos. Entre 1990 e 2010 registou-se um aumento da produção dos produtos de água doce e salobra de 55,6% para 81,5%. Esta evolução deve-se principalmente ao importante contributo da produção de salmão em offshore, isto é, em jangadas flutuantes. Por outro lado, a indústria dos bivalves tem sofrido uma estagnação ou até mesmo um Água Doce 29.9 32.4 34.3 36.8 38.7 41.9 Marinha 20.0 20.5 21.4 22.3 23.3 24.7 Total da produção 49.9 52.9 55.7 59.0 62.0 66.6 Capturas e Produção 140.7 143.1 145.8 148.1 155.7 158.0 Utilização Consumo humano 117.3 120.9 123.7 128.2 131.2 136.2 Outros fins 23.4 22.2 22.1 19.9 24.5 21.7 3 decréscimo na sua produção. Assim, em 2010, a produção europeia foi dominada pelos peixes, que representaram três quartos da produção total de pescado, enquanto que os bivalves representaram apenas um quarto (FAO, 2012). Na Europa meridional as principais espécies marinhas produzidas são a dourada (Sparus aurata), o robalo (Dicentrarchus labrax), o rodovalho (Psetta máxima) e a corvina (Argyrosomus regius) (Apromar, 2012). Porém, o aumento da aquacultura na Europa, e principalmente na União Europeia, não tem sido suficiente para compensar o aumento da procura e o decréscimo dos desembarques provenientes da pesca. Assim, a União Europeia vê-se obrigada a importar, por ano, um saldo de 17 milhões de toneladas de pescado, originando um défice de 13.500 milhões de euros anuais (Apromar, 2012). Na última década, as médias anuais de crescimento da aquacultura na Europa foram de 2,4%, o que revela a dificuldade que a Europa tem sentido em evoluir em termos de produção, comparativamente com os outros países do mundo (Apromar, 2012). 1.1.3. Estado da aquacultura da corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) A espécie Argyrosomus regius reúne potencial para ser produzida em larga escala, contribuindo assim para a diversificação das espécies marinhas produzidas em aquacultura (Jiménez et al., 2005). De facto esta espécie apresenta elevadas taxas de fecundidade, ampla distribuição geográfica (Fig. 1), um crescimento rápido e bons índices de conversão alimentar. Além disso, a corvina apresenta pouca gordura mesentérica e muscular, o que torna o seu músculo ideal para o processamento industrial, pois assim o período de conservação em refrigeração é maior (Poli et al., 2003). Acresce que este é um peixe apreciado pelo consumidor e com um preço de mercado bastante elevado (5-6 euros/kg). Um outro aspeto importante são as suas taxas de crescimento quando em jangadas flutuantes. Assim, a utilização desta tecnologia de jangadas flutuantes para produção de corvina permite obter pesos de 1850 gramas em apenas 8 meses, iniciandose a engorda com exemplares de apenas 110 gramas. Além disso, e por ser eurihalina, esta espécie consegue adaptar-se a diferentes condições de produção (Cárdenas, 2012). Contudo, mesmo com todas as potencialidades de produção exibidas por esta espécie, a sua aquacultura é algo muito recente, tendo sido a França a pioneira da sua produção comercial em 1997 (Quémener et al., 2002). Atualmente esta espécie, Argyrosomus regius (Asso, 1801), já é produzida em 6 países da bacia do Mediterrâneo, nomeadamente: Espanha, França, Itália, Marrocos, Turquia e 4 Egito (Jiménez et al., 2005; Cárdenas, 2012). Com o crescente interesse da sua comercialização, em 2010 a corvina atingiu um record de produção de 10 000 toneladas (Monfort, 2010). O país com maior produção de corvina é a Espanha, que em 2010 produziu 3 250 toneladas (o que representa 84% do total europeu) (Monfort, 2010). Relativamente à forma de comercialização da corvina, ela é vendida a fresco, inteira e com a cabeça, não eviscerado ou eviscerado, dependendo do fim a que se destina. Normalmente não são vendidos exemplares abaixo de 1 kg e por isso, mais de 50% do peixe é vendido com um peso entre 1-2 kg. As gamas de peso entre as 400-700 gramas não são comercializadas, porque o peixe tem uma cabeça muito grande, o que significa que possui pouco músculo (Monfort, 2010) e os maiores tamanhos (> 2.5 kg) são vendidos para a restauração, sendo posteriormente processado em filetes (Monfort, 2010). De forma global, o volume de produção para congelamento é baixo. É de referir ainda que os principais países onde se comercializa este peixe são Espanha, Itália e Portugal, tendo recentemente o Egito iniciado a sua comercialização para Israel (Monfort, 2010). 1.2. A Corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) A espécie Argyrosomus regius pertence à classe Actinopterygii, pois possui raios nas barbatanas (Fishbase, 2010), e à família Sciaenidae. Em Portugal, o nome comum desta espécie é corvina e que advém do facto destes peixes terem a capacidade de produzirem sons, utilizando para tal a bexiga natatória como câmara de ressonância (Cárdenas, 2010; Fishbase, 2010). A corvina tem uma distribuição geográfica alargada (Fig.1), sendo uma espécie semipelágica costeira, com tendência demersal (Quéro & Vayne, 1987). Fig. 1: Mapa da distribuição nativa da Corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Fonte: Fishabase, 2010. 5 Morfologicamente a corvina apresenta um corpo comprido, coberto por escamas grandes e ciclóides (Cárdenas, 2010). A linha lateral é curva e formada por cerca de 50 escamas ctenóides (Cárdenas, 2010), sendo bem evidente pelo seu brilho e terminando na barbatana caudal (FAO, 2013). A boca das corvinas é grande e amarela e os seus dentes estão inseridos em várias séries, sendo que os maiores e mais fortes estão localizados na parte mais interna (Cárdenas, 2010) (Fig. 2). Fig. 2: Exemplar de um juvenil de Corvina, Argyrosomus regius, Asso 1801. Fonte: http://www.diversifyfish.eu/meagre-argyrosomus-regius.html Dentro da família Sciaenidae, esta espécie destaca-se pelas suas elevadas taxas de crescimento e tamanho máximo atingido, uma vez que pode chegar aos 200 cm de comprimento (comprimento total) e 50 kg de peso (Quéro & Vayne, 1987). As maiores taxas de crescimento registam-se durante o verão diminuindo quando as temperaturas estão abaixo dos 13-15 ºC. Assim, a temperatura ideal para o crescimento da corvina é entre os 17-21 ºC, sendo que um crescimento moderado é atingido entre as temperaturas 14-17 ºC e 21-23 °C (Cárdenas, 2012; FAO, 2013). A corvina é uma espécie anádroma pois reproduz-se em água salobras. Durante a época de reprodução (entre Março e Agosto), as corvinas migram para os estuários, onde desovam. No primeiro tempo de vida os juvenis mantêm-se nos estuários e depois migram para as águas costeiras, onde permanecem durante os 2-3 anos de vida. Após este período, com 70-110 cm, os indivíduos atingem a maturidade sexual e migram então para os estuários, para se reproduzirem (González-Quirós et al., 2011). Relativamente aos hábitos alimentares, a corvina (Argyrosomus regius) é uma espécie muito voraz e alimenta-se de poliquetas, crustáceos, equinodermes, moluscos e outras espécies de peixes mais pequenos como clupeídeos e mugílidios (Jiménez et al., 2005). Isso está de acordo com as observações de Gill, Grau & Riera (2009) que constataram que a corvina apresenta um trato digestivo curto, correspondendo a 75% do total da longitude do corpo, que é uma caraterística típica das espécies carnívoras. 6 1.3. A corvina como uma fonte importante de ácidos gordos para os humanos O peixe representa uma fonte alimentar altamente nutritiva, pois é rico em proteína e uma fonte de ácidos gordos polinsaturados (PUFA) e de ácidos gordos altamente insaturados (HUFA). Estes ácidos gordos insaturados são importantes na prevenção de doenças cardiovasculares, cancro do cólon e da mama, entre outras patologias. Além disso, o peixe também contém micronutrientes como iodo, selénio e vitaminas lipossolúveis (A e D) benéficos para a saúde humana (Hasan, 2001). A corvina, em particular, é uma espécie cujo músculo tem um valor nutricional muito elevado pois é magro e os seus lípidos de alta qualidade (Poli et al., 2003). O perfil e composição dos ácidos gordos do músculo dos peixes está intimamente relacionado com a dieta dos animais. Neste sentido, os peixes marinhos e particularmente os carnívoros necessitam de uma dieta rica em HUFA das série n-3 e n-6 para um óptimo crescimento e saúde, dado que não apresentam taxas de bioconversão de PUFA C18 em HUFA C20 e C22 suficientes para suprimirem as suas exigências fisiológicas (Hasan, 2001). 1.4. Caraterização e importância dos ácidos gordos Os lípidos são biomoléculas compostas por átomos de carbono, hidrogénio e oxigénio e, ao contrário do que sucede com outras biomoléculas, não apresentam uma estrutura típica. Porém, todas as famílias de lípidos caraterizam-se por possuírem uma baixa solubilidade na água (Cook & McMaster, 2002; Leaver et al., 2008a). Nos organismos eucariotas, a grande maioria dos lípidos são derivados da acetil-CoA e pertencem a três classes principais (Leaver et al., 2008a):  ácidos gordos de cadeia linear;  ácidos gordos de cadeia ramificada, cíclica, e outros ácidos gordos especializados;  compostos poliprenóides que incluem os carotenóides e os esteróis e seus derivados. Além disso, os lípidos são constituídos por diversas famílias, sendo a mais importante, a família dos ácidos gordos (Tocher, 2003; Quintas, Freire & Halpern, 2008). Assim, esta importante família de lípidos apresenta uma estrutura linear, constituída por uma cadeia hidrogenocarbonatada alifática que poderá ser insaturada ou saturada na presença ou ausência de ligações duplas (Duplus, Glorian & Forest, 2000). Nesta molécula o grupo 7 funcional é o grupo carboxilo e estão separados por um grupo -CH2- (Los e & Murata, 1998; Tocher, 2003; Quintas, Freire & Halpern, 2008). Na verdade, a importância dos lípidos é elevada, pois desempenham importantes papéis em todos os organismos, a saber: função estrutural da membrana, armazenamento (no tecido adiposo) para obtenção de energia (Tocher, 2003; Quintas, Freire & Halpern, 2008) e, ainda, funcionam como percursores de moléculas biologicamente ativas como eicosanóides, feromonas e hormonas (Pereira, Leonard & Mukerji, 2003). Relativamente à função que desempenham na membrana celular, é sabido que a coesão entre os diversos lípidos membranares é garantida pela interação de forças, sendo a mais importante a de London-Van der Waals, que tem uma grande impacto nas cadeias de ácidos gordos. Esta força é tanto maior quanto mais grupos metilo possuírem os ácidos gordos e diminui com o afastamento destes grupos. Por conseguinte, quanto maior for a cadeia de ácidos gordos, maior é a interação entre os grupo metilo. Esta interação contrasta com as ligações de hidrogénio e electroestáticas que são pequenas nos grupos polares da molécula. Desta feita, esta interação é de extrema importância para a estabilidade da membrana das células (Cook & McMaster, 2002). A par disso, também o comprimento e o grau de saturação dos ácidos gordos das membranas influenciam a solubilidade e o ponto de fusão da membrana celular, já que quanto maior a cadeia de grupos metilo, menor a solubilidade e maior o ponto de fusão (Carlier, Bernard & Caselli, 1991; Cook & McMaster, 2002; Quintas, Freire & Halpern, 2008) (Fig. 3). Por outro lado, estes efeitos podem ser contrariados com a introdução de ligações duplas, o que leva a uma diminuição do ponto de fusão (Fig. 3). Este efeito é consequência do facto da introdução de ligações duplas conduzir à alteração da conformação das ligações Cis, e portanto a molécula deixa de ser linear, diminuindo a eficácia da interação intermolecular, e consequentemente aumentando a fluidez membranar (Srinivasarao et al., 1997; Cook & McMaster, 2002; Haag, 2003; Quintas, Freire & Halpern, 2008). Fig. 3: Caraterísticas físicas dos ácidos gordos. Fonte: Cook & McMaster, 2002. Fatty acid Abbreviation Melting point Astearic Acid 18:0 70º Oleic acid c-18:1 n-9 16º Elaidic acid t-18:1 n-9 43º Linoleic acid c,c-18:2 n-6 -5º 14 Tabela 3: Padrão de distribuição da expressão do gene fads2 nos tecidos de diversas espécies. Espécie Nível de expressão nos tecidos Referência Robalo Coração> cérebro> ovários> rim> tecido adiposo> fígado González-Rovira et al., 2009 Bacalhau Cérebro> fígado> rim Tocher et al., 2006 Cobia Cérebro> coração> fígado Zheng et al., 2009 Truta Fígado> intestino> cérebro Seiliez et al., 2001 Corvina Cérebro> fígado> cecos pilóricos> estômago Monroig et al., 2013 Salmão Intestino> fígado> cérebro Zheng et al., 2005a; Monroig et al., 2010 Neste sentido, nos peixes marinhos a fads2 é intensamente expressa no cérebro a fim se assegurar a quantidade de DHA, independentemente das flutuações na dieta de EPA e de DHA, especialmente em momentos cruciais do desenvolvimento (Cho, Nakamura & Clarke, 1999; Sargent et al., 2002, citado por Zheng et al., 2009). Este facto reforça a importância que esta enzima assume na síntese de EPA e DHA no cérebro dos peixes (Zheng et al., 2009). 