Citoxicidade e captação de nanopartículas de ouro em modelo celular de epitélio intestinal humano: importância de funcionalização

David António Silva Fernandes Citotoxicidade e Captação de Nanopartículas de Ouro em Modelo Celular de Epitélio Intestinal Humano: Importância da Funcionalização Dissertação de Mestrado Mestrado em Toxicologia Analítica, Clínica e Forense Trabalho realizado sob a orientação da Doutora Sónia Fraga e co-orientação da Professora Doutora Helena Carmo Departamento de Toxicologia Faculdade da Farmácia da Universidade do Porto Setembro de 2010 ii DECLARAÇÃO DE REPRODUÇÃO É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO CANDIDATO, QUE A TAL SE COMPROMETE; O Autor, _________________________________________________ (David António Silva Fernandes) iii AGRADECIMENTOS Esta página torna-se demasiado curta para poder agradecer, de modo apropriado, a todos aqueles que me ajudaram ao longo deste trabalho. Os meus sinceros agradecimentos: À Doutora Maria de Lourdes Bastos, por me ter aceite no curso de Mestrado em Toxicologia Analítica, Clínica e Forense e por nos incutir a nós, alunos, uma paixão tão grande por esta ciência. Obrigado pelas palavras de encorajamento e sabedoria, À Doutora Sónia Fraga, pela paciência, resistência e bondade em me ensinar e guiar através deste caminho com obstáculos tão imprevisíveis. Admiro-a pela sua dedicação, empenho e optimismo e sem a sua presença este trabalho teria sido, de todo, impossível. Muito, muito obrigado! À Professora Helena Carmo, pelas palavras de conforto e de motivação que tornaram tudo mais suave e ajudaram a ultrapassar dias mais difíceis, À Senhora Engenheira Maria Elisa Soares, pela sua preciosa ajuda, amizade e carinho e pela sua tenacidade na sua colaboração, Aos meus colegas e restantes membros do Departamento de Toxicologia, pelo companheirismo, pelos ensinamentos e pela motivação transmitidos. Ao Professor José Alberto Duarte pelas imagens de Microscopia Electrónica, e à Leonor pela síntese de nanopartículas, que sem o seu contributo fundamental este trabalho se tornaria muito mais difícil, E à minha mãe, pelo apoio incondicional e por não me deixar desistir, sobretudo quando tudo parecia perdido e a vida deixou de ter significado. Nunca como nestes tempos tinha pensado no verdadeiro significado da palavra «mãe», e a noção de sacrifício pessoal fezme amá-la mais do que eu seria capaz de conceber. Obrigado! iv v RESUMO No presente trabalho pretendeu-se avaliar a potencial citotoxicidade induzida por nanopartículas de ouro (AuNPs) funcionalizadas com diferentes revestimentos em células Caco-2, um modelo de epitélio intestinal humano. As nanopartículas testadas apresentavam um diâmetro entre 23 e 35 nm e como agentes de revestimento foram usados o citrato, 11-MUA e os pentapéptidos CALNS e CALND. Os ensaios escolhidos para avaliação da viabilidade celular foram o de redução do MTT e incorporação de Vermelho Neutro. Para os intervalos de tempo (24 a 96 h) e de concentração (1 a 100 µM) testados, não foram observados fenómenos de citotoxicidade. No mesmo modelo celular, foi também avaliada a capacidade de translocação e internalização das diferentes AuNPs funcionalizadas. O estudo realizado foi bidireccional, sendo a quantificação de ouro presente nas fracções apical, basal e celular efectuada por Espectrometria de Absorção Atómica. Uma análise qualitativa do grau de internalização das nanopartículas nas células foi realizada por Microscopia Electrónica de Transmissão. As AuNPs revelaram uma baixa capacidade em atravessar a monocamada de células Caco-2, sendo a extensão da internalização dependente do revestimento Palavras-chave: nanopartículas de ouro, Caco-2, revestimento, citotoxicidade, internalização, translocação vi ABSTRACT The present work aimed to evaluate the potential cytotoxic effects induced by gold nanoparticles (AuNPs) with different coatings in Caco-2 cells, a model of human intestinal epithelial cells. Sphere AuNPs nanoparticles (23 to 35 nm) were functionalized with citrate, 11-MUA and the pentapeptides CALNS and CALND. Cell viability was assessed by the MTT reduction and Neutral Red uptake assays for concentrations ranging from 1 to 100 µM for 24 to 96 hours. Under the present experimental conditions, no cytotoxic effects were observed with any of the AuNPs tested. Uptake and translocation of functionalized AuNPs across polarized and differentiated Caco-2 cells monolayers was also investigated. Bidirectional experiments were conducted and gold content of the apical, basal and cellular fractions was quantified by Atomic Absorption Spectrometry. A qualitative analysis of cellular internalization of AuNPs by Transmission Electron Microscopy was also performed. The AuNPs revealed a low ability to translocate across Caco-2 monolayers with the uptake efficiency being dependent of surface coating. Key words: gold nanoparticles, Caco-2, coating, cytotoxicity, uptake, translocation vii Índice Introdução ....................................................................................................................... 2 1. Nanotecnologia e nanomateriais ................................................................................ 3 1.1. Tipos de nanopartículas ...................................................................................... 5 1.2. Vantagens e limitações na utilização de nanopartículas em medicina ................. 7 2.Nanopartículas de ouro ............................................................................................... 8 2.1. Perspectiva histórica ........................................................................................... 8 2.2. Propriedades físicas das AuNPs ......................................................................... 9 2.3. Síntese .............................................................................................................. 10 2.3.1. Redução por citrato .................................................................................. 10 2.3.2. Método de Brust-Schiffrin ......................................................................... 10 2.4. Funcionalização ................................................................................................ 11 2.4.1. Adição de biomoléculas: revestimento por péptidos ................................. 12 2.5. Métodos de caracterização .............................................................................. 14 2.5.1. Microscopia Electrónica de Transmissão (T.E.M.) .................................... 14 2.5.2. Espectrofotometria de UV/Vis ................................................................... 15 2.5.3. Medidas de dispersão de luz .................................................................... 15 2.5.3.1. Difracção dinâmica de luz (DLS) .............................................. 15 2.5.3.2. Potencial zeta .......................................................................... 16 3. Aplicação de AuNPs em medicina ........................................................................... 16 3.1. Terapia .............................................................................................................. 16 3.1.1. AuNPs como sistema de libertação controlada ......................................... 17 3.1.2. Terapia fototérmica .................................................................................. 19 3.1.3. Terapia por radiofrequência ...................................................................... 20 3.1.4. Terapia contra a angiogénese .................................................................. 20 3.1.5. AuNPs na terapêutica da artrite reumatóide ............................................. 20 3.1.6. Terapia antibacteriana .............................................................................. 20 3.2. Métodos de diagnóstico ..................................................................................... 21 4.Citotoxicidade de AuNPs .......................................................................................... 22 4.1. Estudos de citotoxicidade .................................................................................. 24 4.2. Considerações sobre o tamanho, a forma e o revestimento na citotoxicidade de AuNPs ...................................................................................................................... 28 viii 5. As células Caco-2 como modelo para o estudo do epitélio intestinal humano ......... 30 5.1. Características gerais das células Caco-2 ......................................................... 30 5.2. Estudos de transporte ....................................................................................... 31 5.3. Ensaios de citotoxicidade e captação de nanopartículas em células Caco-2 .... 32 Objectivos ...................................................................................................................... 35 Materiais e Métodos ...................................................................................................... 37 1.Síntese e caracterização das nanopartículas ............................................................ 39 1.1. Síntese e caracterização de nanopartículas de ouro (AuNPs) revestidas por citrato ....................................................................................................................... 39 1.2. Funcionalização ................................................................................................ 39 1.3. Preparação de veículo ...................................................................................... 40 1.4. Caracterização e análise das nanopartículas .................................................... 41 2.Cultura celular – manutenção e propagação ............................................................. 41 3.Ensaios de citotoxicidade.......................................................................................... 42 3.1. Ensaio de MTT .................................................................................................. 42 3.1. Ensaio de NR .................................................................................................... 42 4.Estudos de captação e translocação de AuNPs ........................................................ 43 4.1. Verificação da integridade e permeabilidade celular.......................................... 43 4.1.1. Medição da resistência eléctrica transepitelial (TEER) ........................... 43 4.1.2. Transporte de manitol ............................................................................. 44 4.2. Estudo de captação........................................................................................... 45 5.Tratamento estatístico dos dados ............................................................................. 46 Resultados e Discussão ............................................................................................... 