Mecanismos imunológicos na reabsorção espontânea de hérnias do disco intervertebral.

2017/2018 Belmiro Manuel Kabelevski Oliveira Alves Mecanismos imunológicos na reabsorção espontânea de hérnias do disco intervertebral Immunological mechanisms in the spontaneous resorption of the intervertebral disc hernias março, 2018 Mestrado Integrado em Medicina Área: Ortopedia Tipologia: Monografia Trabalho efetuado sob a Orientação de: Dr. Jorge Alves Trabalho organizado de acordo com as normas da revista: Revista Portuguesa de Ortopedia e Traumatologia Belmiro Manuel Kabelevski Oliveira Alves Mecanismos imunológicos na reabsorção espontânea de hérnias do disco intervertebral Immunological mechanisms in the spontaneous resorption of the intervertebral disc hernias março, 2018 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ao meu pai À minha mãe Aos meus irmãos Aos meus sobrinhos E ao meu avô Belmiro ! Mecanismos imunológicos na reabsorção espontânea de hérnias do disco intervertebral Immunological mechanisms in the spontaneous resorption of the intervertebral disc hernias Belmiro M. K. O. Alves Estudante de Medicina Jorge M. S. R. O. Alves Médico Especialista em Ortopedia e Traumatologia Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Belmiro Alves Rua Adelaide Estrada, 129 1ºB 4250-016, Ramalde, Porto (+351)913022955 [email protected] Os autores declaram inexistência de conflito de interesses na realização deste trabalho 2 Resumo Está comprovado que as hérnias do disco intervertebral podem sofrer um fenómeno de reabsorção espontânea e existe evidência na literatura que este processo ocorre por mecanismos imunológicos. O disco intervertebral é o maior órgão avascular do organismo, sendo considerado um dos locais imunologicamente privilegiados do ser humano. Perspetiva-se que a violação deste estado imunologicamente privilegiado ocorrida durante a herniação poderá expor o conteúdo do disco intervertebral ao sistema imune e assim ser desencadeada uma resposta imunológica a fim de proceder à sua reabsorção. O objetivo desta “monografia” visa a revisão da literatura e a sistematização dos possíveis mecanismos pelos quais a reabsorção das hérnias do disco intervertebral acontece. A base de dados utilizada foi a PUBMED, onde foram selecionados artigos completos e revisões escritas em língua inglesa publicados entre 1953 e 2017. Os termos MeSH usados foram “intervertebral disc”, “intervertebral disc displacement”, “spontaneous resorption” “immune system”, isoladamente ou em combinação. A lista de referências dos artigos identificados foi também analisada na procura de mais artigos relevantes associados ao tema. É consensualmente aceite que no processo de reabsorção das hérnias do disco intervertebral estão envolvidos fenómenos de neovascularização, quimiotaxia de células imunes e formação de um tecido de granulação, culminando num processo fagocitose do material herniado. Contudo, ainda existe controvérsia quanto ao tipo de imunidade implicada neste processo, pelo que quer a imunidade inata, quer a imunidade adaptativa poderão estar ambas implicadas. Palavras-Chave: Intervertebral Disc Displacement; Intervertebral Disc; Immune System; Immunology. Abstract It has been proven that the intervertebral disc hernia may suffer a phenomenon of spontaneous resorption and there is evidence in literature that this is mediated by immunological mechanisms. The intervertebral disc is considered one of the human immunological privileged sites, being also the largest avascular organ in the human body. It is foreseen that the invasion of this immunologically privileged state that occurs during herniation may expose the IVD to the immune system hence triggering an immune response in order to promote its resorption. The aim of this "monography" is to review literature and systematize the possible mechanisms by which the resorption of the intervertebral disc hernia occurs. The database used was PUBMED where full text articles and English-written reviews published between 1953 and 2017 