Evolução das Antocianinas, Atividade Antioxidante e Parâmetros de Cor no Vinho do Porto ao Longo do seu Envelhecimento

Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto Departamento de Ciências Químicas Laboratório de Bromatologia e Hidrologia Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no Vinho do Porto ao longo do seu envelhecimento Dissertação do 2º Ciclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre em Controlo da Qualidade – Ramo de Especialização Água e Alimento Orientador: Doutora Olga Maria da Silva Viegas Coorientador: Professora Doutora Isabel Maria Pinto Leite Viegas Oliveira Ferreira Mafalda Jacob Galante de Queiroz Porto Setembro 2015 Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz iii É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz v Muitas pessoas devem a grandeza das suas vidas a problemas e obstáculos que tiveram que vencer. Impele a tua própria Canoa. Lord Robert Stephenson Smyth Baden-Powell (Escoteiro Chefe Mundial) Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz vii Agradecimentos Existem ocasiões em que de facto devemos reconhecer e agradecer o apoio e carinho que outros nos dão. Por esta razão nesta dissertação, embora se trate de um documento de índole académica, não poderia já mais esquecer algumas pessoas sem as quais nunca o conseguiria ter terminado. Á minha família, mãe, Pai e irmão, que se fartaram de ouvir falar em mestrado e me empurraram na direção certa para o acabar. Aos meus amigos e colegas de curso, pela opinião sincera e ajuda. Á Professora Doutora Isabel Ferreira, que tão prontamente me acolheu e me propôs este belíssimo tema que tanto gosto me tem dado a escrever. Á minha orientadora Doutora Olga Viegas sem ela não conseguiria passar da teoria para a prática. A todos os colegas do departamento de Laboratório de Bromatologia e Hidrologia, em especial ao Doutor Armindo Melo pelo conhecimento e ajuda na determinação das antocianinas. A todos com quem trabalhei durante as duas vindimas na Quinta da Roeda, e em especial à D. Fátima e ao Sr. Machado, por aturarem os meus telefonemas, todos os meus devaneios durante as vindimas que fizemos juntos (espero que a essas se juntem muitas mais) e desvios ao seu trabalho para recolherem as minhas preciosas amostras, sem as quais não poderia realizar a parte prática deste mestrado. Ao Sr. David Guimaraens, pois se ele não desse a sua aprovação esta tese de mestrado nunca sairiam do papel. O meu mais profundo e sincero obrigada por tudo o que fizeram por mim. Espero um dia ser capaz de retribuir em igual ou superior dimensão e generosidade. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz ix Resumo O vinho do Porto é um dos produtos da gastronomia Portuguesa mais emblemático e a cor é um parâmetro relevante para a sua caraterização. Associado a esta estão os compostos fenólicos, nomeadamente, os flavonoides, com destaque para as antocianinas, como responsáveis não só pela cor, mas também pela atividade antioxidante. Neste trabalho foram estudadas amostras recolhidas em sete etapas da vinificação, fazendo parte de um lote de uvas que foram divididas por dois métodos, o tradicional em lagares de granito e a cuba mecânica. No presente estudo efetuou-se a avaliação do perfil de antocianinas, bem como a sua quantificação por HPLC-DAD, procedeu-se também à quantificação dos polifenóis totais e capacidade antioxidante recorrendo às técnicas em microplaca de DPPH e ABTS. Relativamente à avaliação colorimétrica as técnicas escolhidas foram, as coordenadas CIELab e as medições espectrofotométricas dos índices de Glories. A análise do perfil de antocianinas revelou que a Malvidina-3-glucósido foi a mais prevalente em todas as amostras, não obstante foram encontradas diferenças quantitativas em relação aos diferentes tipos de vinificação e as três primeiras etapas, já durante a maturação os valores foram similares. Este tipo de perfil foi também observado em relação às metodologias de quantificação de fenólicos totais e capacidade antioxidante. Na cor o que se observou foi que o parâmetro L* se manteve constante ao longo de toda a amostragem e que os parâmetros a* e b* estão interligados, no entanto os índices de Glories permitiram acompanhar mais adequadamente as modificações de cor que ocorreram. Observou-se que a %V foi a mais relevante e que influenciou grandemente a intensidade de cor. Palavras-chave: Antocianinas; Atividade antioxidante; Cor; Vinho do Porto Vinificação. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz xvi Tabela 22: Resultados obtidos para as diferentes técnicas de fenólicos totais (FolinCiocalteu) e de atividade antioxidante (DPPH e ABTS), em relação às diferentes etapas da maturação…………………………………………………………………………………………83 Tabela 23: Resultados obtidos correspondentes a cada uma das antocianinas identificadas para as diferentes etapas da vinificação…………………..……………………………………86 Tabela 24: Resultados obtidos correspondentes a cada uma das antocianinas identificadas, para as diferentes etapas da maturação……………………………………….88 Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz xvii Lista de Abreviaturas %A – Percentagem de Amarelo %B – Percentagem de Azul %Vol. – Grau Alcoólico Volumétrico %V - Percentagem de Vermelho 1O2 – Radical Oxigénio Singleto AAPH – Dicloro de 2,2’- azobis(2-amidinopropano) ABTS – Ácido 6-hidro-2-5-7-8-tetrametilcromo 2carboxílico ANOVA – Analysis of Variance (Análise de Variâncias) C18 – Octadecilsilano C.I.E. – Comission International d’Eclairage Cy-3-gluc – Cianidina – 3glucósido DAD – Diode ArrayDetector (Detetor de Díodos) DMPD – N,N – dimetil – ρ – fenilenodiamina DOC – Denominação de Origem Controlada Dp-3-gluc – Delfinidina-3-glucósido DOP – Denominação de Origem Protegida DPPH – 2,2difenil – 1picril – hidrazina ELISA – Enzyme Linked Immunoabsorvent Assay (Ensaio Imunoenzimático) EI – Electron Impact (Impacto de Electrões) ESI – Electrospray Ionization Source (Ionização Eletrospray) ET – Equivalentes de Trolox Fe3+-TPZ – Complexo Férrico – Tripiridiltriazina Fe2+-TPZ – Complexo Ferroso – Tripiridiltriazina FeCl3 – Cloreto Férrico FRAP – Capacidade de Redução Férrica GAE – Galic Acid Equivalentes (Equivalentes de Ácido Gálhico) GC – Gas Chromatography (Cromatografia Gasosa) HCl – Ácido Clorídrico HO2• - Radical Hidroperoxilo HO• - Radical Hidroxilo H2O2 – Peroxido de Hidrogénio HPLC –High Performance Liquid chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) IC – Intensidade de Cor IG – Indicação Geográfica LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade LBV - Late Bottle Vintage MSMass Spectrometry NO• - Óxido Nítrico ou Monóxido de Azoto NO2•- - Dióxido de Azoto NO2Cl – Cloreto de Nitrílo O2• - Radical Superóxido O.I.V. – Office International de La Vigne et du Vin ONOO- - Radical Peroxinitrito ORAC – Oxygen Radical Absorvance Capacity (Capacidade de Absorção de Radicais de Oxigénio) Pn-3-galac - Peonidina-3-glucósido Pt-3-gluc – Petunidina-3-glucósido RNS – Reactive Nitrogen Species (Espécies Reativas de Azoto) ROS – Reactive Oxigen Species (Espécies Reativas de Oxigénio) SO2 – Dióxido de Enxofre SPE – Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida) SPSSStatistical Package for the Social Sciences UV/VIS – Ultra Violeta/Visível Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 19 Objetivos Os objetivos desta dissertação de mestrado foram: - Conhecer a composição em polifenóis, atividade antioxidante e parâmetros de cor ao longo do processamento do vinho do Porto; - Comparar a composição do Vinho do Porto feito em lagar (procedimento tradicional) e outro feito em cuba mecânica (procedimento industrial moderno), a partir de um mesmo lote de uvas. Publicações desenvolvidas no decurso da preparação desta dissertação M. Queiroz, O. Viegas, A. Melo, I.M.P.L.V.O. Ferreira “Evolution of phenolic and anthocyanins in Port Wine” no IJUP’15 – 8º Encontro de Jovens Investigadores da Universidade do Porto – 12, 13 e 14 de Maio de 2015, na Reitoria da Universidade do Porto Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 21 Parte I Introdução 1.1 – O vinho em Portugal 1.2 - Região do Douro 1.3 – O Vinho do Porto 1.4 - Cor 1.5 - Compostos fenólicos no vinho 1.6 - Antioxidantes Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 23 1.1 – A Produção de Vinho em Portugal Crê-se que foram os Tartéssios o povo que cultivou a vinha pela primeira vez na Península Ibérica por volta de 2000 a.C.. Desde então os vários povos que por aqui passaram utilizaram o vinho não só para consumo próprio, mas também como moeda de troca no comércio e em cerimónias religiosas. Ao longo de milénios foram sendo adquiridos novos conhecimentos, práticas e técnicas na área. [1,2] Avançando até à época dos descobrimentos, tanto as caravelas, como as naus que partiam à descoberta transportavam nos seus porões vinho que lhes servia de lastro e moeda nas trocas comerciais com os povos do Oriente e do Brasil. O vinho que não era vendido, retornava aos produtores e por sofrer alterações vantajosas à sua qualidade durante a viagem, era vendido a preços mais elevados, razão pela qual em meados do século XVI, Lisboa se tronara o maior centro de consumo e distribuição de vinho de todo o Império. Mais tarde já no século XVIII, o Marquês de Pombal, instituiu uma série de medidas que incentivaram o desenvolvimento da vitivinicultura na região do Douro, na altura dominado pelos ingleses, fazendo desta a primeira região demarcada do país e do mundo e convertendo as exportações de Porto e Moscatel no ex-líbris português. [1,2] A segunda metade do século XIX, foi a mais nefasta para a vinha, pois esta foi atacada por pragas e doenças responsáveis pela diminuição da produção de vinho. A bem conhecida filoxera foi a mais devastadora de todas. Entre 1900 e 1986, Portugal sofreu várias alterações tanto ao nível da reorganização das regiões vitivinícolas, como também na criação de organismos reguladores e cooperativistas e ainda na modernização das técnicas de produção vinícola. Com a entrada para a União Europeia, foram introduzidas novas regras e metodologias a fim de se cumprir a regulamentação das políticas agrícolas Europeias e também favorecer a qualidade do vinho. [1,2] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 24 1.1.1 - O Consumo e Exportação de Vinho em Portugal O sector vitivinícola português transpõe um elevado interesse tanto pelo valor económico que gera como pelo papel que desempenha a nível social e de empregabilidade. De acordo com um estudo realizado pelo “Wine Institute”, Portugal apresenta-se bem qualificado quer a nível de exportações, que a nível de consumo de vinho per capita.