47 1. Síntese e caracterização de AuNPs ........................................................................ 49 2. Avaliação do potencial citotóxico das AuNPs em células Caco-2 ............................. 52 3. Estudos de captação e translocação ........................................................................ 65 Conclusão ...................................................................................................................... 71 Bibliografia .................................................................................................................... 75 ix Índice de figuras Figura 1: Integração da escala nanométrica ..................................................................... 3 Figura 2: Estrutura dos pentapeptídeos CALND e CALNS ............................................. 13 Figura 3: Aplicações das AuNPs na terapêutica ............................................................. 17 Figura 4: Possíveis mecanismos mediados por espécies reactivas de oxigénio associados com a toxicidade de nanopartículas .............................................................. 24 Figura 5: Representação esquemática do epitélio intestinal ........................................ ..31 Figura 6: Representação esquemática de um sistema de cultura polarizada .................. 32 Figura 7: Processo de medição de TEER ....................................................................... 44 Figura 8: Solução coloidal de AuNPs e respectivo espectro de absorção ....................... 49 Figura 9: Imagens de T.E.M. de uma amostra de solução coloidal de AuNPs-Cit .......... 50 Figura 10: Resultados dos ensaios de viabilidade (MTT e NR) para AuNPs-Cit, às 24 e 48 horas .......................................................................................................................... 52 Figura 11: Resultados dos ensaios de viabilidade (MTT e NR) para AuNPs-Cit, às 72 e 96 horas .......................................................................................................................... 53 Figura 12: Efeito de AuNPs-Cit (10 µM e 100 µM) e respectivo controlo, em células Caco2 após 24 e 96 horas ....................................................................................................... 54 Figura 13: Resultados dos ensaios de viabilidade (MTT e NR) para AuNPs-MUA, às 24 e 48 horas .......................................................................................................................... 55 Figura 14: Resultados dos ensaios de viabilidade (MTT e NR) para AuNPs-MUA, às 72 e 96 horas .......................................................................................................................... 56 Figura 15: Efeito de AuNPs-MUA, (10 µM e 100 µM) e respectivo controlo, em células Caco-2 após 24 e 96 horas ............................................................................................. 57 Figura 16: Resultados dos ensaios de viabilidade (MTT e NR) para AuNPs-CALNS, às 24 e 48 horas ....................................................................................................................... 58 Figura 17: Resultados dos ensaios de viabilidade (MTT e NR) para AuNPs-CALNS, às 72 e 96 horas ....................................................................................................................... 59 2 3 INTRODUÇÃO 1. Nanotecnologia e nanomateriais A nanotecnologia consiste na compreensão e controlo dos nanomateriais, matéria com dimensões entre aproximadamente 1 e 100 nanómetros (1 × 10-9 metros). A capacidade de visualizar, medir, fabricar e manipular matéria a nível da escala nanométrica permite o desenvolvimento de novas tecnologias com um impacto que irá afectar virtualmente cada sector económico (1). A nanotecnologia distingue-se de outras tecnologias devido às características físicas, químicas e biológicas únicas que ocorrem nos materiais à escala nanométrica e que possibilita novas aplicações (1,2). Essas propriedades podem ser então observadas e manipuladas à escala microscópica ou macroscópica para o desenvolvimento de materiais e dispositivos com funções e desempenhos inovadores. A nanoescala refere-se a um intervalo entre 1 e 100 nm, ainda que este intervalo de valores não seja absoluto (Figura 1). Figura 1. Integração da escala nanométrica. Comparação entre pequenos objectos como (a) um insecto, (b) cabelo humano, (c) grão de pólen, (d) glóbulos vermelhos, (e) agregados de paládio, (f) nanocristais de cobalto, (g) molécula de aspirina. Retirado de (3). 4 A importância das nanotecnologias reflecte-se na obtenção de inovações que possam contribuir para a resolução de muitos problemas que a sociedade enfrenta actualmente, nomeadamente na área de (i) biomedicina, (ii) tecnologias da informação (iii) produção e armazenamento de energia (utilização de dióxido de cerúlio (CeO2) como catalisador de combustíveis), (iv) ciências dos materiais (utilização de nanopartículas de prata em roupa e desinfectantes, utilização de dióxido de titânio (TiO2) em protectores solares), (v) alimentos, água e ambiente, entre outras. A comercialização de vários produtos derivados de nanotecnologias é já uma realidade, incluindo produtos médicos, componentes electrónicos, tintas e tecidos sendo um comércio em expansão cujo investimento é gradualmente crescente (1). A transição de micropartículas para nanopartículas (NPs) pode levar a um elevado número de mudanças em propriedades físicas (4). As mudanças imediatamente perceptíveis são o aumento da razão área/volume e a predominância de efeitos quânticos. O aumento da área de superfície em relação ao volume é um processo gradual que ocorre com a diminuição do tamanho da partícula, com o comportamento dos átomos presentes na superfície das partículas a tornar-se dominante relativamente aos dos átomos presentes no interior. Este comportamento reflecte-se na interacção com outros materiais, permitindo o seu aproveitamento em processos catalíticos, na utilização de estruturas como eléctrodos, no aumento da resistência física, química e térmica de materiais. As propriedades quânticas reflectem-se no comportamento dos electrões livres que passam a comportar-se de um modo semelhante aos electrões ligados a átomos na medida em que apenas podem ocupar determinados estados de energia. Nanofármacos estão já disponíveis para uso clínico (como o fármaco imunossupressor Rapamune®, o antiemético Emend® ou o antidislipidémico Tricor®, já disponíveis nos Estados Unidos), e numerosos outros encontram-se em ensaios clínicos (5,6). Embora a nanotecnologia explore partículas entre 1 e 100 nm de diâmetro, o tamanho de partículas usadas em medicina pode variar entre 2 a 1000 nm (7). As nanopartículas encontram-se no mesmo intervalo de dimensões que os anticorpos, receptores membranares, ácidos nucleicos e proteínas, entre outras biomoléculas. 5 1.1 Tipos de nanopartículas As nanopartículas podem ser agrupadas pela sua natureza orgânica ou inorgânica. As nanopartículas de natureza orgânica incluem lipossomas, dendrímeros, nanomateriais de carbono e micelas poliméricas. Lipossomas – os lipossomas são vesículas fosfolipídicas, com um tamanho entre 50 e 100 nm, com uma bicamada lipídica que se assemelha à das membranas biológicas e com uma fase interna aquosa (6). Os lipossomas podem classificar-se de acordo com o seu tamanho e número de camadas (multi, oligo ou multi-lamelares). A natureza anfifílica dos lipossomas torna possível o transporte de fármacos hidrofílicos (no seu interior, na fase aquosa) e fármacos hidrofóbicos (dissolvidos na membrana), sendo que a natureza da ligação de fármacos à membrana pode ser modificada com a adição de ligandos. Os lipossomas apresentam excelente capacidade de circulação, penetração e difusão. A sua aplicação como veículos data desde os anos 60 (8). Micelas poliméricas – as micelas poliméricas consistem num conjunto de polímeros anfifílicos em torno de um núcleo hidrofóbico, que formam estruturas supra-moleculares em meio aquoso (6). O seu tamanho é usualmente inferior a 100 nm. Os polímeros anfifílicos podem ser constituídos por fosfolípidos, cadeias hidrofílicas de óxido de polietileno intercaladas com cadeias hidrofóbicas de óxido de polipropileno, cadeias de aminoácidos ou poliéster. Fármacos podem localizar-se no interior do núcleo ou ligados covalentemente a superfície das micelas. Dendrímeros – os dendrímeros são polímeros altamente ramificados, de tamanho inferior a 15 nm, constituídos por um núcleo central, uma região interna e numerosos grupos terminais como poliamidas ou poliaminas (6). A natureza dos grupos terminais pode ser alterada de modo a facilitar a ligação de determinado fármaco, podendo ser funcionalizados com hidratos de carbono, péptidos ou silicone. Nanomateriais de carbono – os nanomateriais de carbono incluem a família dos fulerenos (C60) e outras nanopartículas constituídas por lâminas co-axiais de grafite, enroladas em cilindros e de tamanho inferior a 100 nm (6). Estas estruturas podem designar-se por nanotubos de parede simples ou nanotubos de paredes múltiplas, conforme possuam apenas uma lâmina ou várias lâminas enroladas concentricamente. Apresentam uma elevada resistência, condutibilidade eléctrica e térmica. 6 As nanopartículas de natureza inorgânica incluem pontos quânticos (Quantum dots), nanopartículas magnéticas e nanopartículas metálicas. Normalmente apresentam um núcleo central inorgânico que determina as suas propriedades ópticas, electrónicas, magnéticas e fluorescentes. Pontos quânticos – são nanocristais coloidais com fluorescentes e fotoestáveis, com um tamanho entre 2 e 10 nm (6). O seu núcleo central consiste na combinação de elemntos dos grupos II-VI da tabela periódica (CdSe, CdTe, CdS, PbSe, ZnS e ZnSe) ou dos grupos III – IV (GaAs, GaN, InP e InAs), que são revestidos com uma camada de ZnS. Além de fotoestáveis, apresentam uma elevada resistência à degradação química. Nanopartículas magnéticas – as nanopartículas magnéticas são nanocristais esféricos, com um tamanho entre 10 e 20 nm, com um núcleo de Fe2+ e Fe3+ revestido por dextrano ou polietileno glicol (PEG) (6). Nanopartículas metálicas – as nanopartículas metálicas podem ter tamanhos entre 1 e 100 nm, sendo constituídas por metais como o ouro (Au), a prata (Ag), o níquel (Ni), a platina (Pt) e o dióxido de titânio (TiO2) (6). O financiamento da nanotecnologia é crescente (9). O interesse da aplicação da nanotecnologia na área da medicina levou à criação de um novo campo da ciência apelidado de nanomedicina. A nanomedicina consiste no processo de diagnóstico, tratamento, e prevenção de doenças ou lesões traumáticas, aliviando a dor e preservando ou incrementando a saúde humana recorrendo a ferramentas moleculares e ao conhecimento molecular do corpo humano (9). A nanomedicina tem como principais objectivos (i) a construção de estruturas à escala nanométrica para diagnóstico, monitorização e libertação de fármacos, (ii) a intervenção na genómica e proteómica (iii) a criação de máquinas moleculares capazes de identificar e eliminar agentes patogénicos, reparar ou substituir células ou componentes celulares in vivo (3,9). 