Efeito de Nanopartículas de Prata em Neutrófilos Humanos

Efeito de nanopartículas de prata em neutrófilos humanos Tânia Sofia Couto Soares Trabalho realizado sob a orientação da Doutora Marisa Andreia Carvalho de Freitas e co-orientação da Professora Doutora Eduarda das Graças Rodrigues Fernandes setembro 2014 ii Autoria: Tânia Sofia Couto Soares Curso: Mestrado em Controlo de Qualidade Título da Tese: Efeito de nanopartículas de prata em neutrófilos humanos Orientação: Doutora Marisa Freitas Co-orientação: Professora Doutora Eduarda Fernandes Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto Departamento de Ciências Químicas Laboratório de Química Aplicada iii Dissertação do 2º ciclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre em Controlo de Qualidade. iv Declaração de Reprodução É autorizada a reprodução integral desta dissertação apenas para efeitos de investigação mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete. Declaração de Integridade Eu, Tânia Sofia Couto Soares, abaixo assinado, nº 200901630, estudante do Mestrado em Controlo de Qualidade da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, declaro ter atuado com absoluta integridade na elaboração desta dissertação. Nesse sentido, confirmo que NÃO incorri em plágio (ato pelo qual um indivíduo, mesmo por omissão, assume a autoria de um determinado trabalho intelectual ou partes dele). Mais declaro que todas as frases que retirei de trabalhos anteriores pertencentes a outros autores foram referenciadas ou redigidas com novas palavras, tendo neste caso colocado a citação da fonte bibliográfica. Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto,____de______________de _____ Assinatura: ____________________________________ v Agradecimentos Este mestrado lembrou-me de como é maravilhoso fazer algo com real gosto, e no final desta etapa, gostaria de deixar o meu sincero agradecimento às pessoas que contribuíram para a sua concretização. À Doutora Marisa Freitas, minha orientadora, por ter sido a luz que me guiou e orientou neste projeto. O seu trabalho foi extraordinário pela ajuda, incentivo, rigor, paciência e amizade. Faltam-me as palavras para descrever o modo como contribuiu para que esta dissertação fosse uma realidade. À Professora Doutora Eduarda Fernandes, minha co-orientadora, por me ter recebido com simpatia no seu laboratório e proporcionado as condições para a elaboração deste projeto. O seu interesse e exigência, associada ao conhecimento que transmite, dá o exemplo de uma liderança de excelência com a qual consegue cativar a admiração e respeito. Ao Professor Doutor Félix Carvalho, diretor do Mestrado de Controlo de Qualidade que sempre se mostrou disponível para esclarecer as nossas dúvidas e proporcionar o diálogo para que os nossos projetos fossem de encontro aos nossos gostos. À Daniela e Diana, que foram ajudas preciosas no laboratório com os seus conselhos e elucidações. Ensinaram-me a respeitar os desígnios da natureza do laboratório: “Se correr mal, melhores dias virão”. Assim, como agradeço a todo o grupo em geral pelas dicas e principalmente ao bom ambiente que proporcionaram. Ao David, que acredita mais em mim do que eu própria. Agradeço por estar sempre do meu lado com o amor, a paciência e a compreensão a que me habituou. À Irene por ser a tia, amiga e irmã que sempre me apoiou em todas as decisões da minha vida. À Sara à Eliana e à Laura por me honrarem com uma amizade tão verdadeira e tão essencial nesta fase. Aos meus pais e avós que muito contribuíram para o meu percurso. Agradeço o amor, o apoio e a confiança que sempre depositaram em mim. À Carolina e à Sofia por me encherem a vida de gargalhadas, brincadeiras, traquinices e muitos beijinhos. Por último, a todos os dadores da unidade de hematologia do Hospital de Santo António que contribuíram com a sua dádiva de sangue para que fosse possível a elaboração deste trabalho. vi Resumo As nanopartículas de prata (AgNPs) têm emergido como uma importante classe de nanomateriais com uma ampla gama de aplicações industriais e médicas. Têm aplicações, ou possíveis aplicações, como agentes antibacterianos, antifúngicos, antivirais, anti-inflamatórios, antitumorais, regeneradores, biossensores e catalisadores. Apesar da frequente utilização das AgNPs no nosso quotidiano, os seus efeitos tóxicos não se encontram ainda totalmente esclarecidos e pouco se sabe da sua interação com os neutrófilos humanos. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes do organismo e representam a primeira linha de defesa do nosso organismo contra uma grande diversidade de ameaças. A atividade excessiva destas células pode causar danos nos tecidos e células adjacentes. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de dois tamanhos diferentes de AgNPs (10 e 50 nm) em neutrófilos humanos. Para o efeito recorreu-se a três métodos diferentes, o método de exclusão do azul tripano, o do iodeto de propídio (PI) e o do vermelho neutro (NR). Verificou-se que a viabilidade dos neutrófilos foi alterada com a exposição às AgNPs, tendo as AgNPs de 10 nm um efeito muito mais deletério. Estes dados foram observados com todos os métodos. Contudo, o método que permitiu ver diferenças significativas relativamente ao controlo (sem AgNPs) com tempos de exposição mais curtos foi o NR. Com este método verificou-se que com apenas 4h de exposição, 25 μg/mL de AgNPs (10 nm) foram suficientes para diminuir a viabilidade cerca de 22%. No segundo trabalho experimental, analisou-se a morfologia das células após exposição às AgNPs, por duas técnicas de microscopia, a microscopia ótica composta (MOC) e a microscopia eletrónica de transmissão (TEM). Verificaram-se alterações morfológicas com ambas as técnicas, estando mais uma vez implícito o maior efeito das AgNPs de 10 nm, não se verificando inclusivamente o efeito com as AgNPs de 50 nm recorrendo a TEM. De notar que com TEM foi possível confirmar que as AgNPs de 10 nm têm a capacidade de entrar na célula, podendo assim, justificar a sua maior toxicidade quando comparadas com as AgNPs de 50 nm. Está descrita na literatura a capacidade destas nanopartículas induzirem a produção de espécies reativas, sendo esta uma das vias pela qual as AgNPs induzem toxicidade. Como tal, o objetivo do terceiro e último trabalho experimental consistiu na avaliação do efeito das AgNPs na vii produção de espécies reativas pelos neutrófilos humanos. Concluiu-se que as AgNPs de 10 nm induziram a produção de espécies reativas ao fim de 4h desta exposição. Este trabalho permitiu concluir, que nas condições experimentais testadas, as AgNPs induzem citotoxicidade em neutrófilos humanos, sendo que, as de menor diâmetro (10 nm) revelaram ser mais citotóxicas. Palavras-chave: nanopartículas de prata; neutrófilos humanos; citotoxicidade, espécies reativas viii Abstract Silver nanoparticles (AgNPs) have emerged as an important class of nanomaterials with a wide range of industrial and medical applications. They have applications, or potential applications, as antibacterial, antifungal, antiviral and anti-inflammatory agents, antitumor, regenerators, catalysts and biosensors. Despite the routinely use of AgNPs in our daily lives, its toxic effects are not yet fully understood and little is known of their interaction with human neutrophils. Neutrophils are the most abundant leukocyte in the body and represent the first line of defense of our organism against a wide variety of threats. Excessive activity of these cells can cause tissue damage and adjacent cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate the toxicity of two different sizes of AgNPs (10 and 50 nm) in human neutrophils. For the effect three different methods were used, the method of exclusion of trypan blue, propidium iodide (PI) and neutral red (NR). It was found that the viability of the neutrophils was altered by exposure to AgNPs, and the 10 nm AgNPs has a much more deleterious effect. These data were observed with all methods. However, the method that allowed the detection of significant differences, compared to control (without AgNPs), with shorter exposure times was NR. This method showed that with only 4 hours of exposure, 25 μg/mL AgNPs (10 nm) were enough to reduce the viability of about 22%. In the second study, it was analyzed the morphology of the cells after exposure to AgNPs of two different sizes, by two microscopy techniques, light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). Morphological changes with both techniques were observed, with the greatest effect observed with the 10 nm AgNPs. Using TEM it was possible to confirm that the 10 nm AgNPs has the ability to enter into the cell, which may explain its greater toxicity when compared with 50 nm AgNPs. It was already described in literature the ability of these nanoparticles to induce the production of reactive species, being this effect reported as one possible mechanism of toxicity induced by AgNPs. As such, in the third study it was evaluated the effect of AgNPs in the production of reactive species by human neutrophils. It was concluded that the 10 nm AgNPs induced the production of reactive species after 4 hours exposure. ix This study revealed that, in the present experimental conditions, AgNPs are cytotoxic to human neutrophils, being the nanoparticles of 10 nm most actives than the 50 nm. Keywords: silver nanoparticles; human neutrophils; cytotoxicity; reactive species xvi MES- Sulfonato de sódio-2-mercaptoetano MIN. - Minutos MOC- Microscopia ótica composta MPO- Mieloperoxidase NADPH- Nicotinamida adenina dinucleótido difosfato (do inglês Nicotinamide Adenine Dinucleotide PHosphate-oxidase) NETs- Armadilhas extracelulares de neutrófilos (do inglês Neutrophil Extracellular Traps) NO- Óxido