Separação enantiomérica de derivados catinónicos em drogas de abuso por HPLC quiral - Estudo da citotoxidade dos enantiómeros da 3,4- metilenodioxipirovalerona (MDPV)

Separação enantiomérica de derivados catinónicos em drogas de abuso por HPLC quiral Estudo da citotoxicidade dos enantiómeros da 3,4metilenodioxipirovalerona (MDPV) Bárbara Sofia Poléri da Silva Mestrado em Ciências Forenses Orientação Professor Doutor Fernando Manuel Gomes Remião Doutora Maria Paula do Amaral Alegria Guedes de Pinho Professora Doutora Carla Sofia Garcia Fernandes Universidade do Porto Setembro de 2015 “A ciência não é uma ilusão, mas seria uma ilusão acreditar que poderemos encontrar noutro lugar o que ela não nos pode dar.” Sigmund Freud v Agradecimentos Este trabalho foi uma das muitas etapas que passarei na vida. E, como em todas elas, nunca as conseguiria ultrapassar sem ajuda. Sendo assim, não poderia deixar de agradecer a todas as pessoas que fizeram com que a realização deste trabalho fosse possível. Gostaria de agradecer:  Ao professor Doutor Fernando Remião e à Doutora Paula Guedes pela oportunidade da realização desta tese e orientação nesta jornada tão importante. Sem eles nada disto seria possível.  À Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, por me ter permitido realizar o trabalho experimental no laboratório de Toxicologia que dirige.  À Professora Doutora Carla Fernandes pela coorientação e grande ajuda na realização deste trabalho, que sem a sua ajuda e conhecimento não teria sido possível  À Professora Doutora Madalena Pinto, responsável pelo Laboratório de Química Orgânica e Farmacêutica, por permitir a realização do trabalho de HPLC  À Dra Sara Cravo pela ajuda técnica no HPLC e pelas horas perdidas na formação do “famoso” cloridrato  À Estudante de doutoramento Maria João pela ajuda nos testes de citotoxicidade  Às amigas que ganhei neste mestrado que muito me aturaram a “resmungar” sobre aquilo que me corria menos bem e à amizade e apoio que me deram e como me acolheram  À minha família e ao meu namorado por me aturarem nos dias menos bons por me darem ânimo para seguir em frente e nunca desistir. vii Alguns resultados deste trabalho foram apresentados em forma de comunicação em painel na 8ª edição do Encontro Investigação Jovem da Universidade do Porto (IJUP 2015): - B. Silva, C. Fernandes, M. Pinto, P. Guedes de Pinho and F. Remião, Chiral HPLC enantioresolution of synthetic cathinones “Legal Highs”, IJUP 2015, Porto, Portugal, 1315 maio de 2015. O resumo e poster encontram-se no Anexo 1. ix Resumo As denominadas “drogas legais” têm vindo a ter cada vez mais popularidade no “mundo das drogas”. Estas drogas eram vendidas nas antigas “smartshops” e continuam a ser comercializadas através da internet. Dentro deste grupo de drogas de abuso, as catinonas sintéticas estão em grande destaque, pois tem havido um crescimento exponencial do seu consumo, ano após ano. Todas as catinonas sintéticas são quirais e, num ambiente quiral, como o nosso corpo, as propriedades geralmente diferem entre os enantiómeros. Na realidade, estes podem ter efeitos e potências biológicas diferentes, com casos em que apenas um dos enantiómeros apresenta ação biológica. Sendo assim, é de enorme importância separar os enantiómeros de derivados catinónicos presentes em “drogas legais” de forma a analisar a proporção em que estes se encontram nas mesmas assim como avaliar os efeitos biológicos de cada um. Em conformidade, o principal objetivo deste trabalho consistiu em desenvolver um método de HPLC quiral capaz de separar e determinar a proporção enantiomérica de catinonas sintéticas presentes em amostras destas drogas, adquiridas nas antigas “smartshops”, que continuam a circular no mercado por meio da internet. Para além disso, efetuou-se a resolução semi-preparativa por HPLC quiral dos enantiómeros de uma das catinonas estudadas, a MDPV, para posteriores estudos de enantiosseletividade em ensaios de hepatotoxicidade. Nestes ensaios de citotóxicidade foram usados modelos in vitro, tais como culturas primárias de hepatócitos de rato. Os resultados obtido mostraram que a proporção enantiomérica das catinonas presentes nas amostras testadas era, na sua maioria, de 50:50 (mistura racémica), com exceção das amostras que continham o derivado de catinona 4-MEC. Nos estudos de citotoxicidade, as células foram expostas à mistura racémica de MDPV e a cada um dos seus enantiómeros isolados, em cinco concentrações diferentes (0, 0,2, 0,4, 0,8 e 1,6 mM). Os resultados dos testes de citotoxicidade revelaram que não existe enantiosseletividade para a MDPV, sendo a ação de ambos os enantiómeros idêntica à da mistura racémica. xvi Khat: Catha edulis M: Molar MAO: Monoamina Oxidase MDMA: 3,4-metilenodioximetanfetamina MDPBP: 3,4-Metilenodioxi-α-pirrolidinobutirofenona MDPPP: 3,4-metilenodioxi-α-pirrolidinopropiofenona MDPV: 3,4-metilenodioxipirovalerona mg: Miligrama min: Minutos mL: Mililitros mM: Milimolar mm: Milimetros MTT: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilltetrazólio ng: Nanograma nm: Nanometro NRG: Grupo de catinonas denominado "Energy" OEDT: Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência Pen/Strep: Penicilina/estreptomicina Rs: Fator de resolução SNC: Sistema Nervoso Central T0: Tempo morto TEA: Trietilamina TFA: Ácido trifluoracético tr: Tempo de retenção UV: Ultravioleta W: Largura da banda cromatográfica d: dextrógiro l: levógiro xvii Índice de Figuras Figura 1 Bloom - um exemplo de “drogas legais ” vendidas em Portugal. ...................... 3 Figura 2 Número de novas substâncias psicoativas notificadas entre 2005 e 2014. (adaptado de [8]) ....................................................................................................................... 5 Figura 3 Planta Khat. ......................................................................................................... 6 Figura 4 Estrutura química da catina (A) e da catinona (B). ............................................. 6 Figura 5 Metabolismo da catinona. (adaptado de [11]) ............................................................. 7 Figura 6 Estrutura química da anfetamina. ...................................................................... 8 Figura 7 Estrutura química geral das catinonas sintéticas. ............................................ 10 Figura 8 Diferentes vias metabólicas de Fase I para derivados de catinona. (A) Desmetilação (B) Redução da β-cetona (C) Hidroxilação seguida de oxidação (D) Desmetilação seguida por O-metilação (E) Hidroxilação seguida de desidrogenação em lactama. (adaptado de [12]) ..................................................................................................... 17 Figura 9 Principais vias metabólicas de fase I de derivados β-cetónicos com anel de 3,4metilenodioxi. (adaptado de [48]) ............................................................................................ 18 Figura 10 Metabolismo de fase I da mefedrona. (adaptado de [37]) ...................................... 19 Figura 11 Metabolismo da MDPV. (adaptado do [33]) ............................................................ 20 Figura 12 Número de apreensões de catinonas sintéticas entre 2008 e 2013. (adaptado de [8]) .................................................................................................................................... 23 Figura 13 Imagens especulares de dois enantiómeros num espelho plano. ................. 24 Figura 14 Enantiómeros R e S do ácido láctico. .............................................................. 25 Figura 15 Quiralidade de novas moléculas. a - Percentagem e número novas moléculas aprovadas pela FDA b – Percentagem e número de novas moléculas aprovadas em todo o mundo. (adaptado de [55]) ........................................................................................... 26 Figura 16 Catinonas sintéticas avaliadas neste trabalho. .............................................. 47 Figura 17 Esquema de preparação das soluções para análise. ...................................... 49 xviii Figura 18 Estrutura da fase estacionária Whelk-O®1. .................................................... 50 Figura 19 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A8; Coluna Whelk-O® 1; Fase móvel Hex:EtOH:TEA:TFA (95:5:0,05:0,05); Fluxo 1 mL/min; Deteção UV 254nm. ............................................................................ 50 Figura 20 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A8; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 1 mL/min; Deteção UV 254nm. ............................................................................ 51 Figura 21 Cromatograma da separação da Metilona; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 1 mL/min; Deteção UV 254nm...................... 52 Figura 22 Cromatograma da separação da Pentedrona; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); 0,8mL/min; Deteção UV 254nm. ............................ 