7 1.2 Vantagens e limitações na utilização de nanopartículas em medicina A capacidade das nanopartículas em interagir com outras moléculas, assim como a possibilidade de moldar as suas propriedades, torna-as instrumentos de elevado interesse na monitorização, diagnóstico e terapêutica de doenças. A sua aplicação como veículos de fármacos é promissora, uma vez que as nanopartículas podem modificar vários aspectos relacionados com o perfil farmacocinético. Podem aumentar a solubilidade de um fármaco, permitindo a sua administração por via parentérica (6,8), aumentar o seu tempo de semi-vida, aumentar a especificidade em relação ao alvo, reduzindo assim os efeitos secundários (uma vez que diminui a sua acumulação em tecidos saudáveis) (6,8). Podem também melhorar a biodisponibilidade, diminuir o seu metabolismo e permitir uma libertação controlada de fármacos. Um dos principais problemas que se coloca na descoberta de novos fármacos é precisamente a sua fraca biodisponibilidade e biodistribuição (8). A aplicação de nanopartículas como veículos permite reduzir a dose de fármacos a administrar, aumentado a eficácia terapêutica e os perfis de segurança de novos fármacos (8). A utilização de materiais biocompatíveis torna as nanopartículas alternativas seguras, evitando reacções de hipersensibilidade (8). Contudo, existem algumas limitações ao uso de nanopartículas. Actualmente é difícil prever a biodistribuição de nanopartículas no organismo de acordo com as suas propriedades físico-químicas (8). A própria biodistribuição pode ser afectada por interacções indesejadas com moléculas, como proteínas, ou mesmo células pertencentes ao sistema de defesa do organismo, como monócitos ou macrófagos (8). A penetração no interior das células não é um processo fácil, requerendo estratégias de alteração da superfície das nanopartículas (10). O próprio destino das nanopartículas no interior das células é ainda pouco conhecido, podendo estas permanecer inalteradas, modificarem-se ou sofrerem metabolização Apesar dos benefícios que as nanopartículas parecem trazer à medicina, algumas aplicações permanecem desafiantes, como por exemplo a monitorização in vivo de eventos celulares, a especificidade do local de acção ou a entrega de fármacos no interior da célula. Na tentativa de ultrapassar estas limitações, presentemente estão a desenvolver-se nanopartículas multifuncionais, isto é, nanopartículas com uma única estrutura definida mas com diferentes funcionalidades. Como exemplo, uma única nanopartícula seria capaz de se ligar especificamente a uma célula-alvo, emitir um sinal de localização que permitiria monitorizar o transporte de um fármaco ligado à nanopartícula e ainda, através de um estímulo externo, provocar a libertação controlada do fármaco. Contudo, a maior limitação na produção de nanopartículas multifuncionais é 8 a combinação dos diferentes grupos químicos requeridos à superfície da nanopartícula, sendo um processo considerado complexo. Além disso, a actividade dos diferentes grupos químicos tem que funcionar de um modo coordenado de modo a providenciar as diferentes funcionalidades. Um exemplo destas nanopartículas foi desenvolvido por Yang (10), e que consiste num nanossitema multifuncional combinando nanocristais magnéticos (para a monitorização), anticorpos terapêuticos (para a especificidade do alvo) e o fármaco doxorrubicina (para o efeito terapêutico). 2. Nanopartículas de ouro O ouro tem sido dos mais antigos objectos de investigação na ciência, e a sua aplicação em nanotecnologia tem feito renascer o seu interesse. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são as nanopartículas metálicas mais estáveis, apresentam aspectos fascinantes como o comportamento individual das suas partículas, propriedades ópticas e magnéticas, e a sua aplicação na catálise e biologia (11 - 13). O ouro (elemento químico de símbolo Au com o número atómico 79) apresenta-se como um metal amarelo, brilhante e com um ponto de fusão de 1336 K (11). Por seu lado, as AuNPs apresentam uma coloração vermelha intensa e a temperatura de fusão é proporcionalmente decrescente com a diminuição do seu tamanho (12). As AuNPs podem apresentar forma esférica (11), cilíndrica (11, 14), hexagonal (11) e triangular (15), ou ainda associarem-se a outras nanopartículas (como dendrímeros) ou metais (Ag, Pd, Pt, TiO2, Fe, Zn e Cu, entre outros), formando as denominadas nanoshells. As nanoshells consistem num núcleo de átomos com elementos anteriormente referidos, revestido com átomos de ouro (16). As AuNPs podem ainda apresentar porosidades na sua estrutura, denominando-se nanocages (17). 2.1 Perspectiva histórica O chamado «ouro coloidal» terá aparecido cerca do século V ou IV antes de Cristo, no Egipto e na China, muito depois da forma metálica (cerca de 5000 anos antes de Cristo). As suas primeiras aplicações foram com propósitos estéticos e curativos (11,12). O ouro coloidal foi inicialmente utilizado na fabricação e decoração de cerâmica, sendo o mais famoso exemplo a Taça de Lycurgus, tendo sido fabricada no século V ou IV antes de Cristo. Na Idade Média eram atribuídos ao ouro coloidal poderes curativos para várias doenças, nomeadamente doenças do coração, disenteria, epilepsia e tumores. No século 9 XVII, autores como Francisco Antonii e Johann Kunckels, publicam, respectivamente em 1618 e 1676, livros contendo métodos de síntese de ouro coloidal e suas aplicações em medicina. Ao longo do século XVIII, vários tratados sobre a síntese de ouro coloidal são publicados (11), nomeadamente quanto ao seu processo de síntese e suas aplicações. Em 1857, Faraday descreve a síntese de ouro coloidal a partir de uma solução de cloroaurato (AuCl4-) utilizando um sistema de duas fases contendo fósforo em dissulfeto de carbono. Faraday observou as propriedades ópticas de soluções coloidais desidratadas e observou mudanças de cor após compressão mecânica. No século XX, vários métodos para a preparação de ouro coloidal foram efectuados e revistos. Desde os anos 90 que o ouro coloidal tem sido objecto de investigação intensiva, nomeadamente após novos métodos de síntese terem sido reportados por Schiffrin e Brust (18). Actualmente, a investigação centra-se nos seus efeitos quânticos. 2.2 Propriedades físicas das AuNPs A cor vermelha das AuNPs em meio aquoso deve-se a um pico de absorção na região do visível (520 nm), denominado banda plasmónica (Surface Plasmon Band - SPB). A banda plasmónica deve-se sobretudo à oscilação colectiva da nuvem de electrões presente na superfície das nanopartículas, originada a partir da interacção com a radiação electromagnética incidente (11, 19). A sua largura diminui de tamanho com a diminuição do tamanho das nanopartículas, encontrando-se ausente para AuNPs com um diâmetro inferior a 2 nm e para a forma metálica do ouro (11). Para nanopartículas com diâmetros de 9, 15, 22, 48 e 99 nm, o comprimento de onda máximo para a banda plasmónica é, respectivamente, de 517, 520, 521, 533 e 575 nm, em meio aquoso (11). O pico e a largura da banda são também influenciados pela forma da partícula, pelo seu revestimento, pela constante dieléctrica do meio e pela temperatura (11). Assim sendo, por exemplo, um desvio no pico de absorção da banda plasmónica aquando da caracterização de nanopartículas após a sua síntese pode ser indicativo da presença de impurezas. Estudos de fluorescência têm sido conduzidos com AuNPs, nomeadamente os que utilizam revestimentos fluorescentes como grupos pirenilo, polioctiltiofenilo e fluorenilo (11). A capacidade de fluorescência depende do tamanho e da forma das AuNPs, da distância entre o núcleo e o corante e a sobreposição entre a emissão de radiação electromagnética do corante e o espectro de absorção da nanopartícula. 10 2.3 Síntese Nos últimos 40 anos, têm sido dedicados muitos esforços no sentido de fabricar AuNPs com dispersibilidade e tamanho controlados (20). Regra geral, AuNPs com determinado diâmetro são preparadas através da redução de sais de ouro na presença de agentes estabilizantes apropriados que previnem a agregação das partículas. A síntese de AuNPs pode ser conseguida por diversos métodos: métodos químicos (redução por citrato, método de Brust-Schiffrin, utilização de surfactantes) e por métodos físicos (fotoquímica por raios UV e Infra-vermelhos, radiólise e termólise). Nesta secção irá dar-se importância aos métodos químicos de síntese mais comummente utilizados na prática laboratorial. 2.3.1 Redução por citrato Entre os diversos métodos convencionais de síntese de AuNPs por redução de derivados de ouro (III), o mais popular por tem sido o que utiliza a redução por citrato de HAuCl4 em água, introduzido por Turkevish em 1951 (21). Este método leva à formação de nanopartículas de cerca de 20 nm em diâmetro. O método tem sido aperfeiçoado sucessivamente com o objectivo de obter nanopartículas com um diâmetro predefinido. Em 1973, Frens reportou um método capaz de controlar o tamanho das nanopartículas alterando a razão entre o agente redutor e o agente estabilizante (22). Este método caracteriza-se por ser fácil, rápido, reprodutível, do qual se obtêm NPs esféricas, com baixa dispersão, bastantes estáveis com diâmetros compreendidos entre os 10-20 nm, e que facilmente funcionalizáveis com diversos ligandos orgânicos. 2.3.2 Método de Brust-Schiffrin O método de Brust-Schiffrin foi considerado inovador devido ao facto de permitir, pela primeira vez, a síntese de AuNPs estáveis a temperaturas elevadas, com dispersão diminuída e diâmetro entre 1,5 e 2 nm (18). Estas AuNPs podem ser repetidamente isoladas e redissolvidas na maioria dos solventes orgânicos sem agregação ou decomposição irreversíveis, podendo ser facilmente funcionalizadas. AuCl4é transferido para uma molécula de tolueno utilizando brometo de tetraoctilamónio e reduzido por NaBH4 na presença de dodecanotiol. 11 Este método permite a síntese de AuNPs estabilizadas com uma grande variedade de tióis: a ligação entre o grupo SH dos tióis e o Au da superfície das nanopartículas é uma ligação bastante estável. Contudo, e tal como no método de redução por citrato, diversas outras moléculas podem ser introduzidas na superfície das nanopartículas (tais como ligandos contendo fosfatos, aminas ou carboxilatos). 