1.7.3.2. Elongases dos ácidos gordos dos peixes teleósteos O sistema de elongases, ou apenas elongases, diz respeito às enzimas que são responsáveis pela introdução de duas unidades de carbono no fim da cadeia de ácidos gordos. Nas plantas e nos animais o sistema de elongases é composto por quatro enzimas: a enzima de condensação (β-cetoacil CoA sintase), a β-cetoacil CoA redutase, a β-hidroxiacil CoA dehidrase e a trans-2-enoil CoA redutase (Leonard et al., 2004). Este sistema multienzimático está localizado no retículo endoplasmático (Leaver et al., 2008a) e cataliza diversas reações sequenciais que se podem observar na figura 5. Esta via microssomal é ativada tanto por ácidos gordos saturados como por ácidos gordos insaturados, sendo o ácido-γ-linolénico (18:3 n-6) o substrato mais eficaz (Cook & McMaster, 2002). A elongação microssomal é particularmente importante na formação de ácidos gordos de cadeias superiores a 16 carbonos, sendo estes importantes constituintes dos fosfolípidos que irão contribuir principalmente para a formação das membranas celulares. Os ácidos gordos com 18 a 24 carbonos, tanto saturados como 15 monoinsaturados, e aos ácidos gordos polinsaturados com 20 e 22 carbonos, são indispensáveis para a formação do tecido neural (Cook & McMaster, 2002). Fig. 5: Reação de elongação dos ácidos gordos. Fonte: Leonard et al., 2004. Todas as elongases caraterizadas em mamíferos e peixes obedecem à mesma estrutura. No que concerne aos mamíferos, foram identificados 7 genes envolvidos na elongação dos ácidos gordos, embora os genes responsáveis pela síntese de HUFA sejam a Elovl2 e Elovl5 (Leonard et al., 2002). A ELOVL5 está envolvida na elongação dos PUFA C18 e C20, sendo que os substratos C18 são os preferenciais (Leaver et al., 2008a) e a ELOVL2 atua sobre os substratos C20 e C22, com especial preferência para os substratos C22 (Leonard et al., 2002; Jakobsson, Westerberg & Jakobsson, 2006). Todas as sequências dos genes putativos clonados a partir de peixes mostraram que as elongases dos peixes são mais próximas, filogeneticamente, dos mamíferos do que dos restantes grupos (Agaba et al., 2005). Assim, os estudos de PCR com primers degenerados concluiram que o cDNA isolado, a partir de genes putativos de elongases de diversas espécies de peixes, é muito semelhante ao da Elovl5 dos humanos (com homologia pelo menos 61%) (Agaba et al., 2005; Gregory et al., 2010; Kim et al., 2012). 1.7.3.2.1. elovl5 e elongase 5 dos peixes teleósteos A caraterização funcional das elongases de ácidos gordos (Elovl) em peixes tem sido reportada a partir de diversas espécies (Agaba et al., 2004, 2005; Hastings et al., 2005; Zheng et al., 2009; Gregory et al., 2010). 16 A especificidade dos substratos das elongases varia entre as espécies de teleósteos, revelando-se muito versáteis dentro deste grupo de animais, tal como mostra a tabela 4. Tabela 4: Variedade dos ácidos gordos metabolizados pela Elovl5 dos peixes teleósteos. Espécies Substratos de metabolização Referência Oreochromis niloticus, Clarius gariepinus, Gadus morhua, Sparus aurata, Scophthalmus maximus Danio renio Salmo salar Argyrosomus regius Lates calcarifer Rachycentron canadum 18:4 n-3 (ácido estearidónico) 18:3 n-6 (ácido-γ-linolénico) 20:4 n-6 (ácido araquidónico) 20:5 n-3 (ácido eicosapentaenóico) 22:5 n-3 (ácido docosapentaenóico) 22:4 n-6 (ácido adrénico) Agaba et al., 2005 Agaba et al., 2004 Hastings et al., 2005 Monroig et al., 2013 Mohd-Yusof et al., 2010 Zheng et al., 2009 Danio renio Thunnus maccoyii Salmo salar 16:1 n-7 (ácido palmitoleico) 18:1 n-9 (ácido oleico) 18:1 n-7 (ácido vacénico) Agaba et al., 2004 Gregory et al., 2010 Hastings et al., 2005 Argyrosomus regius 16:3 n-3 (ácido hexadecatrienóico) Monroig et al., 2013 Thunnus maccoyii Acanthopagrus schlegelii 18:3 n-6 (ácido-γ-linolénico) 20:4 n-6 (ácido araquidónico ) 20:5 n-3 (ácido eicosapentaenóico) Kim et al., 2012 Agaba et al., 2004 Gregory et al., 2010 Ictalurus Melas Oreochromis niloticus Scophthalmus maximus 16:1n-7 (ácido palmitoleico) Agaba et al., 2005 Danio rerio Thunnus maccoyii 16:0 (ácido palmítico) Agaba et al., 2004; Gregory et al., 2010 A taxa de conversão tende a diminuir com o aumento da cadeia de ácidos gordos (Agaba et al., 2004; Kim et al., 2012). Como já se referiu, nalgumas espécies como a Argyrosomus regius (Monroig et al., 2013), Lates calcarifer e Rachycentron canadum (Mohd-Yusof et al., 2010) a elovl5 é 17 mais expressa no cérebro do que no fígado. Este padrão contrasta com as espécies tipicamente de água doce onde esta enzima é mais expressa no fígado e intestino (Zheng et al., 2005a; Morais et al., 2009). Portanto, estes padrões distintos poderão querer dizer que os peixes marinhos expressam mais intensamente as enzimas relacionadas com a síntese de HUFA no tecido neural de forma a manterem os níveis de DHA no cérebro (Zheng et al., 2009; Mohd-Yusof et al., 2010). 1.8. Importância dos ácidos gordos na neurotransmissão cerebral Os lípidos são um dos principais constituintes do cérebro representando 50-60% do seu peso seco, sendo que 35% deste são ácidos gordos altamente insaturados (HUFA) como o ARA, DHA e EPA (Wainwright, 2002). Frequentemente, o DHA pode constituir até cerca de 30-40% do peso seco dos fosfolípidos das células do córtex cerebral e fotorrecetores na retina (Tanaka et al., 2012), tecidos que requerem um alto grau de insaturação (Youdim, Martin & Joseph, 2000). Mais ainda, foi demonstrado que o cérebro é o último órgão a sofrer o declínio dos níveis de DHA, em situações de deficiência de ALA na dieta, o que revela a importância deste ácido gordo para o cérebro (Bourre et al., 1992). Os lípidos influenciam as propriedades físicas das membranas e consequentemente interferem com diversas funções relacionadas com os recetores membranares (Tanaka et al., 2012), canais iónicos e de transporte, endo e exocitose, atividade das proteínas de ligação à membrana e neurotransmissão (Wainwright, 2002). A composição de ácidos gordos na dieta condiciona a composição de ácidos gordos dos fosfolípidos das membranas dos diversos tipos celulares cerebrais e, por conseguinte, a atividade de diferentes enzimas membranares (Srinivasarao et al., 1997; Marteinsdottir et al., 1998; Arsenault et al., 2012). Entre os mecanismos que influenciam a atividade funcional do cérebro, aqueles relacionados com o transporte de neurotransmissores são cruciais. Portanto, a dieta condiciona a composição em ácidos gordos das membranas regulando as funções monoaminérgicas do cérebro e, por conseguinte, o comportamento dos animais (Chalon et al., 1998). Alguns dos neurotransmissores mais importante e frequentemente estudados são classificados como monoaminas, pois derivam da descarboxilação de aminoácidos. Este é o caso das catecolaminas a saber: dopamina (DA), noradrenalina (NA, ou norepinefrina) e adrenalina (A, ou epinefrina), originadas a partir da tirosina e a serotonina (5-HT), derivada do triptofano (Wainwright, 2002). 18 1.8.1. Modo de ação dos neurotransmissores As monoaminas exercem a sua função através da sua ligação a recetores membranares, que são específicos para o neurotransmissor, bem como para a ação que desencadeiam no organismo. Porém, todos eles são caraterizados por pertencerem à família de recetores ligados à proteína G e por produzirem uma resposta celular quando ativados por uma monoamina (Docherty, 1998; Calzada & Artiñano, 2001; Wallukat, 2002). Assim, após ativação do recetor, ocorre a estimulação de um segundo mensageiro designado de adenosina de monofosfato cíclico (cAMP), localizado no lado interno da dupla camada de fosfolípidos e que é usado para a transdução de sinal intracelular (Wallukat, 2002). Ou seja, o sistema de sinalização das monoaminas está dividido em 3 fases (Pandey, Mersha & Dhillon, 2013):  Ativação dos recetores na superfície da célula por um ligando;  Interação do recetor com o heterotrímero de proteínas G;  Transdução do sinal através de moléculas efetoras que geram resposta celular. 1.8.2. Recetores pós-sináticos das monoaminas 1.8.2.1. Recetores da dopamina Existem cinco recetores de dopamina designados de D1 a D5. Contudo, e com base nas suas propriedades bioquímicas e farmacológicas, estes recetores são frequentemente classificados como recetores do tipo D1 e que englobam os recetores D1 e D5 e recetores do tipo D2, que englobam os recetores D2, D3 e D4 (Fig. 6) (Jaber et al., 1996; Elsworth & Roth,1997; Pandey, Mersha & Dhillon, 2013). Fig. 6: Esquema da estrutura dos recetores de dopamina D1 e D2. Fonte: Pandey, Mersha & Dhillon, 2013. 19 A partir do momento em que são ativados, os recetores do tipo D1 estimulam a atividade da adenilato ciclase (enzima que ativa a cAMP), enquanto que a ativação dos recetores do tipo D2 inibe a atividade desta mesma enzima (Jaber et al., 1996; Elsworth & Roth,1997; Schmitz et al., 2003; Pandey, Mersha & Dhillon, 2013). Os recetores D1 e D2 localizados no hipocampo e na região pré-frontal desempenham importantes funções, como por exemplo na memória de trabalho (Jaber et al., 1996; Picetti & Borrelli, 2000; Chalon et al., 2001; Takahashi et al., 2008; Vallone, Pandey, Mersha & Dhillon, 2013). Além disso, os recetores da DA localizados nessa e nas restantes áreas cerebrais regulam o metabolismo celular neuronal, incluindo as funções dos canais iónicos, bem como a dessensibilização dos recetores acopolados à proteína G e que leva à resposta celular e libertação de neurotransmissores. Os recetores D2, mais especificamente, modelam a concentração intracelular de Ca2+, o que pode ser importante na biossíntese de DA (Vallone, Picetti & Borrelli, 2000). 