Síntese de Péptidos Antimicrobianos e Penetradores Celulares

Síntese de Péptidos Antimicrobianos e Penetradores Celulares Luísa Aguiar Tavares da Silva Mestrado em Química Departamento de Química e Bioquímica 2014 Orientador Paula Alexandra de Carvalho Gomes Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Orientador Empresa Nuno Filipe de Sousa Vale Centro de Investigação em Química da Universidade do Porto Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________ Faculdade de Ciências da Universidade do Porto i Agradecimentos Gostaria de agradecer à Profª Doutora Paula Gomes, orientadora deste trabalho, por todas as oportunidades de aprendizagem que me proporcionou nos útimos anos e pela paciência e dedicação com que sempre me presenteou. Pelos mesmos motivos agradeço ao Doutor Nuno Vale, que desde sempre se mostrou disponível para me apoiar e ensinar. Agradeço também às minhas companheiras de laboratório que me proporcionaram um ambiente de trabalho fantástico, cheio de boa disposição. Aos meus amigos, pela paciência nos momentos menos bons, mas também pelos bons momentos, um grande “obrigada”. Em especial agradeço ao António, pela companhia, pelo carinho e, particularmente, pela força e paciência nos momentos de mais “stress”. Devo agradecer também ao meu irmão e amigo, que sempre me incentivou a enveredar pela química quando eu não sabia o que escolher – hoje não me imagino a fazer outra coisa. Estou para sempre agradecida aos meus pais pelo constante apoio, carinho e entusiasmo e também por todas as oportunidades que me proporcionaram. ii Resumo O tratamento e/ou cura de doenças genéticas, cancro ou infeções bacterianas resistentes aos antibióticos convencionais são, hoje em dia, alguns dos maiores desafios na área da medicina. Neste contexto, péptidos e proteínas têm sido alvo de grande interesse e estudo na medicina e desenvolvimento de fármacos, devido a uma grande variedade de possíveis aplicações. Os MAP (Membrane Active Peptides) apresentam vantagens relativamente a pequenas moléculas, por apresentarem maior especificidade e afinidade para alvos terapêuticos, mas também em relação a proteínas de maior peso molecular, em termos de viabilidade de síntese, flexibilidade de derivatização, baixa imunogenicidade e parâmetros físico-químicos mais compatíveis com o seu emprego como agentes terapêuticos [1]. Os MAP incluem os Péptidos Penetradores Celulares (CPP, Cell Penetrating Peptides), capazes de transportar de forma eficiente ácido desoxirribonucleico (ADN), proteínas ou outras moléculas para o interior de células (mantendo a integridade da célula), e os Péptidos Antimicrobianos (AMP, Anti-Microbial Peptides), que interagem com bactérias, fungos ou parasitas, inibindo a sua atividade por destabilização das suas membranas celulares. O trabalho visou a síntese de derivados modificados de MAP com interesse terapêutico, nomeadamente, do péptido hLF(1-11) [2], um AMP catiónico com ação antimicrobiana potente e de largo espetro, e do péptido S413-PV [3], capaz de se comportar como um CPP. Para tal, empregaram-se metodologias de síntese peptídica em fase sólida (SPPS, Solid Phase Peptide Synthesis) clássica ou assistida por microondas (MW-SPPS). Os péptidos foram sintetizados com sucesso, sendo posteriormente purificados por cromatografia líquida de fase reversa. A análise dos produtos finais foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) e espetrometria de massa com ionização por electro-nebulização e deteção por armadilha de iões (ESI-IT MS, Electro-Spray Ionization-Ion Trap Mass Spectrometry), permitindo confirmar a obtenção dos péptidos-alvo com excelentes graus de pureza. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto iii Abstract The treatment and/or cure of genetic deseases, cancer or bacterial infections are considered a few of the greatest challenges in the field of medicine. In this context, peptides and proteins have been a subject of great interest and study in medicine and drug development, due to a large variety of possible applications. MAP (Membrane Active Peptides) present several advantages over small molecules, since they present higher specificity and affinity towards therapeutic targets, but also over proteins of higher molecular weight, in terms of synthesis viability, derivatization flexibility, low immunogenicity and physico-chemical characteristics compatible with their employment as therapeutic agents [1]. MAP include Cell Penetrating Peptides (CPP), capable of efficiently transporting deoxyrribonucleic acid (DNA), proteins or other molecules to the interior of the cells (maintaining the integrity of the cell), and Antimicrobial Peptides (AMP), which are able to interact with bacteria, fungus or parasites, inhibiting their activity through destabilization of the cell‟s membranes. This work targeted the synthesis of modified derivatives of peptides with therapeutical interest, namely, of hLF(1-11) [2], a cationic AMP with potent broadspectrum activity, and of S413-PV [3], capable of acting as a CPP. To this end, classic or microwave-assisted Solid-Phase Peptide Synthesis (SPPS) methodologies were employed. The peptides were successfully synthesized and next purified by reversephase liquid chromatography. The analysis of the final products was performed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Electro-Spray Ionization-Ion Trap Mass Spectrometry (ESI-IT MS), which provided confirmation that the target peptides were effectively obtained with excellent purity degrees. iv Índice Geral Índice de Esquemas ........................................................................................... vii Índice de Figuras ................................................................................................ ix Índice de Tabelas ................................................................................................ xiii Índice de Abreviaturas ....................................................................................... xiv Capítulo 1 – Breve introdução à síntese peptídica ......................................... 1 1. Preâmbulo ........................................................................................................ 3 2. Síntese Peptídica em Fase Sólida ................................................................... 4 2.1. A ligação peptídica .............................................................................. 4 2.2. Metodologias de síntese peptídica em fase sólida .............................. 7 2.2.1. Suporte sólido ................................................................................ 9 2.2.2. Esquemas de proteção .................................................................. 10 2.2.3. Agentes de acoplamento ............................................................... 14 2.2.3.1. Carbodiimidas .................................................................... 14 2.2.3.2. Sais de urónio .................................................................... 17 2.2.3.3. Sais de fosfónio .................................................................. 19 2.2.3.4. Derivados da “Oxyma Pure” ............................................... 21 2.2.3.5. N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-di-hidroquinolina (EEDQ) ........ 22 2.2.4. Monitorização do enlongamento da cadeia peptídica ................... 23 2.2.5. Clivagem de um péptido sintetizado pelo esquema Fmoc/tBu ...... 25 2.2.6. SPPS assistida por intrumentação automatizada .......................... 30 3. Bibliografia ........................................................................................................ 34 Capítulo 2 – Síntese de análogos lipofílicos do péptido penetrador celular S413-PV para potencial aplicação em terapia génica ....................................... 39 1. Considerações gerais ....................................................................................... 41 1.1. Péptidos penetradores celulares ......................................................... 41 1.2. Classificação de péptidos penetradores celulares .............................. 42 1.2.1. CPP catiónicos .............................................................................. 42 1.2.2. CPP anfipáticos ............................................................................. 43 1.2.3. CPP hidrofóbicos ........................................................................... 43 1.3. Mecanismos de penetração celular ..................................................... 45 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto v 1.3.1. Translocação membranar direta .................................................... 45 1.3.2. Endocitose ..................................................................................... 47 1.4. CPP aplicados à terapia génica .......................................................... 48 1.5. O péptido S413-PV em terapia génica ................................................. 48 1.6. Modificação de CPP com ácidos gordos ............................................. 49 2. Objetivo ............................................................................................................ 51 3. Resultados e discussão ................................................................................... 52 3.1. Síntese de derivados lipofílicos do CPP S413-PV ............................... 52 3.2. Síntese de derivados do péptido S413-PV Scrambled ......................... 59 4. Procedimento experimental .............................................................................. 63 4.1. Montagem experimental ...................................................................... 63 4.2. Reagentes e equipamentos utilizados ................................................ 63 4.3. Preparação da resina .......................................................................... 64 4.4. Ciclos de desproteção e acoplamento de aminoácidos ...................... 64 4.5. Acilação do aminoácido C-terminal ..................................................... 64 4.6. Clivagem do péptido e desproteção das cadeias laterais ................... 65 5. Bibliografia ........................................................................................................ 66 Capítulo 3 – Sintese de péptidos antimicrobianos funcionalizados para conjugação a biomateriais para terapia local da osteomielite ....................... 71 1. Considerações gerais ....................................................................................... 73 1.1. Péptidos antimicrobianos ................................................................... 73 1.2. Mecanismos de ação dos AMP .......................................................... 74 1.3. Os AMP no tratamento da osteomielite .............................................. 76 1.4. O péptido hLF(1-11): um potente AMP de largo espetro ................... 77 1.5. Criação de revestimentos antimicrobianos por imobilização covalente do péptido hLF(1-11) ao quitosano .................................... 78 2. Objetivo ............................................................................................................ 81 3. Resultados e discussão ................................................................................... 