Regeneração óssea craniofacial com recurso a células estaminais

REGENERAÇÃO ÓSSEA CRANIOFACIAL COM RECURSO A CÉLULAS ESTAMINAIS ANA JOÃO OLIVEIRA DA SILVA ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA DENTÁRIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO PORTO 2015 Regeneração óssea craniofacial com recurso a células estaminais Ana João Oliveira da Silva fMDUP 2015 Faculdade de Medicina dentária Universidade do Porto ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA “Regeneração óssea craniofacial com recurso a células estaminais” Autora: Ana João Oliveira da Silva Aluna 5º ano Mestrado Integrado Medicina Dentária Contacto: [email protected] Orientador: Prof. Doutor Pedro de Sousa Gomes Professor Auxiliar Co-orientadora: Prof. Doutora Maria Helena Raposo Fernandes Professora Catedrática Porto, 2015 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* I* * Ana*João*Oliveira*da*Silva* “(...) Vede sempre o lado melhor das coisas e não o pior. Mas o melhor meio para alcançar a felicidade é contribuir para a felicidade dos outros. Procurai deixar o mundo um pouco melhor de que o encontrastes e quando vos chegar a vez de morrer, podeis morrer felizes sentindo que ao menos não desperdiçastes o tempo e fizestes todo o possível por praticar o bem. (...)” Baden Powell Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* II* * Ana*João*Oliveira*da*Silva* ABREVIATURAS ASC – Células estaminais derivadas do tecido adiposo BMP – Proteína óssea morfogenética BMSC – Células estaminais derivadas da medula óssea CPC – Cimento fosfato de cálcio DFPC – Células estaminais derivadas do folículo dentário DNA – Ácido desoxirribonucleico DPSC – Células estaminais derivadas da polpa dentária ESC – Células estaminais embrionárias FEV - Fração vascular de estroma FGF - Fator de crescimento fibroblasto HA – Hidroxiapatite IGF – Fator de crescimento tipo insulina iPS – Células de pluripotencia induzida mPEG – metoxi-polietilenoglicol MSC – Células estaminais mesenquimais PCL – Policaprolactona PCR – Reação em cadeia da polimerase PGA – Ácido poliglicólico PLA – Ácido poliláctico PDLSC – Células estaminais derivadas do ligamento periodontal RNA – Ácido ribonucleico SHED – Células estaminais derivadas dentes decíduos exfoliados SCAP – Células estaminais derivadas da papila apical TGF-β – Fator de crescimento transformado UCMSC – Células estaminais do cordão umbilical VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* III* * Ana*João*Oliveira*da*Silva* ÍNDICE 1. Resumo 2 2. Introdução 4 3. Material e Métodos 5 4 – Desenvolvimento 6 4.1 Defeitos ósseos craniofaciais 6 4.1.1 – Cancro da cabeça e pescoço 6 4.1.2 – Fenda Labial e Palatina 6 4.2. Tratamento dos defeitos ósseos 7 4.2.1 Enxerto ósseo autólogo 7 4.2.2 Aloenxertos e xenoenxertos 7 4.2.3 Materiais Aloplásticos 8 4.2.4 Outras técnicas 9 4.3. Engenharia tecido ósseo 10 4.3.1 Scaffold 11 4.3.1.1Scaffolds metálicos 13 4.3.1.2 – Scaffolds Cerâmicos 13 4.3.1.3 – Scaffolds Poliméricos 14 4.3.1.4 – Scaffolds Compósitos 16 4.3.2 Biomoduladores 17 4.3.3 Células 19 4.3.3.1 – Células estaminais embrionárias 19 4.3.3.2 – Células estaminais mesenquimais adultas 21 4.3.3.2.1 – Células estaminais derivadas de medula óssea 22 4.3.3.2.2 – Células estaminais derivadas de tecido adiposo 24 4.3.3.2.3 – Células estaminais dos tecidos dentários 25 4.3.3.2.4 – Células estaminais perivasculares 27 4.3.3.2.5 – Células estaminais perinatais 28 4.3.3.3 – Células de pluripotência induzida 32 5. Conclusão 34 6. Bibliografia 35 Anexos 40 Anexo I 40 Anexo II 42 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* * 2* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 1. RESUMO A existência de defeitos ósseos derivados de traumas, patologias (e.g. osteomielite, osteoporose) ou de excisão de tumores, levou à necessidade de criar estratégias de tratamento que visam a reconstrução óssea. O tratamento destes defeitos, atualmente cursa com a utilização de enxertos ósseos. Contudo, é sabido que estes apresentam inúmeras desvantagens como complicações no segundo local cirúrgico, sobrevivência variável e ainda provável rejeição no caso de aloenxertos ou xenoenxertos. O recurso a biomateriais também se torna ineficaz em casos de defeitos de grande dimensão. Para a aplicação clínica da engenharia de tecidos, é necessária a existência de células estaminais, de um scaffold biocompatível e sinais moleculares. Assim, a engenharia do tecido ósseo envolvendo células estaminais tem sido vista como uma alternativa viável e eficaz no tratamento destes problemas, permitindo uma regeneração óssea mais rápida e eficaz. Esta monografia tem como objectivo a realização de uma revisão bibliográfica sobre a utilização das células estaminais na regeneração óssea craniofacial. Palavras-chave: Regeneração óssea; Engenharia tecidos; Células estaminais Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* * 3* Ana*João*Oliveira*da*Silva* ABSTRACT The existence of craniofacial defects due to trauma, diseases (e.g. osteomyelitis, osteoporosis) or tumor excision, lead to the need to create treatment strategies for bone regeneration. The treatment of these defects currently is the use of bone grafts. However, it is known that this solution has a lot of disadvantages as complication in the second surgical site, variable survival and probably rejection in allografts or xenografts. The use of biomaterials isn’t efficient too, for critical-sized defects. The clinical application of tissue engineering implies the presence of stem cells, biocompatible scaffolds and molecular signals. In this way, the bone tissue engineering with stem cells has been available as a viable and efficient alternative on treatment of these problems, permitting the bone regeneration. This bibliography review aims to conduct a literature search and present the use of stem cells in the craniofacial bone tissue