Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos

Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Dissertação do Mestrado em Ciências e Tecnologia do Ambiente Ana Catarina Faria Ferreira Departamento de Geociências, Ambiente e Ordenamento do Território Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Porto, 7 de Novembro de 2014 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Dissertação do Mestrado em Ciências e Tecnologia do Ambiente Ana Catarina Faria Ferreira Orientada por: Prof. Doutora Maria Clara Basto Doutora Marisa Almeida Dissertação submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para obtenção do grau de Mestre em Ciências e Tecnologia do Ambiente, Área de especialização em Tecnologias de Remediação Ambiental Departamento de Geociências, Ambiente e Ordenamento do Território Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Porto, 7 de Novembro de 2014 F C U P | i Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Agradecimentos À Doutora Maria Clara Basto, minha orientadora, pela disponibilidade, empenho e apoio demonstrado ao longo deste trabalho. À Doutora Cristina Marisa Almeida, minha coorientadora, um agradecimento especial, pela sua disponibilidade, estímulo, dedicação, pelas críticas pertinentes e construtivas ao longo do trabalho. À Doutora Ana Paula Mucha pela orientação prestada na análise dos nutrientes no laboratório do ECOBIOTEC do CIIMAR, assim como por todo o apoio e incentivo. Ao Doutor Carlos Rocha Gomes e à Doutora Isabel Rocha pela disponibilidade e pela disponibilização de equipamento laboratorial necessário para a análise de diversos parâmetros, assim como o seu conhecimento. Às colegas, Filipa Santos e Iolanda Lourinha pelo companheirismo e preciosa ajuda ao longo das experiências laboratoriais. Ao Engenheiro Tiago pela recetividade e colaboração no fornecimento de água residual da suinicultura. Ao meu pai, ao meu guerreiro eterno, ao qual dedico este trabalho, um agradecimento muito especial pela força e coragem transmitida, incentivando-me a nunca desistir. À minha mãe, o pilar da minha vida, pelos conselhos, pelo incentivo e pela compreensão. Á Raquel e ao Vasco, pelo apoio e por me ouvirem sempre nos momentos mais difíceis. Ao Tio Eduardo pelos conselhos e pela sabedoria transmitida. Á “mãe” Paula pela amizade, companheirismo, compreensão, preocupação e transmissão de força para “lutar” ao longo deste percurso. À Sónia e ao Miguel pela boa disposição e pelo apoio moral. Á Patrícia e à Nathalie pela prestabilidade na resolução de questões técnicas. F C U P | ii Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos F C U P | iii Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Resumo As Zonas Húmidas Construídas (ZHC) podem ser utilizadas para um tratamento adicional após o tratamento convencional das águas residuais, sendo uma alternativa barata para a redução dos diversos poluentes presentes nas águas residuais, nomeadamente matéria orgânica, nutrientes e metais. Recentemente estes sistemas têm sido também utilizados para remoção dos chamados poluentes emergentes. Estes poluentes emergentes podem ser nocivos quer para as comunidades microbianas quer para as plantas, que são os agentes mais importantes destes sistemas de ZHC. É necessário, portanto, investigar a influência que a presença de poluentes emergentes, nomeadamente antibióticos, pode ter na remoção dos restantes poluentes nestes sistemas, sendo este o objetivo do presente trabalho. Utilizaram-se microcosmos com a planta Phragmites australis de forma a simular as ZHC. Adicionou-se água residual de suinicultura dopada com 100 µg/L de enrofloxacina (Enr) e ceftiofur (Cef), dois antibióticos bastante utilizados na agropecuária. Assim, três microcosmos foram dopados com 100 µg/L Enr cada um, três microcosmos foram dopados com 100 µg/L Cef cada um, outros três microcosmos foram dopados com 100 µg/L de Enr e 100 µg/L de Cef, cada um. Nos restantes três microcosmos a água residual não foi dopada com nenhum dos fármacos veterinários servindo como controlo. A água residual da suinicultura foi tratada em ciclos de uma semana. No final de cada semana a água foi removida de cada microcosmos e nova água residual dopada, ou não, foi adicionada a cada microcosmo. Ao longo de diversas semanas (semana 1, 2, 4, 8 e 14) as amostras de água residual tratada foram recolhidas para posterior análise de diversos parâmetros, tais como a concentração de nutrientes (azoto amoniacal, ião nitrato, ião nitrito e fósforo (na forma de ião fosfato)), concentração de metais (zinco (Zn), cobre (Cu), ferro (Fe) e manganês (Mn)), concentração de matéria orgânica (carência química de oxigénio (CQO)), incluindo a biodegradável (carência bioquímica de oxigénio (CBO)), e concentração de sólidos (sólidos totais (ST), sólidos totais voláteis (SVT), sólidos suspensos totais (SST) e sólidos suspensos voláteis (SSV), bem como dos dois fármacos veterinários (Enr e Cef). Verificou-se que houve uma remoção de matéria orgânica biodegradável (CBO) presente nas águas residuais na ordem dos 90%. Em relação aos sólidos ocorreram remoções na ordem dos 80% para os SST e entre 40% e 60% para os SVT. Relativamente ao azoto amoniacal observaram-se remoções entre 76 e 96% e para o F C U P | iv Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos ião fosfato a remoção atingiu os 93% nas primeiras semanas do estudo. Quanto aos metais as remoções foram no geral superiores a 70 e 80% para Cu e Zn, respetivamente, e superior a 40% para Mn. Para o Fe as remoções foram superiores a 60% até à semana 8, diminuindo na semana 14. Os fármacos veterinários (Enr e Cef) foram também eficazmente removidos (remoções superiores a 90% para a fração solúvel analisada). Apesar das elevadas percentagens de remoção, alguns parâmetros (CQO, SST e azoto amoniacal) não cumpriram os requisitos expressos na legislação para a descarga de águas residuais, indicando que seria necessário um dimensionamento dos microcosmos diferente. No geral, não existiram diferenças nas remoções ao longo do tempo até à semana 8. Após a semana 8 alguns parâmetros (por exemplo, pH, Fe, Cu, azoto amoniacal, ião nitrato, ião nitrito e ião fosfato) indicaram que os sistemas de microcosmos estariam a diminuir a eficácia dos processos de remediação, o que poderá estar associado, por exemplo, ao declínio da vitalidade das plantas observado a partir desse período. No geral, a presença de fármacos veterinários (Enr e Cef) adicionados às águas residuais de suinicultura não influenciaram a remoção dos poluentes presentes nas mesmas, sendo a única exceção a remoção de Fe para a qual contribuiu a presença