53 Figura 23 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Flefedrona presentes na amostra Blast A3; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,8 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 54 Figura 24 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 3,4-DMMC presentes na amostra Cyclop A6; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,8 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 54 Figura 25 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Bufedrona presentes na amostra Kick A14; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,8 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 54 Figura 26 Cromatograma da separação da 4-MEC; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ............................ 55 Figura 27 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Bufedrona e da Etcatinona presentes na amostra Charlie A10; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ............................ 55 Figura 28 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Pentedrona presentes na amostra Kick A13; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móve Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 56 Figura 29 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Bufedrona presentes na amostra Rush A4; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móve Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ................................................................................... 56 xix Figura 30 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Bufedrona e Etcatinona presentes na amostra Charlie A9; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ........................................................ 57 Figura 31 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 4-MEC presentes na amostra Blow A11; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 57 Figura 32 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 4-MEC presentes na amostra Blow A12; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 58 Figura 33 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A8; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 58 Figura 34 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A7; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 58 Figura 35 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 3,4-DMMC presentes na amostra Crabby A5; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 59 Figura 36 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 3,4-DMMC presentes na amostra Cyclop A6; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 59 Figura 37 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metilona presentes na amostra Bliss A15; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ......................................................................... 60 Figura 38 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metilona; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ............................................................................................................................ 60 Figura 39 Cromtagrama da separação dos enantiómeros da Pentedrona, 4-MEC e Metilona presentes na amostra Bloom A1; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ....................................... 61 Figura 40 Cromatograma da separação dos enantiómeros Pentedrona, Etcatinona e Metedrona presentes na amostra Bloom A2; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. ............................ 61 xx Figura 41 Cromatograma da Bufedrona a A) UV: 254nm e a B) Polarímetro; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min ................ 64 Figura 42 Cromatograma da 4-MEC a A) UV: 254nm e a B) Polarímetro; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min ................ 64 Figura 43 Cromatograma da Pentedrona a A) UV: 254nm e a B) Polarímetro; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min ................ 65 Figura 44 Cromatograma da separação dos enantiómeros da MDPV; coluna CSP2; Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min;Deteção UV:254 nm ...................... 67 Figura 45 Fase quiral derivado de fenilcarbamato de amilose: tris(3,5dimetilfenilcarbamato) ................................................................................................... 69 Figura 46 Cromatograma da separação semi-preparativa dos enantiómeros da MDPV; coluna de tris-3,5-dimetilfenilcarbamato aderida a APSNucleosil;Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo de 1,5 mL/min; Deteção UV:254 nm ........................... 70 Figura 47 Eliminação da TEA por extração múltipla líquido-líquido. ............................. 71 Figura 48 Cromatograma do excesso enantiomérico do enantiómero S-(-)-MDPV; coluna CSP2; Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV:254 nm ................................................................................................................................... 73 Figura 49 Cromatograma do excesso enantiomérico do enantiómero R-(+)-MDPV ; coluna CSP2; Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV:254 nm ................................................................................................................................... 73 Figura 50 Cromatograma do excesso enantiomérico do enantiómero R-(+)-MDPV após reinjeção Cromatograma do excesso enantiomérico do enantiómero R-(+)-MDPV ; coluna CSP2; Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV:254 nm ................................................................................................................................... 74 Figura 51 Redução do MTT em hepatócitos de rato incubados com cloridrato de MDPV racémico ou cada um dos seus enantiómeros (0,2 – 1,6 mM), durante 24 e 48 h. **p<0,01, ****p<0,0001 vs. controlo. ........................................................................... 76 Figura 52 Redução do MTT em hepatócitos de rato incubados com cloridrato de MDPV racémico ou cada um dos seus enantiómeros (0,2 – 1,6 mM), durante 24 e 48 h. **p<0,01, ****p<0,0001 vs. controlo. ........................................................................... 77 xxi Índice de Tabelas Tabela 1. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 1. ......................... 11 Tabela 2. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 2 .......................... 12 Tabela 3. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 3 .......................... 12 Tabela 4. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 4 .......................... 13 Tabela 5. Alguns acontecimentos históricos relevantes das catinonas e seus derivados ........................................................................................................................................ 15 Tabela 6. Efeitos provocados pelas catinonas sintéticas (adaptado de [41]) ................ 22 Tabela 7. Alguns exemplos de diferenças na atividade biológica de pares enantioméricos (adaptado de [54]) ................................................................................ 25 Tabela 8. Exemplos de diferentes tipos de FEQs (adaptado de [59]) ............................ 28 Tabela 9. Amostras utilizadas e sua identificação por GC-MS e NMR (adaptado de [30]) ........................................................................................................................................ 48 Tabela 10. Dados cromatográficos obtidos na separação enantiomérica de catinonas sintéticas com a utilização da Chiralpak® AS-H a um fluxo de 1 mL/min ...................... 52 Tabela 11. Dados cromatográficos obtidos na separação enantiomérica de catinonas sintéticas com a utilização da Chiralpak® AS-H a um fluxo de 0,8 mL/min ................... 53 Tabela 12. Resultados cromatográficos obtidos com a coluna Chiralpak® AS-H para as 8 catinonas sintéticas presentes nas diferentes amostras ............................................... 62 xxii Tabela 13. Proporções enantioméricas das catinonas presentes nas amostras de “drogas legais” ................................................................................................................ 63 Tabela 14. Ordem de eluição vs atividade ótica de diferentes catinonas ..................... 64 Tabela 15. Colunas e fases móveis testadas para a separação da MDPV...................... 66 Tabela 16. Dados cromatográficos da separação enantiomérica da MDPV. ................. 67 Tabela 17. Atividade ótica dos enantiómeros da MDPV ................................................ 72 Tabela 18. Dados cromatográficos obtidos para cálculo do excesso enantiomérico do enantiómero S-(-)-MDPV ................................................................................................ 74 Tabela 19. Dados cromatográficos obtidos para cálculo do excesso enantiomérico do enantiómero R-(+)-MDPV ............................................................................................... 74 Tabela 20. Dados cromatográficos obtidos para cálculo do excesso enantiomérico do R-(+)-MDPV após reinjeçao ............................................................................................ 