regeneration. Key words: Bone regeneration; Tissue Engineering; Stem cells Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* * 4* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 2. INTRODUÇÃO O osso craniofacial tem uma função de proteção dos órgãos internos da região da cabeça (como o cérebro) e de suporte para os tecidos moles da região em questão, proporcionando assim uma ancoragem às estruturas dentárias e uma manutenção da estabilidade estrutural, necessária para as funções físicas e componentes estéticos do corpo humano.1,2,3 Os defeitos do osso craniofacial resultam de diversas condições desde malformações congénitas (fenda palatina) até quadros de trauma, infeção, osteomielite ou resseções cirúrgicas de tumor.4,5,6 Além destas, o osso craniofacial pode ser afetado por situações sistémicas como as doenças osteodegenerativas, que têm ganho importância devido ao aumento da incidência de patologias como a osteoporose e a artrite. Considerando ainda este tipo de condições, são de referenciar a osteogénese imperfeita ou displasia fibrosa, associadas a fragilidade do tecido ósseo devido a defeitos na matriz.7 Face a estes defeitos ósseos da região da cabeça e face há um comprometimento de funções como a mastigação, fala e deglutição.3 É também de salientar que as consequências se estendem além das condições locais pois afetam a qualidade de vida dos pacientes.8 Além das despesas médicas, a existência de defeitos ósseos afeta a integração social, a capacidade de obtenção de atividade económica e afeta os pacientes em termos psico-sociais.5 O tratamento regenerativo mais usado atualmente cursa com o uso de enxertos ósseos autólogos, aloenxertos ou materiais aloplásticos.8 Apesar de estes procedimentos poderem restaurar certos defeitos craniofaciais, estes apresentam diversas desvantagens, estando longe de serem o tratamento ideal.2,8 A promessa da medicina regenerativa é produzir um tecido saudável para substituir os tecidos patológicos ou danificados.7 A engenharia do tecido ósseo oferece abordagens interessantes para a regeneração e reparação óssea que envolve o sinergismo entre células estaminais, sinais moleculares e um scaffold adequado.9 Esta revisão bibliográfica tem como objetivo analisar a literatura científica sobre a regeneração óssea craniofacial com células estaminais, conhecendo as diferentes abordagens e as vantagens e desvantagens das mesmas. Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* * 5* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 3. MATERIAL E MÉTODOS Foram realizadas duas pesquisas bibliográficas na base de dados Pubmed e Biblioteca Virtual da U.Porto. A primeira pesquisa incluiu os termos “Craniofacial bone regeneration stem cells” limitados a cinco anos e com o texto disponível. Desta pesquisa resultaram cinquenta e seis artigos os quais foram lidos e selecionados consoante o interesse para o tema em questão. A exclusão de sete artigos resultou da sua referência a células estaminais hematopoiéticas, não sendo estas diretamente relacionadas com a regeneração óssea, ou por referência da regeneração de outros tecidos que não o tecido ósseo. Assim, foram selecionados quarenta e nove artigos. Foram ainda utilizados 2 livros de texto, com informação relativa à temática em análise. Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *12* Ana*João*Oliveira*da*Silva* meses, e deve acontecer numa razão semelhante à da incorporação, proliferação e migração celular, para formação do novo tecido.3,19,31 A injetabilidade de um biomaterial apresenta diversas vantagens. Esta característica proporciona uma melhor performance no envolvimento da região dos defeitos craniofaciais e ainda permite a incorporação de vários fatores de crescimento e células, evitando uma “cirurgia aberta” para o procedimento cirúrgico propriamente dito.8 Deste modo, o tempo de cirurgia é diminuído e esta torna-se menos traumática, e com melhor recuperação8,30 Contudo, além das vantagens de tempo, dano e custo reduzido, segundo Drury e Mooney (2003), esta característica não proporciona força mecânica suficiente para que o biomaterial seja usado em osso sujeito a cargas biomecânicas efetivas.30 Em todo o caso, um biomaterial deve ser ainda moldável para se adaptar aos contornos do defeito ósseo.19 No que diz respeito à osteocondutividade, um scaffold deve ser osteocondutor de modo a permitir a adesão e proliferação celular, resultando na formação de uma matriz extracelular.34 A osteoindução, por sua vez, faz com que haja uma indução da formação de novo osso através de sinais biomoleculares e recrutamento de células osteoprogrenitoras.34 A característica ideal referente à capacidade de formar novos vasos sanguíneos permite a distribuição de nutrientes e oxigénio, essenciais à regeneração óssea.34 A angiogénese é um processo que visa a formação de novos vasos a partir dos vasos já existentes, respondendo ao aumento da massa tecidular com expansão da componente vascular.35 É de atender que este processo pode ser fisiológico ou patológico.35 O primeiro ocorre na cicatrização de feridas, regeneração de um órgão, enquanto que o segundo tipo é desencadeado no crescimento de metástases de tumores ou patologias como osteoporose, artrite reumatoide, aterosclerose, entre outras.35 A angiogénese deve ser conciliada com a porosidade uma vez que o tamanho dos poros influencia o crescimento vascular e a difusão do oxigénio existente.24 Apesar da porosidade elevada melhorar a oxigenação e vascularização, a existência de poros grandes influencia negativamente a resistência mecânica.31 O scaffold deve então ter todas as características para tornar possível a existência de um microambiente favorável para a deposição de matriz extracelular, que permita a definição de uma geometria 3D da regeneração óssea, proporcionando composição química e estrutura física biologicamente funcionais.3 No que diz respeito aos tipos de scaffold, existem diversas composições. Geralmente estes são divididos em metálicos, cerâmicos, poliméricos e compósitos como será descrito de seguida. Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *13* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 4.3.1.1SCAFFOLDS METÁLICOS Os scaffolds metálicos foram primeiramente aplicados por Greenfield em 1909 sob a forma de rede metálica de modo a criar uma raiz dentária artificial que fixasse o osso em crescimento.36 Posteriormente, em 1971, Galante desenvolveu fibras metálicas monoporo para uso clínico.36 Estes materiais, predominantemente constituídos por titânio, tântalo e aço inoxidável, têm elevada força compressiva e excelente resistência à fadiga.34,36 Contudo, são materiais com diversas desvantagens que os tornam menos favoráveis ao uso como scaffold para a engenharia de tecido ósseo. O facto de serem metálicos faz com que haja libertação de iões ou partículas tóxicas devido ao processo de corrosão, podendo causar inflamação ou alergias.36 Tal contribui para a ausência de duas características ideais referidas: biocompatibilidade e biodegradação.34,36 Além disso, os scaffolds metálicos não permitem a incorporação de biomoléculas e apresentam um módulo de elasticidade diferente do osso natural, o que se traduzirá numa reduzida estimulação do crescimento de novo osso.34,36 Apesar das boas propriedades mecânicas, o uso de scaffolds metálicos compromete a eficaz abordagem regenerativa na engenharia de tecido ósseo, que implica um microambiente favorável com biomoléculas e células. 4.3.1.2 – SCAFFOLDS CERÂMICOS Os biomateriais cerâmicos podem ser distinguidos em dois grandes grupos: bioinertes e bioativos.36 O último grupo pode ainda ser dividido em materiais reabsorvíveis e não reabsorvíveis.36 Estes apresentam excelente biocompatibilidade, bioatividade, bem como propriedades químicas semelhantes aos componentes do osso mineral, sendo por isso muito usados.36 As desvantagens deste tipo de scaffolds relacionam-se com as propriedades mecânicas em termos de fadiga e fratura.36 Como exemplos deste tipo de biomaterial existem os biovidros, a hidroxiapatite e os materiais à base de fosfato de cálcio.34,36 Os biovidros tiveram a sua origem numa composição apresentada por Hench em 1969.36 Este biovidro apresenta diversas vantagens como a capacidade de mimetizar a componente mineral do tecido ósseo, de facilitar a ligação e função celular, e de se ligar ao osso, formando uma interface funcional.9,26,32 Além disso, o biovidro é um material bioativo com excelente osteocondutividade e ratio de degradação Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *14* Ana*João*Oliveira*da*Silva* controlada. 26,37,36 As desvantagens deste biomaterial cursam com as reduzidas propriedades mecânicas, nomeadamente baixa força e tenacidade.36 Relativamente à hidroxiapatite, a sua força mecânica, capacidade de união ao osso e a semelhança com os minerais ósseos são vantagens ao seu uso como scaffold.6,11 Contudo, é um material pré-formado, sendo por isso incapaz de se adaptar na cavidade óssea resultante do defeito, e apresenta ainda um processo de reabsorção muito lento.6 Dos exemplos de scaffolds referidos, os que são baseados em cimento de fosfato de cálcio (CPC) são dos mais utilizados nas aplicações craniofaciais. O fosfato de cálcio, por si só, foi usado primeiramente por Albee e Morrinson em 1920, sob a forma de fosfato tricálcico.36 O CPC consiste numa mistura de fosfato tricálcico e fosfato dicálcico anidroso, que surgiu em 1986, por Brown e Chow, tendo tido a aprovação da FDA para comercialização, cerca de 10 anos depois.6,33,30 Este tipo de scaffold cerâmico é injetável, moldável, biocompatível, osteocondutor, biodegradável e bioativo.37,33,36 Apesar da elevada fragilidade mecânica, limitação ao seu uso, as características referidas fazem com que o CPC se torne um biomaterial bastante próximo do descrito como ideal.9 O CPC pode ainda ser reforçado com a adição de vários elementos e agentes biofuncionais.9 A combinação com o colagénio melhora as propriedades mecânicas e aumenta a adesão celular, diferenciação e expressão de marcadores osteogénicos como Runx-2 e fosfatase alcalina.33 Outro elemento que também pode reforçar a composição do CPC é o quitosano.9 Outros exemplos são os agentes biofuncionais como RGD, fibronectina, FEPP (proteína tipo fibroblasto modificado), Geltrex (forma solúvel de matriz da membrana basal, usado como matriz extracelular 3D) e concentrado de plaquetas.11,26 Estes contribuem para a melhoria das propriedades biológicas.11,26 4.3.1.3 – SCAFFOLDS POLIMÉRICOS Os materiais poliméricos podem ser divididos, de acordo com a sua origem, em materiais: naturais e sintéticos.34,36 Entre os polímeros naturais, os mais usados são o colagénio, alginato, ácido hialurónico e quitosano.34,36 O alginato é um heteropolissacarídeo natural isolado a partir de algas marinhas castanhas.15 É um polímero natural biocompatível, biodegradável, solúvel em água e com um comportamento de gelificação suave à temperatura ambiente.8,15,36 Além disto, o alginato apresenta baixo custo e baixa imunogenicidade.8 Relativamente ao colagénio, é sabido que é o principal componente orgânico do tecido ósseo.36 É também biocompatível, biodegradável e tem a capacidade de estimular a Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *15* Ana*João*Oliveira*da*Silva* proliferação e diferenciação de células.36 Este biomaterial é geralmente usado como base, sendo posteriormente adicionados polímeros e biomoléculas de forma a melhorar a osteoindução.36 O ácido hialurónico é um polímero hidrofílico, não imunogénico, que pode ser encontrado no citoplasma de células osteoprogenitoras e tem sido demonstrado o seu potencial como material para scaffold em aplicações regenerativas do tecido ósseo.36 Tem sido usado em combinação com outros materiais ou fatores para aumento do potencial osteogénico. 