dos antibióticos. O presente estudo permite concluir que, nas condições testadas, a presença de fármacos veterinários, nomeadamente os antibióticos Enr e Cef, não influenciou os processos biogeoquímicos que ocorrem naturalmente nas ZHC para o tratamento de águas residuais da indústria agropecuária, não afetando significativamente o funcionamento destes sistemas. Palavras-chave: Águas residuais; Zonas Húmidas Construídas; Remediação; Antibióticos; Nutrientes; Metais. F C U P | v Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Abstract Constructed wetlands can be used as an additional treatment after conventional treatments of the residual waters. It is an inexpensive alternative to reduce the various pollutants present in residual waters, such as organic matter, nutrients and metals. Recently these systems have also been used to remove the so called emergent pollutants. These pollutants can be harmful for both microbial communities and plants, which are the most important agents in constructed wetlands. Therefore, the influence that emergent pollutants presence, namely antibiotics, may have on the removal of the remaining pollutants in these systems must be assessed, being this the objective of the present work. Microcosms were assembled with the plant Phragmites australis to simulate constructed wetlands, and feed with pig industry wastewater a doped with 100 µg/L of enrofloxacin and ceftiofur, two of the most used antibiotics in the agriculture. Thus, twelve microcosms were assembled: a) for three microcosms wastewater was doped with 100 µg/L of enrofloxacin, b) for other three microcosms wastewater was doped with 100 µg/L of ceftiofur, c) for another three microcosms wastewater was doped with 100 µg/L of enrofloxacin and with 100 µg/L of ceftiofur and d) for remaining three microcosms wastewater was without veterinary antibiotics to be used as a control. The wastewater of the pig industry was treated with one week cycle. By the end of each week the water was removed from each microcosms and new wastewater was added to each microcosm with or without the veterinary antibiotics. Through several weeks (weeks 1, 2, 4, 8 and 14) the treated wastewater samples were collected for further analysis of some parameters such as nutrient concentrations (ammonia, nitrates, nitrites and phosphates), metal concentrations (zinc, copper, iron and manganese), organic matter concentrations (chemical oxygen demand (COD)), including the biodegradable organic matter (biological oxygen demand (BOD)), and solid concentrations (total solids, total volatile solids (TVS), total suspended solids (TSS) and volatile suspended solids), as well as both veterinary drugs (enrofloxacin and ceftiofur) concentrations. A removal of biodegradable organic matter in treated wastewater around 90% was observed. Regarding solids, there were a removal around 80% for TSS and a removal between 40 to 60% for TVS. For ammonia the removal was around 76 to 96% and for phosphates the removal achieved 93% in the first weeks of the study. For metals, removals were generally higher than 70% and 80% for Cu and Zn, respectively and higher than 40% for Mn. For Fe, removals were higher than 60% till week 8, F C U P | xii Potencialidades da remediação biológica para a remoção de fármacos e poluentes emergentes inicial de ST 1,5 ± 0,2 g/L. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. As percentagens de remoção deste parâmetro relativo à água inicial são também apresentadas. Valor Limite de Emissão CBO5 presente no DecretoLei nº 236/98 de 1 de Agosto: 0,06 g/L. Valor da água Inicial de suinicultura na semana 8: 1,5 ± 0,2 g/L. ........................................................................................................... 38 Figura 10 – Concentração de azoto amoniacal (média e desvio padrão, n=3) presente nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de azoto amoniacal relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão de azoto amoniacal presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto: 10 mg/L (0,55 mM). Valores na água residual inicial entre 27 e 70 mM. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. Wi, semana i. ..................................................... 40 Figura 11Concentração de ião nitrato (NO3-) e ião nitrito (NO2-) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão de ião nitrato presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto: de 50 mg/L NO3- (800 µM). Valores de ião nitrato na água residual inicial entre 1,1 e 313 µM. Valores de ião nitrito na água residual inicial entre 3,4 e 9,9 µM. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. Wi, semana i.i. ................................................... 41 Figura 12 - Concentração de ião fosfato (PO4-) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de ião fosfato relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão de fósforo presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto: 10 mg/L (323 µM). Valores na água residual inicial entre 908 uM e 159 uM. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. Wi, semana i. ............................................................................................... 43 F C U P | xiii Potencialidades da remediação biológica para a remoção de fármacos e poluentes emergentes Figura 13 - Concentração de zinco (Zn) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de zinco relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valores na água residual inicial entre 805 ug/L e 3292 ug/L. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. * inferior ao limite de detecção. Wi, semana i. ......................................................................................... 46 Figura 14 - Concentração de manganês (Mn) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de manganês relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão do Mn presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto= 2,0 mg/L. Valores na água residual inicial: 397 µg/L em média. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. * não determinado. Wi, semana i. ........................................................................................ 47 Figura 15 - Concentração de ferro (Fe) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de ferro relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão do Fe presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto= 2,0 mg/L. Valores na água residual inicial entre. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. * inferior ao limite de deteção. Wi, semana i. .............................................................................................................. 