2.4. Funcionalização A funcionalização de AuNPs consiste na adição de grupos funcionais (ligandos) à superfície das nanopartículas, sendo efectuada com objectivos específicos: aumentar a estabilidade coloidal das partículas, prevenir fenómenos de agregação ou determinar maior afinidade para determinado alvo (23). Dependendo do sistema da partícula, isto é, o material do núcleo e o solvente em que as partículas estão dispersas, a escolha do ligando certo pode levar à formação de partículas estáveis (24). Os ligandos à superfície podem ser trocados por outros de forma a melhorar a estabilidade das nanopartículas, podendo dotá-las de novas propriedades ou funções (24). Na maioria dos casos, o novo ligando liga-se mais fortemente à superfície da nanopartícula. A geometria molecular dos ligandos em relação ao diâmetro das partículas é um factor que influencia o modo como as moléculas se distribuem em redor das partículas, afectando por sua vez a estabilidade coloidal das partículas. Um dos exemplos mais significativos é precisamente o caso das AuNPs em meio aquoso, sintetizadas por redução de citrato (24). As nanopartículas resultantes contêm iões citrato carregados negativamente adsorvidos à sua superfície e mantêm-se estabilizadas por repulsões electrostáticas. A camada de citrato pode ser substituída por ligandos que se liguem com maior afinidade, sendo os exemplos mais populares moléculas como fosfinas sulfonadas ou ácidos mercaptocarboxílicos, como o ácido 11-mercaptoundecanóico (11MUA). Em soluções orgânicas, as AuNPs são normalmente sintetizadas pelo método de BrustSchiffrin. A síntese pode ocorrer na ausência de dodecanotiol. Desta forma, a síntese e o revestimento tornam-se acontecimentos independentes e a funcionalização pode ocorrer por outras moléculas além do dodecanotiol. Os grupos tióis são considerados aqueles que têm maior afinidade para o ouro. Apesar desta ligação ser classificada de covalente, o modo como se processa ainda a ligação destes grupos às nanopartículas é tema de debate (24). 18 A utilização de glutationa como mediador da libertação de pequenas moléculas, nomeadamente de modelos de fármacos hidrofóbicos, foi já reportada (20). As AuNPs são capazes de transportar biomoléculas como péptidos, proteínas e ácidos nucleicos como o DNA e RNA. A utilização de AuNPs seria inovadora para a terapia génica. A terapia génica é considerada uma estratégia ideal no que diz respeito ao tratamento de doenças genéticas hereditárias e adquiridas. As nanopartículas podem contornar problemas inerentes ao uso de outros agentes de transfecção que acarretam riscos de citotoxicidade e de resposta imunológica, ou outros sistemas não virais de eficácia reduzida (20). Os conjugados AuNPs-ácidos nucleicos podem apresentar ligações covalentes ou nãocovalentes. O estudo de conjugados AuNPs-ácidos nucleicos, estabilizados por ligações não-covalentes, mostraram que AuNPs funcionalizados com grupos de amónia quaternária conseguem ligar-se ao DNA através de ligações electrostáticas, proteger o DNA de digestão enzimática e ser capaz de se libertarem facilmente na presença de glutationa (34). Por exemplo, foi avaliada com sucesso a transfecção do gene que codifica para a β-galactosidase em células de mamíferos 293T. A utilização de conjugados AuNPs-ácidos nucleicos estabilizados por ligações covalentes foi descrita no silenciamento genético (20). As AuNPs podem também servir como transportadores de péptidos ou proteínas de interesse. Estudos mostraram que nanopartículas revestidas de amónio (carga positiva) conseguem ligar-se a proteínas aniónicas (como a β-galactosidase) e inibir a sua actividade (15). A actividade é recuperada por adição de glutationa, que se liga à superfície da AuNP, quebrando a ligação electrostática entre a nanopartícula e a proteína. A proteína transferrina também foi objecto de conjugação com AuNPs, tendo sido observada a sua internalização em células tumorais de cancro da mama Hs578T (35) Num estudo in vivo, AuNPs com um diâmetro de 26 nm foram conjugadas com TNF (factor necrosante tumoral), tendo sido injectadas em ratinhos portadores de tumores. A sua acumulação no tumor levou à diminuição da massa deste, de uma forma mais eficaz que o TNF isoladamente (36). 19 3.1.2 Terapia fototérmica O efeito fototérmico das AuNPs tem sido investigado na terapia contra o cancro (31). Actualmente, os tratamentos convencionais implicam a remoção cirúrgica de tumores (com a limitação da aplicação a tumores de grande tamanho, acessíveis do ponto de vista cirúrgico), quimioterapia (com elevados efeitos secundários danosos), e radioterapia (cujas radiações aplicadas também atingem as células normais). A terapia fototérmica, que consiste na elevação local de temperatura através da aplicação de radiações promovendo a destruição de tumores, tenta evitar as limitações anteriores. A terapia fototérmica requer a utilização de compostos orgânicos ou inorgânicos que absorvam a radiação no local de aplicação, mas muitas vezes esses compostos requerem elevadas quantidades de radiação e não são desprovidos de citotoxicidade. As vantagens na utilização de AuNPs na terapia fototérmica contra o cancro consistem na utilização de radiação com uma energia mínima e considerada desprovida de toxicidade (20). O efeito plasmónico de ressonância das AuNPs consegue converter a luz absorvida em calor. Além disso, o pequeno tamanho com que se conseguem sintetizar as AuNPs (entre 10 e 30 nm) permite um acesso mais fácil ao tumor. A possibilidade de agregação das nanopartículas permite uma forma mais eficaz de provocar a morte de células tumorais. Na pesquisa de novos agentes que possam ser utilizados na terapia fototérmica, têm sido empregues AuNPs de diferentes formas (cilíndricas, nanocages, nanoshells). Estas AuNPs têm a capacidade de absorver luz que vai do espectro de UV/Vis à região do infravermelho próximo (NIR), sendo contudo a região de NIR crucial na penetração da luz no interior de tecidos vivos. A penetração pode atingir alguns centímetros quando se aplicam comprimentos de onda entre 650 e 900 nm, o local ideal de absorção pela banda plasmónica das AuNPs. 3.1.3 Terapia por radiofrequência A radiofrequência tem sido aplicada há quase um século com objectivos terapêuticos, sobretudo na luta contra o cancro hepático (31). Contudo, a sua utilização tem diversas limitações: é um procedimento invasivo, que se aplica a tumores com um tamanho definido, sendo comum a presença de lesões nos tecidos adjacentes e uma alta taxa de reincidência da patologia. Radioisótopos de ouro coloidal (138Au) são actualmente utilizados na tentativa de ultrapassar estas limitações (37). Os radioisótopos de ouro emitem radiações β de baixo poder de penetração, sendo injectados directamente no tumor de forma a causar a morte das células cancerígenas sem afectar os tecidos 20 vizinhos saudáveis. A sua aplicação estende-se a vários tipos de cancro, como o do ovário, da próstata e nasofaríngeo (37,38). 3.1.4 Terapia contra a angiogénese A angiogénese consiste na formação de novos vasos sanguíneos a partir de outros já existentes e tem um papel crucial no crescimento e difusão do cancro. A angiogénese pode ser um processo normal fisiológico ou patológico, em que há um elevado número de vasos sanguíneos permeáveis a proteínas plasmáticas. A angiogénese é um processo complexo regulado por factores próe anti-angiogénicos. As células tumorais têm a capacidade de desregular esse equilíbrio no sentido de promover a angiogénese. Os novos vasos sanguíneos permitem o acesso de oxigénio e nutrientes às células cancerígenas, permitindo o seu crescimento e difusão pelo organismo. Uma proteína denominada VEGF (factor de crescimento endotelial) é um factor pró-angiogénico responsável pela regulação da permeabilidade de vasos sanguíneos tumorais e é secretada pelas células tumorais, sendo necessária para a sua sobrevivência. A isoforma VEGF165 (constituída por 165 aminoácidos) é a predominante, apresentando um domínio de ligação à heparina. É precisamente nesse domínio que se ligam as AuNPs, inibindo a sua ligação ao receptor presente nas células endoteliais e diminuindo deste modo a angiogénese. Esta aplicação foi estudada em diversos tipos de cancro (cancro do ovário e do mieloma múltiplo) onde se observou um menor crescimento do tecido tumoral (37 - 39). 3.1.5. AuNPs na terapêutica da artrite reumatóide O uso de AuNPs no tratamento paliativo da artrite reumatóide remonta à década de 20 do século passado (11). A angiogénese tem um papel fulcral na formação e manutenção da artrite reumatóide. Estudos realizados com nanopartículas de 13 nm de diâmetro, revestidas com citrato demonstraram uma inibição da proliferação e migração de TNF e uma redução considerável da inflamação, após injecção intra-dérmica durante 7 a 10 dias (40). 21 3.1.6 Terapia Antibacteriana Sob o efeito de radiação incidente, as AuNPs têm capacidade de destruição térmica de patogénios, sendo AuNPs de 10, 20 e 40 nm revestidas com anticorpos anti-proteína A capazes de eliminar de um modo selectivo bactérias Staphylococcus aureus (41). 3.2. Métodos de diagnóstico As AuNPs têm sido utilizadas in vivo como marcadores radioactivos desde os anos 50 do século XX e AuNPs conjugadas com anticorpos têm sido utilizadas desde os anos 80 para marcação biológica em microscopia electrónica (42). A aplicação inicial das nanopartículas neste campo foi na detecção de sequências específicas de interesse em DNA. A utilização de AuNPs em métodos de diagnóstico é vantajosa em relação aos métodos tradicionais, uma vez que a sua toxicidade é nula ou muito reduzida, funcionam como melhores agentes de contraste que determinados agentes orgânicos (que sofrem uma rápida fotodegradação) e a presença de propriedades espectroscópicas como a banda plasmónica permite ensaios colorimétricos (42). A utilização de AuNPs em métodos de diagnóstico pode seguir três vertentes: (i) ensaios colorimétricos, em que a mudança de cor ocorre após agregação das AuNPs funcionalizadas com DNA com amostras biológicas, (ii) nanosondas, após funcionalização das AuNPs com sequências específicas, como hidratos de carbono ou anticorpos e (iii) ampliação do sinal de métodos electroquímicos (31,42). Em imunoensaios, a utilização de AuNPs promove uma maior amplificação do sinal aumentando a sensibilidade da técnica. Por exemplo, a detecção da hormona gonadotrópica coriónica pode ser detectada até níveis de 1 pg mL-1. As AuNPs podem ser utilizadas na detecção, por imunoensaio, de diversas patologias como o cancro, Alzheimer (43), HIV (44) ou tuberculose (45). O uso de AuNPs em técnicas de imagiologia é sobretudo devido ao efeito de ressonância plasmónica. AuNPs podem ser observadas por diferentes métodos como microscopia de contraste de fase, microscopia de fluorescência ou o por difracção de raios-X. Métodos mais tradicionais envolvem a ligação de conjugados anticorpos-AuNPs a antigénios presentes na superfície de células (31). 