74 Introdução 1.”Drogas Legais” 2.Catinonas Naturais 3.Catinonas Sintéticas 4.Quiralidade 3 1. “Drogas Legais” O uso de substâncias como drogas de abuso tem aumentado exponencialmente nas últimas décadas. Entre estas, no início do século XXI, deu-se início ao consumo das denominadas “drogas legais” [1]. As “drogas legais” dizem respeito a uma grande variedade de substâncias, de origem natural ou sintética, que são distribuídas e comercializadas para uso recreativo devido aos seus efeitos psicoestimulantes. Estes compostos podem diferir tanto na estrutura química, potência, semivida, metabolismo e efeitos colaterais [2, 3]. No entanto, normalmente, estas drogas têm a particularidade comum de aumentarem a atividade dopaminérgica e inibirem a recaptação da serotonina, causando agitação psicológica e física, euforia e disforia. Com doses elevadas destas substâncias podem ainda ocorrer sintomas psicóticos, nomeadamente, alucinações visuais e auditivas [3]. A evolução e globalização das novas tecnologias levou, de alguma forma, ao desenvolvimento deste novo mercado de consumo, uma vez que o comércio e a comunicação já não são constrangidos pelas barreiras físicas ou geográficas. Assim, a grande maioria destas substâncias é vendida na internet, principalmente depois do fecho das designadas “smartshops” [1]. Na figura 1 é apresentado um exemplo de uma “droga legal” que era vendida em “smartshops” em Portugal até há recente proibição da sua comercialização. Figura 1 Bloom - um exemplo de “drogas legais ” vendidas em Portugal. 10 em diferentes locais da molécula [11]. A estrutura geral de uma catinona sintética (Figura 7) mostra as possibilidades de substituição em quatro pontos distintos (R1, R2, R3 e R4) da molécula original de catinona [7]. Apesar de apresentarem a mesma estrutura central, os derivados de catinona são divididos quimicamente em quatro grupos distintos [5]: 1. Catinonas “clássicas” - consistem num anel benzénico, substituído ou não substituído, e uma cadeia lateral linear. 2. Catinonas "3,4-metilenodioxifenilo” - são constituídas por um anel 3,4metilenodioxifenilo e uma cadeia lateral. 3. Catinonas derivados de pirrolidinopropiofenona - consistem num anel benzénico, substituído ou não substituído, e um anel de pirrolidinilo no nitrogénio da cadeia lateral. 4. Catinonas "mistas" - contêm um anel 3,4-metilenodioxifenilo e um anel de pirrolidinilo. Nas Tabelas 1, 2, 3 e 4 são apresentadas as estruturas químicas de várias catinonas sintéticas pertencentes aos 4 grupos mencionados anteriormente. Figura 7 Estrutura química geral das catinonas sintéticas. 11 *1 4-metiletcatinona *2 4-fluorometcatinona *3 3,4-dimetilmetcatinona Tabela 1. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 1. Grupo Nome Estrutura Química Nome Estrutura Química Derivados N-Alquilados Mefedrona Etcatinona ou etilpropiona ou Netilcatinona Bupropiona ou amfebutamona 4-MEC*1 Dimetilpropiona ou dimetilcatinona ou metamfepramona Metedrona Dietilpropiona ou amfepramona Bufedrona Flefedrona ou 4FMC+2 Pentedrona 3,4-DMMC*3 Efedrona ou Metcatinona 12 Tabela 2. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 2 Grupo Nome Estrutura Química Derivados 3,4-metilenodioxi-Nalquilados Metilona ou βk-MDMA Etilona ou βk-MDEA Butilona ou βk-MBDB Pentilona ou βk-MBDP Tabela 3. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 3 Grupo Nome Estrutura Química Nome Estrutura Química Derivados Pirrolidinos Pirovalerona 4-metil-αpirrolidinopropiof enona ou MPPP α-PPP 4-metoxi-αpirrolidinopropiof enona ou MOPPP αpirrolidinovalerof enona (α-PVP) 4-metil-αpirrolidinobutiofe nona ou MPBP 13 3.2 Desenvolvimento Após a confirmação de que a catinona era um dos constituintes ativos de Khat, foram sintetizados os primeiros derivados de catinona, designadamente a efedrona e a mefedrona (Tabela 1) [12]. Estes derivados foram sintetizados no início do século XX para fins terapêuticos, devido aos seus efeitos estimulantes ao nível do SNC. Apenas na última década, é que o uso recreativo destas novas substâncias ganhou popularidade entre os consumidores [11, 12]. A bupropiona, a dietilpropiona e a dimetilpropiona (Tabela 1) são outros exemplos de derivados de catinona que foram inicialmente sintetizados para fins terapêuticos [11]. A efedrona foi desenvolvida nos anos 30 como agente antidepressivo, porém, deixou rapidamente de ser comercializada, pois apresentava um enorme poder de adição e um estímulo mais potente que a cocaína e a própria catinona [23]. Estes dois Tabela 4. Exemplos de catinonas sintéticas pertencentes ao grupo 4 Grupo Nome Estrutura Química Derivados 3,4-metilenodioxi-N-alquilados e pirrolidinos 3,4metilenodioxipirovalerona ou MDPV 3,4-metilenodioxi αpirrolidinopropiofenona ou MDPPP 3,4-Metilenodioxi-αpirrolidinobutirofenona ou MDPBP 14 fatores levaram a um consumo abusivo desta substância. Consequentemente, desde os anos 90, esta tem estado envolvida em inúmeras intoxicações [11]. Em 1996, a metilona (Tabela 2) foi também sintetizada como agente antidepressivo e como antiparkinsónico [24]. Logo de seguida, surgiram os derivados pirrolidinos da catinona e, no início do século XXI, foi desenvolvida a pirovalerona (Tabela 3) para tratar a obesidade, fadiga crónica e letargia. No entanto, uma vez mais, a pirovalerona foi rapidamente retirada de tratamentos clínicos devido ao seu efeito de dependência [6]. A família dos derivados pirrolidinos de catinona também incluía substâncias psicoativas que não eram destinadas a um fim terapêutico, nomeadamente, MPPP, MPHP, MPBP, MOPPP, MDPPP e MDPV (Tabela 3) [11]. Com fins recreativos e não terapêuticos, a metilona foi o primeiro derivado de catinona a ser comercializado, em 2004, sob a marca “Explosion”. A sua aquisição era fácil devido à sua comercialização através da internet e nas ”smartshops” [22]. A mefedrona (Tabela 1), conhecida na rua como “M-Cat”, “Meph”, “Subcoca”, “TopCat “ ou “Miau Miau”, tornou-se popular na Europa a partir de 2008, após ser proibida em Israel, país onde começou a ser comercializada [12]. No mesmo ano, para além da mefedrona, foram identificadas mais 5 catinonas sintéticas, designadamente a etcatinona, flefedrona e seu isómero de posição 3fluorometcatinona (3-FMC), butilona e MDPV [25]. A etcatinona, a bufedrona e a metedrona (Tabela 1) surgiram no mercado como uma alternativa legal à mefedrona. A flefedrona e a 3-FMC foram os derivados seguintes a alcançar o mercado, seguindose a butilona e a etilona e, finalmente, a MDPV [25-27]. Curiosamente, a procura pelos consumidores destes derivados de mefedrona aumentou consideravelmente após terem passado a ser controlados na União Europeia [11]. Como consequência da proibição da mefedrona e dos seus derivados, um grupo de catinonas denominado "Energy" (NRG), anunciado como análogos naftilo da catinona, começou a ser comercializado [11]. De seguida, surgiram a 3,4-DMMC, a pentedrona (Tabela 1) e α-PVP (Tabela 3) [28, 29]. A regulamentação de drogas sintéticas como os derivados de catinona é um trabalho de difícil concretização, uma vez que estas novas drogas são facilmente substituídas por outras através de modificações na sua estrutura original [11]. 15 As razões que levaram a um aumento na procura destes derivados de catinona estão relacionadas com o seu baixo custo, efeitos psicoativos semelhantes à cocaína e anfetaminas, diminuição da pureza da MDMA e cocaína, assim como a fácil acessibilidade que se verificou através das “smartshops” e da internet [12]. Alguns dos acontecimentos históricos mais relevantes relacionados com estas drogas encontram-se resumidos na Tabela 5. Tabela 5. Alguns acontecimentos históricos relevantes das catinonas e seus derivados Data Acontecimento Século XVIII Khat (Catha edulis) é descrita pela primeira vez por Peter Forskal Início do século XX Produção dos primeiros derivados de catinona (efedrona e mefedrona) para uso terapêutico 1930 A catina foi isolada da planta Khat pela primeira vez por Wolfes 1975 A catinona é isolada das folhas da planta Khat e identificada como o seu princípio ativo Última década do século XX Consumo abusivo de metcatinona 1996 Síntese da metilona Início século XXI Aparecimento dos derivados pirrolidinos da catinona 2004 A metilona começa a ser comercializada para fins recreativos com o nome “Explosão” através da Internet e “smartshops” 2008 Aparecimento da mefedrona na Europa 2010 Um grupo denominado "Energia" (NRG), anunciado como análogos naftilo de catinona aparece como alternativa à mefedrona 2013 Os derivados de catinona são banidos das “smartshops” em Portugal 16 3.3 Aparência As catinonas sintéticas são geralmente vendidas sob a forma de pó (branco ou amarelado, amorfo ou cristalino) ou comprimidos. Estas drogas são normalmente vendidas em pacotes de 200 mg a 10 g e em embalagens de 2 ou 3 comprimidos [11]. 3.4 Administração, Absorção, Metabolismo e Eliminação As catinonas sintéticas são consumidas usualmente por via oral. Todavia, também já foram descritas outras vias de administração, designadamente, administração retal, intramuscular, intravenosa e inalação [30]. A absorção deste tipo de compostos é atrasada pela presença de alimentos no estômago [31]. Vários estudos realizados em ratos e seres humanos demonstram que as catinonas sintéticas podem ser metabolizadas por várias vias, dependendo da estrutura molecular [27, 32-36]. Todos os derivados de catinona passam por um extenso metabolismo de Fase I (Figura 8) [12]. 