nítrico NO2 - Dióxido de azoto N2O3 - Óxido nitroso NOS- Óxido nítrico sintetase (do inglês Nitric Oxide Synthase) NPs- Nanopartículas NR- Vermelho neutro (do inglês Neutral Red) 1O2 - Oxigénio singuleto O2- Anião radical superóxido ONOO- - Anião peroxinitrito OsO4- Ósmio PBS- Tampão fosfato salino (do inglês Phosphate Buffered Saline) PDGF- Fator de crescimento derivado das plaquetas (do inglês platelet-derived growth factor) PEG- Polietilenoglicol PEI- Polietilenoimina PI- Iodeto de propídio (do inglês Propidium Iodide) PS- Fosfatildilserina (do inglês PhosphatidylSerine) PVP- Polivinilpirrolidona R 123- Rodamina 123 RNA- Ácido ribonucleico (do inglês Ribonucleic Acid) RNS- Espécies reactivas de azoto (do inglês Reactive Nitrogen Species) ROO- Radicais peroxinitrilo ROS- Espécies reactivas de oxigénio (do inglês Reactive Oxygen Species) SEM- Erro padrão da média (do inglês Standard Error of the Mean) SDS- Dodecil sulfato de sódio (do inglês Sodium Dodecyl Sulfate) SOD- Superóxido dismutase TEM- Microscopia electrónica de transmissão (do inglês Transmission Electron Microscopy) xvii TGF-β1- Fator β1 de transformação do crescimento (do inglês Transforming Growth Factor β1) TGF-β- Fator β de transformação do crescimento (do inglês Transforming Growth Factor β) TNF-α- Fator de necrose tumoral (do inglês Tumour Necrosis Factor) TSLP- Linfopoetina estromal tímica (do inglês Thymic Stromal Lymphopoietin) VEGF- Fator de crescimento endotelial vascular (do inglês Vascular Endothelial Growth Factor) 1.Introdução geral 1.1 Considerações gerais Esta dissertação foi realizada no âmbito do Curso de Mestrado em Controlo de Qualidade da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. O tema foi escolhido com base nas inúmeras aplicações e crescente utilização de nanopartículas no nosso quotidiano. As mais comummente utilizadas são as nanopartículas de prata (AgNPs), sendo que o seu impacto na saúde humana ainda não está totalmente estudado, havendo ainda muitas questões por esclarecer. Uma delas diz respeito ao efeito destas NPs em neutrófilos humanos, as principais células de defesa do organismo. Assim sendo, a parte experimental desta dissertação envolve a avaliação da toxicidade de AgNPs de dois tamanhos diferentes (10 e 50 nm) em neutrófilos humanos. 1.2 Objetivos do trabalho e estrutura da dissertação O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de AgNPs, de dois tamanhos diferentes (10 e 50 nm), em neutrófilos humanos. Para atingir este objetivo dividiu-se o trabalho experimental em várias fases complementares. Na primeira fase avaliou-se, através de diferentes métodos, a viabilidade de neutrófilos humanos expostos às AgNPs. Na segunda fase analisou-se a morfologia das células por duas técnicas de microscopia. A última fase deste trabalho diz respeito à avaliação do efeito das AgNPs no burst oxidativo de neutrófilos humanos. Esta dissertação encontra-se dividida em 5 capítulos e apresenta a seguinte estrutura: no primeiro capítulo apresenta-se uma caracterização de todos os componentes do sangue, focando nas células alvo deste estudo, os neutrófilos, bem como uma revisão da literatura onde se faz uma abordagem às principais características das AgNPs. No segundo capítulo são indicados materiais e métodos utilizados na fase experimental do trabalho. Este capítulo inclui o fundamento teórico das técnicas utilizadas e os procedimentos experimentais efetuados. Os Resultados obtidos são apresentados num terceiro capítulo, a que se segue a Discussão no quarto capítulo. Por último, são apresentadas as Referências Bibliográficas que sustentaram o desenvolvimento do presente trabalho. 2 Elementos figurados do sangue Eritrócitos Leucócitos Plaquetas Granulócitos Agranulócitos Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Linfócitos Monócitos 2.Introdução 2.1 Sangue O sangue é um tipo de tecido conjuntivo, constituído por células e fragmentos de células (elementos figurados) rodeados por uma matriz líquida (plasma), que circula pelo organismo. Os elementos figurados constituem cerca de 45% e o plasma 55% do volume total do sangue que, num adulto é em média cerca de 4 a 5 L nas mulheres e de 5 a 6 L nos homens. O sangue tem como principais funções o transporte, manutenção e proteção do organismo (1). Os elementos figurados dividem-se em eritrócitos, plaquetas e leucócitos, que serão discutidos nos pontos seguintes (Figura 1). Figura 1: Constituintes dos elementos figurados do sangue 2.1.1 Eritrócitos Os eritrócitos, também conhecidos por glóbulos vermelhos ou hemácias, são as células maioritárias do sangue com cerca de 5 milhões por milímetro cúbico de sangue (700 vezes mais numerosas que que os leucócitos e 17 vezes mais que as plaquetas) (1). Estas células têm a forma de discos bicôncavos (Figura 2) com um diâmetro 3 médio de cerca de 7 μm e as extremidades mais espessas do que o centro da célula (1-3). Durante o processo de formação ocorrem processos de mitose, síntese de ácido desoxirribonucleico (DNA) e hemoglobina, incorporação do ferro, perda de núcleo e organelos (3, 4). Sendo estas células anucleadas, têm maior capacidade de armazenamento, e também de deformabilidade, permitindo-lhes a passagem pelos capilares menores e assim, fornecer oxigénio a todos os tecidos (3). Os eritrócitos desempenham funções de transporte de gases respiratórios, nomeadamente de oxigénio dos pulmões para os vários tecidos do corpo e de dióxido de carbono (CO2) dos tecidos para o exterior. O transporte de oxigénio realiza-se através da ligação reversível à proteína hemoglobina que se encontra no interior destas células e é responsável pela cor vermelha do sangue (1, 2). Por outro lado, a presença de anidrase carbónica torna possível o transporte de grandes quantidades de CO2. Esta enzima possui a importante função de catalisar a reação entre o CO2 e a água, dando origem a ácido carbónico, que por sua vez, se dissocia formando iões bicarbonato e hidrogénio. É sob a forma de bicarbonato que grande parte do CO2 é transportado para os pulmões onde é expelido. A produção de iões bicarbonato é também importante para a regulação do pH do sangue (1, 2). Estas células permanecem em circulação relativamente pouco tempo, cerca de 120 dias numa célula saudável (1, 2, 4). Figura 2: Eritrócitos. Os corpos roxos são plaquetas (ampliação 400x) [adaptado de(3)]. 4 2.1.2 Plaquetas As plaquetas, também designadas por trombócitos, são pequenos fragmentos de células (2 a 4 µm), com forma biconvexa, sem cor, sem núcleo, com um citoplasma composto por mitocôndrias, retículo endoplasmático liso e vários grânulos que contêm citocinas e proteínas de coagulação. Têm um tempo de vida de 8 a 10 dias, após o qual, são eliminadas pelo baço (5). A sua principal função é a formação de coágulos, participando portanto no processo de coagulação sanguínea. Em caso de lesão vascular, as plaquetas aderem às superfícies vasculares alteradas ou matrizes subendoteliais expostas em microssegundos. Após adesão, as plaquetas são ativadas, alteram a sua forma, libertam o conteúdo dos seus grânulos e agregam-se umas às outras formando o tampão hemostático primário. Este proporciona uma superfície catalítica que promove a coagulação do sangue (6). O número ou atividade excessiva das plaquetas pode causar oclusão dos vasos originando ataques cardíacos ou acidentes vasculares cerebrais (7). 2.1.3 Leucócitos Os leucócitos ou glóbulos brancos são outro tipo de células do sangue. Os leucócitos podem ser agrupados consoante a sua morfologia em granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e agranulócitos (linfócitos e monócitos). O que os distingue é a presença ou ausência de grânulos no citoplasma. Os nomes dos diferentes tipos de células dos granulócitos resultam das propriedades de coloração dos seus grânulos. Os grânulos dos basófilos coram de azul-escuro com corantes básicos, os grânulos dos eosinófilos coram de rosa escuro com o corante ácido eosina e os grânulos dos neutrófilos como não coram com os corantes padrão de sangue são considerados “neutros” (Figura 3) (2, 4). Cada tipo de leucócitos será abordado de seguida, com uma descrição mais detalhada dos neutrófilos por serem as células alvo deste estudo. 5 Figura 3: Granulócitos: (A) - Basófilo, (B) - Eosinófilo, (C) – Neutrófilo; Agranulócitos: (D) - Monócito, (E) - Linfócito [adaptado de (8)]. 2.1.3.1 Linfócitos Os linfócitos são células mononucleares com 6 a 14 μm de diâmetro (3). O citoplasma do linfócito consiste exclusivamente num fino anel quase impercetível ao redor do núcleo (Figura 4) (1). Aproximadamente 75% dos linfócitos do sangue periférico são células T. Entre 10 e 15% dos linfócitos são células B e as restantes 10- 15% são linfócitos granulares grandes (LGL) (3). Figura 4: Linfócito [adaptado de(3)]. Embora tenham origem na medula óssea, os linfócitos migram através do sangue até aos tecidos linfáticos nomeadamente gânglios linfáticos, baço, amígdalas e timo, onde proliferam e produzem mais linfócitos (1). As células B podem ser estimuladas por bactérias ou toxinas para se dividirem, formando células que produzem anticorpos, os quais são glicoproteínas destinadas a ligarem-se aos antigénios específicos levando à sua destruição. As células T protegem contra vírus atacando e destruindo células onde estes se produzem. Além disso, as células T estão envolvidas na destruição de células tumorais e na rejeição de enxertos (1, 2). 6 Os LGL são maiores do que a média dos linfócitos e incluem as células natural killer (3), que fazem parte da imunidade inata que lisam células tumorais e células infetadas por vírus (1). A contagem elevada de linfócitos no sangue periférico (linfocitose) está muitas vezes associada a infeções virais, mas também pode ser observada em algumas infeções bacterianas e doenças malignas hematológicas (3). 