84 3.1. Síntese de derivados funcionalizados do péptido hLF(1-11) ............. 84 4. Procedimento experimental .............................................................................. 90 4.1. Montagem experimental ..................................................................... 90 4.2. Reagentes e equipamentos utilizados ............................................... 90 4.3. Preparação da resina ......................................................................... 90 xii Figura F2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido C18-S413PV bruto. ................................................................................................................ 109 Figura G1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido C12-S413-PV Scr purificado, com uma eluição em gradiente de 0-100% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. .................................................................... 110 Figura G2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido C12-S413PV Scr bruto. ..................................................................................................... 110 Figura H1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido Hexinoil-hLF(1-11) purificado, com uma eluição em gradiente de 10-30% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. ................................................................... 111 Figura H2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido HexinoilhLF(1-11) bruto................................................................................................. 111 Figura I1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido hLF(1-11)-Ahx-Pra purificado, com uma eluição em gradiente de 10-30% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. ................................................................... 112 Figura I2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido hLF(1-11)- Ahx-Pra bruto. ................................................................................................... 112 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto xiii Índice de Tabelas Tabela 2.1 – Origem e sequência de aminoácidos dos dois primeiros CPP descritos na literatura: Penetratin e TAT. ......................................................... 41 Tabela 2.2 – Sequências de alguns CPP descritos na literatura e respetiva categoria, de acordo com a classificação referida na secção 1.2. ................... 44 Tabela 2.3 – Derivados lipofílicos do péptido S413-PV sintetizados. .............. 53 Tabela 2.4 – Adutos formados entre o péptido-base Fmoc-S413-PV e iões H+. ................................................................................................................... 55 Tabela 2.5 – Adutos formados entre o péptido C8-S413-PV e iões H+. ........ 57 Tabela 2.6 – Resumo dos resultados experimentais da síntese dos derivados lipofílicos do péptido S413-PV. ...................................................... 58 Tabela 2.7 – Peso molecular dos derivados do péptido S413-PV Scr ........... 59 Tabela 2.8 - Adutos formados entre o péptido Ac-S413-PV Scr e iões H+. ... 61 Tabela 2.9 – Resumo dos resultados experimentais da síntese dos derivados lipofílicos do péptido S413-PV. ...................................................... 62 Tabela 3.1 – Derivados funcionalizados do péptido hLF(1-11) sintetizados 85 Tabela 3.2 – Adutos formados entre o péptido Pra-Ahx-hLF(1-11) e iões H+ Tabela 3.3 – Resumo dos resultados experimentais da síntese dos derivados funcionalizados do péptido hLF(1-11). ......................................... Tabela A1 – Estrutura dos aminoácidos proteinogénicos ............................. 87 89 103 xiv Índice de Abreviaturas 1H-RMN Ressonância magnética nuclear de protão AA Aminoácido ACN Acetonitrilo ADN Ácido desoxirribonucleico Ahx Ácido 6-amino-hexanóico Ala Alanina AMP Péptidos Antimicrobianos Arg Arginina Asn Asparagina Asp Ácido Aspártico Boc terc-Butoxicarbonilo BOP Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfónio BtO1-N-óxido de benzotriazolilo Bzl Benzil CPP Péptido Penetrador Celular Ct Carbono terminal Cys Cisteína DCM Diclorometano DIEA N-etil-N,N-diisopropilamina DMF N,N-Dimetilformamida EEDQ N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-di-hidroquinolina ESI-IT MS espetrometria de massa com ionização por eletro-nebulização e deteção por armadilha de iões Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo Fmoc-Rink Ácido p-[(R,S)-α-[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetoxibenzil]fenoxiacético Faculdade de Ciências da Universidade do Porto xv Gln Glutamina Glu Ácido Glutâmico Gly Glicina HATU Hexafluorofosfato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurónio HBTU Hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurónio HCTU Hexafluorofosfato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurónio HF Ácido Fluorídrico His Histidina hLF Lactoferrina humana HMPA Hexametilfosforamida HOAt 7-aza-1-hidroxibenzotriazole HOBt 1-hidroxibenzotriazole HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência Ile Isoleucina Leu Leucina Lys Lisina MBHA metilbenzidrilamina Met Metionina MRSA Multidrug-Resistant Staphylococcus aureus MW-SPPS Microwave assisted solid-phase peptide synthesis Nle Norleucina NLS Sinal de localização nuclear NMP N-metilpirrolidona Nt Amina terminal Oxyma Pure 2-ciano-2-hidroximinoacetato de etilo Pbf 2,2,4,6,7-pentametil-2,3-di-hidrobenzofuran-5-sulfonilo PEG Polietilenoglicol Phe Fenilalanina xvi Pra Propargil-glicina Pro Prolina PS Poliestireno PyAOP Hexafluorofosfato de (7-aza-benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfónio PyBOP Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfónio PyOxB Tetrafluoroborato de O-[(1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilideno)amino]oxitripirrolidinofosfónio PyOxP Hexafluorofosfato de O-[(1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilideno)amino]oxitripirrolidinofosfónio RP-MPLC Cromatografia líquida de fase reversa a média pressão Ser Serina SiRNA Ácido ribonucleico interferente pequeno SN1 Substituição nuclófica de unimolecular SNAr Substituição nucleofílica aromática SPPS Síntese Peptídica em Fase Sólida TATU Tetrafluoroborato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurónio TBTU Tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurónio tBu terc-Butilo TFA Ácido Trifluoroacético Thr Treonina TIS Triisopropilsilano tr tempo de retenção Trp Triptofano Trt Tritilo Tyr Tirosina Val Valina Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 1 Capítulo 1 Breve introdução à síntese peptídica 2 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 3 1. Preâmbulo Péptidos e proteínas assumem um papel fundamental em diversos processos biológicos e fisiológicos de organismos vivos, nomeadamente na comunicação intracelular e intercelular (como hormonas ou neurotransmissores), no sistema imunitário (péptidos antimicrobianos endógenos, anticorpos), ou ainda no transporte de diversas substâncias através de membranas biológicas (proteínas transmembranares, vulgarmente designadas por “canais”) [1]. Devido ao largo espetro de funções exercidas por aquelas biomoléculas, começaram a surgir diversos tratamentos baseados em péptidos bioativos, derivados de hormonas peptídicas naturais ou de fragmentos de proteínas, por exemplo. Neste contexto, os péptidos apresentam vantagens relativamente a outras pequenas moléculas, por possuírem geralmente maior especificidade e afinidade para alvos terapêuticos, mas também relativamente a proteínas de elevado peso molecular, em termos de viabilidade de síntese, flexibilidade de derivatização, baixa imunogenicidade e parâmetros físico-químicos mais compatíveis com o seu emprego como agentes terapêuticos [2]. Considerando a importância biológica dos péptidos, tornou-se importante facilitar a sua obtenção na quantidade necessária e com o grau de pureza exigido para a aplicação desejada. Atualmente, sequências peptídicas podem ser obtidas de três formas:  Isolamento de péptidos de uma matriz biológica - como, por exemplo, células, tecidos ou mesmo organismos;  Manipulação genética - técnicas de ADN recombinante para a expressão de péptidos e proteínas em microorganismos;  Síntese química. Ainda que a cada um destes métodos estejam associadas vantagens e desvantagens, o último é o único que permite a incorporação de aminoácidos não naturais ou de outras modificações com vista à melhoria do índice terapêutico do péptido. Adicionalmente, a síntese química proporciona, geralmente, a produção de péptidos em maior escala e com maior grau de pureza final. 4 2. Síntese Peptídica em Fase Sólida 2.1. A Ligação Peptídica À ligação amida resultante da condensação de dois aminoácidos dá-se o nome de ligação peptídica. Esta ligação desempenha um papel fundamental em sistemas biológicos, caracterizando-se por ser extremamente estável, polar e capaz de estabelecer ligações de hidrogénio com outros átomos, atuando quer como grupo dador, quer como grupo aceitador dessas ligações [3]. Assim, a síntese peptídica tem por base a junção sequencial de α-aminoácidos através de uma ligação amida, formada através de uma reação de adição nucleófila-eliminação (condensação) entre o grupo -amino de um α-aminoácido (AA1) e o grupo carboxilo de outro (AA2). Por convenção, a ordem sequencial dos aminoácidos de um péptido é apresentada no sentido Nt→Ct, ou seja, com o aminoácido N-terminal (Nt, com o grupo -amino livre) à esquerda, e com o aminoácido C-terminal (Ct, com o grupo carboxilo livre), à direita. A reação de condensação deve ser regiosseletiva, sendo absolutamente necessária a supressão de reatividade de outros grupos funcionais que não aqueles que se pretende fazer reagir, ou seja, será preciso desativar de alguma forma o grupo carboxilo do AA1, o grupo -amino do AA2 e grupos funcionais reativos eventualmente presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos. A reação de condensação entre um grupo amino e um grupo carboxilo, apesar de termodinamicamente viável, não é cineticamente favorecida. Assim, à temperatura ambiente ou inferior, sem uma ativação apropriada do grupo carboxilo, a junção daqueles grupos funcionais dará lugar a uma reação ácido-base, com a formação de um sal estável (Esquema 1.1). A formação da amida a partir deste sal requer temperaturas muito elevadas (160-180 ºC), geralmente incompatíveis com a síntese peptídica [4]. Alternativamente, e de forma a evitar-se o recurso a temperaturas tão altas, dever-se-á ativar o grupo carboxilo, ou seja, convertê-lo num seu derivado mais reativo, que reaja prontamente com a amina nucleofílica através do mecanismo de adição-eliminação conducente à amida desejada (Esquema 1.2). Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 5 Esquema 1.1 – Formação de um sal estável entre uma amina e um ácido carboxílico e sua conversão térmica numa amida. Assim, a promoção de uma condensação peptídica em condições suaves requer dois passos: (a) a ativação do grupo carboxílico de um dos reagentes, geralmente promovida por adição dos denominados agentes de condensação, ativação ou acoplamento, que promove a inserção de um bom grupo de saída (At), e (b) o ataque nuceófilo do grupo amino do outro reagente ao derivado carboxílico ativado (Esquema 1.2). Esquema 1.2 – Formação de uma ligação amida por ataque nucleófilo de uma amina a um intermediário reativo derivado de um ácido carboxílico. Na formação de uma ligação amida (peptídica) entre dois aminoácidos, será também preciso salvaguardar que o processo de ativação não ponha em causa a configuração do(s) carbono(s) quiral(is) do aminoácido ativado, conduzindo à sua racemização. Na realidade, este é um problema significativo quando se faz crescer uma cadeia peptídica no sentido Nt→Ct, ou seja, no sentido idêntico ao observado na biossíntese ribossómica de péptidos e proteínas: a ativação do grupo carboxilo de um aminoácido N-acilado é geralmente acompanhada de racemização do C desse Δ 12 peptídica em construção, em consequência de se tratar de um esquema de proteção seletivo, e não ortogonal. Por outro lado, a acidólise com HF anidro é uma operação delicada, que exige um operador experimentado e uma montagem específica que impeça qualquer fuga de HF e que seja totalmente construída em Teflon® e colocada em laboratório dedicado a reações especiais. Ao esquema Boc/Bzl estão ainda associadas reações laterais que contribuem para a diminuição do rendimento da síntese e da qualidade do produto final [21]. Figura 1.2 – Grupos protetores associados ao esquema de proteção Boc/Bzl. Num esforço de contornar as dificuldades associadas ao uso do esquema Boc/Bzl, Carpino e Han desenvolveram em 1970 o grupo Fmoc [23], ao que de imediato se seguiu a proposta do esquema de proteção ortogonal Fmoc/tBu para SPPS [24-25]. Neste esquema, o grupo Fmoc é normalmente removido com soluções de piperidina a 20% em DMF (Esquema 1.5), podendo recorrer-se a outras bases, se necessário; estas condições suaves de tratamento repetitivo da peptidil-resina não só não causam, geralmente, desproteção ou clivagem prematura, como também são totalmente compatíveis com grupos que, como o tBu, são estáveis a bases e lábeis a ácidos. Alguns outros grupos protetores permanentes usados em SPPS pelo esquema Fmoc/tBu são o tritilo (Trt, 6), o Boc (2) ou o 2,2,4,6,7-pentametyldi-hidrobenzofuran-5sulfonilo (Pbf, 7). Assim, a clivagem (e concomitante desproteção total) de um péptido construído pelo esquema de proteção Fmoc/tBu é geralmente realizada por acidólise com TFA (c.f. secção 2.1.5) Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 13 Figura 1.3 – Alguns grupos protetores, temporários ou permanentes, usados no esquema de proteção Fmoc/tBu. A menor agressividade química da SPPS segundo um esquema Fmoc/tBu, em comparação com um esquema Boc/Bzl, faz com que aquele seja compatível com uma variedade substancialmente maior de grupos protetores e modificações químicas, bem como com diversos sistemas automatizados de síntese peptídica (c.f., secção 2.1.6). Por essa razão, e também pela sua menor perigosidade e ortogonalidade, o esquema Fmoc/tBu rapidamente se tornou o esquema de proteção de eleição em SPPS. 14 Esquema 1.5 – Mecanismo de remoção do grupo Fmoc com piperidina. 2.2.3. Agentes de Acoplamento Os métodos correntemente utilizados para a ativação do componente carboxílico em síntese peptídica, quer em solução, quer em fase sólida, baseiam-se nos chamados agentes de condensação, ativação ou acoplamento, que promovem a ativação in situ. Estes agentes estão geralmente associados a uma reação de ativação rápida, mesmo no caso de aminoácidos estereoquimicamente impedidos, formando-se um éster ativo como intermediário. Existem atualmente diversos agentes de acoplamento como, por exemplo, carbodiimidas ou sais de fosfónio ou urónio, sendo os últimos geralmente mais eficientes, possibilitando a diminuição dos tempos de reação, bem como o aumento do rendimento global de síntese. 2.2.3.1. Carbodiimidas As carbodiimidas foram o primeiro tipo de agente de condensação in situ a ser desenvolvido, em meados do século XX [26]. Ao reagir com um ácido carboxílico, as carbodiimidas (8) originam uma O-acilisoureia lábil (9), muito propensa a sofrer um ataque nucleófilo (Esquema 1.6). Assim, sendo esta isoureia gerada na presença do componente amino, reagirá prontamente com este para produzir a amida desejada. No entanto, a elevada reatividade da O-acil-isoureia está também muitas vezes associada à racemização do substrato ativado ou ainda à conversão intramolecular da própria O- Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 15 acilisoureia no seu isómero N-acilureia (10) que não é reativo, ou seja, não sofre a reação de aminólise conducente à formação da ligação amida desejada [26]. Esquema 1.6 – Ativação de um grupo carboxílico por uma carbodiimida e subsequente reação da O-acilisoureia (9) formada (i) por via intramolecular para formar uma N-acilureia estável (10), ou (ii) com uma amina nucleofílica para formar o produto de condensação desejado. 16 Ainda no último quartil do século XX, e com o objetivo de contornar os problemas associados à utilização de carbodiimidas, introduziu-se o conceito de nucleófilo auxiliar, em que espécies nucleófilas como o 1-hidroxibenzotriazole (HOBt, 11) eram usadas em conjunto com as carbodiimidas para promover a ativação in situ [27]. O HOBt reage prontamente com a O-acil-isoureia, gerando um éster reativo de benzotriazolilo, menos lábil que a isoureia, mas ainda passível de sofrer um ataque nucleófilo por parte de uma amina (esquema 1.7). Para além de evitar a conversão da O-acilisoureia em N-acilureia, o HOBt é também capaz de reduzir os níveis de racemização por ser ligeiramente acídico, proporcionando uma formação da amida desejada com melhores rendimentos [28-29]. Esquema 1.7 – Ataque nucleófilo do HOBt a uma O-acilisoureia e subsequente aminólise do éster de benzotriazolilo formado. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 17 Outros nucleófilos auxiliares similares ao HOBt surgiram posteriormente, como é o caso do 7-aza-1-hidroxibenzotriazole (HOAt, 12), geralmente mais eficiente que o HOBt na supressão da racemização e no aumento da velocidade e do rendimento da condensação [30-32]. Esta melhoria está provavelmente relacionada com a incorporação de um átomo de azoto na posição 7 do sistema aromático, que poderá contribuir quer para uma melhor estabilização do grupo de saída (aumentado assim a reatividade do éster), quer para o estabelecimento de „neighboring group effect‟ que aumenta a nucleofilia da amina (esquema 1.8) [10,30,33]. Figura 1.4 – Estrutura dos nucleófilos auxiliares HOBt (11) e HOAt (12). Esquema 1.8 – Representação do „neighbouring group effect‟, por estabelecimento de ligações de hidrogénio entre o azoto da posição 7 do HOAt e a amina nucleofílica. 2.2.3.2. Sais de urónio O sucesso da combinação do HOBt com carbodiimidas conduziu à síntese de diversos novos agentes de acoplamento in situ, capazes de produzir resultados similares aos da referida combinação. Surgiram assim os denominados sais de urónio, como o tetrafluoroborato ou o hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′- tetrametilurónio (TBTU, 13 ou HBTU, 14, respetivamente). O HBTU foi introduzido 18 como agente de acoplamento em 1978 [34] e é atualmente um dos mais utilizados em SPPS. Os sais de urónio são usados na presença de aminas terciárias, como a N-etilN,N-diisopropilamina (DIEA), que desprotonam o aminoácido N  -protegido. Este, na sua forma carboxilato, reage rapidamente com o sal de urónio, produzindo, num primeiro passo, 1-N-óxido de benzotriazolilo (BtO-) e um intermediário O-acilisourónio; este é prontamente atacado pelo BtO-, gerando-se o éster reativo de benzotriazolilo que irá depois reagir com o componente amino (esquema 1.9). Na sequência do desenvolvimento do HOAt como um agente de acoplamento mais eficiente que o HOBt, surgiram também sais de urónio baseados na sua estrutura, como, por exemplo, tetrafluoroborato ou hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurónio (TATU, 15 ou HATU, 16, respetivamente) [35]. Para além de ter demonstrado um melhor desempenho em termos de reatividade e supressão do mecanismo de racemização do que o HBTU [36-37], o HATU é também uma boa alternativa para a condensação de aminoácidos estereoquimicamente impedidos, como N-metilaminoácidos [38]. Esquema 1.9 – Mecanismo de ativação do componente carboxilo com um sal de urónio. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 19 Os sais de urónio, apesar de mais eficazes que as carbodiimidas ou combinações destas com nucleófilos auxiliares, podem conduzir à N-guanidilação do componente amino, particularmente se o ataque do carboxilato ao urónio for lento (esquema 1.10) [35]. Este problema raramente assume proporções significativas em SPPS, dados os curtos períodos de reação e o grande excesso molar do componente carboxilo (aminoácido N-protegido, adicionado juntamente com a base e o agente de condensação in situ à peptidil-resina) em relação ao componente amino (grupos amino livres na peptidil-resina). Esquema 1.10 – N-guanidilação do componente amino por reação deste com o sal de urónio. 2.2.3.3. Sais de Fosfónio Em paralelo ao desenvolvimento dos sais de urónio, foram também desenvolvidos sais de fosfónio como eficientes agentes de condensação in situ. Nos anos 1970, Castro et al. propuseram o primeiro desses agentes, o hexafluorofosfato de (benzotriazole-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfónio (BOP, 17), também conhecido como Reagente de Castro. À semelhança do que ocorre com os sais de urónio, os sais de fosfónio originam um éster ativo de benzotrioazolilo (Esquema 1.11), com a vantagem de não poderem promover a N-guanidilação da amina [39]. Apesar da elevada eficiência do Reagente de Castro, o uso deste foi rapidamente desencorajado, pois a hexametilfosforamida (HMPA, 18) gerada como produto lateral é um potencial agente carcinogénico [10,40]. 20 Esquema 1.11 - Mecanismo de ativação do componente carboxilo com um sal de fosfónio. Tal motivou a procura de alternativas, conduzindo a análogos do BOP, como o hexafluorofosfato de (benzotriazole-1-iloxi)tripirrolidinofosfónio (PyBOP, 19). O PyBOP é atualmente um dos sais de fosfónio mais populares em SPPS, apresentando todas as vantagens do BOP, e gerando uma fosforamida menos tóxica que a HMPA [41]. Figura 1.5 – Estrutura dos agentes de acoplamento PyBOP e PyAOP. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 21 Tal como no caso dos sais de urónio, também entre os sais de fosfónio podem encontrar-se análogos derivados de HOAt, como o hexafluorofosfato de (7-azabenzo-triazole-1-iloxi)tripirrolidinofosfónio (PyAOP, 20) [42]. 