49 Figura 16 – Representação Esquemática da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) retirado de https://fenix.tecnico.ulisboa.pt/downloadFile/3779571246992/LQIIICromat_HPLC_Cafeina.pdf). ...................................................................................... 68 F C U P | xiv Potencialidades da remediação biológica para a remoção de fármacos e poluentes emergentes Índice de Tabelas Tabela 1Valores limite de emissão (VLE) na descarga de águas residuais presentes no Decreto-Lei nº236/98, de 1 de Agosto. .................................................................... 8 Tabela 2 – Identificação de fármacos veterinários classificados como de alta prioridade referente ao sector da suinicultura (Carvalho, 2012). .................................................. 12 F C U P | xv Potencialidades da remediação biológica para a remoção de fármacos e poluentes emergentes F C U P | xvi Potencialidades da remediação biológica para a remoção de fármacos e poluentes emergentes Abreviaturas e símbolos CBO – Carência Bioquímica de Oxigénio Cef - Ceftiofur CONT – microcosmo com adição de água residual sem fármacos CQO - Carência Química de Oxigénio Enr - Enrofloxacina ETARs – Estações de Tratamento de Águas Residuais HPLC – Cromatografia de Alta Eficiência Mix – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur SSTSolidos Suspensos Totais SSVSólidos Suspensos Voláteis ST – Sólidos Totais SVT – Sólidos Voláteis Totais VLE – Valor Limite de Emissão ZHC – Zonas Húmidas Construídas F C U P | xvii Potencialidades da remediação biológica para a remoção de fármacos e poluentes emergentes F C U P | xviii Potencialidades da remediação biológica para a remoção de fármacos e poluentes emergentes F C U P | 1 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Capítulo I - Introdução F C U P | 2 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos F C U P | 3 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos 1. Introdução geral Ao longo dos anos foram sendo realizados estudos para a caracterização de águas residuais tendo sido utilizadas técnicas cada vez mais específicas para análise dos constituintes das mesmas, e para compreender os efeitos na saúde e no meio ambiente. As águas residuais podem conter matéria orgânica, nutrientes, metais pesados e outras substâncias, entre as quais poluentes emergentes tais como os fármacos. O tratamento de águas residuais é um procedimento relevante para a sustentabilidade do meio ambiente, económico e social. Existem diversos tratamentos convencionais nomeadamente em Estações de Tratamentos de Águas Residuais onde se utilizam processos físicos, químicos e biológicos para a remoção dos poluentes nelas presentes (Gray, 2004). Existe legislação ambiental relativamente ao tratamento de águas residuais, tendo em consideração diversos parâmetros de qualidade, de forma a ocorrer a descarga dos efluentes para o meio hídrico cumprindo os limites de emissão. A Diretiva 91/271/CEE relata a recolha, tratamento e descarga de águas residuais urbanas assim como o tratamento e descarga de águas residuais de determinados setores industriais (Gray, 2004). Nas últimas décadas, as Zonas Húmidas Construídas (ZHC) têm demonstrado uma significativa melhoria da eficiência de remoção em relação aos tratamentos convencionais de águas residuais, nomeadamente águas residuais domésticas, águas residuais industriais, águas residuais agrícolas, entre outras. (Li et al., 2014). Em comparação com os tratamentos convencionais, estas apresentam baixos custos. O uso das ZHC tornou-se comum, peculiarmente em áreas que carecem de sistemas de esgotos em países economicamente subdesenvolvidos (Liu et al., 2014), tendo estas sido já muito testadas para a remoção de nutrientes presentes nas águas (Gao et al., 2014). Ao longo do tempo, o consumo de produtos farmacêuticos tem aumentado, sendo necessária a remoção dos mesmos, procurando-se alternativas de baixo custo e eficientes como as ZHC (Li et al., 2014). Recentemente, as ZHC começaram a ser pesquisadas para a remoção de micro poluentes orgânicos, nomeadamente de produtos farmacêuticos. Contudo, vários estudos apenas se focam na presença de produtos farmacêuticos de uso humano nas F C U P | 10 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos questão. Existe a necessidade de investigar o comportamento, o destino, risco e controlo de tais poluentes emergentes (Li et al., 2014). Muitos produtos farmacêuticos não são completamente metabolizados pelo organismo do ser humano e dos animais, sendo excretados pela urina e fezes, ficando as águas residuais contaminadas pelos mesmos. Atualmente, os tratamentos convencionais das águas residuais não estão preparados para a eliminação eficaz de produtos farmacêuticos, não sendo estes completamente removidos. Consequentemente, os vários tipos de produtos farmacêuticos entram em contacto com águas superficiais, águas subterrâneas, águas costeiras e até mesmo águas potáveis através dos efluentes das ETARs. Assim, os compostos farmacêuticos e os respetivos metabolitos desencadeiam potenciais riscos para a saúde dos seres humanos, tais como reações inflamatórias no fígado e, também, para a vida aquática, onde poderá ocorrer, por exemplo, a feminização dos peixes machos, o comprometimento do funcionamento renal e hepático dos peixes, o desenvolvimento de resistência dos organismos patogénicos e a diminuição da diversidade do plâncton (Li et al., 2014). São, portanto, necessários controlos mais rigorosos no tratamento de fármacos em águas residuais. A principal investigação dos efeitos dos poluentes emergentes sobre o meio ambiente tem sido focada apenas em produtos farmacêuticos aplicados a seres humanos, sendo negligenciada a investigação de produtos farmacêuticos veterinários utilizados nas atividades agropecuárias. O aumento mundial do consumo de carne tem pressionando a indústria agropecuária para a utilização de produtos farmacêuticos de modo a proteger a saúde animal, evitar a perda económica e a garantir a qualidade do alimento (D’Amato, 2011). No entanto, estima-se que, por exemplo, 75% dos antibióticos administrados aos animais sejam excretados, podendo os mesmos entrar no ambiente não só através das ETARs mas também através da aplicação direta dos dejetos dos animais (estrume) em solos como forma de fertilizante (Carvalho, 2012).Existe uma vasta gama de fármacos e aditivos alimentares em utilização no sector pecuário, nomeadamente os antibióticos, anti-inflamatórios, antiparasitários, anestésicos, hormonas sexuais, antissépticos, broncodilatadores e antifúngicos. De