22 4. Citotoxicidade de AuNPs Apesar das vantagens que aparentam apresentar as nanopartículas de ouro, numerosas questões têm sido elaboradas antes da sua implementação no campo da medicina. A compreensão dos seus potenciais riscos para a saúde humana é pouco clara, e informações como se processa a absorção, distribuição, metabolismo e excreção são ainda escassas (46). A essas questões poderá responder a nanotoxicologia (12). A nanotoxicologia é um ramo emergente da nanotecnologia. A nanotoxicologia refere-se ao estudo das interacções das nanopartículas com sistemas biológicos e a elucidação da relação entre as propriedades físico-químicas (como o tamanho, a forma, o revestimento, a composição e a agregação) de nanopartículas e a sua toxicidade (47). Existe a noção de que as nanopartículas podem penetrar em tecidos, células e organelos, precisamente devido ao seu tamanho reduzido. Essa penetração não é indiscriminada uma vez que depende das propriedades físico-químicas das nanopartículas bem como da identidade de moléculas funcionais presentes na sua superfície (12). Torna-se urgente compreender os mecanismos que ditam o comportamento e o destino (biodistribuição) das nanopartículas após introdução no organismo humano, não só para desenvolver sistemas adequados de nanopartículas para veículo de fármacos como para prevenir potenciais efeitos tóxicos. De um modo geral, nanopartículas podem ser absorvidas pelo organismo por inalação, ingestão ou penetração dérmica (48). AuNPs têm a capacidade de penetrar na pele, sendo maior a penetração quanto menor for o seu tamanho (49). Após absorção, as nanopartículas podem ser directamente excretadas ou então distribuírem-se por outros compartimentos, serem metabolizadas (ou armazenadas) e excretadas. Diversos estudos in vivo têm concluído que o tamanho das AuNPs condiciona a sua distribuição: nanopartículas maiores acumulam-se sobretudo no fígado, seguidamente do pulmão, baço e rim, enquanto que nanopartículas mais pequenas conseguem disseminar-se através da barreira hemato-encefálica (50,51). Muitos estudos têm sugerido que as AuNPs são biocompatíveis e que podem ser utilizadas com segurança (52). Apesar de esta dedução resultar de uma associação directa entre o observado para o metal, na realidade as AuNPs poderão comportar-se de uma forma diferente. Ao possuírem propriedades distintas (como a elevada área de superfície em relação ao volume), as AuNPs podem despoletar mecanismos únicos de toxicidade. Vários mecanismos de toxicidade de nanopartículas metálicas têm sido associados à sua instabilidade química, nomeadamente através da libertação de metais 23 em solução, das suas propriedades catalíticas e da capacidade de oxidação-redução da superfície, que pode ter a capacidade de gerar espécies reactivas de oxigénio (ROS) e induzir stresse oxidativo (52). A modificação de nanopartículas metálicas dependerá de factores como a sua concentração no meio, do pH, da força iónica e das condições redox do meio. Os nanomateriais podem interagir com a superfície ou com o interior das células. A formação de ROS na superfície da célula afecta a estabilidade da membrana e consequentemente a viabilidade celular (6,53,54). Intracelularmente os nanomateriais podem interagir com componentes celulares (provocando, por exemplo, a oxidação de lípidos, proteínas e DNA), alterando ou interrompendo funções celulares, ou ainda originar ROS (55). Interacções de nanopartículas com mitocôndrias são consideradas as principais fontes de citotoxicidade, podendo induzir fenómenos apoptópicos, necróticos e mutagénicos. A internalização de AuNPs pode ser efectuada por diversos mecanismos endocíticos: fagocitose, macropinocitose, endocitose mediada por clatrina ou endocitose não mediada por clatrina (56). O processo mais eficiente parece ser aquele que recorre à mediação por receptores. Um dos possíveis mecanismos de internalização por endocitose mediada por receptores é o reconhecimento celular de proteínas. Foi provado que a carga de superficial dos nanomateriais muda rapidamente no meio biológico, devido à adsorção de proteínas plasmáticas, aproximando-se a sua carga ao valor de carga do meio envolvente, nomeadamente aos das proteínas presentes em maiores quantidades no plasma: a albumina e o fibrinogénio. Ambas têm a capacidade de se ligar a partículas tanto com carga positiva como com carga negativa devido à presença de domínios na sua estrutura com diferentes densidades de carga. Contudo, a conformação favorável do fibrinogénio e o seu menor valor de carga em relação à albumina parecem torná-lo preferencial para a adsorção à superfície de nanopartículas (57). Se a AuNP entrar na célula, a toxicidade pode manifestar-se com formação de ROS, dissolução de partículas ou mesmo lesões mecânicas dos organelos celulares (como os lisossomas, o retículo endoplasmático ou o núcleo). A formação de ROS resultar na lesão da mitocôndria por parte das nanopartículas. Quando o esta formação excede as defesas antioxidantes da célula, observam-se respostas inflamatórias e citotóxicas como peroxidação lipídica (dano na membrana celular), desnaturação proteica e dano no DNA (figura 4). A interacção da nanopartícula com a célula irá depender não só do seu revestimento mas também do seu tamanho. Partículas maiores podem potencialmente 24 causar mais danos a nível da membrana enquanto partículas de menor tamanho poderão atravessar a membrana mais facilmente e causar danos internos (55). Figura 4: Possíveis mecanismos mediados por espécies reactivas de oxigénio associadas com a toxicidade de nanopartículas. Quando a formação de espécies reactivas de oxigénio ultrapassa as defesas antioxidantes, observam-se respostas inflamatórias e citotóxicas. Retirado de (6). 4.1 Estudos de citotoxicidade O conhecimento acerca da citotoxicidade de AuNPs é crescente, embora estudos sobre o seu modo de internalização nas células e a relação com a forma e o tamanho, sejam ainda escassos. A comparação dos estudos disponíveis é dificultada devido às diferentes condições experimentais e linhas celulares utilizadas. Um dos primeiros estudos efectuados sobre a citotoxicidade de nanopartículas de ouro esféricas pertence a Tkachenko e colaboradores (58). Nesse estudo, é realçada a necessidade de criar estratégias de internalização intra-nuclear de modo a, futuramente, possibilitar o diagnóstico fenotípico de doenças, a identificação de potenciais fármacos 25 que actuem a nível intra-nuclear e o desenvolvimento de novas terapêuticas baseadas na entrega de materiais no núcleo de células vivas. A estratégia de internalização nuclear abordada baseou-se na funcionalização de AuNPs (20 nm) com diferentes péptidos derivados de vírus SV40. Os resultados demonstraram que em células HepG2, as AuNPs eram internalizadas por endocitose.mediada por receptor e que a sua localização subcelular (nuclear ou citoplasmática) era dependente da informação contida na sequência peptídica vírica utilizada na funcionalização. A viabilidade celular não era afectada após 12 horas de exposição a estas AuNPs. Outro estudo do mesmo grupo demonstrou que a localização subcelular de AuNPs funcionalizadas com diferentes sequências peptídicas de SV40 e HIV-1 era também influenciada pela linha celular utilizada (HeLa, 3T3/NIH e HepG2). As diferenças observadas no perfil de distribuição intracelular das nanopartículas nas diferentes linhas celulares reflectiam-se na citotoxicidade (59). Em 2003, Thomas e colaboradores investigaram a aplicação de conjugados de polietilenimina (PEI) com AuNPs (de 4 nm de diâmetro) como vectores de transfecção de DNA plasmídico na linha celular COS-7 (60). A citotoxicidade de AuNPs apenas revestidas com PEI foi inferior comparativamente à de AuNPs revestidas com PEI e ácido undecanóico. Imagens obtidas por T.E.M. mostraram a presença de AuNPs no exterior das células, associadas à membrana plasmática, no interior do citoplasma e no interior do núcleo. Em 2004, Goodman avaliou a citotoxicidade de duas AuNPs de 2 nm diâmetro de carga oposta (61). O efeito destas nanopartículas na viabilidade foi estudado em células Cos-1, glóbulos vermelhos e culturas bacterianas (Escherichia coli). Os resultados obtidos indicaram, para todas as células utilizadas, as nanopartículas de origem catiónica exerciam efeitos moderadamente tóxicos em relação às nanopartículas aniónicas. Goodman e colaboradores consideraram que o mecanismo de toxicidade pareceu ser semelhante para as 3 linhas celulares, sendo as nanopartículas internalizadas passivamente e não por endocitose mediada por receptores. A toxicidade resultante das AuNPs catiónicas seria atribuída à sua adesão à membrana celular, causando uma variedade de interacções que comprometeriam a sua viabilidade. Em 2005, Shukla e colaboradores investigaram os efeitos citotóxicos e imunogénicos das AuNPs em células de linhas macrofágica RAW264.7 (62). As AuNPs utilizadas possuíam um diâmetro de aproximadamente 35 nm, sendo revestidas com lisina e poli-L-lisina. A viabilidade celular não sofreu alterações até ao tempo máximo da experiência (72 horas), 26 excepto em que a incubação das células com AuNPs na sua concentração máxima (100 µM) reduziu a viabilidade para 85%. Contudo este facto foi atribuído pelos investigadores ao stresse sofrido pelas células devido à deplecção de nutrientes do meio, não sendo este substituído ao longo do ensaio. Foi então considerado que estas AuNPs não apresentavam citotoxicidade para os macrófagos da linha RAW264.7. A produção de espécies reactivas de azoto (RNS) e de oxigénio (ROS) manteve-se constante. Estes resultados sugerem que, para além da ausência de citotoxicidade, as AuNPs não parecem desencadear uma resposta imunológica inicial. A entrada de AuNPs nestas células pareceu dar-se por um processo endocítico dependente de energia, observandose a internalização de nanopartículas a 37ºC mas não a 4ºC. Em 2005, Connor e colaboradores avaliaram a internalização e citotoxicidade de AuNPs em células leucémicas humanas (linha celular K562) (63). As nanopartículas utilizadas possuíam um diâmetro de 4, 12 e 18 nm, com uma variedade de revestimentos: cisteína e citrato para as nanopartículas de 4 nm, glucose para as nanopartículas de 12 nm e citrato, biotina e CTAB para as nanopartículas de 18 nm. Nanopartículas revestidas com cisteína, citrato e glucose não aparentaram ser tóxicas para concentrações até 250 µM. AuNPs de 18 nm revestidas com CTAB revelaram toxicidade, ocorrendo morte celular quase total para a concentração de 0.1 µM. Estes valores foram muito semelhantes para CTAB livre (não ligado às nanopartículas), sendo investigado se a citotoxicidade observada se devia ao CTAB livre ou ao conjugado nanopartículas-CTAB. Procedendose à lavagem de CTAB da superfície das nanopartículas, observou-se que estas não causavam citotoxicidade nas mesmas condições que o ensaio tinha ocorrido previamente. Em 2006, Pernodet e colaboradores estudaram o efeito de AuNPs (13 nm) revestidas com citrato em fibroblastos de origem dérmica (64). A intenção deste estudo foi observar as alterações morfológicas subtis provocadas pelas AuNPs. Segundo estes autores, a proliferação celular, a morfologia estrutural, o crescimento e síntese de proteínas (como a actina) podem ser afectados pela presença de nanopartículas, mesmo na ausência de citotoxicidade aparente. Com o aumento da concentração de AuNPs, o crescimento celular e a proliferação foram diminuindo. A adição de nanopartículas resultou na em modificações da estrutura de actina, nomeadamente na diminuição do seu diâmetro e da sua densidade. Estas AuNPs foram encontradas no interior dos lissosomas após uma hora de incubação, desprovidas do seu revestimento de citrato, sendo sugerido que a carga das nanopartículas é irrelevante após internalização celular. 