2.1.3.2 Monócitos Os monócitos são tipicamente as maiores células leucocitárias com 12 a 20 μm de diâmetro (1). Os monócitos têm um núcleo irregular, ou em forma de C, com um citoplasma azul-acinzentado e um pequeno número de grânulos azurófilos (Figura 5), cujo conteúdo desempenha um papel importante na degradação das partículas ingeridas (3). Os monócitos não são células efetoras, normalmente permanecem em circulação durante 2 a 3 dias e depois abandonam-na, transformando-se em macrófagos e migrando para os vários tecidos (1). Os monócitos complementam a função de defesa contra agentes invasores dos neutrófilos (3). Figura 5: Monócito [adaptado de (3)]. 2.1.3.3 Eosinófilos Os eosinófilos têm uma dimensão de 11 a 14 μm e representam 3% dos leucócitos. Têm um núcleo bilobado e um citoplasma composto por grânulos de grande dimensão (Figura 6) (1, 3). Nos grânulos dos eosinófilos destacam-se quatro proteínas: a peroxidase eosinofílica, a proteína básica principal, a proteína catiónica eosinofílica e neurotoxina derivada de eosinófilos. Os grânulos também armazenam diversas citocinas, enzimas e fatores de crescimento (9). 7 Figura 6: Eosinófilo [adaptado de (3)]. Os eosinófilos são conhecidos como sendo importantes mediadores de reações alérgicas (hipersensibilidade) e desempenham um papel fundamental na destruição de vários parasitas (3). Apesar da maioria dos parasitas serem demasiadamente grandes para serem fagocitados por qualquer célula fagocitária, os eosinófilos têm a capacidade de se ligar aos parasitas através de moléculas de superfície específicas e libertarem substâncias capazes de eliminar ainda mais parasitas, como espécies reactivas de oxigénio (ROS), enzimas hidrolíticas e proteína básica principal (2). Em algumas parasitoses e em doenças alérgicas o número de eosinófilos no sangue aumenta (eosinofilia). A eosinofilia está associada a algumas anomalias, incluindo alergias, reações medicamentosas, infeções por helmintes, síndrome de Churg-Strauss, algumas neoplasias, distúrbios metabólicos, distúrbios gastrointestinais eosinofílicos e síndrome de hipereosinofilia (10). 2.1.3.4 Basófilos Os basófilos são os menos comuns dos leucócitos no sangue periférico (0,5 a 1%) e têm entre 10 a 12 μm de diâmetro. Têm um núcleo bilobular e o citoplasma é rico em grânulos que coram de azul-escuro, como mostrado na Figura 7Figura. Os grânulos são geralmente tão grandes e numerosos que obscurecem o contorno do núcleo (1-3). Figura 7: Basófilo [adaptado de (3)]. 8 Os basófilos normalmente circulam na corrente sanguínea e, em certas condições patológicas, tais como doenças alérgicas e infeções por parasitas, são recrutados para os tecidos periféricos, embora em pequenas quantidades (11). Os basófilos podem ser ativados por uma série de sinais incluindo os mediados por anticorpos [imunoglobulinas (Ig) E, IgG e IgD)], citocinas [interleucina (IL) 3 (IL-3), IL- 18 e IL-33), proteases, ligandos e fatores do complemento (12). Uma vez ativados são capazes de produzir uma série de fatores excretados como as citocinas IL-4, IL-13, IL- 6, fator de necrose tumoral α (TNF-α) e linfopoetina estromal tímica (TSLP). Além disso, libertam mediadores pré-formados, armazenados nos seus grânulos como a histamina, leucotrieno C4 (LTC4), péptidos antimicrobianos e fatores quimiotáticos que recrutam células imunitárias (12). Subsequentemente, estas células regulam as respostas alérgicas e imunológicas do organismo (11). Os basófilos existem num número muito reduzido nosso organismo porque, como respondem a vários estímulos e libertam modeladores imunológicos, um número elevado destas células pode provocar distúrbios homeostáticos no sistema imunitário e levar a uma anafilaxia sistémica (11). 2.1.3.5 Neutrófilos No final do séc. XIX, Paul Ehrlich, descobriu os neutrófilos, quando as técnicas de fixação e coloração celulares tornaram possível a identificação dos núcleos lobados e a presença dos grânulos citoplasmáticos, característicos destas células. A coloração de tais grânulos a partir de corantes neutros conferiu a estes leucócitos a denominação de “neutrófilos” (13). Nos seres humanos, os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa contra uma grande diversidade de ameaças incluindo bactérias (14), vírus (15), protozoários (16) e fungos (17). 2.1.3.5.1 Morfologia Os neutrófilos, também denominados por polimorfonucleares têm um diâmetro de cerca de 7-10 μm e um núcleo segmentado (18) com 3 a 5 lóbulos ligados por finas pontes de heterocromatina (3). O citoplasma dos neutrófilos apresenta três tipos de granulações: os grânulos primários ou azurófilos (lisossomas), os grânulos secundários e os grânulos terciários (18). Os grânulos azurófilos, por serem os primeiros a aparecer durante a maturação, 15 destas estas espécies, o NO ao reagir com o O2-, origina uma espécie muito citotóxica, o anião peroxinitrito (ONOO-) (Equação 10). Equação 8: 2NO + O2 2NO2 Equação 9: 2NO + 2NO2 2N2O3 Equação 10: NO + O2- ONOO- Para a eliminação de agentes invasores, além da produção de espécies reativas, os neutrófilos podem libertar proteínas granulares e cromatina que formam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que degradam fatores de virulência e ligam-se matando as bactérias num microambiente contido (13, 36, 43). 2.2 Nanopartículas de prata A nanotecnologia é uma ciência que estuda materiais em nano-escala (escala atómica), ou seja, estruturas menores do que 100 nm (44, 45). Tal como se pode verificar na Figura 12, uma célula chega a ser mil vezes maior em volume e tamanho, em comparação com uma nanopartícula (NP) de 10 nm (44). Proteínas e pequenas moléculas (1 a 4 nm) NP de 10 nm Célula animal de 2 µm Figura 12: Comparação de tamanho entre proteínas e pequenas moléculas, NPs de 10 nm e uma célula animal [adaptado de (44)] 16 As NPs têm propriedades físicas e químicas singulares que resultam da elevada quantidade de átomos presentes na superfície e da sua elevada relação área/volume (46, 47). A nanotecnologia é uma ciência multidisciplinar e tem sido utilizada em aplicações tão diversas como cosmética, têxteis, eletrónica, ótica, agricultura, matérias para engenharia (48, 49). As nanopartículas de prata (AgNPs) são as NPs mais utilizadas devido às suas inúmeras aplicações (50-52) e por isso serão o foco de incidência desta dissertação. A base de dados do centro Woodrow Wilson dos Estados Unidos, apesar de não ser muito exaustiva, listou 1015 produtos no mercado contendo NPs, dos quais, 250 são constituídos por AgNPs (Tabela 1) (53). Estes dados revelam a elevada utilização destas NPs pela população em geral. As AgNPs possuem propriedades físicoquímicas muito características, incluindo a sua flexibilidade, maleabilidade e uma condutividade térmica e elétrica elevada em relação a qualquer outro metal (54). Caracterizam-se pela sua estabilidade química, atividade catalítica e um comportamento ótico não linear. Estas propriedades conferem um imenso potencial em tintas, microeletrónica e imagiologia médica. No entanto, é o largo espectro de atividade antimicrobiana da prata e o custo relativamente baixo de obtenção de AgNPs que as torna extremamente populares numa vasta gama de produtos de consumo incluindo plásticos, sabonetes, adesivos, metais e têxteis (53). Tabela 1: Principais produtos no mercado contendo AgNPs (53). Produtos com AgNPs Percentagem Cremes e cosméticos 32.4 Suplementos alimentares 4.1 Têxteis e vestuário 18.0 Filtros de ar e água 12.3 Utensílios domésticos 16.4 Detergentes 8.2 Outros 8.6 O facto de a prata ser um metal amplamente utilizado há milhares de anos na história da Humanidade, também contribui para a sua grande aplicabilidade (54). 17 Hipócrates proclamou as propriedades medicinais da prata, nomeadamente o facto de poder curar enfermidades múltiplas. Durante séculos, as diferentes formas de prata foram utilizadas no tratamento de queimaduras e feridas (55). Contudo, descobriu-se que a pigmentação irreversível da pele e/ou dos olhos – argíria (Figura 13), podia desenvolver-se devido à exposição prolongada à prata ou a compostos constituídos por prata. Devido a este problema e juntamente com a introdução da penicilina na década de 1940, o uso da prata diminuiu drasticamente (55, 56). Figura 13: Pigmentação azul acinzentada característica da argíria (57). Mais tarde, a resistência dos microrganismos aos diferentes antibióticos e o desenvolvimento de métodos de síntese de AgNPs mais simples revitalizou o interesse neste valioso agente antimicrobiano. A prata possui atividade biocida contra mais de 650 organismos patogénicos (bactérias, fungos e vírus) (56) e o avanço da ciência moderna e da nanotecnologia ajudou a renovar a sua importância. As aplicações das AgNPs continuam a ser amplamente estudadas, devido às suas notáveis características antimicrobianas (54), que estão associadas com a oxidação e libertação lenta de iões prata (Ag+) para o ambiente, tornando-as num agente biocida ideal. 2.2.1 Síntese, revestimento e caracterização A nanotecnologia e a química de síntese moderna têm sido utilizadas para desenvolver métodos de síntese no sentido de melhorar o desempenho das NPs. O desafio para os investigadores é desenvolver um processo de síntese de NPs em que se obtenha um melhor controlo sobre o tamanho, distribuição, morfologia, pureza, quantidade e qualidade das NPs, utilizando processos económicos e que não sejam prejudiciais ao meio ambiente (58). 