were preferred. The MeSH terms used were ‘intervertebral disc’, ‘intervertebral disc displacement’, ‘spontaneous resorption’ and ‘immune system’ either alone or in combination. The references of the articles were also considered when searching for the most relevant articles. It is widely accepted that the resorption process of the herniated disc implies mechanisms such as neovascularization, chemotaxis of immune cells and synthesis of a granulated tissue culminating in the phagocytosis of the herniated material. However, there is controversy as to which immunity is implicated in this process thus both innate immunity and adaptive immunity may be involved. 3 Introdução A lombalgia e a dor ciática são uma das principais causas de incapacidade da população mundial, observando-se uma prevalência de 11,9%.[1] Aproximadamente 84% da população experiencia pelo menos um episódio de lombalgia ao longo da sua vida.[2] A hérnia do disco intervertebral (HDIV) é considerada como a principal causa de lombalgia e dor ciática.[3] A evolução dos meios auxiliares de diagnóstico permitiu uma melhoria na avaliação e orientação de doentes com HDIV. Tornou-se evidente que em certos doentes estas regridem espontaneamente.[4-6] Numa meta-análise que incluía 11 estudos, Zhong et al. verificou que 67% das hérnias discais lombares são reabsorvidas espontaneamente.[7] Normalmente a regressão espontânea associa-se ao alívio sintomático.[6] A capacidade de prever quais os doentes com maior probabilidade de regressão das HDIV vai permitir melhorar o aconselhamento do doente relativamente ao tratamento, evitando cirurgias desnecessárias, com morbilidade, riscos e custos conhecidos. O disco intervertebral (DIV) é uma estrutura única, com capacidade de absorver choques e de resistir à deformação induzida pela carga. É composto por uma estrutura externa rígida, designada anel fibroso (AF), e uma estrutura interna gelatinosa, chamada núcleo pulposo (NP). O AF é composto principalmente por colagénio, enquanto o NP é constituído por proteoglicanos, maioritariamente agrecanos. Tem sido sugerido que o processo degenerativo se inicia no NP e depende da perda de proteoglicanos.[8] Geralmente, as HDIV ocorrem no contexto da degeneração do DIV.[9] Com as recorrentes agressões biomecânicas, aliadas à perda da homeostasia na composição do DIV, o AF acaba por romper, ocorrendo a falência da sua integridade e permitindo o extravasamento do NP.[10] Ainda são desconhecidos os mecanismos concretos responsáveis pelo processo de reabsorção espontânea das HDIV. Várias hipóteses foram sugeridas, das quais realçamos a desidratação do tecido herniado, o repuxamento pelo ligamento longitudinal posterior (LLP) e o envolvimento de uma resposta imune. Independentemente destas hipóteses, foram encontrados vários fatores associados à maior probabilidade da ocorrência a regressão espontânea das HDIV. Material e Métodos A base de dados utilizada foi a PUBMED, onde foram selecionados artigos completos e revisões escritas em língua inglesa publicados entre 1953 e 2017. Os termos usados foram “intervertebral disc”, “intervertebral disc displacement”, “spontaneous resorption” “immune system”, isoladamente ou em combinação. A lista de referências dos artigos identificados foi também analisada na procura de mais artigos relevantes associados ao tema. Discussão 1. Mecanismos de reabsorção hipotéticos Uma das hipóteses propostas na literatura para a regressão espontânea das HDIV é a da desidratação, ocorrendo uma redução do tamanho do NP herniado após esse fenómeno.[11] Através de RMN, observa-se numa fase inicial que a intensidade de sinal do NP herniado aumenta em relação à do NP original, diminuindo de seguida com o tempo.[12] Esta perda de intensidade de sinal nas ponderações em T2 da RMN suporta a hipótese da desidratação.[12, 13] Quando a intensidade de sinal é inicialmente elevada 4 nas imagens em T2, a probabilidade da regressão do tamanho da hérnia é maior, comparativamente aos casos em que a intensidade de sinal inicialmente é baixa. Isto leva a inferir que a intensidade de sinal pode ser um bom preditor da redução espontânea do HDIV.