2.2.3.4. Derivados da “Oxyma Pure” Os derivados do HOBt, apesar de serem agentes de acoplamento eficientes, são considerados perigosos devido ao seu potencial de decomposição fortemente exotérmico, o que os classifica como explosivos de classe 1 requerendo condições especiais de transporte [43-44]. Foi com base neste argumento que Albericio e colaboradores trabalharam no desenvolvimento de agentes de acoplamento contendo estruturas N-hidroxiladas alternativas ao HOBt, como o 2-ciano-2-hidroximinoacetato de etilo, ou “Oxyma Pure” (21). O potencial da “Oxyma Pure” como nucleófilo auxiliar de carbodiimidas foi recentemente avaliado, com resultados que sugeriram um desempenho superior ao do HOBt, tanto a nível de supressão de racemização, como a nível de eficiência da condensação. Para além disso, foi ainda demonstrada a sua compatibilidade com sistemas de síntese automatizada, cada vez mais importante nos dias que correm, considerando a constante evolução das metodologias de SPPS [44]. Figura 1.6 – Estrutura da “Oxyma Pure”. Com base nos resultados observados para a “Oxyma Pure”, o mesmo grupo de investigação decidiu combinar esta estrutura com um sal de tetrafluoroborato de trispirrolidinofosfónio, surgindo assim o tetrafluoroborato de O-[(ciano-(etoxicarbonil)- metilideno)amino]-iloxitripirrolidinofosfónio (PyOxB, 22) [45]. Este agente foi avaliado relativamente à sua capacidade de inibir reações de racemização, bem como de aumentar a extensão da reação de condensação e comparado com o hexafluorofosfato de O-[(ciano-(etoxicarbonil)-metilideno)amino]iloxitripirrolidinofosfónio (PyOxP, 23) [46]. Deste estudo concluiu-se que o PyOxP demonstra elevada 28 Esquema 1.16 – Mecanismo de acidólise do grupo Pbf, protetor do grupo guanidínio presente na arginina [51]. Em algumas situações torna-se necessário utilizar uma mistura de scavengers diferente, para garantir que a presença de um elevado número de aminoácidos muito nucleofílicos, ou de grupos protetores com especificidades reacionais, não ponham em causa o sucesso da síntese. Por exemplo, em sequências peptídicas com duas ou mais argininas, é recomendado o uso de determinados tióis (tioanisole, anisole e etano-1,2-ditiol) como scavengers, para evitar que a clivagem do grupo protetor (Pbf) ocorra com uma orientação indesejada, ou seja, que o grupo sulfonilo seja clivado “pelo lado errado”, dando origem a uma arginina sulfonada (Esquema 1.17) [21,52]. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 29 Esquema 1.17 – Possíveis resultados da clivagem do grupo Pbf com TFA: rota A conduz ao péptido desejado, enquanto que a rota B dá origem a uma arginina sulfonada. Adaptado de [52]. 2.2.6. SPPS assistida por instrumentação automatizada A natureza repetitiva dos ciclos de acoplamento e desproteção de aminoácidos em SPPS, juntamente com a evolução da informática, da robótica e da microfluídica, proporcionaram o desenvolvimento de instrumentação dedicada à SPPS. A automatização da SPPS é praticamente contemporânea da própria SPPS, já que Merrifield e colaboradores desenvolveram um primeiro instrumento logo em 1965, o que representou um novo marco na ciência da síntese de péptidos, publicado na revista Science [53]. Desde então, e até hoje, tem sido substancial o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais rápidos, flexíveis e eficientes, desde equipamentos dedicados à produção de um só péptido de cada vez, permitindo trabalhar a diferentes escalas de síntese, até equipamentos de síntese múltipla, capazes de produzir de cerca de uma dezena a mais de uma centena de péptidos em simultâneo, nesses casos geralmente a pequena ou média escala. Na esmagadora maioria dos casos, os sistemas para síntese automatizada de péptidos são apenas compatíveis com SPPS segundo um esquema de proteção Fmoc/tBu, por ser difícil e muito dispendioso tentar 30 compatibilizar os delicados componentes de microfluídica com a agressividade dos tratamentos repeptitivos com TFA, requeridos quando se usa o esquema Boc/Bzl [54]. O interesse da síntese automatizada de péptidos não reside apenas na sua maior rapidez, ou na possibilidade que oferece de continuar a ser realizada durante períodos de ausência do operador. Na realidade, ainda que seja atualmente a metodologia mais eficaz de produção de péptidos nativos ou modificados, a SPPS continua a apresentar diversos desafios, alguns dos quais podem benificiar do uso de determinados sistemas automatizados de SPPS. O mais emblemático desses desafios é o da síntese de péptidos longos (com mais de 30 aminoácidos), em especial se forem ricos em aminoácidos hidrofóbicos. As cadeias peptídicas em crescimento sobre uma resina têm tendência a agregar-se à medida que vão ficando cada vez mais longas, através de interações intermoleculares, sejam pontes de hidrogénio ou outras interações dipólo-dipólo, sejam interações hidrofóbicas. Estas interações podem também ocorrer intramolecularmente, promovendo o enrolamento da cadeia peptídica, à medida que esta cresce. Em ambos os casos, o rendimento e qualidade da síntese são drasticamente afetados, já que a estruturação (intraou inter-molecular) das cadeias peptídicas crescentes vai tornando inacessíveis os grupos reativos necessários para o passo sintético seguinte, seja de desproteção ou condensação. Problemas similares podem surgir devido a efeitos estéricos, quer quando a amina terminal é secundária (por exemplo, na prolina ou aminoácidos N-substituídos), quer em casos em que o grupo protetor da cadeia lateral é muito volumoso, o que diminui substancialmente a velocidade e extensão das reações. Uma das estratégias mais recentes para tentar ultrapassar estes problemas, para além do uso de agentes de condensação e desproteção mais eficazes, tem sido a aplicação de aquecimento nos ciclos de N-desproteção e acoplamento [55-57] (Figura 1.8). Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 31 Figura 1.8 – Representação esquemática do efeito do aquecimento/radiação microondas no enrolamento da cadeia peptídica. Neste contexto, o aquecimento através de radiação microondas, que se impôs no início deste século como uma ferramenta útil em síntese orgânica [57], passou a integrar alguns sistemas automatizados de SPPS (Figura 1.9). Nasceu, assim, a Síntese Peptídica em Fase Sólida Assistida por Microondas (MW-SPPS), que possibilitou não só uma diminuição significativa dos tempos de reação, mas também um aumento do rendimento de síntese e, em muitos casos, uma melhoria no grau de pureza do péptido [58]. Figura 1.9 – Sintetizador automático CEM Liberty1™. 32 A MW-SPPS ainda não permitiu, contudo, que a síntese peptídica atingisse um nível de desempenho ótimo. A maior propensão de alguns aminoácidos, ou seus derivados, para sofrer alterações indesejadas, como a racemização ou outras, pode ser agravada nas condições de acoplamento e desproteção assistidos por microondas. Tal exige um cuidado adicional com sequências contendo resíduos como cisteína, histidina ou ácido aspártico, ou na síntese de determinados péptidos modificados, como fosfopéptidos, glicopéptidos ou péptidos N-metilados [57,59]. Perante isto, novos equipamentos estão a surgir no mercado, e novos protocolos de síntese a ser explorados, tendo em vista o constante melhoramento e maior flexibilização da SPPS. Exemplo disso é o recente lançamento de um sintetizador paralelo (síntese simultânea de até 24 péptidos) que permite não só o aquecimento por radiação infra-vermelha, como é também compatível com o esquema Boc/Bzl, no qual os problemas de agregação/estruturação das cadeias peptídicas são menores, dado que as interações subjacentes a esses problemas são maioritariamente destruídas em cada ciclo de desproteção com TFA [60]. Adicionalmente, o uso combinado deste tipo de sintetizador com protocolos de SPPS envolvendo o uso do hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurónio (HCTU, 27) como agente de condensação, tem vindo a revelar-se uma via eficaz para a síntese de sequências longas e hidrofóbicas, como é o caso do péptido -amilóide 1-42 humano [61]. Figura 1.10 – Estrutura do agente de condensação HCTU. Em suma, a SPPS é um marco na síntese peptídica que, desde a sua invenção até hoje, tem evoluído de forma considerável. Apesar de haver ainda alguns obstáculos a transpor em síntese de péptidos, é hoje possível sintetizar de forma Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 33 simples e rápida um sem número de sequências peptídicas diversas, se necessário incorporando aminoácidos não naturais ou modificações químicas inacessíveis por via biossintética. Tal trouxe aos péptidos um novo protagonismo em várias áreas, da engenharia biomédica à nanotecnologia e à criação de novos fármacos [62]. 34 3. Bibliografia [1] N. Sewald, H. D. Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Wiley-VCH, Verlag, 2002. [2] D. P. McGregor, Curr. Opin. Pharmacol. 2008, 8, 616-619. [3] V. R. Pattabiraman, J. W. Bode, Nature 2011, 480, 471-479. [4] R. B. Martin, Biopolymers 1998, 45, 4, 351-353. [5] M. Goodman, W.J. McGahren, Tetrahedron 1967, 23, 2031-2050. [6] I. Antovonics, J. T. Young, J. Chem. Soc. 1967, 595. [7] M. Bodansky, Principle of Peptide Synthesis, Second ed., Springer, Verlag, Berlin, 1993. [8] L. A. Carpino, J. 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Tabela 2.2 – Sequências de alguns CPP descritos na literatura e respetiva categoria, de acordo com a classificação referida na secção 1.2.. Péptido Sequência de Aminoácidos Categoria TAT GRKKRRQRRRPPQ Catiónico R9 RRRRRRRRR DPV3 RKKRRRESRKKRRRES Penetratin RQIKIWFQNRRMKWKK Anfipático MPG GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV pVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKRKV Bac7 RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG PFV PFVYLI Hidrofóbico Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 45 1.3. Mecanismos de Penetração Celular Um dos grandes desafios no campo dos CPP prende-se com a elucidação do seu mecanismo de internalização celular, que permanece um assunto controverso. O facto de este fenómeno ocorrer mesmo a baixas temperaturas fez com que, à partida, fosse excluída a via endocitótica, sugerindo a existência de um mecanismo alternativo, independente de energia. Posteriormente, avaliou-se a capacidade de translocação de enantiómeros D ou péptidos com a sequência invertida, verificando-se que as suas atividades eram similares, excluindo-se assim a hipótese de o mecanismo de internalização estar dependente de recetores presentes nas membranas celulares [23]. Como resultado destas observações, começaram a ser propostos vários modelos que pudessem explicar a translocação de CPP através de membranas celulares, com base nas suas interações com fosfolípidos ou outros componentes da membrana [24]. Ainda que esta questão não esteja completamente solucionada, são aceites, hoje em dia, duas vias de internalização - endocitose ou translocação membranar direta, podendo estes mecanismos ocorrer para o mesmo péptido, em condições experimentais diferentes [25]. 1.3.1. Translocação membranar direta Para explicar a translocação direta de CPP através de membranas biológicas, processo independente da disponibilidade de energia, foram propostos três modelos: formação de micelas invertidas, formação de poros membranares e modelo “em carpete” (Figura 2.1). De acordo com o modelo das micelas invertidas (Figura 2.1.A), a interação do CPP com a membrana plasmática resulta num distúrbio da bicamada lipídica, com a consequente formação de estruturas hexagonais (micelas) invertidas. Os péptidos permanecem retidos no meio hidrofílico do centro da micela, até que a sua interação com os componentes da membrana provoque um processo inverso, resultando na destabilização da micela invertida, e consequente libertação do péptido para o meio intracelular [23,24]. Este modelo é aceite para a translocação de péptidos de baixo peso molecular através da bicamada lipídica, sem que seja necessário ultrapassar a barreira energética apresentada pelo seu interior. No entanto, não é compatível com a internalização de péptidos de maior peso molecular, uma vez que a formação de micelas em torno destas moléculas maiores não é favorecida energeticamente [24]. 