[1,3] O vinho português tem conseguido afirmar-se a nível internacional por ser uma proposta única e diferenciadora, baseada na diversidade e singularidade das suas castas e dos seus terroirs, a que se associa uma qualidade muito consistente e uma excelente relação qualidade-preço. [1,3] Hoje a reputação internacional dos vinhos Portugueses é inquestionável. As exportações de vinho português demonstram também este dinamismo do sector, visto que registaram um desempenho bastante favorável nos últimos anos (Tabela 1). [1,3] Tabela 1: Resumo referente ao consumo e exportações portuguesas relativas respetivamente ao período de 2005 a 2015 e ano de 2014. (adaptado de http://www.viniportugal.pt/) [1] Milhares de hl 05/06 06/07 07/08 08/09 09/10 10/11 11/12 12/13 13/14 14/15 Produção 7266 7543 6073 5689 5894 7148 5622 63327 6231 6195 Consumo 5889 5666 5114 5392 5518 5450 5455 4523 4376 4234 Exportações 2014 Vinho Vinho Licoroso Vinho DOP Vinho IG Vinho espumante e espumosos Mostos/outros vinhos 283 154 112 82 4 3 Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 25 1.2 - A região do Douro A região do Douro é a mais antiga (1756) e emblemática, das regiões vitivinícolas demarcadas do nosso país, tendo adquirido por direito próprio a Denominação de Origem Controlada (DOC) para os Vinhos Comuns (mesa) e Especiais “Generosos” (Vinho do Porto). [2, 4] 1.2.1 - Localização Geográfica A região do Douro localiza-se no Nordeste de Portugal, na bacia hidrográfica do Douro, entre as serras do Marão a norte e Montemuro a sul, e desde Barqueiros a oeste até Mazouco a este (Figura 1). Fazem ainda parte desta região os afluentes do Douro, sendo os mais importantes o Tua e o Corgo. Possui uma área cerca de 250 000 hectares apesar de apenas cerca de 40 000 hectares serem de área vitivinícola. [4, 5] Figura 1 - Localização geográfica da Região Douro [5] Sendo a região do Douro muito vasta, esta encontra-se dividida em três sub-regiões, são elas: o Baixo Corgo, o Cima Corgo, sendo a junção destes também chamada de Alto Douro e o Douro Superior (Figura 2) que faz fronteira com Espanha. [2, 4, 5] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 32 garrafa, é produzido a partir de uvas de um único ano e engarrafado dois a três anos após a vindima, evolui gradualmente durante 10 a 50 anos em garrafa; Late Bottled Vintage (LBV) - é um Porto Ruby produzido a partir de uvas de um único ano, selecionado pela sua elevada qualidade engarrafado depois de um período de envelhecimento de entre quatro a seis anos; Porto (Vintage) Single Quinta Vintage - são vinhos de alta qualidade provenientes não só de um só ano mas também de uma só quinta. [4, 5, 14] No caso do Porto Tawny podem encontrar-se os seguintes tipos: Tawny Reserva - é um vinho envelhecido em madeira de carvalho, pode ser um vinho jovem ou com alguma idade (média de 6 anos), revelada também cores âmbar médio; Tawny 10 anos - é um vinho um pouco mais de evoluído do que o Porto Tawny Reserva, possuem semelhanças, embora com a garantia de que o vinho possui as características de um vinho com dez anos de idade; Tawny 20 anos - possui uma gama de cores que vão do âmbar avermelhado ao âmbar dourado, são vinhos raros, envelhecidos em pequenas pipas de carvalho; Tawny 30 anos - são vinhos selecionados para um envelhecimento mais longo em pipas de madeira; Tawny 40 anos -classificado com a idade mais elevada dos Portos Tawny apresenta-nos vinhos maravilhosamente concentrados e complexos; Porto Colheita - são Tawnies de uma só colheita, envelhecidos em cascos por um período mínimo de sete anos, originando vinhos com amplitudes de cor que vão do tinto aloirado ao aloirado, dependendo da sua idade. [4, 5, 14] No que toca aos brancos, este tipo de vinhos é normalmente identificado pela sua doçura, ou seja pela quantidade de açúcares nele contido podendo assim ser identificados os seguintes tipos: muito doce, doce, meio-seco, seco ou extra seco (Tabela 2).[4, 5, 14] Tabela 2: Caracterização dos vinhos brancos quanto à sua doçura, correspondência entre o tipo e o valor em g/L de açúcares presentes no mesmo. [4,5] Classe de doçura Valores extremos de massa volúmica a 20 °C (g/l) ºBaumé Açúcares (g/l) Extra-seco < 998 0,0 <40 Seco de 998 a 1008 0,0 - 1,3 40 - 65 Meio-seco de 1008 a 1018 1,4 - 2,7 65 - 90 Doce de 1018 a 1034 2,8 - 5,0 90 - 130 Muito doce > 1034 >5,0 >130 Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 33 Figura 6: Imagem representativa das várias tonalidades que o vinho do Porto pode adquirir, passando pelas castas brancas e tintas. [15] Quanto ao Porto Rosé este é um vinho que foi conseguido devido a uma nova técnica de vinificação capaz de tratar as uvas de castas tintas de uma forma semelhante à vinificação de um vinho branco, proporcionando um cor-de-rosa subtil e delicado ao vinho. Este método de vinificação extrai uma quantidade razoável de cor da película das uvas sem, no entanto, extrair os taninos adstringentes. A decantação a frio que antecede a fermentação a frio que são fundamentais para assegurar a frescura dos aromas a fruta e sua elegância. É um vinho do ano por isso não permanece durante longos períodos de tempo em estágio, e deve ser consumido no ano de aquisição. [11, 16] Quanto à sua classificação, no que respeita à cor, os vinhos do Porto podem ser identificados da seguinte forma (Figura 6): os Vinhos do Porto Tintos podem variar entre o retinto e o alourado-claro, sendo possíveis todas as tonalidades intermédias (tinto, tintoalourado, alourado e alourado-claro); os Vinhos do Porto Branco apresentam tonalidades diversas (branco pálido, branco palha e branco dourado), intimamente relacionadas com a tecnologia de produção. Quando envelhecidos em casco, durante muitos anos, os vinhos brancos adquirem, por oxidação natural, uma tonalidade alourada claro semelhante à dos vinhos tintos muito velhos. [4,5, 11] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 34 1.4 - Cor A luz visível é uma radiação eletromagnética, que se encontra numa faixa bastante estreita de comprimentos de onda (400-800 nm). Inclui o vermelho (~ 625 – 740 nm),laranja (~ 590 – 625 nm), amarelo (~ 565 – 590 nm), verde (~ 500 – 565 nm), ciano (~ 485 – 500 nm), azul (~ 440 – 485 nm) e termina no violeta (~ 380 – 440 nm) (Tabela 3).[17, 18] Tabela 3: Tabela de correspondência entre o comprimento de onda e as cores absorvidas e transmitidas do espectro do visível, adaptado de Juster. [18]  Comprimento de onda (nm) Cor Absorvida Cor Observada (transmitida) 400 Violeta Amarelo-esverdiado 425 Azul-escuro Amarelo 450 Azul Laranja 490 Azul-esverdiado Vermelho 510 Verde Roxo 530 Amarelo-esverdiado Violeta 550 Amarelo Azul-escuro 590 Laranja Azul 640 Vermelho Azul-esverdiado 730 Roxo Verde À absorção seletiva da luz visível por uma substância chama-se cor, não sendo porém a da luz absorvida, mas sim, da luz que a substância transmite ou reflete que conseguimos ver. Por esta razão, uma substância preta absorve todos os comprimentos de onda de luz visível. É importante reconhecer ainda que a cor não irá necessariamente depender em ter o comprimento de onda para a absorção máxima na região do visível, pois muitas substâncias com bandas de absorção largas têm uma absorvância abaixo de 400 nm e ainda aparecem fortemente coloridas devido às suas bandas de absorção se estenderem para o espectro visível (Tabela 3). [17, 18] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 35 1.4.1 - Cor nos Vinhos A cor dos vinhos é o parâmetro principal para a avaliação da sua qualidade, pois não só está dependente de muitos fatores, relativos à origem e produção, como é também um critério de aceitação do produto por parte do consumidor. Através dela podemos obter informações como a idade ou até a presença/ausência de alguns defeitos. [4,5,6] Para além de fatores como a casta e o seu porta-excerto, fatores ambientais como o clima e o solo e mesmo a tecnologia vitivinícola, a cor é também influenciada pelos compostos químicos provenientes da uva que lhe conferem pigmentação nomeadamente os compostos fenólicos como as antocianinas e outros. Estes pigmentos constituem uma família muito heterogénea de moléculas com vários mecanismos de formação que vão ser abordados com maior detalhe mais à frente. [4,5,18] 1.4.2 – Metodologias utilizadas para Avaliação da Cor do Vinho A fim de se realizar a caracterização da cor foram desenvolvidas várias metodologias que permitem uma melhor normalização dos parâmetros, estas metodologias incluem os índices de Sudraud, de Glories e o de Roubert, os parâmetros colorimétrios dos sistemas CIE e CIELAB e os métodos de Somers e Evans. Todas estas metodologias são baseadas em medidas espectrofotométricas com variações nas fórmulas e comprimentos de onda utilizados. [19, 20] O índice de Sudraud que é usado para calcular o tom do vinho, este compreende os comprimentos de onda de 420 e 520nm, pois dá maior importância aos tons vermelhos e amarelos. Para que se identifique então o tom de um vinho utiliza-se a fórmula T= (A420/A520) x 100. [19 -21] O índice de Glories efetua-se para calcular a intensidade de cor do vinho, é o método mais usado nas adegas e empresas vitivinícolas. Este compreende para além dos comprimentos de onda já referidos inclui o de 620 nm para que se incorpore o tom azul. A fórmula utilizada para tal é IC= A420 + A520 + A620. Glories determinou ainda as seguintes fórmulas para calcular o tom do vinho Tom= A420/A520, a percentagem de amarelo através da fórmula A%= [100xA420/IC], já para a percentagem de vermelho a fórmula que é utilizada é V%= [100xA520/IC], por outro lado a fórmula utilizada para a percentagem de azul é B%= [100xA620/IC]. Estas medições são realizadas através de medidas espectrofotométricas com percursos óticos de 2mm.