entre os fármacos aprovados para a utilização no setor pecuário, os antibióticos estão entre os mais utilizados (Carvalho, 2012). Por exemplo, estima-se que o valor médio anual de antibióticos veterinários utilizados na China seja de cerca F C U P | 11 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos de 6000 toneladas. Nos EUA mais de metade dos antibióticos utilizados são administrados no setor pecuário (Liu et al., 2013). O uso de fármacos veterinários tornou-se uma parte integrante da criação intensiva de animais para a produção de carne e derivados, sendo estes administrados através dos alimentos ou da água, por injeção, implantes, via oral ou via tópica (Carvalho, 2012). Existe uma maior probabilidade de atingirem o ambiente quando estes são administrados por via tópica (Kim et al., 2008). No entanto, as restantes formas de administração levam também a que sejam detetados estes compostos no meio ambiente. Por exemplo, os antibióticos podem ser administrados através da ração animal, como forma de evitar a rápida disseminação de doenças devido aos espaços confinados onde os animais se encontram nas instalações pecuárias (D’Amato, 2011). No entanto, os antibióticos não são totalmente absorvidos pelos animais, sendo 30-90% são excretados. Na suinicultura verifica-se que os antibióticos mais utilizados são as tetraciclinas, as sulfonamidas e as fluoquinolonas (Liu et al., 2013). A natureza farmacológica dos fármacos veterinários, as taxas de aplicação frequente e a utilização em larga escala na produção pecuária sensibilizou as autoridades de regulamentação quanto às questões ambientais. Dessa forma, constam nas diretrizes da União Europeia para uma Avaliação de Riscos Ambientais decorrentes da utilização dos fármacos veterinários (D’Amato, 2011). Estima-se que 6051 toneladas de substâncias ativas de fármacos veterinários foram utilizadas em 2004 na União Europeia. (Carvalho, 2012). Como referido, os fármacos veterinários podem entrar no ambiente através das ETARs ou através da aplicação direta de estrume (contendo produtos excretados) no solo. Uma vez libertados no ambiente, os fármacos veterinários podem afetar as águas de superfície e subterrâneas, afetando o ecossistema, assim como a saúde humana (Carvalho, 2012). 1.4. Priorização de fármacos veterinários Existe uma variedade de fármacos veterinários disponíveis, sendo difícil identificar as substâncias que têm impacto no meio ambiente. O impacto de um fármaco veterinário para o ambiente vai ser determinado por diversos fatores, incluindo a quantidade utilizada, o grau de metabolismo do animal, a degradação do F C U P | 12 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos mesmo durante o armazenamento de estrume e a toxicidade para os organismos aquáticos e terrestres (Carvalho, 2012). Vários estudos têm sido desenvolvidos para a identificação de substâncias que podem representar uma abordagem de risco. No Reino Unido, por exemplo, foram identificadas onze substâncias, incluindo antibióticos e ectoparasiticidas de alta prioridade, consoante informações de toneladas vendidas, regime de utilização e toxicidade para os organismos aquáticos e terrestres (Tabela 2). Na Coreia do Sul foram também identificados 50 fármacos veterinários (Tabela 2) que foram classificados como alta prioridade, em relação ao setor da pecuária, aquicultura e ao tratamento de animais de companhia, devido ao seu potencial de atingir o meio ambiente. Tabela 2 – Identificação de fármacos veterinários classificados como de alta prioridade referente ao sector da suinicultura (Carvalho, 2012). Em Portugal, a identificação de fármacos veterinários de alta prioridade ainda não existe. F C U P | 13 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos 1.5. Ecotoxicologia de compostos farmacêuticos Uma vasta gama de produtos farmacêuticos e produtos de cuidados pessoais encontram-se disponíveis no mercado. Foram detetadas na água potável, águas subterrâneas e águas residuais concentrações de antibióticos, vasodilatadores, antiflogísticos, antiepiléticos, entre outros, que provocam alterações bioquímicas e fisiológicas quando entram em contacto com o solo e os ambientes aquáticos. Muitos dos compostos farmacêuticos e/ou os seus metabolitos são eliminados através do sistema renal (urina) e pelo sistema biliar (fezes), ou uma combinação de ambos dependendo do composto e do organismo em questão. Durante o tratamento convencional das águas residuais os compostos farmacêuticos presentes nas mesmas não são removidos permanecendo nos efluentes que, posteriormente, entram na água superficial e subterrânea (Jjemba, 2006). A farmacocinética e a farmacodinâmica dos produtos farmacêuticos são extensivamente estudadas antes da aprovação dos mesmos. Existem atualmente diretrizes pouco rigorosas nos Estados Unidos da América e na União Europeia para proceder à avaliação ambiental dos compostos dos produtos farmacêuticos (Jjemba, 2006). Os fármacos são concebidos para afetar as vias metabólicas e moleculares dos seres humanos e dos animais. Até agora, os testes de ecotoxicidade apenas fornecem indicações dos efeitos que provocam aos seres vivos em diferentes níveis tróficos após a exposição aos fármacos a curto prazo (Fent et al., 2006). Pesquisas recentes têm demonstrado que muitos compostos farmacêuticos podem ser bioacumuláveis, afetando os organismos aquáticos visto que ocorrem alterações ao nível fisiológico e reprodutor, assim como pode ocorrer o desenvolvimento da resistência de estirpes de bactérias a antibióticos. Existe uma necessidade de aumentar o conhecimento sobre o destino dos produtos farmacêuticos durante o tratamento de águas residuais de forma a implementar-se técnicas eficientes na remoção dos mesmos (Fent et al., 2006). 