1.8.2.2. Recetores da noradrenalina e adrenalina Os recetores pós-sináticos da NA e A são designados de adrenérgicos e dividem-se em dois grupos: adrenérgicos α e adrenérgicos β (Docherty, 1998; Calzada & Artiñano, 2001). Os recetores adrenérgicos α dividem-se em 2 tipos: α1 e α2. Eles estão ligados às funções excitatórias, sendo que o subtipo α1 medeia a resposta nos órgãos efetores, enquanto que o α2, que se localiza essencialmente na região pré-sinática, controla a libertação dos neurotransmissores (Docherty, 1998; Calzada & Artiñano, 2001; Morilak et al., 2005). Além disso, os recetores α1 participam na manutenção do tónus vascular basal, pressão do sangue arterial dos animais conscientes e na resposta a estímulos agonísticos exógenos. Já os recetores α2, estão envolvidos no controlo da contração arterial e vasoconstrição das veias (Docherty, 1998; Calzada & Artiñano, 2001). Um segundo grupo de recetores importantes na resposta destes neurotransmissores são os recetores β-adrenérgicos, que desempenham funções como: vasodilatação, relaxamento da musculatura uterina, broncodilatação e uma função excitatória relacionada com as funções cardíacas (Calzada & Artiñano, 2001). Em suma, os recetores α estão essencialmente ligados às funções excitatórias e os recetores β às funções inibitórias (Docherty, 1998; Calzada & Artiñano, 2001). 20 1.8.2.3. Recetores da serotonina (5-HT) A 5-HT produz o seu efeito através de sete tipos de recetores (Tabela 5), todos eles compostos por uma multiplicidade de subtipos de recetores que, quando ativados, desempenham diferentes funções (Pytliak et al., 2011). A 5-HT é a única monoamina que atua em recetores ligados à proteína G e também em recetores associados a canais iónicos (Tabela 5). Importa ainda saber que alguns recetores, como o 5-HT3, que estão presentes nos terminais nervosos pré-sinápticos, funcionam como mediadores ou moduladores da liberação de neurotransmissores (Hoyer, Hannon & Martin, 2002; Pytliak et al., 2011). Tabela 5. Famílias dos recetores da serotonina. Família Potencial Tipo Mecanismo de acção 5-HT1 Inibitório Acoplado à proteína G Decresce a concentração de cAMP 5-HT2 Excitatório Acoplado à proteína G Aumenta a concentração intracelular de IP3 e DAG 5-HT3 Excitatório Ligante do canal iónio Na+/K+ Despolarização da membrana plasmática celular 5-HT4 Excitatório Acoplado à proteína G Aumenta a concentração de cAMP 5-HT5 Inibitório Acoplado à proteína G Decresce a concentração de cAMP 5-HT6 Excitatório Acoplado à proteína G Aumenta a concentração de cAMP 5-HT7 Excitatório Acoplado à proteína G Aumenta a concentração de cAMP IP3: inositol trifosfato; DAG: Diacilglicerol; cAMP: monofosfato adenosina ciclina. Adaptado: (Pytliak et al., 2011). O sistema serotogénico está então envolvido na regulação da ingestão de alimento e metabolismo energético, comportamento agonístico, respiração, nocicepção, memória e locomoção, entre outros (Pytliak et al., 2011). 21 1.8.3. Síntese de monoaminas 1.8.3.1. Síntese das catecolaminas: Dopamina, Noradrenalina e Adrenalina A via de biossíntese de qualquer catecolamina tem em comum a reação inicial, dado que todas elas derivam da tirosina (Elsworth & Roth,1997; Pandey, Mersha & Dhillon, 2013). Desta feita, após a entrada deste aminoácido no neurónio, ele é hidroxilado a L-3,4- Dihidroxifenilalanina (L-DOPA), uma reação catalizada pela enzima tirosina hidroxilase (TH). Seguidamente, a L-DOPA é descarboxilada a DA, pela enzima L- aminoácido aromático descarboxilase. Os neurónios que contêm a enzima adicional, DA-β- hidroxilase, convertem a DA em NA. Os neurónios que utilizam a A como neurotransmissor possuem ainda uma outra enzima designada de feniletanolamina-N- metiltransferase (PNMT), para converterem a NA em A (Fig. 7) (Fuller, 1982; Fernstrom & Fernstrom, 2007). Fig. 7: Via da biossíntese das catecolaminas: dopamina, noradrenalina e adrenalina a partir da tirosina. Fonte: http://www.sistemanervoso.com/pagina.php?secao=6&materia_id=256&materiaver=1. O passo inicial representa o passo limitante desta via e controla a taxa de síntese de toda a via (Elsworth & Roth,1997; Fernstrom & Fernstrom, 2007). 22 1.8.3.2. Síntese da Serotonina A serotonina é uma monoamina derivada do triptofano. Este aminoácido serve de substrato à enzima triptofano hidroxilase formando o 5-Hidroxitriptofano (5-HTP). O 5- HTP é alvo da enzima L-aminoácido aromático descarboxilase que, por intermédio do processo de descarboxilação, forma a 5-HT (Fig. 8) (Kema, Vries & Muskiet, 2000). Fig. 8: Biossíntese da serotonina. As enzimas envolvidas na sua biossíntese são: a triptofano hidroxilase, que forma o 5-Hidroxitriptofano (5-HTP) a partir do triptofano e a enzima L-aminoácido aromático descarboxilase, que converte o 5-HTP em serotonina. Fonte: http://www.orgone.com.br/a_thumor1.html. 1.8.4. Armazenamento das monoaminas As monoaminas são armazenadas nos neurónios através de vesículas de armazenamento, capazes de manter os neurotransmissores a uma concentração de 0,1M, o que representa uma concentração de 10-1000 vezes maior do que aquela existente no citoplasma da célula (Elsworth & Roth,1997). Tal acumulação é possível devido a um sistema antiporte, efetuado pelo transportador de monoaminas vesicular (VMAT), que introduz uma monoamina no interior da vesícula por cada protão que é expulso para o citoplasma. As vesículas localizam-se essencialmente nas dendrites e retículo endoplasmátilo liso dos neurónios (Elsworth & Roth,1997). Este processo é comum à dopamina, adrenalina, serotonina e outras monoaminas, uma vez que o VMAT é um transportador inespecífico. 23 1.8.5. Libertação das monoaminas O principal mecanismo de libertação das monoaminas armazenadas nos terminais nervosos pode ser genericamente explicado pelo facto de após a propagação de um impulso nervoso ocorrer localmente um potencial de ação no neurónio que culmina numa mudança da conformação das proteínas de membrana, facto que permite o influxo de iões de cálcio. Esta ocorrência provoca a fusão das vesículas de armazenamento de neurotransmissores com a membrana neuronal e, através de processos de exocitose, as vesículas libertam os neurotransmissores na fenda sinática (Elsworth & Roth,1997). 1.8.6. Manutenção dos níveis das monoaminas no cérebro 1.8.6.1. Manutenção dos níves de Dopamina A manutenção dos níveis de dopamina é assegurada pela recaptação dos neurotransmissores por transportadores dopaminérgicos. Assim, dependendo da concentração de dopamina no interior do neurónio, esse transportador recapta a dopamina libertada caso a concentração seja baixa, ou então liberta dopamina se a concentração no seu interior for muito elevada (Elsworth & Roth,1997). Outro mecanismo é assegurado pelos autorrecetores. Estes recetores são capazes de reconhecer a dopamina libertada pelo neurónio (Elsworth & Roth,1997) e dependendo da região do cérebro, os autorecetores possuem capacidade de regular a libertação de dopamina e até a sua síntese (Elsworth & Roth,1997). Em geral, todos os autorrecetores da dopamina podem ser classificados como recetores de dopamina do tipo D2 (Elsworth & Roth,1997; Schmitz et al., 2003) e são mais sensíveis à dopamina do que os recetores pós-sináticos (Elsworth & Roth,1997). Contudo, a ativação eficiente dos autorrecetores está dependente da acumulação extracelular da DA, originada pela libertação de dopamina (Benoit-Marand, Borrelli & Gonon, 2001), sendo que o mesmo se passa com os recetores pós-sinápticos D1 (Schmitz et al., 2003). 1.8.6.2. Manutenção dos níveis de Noradrenalina e Adrenalina Após a libertação da noradrenalina para a fenda sinática, a noradrenalina pode difundirse pela fenda sinática e entrar na circulação sanguínea, ser metabolizado na fenda 30 Fig. 14: Mecanismo da transcrição génica através dos recetores ativados pela proliferação de peroxissomas. No estado desativado, o PPAR interage com o complexo antirepressor; O correpressor apresenta atividade histona deacetilase inibindo a transcrição de genes. Com a ligação do ligando, forma-se o heterodímero PPAR/RXR e o recrutamento de coativadores que contêm ativadade histona acetilase que facilita a transcrição dos genes. Fonte: Kota, Huang & Roufogalis, 2005. 1.9.2. As Proteínas de Ligação ao Elemento Regulador de Esterol As proteínas de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP) pertencem a uma família de fatores de transcrição designada de “basic helix-loop-helix–leucine zipper” (bHLH-Zip). As SREBP possuem a capacidade de se ligarem ao elemento regulador de esterol e, a partir daí, regularem a transcrição de vários genes envolvidos na síntese de colesterol e ácidos gordos (Xu et al., 1999). Os mamíferos contêm no seu genoma três isoformas da SREBP, denominadas de SREBP-1a, SREBP-1c e SREBP-2. A SREBP-1a é capaz de ativar todos os genes de resposta à SREBP, onde se incluemos genes responsáveis pela síntese de colesterol, ácidos gordos e triglicerídeos. Por outro lado, a SREBP-1c atua preferencialmente sobre os genes responsáveis pela síntese de ácidos gordos. Já a SREBP-2 atua essencialmente sobre os genes relacionados com a síntese de colesterol (Xu et al., 1999; Horton, Goldstein & Brown, 2002; Nakamura et al., 2004). Os percursores SREBP possuem cerca de 1150 aminoácidos e estão organizados em três domínios (Xu et al., 1999; Horton, Goldstein & Brown, 2002):  um domínio NH2-terminal, contendo a região de bHLH-Zip para a ligação ao DNA; 31  dois segmentos hidrofóbicos transmembranares que se projetam para o lúmen do RE (retículo endoplasmático);  um domínio COOH-terminal com cerca de 590 aminoácidos que executa a função reguladora. Para atingir o núcleo e agir como um fator de transcrição o domínio terminal NH2, de cada SREBP deve ser libertado da membrana do RE proteoliticamente, tal como é mostrado na Fig. 15. Fig. 15: Mecanismo da libertação das proteínas de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP) a partir das membranas por processos proteolíticos mediados por esteróis. A proteína de ativação da clivagem da SREBP (SCAP) é um sensor de esteróis e um acompanhante da SREBP. Quando as células têm falta de esteróis, a SCAP transporta as SREBP a partir do retículo endoplasmático até ao complexo de Golgi, onde estão as protéases do sítio 1 (S1P) e do sítio 2 (S2P), as quais atuam sequencialmente para libertar o domínio bHLH-Zip NH2-terminal a partir da membrana. Consequentemente, o domínio bHLH-Zip NH2-terminal entra no núcleo e liga-se ao elemento de resposta ao esterol, ativando a transcrição dos genes. Quando há muito esterol disponnível, a SCAP é retida no retículo endoplasmático e as SREBP não vão até ao complexo de Golgi, resultando na inibição da expressão dos genes. Fonte: Horton, Goldstein & Brown, 2002. 1.9.3. Os ácidos gordos como reguladores dos fatores transcricionais Até agora, os estudos in vivo têm demonstrado que o PPARα e a SREBP-1c regulam a transcrição dos genes alvo dos ácidos gordos (Jump, Tripathy & Depner, 2013). Porém, 32 tem de existir um mecanismo que controle os fatores de transcrição. Na verdade tem-se observado que os ácidos gordos são capazes de regular a atividade e abundância de fatores de transcrição como o PPAR e SREBP-1c (Jump, Tripathy & Depner, 2013). 