Avaliação de lipoxinas da insuficiência cardíaca

MSc Avaliação de lipoxinas na insuficiência cardíaca Jorge Daniel Moreira da Silva de Carvalho 2012 Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência cardíaca Jorge Daniel Moreira da Silva de Carvalho 2012 i Avaliação de lipoxinas na Insuficiência cardíaca Jorge Daniel Moreira da Silva de Carvalho Mestrado em Bioquímica Departamento de Farmacologia e Terapêutica, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto 2012 Orientador Doutora Teresa Maria de Jesus Teixeira de Sousa, Investigador Auxiliar, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Coorientador Professor Doutor António Albino Coelho Marques Abrantes Teixeira, Professor Catedrático, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto iii Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O presidente do Júri, Porto, _____/_____/__________ v “Of the heart. This moves of itself and does not stop unless forever.” LEONARDO DA VINCI vii AGRADECIMENTOS Aos meus orientadores, Doutora Teresa Sousa e Professor Doutor António Albino- Teixeira, agradeço a inexcedível orientação científica que me proporcionaram, bem como as críticas construtivas e as oportunas sugestões que me colocaram ao longo deste percurso e que em muito contribuíram para o meu enriquecimento científico. Gostaria ainda, de agradecer a disponibilidade incondicional e pelo exemplo, dedicação, trabalho e busca de conhecimento. À Maria João Valente, obrigado pela ajuda constante e crucial e por estares disponível para aquelas explicações que fazem a diferença. Ao grupo The little ONES, pela boa disposição e pelos momentos de distração, descontração e diversão (Johnny, Kek e Bera). À Dra. Marta Couto, que sem o seu apoio e colaboração este trabalho não seria possível. A todo o grupo do Departamento de Farmacologia e Terapêutica pela disponibilidade e simpatia com que sempre me receberam. Aos meus colegas de mestrado e amigos, em especial ao Bruno Bragança, Cátia Costa, Daniela Barros, Marina Mendes pela amizade, espírito de entreajuda e partilha de experiências e sobretudo pelos bons momentos que passamos. Aos meus amigos de “Aveiro”, em especial a Andreia Almeida, Daniela Freitas, Filipa Oliveira pelo incentivo e apoio constante; e um agradecimento especial ao Tiago Baptista pela sua incansável amizade a qualquer hora e em qualquer momento e o incentivo, sempre tão reforçador, ao longo da concretização desta dissertação e ajuda mútua. A todos os meus amigos de longa data que me apoiaram ao longo de todo este processo, aceitando as minhas constantes ausências. Aos meus pais por terem sido o contínuo apoio em todos estes anos, ensinando-me, principalmente, a importância da construção e coerência de meus próprios valores e pelos diversos sacrifícios suportados, assim como os meus irmãos pelo companheirismo e habitual motivação com que pude contar ao longo deste trabalho. O meu profundo e sentido agradecimento a todas as pessoas que contribuíram para a concretização desta dissertação, estimulando-me intelectual e emocionalmente. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 3 D - Influência da terapêutica com AAS na concentração de LXs e outros biomarcadores63 1. Efeito do tratamento com AAS na concentração sistémica de LXA4 e 15-epi-LXA4 ..63 2. Efeito do tratamento com AAS na excreção urinária de LXA4 ...................................63 3. Efeito do tratamento com AAS na excreção urinária de 15-epi-LXA4 ........................64 4. Efeito do tratamento com AAS nos restantes marcadores inflamatórios e de stresse oxidativo ..........................................................................................................................64 5. Efeito do tratamento com AAS nos marcadores de disfunção/lesão cardíaca ...........64 VI - DISCUSSÃO ................................................................................................................69 VII - CONCLUSÃO ..............................................................................................................77 VIII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................81 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 5 LISTA DE ABREVIATURAS 12-LOX 12-Lipoxigenase 15-epi-LXA4 15-epi-lipoxina A4 15-epi-LXB4 15-epi-lipoxina B4 15-LOX 15-Lipoxigenase 15R-HETE Ácido 15-R-hidroxieicosatetraenoico 15S-HPETE Ácido 15-hidroperoxieicosatetranoico 5(S)-HPETE Ácido 5-hidroperoxieicosatetranoico 5-LOX 5-Lipoxigenase AA Ácido araquidónico AAS Ácido acetilsalicílico AINEs Anti-inflamatórios não esteroides ALX Recetor de Lipoxinas AP1 Proteína ativadora 1 ATLs Lipoxinas induzidas pela aspirina AU Ácido úrico BLT1 Recetor do leucotrieno B4 BNP Péptido natriurético tipo B CCR5 Recetor de tipo 5 para quimiocinas CINC1 Fator quimiotático de tipo 1 para neutrófilos induzido por citocinas CL- Cloreto COX-1 Cicloxigenase de tipo 1 COX-2 Cicloxigenase de tipo 2 CTGF Fator de crescimento de tecido conjuntivo CTGFR Recetor do fator de crescimento de tecido conjuntivo ERK Cínases reguladas por sinais extracelulares GFR Recetor de fator de crescimento GPCR Recetor acoplado à proteína G H2O2 Peróxido de hidrogénio IC Insuficiência cardíaca ICC Insuficiência cardíaca crónica IL-6 Interleucina-6 InsP3 Trifosfato de inositol 6 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca Isop Isoprostanos JNK Cínase do terminal amínico da proteína c-Jun LOX Lipoxigenases LPC Lisofosfatidilcolina LT Leucotrieno LTA4 Leucotrieno A4 LXA4 Lipoxina A4 LXB4 Lipoxina B4 LXs Lipoxinas MDRS Espécies reativas derivadas da mieloperoxidase mmLDL LDL minimamente modificado MMP3 Metaloproteinase de tipo 3 da matriz extracelular MPO Mieloperoxidase NF-kB Fator nuclear kappa B NO Monóxido de Azoto NYHA New York Heart Association oxoHDL HDL oxidado oxoLDL LDL oxidado PDGFR Recetor do fator de crescimento derivado de plaquetas PG Prostaglandina PGG2 Prostaglandina G2 PKC Cínases C de proteínas PMNs Células polimorfonucleares PPAR Recetor ativador da proliferação de peroxissomas PRC Proteína reativa C ROS Espécies reativas do oxigénio SCN- Tiocianato TAS Capacidade antioxidante total TMB Tetrametilbenzidina TNF-α Fator de necrose tumoral α VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular VEGFR Recetor do fator de crescimento do endotélio vascular XO Xantina oxídase FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 7 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Evolução da mortalidade em Portugal desde 1960. Fontes/Entidades: INE– DGS/MS, INE, PORDATA................................................................................................15 Figura 2 - Condições que causam IC pela diminuição da função sistólica ou diastólica ventricular (Lilly 2010) ......................................................................................................21 Figura 3 - Vias da Inflamação aguda: resolução ou inflamação crónica, (adaptado de Serhan, Chiang et al. 2008). ............................................................................................23 Figura 4 - Vias funcionais da PRC. Na resposta às citocinas como a IL-6, a expressão hepática da PRC aumenta. A PRC circulante promove uma série de ações como a opsonização de bactérias e células apoptóticas e a libertação de células fagocíticas de citocinas imunomoduladoras (adaptado de Rhodes, Furnrohr et al. 2011). ......................27 Figura 5 - Efeitos da MPO nos vasos sanguíneos. A MPO é libertada pelos macrófagos em estados inflamatórios e catalisa a formação de espécies reativas derivadas da MPO (MDRS) usando o cloreto (Cl-), o tiocianato (SCN-), o monóxido de azoto (NO) como substratos e o H2O2 como co-substrato. O consumo de NO pela MPO pode prejudicar a vasodilatação dependente do endotélio. As MDRS promovem também a aterosclerose por vários mecanismos: exacerbam a oxidação de partículas de LDL (mmLDL, LDL minimamente modificado) iniciada por outras ROS, formando o LDL oxidado (oxoLDL); o oxoLDL é depois fagocitado pelos macrófagos, originando as células espumosas que se acumulam junto ao endotélio formando a placa de ateroma; as MDRS oxidam ainda o HDL formando HDL oxidado (oxoHDL) o que diminui o efeito protetor do HDL e inibe o transporte reverso de colesterol. As MDRS podem ainda contribuir para a rutura das placas de ateroma por enfraquecimento da camada fibrosa. (adaptado de Schindhelm, van der Zwan et al. 2009). ...............................................................................................29 Figura 6 - A) Efeitos da LXA4 no recrutamento de neutrófilos e células mononucleares – Os gradientes quimiotáticos endógenos e exógenos estimulam o recrutamento de neutrófilos que é amplificado pela produção local de LTB4. Durante a progressão de eventos inflamatórios nos tecidos, as interações entre plaquetas e leucócitos induzem a formação de LXA4 e LXB4. Estas lipoxinas inibem o recrutamento de neutrófilos e estimulam a infiltração não-inflamatória de monócitos. B) Dupla ação, anti-inflamatória e de pró-resolução, de lipoxinas, resolvinas e protectinas (adaptado de Serhan, Chiang et al. 2008). ..........................................................................................................................33 8 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca Figura 7 - Mecanismos de ação da LXA4. A generalidade dos efeitos da LXA4 in vivo é possivelmente mediada pela sua interação com recetores acoplados a proteínas G (GPCRs) e com recetores de fatores de crescimento. A ativação do recetor da LXA4 (ALX) resulta em eventos de sinalização específicos, dependentes do tipo de células envolvidas, que inibem a migração de neutrófilos e estimulam a ativação de monócitos e macrófagos. A inibição indireta, mediada pela interação com outros GPCRs, tais como o BLT1 (recetor do LTB4) e recetores de fatores de crescimento, como o VEGFR (recetor do fator de crescimento do endotélio vascular) expresso nas células endoteliais, o PDGFR (recetor do fator de crescimento derivado das plaquetas) e o CTGFR (recetor do fator de crescimento do tecido conjuntivo) expressos nas células mesangiais, reduz a angiogénese, a proliferação das células mesangiais e a fibrose (adaptado de Serhan, Chiang et al. 2008). ......................................................................................................... 34 Figura 8 - Metabolismo de lipoxinas (LXA4, LXB4, 15-epi-LXA4 e 15-epi-LXB4) (Stables and Gilroy 2011). ............................................................................................................. 36 Figura 9 - Representação da inativação enzimática de LXA4. O primeiro passo é a desidrogenação do grupo 15-hidroxilo catalisada pela 15-PGDH, seguido da redução da ligação dupla 13-14 pela EOR (Chiang, Arita et al. 2005). ............................................... 39 Figura 10 - Concentração plasmática do BNP (A) e troponina (B) em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=15). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). *p<0.05 vs. doentes com ICC moderada. .................... 56 Figura 11 - Concentração plasmática da PRC em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and- Whiskers-Plot). ................................................................................................................ 57 Figura 12 - Leucócitos totais (A), monócitos (B), neutrófilos (C), linfócitos (D), e rácio neutrofilos/linfócitos (E) em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). ........................................................................................................................................ 57 Figura 13 - Concentração (A) e atividade (B) MPO plasmática em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). *p<0.05 vs. doentes com ICC moderada. .................... 58 Figura 14 - Concentração plasmática de LXA4 (A) e de 15-epi-LXA4 (B) em doentes com ICC moderada (n=17) e grave (n=15). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). *p<0,05 vs. doentes ICC moderada. ......... 