[12, 14] No entanto, a desidratação ao contribuir para uma redução do tamanho da HDIV, não explica os casos de desaparecimento completo do fragmento livre.[11] Outra hipótese sugerida pressupõe a ocorrência de um fenómeno de retração mecânica do material herniado, retornando para o interior do DIV,[4, 15] possivelmente através de uma variação de tensão no LLP[13] e também por um possível fenómeno de negativização da pressão do espaço intradiscal, levando ao repuxamento espontâneo do material herniado.[13, 15] Contudo, como descreveremos mais à frente, a reabsorção espontânea das HDIV ocorre mais frequentemente quando estas se encontram sequestradas, estando neste caso totalmente separadas do próprio LLP.[16] Estes achados sugerem que a teoria do repuxamento do conteúdo herniado pelo LLP não se adequa na fundamentação de um mecanismo para a regressão espontânea de todas as HDIV. Por último, a hipótese que relaciona o envolvimento do sistema imune no processo de reabsorção espontâneo das HDIV permanece a mais aceite pela comunidade científica. Conquanto, o próprio sistema imune é um vasto e complexo domínio gerador de múltiplas e distintas respostas, muitas vezes interligadas, que iremos relacionar com o seu possível envolvimento naquele processo. De um modo geral, permanece controvérsia na abordagem a este assunto pelos vários autores. A divergência de opiniões centra-se em duas hipóteses para o mecanismo imunomediado responsável pela reabsorção espontânea do DIV. Uma considera o envolvimento da imunidade inata, com a formação de uma resposta inflamatória direcionada ao NP. Outra foca a resposta secundária da imunidade adaptativa, com a formação de uma resposta autoimune direcionada ao NP. 2. DIV imunoprivilegiado O DIV é a maior porção de tecido avascular do adulto, estando por esse motivo isolado do sistema imune do hospedeiro.[16, 17] Ao ser considerado um dos locais imunoprivilegiados do ser humano, a existência de células imunológicas no seu interior é sinal de rotura da barreira imunológica. O ambiente imunologicamente privilegiado do DIV não se deve apenas a uma simples barreira física entre os tecidos do DIV e a circulação sanguínea, mas também à envolvência de uma série de mecanismos moleculares contribuidores para uma barreira fisiológica.[17, 18] O Fas Ligando (FasL) é expresso na superfície celular de linfócitos T citotóxicos (CTL), células Natural Killer (NK) e em locais imunologicamente privilegiados.[17] Atua causando a morte apóptica de células que expressam o seu recetor, por meio da ativação de uma cascata de caspases.[19] Foi comprovado que o FasL existe nas células do DIV, particularmente nas células do NP.[20] As células do NP saudáveis sobreregulam o FasL, induzindo a apoptose de células endoteliais vasculares, macrófagos e CTL que invadem o DIV.[17, 18] Outro dado também relevante é que a expressão do FasL nas células do NP saudável é significativamente superior em relação ao NP degenerado.[17] Por outro lado, a expressão de FasL nas células do NP de HDIV contidas foi significativamente superior em relação às HDIV extrusas.[20] Portanto, a expressão do FasL nas células do NP humano ao prevenir a neovascularização[18] e a infiltração de células inflamatórias no DIV, através da 11 com um predomínio da concentração sérica IL-4, enquanto as extrusões do DIV com o predomínio de TNFα.[81] Localmente, as concentrações de IFNγ e IL-12 foram superiores nas HDIVE, ao contrário da IL-4, em que a sua concentração foi superior nas HDIVC.[21] A positividade para o IFNγ, a presença de macrófagos e o aumento de celularidade no DIV parece traduzir resposta do tipo Th1 na HDIV.[82] A análise do plasma sérico demonstrou significativamente um aumento dos níveis de fatores pro inflamatórios (IL-1β, IL-2, IL-12, IFNγ e TNFα) e uma diminuição dos níveis de IL-4 em indivíduos com evidência de HDIV, em comparação aos indivíduos sem a patologia. Apesar de numerosos fatores afetarem os níveis no sangue periférico, uma total avaliação do sistema imune poderá ser útil na definição do tratamento médico na HDIV.