Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias

Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias Sílvia Daniela Lobo Magalhães Mestrado em Genética Forense Departamento de Biologia 2015 Orientador Doutora Ana Goios, PhD, Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto (IPATIMUP) FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias ii A GRADECIMENTOS Expresso aqui o mais profundo agradecimento a todos aqueles que tornaram a realização deste trabalho possível. Ao Professor Amorim, agradeço a oportunidade que tive em frequentar este mestrado que muito contribuiu para o enriquecimento da minha formação académica e científica. À minha orientadora, Ana Goios, quero agradecer por me ter integrado no seu projeto, por toda a orientação que me deu no desenvolvimento deste trabalho, pelo conhecimento transmitido e ajuda, por todos os esclarecimentos científicos, correções e sugestões. À Sofia M. agradeço a pronta disponibilidade, partilha de conhecimentos e simpatia. Ao Luís, Cíntia, Filipe P. e Filipe C. agradeço as valiosas contribuições para este trabalho. Aos meus Pais e à minha irmã agradeço o apoio incondicional prestado neste percurso. Espero um dia retribuir-vos. Aos meus colegas de mestrado, em especial à Tatiana e Filipa, muito obrigada pela vossa amizade. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias iii R ESUMO A heteroplasmia define-se como a presença de dois ou mais tipos de DNA mitocondrial (mtDNA) num indivíduo. Os níveis heteroplásmicos têm interesse tanto como marcadores genéticos, podendo aumentar o poder de discriminação em análises forenses, como em diagnóstico genético de doenças mitocondriais, já que o fenótipo da doença apenas se torna evidente quando a percentagem de moléculas mutantes existentes excedem um determinado limiar. A sequenciação do genoma mitocondrial completo através do método de Sanger para o estudo de heteroplasmias é dispendiosa, morosa e não é sensível o suficiente para a deteção a níveis inferiores a 15-20%. A Sequenciação Paralela Massiva (MPS) em diversas plataformas, e em particular na plataforma Ion Torrent PGMTM, permite superar grande parte dessas limitações possibilitando uma análise mais sensível do genoma mitocondrial para a identificação das misturas com níveis reduzidos de heteroplasmia, uma vez que são sequenciadas moléculas resultantes da amplificação monoclonal de uma única cadeia modelo, produzindo diversas reads independentes para cada posição. A análise quantitativa das moléculas amplificadas de mtDNA permitiu-nos criar misturas de DNA de dois indivíduos distintos, com haplótipos previamente determinados, simulando heteroplasmias em proporções específicas. Foi utilizada a amplificação do genoma mitocondrial completo por Long-Range PCR (LR-PCR) para se tentar proporcionar uma cobertura uniforme. A análise dos dados de MPS indicou que até ao nível de 5% as variantes podiam ser detetadas e quantificadas com grande precisão (R2= 0,9998). Foi visível a problemática já conhecida da análise de regiões homopoliméricas por MPS. Em todas as proporções das misturas foram detetados falsos positivos o que sugere uma menor especificidade do método, embora a maioria deles surgissem associados a verdadeiras variantes ou regiões homopoliméricas, o que facilita a exclusão destas posições da análise. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias iv A BSTRACT Heteroplasmy is defined by the existence of two or more mitochondrial DNA (mtDNA) types within an individual. Heteroplasmic level is of particular interest as genetic marker, increasing the power of discrimination when applied to forensic cases, and in the genetic diagnosis of mitochondrial disease, since the disease phenotype becomes evident only when the percentage of mutant molecules exceeds a critical threshold value. Sequencing the whole mitochondrial genome searching for heteroplasmy using Sanger methodology is expensive, time-consuming and not sensitive enough to detect levels below 15-20%. Massively Parallel Sequencing (MPS) technology in several platforms, and particularly in the Ion Torrent PGMTM System, overcomes several of these limitations allowing for a more sensitive analysis of the mitochondrial genome for identification of low-level mixtures, since clonal populations of molecules originating from a single template strand are sequenced generating many independent reads for each position. The quantitative analysis of amplified mtDNA molecules allowed us to create mixtures of DNA from two different individuals, with previously determined haplotypes, simulating heteroplasmy in defined proportions. The entire mitochondrial genome amplification by Long-Range PCR (LR-PCR) was used in attempt to provide uniform coverage. Analysis of MPS data indicated that minor variants could be detected and quantified to 5% level with great accuracy (R2=0,9998). We could observe that the well characterized problem of homopolymeric stretches is indeed problematic when performing MPS. False positives were detected at all mixtures ratios suggesting a reduced specificity of the method, although most of them were associated to true variant sites or homopolymeric stretches, which allows for an easied exclusion of these positions from the analysis. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias v P ALAVRAS -C HAVE mtDNA, heteroplasmia, MPS, PGM, sequenciação Sanger, Long-Range PCR K EYWORDS mtDNA, heteroplasmy, MPS, PGM, Sanger sequencing, Long-Range PCR FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias vi Í NDICE Agradecimentos .............................................................................................................. iii Resumo ......................................................................................................................... iiii Abstract ...........................................................................................................................iv Palavras-Chave .............................................................................................................. v Keywords ........................................................................................................................ v Índice ..............................................................................................................................vi Lista de Tabelas ........................................................................................................... viii Lista de Figuras .............................................................................................................. x Abreviaturas .................................................................................................................. xiii 1. Introdução ................................................................................................................. 15 1.1. DNA Mitocondrial ............................................................................................... 16 1.1.1. Origem e estrutura ....................................................................................... 16 1.1.2. Herança materna e ausência de recombinação .......................................... 17 1.1.3. Número de cópias ....................................................................................... 18 1.1.4. Taxa de mutação ......................................................................................... 18 1.1.5. Heteroplasmia ............................................................................................. 19 1.1.6. Aplicações em Genética Forense ................................................................ 19 1.1.7. Aplicações na prática clínica ....................................................................... 21 1.2. Tecnologias utilizadas na sequenciação do mtDNA .......................................... 24 1.2.1. Sequenciação de Sanger ............................................................................ 24 1.2.2. Sequenciação Paralela Massiva ................................................................. 26 2. Objetivos ................................................................................................................... 30 3. Materiais e Métodos ................................................................................................. 32 3.1. Visão global da estratégia experimental e seleção de amostras ....................... 33 3.2. Extração do DNA ............................................................................................... 34 3.3. Amplificação das amostras por PCR/PCR multiplex e sequenciação pelo método de Sanger .................................................................................................................. 35 3.3.1. Amplificação das amostras .......................................................................... 35 3.3.2. Sequenciação do mtDNA pelo método de Sanger ...................................... 37 3.3.3. Visualização e análise das sequências ....................................................... 40 3.4. Amplificação das amostras por Long-Range PCR e sequenciação pela plataforma Ion Torrent PGM ....................................................................................................... 41 3.4.1. Amplificação das amostras por Long-Range PCR ...................................... 41 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias vii 3.4.2. Purificação dos amplificados ....................................................................... 43 3.4.3. Quantificação dos amplificados purificados ................................................ 44 3.4.4. Preparação da biblioteca ............................................................................. 44 3.4.5. Preparação do template .............................................................................. 48 3.4.6. Limpeza e inicialização do PGM ................................................................. 50 3.4.7. Preparação e carregamento do chip ........................................................... 50 3.4.8. Sequenciação no Ion Torrent PGM ............................................................. 51 3.4.9. Análise bioinformática dos resultados ......................................................... 52 4. Resultados ................................................................................................................ 54 4.1. Haplótipos obtidos por sequenciação de Sanger ............................................... 55 4.2. Amplificação por Long-Range PCR ................................................................... 56 4.2.1. Cobertura das amostras de referência ........................................................ 56 4.3. Sequenciação no Ion Torrent PGM .................................................................... 57 4.3.1. Sequenciação das amostras de referência ................................................. 57 4.3.2. Relatório da corrida das amostras com heteroplasmias artificiais .............. 57 4.3.3. Cobertura das amostras com heteroplasmias artificiais .............................. 60 4.4. Deteção e quantificação de variantes ................................................................ 64 4.5. Precisão da quantificação das heteroplasmias .................................................. 68 4.6. Análise das misturas pelo método de Sanger .................................................... 68 5. Discussão ................................................................................................................. 