58 Figura 15 - Excreção urinária de LXA4 por dia (A), por clearance estimada de creatinina (B) e por creatinina urinária (C) em doentes com ICC moderada (n=16-17) e grave (n=15- 16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers- Plot). ................................................................................................................................ 59 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 9 Figura 16 - Excreção urinária de 15-epi-LXA4 por dia (A), por clearance estimada de creatinina (B) e por creatinina urinária (C) em doentes com ICC moderada (n=16-17) e grave (n=15-16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box- and-Whiskers-Plot).*p<0,05 vs. doentes ICC moderada. .................................................59 Figura 17 - Concentração sérica de AU (A) e TAS no plasma (B) de doentes com ICC moderada (n=14-17) e grave (n=9-15). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). ***p<0,001 vs. doentes com ICC moderada. ........................................................................................................................................60 Figura 18 - Excreção urinária de H2O2 (A) e de Isop (B) em doentes com ICC moderada (n=14-16) e grave (n=8-14). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). .....................................................................................60 Figura 19 - Efeito do tratamento com AAS na concentração plasmática de LXA4 (A) e 15- epi-LXA4) (B) em doentes com ICC moderada (n=8 s/AAS vs. 9 c/AAS) e doentes com ICC grave (n=10 s/AAS vs. 5 c/AAS). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). ...................................................................63 Figura 20 - Efeito do tratamento com AAS na excreção urinária de LXA4 em doentes com ICC moderada (n=8 s/AAS vs. 8 c/AAS) e ICC grave (n=10 s/AAS vs. 5 c/AAS): excreção por dia (A), excreção por clearance estimada de creatinina (B), e excreção por creatinina urinária (C). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and- Whiskers-Plot). ................................................................................................................63 Figura 21 - Efeito do tratamento com AAS na excreção urinária de 15-epi-LXA4 em doentes com ICC moderada (n=8 s/AAS vs. 8 s/AAS) e ICC grave (n=9 s/AAS vs. 5 c/AAS): excreção por dia (A), excreção por clearance estimada de creatinina (B) e excreção por creatinina urinária (C). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). * p <0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. ..............64 Figura 22 - Efeito do tratamento com AAS na concentração plasmática do BNP em doentes com ICC moderada (n=8 s/ AAS vs. 10 c/AAS) e ICC grave (n=10 s/AAS vs. 5 c/AAS). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and- Whiskers-Plot). ................................................................................................................65 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Classificação da IC (Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008) .................................22 Tabela 2 - Classificação da IC pelos sintomas e capacidade física (NYHA). (Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008) ..................................................................................................22 Tabela 3 - Biomarcadores na IC. Adaptado de (Braunwald 2008)....................................25 Tabela 4 - Principais ações das LXA4 e 15-epi-LXA4 (Serhan, Chiang et al. 2008). .........38 Tabela 5 - Lista dos testes para os biomarcadores do estudo. ........................................51 Tabela 6 - Distribuição dos doentes NYHA (Classe I/II e III/IV) por género, idade, peso e terapêutica com AAS. ......................................................................................................55 Tabela 7 - Correlações entre a LXA4 plasmática e os biomarcadores de disfunção/lesão cardíaca, inflamação e stresse oxidativo (n= 22-34). .......................................................61 Tabela 8 - Correlações entre a 15-epi-LXA4 plasmática e os biomarcadores de disfunção/lesão cardíaca, inflamação e stresse oxidativo (n= 22-34). ..............................62 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 19 II - REVISÃO DA LITERATURA 1. O coração e a IC A estrutura anatómica, a composição celular e as vias de condução do coração formam um sistema eficaz para a produção de contrações organizadas e eficientes. Como resultado, o coração é capaz de promover milhares de milhões de estímulos durante o tempo de vida de uma pessoa. Em cada ciclo de contração, o coração, recebe e ejeta sangue através da circulação fornecendo nutrientes e recebendo produtos do metabolismo celular dos tecidos do corpo. O coração recebe o sangue a baixas pressões de enchimento, durante a diástole e, de seguida, promove a sua ejeção a pressões mais elevadas, durante a sístole (Poole-Wilson 2005; Maeder and Kaye 2009; McMurray 2010). A IC foi durante muito tempo considerada uma doença incurável com uma esperança de recuperação muito baixa. No final do século XX, o desenvolvimento de novos tratamentos, resultantes do conhecimento hemodinâmico e neuro-hormonal da doença, transformou a insuficiência cardíaca numa doença crónica. No entanto, a prevalência desta doença em todo o mundo continua a aumentar, estando associada a altas taxas de morbimortalidade e a elevados custos humanos, sociais e económicos (Rosamond 2008). A IC é muitas vezes a manifestação final e mais grave de quase todos os tipos de doenças cardíacas, incluindo aterosclerose coronária, enfarte do miocárdio, doenças valvulares, hipertensão, doença coronária congénita e cardiomiopatias (Maeder and Kaye 2009). Os sintomas da IC desenvolvem-se, geralmente, de forma gradual, determinando uma diminuição progressiva de atividade nestes doentes, e a ocorrência de episódios cada vez mais frequentes de insuficiência cardíaca aguda (conhecida como descompensação). O tratamento da condição aguda centra-se em abordagens hemodinâmicas que não têm tido avanços significativos na última década, comparativamente com o grande desenvolvimento de tratamentos farmacológicos direcionados para a condição crónica (Mudd and Kass 2008). 20 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 1.1. Patogénese da IC A IC desenvolve-se quando o coração não consegue fornecer o fluxo sanguíneo e/ou pressão adequada às necessidades circulatórias do organismo (Mudd and Kass 2008) e surge devido a anomalias hereditárias ou adquiridas da estrutura e/ou função cardíaca (Shah and Mann 2011). As causas mais comuns incluem distúrbios que cronicamente aumentam a carga de trabalho cardíaco (perda de massa muscular devida a enfarte do miocárdio) e sobrecargas de pressão devido à hipertensão arterial (Mudd and Kass 2008; Lilly 2010) (Figura 2). A redução do débito cardíaco e disfunção do miocárdio levam à expansão do volume intravascular e ativação dos sistemas neuro-hormonais, mais particularmente do sistema nervoso simpático e do sistema renina-angiotensina. Estas respostas compensatórias mantêm a perfusão dos órgãos vitais, aumentando a pré-carga ventricular esquerda e estimulando a contração do miocárdio e o aumento do tónus arterial. Estes mecanismos ajudam a manter o débito cardíaco, promovendo altos volumes diastólicos no coração. No entanto, cada uma destas respostas compensatórias também contribui para a progressão da doença. A expansão do volume intravascular e os elevados volumes ventriculares aumentam a tensão diastólica e sistólica da parede e podem prejudicar o balanço energético do miocárdio e induzir hipertrofia (Lilly 2010; Robbins, Kumar et al. 2010; Lüllmann 2011). A ativação neuro-hormonal promove a constrição arterial e venosa, a hipertrofia e/ou apoptose dos cardiomiócitos, a proliferação de fibroblastos e a acumulação de colagénio intersticial, determinando uma remodelação adversa que compromete a fração de ejeção e a pré-carga e aumenta a tensão nas paredes do coração (Ramani, Uber et al. 2010; Gajarsa and Kloner 2011). Estudos clínicos e experimentais concluíram que a remodelação cardíaca é um processo fundamental na progressão da IC, especialmente em doentes com enfarte do miocárdio, e envolve mudanças significativas na expressão génica e função proteica, tanto na matriz extracelular como nos cardiomiócitos (Choi, Saric et al. 2011; Gajarsa and Kloner 2011). Embora a remodelação ventricular possa inicialmente ser favorável, normalizando o stresse da parede e mantendo a função contrátil em resposta à perda ou aumento de massa muscular, com o tempo verifica-se uma dilatação ventricular progressiva, que aumenta a fibrose intersticial e promove o desenvolvimento de arritmia, além de causar uma diminuição do fluxo sanguíneo (Grieve and Shah 2003; Choi, Saric et al. 2011). Os mecanismos compensatórios da IC, incluindo a estimulação neuro-hormonal dos órgãos, a ativação de cascatas de sinalização intracelular no coração e vasos FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 21 sanguíneos e a retenção de sal e água nos rins, aumentam a probabilidade de falência dos órgãos e pioram o prognóstico clínico (Mudd and Kass 2008; Lilly 2010). Figura 2 - Condições que causam IC pela diminuição da função sistólica ou diastólica ventricular (Lilly 2010) 1.2. Classificação da IC A IC pode ser classificada como aguda ou crónica, consoante a rapidez com que se desenvolve e a necessidade de tratamento urgente ou a longo-prazo. Assim, a IC aguda carateriza-se por um início abrupto de sintomas e sinais de disfunção cardíaca e por uma necessidade urgente de tratamento. Por sua vez, a IC crónica (ICC) desenvolvese lentamente, pode gradualmente piorar e requer um tratamento a longo prazo. É de notar que a palavra "agudo" pode ter vários significados podendo indicar gravidade ou descompensação, caso recente, ou mesmo novo caso (Nieminen, Bohm et al. 2005). Assim foi criada uma nova classificação de IC: 1) novo caso de IC (aguda ou 22 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca aparecimento lento), 2) IC transitória (recorrente) e 3) ICC (persistente) (Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008) (Tabela 1). Tabela 1 - Classificação da IC (Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008) De novo Primeira apresentação Agudo ou início lento Transitória Recorrente ou episódico Crónica Persistente Estável, agravamento ou descompensação A IC é dividida em ligeira, moderada e grave, com base na avaliação clínica dos sintomas. A designação de IC ligeira é usada para caraterizar doentes que se podem movimentar sem limitações importantes enquanto a IC grave se refere a doentes sintomáticos que requerem cuidados médicos frequentes (Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008). A classificação mais utilizada e clinicamente mais útil é a da NYHA - New York Heart Association, que divide a IC em 4 estadios de acordo com os sintomas e a capacidade física dos doentes (Dickstein 1999; Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008) (Tabela 2). Tabela 2 - Classificação da IC pelos sintomas e capacidade física (NYHA). (Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008) Classificação funcional NYHA Gravidade baseada nos sintomas e capacidade física Classe I Sem limitações para atividade física. Atividade usual não causa fadiga excessiva, palpitação ou dispneia Classe II Ligeira limitação das atividades. Confortável em repouso, atividade física usual resulta em fadiga, palpitações e dispneia Classe III Limitação grave da atividade física. Confortável em repouso, mas atividade mais leve que a usual causa fadiga, palpitações e dispneia Classe IV Incapacidade de realizar qualquer atividade física sem desconforto. Sintomas de insuficiência cardíaca em repouso. A atividade física agrava o desconforto 1.3. O papel da inflamação na IC A inflamação é uma importante resposta celular ativada por fatores de natureza mecânica, química ou imunológica. O balanço entre estes fatores locais regula a FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 23 inflamação, determinando a progressão ou resolução do processo inflamatório (Huwiler and Pfeilschifter 2009). A inflamação é reconhecida como uma característica central na patogénese e progressão de várias doenças (Levine, Kalman et al. 1990; Braunwald 2008), causada principalmente por mediadores eicosanóides derivados do ácido araquidónico (prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos) (Schaloske and Dennis 2006) e por componentes do complemento (C5a) (Serhan, Chiang et al. 2008) (Figura 3). Os primeiros dados sobre a relação entre IC e inflamação remontam a um estudo de 1956 (Elster et al., 1956) em que foi observada uma correlação positiva entre a concentração da Proteína Reativa C (PRC) e a gravidade da insuficiência cardíaca congestiva. Em 1990, outros autores (Levine et al.,1990) descreveram também uma elevação da concentração do fator de necrose tumoral α (TNF-α) circulante em doentes com IC. Pesquisas realizadas desde então têm revelado novos dados acerca da relação entre citocinas e a IC. Atualmente sabe-se que a IC resulta em grande parte, de um desequilíbrio entre mediadores inflamatórios e anti-inflamatórios (Mann 2002; Heymans, Hirsch et al. 2009). Figura 3 - Vias da Inflamação aguda: resolução ou inflamação crónica, (adaptado de Serhan, Chiang et al. 2008). 