1.9.3.1. Influência dos ácidos gordos na regulação do PPARα Tal como referido, de todas as isoformas de PPAR os PPARα são os recetores de PUFA mais importantes, estando intimamente relacionados com a expressão de genes envolvidos na oxidação mitocondrial e peroxissomal (Georgiadi & Kersten, 2012). Esta interação é conseguida porque os ácidos gordos funcionam como hormonas hidrofóbicas que controlam a função dos recetores nucleares, como é o caso da família dos PPAR (Jump, Tripathy & Depner, 2013). Todos os ácidos gordos de cadeia longa saturados e insaturados ligam-se aos PPAR (Yoshikawa et al., 2003). A junção destes ligandos estimula a troca de correpressores por coativadores sobre os recetores ligados à cromatina e ao recrutamento de mais proteínas envolvidas na transcrição do gene, tais como o ácido ribonucleico (RNA) e a polimerase II (Georgiadi & Kersten, 2012). Deste modo, a ativação do PPARα por ácidos gordos faz parte de um mecanismo “feedforward” que não só induz a oxidação dos ácidos gordos que entram na célula, mas impede também que esses compostos lipotóxicos se acumulem na mesma (Georgiadi & Kersten, 2012). Embora os PPAR sejam sensores intracelulares de ácidos gordos, importa referir que os PPAR respondem de modo diferente aos vários ácidos gordos, tendo diferentes efeitos na ativação do PPARα ou na indução dos genes alvo do PPARα. Na verdade, os ácidos gordos não esterificados são considerados os principais ligandos do PPARα. O EPA e o DHA induzem um aumento significativo da transcrição dos genes-alvo do PPARα, ao passo que o ácido oleico (18:1 n-9) tem um efeito menos significativo na indução da transcrição desses mesmos genes (Lemberger, Desvergne & Wahli, 1996; Jump, Tripathy & Depner, 2013). Isto significa que os ácidos gordos de cadeias maiores ativam mais eficientemente o PPARα do que os de cadeia curta, tal como acontece com os ácidos gordos da série n-3 quando comparados com os da série n-6 (Wahli, Braissant & Desvergne, 1995). 33 1.9.3.2. Influência dos ácidos gordos na regulação da SREBP-1 Os PUFA conseguem inibir a expressão dos genes relacionados com as SREBP (Xu et al., 2001; Nakamura & Nara, 2003), dado que aumentam a taxa de degradação do mRNA das SREBP (Xu et al., 2001; Nakamura & Nara, 2003). Porém, a capacidade destes ligandos atuarem a este nível é diferenciada, sendo maior sobre a SREBP-1 do que sobre a SREBP-2 (Xu et al., 2001; Tang et al., 2003). Além disso, a SREBP-1c é mais sensível à regulação dos PUFA do que a SREBP-1a (Xu et al., 2001). Na verdade, a SREBP-1 funciona como um regulador chave no controlo da transcrição de genes responsáveis pela síntese e transporte de ácidos gordos (Jump, Tripathy & Depner, 2013) através de um mecanismo que envolve duas fases. A primeira fase é rápida e tem como objetivo inibir o processo de libertação proteolítico. A segunda tem como objetivo reduzir o conteúdo de mRNA de SREBP-1, e consequentemente, reduzir a quantidade de precursores da proteína SREBP-1 (Xu et al., 1999; Clarke, 2001; Jump et al., 2005). Além disso, também tem sido sugerido que apenas o DHA e não outros PUFA estimulam a remoção da SREBP-1 nuclear (nSREBP-1) (Georgiadi & Kersten, 2012). Este processo é conseguido pois as SREBP são fosfoproteínas e o seu estado de fosforilação controla a sua capacidade para ativar os genes, bem como a sua abundância nuclear. Assim, a fosforilação de SREBP dentro do domínio de ligação de DNA inibe a ligação ao SREBP (Fig. 16) (Georgiadi & Kersten, 2012; Jump, Tripathy & Depner, 2013). O DHA regula, portanto, a abundância da nSREBP-1 por meio de mecanismos de fosforilação/desfosforilação e por degradação proteossomal (Jump, Tripathy & Depner, 2013), conseguindo assim inibir a transcrição de genes lipogénicos (Xu et al., 1999; Clarke, 2001). 34 Fig. 16. Mecanismos gerais da regulação dos genes pelos ácidos gordos polinsaturados (PUFA). O mecanismo mostra que os PUFA reduzem a expressão dos genes envolvidos na biossíntese de colesterol e ácidos gordos pela ligação e inativação da UBXD8, inibindo assim, as proteínas de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP) por processos proteolíticos. Vários ácidos gordos, mas especialmente os PUFA, atuam como ligandos dos PPAR. A ativação do PPARα pelos PUFA leva ao catabolismo dos ácidos gordos. Fonte: Georgiadi & Kersten, 2012. 1.9.4. Influência dos ácidos gordos na expressão da Fads2 Nos mamíferos foi observado que a região promotora do gene da ∆6 dessaturase é ativada pela SREBP-1 (Horton, Goldstein & Brown, 2002; Matsuzaka et al., 2002). Sendo assim, quando as dietas são incrementadas com PUFA, ocorre uma diminuição da abundância de nSREBP-1, bem como dos seus genes-alvo hepáticos, como as dessaturases (por exemplo Fads1 e Fads2) e as elongases (tal como Elovl5 e Elovl6) (Jump, Tripathy & Depner, 2013). Existe então uma diminuição do mRNA do gene que codifica a ∆6 dessaturase quando a dieta é suplementada com PUFA e, contrariamente a deficiência em ácidos gordos essenciais induz a transcrição do gene Fads2 (Cho, Nakamura & Clarke, 1999). Relativamente ao papel dos PPAR, sabe-se que os ácidos gordos atuam como ligando agonístico do PPARα, o qual atua sobre os genes da oxidação lipídica. Assim, quando os PUFA se ligam ao PPARα, este último liga-se ao PPRE da região promotora dos genes 35 da oxidação lipídica, induzindo a oxidação dos ácidos gordos, tanto nos peroxissomas como nas mitocôndrias. Por outras palavras, o aumento de PUFA na dieta promove a oxidação dos ácidos gordos pela ação do PPARα (Nakamura & Nara, 2003; Tang et al., 2003). 1.9.5. Influência dos ácidos gordos na expressão da fads2 dos peixes teleósteos Os mecanismos e processos envolvidos na regulação da expressão da fads2 são menos conhecidos nos peixes do que nos mamíferos (Vagner & Santigosa, 2011). Apesar disso, já há alguns estudos que revelam a importância dos PPAR na modulação nutricional em peixes. O estudo levado a cabo por Kennedy et al. (2006) constatou que, no salmão, o incremento de óleo de peixe na dieta diminui a expressão do gene que codifica a ∆6 dessaturase do fígado. Coincidentemente, a expressão do PPARα e do PPARβ diminuiu com o aumento da quantidade de óleo de peixe na dieta (Kennedy et al., 2006). Neste mesmo estudo, a expressão do gene do PPARα excedeu em muito a do PPARβ, facto que evidencia a maior importância do PPARα naquela regulação (Kennedy et al., 2006). Trabalhos desenvolvidos em outras espécies têm confirmado esses resultados. Por exemplo, em Fugu rubripes, Dicentrarchus labrax (robalo), Sparus aurata (dourada) e Pleuronectes platessa (solha), a clonagem e caraterização dos genes que codificam os PPAR revelaram elevada homologia com os PPARα, β ou δ e γ dos mamíferos (Maglich et al., 2003; Boukouvala et al., 2004; Leaver et al., 2005). No peixe-zebra também foi caraterizado o cDNA, que codifica duas proteínas homólogas ao PPARβ dos mamíferos, sugerindo a existência de mais do que três genes para os PPAR (Robinson-Rechavi et al., 2001). Por outro lado, em S. aurata e em P. platessa não foram encontrados mais do que três genes para o PPAR (Leaver et al., 2005). Tal como nos mamíferos, é provável que nos peixes os isotipos também formem um heterodímero com o RXR e se liguem aos elementos de resposta do PPAR (PPRE) (Boukouvala et al., 2004; Leaver et al., 2005). Além disso, confirmou-se que os ácidos gordos também são ligandos do PPARα e β, podendo atuar por mecanismos semelhantes aos PPAR dos mamíferos (Boukouvala et al., 2004; Leaver et al., 2005). Alíás, em S. aurata, a ativação do PPARγ só foi conseguida pelos HUFA (como EPA, DHA e ARA), já que os ácidos gordos saturados ou monoinsaturados não produziram qualquer efeito significativo (Leaver et al., 2005). 36 Estudos mais recentes, realizados em larvas de peixe, confirmaram que esta modulação nutricional é bem evidente mesmo em estágios de desenvolvimento precoces (Vagner et al., 2007b; Vagner et al., 2009). 1.9.6. Influência dos ácidos gordos na expressão da Elovl5 Nos mamíferos, a Elovl5 é regulada pela SREBP (Jakobsson, Westerberg & Jacobsson, 2006; Quin et al., 2009), tendo alguns estudos demonstrado que o aumento da expressão da SREBP-1 conduz ao aumento dos níveis de mRNA da Elovl5 (Horton et al., 2003). Na verdade, os níveis trancricionais da Elovl5 são regulados, mais especificamente, pela SREBP-1c (Quin et al., 2009). Por outro lado, os PUFA inibem a transcrição dos genes envolvidos na lipogénese, dado que eles próprios inibem a expressão do gene da SREBP-1 através da redução dos níveis de nSREBP-1 (Quin et al., 2009). Este efeito inibitório apenas é conseguido por determinados ácidos gordos, já que em hepatócitos isolados de ratos, este efeito foi evidente com o ARA, mas esteve ausente com o ácido oleico (Xu et al., 1999). De facto, mais tarde, Botolin et al. (2006) constataram que o EPA e o DHA suprimem a lipogénese por fosforilação do nSREBP-1. Por outro lado, a diminuição da atividade da ELOVL5 diminui a quantidade de HUFA C20- 22. Este fenómeno origina a ativação da SREBP-1c e, consequentemente, estimula os genes envolvidos na síntese de ácidos gordos e triglicerídeos (Moon, Hammer & Horton, 2009; Quin et al., 2009). O PPARα também regula a expressão da Elovl5, tendo sido observado que a estimulação do PPARα promove também a expressão da Elovl1, Elovl3, e Elovl6 (Jakobsson, Westerberg & Jacobsson, 2006). Em suma, a expressão da Elovl5 é controlada nutricionalmente pois os HUFA inibem a síntese de ácidos gordos (Horton, Goldstein & Brown, 2002; Wang et al., 2005; Espenshade, 2006). 1.9.7. Influência dos ácidos gordos na expressão da elovl5 dos peixes teleósteos Até ao momento, alguns estudos demonstraram que os mecanismos envolvidos no controlo do metabolismo lipídico dos peixes são similares à dos mamíferos, na medida descreveram uma forte correlação entre os níveis de mRNA dos genes do metabolismo 37 lipídico com os níveis de mRNA das SREBP e dos PPAR (Morais et al., 2011; Cunha et al., 2013) De facto, Leaver et al. (2008b) constataram que a expressão dos genes envolvidos na biossíntese de colesterol, assim como o gene que codifica a SREBP-2, aumentou no fígado dos peixes alimentados com dietas cujo óleo de peixe da dieta foi substituído por óleos vegetais como o óleo de: colza, de soja ou de linhaça. Esta observação demonstra a importância da SREBP-2 no metabolismo lipídico. Além disso, a substituição de óleo de peixe por óleo vegetal originou o aumento significativo da expressão do gene da SREBP- 1 no fígado de salmões (Morais et al., 2011). Por outro lado, a mesma substituição influenciou ainda de forma negativa a expressão quer do gene do PPARα quer do gene do PPARβ, indicando a intervenção de ambos na regulação nutricional. Já o gene do PPARγ não demonstrou qualquer alteração na sua expressão, uma vez que se relaciona com a diferenciação de adipócitos (Morais et al., 2011). Um outro trabalho constatatou que a transcrição da maior parte dos genes envolvidos no metabolismo dos ácidos gordos tem uma forte correlação com os níveis de mRNA dos PPARα, β e γ durante o desenvolvimento das larvas do Scopthalmus maximus (Cunha et al., 2013), Desta forma, a modulação nutricional dos peixes parece seguir os mecanismos descritos para os mamíferos, sendo que o PPARα, o PPARβ e a SREBP-1 parecem desempenhar um papel crucial na modulação nutricional dos ácidos gordos no metabolismo dos ácidos gordos. 