46 Por outro lado, a hipótese de formação de poros membranares (Figura 2.1.B) considera a inserção membranar dos CPP, que se reorganizam para formarem estruturas cilíndricas. Este modelo é aceite para péptidos que assumem uma estrutura de hélice-α anfipática, ou seja, com uma face lipofílica que interage com a bicamada lipídica, e outra face hidrofílica, que se orienta para o centro do poro [26]. Por último, de acordo com o modelo “em carpete” (Figura 2.1.C), a translocação dos péptidos ocorre como consequência da sua acumulação na superfície externa da membrana celular, induzindo uma reorganização dos fosfolípidos que proporciona a internalização do péptido [26]. Figura 2.1 – Representação esquemática dos mecanismos propostos para a internalização de um CPP via translocação membranar direta: (A) modelo das micelas invertidas; (B) formação de poros membranares, e (C) modelo “em carpete”. Adaptado de [8]. Fosfolípidos c/ carga negativa Fosfolípidos zwiteriónicos CPP carregados positivamente Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 47 1.3.2. Endocitose A internalização de CPP via endocitose consiste em dois passos: penetração endocítica, seguida da evasão do endossoma. Este último passo é fundamental, não só para evitar a degradação do péptido (bem como de moléculas a ele conjugadas), mas também para permitir que este atinja o seu alvo, exercendo a atividade biológica pretendida. A endocitose é o mecanismo mais aceite para a internalização de péptidos, estando atualmente descritas três diferentes vias endocitóticas para a ocorrência deste fenómeno (Figura 2.2): macropinocitose, endocitose mediada pela clatrina e endocitose mediada por cavéolas [8]. Figura 2.2 – Internalização de um CPP por via endocitótica. Adaptado de [27]. No caso particular da aplicação de CPP à veiculação de fármacos, será provavelmente preferível uma translocação membranar direta, uma vez que este mecanismo permitirá evitar a retenção do conjugado CPP-fármaco nos endossomas [28]. Ainda assim, os mecanismos atrás referidos como possivelmente associados à translocação de CPP implicam uma elevada destabilização da membrana celular, o que torna difícil explicar a baixa citotoxicidade associada a este tipo de péptidos e A Macropinocitose B Endocitose mediada pela Clatrina C Endocitose mediada por cavéolas Macropinossoma Vesícula caveolar Caveossoma Retículo Endoplasmátco Lisossoma Vesícula Revestida por clatrina Endossoma Precoce Endossoma Tardio Núcleo 48 seus conjugados. Ou seja, nenhum dos modelos acima descritos explica inteiramente os dados experimentais obtidos para diferentes CPP, o que sugere que exista(m), para além destes, outro(s) mecanismo(s) de internalização de CPP [24]. 1.4. CPP aplicados à terapia génica A terapia génica foi descrita pela primeira vez nos anos 70 e tem como principal objetivo a inserção de genes terapêuticos no núcleo de células alvo, de forma a promover a expressão correta de um produto genético que esteja a ser expresso de forma incorreta ou deficiente [29]. Uma das limitações deste tipo de tratamento prendese com a dificuldade de desenvolver vetores seguros e eficientes, capazes de promover e sustentar localmente a expressão genética por longos períodos de tempo [30]. Os vetores virais são os mais comumente usados em terapia génica, uma vez que apresentam algumas vantagens frente a outros vetores, como os elevados níveis de transdução e, em alguns casos, a integração estável e eficiente de ADN exógeno na célula alvo. No entanto, a estes vetores estão também associados alguns problemas, como imunogenicidade, toxicidade, dificuldade de produção em larga escala, e os riscos de indução de mutações oncogénicas ou de formação de partículas virais ativas através de mecanismos recombinantes [31]. Com o objetivo de contornar estes obstáculos, começaram a ser desenvolvidos novos vetores não virais de entrega genética, como nanopartículas, polímeros, lipossomas e CPP. Neste contexto, a utilização de CPP é particularmente interessante, uma vez que os péptidos são capazes de se conjugar a ácidos nucleicos, covalentemente ou não, possibilitando o transporte de carga genética para o interior do núcleo celular [24]. 1.5. O péptido S413-PV em terapia génica As dermaseptinas constituem uma família de AMP que são expressos na pele de rãs pertencentes ao género Phyllomedusa. Estes AMP caracterizam-se por serem policatiónicos (ricos em lisinas) e apresentarem atividade citolítica frente a um largo espetro de microorganismos patogénicos, como bactérias e fungos; esta atividade é mediada pela interação do péptido, adotando uma conformação em hélice-α anfipática, com fosfolípidos da membrana plasmática do patogénio [32]. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 49 O péptido S413 é um fragmento de 13 aminoácidos derivado da dermaseptina S4, que apresenta atividade antimicrobiana associada a uma baixa atividade hemolítica, aliada à capacidade de penetrar eficientemente a membrana plasmática [33]. Tendo em conta que este é um péptido curto, de peso molecular relativamente baixo, esperava-se que fosse capaz de se difundir livremente através dos poros nucleares, acumulando-se no núcleo das células alvo, o que não se observou. Pelo contrário, após atravessar facilmente a membrana plasmática, este péptido fica retido no citoplasma. Assim, com o objetivo de conferir a capacidade de penetração nuclear ao péptido S413, este foi conjugado com a sequência NLS do grande antigénio T do vírus símio 40 (SV-40), um vírus potencialmente oncogénico encontrado em símios e humanos. Esta conjugação deu origem ao péptido quimérico S413-PV (Figura 2.3), que não só manteve a propriedade de permear a membrana plasmática, mas também adquiriu a capacidade de penetrar o núcleo celular de uma forma rápida, eficiente e não tóxica [34]. Figura 2.3 – Sequência de aminoácidos do péptido quimérico S413-PV, constituído pelo péptido S413, representado a azul, e pelo NLS SV-40, representado a cinzento. A internalização do S413-PV ocorre através de dois mecanismos distintos: a baixas concentrações, este processo ocorre por um mecanismo endocitótico, dependente de glicosaminoglicanos; por outro lado, a elevadas concentrações de péptido, a internalização ocorre via translocação membranar direta, independente de energia [35]. Considerando a capacidade de translocação membranar do péptido S413-PV, Trabulo et al. avaliaram o seu potencial como vetor de entrega intracelular de ADN plasmídico, para futuras aplicações em terapia génica [36]. Efetivamente, o péptido demonstrou a capacidade de entregar ADN plasmídico de forma eficiente, realçando assim a possibilidade de utilização de CPP, neste caso o péptido quimérico S413-PV, como vetores em terapia génica. A L W K T L L K K V L K A P K K K R K V C 50 1.6. Modificação de CPP com ácidos gordos Em 2001, Futaki et al. avaliaram o efeito, na capacidade de translocação membranar, da modificação de CPP previamente estudados (como, por exemplo, o péptido TAT) com ácidos gordos. De acordo com os resultados publicados, a modificação de CPP com cadeias lipofílicas, especialmente com o ácido esteárico, parece aumentar drasticamente a capacidade de penetração celular, provavelmente porque a inserção de uma cadeia hidrofóbica permite uma maior perturbação das paredes dos endossomas, promovendo a sua rutura [37]. Desde então, diversos estudos têm surgido no sentido de avaliar CPP modificados com o ácido esteárico no que se refere à sua capacidade penetração celular e de entrega intracelular de moléculas bioativas como, por exemplo, ácido ribonucleico interferente pequeno (SiRNA, do inglês Small Interference Ribonucleic Acid) [38-41]. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 51 2. Objetivo O trabalho experimental realizado teve como objetivo principal a síntese de derivados lipofílicos do péptido penetrador celular S413-PV (Figura 2.4), a fim de se averiguar, posteriormente, se estas modificações podem conduzir a uma melhor capacidade de entrega intracelular de ADN plasmídico. Figura 2.4 – Derivados lipofílicos do péptido S413-PV sintetizados no âmbito do trabalho. Pretendeu-se, também, sintetizar dois péptidos baseados na sequência S413PV Scrambled (KTLKVAKWLKKAKPLRKLVKC), resultante da reordenação aleatória dos aminoácidos constituintes do péptido S413-PV. Os dois péptidos, produzidos para usar como controles em ensaios biológicos posteriores, corresponderam a derivados N-acilados do S413-PV Scr, o primeiro (Figura 2.5.A) com o grupo acetilo, e o segundo (Figura 2.5.B) com o grupo dodecilo (lauroílo). Figura 2.5 – Péptidos N-acetil-S413-PV (A) e N-lauroil-S413-PV (B). n = 6: C8-S413-PV n = 8: C10-S413-PV n = 10: C12-S413-PV n = 12: C14-S413-PV n = 14: C16-S413-PV n = 16: C18-S413-PV (A) (B) 52 3. Resultados e Discussão 3.1. Síntese de derivados lipofílicos do CPP S413-PV Começou-se por construir o péptido S413-PV (ALWKTLLKKVLKAPKKKRKVC, 2480 g/mol) por SPPS, utilizando um esquema de proteção ortogonal Fmoc/tBu. Como suporte sólido foi utilizada a resina Fmoc-Rink Amide MBHA (0,38 mmol/g), que consiste num polímero-base de poliestireno reticulado com 1% de divinilbenzeno (PSDVB) e modificado com grupos do tipo metilbenzidrilamina, por sua vez conjugados com o espaçador bifuncional ácido p-[(R,S)-α-[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]- 2,4-dimetoxibenzil]fenoxiacético (Fmoc-Rink), através do aminoácido norleucina (Nle) (Figura 2.6). Figura 2.6 – Estrutura da resina Fmoc-Rink Amide MBHA (o círculo com a letra P representa o polímero PS-DVB). O grupo Fmoc do espaçador foi inicialmente removido com uma solução de piperidina a 20% em DMF, seguindo-se a lavagem da resina, com DMF e DCM, com o objetivo de remover reagente em excesso e produtos da reação de desproteção. Ao grupo amino do espaçador acoplou-se o primeiro aminoácido da sequência (Cterminal) N-Fmoc-protegido (Fmoc-AA-OH), utilizando como agente de condensação HBTU, na presença de DIEA. O enlongamento da cadeia peptídica foi realizado através de ciclos repetitivos de reações de desproteção e acoplamento, que foram Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 53 intercaladas com lavagens da resina com DMF e DCM e monitorizadas pelo teste de Kaiser. Sempre que este teste revelou que a reação não havia sido completa, a mesma foi repetida. Assim, quando foi necessário repetir o acoplamento de um aminoácido, substituiu-se o HBTU por HATU, geralmente mais eficiente [42]. Nas repetições de ciclos de desproteção, usou-se uma solução de piperidina a 50% em DMF. Terminada a construção da sequência peptídica, recolheu-se uma alíquota da peptidil-resina para posterior clivagem e análise da sequência S413-PV construída, e procedeu-se à divisão da restante resina em seis frações iguais. A cada uma destas frações acoplou-se um ácido gordo diferente, utilizando como agentes de acoplamento PyBOP e DIEA, dissolvidos em DMF. Completou-se, assim, a construção dos seis derivados lipofílicos do péptido S413-PV (tabela 2.3) em fase sólida. Tabela 2.3 – Derivados lipofílicos do péptido S413-PV sintetizados. Ácido Gordo Lipopéptido Massa molar/g.mol-1 Ácido octanoico (caprílico) C8-S413-PV 2606 Ácido decanoico (cáprico) C10-S413-PV 2634 Ácido dodecanoico (láurico) C12-S413-PV 2662 Ácido tetradecanoico (mirístico) C14-S413-PV 2690 Ácido hexadecanoico (palmítico) C16-S413-PV 2718 Ácido octadecanoico (esteárico) C18-S413-PV 2746 Procedeu-se, depois, à clivagem de todas as peptidil-resinas, por acidólise com um cocktail de clivagem constituído por TFA (90%), TIS (2,5%) e H2O (2,5%). Após a clivagem, os produtos brutos de síntese foram isolados de acordo com o procedimento descrito na secção 4.6, e analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e por espetrometria de massa com ionização por eletro-nebulização e deteção por armadilha de iões (ESI-IT MS), com o objetivo de determinar, respetivamente, o grau de pureza e massa molecular de cada péptido bruto. 