Análise da expressão de micrornas em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcionogénese induzida por HPV

Isabel Paiva de Castro ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE MICRORNAS EM MURGANHOS TRANSGÉNICOS K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Oncologia submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador – Professor Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva Categoria – Professor Associado com Agregação Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto/ Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do IPO-Porto Co-orientador - Doutor Rui Miguel Gil da Costa Oliveira Categoria – Investigador de Pós-Doutoramento Afiliação – Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto/ Grupo de Patologia e Terapêutica Experimental do IPO-Porto II INFORMAÇÃO TÉCNICA TÍTULO: Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Oncologia, Especialização em Oncologia Molecular, submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto AUTOR: Isabel Paiva de Castro DATA: Setembro de 2014 E-MAIL: [email protected] I Prefácio O presente estudo foi realizado no Grupo de Oncologia Molecular do IPO-Porto com a colaboração do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, do Departamento de Ciências Veterinárias da Universidade e Trás-os-Montes e Alto Douro e do Laboratório de Engenharia de Processos, Ambiente, Tecnologia e Ambiente da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto. Os resultados obtidos foram apresentados em formato de poster no IV Congresso Nacional de Virologia em Lisboa (Outubro de 2013) e no ESVP/ECVP/ESTP Cutting Edge Veterinary Pathology Meeting em Berlim (Agosto de 2014) e foram também submetidos para publicação: Paiva I, Gil da Costa RM, Ribeiro J, Sousa H, Bastos MM, Faustino-Rocha A, Lopes C, Oliveira PA, Medeiros R. A role for microRNA-155 expression in microenvironment associated to HPV-induced carcinogenesis in K14-HPV16 transgenic mice. Submetido PloS One. Paiva I, Gil da Costa RM, Ribeiro J, Sousa H, Bastos MM, Faustino-Rocha A, Lopes C, Oliveira PA, Medeiros R MicroRNA-21 expression and susceptibility to HPV-induced carcinogenesis – role of microenvironment in K14-HPV16 mice model. Submetido LifeSciences. II III AGRADECIMENTOS A realização desta dissertação não seria possível sem a colaboração, apoio e entusiamo de várias pessoas. Portanto, o meu obrigado a todos os que tornaram tudo isto numa realidade! Primeiramente, agradeço à minha família, principalmente aos meus pais, avó e ao Ricardo por todo o apoio e carinho incondicional, e por sempre me dizerem que com esforço e dedicação tudo se consegue! Ao Professor Rui Medeiros, pela incrível oportunidade de poder estagiar neste grupo, por toda o conhecimento transmitido e por toda a confiança que depositou em mim, Obrigada pela oportunidade e pelas horas dedicadas a este projeto! Ao Doutor Gil, o meu grande obrigada pela disponibilidade, pela motivação que sempre me transmitiu, pelo espirito crítico que sempre me incutiu e pela dedicação com que sempre me presenteou. À Professora Luisa Villa por me ter iniciado na área do HPV e por me ter despertado o interesse em continuar a investigação nesta área. À Joana por toda a amizade, por todo o conhecimento transmitido, pelo apoio na resolução de problemas, pela enorme paciência, pelas suas sugestões sempre pertinentes e por todos os momentos de diversão e de profissionalismo. Aos elementos de Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do IPO-Porto e do Departamento de Ciências Veterinárias da UTAD, um obrigada por todo o apoio! Agradeço especialmente à Tixa, à Chica, à Mara e à Rita pela incrível amizade, por todos os momentos de gargalhadas e conversas aleatórias. Aos meus colegas de Mestrado pela amizade e bons momentos partilhados, principalmente aos “Sacaninhas da Presidente”. Às minhas colegas de casa, um enorme obrigada pela amizade, pela grande paciência, e por todos os momentos de palhaçadas e de conversas sérias (e menos sérias). À Renata, à Cepa ao Pedro e ao Hélder por toda a amizade, por todos os incríveis momentos de diversão, de confidências e por todos os momentos partilhados. Aos meus quatro fiéis amigos de quatro patas! Um enorme obrigada a todos por tornarem isto possível! IV V ABREVIATURAS A AGO - proteínas argonautas APC - célula apresentadora de antigénio B BCL2 - fator anti-apoptótico do linfoma de células B BPV – papillomavirus bovino C CD – cluster differentiation CDK - ciclina depende de cinase CER – região early completa CFS - chromosomal fragile site CIN - cervical intraepithelial neoplasia CIS - carcinoma in situ Ct - cycle threshold CTLA - cytotoxic T-lymphocyte-associated protein D DGCR - DiGeorge critical region DNA – ácido desoxirribonucleico dNTPs - deoxynucleotide Triphosphates E E - early E6AP - ubiquitin-protein ligase EBV – vírus Epstein-Barr F FOXP3 - forkhead box P3 VI H HDAC - histona desacetilase HIF - fator induzido por hipoxia HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana HLA - antigénio leucocitário humano HNSCC - carcinoma de células pavimentosas de cabeça e pescoço HPV - Papilomavírus Humano HR - alto risco HSIL - lesão intraepitelial de alto grau hTERT – transcriptase reversa da telomerase humana I I3C - índole-3-carbinol IFN - interferão Il - interleucina IRF - fator regulador do interferão K K14 - citoqueratina 14 L L - late LCR - Long Control Region LR – baixo risco LSIL - lesão intraepitelial de baixo grau M MBG- Mouse-β-globina MDSCs - células supressoras derivadas de células mieloides MHC - complexo principal de histocompatibilidade miRNA - microRNA MMP - metaloproteinase de matriz VII mRNA – RNA mensageiro N NF- κB - fator nuclear κB NK - natural killer O ORF - open reading frame P Pb – pares de base PCR – reação em cadeia da polimerase PDCD - programmed cell death PD-L - programmed death-ligand PV - papilomavírus Q qRT-PCR – RT-PCR em tempo real R Ran - RAs-related Nuclear protein RB - retinoblastoma RISC - complexo de indução do silenciamento de RNA RNA – ácido ribonucleico RSV - Vírus do Sarcoma de Rous RT – transcrição reversa S snoRNA - small nucleolar RNA T TAMs - macrófagos associados ao tumor TAP - transportador associado ao processamento de antigénios XIV XV RESUMO XVI XVII O papilomavírus humano (HPV) é o principal agente etiológico do carcinoma do colo do útero. Além disso, tem sido associado a uma grande percentagem de carcinomas anogenitais, orofaringe e cavidade oral. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe de RNAs não-codificantes que regulam a expressão de genes associados à proliferação, diferenciação, sobrevivência e apoptose. Estudos prévios sugerem que alguns miRNAs, como o miR-155 e o miR-21, desempenham um papel importante na carcinogénese. No entanto, existem poucas evidências sobre o papel desempenhado por estes microRNAs em neoplasias associadas ao HPV. Neste estudo foram utilizados murganhos transgénicos K14-HPV16 que expressam os genes da região early (E2-E8) do HPV16 nas células basais dos epitélios queratinizados, tornando-se assim um modelo representativo de neoplasias associadas ao HPV. Pretendia-se, neste estudo, avaliar os padrões de expressão do miR-155 e do miR-21 em amostras de pele destes murganhos e avaliar as suas implicações para o processo carcinogénico associado ao HPV. Para o estudo de cada miRNA, utilizaram-se dois grupos de murganhos nascidos em datas diferentes. Para definir, genotipicamente, os animais wild-type e os HPV16+/-, realizouse, primeiramente, a genotipagem dos murganhos através da amplificação de fragmentos do genes HPV16-E6 e E2 por PCR convencional a partir de amostras de cauda. Posteriormente avaliou-se, histologicamente, amostras de pele da orelha e peito de cada murganho para definir o tipo de lesão presente. A partir do mesmo tipo de amostra, realizou-se a análise de expressão do miR-155 