1.4. O papel da oxidação na IC O stresse oxidativo é referido como um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS), e os mecanismos de defesa antioxidantes endógenos (Grieve and Shah 2003), com prevalência de um estado pró-oxidante potencialmente prejudicial para a viabilidade, sinalização e função das células. A produção de ROS, incluindo radicais livres como o superóxido, e espécies nãoradicais como o peróxido de hidrogénio (H2O2), é cada vez mais reconhecida como um 24 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca importante contribuinte para a patogénese e progressão da IC. O aumento da concentração de marcadores de stresse oxidativo em doentes com IC está correlacionado com a disfunção miocárdica e agravamento geral da IC (Ungvari, Gupte et al. 2005; Takimoto and Kass 2007). As ROS podem exercer múltiplos efeitos relevantes para a fisiopatologia de IC (Finkel 1999). As lesões oxidativas nas proteínas celulares podem induzir disfunção celular ou morte por apoptose ou necrose (Finkel 1999; Finkel 2011) que por sua vez estão associadas a arritmias e a disfunção endotelial (Grieve and Shah 2003). O processo de quantificação direta de ROS é dificultado pela instabilidade da maioria destas moléculas. Assim, a avaliação de stresse oxidativo em patologias humanas tem sido frequentemente realizada com base na quantificação de marcadores indiretos como a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade, a peroxidação lipídica (malonildialdeido, isoprostanos) e a concentração e atividade da mieloperoxídase (MPO) no plasma e urina (Kameda, Matsunaga et al. 2003; Polidori, Pratico et al. 2004). 1.5. Biomarcadores na IC A natureza multifatorial da IC, incluindo lesões, sobrecarga cardíaca, interações genéticas, alterações neuro-hormonais, inflamatórias e bioquímicas, entre outras, justifica, de certo modo, o crescente interesse e a relevância clínica de biomarcadores de stresse e disfunção do coração, tais como enzimas, hormonas e outras substâncias biológicas (Braunwald 2008). De acordo com Morrow et al. (2007), os biomarcadores devem cumprir três critérios que os tornam úteis: i) possibilitar medições precisas e reprodutíveis, disponíveis para a atividade clínica num curto intervalo de tempo e com custos acessíveis; ii) fornecer informação não disponível numa avaliação clínica e iii) auxiliar a decisão médica com base na concentração quantificada. Apesar de poucos biomarcadores satisfazerem todos os critérios anteriormente referidos, muitos deles facultam informações importantes relacionadas com a patogénese de IC ou a identificação de indivíduos de risco, e podem ainda ser úteis para a estratificação do risco, o estabelecimento do diagnóstico de IC ou a monitorização desta doença (Braunwald 2008). É de notar que biomarcadores podem ser fatores de risco e, portanto, podem ser potenciais alvos de terapia (Tabela 3). A pesquisa de novos e melhores biomarcadores está em constante evolução, pretendendo-se que estes tenham um importante valor prognóstico na avaliação clínica convencional, fornecendo informações sobre a manifestação da doença antes do aparecimento de alterações estruturais e fisiológicas evidentes. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 25 Tabela 3 - Biomarcadores na IC. Adaptado de (Braunwald 2008) Inflamação*†‡ Lesão dos Miócitos *†§ Proteína reativa C Troponinas I e T Fator de necrose tumoral α Cínase da miosina de cadeia-leve I Fas (APO-1) Proteína cardíaca de ligação ácidos-gordos Interleucina 1, 6, e 18 Cínase da creatina (CK-MB) Stresse Oxidativo *†§ Stresse dos Miócitos †‡§¶ Lipoproteinas baixa densidade oxidadas Péptido natriurético tipo-B Mieloperoxidase Terminal amínico do pró-péptido natriurético tipo-B Biopirrinas urinárias Pró-adrenomedulina Isoprostanos urinários e plasmáticos ST2 Malonidialdeído plasmático Novos Biomarcadores† Remodelação matriz-extracelular *†§ Cromogranina Metaloproteinases da matriz extracelular Galectina 3 Inibidores teciduais de metaloproteinases Osteoprotegerina Pro-péptidos colagénio Adiponectina Neuro-hormonas*†§ Fator de diferenciação-15 Noradrenalina * Biomarcadores nesta categoria ajudam na compreensão da patogénese de IC. † Biomarcadores nesta categoria providenciam informações prognósticas e melhoram a estratificação de risco. ‡ Biomarcadores nesta categoria podem ser usados para identificar indivíduos com risco de IC. § Biomarcadores nesta categoria são potenciais alvos de terapia ¶ Biomarcadores nesta categoria são úteis no diagnóstico de IC e monitorização da terapia Renina Angiotensina II Aldosterona Endotelina 1.6. Biomarcadores de disfunção/lesão cardíaca 1.6.1. Péptido natriurético tipo-B (BNP) Os péptidos natriuréticos, incluindo o peptídeo natriurético auricular (Atrial natriuretic peptide, ANP), o péptideo natriurético tipo-B (B-type natriuretic peptide, BNP) e o peptídeo natriurético tipo-C (C-type natriuretic peptide, CNP), são importantes mecanismos contra-reguladores na IC, havendo uma elevação significativa das suas concentrações sistémicas e/ou tecidulares no contexto desta patologia. Estes peptídeos, principalmente o BNP e o seu fragmento terminal amínico inativo (NT-pró-BNP), têm vindo a assumir uma crescente relevância clínica como biomarcadores de IC (Braunwald 2008). A formação destes compostos é iniciada com a síntese de um precursor inativo (pré-hormona) que posteriormente é clivado originando a formação de BNP ativo, que representa o fragmento terminal carboxílico, e de NT-pró-BNP, fragmento terminal amínico, sem atividade fisiológica conhecida (Levin, Gardner et al. 1998; Braunwald 2008). Estes dois péptidos são libertados principalmente dos ventrículos cardíacos em resposta ao estiramento e/ou tensões dos miócitos (Levin, Gardner et al. 1998; 26 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca Kragelund, Gronning et al. 2005) e, além de refletirem o stresse da parede ventricular estão também associados a outros eventos cardiovasculares de risco (Goetze, Christoffersen et al. 2003). O BNP apresenta uma ação fisiológica de proteção de lesões cardíacas e disfunção miocárdica (Kehl, Iqbal et al. 2012) e tem ainda vários efeitos sistémicos, incluindo vasodilatação, aumento da excreção de sódio e inibição do sistema nervoso simpático (Levin, Gardner et al. 1998; Hall 2004). Vários estudos demonstram a utilidade clínica do BNP e NT-pró-BNP no diagnóstico e tratamento de IC sugerindo que cada um destes péptidos pode ser utilizado na avaliação dos doentes (Kazanegra, Cheng et al. 2001; Maisel, Krishnaswamy et al. 2002). Ambos os péptidos são descritos como bons fatores preditivos da morbidade e mortalidade associados à IC (Tsutamoto, Wada et al. 1997; de Lemos, Morrow et al. 2001), mesmo para valores inferiores a 100 pg/mL (valor utilizado para identificar IC) (Wang, Larson et al. 2004; Kragelund, Gronning et al. 2005). O BNP é, portanto, um marcador de alta sensibilidade e especificidade para a IC, uma vez que se correlaciona com a gravidade da doença (Masson, Latini et al. 2008). A sua concentração é normalmente determinada por imunoensaios (Loke, Squire et al. 2003). O BNP pode ainda ser útil na identificação de indivíduos assintomáticos com risco acentuado de desenvolvimento de IC (diabéticos, hipertensos, idosos) ou na avaliação de cardiotoxicidade induzida por quimioterapia anti-tumoral (Braunwald 2008). 1.6.2. Troponina A troponina é um complexo de três proteínas que controlam a interação da actina e miosina que, por sua vez, promove a contração e relaxamento do músculo estriado (Daubert and Jeremias 2010). Existem três tipos de troponina, I, T, e C, mas apenas duas delas são expressas no músculo cardíaco, I e T, sendo, por esse motivo biomarcadores específicos para doenças do coração (Morrow, Cannon et al. 2007; Kehl, Iqbal et al. 2012). Uma concentração elevada de troponina cardíaca pode indicar a presença de lesões ou mesmo morte dos cardiomiócitos (Wu and Ford 1999). A deteção de troponina circulante é rara na população em geral (Wallace, Abdullah et al. 2006) estando associada a instabilidade hemodinâmica, a disfunção sistólica ventricular esquerda e à diminuição da sobrevida (Fonarow and Horwich 2003; Xue, Yu et al. 2003). O aumento da concentração de troponina está, portanto, correlacionado com um prognóstico adverso na IC (Horwich, B. et al. 2003; Kociol, Pang et al. 2010). De acordo com Peacock et al. (2008) a elevação da concentração de troponina é um promissor marcador de prognóstico independente na IC e a sua deteção pode ser útil na estratificação dos doentes. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 27 1.7. Biomarcadores inflamatórios 1.7.1. Proteína reativa C (PRC) Um dos marcadores mais utilizados na avaliação de inflamação é a PRC (Pearson, Mensah et al. 2003; Kardys, Knetsch et al. 2006). A PRC é um pentâmero com 115 KDa sintetizado maioritariamente no fígado pelos hepatócitos em resposta a estímulos de citocinas pró-inflamatórias como a interleucina-6 (IL-6) e o TNF-α (Packard, O'Reilly et al. 2000; Araujo, Lourenco et al. 2009) libertadas em diversas condições fisiopatológicas incluindo inflamação, infeção, lesões celulares e neoplasias (Pepys and Hirschfield 2003) (Figura 4). Figura 4 - Vias funcionais da PRC. Na resposta às citocinas como a IL-6, a expressão hepática da PRC aumenta. A PRC circulante promove uma série de ações como a opsonização de bactérias e células apoptóticas e a libertação de células fagocíticas de citocinas imunomoduladoras (adaptado de Rhodes, Furnrohr et al. 2011). Um aumento da PRC é geralmente considerado um sinal de inflamação (Kushner, Rzewnicki et al. 2006). O grande interesse desta proteína na medicina cardiovascular desenvolveu-se após uma série de estudos epidemiológicos nos quais foi demonstrado que pequenas elevações na sua concentração sistémica são preditivas de diversos eventos cardiovasculares (Pirro, Bergeron et al. 2001; Jialal and Devaraj 2003; Braunwald 2008). No contexto específico de IC, elevadas concentrações desta proteína contribuem para o seu desenvolvimento e progressão (Backes, Howard et al. 2004; Kardys, Knetsch et al. 2006). Doentes com concentração de PRC superior a 3 mg/L (valor de referência para o diagnóstico de IC) apresentam um risco duplo de desenvolverem IC (Engstrom, Melander et al. 2009). De facto, existe uma associação entre a PRC e o estadio da IC (Alonso-Martínez, Llorente-Diez et al. 2002; Yin, Chen et al. 2004). 28 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 1.7.2. Leucócitos Os glóbulos brancos têm alto valor preditivo na avaliação do risco cardiovascular estando o seu aumento geralmente relacionado com o agravamento da incidência de IC e da mortalidade (Cooper, Exner et al. 1999; Horne, Anderson et al. 2005; Duffy, Gurm et al. 2006). Os monócitos e linfócitos participam ativamente na formação de ateromas nas placas das artérias coronárias (Libby 2003). Os neutrófilos estão envolvidos na formação de agregados de plaquetas e leucócitos, contribuindo para a exacerbação das lesões em síndromes coronárias agudas. Por outro lado, a linfocitopenia também está independentemente associada ao aumento da mortalidade em doentes com IC (Huehnergarth, Mozaffarian et al. 2005; Rudiger, Burckhardt et al. 2006). Foi postulado que os potenciais mecanismos para linfocitopenia observada em doentes com IC incluem regulação negativa da proliferação e diferenciação leucocitária, ativação neuro-hormonal e apoptose de linfócitos (Sciarretta, Ferrucci et al. 2007; Uthamalingam, Patvardhan et al. 2011). Recentemente, o rácio neutrófilos/linfócitos (N/L) emergiu como marcador inflamatório eficaz, estando o seu aumento relacionado com uma maior mortalidade em doentes com IC crónica. (Cooper, Exner et al. 1999; Tamhane, Aneja et al. 2008). 