60 Figura 2.12 – Cromatograma obtido para o péptido Ac-S413-PV Scr, com uma eluição de 0100% ACN em água (com 0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. Figura 2.13 – Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido Ac-S413-PV Scr. Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 mAU -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 mAU -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 DAD-CH1 220 nm C12-S413-PV Scrambled Retention Time Area Percent NVAcetil-S413-PV-Scr #426-437 RT: 10,69-10,96 AV: 12 NL: 3,26E8 T: + p ESI Full ms [ 250,00-2000,00] 500 1000 1500 2000 m/z 0 20000000 40000000 60000000 80000000 100000000 120000000 140000000 160000000 180000000 200000000 220000000 240000000 260000000 280000000 300000000 320000000 Intensity 631,20 505,33 841,20 1261,20 421,47 659,27 1316,60 1680,67 955,67 1083,40 1918,33 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 61 Tabela 2.8 - Adutos do péptido Ac-S413-PV Scr com iões H+ detetados por ESI-IT MS. Adutos m/z esperado m/z observado P + 2H+ 1261,50 1261,20 P + 3H+ 841,33 841,20 P + 4H+ 631,25 631,20 P + 5H+ 505,20 505,33 P + 6H+ 421,17 421,47 O cromatograma do péptido Ac-S413-PV Scr (Figura 2.12) revela um pico bastante intenso, com um tr = 13,8 minutos, que se verificou corresponder ao produto esperado por ESI-IT MS (Figura 2.13). No espetro de massa deste péptido (peso molecular 2521 g/mol) surgem diversos picos, que correspondem a moléculas do péptido-alvo com diferentes graus de protonação (Tabela 2.8). Analisando o cromatograma obtido, pode concluir-se que o péptido não se encontrava suficientemente puro (<90%), sendo necessário proceder-se à sua purificação. Após otimização, por HPLC, do gradiente apropriado para a purificação do péptido, o produto bruto foi submetido a separação por RP-MPLC, utilizando uma eluição em gradiente de 15-45% ACN em água (com 0,05% TFA). O péptido purificado foi novamente analisado por HPLC, determinando-se um grau de pureza final de 98,5% (Figura 2.14), e foi finalmente liofilizado para posterior envio para ensaios biológicos. 62 Figura 2.14 –Cromatograma obtido para o péptido Ac-S413-PV Scr purificado, com uma eluição de 0-100% ACN em água (com 0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. Os dados cromatográficos e espetroscópicos foram também obtidos para o péptidos C12-S413-PV Scrambled, constando na tabela 2.9 o grau de pureza e rendimento global de síntese dos derivados N-acilados do péptido S413-PV Scrambled. Tabela 2.9 – Resumo dos resultados experimentais da síntese dos derivados lipofílicos do péptido S413-PV. Péptido P. Mol. / g.mol-1 Massa / mg Pureza / % Rendimento / % C12-S413-PV Scr 2662 36,0 98,8 13,5 Ac-S413-PV Scr 2521 17,0 98,5 6,7 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 mAU -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 mAU -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 12.987 0.25413.267 0.346 13.547 0.393 13.800 98.794 14.020 0.214 DAD-CH1 220 nm C12-S413-PV Scrambled Final Retention Time Area Percent Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 63 4. Procedimento Experimental 4.1. Montagem Experimental Figura 2.15 – Montagem experimental aplicável à SPPS manual. 4.2. Reagentes e Equipamentos Utilizados Os reagentes e solventes utilizados no âmbito deste trabalho foram da marca na Novabiochem (Fmoc-Aminoácidos, resina), Sigma-Aldrich (agentes de acoplamento, piperidina, DIEA) e Merck (TFA, solventes). As análises ESI-IT MS foram realizadas sobre soluções dos produtos em metanol (LC-MS grade) num equipamento Finnigan Surveyor LCQ DECA XP MAX, no Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto (DQB-FCUP). No decorrer do trabalho, os péptidos-alvo foram purificados por RP-MPLC, usando-se uma fase estacionária do tipo octadecil-silano Vydac® 218TP, da Grace Vydac. A pureza dos compostos foi avaliada por HPLC, num equipamento MerckHitachi LaChrom Elite dotado de bomba quaternária, injetor automático termostatizado por efeito peltier e detetor de diodos. Usou-se uma coluna de fase reversa (octadecilsilano) Purospher star RP C-18 de 125 x 4,0 mm e 5 μm (diâmetro de partícula). Foi realizada uma eluição gradiente com acetonitrilo / água + 0,05% TFA. Os péptidos purificados foram liofilizados num equipamento BenchTop Pro with omnitronics SP Scientific. Teflon Seringa Filtro Vácuo 64 4.3. Preparação da Resina Após a preparação da montagem experimental (Figura 2.15), colocou-se a resina seca (Fmoc-Rink-MBHA 0,25 mmol; 0,66 g) na seringa, à qual se adicionou DMF, mantendo a mistura sob agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a resina e foilhe adicionado DCM, que foi rejeitado 20 minutos mais tarde. Procedeu-se então à remoção do grupo Fmoc com uma solução de piperidina a 20% em DMF (3 mL, 1 x 1‟ + 1 x 20‟), mantendo-se a mistura sob agitação. Após a desproteção de 20 minutos, lavou-se a resina com DMF (3 mL, 3 x 1‟) e DCM (3 mL, 3 x 1‟), foram retirados alguns grãos da mesma e efetuou-se o teste de Kaiser. Quando o resultado foi positivo (solução azul escura), avançou-se para a construção da cadeia peptídica. 4.4. Ciclos de Desproteção e Acoplamento de Aminoácidos Preparou-se uma solução de Fmoc-AA-OH (5,0 eq.), HBTU (5,0 eq.) e DIEA (10,0 eq) em DMF (3 mL) e adicionou-se à resina, previamente desprotegida, permanecendo a mistura sob agitação durante 1 hora. Terminado o tempo de reação, filtrou-se a resina, que foi posteriormente lavada com DMF (3 mL, 3 x 1‟) e DCM (3 mL, 3 x 1‟). Com alguns grãos, efetuou-se o teste de Kaiser e, quando o resultado foi negativo (solução amarela), prosseguiu-se para a desproteção da peptidil-resina, com uma solução de piperidina a 20% em DMF (3 mL, 1 x 1‟ + 1 x 20‟).Terminada a reação de desproteção, efetuou-se o teste de Kaiser e, quando o resultado foi positivo, procedeu-se ao acoplamento do aminoácido seguinte, nas condições anteriormente referidas. A construção da sequência peptídica foi realizada através de diversos ciclos de desproteção e acoplamento. Na eventualidade de serem necessárias mais do que duas repetições de um dado passo, para que o teste de Kaiser desse o resultado desejado, as condições da reação de desproteção e acoplamento foram alteradas. Nesses casos, a desproteção dos Fmoc-Aminoácidos foi realizada com piperidina a 50% em DMF (15‟) e, nas reações de acoplamento, o HBTU foi substituído pelo HATU, mantendo-se as restantes condições da reação. 4.5. Acilação do Aminoácido N-terminal Terminado o elongamento da cadeia peptídica, prodeceu-se à divisão da resina em 7 frações, tendo sido 6 delas modificadas com um ácido gordo diferente. Para tal, promoveu-se a desproteção do aminoácido Nt e preparou-se uma solução do ácido gordo relevante (5,0 eq.), PyBOP (5,0 eq.) e DIEA (10,0 eq.), em DMF (3 mL), a qual Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 65 foi adicionada à peptidil-resina, permanecendo a mistura sob agitação durante 1 hora. Terminada a reação, efetuou-se o teste de Kaiser e, perante um resultado negativo (solução amarela), procedeu-se à clivagem do péptido. 4.6. Clivagem do Péptido e Desproteção das Cadeias Laterais Na hotte, preparou-se o cocktail de clivagem (95% TFA, 5% TIS e 5% H2O). Transferiram-se porções de 100 mg de peptidil-resina seca para tubos de falcon de 15 mL e transferiu-se 1 mL de cocktail de clivagem para cada tubo, deixando-se a mistura sob agitação contínua durante 2 horas. Na hotte, fez-se uma montagem para filtração sob vácuo, utilizando um funil de placa porosa D4 e, após as 2 horas de reação, verteu-se a mistura contida nos tubos de falcon para o funil, ficando o péptido solúvel no filtrado. Dividiu-se o filtrado em porções de 2 mL, em tubos de falcon, perfazendo o volume de 15 mL com éter etílico seco. Após alguns minutos no congelador, centrifugou-se a mistura e decantou-se o líquido sobrenadante para um matraz com rolha. A adição de éter etílico seco e posterior centrifugação e decantação foram realizadas mais três vezes e, finalmente, os tubos foram colocados no exsicador. Ao líquido sobrenadante foram efetuadas extrações líquido-líquido, com o objetivo de se recuperar algum péptido que tivesse ficado dissolvido no éter. Para isso, lavou-se a camada orgânica três vezes com água (0,05% TFA) (~10 mL) e, por fim, liofilizou-se a camada aquosa, juntando-se a fração obtida ao produto isolado anteriormente por centrifugação. O péptido foi dissolvido numa solução de ácido acético a 10% e analisado por HPLC e ESI-IT MS. Todos os péptidos obtidos foram purificados por RP-MPLC, com uma eluição em gradiente de 15-45% ACN em H2O (0,05% TFA). Depois de isoladas e combinadas as frações contendo o péptido puro, a solução final de péptido foi dividida em tubos de falcon (45 mL), que foram posteriormente colocados no congelador, consistindo o último passo na liofilização do péptido purificado. 66 5. Bibliografia [1] R. Tréhin, H. P. Merkle, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2004, 58, 209-223. [2] A. D. Frankel, C. O. Pabo, Cell 1988, 55, 1189-1193. [3] M. Green, P.M. Lowenstein, Cell 1988, 55, 1179-1188. [4] E. Koren, V. P. Torchilin, Trends Mol. Med. 2012, 18, 7, 385-393. [5] A. Joliot, C. 