[19, 23, 24] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 36 O índice de Roubert, faz referência ao número de cores e para esse efeito efetuam-se medidas nos comprimentos de onda de 625, 650 e 675nm. [21] Com os avanços da técnica e instrumentação de medição, é agora possível utilizar para a determinação da cor das amostras num curto espaço de tempo metodologias que aplicam aparelhos denominados colorímetros que para além de serem portáteis e de fácil utilização, os valores medidos podem ser facilmente traduzido em mudanças físicas. Neste contexto, as técnicas utilizam os sistemas CIE e CIELAB para a expressão de resultados, que de um modo geral compreendem as seguintes características básicas [21, 24, 26, 27]: Tonalidade – intervalo de comprimento de onda da cor apresentada; Brilho – corresponde à luminosidade, fazendo a cor parecer mais clara; Saturação – caracteriza o grau de pureza da amostra em análise. A metodologia de CIE, foi estabelecida pelo Office International de la Vigne et du Vin (O.I.V.) e determina-se através da transmitância por medições espectrofotométricas de tristimulus as coordenadas X, Y, e Z, as quais se vão depois transformar matematicamente em coordenadas de cor. Assim sendo, para o efeito são então determinados os comprimentos de onda de 445, 495, 550 e 625nm. [21, 24, 26, 27] Relativamente à metodologia de CIELAB (L*a*b), esta é muito semelhante à anterior usando no entanto coordenadas geométricas para a identificação dos parâmetros colorimétricos. Podemos então com isto fazer corresponder à coordenada L* a luminosidade que vai variar do valor de zero, como o tom menos luminoso, preto, ao valor cem (100) como sendo mais luminoso, incolor (L*= 0 preto e L*= 100 incolor). A coordenada a*, vai variar do sentido negativo (-a) para o positivo (+a) dos tons verdes para os tons vermelhos (a*> 0 vermelho e a*< 0 verde), e a coordenada b*, vai variar do sentido negativo (-b) para o positivo (+b) entre os tons azul e amarelo (b*>0 amarelo e b*<0 azul) (figura 7). [24, 25] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 37 Figura 7: Esquema representativo do método de coordenadas geométricas CIELAB coordenadas L*a*b, cores e luminosidade correspondentes. [28] Para além das coordenadas L*a*b, este método permite ainda calcular a saturação métrica C* através da fórmula [(a*)2+ (b*)2 ]0,5 e também o ângulo da matriz h através da fórmula h= arctan b*/a*, sendo que para um ângulo de 0º/360º denota-se o tom vermelho, para um ângulo de 90º denota-se um tom amarelo. Já para um ângulo de 270º é a aproximação ao tom azul e entre este e o 360º existe um aumento da intensidade da cor azul. Nos vinhos jovens, o ângulo de 350º é indicativo de uma matriz de tom violeta característico dos mesmos. [29-32] O método de Somers e Evans, também denominado de índice de ionização, permite conhecer os elementos contribuintes para a cor como as antocianinas e os compostos fenólicos. Para tal procede-se ao tratamento do vinho com um excesso de dióxido de enxofre (SO2), para que se conheçam os pigmentos SO2 – resistentes, e com um excesso de ácido clorídrico (HCl), para que obtenha uma indicação da concentração total de pigmentos vermelhos (520nm) e compostos fenólicos totais (280nm) e efetuamse ainda medidas nos comprimentos de onda de 520nm (pigmentos vermelhos) e 420nm (pigmentos amarelos/laranjas) antes da adição destes compostos. [20, 23] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 38 1.5 - Compostos Fenólicos no Vinho Os compostos fenólicos são constituintes importantes do vinho, em especial do vinho tinto. Quimicamente os fenóis são compostos que possuem um anel benzénico com um ou mais grupos hidroxilo. [33] Em termos de classificação os compostos fenólicos dividem-se em dois grandes grupos, os não flavonoides e os flavonoides. Dentro do primeiro grupo, encontramos os ácidos fenólicos que por sua vez se dividem em ácidos hidroxibenzóicos (ex.: ácido gálhico) e ácidos hidroxicinâmicos (ex.: ácido paracumárico), e também os estilbenos (ex.: resveratrol) (Figura 9). No segundo grupo podemos encontrar, as flavonas, os flavonóis, os favanonóis, as antocianinas e os flavan-3-oís. Estes flavan-3-oís podem por sua vez tomar a forma monomérica, oligomérica ou a forma polimérica, sendo as duas ultima também chamadas de proantocianidinas ou também de taninos condensados (Figura 8) [33]. Figura 8: Classificação química dos compostos fenólicos a sua divisão nos grandes grupos segundo os radicais e grupos funcionais que os constituem. Os compostos fenólicos são conhecidos por darem cor e sabor ao vinho, e também por possuírem propriedades antioxidantes, bactericidas, vitamínicas (vitamina E) e anti-inflamatórias. O seu consumo moderado está aparentemente associado a benefícios que protegem os consumidores de doenças cardiovasculares. Esses benefícios incluem a indução do relaxamento endotelial dos vasos dependente óxido nítrico; inibição dos efeitos da oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (que estão associadas a uma baixa incidência de doenças cardiovasculares); e a atividade anticancerígena. [34] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 39 A sua proveniência é variada e começa na planta (desde a videira, porta-excerto, casta até à película da uva) e podem ser obtidos em várias fases da vinificação, bem como ser alterados por fatores como o pH, tipo de tecnologia vitícola e fatores ambientais (clima e solo). [35, 36] A composição do vinho em fenólicos refletirá o efeito conjunto de todos os fatores mencionados anteriormente que permitem ter alguma perceção da idade, e evolução temporal assim como de possíveis defeitos que nele existam. [36] 1. 5.1 - Os Compostos não Flavonóides 1.5.1.1 - Ácidos Fenólicos São ácidos fenólicos de estrutura simples (Tabela 4) que derivam normalmente do ácido benzoico e do ácido cinâmico. Entre outros compostos que derivam do primeiro aquele que possui maior relevância é o ácido gálhico, que se encontra nas partes sólidas da uva sob a forma livre ou sob a forma de éster flavanol (ρ-epicatequina-3-O-galhato). Os mais numerosos e mais diversificados entre as espécies são os que derivam do ácido cinâmico, os ácidos cafeoil tartárico; ρ-cumaroil tartárico e feruloil tartárico, estando sob a forma de ésteres tartáricos trans. A forma isomérica cis também pode ser encontrada mas em muito menores quantidades. Podemos ainda encontrar ésteres de glicose como o ácido - ρ-cumárico e ferúlico. [33, 37] Estes compostos armazenam-se nos vacúolos das células da película e da polpa e são extraídos facilmente por esmagamento. [33,37] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 40 Tabela 4: Estrutura química de alguns exemplos de compostos fenólicos, pertencentes ao grupo dos Ácidos Fenólicos. [33,37] Deivados de* *Ácido Benzóico R1 R2 R3 R4 ρ – Hidroxibenzóico H H OH H Protocatecuico H OH OH H Vanílico H OCH3 OH H Gálhico H OH OH OH Siríngico H OCH3 OH OCH3 Salicílico OH H H H Gentísico OH H H OH *Ácido Cinâmico R1 R2 ρ-cumárico H OH Cafeico OH OH Ferúlico OCH3 OH Sinápico OCH3 OH *Ester Hidroxicinâmico R Ácido Trans – cafeiol tartárico OH Ácido Trans - ρ-cumaroil tartárico H Ácido Trans - feruliltartárico OCH3 1.5.1.2Estilbenos Os estilbenos são um pequeno grupo de fenilpropanóides de pequenas dimensões que derivam do ácido cinâmico e são caracterizados por possuírem uma estrutura 1,2 difenil-etileno (tabela 5). [33, 37,38] No caso da videira são produzidos na pelicula das uvas, nas folhas e nas raízes em resposta a infeções por diversos agentes patogénicos, danos causados por radiação ultravioleta (UV) ou outras condições de stress. [33, 37,38] Os estilbenos provenientes das uvas são considerados os mais importantes em termos dietéticos. O mais comum é o transresveratol, encontrando-se também presente o seu isómero cis, ambos na forma glicosilada. [33, 37,38] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 41 Tabela 5: Estrutura química dos estilbenos mais comuns nas uvas. [33,37,38] Estilbeno R1 R2 R3 Trans – resveratrol H H H Trans – resveratrol – 3 – O – glucósido H glc H Trans – resveratrol – 2 – C – glucósido H H glc Trans – astringina OH glc H Cis - resveratol 1.5.2 - Os compostos Flavonoides Os flavonoides são um grupo de compostos de baixo peso molecular, caracterizados por serem difenilpropanóides, C6-C3-C6, constituídos por dois anéis benzénicos que se encontram ligados por uma cadeia de três átomos de carbono, podendo ou não formar-se um terceiro anel, este irá ser chamado de anel heterocíclico (Figura 10). [33, 37, 39] Estes compostos são importantes antioxidantes pois possuem um elevado potencial redox que lhes permite atuar como agentes redutores e possuem ainda um potencial para quelatar metais. [33, 37, 39] No caso das uvas e dentro do grupo dos flavonóides podemos encontrar as seguintes subclasses de compostos, flavonas, flavonóis, flavan-3-óis, flavanonóis e antocianinas, a diferença entre cada um destes grupos será o número e posição dos radicais hidroxilo, metilo do anel benzénico B (figura 9). [33, 37, 39] Estes compostos encontram-se primeiramente na pelicula e nas sementes das uvas e menos frequentemente na haste, no caso dos flavonóis e das antocianinas estes compostos armazenam-se nos vacúolos celulares da pelicula das uvas. [33, 37, 39] Figura 9: Estrutura química geral de um flavonóide. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 48 As formas mais comumente encontradas destes compostos são distinguidas em dois grandes grupos as (+) catequinas e as (-) epicatequinas (figura 13). [33, 34,37] (+) catequina R1= OH; R2= H (-) epicatequina R1= H; R2= OH Figura 13: Estrutura química das catequinas e epicatequinas. Estas podem ainda distinguir-se em formas monoméricas, oligomérica e poliméricas, sendo que estas duas últimas também podem ser denominadas de taninos condensados ou proantocianidinas. [33, 34,37] As diferenças entre as (+) catequinas e as (-) epicatequinas encontram-se na natureza estereoquímica dos carbonos assimétricos do anel C (C2 e C3) bem como no grau de hidrolisação dos anéis A e B. Assim sendo as formas monoméricas dos flavan-3óis que podem ser encontradas nas vitis vinífera, (+) catequinas, (-) epicatequinas, são ortohidrolizadas em C’3 e C’4 do anel B, enquanto as (+) galhocatequinas e (-) epigalhocatequinas possuem um terceiro grupo hidroxilo na posição C’5 (Figura 14 e Tabela 11). [33, 34,37] (+) galhocatequina R1= OH; R2= H (-) epigalhocatequinas R1= H; R2= OH Figura 14: Estrutura química das galhocatequinas e epigalhocatequinas. Devido a estas variações os quatro monómeros podem ser grupados em dois grupos distintos denominados de pares diastereoisómeros, que são devidos aos dois centros moleculares assimétricos C2 e C3. As configurações desses grupos são então: 2R:3S para as (+) catequinas e (+) galhocatequinas, e 2R: 3R para as (-) epicatequinas e (-) epigalhocatequinas (Tabela 11). Podemos ainda dizer que a forma di-hidroxiladas as (-) epicatequinas podem ser esterificadas a partir do ácido gálhico na posição C3, o que resulta na (-) epicatequina-3-O-galhato. Podem ainda ser encontradas algumas formas Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 49 livres trihidroxilisadas de (+) galhocatequinas, (-) epicatequinas e (+) galhocatequina -3O-galhato distribuídas um pouco por toda a uva exceto nas grainhas. [33, 34,37] Tabela 11: Estrutura estereoquímica referente às formas monoméricas dos flavan-3-óis. Flavan-3-ol R1 C-2 C-3 (+) Catequina H R S (+) Galhocatequina OH R S (-) Epicatequina H R R (-) Epigalhocatequina OH R R Os taninos condensados (proantocianidinas) são oligómeros que surgem após a polimerização dos monómeros, por isso possuem alto peso molecular e são incolores sendo detetados a um comprimento de onda de 280 nm (na gama do ultravioleta). Estes compostos possuem a propriedade de libertar antocianidinas em condições ácidas aquecidas como resultado de clivagem nas ligações interflavílicas. [34,37, 38] Podemos distinguir as proantocianidinas em dois grupos dependendo da antocianidina libertada (cianidina ou delfinidina) são eles: procianidinas compostas por, (+) catequinas e (-) epicatequinas que derivam de catequinas e epicatequinas e do seu estér gálhico, e prodelfinidinas compostas por, (+) galhocatequinas e (-) epigalhocatequinas, estes últimos estão presentas nas grainhas mas ambos podem ser encontrados na película da uva (Tabela 12). [34,37, 38] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 50 Tabela 12: Estrutura química de antocianidinas e os seus radicais. Além desta distinção podemos ainda caracterizar as proantocianidinas pelo seu comprimento de cadeia e pela sua ligação interflavílica. Em relação ao primeiro, o termo “oligómero” é aplicado à maior cadeia de uma mistura e que pode corresponder a uma proantocianidina que possua um grau de polimerização médio de 2 a 5 unidades, que lhe permite ser bem separada e identificada. Já o termo “polímero”, é aplicado a proantocianidinas com um grau de polimerização superior a 5 unidades e que, por isso, não permite nem uma boa separação, nem uma boa identificação devido ao grande número de isómeros possível de ser formado. [34,37, 38] Em relação a ligação interflavílica, para caracterizar as proantocianidinas, podemos classificar as antocianidinas como sendo do tipo B, onde a ligação dos monómeros é feita através da posição C-4 da unidade de topo e o carbono C-6 ou C-8 da unidade terminal. Predominam os isómeros C-4 e C-8, em relação os isómeros C-4 e C6. As do tipo A podem conter dois tipos de ligações entre o carbono C-2 da unidade de topo e o grupo hidroxilo no carbono C-5 ou C-7 da unidade inferior. [34,37, 38] Antocianidinas R1 R2 Cianidina OH H Delfinidina OH OH Peonidina OCH3 H Petonidina OCH3 OH Malvidina OCH3 OCH3 –CO-CH3 (acetilo) R3 Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 51 1.5.3 - Metodologias de Análise dos Compostos Fenólicos no Vinho O teor de polifenóis totais ou índice de compostos polifenólicos é normalmente determinado em vinhos fortificados, utilizando o método de Folin-Ciocalteu, que é o reconhecido pela O.I.V. (L'Organisation Internationale de la Vigne et du Vin), utilizando o ácido gálhico como padrão. Este método baseia-se na redução do complexo fosfovolframite-fosfomolibdato pelos fenóis com a formação de produtos de reação de cor azul, a partir dos quais se vai medir a absorvância aos comprimentos de onda de 700 ou 750nm. Os resultados desta medição são depois expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálhico (GAE) por litro. [34,37, 38, 42] Geralmente, o ácido gálico é um dos compostos fenólicos que apresenta valores mais elevados para os vinhos fortificados. No caso específico do vinho do Porto, ácido siríngico, ácido cis-cafeoil tartárico, rutina, tirosol, epicatequina e catequina também são importantes quantitativamente. [34,37, 38,42] Quanto às metodologias, as técnicas cromatográficas são as mais utilizadas tanto para a quantificação como para identificação. No entanto nem todas são empregadas, sendo a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC - high-performance liquid chromatography) a que se destaca. No que respeita ao detetor, o mais usado é o detetor de díodos (DAD), e a espectrofotometria de massa incluindo ESI-MS (electrospray ionization source) (Tabela 13). [34,37, 38, 43] No que respeita a técnicas separativas, observou-se que a cromatografia gasosa é também uma das escolhidas tanto para a quantificação como identificação destes compostos, estando na maioria dos casos acoplada com um detetor de massa, e para um estudo mais aprofundado em termos estruturais destes composto surge a cromatografia gasosa por impacto eletrónico equipado com espectrómetro de massas (GC/EI-MS - gas chromatographyelectron impact mass spectrometry). No entanto, em ambas as metodologias, é necessário proceder a uma purificação dos compostos devido ao facto de existirem interferentes, tais como açúcares nas amostras originais, para tal é usada a extracção em fase sólida (SPE - solid phase extraction), recorrendo normalmente a colunas extrativas de octadecilsilano (C18). [34,37, 38, 43] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 52 Tabela 13 – Resumo dos compostos fenólicos que podem ser encontrados no Vinho do Porto com recurso a diferentes metodologias analíticas. [34,37, 38, 42,43] Metodologia HPLCDAD RPHPLC UPLCDAD Electroforese capliar HPLC/MS Ácido 3,4-dihidroxibenzóico   Ácido cafeíco    Catequina   Ácido cis-cafeoil tartárico  Ácido cis-cumaroil tartárico   Cis - resveratrol - 3 - s - beta – glucósido   Cis-resveratrol   Epicatequina     Ácido gálhico     Miricetina    Ácido cumárico      Rutina   Ácido siríngico      Trans-astringíco  Ácido trans-cumaroil tartárico   Transresveratrol - 3 - s - beta – glucósido   Trans-resveratrol    Tirosol     Ácido valínico     No entanto há ainda outras metodologias, que ainda se enquadram nas técnicas separativas mas que são menos comuns, são o caso das eletroforeses. Nesta classe de metodologias podemos também encontrar vários tipos de procedimentos, são exemplo disso, a eletroforese capilar, a eletroforese capilar de zona e a eletroforese capilar em gel. [34,37, 38, 43] Podemos ainda falar de outras metodologias que podem ainda ser utilizadas como a técnica de ELISA (ensaio imunoenzimático), as medidas de fluorescência e as medidas espectrofotométricas simples para quantificação de fenóis e/ou antocianinas totais. [34,37, 38, 43] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 53 1.6 - Antioxidantes Os radicais livres podem ser definidos como pequenas moléculas altamente reativas, orgânicas e inorgânicas que contêm um ou mais eletrões desemparelhados na orbital eletrónica mais externa. Estas moléculas para além do facto de serem altamente reativas, são quimicamente instáveis, possuem