[69] Uma nota final para o papel da citocina proinflamatória IL-2, que está aumentada em HDIV, possuindo um papel patogénico no prolapso de DIV, nomeadamente através da promoção da apoptose celular e da degradação da matriz extracelular no NP de DIV.[83] Num outro estudo, Geiss et al. verificou que o NP autólogo transplantado subcutaneamente atrai uma proporção significativamente elevada de linfócitos T (com maior proporção de linfócitos T CD4+ em comparação aos linfócitos T CD8+) e linfócitos B ativados expressando a imunoglobulina kappa. Observaram também uma grande quantidade de células T CD45RC imunorreativas, indicando a presença de linfócitos T de memória. A grande expressão de linfócitos B expressando cadeias leves kappa de IgG aponta mais para a presença de linfócitos B de memória, do que de plasmócitos produtores de autoanticorpos. Este estudo permitiu confirmar que o NP herniado atrai linfócitos T e B, mimetizando a sua exposição aquando da herniação do DIV, e mostrando a sua potencialidade para gerar uma reposta imune específica devido às suas propriedades autoimunes. Os linfócitos T CD4+ e linfócitos B devem estar envolvidos nesta resposta, [84] pelo que a sua prevalência é superior nos sequestros comparativamente às extrusões.[72] A ativação de linfócitos T representa o marco na geração de uma possível resposta autoimune, levando subsequentemente à diferenciação de linfócitos B.[84] A quantidade de linfócitos T e macrófagos, assim como as concentrações de imunoglobulinas IgM e IgG no sangue periférico, foram superiores em pacientes com HDIVE comparativamente àqueles com protusões.[79] Satoh et al. verificou através de estudos imunohistoquímicos do conteúdo de tecido herniado a existência de complexos antigénio-anticorpo localizados na cápsula pericelular dos condrócitos da HDIV. Tais complexos não foram observados nas amostras de NP não herniado dos mesmos doentes e no grupo de controlo. Os autores sugerem que a IgG é o anticorpo primário, ligando-se a estruturas específicas no tecido da HDIV. Contudo, afirmam que o antigénio responsável é desconhecido.[85] Verificou-se que a IgM e a IgG são depositadas em redor dos vasos recém-formados e do NP das HDIV, concluindo que estas imunoglobulinas possuem um papel importante na resposta imune do HDIV. [79] 7. Fagocitose Independentemente do processo imune subjacente, é de algum modo consensual que a reabsorção espontânea ocorre através da fagocitose do tecido herniado, mediada pelos macrófagos.[61, 62, 65, 86, 87] As principais ações mediadas pelos macrófagos parecem decorrer da sua poderosa atividade fagocítica e secretora de enzimas com um papel na digestão e degradação do material herniado.[62] 12 Ikeda et al. verificou a existência de proteínases em redor dos infiltrados macrófagicos.[54] Estas enzimas, maioritariamente metaloproteínases da matriz (MMP), ADAMTS ou catepsinas, estão envolvidas na degradação da matriz extracelular do NP através do seu papel na decomposição de colagénio, agrecanos e proteoglicanos.[54, 55, 61, 71] As quimiocinas além de influenciarem a infiltração de macrófagos, parecem também promover a ativação das MMP.[33, 43, 59, 61, 62, 65-67] A produção MMP é regulada por inibidores tecidulares da metaloproteínase 1 (TIMP1), glicoproteínas naturalmente produzidas no DIV que inibem as MMP. De um modo geral os macrófagos expressam caracteristicamente MMP7[33, 86, 88, 89] e MMP3[33, 90]. Por sua vez, as células do DIV expressam caracteristicamente MMP3[33, 89, 91, 92], TIMP1[92], MMP7[86, 91] e MMP1[93] (Tabela 1) A elevação dos níveis de MMP, principalmente de MMP3, ocorre paralelamente ao aumento do número de macrófagos.[33, 61, 87] As MMP1 e MMP3 estão envolvidas na formação do tecido de granulação, na degradação e na reabsorção dos tecidos da HDIV.