1.7.3. Mieloperoxidase (MPO) A mieloperoxidase (MPO) é uma hemoproteína, sintetizada durante a diferenciação mielóide, expressa abundantemente em células polimorfonucleares (PMNs) e secretada durante a sua ativação (Nauseef 1988; Nauseef, Olsson et al. 1988; Malech and Nauseef 1997). É uma enzima simultaneamente relacionada com a inflamação e o stresse oxidativo, é libertada por leucócitos em condições inflamatórias e catalisa a formação de ROS (Klebanoff 2005) (Figura 5). Esta proteína é armazenada em grânulos primários até ser libertada pela ativação leucocitária e desgranulação (Nauseef 1988; Malech and Nauseef 1997) catalisando depois a formação de diversas espécies reativas incluindo o ácido hipocloroso, com papel preponderante na defesa contra microrganismos, cloraminas, radicais tirosilo e dióxido de azoto que oxidam proteínas e lípidos. A MPO parece funcionar como um catalisador enzimático de modificações oxidativas de lipoproteínas na parede arterial (Holvoet 1998). A oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) facilita a progressão da aterogénese pela deposição de colesterol, principalmente no interior de macrófagos, formando as células espumosas. Este processo resulta também no recrutamento de células inflamatórias, como monócitos e linfócitos, pelas propriedades quimiotáticas da LDL oxidada (Malech and Nauseef 1997; FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 35 derivados do ácido araquidónico (AA) numa suspensão de leucócitos humanos. Os mais abundantes foram caracterizados como ácido 5,6,15-L-trihidroxi-7,9,11,13- eicosatetraenoico (lipoxina A4, LXA4) e ácido 5D,14,15-L-trihdroxi-6,8,10,12- eicosatetraenoico (lipoxina B4, LXB4). A concentração de LXs presentes em matrizes biológicas, nomeadamente sangue e urina, reflete a capacidade de biossíntese destes compostos, permitindo distinguir o estado de progressão de doenças que envolvem inflamação (Serhan 2005). 2.1. Biossíntese de lipoxinas A4 e B4 As LXs são produzidas por um sistema transcelular, i.e. a sua síntese implica a ação de enzimas produzidas em diferentes tipos celulares (Ryan and Godson 2010). Existem duas vias principais de biossíntese de LXs no Homem (Figura 8). A primeira via biossintética envolve a oxigenação do AA no C-15 pela 15-lipoxigenase (15- LO) existente nos eosinófilos, monócitos ou células epiteliais, originando o ácido 15- hidroperoxieicosatetranóico (15S-HPETE). Na sequência da secreção, o 15S-HPETE é captado pelas células polimorfonucleares (PMNs) ou monócitos e é rapidamente convertido em 5,6-epoxitetraeteno pela 5-lipoxigenase (5-LO), que por sua vez é hidrolisado nestas mesmas células pela LXA4 ou LXB4 hidrolase originando LXA4 ou LXB4 ativas. Este processo, curiosamente, reduz a formação de LTs, que requerem a 5-LO para a conversão do AA em leucotrieno A4 (LTA4) (Serhan 1989; Claria and Serhan 1995; Serhan 1995). A segunda maior via de biossíntese de LXs é dependente da formação de LTA4, e envolve a interação entre plaquetas e leucócitos. A 5-LO leucocitária converte o AA em LTA4 como já foi referido, e este é libertado, captado pelas plaquetas e subsequentemente transformado em LXA4 ou LXB4 pela ação da LX-sintetase, 12-LO (Serhan and Sheppard 1990; Romano and Serhan 1992). 2.2. Biossíntese de 15-epi-lipoxinas É de especial interesse o facto de a aspirina (ácido acetilsalicílico, AAS) ser capaz de desencadear a formação de mediadores lipídicos específicos, mediante uma via biossintética única que leva à formação de 15-epi-LXA4, usualmente denominada por aspirin-triggered-lipoxin (ATL) (Claria and Serhan 1995) (Figura 8). Esta é uma terceira via de formação de LXs, que ocorre após a administração exógena de AAS mas não de outros anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) convencionais. A acetilação da COX-2 nas células endoteliais e outros tipos celulares, 36 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca altera o seu perfil de atividade, promovendo a conversão do AA no Ácido 15R- hidroxieicosatetraenóico (15R-HETE) ao invés da sua transformação em PGG2 (Claria and Serhan 1995; Chiang, Bermudez et al. 2004; Stables and Gilroy 2011). O 15R-HETE é depois metabolizado num processo transcelular nos leucócitos pela 5-LO, formando um epímero da LX, a 15-epi-LXA4, que possui um grupo álcool no C-15 na configuração R ao invés da configuração 15S nativa (Paul-Clark, van Cao et al. 2004; Stables and Gilroy 2011). É sabido que o tratamento com doses baixas de AAS confere proteção cardiovascular mediada pela inibição da agregação plaquetar. No entanto, a produção de 15-epi-LXA4 induzida pela AAS poderá também contribuir para os efeitos benéficos deste fármaco. A 15-epi-LXA4 é então um potencial biomarcador da resposta anti-inflamatória mediada por leucócitos e outras células, em doentes tratados com AAS (Chiang, Bermudez et al. 2004; Serhan 2005). Figura 8 - Metabolismo de lipoxinas (LXA4, LXB4, 15-epi-LXA4 e 15-epi-LXB4) (Stables and Gilroy 2011). 2.3. Recetor de lipoxinas As ações das LXs e ATLs estão dependentes da ativação de um recetor específico, formado por 7 domínios transmembranares que pertence à família dos recetores quimiotáticos (Fiore, Maddox et al. 1994; Takano 1997). Este recetor, membro FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 37 dos recetores formil-peptídicos (FPR) é designado por FPR2/ALX e apresenta uma expressão elevada nas células de resposta imune e inflamatória, nomeadamente nas PMNs, monócitos, linfócitos e células endoteliais. Para além das LXs e ATLs, este recetor é também reconhecido por outros peptídeos e mediadores lipídicos o que justifica a existência de outras respostas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias mediadas pela sua ativação. A expressão do ALX é induzida por citocinas, estando aumentada em casos de inflamação (Romano, Recchia et al. 2007; Dufton, Hannon et al. 2010). Embora se conheçam alguns mecanismos, muitas das vias de sinalização intracelulares desencadeadas por estes recetores ainda permanecem por elucidar. Contudo, alguns estudos indicam que as diferentes afinidades dos lípidos e pequenos peptídeos para este recetor, assim como a existência de locais distintos de interação do recetor com estas moléculas, condicionam uma ativação diferencial de segundos mensageiros e, consequentemente, de diferentes vias de sinalização a jusante (Chiang, Arita et al. 2005; Chiang 2006; Romano, Recchia et al. 2007). 2.4. Ação das lipoxinas As LXs desempenham importantes atividades fisiológicas e patológicas (Serhan 1994). Estes compostos inibem a infiltração de células PMNs, como por exemplo os neutrófilos, e atuam ainda em muitos outros tipos celulares, incluindo células neuroniais, epiteliais e endoteliais (Takano, Clish et al. 1998; Chiang 2006). Na Tabela 4 estão descritas as principais as ações anti-inflamatórias e de próresolução das lipoxinas e ATLs in-vivo. Estes múltiplos mecanismos celulares e locais de ação contribuem para a eficácia das LXs na redução da inflamação e no retardamento da progressão de várias doenças (Serhan 2006; Schwab, Chiang et al. 2007). No entanto apesar da sua potencial relevância clínica ainda não existem estudos sobre o papel destas moléculas na patogénese e progressão da IC. 2.5. Inativação metabólica de lipoxinas As LXs são produzidas em resposta a estímulos, atuam localmente e são rapidamente inativadas por enzimas metabólicas. A principal via de inativação de LXs passa pela sua desidrogenação nos monócitos, que convertem LXA4 em 15-oxo-LXA4, seguida de uma redução específica da ligação dupla adjacente ao grupo cetona (Serhan, Maddox et al. 1995). A 15-hidroxiprostaglandina desidrogenase (15-PGDH) catalisa a oxidação da LXA4 a 15-oxo-LXA4. 38 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca Tabela 4 - Principais ações das LXA4 e 15-epi-LXA4 (Serhan, Chiang et al. 2008). Célula alvo Ações Leucócitos • Diminui a expressão da CD11b/CD18 • Previne a eliminação de L-selectina da superfície de leucócitos • Reduz a produção de peroxinitrito em neutrófilos, monócitos e linfócitos Neutrófilos • Bloqueia a quimiotaxia, a adesão e a transmigração • Bloqueia interações celulares neutrófilos-epitélio e neutrófilos-endotélio • Bloqueia a produção do anião superóxido • Reduz a expressão de CD11b/CD18 e a formação de InsP3 • Inibe a produção de peroxinitrito • Atenua a acumulação de AP1 e NF-κB, inibe a expressão do gene IL8 Eosinófilos • Bloqueia a migração e quimiotaxia in vivo • Inibe a produção de eotaxina e IL-5 Monócitos • Estimula a quimiotaxia e adesão à laminina, sem aumentar a cito toxicidade • Inibe a produção de peroxinitrito Macrófagos • Estimula a fagocitose de neutrófilos apoptóticos Células T • Inibe a secreção de TNF bloqueando a ativação da ERK • Aumenta a expressão de CCR5 Células dendríticas • Bloqueia a produção de IL-12 Células epiteliais • Inibe a expressão e a libertação de TNF induzida pela IL-8 nos enterócitos Células endoteliais • Estimula a formação de PKC dependente da prostaciclina • Bloqueia a produção de espécies reativas do oxigénio • Inibe a migração de células endoteliais induzida pelo VEGF Fibroblastos • Inibe a produção de IL-1β induzida pela IL-6, IL-8 e de MMP3 • Inibe a proliferação induzida pela CTGF Hepatócitos • Reduz a expressão do PPARα e CINC1 Células mesangiais • Inibe a proliferação induzida pelo leucotrieno D4 • Inibe a produção de quimiocinas induzidas pela CTGF Células estaminais neuronais • Atenua o crescimento celular Astrócitos • Inibe a ativação da ERK e JNK Este composto é biologicamente inativo e é ainda convertido em 13,14-dihidro- oxo-LXA4 pela ação de uma oxidorredutase eicosanoide (EOR). A 15-PGDH reduz ainda o grupo 15-oxo em 13,14-dihidro-LXA4 o que revela uma capacidade catalítica adicional para esta enzima (Clish, Levy et al. 2000). A LXB4 pode também ser desidrogenada pela 15-PGDH no C-5 produzindo 5-oxo-LXB4, compartilhando de seguida a mesma via comum de inativação da LXA4 (Maddox, Colgan et al. 1998) (Figura 9). Serhan et al. (1995) demonstrou que as ATLs, quando comparadas com a LXA4, são convertidas nos seus 15-oxo-metabolitos numa cinética mais lenta pela 15-PDGH, indicando a estéreo-especificidade desta enzima. As ATLs apresentam assim um tempo de semivida biológica maior, tendo por isso uma maior duração de ação que a LXA4 (Serhan, Maddox et al. 1995; Maddox 1997; Clish 1999) FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 39 Figura 9 - Representação da inativação enzimática de LXA4. O primeiro passo é a desidrogenação do grupo 15-hidroxilo catalisada pela 15-PGDH, seguido da redução da ligação dupla 13-14 pela EOR (Chiang, Arita et al. 2005). CAPÍTULO III OBJETIVOS FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 43 III - OBJETIVOS Pensa-se que a deterioração do funcionamento cardíaco poderá resultar de um decréscimo da formação de LXs, com consequente aumento da ativação leucocitária, inflamação e fibrose (Das 2011b). No entanto, apesar do interesse crescente nos mecanismos de proteção mediados pelas LXA4 e 15-epi-LXA4 ainda não há estudos sobre o seu papel na patogénese e progressão da IC. Este projeto pretendeu avaliar a relação entre a biodisponibilidade de LXs e o estadio de IC, tendo sido quantificadas a concentração plasmática e urinária de LXA4 e de 15-epi-LXA4 em doentes com IC crónica, e a correlação destes parâmetros com alguns biomarcadores específicos de IC, inflamação e stresse oxidativo. Analisou-se ainda o impacto da terapêutica com AAS na concentração de 15-epi-LXA4, LXA4 e restantes marcadores. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 51 Isoprostanes, Oxford Biomedical Research) e um leitor de placas. A creatinina urinária foi quantificada num multianalisador automático no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital de S. João. A excreção urinária de H2O2 e de Isop foi expressa em função da concentração de creatinina na urina. 2. Resumo dos métodos analíticos A Tabela 5 apresenta um resumo dos métodos analíticos utilizados para avaliar os marcadores inflamatórios e de stresse oxidativo (com exceção da PRC e do AU). Tabela 5 - Lista dos testes para os biomarcadores do estudo. Biomarcador Fabricante (código) Tipo de amostra Método analítico MPO concentração BioCheck, Oxis Research (BC-1129) Plasma ELISA MPO atividade n.a.* Plasma Espectrofotometria TAS Cayman Chemical (709001) Plasma Espectrofotometria H2O2 Molecular Probes (A22188) Urina Fluorimetria Isop Oxford Biomedical Research (EA85) Urina ELISA LXA4 Neogen Corporation (407010) Urina e Plasma ELISA 15-epi-LXA4 Neogen Corporation (407110) Urina e Plasma ELISA *n.a. não aplicável 3. Análise de resultados e estatística Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (standard error of the mean, S.E.M.) e/ou representados graficamente por diagramas de extremos e quartis (“Box-and-Whiskers plot”) em que as linhas horizontais da caixa indicam, de baixo para cima, o primeiro quartil (Q1: contém 25% dos valores do grupo), o segundo quartil (Q2: contém 50% dos valores do grupo; coincide com a mediana) e o quartil superior (Q3: 52 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca contém 75% dos elementos do grupo). As linhas horizontais exteriores (Whiskers) à caixa representam os valores extremos (menor e maior) do grupo que não são outliers e os pontos isolados correspondem a outliers. A clearance estimada da creatinina foi calculada utilizando um programa da National Kidney Foundation (Cockroft-Gault Calculator) que determina a clearance da creatinina com base na concentração plasmática da creatinina, peso corporal, género e idade do doente. As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student para amostras não emparelhadas ou pelo teste de Mann Whitney U, de acordo com a distribuição normal ou não normal da amostra, respetivamente. Foi também efetuado o teste ANOVA para comparações múltiplas para analisar diferenças entre quatro grupos. As correlações entre variáveis foram testadas pela correlação de Pearson, no caso de as variáveis apresentarem uma distribuição normal, ou pela correlação de Spearman, se pelo menos uma das variáveis apresentasse uma distribuição não normal. Foram considerados significativos os valores de p inferiores a 0,05. CAPÍTULO V RESULTADOS FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 55 V - RESULTADOS A - Dados demográficos dos doentes Foram constituídos dois grupos de doentes (ICC moderada vs ICC grave) para a análise dos resultados. Considerou-se ICC moderada os doentes correspondentes a classes funcionais NYHA I, I/II ou II, e ICC grave doentes em NYHA II/III, III e III/IV. Este estudo incluiu uma população de 34 doentes, com 14 mulheres e 20 homens (Tabela 6). O grupo de doentes com ICC moderada apresenta um maior número de doentes do género masculino (13 em 18), ao contrário do grupo de doentes com ICC grave, que apresenta mais doentes do género feminino (9 em 16). Relativamente à idade, não se observaram diferenças significativas entre o grupo de ICC moderada e o grupo de ICC grave. No entanto, observou-se uma redução significativa do peso corporal no grupo com ICC grave (Tabela 6). Só 31% dos doentes com ICC grave é que estavam medicados com AAS, enquanto no grupo de ICC moderada o número de doentes tratados com este fármaco era consideravelmente superior (56%). Tabela 6 - Distribuição dos doentes NYHA (Classe I/II e III/IV) por género, idade, peso e terapêutica com AAS. Masculino n=20 Feminino n=14 Total n=34 Género ICC moderada 72% (13/18) 28% (5/18) 53% (18/34) Grave 44% (7/16) 56% (9/16) 47% (16/34) Idade (anos) ICC moderada 70,46 ± 2,63 75,20 ± 4,04 71,50 ± 2,13 Grave 73,14 ± 2,73 78,67 ± 2,93 76,25 ± 2,09 Peso (Kg) ICC moderada 79,36 ± 3,87 63,54 ± 6,80 77,50 ± 3,69 Grave 71,54 ± 3,58 61,40 ± 4,06 65,84 ± 2,98* AAS ICC moderada 56% (10/18) grave 31% (5/16) *p<0,05 vs ICC moderada. 56 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca B - Marcadores de disfunção/lesão cardíaca, inflamação e stresse oxidativo 1. Biomarcadores de disfunção/lesão cardíaca As concentrações plasmáticas de BNP e troponina são apresentadas na Figura 10. Os doentes com ICC grave apresentaram concentrações plasmáticas de BNP significativamente mais elevadas do que os doentes com ICC moderada (1464 ± 442 pg/ml vs. 555 ± 162 pg/ml, respetivamente, p<0,05), correspondendo a um aumento de aproximadamente de 3 vezes na classe de ICC grave. Não se observaram diferenças significativas nas concentrações de troponina entre os dois grupos. Figura 10 - Concentração plasmática do BNP (A) e troponina (B) em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=15). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). *p<0.05 vs. doentes com ICC moderada. 2. Marcadores Inflamatórios 2.1. PRC Não se verificaram diferenças significativas na concentração plasmática de PRC entre os doentes com ICC moderada e ICC grave (Figura 11). FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 57 Figura 11 - Concentração plasmática da PRC em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). 2.2. Leucócitos totais, neutrófilos, monócitos e linfócitos Não se observaram diferenças estatisticamente significativas na quantidade total de leucócitos do sangue periférico, nem no número de monócitos, neutrófilos, linfócitos, e rácio neutrófilos/linfócitos, entre os dois grupos de doentes (Figura 12). Figura 12 - Leucócitos totais (A), monócitos (B), neutrófilos (C), linfócitos (D), e rácio neutrofilos/linfócitos (E) em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and- Whiskers-Plot). 2.3. MPO Na Figura 13A está representada a concentração plasmática da MPO. Não se observaram diferenças estatisticamente significativas na concentração de MPO entre os grupos. No entanto, os doentes com ICC grave apresentaram um aumento significativo, de aproximadamente 3 vezes, da atividade da MPO, em comparação com os doentes 58 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca com ICC moderada (45,15 ± 11,56 µmol/min/mg MPO vs. 15,90 ± 2,80 µmol/min/mg MPO, respetivamente) (Figura 13B). Figura 13 - Concentração (A) e atividade (B) MPO plasmática em doentes com ICC moderada (n=18) e grave (n=16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). *p<0.05 vs. doentes com ICC moderada. 2.4. LXs 2.4.1. Concentração sistémica de LXA4 e 15-epi-LXA4 Na Figura 14 estão representadas as concentrações de LXA4 e 15-epi-LXA4 no plasma. Observou-se uma diminuição significativa da concentração de LXA4 nos doentes com ICC grave (0,262 ± 0,034 ng/ml vs. 0,362 ± 0,039 ng/ml, p<0,05 vs. doentes com ICC moderada). Não se verificaram diferenças na concentração plasmática de 15-epi-LXA4 entre os dois grupos. Figura 14 - Concentração plasmática de LXA4 (A) e de 15-epi-LXA4 (B) em doentes com ICC moderada (n=17) e grave (n=15). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). *p<0,05 vs. doentes ICC moderada. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 59 2.4.2. Excreção urinária de LXA4 Para estudar a excreção urinária de LXA4, realizaram-se três tipos de normalizações dos resultados: em função do volume de urina excretado por dia (Figura 15A), em função da clearance estimada de creatinina (Figura 15B) e em função da concentração urinária de creatinina (Figura 15C). Não foram observadas variações significativas na excreção urinária de LXA4 entre os dois grupos de doentes, para qualquer das análises efetuadas. Figura 15 - Excreção urinária de LXA4 por dia (A), por clearance estimada de creatinina (B) e por creatinina urinária (C) em doentes com ICC moderada (n=16-17) e grave (n=15-16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). 2.4.3. Excreção urinária de 15-epi-LXA4 Para a análise da excreção urinária da 15-epi-LXA4 também se realizaram três normalizações, tal como para a LXA4 urinária. Apesar de a excreção urinária de 15-epi- LXA4 ser tendencialmente menor no grupo de doentes com ICC grave, só se observou uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos nos resultados normalizados em função do volume de urina excretado (4,88 ± 1,03 µg/dia vs 2,28 ± 0,44 µg/dia, *p<0,05 vs ICC moderada), não havendo variações na excreção normalizada em função da clearance da creatinina ou da creatinina urinária (Figura 16). Figura 16 - Excreção urinária de 15-epi-LXA4 por dia (A), por clearance estimada de creatinina (B) e por creatinina urinária (C) em doentes com ICC moderada (n=16-17) e grave (n=15-16). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot).*p<0,05 vs. doentes ICC moderada. 60 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 3. Marcadores de stresse oxidativo 3.1. AU e TAS Não se observaram diferenças significativas na concentração sérica de AU entre os dois grupos de doentes em estudo (Figura 17A) apesar de esta se encontrar tendencialmente aumentada nos doentes com ICC grave. Relativamente à TAS, verificaram-se diferenças significativas entre os doentes com ICC moderada e ICC grave (p<0,0001) (Figura 17B), com valores de 2,83 ± 0,14 µmol Trolox/ml e 3,90 ± 0,12 µmol Trolox/ml, respetivamente. Figura 17 - Concentração sérica de AU (A) e TAS no plasma (B) de doentes com ICC moderada (n=14-17) e grave (n=9- 15). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). ***p<0,001 vs. doentes com ICC moderada. 3.2. Excreção urinária de H2O2 e Isop Não se observaram diferenças significativas na excreção urinária de H2O2 nem de Isop entre os doentes com ICC moderada e grave (Figura 18). Figura 18 - Excreção urinária de H2O2 (A) e de Isop (B) em doentes com ICC moderada (n=14-16) e grave (n=8-14). Resultados apresentados em diagramas de extremos e quartis (Box-and-Whiskers-Plot). CAPÍTULO VI DISCUSSÃO FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 69 VI - DISCUSSÃO A formação de AA, resultante da hidrólise de fosfolípidos da membrana celular, e a sua posterior oxigenação por cicloxigenases e/ou lipoxigenases são passos críticos na regulação de processos inflamatórios nos quais se inicia a biossíntese de potentes compostos bioativos designados de eicosanoides, nos quais estão incluídas as LXs (Samuelsson, Funk et al. 1989). O recente e crescente interesse nas LXs foi motivado pela descoberta de que a regressão da inflamação é um processo ativo que envolve mediadores anti-inflamatórios produzidos por lipoxigenases no decurso de interações celulares (Chan and Moore 2010). Foi já demonstrada uma diminuição da produção destes compostos em algumas doenças crónicas tais como asma (Bonnans, Vachier et al. 2002), doença hepática (Claria, Titos et al. 1998) e leucemia mieloide (Stenke, Nasman-Glaser et al. 1991). Contudo, apesar de ser amplamente reconhecido o papel da inflamação na patogénese da ICC, não existem ainda estudos sobre as LXs nesta patologia. O nosso trabalho pretendeu assim investigar a relação entre estes mediadores anti-inflamatórios e a progressão da ICC, bem como analisar o efeito do tratamento com AAS na produção destas moléculas. Uma das principais conclusões do nosso estudo é que o agravamento da ICC está associado a uma diminuição da LXA4 sistémica. Isto é corroborado não só pela observação de menores concentrações deste eicosanoide no plasma de doentes com ICC grave mas também pela demonstração da existência de correlações inversas significativas entre a LXA4 plasmática e diversos marcadores estabelecidos de IC, tais como o BNP, a troponina, a PRC e o AU. Estes resultados sugerem ainda que a LXA4 plasmática pode ser também usada como um biomarcador na IC. A redução da concentração sistémica de LXA4 não parece ser devida a maior eliminação renal deste composto uma vez que não se verificou o aumento da sua excreção urinária nos doentes mais graves, nem a existência de uma correlação inversa entre a LXA4 plasmática e urinária. Foi já descrito que a diminuição da concentração de LXs observada em