17 Estudos demonstram que as catinonas substituídas no anel 3,4metilenodioxifenilo (como por exemplo a metilona) são principalmente metabolizados por desmetilação seguida de O-metilação, N-desalquilação e redução do grupo β-ceto [27, 32, 34]. Estas vias de metabolização estão descritas na Figura 9. Os três metabolitos hidroxilados resultantes das duas últimas vias estão mais propensos a sofrer metabolismo de fase II (glucuronidação e sulfonação do grupo álcool) e os conjugados são, posteriormente, excretados na urina [11]. Figura 8 Diferentes vias metabólicas de Fase I para derivados de catinona. (A) Desmetilação (B) Redução da β-cetona (C) Hidroxilação seguida de oxidação (D) Desmetilação seguida por Ometilação (E) Hidroxilação seguida de desidrogenação em lactama. (adaptado de [12]) 18 Relativamente às catinonas estruturalmente semelhantes à mefedrona verificase uma via metabólica diferente. Com base na identificação de metabolitos da mefedrona na urina de ratos e seres humanos, temos as seguintes vias metabólicas de fase I (Figura 10): N-desmetilação da amina primária, redução da função cetónica e oxidação do do grupo metilo. Citocromo P450 CYP2D6 é a enzima com maior importância no metabolismo de fase I da mefedrona [37]. Relativamente à metabolização de fase II foi descoberto recentemente por Khreit et al. (2013) que os metabolitos de fase II são resultado de reações de acetilação e/ou glucuronidação [11]. Figura 9 Principais vias metabólicas de fase I de derivados β-cetónicos com anel de 3,4metilenodioxi. (adaptado de [48]) 19 Figura 10 Metabolismo de fase I da mefedrona. (adaptado de [37]) O metabolismo de alguns derivados de pirrolidinopropiofenona foi caracterizado [36, 38-41]. A cetona na posição ß de derivados de pirrolidino é convertida no álcool resultante, mecanismo metabólico que ocorre de uma forma semelhante noutras catinonas [38]. Foram realizados estudos para identificar os metabolitos da MDPV [33]. Tendo em conta os metabolitos presentes na urina, as principais metabólicas em seres humanos (Figura 11) incluem a desmetilação, a metilação e a hidroxilação. 26 Figura 15 Quiralidade de novas moléculas. a - Percentagem e número novas moléculas aprovadas pela FDA b – Percentagem e número de novas moléculas aprovadas em todo o mundo. (adaptado de [55]) As autoridades reguladoras têm vindo a encorajar a Indústria Farmacêutica a desenvolver fármacos enantiomericamente puros. Como consequência, o desenvolvimento e comercialização de fármacos contendo apenas um dos enantiómeros têm crescido nos últimos tempos (Figura 15) [55]. Outras razões que também contribuíram para este aumento foram os avanços tecnológicos para a síntese, resolução e análise de enantiómeros, o fenómeno do “chiral switching” e as inúmeras vantagens dos enantiómeros puros comparativamente com os racematos [57]. Deste modo, o desenvolvimento de métodos que permitam a obtenção de enantiómeros puros e a avaliação da pureza enantiomérica adquiriu uma importância crucial [58]. De uma forma geral, para se obter compostos quirais enantiomericamente puros existem duas estratégias possíveis: a síntese enantiosseletiva do enantiómero pretendido e a resolução enantiomérica [50]. 27 4.2 Resolução Enantiomérica Pasteur marcou o início das separações quirais quando, em 1848, recristalizou o sal de amónio de sódio racémico de ácido tartárico e observou duas formas cristalinas diferentes. Após separá-los descobriu que rodavam a luz polarizada de forma diferente. Desde então foi dada a devida relevância ao papel crucial da quiralidade [59]. A resolução de uma mistura de enantiómeros pode ser realizada através de dois métodos: método indireto e método direto. [60] No método indireto de separação de enantiómeros é efetuada a reação dos enantiómeros presentes na mistura racémica com um reagente oticamente puro com formação de derivados diastereoisoméricos. Como estes apresentam propriedades físico-químicas diferentes podem ser separados empregando uma grande variedade de procedimentos como cristalização, cromatografia usando fases estacionárias convencionais, entre outros. Embora esta metodologia seja eficiente para a separação de uma grande diversidade de enantiómeros, apresenta algumas desvantagens, a destacar: a formação dos derivados diastereoisoméricos nem sempre é fácil e, de um modo geral, é um processo demorado; falha na separação total dos enantiómeros; requer reagentes opticamente puros; é necessário um tratamento químico posterior para a recuperação dos enantiómeros separados [51]. Atualmente, o método mais descrito para a separação de enantiómeros é o método direto, uma vez que não necessita de derivação prévia. A resolução direta de enantiómeros é efetuada, geralmente, por cromatografia líquida ocorrendo reconhecimento quiral entre a mistura racémica e o seletor quiral presente no sistema cromatográfico [61]. O seletor quiral deve associar-se preferencialmente a um dos enantiómeros formando complexos diastereoisoméricos transitórios. As diferenças na estabilidade dos complexos transitórios formados levam a diferentes tempos de retenção dos enantiómeros na coluna cromatográfica. O enantiómero que forma o complexo menos estável elui primeiro [59]. O seletor quiral tanto pode estar ancorado à fase estacionária, constituindo uma fase estacionária quiral (FEQ), como pode ser um aditivo da fase móvel. Neste último caso, a fase estacionária não precisa de ser quiral [51, 53, 59]. 28 Para o estudo de compostos quirais, recorrendo a técnicas que envolvem a separação de enantiómeros, podem utilizar-se diferentes técnicas cromatográficas. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) permite a realização de análises rápidas, separação de misturas complexas, reprodutibilidade, podendo ser utilizada tanto na forma analítica como preparativa, entre outras vantagens. Por estas razões, a HPLC com a utilização de FEQs é uma das técnicas mais empregues para a resolução enantiomérica [59]. 4.2.1. Fases estacionárias quirais utilizadas em HPLC Existe uma grande diversidade de FEQs disponíveis comercialmente para a resolução enantiomérica por HPLC (Tabela 8). A grande maioria das FEQs é preparada a partir de moléculas ou polímeros quirais, naturais ou sintéticos, adsorvidos ou quimicamente ligados a um suporte cromatográfico, normalmente sílica [53, 62]. Tabela 8 Exemplos de diferentes tipos de FEQs (adaptado de [61]) Seletor Quiral Fases estacionárias quirais Natural Proteínas Ciclodextrinas Polissacarídeos Antibióticos macrocíclicos Cinchona Sintético Tipo Pirkle Troca de ligantes Éteres de coroa Polímeros sintéticos Da grande diversidade de FEQs, as mais usadas são as fases derivadas de polissacarídeos, as de antibióticos e as do “tipo Pirkle”. Para o desenvolvimento de FEQs derivadas de polissacarídeos, vários polissacarídeos, como por exemplo, celulose e amilose, foram eficientemente 29 derivados e usados como seletores quirais para a separação de uma grande diversidade de compostos. As FEQS deste tipo preparadas inicialmente, cujos seletores se encontravam adsorvidos à superfície do suporte cromatográfico, exigiam alguns cuidados na escolha da fase móvel. Efetivamente, alguns solventes como tetra-hidrofurano, acetato de etilo, acetona, clorofórmio, diclorometano e tolueno não podiam ser utilizados como fases móveis pois podiam solubilizar o seletor quiral [59]. Nas FEQs desenvolvidas mais recentemente, os seletores quirais já são imobilizados ao suporte cromatográfico solucionando essa limitação e oferecendo outras vantagens [61]. Os mecanismos de separação deste tipode FEQs inclui basicamente, a formação de complexos de inclusão e interações atrativas [59]. É importante enfatizar que as FEQs derivadas de polissacarídeos, adsorvidos ou quimicamente ligados ao suporte, apresentam um elevado poder de resolução enantiomérico para uma grande diversidade de compostos quirais de natureza química diversa, sendo as fases mais eficientes e amplamente utilizadas [61]. As FEQs derivadas de antibióticos são constituídas por glicopeptídeos macrocíclicos tal como a vancomicina, rifamicina B, teicoplanina, entre outros, covalentemente ligados à sílica. Estas fases também demonstram excelentes enantiosseletividades para uma larga gama de analitos [61]. Neste tipo de FEQs, a enantioseparação pode envolver diferentes mecanismos, tais como, formação de complexos de inclusão, interações de hidrogénio, π-π, eletrostáticas, estéricas, dipolo-dipolo e dispersão de London. [63, 64]. Com a utilização destas FEQs é possível efetuar análises no modo normal, reverso, polar orgânico e polar iónico [65]. As FEQs do “tipo Pirkle” são constituídas por pequenas moléculas quirais de natureza química diversa como seletores quirais. Originalmente, estas pequenas moléculas eram aminoácidos modificados que se ligaram covalentemente à superfície do suporte cromatográfico [61]. Os seletores quirais do tipo “Pirkle” possuem porções aromáticas essenciais para o estabelecimento de interações com os enantiómeros a separar e consequente formação dos complexos diastereoisoméricos. Efetivamente, estas FEQs podem interagir com os enantiómeros a resolver através de interações π-π, assim como de hidrogénio, dipolo-dipolo e estéricas. Normalmente são utilizadas em 30 fase normal de eluição, todavia, também apresentam poder de discriminação quiral em modo inverso. Diversas FEQs deste tipo foram desenvolvidas e estão comercialmente disponíveis [61]. Uma das fases mais eficientes e amplamente usada é a (S,S)-Whelk-O®1 [59]. 