36 Outro polímero usado é o quitosano, sendo este biodegradável, biocompatível, antibacteriano e com propriedades de bioadesão.36 As propriedades osteogénicas podem ser modificadas através da adição de outros polímeros, células ou fatores indutores ósseos.36 Existem outros polímeros naturais disponíveis como o hidrogel peptídeo e a seda, que também apresentam biocompatibilidade e biodegradabilidade, e o caso da fibroína de seda que apresenta boas propriedades mecânicas.36,38 No que diz respeito a polímeros sintéticos existem, globalmente, os poliésteres e os co-polímeros.36 Os poliésteres alifáticos como o ácido poliglicólico (PGA), ácido polilático (PLA) e policaprolactona (PCL) são os mais usados na engenharia de tecidos.34,36 Os seus produtos de degradação estão presentes no corpo humano e por isso podem ser eliminados por vias metabólicas naturais.34 Estes são geralmente usados em combinação com outros elementos como a hidroxiapatite (HA) que permitirão uma melhoria das propriedades mecânicas e biológicas dos scaffolds.36 Os co-polímeros, por sua vez, são atrativos pelo facto de apresentarem propriedades físico-químicas altamente controláveis.36 A gelificação, densidade, propriedades mecânicas e biodegração podem ser controladas através da regulação do peso molecular, das estruturas e das ligações degradáveis.36 Como exemplo deste tipo de polímeros sintéticos referencia-se o co-polimero tribloco mPEG-PCL-mPEG, que contém PCL, material aprovado pela FDA, que apresenta fácil aplicação clínica e biodegradação, e ainda mPEG que permite uma melhoria do ângulo de contacto e da hidrofobia (desfavoráveis no PCL).31 Outro exemplo é o biocomposto formado pelo tribloco referido anteriormente com adição da hidroxiapatite que irá tornar o co-polímero mais hidrofilico.31 Este biocomposto terá maior porosidade, maior resistência mecânica, permitirá maior proliferação celular e terá ainda melhores propriedades osteocondutoras e osteoindutoras devido á presença da componente cerâmica.31 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *16* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 4.3.1.4 – SCAFFOLDS COMPÓSITOS Os scaffolds compósitos são fabricados pela combinação de dois ou mais materiais diferentes, como cerâmicas e polímeros, tirando proveito das vantagens de ambos materiais, e assim visando obter uma sinergia nas propriedades finais.34,36 Por exemplo, considera-se a combinação de uma cerâmica à base de fosfato de cálcio para melhorar a integridade mecânica e com um material polimérico, para a indução da bioatividade. 34 Smith e colaboradores, em 1963 desenvolveram Cerosium®, que consiste num scaffold compósito cerâmico-plástico para uso em próteses mandibulares.36 É constituído por uma mistura de alumina, sílica, carbonato de cálcio e carbonato de magnésio, apresentando força e elasticidade semelhante ao osso.36 Assim, existem vários tipos de combinações possíveis e viáveis. Os scaffolds compósitos metálico/polímero apresentam propriedades físicas e químicas com papel crucial na osteointegração.36 Estes podem ser implantes metálicos com revestimento de poliéster ou implantes de biodegradação parcial como o desenvolvido por Laagoa et al.36 Este era constituído por titânio, ácido polilático, hidroxiapatite e carbonato de cálcio, conseguindo-se obter estabilidade mecânica e biocompatibilidade.36 Também será possível a combinação de scaffolds metálicos com cerâmica, cujas características de adesão, propriedades mecânicas e bioatividade são favoráveis.36 Outra possibilidade é a combinação de polímeros e cerâmicas.36 Kaplan e colaboradores combinaram o fosfato de cálcio com poliésteres para a produção de um scaffold.36 Neste tipo de scaffold compósito, vários estudos in vitro demonstraram a viabilidade e proliferação celular, bem como a capacidade de promover a diferenciação osteogénica.36 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *17* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 4.3.2 BIOMODULADORES As citocinas funcionam como agentes biomoduladores da função celular, e constituem outro componente essencial na engenharia de tecidos para a regeneração óssea, compreendendo biomoléculas ou fatores de crescimento integrados no scaffold.29 Este componente controla e promove a osteogénese, a regeneração do tecido ósseo e a formação de matriz extracelular, através do recrutamento e diferenciação de células osteoprogenitoras, na linhagem específica.34 Além disso, têm como funções aumentar a proliferação celular, o homing de células mesenquimais em circulação, a diferenciação das células em osteoblastos, entre outras atividades biológicas. 18 Como exemplos de fatores existem o NELL-1, TGF-β, BMP, IGF, FGF, VEGF entre outros.34 O fator de crescimento NELL-1 apresenta propriedades vasculogénicas, próangiogénicas e de osteoindução.16 A sua utilização inibe a adipogénese e torna a resposta osteogénica mais específica.16,39 Além de promover a expressão de BMPs, que favorecem a regeneração óssea, o uso do fator NELL-1 assegura uma proliferação apropriada e um microambiente osteoindutor.40 A sua presença contribui também para uma sobre-regulação da expressão dos genes Runx2 e Ocn.40 As proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) são um grupo de glicoproteinas reguladoras, membros da família do TGF-β, que estimulam a diferenciação de células estaminais mesenquimais em osteoblastos e condroblastos.41 O nome BMP foi dado em 1965 por Urist e colaboradores.41 O genoma humano codifica várias BMPs, estando essas divididas em grupos: o primeiro grupo, com as BMP-2 e BMP-4; o segundo com BMP-3 e BMP-3B, o terceiro com BMP-5, BMP-6, BMP-7 e BMP-8 e por último, a subfamília que inclui GDF-5, GDF-6 e GDF-7.41 A função das BMPs é a regulação das atividades mesenquimais e osteoblásticas, como a adesão celular, diferenciação, atividade