e do miR-21 utilizando a técnica de RTPCR em tempo real. Nos dois grupos de murganhos verificou-se que cerca de 50% destes apresentavam genótipo positivo para HPV16. Este genótipo foi totalmente coincidente com a presença de lesões fenotipicamente características de infeção por HPV. Em ambos os grupos, verificou-se que todas as amostras de pele de orelha dos animais transgénicos apresentavam carcinoma in situ enquanto as amostras de peito apresentavam apenas hiperplasia epidérmica. Observou-se, nos animais wild-type, que a expressão do miR-155 e do miR-21 foi significativamente inferior nos tecidos de orelha comparativamente com os tecidos de peito (p = 0,028 e p = 0,036, respetivamente). Além disso, observou-se que em amostras de pele de peito (com hiperplasia), a expressão do miR-155 foi significativamente inferior quando comparada com a pele normal de peito dos murganhos wild-type (p = 0,026). Entre os animais transgénicos a expressão do miR-21 foi inferior em tecidos que apresentavam carcinoma in situ em comparação com os que apresentavam apenas hiperplasia (p = 0,043). Estes resultados sugerem que, apesar das funções já conhecidas do miR-155 e do miR-21 em vários tipos de cancro, as suas propriedades relacionadas com a imunomodulação e interação com vias de sinalização celular, poderão estar relacionadas com a indução de um microambiente menos favorável para a carcinogénese induzida por HPV. XVIII XIX ABSTRACT XX XXI Human papillomavirus (HPV) is the major etiological agent of cervical cancer. HPV has also been associated with others neoplasias, including anogenital and oropharynx carcinomas. MicroRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs that regulate the expression of genes associated with the proliferation, differentiation, survival, and apoptosis. Previous studies suggested that some miRNAs, such as miR-155 and miR-21 plays an important role in carcinogenesis. However, the role of these microRNAs in HPV- associated cancers remains unclear. In this study, we used K14-HPV16 transgenic mice expressing early genes (E2-E8) of HPV16 in the basal cells of keratinized epithelia, thus becoming a representative model of cancer associated with HPV. The aim of this study was to verify the expression of miR-155 and miR-21 in skin samples from these mice and evaluate their implications for the carcinogenic process associated with HPV. To evaluate the levels of each miRNA, we used two groups of mice born in different dates. To determine, genotypically, the wild-type and HPV16 +/- mice, firstly, we genotype each mice by amplification of fragments of HPV16-E6 and E2 genes by standard PCR from samples of tail. Subsequently we evaluated, histologically, skin samples of the ear and chest of each mouse to define the type of associated lesion. From the same type of sample, we analyzed the expression of miR-155 and miR-21 by RT qPCR. In both groups of mice it was found that about 50% of these were positive for HPV16. This genotype was fully coincident with the presence of phenotypic characteristic lesions of HPV infection. In both groups, it was found that all of the ear skin samples of transgenic animals presented carcinoma in situ while the chest samples presented only epidermal hyperplasia. It was observed that in wild-type animals the expression of miR-155 and miR-21 was significantly lower in ear tissues when compared with chest tissue (p = 0.028 and p = 0.036, respectively). Furthermore, it was found that in samples of chest skin (hyperplasia), the expression of miR-155 was significantly lower when compared with normal chest skin of wild-type mice (p = 0.026). Among the transgenic animals, we observed a decreased expression of miR-21 in carcinoma in situ when compared with hyperplasia tissues (p = 0.043). Despite the acknowledged functions of miR-155 and miR-21 in various cancers, further studies are needed to clarify its contribution of theses miRNAs in immunomodulation, and its interaction with cell signaling pathways. However, our results suggested that it might be related to the induction of a microenvironment less favorable for HPV-induced carcinogenesis. XXII Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 1 CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 8 replicação e a transcrição do vírus [37-40]. A região late ocupa cerca de 40% do genoma do HPV e abrange as ORFs L1 e L2. A região LCR contém cerca de 850 pb, situa-se entre a região early e late, e não tem função codificante de proteína, no entanto, contém a origem da replicação, bem como locais de ligação para fatores de transcrição, importantes na regulação da transcrição iniciada pela RNA polimerase II dos promotores da região early e late [29]. Assim, a região LCR torna-se necessária para a replicação do vírus e para o controlo da expressão genética. Todas as ORFs do HPV estão localizadas em apenas uma das cadeias de DNA, isto é, todos os genes estão localizados nesta cadeia [41] e estudos anteriores demonstram que apenas uma das cadeias serve de molde para a síntese do mRNA [42]. Quando está na forma epissomal, o DNA do HPV apresenta-se na forma circular, no entanto, o DNA de alguns tipos de HPV, tem a capacidade de integrar-se no genoma do hospedeiro, obtendo a forma linear. A integração parece ser crucial no processo de carcinogénese, visto que durante esta etapa ocorre uma rutura na região E1-E2, o que compromete o controlo genético que E2 exerce nos oncogenes E6 e E7 [43]. 1.3.4 Proteínas As proteínas do HPV apresentam funções estruturais e não estruturais, representadas pelas proteínas early (E) e late (L), respetivamente. Os genes E1/E2 codificam proteínas responsáveis pelo controlo das funções dos genes E6 e E7; a função da proteína codificada pelo gene E4 ainda não é bem definida, no entanto há possibilidade de esta estar relacionada com os mecanismos de replicação viral [44, 45]; o gene E5 codifica uma proteína hidrofóbica associada à diminuição da expressão do antigénio leucocitário humano 1 (HLA-1) e ao aumento da imortalização celular [46]; o gene E6 codifica a oncoproteína E6 que está relacionada com a inibição de reguladores negativos do ciclo celular, especialmente através da inativação funcional da p53, proteína codificada por um gene supressor tumoral; o gene E7 codifica uma proteína viral que se liga à proteína do retinoblastoma (pRb), proteína supressora tumoral, permitindo, assim, que a célula continue o ciclo celular na ausência de sinais mitogénicos normais [47]. A expressão das proteínas do HPV é vigorosamente regulada e dependente da diferenciação celular. As proteínas E são expressas precocemente no ciclo de replicação do HPV, enquanto as proteínas L são expressas nos estadios mais tardios, ou seja, nas células mais diferenciadas do epitélio, onde ocorre a formação dos viriões [48]. Assim, as proteínas L1 e L2 estão relacionadas com a função viral tardia e com a formação completa das partículas virais. (Tabela 1) Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 9 Tabela 1 Proteínas early e late do HPV e respetiva função. Proteínas do HPV Função E1 Replicação do genoma viral E2 Transcrição, replicação e manutenção do genoma viral E4 Replicação viral (?) E5 Imortalização e inibição da apoptose (?) E6 Proliferação, imortalização e inibição da apoptose Manutenção do genoma viral E7 Reativação de mecanismos de proliferação celular Proliferação, instabilidade genómica e inibição da apoptose Manutenção do genoma viral L1 Proteína Major da cápside L2 Proteína Minor da cápside 1.3.5 Ciclo de replicação do HPV O ciclo viral do HPV é dependente da diferenciação das células do epitélio estratificado e o resultado da infeção depende da camada celular onde esta ocorre. Quando são infetadas células presentes nas camadas superiores do epitélio, não ocorrem consequências clínicas relevantes, visto que estas células são descamadas rapidamente