4.2.2. Resolução enantiomérica de catinonas sintéticas Como é bem conhecido, a resolução enantiomérica tem um papel importante na análise de drogas ilícitas na área de Toxicologia Forense. Tal como acontece como para muitos fármacos quirais, a atividade das principais drogas ilícitas pode variar com a forma enantiomérica [56] Um facto interessante das catinonas sintéticas é que todas são quirais [66]. Na literatura existe ainda pouca informação sobre as catinonas sintéticas e praticamente nenhuma sobre os enantiómeros isolados [58]. No entanto, relativamente à metcatinona, está reportado na literatura que o enantiómero S-(+) exibe maior efeito estimulante que o enantiómero R-(-). Na verdade, o abuso do enantiómero S puro da metcatinona pode levar a riscos de sobredosagem ou casos letais, uma vez que é mais potente isolado do que na sua forma racémica [67-69]. Relativamente à resolução enantiomérica, na literatura encontram-se descritos alguns trabalhos de separação de catinonas sintéticas com o emprego de várias técnicas, incluindo eletroforese capilar [70], cromatografia gasosa [66, 71] e HPLC [58, 72, 73]. Do nosso conhecimento, existem apenas dois trabalhos relacionados com a separação enantiomérica de catinonas sintéticas por HPLC pelo método direto: Mohr et al. conseguiram separar 19 derivados de catinonas usando uma FEQ comercial para HPLC derivada de polissacarídeos, especificamente a CHIRALPAK® AS-H [58]; a catinona e a metcatinona foram separadas por Perer et al. usando uma FEQ comercial para HPLC do “tipo Pirkle” (Whelk-O® 1)[72]. Mais recentemente, Suzuki et al. isolaram os enantiómeros da MDPV através de um método indireto [73]. Objetivos 1.Objetivos 33 1. Objetivos Este trabalho dividiu-se em três partes: uma primeira parte relacionada com a separação enantiomérica de derivados catinónicos presentes em “drogas legais”, uma segunda parte que envolveu a separação e isolamento dos enantiómeros da MDPV, e uma terceira parte que incluiu um estudo in vitro da citotoxicidade de cada enantiómero da MDPV. O objetivo da primeira parte do presente trabalho foi separar por HPLC quiral os enantiómeros de derivados de catinonas presentes em amostras obtidas em “smartshops”. Apesar destas lojas já terem sido proibidas e fechadas em Portugal, estas drogas continuam a ser comercializadas através da internet. Posteriormente, pretendeu-se também analisar a proporção de cada enantiómero em cada um dos pares de catinonas avaliados e analisar a proporção enantiomérica de cada composto que constitui estas amostras. Relativamente à segunda etapa do trabalho, o principal objetivo foi isolar cada um dos enantiómeros da MDPV, um dos derivados de catinona mais potentes e comumente consumidos para, na terceira parte, avaliar a citotoxicidade de cada um dos enantiómeros em separado. Para isso foram otimizadas as condições analíticas de separação enantiomérica da MDPV por HPLC, para posteriormente por HPLC semipreparativa quiral efetuar o isolamento de ambos os enantiómeros. No final, foram então efetuados estudos de citotoxicidade de cada um dos seus enantiómeros, recorrendo para isso a ensaios in vitro de cultura primária hepatócitos de rato. Experimental Parte 1: Separação analítica dos enantiómeros de derivados catinónicos em “drogas legais” Parte 2: Separação semi-preparativa dos enantiómeros da MDPV Parte 3: Estudo da citotoxicidade dos enantiómeros da MDPV 42 azul de tripano, piruvato de sódio, β-nicotinamida adenina dinucleótideo reduzida (βNADH) e brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilltetrazólio (MTT) foram adquiridos a partir da Sigma Aldrich (St. Louis, MO). O soro bovino fetal (FBS), fungizona (250 μg/mL) e mistura de antibióticos penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) (10.000 U/mL/10.000 μg/mL) foram obtidos a partir da GIBCO Invitrogen (Barcelona, Espanha). Todos os outros reagentes químicos, de grau analítico, foram adquiridos à Merck (Darmstadt, Alemanha). O cloridrato de MDPV foi obtido online no site Sensearomatic em março de 2013. O sal foi caracterizado por espectrometria de massa, RMN e análise elementar, sendo a sua pureza superior a 98 %. Os enantiómeros isolados da MDPV foram obtidos através dum método de HPLC semipreparativo, como descrito anteriormente. 1.2 Animais Ratos Wistar-Han machos adultos (Charles-River Laboratories, Barcelona, Espanha), com um peso entre 200-250 g, foram utilizados em todas as experiências como uma fonte de hepatócitos. Os animais foram aclimatizados em gaiolas de polietileno num ambiente com uma temperatura de 20 ± 2 °C, humidade entre 40 e 60 % e um ciclo de luz/escuro de 12h/12h. Foi dado aos animais acesso livre à ração padrão e água ad libitum. 1.3 Isolamento de hepatócitos de rato O isolamento de hepatócitos foi realizado entre as 10 e as 12h da manhã. O rato foi anestesiado por inalação de isoflurano. Após abertura do abdómen e exposição do fígado, uma cânula foi introduzida num pequeno corte feito na veia porta hepática para uma primeira perfusão do fígado com uma solução de lavagem Hank (NaCl a 2,7 M, KCl a 0,1M, MgSO4.7H2O a 16mM, Na2HPO4.2H2O a 8,4 mM, KH2PO4 a 8,8 mM, NaHCO3 a 25 mM, HEPES a 12,5 mM, EGTA a 0,6 mM e albumina a 0,67 %) durante 10 minutos. Posteriormente, o diafragma foi perfurado e a aorta seccionada para proceder à eutanásia do animal. Numa segunda fase, as moléculas de colagénio hepáticas foram hidrolisadas pela ação da colagenase presente na solução de perfusão 43 Hank (NaCl a 2,7 M, KCl a 0,1M, MgSO4.7H2O a 16 mM, Na2HPO4.2H2O a 8,4 mM, KH2PO4 a 8,8 mM, NaHCO3 a 25 mM, HEPES a 12,5 mM e colagenase 0,5 mg/mL e CaCl2 a 5,88 %). A colagenase é adicionada imediatamente antes do início da perfusão. Esta última perfusão foi realizada até ser a visível a perda da plasticidade do fígado quando pressionado levemente com uma pinça. Quando concluída a digestão, a cânula foi retirada, a cápsula do fígado foi rompida e os hepatócitos foram libertados. A suspensão de hepatócitos foi purificada através de centrifugações a baixa velocidade (300 rpm, 2 min) e lavagens com tampão de Krebs-Henseleit (NaCl a 0,42 M, KCl a 16,9 mM, MgSO4.7H2O a 4,2 mM, KH2PO4 a 4,2 mM, NaHCO3 a 25,5 mM e CaCl2.2H2O a 9,1 mM) suplementado com HEPES a 12,5 mM. Após a suspensão estar limpa, adicionaram-se 20 mL da mesma solução até homogeneização completa. Foi então adicionado 1 mL de Pen/Strep à suspensão celular e esta foi mantida em gelo durante 30 min. Para a determinação da viabilidade das células utilizou-se a técnica de exclusão do azul tripano (azul de tripano é um corante orgânico com carga negativa, que é excluído pelos hepatócitos com membranas citoplasmáticas intactas, como resultado da manutenção do potencial de membrana). Para tal, a 100 μL de suspensão foram adicionados 900 μL de solução de azul tripano a 1 % para posterior contabilização de células numa câmara de Neubauer. 1.4 Cultura de hepatócitos de rato Uma suspensão de 500 000 células/mL em meio de cultura completo (meio William E suplementado com 10 % de FBS, 0,1 mg/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina, 2 ng/mL de insulina, 10 ng/mL de gentamicina e 5 nM de dexametasona) foi semeada em placas com 96 poços, perfazendo um total de 50 000 células por poço. As células foram incubadas, para adesão celular, a 37 °C, numa estufa com 95/5 % de O2/CO2, durante a noite. No dia seguinte, procedeu-se à incubação das células com os compostos a analisar, numa gama de 0,2 a 1,6 mM, em meio de cultura sem FBS, durante 24 e 48 h. 44 1.5 Ensaio de redução de MTT O ensaio de redução de MTT foi realizado como descrito previamente [77]. Resumidamente, as células foram incubadas, a 37 °C, durante 1 h 30 min, com uma solução de 500 μg/mL de MTT. Os cristais de formazano, que foram formados através da succinato desidrogenase mitocondrial, foram dissolvidos em 100% de DMSO, e detetados a 550 nm num leitor de placas de 96 poços (PowerWaveX; Bio-Tek, Winooski, VT, EUA). Os dados foram normalizados para os controlos positivos e negativos. Para os controlos positivos, foram utilizados células sem tratamento, que equivale a 100 % de redução do MTT. Para servir de controlo negativo, foi utilizado 1 % de Triton X-100, que equivale a 0 % de redução do MTT. Os dados foram obtidos a partir de três experiências independentes, realizadas em quadruplicado para cada concentração. 