1.6 Estações de tratamento de águas residuais (ETARs) Como referido anteriormente as águas residuais contêm muitos compostos, incluindo nutrientes e poluentes inorgânicos e orgânicos que podem causar efeitos F C U P | 14 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos nefastos no meio ambiente. Como tal, é necessário tratar estas águas antes da sua descarga no meio ambiente. O tratamento de águas residuais apresenta como objetivos a separação, tratamento e eliminação das matérias poluentes da água, com o intuito da restituição da água aos meios hídricos com o menor impacto possível no ecossistema (Gomes, 2011). As águas residuais resultam de diversas atividades, tendo como origem o uso doméstico, agrícola ou industrial. Conforme essas atividades, as águas residuais apresentam características que vão influenciar o tipo de tratamento necessário para que a água seja lançada no meio natural sem causar impactos negativos no ecossistema (Oliveira, 2012). Existem diversos sistemas de tratamento de águas residuais que dependem da especificidade do efluente, dos limites legais exigidos, das características do meio recetor e dos custos e disponibilidade dos terrenos para implementar um sistema de tratamento de águas residuais (Oliveira, 2012). O tratamento de águas residuais pode ser efetuado por operações e processos de natureza física, química e biológica, com vários níveis de tratamento: preliminar, primário, secundário, terciário e tratamento de fase sólida (Figura 2) (Gomes, 2011). Figura 2 - Fluxograma do tratamento convencional de uma Estação de Tratamento de Águas Residuais (Gomes, 2011). Na primeira etapa de tratamento estão incluídas as operações de gradagem (passagem do efluente por um canal onde estão colocadas uma ou mais grades de diferentes tamanhos que retêm os materiais grosseiros), desarenamento (remoção de areias) e remoção de gorduras, tendo como finalidade a proteção dos sistemas F C U P | 15 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos mecânicos das ETARs, evitando interferências operacionais provocadas por objetos arrastados pelas águas residuais (Gomes, 2011). Na etapa seguinte, tratamento primário, num decantador são removidos sólidos suspensos orgânicos e inorgânicos e recolhidos à superfície escumas e materiais que flutuam (óleos e gorduras), por meio de raspadores. Estima-se que a decantação primária remova em média 50-70% dos sólidos suspensos sedimentáveis (Gomes, 2011). Existem vários processos secundários para o tratamento de águas residuais; os de natureza biológica são muito utilizados, nomeadamente os filtros percoladores, as lamas ativadas e as lagoas de oxidação. As lamas ativadas são o processo de biomassa suspenso mais utilizado, onde ocorre a mistura por agitação e arejamento da água residual com a biomassa (microrganismos), originando uma lama biológica sendo esta, posteriormente, separada da fase líquida por decantação secundária. Após a decantação das lamas no decantador secundário, o excesso das mesmas é removido para posterior tratamento da fase sólida (Gomes, 2011). Por último, o tratamento terciário é considerado uma etapa adicional do processo de tratamento. São vários os processos de tratamento terciário. Por exemplo, se houver necessidade de remoção ou inativação de organismos patogénicos, por questões de saúde pública, a desinfeção poderá ser efetuada através de cloragem, ozonização ou por radiação ultravioleta, sendo que este último apresenta custos bastante elevados (Gomes, 2011). Os tratamentos realizados pelas estações de águas residuais resultam na remoção de quantidades significativas de matéria orgânica, nutrientes e de outros poluentes, como os metais. (Gagnon et al., 2014). No entanto, atualmente, os tratamentos convencionais das águas residuais não estão preparados para a eliminação eficaz de produtos emergentes como os farmacêuticos, não sendo estes completamente removidos. São, portanto, necessários controlos mais rigorosos no tratamento de fármacos em águas residuais. Existe assim, uma necessidade de aumentar o conhecimento sobre o destino dos produtos farmacêuticos durante o tratamento de águas residuais de forma a implementar-se técnicas eficientes na remoção dos mesmos (Fent et al., 2006). Nos últimos anos têm sido utilizadas tecnologias avançadas, tais como processos de oxidação (ozonização, fotólise e fotólise heterogénea, sonólise, entre outros), adsorção por carvão ativado e biorreatores de membrana para aumentar as F C U P | 16 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos eficiências de remoção de produtos farmacêuticos. No entanto, essas tecnologias revelam-se dispendiosas não sendo possível aplicá-las em larga escala. Assim, a utilização de tecnologias alternativas de baixo custo para o tratamento de águas residuais que contenham compostos farmacêuticos é de grande importância. Uma possibilidade é a utilização de leitos de macrófitas (as ZHC), sendo de referir que esta tecnologia apresenta baixo custo de construção, operação e manutenção. Nas últimas décadas, foi demonstrado que estes leitos de macrófitas são eficazes para o tratamento de poluentes convencionais em vários tipos de águas residuais, como águas residuais domésticas, águas residuais agrícolas e águas residuais industriais. No entanto, para o tratamento de produtos farmacêuticos a aplicação de ZHC ainda é um campo de aplicação recente. A viabilidade das mesmas está a exigir uma compreensão abrangente dos mecanismos e eficiências de remoção, das influências do design e dos fatores ambientais e dos riscos de toxicidade. Por isso, é necessário uma atenção redobrada aos fatores descritos (Li et al., 2014). 1.7. Zonas Húmidas Construídas As ZHC para o tratamento de águas são sistemas de engenharia projetados e construídos para realizar processos naturais na remoção de poluentes (Li et al., 2014), ou seja, processos físicos, químicos e biológicos, podendo ser complementares aos tratamentos convencionais de águas residuais (Zhang et al., 2014). As ZHC consistem em bacias de pequena profundidade com macrófitas aquáticas que são impermeabilizadas para evitar a infiltração e contaminação de águas subterrâneas. Estas estruturas podem conter equipamentos que controlam a direção do fluxo, tempo de retenção hidráulico e o nível da água (Botequilha, 2013). Estes sistemas podem ter várias designações, nomeadamente “leitos de macrófitas”, “fito-ETAR”, “fito-lagunagem”, “ETAR através de plantas” entre outras. Na terminologia anglo-saxónica designações como “constructed wetlands”, “treatment wetlands” e “engineered wetlands” são também utilizadas, sendo mais frequentes as duas primeiras (Botequilha, 2013). Estes sistemas têm sido desenvolvidos ao longo das últimas três décadas, estando estabelecidos em todo o mundo como uma alternativa ao tratamento F C U P | 17 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos convencional de águas residuais. São sistemas robustos, apresentam requisitos baixos de energia e são fáceis de operar o que os torna adequados, por exemplo, para implementação em áreas que não possuem saneamento ou que são economicamente subdesenvolvidas (Wu et al., 2014). A tecnologia de tratamento de águas residuais por ZHC foi implementada nas décadas de 1960 e 1970. Na fase inicial de desenvolvimento, a aplicação das mesmas foi utilizada para o tratamento de águas residuais domésticas como tratamento primário, secundário e terciário. Com o objetivo de purificação das águas residuais e sendo uma alternativa barata, as ZHC têm