[71] (Figura 2) No tecido do DIV saudável a expressão de MMP1 é superior à de MMP3, contudo diminui com a evolução da degeneração do DIV, tornando-se os níveis de ambas as MMP similares num estado avançado da degeneração. Quando ocorre herniação do DIV os níveis de MMP3 tornam-se superiores aos de MMP1, indicando que a reabsorção do tecido herniado parece estar mais dependente da MMP3.[93] A produção de MMP1[58], MMP3[58, 90, 92] e MMP7[86] aumentam significativamente quando o NP herniado é exposto ao espaço epidural, estando aumentadas nas HDIVE em comparação às HDIVC. Haro et al. através de um modelo de cocultura de macrófagos de ratinhos com tecidos do DIV, relacionou a expressão de MMP7, MMP3 e TNFα pelos macrófagos com a redução do peso da amostra de tecido do DIV e a sua reabsorção. Concluiu que a produção de MMP7 por macrófagos é requerida para a indução de MMP3 no DIV e este efeito é mediado por uma via de sinalização que envolve o TNFα. O efeito da MMP7 não foi direto na síntese de TNFα, mas na sua libertação na superfície celular.[88] Temporalmente ocorre primeiro a expressão de TNFα, seguindo-se a expressão de uPA, de MMP7 e de MMP3. A uPA ativa as formas latentes de MMP3 e MMP7.[89] O TNFα é assim necessário, mas não suficiente, para a reabsorção do DIV.[88] O TNFα induz a produção de MMP3 nas células do DIV de forma significativa [58, 88, 91, 94]comparativamente, a IL-1β apresenta um efeito mais modesto na indução da MMP3, sendo esta mais responsiva ao TNFα.[88, 94] Quando estimuladas com IL-1β e TNFα, as HDIVE produzem uma maior quantidade de MMP1 e MMP3 do que as HDIVC.[58] Os macrófagos produzem TNFα e MMP7, resultando na libertação de mais TNFα.[88] Ocorre assim a consequente produção de MMP3 pelas células do DIV que contribui para a geração de fatores promotores da migração de macrófagos, através do seu papel na comunicação condrócito/macrófago.[33, 88, 91] O papel da expressão de MMP3 na degradação dos diversos componentes da matriz do DIV[94] parece estar mais relacionado com a mediação da interação célula-célula do que com a própria degradação da matriz dos tecidos herniados.[33] A MMP7 apesar de ser necessária para a libertação de TNFα e, indiretamente, para a infiltração de macrófagos no tecido do DIV,[88] é uma enzima potente envolvida na degradação direta dos tecidos de HDIV. Neste sentido, foi demonstrado que a MMP7 leva uma diminuição significativa, enquanto a MMP3 13 origina apenas uma diminuição relativa do peso das amostras no modelo estudado.[70] A indução da MMP3 nas células do DIV foi necessária, mas não suficiente, para ocorrer degradação da matriz no modelo de reabsorção da HDIV.[33] Os autores especulam que as várias famílias de proteínases atuem em conjunto ao mediar a destruição da cartilagem no processo de reabsorção do HDIV.[86, 88] As catepsinas são proteínases de serina produzidas pelas células do DIV independentemente da infiltração de macrófagos, ao contrário das MMP. O pico da quantidade de catepsinas G e L ocorre antes da invasão do DIV por macrófagos, sendo o pico da catepsina L mais tardio do que o da catepsina G. A catepsina G e a CCL2(=MCP1) parecem ativar-se antes do início do processo de reabsorção dependente dos macrófagos. Estas parecem influenciar a própria infiltração de macrófagos e a ativação das MMP produzidas por eles mesmo. Efetivamente, estas catepsinas ativam as MMP latentes e degradam TIMP. A localização da catepsina G e das MMP foi semelhante, o que reforça esta evidência.[61] As ADAMTS4/5 são importantes enzimas envolvida na degradação de agrecanos.[51, 95, 96] Os macrófagos dos tecidos de granulação expressam ADAMTS4, sugerindo o seu envolvimento na regressão da HDIV. A contagem de macrófagos e a expressão de ADAMTS4 foi significativamente superior nas HDIVE, comparando com as HDIVC, pelo que estas evidências poderão explicar a razão pela qual as primeiras são mais rapidamente reabsorvidas.[51] Tanto a ADAMTS4, como a ADAMTS5 são necessárias para a degradação dependente de citocinas nas células do NP humano, pelo que a sua função não parece ser redundante, sugerindo o seu papel em patologias do DIV.