1.6 Ensaio de libertação de LDH A atividade da lactato desidrogenase foi determinada por meio da diminuição da absorvância de β-NADH durante a redução do piruvato a lactato, tal como descrito anteriormente [78], com algumas modificações. Após a exposição, o conteúdo das placas foi centrifugado a 250g, durante 10 min e 50 μL do meio de incubação (diluições preparadas em tampão fosfato: KH2PO4 50 mM, pH 7,4) e recolhido de cada poço para um novo poço de novas placas de 96 poços. A estas novas placas foi adicionado 200 μL de uma solução de 0,21 mM de β-NADH (preparado em tampão de fosfato). A oxidação de β-NADH em β-NAD+, após a adição de 25 μL de piruvato de sódio (22,7 mM) foi monitorizada a 340 nm num leitor de placa de 96 poços. Os dados foram obtidos a partir de três experiências independentes, realizadas em quadruplicado. Resultados e Discussão Parte 1: Separação analítica dos enantiómeros de derivados catinónicos em "drogas legais" Parte 2: Separação semi-preparativa dos enantiómeros da MDPV Parte 3: Estudo da citotoxicidade dos enantiómeros da MDPV 47 Figura 16 Catinonas sintéticas avaliadas neste trabalho. Parte 1: Separação analítica dos enantiómeros de derivados catinónicos em "drogas legais" 1. Separação analítica dos enantiómeros de derivados catinónicos presentes em “drogas legais” Neste trabalho foi efetuada a separação enantiomérica de 15 amostras e 4 padrões de derivados catinónicos. Na figura 16 estão sumarizadas as estruturas químicas das catinonas sintéticas avaliadas. As amostras utilizadas foram previamente analisadas por cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa (GC-MS) e por ressonância magnética nuclear (RMN) para identificação da sua composição química, num trabalho realizado na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto ("Psychoactive substances present in "legal highs" acquired in "smartshops" or via Internet") [48]. Sendo assim, a composição química destas amostras já é conhecida e consta da Tabela 9 [30]. Foram também utilizados padrões comerciais de algumas catinonas sintéticas para auxiliar na identificação das respetivas catinonas nas amostras analisadas por HPLC quiral. Numa primeira fase, apenas foram injetadas algumas amostras que continham no máximo 2 catinonas sintéticas diferentes na sua composição (Blast A3, Charlie A10, Cyclop A6, Bliss A8 e Kick A14), assim como também os padrões: Metilona, Pentedrona, 4-MEC e MDPV. . 48 Tabela 9 Amostras utilizadas e sua identificação por GC-MS e NMR (adaptado de [30]) Amostra Nome Produto Smartshop Substâncias Identificadas 1 Bloom Magic Mushroom Metilona (43 %), 4-MEC (29 %), Pentedrona (25 %), Dimetocaína (<1 %), Isopentedrona (< 1 %) 2 Bloom Magic Mushroom Metedrona (34 %), Pentedrona (29 %), Etcatinona (24 %), Cafeína (13 %), Isopentedrona (< 1 %) 3 Blast Euphoria Flefedrona (87 %), Cafeína (13 %) 4 Rush Magic Mushroom Bufedrona (87 %), Cafeína (13 %) 5 Crabby Euphoria 3,4-DMMC (>99 %) 6 Cyclop Euphoria 3,4-DMMC (>99 %) 7 Bliss Magic Mushroom Metedrona (89 %), Pentedrona (5 %), 3,4-DMMC ( 4 %), Cafeína (< 1 %), Isopentedrona (< 1 %) 8 Bliss Euphoria Metedrona (>99 %) 9 Charlie Magic Mushroom Bufedrona (80 %), Etcatinona (19 %), Cafeína (< 1 %) 10 Charlie Magic Mushroom Bufedrona (52 %), Etcatinona (48 %) 11 Blow Magic Mushroom 4-MEC (86 %), MDPV (14 %), 3-MEC (<1 %) 12 Blow Euphoria 4-MEC (83 %), MDPV (8 %), cafeína (8 %), 3-MEC (<1 %) 13 Kick Magic Mushroom Pentedrona (89 %), Isopentedrona (11 %) 14 Kick Euphoria Bufedrona (80 %), Cafeína (20 %) 15 Bliss* Euphoria Metilona (<99 %) Padrões: MDPV, 4-MEC, Pentedrona, Metilona *pastilha 49 Figura 17 Esquema de preparação das soluções para análise. Todas as amostras e padrões foram dissolvidos em EtOH. Primeiramente foi preparada uma solução mãe de concentração 1mg/mL, a qual foi diluída para uma concentração final de 100 μg/mL. A esta solução final foi adicionada 0,1% de TEA, de acordo com o esquema da Figura 17. Uma vez conhecida a composição química das amostras de “drogas legais” vendidas nas antigas “smartshops” é de grande importância saber a proporção de cada enantiómero das catinonas sintéticas constituintes da amostra, uma vez que os efeitos provocados por estas novas drogas podem ser dependentes dessas proporções. Assim, com o intuito de determinar a razão de cada um dos enantiómeros das catinonas sintéticas presentes nas “drogas legais” foram inicialmente testadas as condições cromatográficas para a sua separação enantiomérica. Com base em trabalhos descritos na literatura, foram usadas duas colunas quirais diferentes, designadamente a (S,S)-Whelk-O®1 [72] e Chiralpak® AS-H [58], para avaliar a separação enantiomérica das catinonas nas amostras. Relativamente à Whelk-O®1 (Figura 18) foi testada primeiramente a fase móvel Hex:2-PrOH:TEA:TFA (90:10:0,05:0,05) de acordo com o trabalho descrito em [72]. Uma vez que não se observou nenhum indício de separação enantiomérica, em nenhuma das amostras analisadas, usou-se EtOH como modificador orgânico em alternativa ao 2-PrOH. Com a fase móvel Hex:EtOH:TEA:TFA (90:10:0,05:0,05) observou-se início de separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na 50 Figura 18 Estrutura da fase estacionária Whelk-O®1. amostra Bliss A8. Sendo assim, o passo seguinte consistiu na otimização da fase móvel com o incremento da percentagem de Hex até à proporção de 95 %. Assim, com a fase móvel Hex:EtOH:TEA:TFA (95:5:0,05:0,05) foi possível uma separação à linha de base dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss, porém, com um tempo de análise superior a 52 min (Figura 19). Nestas condições cromatográficas foi possível a separação dos enantiómeros da metedrona presente na amostra Bliss A8 com um α de 1,12 e um Rs de 1,29. Contudo, com a coluna do tipo Pirkle (S,S)-Whelk-O®1 apenas foi possível a separação enantiomérica de um derivado catinónico não sendo, portanto, a melhor opção para a resolução enantiomérica deste tipo de compostos. Figura 19 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A8; Coluna Whelk-O® 1; Fase móvel Hex:EtOH:TEA:TFA (95:5:0,05:0,05); Fluxo 1 mL/min; Deteção UV 254nm. 51 Com base em outro estudo que descreve a separação enantiomérica de catinonas sintéticas [58], foi usada a coluna Chiralpak® AS-H e a fase móvel Hex:2prOH:TEA (97:3:0,1). Numa fase inicial, com a coluna e fase móvel mencionadas anteriormente (Chiralpak® AS-H e Hex:2-PrOH:TEA (97:3:0,1) respetivamente), e a um fluxo de 1 mL/min foram injetadas as mesmas amostras (Blast A3, Charlie A10, Cyclop A6, Bliss A8 e Kick A14) e padrões (Metilona, Pentedrona, 4-MEC, MDPV) usados, anteriormente, na primeira avaliação com a coluna (S,S)-Whelk-O®1. Com este fluxo foi possível a separação dos enantiómeros da Metedrona presente na amostra Bliss A8 e do padrão Metilona, como se pode observar nas Figuras 20 e 21, respetivamente. Na separação dos enantiómeros da Metedrona da amostra Bliss A8 (Figura 20) foi obtida uma boa enantiosseletividade e resolução, com um α de 1,58 e um Rs de 6,19, respetivamente. Relativamente ao padrão Metilona (Figura 21) os valores de α e de Rs também foram satisfatórios (1,71 e 6,15 respetivamente). Figura 20 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A8; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 1 mL/min; Deteção UV 254nm. 58 Foi igualmente possível a separação dos enantiómeros da Metedrona presente na amostra Bliss A7 (Figura 33) e Bliss A8 (Figura 34) com um α de 1,72 e 1,71 e um Rs de 6,79 e 6,79, respetivamente. Figura 32 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 4-MEC presentes na amostra Blow A12; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. Figura 34 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A7; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. Figura 33 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metedrona presentes na amostra Bliss A8; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. 59 Relativamente à 3,4-DMMC presente na amostra Crabby A5 (Figura 35) foi obtida uma boa enantiosseletividade (α de 3,62) e resolução (Rs de 9,46). De igual forma e com valores cromatográficos similares, foi possível a separação dos enantiómeros da 3,4-DMMC presentes na amostra Cyclop A6 (Figura 36) com um α de 3,59 e um Rs de 10,34. Foi ainda possível a separação dos enantiómeros da Metilona presentes na amostra Bliss A15 (Figura 37) com um α de 1,79 e um Rs de 7,47. Foi também possível a separação dos enantiómeros da Metilona (Figura 38) com um α de 1,77 e um Rs de 7,39. Figura 35 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 3,4-DMMC presentes na amostra Crabby A5; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. Figura 36 Cromatograma da separação dos enantiómeros da 3,4-DMMC presentes na amostra Cyclop A6; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. 60 De igual forma foi conseguida a separação dos enantiómeros da Metilona, 4MEC e Pentedrona presentes na amostra Bloom A1 (Figura 39), porém, apenas foi possível distinguir os enantiómeros da metilona (separados com um α de 1,78 e um Rs de 8,66), pois as catinonas 4-MEC e Pentedrona têm um dos seus enantiómeros com tempos de retenção coincidentes. É possível verificar, comparando o tempo de retenção com o padrão 4-MEC cujos tempos de retenção são de 8,20 e 9,38 e comparando o tempo de retenção com o padrão da Pentedrona cujos tempos de retenção são 6,92 e 9,37 que a primeira banda cromatográfica pertence ao primeiro enantiómero da Pentedrona, a segunda banda pertence ao primeiro enantiómero da 4-MEC e a terceira banda pertence ao segundo enantiómero de ambas as catinonas. Figura 37 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metilona presentes na amostra Bliss A15; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. Figura 38 Cromatograma da separação dos enantiómeros da Metilona; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. 