da fosfatase alcalina, mineralização e quimiotaxia.41 Relativamente à proteína BMP-2, esta apresenta um efeito poderoso no desenvolvimento e regeneração óssea.42 Este fator induz uma elevada densidade óssea, sendo o principal fator osteoindutor aprovado pela FDA.16,39 Ainda assim, o uso desta proteína acarreta como efeitos indesejáveis o edema no local de implantação, a ativação de osteoclastos, ocorrência de diferenciação adipogénica e o risco de formação de cisto ósseo.39,40 O fator de crescimento fibroblástico (FGF) desempenha um papel crucial em múltiplos processos: diferenciação, proliferação e sobrevivência celular.43 A família FGF Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *18* Ana*João*Oliveira*da*Silva* inclui 24 membros.43 O FGF-4 é o primeiro membro detectado durante o desenvolvimento embrionário, sendo um fator autócrino e/ou parácrino requerido em múltiplos eventos celulares na embriogénese.43 Além disso, este fator aumenta a proliferação de células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea.43 O FGF-2, FGF-5 e FGF-6 são sobreregulados no início da formação do calo ósseo e mantém os seus níveis elevados durante o processo de cicatrização óssea.42 O FGF-2, por si só, estimula a proliferação das células periosteais, osteoprogenitoras, condroprogenitoras, aumentando a formação do calo.42 Outros fatores apresentam também um papel importante no processo de regeneração óssea. O IGF ajuda a migração de diferentes células ósseas, o VEGF pode ser usado para induzir uma rede complexa de vasos sanguíneos ao longo do scaffold e os fatores IFN-γ e TNF-α induzem a apoptose das células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea.34 Neste componente da engenharia de tecidos existem ainda vias de sinalização como a via do fator de crescimento derivado plaquetas (PDGF) que está envolvida nos processos de cicatrização em vários tecidos, incluindo o osso.42 Os ligandos e receptores desta via são expressos nos osteoblastos e células estaminais mesenquimais.42 Outra via de sinalização é a via Notch, que regula o desenvolvimento do esqueleto, aumentando a diferenciação de células osteoprogenitoras e a massa de osso trabecular.42 Na cicatrização de uma fratura, a sinalização Wnt também contribui significativamente para o processo.42 Fig.2 Diferenciação de células osteoprogenitoras e o papel dos fatores de crescimento durante a progressão temporal. (Adaptado de Polo-Corrales, L. 2014) 36 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *19* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 4.3.3 CÉLULAS Na engenharia de tecido ósseo, as células têm a função de se diferenciarem em osteoblastos que, por sua vez, produzirão a matriz extracelular e irão secretar as proteínas especificas do osso.4 As células estaminais podem ser guiadas para a diferenciação osteogénica e distribuídas via scaffold, tendo estas demonstrado imenso potencial para a regeneração óssea.37,12 As células estaminais são um tipo especial de células, pois, possuem a capacidade de se autorregenerarem e de se diferenciarem em diferentes tipos de células de vários tecidos e assim regenerá-los.35 Estas células indiferenciadas podem ser classificadas em: totipotentes, pluripotentes, multipotentes, e unipotentes.35 As células totipotentes tem capacidade de se diferenciarem nos 216 tipos de tecidos do corpo humano, incluindo a placenta e anexos embrionários.35 No caso das células pluripotentes e multipotentes, a diferenciação em células de tecidos extraembrionários não é possível.35 As células unipotentes são aquelas em que a diferenciação só é possível para um único tipo de tecido.35 As células destes dois últimos tipos descritos são considerados células somáticas e podem ser classificadas em hematopoiéticas, queratinócitas, adipócitas e mesenquimais.35 No âmbito da medicina regenerativa, existem dois grandes tipos de recursos celulares usados: células estaminais embrionárias e células estaminais adultas.9 4.3.3.1 – CÉLULAS ESTAMINAIS EMBRIONÁRIAS As células estaminais embrionárias (ESC) são células pluripotentes que podem ser isoladas da massa interna do embrião pré-implantado durante o estado de blastocisto, e assim constituem um recurso celular alogénico na engenharia de tecidos 7,23,29 Este tipo de células expressa níveis elevados de antigénios de superfície característicos de células estaminais mesenquimais: CD44, CD49a, CD73 e CD105.28 Um exemplo de células estaminais embrionárias, são as células do gérmen embrionário que derivam da crista gonodal do feto com 5-10 semanas, sendo estas que darão posteriormente origem aos óvulos e esperma no adulto.23 As células tipo osteoblastos pretendidas na engenharia do tecido ósseo surgirão através da indução osteogénica de células estaminais mesenquimais, derivadas de células estaminais embrionárias.28 Esta indução osteogénica poderá ocorrer pela diferenciação Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *20* Ana*João*Oliveira*da*Silva* osteogénica direta de corpos embrióides num meio osteogénico durante vinte e cinco dias, ou após a co-cultura de corpos embrióides com células ósseas primárias, catorze dias antes do transplante para implantação subcutânea.28 Uma das principais características das células estaminais embrionárias é a capacidade elevada de proliferação em estado indiferenciado, isto é, estas células conseguem-se autorrenovar.4,9,28 Além disso, este tipo de recurso celular é acessível, evita um segundo local cirúrgico e as células são relativamente homogéneas.9,28 Contudo, o uso destas células acarreta diversos problemas éticos relacionados com a necessidade de destruir um embrião humano para o isolamento das mesmas, e com instabilidade genómica, risco de tumorogénese e rejeição imune associadas.2,7,18 Além disso existe uma grande dificuldade em controlar a diferenciação destas células. Tal dificuldade pode culminar no