[96] Conclusão Ainda existe controvérsia em relação ao tipo de imunidade implicada na reabsorção das HDIV, ficando os autores com a impressão que quer a imunidade inata, quer a imunidade específica podem estar ambas implicadas. É de algum modo consensual que no processo de reabsorção das HDIV estão envolvidos fenómenos de neovascularização, quimiotaxia de células imunes e formação de um tecido de granulação, culminando na fagocitose onde várias famílias de proteínases atuam em conjunto para destruir o material herniado. Foram encontrados fatores que se associam a uma maior probabilidade de reabsorção como as HDIVE, o maior volume e intensidade de sinal do material herniado, enquanto que por outro lado um maior conteúdo de plataforma cartilagínea e a associação a alterações Modic influenciam negativamente aquele processo. Bibliografia 1. Hoy, D., et al., A systematic review of the global prevalence of low back pain. Arthritis Rheum, 2012. 64(6): p. 2028-37. 2. Walker, B.F., The prevalence of low back pain: a systematic review of the literature from 1966 to 1998. J Spinal Disord, 2000. 13(3): p. 205-17. 3. Simon, J., et al., Discogenic low back pain. Phys Med Rehabil Clin N Am, 2014. 25(2): p. 305-17. 4. Bozzao, A., et al., Lumbar disk herniation: MR imaging assessment of natural history in patients treated without surgery. Radiology, 1992. 185(1): p. 135-41. 5. Komori, H., et al., The natural history of herniated nucleus pulposus with radiculopathy. Spine (Phila Pa 1976), 1996. 21(2): p. 225-9. 14 6. 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Legenda: TNF𝛂, tumor necrosis factor alpha; IL-1𝛃, interleukin-1 beta; bFGF, basic fibroblast growth factor; VEGF, vascular endothelial growth factor; uPA, urokinase-type plasminogen activator; MMP, matrix metalloprotease; ADAMTS, a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs; TIMP, tissue inhibitor of metalloproteinases. O texto dos artigos de revisão não obedece a um esquema rígido de secções. O texto dos casos clínicos deve conter as seguintes secções, cada uma com o seu respectivo subtítulo: a) Introdução: apresenta de modo sucinto o que se sabe a respeito da patologia em questão e quais são as práticas actuais de abordagem diagnóstica e terapêutica. b) Descrição do(s) caso(s): o caso é apresentado com detalhes suficientes para o leitor compreender toda a evolução e os seus factores condicionantes. Quando o artigo descrever mais de um caso, sugere-se agrupar as informações em tabela. c) Discussão: apresenta correlações do(s) caso(s) com outros descritos e a sua importância para a prática clínica. Agradecimentos: Devem ser breves e objectivos, somente a pessoas ou instituições que contribuíram significativamente para o estudo, mas que não tenham preenchido os critérios de autoria. Os integrantes da lista de agradecimento devem dar a sua autorização por escrito para a divulgação de seus nomes, uma vez que os leitores podem supor seu endosso às conclusões do estudo. Referências bibliográficas: As referências bibliográficas devem ser numeradas e ordenadas segundo a ordem de aparecimento no texto, no qual devem ser identificadas pelos algarismos árabes respectivos entre parêntesis. Se houver mais de 6 autores, devem ser citados os seis primeiros nomes seguidos de "et al". Os títulos de revistas devem ser abreviados de acordo com o estilo usado no Índex Medicus,. Uma lista extensa de periódicos, com as suas respectivas abreviaturas, está disponível através da publicação da NLM "List of Serials Indexed for Online Users" em http://www.nlm.nih.gov/tsd/journals. As referências bibliográficas devem estar em conformidade com os requisitos uniformes para artigos submetidos a revistas biomédicas (“Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals”), publicado pelo Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (estão disponíveis exemplos de referências bibliográficas em: http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html Listam-se em seguida alguns exemplos de referência bibliográfica: 1. Artigo padrão Halpern SD, Ubel PA, Caplan AL. Solid-organ transplantation in HIV-infected patients. N Engl J Med. 2002;347:284-7. 