70 5.1. Amplificação por Long-Range PCR ................................................................... 71 5.2 Haplótipos e Haplogrupos das amostras de referência ...................................... 72 5.3. Cobertura ........................................................................................................... 73 5.4. Sensibilidade, especificidade e precisão da quantificação de heteroplasmias .. 75 5.5. Comparação da sensibilidade com o método de Sanger .................................. 77 5.6. Considerações finais .......................................................................................... 79 Referências Bibliográficas ............................................................................................ 80 Anexos .......................................................................................................................... 85 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias viii L ISTA DE T ABELAS Tabela 1 - Proporções das 7 misturas para análise por MPS. ..................................... 33 Tabela 2 - Proporções das 7 misturas para análise pelo método de Sanger. ............. 34 Tabela 3 - Localização da posição de ligação e sequência dos 12 pares de primers utilizados para amplificação da molécula de mtDNA. ................................................... 36 Tabela 4 - Localização da posição de ligação e sequência dos primers utilizados para sequenciar a molécula de mtDNA. ............................................................................... 39 Tabela 5 - Sequência dos primers utilizados para amplificar a molécula de mtDNA. .. 41 Tabela 6 - Haplogrupos das amostras T3, T4 e T5 obtidos com recurso à ferramenta HaploGrep e a precisão dessa atribuição (qualidade), tendo por base os haplótipos completos obtidos pela sequenciação das duas amostras. ......................................... 55 Tabela 7 - Características das reads segundo os diferentes níveis de qualidade de alinhamento. ................................................................................................................. 60 Tabela 8 - Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 1(T4):99(T5). ................................................................................................................. 86 Tabela 9 - Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 5(T4):95(T5). ................................................................................................................. 88 Tabela 10 – Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 10(T4):90(T5). ............................................................................................................... 90 Tabela 11 – Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 50(T4):50(T5). ............................................................................................................... 92 Tabela 12 – Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 90(T4):10(T5). ............................................................................................................... 94 Tabela 13 – Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 95(T4):5(T5). ................................................................................................................. 96 1. I NTRODUÇÃO FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 16 1.1. DNA Mitocondrial 1.1.1. Origem e estrutura As mitocôndrias são organelos presentes em quase todas as células eucarióticas. São constituídas por uma membrana externa e uma membrana interna que possui várias invaginações – cristas mitocondriais - que aumentam a sua área de superfície. No seu interior, encontra-se a matriz mitocondrial onde estão dispersas enzimas, ribossomas, RNA e DNA. A sua principal função é a produção de energia a partir da hidrólise de hidratos de carbono e de ácidos gordos, os quais são convertidos em ATP por um processo designado fosforilação oxidativa (OXPHOS) (Andersson et al., 2003; da Fonseca et al., 2008). A teoria endossimbiótica defende que as mitocôndrias derivam da endocitose de um procarionte ancestral aeróbio por um eucarionte unicelular anaeróbio. Esta relação terá persistido por ser mutuamente benéfica. A célula procariótica proporcionava ao eucarionte a capacidade de realizar a fosforilação oxidativa, permitindo-lhe sobreviver em ambientes diversos, e a célula anaeróbia fornecia nutrientes e proteção ao endossimbionte. Ao longo do tempo, a célula procariótica tornou-se parte integrante da célula hospedeira, culminando com a evolução para células eucarióticas atuais. Esta teoria é suportada por vários argumentos, nomeadamente por as mitocôndrias serem muito semelhantes a alguns procariontes em dimensão e estrutura, e por possuírem DNA próprio, o que lhes confere autonomia relativamente à célula hospedeira por lhes permitir dividir-se independentemente desta (Margulis, 1981). Desde a origem da célula eucariótica até ao DNA mitocondrial (mtDNA) atual de mamíferos, muitos dos genes que constituíam o genoma mitocondrial foram perdidos e/ou transferidos para o DNA nuclear (nDNA). Da mesma forma que estes genes foram transferidos para o núcleo, alguns fragmentos de mtDNA têm sido inseridos nos cromossomas nucleares durante a nossa história evolutiva, sob a forma de pseudogenes (não-codificantes). Algumas destas inserções de mtDNA no genoma nuclear (NUMTs) são remotas no tempo e partilhadas por todos os primatas, enquanto outras são mais recentes, variando mesmo a sua presença ou não entre populações (Ricchetti et al., 2004). O DNA mitocondrial de mamíferos é uma molécula circular de cadeia dupla constituída por 37 genes que codificam duas moléculas de rRNA, 22 moléculas de tRNA e 13 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 17 polipéptidos envolvidos no processo de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e na produção de energia (Andrews et al., 1999). O DNA mitocondrial humano tem cerca de 16569 pares de bases, podendo este comprimento variar devido a mutações de um pequeno número de nucleótidos, que podem ser inserções ou deleções (Anderson et al., 1981; Andrews et al., 1999). A cadeia pesada ou H (heavy) é mais rica em guaninas e a cadeia leve ou L (light) possui mais citosinas na sua composição (Butler, 2012). O mtDNA apresenta uma organização bastante económica: a maioria dos seus genes são contíguos, não possuem intrões e praticamente todo o mRNA é traduzido. Contudo, há uma região não codificante que se estende desde a posição 16024 até à posição 576 – região controlo ou D-loop – que contém os promotores de transcrição e a origem de replicação (Andrews et al., 1999). Esta área também inclui pequenos segmentos que, quando comparados com o resto do genoma, apresentam sequências altamente variáveis – as regiões hipervariáves (HVR): a região hipervariável 1 (HVR1) que corresponde ao segmento entre as posições 16024 e 16365; a região hipervariável 2 (HVR2), que está localizado entre as posições 73 e 340, e a região hipervariável 3 (HVR3) que corresponde à zona entre as posições 438 e 574 (Butler, 2012; Lutz et al., 1997). 1.1.2. Herança materna e ausência de recombinação O mtDNA humano tem transmissão exclusivamente materna (Giles et al., 1980; Taylor et al., 2003). Durante a fecundação, as mitocôndrias paternas ficam retidas na cauda do espermatozoide e o zigoto herda somente as mitocôndrias que se encontram no citoplasma do oócito. Foi sugerido que, caso algumas mitocôndrias paternas conseguissem penetrar no oócito, estas ficariam extremamente diluídas em comparação com as maternas e que seriam marcadas com ubiquitina para posterior degradadação (Sutovsky et al., 2000). Foi apenas reportado um caso de herança mitocondrial paterna (Schwartz & Vissing, 2002). Consequentemente, este genoma não sofre recombinação e é transmitido “em bloco” (haploide). Assim, o mtDNA pode ser herdado intacto através das gerações a não ser que ocorra uma mutação. O haplótipo mitocondrial materno será passado a todos os filhos e filhas no entanto, apenas estas os transmitirão aos seus descendentes. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 18 1.1.3. Número de cópias Uma mitocôndria contém entre 2 a 10 cópias de mtDNA e cada célula pode encerrar entre dezenas a milhares destes organelos (Cavelier et al., 2000). Assim, enquanto a maioria das células apenas possui duas cópias de DNA nuclear, podem conter entre 1000 e 100000 cópias de mtDNA, dependendo do tipo de célula e dos seus requerimentos energéticos (Chinnery & Hudson, 2013). 1.1.4. Taxa de mutação O mtDNA é herdado ao longo das gerações mas, durante esse processo, podem ocorrer mutações que alteram a sua sequência. Muitas dessas mutações são mantidas ao longo do tempo e não apresentam qualquer efeito adverso para o seu portador, aparecendo em pelo menos 1% da população – polimorfismos. Nos polimorfismos do mtDNA destacam-se os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) que surgem quando um par de bases é substituído por outro - mutação pontual. O genoma mitocondrial exibe uma acelerada taxa de mutação que poderá ser cerca de 5 a 10 vezes superior à taxa mutacional média do nDNA (Butler, 2012). A taxa de substituições na região controlo encontra-se entre 5x10-7 e 5x10-6 substituições por posição por ano (Parsons et al., 1997) e para a região codificante 1,26x10-8 substituições por posição por ano (Mishmar et al., 2003). Esta elevada taxa de mutação, em comparação com o nDNA, dever-se-á: • à acumulação de radicais livres, que podem danificar o DNA, resultantes da atividade da mitocôndria; • à ausência de histonas na molécula de mtDNA; • à frequente replicação do mtDNA; • e à inexistência de sistemas eficientes de reparação de DNA (Birky, 2001). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 19 1.1.5. Heteroplasmia A ocorrência de uma nova mutação ou polimorfismo numa determinada molécula de mtDNA leva a que, dentro de uma célula, passe a existir uma mistura de sequências de DNA diferentes, uma condição denominada heteroplasmia (Lightowlers et al., 1997). Quando uma célula heteroplásmica se replica, os dois tipos de moléculas são segregadas de forma aleatória para as células-filhas e o acaso determina a proporção do tipo de DNA em cada uma. Apesar de a maioria das células herdar uma mistura dos dois tipos de DNA, algumas células podem receber apenas um deles – homoplasmia. Assim, um único indivíduo pode ter diferentes tipos de mtDNA num só tecido, ter um tipo de mtDNA num tecido e outro tipo noutro tecido e/ou apresentar heteroplasmia numa amostra de um tecido e homoplasmia em outra amostra do mesmo tecido (Carracedo et al., 2000) ou até mesmo apresentar heteroplasmia numa única mitocôndria (Reiner et al. 2010). As heteroplasmias podem ser heteroplasmias de sequência (ou pontuais) ou heteroplasmias de comprimento. As heteroplasmias de sequência caraterizam-se pela presença de dois nucleótidos diferentes na mesma posição. As heteroplasmias de comprimento ocorrem, normalmente, junto às expansões de citosinas nas regiões homopoliméricas da HVR1 (da posição 16184 até à 16193) e da HVR2 (da posição 303 até à 310) (Parson & Bandelt, 2007; Stewart et al. 2001). Estudos recentes apontam para que quase todos os indivíduos possuam algum estado de heteroplasmia mesmo que em níveis muito reduzidos (Naue et al., 2015; Payne et al., 2013). A incidência de heteroplasmia de sequência em tecidos com elevada atividade metabólica (por exemplo, músculo e fígado) parece ser frequentemente maior do que em tecidos como o sanguíneo, o ósseo e o epitélio bucal (Naue et al., 2015; Ramos et al., 2013). 