recebido grande atenção dos cientistas e engenheiros nas últimas décadas. Em Portugal os primeiros passos na implementação de ZHC ocorreram na década de 70, com uma construção na região de Viseu e outra no Instituto Politécnico de Faro. Porém, o maior interesse surgiu no princípio dos anos 90. Em 1993, em Estarreja, Aveiro, foi construída a primeira ZHC com escoamento vertical, para tratamento de águas residuais industriais, surgindo desde aí diversos tipos destes sistemas (Botequilha, 2013). Além da aplicação de ZHC para efluentes industriais, estes sistemas foram também aplicados para a purificação de efluentes agrícolas e lixiviados de aterros sanitários, entre outros. A remoção de contaminantes em ZHC é complexa e depende de uma variedade de mecanismos de remoção, incluindo sedimentação, filtração, precipitação, volatilização, adsorção, absorção pelas plantas e diversos processos microbianos. Esses mecanismos são influenciados, entre outros, pelas temperaturas e pelos tipos de solo (Wu et al., 2014). Contudo, podem surgir problemas que prejudicam o bom funcionamento das ZHC, tais como o aparecimento de pragas nas plantas, o endurecimento da superfície do substrato e a variação da qualidade da água (Zhang et al., 2012). Um correto funcionamento das ZHC depende da interação entre as plantas, substrato e microrganismos (Leto et al., 2013). A presença de vegetação reduz a velocidade da água nas ZHC, criando melhores condições para que ocorra sedimentação de sólidos suspensos. O crescimento de raízes dentro do meio de enchimento influencia a decomposição da matéria orgânica e previne a colmatação do meio. O oxigénio libertado pelos órgãos radiculares permite uma oxigenação da rizosfera onde ocorrem condições para desenvolvimento de biofilme. F C U P | 18 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos A vegetação das ZHC deve ser resistente a pragas e doenças, com crescimento rápido, deve também ter raízes ou rizomas com uma área superficial elevada para a fixação da população microbiana, assim como um transporte eficiente de oxigénio para a zona radicular (Botequilha, 2013). O meio de enchimento das ZHC suporta os organismos que nele vivem, garantindo uma área superficial para o crescimento microbiológico e permitindo o armazenamento de muitos poluentes. Leitos com substrato mais fino permitem uma maior eliminação de poluentes e microrganismos, exigindo no entanto, áreas mais extensas. Do mesmo modo, leitos mais permeáveis, com materiais grosseiros, não são tão eficazes no desenvolvimento das plantas nem na remoção, mas suportam cargas hidráulicas mais elevadas e oferecem menores riscos de colmatação, sendo este um aspeto relevante nos primeiros anos de funcionamento (Botequilha, 2013). As plantas comummente utilizadas nas ZHC são as macrófitas (plantas vasculares e vegetação aquática, sendo classificadas em: i) Macrófitas flutuantes: plantas que flutuam à superfície da água, não estando fixas ao substrato; ii) Macrófitas submersas: plantas fixas ao substrato ou em suspensão na água, estando os órgãos vegetativos da planta completamente submersos; iii) Macrófitas enraizadas com folhas flutuantes: plantas fixas ao substrato mas com as folhas à superfície; iv) Macrófitas emergentes: plantas fixas ao solo, contudo as folhas e os caules permanecem fora de água. (Botequilha, 2013). A escolha da espécie de planta para as ZHC é extremamente importante sendo necessário ter em consideração diversos fatores nomeadamente as condições climatéricas e de habitat, a composição da água residual com a qual as plantas vão estar em contacto. (Leto et al., 2013). Existem muitas espécies de plantas que podem ser utilizadas nas ZHC no entanto, a espécie utilizada habitualmente é a Phragmites australis, sendo esta uma planta cosmopolita dominante em águas doces e salobras (Březinová & Vymazal, 2014). Esta espécie é capaz de prosperar em lagos e lagoas fortemente poluídos, sendo bastante tolerante à salinidade e é considerada mundialmente uma espécie de valor para as ZHC (Struyf et al., 2007). F C U P | 19 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos A biomassa da espécie P. australis é altamente variável, dependendo do clima, latitude, salinidade, profundidade da água, eutrofização entre outros fatores (Březinová & Vymazal, 2014).De acordo com os diferentes padrões de fluxo de água, as ZHC podem ser divididas em escoamento superficial e escoamento subsuperficial, esta última podendo ainda ser dividida em escoamento horizontal e escoamento vertical (Zhang et al., 2012). Nas ZHC de escoamento superficial a água residual desloca-se horizontalmente numa bacia pouco profunda (0,3-1m) com declives de leito entre 0,5-1,5%, sendo impermeabilizada no fundo. Este tipo de ZHC permite a proliferação de insetos e roedores e de odores desagradáveis, podendo apresentar riscos para a saúde humana, não sendo utilizada para o tratamento secundário. Este tipo de escoamento é mais adequado para climas quentes visto que as taxas de decomposição biológica diminuem com as baixas temperaturas (Botequilha, 2013). Nas ZHC de escoamento subsuperficial o efluente desloca-se abaixo da superfície do leito (no substrato). Este design apresenta como vantagens a menor ocorrência de odores pois a água residual é mantida abaixo da superfície do leito. Com referido, as ZHC de escoamento subsuperficial podem ser divididas consoante a direção da alimentação: i) Escoamento Subsuperficial Horizontal, onde o leito possui uma membrana impermeável no fundo, com gravilha ou outro material como substrato, sendo plantado com macrófitas emergentes que crescem no substrato. O efluente é distribuído à entrada do leito ao longo do seu comprimento e respetiva altura penetrando nos poros do substrato e da rizosfera, ocorrendo o contacto com zonas aeróbicas e anaeróbicas, e permitindo que ocorra mecanismos de adsorção, absorção, precipitação e degradação microbiana (Figura 3) (Botequilha, 2013). ii) Escoamento Subsuperficial Vertical, baseia-se na deslocação vertical do efluente num substrato com camadas heterogéneas e com diferentes porosidades, no qual o efluente se desloca gradualmente. À medida que ocorre a infiltração do efluente, ocorre uma transferência de oxigénio do ar para o substrato e, por exemplo, a capacidade de nitrificação é melhorada. Estes sistemas podem ser divididos em escoamento subsuperficial vertical descendente e escoamento subsuperficial vertical ascendente ou invertido. As ZHC-Escoamento Subsuperficial Vertical descendente são constituídas F C U P | 26 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos O nível de solução/água foi mantido sempre