2. Livro Murray PR, Rosenthal KS, Kobayashi GS, Pfaller MA. Medical microbiology. 4th ed. St. Louis: Mosby; 2002. 3. Capítulo de livro Meltzer PS, Kallioniemi A, Trent JM. Chromosome alterations in human solid tumors. In: Vogelstein B, Kinzler KW, editors. The genetic basis of human cancer. New York: McGraw-Hill; 2002. p. 93-113. 4. Teses e dissertações Borkowski MM. Infant sleep and feeding: a telephone survey of Hispanic Americans [dissertation]. Mount Pleasant (MI): Central Michigan University; 2002. 5. Trabalho apresentado em congresso ou similar (publicado) Christensen S, Oppacher F. An analysis of Koza's computational effort statistic for genetic programming. In: Foster JA, Lutton E, Miller J, Ryan C, Tettamanzi AG, editors. Genetic programming. EuroGP 2002: Proceedings of the 5th European Conference on Genetic Programming; 2002 Apr 3-5; Kinsdale, Ireland. Berlin: Springer; 2002. p. 182-91. 6. Artigo de revista eletrónica Abood S. Quality improvement initiative in nursing homes: the ANA acts in an advisory role. Am J Nurs [serial on the internet]. 2002 Jun [cited 2002 Aug 12];102(6):[about 3 p.]. Available from: http://www.nursingworld.org/AJN/2002/june/Wawatch.htm. 7 Sítio na Internet Cancer-Pain.org [homepage on the Internet]. New York: Association of Cancer Online Resources, Inc.; c2000-01 [updated 2002 May 16; cited 2002 Jul 9]. Available from: http://www.cancer-pain.org/. Artigos aceites para publicação, mas ainda não publicados, podem ser citados desde que seguidos da indicação “in press”. Observações não publicadas e comunicações pessoais não podem ser citadas como referências; se for imprescindível a inclusão de informações dessa natureza no artigo, elas devem ser seguidas pela observação "observação não publicada" ou "comunicação pessoal" entre parênteses no corpo do artigo. Tabelas: Cada tabela deve ser apresentada em folha separada, numerada na ordem de aparecimento no texto, e com um título sucinto, porém explicativo. Todas as notas explicativas devem ser apresentadas em notas de rodapé e não no título, identificadas pelos seguintes símbolos, nesta sequência: *,†,‡,§,||,,**,††,‡‡. As tabelas não devem conter linhas verticais ou horizontais a delimitar as células internas. Figuras (fotografias, desenhos, gráficos): Todas as figuras devem ser numeradas na ordem de aparecimento no texto. As notas explicativas devem ser apresentadas nas legendas. As figuras reproduzidas de outras fontes já publicadas devem indicar a fonte e ser acompanhadas por uma carta de permissão de reprodução do detentor dos direitos de autor. As fotografias não devem permitir a identificação do paciente ou devem ser acompanhadas de autorização por escrito para publicação. As imagens em formato digital devem ser anexadas nos formatos TIFF ou JPEG, com resolução entre 300 e 600 ppp, dimensão entre 15cm e 20cm e a cores, para possibilitar uma impressão nítida. As figuras serão convertidas para o preto-e-branco só para efeitos de edição impressa. Caso os autores julguem essencial que uma determinada imagem seja colorida, solicita-se contacto com os editores. As imagens em formato de papel devem conter no verso uma etiqueta com o seu número, o nome do primeiro autor e uma seta indicando o lado para cima. Legendas das figuras: Devem ser apresentadas em página própria, devidamente identificadas com os respectivos números. Abreviaturas, símbolos e acrónimos: Devem ser evitados, principalmente no título e resumo. O termo completo expandido deve preceder o primeiro uso de uma abreviatura, símbolo ou acrónimo. Unidades de medida: Devem ser usadas as Unidades do Sistema Internacional (SI), podendo usar-se outras unidades convencionais quando forem de uso comum. RPOT - Revista Portuguesa de Ortopedia e Traumatologia Rua dos Aventureiros, nº 19 B, Parque das Nações 1990-024 LISBOA - PORTUGAL Tel: +351 21 895 8666 E-mail: [email protected]