do epitélio [49-51]. As células da camada basal são o alvo dos viriões de HPV para iniciação do ciclo viral completo [51, 52]. Quando a infeção ocorre nestas células, a expressão das oncoproteínas do HPV impede a diferenciação e promove uma elevada instabilidade genómica que está na base da progressão para transformação maligna [51, 53, 54]. Após a internalização do vírus, que parece ocorrer por endocitose através de vesículas revestidas por clatrina, há o desnudamento do virião no interior da célula, permitindo o transporte do DNA viral para o núcleo. Após a infeção e o desnudamento, o genoma do HPV é estabilizado na forma de DNA epissomal [55]. A transcrição do genoma viral é regulada por elementos presentes na região reguladora a montante da ORF E6. Esta é responsável pela codificação das proteínas E6, E7, E1, e E2 [55]. Nesta fase, as proteínas virais impossibilitam a saída das células do ciclo celular permitindo assim que ocorra a produção de novo genoma viral [56]. Através da divisão de cada célula da camada basal, ocorre multiplicação dos epissomas do HPV e são distribuídos equitativamente pelas duas células filhas. Uma destas células inicia o processo de Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 10 diferenciação e maturação, enquanto a outra permanece não diferenciada na camada basal, sendo utilizada como um reservatório de DNA [57, 58]. Para finalizar a síntese viral, o genoma viral codifica as duas proteínas estruturais, L1 e L2, responsáveis pela formação da cápside, que são expressas na camada suprabasal altamente diferenciada. Desse modo, são formadas as partículas virais, que são libertadas apenas quando as células infetadas alcançam a superfície do epitélio [59]. Após a amplificação, os genomas virais são empacotados dentro das cápsides compostas por L1 e L2, formando o virião que será sujeito a maturação, antes de ser libertado da célula [60]. 1.3.6 Mecanismo de carcinogénese A etapa essencial para a progressão maligna é a integração do DNA do HPV no genoma da célula hospedeira [61]. Este processo de integração tem impacto na transformação celular, na manutenção do fenótipo transformado e/ou na progressão maligna. Esta ocorre em locais aleatórios, no entanto, ocorre com mais frequência em CFS (chromosomal fragile site), locais de elevada instabilidade genómica. Esses locais são loci específicos no cromossoma que apresentam lacunas em resposta a determinados agentes químicos. A integração implica a linearização do genoma viral e a ativação de vias de reparação do DNA. Após a integração há rutura e perda de material genético do vírus, incluindo a rutura do gene E2. Como consequência deixa de haver uma regulação negativa na expressão das oncoproteínas virais E6 e E7 levando à imortalidade das células infetadas e impedindo a diferenciação das células epiteliais [43]. A oncoproteína E6 do HPV de alto risco é suficiente para induzir e manter a transformação celular [53, 62-64]. Esta proteína está localizada tanto no núcleo como no citoplasma dos queratinócitos infetados, e a sua função melhor definida é a sua capacidade de alterar a regulação do ciclo celular através da interação com a p53 [55]. A E6 interage com a p53, proteína supressora tumoral, e induz a sua degradação pela via ubiquitina-proteassoma [65-68]. A proteína p53 atua na paragem do ciclo celular, na ativação da reparação do DNA e na regulação da apoptose, evitando que células alteradas geneticamente progridam no ciclo celular [69, 70]. Este processo de degradação da p53 pela proteína E6 ocorre através de um complexo trimérico contendo E6, uma proteína associada a E6 (E6AP) e a p53 [71]. E6AP atua como ubiquitina ligase que ubiquitina a p53 e a induz para degradação pelo proteassoma. No entanto, estudos posteriores demostram que E6 poderá degradar a proteína p53 na ausência de E6AP [72]. A proteína E6 inativa, também, a p73, uma proteína homóloga à p53 [73]. A Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 11 inativação da p53 compromete a integridade do DNA replicado, provocando danos no mesmo [74] e promovendo instabilidade cromossómica [75]. Estas alterações estão relacionadas com o aumento da proliferação celular e com o desenvolvimento de neoplasias [76, 77]. Outra função relacionada com a proteína E6 é o aumento do tamanho dos telómeros das células epiteliais através da ativação da subunidade catalítica da enzima telomerase (hTERT) [78]. A atividade desta enzima está presenta na maioria das células neoplásicas e encontra-se ausente na grande parte das células somáticas normais [79], indicando que a ativação da hTERT é uma etapa importante no processo de carcinogénese através da imortalização e transformação celular. A oncoproteína E7 liga-se à pRb e inativa a sua função ao impedir a ligação da pRb ao fator de transcrição E2F [80]. A pRb atua como supressor tumoral, regulando negativamente a atividade de diversos fatores de transcrição, incluindo os membros da família E2F. Com base na estrutura primária esta proteína viral, que pode ser divida em três domínios (as regiões conservadas 1-3, CR1-3, CR2), contém um domínio LXCXE envolvido na ligação à pRb e as suas proteínas relacionadas p107 e p130. Estas três proteínas estão profundamente envolvidas na regulação do ciclo celular. A pRb é inativa quando hipofosforilada e liga-se a E2F para impedir a entrada na fase S do ciclo celular. Numa situação normal de regulação do ciclo celular a hipofosforilação da pRb é efetuada pela ciclina D1/ ciclina depende de cinase (CDK) 4 e pelo complexo ciclina E/CDK2, originando a disrupção do complexo pRb/E2F, induzindo a entrada na fase S. No entanto, a oncoproteína E7 do HPV liga-se às proteínas p107 e p130 da pRB hipofosforilada, impedindo a sua interação com E2F. Assim, ocorre a ativação de fatores de transcrição E2F que, por sua vez, ativam a transcrição de um grupo de genes que codificam proteínas essenciais na progressão do ciclo celular, contribuindo assim para uma proliferação celular descontrolada [80, 81]. A proteína E7 parece também induzir a degradação de pRb através da via mediada por ubiquitina-proteossoma [82]. Além da interação com a pRb, a E7 interage com várias proteínas, incluindo a histona desacetilase (HDAC). Esta ligação, induz a transcrição de E2F [83] promovendo a proliferação celular. Também, E7 liga-se à CDK2/ciclina A e CDK2/ciclina E ativando essas cinases que irão fosforilar pRb e induzir a transcrição de genes da fase S [84]. Desta forma, a proteína E7 parece ser a proteína early mais eficiente na desregulação do ciclo celular [81]. Em apenas uma pequena percentagem dos casos, os HR-HPV podem, inicialmente, provocar uma alteração no ciclo celular dos queratinócitos que poderá ser evidenciada morfologicamente por transformações citológicas denominadas por “lesões intraepiteliais Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 12 pavimentosas de baixo grau” (LSIL), também classificadas como CIN1. Embora haja regressão de aproximadamente 30% das HSIL, há uma ativação contínua da proliferação celular mediada pela oncoproteína E7, acoplada por um aumento da instabilidade cromossómica impulsionada pela oncoproteína E6 [85]. Cerca de 20% de CIN1 irão progredir para CIN2 e 30% destas lesões irão progredir para CIN3, que, em 40% dos casos, irão evoluir para carcinoma invasivo [86]. As lesões do tipo CIN2-3 afetam cerca de 2/3 a 3/3 do epitélio e apresentam uma fase de proliferação celular mais extensa induzida, principalmente, pelas alterações nos níveis de expressão das proteínas virais E6 e E7 que ocorrem após a integração do genoma do HPV no genoma da célula hospedeira [85]. (Figura 2) Figura 2 O HPV infeta as células da membrana basal através de micro-ruturas no epitélio do colo do útero. Após infeção, os genes early E1, E2, E4, E5, E6 e E7 são expressos e o DNA viral replica-se de forma epissomal (núcleo roxo). Nas camadas