ligeiramente acima da superfície do substrato, o que corresponde a uma taxa de inundação de 100%. Posteriormente, adicionou-se semanalmente 1,2 L de água de uma suinicultura, água dopada ou não com antibióticos. A concentração final do fármaco na água dopada foi de 100 µg/L. A suinicultura possuía um sistema físico para a separação de sólidos presentes nas águas residuais e também um sistema de lagoas aeróbias com arejamento para a decomposição significativa da matéria orgânica. O tempo de uma semana foi escolhido tendo em consideração os tempos de retenção hidráulica, usualmente utilizados nos sistemas de ZHC. A concentração dos fármacos veterinários, selecionada nestas experiências, é da ordem de grandeza de concentrações reais encontradas já detetadas em águas deste tipo (Carvalho, 2012). Assim, três microcosmos foram dopados com 100 µg/L Enr cada um, três microcosmos foram dopados com 100 µg/L Cef cada um, outros três microcosmos foram dopados com 100 µg/L de Enr e 100 µg/L de Cef, cada um. Nos restantes três microcosmos a água residual não foi dopada com nenhum dos fármacos veterinários servindo como microcosmos de controlo. A partir da sexta semana apenas 1L de água residual, dopada ou não, foi adicionada aos microcosmos. Diariamente, a água residual era recirculada para evitar formação de zonas anaeróbicas na matriz de suporte das plantas. Para controlar a evaporação da água em cada microcosmo, aquando da recirculação, procedia-se ao acerto da mesma com água desionizada até perfazer o volume inicial de água residual. No final de cada semana a água foi removida de cada microcosmos e nova água residual, dopada ou não, foi adicionada a cada microcosmo. A experiência teve a duração de 14 semanas, onde a recolha de amostras líquidas e respetivas análises foi efetuada à semana 1, 2, 4, 8 e 14. Para análise da concentração dos fármacos veterinários, foram recolhidos, no final de cada uma das semanas mencionadas acima, 250 mL por microcosmo. Estas soluções foram filtradas (filtros de nitrato de celulose, 0,45 µm de porosidade), para eliminar a matéria em suspensão, sendo, posteriormente, acidificadas com ácido clorídrico a pH 2 (100 µL por cada 50 mL de amostra), e armazenadas a -20ºC até análise. Foram recolhidas também amostras filtradas para análises de nutrientes (armazenadas a -20ºC) e metais (armazenadas a 4ºC). Recolheu-se também amostras liquidas não filtradas para a análise de pH, SST e SSV (250 mL), COQ (2 mL), CBO F C U P | 27 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos (500 mL) e metais (15 mL), sendo conservadas a uma temperatura de 4 ºC. Todas as amostras recolhidas para análises de metais foram acidificadas (10% HNO3). Em cada semana foram também armazenadas, do mesmo modo, amostras da água residual inicial (exceto para análise de fármacos veterinários). 2.2 Metodologias experimentais Para a análise da concentração dos fármacos veterinários utilizou-se extração em fase sólida (SPESolid phase extraction) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLCHigh Performance Liquid Chromatography), processo desenvolvido por Carvalho (2012). Para a análise da CQO e da CBO utilizou-se kits fornecidos pela Hanna Instruments. Vários outros parâmetros foram também analisados nas águas, nomeadamente, o pH e a concentração de metais (cobre, zinco, manganês e ferro) pelo método de espectrometria de absorção atómica. Também foram analisados os nutrientes, nomeadamente ião nitrato (NO3-), ião nitrito (NO2-), azoto amoniacal (NH3) e ião fosfato. 2.2.1. Materiais e reagentes O metanol, acetonitrilo, ácido fórmico e ácido clorídrico foram fornecidos pela Sigma-Aldrich (Barcelona-Espanha). Enr e Cef foram também fornecidos pela SigmaAldrich (Barcelona-Espanha). As soluções stock padrão de fármacos foram preparadas em metanol, sendo as soluções padrão, usadas para quantificação, preparadas em água desionizada com 1% de ácido fórmico. Para a análise da CQO utilizou-se Kits HI93754A-25 e HI93754B-25 Reagentes CQO, GB - 0 a 150 mg/L e GM – 0 a 1500 mg/L, respetivamente, da Hanna Instruments Portugal, enquanto que para a medição da CBO se utilizou o método oxitop tendo-se utilizado hidróxido de potássio a 45% e tiocarbamida de alilo, como inibidor de nitrificação. F C U P | 28 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Para a determinação de nutrientes nomeadamente azoto amoniacal, ião nitrato, ião nitrito e fósforo (na forma de ião fosfato) utilizou-se os reagentes indicados na literatura (Koroleff, 1983) (Jones, 1984) (Joyce & Chambers, 1993). Todos os reagentes usados foram de qualidade pro analisis ou equivalente. O material foi lavado de acordo com as especificações de cada método de modo a não haver contaminações. No caso do material utilizado na determinação de metais e fármacos, este foi mergulhado por um período de 24h numa solução de ácido nítrico (20%, v/v), passado por água desionizada e, posteriormente, seco na estufa. Foi sempre utilizado água desionizada (condutividade <0.1 uS cm-1). 2.2.2 Métodos Analíticos 2.2.2.1 Determinação da concentração de fármacos veterinários A metodologia utilizada foi baseada na descrita na literatura (Carvalho et al., 2013). Extração em fase sólida Para a SPE utilizou-se cartuchos OASIS HLB (60 mg, 3 mL) que foram inicialmente condicionados com 5 mL de metanol e, posteriormente, com 5 mL de água desionizada. As amostras foram, posteriormente, passadas através dos cartuchos pré condicionados utilizando um manifold ligado a uma bomba de vácuo. Seguidamente, os cartuchos foram limpos com uma mistura de metanol/água (5:95 v/v), sendo secos sob vácuo durante 30 minutos. A eluição realizou-se com 5 mL de uma mistura de ácido fórmico e metanol (94:4, v/v). De seguida, os extratos foram evaporados até à secura sob uma corrente de azoto a 35 ºC. Os resíduos foram dissolvidos em 1,0 mL de fase móvel de HPLC (água/ácido fórmico, 99:1, v/v). Cromatografia Líquida de Alta Eficiência A técnica HPLC (Anexo 1) foi usada neste trabalho, tendo sido utilizado um equipamento Beckman Coulter com detetor de díodos (DAD-modulo 128) e amostrador automático (modulo 508). Os analitos foram separados por uma coluna Kinetex 2,6 µm C18 100 mm x 4.6 mm. Utilizou-se um programa de gradiente linear que consistiu em: 100% de eluente A (ácido fórmico 99:1 v/v), mantendo as condições isocráticas durante 2 minutos, seguindo-se um gradiente linear de 10 minutos a 70% F C U P | 29 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos do eluente A e 30% do eluente B (acetonitrilo). As condições iniciais (100% de eluente A) foram novamente atingidas passado 10 minutos, com um tempo de reequilíbrio de 2 minutos, a fim de restaurar a coluna. O volume de injeção da amostra foi fixado em 50 µL e o sinal do detetor foi monitorizado com um comprimento de onda de 280 nm. Todas as soluções de HPLC foram previamente filtradas por filtro de 0,45 µm de porosidade (de nitrato de celulose) e desgasificadas por ultra-sons. A quantificação das concentrações foi efetuada recorrendo a calibração com soluções padrão aquosas de cada fármaco veterinário. 