Caracterização Dos Telómeros Como Biomarcadores Moleculares: Implicações no Estabelecimento da Idade Biológica

TELMA FILIPA AZEVEDO RESENDE CARACTERIZAÇÃO DOS TELÓMEROS COMO BIOMARCADORES MOLECULARES: IMPLICAÇÕES NO ESTABELECIMENTO DA IDADE BIOLÓGICA Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Orientadora – Doutora Ana Luísa Teixeira Afiliação – Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral, Centro de Investigação do Instituto Português de Oncologia do Porto Co-orientador – Professor Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva Categoria – Professor Associado Convidado Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto e Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral, Centro de Investigação do Instituto Português de Oncologia do Porto Informação Técnica TÍTULO: Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica Tese de Candidatura ao Grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto AUTOR: Telma Filipa Azevedo Resende DATA: setembro de 2015 EDITOR: Telma Filipa Azevedo Resende MORADA: Rua do Crasto, nº20 LOCALIDADE: Gondomar CÓDIGO-POSTAL: 4515-510 CORREIO ELETRÓNICO: [email protected] 1ª EDIÇÃO: setembro de 2015 “If you can’t excel with talent, triumph with effort” – Stephen G. Weinbaum Agradecimentos Tendo em conta que o finalizar desta dissertação não seria possível sem o auxílio de orientadores, professores, colegas, amigos e familiares, não poderia deixar de agradecer a todos. Em primeiro lugar, agradeço à Doutora Ana Luísa Teixeira, minha orientadora, pela inacreditável ajuda. Agradeço pelo ensino, pela confiança e sobretudo pela compreensão. Ao Professor Doutor Rui Medeiros, meu co-orientador, pelo interesse neste projeto e pelas contribuições dadas a este. À Professora Doutora Maria José Pinto da Costa, Coordenadora do Mestrado em Medicina Legal, por acreditar nos seus alunos e principalmente por lutar por e com eles, pela melhor qualidade dos ensinamentos da Medicina Legal. Agradeço ao Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral, por tão bem acolherem cada novo membro, por estarem sempre disponíveis e pela boa disposição. Agradeço especialmente à Francisca Dias, pelas horas perdidas e pela ajuda tão preciosa. À minha avó Fátima, pela preocupação, pelo carinho e pela motivação. Obrigada por me fazeres ver que com calma e determinação tudo se consegue. Aos meus pais, por terem a palavra certa na hora certa. E por todo o resto. Ao Pedro, por me acompanhar sempre nestas jornadas e por se manter de forma indiscutível o meu grande apoio. Obrigada. Muito obrigada a todos. Abreviaturas A ALT Alternative Lengthening of Telomeres B BA Biological age C CA Chronological age CCR Carcionoma de células renais CIN Cromossomal Instability Pathway Ct Cycle Threshold CYCC Cistatina C D DD Dímero D DNA Deoxyribonucleic Acid DKC1 Dyskeratosis Congenita 1 DST Digital Symbol Test E EGF Epidermal Growth Factor G GRS Genomic DNA Kit Broad Range H HBB β-globina I IMC Índice de Massa Corporal IMT Intima-media Thickness M MIN Microsatellite Instability Pathway mRNA Messenger Ribonucleic Acid MVEA Mitral Annulus Peak E Anterior Wall P PCR Polymerase Chain Reaction PNA Peptide Nucleic Acid Q Q-FISH Quantitative Florescence in situ Hybridazation R RNA Ribonucleic Acid ROS Reactive Oxygen Species S SNP Single Nucleotide Polymorphisms T TERC Telomerase RNA Component TERT Telomerase Reverse Transcriptase TRF Terminal Restriction Fragment TRF1 Telomere Repeat Binding Factor 1 TRF2 Telomere Repeat Binding Factor 2 Índice Geral Resumo………………………………………………………………………………………..…15 Abstract……………………………………………………………………………………….…17 1. Introdução………………………………………………………………………………21 1.1. Idade biológica versus idade cronológica…………………………………………………………………….21 1.2. Senescência celular – considerações gerais…………………………….22 1.3. Telómeros – biologia e potenciais aplicações………………………….23 1.4. Função da telomerase e processo de reativação………………………26 1.5. Polimorfismos genéticos: o exemplo do TERT-1327T/C…………….31 2. Objetivos………………………………………………………………………………..39 2.1. Objetivo-geral…………………………………………………………………39 2.2. Objetivos-específicos………………………………………………………..39 3. Materiais e Métodos…………………………………………………………….