aparecimento de um teratoma após a implantação, isto é, um tumor constituído por tecidos somáticos diferenciados das camadas endoderme, ectoderme e mesoderme.4,18,44 É assim importante referir que este tipo de células só pode ser utilizado após a diferenciação total num tipo celular, não restando quaisquer células indiferenciadas que possam contribuir para o desenvolvimento de um teratoma.35 Deste modo, o uso destas células implicará ultrapassar dois desafios: criar técnicas que possam remover com segurança as populações celulares com risco tumorogénico, e conseguir a reprodução celular deste tipo de células na via osteogénica.44 Apesar das características favoráveis e conhecimento das desvantagens das células estaminais embrionárias, o uso destas ainda se encontra limitado devido á falta de entendimento dos requisitos para a diferenciação.44 Ainda assim, as células osteogénicas derivadas de células estaminais embrionárias humanas representam um avanço significativo do conceito celular da engenharia de tecidos.44 Estas servirão de recurso para o estudo de patologia ósseas bem como uma fonte inesgotável de precursores osteogénicos para a regeneração óssea, desde que se resolvam os problemas de rejeição imune do hospedeiro e os risco de desenvolvimento tumoral.,29,44 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *21* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 4.3.3.2 – CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMAIS ADULTAS As células estaminais mesenquimais adultas foram alvo de investigação para a engenharia do tecido ósseo em 1992 por Caplan et al., que recorreram à combinação de MSC com um scaffold, pela primeira vez.35 Estas células residem em vários tecidos como a polpa dentária, ligamento periodontal, periósteo, músculo esquelético, medula óssea, tecido adiposo, entre outros.6,25,45 Além de serem encontradas em diversos tecidos, estas células, sendo multipotentes, tem a capacidade de se diferenciarem em vários tipos celulares como osteoblastos, condrócitos e adipócitos.25,29,35 É sabido que a maioria dos tecidos relevantes na reparação cirúrgica são de origem mesenquimal. Assim, dada a origem, multipotência, variedade de recursos, autorrenovação e capacidade de reparação de tecidos danificados, as MSC são as mais usadas clinicamente na reparação de tecidos.18,25,29 A utilização destas células implica três etapas principais: isolamento, purificação e expansão in vitro sendo esta última essencial para a obtenção de um número adequado de células de elevada qualidade.5 Fig.3. Métodos de isolamento e caracterização de potenciais recursos celulares para regeneração óssea. (Adaptado de Robey,PG.2011)4 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *28* Ana*João*Oliveira*da*Silva* em 2011 isolaram pericitos do pâncreas para mostrar o seu potencial osteogénico.40 Apesar do pâncreas não estar relacionado tipicamente com a formação óssea, tal serviu para mostrar que, independentemente da localização do tecido vascularizado, os pericitos tem potencial para a osteogénese.40 Tal foi evidenciado pela expressão dos genes Runx-2, Osx-2, Ocn e pela mineralização da cultura celular estabelecida in vitro.40 Relativamente às células adventícias, estas encontram-se na túnica adventícia dos grandes vasos, têm expressão dos marcadores típicos de MSC e, tal como elas, apresentam multipotência.16 A atratividade deste recurso celular cursa então pela pureza, viabilidade e abundância existentes. Em relação aos recursos de células estaminais convencionais, estas têm diversas vantagens como a possibilidade de uso após triagem, uma vez que dispensa expansão in vitro. Tal traduzir-se-á num menor tempo requerido e prevenirá as complicações associadas à expansão.16 Outras vantagens referidas são a pureza, abundância e o efeito positivo na vascularização, evidenciado pela maior secreção de VEGF, pelo aumento significativo do número e tamanho de vasos sanguíneos, bem como pelo facto de permitirem o tratamento de defeitos ósseos em condições de pobre fluxo sanguíneo (e.g., feridas diabéticas e defeitos ósseos crónicos).16 4.3.3.2.5 – CÉLULAS ESTAMINAIS PERINATAIS As células perinatais são células derivadas do líquido amniótico, placenta, membranas fetais ou cordão umbilical, sendo facilmente isoladas dos tecidos extraembrionários uma vez que são geralmente descartados após o nascimento.2,23 Dada a sua localização, este recurso evita problemas éticos pelo que a colheita e manipulação são fáceis, e sem quaisquer danos para o bebé ou para a mãe.2 Estas apresentam tanto propriedades de células estaminais embrionárias como células estaminais adultas.2,23 Relativamente às suas características, estas células tem a mesma origem que o osso craniofacial e apresentam capacidade de proliferação e multidiferenciação in vitro e in vivo.2 Tal como as células estaminais embrionárias, estas tem boa capacidade de autorrenovação, mas apresentam baixa imunogenicidade e não há risco de formação de teratomas.2,23 Existem várias células estaminais perinatais de acordo com o tecido utilizado como recurso. O líquido amniótico é um líquido protetor localizado dentro do saco fetal durante o estado gestacional.2 Anker et al. demonstraram que o líquido amniótico contém células com a morfologia fibroblástica que são positivas para marcadores mesenquimais CD90, CD105, Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *29* Ana*João*Oliveira*da*Silva* CD73 e CD166 e negativas para marcadores hematopoiéticos, como CD45, CD34 e CD14.2 Coppi et al. isolaram com sucesso, do líquido amniótico, uma subpopulação de células estaminais multipotentes através da separação das células ativadas por fluorescência. 