1.1.6. Aplicações em Genética Forense De uma maneira generalizada, pode-se afirmar que todos os humanos são relacionados por via materna pois descendem todos de um tipo ancestral de mtDNA comum presente na população da África subsariana há cerca de 150000-200000 anos (Wallace et al., 1999). As mutações que se acumularam no genoma mitocondrial desde então, aliadas às diferentes migrações das populações pelo planeta e outras pressões seletivas, são os geradores das diferenças existentes entre indivíduos e populações. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 20 A utilização das regiões variáveis do genoma é útil quando aplicada na identificação humana (Butler, 2012). No entanto, por não sofrer recombinação e ser transmitido por via materna, o mtDNA não permite distinguir um indivíduo dos outros pertencentes à mesma linhagem materna e, assim, possui um poder de discriminação inferior ao do nDNA (Holland & Parsons, 1999). Ainda assim, a herança materna permite o aumento do número de potenciais amostras de referência de um indivíduo, quando amostras deste ou dos seus familiares diretos não são acessíveis para comparação. A amostra de referência poderá, então, provir de qualquer familiar da linhagem materna, mesmo que separado por várias gerações (Budowle et al., 2003). Além disto, a proteção pela dupla membrana da mitocôndria e a forma circular da molécula de DNA, que o torna menos vulnerável à degradação por exonucleases, faz com que a possibilidade de ser recuperado intacto, após um longo período de tempo, seja mais elevada do que o nDNA. Da mesma forma, a pequena molécula e as muitas cópias de mtDNA em cada célula, tornam possível a obtenção de DNA a partir de amostras biológicas muito pequenas, como as encontradas em desastres em massa ou em investigações de pessoas desaparecidas. No início dos anos 90, a análise das HVR ou, por vezes, de toda a região controlo tornouse o método mais comum de análise de mtDNA por serem estas as zonas que apresentam mais variabilidade Atualmente, as análises forenses de rotina do mtDNA ainda consistem exclusivamente na análise da região controlo (Butler, 2012). Apenas depois da passagem do século, surgiram os primeiros estudos que contemplavam a sequenciação completa de genomas mitocondriais de várias populações mundiais de forma a aumentar o poder de discriminação (Ingman et al. 2000; Parsons & Coble 2001). Tendo em conta as técnicas mais utilizadas na maioria dos laboratórios forenses, a presença de heteroplasmia pode complicar a interpretação dos resultados, como veremos mais à frente. Contudo, este fenómeno pode também aumentar o valor de uma identificação quando se encontra a mesma heteroplasmia na amostra de referência e na amostra a testar (Coble et al., 2009). Por outro lado, como já referido anteriormente, amostras provenientes de diferentes tecidos que podem não apresentar o mesmo padrão de heteroplasmia. Quando uma amostra referência apresenta este fenómeno e a amostra teste não apresenta, ou viceversa, gera-se uma dificuldade na interpretação dos resultados. Isto ocorre frequentemente quando a amostra de um local de crime é, por exemplo, cabelo FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 21 (frequência de heteroplasmia de 36.7% a 30.2%) e a amostra colhida ao suspeito é saliva ou sangue (19.8% a 16.2%) (Naue et al., 2015). 1.1.7. Aplicações na prática clínica As doenças mitocondriais são disfunções da cadeia respiratória, de origem genética, que afetam a fosforilação oxidativa. São doenças multissistémicas mas afetam, sobretudo, os tecidos com elevadas necessidades energéticas como o sistema nervoso central, os músculos esqueléticos, o coração, os rins e o sistema endócrino. As citopatias mitocondriais podem ser causadas por alterações nos genes mitocondriais ou nos genes nucleares relacionados com a estrutura e função mitocondrial (Chinnery & Hudson, 2013). As mutações do mtDNA são responsáveis por 5-40% das doenças mitocondriais na idade adulta e até 25% dos casos na criança (Thorburn, 2004a & 2004b). Apesar da maioria das alterações no mtDNA serem polimorfismos neutros (Ingman et al., 2000), a primeira mutação patogénica foi identificada em 1988 (Holt et al., 1988; Wallace et al., 1988). Desde aí, mais de 270 mutações causadoras de doença foram registadas (Lott et al., 2013) e originam um espectro variado de doenças (MacFarland et al., 2007). O modo de transmissão complexo (materno, no caso de mutações no mtDNA, e mendeliano, no caso de mutações no nDNA) e a heterogeneidade clínica das doenças mitocondriais resultam muitas vezes em diagnósticos demorados ou mal concebidos. A prevalência das doenças mitocondriais é, também por isso, difícil de determinar. Estimativas cautelosas apontam para cerca de 1 em 5000/10000 indivíduos afetados (Chinnery et al., 2000; Schaefer et al., 2008; Skladal et al., 2003). Como a penetrância é reduzida, a prevalência nos adultos poderá ser ainda mais elevada. Um estudo afirma mesmo que 1 em cada 200 adultos saudáveis possui uma mutação pontual no mtDNA (Elliott et al., 2008). As mutações de mtDNA podem ser pontuais ou rearranjos do DNA (grandes deleções ou inserções). As mutações pontuais são geralmente herdadas e frequentemente heteroplásmicas (Tuppen et al., 2009). Dada a elevada taxa de mutação do mtDNA e a presença frequente de polimorfismos, a distinção entre mutações neutras ou causadoras de doença pode ser problemática. Os rearranjos de mtDNA são geralmente grandes deleções que variam entre 1,3 a 8 kbs e incluem diversos genes (Schon et al., FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 22 1989). Costumam ocorrer de forma esporádica no início do desenvolvimento e de forma constante em todas as células do mesmo tecido (Chen et al., 1995). 1.1.7.1. Efeito limiar A manifestação clínica de doença mitocondrial e os defeitos a nível bioquímico ocorrem quando a fosforilação oxidativa fica enfraquecida, o que só acontece quando se atinge um número mínimo crítico de moléculas de mtDNA mutado - efeito limiar. Este limiar varia com o tipo de mutação e de tecido, sendo o seu nível mais reduzido nos tecidos com maiores requerimentos energéticos (Tuppen et al., 2009). A expressão clínica de uma heteroplasmia patogénica no mtDNA está diretamente correlacionada com a proporção de mtDNA mutado. Parece ser necessária uma proporção superior a 60% mtDNA mutado para ser observado um fenótipo, variando os níveis acima deste valor de acordo com o tipo de mutação e de tecido afetado (Rossignol et al., 2003). Para o diagnóstico de doenças mitocondriais têm sido utilizados tecidos que possuem um elevado número de mitocôndrias, tal como o músculo esquelético. Uma biópsia deste tecido é o ideal para se detetarem variantes patogénicas que podem não ser detetadas numa amostra comum de sangue através das tecnologias mais comuns num laboratório de diagnósticos. 1.1.7.2. Modo de transmissão e efeito de gargalo mitocondrial A transmissão de doenças mitocondriais entre gerações é bastante complexa devido à interação dos dois genomas, mitocondrial e nuclear, na manifestação de determinado fenótipo. Para além disto, como muitos fatores clínicos dependem da proporção de mtDNA mutado, torna-se difícil estimar a probabilidade de uma mãe que apresente doença mitocondrial ter filhos afetados (Carling et al., 2011; Cree et al., 2008). Alguns estudos apontam para o facto de mães com heteroplasmia pontual terem uma descendência com herança de mtDNA variada. Este fenómeno está associado ao efeito de gargalo mitocondrial. No início da oogénese, há uma redução de moléculas de mtDNA que são distribuídas para cada oócito primordial. À maturação dos oócitos está associada uma rápida replicação do mtDNA. Este evento de restrição seguida de FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 23 amplificação das moléculas de mtDNA pode levar a uma mudança brusca na proporção de moléculas mutadas nas diferentes gerações e é a responsável pelos níveis variados de mtDNA mutado observado nos descendentes afetados de mães com mutações de mtDNA patogénicas (Carling et al., 2011) (figura 1). Consequentemente, a variabilidade na percentagem de moléculas de mtDNA mutadas observadas na descendência de uma progenitora com heteroplasmia provém, pelo menos em parte, da seleção de apenas um subconjunto de mtDNA durante a oogénese. Uma exceção à herança materna mtDNA mutante ocorre quando a progenitora tem heteroplasmia provocada por uma grande deleção no mtDNA. Por razões desconhecidas, as moléculas com remoção de mtDNA, geralmente, não são transmitidas das mães clinicamente afetadas para a sua descendência. Progenitoras não afetadas que tenham um filho com este tipo de mutação têm pouca probabilidade de ter um segundo filho afetado. Já as progenitoras afetadas correm o risco de 1 para 24 (Chinnery et al., 2004). Figura 1 - Representação esquemática do efeito de gargalo mitocondrial. (Adaptado de Taylor & Turnbull., 2005). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 24 1.2. Tecnologias utilizadas na sequenciação do mtDNA A sequenciação permite-nos desvendar a sequências de nucleótidos de determinada molécula de DNA. Diversas técnicas de sequenciação têm sido utilizadas para a deteção de heteroplasmias devido ao crescente interesse no campo da genética forense, principalmente para o aumento do poder de discriminação de haplótipos, e na prática clínica, onde é necessário quantificar a heteroplasmia e pesquisá-la em vários tecidos para poder ser associada a doença. Os primeiros estudos em mtDNA foram efetuados por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Mais tarde, esta técnica foi aliada à PCR (Polymerase Chain Reaction) originando uma técnica simples e conveniente para a deteção de SNPs (Ota et al., 2007). As endonucleases de restrição reconhecem sequências específicas no DNA onde efetuam um corte, originando fragmentos com comprimentos conhecidos. A presença de um polimorfismo, cria ou elimina o local de corte de uma endonuclease de restrição, resultando em fragmentos com comprimentos distintos, detetados num gel sujeito a eletroforese. A deteção de heteroplasmias através desta técnica pode ser afetada por diversos fatores e níveis inferiores a 10% não conseguem mesmo ser detetados (Bai & Wong, 2004). 1.2.1. Sequenciação de Sanger Em 1975, Frederick Sanger e os seus colaboradores, introduziram uma metodologia de sequenciação de DNA baseada no PCR convencional, designada método de terminação de cadeia (Sanger & Coulson, 1975; Sanger et al., 1977). Devido à sua enorme facilidade de execução, este método tornou-se o padrão para a sequenciação entre a comunidade científica durante mais de três décadas. De acordo com esta técnica, o DNA é replicado na presença de didesoxirribonucleótidos (ddNTPs), que não possuem o grupo hidroxilo do carbono 3’ e atuam como inibidores sintéticos que competem com os seus análogos naturais dNTPs. Para que a síntese do DNA ocorra, a DNA polimerase tem que catalisar a reação entre do hidroxilo do nucleótido antecessor e o fosfato do carbono 5’ do nucleótido a ser adicionada à cadeia. Assim, quando um ddNTPs é incorporado numa cadeia a sua extensão é interrompida pois a DNA polimerase não consegue executar a sua função. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 31 O objetivo principal deste estudo foi desenvolver, implementar e validar uma metodologia de sequenciação paralela massiva (MPS) do mtDNA, com análise de heteroplasmias, para aplicação nos campos clínico e de identificação, recorrendo à plataforma Ion Torrent PGM. Os objetivos específicos traçados para este projeto foram:  Desenvolver uma estratégia de Long-Range PCR para a amplificação de amostras de forma a uniformizar o mais possível a cobertura da MPS e permitir a deteção de grandes deleções no mtDNA;  Avaliar a sequenciação do mtDNA humano completo na plataforma Ion Torrent PGM por comparação com os resultados obtidos pela sequenciação de Sanger;  Determinar da sensibilidade, especificidade e precisão na deteção de diferentes níveis de heteroplasmias da plataforma Ion Torrent PGM através da preparação de misturas de amostras de referência de forma a criar heteroplasmias artificiais. 3. M ATERIAIS E M ÉTODOS FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 33 3.1. Visão global da estratégia experimental e seleção de amostras A seleção de amostras para efetuar misturas que simulassem diferentes proporções de heteroplasmias englobou várias fases. Recolheram-se quatro amostras (T2, T3, T4 e T5) de quatro dadores voluntários saudáveis. Inicialmente, todas foram sequenciadas para a região controlo para determinação do haplogrupo, tendo-se obtido as seguintes classificações:  T2: U5b1c;  T3: U4a1;  T4: H2a2a;  T5: L1b1a12. Para as três amostras que apresentavam haplogrupos mais distintos (T3, T4 e T5) efetuou-se a sequenciação por Sanger do genoma mitocondrial completo para determinação do haplótipo. Para essas três amostras foi, igualmente, efetuada a amplificação por Long Range-PCR, testando a estratégia da obtenção de dois fragmentos e a de um de fragmento. Após se verificar que a estratégia de amplificação em um fragmento ocorreu com sucesso, selecionaram-se os amplificados das duas amostras que apresentavam valores de concentração mais elevados (T4 e T5). Estes foram sequenciados por MPS e misturados, depois de normalizadas as suas concentrações, nas proporções indicadas na tabela 1. Os amplificados correspondentes à estratégia de dois fragmentos da amostra T4 foram também sujeitos a MPS de forma a poderem comparar-se as coberturas resultantes. Tabela 1 - Proporções das 7 misturas para análise por MPS. Amostras Proporções (%) T4 1 5 10 50 90 95 99 T5 99 95 90 50 10 5 1 Para comparar a deteção de heteroplasmias pelas duas metodologias de sequenciação também se realizou a mistura das duas amostras para análise pelo método de Sanger. Devido aos custos e período de tempo associados à sequenciação de toda a molécula FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 34 de mtDNA pelo método de terminação de cadeia, optou-se por se analisar somente uma pequena parte da molécula de mtDNA de cada uma das amostras. Depois de amplificadas e quantificadas as concentrações de cada uma das amostras por NanoDrop 2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific) e da normalização das mesmas, misturaram-se ambas de forma a se obter as proporções assinaladas na tabela 2. Tabela 2 - Proporções das 7 misturas para análise pelo método de Sanger. Amostras Proporções (%) T4 5 10 25 50 75 90 95 T5 95 90 75 50 25 10 5 3.2. Extração do DNA Procedeu-se à recolha de saliva de cada um dos respetivos dadores e à extração do respetivo DNA aplicando o protocolo adaptado para saliva do DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen). A 1 ml de saliva adicionaram-se 4 ml de PBS e centrifugou-se a 1800 g durante 5 min. Descartou-se o sobrenadante obtido e ressuspendeu-se o pellet em 180 µl de PBS. Adicionaram-se 25 µl de uma solução com proteinase K, 200 µl de Buffer AL e misturou-se com recurso ao agitador vortex. De seguida, incubou-se a 56ºC durante 10 min. Ao fim desse tempo, adicionaram-se 200 µl de etanol (96-100%) a cada uma das amostras e misturou-se no vortex. Pipetou-se toda a mistura obtida no passo anterior para uma coluna DNeasy Mini colocada sobre um tubo de recolha e centrifugouse a ≥6000 g durante 1 min. Posteriormente, descartou-se o tubo de recolha com o seu conteúdo e colocou-se a coluna sobre um novo tubo de recolha. Adicionaram-se 500 µl de Buffer AW1 e centrifugou-se a ≥6000 g durante 1 min. Descartou-se novamente o tubo de recolha com o seu conteúdo e colocou-se a coluna sobre um novo tubo de recolha. Adicionaram-se 500 µl de Buffer AW2 e centrifugou-se a 20000 g durante 3 min. Descartou-se de novo o tubo de recolha com o seu conteúdo e colocou-se a coluna sobre um eppendorf. Por fim, o DNA foi eluído da coluna com 100 µl de Buffer AE, após incubação à temperatura ambiente durante 1 min e centrifugação a ≥6000 g durante 1 min, e mantido a -20ºC até à sua utilização. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 35 3.3. Amplificação das amostras por PCR/PCR multiplex e sequenciação pelo método de Sanger 3.3.1. Amplificação das amostras - Estratégia para a amplificação da região controlo: Para cada uma das quatro amostras utilizaram-se os pares de primers MTT1 e MTT2 (tabela 3), em reações separadas, para amplificar a região controlo. - Estratégia para a amplificação do mtDNA completo: Para cada amostra (T3, T4 e T5) utilizaram-se 12 pares de primers num PCR multiplex cujos fragmentos resultantes se sobrepõem de modo a garantir a cobertura total da molécula de mtDNA (tabela 3) (Ramos et al., 2009 & 2011). Os 12 pares de primers foram combinados em duas primer mix de forma a poder amplificar-se simultaneamente 6 fragmentos em cada reação. Uma vez que os fragmentos amplificados são sobreponíveis, e de forma a evitar a amplificação de fragmentos mais pequenos que o desejado, os pares de primers foram distribuídos alternadamente pelas duas mix. Assim, na primer mix 1 colocaram-se os pares de primers MTT1, MTT3A, MTT4A, MTT5A, MTT6 e MTT8 e na primer mix 2 os pares de primers MTT2, MTT3B, MTT4B, MTT5B, MTT7 e MTT9. Em cada mix, colocou-se 2 µl de cada primer e completou-se com água desionizada/RNAse free até perfazer 100 µl de volume final, de forma a cada primer ficar a uma concentração de 2 µM. - Estratégia para a amplificação do fragmento para as misturas: Para cada amostra (T4 e T5) utilizou-se o par de primers MTT1 para amplificar um fragmento para ser misturado em diferentes proporções. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 36 Tabela 3 - Localização da posição de ligação e sequência dos 12 pares de primers utilizados para amplificação da molécula de mtDNA. Pares Nome Localização Sequência MTT1 MTT1_F1 14898_F 5’-TAGCCATGCACTACTCACCAGA-3’ MTT1_R1 151_R 5’- GGATGAGGCAGGAATCAAAGAC-3’ MTT2 MTT2_F1 16488_F 5’- CTGTATCCGACATCTGGTTCCT-3’ MTT2_R1 1677_R 5’- GTTTAGCTCAGAGCGGTCAAGT-3’ MTT3A MTT3_F1 1404_F 5’- ACTTAAGGGTCGAAGGTGGATT-3’ MTT3_R3 2801_R 5’- TAATGCAGGTTTGGTAGTTTA-3’ MTT3B MTT3_F3 2646_F 5’- GGTTCAGCTGTCTCTTACTTT-3’ MTT3_R1 3947_R 5’- TCGATGTTGAAGCCTGAGACTA-3’ MTT4A MTT4_F1 3734_F 5’- AAGTCACCCTAGCCATCATTCTA-3’ MTT4_R3 5571_R 5’- AAGTATTGCAACTTACTGAGG-3’ MTT4B MTT4_F4 5468_F 5’- CACGCTACTCCTACCTATCTC-3’ MTT4_R1 6739_R 5’- GATATCATAGCTCAGACCATACC-3’ MTT5A MTT5_F1 6511_F 5’- CTGCTGGCATCACTATACTACTA-3’ MTT5_R3 8000_R 5’- CAACGTCAAGGAGTCGCAGGT-3’ MTT5B MTT5_F3 7713_F 5’- TCCTAACACTCACAACAAAAC-3’ MTT5_R1 9220_R 5’- GATTGGTGGGTCATTATGTGTTG-3’ MTT6 MTT6_F1 8910_F 5’- CTTACCACAAGGCACACCTACA-3’ MTT6_R1 10648_R 5’- GGCACAATATTGGCTAAGAGGG-3’ MTT7 MTT7_F1 10360_F 5’- GTCTGGCCTATGAGTGACTACA-3’ MTT7_R1 12226_R 5’- CAGTTCTTGTGAGCTTTCTCGG-3’ MTT8 MTT8_F1 11977_F 5’- CTCCCTCTACATATTTACCACAAC-3’ MTT8_R1 13830_R 5’- AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGA-3’ MTT9 MTT9_F1 13477_F 5’- GCAGGAATACCTTTCCTCACAG-3’ MTT9_R1 15349_R 5’- GTGCAAGAATAGGAGGTGGAGT-3’ - Amplificação: Para a amplificação, utilizaram-se dois tubos distintos para cada amostra. A cada tubo adicionaram-se 15 µl de água desionizada/RNAse free, 5 µl de par de primer/primer mix e, por fim, 25 µl de Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen). De seguida, foram adicionados 5 µl de DNA da amostra nos dois tubos, perfazendo assim 50 µl de volume de reação. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 37 Para cada corrida de amplificação foi efetuado um controlo negativo que continha a mesma mistura reacional mas sem DNA adicionado. Todos os passos, à exceção da adição do DNA, foram executados numa sala de pré- PCR de forma a evitar contaminações. A amplificação foi executada num termociclador programado com as condições apresentadas na figura 4. A partir da amplificação o procedimento decorreu no laboratório de pós-PCR. Para a deteção dos produtos de PCR, os mesmos foram sujeitos a eletroforese horizontal através de gel de poliacrilamida T9C5. A visualização das bandas foi alcançada pela coloração do gel por nitrato de prata (Budowle et al. 1991). 3.3.2. Sequenciação do mtDNA pelo método de Sanger A partir deste momento, para cada fragmento a ser sequenciado realizaram-se reações independentes. Após a amplificação, os produtos de PCR foram submetidos a uma purificação por Exosap-IT (GE Healthcare) para a remoção dos dNTPs e primers não utilizados na reação de PCR, de modo a evitar que interferissem na reação de sequenciação. Utilizou-se 1 µl de Exosap-IT para cada 1,5 µl de amostra. Esta reação ocorreu num termociclador durante 15 min a 37ºC e seguiu-se um passo para a inativação da enzima durante 15 min a 80ºC. Aos 2,5 µl de amostra já purificada adicionou-se 1 µl de BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems®),1 µl de Buffer (Applied Biosystems®), e 0,5 µl do primer (2 µM) correspondente ao fragmento a sequenciar. De modo a sequenciar a Figura 4 - Condições para a amplificação do mtDNA completo por PCR multiplex. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 38 molécula completa de mtDNA foi utilizada uma estratégia com 31 fragmentos sobreponíveis (tabela 4) (Ramos et al., 2009 & 2011). Todos os fragmentos foram sequenciados no sentido forward (cadeia L) e apenas no sentido reverse (cadeia H) quando, após análise dos resultados, se detetava a falha da sequenciação da primeira estratégia, normalmente, devido à presença de regiões homopoliméricas. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 39 Tabela 4 - Localização da posição de ligação e sequência dos primers utilizados para sequenciar a molécula de mtDNA. Nome Local. Sequência Nome Local. Sequência MTT1_F1 14898_F 5’-TAGCCATGCACTACTCACCAGA-3’ MTT5_F2 7111_F 5’-ACACCCTAGACCAAACCTACG-3’ MTT1_F2 15416_F 5’-TACACAATCAAAGACGCCCTC-3’ MTT5_F3 7713_F 5’-TCCTAACACTCACAACAAAAC-3’ MTT1_F3 15966_F 5’-AGTCTTTAACTCCACCATTAG-3’ MTT5_F4 8311_F 5’-TAGCATTAACCTTTTAAGTTA-3’ MTT1_R1 151_R 5’-GGATGAGGCAGGAATCAAAGAC-3’ MTT5_R1 9220_R 5’-GATTGGTGGGTCATTATGTGTTG-3’ MTT1_R2 16281_R 5’-GTTGGTATCCTAGTGGGTGAG-3’ MTT5_R2 8600_R 5’-AGAATGATCAGTACTGCGGCG-3’ MTT1_R3 15825_R 5’-GTGAAGTATAGTACGGATGCT-3’ MTT5_R3 8000_R 5’-CAACGTCAAGGAGTCGCAGGT-3’ MTT2_F1 16488_F 5’-CTGTATCCGACATCTGGTTCCT-3’ MTT5_R4 7359_R 5’-CTACTATTAGGACTTTTCGCT-3’ MTT2_F2 411_F 5’-CGGTATGCACTTTTAACAGTC-3’ MTT6_F1 8910_F 5’-CTTACCACAAGGCACACCTACA-3’ MTT2_F3 909_F 5’-GATTAACCCAAGTCAATAGAA-3’ MTT6_F2 9393_F 5’-CGAGAAAGCACATACCAAGGC-3’ MTT2_R1 1677_R 5’-GTTTAGCTCAGAGCGGTCAAGT-3’ MTT6_F3 9874_F 5’-TAATATTTCACTTTACATCCA-3’ MTT2_R2 1159_R 5’-TAAGCTGTGGCTCGTAGTGT-3’ MTT6_R1 10648_R 5’-GGCACAATATTGGCTAAGAGGG-3’ MTT2_R3 638_R 5’-GGTGATGTGAGCCCGTCTAAA-3’ MTT6_R2 10154_R 5’-TTCTATGTAGCCGTTGAGTTG-3’ MTT3_F1 1404_F 5’-ACTTAAGGGTCGAAGGTGGATT-3’ MTT6_R3 9647_R 5’-AGCTCAGGTGATTGATACTCC-3’ MTT3_F2 2028_F 5’-GATAGAATCTTAGTTCAACTT-3’ MTT7_F1 10360_F 5’-GTCTGGCCTATGAGTGACTACA-3’ MTT3_F3 2646_F 5’-GGTTCAGCTGTCTCTTACTTT-3’ MTT7_F2 10892_F 5’-ATCAACAACAACCTATTTAGC-3’ MTT3_F4 3239_F 5’-GCAGAGCCCGGTAATCGCATA-3’ MTT7_F3 11461_F 5’-ACTCTTAAAACTAGGCGGCTA-3’ MTT3_R1 3947_R 5’-TCGATGTTGAAGCCTGAGACTA-3’ MTT7_R1 12226_R 5’-CAGTTCTTGTGAGCTTTCTCGG-3’ MTT3_R2 3382_R 5’-TTCGTTCGGTAAGCATTAGGA-3’ MTT7_R2 11673_R 5’-GTTTGGATGAGAATGGCTGTT-3’ MTT3_R3 2801_R 5’-TAATGCAGGTTTGGTAGTTTA-3’ MTT7_R3 11163_R 5’-CGGGTGATGATAGCCAAGGTG-3’ MTT3_R4 2263_R 5’-GGGTGTGAGGAGTTCAGTTAT-3’ MTT8_F1 11977_F 5’-CTCCCTCTACATATTTACCACAAC-3’ MTT4_F1 3734_F 5’-AAGTCACCCTAGCCATCATTCTA-3’ MTT8_F2 12500_F 5’-TGTGCCTAGACCAAGAAGTTA-3’ MTT4_F2 4346_F 5’-GAACCCATCCCTGAGAATCCA-3’ MTT8_F3 12988_F 5’-CTAGCAGCAGCAGGCAAATCA-3’ MTT4_F3 4896_F 5’-TACCAAATCTCTCCCTCACTA-3’ MTT8_R1 13830_R 5’-AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGA-3’ MTT4_F4 5468_F 5’-CACGCTACTCCTACCTATCTC-3’ MTT8_R2 13297_R 5’-GGTTGATGCCGATTGTAACTA-3’ MTT4_F5 5995_F 5’-CAGCTCTAAGCCTCCTTATTC-3’ MTT8_R3 12763_R 5’-CGATGAACAGTTGGAATAGGT-3’ MTT4_R1 6739_R 5’-GATATCATAGCTCAGACCATACC-3’ MTT9_F1 13477_F 5’-GCAGGAATACCTTTCCTCACAG-3’ MTT4_R2 6154_R 5’-GGAACTAGTCAGTTGCCAAAG-3’ MTT9_F2 13950_F 5’-CTATCTAGGCCTTCTTACGAG-3’ MTT4_R3 5571_R 5’-AAGTATTGCAACTTACTGAGG-3’ MTT9_F3 14440_F 5’-ATACTCCTCAATAGCCATCGC-3’ MTT4_R4 5017_R 5’-GAGGAGTATGCTAAGATTTTG-3’ MTT9_R1 15349_R 5’-GTGCAAGAATAGGAGGTGGAGT-3’ MTT4_R5 4421_R 5’-CTTATTTAGCTGACCTTACTT-3’ MTT9_R2 14838_R 5’-CATCATGCGGAGATGTTGGAT-3’ MTT5_F1 6511_F 5’-CTGCTGGCATCACTATACTACTA-3’ MTT9_R3 14325_R 5’-AACTTTAATAGTGTAGGAAGC-3’ A reação de sequenciação foi executada num termociclador que apresentava a programação descrita na figura 5. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 40 No final, os produtos de sequenciação foram submetidos a uma nova purificação de modo a remover os dNTPs não utilizados na reação de sequenciação. Colocaram-se colunas apropriadas em tubos de recolha sobre as quais se pipetaram 750 µl de Sephadex™ G50 (GE Healthcare) e centrifugou-se a 4400 rpm durante 4 min. De seguida, as colunas foram transferidas para eppendorfs e pipetou-se a totalidade das amostras sobre estas colunas. Procedeu-se a uma nova centrifugação a 4400 rpm durante 4 min. A cada tubo eppendorf com amostra purificada adicionaram-se 10 µl de formamida Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems). Por fim, todos os fragmentos foram sujeitos à eletroforese capilar desnaturante nos equipamentos Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 ou Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems®). 3.3.3. Visualização e análise das sequências A visualização dos eletroferogramas obtidos foi realizada com recurso ao software Geneious Pro v.5.5.8 (Biomatters) e SeqScape v.2.5 (Life Technologies) que alinham e comparam as amostras com a sequência de referência do mtDNA – a rCRS (revised Cambridge Reference Sequence) (Andrews et al.,1999). Isto leva à identificação de variantes presentes nas amostras e, consequentemente, aos haplótipos das mesmas utilizando a nomenclatura adotada pela ISFG (International Society for Forensic Genetics) (Carracedo et al., 2000). Figura 5 - Condições para a reação de sequenciação do mtDNA. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 47 - Amplificação da biblioteca: De forma a incrementar o número de fragmentos de tamanho desejado realizou-se uma amplificação por PCR. Para isso, juntaram-se 100 µl de Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Thermo Fisher), 5ul de Library Amplification Primer (Thermo Fisher) e 25 µl da biblioteca preparada anteriormente. Colocou-se no termociclador com a programação descrita na figura 12. - Purificação da biblioteca: A biblioteca amplificada foi purificada através da utilização de Agencourt® AMPure® XP Kit (Beckman Coulter) de modo a remover-se produtos indesejados resultantes do PCR. Adicionou-se um volume de 130 µl da biblioteca amplificada a 195 µl de Agencourt® e misturou-se a solução pipetando up and down. Deixou-se incubar à temperatura ambiente durante 5 min. De seguida, colocaram-se os tubos num suporte magnético durante 3 min (ou até que a solução ficasse limpa). Retirou-se o sobrenadante cuidadosamente, de forma a não perturbar as beads depositadas. Logo a seguir, adicionaram-se 500 µl de etanol (70%) a cada tubo e incubou-se durante 30 seg, rodando duas vezes os tubos no suporte. Retirou-se de novo o sobrenadante e realizouse uma segunda lavagem com etanol, tal como a descrita anteriormente. Retirou-se, novamente, o sobrenadante e, de forma a não ficar etanol residual, realizou-se um spin down na centrífuga. Voltou a colocar-se os tubos no suporte e deixaram-se secar ao ar num período inferior a 5 min. Retiraram-se os tubos do suporte magnético, adicionaramse 20 a 25 µl de LowTE e pipetou-se up and down de forma a ressuspender as beads. Colocou-se no agitador vortex e efetuou-se um spin down na centrífuga. Voltou a colocar-se os tubos no suporte magnético até que a solução ficasse limpa. Por fim, Figura 12 - Condições para a amplificação da biblioteca. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 48 retirou-se (apenas até 20 µl de modo a não perturbar as beads) e guardou-se o sobrenadante. - Quantificação e diluição da biblioteca: Efetuou-se uma quantificação das amostras fragmentadas de igual forma ao processo descrito na secção “Quantificação dos amplificados purificados”. Com base nos valores de concentração obtidos, calculou-se o fator de diluição necessário para obter uma concentração de 0,6 nM. - TDF (Template Dilution Factor) – utilizando uma folha Excel. De acordo com o valor obtido, diluiu-se a biblioteca e agitou-se no vortex. 3.4.5. Preparação do template Neste passo, cada fragmento de DNA irá ficar ligado a uma única ISP (Ion Sphere™ Particle) com adaptador P1. É, ainda, realizada a amplificação clonal, de forma a que cada ISP fique revestida por várias cópias do mesmo fragmento de DNA (figura 13). Ao mesmo tempo, o adaptador X é marcado com biotina para ser possível realizar-se o enriquecimento das ISPs. Durante o enriquecimento, o lado do conjugado ISP-template marcado com biotina vai ligar-se a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina, que vão ser atraídas por um íman. Todas as ISPs sem fragmentos de DNA vão ser removidas por lavagem e as que ISP com amplificados vão ser desnaturadas (figura 14). -PCR de emulsão: Neste passo, realizou-se a amplificação clonal utilizando-se o sistema semi-automático OneTouch™ (Thermo Fisher). Assim, preparou-se a solução de amplificação para um volume total de 900 µl juntando 25 µl de água, 500 µl de Reagent Mix, 300 µl de Reagent B, 50 µl de Enzyme Mix e 25 µl da biblioteca diluída. Agitou-se no vortex e fez-se um spin down. Prepararam-se as ISPs, adicionaram-se 100 µl destas à solução de amplificação preparada anteriormente e agitou-se no vortex. Por fim, carregou-se o filtro do equipamento, de forma lenta e contínua, com 1000 µl de solução de amplificação, de seguida, com 1000 µl de Reaction Oil e, como uma nova ponta, mais 500 µl de Reaction Oil. Inverteu-se o filtro e inseriu-se no aparelho. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 49 No final da corrida, efetuou-se uma centrifugação final de cerca de 10 min. Retiraramse os tubos e, em cada tubo, retirou-se cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1000 µl do lado oposto ao sedimento, deixando apenas cerca de 50 µl no fundo dos tubos. Com uma nova ponta, ressuspendeu-se o sedimento nos 50 µl de cada tubo, pipetando up and down. Transferiram-se as soluções de ambos os tubos para um novo eppendorff. - Enriquecimento do template: Os conjugados ISP-template resultantes do passo anterior foram, então, enriquecidos utilizando o sistema OneTouch™ES no qual se colocou, no início, uma nova ponta e um tubo de recolha de 200 µl contendo 10 µl de Neutralization Solution. Preparou-se a solução Melt-Off juntando 280 µl de Tween com 40 µl de NaOH (1M). Agitou-se no vortex o tubo contendo Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 (Life Technologies) e retiraramse 13 µl para um novo eppendorff. De seguida, colocou-se o eppendorff no suporte magnético durante 2 min, retirou-se cuidadosamente o sobrenadante e adicionaram-se 130 µl de MyOne Beads Wash Solution. Por fim, ressuspendeu-se e agitou-se no vortex a solução. Preencheu-se a strip de 8 poços do Ion OneTouch™ES na seguinte ordem:  Poço 1: todo o volume de template (cerca de 100 µl);  Poço 2: 130 µl das Dynabeads preparadas;  Poços 3 a 5: 300 µl de OneTouch Wash Solution em cada poço; Figura 13 - Esquema representativo do processo do emPCR, No interior de cada bolha podem encontrar-se dispostos ao acaso fragmentos de DNA e ISPs. Após o processo de amplificação podemos obter uma variedade de produtos para além dos desejados (Adaptado de: Inger Jonasson). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 50  Poço 6: mantém-se vazio;  Poço 7: 300 µl da solução Melt-Off preparada;  Poço 8: mantém-se vazio. Colocou-se a strip no equipamento e iniciou-se o aparelho. 3.4.6. Limpeza e inicialização do PGM Antes da inicialização do equipamento Ion Torrent PGM foi realizada uma limpeza do mesmo de acordo com o manual fornecido (Ion PGM™ Hi-Q ™ Sequencing Kit). De seguida, planeou-se a corrida no Torrent Browser. 3.4.7. Preparação e carregamento do chip Após preparação das Control Ion Sphere Particles (para controlo de qualidade), adicionaram-se 5 µl destas ao volume total do template de ISPs enriquecido. Misturouse pipetando up and down e centrifugou-se durante 2 min a 15500 g. De seguida, retirouse cuidadosamente o sobrenadante deixando 15 µl no tubo. Adicionaram-se 12 µl de sequencing primer e confirmou-se o volume final de 27 µl. Misturou-se pipetando up and down. Colocou-se no termocliclador a 95ºC durante 2 min seguido de 37ºC durante 2 min para o annealing do sequencing primer às ISPs. No final adicionaram-se 3 µl de Ion PGM Sequencing Polymerase às ISPs, para um volume final de 30 µl. Pipetou-se up and down e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min. Figura 14 - Esquema representativo do processo de enriquecimento: A) Biotina liga-se ao adaptador X; B) A biotina liga-se às esferas de estreptavidina Dynabeads; C) As Dynabeads são atraídas para um íman e as impurezas são removidas; D) O conjugado ISP-template é desnaturado com NaOH (Adaptado de: ThermoFisher). A D C B FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 51 Posteriormente, testou-se o funcionamento do chip no PGM, segundo as instruções do aparelho. Sem utilizar luvas, retirou-se o chip do PGM e inclinou-se o chip a 45º, com a porta de carregamento para baixo, inseriu-se a pipeta na porta de carregamento e, com a pipeta perpendicular ao chip, removeu-se o máximo possível de líquido. De seguida, colocouse o chip virado para baixo no suporte da centrífuga, com o tab (marcação no chip) apontando para o centro. Centrifugou-se durante 5 seg. A seguir, retirou-se o chip e pousou-se virado para cima no suporte. Aspirou-se todo o volume da amostra e inseriuse a ponta da pipeta na porta de carregamento, com a pipeta na vertical. Inseriu-se, rodando o êmbolo da pipeta, de forma lenta e contínua, as ISPs no chip (deixando um pequeno volume na pipeta no final). Centrifugou-se o chip durante 30 seg. Com a pipeta regulada para o volume total da amostra, inclinou-se o chip a 45º com a porta de carregamento para baixo, e pipetou-se lentamente a amostra para fora e para dentro do chip 3 vezes, sempre de forma lenta e sem aspirar todo o líquido de forma a não criar bolhas. Voltou a centrifugar-se o chip durante 30 seg. Repetiu-se a agitação utilizando a pipeta e voltou-se a centrifugar durante 30 seg. Inclinou-se, novamente, o chip a 45º com a porta de carregamento para baixo, e lentamente aspirou-se o líquido através da porta de carregamento rodando o êmbolo da pipeta. Realizou-se um novo spin na centrífuga e removeu-se algum líquido que ainda permanecia no chip. Cada chip tem inúmeros poços que vão ser preenchidos com uma ISP revestida com DNA amplificado de modo a gerar um sinal suficiente para a deteção da incorporação de cada base durante a sequenciação. Cada poço só pode ser preenchido por uma ISP, caso contrário será eliminado na análise bioinformática, e alguns poderão permanecer vazios. 