…….43 3.1. População em estudo………………………………………………………..43 3.2. Extração de DNA genómico………………………………………………..43 3.3. Análise do polimorfismo TERT-1327T/C………………………………..44 3.4. Quantificação relativa do tamanho dos telómeros por PCR em tempo real……………………………………………………………………………….45 3.5. Análise estatística…………………………………………………………….47 4. Resultados………………………………………………………………………………51 4.1. Análise do tamanho dos telómeros em indivíduos saudáveis do Norte de Portugal e sua associação com a idade, género, hábitos tabágicos e índice de massa corporal……………………………………51 4.2. Associação do polimorfismo genético TERT-1327T/C no tamanho dos telómeros e no carcinoma de células renais……………………………………………………………………………53 5. Discussão……………………………………………………………………………….57 6. Conclusão……………………………………………………………………………….63 7. Referências Bibliográficas……………………………………………………………67 Resumo 16 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 1327T/C no estabelecimento do tamanho dos telómeros foi também determinado. De acordo com os resultados, verificou-se que o comprimento dos telómeros diminui com a idade em indivíduos saudáveis, podendo esta diminuição ser influenciada pelo índice de massa corporal e modulada pelo género. Observou-se também que os doentes com CCR apresentam uma diminuição significativa do comprimento dos telómeros comparativamente aos indivíduos saudáveis (P=0,001). Quanto ao polimorfismo analisado, observou-se que os indivíduos saudáveis homozigóticos CC têm telómeros mais curtos comparativamente aos indivíduos portadores dos genótipos TC/TT, sugerindo um efeito funcional deste polimorfismo na regulação do gene TERT (P=0,004). Em suma de acordo com os resultados, a determinação do tamanho dos telómeros em indivíduos saudáveis é uma estratégia útil e com aplicabilidade na área forense, em casos ante e postmortem. No entanto, é importante ter em conta que este biomarcador pode sofrer influência de fatores associados ao estilo de vida, assim como de patologias existentes. Palavras-chave: telómeros; idade biológica; telomerase; polimorfismo TERT1327T/C; PCR quantitativo; Ciências Forenses; Medicina Legal. Abstract 17 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica Abstract Biological age is defined as a group of age-dependent variables, denominated biomarkers, which are quantified using statistical algorithms. Its estimation is an important concept in Forensic Science and Legal Medicine, because it can be applied in the resolution of practical cases, such as the reduction of a suspected group of a criminal act, or allowing the assignment of a biological age to a corpse, whose characteristics are too compromised to be used in their individual recognition. Various biomarkers have been used in the investigation of the estimated individual remaining life, in particular in the study of cellular senescence. A biomarker that plays an important role in the study of aging is the determination of telomere length. Telomeres are nucleoprotein complexes present at the ends of eukaryotic chromosomes, consisting of non-coding DNA sequence TTAGGG tandemly repeated, with the function of the preservation of the genome integrity. At the end of each cell cycle these are shortened up to a limit of incompatibility with the life of the cell, which allows us to relate its length with cellular aging. Telomerase is an enzyme responsible for the regulation of the size of telomeres, resetting them steadily. However, this is present during embryonic development and in immortalized and cancer cells, and in adult human cells is absent or basal expression levels. However the occurrence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in functional TERT gene could also affect the length of telomeres. Thus, studies have been conducted with the main objective to analyze the shortening of telomeres as a potential biomarker for the establishment of individual biological age by quantitative real-time PCR using SYBR® Green technology. For this, we analyzed the length of telomeres using blood circulating cells of healthy individuals from Northern Portugal as well as the length of telomeres of individuals diagnosed with renal cell carcinoma (RCC), in order to also evaluate the influence this pathology in the size of these structures. Additionally, the functional effect of genetic polymorphism TERT-1327T/C in the establishment of telomere size was also determined. According to the results, it was found that the telomere length decreases with age in healthy individuals, this reduction may be influenced by body