27 Em 2006, Patra e colaboradores avaliaram o efeito de AuNPs revestidas de citrato (33 nm) nas linhas celulares A549 (carcinoma pulmonar hepático), BHK21 (rim de hamster) e HepG2 (carcinoma hepático humano) (65). A linha celular A549 mostrou-se mais susceptível que as outras, observando-se alterações na sua morfologia em curtos períodos de tempo (48 horas), indicando stresse sofrido pelas células. A redução da viabilidade foi proporcionalmente crescente com o aumento da concentração das AuNPs incubadas. A morte celular ocorreu por mecanismos apoptóticos (via das caspases). As células BHK21 e HepG2 não sofreram alterações na sua viabilidade. Os autores concluíram que a citotoxicidade não se manifesta de uma forma igual para todas as linhas celulares. Em 2007, Pan e colaboradores avaliaram o impacto do tamanho das AuNPs na sua citotoxicidade nas linhas celulares HeLa (células epiteliais do carcinoma do cérvix), SKMel-28 (melanoma), L929 (fibroblastos de ratinho), e células J774A1 (células macrofágicas/monocíticas de ratinho). (66). As nanopartículas apresentavam uma diversidade de tamanhos (entre 0,8, e 15 nm de diâmetro), sendo revestidas com trifenilfosfina mono-fosfato (TPPMS). Além deste revestimento, AuNPs com 1.4 nm foram funcionalizadas com trifenilfosfina tri-fosfato (TPPTS). AuNPs com diferentes revestimentos mas do mesmo tamanho (1,4 nm) provaram ser as mais tóxicas, provocando uma rápida diminuição do crescimento celular em menores concentrações. Apesar das linhas celulares serem de origem bastante diferente, a inibição do crescimento causada pelas nanopartículas foi praticamente idêntica em todas elas, não se observando nenhuma variação significativa. Em 2009, Uboldi e colaboradores investigaram a citotoxicidade induzida por AuNPs, de diferentes tamanhos (9,5; 11 e 25 nm) e revestimentos (presença ou ausência de resíduos de citrato de sódio à superfície) em células A549 e NCIH441 (células alveolares de tipo II) (67). Para a linha celular A549, AuNPs de 9,5 sem revestimento enquanto que as nanopartículas de 11 e 25 nm, revestidas com citrato, exerciam uma moderada redução da viabilidade. Na linha celular NCIH441 não se observou alterações à citotoxicidade. Tendo em conta estes resultados, os investigadores concluíram que a presença de citrato diminui a viabilidade na linha A549 e que, comparativamente, a linha NCIH441 é ligeiramente mais resistente aos efeitos citotóxicos das nanopartículas de ouro. Os efeitos mais pronunciados observaram-se na presença de revestimento, parecendo o efeito do tamanho na citotoxicidade ser secundário. 34 35 OBJECTIVOS A presente dissertação pretende contribuir para o esclarecimento da importância do revestimento na sua captação, translocação e citotoxicidade de nanopartículas de ouro. Deste modo, os estudos realizados em células Caco-2, um modelo celular de epitélio intestinal humano, tiveram como principais objectivos:  Avaliar a potencial citotoxicidade de nanopartículas de ouro (AuNPs) com diferentes revestimentos (citrato, 11-MUA, CALND e CALNS) pelos ensaios de redução do MTT e captação do Vermelho Neutro (NR);  Detectar possíveis alterações morfológicas das células induzidas pelas AuNPs  Avaliar quantitativamente o grau de translocação e captação nas AuNPs funcionalizadas  Avaliar qualitativamente por Microscopia de Transmissão Electrónica a internalização de AuNPs com diferentes revestimentos. 36 37 CAPÍTULO II Materiais e Métodos 38 39 MATERIAIS E MÉTODOS 1. Síntese e caracterização das nanopartículas 1.1 - Síntese de nanopartículas de ouro (AuNPs) revestidas por citrato As nanopartículas de ouro esféricas com o diâmetro de 20 nm foram sintetizadas na Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, pelo método de redução de ouro por citrato (80). Este método insere-se no tipo de síntese em que a redução ocorre quimicamente, tendo esta sido inicialmente descrita por Turkevich e colaboradores (21). em 1951. Neste método o ouro proveniente do agente precursor, ácido tetracloroaúrico (III) em solução aquosa e à temperatura de ebulição, é reduzido a ouro metálico por acção do citrato de sódio, um agente redutor fraco que funciona simultaneamente como agente de revestimento. O citrato é introduzido no meio reaccional em excesso. Á medida que ocorre a redução do ouro, o restante citrato de sódio, sob a forma de ião citrato carregado negativamente é adsorvido à superfície da AuNP. Uma vez revestida vai repelir as restantes NPs existentes em solução devido a repulsões electrostáticas, prevenindo assim a agregação e um crescimento descontrolado das mesmas. Todos os procedimentos foram efectuados em condições de esterilidade. 1.2. Funcionalização Os agentes de revestimento utilizados foram compostos de origem orgânica, nomeadamente uma molécula bifuncional (ácido 11-mercaptoundecanóico, 11-MUA) e dois pentapéptidos (CALND e CALNS). A seguinte tabela apresenta as fórmulas de estruturas de cada um dos compostos orgânicos utilizados como agentes de revestimento. 40 Tabela 1: Representação da estrutura química dos diferentes revestimentos utilizados neste trabalho: 11MUA, CALND e CALNS. Molécula Orgânica Fórmula de Estrutura 11-MUA CALND CALNS A adição dos agentes de revestimento foi efectuada determinando a concentração do total de NPs, determinando-se de seguida a quantidade equivalente de agente de revestimento (11-MUA ou péptido) necessária para funcionalizar a superfície de cada NP na razão molar agente de revestimento/NP de 120. 1.3 Preparação de veículo O veículo foi preparado tendo em conta o meio em que as NPs se encontram presentes. Foram preparadas soluções contendo 3,529 × 10-3 M de citrato de sódio e 3,79 × 10-4M de cloreto de sódio, sendo estas filtradas de modo a assegurar a sua esterilidade. 41 1.4 Caracterização e análise de nanopartículas A caracterização e a análise de NPs ficaram a cargo do Departamento de Química da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, onde foram efectuadas por diversas técnicas, tais como espectrofotometria de UV/Vis, microscopia electrónica de transmissão (T.E.M.), medidas de dispersão que englobaram a difracção dinâmica de luz (D.L.S.) e medição do potencial zeta (ζ-potencial). 2. Cultura celular - manutenção e propagação Neste trabalho, foi utilizada a linha Caco-2 (HTB-37, American Type Culture Collection, EUA), proveniente de um adenocarcinoma de cólon humano. As células foram mantidas a 37ºC com 5% de CO2, em meio Eagle modificado por Dulbecco com 4.5 g/L de glucose (DMEM), suplementado com 10% de soro bovino fetal (Gibco), 1% de solução de antibiótico-antimicótico (10000 U/mL penicilina/estreptomicina e 250 µg/mL anfotericina B) e 1% de solução de aminoácidos não-essenciais (Gibco). A propagação celular foi efectuada expondo as células durante breves minutos a uma solução de 0.25%tripsinaEDTA (Gibco). Para os ensaios de citotoxicidade, as células foram cultivadas em placas de 96 poços (TPP, Switzerland) com uma densidade celular de 65 000 células/cm2. Nos ensaios de acumulação, as células foram mantidas a 37ºC em idênticas condições. As células foram cultivadas, na densidade de 100 000 células/cm2, num sistema vulgarmente designado por Transwell® e mantidas em cultura durante 21 dias, de modo a permitir a sua completa diferenciação (50). Este sistema consiste numa membrana semi-permeável de politereftalato de etileno (PET) com uma porosidade de 0.4 µm (BD Falcon®, EUA) e permite a polarização celular. Todas as experiências foram efectuadas entre a passagem 58 e 68. 42 3. Ensaios de citotoxicidade Os ensaios de avaliação da citotoxicidade (redução do MTT e captação do Vermelho Neutro) foram realizados após as células atingirem a confluência, 4 dias após a sementeira. A avaliação da citotoxicidade de AuNPs esféricas, com diferentes revestimentos, bem como dos seus veículos, foi efectuada em células Caco-2 expostas durante 24, 48, 72 e 96 horas, na concentração de 1, 3, 10, 30 e 100 µM, em soluções extemporâneas preparadas em meio de cultura sem soro bovino fetal. A avaliação qualitativa da morfologia de células expostas a AuNPs de diferentes revestimentos foi realizada por observação em microscópio óptico de contraste de fase (modelo) e registo fotográfico (Canon Power Shot S40). 3.1 Ensaio de MTT O ensaio de MTT (brometo de (3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilterazólio)permite avaliar a viabilidade celular, analisando a actividade metabólica das células a nível mitocondrial. O MTT, um composto de cor amarelada, é reduzido em sais de formazano, um composto de cor arroxeada, pelas redutases mitocondriais das células metabolicamente activas. O ensaio de MTT (brometo de (3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilterazólio) permite avaliar a viabilidade celular, analisando a actividade metabólica das células a nível mitocondrial. O MTT, um composto de cor amarelada, é reduzido em sais de formazano, um composto de cor arroxeada, pelas redutases mitocondriais das células metabolicamente activas. O MTT 0,5 mg/mL foi preparado em solução de Hanks (HBSS), tendo este como constituintes 5,56 mM glucose, 1,26 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2·6H2O, 0,41 mM MgSO4·7H2O, 5,33 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137,93 mM NaCl e 0,34 mM Na2HPO4·7H2O. Após aspiração do meio, o volume de MTT adicionado às células foi de 150 µl, sendo o período de incubação de 30 minutos, a 37ºC. Seguidamente, a solução foi aspirada e foram adicionados 200 µl de DMSO, para dissolução dos cristais de formazano formados durante o período de incubação com MTT. A solução foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos ao abrigo da luz. A absorvância foi depois lida num espectrofotómetro (Power Wave X, Bio Tek Instruments), no comprimento de onda de 550 nm, sendo o comprimento de onda de referência de 690 nm 3.2 Ensaio de Neutral Red O ensaio do Vermelho Neutro (Neutral Red) permite avaliar a viabilidade celular, sendo um indicador da integridade de membrana. O Neutral Red é uma molécula neutra, com capacidade de penetrar em células vivas ou mortas. Nas células vivas, o NR acumula-se nos lisossomas, onde sofre protonação absorvendo radiação a 540 nm. 43 O NR foi preparado na concentração de 0.5 mg/mL em HBSS, na presença de cálcio e magnésio, sendo colocados 150 µl em contacto com as células após aspiração do meio. As placas foram depois incubadas durante 2 horas a 37ºC. Seguidamente, a solução foi aspirada e foram adicionados 150 µl de solução de lise (1% de ácido acético glacial numa mistura de 1:1 etanol/água). Posteriormente, a placa foi mantida à temperatura ambiente durante 15 minutos ao abrigo da luz. A absorvância foi depois lida no espectrofotómetro no comprimento de onda de 540 nm, sendo o comprimento de onda de referência de 690 nm. 4. Estudos de captação e translocação de AuNPs Os estudos de captação e translocação de AuNPs foram efectuados em sistema Transwell®. Este sistema é composto por dois compartimentos separados horizontalmente por uma membrana. As células Caco-2 cultivadas sobre a membrana formam uma monocamada polarizada, constituindo um modelo celular de absorção em que o compartimento superior (em contacto com a superfície apical) equivale ao lúmen intestinal, e o compartimento inferior simula a circulação sanguínea ou linfática em contacto com a superfície basolateral dos enterócitos. 