superiores do epitélio (média e superficial) o genoma viral replica-se e são expressos os genes late L1 e L2, e E4. As proteínas L1 e L2 permitem a formação da cápside viral para a criação de novos viriões. O virião pode assim iniciar uma nova infeção. A progressão para carcinoma invasivo está associada à integração do genoma do HPV no DNA hospedeiro (núcleo vermelho), juntamente com a perda ou disrupção de E2 e consequentemente sobre-expressão dos oncogenes E6 e E7. (Adaptado) [87] Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 13 1.3.7 Resposta imunitária e inflamação na carcinogénese induzida por HPV A probabilidade da infeção por HPV se tornar persistente e assim promover o desenvolvimento de carcinoma invasivo estará relacionada com a combinação entre o genótipo do próprio vírus e o estado imunológico do hospedeiro. Mecanismos de evasão ao sistema imunitário pelo HPV resultam na alteração da resposta inata e adaptativa, incluindo a expressão de citocinas, processamento e apresentação de antigénios. A capacidade de replicação do HPV é altamente dependente do programa de diferenciação dos queratinócitos. Desta forma, o vírus raramente é detetado sistemicamente e em outros tipos de células para além das células epiteliais pavimentosas, minimizando assim a exposição dos antigénios virais para as células do sistema imunitário. As proteínas early do HPV são expressas em níveis baixos e apenas na camada epitelial basal, onde as células têm a capacidade de proliferar, assegurando assim a replicação do vírus, juntamente com a renovação do epitélio. Por outro lado, as proteínas late do HPV, que são os mais imunogénicas, são somente expressas nas camadas queratizantes, onde as células apresentadoras de antigénios (APCs) não são muito abundantes, favorecendo a propagação do vírus [88]. Ao contrário de outros vírus, o HPV não lisa as células epiteliais e, como resultado, as APCs não podem ingerir os viriões e apresentar os antigénios às células do sistema imunitário. Além disso, a proteína E7 do HPV16 é expressa nos núcleos dos queratinócitos onde se torna inacessível para as APCs. Também apresentam padrões comuns a proteínas humanas para evitar o reconhecimento do antigénio [15]. Estudos recentes também têm mostrado que, o HPV tem a capacidade de diminuir a expressão do interferão-β (IFN-β) nos queratinócitos. Tem sido observado que a proteína E6 consegue interagir como fator regulador do interferão 3 (IRF-3) diminuindo a expressão do IFN-β [89]. Por sua vez, E7 bloqueia a expressão dos genes induzíveis pelo IFN-α [90]. As proteínas early do HPV também afetam a resposta imune adaptativa: as proteínas E5, E6 e E7 do HPV induzem a diminuição da apresentação e do processamento de antigénios através da inibição da expressão do transportador associado ao processamento de antigénios (TAP) e à diminuição das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) [91]. Doentes que apresentam neoplasias associadas ao HPV e que apresentam um perfil de citocinas T helper 1 (Th1) exibem um melhor resultado clínico comparativamente com os doentes que apresentam um perfil Th2 [92]. A progressão para cancro do colo do útero está associada a uma mudança indesejável das citocinas do tipo Th1 para Th2 Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 14 induzida por dois epítopos derivados da E7 e por um aumento da expressão de interleucina-10 (Il-10) [93, 94]. Por outro lado, a presença de forkhead box P3 (FOXP3) e células T reguladoras (Tregs) está associada a uma pior sobrevivência em vários tipos de cancro, incluindo o cancro do colo do útero. Além disso, um valor baixo do rácio CD8+/Tregs está fortemente associado a um mau prognóstico [95]. Foram identificadas Tregs específicas para os antigénios E6 e E7 em infiltrados linfocitários de HSIL e de carcinomas do colo do útero. Estudos em modelos animais demonstraram que a depleção de Tregs induz uma resposta imune antitumoral [96]. Vários estudos relacionaram o aumento do infiltrado celular inflamatório com as lesões de alto grau associadas ao HPV. A contribuição específica de cada uma das populações de células presentes no ambiente tumoral, particularmente, os macrófagos associados ao tumor (TAMS) e as células mieloides imaturas, no desenvolvimento da neoplasia é uma questão ainda em debate [97-99]. Além disso, a resposta inflamatória poderá contribuir para a progressão das lesões associadas ao HPV através da indução de danos no DNA das células infetadas. A acumulação de 8-nitroguanina, biomarcador de dano oxidativo, causada pela produção de óxido nítrico e de espécies reativas de oxigénio a partir de células inflamatórias, tem sido observada em HSILs [100]. Além disso, o tratamento com TGF-β1 para queratinócitos do colo do útero, imortalizados por oncogenes do HPV16, resultou na diminuição da atividade da telomerase, na erosão dos telómeros e no progressivo aparecimento de aberrações estruturais nos cromossomas [101]. As células dendríticas, células apresentadoras de antigénios, unem a resposta imune inata e a adaptativa. Estas células maturam, em resposta a sinais locais e para estimularem os linfócitos nos órgãos linfóides secundários. Estudos prévios demonstram a existência de uma diminuição do número de células de Langerhans, células dendríticas principais da pele, em lesões associadas ao HPV [102]. Evidências indicam que esta inibição será resultante de uma diminuição da expressão da caderina E dos queratinócitos mediada pela E6 [103]. Além disso, as células dendríticas e as células estromais mielóides foram encontrados em lesões associadas ao HPV expressando a enzima indoleamina 2, 3-dioxigenase, conhecida pelo seu papel na indução de fenótipo regulador das células T [98, 104]. As estratégias de imunoterapia deverão ter em conta o grau de infiltrado linfocitário tumoral, visto que este é determinante no prognóstico de cancro. Assim, Schreiber et al. propuseram que tumores imunogénicos (infiltrado linfocitário tumoral elevado) deverão apresentar maiores sinais de imunossupressão e deverão ser tratados com agentes que depletem as células Tregs ou com bloqueadores dos inibidores co-estimulatórios como Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 15 anti-CTLA ou anti-PDL1. Por outro lado, tumores que apresentem níveis baixos ou ausentes de linfócitos no infiltrado tumoral devem ser tratados com vacinas que forneçam eficientes antigénios tumorais. [105, 106] Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 16 Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 17 1.4 MicroRNAs MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes evolutivamente conservados de 18-25 nucleótidos de comprimento que atuam como reguladores de expressão de genes envolvidos em processos celulares tais como o desenvolvimento, diferenciação, proliferação, sobrevivência e apoptose [107]. Esta regulação da expressão genética é efetuada em níveis pós-transcricionais pela ligação à região não traduzida 3’ (3’UTRs) dos genes alvo, levando à degradação do RNA mensageiro (mRNA) alvo ou à repressão da sua tradução [108] (Figura 3). Os miRNAs são transcritos, na sua maioria, pela RNA polimerase II em longos transcritos primários caracterizados por estruturas hairpin (pri-miRNA). Estes são processados no núcleo pela ribonuclease Drosha em percursores de miRNAS de 70-100 nucleótidos (pré-miRNAs), em combinação com cofatores, tais como a DGCR8, uma proteína evolutivamente conservada que interage com péptidos ricos em prolina através do seu domínio WW [109, 110]. A DGCR8 está localizada na região cromossómica 22q11.2, cuja deleção heterozigótica está na origem da síndrome de DiGeorge. Os sintomas clínicos da doença são altamente variáveis e em aproximadamente 75% dos pacientes, são observadas disfunções cardíacas congénitas [111, 112]. O pré-miRNA, produto da clivagem do pri-miRNA, é exportado para o citoplasma pela