algumas doenças inflamatórias envolve a desregulação de enzimas envolvidas na sua produção, tais como a 15-LO (Levy 2005) com consequente decréscimo da capacidade de biossíntese destas moléculas. Contudo, não podemos excluir que a diminuição da LXA4 plasmática seja causada por uma maior inativação metabólica catalisada pela 15-PGDH. É importante sublinhar que o aumento da expressão e/ou atividade desta enzima poderia contribuir não só para o aumento do 70 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca catabolismo da LXA4 mas também para a inibição indireta da sua produção. De facto, é sabido que a 15-PGDH é responsável pela inativação de vários eicosanóides, entre os quais a PGE2 que parece ter um papel importante na indução da biossíntese da LXA4 (Ivanov and Romanovsky 2004; Chan and Moore 2010). Tem sido sugerido que a desregulação da síntese de LXs está relacionada com a dificuldade de resolução de uma reação inflamatória aguda, contribuindo para a progressão para um estado de inflamação crónica (McMahon and Godson 2004). Nos doentes com ICC grave foi evidenciado um aumento da atividade da MPO, uma enzima libertada pelos leucócitos ativados e conhecida pelas suas propriedades pró-inflamatórias e pró-oxidantes que contribuem para a disfunção endotelial, aterogénese, remodelação estrutural do miocárdio e arritmias cardíacas. Uma vez que as LXs inibem o recrutamento de leucócitos, a quimiotaxia e a adesão de neutrófilos ao endotélio e reduzem a atividade da MPO, não é de estranhar que a redução de LXs esteja associada a uma maior atividade desta enzima na ICC grave. Contudo, não foram observadas diferenças na concentração plasmática desta enzima, nem na contagem de leucócitos do sangue periférico. A concentração de MPO tem sido utilizada como marcador de inflamação (Kehl, Iqbal et al. 2012). Vários estudos descreveram que a concentração desta enzima aumenta com a gravidade da ICC (Tang, Brennan et al. 2006; Eleuteri, Di Stefano et al. 2009) o que poderá refletir uma exacerbação da ativação leucocitária, inflamação e stresse oxidativo (Tang, Brennan et al. 2006). A quantidade de leucócitos totais, bem como os seus subtipos e a razão N/L são também frequentemente utilizados para avaliar a ativação leucocitária e inflamação sistémica. O seu aumento está associado a eventos clínicos adversos e deste modo, a um maior risco de mortalidade (Tamhane, Aneja et al. 2008; Uthamalingam, Patvardhan et al. 2011; Imtiaz, Shafique et al. 2012). Contrariamente ao previsto, os nossos resultados não sugerem um aumento da ativação leucocitária. No entanto, também é possível que estes marcadores não sejam suficientemente sensíveis para detetar alterações significativas em populações pequenas como a do nosso estudo. De facto, é usual recorrer a uma estratégia de multi-marcadores para avaliar a ativação leucocitária (Santos-Silva, Rebelo et al. 2001). A concentração de uma enzima pode não estar diretamente relacionada com a sua atividade e inclusivamente foi já descrito que a atividade da MPO é independente da quantidade de neutrófilos (Kitahashi, Hino et al. 2000). Assim, quando se estuda o papel fisiopatológico de uma enzima é mais correto avaliar quer a quantidade quer a atividade enzimática. Tanto quanto sabemos, não existem ainda estudos publicados sobre a atividade de MPO na ICC humana. O nosso trabalho sugere que a atividade de MPO é um biomarcador inflamatório mais sensível do que a concentração desta enzima e poderá FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 71 funcionar como uma ferramenta adicional para o diagnóstico, prognóstico e monitorização da terapêutica da ICC. A elevação significativa da TAS no plasma foi outra alteração importante observada nos doentes com ICC grave. Alguns estudos referem que o AU contribui para mais de 50% desta capacidade antioxidante plasmática e que o aumento da TAS reflete sobretudo a elevação da concentração do AU que é um reconhecido biomarcador de risco cardiovascular (Young and Woodside 2001; Chuang, Shiesh et al. 2006). O aumento da concentração de AU está associado a um agravamento do prognóstico cardiovascular (Alderman, Cohen et al. 1999; Anker, Doehner et al. 2003). Estudos anteriores demonstraram que a concentração de AU na IC é tanto maior quanto mais grave o estado da doença (Leyva, Anker et al. 1997; Leyva, Anker et al. 1998; Leyva, Chua et al. 1998; Tereshchenko, Levchuk et al. 2000). No entanto, apesar de a concentração de AU estar tendencialmente aumentada nos doentes mais graves, neste estudo não se verificaram alterações significativas entre os dois grupos. Este facto pode indicar também uma maior sensibilidade da TAS como biomarcador de risco cardiovascular, comparativamente com o AU. Foi já sugerida a utilidade clínica da TAS como marcador da gravidade de condições patológicas como a sépsis (Chuang, Shiesh et al. 2006). A ICC grave está ainda associada a uma redução significativa da excreção urinária de 15-epi-LXA4, mas não da sua concentração plasmática. Esta diminuição não parece dever-se a uma maior inativação mediada pela 15-PGDH, uma vez que não foram detetadas alterações na excreção urinária de LXA4 que, como se sabe, é mais suscetível à degradação enzimática do que a 15-epi-LXA4 (Serhan, Maddox et al. 1995; Maddox 1997; Clish 1999). Assim, a diminuição da excreção urinária destes compostos poderá ser causada por uma redução da capacidade biossintética destes compostos no rim. A alteração da atividade e/ou expressão de enzimas como a COX-2, o citocromo P450 e a 5-LO pode comprometer a produção destas LXs, justificando os resultados obtidos (Levy 2006). No entanto, o facto de as normalizações para a clearance estimada da creatinina ou para a creatinina urinária anularem a significância estatística neste parâmetro sugere que a insuficiência renal possa ser o principal responsável pela diferença observada na excreção de 15-epi-LXA4 nos doentes com ICC grave. A IC está associada a um estado hipercoagulante, formação de trombos e embolismo cerebral (Kalaria, Passannante et al. 1998; Lip and Gibbs 1999; Uretsky, Thygesen et al. 2000). Sabe-se ainda que as plaquetas desempenham um papel fundamental na trombose coronária, o que as torna um alvo terapêutico. Por este motivo, torna-se clara a razão para a utilização de antiagregantes plaquetários como o AAS no tratamento da ICC. Tem sido descrito que o efeito protetor cardiovascular do AAS se 72 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca deve fundamentalmente às suas propriedades antiagregantes plaquetárias e não à sua atividade anti-inflamatória mediada pela inibição da COX-2, existindo ainda muita controvérsia em relação a este assunto, (Feng, Tracy et al. 2000; Azar, Klayme et al. 2003). No entanto, além de inibir irreversivelmente a COX-1 e reduzir consequentemente a síntese de tromboxanos, o AAS altera o perfil de atividade da COX-2 que passa a produzir 15-epi-LXA4 em vez de PGs (Stables and Gilroy 2011). O AAS pode ainda exercer efeitos antioxidantes diretos ou inibir indiretamente a produção de ROS (Chen, Zhao et al. 2012). Foi já descrito que doentes medicados com AAS mostraram reduções significativas no risco de morte cardiovascular (Hennekens, Dyken et al. 1997). Doses baixas deste fármaco (65 - 325mg/dia) parecem ser benéficas na redução de ataques cardíacos (Hennekens, Buring et al. 1989). Apesar dos mecanismos supracitados, neste estudo não foram encontradas diferenças na LXA4 plasmática e urinária, nem na 15-epi- LXA4 plasmática, induzidas pela terapêutica com AAS. No entanto, o tratamento com AAS aumentou marcadamente a excreção urinária de 15-epi-LXA4 nos doentes com ICC moderada, sugerindo uma maior síntese deste composto no rim (Claria and Serhan 1995). Vários estudos demonstram que a COX-2 é expressa de forma constitutiva no rim (Brater, Harris et al. 2001; Harris 2006). O grande aumento da excreção urinária de 15- epi-LXA4, mas não da 15-epi-LXA4 plasmática, nos doentes tratados com AAS, poderá indicar uma indução da COX-2 maioritariamente renal nas fases iniciais da ICC. Contudo, esta suposta capacidade biossintética de 15-epi-LXA4 perde-se nos doentes graves provavelmente devido ao maior estado de inflamação e oxidação e lesão renal. Embora não tenhamos observado alterações estatisticamente significativas nos restantes biomarcadores de disfunção/lesão cardíaca, inflamação e stresse oxidativo nos doentes tratados com AAS, verificámos que a concentração de BNP estava tendencialmente diminuída nos doentes com ICC moderada tratados com AAS. Isto sugere que o aumento da produção renal de 15-epi-LXA4 tem um efeito protetor na função cardíaca. Os peptídeos natriuréticos têm vindo a ganhar importância enquanto biomarcadores para o diagnóstico de IC e disfunção do miocárdio (Kehl, Iqbal et al. 2012). O BNP é um dos mais completos fatores preditivos de mortalidade e hospitalização relacionada com IC, e tem ações preponderantes contra anomalias fisiológicas no coração (Kehl, Iqbal et al. 2012). Os nossos resultados são concordantes com estudos anteriores (Sugiura, Takase et al. 2005; Vickery, Price et al. 2005) nos quais a concentração de BNP apresenta elevada precisão no diagnóstico e estratificação do risco de ICC, observando-se valores superiores a 400 pg/ml que são indicadores de um diagnóstico provável de ICC (Januzzi, Camargo et al. 2005; Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008). A elevação significativa de BNP nos doentes com ICC grave, em comparação com FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 73 os doentes com ICC moderada, valida a avaliação clínica e estratificação da população consoante a gravidade da doença. Por outro lado, a ausência de alterações expressivas na concentração sistémica de troponina, PRC e AU e na excreção urinária de H2O2 ou de Isop poder-se-á dever quer ao ainda reduzido número de doentes envolvidos neste estudo, quer ao efeito de diversos fármacos usados na terapêutica da IC, como os bloqueadores , inibidores da enzima de conversão da angiotensina ou antagonistas dos recetores da angiotensina II que poderão exercer efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes (Giordano 2005; Dandona, Ghanim et al. 2007; Evangelista, Garbin et al. 2007). O estudo realizado apresenta assim algumas limitações, tais como o número reduzido de doentes e a distribuição desigual da população quanto ao género, classes funcionais e terapêutica. Efetivamente, a população apresentava um predomínio de doentes do género masculino e com IC moderada, além de o número de doentes com ICC grave tratados com AAS ser muito inferior ao do grupo de doentes graves não tratados com este fármaco. CAPÍTULO VII CONCLUSÃO FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 83 Dufton, N., R. Hannon, et al. (2010). "Anti-inflammatory role of the murine formyl-peptide receptor 2: ligand-specific effects on leukocyte responses and experimental inflammation." J Immunol 184(5): 2611-2619. Eleuteri, E., A. Di Stefano, et al. (2009). "Increased nitrotyrosine plasma levels in relation to systemic markers of inflammation and myeloperoxidase in chronic heart failure." International Journal of Cardiology 135(3): 386-390. Elster, S. K., E. Braunwald, et al. (1956). "A study of C-reactive protein in the serum of patients with congestive heart failure." Am Heart J 51(4): 533-541. Engstrom, G., O. Melander, et al. (2009). "Carotid intima-media thickness, systemic inflammation, and incidence of heart failure hospitalizations." Arterioscler Thromb Vasc Biol 29(10): 1691-1695. Evangelista, S., U. Garbin, et al. (2007). "Effect of DL-nebivolol, its enantiomers and metabolites on the intracellular production of superoxide and nitric oxide in human endothelial cells." Pharmacol Res 55(4): 303-309. Feng, D., R. P. Tracy, et al. (2000). "Effect of short-term aspirin use on C-reactive protein." J Thromb Thrombolysis 9(1): 37-41. Finkel, T. (1999). "Signal transduction by reactive oxygen species in non-phagocytic cells." J Leukoc Biol 65(3): 337-340. Finkel, T. (2011). "Signal transduction by reactive oxygen species." J Cell Biol 194(1): 7-15. Fiore, S., J. F. Maddox, et al. (1994). "Identification of a human cDNA encoding a functional