4.1 Verificação da integridade e permeabilidade celular 4.1.1 Medição da resistência eléctrica transepitelial (TEER) A resistência eléctrica transepitelial (TEER) das células cultivadas no sistema Transwell® foi medida com um voltímetro Evom2 (World Precision Instruments, EUA) (Figura 7). Este aparelho avalia a resistência da barreira transepitelial, sendo determinada pelo fluxo de iões que atravessam o espaço paracelular, e indica o estado de saúde e a confluência das células mantidas em cultura. As medições foram efectuadas a partir do momento em que as células atingiam a confluência (4º dia), tentando efectuar-se regularmente no período de 2 em 2 dias. As determinações foram efectuadas com as células à temperatura ambiente, mantendo os eléctrodos sempre na mesma posição. Um Transwell® sem células foi utilizado como branco, de forma a determinar o valor de resistência da membrana. 50 Figura 9 – Imagem representativa da análise por T.E.M. de uma amostra de solução coloidal de AuNPs revestidas com citrato. O diâmetro das AuNPs com diferentes agentes de revestimento foi determinado pela medição da difracção dinâmica de luz (D.L.S.) Os resultados encontram-se na tabela 2 e mostram que após funcionalização há um aumento do diâmetro das AuNPs relativamente às AuNPs revestidas a citrato (AuNPs-Cit). Os valores encontrados para as AuNPs-Cit rondam os 23 nm, enquanto que nas diferentes AuNPs funcionalizadas os diâmetros médios rondam os 33 e 35 nm. Estes resultados demonstram que o processo de funcionalização foi eficiente, com uma substituição do citrato pelo agente de revestimento e que as AuNPs funcionalizadas com 11-MUA e com os pentapéptidos CALNS e CALND apresentam um tamanho muito semelhante. Tabela 2 – Diâmetros das AuNPs com diferentes revestimentos determinados por D.L.S. AuNPs + Agentes de revestimento Diâmetro/nm Citrato 22,4 ± 5,7 11 – MUA 33,2 ± 9,8 CALND 35,1 ± 9,9 CALNS 34,9 ± 9,6 51 O potencial zeta das AuNPs foi determinado e os resultados obtidos encontram-se apresentados na tabela 3. Todas as AuNPs têm um valor de potencial zeta negativo e muito semelhante entre si. O facto dos valores obtidos se situarem na ordem dos ‒ 40 mV é indicativo de soluções coloidais com boa estabilidade, ou seja, menor tendência de agregação. Tabela 3: Valores do potencial zeta das AuNPs com diferentes revestimentos. AuNPs + Agentes de revestimento Potencial ζ / mV Citrato -44,7 ± 7,5 11 – MUA -37,3 ± 8,4 CALND -47,1 ± 6,0 CALNS -40,5 ± 7,0 Os resultados fornecidos por D.L.S. indicaram que o diâmetro médio das nanopartículas de citrato é de aproximadamente 23 nm. Nas restantes nanopartículas revestidas o aumento no diâmetro é de cerca de 10 nm (entre 33 e 35 nm). Este aumento deve-se ao tamanho do agente de revestimento, que ao ligar-se à superfície da nanopartícula contribui para o aumento do raio desta. Esse aumento é semelhante devido ao tamanho também semelhante dos agentes de revestimento entre si. 52 2. Avaliação do Potencial Citotóxico das AuNPs funcionalizadas em células Caco-2 Os potenciais efeitos citotóxicos das AuNPs foram avaliados num modelo celular de epitélio intestinal humano, a linha celular Caco-2. As células foram expostas a concentrações de AuNPs (1 a 100 µM) preparadas em meio de cultura sem soro, durante 24, 48, 72 ou 96 horas. No final de cada exposição, a viabilidade foi avaliada pelos ensaios de MTT e do vermelho neutro (NR). Conforme se encontra representado nas figuras 10 e 11, para as concentrações e tempos de exposição testados, as AuNPs-Cit parecem não exercer efeitos citotóxicos nas células Caco-2. 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-Cit NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-Cit NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) Figura 10: Efeitos das AuNPs revestidas com citrato (AuNP-Cit) e respectivos veículos na viabilidade das células Caco-2 após (A) 24 e (B) 48 horas de exposição a diferentes concentrações. A viabilidade celular foi avaliada pelos métodos de redução do MTT e incorporação do vermelho neutro (NR) e os resultados, em % de controlo (células não tratadas), encontram-se expressos como média ± erro padrão de 3 experiências independentes (n = 8). A B 53 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-Cit NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-Cit NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) Figura 11: Efeitos das AuNPs revestidas com citrato (AuNP-Cit) e respectivos veículos na viabilidade das células Caco-2 após (A) 72 e (B) 96 horas de exposição a diferentes concentrações. A viabilidade celular foi avaliada pelos métodos de redução do MTT e incorporação do vermelho neutro (NR) e os resultados, em % de controlo (células não tratadas), encontram-se expressos como média ± erro padrão de 3 experiências independentes (n = 8). Não foram detectadas alterações significativas na morfologia celular após 24 horas de exposição às AuNPs-Cit. Imagens de microscopia óptica mostram que o tamanho e a forma das células parecem não ser afectados pela presença das NPs (fig. 12). Após 96 horas, as células incubadas com AuNPs mantinham a mesma morfologia que células em que as AuNPs estavam ausentes do meio. A presença de agregados é evidente, sobretudo na concentração de AuNPs mais elevada (figs. 12C e 12 F). A B 54 A B C D E F Figura 12: Efeito das AuNPs-Cit na morfologia das células Caco-2. Após 24 horas de exposição, as células foram observadas num microscópio de contraste de fases com uma ampliação de 400×. (A) Controlo, (B) 10 µM AuNP-Cit e (C) 100 µM. Após 96 horas de exposição, As células foram novamente observadas ao microscópio às 96 horas com uma ampliação de 400×. (D) Controlo, (E) 10 µM AuNP-Cit e (F) 100 µM. A análise de ambos os resultados dos ensaios de viabilidade, por MTT e NR parece descartar qualquer fenómeno de citotoxicidade associado às AuNPs-Cit. Estes resultados são concordantes com os obtidos por Connor (63) que observou a ausência de citotoxicidade de AuNPs-Cit com diâmetros de 4 e 18 nm revestidas com citrato em células K562 até uma concentração máxima de 250 µM. Apesar do tamanho das AuNPs e da linha celular ser diferente, o revestimento de citrato parece não estar associado a fenómenos de citotoxicidade. Porém, Uboldi e colaboradores (67) demonstraram que AuNPs-Cit com um tamanho de 11 e 25 nm provocam uma diminuição entre 30 a 40% na viabilidade de células alveolares A549, comparativamente a AuNPs de 9,5 nm em que o revestimento de citrato foi removido por filtração e diálise. A linha celular NCIH441, também testada com as mesmas AuNPs, não sofreu qualquer tipo de alteração na sua viabilidade. Depreende-se que a susceptibilidade a efeitos citotóxicos de AuNPs revestidas por citrato poderá também dever-se às características das células. 55 De modo a compreender a influência da funcionalização das AuNPs na citotoxicidade, a partir das AuNPs-Cit, utilizadas como referência, foram sintetizadas AuNPs com novos revestimentos (11-MUA, CALNS e CALND). A funcionalização com 11-MUA pode ser uma estratégia para obter AuNPs mais estáveis e com menor capacidade de agregração (81). De forma a avaliar o potencial citotóxico das AuNPs funcionalizadas com 11-MUA, o mesmo tipo de abordagem metodológica foi utilizado. À semelhança do observado para AuNPs de referência (AuNPs-Cit), as AuNPs revestidas com 11-MUA parecem não alterar a viabilidade celular, após 24 e 48 horas e nas concentrações testadas (figura 13). 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Concentração (µM) MTT Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-MUA NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Concentração (µM) MTT Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-MUA NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) Figura 13: Efeitos das AuNPs revestidas com 11-MUA (AuNP-MUA) e respectivos veículos, na viabilidade das células Caco-2 após (A) 24 e (B) 48 horas de exposição a diferentes concentrações. A viabilidade celular foi avaliada pelos métodos de redução do MTT e incorporação do vermelho neutro (NR) e os resultados, em % de controlo (células não tratadas), encontram-se expressos como média ± erro padrão de 3 experiências independentes (n = 8). A B 56 Para tempos de exposição ainda mais longos (72 e 96 horas), continua a observar-se ausência de citotoxicidade (figura 14). 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-MUA NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-MUA NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) Figura 14: Efeitos das AuNPs revestidas com 11-MUA (AuNP-MUA) e respectivos veículos, na viabilidade das células Caco-2 após (A) 72 e (B) 96 horas de exposição a diferentes concentrações. A viabilidade celular foi avaliada pelos métodos de redução do MTT e incorporação do vermelho neutro (NR) e os resultados, em % de controlo (células não tratadas), encontram-se expressos como média ± erro padrão de 3 experiências independentes (n = 8). A morfologia celular, após 24 horas de exposição às AuNPs-MUA, não parece sofrer alterações, conforme observado pelas imagens de microscopia óptica (fig.15). Na exposição mais longa (96 horas), o tamanho e a forma das células aparentemente não sofreram alterações. Agregados podem ser observados na concentração de AuNPs mais elevada, em ambos os tempos (fig. 15 C e 15 F). A B 57 11-MUA A B C D E F Figura 15: Efeito das AuNPs-MUA na morfologia das células Caco-2. Após 24 horas de exposição, as células foram observadas num microscópio de contraste de fases com uma ampliação de 400×. (A) Controlo, (B) 10 µM AuNP-MUA e (C) 100 µM AuNP-MUA. Após 96 horas de exposição, As células foram novamente observadas ao microscópio às 96 horas com uma ampliação de 400×. (D) Controlo, (E) 10 µM AuNP-MUA e (F) 100 µM AuNP-MUA. A funcionalização de AuNPs com péptidos permite a obtenção de nanopartículas estáveis, hidrossolúveis, com propriedades análogas às proteínas (28). Estas características podem ser aproveitadas para promover o reconhecimento celular de AuNPs e consequentemente a sua internalização (29). Contudo, o conhecimento sobre efeitos tóxicos de AuNPs revestidas com péptidos ainda é limitado. Neste estudo, foram utilizados os pentapéptidos CALNS e CALND. O aminoácido terminal confere a estes péptidos diferentes propriedades: ambos são hidrófilos e polares, contudo o aminoácido serina (S) apresenta uma carga negativa – 1 em pH 7 enquanto o ácido aspártico (D) apresenta carga negativa – 2 (29). Na tentativa de apurar potenciais efeitos tóxicos destes agentes, a análise da viabilidade de AuNPs revestidas com pentapéptidos CALND e CALNS foi efectuada. Para os tempos estabelecidos, observou-se ausência de citotoxicidade induzida por AuNPs revestidas com CALND (figs. 16 e 17). 