mass index and modulated by gender. It was also observed that patients with RCC have a significant decrease in telomere length compared to healthy individuals (P=0.001). Regarding the polymorphism analysis, it was observed that healthy Abstract 18 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica individuals homozygous CC have shorter telomeres as compared to individuals carrying the CT/TT genotypes, suggesting a functional effect of this polymorphism in the regulation of TERT gene (P=0.004). In conclusion according to the results, determining the size of telomeres in healthy subjects is a useful and applicable strategy in forensic, in ante and postmortem cases. However, it is important to note that this biomarker may be influenced by factors associated with lifestyle and existing pathologies. Key-words: telomeres; biological age; telomerase; TERT-1327T/C polymorphism; Real Time PCR; Forensic Sciences; Legal Medicine. INTRODUÇÃO 1. Introdução 21 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 1. Introdução 1.1. Idade biológica versus idade cronológica Uma das consequências da existência de variabilidade interindividual conduz a que a idade cronológica não traduza com exatidão a idade biológica de um indivíduo [1]. A idade biológica é um conceito pouco objetivo, e é muitas vezes explicado como um valor que reflete melhor o “verdadeiro estado global” do envelhecimento do organismo, comparativamente à idade cronológica do indivíduo [2]. O conceito mais comum define a idade biológica como um conjunto de variáveis dependentes da idade cronológica, denominadas de biomarcadores, que são quantificados através de algoritmos estatísticos [2]. De acordo com a literatura, muitos biomarcadores, como a concentração de prostaciclina em fibroblastos ou de linfócitos, tendem a declinar linearmente com a idade, numa proporção de menos de 1% ao ano, permitindo relacioná-los com o processo de envelhecimento [3]. Inúmeros estudos têm sido realizados com o objetivo de estimar o tempo de vida restante de um indivíduo e vários biomarcadores têm auxiliado nessa investigação, particularmente no estudo da senescência celular [1, 4, 5]. A estimativa da idade biológica é um conceito importante nas Ciências Forenses e na Medicina Legal, na medida em que pode ser aplicada na resolução de casos práticos, como a diminuição de um espectro de suspeitos de um ato criminoso, ou permitindo a atribuição de uma idade biológica a um cadáver, cujas características estejam demasiado comprometidas para serem usadas no estabelecimento da identidade individual. Um dos métodos utilizados na estimativa da idade é o da medição dos ossos e reflete a idade biológica e não a cronológica. Este pode ser aplicado em casos de morte, em que o objetivo passa pela criação de um perfil biológico, que possa ser comparado com o de pessoas desaparecidas, ou em casos de vida, em que visa a resolução de questões judiciais ou civis, referentes à idade de menores ou outras questões relacionadas com falta de documentos de identificação [6]. A medição pode ser elaborada em ossadas não adultas e ossadas adultas. Em ossadas não adultas, a fiabilidade do método é dependente do género, visto que no género feminino, a fase imatura prolonga-se até aos 22 anos, e no género masculino até aos 25 anos [6]. As ossadas adultas podem ser distinguidas de 1. Introdução 22 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica acordo com certas características, que as diferenciam de ossadas não adultas: 1) união e fusão do esqueleto – desenvolvimento dos ossos da mão e do pulso; fusão da crista ilíaca, que ocorre após os 20 anos de idade; formação completa do esterno aos 21 anos de idade, das lâminas epifiseais das costelas aos 25 anos, da omoplata aos 19 anos e das costelas aos 18 anos; 2) existência de calcificação das cartilagens; 3) alterações na costela IV – margens mais afiadas e irregulares; 4) contagem de osteões (unidade de estrutura do osso compacto) – número de osteões diminui com a idade; 5) desgaste dentário; entre outros métodos menos aplicados [6]. No entanto, este método não é tão fiável, tendo em conta que se deve utilizar os diferentes indicadores anteriormente referenciados em simultâneo, e não apenas um, de forma a obter resultados mais fiáveis. Contudo, a fiabilidade é sempre dependente da variação populacional, da existência de patologias, da dieta nutricional, e de fatores genéticos e ambientais, assim como o facto de só ser aplicável, nas suas diferentes formas, em indivíduos até 65 anos, no máximo, e os intervalos de idade conseguidos serem apresentados com um desvio máximo de 20 anos [6]. 