3.4.8. Sequenciação no Ion Torrent PGM Seguir as instruções no ecrã do PGM, selecionar a corrida planeada e introduzir o chip quando solicitado. Nesta fase, ocorreu a sequenciação por síntese, onde milhões de poços do chip continham apenas um conjugado ISP-template desnaturado. O chip foi sendo impregnado com os diferentes nucleótidos faseadamente. Cada vez que um nucleótido foi inserido numa cadeia em extensão, libertou-se um protão que alterou o pH do poço correspondente e essa alteração foi registada com a informação que o nucleótido foi incorporado. Quando nucleótidos não foram incorporados, não houve FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 52 alteração de pH. Assim, conseguiu obter-se a sequência de forma paralela e massiva de todo o genoma mitocondrial das amostras (figura 3). 3.4.9. Análise bioinformática dos resultados Os resultados obtidos são transmitidos a partir do PGM™ System para o Torrent Suite v.4.4.3 que traduz os resultados em ficheiros BAM (Binary Alignment Map) que podem ser alinhados com a rCRS e visualizados no software Integrative Genomics Viewer v.2.3.55. O plug-in Variant Caller v.4.4.23.-1 foi definido para “Generic – PGM – Somatic – Low Stringency” e com a “Minimum allele frequency” definida para valores superiores a 0,1%. Nos resultados deste plug-in vêm somente as diferenças em relação à rCRS em formato de tabela (anexo I). Esta tabela foi analisada no Microsoft Office Excel onde também se realizou a análise estatística dos dados obtidos. Para a análise da cobertura elaboraram-se gráficos (figuras 19 e 20) recorrendo aos valores referentes à cobertura forward e à cobertura reverse em cada variante reportada para cada mistura. Para análise da frequência das variantes foram elaborados gráficos (figuras 21 e 22) para cada mistura onde se diferenciaram as variantes esperadas (das amostras T4 e T5) dos valores dos falsos positivos. Para facilitar a visualização das amostras correspondentes a cada um dos componentes da mistura, os valores de frequência das variantes da amostra T5 e SNPs comuns entre as duas amostras de referência foram subtraídos ao valor de 100% (rCRS). Nestes gráficos incluiu-se ainda os valores referentes à cobertura alélica para cada posição reportada das variantes comuns e da amostra T5. Esta foi calculada através da subtração do valor da cobertura alélica forward ao valor da cobertura total forward e o mesmo foi feito para os valores da cobertura reverse. Para as variantes da amostra T4 e falsos positivos foram utilizados os valores da cobertura alélica forward e reverse originais. Desta forma, para elaboração dos gráficos, a amostra T5 converteu-se na nossa “referência”. Para análise das frequências observadas das variantes esperadas foi elaborado um gráfico (figura 23) no qual constavam os valores de todas as 7 amostras com mistura. Às variantes esperadas que não foram registadas pelo software, isto é, aos falsos negativos, foram atribuídos os valores de 0%, caso fossem iguais à rCRS, ou de 100%, FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 53 caso diferissem desta. Assim, os valores apontados no gráfico apresentam-se como a proporção da amostra T4 em cada uma das misturas reportadas como diferenças em relação à amostra T5. Para apurar a precisão da deteção das frequências esperadas elaborou-se um gráfico (figura 24) que comparava os valores de frequência observados com os valores esperados das variantes em cada mistura. Da média dos valores das 7 amostras resulta uma linha de regressão que nos dará o valor da correlação entre as duas variáveis. O cálculo do desvio padrão e a sua representação no gráfico permite-nos visualizar a desproporção entre as duas variáveis em cada mistura. 4. R ESULTADOS FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 55 4.1. Haplótipos obtidos por sequenciação de Sanger Os haplótipos obtidos e os haplogrupos definidos com a ajuda da ferramenta online HaploGrep podem ser visualizados na tabela 6. Tabela 6 - Haplogrupos das amostras T3, T4 e T5 obtidos com recurso à ferramenta HaploGrep e a precisão dessa atribuição (qualidade), tendo por base os haplótipos completos obtidos pela sequenciação das duas amostras. Amostra Haplogrupo Qualidade (%) Haplótipo T3 U4a1a1 99,6 73G, 152C, 195C, 263G, 309.1C, 315.1C, 499A, 524.1A, 524.2C, 750G, 961C, 965.1C, 1438G, 1811G, 2706G, 4646C, 4769G, 5999C, 6047G, 7028T, 8818T, 8860G, 11332T, 11467G, 11719A, 11722C, 12308G, 12372A, 12937G, 14620T, 14766T, 15326G, 15693C, 16134T, 16356C, 16519C T4 H13a1a 95,3 263G, 315.1C, 750G, 1438G, 2259T, 4745G, 4769G, 8860G, 12061T, 13680T, 14872T, 15326G T5 L1b1a12a 99,6 73G, 152C, 182T, 185T, 195C, 198T, 247A, 263G, 315.1C, 357G, 523d, 524d, 709A, 710C, 750G, 769A, 825A, 1018A, 1462A, 1738C, 2352C, 2706G, 2758A, 2768G, 2885C, 3308C, 3594T, 3666A, 3693A, 4104G, 4769G, 5036G, 5046A, 5393C, 5655C, 6548T, 6827C, 6989G, 7028T, 7055G, 7146G, 7256T, 7389C, 7521A, 7867T, 8248G, 8468T, 8655T, 8701G, 8860G, 9540C, 10398G, 10688A, 10810C, 10873C, 11002G, 11719A, 12519C, 12705T, 13105G, 13506T, 13650T, 13789C, 13880A, 14178C, 14203G, 14560A, 14766T, 14769G, 15115C, 15326G, 16126C, 16187T, 16189C, 16223T, 16264T, 16270T, 16278T, 16293G, 16311C, 16400T, 16519C FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 56 4.2. Amplificação por Long-Range PCR A estratégia de Long-Range PCR foi utilizada para amplificar o genoma mitocondrial num só fragmento, não sobreponível, através do uso de um par de primers. Os produtos amplificados foram sujeitos a eletroforese num gel de agarose 0,8%. Nas duas amostras foram encontrados fragmentos do tamanho desejado (cerca de 16,5 kbs) (figura 15). 4.2.1. Cobertura das amostras de referência A cobertura das amostras de referência amplificadas por Long-Range PCR, quer num só fragmento ou em dois amplicões sobreponíveis, pode ser visualizada na figura 16. Os resultados das sequenciações efetuadas pelo Ion Torrent PGM analisados pelo software Torrent Suite v.4.4.3 e convertidos em ficheiros BAM que foram visualizados no software Integrative Genomics Viewer. Verificou-se que as coberturas são muito semelhantes com ambas as estratégias. Figura 15 - Verificação da amplificação por Long-Range PCR das amostras T4 e T5 em gel de agarose a 0,8%. Legenda: M – Marcadores de peso molecular; T4 – Amostra T5; T5 – Amostra T5; C- – Controlo negativo. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 63 Figura 20 - Gráficos da cobertura [em número de reads (eixo das ordenadas)] das posições assinaladas como variantes (eixo das abcissas) nas amostras com mistura: A) 50(T4):50(T5); B) 90(T4):10(T5); C) 95(T4):5(T5); D) 99(T4):1(T5). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 64 4.4. Deteção e quantificação de variantes Os haplótipos das duas amostras de referência diferem em 82 posições, sendo outras 6 variantes comuns entre as duas mas distintas da rCRS. Nas figuras 21 e 22, apresentam-se os gráficos individuais de cada uma das 7 amostras correspondentes às diferentes misturas, com o registo das frequências das variantes das duas amostras de referência, da cobertura alélica (forward e reverse) e dos falsos positivos e falsos negativos (em branco). A posição 315.1C, comum às duas amostras de referência, apresentou sempre valores de frequência mais elevados do que as restantes posições comuns, que se mantiveram sempre próximas de 0% (figuras 21 e 22). Foram detetados falsos positivos em todas as 7 amostras, numa média de 7 a 12 posições em cada uma, sempre a níveis inferiores a 5%. O número de falsos positivos surge de modo aleatório nas amostras de diferentes proporções, no entanto, a maioria das posições onde se encontram é detetada de forma recorrente nas diferentes misturas. As posições que surgem mais frequentemente como falsos positivos são: 71, 310, 520, 3290, 6698/6699, 8249, 8860C, 14768, 14770 e 16506. Na figura 23 podemos observar as frequências das 82 variantes representadas como diferenças à amostra T5. Na mistura 1(T4):99(T5) nenhuma das variantes esperadas para a amostra T4 foi registada. Em todas as outras proporções, as mesmas variantes foram sempre detetadas. As variantes da amostra T5 foram quase sempre identificadas com exceção da mistura com a proporção 99(T4):1(T5), onde somente a posição 16159 foi identificada. Nas restantes amostras verificou-se a ausência das posições:  523/524, 16187 e 16189 na mistura com a proporção 90(T4):10(T5);  523/524, 10873, 16189 e da posição 16264 à 16400 na mistura com a proporção 95(T4):5(T5). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 65 Figura 21 - Gráficos da cobertura alélica e frequência [em número de reads e percentagem (eixo das ordenadas esquerdo e direito, respetivamente)] das posições assinaladas como variantes (eixo das abcissas) nas amostras com mistura: A) 1(T4):99(T5); B) 5(T4):95(T5); C) 10(T4):90(T5). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 66 Figura 22 - Gráficos da cobertura alélica e frequência [em número de reads e percentagem (eixo das ordenadas esquerdo e direito, respetivamente)] das posições assinaladas como variantes (eixo das abcissas) nas amostras com mistura: A) 50(T4):50(T5); B) 90(T4):10(T5); C) 95(T4):5(T5); D) 99(T4):1(T5). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 67 Figura 23 - Frequência da heteroplasmias [em percentagem (eixo das ordenadas)] nas posições onde se esperavam serem detetadas variantes (eixo das abcissas) nas 7 amostras com mistura. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 68 4.5. Precisão da quantificação das heteroplasmias Na figura 24 podemos examinar o gráfico correspondente à correlação entre os níveis de heteroplasmia esperados e observados nas 7 amostras, onde se pode confirmar que a quantificação das heteroplasmias é bastante correta e precisa. 4.6. Análise das misturas pelo método de Sanger Na figura 25 podemos observar algumas das variantes detetadas por sequenciação de Sanger, numa pequena zona do fragmento MTT1, das 7 amostras em diferentes proporções. Verifica-se que a mistura só é detetada com clareza, ou seja, claramente distinta do ruído de fundo, a partir das proporções de 25-75% apesar do limite de deteção do software ter sido definido para 5%. Figura 24 - Correlação entre os níveis de heteroplasmia esperados (eixo das abcissas) e observados (eixo das ordenadas). O círculo e a barra de erro representam, respetivamente, a média e o desvio padrão das 82 posições de cada uma das 7 amostras. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 69 Figura 25 - Visualização de algumas heteroplasmias (destacadas a azul) das 7 amostras com mistura analisadas pelo método de Sanger no software SeqScape. 