1.9.8. Influência do selénio na expressão adipogénica Os ácidos gordos não são os únicos nutrientes capazes de influenciar a expressão de genes-alvo. Até ao momento tem-se verificado que a suplementação da dieta com selénio aumenta a atividade das selenoproteínas e potencia a expressão dos seus respetivos genes (Bermano et al., 1995). Trabalhos recentes sobre terapias oncológicas (Cho et al., 2004; Dong et al., 2004; Zhao et al., 2004; Lee et al., 2005; Rayman, 2005; Chun et al., 2006) mostraram que o “Methylseleninic acid” (MSA), um metabolito do selénio, altera a expressão de diversos genes envolvidos na regulação da apoptose (Dong et al., 2002; Zhao et al., 2004), tendo também efeitos no controlo do ciclo celular e em moléculas de sinalização (como as ciclinas A e D1) (Dong et al., 2002). O selénio tem sido apontado como podendo desempenhar um potencial papel no tratamento de alguns tipos de cancro com base no seu efeito na disrupção dos recetores 38 de estrogénios. Os recetores de estrogénio, em particular o recetor de estradiol são fatores de transcrição hormono-dependentes que pertencem à família de receptores de esterol (Lee et al., 2005). Neste sentido, a suplementação da dieta com selénio diminui a expressão do recetor de estrogénio α (REα), bem como a ligação do estradiol a esse recetor de estrogénio (Lee et al., 2005; Shah et al., 2005). A mesma relação foi estabelecida para os recetores de androgénios (Dong et al., 2004; Zhao et al. 2004). Além destas evidências, o selénio foi considerado importante na diminuição da estabilidade do mRNA do recetor de androgénios, na aceleração da degradação da proteína do recetor de androgénios e como bloqueador da translocação do recetor de androgénios nucleares. O selénio inibe também o recrutamento de coativadores e mantém os correpressores ligados aos promotores dos genes-alvo (Dong et al., 2004; Chun et al., 2006). Porém, o mecanismo pelo qual o selénio inibe o recetor de estrogénio α não é totalmente conhecido. Okuno et al. (2012) propuseram um possível mecanismo que poderá explicar essa interação, baseado na capacidade antioxidativa deste micronutriente. Segundo os esses autores, o MSA é conhecido por diminuir os níveis das espécies reativas de oxigénio (ROS) que provocam danos nas células e no DNA (Rayman, 2005). Dentro dos sistemas envolvidos neste mecanismo, destaca-se o sistema tioredoxina (Trx)/tioredoxina redutase (TrxR) que é a chave da regulação do estado redox das células. Neste contexto, a ação do MSA dever-se-á ao fato deste aumentar a expressão da TrxR bem como a sua atividade enzimática. Assim, a Trx oxidada é inativada, mas é convertido à forma reduzida ativa pela TrxR que se liga às ROS e protege as células do stress oxidativo (Okuno et al., 2012). Por conseguinte, as baixas concentrações de ROS modelam a expressão do REα que culmina na diminuição da proteína REα. Como consequência ocorre a disrupção da sinalização do REα (Fig. 17) (Okuno et al., 2012). Fig. 17: Mecanismo de inibição do recetor de estrogénio e consequente inibição da progressão do ciclo celular pelo MSA. E2: 17β-estradiol; CE2-Q: catecol E quinona; CYP: cotocromo p-450; Erα: recetor de 39 estrogénio α; Efp: proteína indicadora do recetor de estrogénio; ROS: espécies reativas de oxigénio; MAS: Methylseleninic acid; Trx: tioredoxina; TrxR: tioredoxina redutase. Fonte: Okuno et al., 2012. Okuno et al. (2012) concluíram então que o selénio é importante no combate do stress oxidativo das células e poderá ser crucial na modulação da expressão dos genes regulados pelos recetores nucleares. 1.10. Efeito da subituição de óleo de peixe por óleo vegetal da dieta na expressão adipogénica 1.10.1. Efeito da substituição de óleo de peixe por óleo vegetal da dieta na expressão da fads2 A modulação nutricional dos genes que codificam as dessaturases em peixes tem sido extensamente reportada (Seiliez et al., 2003; Zheng et al., 2005a, 2005b; Leaver et al., 2008b). Na truta, a substituição de óleo de peixe por óleo de linhaça levou ao aumento da expressão do gene da ∆6 dessaturase (Seiliez et al., 2001) e resultados semelhantes foram obtidos também em salmão (Zheng et al., 2005a, 2005b; Leaver et al., 2008b; Monroig et al., 2010). Nos peixes marinhos, este tipo de estudos foram realizados em diversas espécies e revelaram a mesma tendência descrita para os salmonídeos (Seiliez et al., 2003; Tocher et al., 2006; Vagner et al., 2007a). Porém, nas espécies marinhas, o aumento da expressão do gene da ∆6 dessaturase nem sempre foi suficiente para garantir o “turnover“dos fosfolípidos da membrana (Vagner et al., 2007a). Outros trabalhos têm concluído que nalgumas espécies marinhas a atividade da ∆6 dessaturase hepática é tendencialmente baixa (Mourente & Dick, 2002; Tocher et al., 2006; González-Rovira et al., 2009). Além disso, a sua atividade não se alterou, tanto nos hepatócitos como dos enterócitos, quando os óleos de peixe foram substituídos por óleos vegetais na dieta (Deveras, Mourente & Dick, 2002; Mourente et al., 2005; Tocher, 2006). Estas evidências contrastam com os resultados obtidos nos peixes de água doce e salmonídeos, espécies em que o aumento da expressão génica tende a repercutir-se no aumento da atividade enzimática (Zheng et al., 2005b; Vagner & Santigosa, 2011). 46 Tabela 6: Ingredientes e percentagem de inclusão dos diferentes lípidos que compõem as 4 dietas testadas. Soja concentrada Vísceras. Farinha de Aves Penas. Farinha (56%) Trigo. Farelo Milho. Grão Carne. Farinha (43%) Trigo. Glúten DL - Metionina Binder Fungistático Vitamina C Selénio Óleo de Peixe Óleo de Colza Óleo de Linhaça Óleo de Soja Premix – Vit e Mineral (sem selénio) Cloreto de Colina ÓLEO DE PEIXE 12% (%) 28,4 17 12 8,8 6 5,61 4 0,5 0,5 0,2 0,01 0,0/0,1 6,16 0,35 0,15 MISTURA VEG 12 % (%) 28,4 17 12 8,8 6 5,61 4 0,5 0,5 0,2 0,01 0,0/0,1 1,85 3,08 1,23 0,35 0,15 Tabela 7: Composição nutricional das 4 dietas testadas em corvina (Argyrosomus regius). Coluna1 CÁLCIO (%) ENERG. DIG. PEIXES (Mcal/kg) FIBRA BRUTA (%) FÓSFORO DISPONÍVEL (%) FÓSFORO TOTAL (%) GORDURA (%) LISINA TOTAL (%) MET. +CISTINA TOTAL (%) METIONINA TOTAL (%) PROTEÍNA BRUTA (%) ÓLEO DE PEIXE 12% (%) 2,24 3,93 2,19 1,14 1,59 12 2,54 1,69 1,28 50 MISTURA VEG 12 % (%) 2,24 3,93 2,19 1,14 1,59 12 2,54 1,69 1,28 50 47 3.4. Amostragem 3.4.1. Amostragem para expressão génica Após 60 dias de ensaio (no dia 10 de outubro de 2013), 6 peixes de cada tratamento (2 peixes por tanque/réplica) foram previamente anestesiados, em gelo, e de seguida sujeitos a eutanásia por decapitação, tendo sido amostrados os seguintes órgãos: fígado (porção final do lobo direito) e cérebro. Após a extração dos órgãos, os mesmos foram imediatamente colocados em tubos de eppendorf com 1000 µl de RNA later. As amostras ficaram “overnight” a 4º C e depois foram armazenadas a -80 ºC. 3.4.2. Amostragem para quantificação de monoaminas Após 90 dias de ensaio (no dia 15 de novembro de 2013), 8 peixes de cada tratamento (2 a 3 peixes por tanque/réplica) foram anestesiados por imersão em benzocaína (100 mg/l). Foram secos numa toalha, medidos (comprimento total), pesados e sujeitos à eutanásia por decapitação, num processo com duração total de 3 minutos. Os cérebros inteiros foram rapidamente removidos e confirmou-se sempre se a hipófise era removida juntamente com o mesmo. Após esta etapa, os cérebros foram colocados num tubo de eppendorf de 1,5 mL e pesados. De seguida, os tubos de eppendorf contendo os cérebros foram transferidos para azoto líquido. Desde a decapitação até ao congelamento, o processo não demorou mais do que 1 minuto. Por fim, as amostras foram armazenadas a -80 ºC até ao seu uso para posterior análise. A amostragem iniciou-se às 14 horas e teve uma duração de 6 horas. 3.5. Quantificação da expressão génica 3.5.1. Extração de RNA O ácido Ribonucleico (RNA) foi extraído a partir de dois tecidos, fígado e cérebro, recorrendo ao Kit “RNAspin Mini RNAIsolation Kit (GE Healthcare)”. Este procedimento inclui o passo com a DNase I que tem o objectivo de remover o DNA presente na amostra. De seguida foi avaliada a integridade do RNA extraído por electroforese em 48 agarose. A concentração de RNA foi obtida por espetofotometria utiizando um aparelho Nanodrop. Posteriormente o RNA total foi transcrito para cDNA (DNA complementar) utilizando o Kit “iScriptTM Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR” da Bio-Rad, seguindo as instruções do fabricante. 3.5.2. Real-Time PCR A expressão dos genes fads2 e elovl5 foram analisadas através da técnica de RT-PCR. A análise de PCR foi realizada com o sistema de detecção “System iCycler iQ RT-PCR (BioRad)”. O volume final da reação foi de 20 µL que incluiu o “SYBR® Green Real-Time PCR Master Mixes”, para marcação do segmento alvo, os primers “forward” e “reverse”, o cDNA e água. Todas as amostras foram realizadas em duplicado e incluído sempre um controlo negativo a fim de confirmar a ausência de contaminações, tendo sido realizada sempre uma reta de calibração para monitorização da eficiência da reação nas diferentes placas. As condições utilizadas durante a experiência estão descritas na tabela 8. Adicionalmente foi realizada uma curva de fusão para confirmarmos a especificidade do ensaio e despistarmos a presença de “primer dimmers”. O valor de “threshold cycle” (Ct), para cada amostra foi normalizado com o gene de referência “β-actina”, já que a sua expressão é constante em todas as amostras, independentemente do tratamento (Monroig et al., 2013). O método utilizado para determinar a expressão do gene em cada amostra foi o de Pfaffl, que assume que todos os genes alvos e genes de referência possuem a mesma eficiência de amplificação e baseia-se na seguinte equação (Pfaffl, 2001): Ratio = 2-∆∆Ct, onde ∆∆Ct significa a diferença entre o ∆Ct (teste) e o ∆Ct (calibrador). O Ct significa o “cycle threshold”, ou seja, o número de ciclos do PCR a partir do qual o amplicon é detetado. 49 Tabela 8: Primers e protocolo para o Real-Time PCR (F – Forward; R – Reverse). Fonte: Monroig et al., 2013. Nome Q-PCR Primer (5´-3´) Annealing (Q- PCR) T (ºC) Protocolo fads2 TGACTGGGTGACAATGCAGT TGGTGCTAACTTTGTGCCCT 60ºC durante 30 s 95ºC - 1 min, (95ºC – 30 s, 60ºC – 30 s, 72ºC - 1 min) × 35 ciclos 72º C - 5 min elovl5 CATCACACAGTTACAGCTGGTC GAATTGTGTGCACGGTTTCT 60ºC durante 30 s 95ºC - 1 min, (95ºC – 30 s, 60ºC – 30 s, 72ºC - 1 min) × 35 ciclos 72º C - 5 min β-actina CCATCGAGCACGGTATTGT CAGCTTCTCCTTGATGTCACG 60°C durante 30s 95ºC - 1 min, (95ºC – 30 s, 60ºC – 30 s, 72ºC - 1 min) × 35 ciclos 72º C - 5 min 3.6. Deteção de monoaminas e metabolitos por HPLC-DE Foram utilizados 8 animais de cada tratatamento dietético para a análise neuroquímica. O cérebro inteiro, incluindo a hipófise, foi desintegrado a 4 ºC usando um ultrasonicador (Sonifier W-250, Branson Ultrasonics, Danbury, CT) em 200 µl de ácido perclórico 0,2M frio . O homogenado foi centrifugado a 13,000 × g a 4 ºC durante 15 minutos e o sobrenadante foi filtrado através de de um microfiltro de Nylon-66 com uma malha de 0,2 µm. Alíquotas de 50 µl do filtrado foram utilizadas para a análise de deteção de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) com detecção electroquímica (DE). O sistema de HPLC utilizado é composto por um auto-injetor LC234, uma bomba de distribuição LC307, um eletrodetetor LC142, um sistema controlador de dados do HPLC 712 versão 1.30 software de gestão (tudo da “Gilson Medical”, Middleton, WI). A fase móvel consistiu num buffer monobásico de fosfato de potássio a 70 mM (pH = 3 ajustado por adição de ácido fosfórico), ácido 1-heptanosulfónico a 1 mM, EDTA de sódio 107,5 µM e metanol a 10% (v/v). O fluxo foi mantido a 0,8 ml/min. A separação 50 cromatográfica foi conseguida utilizando uma columa de fase reversa supelcosil LC (7,5 cm × 4,6 cm, 3 µm). A deteção foi efetuada com um detetor electro-químico equipado com um elétrodo de trabalho de carbono fixado nos +0,75V e a quantificação foi realizada com um padrão externo. Os resultados foram expressos por ng/mg de peso fresco do cérebro. 