18 A redução química é o método mais frequentemente utilizado para a síntese de AgNPs. Baseia-se num processo de redução que se divide em dois passos, permitindo um melhor controlo do tamanho das NPs. Nesta técnica, um agente redutor forte é utilizado para produzir partículas pequenas de prata, as quais são ampliadas num passo secundário por redução com um agente redutor mais fraco (59, 60). São usados como redutores o hidreto de boro, o citrato e o ácido ascórbico (53). A síntese de NPs por métodos de redução química é realizada na presença de agentes estabilizadores, tais como o dodecil sulfato de sódio (SDS), a polivinilpirrolidona (PVP) e o citrato trisódico, a fim de evitar a aglomeração da solução coloidal de AgNPs, que pode resultar na alteração das suas propriedades iniciais (61, 62). Embora as NPs possuam excelentes propriedades físicas e químicas, não possuem propriedades de superfície adequadas para certas aplicações (63). Para evitar a agregação e a aglomeração das NPs, são utilizados agentes estabilizadores, dos quais se destacam compostos com grupos tiol, conjuntos de polímeros ou estruturas dendríticas e o encapsulamento em microemulsões (64). Estes agentes estabilizadores não só protegem as NPs da precipitação, mas também desempenham um papel crítico no tamanho, distribuição, morfologia e biocompatibilidade das mesmas. A PVP é considerada uma excelente estabilizadora polimérica para as AgNPs. No caso de partículas com diâmetros inferiores a 50 nm, o azoto em PVP coordena as ligações com a prata de forma a criar uma camada de proteção. Outros polímeros foram investigados como moléculas estabilizadoras de AgNPs que incluem poliacrilatos, polietilenoglicol (PEG), álcool polivinílico, poliacrilonitrilo, poliacrilamida (64), carbono em espuma, albumina sérica bovina (BSA) e sulfonato de sódio-2- mercaptoetano (MES) (47). Os revestimentos biológicos também constituem uma opção e podem incluir anticorpos, biopolímeros, tais como o colagénio, ou monocamadas de pequenas moléculas (65). As biomoléculas promovem a biocompatibilidade das AgNPs (Figura 14), facilitando a sua utilização como biossensores, em imagiologia e tratamentos de hipertermia (66). Uma enorme variedade de moléculas orgânicas de diferentes composições, tamanho e complexidade estão disponíveis na natureza e proporcionam a estrutura e funcionalização para os vários processos biológicos (63). A caracterização das NPs é importante para se compreender e controlar não só o processo de síntese bem como, as suas aplicações. As comparações entre os estudos e as generalizações que permitem o uso posterior de dados são difíceis de concretizar se as AgNPs não estiverem devidamente caracterizadas (53). 19 Figura 14: Biofuncionalização de AgNPs [adaptado de (63)]. O primeiro passo para a caracterização é determinar se as AgNPs foram realmente sintetizadas. A análise do tamanho, forma e quantidade também é importante. Para a determinação destes parâmetros utilizam-se variadas técnicas, incluindo a microscopia de força atómica (AFM), microscopia eletrónica de varrimento e microscopia eletrónica de transmissão (TEM), espectroscopia de absorção e dispersão dinâmica de luz (DLS) (67). A morfologia e o tamanho das partículas podem ser determinados por TEM, microscopia eletrónica de varriamento e AFM. A técnica de DLS é mais utilizada para a determinação da distribuição das NPs (67). A TEM proporciona o acesso não só ao tamanho e morfologia das NPs, mas também ao seu estado de agregação, constituindo por isso uma técnica muito utilizada na caracterização de NPs. No entanto, para uma melhor caracterização terá de ser utilizada juntamente com outras técnicas pois o processamento da amostra exigido para TEM pode alterar as propriedades de superfície das NPs (68). A técnica de espectroscopia de UV-Vis é amplamente utilizada para a caracterização de AgNPs já que para além de dar informação acerca do tamanho médio das NPs e dispersão é um método de baixo custo e de fácil manuseamento (68). Um outro fator importante na caracterização das AgNPs é a sua estabilidade. O potencial zeta é utilizado para caracterizar a propriedade de carga da superfície das NPs, que reflete o potencial elétrico das partículas e é afetado pela composição da superfície das mesmas, a presença ou ausência de compostos adsorvidos e a composição da solução de dispersão, principalmente a força iónica e o pH. NPs com um potencial zeta acima de (+/-) 30 mV demonstraram ser estáveis pois a carga da superfície impede a sua agregação (69). 20 2.2.2 Aplicações As AgNPs, devido às suas propriedades específicas, têm inúmeras aplicações, sendo as mais populares as antimicrobianas. AgNPs como antibacterianos, antifúngicos e antivirais O espectro antibacteriano das AgNPs é mais amplo do que o dos antibióticos comuns. Como tal, as AgNPs representam uma nova geração de antimicrobianos, capazes de destruir bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (50) (Figura 15). Figura 15: Controlo (A) e efeito antibacteriano (B) (E. coli) das AgNPs ao fim de 24h [adaptado de (61)]. As AgNPs são também capazes de inibir a formação de biofilmes nas superfícies revestidas com as mesmas (70) e têm baixa propensão para induzir resistência microbiana. Assim sendo, têm sido aplicadas numa vasta gama de produtos antimicrobianos para prevenção de infeções, como pensos para queimaduras e feridas traumáticas, revestimento de cateteres, trabalhos odontológicos, próteses e dispositivos médicos (51). Devido às suas propriedades antimicrobianas, as AgNPs também podem ser incorporadas em máquinas de lavar roupa e filtros para purificação de água de consumo e água de piscinas (71). Além disso, esta propriedade incentiva a indústria têxtil a usar AgNPs em diferentes tipos de tecidos (54). São inclusivamente já utilizadas em meias para eliminar as bactérias associadas aos maus odores dos pés. Também podem ser usadas na indústria alimentar (71). O mecanismo de ação da atividade antimicrobiana das AgNPs não está bem definido, mas é amplamente aceite que possa ser mediado pela oxidação parcial das AgNPs e libertação de Ag+. Por sua vez, os Ag+ podem interagir com o peptidoglicano da parede celular e a membrana plasmática, causando lise celular; com o DNA bacteriano (citoplasmático), impedindo a replicação do DNA; e com proteínas bacterianas, interrompendo a síntese proteica (Figura 16). As AgNPs também podem danificar as bactérias diretamente por penetração na parede celular e membrana celular (61). 21 Figura 16: Mecanismos da atividade antibacteriana de iões de prata [adaptado de (61)]. As AgNPs também apresentam considerável atividade antifúngica contra géneros como Aspergillus (72), Candida (73) e Fusarium (74). Além disso, as AgNPs são eficazes contra as leveduras isoladas de mastites bovinas (75) e também contra vários fungos fitopatogénicos (76). Os resultados de um estudo de Kim e colaboradores sugerem que a atividade antifúngica das AgNPs passa pela alteração da estrutura da membrana celular do fungo e consequente inibição do processo de gemulação normal (77). As AgNPs também se têm mostrado ativas contra vários tipos de vírus, incluindo o vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) (78, 79), vírus H1N1 Influenza A (80) , vírus da hepatite B (HBV) (81) e vírus Herpes simplex (HSV) (82). Uma vez que as AgNPs podem atacar uma vasta gama de alvos no vírus, existe uma menor possibilidade de desenvolver resistência, em comparação com antivirais convencionais. Para além da interação direta com as glicoproteínas da superfície viral, as NPs metálicas podem ter acesso ao interior da célula e exercer a sua atividade antiviral através de interações com o genoma viral [DNA ou ácido ribonucleico (RNA)]. Além disso, o compartimento intracelular de uma célula infetada com um vírus está sobrelotado de fatores celulares que são necessários para permitir a replicação viral e a produção adequada de viriões da progenia. A interação de NPs metálicas com estes 22 fatores, que são a chave para uma replicação viral eficiente, pode também representar um novo mecanismo de ação (Figura 17) (47). Figura 17: Modelo esquemático da infeção de uma célula eucariótica por um vírus e o mecanismo de ação antiviral das NPs metálicas [adaptado de (47)]. AgNPs como anti-inflamatórios A cicatrização ocorre após uma sequência de eventos, incluindo a coagulação, inflamação, proliferação e remodelação da matriz e do tecido. A resposta inflamatória durante o processo de cicatrização induz a produção de mediadores que promovem o processo de cura (83). Embora as citocinas sejam cruciais na iniciação, manutenção e regulação da resposta pós-lesão, estas mesmas moléculas têm sido implicadas na cura deficiente de feridas, formação de cicatriz anormal e resposta inflamatória descontrolada (83). Pela análise bibliográfica, Tian e seus colaborados sugerem que a inflamação pode ser prejudicial para o processo de cicatrização (83). Estes autores analisaram a ativação de algumas citocinas envolvidas no processo de cicatrização de queimaduras, num modelo de rato, durante 30 dias após a lesão. As diferenças entre os níveis de citoquinas pró-inflamatórias IL-6, fator β1 de transformação do crescimento (TGF-β1) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)] analisadas no local da ferida e a nível sistémico e as anti-inflamatórias IL-10 e interferon δ (IFN-δ)] confirmaram que as AgNPs podem modular a expressão das 23 citocinas de uma forma dependente da dose, diminuindo assim a inflamação e diminuindo também a cicatriz (83). A atividade anti-inflamatória de um creme tópico com AgNPs também foi avaliada num modelo murino de dermatite de contacto alérgica. Os investigadores verificaram que o creme com AgNPs era o que reduzia visivelmente o eritema, de uma forma dependente da concentração, quando comparado com esteroides e imunossupressores. Também foi verificada a inibição da expressão das citoquinas próinflamatórias TNF-α e de IL-12 e a indução da apoptose em células envolvidas no processo inflamatório (84). Num