5. D ISCUSSÃO FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 71 5.1. Amplificação por Long-Range PCR A escolha do Long-Range PCR para a amplificação baseou-se em estudos já elaborados por parecer a mais apropriada para o objetivo de detetar/quantificar heteroplasmias por MPS. A estratégia de se utilizarem vários pares de primers para a amplificação do mtDNA (tal como a que utilizamos para a amplificação da molécula de DNA mitocondrial para a sequenciação de Sanger) é eficaz em amplificar toda a molécula. Contudo, e apesar de poder demostrar uma cobertura uniforme em cada fragmento após MPS, entre os diferentes fragmentos a intensidade de cobertura varia de forma brusca e nas zonas de sobreposição desses fragmentos atinge valores extremos de cobertura (Zhang et al., 2012). A estratégia de amplificação por 2 pares de primers cria dois fragmentos sobreponíveis, com cerca de 8,5 kbs de comprimento cada um (Fendt et al., 2009) que também amplificam toda a molécula de mtDNA. Na figura 16, podemos comparar a cobertura obtida por esta estratégia e a alcançada na amplificação num só fragmento, após o LRPCR da amostra T4. Em ambas apenas se observou um padrão ligeiramente assimétrico da cobertura, típico na sequenciação do mtDNA com o sistema Ion Torrent PGM, mas sempre com uma intensidade de cobertura satisfatória em todas as posições da molécula de mtDNA. Embora a intensidade cobertura pudesse ser suficiente para se quantificar devidamente o nível de heteroplasmias, outras complicações podem surgir na estratégia da amplificação em dois fragmentos. A presença de variantes na zona de ligação dos primers ou outras pequenas desigualdades nas condições de reação, podem resultar numa eficiência de PCR desigual entre os dois fragmentos e, por isso, as variantes registadas e a quantificação do nível de heteroplasmias devem ser interpretadas com cautela. A estratégia de amplificação em um só fragmento apresenta ainda duas vantagens adicionais, uma vez que evita a co-amplificação de pseudogenes de mtDNA dispersos no DNA nuclear (Cui et al., 2013) e permite identificar a presença de grandes deleções (Cui et al., 2013) que, por vezes, aparecem associadas a doenças mitocondriais (Chinnery & Hudson, 2013). A estratégia de amplificação do mtDNA num fragmento demonstrou-se eficaz. No gel de verificação da amplificação detetaram-se fragmentos com cerca de 16,5 kbs (figura 15). Caso existissem grandes deleções seriam visualizadas como bandas adicionais, de menor tamanho, no gel tal como se pode observar no exemplo da figura 26. FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 72 A zona de ligação dos primers foi escolhida por ser uma zona muito conservada. No entanto, se houver necessidade de sequenciar a região de alinhamento dos primers ou se por amplificação ineficiente se desconfiar de alterações na zona de ligação dos mesmos deverá recorrer-se a um novo PCR com primers diferentes. 5.2 Haplótipos e Haplogrupos das amostras de referência Os resultados da sequenciação completa do genoma mitocondrial das amostras de referência por MPS foram confrontados com os obtidos por sequenciação de Sanger. De um modo geral, observou-se um elevado nível de concordância das informações obtidas entre ambas as metodologias. As discrepâncias observadas correspondem essencialmente a posições onde ocorrem inserções ou deleções, ou substituições em posições consecutivas, por exemplo: • Na amostra T4, verificou-se que a inserção identificada na posição 311 pela plataforma Ion Torrent PGM correspondia na anotação por Sanger à inserção da posição 315. Esta observação pode ser explicada por estas duas posições se inserirem numa região poli-C no interior da região HVR2, e uma das metodologias reporta a inserção no início do homopolímero enquanto a outra reporta na posição final. Uma elevada taxa de erro na sequenciação de indels nas regiões HVR, por algumas plataformas de MPS foi, também, anteriormente Figura 26 – Imagem de um gel com produtos da amplificação por LR-PCR num só fragmento onde se pode visualizar uma amostra (destacada a azul) com bandas adicionais (A. Goios, comunicação pessoal). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 79 R EFERÊNCIAS B IBLIOGRÁFICAS Anderson, S., Bankier, A.T., Barrell, B.G., de Bruijn, M.H., Coulson, A.R., Drouin, J., et al. (1981). Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 290(5806): 457-65. Andersson, S.G., Karlberg, O., Canback, B. & Kurland, C.G. (2003). On the origin of mitochondria: a genomics perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 358(1429): 165-79. Andrews, R.M., Kubacka, I., Chinnery, P.F., Lightowlers, R.N., Turnbull, D.M. & Howell, N. (1999). Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nature Genetics, 23(2): 147. Bai, R.K. & Wong, L.J. (2004). Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis: a single-step approach. Clinical Chemistry, 50: 996-1001. 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Bias 73 A G 76,6 27333,3 SNP 1378 590 788 1055 590 465 0,5 71 GTATGC TAGCTA 23,4 27333,3 MNP 1378 590 788 323 0 323 0,5 152 T C 100 43533,7 SNP 1977 1333 644 1977 1333 644 0,5 182 C T 98,6 43257 SNP 1999 1339 660 1972 1325 647 0,5023 185 G T 98,6 43082,6 SNP 1991 1356 635 1964 1339 625 0,5008 195 T C 98,3 42971,3 SNP 1999 1358 641 1965 1335 630 0,5001 198 C T 98,6 42916,2 SNP 1983 1333 650 1955 1320 635 0,5034 247 G A 98,2 42689,4 SNP 1991 1194 797 1956 1170 786 0,5016 263 A G 100 44119,3 SNP 1989 1204 785 1989 1204 785 0,5 310 T C 8,1 7864,65 SNP 557 5 552 45 0 45 0,5 311 - C 91,9 7864,65 INS 557 5 552 512 5 507 0,5 357 A G 96,6 12706,1 SNP 655 152 503 633 147 486 0,5002 514 CA - 98,5 12595,9 DEL 620 45 575 611 45 566 0,5039 709 GT AC 98,5 30658,9 MNP 1980 895 1085 1950 885 1065 0,5018 750 A G 100 44109,7 SNP 1990 912 1078 1990 912 1078 0,5 769 G A 98 42669,3 SNP 1997 918 1079 1957 899 1058 0,5003 825 T A 98 42470,4 SNP 1991 988 1003 1951 965 986 0,5016 1018 G A 98,3 42827 SNP 1996 594 1402 1962 588 1374 0,5025 1462 G A 98,2 42842,6 SNP 1999 1036 963 1963 1017 946 0,5002 1738 T C 100 36633,3 SNP 1674 530 1144 1674 530 1144 0,5 2352 T C 97 41553,6 SNP 1978 909 1069 1919 885 1034 0,5016 2706 A G 98,5 43124,9 SNP 1998 1079 919 1969 1061 908 0,5012 2758 G A 98,5 43031,1 SNP 1995 1097 898 1965 1082 883 0,5008 2768 A G 98,4 43096,8 SNP 1999 1070 929 1968 1051 917 0,5012 2885 T C 98,8 43254,9 SNP 1995 977 1018 1971 966 1005 0,5004 3290 T C 1,3 42,96 SNP 1997 785 1212 25 1 24 0,9391 3308 T C 98,8 43439,2 SNP 2000 831 1169 1977 822 1155 0,5003 3594 C T 97 19274,5 SNP 925 170 755 897 169 728 0,5076 3666 G A 97,5 37679,8 SNP 1786 876 910 1741 864 877 0,5058 3693 G A 98,3 42948,9 SNP 1997 1034 963 1964 1021 943 0,5021 4104 A G 98,2 40919,8 SNP 1910 896 1014 1876 880 996 0,5 4769 A G 100 44227,9 SNP 1996 1125 871 1996 1125 871 0,5 5036 A G 97 41920,1 SNP 2000 1007 993 1939 963 976 0,5069 5046 G A 98,2 42902,9 SNP 1998 1010 988 1963 992 971 0,5002 5393 T C 98,6 21418,4 SNP 1020 391 629 1006 387 619 0,5014 5655 T C 98,5 43030,3 SNP 1995 1070 925 1965 1054 911 0,5 6548 C T 98,6 43130,6 SNP 1997 997 1000 1969 979 990 0,502 6698 AG GA 2,5 104,7 MNP 1927 985 942 49 6 43 0,8821 6827 T C 99 43554,1 SNP 2000 1082 918 1979 1075 904 0,5022 6989 A G 98,7 43299,4 SNP 1999 1095 904 1974 1081 893 0,5002 7028 C T 98,5 43158,9 SNP 2000 1131 869 1970 1117 853 0,5015 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 87 7055 A G 98,6 42582,7 SNP 1992 1171 821 1965 1153 812 0,5011 7146 A G 94,7 40076 SNP 1989 1153 836 1884 1058 826 0,5185 7256 C T 91,1 37708,2 SNP 1994 1138 856 1816 971 845 0,5364 7389 T C 98,7 36816 SNP 1709 439 1270 1687 432 1255 0,501 7521 G A 98,5 42563,2 SNP 1993 840 1153 1964 830 1134 0,5012 7867 C T 98 42738,7 SNP 1999 708 1291 1959 691 1268 0,5016 8248 A G 98,9 43113,4 SNP 1993 1146 847 1971 1134 837 0,5003 8468 C T 97,2 21446,9 SNP 1050 99 951 1021 96 925 0,5008 8655 C T 98,2 22893 SNP 1094 203 891 1074 200 874 0,5011 8701 A G 96,4 27501,8 SNP 1343 404 939 1295 396 899 0,5059 8860 A C 3,9 37733,1 SNP 1761 685 1076 68 67 1 0,5 8860 A G 96,1 37733,1 SNP 1761 685 1076 1693 618 1075 0,5 9540 T C 96,9 35550,7 SNP 1706 341 1365 1653 333 1320 0,5024 10398 A G 97,9 42583,9 SNP 1995 919 1076 1954 906 1048 0,503 10688 G A 97,7 33181,1 SNP 1576 563 1013 1540 547 993 0,5022 10810 T C 97,8 34033,5 SNP 1609 828 781 1574 816 758 0,5038 10873 T C 97 19949,5 SNP 929 334 595 901 315 586 0,5108 11002 A G 99 21998,8 SNP 1038 291 747 1028 289 739 0,501 11719 G A 98,5 43113,7 SNP 1998 1259 739 1968 1242 726 0,501 12519 T C 98,7 41509,1 SNP 1919 817 1102 1894 807 1087 0,5003 12705 C T 98,7 44339 SNP 1976 994 982 1950 981 969 0,5 13105 A G 98,6 43212 SNP 1999 852 1147 1971 840 1131 0,5 13506 C T 98,8 43157,1 SNP 1990 971 1019 1966 956 1010 0,5017 13650 C T 98,6 21413,3 SNP 996 119 877 982 117 865 0,5008 13789 T C 98,2 21220,3 SNP 990 124 866 972 120 852 0,5041 13880 C A 97,8 27449,6 SNP 1313 519 794 1284 506 778 0,5013 14178 T C 100 21795,6 SNP 1017 388 629 1017 388 629 0,5 14203 A G 98,8 21335,8 SNP 1012 397 615 1000 394 606 0,5018 14560 G A 98,6 12442,2 SNP 588 7 581 580 7 573 0,5035 14766 C T 98 10282,1 SNP 499 22 477 489 20 469 0,5196 14768 A T 5,4 161,44 SNP 515 22 493 28 5 23 0,8296 14769 A G 92 9534,28 SNP 511 23 488 470 16 454 0,5722 14770 C G 5,5 161,79 SNP 511 23 488 28 7 21 0,876 15115 T C 99 43483 SNP 2000 1027 973 1979 1018 961 0,5009 15326 A G 100 44145 SNP 1992 610 1382 1992 610 1382 0,5 16126 T C 98,7 43217,3 SNP 1996 1010 986 1970 1001 969 0,5021 16187 C T 90,4 19371 SNP 1062 48 1014 960 21 939 0,6791 16189 T C 95,4 18730,1 SNP 1062 57 1005 1013 39 974 0,5862 16223 C T 98 25762,2 SNP 1229 163 1066 1205 159 1046 0,5015 16264 C T 97,4 29336,3 SNP 1418 50 1368 1381 47 1334 0,5092 16270 C T 96,4 30830,9 SNP 1507 125 1382 1452 111 1341 0,5222 16278 C T 96,7 33596,4 SNP 1621 217 1404 1567 209 1358 0,5011 16293 A G 95 37209,1 SNP 1864 418 1446 1770 358 1412 0,5327 16304 T A 3,1 245,52 SNP 1995 503 1492 62 15 47 0,5137 16311 T C 97,6 42460,4 SNP 1999 569 1430 1952 553 1399 0,5017 16400 C T 91 37836,1 SNP 1997 876 1121 1818 743 1075 0,5307 16506 T C 4,3 416,27 SNP 1997 984 1013 85 44 41 0,5249 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 88 16519 T C 100 43437,4 SNP 1972 1113 859 1972 1113 859 0,5 Tabela 9 – Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 5(T4):95(T5). Position Ref Variant Freq. Quality Type Cov. Cov+ Cov- Al. Cov Al. Cov+ Al. Cov- S. Bias 73 A G 77 27092 SNP 1441 671 770 1109 645 464 0,5026 71 GTATGC TAGCTA 19,7 27092 MNP 1441 671 770 284 1 283 0,96 152 T C 95 40499,1 SNP 1998 1392 606 1898 1332 566 0,5061 182 C T 94,5 40216,8 SNP 1999 1353 646 1890 1290 600 0,5065 185 G T 94,4 40119,5 SNP 1999 1374 625 1887 1313 574 0,5099 195 T C 94,8 40377,5 SNP 1999 1359 640 1895 1294 601 0,5035 198 C T 94,7 40134,3 SNP 1992 1354 638 1886 1297 589 0,5092 247 G A 92,3 38585,9 SNP 1997 1228 769 1843 1143 700 0,5056 263 A G 100 44113,5 SNP 1987 1242 745 1987 1242 745 0,5 310 T C 4,8 6089,59 SNP 440 6 434 21 0 21 0,5 311 - C 93,4 6089,59 INS 440 6 434 411 5 406 0,5 357 A G 89,3 8264,38 SNP 488 119 369 436 105 331 0,5041 358 A G 6,8 214,99 SNP 502 122 380 34 28 6 0,9355 514 CA - 94,6 9322,48 DEL 497 51 446 470 46 424 0,5131 709 GT AC 93,8 27881,6 MNP 1982 869 1113 1859 818 1041 0,5016 750 A G 100 44154 SNP 1993 912 1081 1993 912 1081 0,5 769 G A 93,7 39623,7 SNP 2000 943 1057 1874 881 993 0,5014 825 T A 91,5 37913,8 SNP 1990 953 1037 1820 872 948 0,5002 1018 G A 93,8 39597,8 SNP 1995 700 1295 1871 649 1222 0,5044 1438 A G 7,3 1032,8 SNP 1999 1013 986 145 69 76 0,5309 1462 G A 93,9 39605,5 SNP 1993 1026 967 1871 963 908 0,5001 1738 T C 94,6 29619,3 SNP 1495 470 1025 1414 449 965 0,5037 2259 C T 6,5 869,04 SNP 1999 808 1191 130 67 63 0,6105 2352 T C 91,6 38059,6 SNP 1989 929 1060 1822 846 976 0,5028 2706 A G 94,3 40088,2 SNP 1999 1061 938 1886 995 891 0,5032 2758 G A 93,8 39622 SNP 1998 1057 941 1874 995 879 0,5019 2768 A G 94,4 40147,6 SNP 2000 1094 906 1888 1033 855 0,5001 2885 T C 94 39810,3 SNP 1998 930 1068 1878 879 999 0,5026 3168 C T 2,1 69,75 SNP 1978 999 979 42 36 6 0,8545 3290 T C 1 28,72 SNP 1650 716 934 17 2 15 0,8514 3308 T C 93,9 34395,9 SNP 1738 801 937 1632 752 880 0,5001 3594 C T 93,5 13360,6 SNP 