3.7. Análise estatística A análise estatística, foi levada a cabo recorrendo ao programa SPSS Statistics 21. O teste Levene´s foi adotado para testarmos a homogeneidade de variância. A homogeneidade de variância para os dados da quantificação da expressão génica foi conseguida após transformação dos mesmos com a função “Log10”. Uma vez que se verificou a homogeneidade de variância, partiu-se para uma “two-way ANOVA”, a fim de verificarmos interações entre os fatores: fonte de óleo (animal vs vegetal) e selénio para cada uma das variáveis. Posteriormente a comparação entre pares foi feita pelo teste post hoc LSD (ou teste de fisher). As diferenças foram consideradas significativas para P<0,05. 51 4. RESULTADOS 4.1. Expressão génica Foi testado o efeito que cada uma de quatro dietas isoproteicas e isolipídicas (50% de proteína e 12% de lípidos), formuladas com 12% de óleo de peixe ou 12% de misturas de óleos vegetais (colza, linhaça e soja) e na presença (1mg/kg) ou ausência de selénio, exerce sobre a expressão relativa dos genes fads2 e elovl5 no fígado e cérebro de juvenis de corvina. Neste trabalho, a expressão relativa dos genes em estudo foi normalizada com gene de referência β-actina, uma vez que este não altera a sua expressão em diferentes condições ambientais. Além disso os níveis de transcrição foram standardizados com os níveis de transcrição do grupo alimentado com a dieta OP-S (óleo de peixe com selénio). A análise de variância (ANOVA) a 2 fatores permitiu verificar interações entre os fatores fonte de óleo (animal vs vegetal) e selénio para a variável fads2 do fígado (P<0,05), indicando que a expressão da fads2 é influenciada não só pela fonte lipídica, mas também pela interação entre a fonte lipídica e a presença ou ausência de selénio na dieta (Tabela 9). Tabela 9: Impacto dos fatores: fonte lipídica (animal vs vegetal) e selénio, na expressão da fads2 e elovl5 do fígado e cérebro da corvina (Argyrosomus regius). Fígado Cérebro fads2 elovl5 fads2 elovl5 ANOVA (P value) Fonte lipídica (L) <0.0001 0.791 0.889 0.270 Selénio (S) 0.0875 0.382 0.821 0.235 L × S 0.0108 0.253 0.474 0.993 Por outro lado, a comparação entre pares através do teste LSD (ou teste de fisher), permitiu-nos analisar as diferenças entre os tratamentos, para cada uma das variáveis. No gráfico 1 apresenta-se o efeito que a substituição total de óleo de peixe por misturas de óleos vegetais, ambas suplementadas com 1mg/kg de selénio, tem sobre a expressão dos genes fads2 e elovl5 no fígado da corvina. Segundo o mesmo, a substituição de OP- S por OV-S conduziu ao aumento significativo da expressão do gene fads2, correspondente a 114 vezes (P<0,001). Também os níveis de transcrição do gene elovl5 sofreram um aumento de cerca de 2 vezes, sem que, contudo, esse aumento fosse estatisticamente significativo. 52 Gráfico 1: Efeito da substituição total de 12% de óleo de peixe (OP) por 12% de misturas de óleos vegetais [OV (colza, linhaça e soja)], nas dietas suplementadas com 1 mg/kg de selénio (S), sobre a expressão dos genes fads2 e elovl5 no fígado da corvina (Argyrosomus regius). As barras representam a média de 6 amostras por tratamento ± SD. As diferenças significativas entre os tratamentos estão marcadas com *** (P<0,001, ANOVA). Quando a mesma análise foi realizada no cérebro, não se observaram diferenças significativas na transcrição de ambos os genes. Contudo, no grupo OV-S, quando comparado com o grupo OP-S, ocorreu um ligeiro aumento, correspondente a 1 vez, da expressão do gene fads2, ao passo que o nível de transcrição do gene elovl5 revelou um decréscimo de 1 vez (Gráfico 2). Gráfico 2: Efeito da substituição total de 12% de óleo de peixe (OP) por 12% de misturas de óleos vegetais [OV (colza, linhaça e soja)], nas dietas suplementadas com 1 mg/kg de selénio (S), sobre a expressão dos 0 10 20 30 40 50 60 70 OP-S OV-S Expressão relativa dos genes (unidades arbitrárias) fads2 elovl5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 OP-S OV-S Expressão relativa dos genes (unidades arbitrárias) fads2 elovl5 *** 53 genes fads2 e elovl5 do cérebro da corvina (Argyrosomus regius). As barras representam a média de 6 amostras por tratamento ± SD. O efeito que a suplementação das dietas de 12% de óleo de peixe (OP) com 1 mg/kg de selénio tem sobre a expressão dos genes fads2 e elovl5 no fígado da corvina está representado no gráfico 3. Assim, constatou-se uma diminuição de cerca de 16 vezes (P<0,01) dos níveis de expressão do gene fads2 nas dietas OP-S em relação às dietas OP-NS, enquanto que na mesma condição o gene elovl5 revelou uma diminuição de expressão de cerca de 3 vezes (P>0,05) (Gráfico 3). Gráfico 3: Efeito da suplementação das dietas de 12% de óleo de peixe (OP) com 1 mg/kg selénio (S) na expressão dos genes fads2 e elovl5 do fígado da corvina (Argyrosomus regius). As barras representam a média de 6 amostras por tratamento ± SD. As diferenças significativas entre os tratamentos estão marcadas com ** (P<0,01, ANOVA). A suplementação das dietas OP com 1 mg/kg de selénio parece não exercer efeitos significativos nos níveis de transcrição dos genes fads2 e elovl5 do cérebro da corvina. No entanto nas dietas com selénio observa-se uma tendência para a diminuição da transcrição do gene fads2, cuja expressão foi cerca de 2 vezes inferior nas dietas OP-S em relação ao grupo OP-NS. Este efeito não foi visível no genes elovl5, pois a sua expressão aumentou cerca de 1 vez no grupo OP-S em comparação com o grupo OP-NS (Gráfico 4). 0 2 4 6 8 10 12 14 OP-S OP-NS Expressão relativa dos genes (unidades arbitrárias) fads2 elovl5 ** 54 Gráfico 4: Efeito da suplementação das dietas de 12% de óleo de peixe (OP) com 1 mg/kg de selénio (S) na expressão dos genes fads2 e elovl5 do cérebro da corvina (Argyrosomus regius). As barras representam a média de 6 amostras por tratamento ± SD. O efeito da suplementação das dietas OV com 1 mg/kg de selénio não influenciou de forma significativa nenhum dos genes. Porém graficamente, observa-se uma tendência para o aumento dos níveis de expressão tanto da fads2 como da elvol5 hepáticas, cuja expressão foi cerca de 2 vezes e 1 vez maior nas dietas OV-S do que nas dietas OV-NS, respetivamente (Gráfico 5). Gráfico 5: Efeito da suplementação das dietas de 12% de misturas de óleos vegetais [OV (colza, linhaça e soja)] com 1 mg/kg de selénio (S) na expressão dos genes fads2 e elovl5 do fígado da corvina (Argyrosomus regius). As barras representam a média de 6 amostras por tratamento ± SD. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 OP-S OP-NS Expressão relativa dos genes (unidades arbitrárias) fads2 elovl5 0 10 20 30 40 50 60 70 OV-S OV-NS Expressão relativa dos genes (unidades arbitrárias) fads2 elovl5 55 A suplementação das dietas OV com 1 mg/kg de selénio não conduziu a diferenças significativas na expressão dos genes fads2 e elovl5 do cérebro. Porém, graficamente é notório que no grupo OV-S ocorreu uma dimuiçao do nível de expressão da fads2 e um aumento do nível de expressão da elovl5, de cerca de 1 vez e 2 vezes, respetivamente, em comparação com o grupo OV-NS (Gráfico 6). Gráfico 6: Efeito da suplementação das dietas de 12% de misturas de óleos vegetais [OV (colza, linhaça e soja)] com 1 mg/kg de selénio (S) na expressão dos genes fads2 e elovl5 do cérebro da corvina (Argyrosomus regius). As barras representam a média de 6 amostras por tratamento ± SD. 4.2. Quantificação das monoaminas A fim de concretizar o segundo objetivo do nosso trabalho, foi testado o efeito que cada uma de quatro dietas isoproteicas e isolipídicas (50% de proteína e 12% de lípidos), formuladas com 12% de óleo de peixe ou 12% de misturas de óleos vegetais (colza, linhaça e soja) e na presença (1mg/kg) ou ausência de selénio, exerce sobre a concentração de algumas monoaminas e os seus metabolitos a nível do sistema nervoso central. A análise de variância (ANOVA) a 2 fatores não detetou intereção entre os fatores fonte lipídica (L) e selénio (S), que se revelaram independentes entre si (Tabela 10). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 OV-S OV-NS Expressão relativa dos genes (unidades arbitrárias) fads2 elovl5 62 HUFA, pois adquirem-nos na dieta. Por conseguinte, o nível de expressão deste gene é mais elevado no cérebro, por forma a assegurar a quantidade de DHA necessária, independentemente das flutuações de EPA e de DHA na dieta. Por outro lado, os peixes de água doce não obtêm esses ácidos gordos na dieta e têm de metabolizá-los intensamente no fígado (Cho, Nakamura & Clarke, 1999; Sargent et al., 2002, citado por Zheng et al., 2009). No presente trabalho e numa situação de privação de HUFA na dieta, a corvina revelou uma alteração no padrão de distribuição da expressão da fads2, ocorrendo um aumento da sua expressão no fígado mas sem que quaisquer alterações acontecessem no cérebro. No que toca ao gene elovl5 do fígado, os nossos resultados indicam que este não sofreu alterações significativas na sua expressão quando comparamos os peixe submetidos às duas condições alimentares experimentais. Os nossos resultados não estão de acordo com os resultados obtidos para o salmão (Zheng et al., 2004b, 2005a, 2005b; Jordal et al., 2005; Miller et al., 2008; Morais et al., 2009) nem para outras espécies tipicamente de água doce como são o caso do Xiphophorus helleri (Ling et al., 2006) e do Danio renio (Jaya-Ram et al., 2008). Segundo Monroig et al. (2013) a atividade enzimática da Elovl5 é elevada e assemelha-se à de outras espécies de peixes (Agaba et al., 2004, 2005; Morais et al., 2009; Zheng et al., 2009). Pelo contrário, a taxa de conversão da Fads2 da corvina foi baixa quando comparada com a ∆6 Fads_c do Salmo salar (Monroig, Li & Tocher, 2011). Assim, a sua baixa atividade poderá ter contrastado com as elevadas atividades da Elovl5. Os produtos metabolizados pela Fads2 seriam rapidamente ulizados pela Elovl5, sem que, ocorresse estimulação génica, pois os substratos não teriam tempo para se acumularem. Além disso, mesmo em peixes como o salmão cuja atividade enzimática é elevada, a transcrição génica das dessaturases é cerca de 8 vezes mais elevada do que das elongases (Zheng et al., 2004b). Nos mamíferos, os mecanismos pelos quais os ácidos gordos modelam a expressão génica estão relacionados com a intervenção de “sensores” endógenos, nomeadamente os recetores nucleares, como é o caso da família dos PPAR (Jump, Tripathy & Depner, 2013). Mais especificamente, o PPARα faz parte de um mecanismo “feed-forward”, do qual resulta um incremento da oxidação de ácidos gordos que entram na célula (Georgiadi & Kersten, 2012). Como tal, o EPA, assim como o DHA, funcionam como os seus principais ligandos, indizindo um aumento significativo da transcrição dos genesalvo do PPARα, ao passo que o ácido oleico (18:1 n-9) produz um efeito menos significativo na indução da transcrição desses mesmos genes (Lemberger, Desvergne & Wahli, 1996; Jump, Tripathy & Depner, 2013). Nos peixes, estes mecanismos são menos conhecidos, mas tudo indica que os princípios são semelhantes aos descritos nos mamíferos. Com efeito, o estudo levado a cabo por Kennedy et al. (2006) constatou que, 63 no salmão, o incremento de óleo de peixe na dieta diminui a expressão do gene da ∆6 dessaturase hepática, bem como do gene do PPARα (Kennedy et al., 2006). No nosso trabalho as dietas com óleo de peixe, ricas em EPA e DHA, poderão ter funcionado como estimuladoras da expressão de genes ligados à oxidação lipídica. Por outro lado, existe uma família de fatores de transcrição