high affinity lipoxin A4 receptor." J Exp Med 180(1): 253-260. Fonarow, G. C. and T. B. Horwich (2003). "Combining natriuretic peptides and necrosis markers in determining prognosis in heart failure." Rev Cardiovasc Med 4 Suppl 4: S20-28. Gajarsa, J. J. and R. A. Kloner (2011). "Left ventricular remodeling in the post-infarction heart: a review of cellular, molecular mechanisms, and therapeutic modalities." Heart Fail Rev 16(1): 13-21. Ghiselli, A., M. Serafini, et al. (2000). "Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data." Free Radical Biology and Medicine 29(11): 1106- 1114. Giordano, F. J. (2005). "Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure." J Clin Invest 115(3): 500-508. Godson, C., S. Mitchell, et al. (2000). "Cutting edge: lipoxins rapidly stimulate nonphlogistic phagocytosis of apoptotic neutrophils by monocyte-derived macrophages." J Immunol 164(4): 1663-1667. Goetze, J. P., C. Christoffersen, et al. (2003). "Increased cardiac BNP expression associated with myocardial ischemia." FASEB J 17(9): 1105-1107. Grieve, D. J. and A. M. Shah (2003). "Oxidative stress in heart failure. More than just damage." Eur Heart J 24(24): 2161-2163. Hall, C. (2004). "Essential biochemistry and physiology of (NT-pro)BNP." Eur J Heart Fail 6(3): 257- 260. Harris, R. C. (2006). "COX-2 and the kidney." J Cardiovasc Pharmacol 47 Suppl 1: S37-42. Harzand, A., L. Tamariz, et al. (2012). "Uric Acid, Heart Failure Survival, and the Impact of Xanthine Oxidase Inhibition." Congestive Heart Failure 18(3): 179-182. Hennekens, C. H., J. E. Buring, et al. (1989). "Aspirin and other antiplatelet agents in the secondary and primary prevention of cardiovascular disease." Circulation 80(4): 749-756. Hennekens, C. H., M. L. Dyken, et al. (1997). "Aspirin as a therapeutic agent in cardiovascular disease: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association." Circulation 96(8): 2751-2753. Heymans, S., E. Hirsch, et al. (2009). "Inflammation as a therapeutic target in heart failure? A scientific statement from the Translational Research Committee of the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology." Eur J Heart Fail 11(2): 119-129. 84 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca Holvoet, P. (1998). "Oxidative modification of low-density lipoproteins in atherothrombosis." Acta Cardiol 53(5): 253-260. Horne, B. D., J. L. Anderson, et al. (2005). "Which White Blood Cell Subtypes Predict Increased Cardiovascular Risk?" Journal of the American College of Cardiology 45(10): 1638-1643. Horwich, T. B., et al. (2003). "Cardiac troponin I is associated with impaired hemodynamics, progressive left ventricular dysfunction, and increased mortality rates in advanced heart failure." Circulation 108(7): 6. Huehnergarth, K. V., D. Mozaffarian, et al. (2005). "Usefulness of Relative Lymphocyte Count as an Independent Predictor of Death/Urgent Transplant in Heart Failure." The American journal of cardiology 95(12): 1492-1495. Huwiler, A. and J. Pfeilschifter (2009). "Lipids as targets for novel anti-inflammatory therapies." Pharmacology & Therapeutics 124(1): 96-112. Imtiaz, F., K. Shafique, et al. (2012). "Neutrophil lymphocyte ratio as a measure of systemic inflammation in prevalent chronic diseases in Asian population." Int Arch Med 5(1): 2. Ivanov, A. I. and A. A. Romanovsky (2004). "Prostaglandin E2 as a mediator of fever: synthesis and catabolism." Front Biosci 9: 1977-1993. Januzzi, J. L., C. A. Camargo, et al. (2005). "The N-terminal Pro-BNP investigation of dyspnea in the emergency department (PRIDE) study." American Journal of Cardiology 95(8): 948-954. Jialal, I. and S. Devaraj (2003). "Role of C-reactive protein in the assessment of cardiovascular risk." The American journal of cardiology 91(2): 200-202. Jin, C., C. Hu, et al. (2009). "Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production." Hypertension 53(6): 1048-1053. Kadiiska, M. B., B. C. Gladen, et al. (2005). "Biomarkers of oxidative stress study II: are oxidation products of lipids, proteins, and DNA markers of CCl4 poisoning?" Free Radical Biol. Med. 38(6): 698-710. Kalaria, V. G., M. R. Passannante, et al. (1998). "Effect of mitral regurgitation on left ventricular thrombus formation in dilated cardiomyopathy." Am Heart J 135(2 Pt 1): 215-220. Kameda, K., T. Matsunaga, et al. (2003). "Correlation of oxidative stress with activity of matrix metalloproteinase in patients with coronary artery disease. Possible role for left ventricular remodelling." Eur Heart J 24(24): 2180-2185. Kardys, I., A. M. Knetsch, et al. (2006). "C-reactive protein and risk of heart failure. The Rotterdam Study." Am Heart J 152(3): 514-520. Kazanegra, R., V. Cheng, et al. (2001). "A rapid test for B-type natriuretic peptide correlates with falling wedge pressures in patients treated for decompensated heart failure: a pilot study." J Card Fail 7(1): 21-29. Kehl, D. W., N. Iqbal, et al. (2012). "Biomarkers in acute myocardial injury." Transl Res 159(4): 252- 264. Kitahashi, S., M. Hino, et al. (2000). "Nonspecific Response of Enzyme Immunoassay System to Myeloperoxidase Antigen Released From Blast Cells in Patients With Nonlymphocytic Leukemia." Laboratory Hematology 6: 121-125. Klebanoff, S. J. (2005). "Myeloperoxidase: friend and foe." J Leukoc Biol 77(5): 598-625. Kociol, R. D., P. S. Pang, et al. (2010). "Troponin Elevation in Heart FailurePrevalence, Mechanisms, and Clinical Implications." Journal of the American College of Cardiology 56(14): 1071- 1078. Kojima, S., T. Sakamoto, et al. (2005). "Prognostic usefulness of serum uric acid after acute myocardial infarction (the Japanese Acute Coronary Syndrome Study)." Am J Cardiol 96(4): 489-495. Kragelund, C., B. Gronning, et al. (2005). "N-terminal pro-B-type natriuretic peptide and long-term mortality in stable coronary heart disease." N Engl J Med 352(7): 666-675. Kushner, I., D. Rzewnicki, et al. (2006). "What Does Minor Elevation of C-Reactive Protein Signify?" The American journal of medicine 119(2): 166.e117-166.e128. Levin, E. R., D. G. Gardner, et al. (1998). "Natriuretic peptides." N Engl J Med 339(5): 321-328. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 85 Levine, B., J. Kalman, et al. (1990). "Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure." N Engl J Med 323(4): 236-241. Levy, B. D. (2005). "Diminished lipoxin biosynthesis in severe asthma." Am. J. Respir. Crit. Care Med. 172: 824-830. Levy, B. D. (2006). "Myocardial 15-epi-lipoxin A4 generation provides a new mechanism for the immunomodulatory effects of statins and thiazolidinediones." Circulation 114(9): 873- 875. Levy, B. D., C. B. Clish, et al. (2001). "Lipid mediator class switching during acute inflammation: signals in resolution." Nat Immunol 2(7): 612-619. Levy, B. D., K. Gronert, et al. (1999). Leukotriene and Lipoxin Biosynthesis. Handbook of Methods in Signal Transduction: Lipid Second Messengers. L. S. and R. R. P. Boca Raton, FL, CRC Press: 83–111. Leyva, F., S. Anker, et al. (1997). "Serum uric acid as an index of impaired oxidative metabolism in chronic heart failure." European Heart Journal 18(5): 858-865. Leyva, F., S. D. Anker, et al. (1998). "Uric acid in chronic heart failure: a marker of chronic inflammation." Eur Heart J 19(12): 1814-1822. Leyva, F., T.-P. Chua, et al. (1998). "Uric acid in chronic heart failure: A measure of the anaerobic threshold." Metabolism 47(9): 1156-1159. Libby, P. (2003). "Vascular biology of atherosclerosis: overview and state of the art." Am J Cardiol 91(3A): 3A-6A. Lilly, L. S. (2010). Pathophysiology of Heart Disease: A Collaborative Project of Medical Students and Faculty, Lippincott Williams & Wilkins. Lip, G. Y. and C. R. Gibbs (1999). "Does heart failure confer a hypercoagulable state? Virchow's triad revisited." J Am Coll Cardiol 33(5): 1424-1426. Lippi, G., M. Montagnana, et al. (2008). "The paradoxical relationship between serum uric acid and cardiovascular disease." Clin Chim Acta 392(1-2): 1-7. Loke, I., I. B. Squire, et al. (2003). "Reference ranges for natriuretic peptides for diagnostic use are dependent on age, gender and heart rate." Eur J Heart Fail 5(5): 599-606. Lüllmann, H. (2011). Color atlas of pharmacology. Stuttgart; New York, NY, Thieme. Luster, A. D., R. Alon, et al. (2005). "Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets." Nat Immunol 6(12): 1182-1190. Maddox, J. F. (1997). "Lipoxin A4 stable analogs are potent mimetics that stimulate human monocytes and THP-1 cells via a G-protein linked lipoxin A4 receptor." J. Biol. Chem. 272: 6972-6978. Maddox, J. F., S. P. Colgan, et al. (1998). "Lipoxin B4 regulates human monocyte/neutrophil adherence and motility: design of stable lipoxin B4 analogs with increased biologic activity." FASEB J 12(6): 487-494. Maderna, P. and C. Godson (2009). "Lipoxins: resolutionary road." Br J Pharmacol 158(4): 947-959. Maeder, M. T. and D. M. Kaye (2009). "Heart Failure With Normal Left Ventricular Ejection Fraction." J Am Coll Cardiol 53(11): 905-918. Mahmood, N., T. Naseem, et al. (2011). "Serum bilirubin and antioxidant levels in first degree relatives of patients with ischemic heart disease and normal subjects." J Ayub Med Coll Abbottabad 23(1): 96-98. Maisel, A. S., P. Krishnaswamy, et al. (2002). "Rapid measurement of B-type natriuretic peptide in the emergency diagnosis of heart failure." N Engl J Med 347(3): 161-167. Majno, G. and I. Joris (2004). Cells, Tissues, and Disease: Principles of General Pathology. New York, Oxford University Press. Malech, H. L. and W. M. Nauseef (1997). "Primary inherited defects in neutrophil function: etiology and treatment." Semin Hematol 34(4): 279-290. Mallat, Z., I. Philip, et al. (1998). "Elevated levels of 8-iso-prostaglandin F2alpha in pericardial fluid of patients with heart failure: a potential role for in vivo oxidant stress in ventricular dilatation and progression to heart failure." Circulation 97(16): 1536-1539. 86 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca Malle, E., P. G. Furtmuller, et al. (2007). "Myeloperoxidase: a target for new drug development?" Br J Pharmacol 152(6): 838-854. Mann, D. L. (2002). "Inflammatory mediators and the failing heart: past, present, and the foreseeable future." Circ Res 91(11): 988-998. Masson, S., R. Latini, et al. (2008). "Prognostic value of changes in N-terminal pro-brain natriuretic peptide in Val-HeFT (Valsartan Heart Failure Trial)." J Am Coll Cardiol 52(12): 997-1003. McMahon, B. and C. Godson (2004). "Lipoxins: endogenous regulators of inflammation." American Journal of Physiology - Renal Physiology 286(2): F189-F201. McMurray, J. J. V. (2010). "Systolic Heart Failure." New England Journal of Medicine 362(3): 228- 238. Milne, G. L., H. Yin, et al. (2011). "Isoprostane Generation and Function." Chemical Reviews 111(10): 5973-5996. Montuschi, P., P. Barnes, et al. (2007). "Insights into Oxidative Stress: The Isoprostanes." Current Medicinal Chemistry 14(6): 703-717. Morrow, D. A., C. P. Cannon, et al. (2007). "National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndromes." Circulation 115(13): e356-375. Morrow, D. A. and J. A. de Lemos (2007). "Benchmarks for the assessment of novel cardiovascular biomarkers." Circulation 115(8): 949-952. Mudd, J. O. and D. A. Kass (2008). "Tackling heart failure in the twenty-first century." Nature 451(7181): 919-928. Nauseef, W. M. (1988). "Myeloperoxidase deficiency." Hematol Oncol Clin North Am 2(1): 135- 158. Nauseef, W. M., I. Olsson, et al. (1988). "Biosynthesis and processing of myeloperoxidase--a marker for myeloid cell differentiation." Eur J Haematol 40(2): 97-110. Nieminen, M. S., M. Bohm, et al. (2005). "Executive summary of the guidelines on the diagnosis and treatment of acute heart failure: the Task Force on Acute Heart Failure of the European Society of Cardiology." Eur Heart J 26(4): 384-416. Packard, C. J., D. S. O'Reilly, et al. (2000). "Lipoprotein-associated phospholipase A2 as an independent predictor of coronary heart disease. West of Scotland Coronary Prevention Study Group." N Engl J Med 343(16): 1148-1155. Paul-Clark, M. J., T. van Cao, et al. (2004). "15-epi-lipoxin A4-mediated induction of nitric oxide explains how aspirin inhibits acute inflammation." J. Exp. Med. 200: 69-78. Peacock, W. F. t., T. De Marco, et al. (2008). "Cardiac troponin and outcome in acute heart failure." N Engl J Med 358(20): 2117-2126. Pearson, T. A., G. A. Mensah, et al. (2003). "Markers of inflammation and cardiovascular disease: application to clinical and public health practice: A statement for healthcare professionals from the Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart Association." Circulation 107(3): 499-511. Pepys, M. B. and G. M. Hirschfield (2003). "C-reactive protein: a critical update." The Journal of Clinical Investigation 111(12): 1805-1812. Pirro, M., J. Bergeron, et al. (2001). "Age and duration of follow-up as modulators of the risk for ischemic heart disease associated with high plasma C-reactive protein levels in men." Arch Intern Med 161(20): 2474-2480. Polidori, M. C., D. Pratico, et al. (2004). "Increased F2 isoprostane plasma levels in patients with congestive heart failure are correlated with antioxidant status and disease severity." J Card Fail 10(4): 334-338. Poole-Wilson, P. A. (2005). "Heart Failure: A Comprehensive Guide to Diagnosis and Treatment." New England Journal of Medicine 353(2): 212-214. Ramani, G. V., P. A. Uber, et al. (2010). "Chronic Heart Failure: Contemporary Diagnosis and Management." Mayo Clinic Proceedings 85(2): 180-195. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 87 Rhodes, B., B. G. Furnrohr, et al. (2011). "C-reactive protein in rheumatology: biology and genetics." Nat Rev Rheumatol 7(5): 282-289. Robbins, S. L., V. Kumar, et al. (2010). Robbins and Cotran pathologic basis of disease. Philadelphia, PA, Saunders/Elsevier. Romano, M., G. Luciotti, et al. (2002). "Urinary Excretion of Lipoxin A4 and Related Compounds: Development of New Extraction Techniques for Lipoxins." Lab Invest 82(9): 1253-1254. Romano, M., I. Recchia, et al. (2007). "Lipoxin receptors." ScientificWorldJournal 7: 1393-1412. Romano, M. and C. N. Serhan (1992). "Lipoxin generation by permeabilized human platelets." Biochemistry 31: 8269-8277. Rosamond, W. (2008). "Heart disease and stroke statistics [mdash] 2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee." Circulation 117: e25-e146. Rudiger, A., O. A. Burckhardt, et al. (2006). "The relative lymphocyte count on hospital admission is a risk factor for long-term mortality in patients with acute heart failure." Am J Emerg Med 24(4): 451-454. Ryan, A. and C. Godson (2010). "Lipoxins: regulators of resolution." Curr Opin Pharmacol 10(2): 166-172. Samuelsson, B., C. D. Funk, et al. (1989). "Molecular biology of leukotriene and lipoxin formation." Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res 19: 1-10. Santos-Silva, A., M. I. Rebelo, et al. (2001). "Leukocyte activation, erythrocyte damage, lipid profile and oxidative stress imposed by high competition physical exercise in adolescents." Clin Chim Acta 306(1-2): 119-126. Schaloske, R. H. and E. A. Dennis (2006). "The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids 1761(11): 1246-1259. Schindhelm, R. K., L. P. van der Zwan, et al. (2009). "Myeloperoxidase: a useful biomarker for cardiovascular disease risk stratification?" Clin Chem 55(8): 1462-1470. Schwab, J. M., N. Chiang, et al. (2007). "Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammationresolution programmes." Nature 447: 869-874. Sciarretta, S., A. Ferrucci, et al. (2007). "Markers of inflammation and fibrosis are related to cardiovascular damage in hypertensive patients with metabolic syndrome." Am J Hypertens 20(7): 784-791. Sela, S., R. Shurtz-Swirski, et al. (2005). "Primed peripheral polymorphonuclear leukocyte: a culprit underlying chronic low-grade inflammation and systemic oxidative stress in chronic kidney disease." J Am Soc Nephrol 16(8): 2431-2438. Serhan, C. N. (1989). "On the relationship between leukotriene and lipoxin production by human neutrophils: evidence for differential metabolism of 15-HETE and 5-HETE." Biochim Biophys Acta 1004(2): 158-168. Serhan, C. N. (1994). "Lipoxin biosynthesis and its impact in inflammatory and vascular events." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism 1212(1): 1-25. Serhan, C. N. (1995). "Leukocyte transmigration, chemotaxis, and oxygenated derivatives of arachidonic acid: when is chirality important?" Am J Respir Cell Mol Biol 12(3): 251-253. Serhan, C. N. (2000). "Novel functional sets of lipid-derived mediators with antiinflammatory actions generated from omega-3 fatty acids via cyclooxygenase 2-nonsteroidal antiinflammatory drugs and transcellular processing." J. Exp. Med. 192: 1197-1204. Serhan, C. N. (2004). "A search for endogenous mechanisms of anti-inflammation uncovers novel chemical mediators: missing links to resolution." Histochem. Cell Biol. 122: 305-321. Serhan, C. N. (2005). "Lipoxins and aspirin-triggered 15-epi-lipoxins are the first lipid mediators of endogenous anti-inflammation and resolution." Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 73(3-4): 141-162. 88 FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca Serhan, C. N. (2006). "Anti-inflammatory actions of neuroprotectin D1/protectin D1 and its natural stereoisomers: assignments of dihydroxy-containing docosatrienes." J. Immunol. 176: 1848-1859. Serhan, C. N., N. Chiang, et al. (2008). "Resolving inflammation: dual anti-inflammatory and proresolution lipid mediators." Nat Rev Immunol 8(5): 349-361. Serhan, C. N., M. Hamberg, et al. (1984). "Lipoxins: novel series of biologically active compounds formed from arachidonic acid in human leukocytes." Proc Natl Acad Sci U S A 81(17): 5335-5339. Serhan, C. N., J. F. Maddox, et al. (1995). "Design of lipoxin A4 stable analogs that block transmigration and adhesion of human neutrophils." Biochemistry 34: 14609-14615. Serhan, C. N. and K. A. Sheppard (1990). "Lipoxin formation during human neutrophil-platelet interactions. Evidence for the transformation of leukotriene A4 by platelet 12- lipoxygenase in vitro." J Clin Invest 85(3): 772-780. Serhan, C. N., S. Yacoubian, et al. (2008). "Anti-Inflammatory and Proresolving Lipid Mediators." Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 3(1): 279-312. Shah, A. M. and D. L. Mann (2011). "In search of new therapeutic targets and strategies for heart failure: recent advances in basic science." Lancet 378(9792): 704-712. Sies, H. (1993). "Strategies of antioxidant defense." European Journal of Biochemistry 215(2): 213- 219. Siflinger-Birnboim, A. and A. B. Malik (1996). "Regulation of endothelial permeability by second messengers." New Horiz 4(1): 87-98. Sousa, T., J. Afonso, et al. (2012). Lipid Peroxidation and Antioxidants in Arterial Hypertension. Lipid Peroxidation. A. Catala, InTech: 345-392. Sousa, T., S. Oliveira, et al. (2012). "Role of H(2)O(2) in hypertension, renin-angiotensin system activation and renal medullary disfunction caused by angiotensin II." Br J Pharmacol 166(8): 2386-2401. Sousa, T., D. Pinho, et al. (2008). "Role of superoxide and hydrogen peroxide in hypertension induced by an antagonist of adenosine receptors." Eur J Pharmacol 588(2-3): 267-276. Stables, M. J. and D. W. Gilroy (2011). "Old and new generation lipid mediators in acute inflammation and resolution." Prog Lipid Res 50(1): 35-51. Stenke, L., B. Nasman-Glaser, et al. (1991). "Lipoxygenase products in myeloproliferative disorders: increased leukotriene C4 and decreased lipoxin formation in chronic myeloid leukemia." Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res 21B: 883-886. Stenvinkel, P., E. Rodriguez-Ayala, et al. (2006). "Statin treatment and diabetes affect myeloperoxidase activity in maintenance hemodialysis patients." Clin J Am Soc Nephrol 1(2): 281-287. Stocker, R. and J. F. Keaney, Jr. (2004). "Role of oxidative modifications in atherosclerosis." Physiol Rev 84(4): 1381-1478. Sugiura, T., H. Takase, et al. (2005). "Circulating levels of myocardial proteins predict future deterioration of congestive heart failure." Journal of Cardiac Failure 11(7): 504-509. Suzuki, K., H. Ota, et al. (1983). "Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes." Anal Biochem 132(2): 345-352. Takano, T. (1997). "Aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 and LXA4 stable analogs are potent inhibitors of acute inflammation: evidence for anti-inflammatory receptors." J. Exp. Med. 185: 1693-1704. Takano, T., C. B. Clish, et al. (1998). "Neutrophil-mediated changes in vascular permeability are inhibited by topical application of aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 and novel lipoxin B4 stable analogues." The Journal of Clinical Investigation 101(4): 819-826. Takimoto, E. and D. A. Kass (2007). "Role of oxidative stress in cardiac hypertrophy and remodeling." Hypertension 49: 241-248. FCUP Avaliação de Lipoxinas na Insuficiência Cardíaca 89 Tamhane, U. U., S. Aneja, et al. (2008). "Association Between Admission Neutrophil to Lymphocyte Ratio and Outcomes in Patients With Acute Coronary Syndrome." The American journal of cardiology 102(6): 653-657. Tang, W. H., M. L. Brennan, et al. (2006). "Plasma myeloperoxidase levels in patients with chronic heart failure." Am J Cardiol 98(6): 796-799. Tang, W. H. W., M.-L. Brennan, et al. (2006). "Plasma Myeloperoxidase Levels in Patients With Chronic Heart Failure." The American journal of cardiology 98(6): 796-799. Tereshchenko, S. N., N. N. Levchuk, et al. (2000). "[Level of blood uric acid in patients with postinfarction heart failure]." Ter Arkh 72(9): 57-60. Ting, H. J. and F. T. Khasawneh (2010). "Platelet function and Isoprostane biology. Should isoprostanes be the newest member of the orphan-ligand family?" J Biomed Sci 17(1): 24. Tsutamoto, T., A. Wada, et al. (1997). "Attenuation of compensation of endogenous cardiac natriuretic peptide system in chronic heart failure: prognostic role of plasma brain natriuretic peptide concentration in patients with chronic symptomatic left ventricular dysfunction." Circulation 96(2): 509-516. Ungvari, Z., S. A. Gupte, et al. (2005). "Role of oxidative-nitrosative stress and downstream pathways in various forms of cardiomyopathy and heart failure." Curr Vasc Pharmacol 3(3): 221-229. Uretsky, B. F., K. Thygesen, et al. (2000). "Acute coronary findings at autopsy in heart failure patients with sudden death: results from the assessment of treatment with lisinopril and survival (ATLAS) trial." Circulation 102(6): 611-616. Uthamalingam, S., E. A. Patvardhan, et al. (2011). "Utility of the neutrophil to lymphocyte ratio in predicting long-term outcomes in acute decompensated heart failure." Am J Cardiol 107(3): 433-438. Vickery, S., C. P. Price, et al. (2005). "B-type natriuretic peptide (BNP) and amino-terminal proBNP in patients with CKD: Relationship to renal function and left ventricular hypertrophy." American Journal of Kidney Diseases 46(4): 610-620. Wallace, T. W., S. M. Abdullah, et al. (2006). "Prevalence and determinants of troponin T elevation in the general population." Circulation 113(16): 1958-1965. Wang, T. J., M. G. Larson, et al. (2004). "Plasma natriuretic peptide levels and the risk of cardiovascular events and death." N Engl J Med 350(7): 655-663. Wu, A. H. and L. Ford (1999). "Release of cardiac troponin in acute coronary syndromes: ischemia or necrosis?" Clin Chim Acta 284(2): 161-174. Xue, C., H. Yu, et al. (2003). "Clinical significance of serum cardiac troponin T in patients with congestive heart failure." Chin Med J (Engl) 116(3): 469-471. Yin, W.-H., J.-W. Chen, et al. (2004). "Independent prognostic value of elevated high-sensitivity C- reactive protein in chronic heart failure." American heart journal 147(5): 931-938. Young, I. S. and J. V. Woodside (2001). "Antioxidants in health and disease." Journal of Clinical Pathology 54(3): 176-186. Zhang, C., J. Yang, et al. (2003). "Interaction of myeloperoxidase with vascular NAD(P)H oxidasederived reactive oxygen species in vasculature: implications for vascular diseases." Am J Physiol Heart Circ Physiol 285(6): H2563-2572. Zimmet, J. M. and J. M. Hare (2006). "Nitroso-redox interactions in the cardiovascular system." Circulation 114(14): 1531-1544.