61 Relativamente à amostra Bloom A2 (Figura 40), foi possível a separação dos enantiómeros da Pentedrona, Etcatinona e Metedrona com um valor de α de 1,95, 1,30 e 1,72, respetivamente, e um valor de Rs de 10,52, 2,61 e 5,39, respetivamente. Podemos verificar comparando o tempo de retenção com o padrão Pentedrona cujos tempos de retenção são 6,92 e 9,37 e com uma amostra que só contenha a Metedrona, por exemplo a Bliss A8, cujos tempo de retenção são de 26,90 e 43,27 que a primeira banda e quarta banda pertencem à Pentedrona, a quinta e sexta banda dizem respeito à Metedrona e consequentemente a segunda e terceira banda pertencem à Etcatinona. Nas condições cromatográfica otimizadas foi possível a separação dos enantiómeros de 15 amostras num total de 19, totalizando 8 catinonas sintéticas diferentes (Metilona, 4-MEC, Pentedrona, Metedrona, Etcatinona, Flefedrona, Bufedrona e 3,4-DMMC), como podemos ver na tabela 12. Figura 39 Cromtagrama da separação dos enantiómeros da Pentedrona, 4-MEC e Metilona presentes na amostra Bloom A1; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. 1º enantiómero da Pentedrona 2º enantiómero da 4-MEC 2º enantiómero da Pentedrona e 1º enantiómero da 4-MEC Metilona Figura 40 Cromatograma da separação dos enantiómeros Pentedrona, Etcatinona e Metedrona presentes na amostra Bloom A2; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm. Pentedrona Metedrona Etcatinona 62 Tabela 12 Resultados cromatográficos obtidos com a coluna Chiralpak® AS-H para as 8 catinonas sintéticas presentes nas diferentes amostras Catinona Amostra t1 t2 α Rs Flefedrona Blast A3 11,12 17,92 1,93 6,33 Pentedrona Padrão 6,92 9,37 1,79 8,63 Kick A13 6,78 9,37 1,87 9,30 Bloom A2 6,63 9,32 1,95 10,52 4-MEC Padrão 8,20 9,38 1,27 2,54 Blow A12 7,95 9,38 1,35 3,24 Blow A11 7,92 9,43 1,37 3,38 3,4-DMMC Cyclop A6 10,97 29,53 3,59 10,34 Crabby A5 10,88 29,43 3,62 9,46 Metedrona Bliss A8 26,90 43,27 1,71 6,79 Bliss A7 26,65 43,03 1,72 6,79 Bloom A2 25,47 41,00 1,72 5,39 Bufedrona Kick A14 7,38 12,27 2,36 7,54 Charlie A10 7,67 12,33 2,21 4,10 Charlie A9 7,65 12,31 2,21 6,14 Rush A4 7,48 12,43 2,34 7,62 Metilona Padrão 32,60 54,90 1,77 7,39 Bloom A1 32,58 55,17 1,78 8,66 Bliss A15 32,58 55,17 1,79 7,47 Etcatinona Bloom A2 7,42 8,50 1,30 2,61 Charlie A10 7,67 8,62 1,25 1,25 Charlie A9 7,65 8,59 1,24 1,24 Estas 15 amostras foram todas separadas em menos de 60 minutos, com fatores de separação entre 1,27 para a 4-MEC e 3,62 para a 3,4-DMMC presente na amostra Crabby A5 e com fatores de resolução entre 2,54 para a 4-MEC e 10,52 para a Pentedrona presente na amostra Bloom A2. Foi possível com esta coluna a separação de 7 destas amostras em menos de 10 minutos, o que é bastante favorável (Tabela 10). Como já era de esperar [58], a MDPV não foi separada com a coluna Chiralpak® AS-H e a fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1) em nenhum dos três fluxos avaliados. Apesar de ser possível a separação enantiomérica das catinonas presentes nas amostras Charlie A9, Charlie A10 e Bloom A1, alguns dos enantiómeros tinham tempos de retenções semelhantes aparecendo com bandas sobreponíveis. Sendo assim, apesar de ser possível a separação dos enantiómeros de todas as catinonas presentes nas amostras não foi possível avaliar a proporção enantiomérica das catinonas cujos enantiómeros se sobrepõem. Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm 63 Com estes resultados, foi possível constatar que esta fase estacionária é indicada para a separação enantiomérica deste tipo de compostos, uma vez que foram obtidas separações cromatográficas com bons fatores de separação e de resolução enantiomérica. Um ótimo exemplo dessa boa separação é a amostra Cyclop A6, cuja constituição é a 3,4-DMMC, que tem uma separação com um α de 3,59 e uma resolução de 10,34 (Tabela 10, Figura 35). Relativamente ao objetivo de avaliar a proporção enantiomérica de cada catinona presente em drogas vendidas em “Smartshops”, foi possível verificar que com a exceção do padrão 4-MEC e das amostras que continham a 4-MEC, os enantiómeros presentes nas restantes amostras e padrões se encontram numa proporção de aproximadamente 50:50, ou seja, sob a forma de racemato (Tabela 13). Uma vez separadas todas as catinonas em todas as amostras, e otimizadas as condições de separação, algumas amostras e padrões foram injetadas num HPLC modelo JASCO com um detetor de polarimetria acoplado, de forma a relacionar a ordem de eluição dos enantiómeros com a sua atividade ótica (Tabela 14). Tabela 13 Proporções enantioméricas das catinonas presentes nas amostras de “drogas legais” Composto K1 α Rs Area % 1 Area % 2 Blast A3 (Flefedrona) 1,93 1,93 6,33 50,08 49,92 Pentedrona 0,82 1,79 8,63 51,38 48,62 4-MEC 1,16 1,27 2,54 63,53 36,47 Cyclop A6 ( 3,4-DMMC ) 1,89 3,59 10,34 50,02 49,98 Bliss A8 ( Metedrona ) 6,08 1,71 6,79 47,35 52,65 Kick A14 ( Bufedrona) 0,94 2,36 7,54 50,27 49,73 Metilona 7,58 1,77 34,44 50,04 49,96 Rush A4 ( Bufedrona ) 0,97 2,34 7,62 50,20 49,80 Blow A12 ( 4-MEC) 1,09 1,35 3,24 62,94 37,06 Blow A11 ( 4-MEC ) 1,08 1,37 3,38 61,90 38,10 Bliss A7 (Metedrona) 6,01 1,72 6,79 49,88 50,12 Kick A13 ( Pentedrona) 0,79 1,87 9,30 54,06 45,94 Crabby A5 ( 3,4 - DMMC) 1,86 3,62 9,46 49,21 50,79 Bloom A2 ( Etcatinona ) 0,95 1,30 2,61 50,14 49,86 Bloom A2 ( Pentedrona ) 0,75 1,95 10,52 50,20 49,80 Bloom A2 ( Metedrona ) 5,70 1,72 5,39 49,76 50,24 Bloom A1 ( Metilona ) 7,57 1,78 8,66 49,92 50,08 Bliss A15 ( Metilona ) 7,56 1,79 7,47 49,96 50,04 Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm 64 Usando este detetor, foi possível verificar qual a ordem de eluição dos enantiómeros para o padrão 4-MEC, Pentedrona e para a amostra Rush A4 cuja constituição é a Bufedrona. Foi possível verificar para todos que o primeiro enantiómero a eluir foi sempre o d(+) e o segundo enantiómero a eluir foi o l(-) (Tabela 14, Figura 41-43). Não foi possível verificar a atividade ótica dos restantes, possivelmente, pelo facto destas moléculas possuírem uma baixa atividade ótica. Tabela 14 Ordem de eluição vs atividade ótica de diferentes catinonas AMOSTRA COMPOSTO ATIVIDADE ÓTICA DO 1º ENANTIÓMERO ATIVIDADE ÓTICA DO 2º ENANTIÓMERO Bliss A8 Metedrona - - Padrão Metilona - - Cyclop A6 3,4-DMMC - - Blast A3 Flefedrona - - Rush A4 Bufedrona (+) (-) Padrão 4-MEC (+) (-) Padrão Pentedrona (+) (-) Figura 42 Cromatograma da Bufedrona a A) UV: 254nm e a B) Polarímetro; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min Figura 41 Cromatograma da 4-MEC a A) UV: 254nm e a B) Polarímetro; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min 65 2. Separação analítica dos enantiómeros da MDPV Uma vez que o único composto que não foi separado na coluna Chiralpak® AS-H foi a MDPV, o passo seguinte foi tentar separar os enantiómeros da MDPV recorrendo a uma série de colunas quirais diferentes. Para isso foram utilizadas 7 colunas diferentes: 3 colunas do tipo Pirkle, 3 de polissacarídeos e 1 de antibióticos. Foram selecionadas estas colunas uma vez que são os tipos de colunas mais utilizadas no mercado. Assim, foram testadas as colunas LPhenylglycine (25 cm, 4,6 mm d.i., 5 µm tamanho de partícula) da Regis Technologies, Inc. (Morton Grove, IL, USA), FEXEGOL2 (15 cm, 4,6 mm d.i., 5 µm tamanho de partícula) preparada como descrito em [75] Chirobiotic T (15 cm, 4,6 mm d.i., 5 µm tamanho de partícula) da ASTEC (Whippany, NJ, USA), CSP2 (constituída por amilose tris-3,5-dimetilfenilcarbamato aderida a APSNucleosil (15 cm, 4,6 mm d.i., 7 µm tamanho de partícula, 20%, w/w, 500 A°) e a CSP3 (constituída por amilose tris-3,5Figura 43 Cromatograma da Pentedrona a A) UV: 254nm e a B) Polarímetro; Coluna Chiralpak® AS-H; Fase móvel Hex:2prOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min 66 dimetoxifenilcarbamato aderida a APSNucleosil (15 cm, 4,6 mm d.i., 7 µm tamanho de partícula, 20%, w/w, 500 A°), preparadas como descrito em [76] (Tabela 15). Tabela 15 Colunas e fases móveis testadas para a separação da MDPV Tipo de Colunas Quirais Coluna Fases Moveis K1 α Tipo Pirkle (S,S)-Whelk-O® 1 Hex:2-prOH:TEA:TFA (90:10:0,05:0,05) 0,71 1,00 Hex:EtOH:TEA:TFA (90:10:0,05:0,05) 5,74 1,00 L-Phenylglycine Hex:EtOH:TEA:TFA (70:30:0,05:0,05) 22,42 1,00 Fexegol2 Hex:EtOH:TEA (90:10:0,1) 0,59 1,00 Polissacarideos Chiralpak® AS-H Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1) 1,00 1,00 Csp3 Hex:2-prOH:TEA (90:10:0,1) 1,18 1,09 Hex:2-prOH:TEA (97:3:0,1) 1,58 1,18 CSP2 Hex:2-prOH:TEA (90:10:0,1) 0,62 1,25 Hex:EtOH:TEA (90:10:0,1) 1,63 1,34 Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1) 1,93 1,28 Antibióticos Chirobiotic T CH3OH:HOAc:TEA (100:1:1) 1,18 1,00 CH3OH:HOAc:TEA (100:0,1:0,1) 3,50 1,00 CH3OH:HOAc:TEA (100:0,01:0,01) 26,39 1,00 Como mencionado no capítulo anterior, as colunas Chiralpak® AS-H e (S,S)- Whelk-O®1 não foram eficazes na separação dos enantiómeros da MDPV, em nenhuma das condições cromatográficas testadas. De seguida, foram utilizadas mais duas colunas do tipo Pirkle, designadamente a FEXEGOL2 e a L-Phenylglycine, com as fases móveis Hex:EtOH:TEA (90:10:0,1) e Hex:EtOH:TEA:TFA (70:30:0,05:0,05) respetivamente. Porém, não