à qual pertencem as SREBP e que possuem a capacidade de se ligarem ao elemento regulador de esterol e, a partir daí, regularem a transcrição de vários genes envolvidos na síntese de colesterol e ácidos gordos (Xu et al., 1999). Por sua vez o DHA, mas não outros PUFA, regula a abundância da nSREBP-1 (proteína de ligação ao elemento regulador de esterol nuclear) por meio de mecanismos de fosforilação/desfosforilação e por degradação proteossomal (Jump, Tripathy & Depner, 2013). Desta forma, o DHA consegue inibir a transcrição de genes lipogénicos (Xu et al., 1999; Clarke, 2001), já que poderá prejudicar a libertação proteolítica do SREBP-1 e/ou suprimir a expressão dos genes da SREBP-1 (Clarke, 2001). De facto, um ensaio com robalos, comprovou que as dietas com óleos vegetais levaram ao aumento dos níveis de mRNA do gene fads2, bem como da proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 1 (SREBP-1) (Geay et al., 2010). Assim, a deficiência em ácidos gordos essenciais induz a transcrição do gene Fads2 (Cho, Nakamura & Clarke, 1999), tal como se verificou neste trabalho. Neste trabalho também avaliámos a influência da suplementação de selénio nas dietas de óleo de peixe bem como nas dietas de misturas de óleos vegetais. Os nossos resultados indicam que a suplementação deste micronutriente na dieta tem efeitos diferentes, dependendo do tipo de óleo presenta na dieta. Assim, a suplementação de selénio na ração com óleo de peixe traduziu-se numa diminuição significativa da expressão do gene fads2, no fígado da corvina comparativamente com o tratamento de óleo de peixe sem suplementação com selénio. Porém, nas dietas com misturas de óleos vegetais foi notório o comportamento inverso, ou seja, o selénio parece ter favorecido, embora não significativamente, a expressão deste gene no fígado. O mecanismo pelo qual o selénio interfere na modulação génica não é totalmente conhecido (Okuno et al., 2012). A ingestão de selénio tem sido associada à alteração da expressão de genes relacionados com a progressão do ciclo celular e sinalização celular em células cancerígenas. Esta relação poderá dever-se à influência do selénio nos receptores de estrogénio. A suplementação deste micronutriente na dieta diminuiu a expressão do recetor de estrogénio α (REα), bem como a ligação do estradiol ao recetor de estrogénio nas células cancerígenas (Lee et al., 2005; Shah et al., 2005). Para além disso, o selénio também interfere directamente com os do REα (Shah et al., 2005). Recentemente, Okuno et al. (2012) formularam a hipótese de que o “methylseleninic acid” (MAS), um metabolito do selénio, poderá interferir com o sistema tioredoxina 64 (Trx)/tioredoxina redutase (TrxR). Este sistema é a chave da regulação do estado redox das células e a sua ativação promove a diminuição da concentração de ROS nas células. Por conseguinte, a diminuição de ROS modela a expressão do REα, culminando na diminuição da proteína REα das células. Desta forma os genes controlados pelo REα são inibidos (Okuno et al., 2012). À semelhança dos REα (Evans, 1998, citado por Okuno et al., 2012) as SRBEP-1 também são fatores de transcrição (Xu et al., 1999). Neste trabalho colocámos a hipótese do selénio poder interferir com as SREBP-1 da mesma forma que influencia os REα. Neste sentido é de supor que na presença de óleos de peixe o selénio modela negativamente as SREBP-1, ao contrário do que acontecerá na presença de óleos vegetais. Esta hipótese baseia-se no facto de os lípidos também modelarem de forma diferenciada a atividade da GPx4. Em células endoteliais de mamíferos, a atividade desta enzima está reduzida na presença do DHA, aumentada na presença do ARA e não é afetada pelo ácido-α-linoleico conjugado (Sneddon et al., 2003). Por outro lado, o número de ligações duplas potencia a peroxidação lipídica no fígado (Haggag, Elsanhoty & Ramadan, 2014). De facto, foi documentado que os ratos alimentados com dietas de óleo de peixe sofreram um aumento da peroxidação lipídica (D’Aquino et al., 1991). Finalmente, níveis aumentados de peroxidação lipídica são acompanhados pelo decréscimo da atividade das enzimas envolvidas no mecanismo de defesa antioxidativa (Haggag, Elsanhoty & Ramadan, 2014). Baseando-nos nestes resultados, a nossa hipótese é que nas dietas OP-S o selénio poderá ter protegido os ácidos gordos da peroxidação lipídica, e por isso o “turnover” fosfolipídico foi menos acentuado comparativamente às dietas OP-NS, onde a estimulação da biossíntese de HUFA teve de ser mais acentuada. O stress oxidativo induzido pelas espécies reactivas de oxigénio (ROS) tem sido associado com a expressão e níveis de proteína dos fatores de transcrição (Okuno et al., 2012), e no presente trabalho foi observada uma redução das ROS em peixes alimentados com dietas de óleos vegetais suplementadas com 1mg/kg de selénio (dados não mostrados). Por isso, é plausível inferir que esta dieta promoveu a estimulação da expressão e níveis proteicos da SREBP-1 pela redução das ROS. Por conseguinte, uma vez que a SREBP-1 regula os genes envolvidos na biossíntese de HUFA, nomeadamente a fads2 e a elovl5 (Jump, Tripathy & Depner, 2013), a suplementação de selénio modelou a expressão destes genes. O segundo objetivo do nosso trabalho foi analisar o efeito que a substituição de 12% de óleo de peixe por 12% de misturas de óleos vegetais (colza, linhaça e soja), cada uma suplementada ou não com selénio, tem sobre a concentração de alguns 65 neurotransmissores no cérebro da corvina, tais como DA, 5-HT, NA e A e alguns dos metabolitos destes, como sejam DOPAC, HVA e 5-HIAA. Este estudo é de extrema relevância na medida em que o sistema monoaminérgico é influenciado pela composição dos ácidos gordos da dieta. Com efeito, diversos trabalhos constataram um resultado negativo da administração de dietas pobres em ácidos gordos essenciais sobre o sistema monoaminérgico de mamíferos (Chalon et al., 1998, 2001; Zimmer et al., 1999, 2000a; Varghese et al., 2001; Kodas et al., 2002a, 2002b, 2004; Lesa et al., 2003; Bois et al., 2006; Marza et al., 2008; Vancassel et al., 2008). Pouco se sabe sobre os efeitos que aquelas substituições terão sobre os sistema neuronal dos peixes, mas verificou-se que a suplementação das dietas com selénio poderá ter um importante contributo na proteção dos ácidos gordos das membranas neuronais, contribuindo para a homeostasia do sistema monoaminérgico (Ferreira, Filitão & Freitas, 2009; El-Saeed et al., 2013). Posto isto, e segundo os nossos resultados, a 5-HT foi o único neurotransmissor que foi influenciado significativamente pela substituição de OP-S por OV-S, tendo a sua concentração aumentado nas dietas de OV-S. Também foi possível observar uma tendência para o aumento da concentração da DA e NA quando ocorre substituição de OP-NS por OV-NS, muito embora, neste caso, as diferenças não tenham sido significativas. Estes resultados corroboram outros trabalhos que também constataram um aumento da concentração de DA e 5-HT no espaço extracelular, quando os animais foram alimentados com uma dieta deficiente em PUFA n-3 (Zimmer et al., 2000a; Kodas et al., 2004). Esta evidência tem sido associada com a diminuição do armazenamento das monoaminas nas vesículas pré-sináticas culminando em níveis de libertação basais de DA (Zimmer et al., 2000a) e 5-HT (Kodas et al., 2004) maiores. Com efeito, a deficiência em ácidos gordos essenciais reflete-se na diminuição do nível de DHA e no aumento dos níveis de PUFA n-6 (tal como o ácido docosapentaenóico [22:5n-6]) nas membranas do tecido neuronal (Delion et al., 1997; Chalon et al., 1998; Kodas et al., 2002a, 2002b; Chalon, 2006). Esta alteração composicional das membranas neuronais tem como consequência a diminuição da reciclagem e síntese de vesículas sináticas (Lesa et al., 2003; Chalon, 2006; Marza et al., 2008). Aliás, alguns estudos referem que, nos mamíferos, as dietas pobres em PUFA n-3 conduzem à dimininuição da densidade de vesículas pré-sináticas no hipocampo (Yoshida et al., 1997) e córtex frontal (Zimmer et al., 1998, 1999, 2000b), bem como à diminuição da densidade de VMAT2, o qual é importante no transporte de monoaminas para o interior das vesículas pré-sináticas (Zimmer et al., 1999; Kodas et al., 2002b). Também foi observada uma diminuição do compartimento vesicular e do número das vesículas dopaminérgicas no córtex cerebral desses animais (Zimmer et al., 1999, 2000b), indicando uma diminuição da libertação de 66 monoaminas a partir das mesmas (Zimmer et al., 1998), uma vez que, a concentração de monoaminas é constante no interior das vesículas de armazenamento (Colliver et al., 2000). Em suma, o aumento dos níveis basais de neurotransmissores será o resultado da diminuição da libertação dos neurotransmissores a partir das vesículas sináticas, que acabam por se acumular no espaço extracelular (Zimmer et al., 2000a). O facto de termos obtido diferenças significativas apenas num dos neurotransmissores estudados (5-HT), em contraste com trabalhos anteriores (Delion et al., 1997; Chalon et al, 1998; Zimmer et al., 2000a; Varghese et al., 2001; Chalon, 2006), poderá justificar-se com dois fatores. O primeiro diz respeito à metodologia pois neste trabalho a quantificação da concentração das monoaminas foi feita com o cérebro inteiro. Ora todos os trabalhos realizados em ratos iniciaram a sua abordagem com a separação do cérebro nas suas respectivas regiões, que também foram analisadas separadamente (Delion et al., 1997; Yoshida et al., 1997; Chalon et al, 1998; Kodas et al, 2002a, 2002b, 2004; Zimmer et al., 1998, 1999, 2000a, 2000b; Varghese et al., 2001; Takeuchi, Fukumoto & Harada, 2002; Chalon, 2006; Vancassel et al., 2008). É portanto provável que os nossos resultados tenham sido afetados pela diluição ao homogenizar o cérebro inteiro, pois a capacidade de recaptação das monoaminas é variável nas diferentes regiões cerebrais o que resultará em concentrações extracelulares de monoaminas regionalmente diferentes (Schmitz et al., 2003). O segundo fator relaciona-se com a duração do ensaio, que poderá ter sido reduzida para que fossem detectadas diferenças significativas, uma vez que nos trabalhos com ratos, citados anteriormente, os ensaios decorrem normalmente ao longo de 2 gerações (Delion et al., 1997; Chalon et al, 1998; Kodas et al, 2002a, 2002b, 2004; Zimmer et al., 1998, 1999, 2000a, 2000b; Takeuchi, Fukumoto & Harada, 2002; Chalon, 2006). Relativamente à concentração dos metabolitos analisados, os nossos resultados não indicaram diferenças significativas quando comparamos os tratamentos OP-S e OV-S nem quando comparamos os tratamentos OP-NS e OV-NS. Por outro lado, alguns trabalhos associaram a diminuição do pool vesicular com o aumento dos níveis dos seus metabolitos (Zimmer et al., 1998, 2000a). O aumento dos níveis de metabolitos, nomeadamente do DOPAC e HVA são fruto da acção da MAO sobre a DA, que se encontra na fenda sinática ou que não foi incluída nas vesículas pré-sináticas (Zimmer et al., 1999; Zimmer et al., 2000a). O facto de nós não termos encontrado diferenças nas concentrações de metabolitos poderá indicar-nos que a atividade da MAO não foi alterada com a substituição dos OP por OV. No que toca à suplementação das dietas com selénio, importa referir que também não encontramos diferenças significativas entre os tratamentos. Porém, quando comparamos os resultados dos tratamentos OP-S e OP-NS podemos observar uma tendência para