692 166 526 647 156 491 0,5017 3666 G A 94,1 27501,5 SNP 1396 755 641 1314 718 596 0,5056 3693 G A 95,1 37301 SNP 1843 1005 838 1753 959 794 0,5018 4104 A G 94,2 26735,8 SNP 1358 695 663 1279 646 633 0,5067 4745 A G 6 773,38 SNP 2000 1078 922 121 69 52 0,5316 4769 A G 100 44301,5 SNP 1996 1099 897 1996 1099 897 0,5 5036 A G 93,2 35688,9 SNP 1822 992 830 1699 910 789 0,5089 5046 G A 94,6 35006,5 SNP 1749 952 797 1654 896 758 0,5026 5393 T C 95,4 15268,4 SNP 756 264 492 721 250 471 0,5027 5655 T C 94,7 40167,7 SNP 1993 1110 883 1887 1053 834 0,5011 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 95 1738 T C 8,6 1061,18 SNP 1611 460 1151 138 40 98 0,5053 2259 C T 92,4 38716,5 SNP 1995 925 1070 1844 873 971 0,5098 2352 T C 7,4 1055,26 SNP 1998 1125 873 147 71 76 0,5797 2706 A G 9,5 1564,74 SNP 2000 1030 970 190 103 87 0,5272 2758 G A 9,7 1619,03 SNP 1998 1003 995 194 102 92 0,5238 2768 A G 9 1430,04 SNP 1998 1031 967 179 88 91 0,5244 2885 T C 10 1690,97 SNP 1998 904 1094 200 95 105 0,5227 3290 T C 0 12,57 SNP 1967 932 1035 0 0 0 0,5 3308 T C 8,4 1308,39 SNP 2000 976 1024 169 84 85 0,509 3594 C T 8,6 512,28 SNP 766 146 620 66 17 49 0,5957 3666 G A 8,8 1024,64 SNP 1502 716 786 132 77 55 0,6058 3693 G A 8,7 1288,38 SNP 1875 964 911 164 98 66 0,5839 4104 A G 8,6 1158,24 SNP 1750 814 936 150 74 76 0,5282 4745 A G 91,8 38365,7 SNP 2000 1122 878 1835 1032 803 0,5014 4769 A G 100 44006,7 SNP 1991 1126 865 1991 1126 865 0,5 5036 A G 9,2 1482,19 SNP 1997 1211 786 184 102 82 0,5533 5046 G A 9,1 1431,39 SNP 1958 1180 778 178 101 77 0,5362 5393 T C 10,3 780,55 SNP 885 352 533 91 30 61 0,5732 5655 T C 9,1 1453,61 SNP 2000 1082 918 181 94 87 0,5217 6548 C T 11,1 1974,35 SNP 1992 1053 939 222 116 106 0,5061 6827 T C 9,6 1571,26 SNP 2000 1138 862 191 107 84 0,5089 6989 A G 9,7 1604,05 SNP 1998 1149 849 193 103 90 0,5418 7028 C T 8,6 1332,93 SNP 2000 1189 811 171 110 61 0,5516 7055 A G 8,1 1174,62 SNP 1974 1219 755 159 93 66 0,534 7146 A G 9,3 1506,42 SNP 1999 1171 828 186 102 84 0,538 7256 C T 8,3 1265,71 SNP 1998 1101 897 166 81 85 0,5629 7389 T C 8,1 993,11 SNP 1647 380 1267 133 36 97 0,5531 7521 G A 9,6 1593,27 SNP 1993 860 1133 192 101 91 0,5939 7867 C T 9,9 1622,8 SNP 1943 558 1385 193 66 127 0,5633 8248 A G 9,4 1508,8 SNP 1997 1117 880 187 113 74 0,5461 8249 G C 0,9 22,06 SNP 1986 1095 891 17 9 8 0,5221 8468 C T 9,4 751,42 SNP 965 124 841 91 9 82 0,5732 8655 C T 9,3 687,27 SNP 901 160 741 84 19 65 0,5751 8701 A G 8,6 735,8 SNP 1127 398 729 97 35 62 0,5084 8860 A C 3,6 32228 SNP 1510 650 860 54 49 5 0,5 8860 A G 96,4 32228 SNP 1510 650 860 1456 601 855 0,5 9531 AC CA 6,3 98,41 MNP 1347 338 1009 85 3 82 0,9014 9540 T C 9,7 1180,45 SNP 1505 400 1105 146 25 121 0,6366 10398 A G 8,3 1285,43 SNP 2000 990 1010 167 88 79 0,5319 10688 G A 8,6 1086,7 SNP 1648 541 1107 141 39 102 0,561 10810 T C 8 868,99 SNP 1481 772 709 118 55 63 0,555 10873 T C 6,9 454,11 SNP 954 441 513 66 21 45 0,6481 11002 A G 9,6 757,99 SNP 948 269 679 91 34 57 0,6009 11719 G A 8,9 1405,41 SNP 1999 1225 774 177 119 58 0,5645 12061 C T 84,7 33576,2 SNP 1988 1194 794 1683 974 709 0,5226 12519 T C 9,6 1359,68 SNP 1735 775 960 166 79 87 0,5294 12705 C T 8,7 1357,1 SNP 1990 973 1017 174 76 98 0,5523 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 96 13046 - C 14,1 1886,9 INS 1585 885 700 224 209 15 0,9168 13105 A G 10,2 1459,1 SNP 1702 917 785 173 82 91 0,5645 13506 C T 10,5 1496,33 SNP 1670 892 778 175 95 80 0,5088 13650 C T 10,4 639,48 SNP 729 23 706 76 8 68 0,7831 13680 C T 91,2 14172 SNP 753 65 688 687 64 623 0,5209 13789 T C 8,3 602,41 SNP 936 152 784 78 9 69 0,5978 13880 C A 7,5 710,61 SNP 1351 634 717 101 44 57 0,5339 14178 T C 10,9 789,52 SNP 824 298 526 90 43 47 0,6175 14203 A G 10,8 748,76 SNP 798 306 492 86 40 46 0,583 14560 G A 9,7 433,3 SNP 554 9 545 54 0 54 0,9996 14766 C T 6 183,67 SNP 499 31 468 30 0 30 0,9994 14769 A G 5,2 139,37 SNP 481 29 452 25 0 25 0,9992 14872 C T 90,2 37139,9 SNP 1992 714 1278 1796 641 1155 0,5017 15115 T C 9,1 1470,45 SNP 1993 1085 908 182 99 83 0,5005 15326 A G 100 38556 SNP 1754 551 1203 1754 551 1203 0,5 16126 T C 9,7 1602,09 SNP 2000 1112 888 193 86 107 0,6091 16223 C T 13,4 978,99 SNP 764 126 638 102 9 93 0,6711 16264 C T 6,6 858,23 SNP 1910 72 1838 127 5 122 0,5113 16270 C T 6,7 901,3 SNP 1983 153 1830 133 13 120 0,5644 16278 C T 6,6 891,36 SNP 1995 277 1718 132 26 106 0,6034 16293 A G 5,5 647,92 SNP 1938 613 1325 107 24 83 0,6154 16311 T C 5 557,93 SNP 1995 653 1342 99 31 68 0,5163 16400 C T 3,4 282,46 SNP 1999 833 1166 67 29 38 0,5165 16519 T C 21,3 5003,5 SNP 1993 1225 768 425 216 209 0,6068 Tabela 13 – Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 95(T4):5(T5). Position Ref Variant Freq. Quality Type Cov. Cov+ Cov- Al. Cov Al. Cov+ Al. Cov- S. Bias 73 A G 6,2 783,24 SNP 1982 1001 981 122 49 73 0,6032 152 T C 5 557,42 SNP 1997 1165 832 99 65 34 0,5772 182 C T 4,8 528,31 SNP 1998 1157 841 96 63 33 0,5812 185 G T 5 566,65 SNP 1999 1192 807 100 69 31 0,6011 195 T C 5 556,92 SNP 2000 1190 810 99 63 36 0,5436 198 C T 4,8 527,35 SNP 1995 1183 812 96 63 33 0,5672 247 G A 4,1 403,56 SNP 1997 1126 871 82 54 28 0,5987 263 A G 100 43977,6 SNP 1985 1148 837 1985 1148 837 0,5 316 G C 0,9 8204,09 SNP 867 11 856 8 0 8 0,5 311 - C 99,1 8204,09 INS 867 11 856 859 11 848 0,5 357 A G 3,3 140,11 SNP 965 198 767 32 12 20 0,6991 520 C A 8,6 596,79 SNP 887 130 757 76 20 56 0,6753 709 GT AC 4,2 54,74 MNP 1990 910 1080 83 46 37 0,596 750 A G 100 43940,3 SNP 1987 956 1031 1987 956 1031 0,5 769 G A 4,3 447,52 SNP 2000 1013 987 87 53 34 0,603 825 T A 4,6 493,73 SNP 1991 1009 982 92 40 52 0,5719 1018 G A 4,3 441,41 SNP 1994 686 1308 86 30 56 0,5053 1438 A G 94,7 40295,2 SNP 2000 993 1007 1893 936 957 0,502 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 97 1462 G A 5 561,43 SNP 1998 1057 941 100 58 42 0,5514 1738 T C 4,4 437,63 SNP 1950 625 1325 85 24 61 0,5452 2259 C T 94,8 40329 SNP 1996 977 1019 1893 929 964 0,5013 2352 T C 4,5 470,09 SNP 1994 1113 881 90 47 43 0,5361 2706 A G 4,5 474,59 SNP 1998 1084 914 90 48 42 0,5093 2758 G A 4,9 532,07 SNP 1997 1063 934 97 54 43 0,5246 2768 A G 4,2 430,02 SNP 2000 1094 906 85 51 34 0,554 2885 T C 5,1 578,39 SNP 1996 930 1066 101 57 44 0,5976 3168 C T 4 287,32 SNP 1963 1025 938 78 72 6 0,9164 3290 T C 1,4 41,18 SNP 1998 938 1060 28 2 26 0,9197 3308 T C 4 393,69 SNP 2000 967 1033 81 38 43 0,5144 3594 C T 3,9 167,02 SNP 862 187 675 34 8 26 0,5262 3666 G A 4,4 408,36 SNP 1789 901 888 79 41 38 0,5154 3693 G A 4,3 435,36 SNP 1996 1060 936 86 42 44 0,5426 4104 A G 3,9 370,34 SNP 1998 1006 992 78 44 34 0,5606 4745 A G 95,7 41029,3 SNP 1999 1187 812 1913 1147 766 0,506 4769 A G 100 44242 SNP 1995 1175 820 1995 1175 820 0,5 5036 A G 5,5 656,46 SNP 1997 1224 773 109 64 45 0,5268 5046 G A 5,4 645,24 SNP 1992 1212 780 108 59 49 0,5634 5393 T C 5,5 378,92 SNP 1164 482 682 64 24 40 0,5408 5655 T C 5,4 633,73 SNP 1998 1054 944 107 65 42 0,5809 6548 C T 6,5 870,06 SNP 1995 1019 976 130 65 65 0,5108 6827 T C 3,6 313,81 SNP 1997 1114 883 71 39 32 0,5086 6989 A G 5,3 614,42 SNP 1999 1153 846 105 54 51 0,5628 7028 C T 5,3 623,98 SNP 2000 1186 814 106 48 58 0,6377 7055 A G 4,8 523,14 SNP 1982 1177 805 95 40 55 0,6678 7146 A G 5,7 688,36 SNP 1999 1217 782 113 66 47 0,5257 7256 C T 4,3 431,39 SNP 1999 1155 844 86 52 34 0,5278 7389 T C 4,7 510,49 SNP 2000 491 1509 94 33 61 0,6244 7521 G A 4,1 404,37 SNP 1996 845 1151 82 30 52 0,5599 7867 C T 5,4 643,58 SNP 1999 572 1427 108 41 67 0,6042 8248 A G 4,3 448,11 SNP 1991 1068 923 86 61 25 0,6783 8249 G C 0,8 18,96 SNP 1994 1069 925 15 6 9 0,634 8468 C T 5,3 353,26 SNP 1155 196 959 61 7 54 0,6119 8655 C T 6,1 427,96 SNP 1121 234 887 68 23 45 0,6595 8701 A G 5,9 502,1 SNP 1364 467 897 81 32 49 0,5564 8860 A C 3,6 38620,2 SNP 1799 774 1025 65 61 4 0,5 8860 A G 96,4 38620,2 SNP 1799 774 1025 1734 713 1021 0,5 9540 T C 4,9 500,15 SNP 1852 525 1327 90 17 73 0,6294 10398 A G 5,6 673,31 SNP 1999 950 1049 111 58 53 0,5472 10688 G A 4,2 413,01 SNP 1999 752 1247 83 34 49 0,535 10810 T C 4,6 460,63 SNP 1856 1069 787 86 49 37 0,5063 11002 A G 4 224,16 SNP 1150 402 748 46 20 26 0,5887 11719 G A 5 557,34 SNP 1999 1221 778 99 61 38 0,5056 12061 C T 89,8 36756,1 SNP 1987 1246 741 1785 1081 704 0,5227 12519 T C 5,3 614,65 SNP 1998 955 1043 105 56 49 0,5552 12705 C T 4,9 535,37 SNP 1984 1089 895 97 54 43 0,5079 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 98 13046 - C 15 2616,99 INS 1945 1070 875 292 275 17 0,9297 13105 A G 5,2 614,23 SNP 2000 1077 923 105 53 52 0,5338 13506 C T 3,9 371,9 SNP 1992 1070 922 78 39 39 0,5371 13650 C T 5 257,8 SNP 898 20 878 45 4 41 0,8107 13680 C T 95 18744,1 SNP 926 64 862 880 62 818 0,5052 13789 T C 4,9 323,55 SNP 1215 238 977 59 13 46 0,5371 13880 C A 4,1 330,58 SNP 1632 767 865 67 34 33 0,5374 14178 T C 4,4 222,98 SNP 949 362 587 42 21 21 0,6185 14203 A G 4,8 246,95 SNP 920 376 544 44 23 21 0,613 14560 G A 4,6 146,81 SNP 613 44 569 28 1 27 0,676 14766 C T 4,7 139,38 SNP 555 41 514 26 1 25 0,6659 14769 A G 4,1 106,8 SNP 539 38 501 22 2 20 0,5686 14872 C T 95,3 40709 SNP 1998 691 1307 1905 653 1252 0,5034 15115 T C 4,4 448,06 SNP 1997 1129 868 87 44 43 0,5597 15326 A G 100 43973,7 SNP 1985 711 1274 1985 711 1274 0,5 16126 T C 5,7 693,36 SNP 1998 1150 848 113 71 42 0,5549 16187 C T 4,1 227,26 SNP 1086 289 797 45 2 43 0,8861 16223 C T 6,4 403,36 SNP 934 170 764 60 10 50 0,5266 16519 T C 13,3 2569,31 SNP 1993 1303 690 266 147 119 0,6045 Tabela 14 – Tabela parcial dos resultados do plug-in Variant Caller da mistura 99(T4):1(T5). Position Ref Variant Freq. Quality Type Cov. Cov+ Cov- Al. Cov Al. Cov+ Al. Cov- S. Bias 263 A G 100 44224 SNP 1993 1058 935 1993 1058 935 0,5 310 T C 8,2 18227,1 SNP 1390 4 1386 114 0 114 0,5 311 - C 91,4 18227,1 INS 1390 4 1386 1271 4 1267 0,5 520 C A 9,8 965,4 SNP 1217 158 1059 119 5 114 0,7728 525 C G 4,6 291,98 SNP 1190 149 1041 55 1 54 0,8852 750 A G 100 43766 SNP 1982 961 1021 1982 961 1021 0,5 1438 A G 98,7 43281,5 SNP 2000 1034 966 1973 1019 954 0,5005 2259 C T 98,4 43021,4 SNP 1999 891 1108 1967 878 1089 0,5007 3290 T C 1,2 32,62 SNP 1997 820 1177 24 1 23 0,9408 4745 A G 100 43651,6 SNP 1982 1169 813 1982 1169 813 0,5 4769 A G 100 44450,2 SNP 1998 1198 800 1998 1198 800 0,5 7816 C T 0 6,26 SNP 1991 948 1043 0 0 0 0,5 8249 G C 0,7 15,22 SNP 1989 1045 944 14 7 7 0,5254 8860 A C 3,3 43163,9 SNP 1996 816 1180 66 64 2 0,5 8860 A G 96,7 43163,9 SNP 1996 816 1180 1930 752 1178 0,5 12061 C T 93,5 39059,9 SNP 1982 1172 810 1853 1052 801 0,5242 13046 - C 12,2 1928,83 INS 1943 1060 883 237 225 12 0,9398 13680 C T 98,8 27814 SNP 1302 61 1241 1287 57 1230 0,5147 14153 T C 4 136,67 SNP 1328 392 936 53 47 6 0,9491 14872 C T 98 42618,7 SNP 1999 669 1330 1959 658 1301 0,5014 15326 A G 100 43978,5 SNP 1989 592 1397 1989 592 1397 0,5 16519 T C 3,3 267,49 SNP 1997 1323 674 65 35 30 0,6272 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 99 II. Cobertura das 7 amostras com mistura A B C D E F G Figura 27 - Gráficos da cobertura (eixo das ordenadas) de todas as posições dos nucleótidos ao longo da molécula de mtDNA (eixo das abcissas) nas 7 amostras com mistura visualizadas no software IGV: A) 1(T4):99(T5); B) 5(T4):95(T5); C) 10(T4):90(T5); D) 50(T4):50(T5); E) 90(T4):10(T5); F) 95(T4):5(T5); G) 99(T4):1(T5). FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 100 III. Ata de congresso da apresentação oral no “26th Congress of the International Society for Forensic Genetics” realizado em Cracóvia, Polónia de 31 de agosto a 5 de setembro de 2015 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 102 FCUP Sequenciação completa do mtDNA por MPS e avaliação da deteção de heteroplasmias 103