foi possível a separação da MDPV em ambas as colunas. Foi também testada uma coluna de antibióticos, a Chirobiotic T, com uma fase móvel de CH3OH:HOAc:TEA (100:1:1) sem sucesso. Posteriormente foi testada a mesma fase móvel mais duas vezes variando a proporção do aditivo da fase móvel, todavia sem sucesso. Uma vez que foram obtidos ótimos resultados na separação enantiomérica das restantes catinonas sintéticas com a coluna Chiralpak® AS-H, o passo seguinte foi a utilização de mais duas colunas de polissacarídeos, neste caso, preparadas em 67 Figura 44 Cromatograma da separação dos enantiómeros da MDPV; coluna CSP2; Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min;Deteção UV:254 nm laboratório [76]. Uma delas era a CSP2 (constituída por amilose tris-3,5dimetilfenilcarbamato aderida a APSNucleosil (15 cm, 4,6 mm d.i., 7 µm tamanho de partícula, 20%, w/w, 500 A°) e a CSP3 (constituída por amilose tris-3,5dimetoxifenilcarbamato aderida a APSNucleosil (15 cm, 4,6 mm d.i., 7 µm tamanho de partícula, 20%, w/w, 500 A°). Foi usada a mesma fase móvel usada na Chiralpak® AS-H (Hex:2-prOH:TEA), alterando a proporção de Hex. Para ambas as colunas foi possível a obtenção de indícios de separação. Uma vez que, segundo trabalhos anteriores, a coluna CSP2 tem melhores resultados com EtOH do que com 2-prOH a fase móvel foi modificada para Hex:EtOH:TEA. Assim com a coluna de polissacarídeos (CSP2), com uma fase móvel de Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1) e um fluxo de 0,5 mL/min foi possível a separação da MDPV com um α de 1,70 e um Rs de 3,11 e com um tempo de eluição corrida inferior a 20 min (Tabela 16, Figura 44). Tabela 16 Dados cromatográficos da separação enantiomérica da MDPV. Composto T1 T2 α Rs Area % 1 Area % 2 MDPV 10,46 15,39 1,70 3,11 49,97 50,03 Coluna CSP2; Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV 254nm 74 Uma vez que pureza enantiomérica do 2º enantiómero (R-(+)-MDPV) não foi tão alta como a do 1º enantiómero, procedeu-se a uma posterior injeção das várias frações do 2º enantiómero recolhido para otimizar a pureza enantiomérica. Efetivamente, foi possível alcançar uma pureza enantiomérica superior a 99% com a reinjeção. Tabela 18 Dados cromatográficos obtidos para cálculo do excesso enantiomérico do enantiómero S-(-)-MDPV Composto tr Area % Enantiómero S-(-)-MDPV 10,442 99,120 Enantiómero R-(+)-MDPV 15,758 0,880 Tabela 19 Dados cromatográficos obtidos para cálculo do excesso enantiomérico do enantiómero R-(+)-MDPV Composto tr Area % Enantiómero S-(-)-MDPV 10,500 5,635 Enantiómero R-(+)-MDPV 15,558 94,365 Tabela 20 Dados cromatográficos obtidos para cálculo do excesso enantiomérico do R-(+)-MDPV após reinjeçao Composto tr Area % Enantiómero S-(-)-MDPV 10,192 0,382 Enantiómero R-(+)-MDPV 14,075 99,618 S-(-)-MDPV R-(+)-MDPV Figura 50 Cromatograma do excesso enantiomérico do enantiómero R-(+)-MDPV após reinjeção Cromatograma do excesso enantiomérico do enantiómero R-(+)-MDPV ; coluna CSP2; Fase móvel Hex:EtOH:TEA (97:3:0,1); Fluxo 0,5 mL/min; Deteção UV:254 nm 75 Parte 3: Estudo da citotoxicidade dos enantiómeros da MDPV 1. Culturas Primárias de hepatócitos O fígado é um dos principais órgãos alvo dos xenobióticos, tendo em conta a sua exposição aos mesmos e ao seu papel nos processos de destoxificação e bioativação dos compostos. Assim, o estudo da citotoxicidade dos xenobióticos em hepatócitos isolados é uma das principais abordagens quando se pretende avaliar a toxicidade dos mesmos [79]. As culturas primárias de hepatócitos são muito utilizadas como uma ferramenta para estudar a toxicidade de drogas de abuso [80]. Apesar de terem algumas limitações, os hepatócitos primários continuam a ser o modelo padrão para estudos do metabolismo e toxicidade de xenobióticos [81]. As culturas primárias de hepatócitos de rato são uma boa alternativa às células humanas pois apresentam respostas metabólicas mais elevadas do que as linhas de células humanas comuns e a variabilidade interdador pode ser minimizada por seleção de animais do mesmo sexo, idade e com regimes alimentares semelhantes [82]. 2. MDPV A MDPV foi sintetizada pela primeira vez em 1969 e hoje em dia é uma das catinonas sintéticas mais usadas em todo o mundo [83]. Em ensaios in vitro recentemente realizados pelo nosso grupo, este derivado da catinona provou ser um poderoso agente hepatotóxico, com uma potência muito semelhante à da MDMA [30]. Por estas razões, foi desenvolvido um método de resolução quiral para o isolamento dos enantiómeros da MDPV, de modo a obtermos quantidade suficiente para o estudo da hepatoxicidade de cada enantiómero isolado e verificar se existe ou não enantiosseletividade nos efeitos citotóxicos da MDPV. 76 3. Enantiosseletividade Nos ensaios de MTT e LDH, tanto para a MDPV racémica como qualquer um dos enantiómeros, a morte celular foi dependente da concentração, ou seja, verificou-se um aumento da morte celular com o aumento da concentração, sendo esta morte significativa para concentrações tão baixas quanto 0,2 mM às 48h (p<0.0001 vs. controlo), como se pode observar no gráfico de redução do MTT (Figura 51). Não foram encontradas diferenças significativas entre os efeitos da MDPV e de cada um dos seus enantiómeros em qualquer um dos ensaios de viabilidade celular realizados (Figura 51 e 52), podendo assim concluir que não existe enantiosseletividade. Figura 51 Redução do MTT em hepatócitos de rato incubados com cloridrato de MDPV racémico ou cada um dos seus enantiómeros (0,2 – 1,6 mM), durante 24 e 48 h. **p<0,01, ****p<0,0001 vs. controlo. 77 Figura 52 Redução do MTT em hepatócitos de rato incubados com cloridrato de MDPV racémico ou cada um dos seus enantiómeros (0,2 – 1,6 mM), durante 24 e 48 h. **p<0,01, ****p<0,0001 vs. controlo. Conclusões 80 81 Conclui-se que:  As colunas de polissacarídeos são eficientes na separação enantiomérica de catinonas sintéticas  As catinonas sintéticas, com exceção da 4-MEC estão presentes nas amostras em estudo na forma de racemato  A MDPV foi isolada por HPLC semi-preparativa com um grande grau de pureza  Foi possível verificar que a MDPV é hepatotóxica em concentrações relativamente baixas e não exibe enantiosseletividade relativamente à sua hepatoxicidade, segundo o ensaio de MTT e de exclusão da LDH realizados em culturas primárias de hepatócitos de ratos. Referências Bibliográficas Anexos 93 Anexo 1 Chiral HPLC enantioresolution of synthetic cathinones “Legal Highs” B. Silva 1,2, C. Fernandes2,3, M. Pinto2,3, P. Guedes de Pinho1 and F. Remião1 1 UCIBIO-REQUIMTE, Laboratory of Toxicology, Department of Biological Science, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Portugal 2 Organic Chemistry and Pharmaceutical Laboratory, Department of Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Portugal 3 Interdisciplinary Center of Marine and Environmental Research (CIIMAR / CIMAR), University of Porto, Portugal In recent decades, "Legal Highs" sold in old "smart shops" and on Internet for recreational use have been fabricated exponentially. Within these new drugs, derivatives of cathinones have gained a huge popularity among consumers. These compounds are analogues of the natural cathinone, the active ingredient of Khat, and are chemically modified generating hudge number of different derivative molecules. All the described cathinone derivatives are chiral and enantioselectivity must be considered for their toxicological effects [11]. Because these is a recent concern, there is little information on racemic mixtures and almost nothing is known about the biological activity of each individual enantiomer [58]. Thus, the aim of this study was to study the enantiomers of cathinones in these “Legal Highs” and evaluate the respective toxicological effects. In this work we describe the enantioresoluion of 9 synthetic cathinones (MDPV, Flephedrone, Pentedrone, 4-MEC, 3,4-DMMC, Metedrone, Buphedrone, Methylone and Etcatinone) present on 13 “Legal Highs” commercially available in drugs sold on old "smartshops" by chiral HPLC method. The separations were performed with the Chiralpak® AS-H column under normal-phase elution conditions. The best results were achieved with n-hexane:2-propanol: TEA (97: 3: 0.1) as mobile phase at a flow rate of 0.5 mL/min. The analyses were performed at room temperature in isocratic mode and UV detection at a wavelength of 254 nm. We successful separate both the samples with only one cathinone as in samples with more than one cathinone. It was found that, with the exception of MDPV all cathinones were enantioseparated with very high enantioselectivity and resolution with α and RS values always greater than 1.25 and 4.00, respectively. The overall results of this study indicate that it is possible to scale-up the enantioresolution in order to obtain the single enantiomers of these derivatives of cathinones. Acknowledgements: This research was developed under the Project PEst-OE/SAU/UI4040/2014 and partially supported by the European Regional Development Fund (ERDF) through the COMPETE - Operational Competitiveness Programme and national funds through FCT - Foundation for Science and Technology, under the project PEst-C/MAR/LA0015/2013. 94