estudo com um modelo suíno de dermatite de contacto, induziu-se inflamação e recorreu-se seguidamente a um tratamento diário com pensos de AgNPs. Verificouse, após análise do eritema, edema e dados histológicos que os suínos tratados com as AgNPs tinham a pele com características próximas das normais após 72h, enquanto os outros grupos de tratamento permaneceram com inflamação (Figura 18). A diminuição da inflamação no grupo tratado com AgNPs foi associada ao aumento da apoptose de células inflamatórias, a uma diminuição da expressão de citoquinas próinflamatórias e uma diminuição da atividade da gelatinase (85). Considerados em conjunto, estes resultados sugerem que as AgNPs podem estar envolvidas na alteração ou supressão de eventos inflamatórios nas fases iniciais da cicatrização de feridas, bem como a utilização de AgNPs podem ser clinicamente aplicável a outras doenças (86), como as infeções por Chlamydia trachomatis. Yilma e colaboradores sugerem que as AgNPs podem ser aplicadas no tratamento da clamídia, pois uma característica da infeção é a indução de respostas inflamatórias severas, as quais desempenham papéis críticos na sua patogénese. Os autores verificaram a regulação de vários mediadores inflamatórios e sugerem que o efeito anti-inflamatório das AgNPs não é generalizado, mas sim altamente seletivo, dependendo assim do tipo de patogénico ou das células expostas (87). Pela análise bibliográfica, existem vários estudos que evidenciam a capacidade das AgNPs modularem a expressão das citoquinas de uma forma dependente da dose, diminuindo assim a inflamação e a aparência da cicatriz. Tian e colaborados sugerem que a inflamação pode ser prejudicial para o processo de cicatrização da ferida, por isso analisaram a ativação de algumas citoquinas envolvidas no processo de cicatrização de queimaduras, num modelo de rato, durante 30 dias após a lesão onde confirmaram que as AgNPs podem modular a expressão das citoquinas de uma forma dependente da dose, diminuindo assim a inflamação e a aparência da cicatriz (83-85). 24 Figura 18: Imagens representativas da evolução da cicatrização dos grupos de tratamento. A- Dia 0, B- Dia 3 com solução salina, C- Dia 3 com nitrato de prata, D- Dia 3 com AgNPs [adaptado de (85)]. Apesar de vários estudos relatarem que as AgNPs poderem induzir a inflamação, a interação direta entre AgNPs e neutrófilos que são os intervenientes mais importantes na inflamação, está mal documentada. No entanto, observou-se que AgNPs causam dano mitocondrial, resultando em indução de apoptose e morte de macrófagos (88). Um estudo de Poirier e colaboradores demonstrou que AgNPs de 20 nm aumentaram o tamanho das células de neutrófilos humanos recentemente isolados e rapidamente interagiram com a membrana celular e penetraram no interior das células, induziram a apoptose celular e inibem a síntese de novo de proteínas apenas quando presentes como grandes agregados (> 500 nm) (89). AgNPs como antitumorais O cancro é uma das doenças do século XXI, e constitui um desafio terapêutico para os investigadores e médicos. Um dos fatores chave para o crescimento e disseminação das células tumorais é a angiogénese, que é o processo de formação de novos vasos sanguíneos e capilares a partir de pré-existentes. Os vasos sanguíneos fornecem oxigénio e outros nutrientes para as células tumorais, permitindo-lhes crescer, migrar e metastizar para diferentes órgãos. A angiogénese tumoral é predominantemente provocada por mitogénios específicos endoteliais, tais como o VEGF, fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) e fator β de transformação do crescimento (TGF-β). Existem inúmeras moléculas antiangiogénicas em diferentes fases de ensaios clínicos, muitas delas foram aprovadas como terapêuticas do cancro. Infelizmente, alguns destes agentes demonstraram sinais de toxicidade (90). Pesquisas focadas no uso anti-angiogénico das AgNPs revelaram que poderiam atuar como moléculas anti-angiogénicas potentes. As AgNPs foram capazes de bloquear completamente a permeabilidade de células endoteliais da retina de suíno induzida por VEGF e IL- 1β (91). Gurunathan e colaboradores demonstraram in vivo, 31 Em geral, os estudos toxicológicos AgNPs têm-se centrado na avaliação da distribuição nos tecidos, após injeção intravenosa, exposição pulmonar, dérmica ou do trato gastrointestinal. Estes estudos fornecem informação útil sobre os potenciais órgãos alvo da toxicidade das NPs, contudo há ainda algumas questões por responder (112, 135). As alterações nas propriedades físico-químicas das AgNPs em fluidos biológicos, tais como o tamanho, a aglomeração, ou formação de agregados e carga de superfície têm de ser necessariamente verificados para determinar a sua toxicidade e para compreender o mecanismo de toxicidade. Os fatores fisiológicos que afetam a absorção, distribuição e excreção de NPs inorgânicas que dependem das vias de exposição, juntamente com o seu mecanismo de absorção e alvos biológicos, também devem ser considerados para uma melhor compreensão do potencial de toxicidade (134). No corpo humano há essencialmente três vias de exposição a AgNPs: a pele, os pulmões e o trato digestivo. O trato genital feminino também pode constituir uma via de entrada, uma vez que as AgNPs são incorporadas em produtos de higiene femininos (54). Assim sendo, as AgNPs podem entrar e penetrar nesses órgãos, sendo que essa penetração depende do tamanho, forma e das características de superfície das NPs, bem como do órgão (histologias diferentes), da idade do consumidor e de outros agentes. A Figura 21 mostra as principais vias de entrada das AgNPs e as áreas do corpo em que a exposição a NPs deve ser evitada (109). Figura 21: Principais vias de entrada das AgNPs (vermelho) e partes do corpo cuja exposição a AgNPs deve ser evitada (a preto) [adaptado de (109)]. Após exposição, as AgNPs são capazes de passar para a circulação sanguínea e assim, se distribuírem pelo organismo, tal como demonstrado na Tabela 3. 32 O tamanho das partículas e a via de exposição afetam a sua distribuição pelos tecidos (136, 137). A eliminação de partículas ocorre essencialmente pelas fezes e urina (135). Tabela 3:Distribuição nos tecidos das AgNPs segundo as várias vias de exposição. Via de exposição Tamanho das AgNPs (nm) Distribuição nos tecidos por ordem decrescente de quantidade Conclusões Fonte Oral 60 Estômago Fígado Rins Pulmões Testículos Cérebro Sangue A absorção das AgNPs após administração oral foi demonstrada e a toxicidade no fígado foi sugerida. (138) Inalação 18-19 Pulmões Fígado Baço Cérebro Translocação dependente da dose. Inflamação alveolar. (139) Inalação 4-10 Pulmões Fígado Rins Coração Cérebro Translocação dependente do tempo e do tamanho. As NPs foram rapidamente eliminadas dos pulmões. (137) Injeção intravenosa 12-20 Baço Fígado Pulmões Rins Toxicidade dependente do tempo e da concentração. (140) Injeção intravenosa 20-100 20 nm: Fígado Rins Baço > 20 nm: Rins Baço Pulmões Translocação dependente do tamanho. (136) Dérmica Acticoat 15 Plasma Concentração no sangue de 56,8 μgmL-1. Eliminação passados 6 meses (141) Dérmica Acticoat 15 Fígado (hepatotoxicidade e argíria) Hepatotoxicidade e argíria que desapareceram passados 7 meses (142) Devido ao facto de um grande número de produtos, contendo AgNPs, serem aplicados diretamente na pele, a avaliação das consequências de uma exposição cutânea é primordial. Atualmente, as investigações têm incidido sobre a eficiência de pensos que contêm AgNPs. No entanto, estão descritos resultados prejudiciais à saúde associados ao tratamento (141, 142), sendo necessários mais estudos para assegurar uma utilização mais segura. As mesmas AgNPs podem ter comportamentos biológicos muito diferentes em pele ferida e em pele normal. É crucial definir os perigos associados à exposição dérmica às AgNPs, uma vez que o fígado é sugerido como o alvo de toxicidade (142-144). 33 Também a probabilidade de aparecimento da condição de argíria com este tipo de exposição, apesar de ser reversível (142), este tipo de resposta limita muito a utilização de produtos contendo AgNPs pelo consumidor, muitas vezes, por razões estéticas (135). O estudo da ingestão oral de suspensões de AgNPs também é relevante uma vez que foi adotada como uma alternativa terapêutica para o tratamento de doenças como artrite e cancro. No entanto, estão descritos uma série de efeitos prejudiciais, associados à ingestão de suspensões de AgNPs, incluindo úlceras intestinais, argíria (145) e danos hepáticos (138, 145). Uma preocupação poderá ser a bioacumulação já que em dois estudos por exposição por ingestão (147, 148) se verificou presença e permanência nos testículos e no cérebro. O aumento da produção e utilização de AgNPs propicia a exposição humana, nomeadamente por inalação. Como tal, é imperativo entender a toxicidade destas NPs após exposição pulmonar. Contudo, esta abordagem não está muito explorada estando o foco dos estudos centrado na avaliação da disponibilidade sistémica de partículas, após exposição pulmonar (135). Em estudos de exposição por inalação verificou-se toxicidade no fígado (149) e nos pulmões (139) além de que, se verificou acumulação de AgNPs em órgãos como o cérebro e o bolbo olfativo (139, 149), não se tendo conhecimento das consequências. De acordo com Oberdörster e colaboradores, a presença de prata dentro do bolbo olfativo e no cérebro pode ter resultado da inalação das partículas, e da sua subsequente transferência para o bolbo olfativo pelos neurónios, como ilustra a Figura 22 (150). 