o 67 aumento da concentração da DA, ao mesmo tempo que há uma ligeira diminuição da concentração dos metabolitos DOPAC e HVA. Os nossos resultados estão de acordo com as observações de Ferreira, Militão & Freitas (2009), cuja administração do ácido-α- lipóico, um forte antioxidante, culminou na diminuição da peroxidação lipídica e no consequente aumento da concentração de NA e DA no hipocampo do cérebro de ratos sem que a concentração de metabolitos tenha sido alterada. A explicação exacta para o facto da concentração de NA ter aumentado no presente trabalho não é óbvia, e este é claramente um dos aspectos que carece de mais investigação, mas uma das hipóteses poderá ser que, embora a sua libertação tenha aumentado, ela foi menos metabolizada ou menos recaptada. O efeito da suplementação de selénio na concentração de monoaminas e metabolitos não foi tão evidente nas dietas de OV. Na verdade, os OV apresentam um menor grau de insaturação quando comparados com os OP, e por isso são menos susceptibilidade à peroxidação lipídica (Haggag, Elsanhoty & Ramadan, 2014). Parece que nos óleos vegetais o efeito da peroxidação lipídica pode não ter sido tão evidente, não se tendo repercutido o efeito positivo do selénio sobre o sistema monoaminérgico. Os nossos resultados também apontam para que as vias de metabolização das monoaminas na corvina sejam distintas das descritas nos mamíferos e das descritas para algumas outras espécies de peixes. Isto porque constatámos que o principal metabolito da serotonina nos mamíferos, o 5-HIAA, não foi detetado pela técnica de HPLC utilizada, o que poderá indicar que, na corvina, a via de metabolização da 5-HT origina metabolitos diferentes do 5-HIAA. Verificámos também que, em todos os tratamentos, a concentração de A foi muito próxima de 1 ng/g de peso do cérebro fresco (ou seja, próximo do limite de detecção do equipamento), o que se revelou muito inferior às concentrações das restantes monoaminas. Provavelmente esta monoamina nos peixes poderá ser menos relevante do que os demais neurotransmissores analisados, ou então, intervirá noutras vias de metabolização sendo rapidamente metabolizada. Em resumo, os nossos resultados confirmam as nossas hipóteses de trabalho, na medida em que verificamos que nesta espécie a substituição total de óleo de peixe por misturas de óleos vegetais modela positivamente a expressão dos genes fads2 e elovl5 hepáticos e tende a aumentar a concentração das monoaminas no cérebro das corvinas. Além disso, a suplementação das dietas com selénio poderá ter um importante contributo na potenciação da expressão destes mesmos genes e na concentração de monoaminas cerebrais, principalmente quando as dietas são à base de óleo de peixe. 68 6. CONCLUSÕES Os resultados deste trabalho indicam que a substituição total de óleo de peixe por misturas de óleos vegetais na dieta poderá modelar positivamente a expressão da fads2 e da elovl5 hepática da corvina. No cérebro a expressão génica não foi influenciada significativamente, mas a concentração de monoaminas foi alterada. Esta constatação poderá indicar-nos que o turnover dos fosfolípidos foi prejudicado nas membranas neuronais diminuindo a libertação de monoaminas, principalmente da 5-HT. Como consequência fica aumentada a probabilidade de ocorrência de alterações neurológicas que poderão resultar, por exemplo, em alterações acentuadas do comportamento da espécie. Relativamente à suplementação das dietas com selénio constatamos que essa pode ser importante no controlo da peroxidação lipídica, contribuindo para o turnover dos fosfolípidos da membrana. 69 7. TRABALHOS FUTUROS Estudos recentes têm confirmado a existência de uma multiplicidade de vias possíveis para a biossíntese de HUFA em peixes, revelando uma diversificação muito mais significativa do que a observada em mamíferos. Alguns autores acreditam que os peixes poderão possuir vias que até ao momento ainda não foram descritas. Neste sentido, seria importante estudarmos as vias adotadas pela corvina no processo de biossíntese de HUFA, através do isolamento de todos os genes e caraterização funcional das enzimas envolvidas neste processo. Por outro lado, ainda existe ainda um grande desconhecimento sobre os mecanismos envolvidos na regulação dos genes do metabolismo lipídico em peixes. O aprofundamento do conhecimento destes mecanismos seria muito importante. O conhecimento sobre o impacto que a dieta tem sobre o sistema monoaminérgico dos peixes é quase nulo. Por isso, seria de grande interesse o estudo da forma como a dieta modela a densidade das vesículas de armazenamento das monoaminas, a composição das membranas neuronais e a atividade da MAO, já que isso seria um significativo complemento a este trabalho. Por fim, a conjugação destes trabalhos com a análise comportamental das espécies e a associação ao seu estado de bem-estar seriam também de extrema relevância. 70 8. BIBLIOGRAFIA Agaba, M., Tocher, D. 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Silva-Brito F, Fonseca SB; Pousão-Ferreira P; Ozório ROA; Gonçalves JFM; Damasceno- Oliveira A. 2014. Effect of diet on concentration of monoamines in brain of meagre (Argyrosomus regius, Asso, 1801). Nutritional Neuroscience (To submit). Magnoni, LJ, Silva-Brito F, Fonseca S, Peixoto MD, Domingues AF, Damasceno-Oliveira A, Gonçalves J, Castro FC, Cunha I and Ozorio ROA (2014). Effect of replacement of fish oil by vegetable oil in diets on expression of fatty acyl desaturase and elongase genes in liver and brain of meagre (Argyrosomus regius). (To submit). 86 Anexo 2 – Abstract publicado no “International Meeting on Marine Research 2014” Metabolic regulation in meagre, Argyrosomus regius (Asso, 1801): Study of gene-diet interactions on lipid metabolism Francisca Silva-Brito1, Sthelio Fonseca2, Maria João D. Peixoto2, Andreia F. Domingues2, Alfredo Damasceno-Oliveira2, José Gonçalves1, Filipe F. C. Castro2, 3, Isabel Cunha2 and Rodrigo O. A. Ozorio1, 2*  1 ICBAS - Abel Salazar Institute for Biomedical Sciences – University of Porto, Portugal  2 CIIMAR - Interdisciplinary Centre of Marine and Environmental Research, Portugal  3 FCUP - Faculty of Sciences - University of Porto, Portugal Fish oil is the most important source of n-3 highly unsaturated fatty acids (HUFAs) for humans. With the stagnation of world marine fisheries, the role of aquaculture stocks increased rapidly as source of n-3 HUFA (FAO, 2012), but not sufficiently. To reduce the dependence as well as find ways to use of marine sources more economically and efficiently, the use of vegetable oils (VO) have been widely investigated (Estévez et al., 2011). Vegetable oils are rich in C18 PUFA, but devoided of the docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA), essential fatty acids involved in maintaining cell membrane structure, among other essential functions. The capacity of fish to thrive on diets containing only the C18 PUFA, 18 : 2n − 6 and 18 : 3n – 3 varies among species (Tocher, 2003; Leaver et al., 2008; Castro et al., 2012). It is well documented that teleosts have different enzyme capacity to desaturate-elongate 18C fatty acids into 20-22C LC- PUFAs (Cook & McMaster, 2004; Leaver et al., 2008). Generally, freshwater fish species can convert 18:2 n−6 and 18:3 n−3 to HUFA more efficiently than marine species, especially carnivorous which prey on organisms rich in HUFA (Tocher, 2003). Thus, the modulation of expression and translation of elongases and desaturases is of great importance to achieve independence of (carnivorous) marine fish aquaculture from fishmeal and fish oil. There is currently considerable interest in the HUFA biosynthetic pathway in fish aiming to determine the effectiveness of vegetable oils as a total replacement of fish oil in the aquaculture of carnivore fish species (Vagner & Santigosa, 2011). Selenium is a structural component for several enzymes, including glutathione peroxidase and thioredoxine (Perottoni et al., 2004). These enzymes have physiological antioxidant properties and thus, protect the tissues of lipid peroxidation products (Orun et al., 2008). The current study aimed to evaluate the effects of dietary lipid profile on fads2 (fatty acyl desaturase gene) and elovl5 (fatty acyl elongase gene) expression in liver and 87 brain of meagre (Argyrosomus regius). The four isoproteic and isolipidic diets (50% protein and 12% lipid, dry matter basis) were formulated with fish oil (FO) or a blend of vegetable oils (VO, rapeseed, linseed and soybean), each with selenium (S, 1mg/kg diet) or without selenium (NS). Fish were fed ad libitum for 60 days under a controlled rearing conditions (temperature = 20,7 ± 0,7 ºC; pH = 8; O2 = > 6 ppm). Ribonucleic acid (RNA) was extracted from two tissues: liver and brain using RNAspin Mini RNAIsolation Kit (GE Healthcare), with includes a step with DNase I to remove the presence of DNA. The integrity of the extracted RNA was verified by agarose electrophoresis. The RNA concentrations were obtained by nanodrop. From the total RNA, 0.5µg were transcribed to complementary DNA (cDNA) using iScript Reverse Transcription Supermix for RT-PCR (BioRad) following the manufacturer protocol. Gene expression from fads2 and elovl5 were quantified by analysis of RT-PCR. The β-actine was used as a reference gene. On VO diet hepatic fads2 expression was significantly higher, but not elovl5 expression. In brain of VO fed fish, fads2 and elovl5 expression was not significantly different when compared with FO fed fish (Table 1). With selenium supplementation hepatic fads2 expression was lower in FO (P< 0.01) but, in VD, selenium had an opposite effect on hepatic fads2 expression (P> 0.05). The same trend was evident for hepatic elovl5 expression (P> 0.05) (Table1). Recently, Monroig et al. (2013) described the first functional characterization of meagre Fads2 and Elovl5. This work concluded that, unlike most teleosts, the Fads2 pocesses ∆6 and ∆8 activity. However, conversion rates of meagre Fads2 were low when compared to Salmo salar ∆6 Fads_c (Monroig et al., 2011). On the other hand, meagre Elovl5 showed high activity towards C18 and C20. Thus, ∆6/∆8 activity might be ineffective in converting C18 PUFA and therefore an increase of dietary C18 PUFA may stimulates the expression of the fads2. In contrast, Elovl5 is very efficient to convert the desaturated products of ∆6/∆8 and so Elovl5 expression is not enhanced, since the activity of this enzyme is already higher. These findings may explain the differences in the expression of two genes, between hepatic fads2 and elovl5. Furthermore, increased hepatic fads2 expression between FO-S and VO-S treatments was 114 fold. Such induction was much greater than observed in Salmo salad (Zheng et al., 2005). However, Salmo salad has separate and distinct genes for ∆6 and ∆5 desaturases (Zheng et al., 2005) and, due to genome duplication, it has two genes with ∆6 activity (Monroig et al., 2010). Moreover, lipid peroxidation in liver increases with the number of fatty acid (FA) double bonds (Haggag, Elsanhoty & Ramadan, 2014). D'Aquino et al. (1991) observed that rats fed diets with fish oil had increased lipid peroxidation. Our results indicate that, in FO-S, selenium may have protected FA from peroxidation, thus dietary HUFA seemed to have been sufficient to maintain the phospholipid turnover and induction of FA metabolism genes did not occur. In FO-NS diet membranes were not