2 Estas células isoladas apresentaram morfologia arredondada uma semana após o isolamento, alterando para forma fibroblasto na segunda semana.2 Além disso, as células apresentavam expressão de alguns marcadores pluripotentes SSEA4 e OCT4 e também marcadores mesenquimais típicos, o que traduz o facto de serem células de um estadio intermediário, entre embrionárias e adultas.2 Outras características evidenciadas foram a capacidade elevada de autorrenovação e o tempo de duplicação de 36 horas. O interesse nestas células cursa com a sua multipotência, podendo formar osso e suportar a hematopoiese.4 A membrana amniótica é uma membrana fetal intima da placenta que limita a cavidade amniótica e também assegura o normal crescimento e desenvolvimento do feto durante a gestação.2 Geralmente o recurso usado é proveniente de material descartado ao nascimento e podem ser isoladas dois tipos de células através da digestão enzimática: as células epiteliais amnióticas e as células estaminais mesenquimais amnióticas.2 As primeiras exibem uma morfologia de epitélio arredondado e desenvolvem-se a partir da região central do epiblasto, criando uma camada única adjacente ao líquido amniótico.2 Relativamente às células estaminais mesenquimais amnióticas estas tem morfologia fibroblástica, residem na matriz de estroma da membrana amniótica e são diferenciadas a partir de células da mesoderme da somatopleura.2 As células derivadas do âmnion, tal como as células derivadas do líquido amniótico, são consideradas intermediárias de células embrionárias e adultas, expressando marcadores típicos de células pluripotentes como OCT4, SOX2, SSEA4, SSEA3 bem como marcadores típicos de células mesenquimais.2 O uso destas para a regeneração óssea baseia-se no seu potencial de diferenciação em linhagens múltiplas e na capacidade imunomoduladora.2 A membrana coriónica da placenta humana é uma fonte rica de células estaminais.2 Tal como as anteriores são células com fenótipo intermédio de células mesenquimais adultas e células embrionárias.2 Ainda assim, estas células tem maior capacidade de autorrenovação e maior potencial de diferenciação que as células mesenquimais adultas. Quando usadas in vivo, as células estaminais derivadas do córion tem efeito terapêutico em lesões do fígado e na osteogénese imperfeita.2 Outro recurso perinatal utilizado é o cordão umbilical, que conecta o feto à placenta, durante a gravidez.2 Anatomicamente este é constituído por duas artérias umbilicais e uma veia umbilical, estando estes componentes envolvidos pela mucosa conetiva de matriz Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *30* Ana*João*Oliveira*da*Silva* enriquecida com proteoglicano – gelatina de Wharton’s.2 As células estaminais do cordão umbilical (UCMSC) podem ser isoladas de diversas partes do cordão como a artéria umbilical, veia umbilical, gelatina de Wharton’s ou sangue.2 Estas células são jovens e têm o potencial de se diferenciarem em adipócitos, osteoblastos, condrócitos, e outras linhagens celulares26,30,32. O procedimento de colheita não implica métodos invasivos, até porque o cordão umbilical é um desperdício biológico e assim, os custos associados à utilização deste recurso são relativamente reduzidos. 37,33,32 Outras características vantajosas destas células são a boa capacidade de expansão, a elevada plasticidade e flexibilidade, imunorrejeição mínima, ausência de formação de teratoma, sendo eliminados os problemas éticos37,33,32,. Quanto à expressão de marcadores, as populações isoladas expressam os típicos mesenquimais e ainda alguns marcadores pluriportentes.2,33 O interesse nestas células para a regeneração de tecido ósseo cursa com a sua elevada potência, na capacidade de sintetizar uma quantidade superior de matriz mineralizada que as BMSC, excelente viabilidade, osteodiferenciação, sendo estas ultimas evidenciadas pela elevada expressão de fosfatase alcalina, Runx-2, colagénio e OC.33,30 As células perinatais são um recurso com vantagens tanto a nível de multipotência, plasticidade e características imuno-privilegiadas, bem como no âmbito do acesso aos tecidos biológicos, minorando o risco de problemas éticos.2 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *31* Ana*João*Oliveira*da*Silva* Fig.4 Esquema ilustrativo da engenharia do tecido ósseo baseada nas células estaminais perinatais. Geralmente as células estaminais perinatais são facilmente colhidas sem dano para o bebé ou mãe, e asseguram uma perspectiva mais promissora da aplicação extensiva da engenharia de tecidos. Numa abordagem mais visionária, através do controlo sofisticado das células estaminais, scaffolds biocompatíveis e sistemas de sinalização, será possível tornar a estratégia de engenharia tecidos baseada nas células estaminais perinatais numa reconstrução clínica personalizada e funcional para defeitos ósseos craniofaciais resultantes de malformações congénitas, osteomielites, trauma e resseção de tumor. (Adaptado Si, JW. 2015)2 Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *32* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 4.3.3.3 – CÉLULAS DE PLURIPOTÊNCIA INDUZIDA Uma alternativa às células estaminais propriamente ditas, são as células de pluripotência induzida, que são o resultado da reprogramação de uma células somática adulta, transformando-a numa célula estaminal pluripotente (iPS).23 Este conceito foi introduzido por Davis et al. quando descobriram que o gene MyoD (fator de transcrição regulador chave durante o desenvolvimento do músculo) pode converter fibroblastos embrionários (MEFs) em mioblastos através sobre-expressão ectópica.7 A reprogramação nuclear é então um processo em que uma célula somática é convertida em outra, através da troca do padrão de expressão de genes.7 Tal procedimento, requer a combinação da terapia génica e celular.3 As estratégias de produção de iPS cursam com a utilização de lentivírus, adenovírus, plasmídios, transposões e proteínas recombinantes.3 É de atender que o uso de transgenes virais pode resultar na integração dos mesmos no genoma somático, sendo que, até à data, o método