1.2. Senescência celular – considerações gerais A senescência celular é definida como o processo biológico que envolve modificações celulares associadas à deterioração das funções fisiológicas normais da célula com a passagem do tempo, o que resulta na morte celular [7]. Durante este processo, ocorre uma paragem do ciclo celular, devida à acumulação de danos em estruturas moleculares e celulares, de que é exemplo o encurtamento dos telómeros, a ativação de proto-oncogenes, a exposição a radiação, o stress oxidativo, estados de infeção (viral, bacteriana e/ou fúngica) e a atuação de toxinas [7, 8]. As células somáticas humanas têm uma capacidade limitada de divisão, o que conduz à disfunção tecidual [8]. O envelhecimento biológico é o principal fator de risco para o desenvolvimento de patologias humanas, como o cancro, a diabetes, as doenças cardiovasculares e as doenças degenerativas [8]. Nos mamíferos, as células senescentes apresentam diversas alterações bioquímicas, como o facto de apresentarem uma morfologia celular mais achatada, um 1. Introdução 23 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica aumento da produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e a presença de atividade da β-galactosidase [8]. 1.3. Telómeros – biologia e potenciais aplicações Na literatura é descrita a utilização de um conjunto de biomarcadores como um método de cálculo da idade biológica de um indivíduo [4]. Vários elementos são descritos como a: – concentração de prostaciclina em fibroblastos, indicadora de agregação plaquetária, vasoconstrição e funções reprodutivas; – viscosidade da membrana celular, que influencia a sua fluidez e consequentemente o transporte de nutrientes; – concentração de linfócitos, entre outros [4]. No entanto, estes biomarcadores apresentam grandes limitações da sua aplicabilidade, na medida em que apenas são usados em conjunto, isto é, nunca se pode calcular a idade biológica de um indivíduo através da análise de um único elemento, e são largamente influenciáveis por fatores ambientais, o que limita a sua utilização generalizada. Contudo, estes podem ser usados e úteis como complemento de métodos mais tradicionais, como por exemplo a medição de ossadas [3]. Um outro biomarcador que assume um papel relevante no estudo do envelhecimento é a determinação do comprimento dos telómeros. Os telómeros são estruturas especializadas, localizados na região terminal dos cromossomas das células eucarióticas e consistem em hexâmeros repetidos em tandem da sequência não codificante TTAGG. Estes encontram-se ligados a proteínas (TRF1 E TRF2) e apresentam um tamanho de aproximadamente 12 kbp (Figura 1) [9]. Os telómeros têm como função a preservação da integridade do genoma, protegendo as terminações dos cromossomas da maquinaria de resposta a danos no DNA (deoxyribonucleic acid: DNA), caso contrário, estas terminações seriam assumidas como quebras da cadeia de DNA, visto que os cromossomas com as terminações quebradas são instáveis [1, 10]. 1. Introdução 24 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica Figura 1. Estrutura dos telómeros nos mamíferos. TRF1 e TRF2 são proteínas às quais os telómeros estão ligados (adaptado de Blasco [11]). Nas células somáticas, a cada divisão celular os telómeros são progressivamente encurtados, até atingir um limite mínimo de tamanho incompatível com a vida da célula, interrompendo as divisões celulares e sinalizando o fim da vida desta – morte celular (Figura 2). Normalmente a célula efetua cerca de cem ciclos celulares até atingir o limite de encurtamento dos telómeros [1, 9]. Os telómeros de um indivíduo saudável sofrem um encurtamento de aproximadamente 30 a 40 pares de bases (pb) por ano, ao longo da divisão celular, tendo em conta a ausência da enzima telomerase em células humanas adultas [12]. A telomerase é responsável pela reposição da perda de DNA telomérico. Na ausência desta enzima, outras vias de recombinação de DNA, designadas de vias de alongamento alternativo dos telómeros (Alternative Lengthening of Telomeres: ALT) também atuam na reposição telomérica, mantendo o tamanho dos telómeros [13]. 