34 Figura 22: Passagem de NPs a partir da mucosa nasal para o cérebro através das terminações do nervo olfativo [adaptado de (109)]. Está descrito que a injeção intravenosa de AgNPs pode ser utilizada para o tratamento de algumas patologias (78, 151). Como tal, a avaliação da distribuição das AgNPs nos tecidos após administração intravenosa é de relevância, no sentido de se entender quais são os órgãos alvo que estão em maior risco de toxicidade. Está descrito que após a exposição por administração intravenosa, as AgNPs podem passar para a circulação sanguínea e serem distribuídas pelo organismo (136, 152). Os estudos disponíveis permitem concluir que a toxicidade pulmonar e a disponibilidade sistémica de AgNPs dependem do tempo de exposição, da concentração, do método de administração das NPs e do tamanho das mesmas (e aglomeração), o que ilustra a importância da montagem experimental, na toxicidade demonstrada após a exposição às partículas (135). 35 3.Material e Métodos 3.1 Materiais O Histopaque 1077, Histopaque 1119, solução de azul tripano 0,4%, NaCl, solução de tampão fosfato salino (PBS) sem Ca2+ e Mg2+, RPMI 1640, soro fetal bovino, αglutamato, penicilina e estreptomicina, dihidrorodamina 123 (DHR), cloreto de difenilenoiodóico (DPI) e vermelho neutro (NR) 0,33% foram adquiridos à Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). O Annexin-V-FLUOS Staining Kit foi adquirido à Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemanha). O Hemacolor® foi obtido à Merck. As AgNPs de 10 e 50 nm, esféricas revestidas com PVP foram adquiridas à Nanocomposix (San Diego, Alemanha). 3.2 Equipamento As leituras de espectrofotometria e fluorimetria foram realizadas em leitor de microplacas Synergy HT (BIO-TEK). As centrifugações foram efeituadas numa centrífuga 5810 R (Eppendorf). As leituras de citometria de fluxo foram realizadas num citómetro de fluxo BD AccuriTM C6. As leituras de microscopia ótica foram realizadas num microscópio ótico Eclipse E 400 (Nikon). Para a contagem das células utilizou-se uma câmara de Neubauer. Os cortes das amostras para microscopia eletrónica foram obtidos através de um micrótomo Leica Reichert Supernova, as células foram analisadas num microscópio eletrónico de transmissão JEM-1400, Jeol e as imagens obtidas através de uma câmera digital Orius® Sc1000CCD (Gatan). Foi ainda utilizada uma balança analítica AG285 (Metler Toledo). 3.3 Caracterização das AgNPs Não foi realizada neste estudo caracterização adicional para além da realizada pelo fabricante, contudo, foi possível pela análise no TEM, confirmar o diâmetro nas NPs utilizadas neste estudo. 36 3.4 Isolamento de neutrófilos humanos pelo método de centrifugação de gradiente de densidade O sangue venoso foi obtido, após consentimento de voluntários saudáveis do Hospital de Santo António, Porto. Todos os ensaios foram precedidos de isolamento dos neutrófilos de todos os outros componentes do sangue humano através do método de centrifugação de gradiente de densidade. 3.4.1 Fundamento do método Os neutrófilos foram isolados do sangue pelo método de centrifugação de gradiente de densidade descrito por Freitas e colaboradores (153). Trata-se de um método que consiste na separação dos componentes do sangue segundo as suas diferentes densidades, ao ser aplicada uma força centrífuga. 3.4.2 Procedimento experimental Para se isolarem os neutrófilos a partir do sangue humano pelo método de centrifugação de gradiente de densidade utilizaram-se duas soluções de diferentes densidades, Histopaque 1077 (densidade de 1,077) e Histopaque 1119 (densidade de 1,119). Estas soluções foram colocadas em quantidades iguais num tubo de polipropileno (material que evita a adesão das células à parede do tubo) ficando a mais densa por baixo e a menos densa por cima, tendo cuidado para não misturar. Por último, adicionou-se cuidadosamente o sangue [colhido num tudo de ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA) para evitar a coagulação]. Após uma centrifugação a 890 g, durante 30 min. a 20 °C, as células distribuem-se no tubo de acordo com a sua densidade (Figura 23). Rejeitou-se o sobrenadante e recolheu-se a camada referente aos neutrófilos para outro tubo de centrífuga, ao qual se adicionou tampão PBS sem Ca2+ e Mg2+ no sentido de se lavar as células e retirar o excesso de Histopaque. Seguiu-se uma centrifugação a 870 g durante 5 min. a 4 ° C. Descartouse o sobrenadante resultante da centrifugação e ressuspendeu-se as células com solução tampão PBS sem Ca2+ e Mg2+. Para eliminar a contaminação por glóbulos vermelhos, procedeu-se à hemólise dos mesmos, adicionando-se água destilada (H2Od) à suspensão e aguardou-se cerca de três minutos, tempo após o qual é restabelecida a isotonia do meio adicionando NaCl 3% (m/v). Esta suspensão foi 37 novamente centrifugada nas mesmas condições, o sobrenadante foi rejeitado e os neutrófilos ressuspensos com solução tampão RPMI 1640 (suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de L-glutamato, 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina). Figura 23: Esquema resumo do procedimento referente ao isolamento de neutrófilos humanos. Centrifugação: 890 g a 20 °C durante 30 min. Aspiração do sobrenadante. Lise dos glóbulos vermelhos. Centrifugação: 870 g a 4 °C durante 5 min. Remoção da camada de neutrófilos e adição de PBS. Centrifugação a 870g a 4 °C durante 5 min. Aspiração do sobrenadante Ressuspensão dos neutrófilos em RPMI 1640 Contagem dos neutrófilos em câmara de Neubauer 38 100(%)  sneutrófilodetotalnúmero viáveissneutrófilodenúmero eViabilidad 3.5 Método da exclusão do azul tripano 3.5.1 Fundamento do método O azul tripano é um corante orgânico, carregado negativamente. As células inviáveis, com danos na membrana, após alguns segundos de exposição ao corante ficam de cor azul (154). 3.5.2 Procedimento experimental Para a realização do ensaio do azul tripano, procedeu-se de acordo com Freitas e colaboradores (155). Após incubação na estufa a 37 °C com intervalos de tempo entre 0 e 24h em placa de 96 poços com neutrófilos humanos (2 x 106 /mL) e AgNPs (10 e 50 nm) com concentrações entre 0 e 100 μg/mL, adicionou-se quantidades iguais de suspensão celular e azul tripano 0,4% num microtubo e homogeneizou-se. Após permanência em gelo durante 2 min., com o auxílio de uma micropipeta, encheu-se a câmara de Neubauer e procedeu-se à contagem dos neutrófilos ao microscópio ótico (ampliação de 400x). A determinação da viabilidade celular foi efetuada a partir da Equação 11: Equação 11: 3.6 Determinação da libertação da lactato desidrogenase 3.6.1 Fundamento do método A LDH é uma enzima citoplasmática presente em quase todos os órgãos com funções no último passo da glicólise, catalisando a reação reversível do piruvato a lactato segundo a Equação 12 (156, 157): Equação 12: L-lactato + NAD+ piruvato + NADH + H+ A perda da LDH intracelular e a sua libertação para o meio de cultura é um indicador da morte celular irreversível devido a danos na membrana da célula (158). A velocidade de formação de NADH é diretamente proporcional à atividade catalítica da LDH e é determinada medindo a taxa de oxidação do mesmo a 340 nm. 39 3.6.2 Procedimento experimental O ensaio foi realizado de acordo com Couto e colaboradores (159). A incubação das células foi realizada numa estufa a 37 °C com intervalos de tempo entre 0 e 24h em placa de 24 poços com neutrófilos humanos (2 x 106 /mL) e de AgNPs (10 e 50 nm) com concentrações entre 0 e 100 μg/mL. No final do tempo de incubação, dividiuse a amostra colocando-se em dois microtubos. Um dos microtubos foi utilizado para a determinação da LDH total, procedendo-se ao rebentamento das células por ultrassons em ciclos de 3 segundos. Todas as amostras foram centrifugadas a 6500 g durante 2 min. a 4 °C e o sobrenadante foi recolhido. A atividade de LDH foi determinada numa placa U.V. de 96 poços, em que cada poço continha sobrenadante, NADH 0,145 mM e piruvato 2 mM, seguindo a taxa de oxidação do NADH a 340 nm numa cinética de 4,30 min. 3.7 Método do iodeto de propídio 3.7.1 Fundamento do método Os neutrófilos em necrose foram analisados por citometria de fluxo após marcação com iodeto de propídio (PI). A aplicação do PI permite a marcação das células com perda de integridade membranar, ou seja, células em necrose. Isto é possível dado que o PI se intercala na dupla cadeia do DNA emitindo fluorescência sendo esta medida por citometria de fluxo. Este marcador não consegue atravessar uma membrana citoplasmática intacta (160). 3.7.2 Procedimento experimental O procedimento experimental foi realizado de acordo com Freitas e colaboradores (155). Após incubação na estufa a 37 °C com intervalos de tempo entre 0 e 24h em placa de 48 poços com neutrófilos humanos (2 x 106 /mL) e AgNPs (10 e 50 nm) com concentrações entre 0 e 100 μg/mL, as células foram centrifugadas a 400 g durante 5 min. a 20 °C e os sobrenadantes foram rejeitados. Ressuspendeu-se o pellet em PBS e centrifugou-se a 200 g durante 5 min. a 20 °C. Rejeitou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em solução de PI preparada de acordo com as indicações do fabricante do kit Annexin-V-FLUOS Staining. Incubou-se no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. e no final desse tempo adicionou-se tampão do kit. Procedeu-se à leitura no citómetro. 40 100 Absteste (%)  oAbscontrol eViabilidad 3.8 Método do NR 3.8.1 Fundamento do método O NR é um corante vital conhecido por se acumular nos lisossomas de neutrófilos viáveis. Este corante ligeiramente catiónico penetra nas membranas por difusão passiva e concentra-se nos lisossomas onde se liga por ligações eletrostáticas hidrofóbicas a grupos aniónicos e/ou fosfato à matriz lisossomal (161). A absorção do NR depende da capacidade da célula em manter os gradientes de pH através da produção de ATP. A um pH fisiológico, o corante apresenta uma carga total perto de zero, permitindo a penetração nas membranas da célula. Dentro dos lisossomas, existe um gradiente de protões que mantém o pH menor que no citoplasma. Assim, o corante fica carregado e é retido nos lisossomas. Quando a célula morre, ou o gradiente do pH é reduzido, o corante não pode ser retido. Consequentemente, a quantidade do corante retido é proporcional ao número de células viáveis. O corante é depois extraído das células viáveis através do uso de uma solução acidificada de etanol e a absorvência do corante solubilizado é quantificado utilizando um leitor de placas (161). 