também um tempo de semivida muito curto e são considerados importantes para em algumas funções fisiológicas, nomeadamente no envelhecimento, cancro, arteriosclerose, inflamação, entre outros. [44, 45] Os radicais livres podem ser formados endogenamente, mais concretamente no citoplasma, na mitocôndria ou na membrana celular por diversas vias, podem também surgir ainda pela respiração aeróbia e inflamações ou podem também ser geradas por fatores exógenos, tais como radiação UV (ultra violeta), radiação gama, medicamentos, ozono, dieta e tabaco entre outos. [44, 45] Entre os mais importantes encontramos as espécies reativas do oxigénio (ROS) e as espécies reativas do azoto (RNS). Sendo que nos primeiros encontramos as partículas, radical superóxido (O2-•); radical hidroperoxilo (HO2•); radical hidroxilo (HO•); peroxido de hidrogénio (H2O2) e por último o radical oxigénio singleto (1O2). Por outro lado nas espécies reativas de azoto podemos encontrar: o óxido nítrico (NO•); o dióxido de azoto (NO2•); o cloreto de nitrilo (NO2Cl) e o radical peroxinitrito (ONOO-). [45, 46, 47] Quando existe um excesso destas espécies no organismo este encontra-se sob stress oxidativo, ou seja existe um predomínio de espécies oxidativas que consequentemente vão provocar danos nas células. Se este stress for moderado um organismo saudável vai conseguir reestabelecer rapidamente o equilíbrio através das defesas antioxidantes, nomeadamente: os mecanismos de prevenção; os mecanismos de reparação; as defesas físicas e defesas antioxidantes. [45, 46, 47] Estas partículas antioxidantes, podem ser definidas como substâncias que presentes em baixas concentrações quando comparadas com a do substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação desse mesmo substrato de maneira eficaz. [45, 46, 47] Existem duas classes de antioxidantes, os antioxidantes naturais e os antioxidantes sintéticos. Os primeiros podem ser definidos como moléculas com diferentes pesos moleculares, diferente composição e estado químico, diferente mecanismo e local de ação e que se subdividem nas seguintes categorias: antioxidantes enzimáticos, antioxidantes de baixo peso molecular, antioxidantes solúveis em lípidos e antioxidantes solúveis em água. [45, 46, 47] Dentro desta categoria, podemos encontrar como exemplo os precursores algumas vitaminas como a A, a E e ainda alguns pigmentos como os carotenoides que vão ser Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 54 essenciais para a proteção da nossa pele contra os efeitos nefastos da radiação UV e efeitos da idade. [45, 46, 47] Já os antioxidantes sintéticos são definidos como, substâncias químicas sintetizadas artificialmente e aprovadas por organismos institucionais, como por exemplo a Food and Drug Administration e que podem ser usados em alimentos. [45, 46, 47] 1.6.1 - Antioxidantes no Vinho As uvas bem como outros produtos derivados, o vinho, o sumo de uva entre outros, são considerados como uma das maiores fontes de compostos fenólicos existentes na natureza. Estes compostos, na forma de ácidos fenólicos, como o ρcumárico, cinâmico, cafeíco, ferúlico e vanílico (Tabela 4); flavonoides, mais concretamente catequina, epicatequina (Figura 13); procianidinas (Tabela 12); antocianinas (Figura 11, Tabela 9), e resveratrol, são de acordo com a literatura cientifica aqueles que possuem maior atividade antioxidante. Os antioxidantes estão associados nomeadamente à capacidade de melhorar a qualidade dos alimentos, proporcionar-lhe melhor estabilidade bem como baixar os valores de LDL (lipoproteína humana de baixa densidade) e colesterol. [48, 49] Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 55 1.6.2 - Metodologias Analíticas para Análise de Antioxidantes no Vinho No que toca a metodologias, a literatura ilustra várias técnicas, nomeadamente técnicas espectrofotométricas e técnicas de HPLC com extratos alcoólicos para determinação tanto qualitativa, como quantitativa de compostos fenólicos totais e flavonoides, conteúdo em antocianinas totais e monoméricas. Em ambas as metodologias os comprimentos de onda selecionados são os seguintes: 280, 320, 360 nm para os compostos fenólicos e 520 e 700 nm para as antocianinas. [50-53] No entanto existem outras metodologias que incluem também medições espectrofotométricas mas que se baseiam em reações químicas. Nesta categoria pode ser inserido o método do DPPH (2,2–difenil–1–picril–hidrazina) que tem por base a redução deste mesmo radical pelos antioxidantes com mudança de coloração do violeta para o amarelo, assim sendo quanto maior for o efeito antioxidante, mais rapidamente se dá a alteração na cor. [50-53] O método de ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), que se baseia na formação deste mesmo radical a partir do ácido 2,2-azino-bis(3etilbenzotiazolin)-6-sulfónico, seu percursor, através de reações químicas ou enzimáticas colorimétricas que são lidas a 414 nm, podendo também proceder-se a medições secundárias aos comprimentos de onda de 645, 734, 754 e 815 nm. [50-53] Uma outra metodologia de deteção de capacidade antioxidante utilizada em vinho é o método de ORAC (capacidade de absorção de radicais de oxigénio), que se baseia na leitura da diminuição da fluorescência de proteínas (Bficoeritrina e R-ficoeritrina). Nesta metodologia o radical peroxil (•OH) vai ser formado através da reação do AAPH [dicloro de 2,2’-azobis(2-amidinopropano)] com o oxigénio atmosférico que irá formar um composto não fluorescente contrariamente ao indicador utilizado. A medição dessa mesma fluorescência pode ser feita a 575 nm quando é utilizada a proteína B-ficoeritrina como indicador e 578 nm quando é utilizada a R-ficoeritrina. [50-53] A técnica de FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power), baseia-se na medição direta da coloração que é obtida através da reação de redução do complexo férricotripiridiltriazina ( Fe 3+- TPZ) a complexo ferroso (Fe 2+- TPZ) em condições ácidas (pH= 3,6). A leitura da cor azul intensa do complexo é feita a na absorção máxima a 593 nm. [50-53] Uma outra metodologia é DMPD (N,N-dimetil-ρ-fenilenodiamina). Esta é menos usada devido a críticas que indicam interações com os metais constituintes integrais de frutos e vegetais. Esta metodologia baseia-se na produção do catião radical do DMPD o Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 56 qual vai formar um composto de cor violeta quando reage com FeCl3 (cloreto férrico) a pH ácido. [50-53] Para além das metodologias descritas, existem ainda muitas outras que se baseiam em princípios semelhantes, quer no que toca ao tipo de reação, como ao tipo de deteção usado, quer até no sistema usado (micro placa ou cuvete) (Tabela 14). [50-53] Tabela 14Resumo das metodologias espectrofotométricas utilizadas para a determinação da capacidade antioxidante em amostras de sumos de fruta e bebidas adaptado de Pisoschi & Negulescu 2011.[50] Nome da metodologia Descrição Tipo de determinação DPPH Reação antioxidante com um radical orgânico. Colorimétrica ABTS Reação antioxidante com um radical catiónico orgânico. Colorimétrica FRAP Reação antioxidante com um complexo de Fe(III). Colorimétrica PFRAP Redução do Ferrocianeto de Potássio pelos antioxidantes e reação subsequente do Ferrocianeto de Potássio com Fe3+. Colorimétrica CUPRAC Redução Cu(II) a Cu(I) pelos antioxidantes. Colorimétrica ORAC Reação antioxidante com radicais peróxido, induzidos pelo APPH (2,2’- azobis-2amidino-propano). Perda de fluorescência da fluoresceína HORAC Capacidade antioxidante dos radicais OH para eliminar radicais gerados pelo Co(II) num sistema Fenton. Perda de fluorescência da fluoresceína TRAP Capacidade antioxidante para eliminar radicais derivados de luminol, gerados pela decomposição do AAPH. Perda de quimiluminescência Fluorimetria Emissão de luz por uma substancia que absorveu luz ou outra radiação eletromagnética de comprimento de onda diferente. Gravação dos espectros de excitação de fluorescência / emissão Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 57 Parte II Materiais e Métodos 2.1 – Material 2.2 – Amostragem e preparação das amostras 2.3 – Procedimentos experimentais 2.4 – Análise estatística dos resultados obtidos Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 64 2.3.2 – Fenólicos Totais e Atividade Antioxidante 2.3.2.1 – Pré-tratamento da Amostra Tendo em conta que as amostras recolhidas apresentavam muitas partículas sólidas foi necessário realizar a extração dos compostos fenólicos e com atividade antioxidante das mesmas. Para tal mediram-se 3 ml de amostra e a esta foram adicionados 3 ml de etanol 50% (v/v). Esta solução foi então colocada a centrifugar a 5000 rpm durante 20 minutos. Após esta primeira extração, foi recolhido o sobrenadante e ao resíduo sólido foram adicionados novamente 3 ml de etanol 50% e centrifugado com as condições descritas anteriormente. O sobrenadante desta segunda centrifugação foi retirado e adicionado ao anterior e o volume foi ajustado até aos 9 ml. No final da extração consideramos então que a amostra se encontra diluída na proporção 1:3. 2.3.2.2 – Fenólicos Totais (Folin-Ciocalteu) Para a determinação dos fenólicos totais a reação e leitura foram realizados em microplaca de 96 poços, baseado na técnica de Magalhães et al. [55] com modificações. Resumidamente, na placa de 96 poços colocaram-se 75 µl de amostra pré-tratada e foram feitas diluições sucessivas entre 1:48 e 1:3072. Nos poços destinados à curva de calibração do padrão, colocou-se padrão de ácido gálhico na concentração de 31,25 mM e 500 mM (solução mãe a 1mM, 170,12mg/L em água), adicionaram-se em todos mais 25 µl de reagente de Folin (2 N 4:10, v/v) e a placa foi colocada no espectrofotómetro durante 10 minutos para agitação e incubação. Após a incubação foram adicionados 100 µl de carbonato de sódio (6% w/v) em todos os poços da placa. A ação dos compostos foi monitorizada a 765 nm a cada minuto durante 120 min (Figura 17 e Figura 18). Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 65 Folin - Ciocalteu Padrão 75µl H2O + 75µl de Padrão de Ácido Gálhico Adicionar depois 25µl de reagente de Folin Fazer diluições a partir do 1º poço com 75µl Rejeitar os últimos 75µl Branco 75µl de H2O + 25µl de reagente de Folin Amostra 75µl H2O + 75µl Amostra Fazer diluições com 75µl Rejeitar os últimos 75µl 1ª e 2ª fila colocar 25µl de reagente de Folin 3ª fila colocar 25µl de H2O Todos os poços levam 100µl de NaCO3 no final Figura 17: Fluxograma explicativo do procedimento executado para a realização da metodologia de Folin – Ciocalteu realizada em microplaca de 96 poços. Figura 18: Esquema da configuração da placa utilizada para a deteção de fenólicos totais. Em que, S1Padrão a 500mM;S2 - Padrão a 250mM; S3Padrão a 125Mm; S4Padrão a 62,5mM; S5 - Padrão a 31,25mM; BBranco; A1 – Amostra 1; RA1Réplica da Amostra 1; BA1Branco da Amostra 1; A2Amostra 2; RA2Réplica da Amostra 2; BA2Branco da Amostra 2; A3 – Amostra 3; RA3Réplica da Amostra 3; BA3Branco da Amostra 3; A4 – Amostra 4; RA4Réplica da Amostra 4; BA4Branco da Amostra 4; A5 – Amostra 5; RA5Réplica da Amostra 5; BA5Branco da Amostra 5; A6 – Amostra 6; RA6Réplica da Amostra 6; BA6Branco da Amostra 6; A7 – Amostra 7; RA7Réplica da Amostra 7; BA7Branco da Amostra 7; Os poços que se encontram sombreados a cinzento não são utilizados. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 66 2.3.2.3 - DPPH (Atividade Antioxidante) Para a determinação da atividade antioxidante pelo método de DPPH, foi baseado em Magalhães et al. [55] Viegas et al. [56], realizado em microplaca de 96 poços (Figura 19 e Figura 20); Para a construção da curva de calibração foi utilizado o padrão Trolox (solução mãe a 1mM, 250,3mg/L em etanol 50%) foram carregados com 100 µl de etanol absoluto e 100 µl de solução padrão de diluídos entre 15,62 mM e 250 mM. Nos poços de amostra foram colocados no primeiro poço 200 µl de amostra e nos restantes 100 µl de etanol 50% e as diluições foram feitas a partir do primeiro poço com 100 µl (1:24 e 1:768), após esta etapa foram adicionados às primeira e segunda filas 100 µl de DPPH (1mM, 5,9mg/50ml em etanol absoluto) e na terceira 100 µl de etanol absoluto. O branco foi efetuado com 100µl de etanol 50% e 100µl de etanol absoluto, já os poços de DPPH controlo foram efetuados com 100 µl de etanol 50% e 100 µl de DPPH. A adição do DPPH foi efetuada no final a quando da introdução na placa no leitor, esta ficou então a ler a cada minuto durante 120 minutos, a um comprimento de onda de 517nm. Posteriormente foi avaliado maior tempo de cinéticas (até 240 min) de acordo com, Carmona-Jiménez et al. [57]. Também foram efetuadas diluições e cinética de reação em eppendorf (em vez de placa), mantendo as proporções dos reagentes fazendo leituras em placa ao fim, 120, 240 e 300 min. O volume final transposto na placa manteve-se igual ao descrito no protocolo a cima referido. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 67 DPPH Padrão 100µl EtOH Absoluto + 100µl de Trolox Fazer diluições a partir do 1º poço com 100µl Rejeitar os últimos 100µl Branco 100µl de EtOH absoluto + 100µl de EtOH 50% Amostra 200µl Amostra no 1º poço 2º a 6º poço 100µl de amostra + 100µl de EtOH 50% Fazer diluições com 100µl Rejeitar os últimos 100µl 3ª fila colocar 100µl de EtOH absoluto 1ª e 2ª fila colocar 100µl de DPPH Todos os poços levam 100µl de DPPHno final Figura 19: Fluxograma explicativo do procedimento executado para a realização da metodologia de DPPH. Figura 20: Esquema da configuração da placa utilizada na metodologia de DPPH. Em que, S1Padrão a 250mM; S2 - Padrão a 125mM; S3Padrão a 62,5Mm; S4Padrão a 31,25mM; S5 - Padrão a 15,62mM; BBranco; DPPHDPPH controlo; A1 – Amostra 1; RA1Replica da Amostra 1; BA1Branco da Amostra 1; A2Amostra 2; RA2Replica da Amostra 2; BA2Branco da Amostra 2, A3Amostra 3; RA3Replica da Amostra 3; BA3Branco da Amostra 3, A4Amostra 4; RA4Replica da Amostra 4; BA4Branco da Amostra 4, A5Amostra 5; RA5Replica da Amostra 5; BA5Branco da Amostra 5, A6Amostra 6; RA6Replica da Amostra 6; BA6Branco da Amostra 6 e A7Amostra 7; RA7Replica da Amostra 7; BA7Branco da Amostra 7. Os poços que se encontram sombreados a cinzento não são utilizados. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 68 2.3.2.4 – ABTS (Atividade Antioxidante) No que toca ao procedimento experimental, este foi realizado em microplaca (Adaptado de Magalhães et al. [55, 58]), sobe as seguintes condições (Figura 21, 22 e 23). Relativamente à solução de trabalho de ABTS*+ (3,5 mM), foi feita 12-16h antes da análise juntando ABTS (96mg/25mL 7mM em água) com persulfato de potássio (2,45 mM) 1:1. Antes da análise foi preparada a solução de ABTS*+ mediante resultado da leitura das absorvâncias a 734 nm (0,8 ± 0,02). Na microplaca de 96 poços, colocaram-se em todos os poços de padrão foram carregados com 150 µl de água e 150 µl de solução padrão de Trolox (solução mãe a 1mM, 250,3mg/L em etanol 50%) diluídos entre 3,91mM e 500mM. Nos poços de amostra foram colocados no primeiro poço 300 µl de amostra e nos restantes 150 µl de água e as diluições foram feitas a partir do primeiro poço com 150 µl (1:48 e 1:3072), após esta etapa foram adicionados às primeira e segunda filas 150 µl de ABTS*+ e na terceira 150 µl de água. O branco foi efetuado com 150 µl de água e 150 µl de tampão acetato, já os poços de ABTS controlo foram efetuados com 150 µl de tampão acetato e 150 µl de ABTS*+. A adição do ABTS*+ foi efetuada no final a quando da introdução da placa no leitor, tendo sido efetuadas leituras a T0 e T5h (300min), ao comprimento de onda de 734nm. Figura 21: Fluxograma explicativo do procedimento executado para a preparação da solução de trabalho de ABTS*+. ABTS (7mM) em H2O Persulfato de Potássio (2,45mM) ABTS*+ (3,5mM) ABTS* + Abs = 0,8 ± 0,02) Tampão Acetato Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 69 Figura 22: Fluxograma explicativo do procedimento executado para a realização da metodologia de ABTS*+. Figura 23: Esquema da configuração da placa utilizada na metodologia de ABTS. Em que, SPadrão; BBranco; ABTSABTS controlo; A1 – Amostra 1; RA1Replica da Amostra 1; BA1Branco da Amostra 1; A2Amostra 2; RA2Replica da Amostra 2; BA2Branco da Amostra 2; A3 – Amostra 3; RA3Replica da Amostra 3; BA3Branco da Amostra 3; A4 – Amostra 4; RA4Replica da Amostra 4; BA4Branco da Amostra 4, A5 – Amostra 5; RA5Replica da Amostra 5; BA5Branco da Amostra 5, A6 – Amostra 6; RA6Replica da Amostra 6; BA6Branco da Amostra 6 e A7 – Amostra 7; RA7Replica da Amostra 7; BA7Branco da Amostra 7. Os poços que se encontram sombreados a cinzento não são utilizados. ABTS Padrão 150µ de H2O + 150µL de Trolox Fazer diluições a partir do 1º poço com 150µl Fazer diluições a partir do 1º poço com 100µl Branco 150µl de H2O + 150µl de tampão acetato Amostras 3ª fila colocar 150µl de tampão acetato 1ª e 2ª fila colocar 150µl de ABTS 300µl Amostra no 1º poço 2º a 6º poço 150µl de amostra + 150µl H2O Fazer diluições com 150µl Rejeitar os últimos 100µl Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 70 Antocianinas Medir rigorosamente 10mL de amostra Adiconar 10ml de ácido clorídrico em metanol 0,1% colocar em agitação magnética 10min ao abrigo da luz. transferir e centrifugar (20min a 8000rpm) transferir o sobrenadante para o balão de 20mL e acertar o volume ao menisco com MeOH (grau de HPLC) 2.3.3 – Composição em Antocianinas Na Identificação e quantificação das antocianina, mediu-se rigorosamente 10 ml de amostra para um balão volumétrico de 20 ml e adicionaram-se até à marca ácido clorídrico em metanol 0,1% (v/v), esta mistura foi colocada em agitação magnética durante 10 minutos sempre ao abrigo da luz. Após este período de tempo o magneto foi retirado e o conteúdo do balão foi transferido para o tubo de centrífuga, sendo colocado a 8000 rpm durante 20 minutos (Figura 24). (Adaptado de Pinho et al.) [59] Após esta etapa, o sobrenadante foi recolhido e novamente colocado num balão de 20 ml acertando-se o volume até à marca com metanol HPLC. Estas alíquotas foram depois colocadas a -20ºC até à altura da sua análise por HPLC. Figura 24: Fluxograma resumo explicativo da preparação das amostras para a metodologia de antocianinas. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 71 As condições da separação cromatográfico foram também adaptadas de Pinho et al. [59] e de Gouvêa et al.,2015 [60], sendo que o volume foi de 20µl na coluna aquecida a 40ºC, utilizando como eluentes, A 10% ácido fórmico aquoso (90:10; v/v) e B uma mistura de ácido fórmico/água/metanol (10:40:50 v/v/v). Relativamente ao gradiente usado foi o seguinte, 20% durante 3 minutos solvente B, 30% em 15 min e por 2 min de solvente B, 60% em 15 min e por 2 min de solvente B e finalmente 20 % em 5 min e por 8 min de solvente B, assim sendo a corrida fica com uma duração total de 50 minutos mas que foi entretanto alterada para 48 min, as amostras foram sempre executadas em triplicado (Tabela 16). Tabela 16: Programa utilizado para o gradiente da corrida de HPLC-DAD da quantificação e identificação de antocianinas. Gradiente Tempo /min B (% )/A 0-3 20 15 30 15-17 30 30 60 30-32 60 40 20 Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 72 2.4 – Análise Estatística dos Resultados Obtidos Os valores obtidos a partir dos resultados experimentais de todas as técnicas analisadas foram estatisticamente analisados através do programa SPSS 22.0 para o Windows e pelo Microsoft Excel 2010. A ANOVA TWO-WAY, foi aplicada neste trabalho para discriminar as amostras em função do tipo e tempo de processamento. A ANOVA ONE-WAY, foi utilizada para avaliar diferenças significativas de evolução/alteração para as amostras da maturação em cada uma das diferentes técnicas utilizadas neste trabalho. O teste de Tukey foi aplicado para verificar o nível de significância das amostras em função do tipo e tempo de processamento e técnicas usadas nas diferentes determinações. O teste de correlação de Pearson foi aplicado para verificar a eficiência das diferentes técnicas utilizadas para a determinação de fenólicos totais e atividade antioxidante. O estudo das médias marginais estimadas relativas, foi realizado para visualizar a evolução ao longo das etapas do processamento. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 73 Parte III Resultados e Discussão 3.1– Colorimetria 3.2 – Fenólicos Totais e atividade antioxidante 3.3 – Composição em antocianinas Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 80 sinergismos entre as cores que compõem o vinho, fazendo com que este perca alguma luminosidade devido à sua cor, apesar de límpida, apresentar uma tonalidade mais escura que a inicial. Segundo os autores, Figueiredo-González et al. [62] e Alañón et al. [67] a diminuição que é observada para o parâmetro a* ao longo de todo o processo de vinificação independentemente do tipo, pode ser explicada pela diminuição da quantidade de antocianinas presentes no vinho e pela interação destas com condições oxidativas às quais o vinho é exposto. No entanto ao observar-se atentamente o parâmetro a* e o parâmetro b* (Figura 29 e 30) pode verificar-se que a evolução de ambos está interligada e que segundo Lago-Vanzela et al. [65] e Santos-Buelga & de Freitas [66], pode indicar que a cor do vinho está a transformar-se de um vermelho rosado claro para um vermelho escuro e mais acastanhado, devido à perda de copigmentação azul que com o tempo se vai transformando em nuances amarelas. Figura 29: Gráfico de linhas que compara as medições das coordenadas a* e b* para as amostras das etapas de vinificação. Os valores apresentados são referentes às médias de amostras repetidas em triplicado. C – Cuba e L – Lagar. -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 C1 C2 C3 L1 L2 L3 Amostras comparação das coordenadas a* e b* para as etapas de vinificação a* b* Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 81 Figura 30: Gráfico de linhas que compara as medições das coordenadas a* e b* para as amostras das etapas de maturação. Os valores apresentados são referentes às médias de amostras repetidas em triplicado. MMaturação Uma análise geral de todos os parâmetros de cor medidos indica que estes sofreram poucas variações, (Tabelas 19 e 20) o que segundo Ho et al. [28], se deve ao facto de vinhos maturados em cubas de inox por oposição a cascos de carvalho ou garrafa estão menos expostos a reações de oxidação redução e oxigénio dissolvido e assim o vinho conseguir manter a sua cor mais vermelha durante mais tempo do que a castanha, encontrada nos vinhos que maturam e envelhecem em cascos de carvalho. -0,1 -0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 M1 M2 M3 M4 Amostras comparação das coordenadas a* e b* para a maturação a* b* Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 82 3.2 - Fenólicos Totais e Atividade Antioxidante Relativamente ao teor em fenólicos totais foi determinado através da metodologia de Folin-Ciocalteu e para a atividade antioxidante, foram realizadas as metodologias de DPPH, ABTS. Considerando a análise das três técnicas em simultâneo pôde-se verificar que os valores obtidos revelaram um perfil relativamente idêntico ao longo do tempo (Tabela 21) sendo que para o DPPH os valores oscilaram entre 7,78 e 17,17 mM de equivalentes de Trolox (ET), já para o ABTS estes variaram entre 10,31 e 40, 37 mM ET, no que toca aos fenólicos totais os valores rondaram os 5,09 e 16,76 desta vez em mM de equivalentes de ácido gálhico (EAG), para as etapas C1 a C3 (cuba) e L1 a L3 (lagar). Estes valores estão concordantes com a literatura encontrada tanto para ensaios como para amostras semelhantes. [55, 68] Tabela 21: Os resultados apresentados na tabela são referentes a valores médios ± desvio padrão para amostras repetidas em triplicado e para as diferentes técnicas de fenólicos totais (Folin-Ciocalteu) e de atividade antioxidante (DPPH e ABTS). 1mM de EAG; 2mM de ET, em relação às diferentes etapas da vinificação. Ccuba; Llagar. Folin-Ciocalteu1 DPPH2 ABTS2 C1 5,09±0,28 7,78±0,80 10,31±0,54 C2 8,7±0,32 9,25±0,97 19,51±0,82 C3 10,36±0,34 15,04±0,96 42,67±2,55 L1 10,49±0,58 16,87±0,51 33,23±0,43 L2 14,53±0,69 17,17±1,41 28,83±0,17 L3 16,76±0,86 16,72±0,42 40,37±0,33 Através da observação da tabela (Tabela 21) podemos visualizar, uma clara distinção entre o tipo de processamento nas três primeiras etapas (C1 e L1; C2 e L2; C3 e L3). Verifica-se ainda que existe um aumento da atividade antioxidante ao longo das etapas e que esta é sempre mais elevada para as amostras provenientes do lagar do que para as provenientes da cuba. Estes dados foram comprovados através do estudo das médias marginais estimadas relativas a cada uma das metodologias em relação às etapas, isto pode dever-se ao facto de a etapa C3 e L3 corresponder às 24h após a aguardentação. A justificação para estes resultados é segundo os autores Mateus & Freitas [41], e Oliveira et al. [68],um conteúdo elevado em etanol favorece a solubilidade dos compostos fenólicos e como estes estão diretamente interligados com a atividade antioxidante, podem favorecer um aumento da mesma nesta etapa da produção do vinho. Outro facto é que a prensagem do vinho que ocorre imediatamente após a aguardentação, vai também ajudar na extração de compostos que estivessem ainda na Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 83 parte sólida da uva este processo pode então contrariar o efeito que pudesse ser causado pela diluição do mosto fermentado com a aguardente. No que respeita à quantificação de compostos fenólicos a técnica de FolinCiocalteu revelou-se de fácil execução e talvez por isso seja muito referida na literatura para o tipo de amostra utilizada e através de uma análise de correlação de Pearson podemos ainda verificar que existe uma correlação muito forte entre esta técnicas e as duas técnicas escolhidas para a avaliação da atividade antioxidante, sendo respetivamente com a técnica de DPPH de 0,556 e com a técnica de ABTS de 0,471. Através da análise estatística com a ANOVA TWO-WAY e o teste de Tukey, verificou-se que entre as três primeiras etapas existem diferenças significativas (ρ< 0,05), quanto ao processo de vinificação (Cuba mecânica-C e Lagar tradicional-L), (Tabela 21). Quanto ao tipo de vinificação não existe literatura disponível, no entanto quando comparados em termos absolutos, os valores obtidos são concordantes com a literatura, nomeadamente Magalhães et al. [55] descreve para vinhos tintos valores de 10,6 a 15,6 EAG. Relativamente às diferentes etapas da maturação (Tabela 22), através da realização de uma ANOVA ONE-WAY pode observar-se que não houve diferenças significativas, mas observou-se um perfil decrescente estável o que é corroborado pelos trabalhos de Pinho et al. [59]; Mateus & Freitas [41] e Oliveira et al. [69], que atribuem à transformação dos compostos originais do mosto noutros mais estáveis como anteriormente referido, e também às reações redox que ocorrem devido às trasfegas de local para local que o vinho realizou, figura 38. Na etapa M4, que corresponde a 6 meses de maturação, obteve-se um valor médio de 14,47 EAG, em que é possível observar a estabilização tendo em conta a semelhança com M3 e cujo valor é equiparável aos obtidos por Magalhães et al. [55] para vinhos tintos. Tabela 22: Os resultados apresentados na tabela são referentes a valores médios ± desvio padrão para amostras repetidas em triplicado e para as diferentes técnicas de fenólicos totais (Folin-Ciocalteu) e de atividade antioxidante (DPPH e ABTS). 