1. Introdução 25 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica Figura 2. Representação esquemática do encurtamento telomérico ao longo da replicação celular (adaptado da fonte http://colinmathers.com/). Os telómeros também funcionam como sensores de eventos genotóxicos, capazes de desligar a progressão do ciclo celular prematuramente, antes que estes tenham diminuído a comprimentos críticos [14]. A disfunção dos telómeros pode promover o desenvolvimento de cancro, em consequência da ocorrência da instabilidade genómica em células com danos no DNA [14]. Relativamente à instabilidade genómica, podem existir dois tipos: a instabilidade cromossómica (CIN) e a instabilidade de microssatélites (MIN). A primeira é a forma mais comum, afetando de forma massiva a integridade dos cromossomas, através de rearranjos estruturais e aberrações numéricas, como aneuploidia e poliploidização [13]. Na maior parte dos cancros, surge instabilidade cromossómica nas primeiras fases da carcinogénese, podendo ser ativadas vias oncogénicas [13]. É conhecido que o encurtamento telomérico extremo provoca fusões dos terminais cromossómicos e aberrações estruturais, podendo estas alterações surgirem em fases iniciais do desenvolvimento neoplásico e coincidirem com a instabilidade cromossómica [13]. A disfunção telomérica indutora de senescência pode, portanto, ser ativada em diferentes tipos de células. Estudos futuros devem revelar toda a extensão em 1. Introdução 32 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica distinto, formando por consequência uma proteína diferente, ou pode ser um polimorfismo silencioso, cuja alteração não altere a formação do aminoácido. Na região intrónica, a alteração pode ocorrer em regiões codificadoras de microRNAs, não permitindo a ligação ao mRNA, alterando a configuração da proteína, ou em regiões de splicing, gerando o mesmo efeito (Figura 6) [47]. Figura 6. Localização de SNP’s e seus efeitos biológicos (adaptado de Monzo et al. [47]). A maior parte destas variações ocorre em genes relacionados com a diferenciação celular, reparação de DNA e preservação da integridade do genoma, assim como em enzimas metabolizadoras e transportadores de xenobióticos [45]. Contudo, em consequência destes poderem ocorrer nas regiões promotoras dos genes, estes podem ser um importante mecanismo de regulação de expressão genética dos mesmos. Um exemplo deste mecanismo de regulação é a ocorrência do SNP TERT1327T/C (SNP ID: rs2735940) no gene TERT, que parece influenciar a expressão deste gene e consequentemente afetar o comprimento dos telómeros. 1. Introdução 33 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica Estudos prévios descreveram a ocorrência de polimorfismos genéticos no gene TERT [48, 49]. Um dos polimorfismos descritos na literatura é o TERT1327T/C, presente na região promotora do gene, que consiste numa substituição de uma timina (T) por uma citocina (C) na posição -1327 (1327 pares de bases (pb) a montante do local de início da transcrição) [48]. Analisando a distribuição deste polimorfismo a nível mundial, é possível verificar que existem diferenças consoante a população, sendo o genótipo TC o mais frequente (Figura 7). Figura 7. Distribuição genotípica do polimorfismo TERT-1327T/C consoante as diferentes populações mundiais (fonte http://www.ensembl.org/). Um estudo realizado por Matsubara e colaboradores descreveu este polimorfismo na população asiática e estudou a sua relação com a atividade da telomerase usando leucócitos de indivíduos saudáveis [48]. Os autores concluíram que os indivíduos portadores do alelo T apresentavam maior atividade transcricional do gene TERT e consequentemente um maior comprimento dos telómeros, comparativamente aos indivíduos portadores do genótipo CC, que apresentavam telómeros muito curtos [48]. Adicionalmente, um estudo realizado por Ludlow e colegas relacionou as diferentes variações genéticas do polimorfismo com o tamanho dos telómeros e concluiu que indivíduos portadores do alelo T apresentavam telómeros mais compridos [49]. Desta forma, ficou assim estabelecido o efeito funcional deste polimorfismo [48, 49]. O polimorfismo TERT-1327T/C tem sido alvo de vários estudos em diferentes tipos de patologias, nomeadamente de cancro, estando associado a resultados controversos (Tabela 1) [12, 50-54]. Noutro estudo realizado por Matsubara e colegas verificou-se que os indivíduos portadores do genótipo CC 1. Introdução 34 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica apresentaram um risco aumentado para o desenvolvimento de doenças da artéria coronária [12]. Por outro lado, Choi e colaboradores demonstraram que o haplótipo TERT rs2735940T/rs2736098A estava associado a um maior risco para o desenvolvimento de cancro do pulmão [50]. Yang e colegas realizaram uma meta-análise englobando treze estudos, de modo a avaliar a influência deste polimorfismo no risco de desenvolvimento de cancro e verificaram que o alelo T estava associado com o risco aumentado para o desenvolvimento de cancro, particularmente em cancro de pulmão [51]. Savage e colegas associaram o genótipo TC a um risco reduzido de cancro de mama em indivíduos com história familiar desta doença [52]. Outros estudos analisaram a associação dos diferentes genótipos deste polimorfismo a outras patologias e não encontraram relação, como é exemplo o estudo realizado por Hashemi e colegas, que não encontrou associação entre o genótipo TC e o risco de cancro da mama, ou o estudo realizado por Hofer e colegas, que não obtiveram resultados que relacionassem as diferentes variáveis do polimorfismo TERT-1327T/C com o risco de cancro colo-retal [53, 54]. 1. Introdução 35 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica Tabela 1. Estudos que relacionam os vários genótipos do polimorfismo TERT-1327T/C com diferentes patologias [12, 50-57]. Autor Ano de publicação População Genótipo Alelo/ Genótipo Risco Patologia CC TC TT Matsubara et al. 2006 Asiática 51,9% D 36,5% S 38,5% 46,1% 9,6% 17,4% Genótipo CC Relativas à artéria coronária Choi et al. 2009 Asiática 32,9% D 38,1% S 49,5% 46,1% 17,6% 15,8% Alelo T Cancro pulmão Iizuka et al. 2013 Asiática 45% D 44% 11% Alelo T Cancro próstata, colo-retal e pulmão Hashemi et al. 2014 Asiática 17,0% D 17,3% S 47,0% 61,3% 36,0% 21,4% Genótipo TC X Cancro de mama Savage et al. 2007 Europeia 29% D 29% S 51% 50% 20% 21% Genótipo TC Cancro mama com história familiar Nordfjäll et al. 2007 Europeia 24,3% D 24,8% S 52,9% 47,8% 22,8% 27,4% Genótipos CC, TC e TT X Enfarte do miocárdio Hofer et al. 2012 Europeia 29,9% D 26,6% S 47,4% 50,0% 22,7% 23,4% Genótipo TC X Cancro colo-retal Liu et al. 2011 Americana 25,2% D 25,0% S 49,6% 49,3% 25,2% 25,7% Genótipos CC, TC e TT X Carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço D – Doentes; S – Saudáveis; X – não foi verificada associação estatisticamente significativa entre o polimorfismo e a doença No que diz respeito à sobrevivência, Catarino e colaboradores verificaram que os doentes com cancro do pulmão de não pequenas células e portadores do 1. Introdução 36 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica alelo T apresentavam uma maior sobrevivência global comparativamente aos indivíduos homozigóticos CC [58]. Da revisão da literatura, admite-se que este polimorfismo está associado ao desenvolvimento de diversas neoplasias, influenciando funcionalmente o tamanho dos telómeros. OBJETIVOS 2. Objetivos 39 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 2. Objetivos 2.1. Objetivo-geral Estudo do encurtamento dos telómeros como potencial biomarcador para o estabelecimento da idade biológica individual. 2.2. Objetivos-específicos - Caracterização do tamanho dos telómeros em amostras biológicas de indivíduos saudáveis provenientes da região Norte de Portugal e sua associação com a idade cronológica dos mesmos; - Caracterização do tamanho dos telómeros em amostras biológicas de indivíduos com cancro de células renais e sua comparação com os indivíduos saudáveis; - Caracterização genotípica da população em estudo (indivíduos saudáveis e doentes com carcinoma de células renais) quanto ao polimorfismo genético TERT-1327T/C; - Avaliar o efeito funcional do polimorfismo genético TERT-1327T/C no comprimento dos telómeros. MATERIAIS E MÉTODOS 3. Materiais e Métodos 48 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica normalizar os resultados, é efetuada a diferença entre o valor de Ct do fragmento do gene alvo (telómeros) e o valor de Ct do fragmento do gene endógeno (HBB), para cada amostra. Esta normalização é designada de ∆Ct e é resumida pela equação: ∆Ct = Ctgene alvo – Ctgene endógeno De