mais seguro consiste na reprogramação dos fatores através do uso de proteínas recombinantes, por um período de tempo definido.3,7 Após a reprogramação resultam células pluripotentes do tipo células estaminais embrionárias, com sobre-expressão de quatro genes em fibroblastos humanos.7 Assume-se que os fatores responsáveis pela manutenção da pluripotência nas células estaminais embrionárias possam induzir a pluripotência nas células somáticas.7 Segundo Takahashi e Yamanaka, os genes responsáveis são Oct4, SOX2, Klf4 e C-myc, enquanto que para James Thomson, serão os genes Oct4, SOX2, Nanog e Lin28.7 As iPS são então células semelhantes às células estaminais embrionárias podendo, tal como estas, levar à formação de teratomas, existindo também problemas éticos e sociais na sua utilização, bem como limitações biológicas associadas à instabilidade genómica, tumorogénese e rejeição imune.2,4,23 A semelhança com as células estaminais embrionárias é evidente na morfologia celular, proliferação ilimitada, expressão génica, tempo de duplicação e capacidade de auto-renovação.3,7,11 Estas células tem capacidade de se diferenciarem em células das três camadas embrionárias (endoderme, ectoderme e mesoderme) e em células maduras, in vitro.7,11 Contudo, antes da utilização clínica das iPS, devem ser superados dois impedimentos existentes, relacionados com o baixo rendimento e as inserções genéticas de sequencias transgénicas.7 O baixo rendimento resulta do facto de as iPS evoluírem de células diferenciadas e por a reprogramação ser um processo escolástico contínuo.7 Quanto às Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *33* Ana*João*Oliveira*da*Silva* inserções genéticas, as células devem ser livres de sequências transgénicas que possam resultar em alterações genéticas graves.7 Deste modo, as células de pluripotência induzida são úteis em vários campos da medicina desde a descoberta de fármacos, estudo do desenvolvimento embrionário e investigação de doenças monogenéticas até à medicina regenerativa, já que está demonstrado o potencial osteogénico destas células em defeitos ósseos de tamanho crítico.2,7 Tabela I. Comparação de diferentes tipos de células estaminais (Adaptado de Robey, PG., 2011)4 Células estaminais adultas Células estaminais embrionárias Células estaminais pluripotência induzida Origem Protocolos específicos consoante os diferentes tecidos Massa celular intima do blastocisto Transdução viral, ou plasmídeos, ou pequenas moléculas ou mRNAs de células adultas Vantagens Divisão moderada; Podem ser autólogas; Compromisso para tipos celulares específicos; Divisão ilimitada; Pluripotentes; Sem alteração molecular; Divisão ilimitada; Pluripotentes; Sem destruição do blastocisto; Autólogas Desvantagens Podem não ser capazes de gerar células suficientes para a terapia; Destruição do embrião; Diferenciação incompleta; Possibilidade formação de teratomas; Alogénicas Integração viral; Equivalentes a hESCs; Memória genética; Diferenciação incompleta; Possibilidade formação de teratomas Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *34* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 5. CONCLUSÃO A regeneração óssea é essencial para a reparação de fraturas, bem como para a cicatrização de enxertos ósseos usados durante a reconstrução de defeitos após um trauma ou excisão de tumor. Com o aumento do número de pessoas idosas, é maior o número de intervenções, impondo-se a necessidade de otimizar as técnicas de regeneração óssea. Ao longo dos tempos foram realizados estudos com diferentes técnicas e analisadas as vantagens e desvantagens das mesmas. O enxerto de ósseo autológo é ainda considerado o tratamento de escolha mas esta terapêutica apresenta diversas desvantagens relacionadas com a necessidade de intervenção num segundo local para a colheita óssea. Surge, então, a engenharia de tecidos como alternativa regeneradora. Esta técnica implica o uso de scaffolds, células estaminais e biomoléculas. O scaffold deve cumprir determinados critérios para ser aplicado e possibilitar o tratamento. As biomoléculas, por sua vez, são essenciais para regular todos os processos envolvidos. As células têm sido cada vez mais estudadas, principalmente o recurso utilizado para a sua obtenção. Existem três tipos principais: embrionárias, mesenquimais adultas e de pluripotência induzida. Todas elas apresentam características que permitem a diferenciação osteogénica. Contudo existem características que vão diferenciando os diferentes tipos e permitindo a seleção das células a utilizar. Aquelas que são consideradas gold standard, as BMSC, estão melhor caracterizadas mas apresentam um procedimento de colheita doloroso. Dada tal desvantagem, outros recursos vão sendo descritos de modo a facilitar a terapêutica regenerativa. Atualmente existem já estudos em diversos modelos animais com diversos tipos celulares. Serão, no entanto, necessários mais estudos, nomeadamente na definição de um protocolo ideal para as situações encontradas, no estudo progressão do enxerto ao longo dos anos no que diz respeito à regulação da proliferação celular após a regeneração óssea. Regeneração*óssea*craniofacial*com*recurso*a*células*estaminais* *35* Ana*João*Oliveira*da*Silva* 6. BIBLIOGRAFIA 1. Ferreira JR, Padilla R, Urkasemsin G, et al. Titanium-enriched hydroxyapatite-gelatin scaffolds with osteogenically differentiated progenitor cell aggregates for calvaria bone regeneration. Tissue Eng Part A. 2013;19(15-16):1803-1816. doi:10.1089/ten.TEA.2012.0520. 2. Si J, Wang X, Shen SGF, Si J, Wang X, Shen SGF. Perinatal stem cells : A promising cell resource for tissue engineering of craniofacial bone. 2015;7(1):149-159. doi:10.4252/wjsc.v7.i1.149. 3. Pagni G, Kaigler D, Rasperini G, Avila-Ortiz G, Bartel R, Giannobile W V. Bone repair cells for craniofacial regeneration. 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