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Os AMP no tratamento da osteomielite Os implantes ósseos estão associados a um grande número de infeções, como a osteomielite, em consequência de colonizações bacterianas e formação de biofilmes superficiais, cuja prevenção e tratamento são geralmente muito difíceis, nomeadamente devido à deficiente imunidade que existe na interface implante/tecido [12]. Apesar das melhorias a que se tem assistido, tanto a nível de diagnóstico, como a nível de opções de tratamento, a osteomielite continua a ser uma das maiores complicações relacionadas com cirurgia ortopédica, resultando em elevada morbilidade, uma vez que as infeções mais persistentes podem ter como consequência a remoção ou substituição do implante [8,13]. Hoje em dia, o tratamento da osteomielite consiste no desbridamento minucioso do tecido infetado, seguido da administração de sistemas de libertação controlada de antibióticos. No entanto, o surgimento de estirpes resistentes aos antibióticos convencionais, especialmente Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA, de Multidrug-Resistant Staphylococcus aureus), tornou-se um dos maiores obstáculos no tratamento destas infeções [14,15], sendo urgente o desenvolvimento de novas estratégias em antibioterapia. Neste contexto, algumas abordagens recentes têm-se centrado na preparação e estudo de superfícies antimicrobianas, como (1) superfícies antiaderentes (superfícies que evitam a adsorção de proteínas e/ou a adesão das células microbianas) [16,17], (2) superfícies colonizadas com bactérias nãopatogénicas [18], e (3) superfícies combinadas com biocidas ou antibióticos [19,20]. As últimas apresentam a vantagem de entregarem o fármaco diretamente no local do implante, resultando numa elevada concentração do mesmo no local de ação, sem que sejam atingidas concentrações elevadas a nível sistémico, o que permite prevenir efeitos secundários associados ao fármaco [18]. Para além disso, esta estratégia permite a existência de atividade antimicrobiana durante longos períodos de tempo, sem que haja acumulação do agente em órgãos não-alvo, como o cérebro, o fígado, os rins ou o baço [21]. A eficiência destes revestimentos está fortemente dependente da atividade do fármaco selecionado, bem como da possibilidade de desenvolvimento de resistência antimicrobiana no período de tempo relevante, pelo que se torna necessário encontrar um agente antimicrobiano de largo espetro, capaz de prevenir a colonização de biomateriais e minimizar o desenvolvimento de resistência bacteriana, mas também que seja estável durante um longo período de tempo [8]. Os AMP são excelentes candidatos para este propósito, uma vez que, como referido anteriormente, apresentam geralmente um largo espetro de atividade e o seu mecanismo primário de ação antimicrobiana torna improvável o desenvolvimento de mecanismos de Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 77 resistência por parte dos agentes patogénicos. A imobilização de AMP a uma superfície faz ainda com que seja possível contornar alguns inconvenientes associados à aplicação sistémica destes agentes, como a degradação proteolítica, a co-precipitação ou a auto-agregação [22]. 1.4. O péptido hLF(1-11): um potente AMP de largo espetro A lactoferrina humana (hLF) é uma glicoproteína pertencente à família das transferrinas, que existe em quantidade significativa no colostro e pode ser encontrada em superfícies mucosas, atuando na primeira linha de defesa do corpo humano contra infeções ou inflamações [23-24]. Esta proteína apresenta atividade antimicrobiana e antifúngica, inicialmente atribuída à sua capacidade para se ligar a iões de ferro, privando os microorganismos deste ião essencial. Hoje em dia sabe-se que a hLF apresenta também atividade anticancerígena, antiparasítica e antiviral, e que a estes mecanismos de ação está associado o seu domínio N-terminal, catiónico e anfipático, rico em argininas [25-27]. O péptido hLF(1-11), fragmento N-terminal da hLF que compreende os primeiros 11 aminoácidos da proteína (Figura 3.2), apresenta um caráter anfipático, integrando o importante domínio catiónico Nt (GRRRR). Este péptido antimicrobiano demonstrou elevada atividade contra um largo espetro de agentes patogénicos [24,28], nomeadamente várias estirpes resistentes de bactérias, como MRSA [29], Acinetobacter baumanni [30], Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae e Escherichia Coli [31], e fungos, como Candida albicans [29] e Aspergillus fumigates [32]. De entre estas estirpes destacam-se, no contexto desta dissertação, a MRSA e a A. baumanni, frequentemente responsáveis pelo desenvolvimento de osteomielite crónica [33,34]. Figura 3.2 - Sequência de aminoácidos do péptido anfipático hLF(1-11), constituído por uma parte catiónica (representada a azul) e uma parte hidrofóbica (representada a cinzento). Futuras aplicações deste péptido incluem, entre outras, o revestimento de dispositivos médicos para implante e/ou aplicação em pacientes com o sistema imunitário comprometido (atuando como um desinfetante com vista a prevenir a G R R R R S V Q W C A 78 formação de biofilmes bacterianos à superfície do dispositivo), ou ainda para a criação de biossensores para a deteção de infeções de difícil despiste, como a meningite, já que o hLF(1-11) é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica [24,35]. 1.5. Criação de revestimentos antimicrobianos por imobilização covalente do péptido hLF(1-11) ao quitosano O quitosano, um polissacárido linear composto por monómeros de 2aminodesoxiglucose (unidade não acetilada) e N-acetil-2-aminodesoxiglucose (unidade acetilada) (Figura 3.3), é obtido a partir da desacetilação alcalina da quitina, o principal componente do exoesqueleto de crustáceos e alguns insetos [36]. O quitosano tem sido alvo de grande interesse, especialmente em áreas de estudo como a medicina e a bioengenharia, devido às suas propriedades intrínsecas como biocompatibilidade, biodegradabilidade (já que pode ser metabolizado por algumas enzimas) e bioadesão (devido à carga positiva que adquire a pH fisiológico). Para além disto, o quitosano promove a cicatrização e apresenta propriedades bacterioestáticas [36-37]. Por todas estas características, aliadas ao facto de este polímero ser relativamente barato, o quitosano tornou-se muito apelativo para diversas indústrias, sendo atualmente utilizado como agente antimicrobiano na agricultura, agente floculante para o tratamento de águas residuais, aditivo na indústria alimentar, agente hidratante em produtos cosméticos ou como ingrediente farmacêutico – especialmente na veiculação de fármacos, entre outras aplicações [38-39]. Figura 3.3 – Representação estrutural do quitosano, com uma das unidades acetilada. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 79 O quitosano tem sido também utilizado no revestimento de superfícies, uma vez que é capaz de prevenir a formação de biofilmes, bem como de aumentar a diferenciação dos osteoblastos [40]. Lu Zhao et al. descreveram, recentemente, o revestimento de implantes de titânio com um conjugado quitosano-ácido láurico com a capacidade de inibir a adesão e proliferação de bactérias, para além de aumentar a capacidade de mineralização dos osteoblastos [41]. O revestimento de implantes de titânio com um conjugado quitosano-RGD (péptido Arg-Gly-Asp) foi também estudado, com resultados semelhantes [42]. F. Costa et al. têm estudado a imobilização covalente do péptido hLF(1-11) ao quitosano, com o objetivo de serem produzidos filmes para o posterior revestimento de dispositivos médicos ou implantes cirúrgicos, de forma a prevenir uma infeção [43]. A imobilização covalente de AMP ao quitosano, em alternativa a um conjugado não covalente, poderá aumentar a estabilidade do conjugado a longo prazo, bem como diminuir a sua toxicidade e proporcionar uma orientação adequada do péptido, o que globalmente poderá significar uma ação antibacteriana mais potente e prolongada [8, 44]. Num trabalho recentemente publicado, estes autores testaram a ligação covalente do hLF(1-11) ao quitosano através de uma ponte dissulfureto, estabelecida entre a cisteína presente na sequência peptídica (Ct) e um grupo tiol de um espaçador previamente inserido no quitosano (Esquema 3.1) [22]. Deste estudo concluiu-se que o hLF(1-11), quando ligado ao quitosano – quer diretamente, quer através de um espaçador, perdeu parte da sua atividade, não se observando diminuição na adesão bacteriana. No entanto, o péptido demonstrou uma melhor atividade quando ligado ao quitosano através de um espaçador, mas ainda longe de uma taxa de redução de adesão bacteriana suficientemente elevada para ter interesse prático. Por este motivo, os autores consideram que este estudo terá ainda que ser expandido e aprofundado, sendo necessário considerar a importância do grupo tiol da cisteína para a atividade antimicrobiana do péptido, bem como a orientação do mesmo e a influência do espaçador. É, também, importante reavaliar o métido de imobilização covalente do péptido ao quitosano, uma vez que as pontes dissulfureto são instáveis num ambiente biorredutor, que promove a conversão dissulfureto→tiol [45-46]. A substituição desta ligação por uma outra estrutura mais estável, sem prejudicar a atividade do péptido nem implicar a sua cisteína Ct, poderá melhorar significativamente a estabilidade do conjugado [46]. 80 Esquema 3.1 – Imobilização do péptido hLF(1-11) ao quitosano através de uma ponte dissulfureto, de acordo com o estudo realizado por F. Costa et al. [22]. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 81 2. Objetivo O trabalho experimental desenvolvido teve como principal objetivo a síntese de derivados funcionalizados do péptido hLF(1-11), para posterior imobilização covalente ao quitosano, através de uma reação de cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen (reação “click” entre um grupo alcino e uma função azida, Esquema 3.2) [47]. Esquema 3.2 – Esquema geral de uma reação de cicloadição 1,3-dipolar de Huigsen. Assim, foi planeada a síntese de quatro péptidos modificados com a função alcino: propargil-hLF(1-11), hex-5-inoil-hLF(1-11), Pra-Ahx-hLF(1-11) e hLF(1-11)-AhxPra – figura 3.4 (A) a (D), respetivamente. Os péptidos foram desenhados de forma a se poder estudar futuramente a influência de alguns parâmetros estruturais nas propriedades antibacterianas dos conjugados péptido-quitosano a produzir: (a) Propargil-hLF(1-11) versus hex-5-inoil-hLF(1-11) – efeito do comprimento do espaçador (cadeia carbonada) entre o péptido e a ligação tripla terminal; (b) Pra-Ahx-hLF(1-11) – efeito da presença de um grupo amino primário livre (à semelhança do que acontece no quitosano não modificado) na extremidade do péptido modificado; a ligação tripla apresenta-se na cadeia lateral de um aminoácido não natural, a propargil-glicina (Pra), ligada à sequência peptídica através de um espaçador flexível, inserido por condensação do ácido 6-aminohexanóico (Ahx); (c) hLF(1-11)-Ahx-Pra – efeito da inserção da modificação no extremo C-terminal do péptido, por comparação Pra-Ahx-hLF(1-11), onde a mesma modificação foi inserida no extremo N-terminal da sequência peptídica. 82 Figura 3.4 – Péptidos sintetizados ao longo do trabalho experimental: (A) Propargil-hLF(1-11), (B) Hexinoil-hLF(1-11), (C) Pra-Ahx-hLF(1-11) e (D) hLF(1-11)-Ahx-Pra. Os derivados alcino do péptido hLF(1-11) a produzir no âmbito desta tese serão, posteriormente, usados em testes preliminares de ligação ao quitosano, previamente modificado de forma a conter a função azida, de acordo com a rota sintética apresentada no Esquema 3.3. Esta rota, a ser já testada por uma estudante de doutoramento do grupo, assenta num primeiro passo de conversão dos grupos amino do quitosano em grupos azida, de acordo com procedimentos descritos na literatura [48]; comprovado o sucesso desse primeiro passo, passar-se-à à reação “click” propriamente dita, fazendo-se reagir o polímero modificado com o péptido, na presença de acetato de cobre e ascorbato de sódio [43]. (C) (A) (B) (D) Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 83 Esquema 3.3 – Rota sintética delineada para a imobilização do péptido hex-5-inoil-hLF(1-11) no quitosano: (i) conversão dos grupos amino primários do quitosano em grupos azida, por reação com cloreto de 1-azida-sulfonil-imidazólio, K2CO3 [48]; (ii) reação “click” entre o quitosano modificado e o péptido, na presença de acetato de cobre e ascorbato de sódio [43]. 