1mM de EAG; 2mM de ET. Mmaturação. Folin-Ciocalteu1 DPPH2 ABTS2 M1 16,48±0,29 14,20±1,02 46,80±5,57 M2 14,99±0,66 15,28±0,19 41,85±0,83 M3 14,54±0,59 14,84±0,99 37,84±2,38 M4 14,47±0,27 13,66±0,18 35,91±1,91 Sig. 0,304 0,774 0,140 Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 84 Em relação às etapas da maturação (M1-M4) (Tabela 20), as diferenças não foram significativas entre cada etapa ρ≥0,05, este facto pode dever-se à exposição do vinho a reações de oxidação/redução irreversíveis que transformam os compostos iniciais presentes no mosto em outros derivados mais estáveis, havendo por isso uma perda. [41, 57] No caso concreto das amostras em análise essa diferença é notada mas não acentuada devido ao facto do vinho ainda ser muito jovem e não ter ainda entrado nas etapas de envelhecimento. Especificamente em relação à técnica de DPPH, para a avaliação da atividade antioxidante, foram encontrados algumas dificuldades na aplicação da técnica às presentes amostras. Carmona-Jiménez et al. [57], indica que há dificuldades em encontrar linearidade entre a concentração de antioxidantes (diluição da amostra) e a percentagem de inibição em amostras de vinho e dos seus subprodutos, demostrando que trabalhar com diluições elevadas minimiza o efeito da matriz. Dificuldades adicionais na aplicação desta metodologia foram por exemplo a mistura destas amostras com percentagens de etanol elevadas (solvente preferido nesta metodologia) em trabalhar com as amostras, no sentido em que ao procede-se à mistura destas com grandes percentagens de etanol, (solvente preterido nesta metodologia [55, 57]) observando-se precipitação. Foi avaliado o tempo de reação, verificando-se que ao final de 120 min [55] a reação não estava completa e que ao final de 300 min [57] já não se observava alterações quando comparado com o tempo de 240 min o que significa o final da reação. De acordo com Carmona-Jiménez et al. [57] foi então selecionado o tempo de 240min como tempo de reação. No entanto com o aumento do tempo de reação, e para evitar evaporações da microplaca ou alterações na mesma devido ao elevado tempo de exposição do material da mesma ao solvente orgânico [55] optou-se por realizar a reação em eppendorf ao abrigo da luz e no final do tempo de ração proceder-se à leitura em placa. Tendo em conta as dificuldades encontradas com na aplicação da técnica de DPPH foi necessário a aplicação de uma outra metodologia para a avaliação da atividade antioxidante assim optou-se por testar a metodologia de ABTS que se revelou de fácil aplicação às amostras. Ambas as metodologias de avaliação da atividade antioxidante foram eficientes e verificou-se uma elevada correlação (0,759 na correlação de Pearson). Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 85 3.3 - Composição em antocianinas Analisou-se a composição em antocianinas das amostras recolhidas das diferentes etapas de elaboração do Vinho do Porto por HPLC-DAD. Foram identificados e quantificados cinco picos cromatográficos (Figura 31), correspondentes às seguintes antocianinas: a delfinidina–3-glucosido (Dp-3-gluc) e a cianidina-3-glucosido (Cy-3-gluc), identificadas através da comparação por os espectros dos respetivos padrões, a malvidina – 3glucosido (Mv-3-gluc), a peonidina-3-glucosido (Pn-3-gluc) e a petunidina3-glucosido (Pt-3-gluc),que foram identificada por comparação com a literatura nos, Mateus & Freitas [41]; Pinho et al. [55]; Oliveira et al. [68]; Oliveira et al. [69]; Fraige et al. [70]. Para a quantificação foi usada a curva de calibração da cy-3-gluc, sendo as restantes antocianinas expressas em mg de equivalentes de cy-3-gluc/l. Figura 31: Cromatogramas representativos de 3 etapas da amostragem para identificação e quantificação de antocianinas 1 – C1; 2C2 e 3 – M4. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 86 Embora o perfil cromatográfico fosse o mesmo, verificaram-se alterações quantitativas ao longo da amostragem (Figuras 31), com variações na quantidade das antocianinas identificadas. No final do cromatograma verificou-se a existência de outros picos (tempo de retenção entre os 30 e os 40 minutos) que não foram quantificados. As variações verificadas no perfil de antocianinas, bem como os picos presentes no final do cromatograma, podem dever-se a reações das antocianinas com metabolitos das leveduras que aparecem durante a fermentação, nomeadamente o ácido pirúvico, Mateus & Freitas [41] e Fulcrand et al. [71]. Relativamente à amostragem ao longo do tempo a variação apesar de ser notória (Tabela 23) é ainda pequena devido ao facto de o intervalo de tempo em que as amostras foram recolhidas ser curto e ainda não terem sido transferidas para envelhecimento em cascos de carvalho, prática utilizada na vinificação do Vinho do Porto e que leva à formação de compostos mais estáveis que os originalmente produzidos. [69] Tabela 23: Valores descritos na tabela representam as médias ± desvio padrão de amostras repetidas em triplicado e correspondentes a cada uma das antocianinas identificadas, para as diferentes etapas da vinificação 1os valores foram expressos em mg de Cy-3-gluc/L. Ccuba; Llagar. Dp-3gluc1 Cy-3-gluc1 Pt-3-gluc1 Pn-3-gluc1 Mv-3-gluc1 Antocianinas Totais1 C1 12,31±1,17 4,46±0,59 14,36±1,90 30,66±2,83 139,80±10,19 201,59 C2 32,52±0,714 6,11±0,30 33,05±0,45 60,87±1,80 291,85±6,96 424,40 C3 20,21±1,30 1,39±0,08 29,32±0,81 36,68±1,73 314,59±7,17 402,19 L1 24,04±1,94 2,99±0,15 29,19±2,38 46,44±1,33 394,81±5,79 497,47 L2 26,42±1,13 3,03±0,12 28,91±1,39 41,23±2,17 420,28±2,68 519,87 L3 13,29±0,11 0,59±0,01 21,22±0,18 20,81±0,49 308,46±1,81 364,37 Através da Tabela 19, pode verificar-se que a antocianina mais prevalente é a mv3-gluc independentemente de tipo e etapa da amostragem com valores entre 139,80 e 420,28 mg de equivalentes de cy-3-gluc/L, seguida da pn-3-gluc com valores que variaram entre 20,33 e as 46,44 mg de equivalentes de cy-3-gluc/L. [41, 59, 68] A antocianina presente em menor quantidade foi a cy-3-glu que teve um máximo no mosto imediatamente antes da aguardentação atingindo na cuba os 6,11 mg de equivalentes de cy-3-gluc/L e 3,03 mg de equivalentes de cy-3-gluc/L no caso do lagar. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 87 Verificaram-se diferenças significativas entre C1 e L1; C2 e L2 e C3 e L3, para os valores de mv-3-gluc, cy-3-gluc e dp-3-gluc, o que segundo Pinho et al. [59] a diminuição na etapa 3 (Figuras 32, 33 e 34) poderá dever-se à diluição feita com a adição da aguardente. Figura 32: Gráfico representativo da variação da quantidade de Malvidina-3-glucósido relativamente às etapas de vinificação 1, 2 e 3 para cuba e lagar respetivamente. Valores de médias para amostras repetidas em triplicado em mg de equivalentes de cy-3-gluc/l. Figura 33: Gráfico representativo da variação da quantidade de Cianidina-3-glucósido relativamente às etapas de vinificação 1, 2 e 3 para cuba e lagar respetivamente. Valores de médias para amostras repetidas em triplicado em mg de equivalentes de cy-3-gluc/l. 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 em mg de equivalentes de cy-3-gluc/l Etapas de vinificação cy-3-gluc Cuba Lagar 100 200 300 400 500 1 2 3 em mg de equivalentes de cy-3gluc/l Etapas de vinificação mv-3-gluc Cuba Lagar Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 88 Figura 34: Gráfico representativo da variação da quantidade de Delfinidina-3-glucósido relativamente às etapas de processamento 1, 2 e 3 para cuba e lagar respetivamente. Valores de médias para amostras repetidas em triplicado em mg de equivalentes de cy-3-gluc/l. Ao realizar-se a estatística, (ANOVA TWO-WAY com o teste de Tukey) foi possível separar as amostras em vários subconjuntos, mostrando que para as etapas iniciais há diferenças (p<0,05) entre tipo de processamento (Ccuba e L - lagar), ao longo do tempo. No que respeita à evolução durante as etapas da maturação (Tabela 24) verificouse que não há diferenças (p≥0,05) entre elas. Tabela 24: Valores descritos na tabela representam os médios ± desvio padrão de amostras repetidas em triplicado e correspondentes a cada uma das antocianinas identificadas, para as diferentes etapas da maturação1os valores foram expressos em mg de Cy-3-gluc/L. M-maturação. Dp-3gluc1 Cy-3-gluc1 Pt-3-gluc1 Pn-3-gluc1 Mv-3-gluc1 Antocianinas Totais1 M1 17,59±0,43 0,91±0,03 24,30±0,19 22,15±0,06 353,5±3,01 419,45 M2 17,09±0,57 0,72±0,02 24,24±0,67 19,94±1,52 256,27±3,21 318,26 M3 15,25±0,51 0,66±0,05 22,66±0,44 20,40±0,54 237,27±8,03 296,24 M4 15,24±1,57 0,67±0,07 21,58±3,44 16,02±1,43 237,19±8,93 290,70 Através da estatística com o teste de Tukey com um intervalo de confiança de 95%, em que p< 0,05 verificam-se diferenças significativas entre as etapas C1, L1, C2, L2, C3 e L3, verifica-se que não só os valores de Mv-3-gluc, como os de Dp-3-gluc e Cy3-gluc sofrem variações diferentes, (Figura 33, 34 e 35) o que segundo Pinho et al. [59], à evolução na extração das antocianinas e posteriormente à diluição com aguardente feita 0 5 10 15 20 25 30 35 1 2 3 em mg de equivalentes de cy-3-gluc/l Etapas da vinificação dp-3-gluc Cuba Lagar Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 89 para parar a fermentação. Quanto às diferenças entre tipo de processamento podem dever-se ao facto do processo de vinificação por cuba mecânica ser mais eficiente na extração de compostos do que o processo de vinificação por lagar, processo tradicional. Relativamente às etapas de maturação (Tabela 24), o que se pode visualizar é que existe um perfil relativamente estável, não entanto observa-se uma tendência para a diminuição dos valores de todas as antocianinas em geral que segundo Pinho et al. [59] e Mateus & Freitas [41], é indicativo da formação de compostos mais estáveis, que os originalmente formados. Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 97 Parte V Referências Bibliográficas Evolução das antocianinas, atividade antioxidante e parâmetros de cor no vinho do Porto ao longo de seu envelhecimento Mafalda Jacob Galante de Queiroz 99 5 - Referências Bibliográficas 1.Instituto da Vinha e do Vinho, I.P. [em linha]. Disponível em, http://www.ivv.minagricultura.pt/np4/vinho, Consultado em 15/04/2015 2.Infovini (2009). Regiões Vitivinícolas [em linha]. Disponível em, http:// http://www.infovini.com/pagina.php?codNode=3893. Consultado em 5/12/2013 3. Wines of Portugal – Estatística [em linha]. Disponível em, http://www.winesofportugal.info, Consultado em 15/04/2015 4.Carrera C., Vinhos de Portugal Da vinha ao vinho – variedades e regiões. 2ª edição. Sintra – Portugal, Colares Editora, (1999) 5.Instituto dos Vinhos do Douro e do Porto. História [em linha]. 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