3.8.2 Procedimento experimental As condições do ensaio de incorporação do NR foram otimizadas de acordo com Repetto e colaboradores e Elifio-Esposito e colaboradores (162) (161). Após incubação na estufa a 37 °C com intervalos de tempo entre 0 e 16h em placa de 48 poços com neutrófilos (2 x 106 /mL), AgNPs (10 e 50 nm) com concentrações entre 0 e 100 μg/mL e NR (15 µg/mL), retirou-se o conteúdo dos poços para microtubos e centrifugou-se a 400 g durante 5 min. a 20 °C. Rejeitou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em PBS. Após nova centrifugação a 400 g durante 5 min. a 20 °C, rejeitou-se o sobrenadante e adicionou-se solução ácida (composta por solução de ácido acético glacial, etanol (100%) e H2Od). Após incubação de 30 min. à temperatura ambiente, ao abrigo da luz e com agitação, transferiu-se 300 µL para a placa de 96 poços (Figura 24) e leu-se a absorvência no leitor de placas a 540 nm (no máximo até 60 min.) após adição da solução ácida. O cálculo da percentagem da viabilidade celular foi feito de acordo com a Equação 13: Equação 13: 47 mesmo assim, muito inferior quando comparada com as AgNPs de 10 nm na mesma concentração (77 ± 10%). Figura 28: Avaliação da viabilidade celular de neutrófilos humanos expostos a AgNPs de 10 e 50 nm (0-100 μg/mL) pelo método do PI após incubação de 4h (A). Os valores são apresentados como a média ± SEM (n≥3), *p<0,05, ***p<0,001, comparativamente ao controlo (sem AgNPs). Imagens representativas da análise por citometria de fluxo dos neutrófilos PI positivos com 4h de incubação. Controlo (B); AgNPs de 50 nm 100 μg/mL (C); AgNPs de 10 nm 100 μg/mL (D). B C D A B C D Concentração de AgNPs (μg/mL) Concentração de AgNPs (μg/mL) A 48 Figura 29: Avaliação da viabilidade celular de neutrófilos humanos expostos a AgNPs de 10 e 50 nm (0-100 μg/mL) pelo método do PI após incubação de 6h (A). Os valores são apresentados como a média ± SEM (n≥3), ***p<0,001, comparativamente ao controlo (sem AgNPs). Análise por citometria de fluxo dos neutrófilos PI positivos com 6h de incubação. Controlo (B); AgNPs de 50 nm 100 μg/mL (C); AgNPs de 10 nm 100 μg/mL (D). Figura 30: Avaliação da viabilidade celular de neutrófilos humanos expostos a AgNPs de 10 e 50 nm (0-100 μg/mL) pelo método do PI após incubação de 16 h (A). Os valores são apresentados como a média ± SEM (n≥3), *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001, comparativamente ao controlo (sem AgNPs).Análise por citometria de fluxo dos neutrófilos PI positivos com 16h de incubação. Controlo (B); AgNPs de 50 nm 100 μg/mL (C); AgNPs de 10 nm 100 μg/mL (D). 4.1.4 Método do NR A Figura 31 representa os resultados obtidos no estudo da viabilidade celular dos neutrófilos, pelo ensaio da incorporação do NR, quando expostos durante 4, 6 e 16h, respetivamente, a AgNPs de 10 e de 50 nm (0-100 μg/mL). Na Figura 31-A, correspondente ao gráfico das 4h de incubação, pode-se observar que, todas as concentrações de AgNPs de 10 nm, inclusivamente a mais baixa (25 μg/mL) revelaram sinais de citotoxicidade pela diminuição de sinal relativamente ao controlo. Inclusivamente, a concentração mais baixa de 25 μg/mL, apresenta uma percentagem de viabilidade de 76 ± 4% já com significado estatístico quando D C B A Concentração de AgNPs (μg/mL) 49 comparada com o controlo (98 ± 2%). Por outro lado, com as AgNPs de 50 nm, não se verificam variações na viabilidade com nenhuma das concentrações. No gráfico B, verifica-se uma situação muito parecida em termos estatísticos, no entanto, a diminuição da viabilidade passadas apenas mais duas horas (6h) revela-se mais pronunciada. Verificam-se viabilidades de 65 ± 12, 48 ± 8 e 37 ± 4%, para as concentrações de 25, 50 e 100 μg/mL, respetivamente. Em relação às AgNPs de 50 nm, para o mesmo tempo de incubação, não se verificam efeitos com significado estatístico, com uma percentagem de viabilidade de 96 ± 1% para a concentração mais alta de 100 μg/mL quando comparada com a do controlo (98 ± 2%). Com 16h de incubação com AgNPs de 10 nm, a percentagem de viabilidade não varia muito entre as concentrações, sendo de 51 ± 3, 47 ± 6 e 40 ± 7% para as concentrações de 25, 50 e 100 μg/mL, respetivamente. Por outro lado, os neutrófilos expostos a AgNPs de 50 nm apresentaram uma percentagem de viabilidade celular de 82 ± 2% na concentração de 50 μg/mL, sendo estatisticamente diferente quando comparada com o controlo. Sendo assim, verifica-se uma diminuição da viabilidade celular dependente da concentração, do tempo de incubação e do tamanho das NPs, segundo o método do NR. 0 25 50 100 0 20 40 60 80 100 V e r m e lh o n e u tro 4 h C o n c e n tra çã o d e A g N P s (g / m l) V ia b ilid a d e (% ) A g N P s 5 0 n m A g N P s 1 0 n m *** * ** 0 25 50 100 0 20 40 60 80 100 V e r m e lh o n e u tro 1 6 h C o n c e n t r a ç ã o d e A g N P s (g / m l) V ia b ilid a d e (% ) A g N P s 5 0 n m A g N P s 1 0 n m *** *** *** *** 0 25 50 100 0 20 40 60 80 100 V e r m e lh o n e u tro 6 h C o n c e n tra çã o d e A g N P s (g / m l) V ia b ilid a d e (% ) A g N P s 5 0 n m A g N P s 1 0 n m *** *** ** Concentração de AgNPs (μg/mL) Concentração de AgNPs (μg/mL) Concentração de AgNPs (μg/mL) 4h 6h 16h 50 Figura 31: Avaliação da viabilidade de neutrófilos humanos expostos a AgNPs de 10 e 50 nm (0-100 μg/mL) pelo método do NR após incubação de 4 (A), 6 (B) e 16h (C). Os valores são apresentados como a média ± SEM (n≥3). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001, comparativamente com o controlo (sem AgNPs). 4.2 Análise morfológica por MOC Na Figura 32 estão representadas as imagens obtidas por microscopia ótica referentes a neutrófilos humanos expostos a AgNPs de 10 e de 50 nm, durante 6 e 16h. Realizou-se o mesmo estudo a tempos inferiores, contudo, nenhuma das AgNPs testadas (10 ou 50 nm) induziu alterações morfológicas diferentes do controlo. Pela análise da Figura 32-C verifica-se que ao fim de 6h de exposição às AgNPs de 10 nm, os neutrófilos apresentam uma ligeira contração das células e ligeira condensação dos neutrófilos (seta azul). Passadas 16h de exposição às mesmas NPs na mesma concentração, os neutrófilos apresentam-se contraídos, com núcleos sem a forma bilobada e condensados relativamente ao controlo (seta vermelha), apresentado assim as características típicas de apoptose que pode culminar em necrose secundária. Tempo Controlo AgNPs de 50nm AgNPs de 10nm 6h 16h Figura 32: Morfologia de neutrófilos humanos quando expostos a AgNPs de 10 e 50 nm durante 6 e 16h (ampliação:1000 x). 4.3 Análise morfológica por TEM As imagens por TEM foram obtidas após exposição dos neutrófilos às AgNPs de 10 e de 50 nm durante 16h. Na Figura 33 (A) temos representado o controlo às 16h, onde se podem observar as células íntegras com os seus característicos núcleos A B C D E F 51 multilobados (seta verde). As células expostas a AgNPs de 50 nm (100 μg/mL) (Figura 33 B) apresentam um aspeto muito semelhante ao controlo. Na Figura 33-C, pode-se observar AgNPs de 50 nm nas imediações dos neutrófilos. As dimensões destas partículas foram calculadas recorrendo às ferramentas da TEM e confirmou-se o tamanho descrito pelo fabricante, de 50 nm. Este resultado sugere que as AgNPs de 50 nm não passam para o interior das células. Na Figura 33-D pode-se observar os neutrófilos após 16h de exposição a AgNPs de 10 nm (100 μg/mL). Verifica-se que existe conteúdo citoplasmático libertado pelas células, disperso no campo. Os núcleos perderam os seus limites ou desapareceram completamente (seta azul). Na Figura 33-E pode-se observar um fagolisossoma (seta laranja) de um neutrófilo quando exposto à concentração de 100 μg/mL de AgNPs de 10 nm e na Figura 33-F pode-se verificar que nesse fagolisossoma, quando ampliado, se observam partículas (setas roxas) que, quando medidas recorrendo às ferramentas do TEM, correspondem às dimensões das AgNPs em questão (10 nm), sugerindo que estas AgNPs têm a capacidade de entrar nos neutrófilos humanos. A espectroscopia de raios X dispersiva de energia (EDS) também confirmou a natureza das NPs medidas como tendo na sua constituição maioritariamente Prata (91%) (Tabela 4). Figura 33: Imagens por TEM de neutrófilos humanos expostos a AgNPs de 10 e 50 nm (100 μg/mL) durante 16h. A- Controlo (sem AgNPs) (ampliação 5000x). B- Com AgNPs de 50 nm. C- Prováveis AgNPs de 50 nm nas imediações exteriores de um neutrófilo (ampliação 40000x) (seta vermelha). D- B E F A C D 52 Com AgNPs de 10 nm (ampliação 8000x). E- Fagossoma (ampliação 40000x). F- Prováveis AgNPs de 10 nm no interior de um fagossoma (ampliação 200000x). Tabela 4: Percentagens dos elementos identificados por EDS. Elemento Massa (%) Fe 8.72 Ag 91.28 Total 100.00 4.4 Efeito das AgNPs no burst oxidativo de neutrófilos humanos Na Figura 34 estão representados os resultados obtidos no estudo da produção de espécies reativas pelos neutrófilos humanos quando expostos a AgNPs de 10 e 50 nm (0-100 μg/mL) durante 4h. Verificou-se que, das concentrações testadas, as AgNPs de 50 nm não foram capazes de induzir a produção de espécies reativas pelos neutrófilos. Pelo contrário, ficou claramente demonstrado que as AgNPs de 10 nm ativaram as células resultando na oxidação da sonda DHR. Essa ativação foi dependente da concentração, tendo-se