forma a avaliar a diferença dos níveis de expressão dos vários fatores analisados graficamente, foi calculada a sua proporção, designada de relative fold change, através da fórmula: 2-∆∆Ct  ∆∆Ct = ∆Ctx - ∆Cty Em que um resultado maior de 1 significa um aumento, e menor que 1 significa uma diminuição. RESULTADOS 4. Resultados 51 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 4. Resultados 4.1. Análise do tamanho dos telómeros em indivíduos saudáveis do Norte de Portugal e sua associação com a idade, género, hábitos tabágicos e índice de massa corporal Na figura 10 está representada graficamente a relação entre a idade cronológica dos indivíduos saudáveis incluídos no estudo, de acordo com os grupos etários definidos (<30 anos versus 31-50 anos versus >51 anos) e o tamanho relativo dos telómeros. Figura 10. Distribuição do comprimento dos telómeros na população saudável segundo grupos etários definidos (média ± erro padrão da média, *P<0,050). De acordo com os resultados obtidos, observámos diferenças estatisticamente significativas no comprimento dos telómeros de acordo com o grupo etário. Os indivíduos pertencentes ao grupo etário <30 anos apresentam um maior comprimento dos telómeros em relação aos indivíduos pertencentes ao grupo dos 31-50 anos (2-ΔΔCt=2,7, P=0,018) e aos pertencentes ao grupo etário >51 anos (2-ΔΔCt=3,0, P=0,043). Deste modo, verificámos que a idade biológica dos indivíduos se encontra em conformidade com a idade cronológica estabelecida. 12,5 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 < 30 anos 31-50 anos >51 anos Comprimento tos telómero s (-ΔCt) Grupos etários * * 4. Resultados 52 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 F M Sim Não N PO O I Género Fumador IMC Comprimento dos telóemros (-ΔCt) * Para além da idade cronológica dos indivíduos saudáveis, a influência de outros fatores como o género, os hábitos tabágicos e o índice de massa corporal foi analisada no comprimento dos telómeros (Figura 11). Relativamente ao género, observámos que as mulheres apresentam um comprimento dos telómeros superior ao dos homens (2-ΔΔCt=2,5, P=0,037). Quanto ao índice de massa corporal (IMC), é possível observar diferenças estatisticamente significativas entre os indivíduos com grau I de obesidade (30 a <35), cujos telómeros são mais curtos comparativamente aos indivíduos com um IMC normal (18 a <25) ou pré-obeso (25 a <30). Os indivíduos com IMC normal apresentam telómeros com um tamanho 4,5 vezes maior, e os indivíduos com IMC pré-obeso 5,3 vezes maior, comparativamente aos indivíduos com grau I de obesidade (P=0,014 e P=0,015, respetivamente). No que diz respeito aos hábitos tabágicos, no presente estudo não observámos diferenças estatisticamente significativas no tamanho dos telómeros quando comparamos fumadores versus não fumadores (P=0,724). F – feminino; M – masculino; N – normal; PO – pré-obeso; O I – Obeso Grau I Figura 11. Comprimento dos telómeros na população saudável segundo as variáveis género, hábitos tabágicos e índice de massa corporal (IMC) (média ± erro padrão da média, *P<0,050). * * 4. Resultados 53 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 CC TC/TT Comprimento dos telómeros (-ΔCt) Genótipo * 4.2. Associação do polimorfismo genético TERT-1327T/C no tamanho dos telómeros e no carcinoma de células renais A análise do equilíbrio de Hardy-Weinberg na população de indivíduos saudáveis e nos doentes com CCR permitiu verificar que as frequências genotípicas observadas eram similares às esperadas (indivíduos saudáveis: P=0,588; doentes CCR: P=0.077). Na população saudável observámos que a frequência do genótipo TT foi de 0,30, do TC foi de 0,46 e do CC foi de 0,24. Relativamente à influência do polimorfismo estudado no comprimento do telómero, verificámos que os indivíduos homozigóticos CC apresentam um menor comprimento dos telómeros, comparativamente aos indivíduos portadores dos genótipos TC/TT (2-ΔΔCt=0,4, P=0,004) (Figura 12). Figura 12. Distribuição do comprimento dos telómeros de acordo com o genótipo quanto ao polimorfismo TERT-1327T/C na população de indivíduos saudáveis (média ± erro padrão da média, *P>0,050). Nos grupos de indivíduos homozigóticos CC e portadores dos genótipos TC/TT não se encontram diferenças entre o comprimento do telómero e os escalões etários definidos no presente estudo (homozigóticos