58 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-CALNS NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-CALNS NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) Figura 16: Efeitos das AuNPs revestidas com CALNS (AuNP-CALNS) e respectivos veículos na viabilidade das células Caco-2 após (A) 24 e (B) 48 horas de exposição a diferentes concentrações. A viabilidade celular foi avaliada pelos métodos de redução do MTT e incorporação do vermelho neutro (NR) e os resultados, em % de controlo (células não tratadas), encontram-se expressos como média ± erro padrão de 3 experiências independentes (n = 8). A B 59 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-CALNS NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 MTT Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) 1 3 10 30 100 0 20 40 60 80 100 120 Veículo AuNP-CALNS NR Concentração (µM) Viabilidade (% controlo) Figura 17: Efeitos das AuNPs revestidas com CALNS (AuNP-CALNS) na viabilidade das células Caco-2 após (A) 72 e (B) 96 horas de exposição a diferentes concentrações e respectivos veículos. A viabilidade celular foi avaliada pelos métodos de redução do MTT e incorporação do vermelho neutro (NR) e os resultados, em % de controlo (células não tratadas), encontram-se expressos como média ± erro padrão de 3 experiências independentes (n = 8). A morfologia celular pareceu não sofrer alterações após 24 e 96 horas de exposição a AuNPs-CALNS (fig. 18). As imagens de microscopia óptica revelam que as células mantiveram a sua forma e o seu tamanho, mesmo na presença de agregados na concentração de AuNPs mais elevada (figs. 18C e 18F). A B 66 Tabela 4: Coeficientes de Permeabilidade (Papp) do Manitol em células Caco-2 com 21 dias de cultura. Soluto Direcção Papp x 10-6 (cm/s) 3H-Manitol A → B 1.10 ± 0.078 B → A 0.72 ± 0.018 A → B: Apical para Basal; B → A: Basal para Apical Resultados expressos como média ± erro padrão da média (n=3) Células com valores de TEER > 500 Ω.cm2 foram utilizadas para estimar a translocação e internalização de AuNPs. Na figura 23, encontra-se representada a percentagem de translocação das AuNPs funcionalizadas do compartimento dador para o receptor (A) e a percentagem de retenção celular das mesmas (B). 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 AuNPs-Cit AuNPs-MUA AuNPs-CALNS AuNPs-CALND AB BA Fracção Basal Fracção Apical % de translocação AuNPs 0 2 4 6 8 10 12 14 ABBA AuNPs-Cit AuNPs-MUA AuNPs-CALNS AuNPs-CALND Fracção celular * ** % de retenção AuNPs Figura 23: (A) Percentagem de translocação de AuNPs e (B) percentagem de retenção celular após 2 horas de incubação com as AuNPs funcionalizadas (30 µM), em células Caco-2. Os estudos foram realizados na direcção apical-basal (A→B) e basal-apical (B→A). Os resultados encontram-se expressos como média ± erro padrão da média (n=3). * p<0.05 vs AuNPs-Cit; ** p<0.0001 vs AuNPs-Cit. A B 67 Os resultados mostram que o fluxo transepitelial das AuNPs em ambas as direcções é reduzido e parece não haver diferenças entre as diferentes AuNPs testadas. Esta reduzida capacidade das AuNPs de atravessarem o epitélio intestinal já foi descrita por outros autores (44, 46, 85, 86). A funcionalização parece ter influência no grau de internalização das AuNPs pelas células Caco-2. Conforme representado na Figura 22 B, a captação apical foi maior para AuNPs revestidas com CALND e as menos internalizadas pelas células foram as AuNPsCALNS, no entanto o mesmo perfil de internalização não foi observado quando as AuNPs foram adicionadas ao compartimento basal. Vários trabalhos demonstraram que a internalização das AuNPs é mediada por endocitose (59, 60, 64). As diferenças observadas no perfil de acumulação das AuNPs podem ser explicadas por uma distribuição assimétrica dos componentes envolvidos na captação das nanopartículas. Por outro lado, o facto das AuNPs serem pouco captadas no domínio basolateral da célula está concordante com o observado nos estudos de biodistribuição onde AuNPs administradas por via endovenosa, não são encontradas no intestino (85, 86) Na tentativa de minimizar a influência de proteínas na internalização das nanopartículas nas células (uma vez que as nanopartículas se podem ligar às proteínas e serem facilmente internalizadas), os ensaios foram efectuados na ausência de proteínas no meio, sendo a internalização observada apenas dependente do revestimento. Apesar da ausência de citotoxicidade, observa-se que o revestimento é determinante no grau de internalização das AuNPs. Um revestimento que apresente uma estrutura química com maior compatibilidade para um receptor membranar específico permitirá que a AuNP seja mais internalizada que um revestimento com menor afinidade para esse receptor. Com o objectivo de observar a extensão de internalização intracelular, após terem sido incubadas durante 24 horas com nanopartículas de diferentes revestimentos, as células Caco-2 foram observadas ao microscópio electrónico (figs. 24 a 26). Quando as células foram incubadas com AuNPs, encontraram-se nanopartículas no espaço extracelular. No interior das células, as nanopartículas aglomeravam-se em espaços pontualmente em espaços delimitados por membranas, levantando-se a hipótese de serem endossomas. Não foram identificadas AuNPs livres no citoplasma ou no núcleo. As células que captaram ouro apresentavam uma menor definição da membrana celular relativamente ao controlo. 68 Figura 24: Imagens de T.E.M., células Caco-2, na ausência de nanopartículas (controlo) (A) e após tratamento com de AuNPs-Cit a 100 µM (B). As setas indicam a presença de AuNPs. Figura 25: Imagens de T.E.M. de células Caco-2 após tratamento com AuNP-MUA (A) e AuNP-CALND (B) a 100 µM. As setas indicam a presença de AuNPs. Na figura 27B, é possível observar um aglomerado de AuNPs numa estrutura delimitada por membrana (caixa). Figura 26: Imagens de T.E.M. a partir de células Caco-2, após tratamento com AuNP-CALNS, a 100 µM, durante 24 horas. A B A B 69 A análise qualitativa do grau de internalização por T.E.M. revelou que AuNPs revestidas por CALND parecem ter maior capacidade de penetração celular, seguidas por AuNPs revestidas por citrato e por 11-MUA. As AuNPs de CALNS parecem ser a menos internalizadas. Estes resultados são concordantes com os observados no estudo de translocação e internalização. O revestimento é sem dúvida fundamental para a internalização das nanopartículas e para o seu destino intracelular. Tkachenko e colaboradores, ao utilizarem AuNPs revestidas por fragmentos de proteínas virais, observaram-nas na região perinuclear e no interior do núcleo (59,60). O grau de internalização das AuNPs dependeu do revestimento das AuNPs, como observado neste trabalho. Pernodet localizou AuNPs em vesículas lisossómicas, sem o seu revestimento prévio de citrato, não as encontrando no núcleo (64). Uboldi não observou AuNPs dispersas no citosol mas apenas na região peri-nuclear (67). No presente trabalho também não foi possível identificar AuNPs na região nuclear. Os diferentes graus de internalização das AuNPs poderão explicar-se com base na estrutura química que constitui o revestimento. Apesar de muito semelhantes entre si, os pentapéptidos CALND e CALNS diferem do aminoácido terminal, traduzindo-se essa diferença no valor de carga. O facto do pentapéptido CALND possuir um maior número de carga (-2) em relação ao CALNS (-1) provavelmente será reponsável pela sua maior capacidade de internalização nas células Caco-2. Este pentapéptido poderá ser o revestimento mais promissor para promover a internalização de AuNPs nas células intestinais. A confirmação deste facto está pendente de novos ensaios que poderão surgir, como por exemplo em ensaios em outros modelos de epitélio intestinal ou mesmo de ensaios in vivo. 70 71 CAPÍTULO IV Conclusão 72 73 CONCLUSÃO As nanopartículas de ouro, graças às suas características únicas (como o tamanho reduzido, possibilidade de funcionalização e presença de banda plasmónica), têm sido cada vez mais investigadas no âmbito da medicina com o objectivo de estabelecer novas aplicações em métodos de diagnóstico e terapêuticos. Devido à natureza inerte do metal de que são constituídas, seria de supôr que seriam isentas de toxicidade. Contudo, o conhecimento sobre o potencial efeito nocivo das nanopartículas de ouro tem sido revelado ao longo dos anos. Apesar de estudos contraditórios existentes na literatura, e da dificuldade em cruzar dados obtidos devido a especificidades inerentes aos ensaios efectuados, sabe-se que as nanopartículas de ouro podem ter efeitos lesivos sobre determinadas células. Também se sabe que diferentes características como a forma, o tamanho e o revestimento têm influência na sua toxicidade. Neste trabalho, procurou-se avaliar o potencial citotóxico, a translocação e acumulação de nanopartículas de ouro em células Caco-2. As células Caco-2 são amplamente utilizadas na pesquisa de novos fármacos uma vez que têm a notável capacidade de recriar os principais atributos do epitélio intestinal humano. Células Caco-2 foram expostas a diferentes concentrações de AuNPs (1 a 100 µM) revestidas com citrato, 11MUA, CALND e CALNS durante 24, 48, 72 e 96 horas. Nestas condições estabelecidas, não foram observados efeitos citotóxicos. O estudo da translocação e internalização das mesmas AuNPs funcionalizadas foi realizado após 2 horas de incubação com as nanopartículas e permitiu concluir a capacidade das AuNPs em atravessarem as células é muito reduzida. Contudo, a influência do revestimento manifesta-se no grau de internalização: nanopartículas de ouro revestidas com CALND são mais facilmente internalizadas que as restantes, sendo as CALNS as menos internalizadas. Pode levantar-se a hipótese de que existirá uma distribuição assimétrica dos componentes envolvidos no processo de captação das partículas nos dois domínios da célula. Mais estudos serão necessários para confirmar se este fenómeno é exclusivo das Caco-2 ou comuns a outros modelos de epitélio intestinal. 74 75 Bibliografia 1. NNI, National Nanotechnology Initiative, 2010 (última visuzalização em 29 de Setembro de 2010), www.nano.gov 2. 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