verificado uma maior ativação para a concentração de 100 μg/mL. C on trolo 50 75 100 0 5000 10000 15000 20000 25000 C o n ce n t r a çã o d e A g N P s (g / m l) U n id a d e s a r b itrá r ia s d e flu o r e s c ê n cia A g N P s 5 0 n m A g N P s 1 0 n m ** *** Figura 34: Efeito das AgNPs de 10 e 50 nm (0-100 μg/mL) na produção de espécies reativas pelos neutrófilos humanos. A deteção foi feita após incubação de 4h, recorrendo à sonda DHR (10 μM) Os valores são apresentados como a média ± SEM (n≥3), *p<0,05 e ***p<0,001, comparativamente ao controlo (sem AgNPs). Concentração de AgNPs (μg/mL) 53 4.5 Contribuição da NADPH oxidase na ativação de neutrófilos humanos pelas AgNPs Na Figura 35 estão representados os resultados obtidos no estudo da contribuição da NADPH oxidase na ativação de neutrófilos humanos pelas AgNPs de 10nm. Pela análise do gráfico, verifica-se que o DPI (inibidor da NADPH oxidase) diminui o sinal induzido pelas AgNPs. Note-se que foi estudado o efeito do DPI, na viabilidade celular dos neutrófilos, e não se obteve qualquer alteração das células em contacto com o composto, como tal, a diminuição do sinal deveu-se à inativação da NADPH oxidase. Figura 35: Efeito do DPI na ativação de neutrófilos humanos por AgNPs de 10 nm.. Os valores são apresentados como a média ± SEM (n≥3), ***p<0,001, comparativamente ao controlo (sem AgNPs). C o ncen tração de A gN Ps 10 n m (g /m l) U n id a d e s a r b itr á ria s d e flu o r e s c ê n cia C ontrolo 100 100 +D P I 0 5000 10000 15000 20000 25000 *** Concentração de AgNPs de 10 nm (μg/mL) 54 5.Discussão Com as metodologias utilizadas ficou claramente demonstrado que as AgNPs de 10 e 50 nm induzem toxicidade de neutrófilos humanos, sendo o efeito dependente do tamanho, tempo de exposição e concentração das NPs. As AgNPs têm emergido como uma importante classe de nanomateriais com uma ampla gama de aplicações industriais e médicas, com grande relevância nos produtos de aplicação dérmica, nomeadamente no tratamento de queimaduras. Está descrito na literatura que as AgNPs são capazes de penetrar na pele (167, 168). Sendo assim, é importante saber qual o efeito destas NPs nas células que constituem a primeira linha de defesa do nosso organismo, os neutrófilos. Note-se que há pouca informação sobre o efeito das AgNPs nestas células, sendo por isso este trabalho de enorme relevância para o conhecimento sobre a toxicidade destas NPs. Outra contribuição importante deste trabalho diz respeito à utilização e comparação de vários métodos, rotineiramente utilizados em laboratório, para a avaliação da toxicidade das AgNPs em neutrófilos humanos. As concentrações de AgNPs utilizadas neste estudo estão na gama utilizada por outros estudos in vitro (116, 127, 132). É importante mencionar que não há nenhum estudo que indique a concentração das AgNPs a que os humanos poderão estar expostos (89). No entanto, a investigação relativa aos efeitos citotóxicos das AgNPs é controversa, dado que existem estudos que revelam alta citotoxicidade em concentrações tão baixas quanto 2-5 μg/mL (126, 169, 170), como outros em que praticamente não se verifica toxicidade até à concentração de 100 μg/ mL (131). As AgNPs induzem respostas diferentes dependendo do tipo de células em estudo (127, 171). Kaur e colaboradores observaram toxicidade das AgNPs em células epiteliais humanas de carcinoma A431, em células humanas de carcinoma pulmonar A549 e em macrófagos de murino RAW264.7, respetivamente, numa gama de concentrações de 5 a 100 μg/mL (171). Neste trabalho, iniciou-se o estudo da viabilidade celular dos neutrófilos após exposição às AgNPs (10 e 50 nm) recorrendo ao método do azul tripano, que é um método já bastante descrito na literatura (154), inclusivamente, para avaliar a toxicidade destas e de outras NPs (172-174). Num estudo relativamente recente de Reddy e colaboradores foi avaliada a viabilidade de diferentes linhas celulares após exposição a NPs de carbono e foi utilizado apenas o método de exclusão do azul 55 tripano, por considerarem ser o mais isento de interferências quando se trata de NPs (173). No presente trabalho, com o método de incorporação do azul tripano, verificouse que a viabilidade dos neutrófilos humanos foi dependente do tempo de exposição às AgNPs. Uma exposição de 6h não induziu efeitos, contudo, ao fim de 16h verificouse uma redução estatisticamente significativa da viabilidade celular, que reduziu ainda mais às 24h com ambas as AgNPs. A viabilidade dos neutrófilos também reduziu com o aumento da concentração das AgNPs. Como exemplo, às 16 e 24h a concentração de 100 μg/mL provocou uma redução da viabilidade muito mais acentuada quando comparada com concentrações menores. Este método também revelou que a toxicidade das AgNPs depende do tamanho das mesmas. Ao fim de 16h de exposição, as AgNPs de 10 nm provocaram uma redução significativa da viabilidade (cerca de 50%) apenas com 12,5 μg/mL, comparativamente com as AgNPs de 50 nm que só demonstraram efeitos significativos, mas menos expressivos, com o quadruplo dessa concentração (50 μg/mL). Num estudo com células epiteliais humanas dos brônquios BEAS 2B, realizado por Nymark e colaboradores, também foi verificada dependência do tempo (4 e 48h) e da concentração (2,5 a 240 μg/mL) com o método do azul tripano. No entanto, neste estudo verificou-se redução da viabilidade na concentração mais baixa às 4h (174), enquanto no presente estudo só foi verificada toxicidade com 16h de exposição com concentrações superiores a 12,5 μg/mL. Esta diferença pode ser justificada pela utilização de dois tipos de células diferentes. A variação de tamanho das NPs não parece justificar esta diferença dado que, no estudo de Nymark tratou-se de AgNPs revestidas com PVP com 42,5 ± 14,5 nm de diâmetro, o que está dentro da gama de tamanho do presente estudo (10 e 50 nm). Por outro lado, um estudo realizado igualmente com neutrófilos (89) indica que, para todas as condições testadas (0 a 100 μg/mL) durante 24h não se verificou diminuição da viabilidade com o método do azul tripano com AgNPs de 20 nm não revestidas. O não revestimento com PVP poderá estar na origem da aglomeração das NPs, não permitindo a sua entrada na célula e com a consequente diminuição da toxicidade. Este é um exemplo, que vem de encontro ao já referido anteriormente (secção 2.2.1), de que os revestimentos das NPs são importantes pelo facto de poderem alterar os seus efeitos. O método do PI é semelhante ao azul tripano pois, pela aplicação do PI é possível contar por citometria de fluxo células com a integridade membranar comprometida, sendo indicador de células em necrose (154). Com o método do PI verificou-se que ao fim de 4h, com as concentrações mais altas de 75 e 100 μg/mL de AgNPs de 10 nm 56 houve um aumento da percentagem de células com PI incorporado relativamente ao controlo. Ao fim de 6h, as mesmas NPs originaram diferenças significativas relativamente ao controlo a partir da concentração de 50 μg/mL. As AgNPs de 50 nm, com estes tempos de incubação (4 e 6h), não provocaram efeitos. Após 16h de incubação com as AgNPs de 10 nm, o aumento da percentagem de neutrófilos com PI incorporado foi muito expressivo e quando comparado com a exposição às AgNPs de 50 nm, em que, apesar de se verificar uma tendência de aumento dos níveis de PI, só se obteve significado estatístico para a concentração mais alta de 100 μg/mL (32 ± 6%), sendo mesmo assim, muito inferior quando comparada com as AgNPs de 10 nm na mesma concentração (77 ± 10%). Apesar da semelhança de mecanismo com o azul tripano, o PI revelou resultados mais rápidos e com concentrações menores. As diferenças encontradas entre o método do azul tripano e o do PI podem ser devidas à diferença de massa destas moléculas. O azul tripano tem uma massa de 960 Dalton (176), enquanto o PI tem 668 Dalton (177). Esta diferença de tamanho pode ser suficiente para o PI ser interiorizado mais depressa em caso de perda da integridade da membrana. Outro fator importante é o facto de no método do azul tripano se fazer a contagem ao microscópio ótico e no PI se utilizar a citometria de fluxo, uma metodologia mais sensível e pouco subjetiva. Apesar do azul tripano se tratar de um método rápido, útil e barato (± 0,01 € por amostra), não é suficientemente sensível ou fiável para ser usado, pelo menos como método único, em ensaios de toxicidade in vitro. Outra desvantagem deste método diz respeito ao tempo de execução, que não permite o estudo da viabilidade de muitas amostras ao mesmo tempo, principalmente devido à exigência de a contagem manual das células, não deixando de ser subjetiva (154) O método do PI, para além de nos indicar a diminuição da viabilidade dependente do tempo e da concentração das AgNPs, principalmente com as de 10 nm, indica que a causa de morte celular foi necrótica. A maior parte dos estudos já realizados com outras linhas celulares indicam morte celular por apoptose (114, 120, 122), inclusive um estudo que foi realizado com AgNPs de 20 nm também em neutrófilos humanos (89). No entanto, a causa de morte celular necrótica também foi verificada em outras células imunitárias nomeadamente em linfócitos com AgNPs ≤ 100 nm com o método do PI, ao fim de 3h de exposição, com a concentração de 25 μg/mL. No estudo de Kim e colaboradores foi avaliada a toxicidade de AgNPs de diferentes tamanhos em duas linhas celulares diferentes. Numa linha celular, MC3T3-E1, a causa principal de morte celular foi a apoptose, enquanto na linha celular PC12 foi a necrose (127). 63 16.Mócsai A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med 2013;210(7):1283-1299. 17.Katragkou A. Chatzimoschou A. Simitsopoulou M. Georgiadou E. Roilides E. 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