exportina-5, membro da família de recetores nucleares dependentes do transporte de Ran (RAsrelated Nuclear protein) [110]. No citoplasma, o pré-miRNA é processado por outra ribonuclease, Dicer, e pela proteína TRBP (proteína de ligação RNA-TAR), originando duas cadeias maduras de miRNA de comprimento variável (~18-25 nucleótidos) [113]. Após a separação das cadeias, a cadeia guia ou miRNA maduro, é incorporado num complexo de indução do silenciamento de RNA (RISC), que contém GW182 e proteínas argonautas (AGO), enquanto a cadeia complementar (miRNA*) é normalmente degradada [108]. Originalmente, o miRNA* foi identificado como sendo não funcional assumindo-se que seria sempre degradado, no entanto, estudos recentes sugerem que este poderá ser utilizado como uma cadeia funcional e desempenhará um papel biológico ainda não inteiramente esclarecido [114, 115]. Como parte do RISC, o miRNA maduro regula a expressão génica pela ligação a sequências parcialmente complementares nas 3'UTRs dos mRNAs alvo, levando à degradação do mRNA ou inibição da sua tradução [108] (Figura 3). No entanto, diversos estudos sugerem que os miRNAs também se ligam a 5'UTR [116, 117], podendo, assim, promover a tradução dos seus genes [118]. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 24 lesões hiperplásicas e displásicas A expressão dos oncogenes E6 e E7 apresenta-se ainda mais elevada do que a do E2, em todos os estratos epiteliais. Há também um aumento progressivo da expressão de E6 e E7 e uma diminuição da expressão de E2 com a agressividade da lesão. Isto é semelhante ao que se observa em humanos, embora, nestes murganhos, não se verifique uma ausência total da expressão de E2 em estadios avançados. Os transcritos dos genes E6 e E7 são expressos constantemente pelo promotor K14 na camada basal, que estando em constante divisão, leva a uma acumulação desses oncogenes no estrato espinhoso [167]. Vários estudos referem que a expressão dos oncogenes E6 e E7 é suficiente para induzir neoplasia epitelial pavimentosa progressiva nestes murganhos [163, 168, 169]. Este modelo transgénico condicional in vivo permite o estudo da carcinogénese induzida pelo HPV16 visto que a progressão para carcinoma de células pavimentosas é fenotipicamente semelhante à carcinogénese do epitélio pavimentoso do colo uterino humano [170]. Quando expostos a estrogénios cronicamente, estes animais desenvolvem carcinomas do colo do útero em grande número [171]. Assim, um estudo anterior, neste modelo animal, revelou que a administração do anti-estrogénico índole-3-carbinol (I3C) inibe a carcinogénese do colo do útero, potenciada pela presença de estrogénios. Este composto fitoquímico parece também reduzir as displasias e os carcinomas da pele existentes nestes animais transgénicos, patologias essas que não são promovidas pelo estrogénio [172]. Diversos estudos sobre hipóxia demonstram que há uma indução da proteína do fator induzido por hipoxia 1α (HIF-1α) e um aumento da expressão dos respetivos genes alvo em linhas celulares de cancro [173]. Desta forma, estudos moleculares anteriores demonstraram que há um aumento da expressão do mRNA de HIF-1α nos queratinócitos basais da epiderme dos transgénicos K14-HPV16 durante a progressão da carcinogénese multi-etapas [174]. Outro estudo refere que, nestes animais, a ausência de cistatina C, que se apresenta diminuída na maioria dos tumores malignos, resulta, concordantemente, numa maior progressão de displasia epidérmica para carcinoma in situ através da regulação de mecanismos associados à redução da apoptose, aumento da neovascularização e da proliferação das células epiteliais [175]. Um exemplo clinicamente importante da carcinogénese multi-etapas está associado ao epitélio do colo do útero humano, em que as alterações neoplásicas progressivas denominam-se por LSIL, que abrange as lesões CIN I, ou HSIL que engloba as lesões CIN II e CIN III. Este sistema de classificação histológica é baseado Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 25 essencialmente na presença de discariose (aumento do volume nuclear e hipercromasia), irregularidade da textura dos cromatídios, presença de nucléolos proeminentes, alteração da relação núcleo/citoplasma. No tecido, essas alterações avançam em porções das camadas celulares, desde a camada basal à superficial. As lesões leves atingem principalmente as camadas basais e parabasais e, por vezes, abrangem as camadas camadas intermédias e superficiais. Quando, aparentemente, todas as camadas apresentam alterações celulares denominamos carcinoma in situ (HSIL) [176, 177]. Nos murganhos K14-HPV16, as lesões hiperplásicas identificadas histologicamente são semelhantes às lesões CIN I em humanos. Já as lesões displásicas epidérmicas, nestes murganhos, revelam similaridades histológicas com as lesões CIN III em humanos, caracterizadas pela existência de elevado número de células basalóides com núcleo irregular e hipercromático presentes no epitélio. Tanto os carcinomas invasivos de células pavimentosas destes murganhos como de humanos apresentam agregados de células epiteliais malignas envolvidas pelo estroma fibrovascular. A correlação entre este modelo experimental e a carcinogénese nos humanos é clara e consistente [170]. Evidências anteriores indicam que o aumento significativo de vasos sanguíneos na lesão é acompanhado de um aumento da expressão do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) nas células epiteliais pavimentosas. Além disso, tanto o aumento da angiogénese como a expressão detetável de VEGF estão presentes tanto nas fases iniciais da progressão neoplásica bem como, na formação de carcinomas invasivos [170]. Conclui-se, desta forma, que além das semelhanças histológicas, também a neovascularização associada às lesões associadas ao HPV são análogas entre este modelo e o colo uterino humano. Algumas evidências que relacionam o infiltrado inflamatório em neoplasias associadas ao HPV e a promoção do crescimento tumoral foram obtidas a partir deste modelo animal [178, 179].Estudos prévios verificaram que o recrutamento dos macrófagos para o local da lesão associada ao HPV é depende da quimiocina CCL2 e do seu recetor CCR2 [180]. Além disso, estudos anteriores, também neste modelo, demonstraram que os TAMs podem modular a angiogénese através da produção da metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) [181]. Foi sugerido, também, que na resposta das células B contra células epiteliais que expressam E6 e E7 há recrutamento de células inflamatórias, potenciando a inflamação crónica e progressão tumoral [182]. Verifica-se, desta forma, que o infiltrado inflamatório poderá potenciar o desenvolvimento tumoral tal como ocorre em carcinomas do colo uterino humano [183]. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 26 Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 27 1. CAPÍTULO 2 OBJETIVOS Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 28 Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 29 2.1 Objetivo Geral Avaliar o padrão de expressão do miR-155 e do miR-21 em pele de murganhos transgénicos K14-HPV16 e suas implicações para a carcinogénese associada ao HPV. 2.2 Objetivos Específicos  Identificar, histologicamente, o tipo de lesão associado ao HPV em diferentes locais anatómicos do murganho  Analisar a expressão do miR-155 e miR-21 em amostras de pele de murganhos wild-type e transgénicos Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 30 Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 31 2. CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 32 Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 33 3.1 Murganhos transgénicos K14-HPV16 O desenvolvimento dos murganhos K14-HPV16 foi previamente relatado [163]. Estes murganhos, pertencentes à estirpe FVB/n, foram generosamente oferecidos à Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto pelo Doutor Jeffrey Arbeit e pelo Doutor Douglas Hanahan da Universidade da Califórnia através do USA National Cancer Institute Mouse Repository. Depois de uma semana de quarentena, os animais foram mantidos e reproduzidos no biotério da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro de acordo com a legislação nacional (Portaria 1005/92 de 23 de outubro) e europeia (Diretiva 2010/63/EU), sob condições controladas de temperatura (23±2 ºC), ciclos de luz/escuridão (12h luz/ 12h escuridão) e humidade relativa (50±10%),. Uma dieta padrão (4RF21 GLP, Mucedola, Itália) e água foram fornecidas ad libitum. A avaliação de condições de saúde de cada animal foi realizada diariamente. Para o estudo de cada miRNA (miR-155 e 21) foram utilizados dois grupos de murganhos (Figura 5). No entanto, todos os restantes procedimentos foram iguais. 