CC: <30 versus 3150 anos P=0,178; <30 versus >51 anos P=0,171 e 31-50 versus >51 P=0,982; 4. Resultados 54 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Indivíduos Saudáveis Indivíduos CCR Comprimento dos telómeros (-ΔCt) Grupos de amostras * portadores dos genótipos TC/TT: <30 versus 31-50 anos P=0,445; <30 versus >51 anos P=0,651 e 31-50 versus >51 P=0,146). No grupo de casos de CCR, observámos que a frequência dos genótipos TT e TC é de 0,37 e 0,58, respetivamente, tendo sido observada uma diminuição da frequência do genótipo CC (0,05) neste grupo comparativamente aos indivíduos saudáveis. Tendo em conta os dois grupos de indivíduos estudados, e comparando o tamanho dos telómeros, observámos que os indivíduos saudáveis apresentam um maior tamanho do comprimento dos telómeros (14,5 vezes mais) comparativamente aos doentes com CCR (P=0,001) (Figura 13). Figura 13. Comparação do comprimento dos telómeros dos indivíduos saudáveis versus doentes com CCR (média ± erro padrão da média, *P>0,050). Quando considerámos os indivíduos com mais de 51 anos da população em estudo, observámos que os indivíduos saudáveis apresentam um comprimento dos telómeros superior comparativamente aos doentes com CCR (2ΔΔCt=44,9, P<0,001). DISCUSSÃO 5. Discussão 57 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 5. Discussão O conceito de distinção dos indivíduos através das suas características genéticas assume-se como crucial nas Ciências Forenses e na Medicina Legal. O primeiro passo neste rumo foi dado por Karl Landsteiner, com a invenção do sistema sanguíneo ABO, apresentando a desvantagem de ser pouco discriminativo entre indivíduos, uma vez que apenas os categorizava em quatro fenótipos [65]. Com o avanço tecnológico e científico, outros métodos mais precisos e eficazes foram criados, em alternativa aos métodos que usavam marcadores proteicos. Estas descobertas assentaram não só na descoberta da molécula de DNA, bem como no aumento do conhecimento da sua sequência. Um dos objetivos das investigações na área das Ciências Forenses e da Medicina Legal passa por identificar um indivíduo, através de uma amostra de DNA. Contudo, sem uma base de comparação de DNA, apenas é possível discriminar o género de uma amostra, o que pode ser efetuado através da análise do gene da amelogenina. Numa tentativa de identificação de um indivíduo, apesar de válida, essa informação é mínima. Para além do género, outro fator que auxiliaria seria a determinação da idade. Deste modo, tentámos definir a utilização de novos biomarcadores genéticos – determinação do comprimento dos telómeros – na determinação da idade biológica a partir de uma amostra de DNA. Os telómeros são complexos de nucleoproteínas presentes nas extremidades dos cromossomas eucarióticos, consistindo em sequências de DNA não codificante TTAGGG repetidos em tandem. Ao fim de cada ciclo celular estes são encurtados, o que nos permite relacionar o seu comprimento com o envelhecimento celular. Vários estudos relacionam o comprimento dos telómeros com a esperança média de vida e com o desenvolvimento de doenças, como o cancro, a diabetes e doenças cardiovasculares [8, 12, 50-57]. Atualmente existem diversos métodos em utilização para a medição do comprimento dos telómeros. O mais tradicional é o Southern Blot, que engloba digestão do DNA com enzimas de restrição. Apesar de ser um método com um elevado nível de especificidade, em consequência do seu pequeno coeficiente de variação, é bastante laborioso, demorado e requer no mínimo 3 μg de DNA, o que nem sempre é possível. O Southern Blot também revela pouca sensibilidade perante casos de telómeros mais curtos [66]. 6. Conclusão 64 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica BA= −2.281TRF+26.321CYSC+0.025DD −104.419MVEA+34.863IMT−0.265DST+0.305CA+26.346 Através deste algoritmo, é possível chegar a um valor da idade biológica, que poderia ser aplicado às amostras analisadas neste trabalho [77]. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 7. Referências Bibliográficas 67 Caracterização dos telómeros como biomarcadores moleculares: implicações no estabelecimento da idade biológica 1. Marzetti, E., et al.., Shorter telomeres in peripheral blood mononuclear cells from older persons with sarcopenia: results from an exploratory study. 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