84 3. Resultados e Discussão 3.1. Síntese dos derivados funcionalizados do péptido hLF(1-11) Começou-se por construir o péptido hLF(1-11) (GRRRRSVQWCA, 1374 g/mol) por SPPS, utilizando um esquema de proteção ortogonal Fmoc/tBu e, como suporte sólido, a resina Fmoc-Rink Amide MBHA, com uma funcionalização de 0,60 mmol/g. A síntese da sequência peptídica foi realizada de forma semelhante à síntese do péptido S413-PV (capítulo 2 – 3.1) e, terminado o enlongamento da cadeia, procedeu-se à divisão da peptidil-resina em três frações que foram, posteriormente, sujeitas a modificações. Numa primeira fração, testou-se o acoplamento do ácido propargílico ao aminoácido Nt da cadeia peptídica ancorada à resina, utilizando HBTU como agente de condensação, na presença de DIEA. Este acoplamento não resultou, razão pela qual se testou novamente a condensação usando EEDQ como agente de acoplamento, realizado de acordo com o procedimento descrito por Tornoe et al. [49]. No entanto, também neste caso não se logrou obter o produto pretendido, mas antes o mesmo produto que havia sido obtido no acoplamento mediado por HBTU/DIEA. Analisou-se esse produto por ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN) e por ESI-IT MS, mas não se conseguiu identificá-lo de forma a tentar compreender o motivo do fracasso da conjugação do ácido propargílico ao péptido hLF(1-11). Face ao acima referido, avançou-se para a modificação das restantes duas frações da peptidil-resina, uma delas por acilação com ácido hexinóico, utilizando-se a EEDQ como agente de acoplamento, conforme descrito em [49]. A terceira fração de peptidil-resina foi sequencialmente acoplada ao ácido 6-amino-hexanóico e à propargilglicina, por acoplamento dos respetivos derivados N-Fmoc-protegidos (FmocAhx e Fmoc-Pra, respetivamente) na presença de HBTU/DIEA, seguida de remoção do grupo Fmoc com uma solução de piperidina a 20% em DMF. Procedeu-se, depois, à clivagem das duas peptidil-resinas modificadas, por acidólise com um cocktail de clivagem constituído por TFA (90%), anisole (2%), etano-1,2-ditiol (3%) e tioanisole (5%). Após a clivagem, os produtos brutos de síntese foram isolados de acordo com o procedimento descrito em 4.5, e analisados por HPLC e por ESI-IT MS, com o objetivo de determinar, respetivamente, o grau de pureza e massa molecular de cada péptido bruto. Para a síntese do péptido C-modificado, hLF(1-11)-Ahx-Pra, partiu-se da mesma resina Fmoc-Rink-MBHA que, após remoção do grupo Fmoc, se acoplou sequencialmente a propargilglicina e ácido 6-amino-hexanóico, igualmente por Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 85 condensação dos respetivos derivados N-Fmoc-protegidos, mediada por HBTU/DIEA, seguida de remoção do grupo Fmoc, nas condições já referidas. Prosseguiu-se depois com a construção da cadeia peptídica, de acordo com o procedimento descrito no capítulo 2 – 3.1, procedendo-se finalmente à clivagem da peptidil-resina nas mesmas condições aplicadas na síntese dos derivados N-modificados do hLF(1-11), sendo o produto isolado como descrito em 4.5, e analisado por HPLC e ESI-IT MS. Em suma, foram sintetizados, em fase sólida, três derivados funcionalizados do péptido hLF(1-11) (Tabela 3.1). Tabela 3.1 – Derivados funcionalizados do péptido hLF(1-11) sintetizados Péptido Peso molecular/g.mol-1 Hexinoil-hLF(1-11) 1468 Pra-Ahx-hLF(1-11) 1581 hLF(1-11)-Ahx-Pra 1581 A título de exemplo, mostram-se o cromatogramas e espetro de massa obtidos para o péptido Pra-Ahx-hLF(1-11) (Figuras 3.5 e 3.6, respetivamente). 92 isoladas e combinadas as frações contendo o péptido puro, a solução final de péptido foi dividida em tubos de falcon (45 mL), que foram posteriormente colocados no congelador, consistindo o último passo na liofilização do péptido purificado. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 93 5. Bibliografia [1] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ (consultado em 4 de Maio de 2014) [2] D. Andreu, L. Rivas, Biopolymers 1998, 47, 6, 415-433 [3] W. Van‟t Hof, E.C. Veerman, E.J. Helmerhorst, A.V. Amerongen, Biol. Chem. 2001, 382, 4, 597-619 [4] R. 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De realçar que a N-acilação do S413-PV com ácidos gordos obrigou a uma alteração no protocolo de clivagem: uma vez que a precipitação em éter não foi tão eficiente, dado o aumento da hidrofobicidade dos péptidos (especialmente no caso dos ácidos gordos mais longos, logo, mais apolares), foi necessário efetuar extrações líquido-líquido com o propósito de se recuperar algum péptido ainda dissolvido no éter etílico. Tal poderá justificar os rendimentos globais de síntese obtidos, eventualmente também afetados por perdas no processo de clivagem e no processo de purificação por RP-MPLC. Para além dos lipopéptidos referidos, logrou-se ainda sintetizar com sucesso dois derivados acilados do péptido S413-PV Scrambled, que serão oportunamente utilizados como controlos em ensaios bioquímicos e biofísicos que visam testar a aplicação de todos os lipopéptidos produzidos na veiculação e entrega intranuclear de ADN plasmídico, em terapia génica. Estes estudos serão levados a cabo pela equipa da Profª Doutora Maria da Conceição Pedroso de Lima, do Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Foram, também, produzidos com sucesso diferentes derivados alcino do hLF(111). Ainda que não tenha sido conseguida a introdução do ácido propargílico no extremo N-terminal da sequência bioativa, logrou-se sintetizar os péptidos HexinoilhLF(1-11) e Pra-Ahx-hLF(1-11) com excelentes graus de pureza. Contudo, estes péptidos foram obtidos com um rendimento baixo, o que pode estar relacionado com o facto de partirem ambos de uma mesma sequência base bastante impura e/ou com o facto de estes péptidos N-modificados apresentarem baixa afinidade para com a fase estacionária, durante a purificação por RP-MPLC, tornando bastante difícil a sua recuperação. O mesmo problema não surgiu na síntese do péptido C-modificado, hLF(1-11)-Ahx-Pra, cujo rendimento global foi excelente, o que de certa forma suporta a hipótese de ser a modificação em N-terminal que justifica propriedades cromatográficas conducentes a um baixo rendimento global de síntese. A provar-se a aplicabilidade destes péptidos na criação de novos biomateriais antimicrobianos, será porventura útil testar-se diferentes fases estacionárias que permitam melhorar substancialmente o rendimento do processo de purificação por RP-MPLC. 100 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 101 Anexos 108 E. Péptido C16-S413-PV Figura E1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido C16-S413-PV purificado, com uma eluição em gradiente de 0-100% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. Figura E2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido C16-S413-PV bruto. Minutes 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 mAU -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 mAU -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 9.073 0.537 11.480 0.688 15.447 0.195 15.993 0.588 16.453 0.702 17.167 97.290 DAD-CH1 220 nm Hexadecanoil-S413-PV Tubos 375 - 475 Retention Time Area Percent PG-C16-S413-PV #590-638 RT: 14,67-15,83 AV: 49 NL: 1,28E8 T: + p ESI Full ms [ 250,00-2000,00] 500 1000 1500 2000 m/z 0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000 70000000 80000000 90000000 100000000 110000000 120000000 Intensity 544,53 680,33 1359,33 906,67 454,20 691,33 949,27 1423,27 985,67 726,60 1811,07 1451,87 1184,53395,00 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 109 F. Péptido C18-S413-PV Figura F1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido C18-S413-PV purificado, com uma eluição em gradiente de 0-100% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. Figura F2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido C18-S413-PV bruto. Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 17.040 1.306 17.667 98.694 DAD-CH1 220 nm Octadecanoil-S413-PV Final Retention Time Area Percent PG-C18-S413-PV #606-672 RT: 15,11-16,71 AV: 67 NL: 1,22E8 T: + p ESI Full ms [ 250,00-2000,00] 500 1000 1500 2000 m/z 0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000 70000000 80000000 90000000 100000000 110000000 120000000 Intensity 550,20 687,33 1373,33 915,93 458,87 930,53 719,33 1401,33 756,47 1056,60 399,20 1511,87 1830,93 110 G. Péptido C12-S413-PV Scr Figura G1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido C12-S413-PV Scr purificado, com uma eluição em gradiente de 0-100% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. Figura G2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido C12-S413-PV Scr bruto. Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 mAU -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 mAU -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 12.987 0.25413.267 0.346 13.547 0.393 13.800 98.794 14.020 0.214 DAD-CH1 220 nm C12-S413-PV Scrambled Final Retention Time Area Percent NVC12-S413-PV-Scr #515-532 RT: 12,86-13,27 AV: 18 NL: 2,35E8 T: + p ESI Full ms [ 250,00-2000,00] 500 1000 1500 2000 m/z 0 20000000 40000000 60000000 80000000 100000000 120000000 140000000 160000000 180000000 200000000 220000000 Intensity 666,33 533,33 887,93 1331,20 444,73 356,53 1066,67 1386,60 854,93 1773,67 1437,93 1891,47 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 111 H. Péptido Hexinoil-hLF(1-11) Figura H1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido Hexinoil-hLF(1-11) purificado, com uma eluição em gradiente de 10-30% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. Figura H2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido Hexinoil-hLF(1-11) bruto. Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 mAU -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 mAU -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 14.187 0.79814.473 0.230 14.960 0.369 15.387 0.769 16.073 94.409 17.213 1.760 17.547 0.147 17.993 1.517 DAD-CH1 220 nm Hexinoil-hLF(1-11) Retention Time Area Percent NVHexonoil2 #482-500 RT: 12,49-12,93 AV: 19 NL: 3,13E7 T: + p ESI Full ms [ 250,00-2000,00] 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 18000000 20000000 22000000 24000000 26000000 28000000 30000000 Intensity 848,00 734,53 791,07 1168,53 528,07 490,07 1467,53 982,93 1809,33 1580,80 1328,40 542,33 1130,60 460,67 1864,07278,93 112 I. Péptido hLF(1-11)-Ahx-Pra Figura I1 - Cromatograma obtido pela análise do péptido hLF(1-11)-Ahx-Pra purificado, com uma eluição em gradiente de 10-30% ACN em água (0,05% TFA) numa coluna RP-18E (5 μm), ao longo de 30 minutos e a um fluxo de 1 ml/min, com deteção ao =220 nm. Figura I2 - Espetro de massa (ESI-IT MS, modo positivo) do péptido hLF(1-11)-Ahx-Pra bruto. Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 15.167 0.549 16.387 4.236 17.153 0.851 17.700 92.607 18.493 0.591 18.953 1.167 DAD-CH1 220 nm hLF(1-11)-Ahx-PGly 10-30 ACN 21Nov Retention Time Area Percent PG-Hlf-Ahx-Pgly14 #382-410 RT: 9,79-10,46 AV: 29 NL: 8,86E7 T: + p ESI Full ms [ 250,00-2000,00] 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 35000000 40000000 45000000 50000000 55000000 60000000 65000000 70000000 75000000 80000000 85000000 Intensity 791,47 848,07 528,07 565,80 905,00 396,33 983,93 490,87 1582,60 1206,60740,00 1107,60 580,47 370,67 1694,93 1305,93 1396,33 1809,33 1898,67