3.2 Genotipagem: HPV16-E6 e E2 Os animais foram genotipados após o desmame, utilizando fragmentos de cauda. A lise do tecido foi realizada através da adição de 300 μL de MagnaPure DNA Tissue Lysis Buffer (Roche®, Indianapolis, EUA) e 20 μL de proteinase K, incubando overnight (aproximadamente 16h) a 65 °C. Os ácidos nucleicos foram extraídos a partir do High Pure Viral Nucleic Acid kit (Roche®, Indianapolis, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A pureza do DNA foi avaliada através dos valores do rácio de absorvância 260/280 nm, utilizando o NanoDrop®spectrophotometer v3.7 (Thermo Scientific, Wilmington DE, EUA). A presença de DNA genómico amplificável foi testada através da amplificação do gene da mouse-β-globina pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers específicos A reação de PCR foi realizada em 50 μl de solução com 1x Taq buffer, 2.0 mM MgCL2, 0.2 mM DNTP’S, 0.50 μM de cada primer, 1 U de Taq DNA Polimerase e 0.2 μg de DNA genómico. As condições de amplificação foram as seguintes: desnaturação da cadeia de DNA a 94ºC durante 3 min, seguido por 35 ciclos a 94ºC por 30 s, 60ºC por 45 s, 72ºC por 90 s, e a extensão final a 72 ºC durante 10 min. O fragmento amplificado de 494 pares de base (pb) foi analisado a partir da técnica de eletroforese com 1.5 % (m/v) de gel de agarose corado com brometo de etídio e visualizado a partir de luz UV. A presença de HPV integrado foi avaliada através da amplificação dos genes HPV16-E6 e HPV16-E2 com os primers específicos, que amplificam a região de 130 pb e 184 pb, respetivamente (adaptado do protocolo descrito por Cañadas et al. (2010) e Ribeiro et al. (2014) [184, 185]). A reação de amplificação por Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 40 a) Wild-type b) Transgénicos Figura 7 Murganhos wild-type (HPV16 -/-) e transgénicos (HPV16 +/-). Os murganhos transgénicos apresentam uma alopecia cefálica, juntamente com uma extensa hiperqueratose e eritema auricular (b). Tabela 3 Associação entre o fenótipo caracteristico de lesão associada a HPV e o genótipo HPV E6/E2 dos murganhos da primeira ninhada Murganho Fenótipo Genótipo 1 NEGATIVO NEGATIVO 2 NEGATIVO NEGATIVO 3 NEGATIVO NEGATIVO 4 NEGATIVO NEGATIVO 5 POSITIVO POSITIVO 6 NEGATIVO NEGATIVO 7 POSITIVO POSITIVO 8 NEGATIVO NEGATIVO 9 NEGATIVO NEGATIVO 10 POSITIVO POSITIVO 11 POSITIVO POSITIVO 12 POSITIVO POSITIVO 13 POSITIVO POSITIVO 14 POSITIVO POSITIVO HPV16 -/- HPV16 -/- HPV16 -/+ HPV16 -/+ Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 41 Tabela 4 Associação entre o fenótipo caracteristico de lesão associada a HPV e o genótipo HPV E6/E2 dos murganhos da segunda ninhada Murganho Fenótipo Genótipo 1 NEGATIVO NEGATIVO 2 NEGATIVO NEGATIVO 3 NEGATIVO NEGATIVO 4 NEGATIVO NEGATIVO 5 POSITIVO POSITIVO 6 NEGATIVO NEGATIVO 7 POSITIVO POSITIVO 8 NEGATIVO NEGATIVO 9 NEGATIVO NEGATIVO 10 POSITIVO POSITIVO 11 POSITIVO POSITIVO 12 POSITIVO POSITIVO 13 POSITIVO POSITIVO 14 POSITIVO POSITIVO 15 POSITIVO POSITIVO Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 42 4.2 Análise histológica A partir da avaliação histológica observou-se que, em todos os murganhos transgénicos dos dois grupos, o tecido da orelha apresentava sempre CIS enquanto a pele de peito apresentava apenas hiperplasia. Os murganhos wild-type exibiram histologia de pele normal. (Figura 8) a) b) c) d) Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 43 Figura 8 Análise histológica. H&E, 200x a), b) pele de murganho wild-type apresentando histologia normal. c), d) pele de murganho transgénico K14-HPV16 apresentando hiperplasia epidérmica, hiperqueratose e papilomatose. Notar aumento do número de estratos da epiderme com diferenciação escamosa conservada. e) f) pele da orelha de murganho transgénico apresentando CIS. Notar perda de estratificação e da diferenciação progressiva da epiderme, a presença de figuras de mitose suprabasais e anisocitose, bem como queratinização paraqueratótica abruta com hiperqueratose. O estroma subjacente apresenta intenso infiltrado inflamatório misto e neovascularização. e) f) Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 44 4.3 Caracterização do modelo: seleção do controlo endógeno de miRNAs Para a quantificação relativa da expressão de miRNAs por qRT-PCR é necessário normalizar os resultados utilizando um miRNA normalizador/controlo endógeno. Quatro critérios são comumente utilizados para selecionar o melhor miRNA normalizador do tecido de interesse: o miRNA deve estar altamente expresso na maioria, se não em todas as amostras avaliadas; o miRNA deve estar consistentemente expresso; apenas um representante de uma família de miRNA deverá ser considerada; devem etar disponíveis comercialmente assays para análise da sua expressão [188]. Hufbauer et al. avaliaram a expressão de alguns miRNAs e dos respetivos alvos durante o processo de tumorigénese mediada pelo HPV8 em murganhos. Neste trabalho utilizaram murganhos wild-type e transgénicos da estirpe FVB/n que expressam os genes da região precoce do HPV8 (E1/E2/E4/E6/E7, HPV8-CER) sob o controlo do promotor da K14. Para estudar os níveis de expressão dos miRNAs utilizaram a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR) e os valores médios foram normalizados pelo controlo endógeno miR-127, que não é alterado nem pela presença do HPV8 nem pela radiação UV [186]. Baseado na semelhança deste com o presente estudo, optou-se também por avaliar este mesmo miRNA (miR-127) como controlo endógeno. Os nossos resultados relativos ao estudo de expressão do miR-127 em amostras de peito e orelha indicam que este não é um bom controlo endógeno neste modelo animal. Em primeiro lugar, testamos a eficiência do assay utilizando diluições seriadas de amostra de RNA e verificamos que o miR-127 apenas apresenta eficiência de 83%. Seguidamente, observamos que os duplicados não são os ideais visto que diferem mais de 1 cycle threshold (Ct) e a curva de eficiência não apresenta linearidade (Figura 9). Estes testes foram realizados três vezes em diferentes dias. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 45 Figura 9 Determinação da eficiência do assay hsa-miR-127-5p (cinco concentrações). A eficiência calculada para este assay foi de 83%. Após a obtenção destes resultados, avaliamos o small nucleolar RNA 202 (snoRNA-202) como controlo endógeno. Em estudos anteriores utilizando modelos de ratinho, este snoRNA apresentou-se em elevada abundância e com pouca variabilidade entre tecidos normais e linhas celulares testadas, sendo utilizado como controlo endógeno em vários modelos animais [187]. Relativamente ao estudo de expressão do snoRNA-202, verificamos que este será um bom controlo endógeno para estudar a expressão de miRNAs em tecido de pele do modelo animal transgénico K14-HPV16. Concentração (ng/µL) Ct Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 46 4.4 Expressão do miR-155 4.4.1 Em pele de murganhos wild-type Com o objetivo de estudar o perfil de expressão do miR-155 em tecidos normais, quantificou-se a sua expressão nas amostras de pele de orelha e de peito dos murganhos wild-type. Observou-se que os tecidos da orelha apresentavam níveis de expressão mais baixos quando comparado com os tecidos do peito (p = 0,028) (Figura 10 e 14). Figura 10 Expressão relativa normalizada do miR-155 em tecido de orelha e peito dos murganhos wild-type. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 47 4.4.2 Em pele de murganhos transgénicos Para avaliar a expressão de miR-155 em tecidos de murganhos transgénicos foram analisadas as amostras de pele da orelha (CIS) e do peito (hiperplasia) desses mesmos animais. Verificou-se assim que não havia diferença estatisticamente significativa entre os níveis de expressão do miR-155 desses dois grupos (p = 0,538) (Figura 11). Figura 11 Expressão relativa normalizada do miR-155 nas diferentes lesões dos murganhos transgénicos K14-HPV16 (CIS e hiperplasia). Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 48 4.4.3 Em pele normal de peito versus hiperplasia Com o objetivo de estudar uma possível influência do HPV16 na expressão do miR-155 durante as fases iniciais da carcinogénese, avaliou-se os seus níveis de expressão nos tecidos de peito dos animais wild-type (histologia normal) e nos tecidos de peito dos murganhos transgénicos (hiperplasia). Observou-se assim que o tecido de peito dos animais transgénicos apresentava menor expressão de miR-155 relativamente ao tecido normal de peito (p = 0,026) (Figura 12 e 14). Figura 12 Expressão relativa normalizada do miR-155 em pele de peito de murganhos transgénicos K14- HPV16 (HPV+) e em murganhos wild-type (HPV-). Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 49 4.4.4 Em pele normal de orelha versus CIS Compararam-se também os níveis de expressão do miR-155 no tecido de orelha dos animais transgénicos, que apresentavam CIS, com o tecido de orelha dos murganhos wild-type, exibindo histologia normal. Os resultados obtidos mostram que não existe uma diferença estatisticamente significativa nos níveis de expressão do miR-155 entre os dois grupos (p = 0,484) (Figura 13). Figura 13 Expressão relativa normalizada do miR-155 em amostras de pele de orelha de murganhos transgénicos (HPV+) e wild-type (HPV-). Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 56 A relevância dos miRNAs na biologia tumoral é uma área de rápido crescimento na investigação oncológica. A razão passa pelo facto terem sido identificados como potenciais biomarcadores de prognóstico e possíveis alvos para o desenvolvimento de novas terapias para cancro [189, 190]. Um elevado número de miRNAs foi já descrito como estando associado à transformação celular, sendo que, a desregulação desses miRNAs está intimamente relacionada com o desenvolvimento e progressão de cancro [189, 190]. É consensual, atualmente, que a infeção pelo HPV é o fator mais importante para a transição do epitélio normal do colo uterino para o desenvolvimento de lesões préneoplásicas, neoplasia intraepitelial e, posteriormente, carcinoma invasivo do colo do útero [16, 17]. A influência de outros fatores, incluindo a presença de um microambiente favorável ao desenvolvimento de neoplasias, permanece ainda pouco definida. Especificamente, no cancro do colo do útero, neoplasia mais associada à infeção por HPV, não foram relatadas evidências conclusivas sobre a relação entre o HPV e a expressão tanto do miR-155 como do miR-21. Os murganhos transgénicos K14-HPV16 são úteis modelos experimentais para o estudo progressivo de carcinogénese multi-etapas induzida por HPV. A estirpe FVB/n tem-se demonstrado particularmente predisposta ao desenvolvimento de neoplasias associadas ao HPV. No entanto, outras estirpes de ratinho (como os Balb/c, C57BL/6, SSIN/SENCAR) contendo o mesmo transgene, não desenvolvem carcinomas invasivos [136]. Este facto destaca o papel fundamental de fatores existentes no hospedeiro que influenciam o desenvolvimento de carcinomas induzidos por HPV. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 57 5.1 Análise histológica O carcinoma espinocelular cutâneo desenvolve-se em vários locais e em etapas bem definidas. No presente estudo os animais transgénicos (HPV16 +/-) de ambas as ninhadas apresentavam CIS em todas as amostras de pele de orelha, enquanto as amostras de pele de peito apenas apresentavam hiperplasia epidérmica. Este facto proporcionou uma oportunidade de estudar os níveis de expressão de miR-155 e do miR- 21, em diferentes fases da carcinogénese induzida pelo HPV16. Estudos prévios verificaram que estes animais desenvolvem hiperplasias que progridem para displasias e, posteriormente, para carcinomas invasivos. Esta última etapa só é observada em murganhos com mais semanas de idade do que os utilizados no presente estudo [164]. Esta situação justifica o facto de não termos observado este tipo de carcinomas nos murganhos transgénicos. Os resultados histológicos relativamente ao tecido auricular foram consistentes com estudos anteriores visto que estes também identificaram lesões agressivas em pele de orelha, inclusive carcinomas invasivos [163, 165, 168, 169]. Relativamente à pele do peito, estudos anteriores referem que este tecido está associado ao desenvolvimento de carcinomas também invasivos, no entanto esses murganhos tinham idades bastante superiores aos do presente estudo [164], o que poderá justificar o facto de apenas observarmos lesões hiperplásicas neste mesmo tecido. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 58 5.2 Análise da expressão do miR-155 Os resultados obtidos neste estudo indicam que, entre os murganhos wild-type (HPV- /-), os níveis de expressão de miR-155 são inferiores nos tecidos de orelha comparativamente com a pele do peito (p=0,028). Além disso, observou-se que a pele do peito que apresentava hiperplasia tinha menores níveis de expressão do miR-155 em comparação com a pele normal do peito (p=0,026). Com base nestes resultados, a expressão do miR-155 parece ser ter um impacto significativo no microambiente associado ao desenvolvimento de lesões associadas ao HPV. Especificamente, estes resultados sugerem que a sub-expressão do miR-155 poderá estar relacionada com o desenvolvimento de lesões hiperplásicas promovidas pelo HPV16. De acordo com os nossos resultados, um estudo recente demonstrou que o miR-155 atua como um supressor tumoral em células de carcinoma do colo do útero humano CaSki, que apresentam DNA de HPV16. Além disso, demonstraram também que a expressão do miR-155 regula positivamente a expressão do gene supressor tumoral p53 [191]. Outro estudo refere também que a sobre-expressão do miR-155 resulta na diminuição do rácio ciclina D1/p21, sugerindo que este miRNA apresenta um papel relevante na inibição da proliferação celular [192, 193]. Trabalhos prévios concluíram que a IL-10 regula negativamente a expressão do miR- 155 [194]. Além disso, as mulheres que são geneticamente predispostas para produzirem níveis elevados ou moderados de IL-10 estão mais propensas a desenvolver carcinoma do colo uterino em comparação com indivíduos geneticamente predispostos a apresentar baixa produção de IL-10 [195]. Os resultados obtidos no presente trabalho estão de acordo com estes estudos, na medida em que permite sugerir que o miR-155 poderá potenciar os processos patológicos associados ao HPV16 promovendo a carcinogénese. Um estudo anterior indica que o miR-155 atua como um regulador positivo da produção de IFN-γ [196], sendo que, o aumento dos níveis IFN-γ eleva a suscetibilidade para a lise das células de carcinoma do colo do útero pelas células T citotóxicas específicas de tumores [197]. Além disso, trabalhos prévios concluíram que o miR-155 tem como alvos alguns oncogenes importantes, tais como BCL2, gene importante na regulação da apoptose [198]. Estes dados podem explicar a relação entre a presença de níveis baixos de expressão de miR-155 e a o desenvolvimento carcinogénico. Os resultados obtidos neste presente trabalho demonstram a existência de uma diminuição dos níveis de expressão do miR-155 em tecidos de pele com hiperplasia comparativamente com a pele normal do peito. Isto poderá ser explicado com base em alguns estudos referidos anteriormente, incluindo a possível diminuição da expressão de Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 59 p53 e do aumento dos níveis p21 e de expressão de BCL2, a regulação positiva de IL-10 e a diminuição dos níveis de IFN-γ, promovendo assim a alteração do epitélio normal para o desenvolvimento de hiperplasia epidérmica. Assim, os dados discutidos neste trabalho indicam um possível efeito anti-oncogénico do miR-155. Estes resultados são, assim, importantes para determinar o possível papel da expressão do miR-155 no microambiente tecidual na predisposição para o desenvolvimento de neoplasias malignas associadas ao HPV16. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 60 5.3 Análise da expressão do miR-21 Tal como ocorre com a expressão do miR-155, os resultados obtidos relativamente ao miR-21 indicam que entre os murganhos wild-type (HPV-/-), a expressão do miR-21 é inferior na pele da orelha do que em tecido de pele do peito (p=0.036). Além disso, a expressão do miR-21 é inferior nos tecidos que apresentam CIS (orelha) relativamente aos tecidos com hiperplasia (peito) (p=0,043). Conclui-se assim que, tal como o miR-155, a expressão do miR-21 em tecido normal poderá ser um fator importante no microambiente local favorecendo o desenvolvimento de tumores associados ao HPV. Vários estudos demonstram que a inflamação é um componente crítico e um fator potenciador da progressão tumoral, incluindo neoplasias associadas ao HPV [183]. Entre outros fatores, a inflamação promove a alteração do estroma através da infiltração de células inflamatórias [199, 200], incluindo monócitos e macrófagos, linfócitos B e T, células natural killer (NK) e neutrófilos. Uma grande parte das neoplasias malignas surge a partir de focos de infeção, irritação e inflamação crónica [201]. No nosso modelo animal, estudos indicam que o défice de células T CD4+ está associado a uma diminuição da progressão tumoral e na redução de incidência de tumores no local através da modulação da inflamação [202]. Vários estudos indicam que o miR-21 apresenta propriedades anti-inflamatórias. Estudos anteriores relataram que miR-21 inibe a expressão da interleucina próinflamatória 12 (IL-12) [203]. A IL-12 é uma citocina importante na inflamação pois regula a resposta Th1 versus Th2, principalmente pela indução da produção da citocina IFN-γ pelas células T [204], que promove o aumento da inflamação e consequentemente, a progressão tumoral. Outros estudos demonstram que os níveis elevados de citocinas próinflamatórias tipo 1, tais como IL-12, são indicadores de infeção persistente pelo HPV no colo do útero, ressaltando os potenciais efeitos da inflamação prolongada no desenvolvimento neoplásico [205]. O gene supressor tumoral programmed cell death 4 (PDCD4) é um alvo funcional importante do miR-21 definido em vários tipos de cancro, inclusive carcinomas do colo uterino [206]. Este alvo codifica uma proteína pró-inflamatória que promove a ativação do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB) e suprime a interleucina anti-inflamatória IL-10. Alguns estudos observaram que o miR-21 bloqueia diretamente a atividade do NF-kB e promove a produção de IL-10 [207]. O NF-kB pode atuar como um oncogene através da sua capacidade para estimular a inflamação, proliferação e sobrevivência celular. Desta forma, o NF-kB é constitutivamente ativado em várias neoplasias malignas humanas Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 61 [208], incluindo o cancro do colo do útero [209, 210] e foi, assim, proposto como um elo de ligação importante entre inflamação crónica e o desenvolvimento de cancro [211]. Dados obtidos anteriormente que correlacionam a sub-expressão do miR-21 com o aumento da inflamação poderão justificar os nossos resultados, sugerindo assim, que tecidos que apresentem níveis baixos de expressão do miR-21 estarão mais propensos ao desenvolvimento de cancro. Estes resultados são importantes na procura de determinar a utilidade da expressão de miR-21 na avaliação de tecidos com maior predisposição ao desenvolvimento de cancro. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 62 CAPÍTULO 6 CONCLUSÃO E PERSPETIVAS FUTURAS Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 63 Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 64 As neoplasias malignas associadas à infeção por HPV são um problema de saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento. É, assim, de elevada importância a definição de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico que poderão ter impacto na sobrevivência global dos doentes. A descoberta dos miRNAs como uma classe de moléculas que regula processos celulares como a proliferação, diferenciação e apoptose e a sua implicação em processos neoplásicos, tornou-os em potenciais alvos de estudo na área clinica. Concluímos, com este estudo, que níveis inferiores de expressão do miR-155 e do miR-21 poderão estar a potenciar o desenvolvimento carcinogénico. Além disso, e através da análise histológica, verificamos que estes animais apresentavam lesões características de infeção por HPV (hiperplasia e CIS), histologicamente análogas às ocorrentes no epitélio humano, o que nos permitiu inferir a utilidade na aplicação deste modelo transgénico em estudos de carcinogénese induzida por HPV. A utilização de modelos in vivo, como o modelo utilizado neste estudo (murganhos transgénicos K14- HPV16), revelou-se, assim, um método vantajoso para a uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à alteração do epitélio de lesões associadas ao HPV e que contribuem para o desenvolvimento de cancro. Desta forma, este modelo animal torna-se um útil objeto de estudo para a investigação de mecanismos inerentes à carcinogénese multi-etapas promovida pela presença do DNA de HPV. Além de avaliarmos, pela primeira vez, a aplicabilidade deste modelo transgénico em estudos de expressão de miRNAs na carcinogénese associada ao HPV, com este estudo, reforçamos também a importância do microambiente tecidual associado à baixa expressão do miR-155 e do miR-21 na predisposição para o desenvolvimento destas neoplasias. Sugere-se, desta forma, que estes miRNAs se expressam de uma forma dependente do microambiente que poderá influenciar o processo neoplásico. Futuramente, seria importante comprovar a associação entre o padrão de expressão destes miRNAs e as alterações a nível imunitário, por exemplo, através de estudos de quantificação de algumas citocinas inflamatórias e da avaliação do infiltrado inflamatório. Seria essencial, também, a análise de expressão destes miRNAs em outros locais anatómicos, como o colo uterino ou cavidade oral. Outra abordagem pertinente seria, também, a análise da relação entre a expressão de oncogenes, como HPV-E6 ou E7, e o padrão de expressão do miR-155 e 21. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 65 Desta forma, a caracterização de padrões de expressão de miRNAs neste modelo animal poderá ser uma estratégia útil para a compreensão dos mecanismos de carcinogénese associada ao HPV. Análise da expressão de microRNAs em murganhos transgénicos K14-HPV16: implicações na carcinogénese induzida por HPV 72 47. Mighty, K.K. and L.A. Laimins, The role of human papillomaviruses in oncogenesis. Recent Results Cancer Res, 2014. 193: p. 135-48. 48. Howley, P.M., Papillomaviruses and Their Replication. 49. Durst, M., et al., Human papillomavirus type 16 (HPV 16) gene expression and DNA replication in cervical neoplasia: analysis by in situ hybridization. Virology, 1992. 189(1): p. 132-40. 50. 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