2.2.2.2. Medição de metais Espectrometria de Absorção Atómica As concentrações dos metais Fe, Mn, Cu e Zn foram determinadas por espectrofotometria de absorção atómica com atomização por chama (Anexo 2). Foi usado um espectrómetro de absorção atómica Philips PU 9200X. Antes da análise por espectrometria de absorção atómica, as amostras foram centrifugadas para separar qualquer fração sólida que existisse na solução. A metodologia seguida foi baseada em Almeida et al. (2004). A quantificação das concentrações foi efetuada recorrendo a calibração com soluções padrão aquosas de cada metal. 2.2.2.3. Medição da Carência Bioquímica de Oxigénio e da Carência Química de Oxigénio A CBO foi determinada utilizando um sistema AL606, através da medição da diferença de pressão no sistema fechado (determinação respirométrica de CBO). Para a determinação da CQO nas amostras foi usado um fotómetro multiparâmetros de bancada e um reator HI 839800 da Hanna Instruments. 2.2.2.4 Medição do pH A medição do pH foi efetuada em todas as amostras de água residual de suinicultura através de potenciometria, usando um elétrodo combinado de vidro Crison 50 10 e um milivoltímetro Crison, micro pH 2002. . F C U P | 30 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos 2.2.2.5 Medição de nutrientes A concentração de azoto amoniacal, ião nitrato, ião nitrito, e fósforo (na forma de ião fosfato) nas diferentes amostras foi medida segundo os métodos expressos por (Jones, 1984), (Joyce & Chambers, 1993), (Koroleff, 1983). 2.2.2.6 Medição de sólidos A determinação do teor em SST realizou-se por pesagem dos sólidos obtidos após a filtração de um determinado volume fixo de amostra, através de um filtro de fibra de vidro (FIORONI 261A 47MM). Os sólidos retidos no filtro foram levados à estufa a 105ºC. Posteriormente, os filtros foram levados a uma mufla a 500ºC, em cadinhos de porcelana, até atingirem peso constante para determinação dos Sólidos Suspensos Voláteis (SSV). Para a determinação dos ST e STV colocou-se em cadinhos um determinado volume de amostra, onde foram levados à estufa a 105ºC obtendo-se o teor de ST. Posteriormente, colocou-se os mesmos cadinhos a 500ºC, obtendo-se a concentração de STV. O método utilizado encontra-se descrito pormenorizadamente no Standard Methods nº 2540 (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater2540 Solids, 2011). F C U P | 31 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Capitulo III – Resultados e discussão F C U P | 32 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos F C U P | 33 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos 3.1. pH O pH da água residual recolhida na suinicultura situou-se entre 7,8 e 7,9 ao longo do tempo da experiência. Relativamente ao pH na água residual após tratamento nos diferentes microcosmos verificou-se que não existiram diferenças significativas entre os diferentes tratamentos, não tendo a presenças dos fármacos veterinários adicionados influenciado este parâmetro (Figura 6). Porém, o valor deste parâmetro variou ao longo do tempo da experiência. Efetivamente durante as semanas 1, 2 e 4, o pH diminuiu, relativamente ao valor inicial da água residual, para valores entre 7,3 e 7,4 nas duas primeiras semanas e para 7,6 na semana 4. No entanto, verificou-se nas semanas 8 e 14 um aumento para valores entre 7,8 e 8,3, em alguns casos superiores ao valor inicial da água residual. Estas variações do pH ao longo das semanas indicam que provavelmente estariam a ocorrer alterações no funcionamento dos microcosmos. Através do Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto verifica-se que o pH das águas residuais de suinicultura tratadas encontra-se dentro da gama de VLE. Figura 6 – Valores de pH nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos ao longo de toda a experiência (Gama Limite de Emissão do pH presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto= 6,0-9,0). Valores na água residual inicial entre 7,8 e 7,9. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. F C U P | 34 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos 3.2. Carência Bioquímica de Oxigénio, Carência Química de Oxigénio e Sólidos totais A CBO é um parâmetro que representa a quantidade de matéria orgânica biodegradável presente na água residual. A CBO na água residual recolhida na suinicultura variou entre 207 mg/L e 427 mg/L. Na água residual tratada nos diferentes microcosmos este parâmetro variou entre 13 mg/L e 37 mg/L não se verificando, no geral, diferenças significativas entre tratamentos (Figura 7). Portanto, a presença de fármacos veterinários na água residual não influenciou a degradação da matéria orgânica presente inicialmente na água. No entanto, observou-se nas semanas 4 e 8 uma tendência (que foi significativa na semana 8) para os valores de CBO serem menores no caso do tratamento ENR. Para cada tratamento não houve no geral diferenças ao longo do tempo. A exceção foram os microcosmos ENR que apresentaram uma maior variabilidade ao longo do tempo. Ao longo do período da experiência observou-se que os microcosmos revelaram capacidade de remoção da matéria orgânica biodegradável, cumprindo com os VLE estabelecidos pelo Decreto-Lei nº236/98 de 1 de Agosto para a descarga de águas residuais (VLE< 40 mg/L). Efetivamente houve reduções entre 80% e 90% no valor CBO, provavelmente devido ao facto de ocorrer processos de degradação biológica e sedimentação, já que o substrato pode funcionar como um filtro. A CQO mede a quantidade de oxigénio necessária para oxidar quimicamente toda a matéria orgânica (biodegradável e não biodegradável) presente na água. A CQO da água residual recolhida na suinicultura variou entre 1416 mg O2 /L e 1649 mg O2 /L. Na água residual tratada nos diferentes microcosmos a CQO na semana 1 variou entre 139 mg O2 /L e 154 mg O2 /L. Devido a problemas operacionais não foi possível quantificar devidamente a CQO nas águas residuais de suinicultura tratadas nas restantes semanas, uma vez que foi ultrapassado o limite máximo operacional da gama de determinação (164 mg O2/L). Assim, não se pode quantificar as taxas de remoção de CQO nas restantes semanas. Não foi, portanto, possível aferir os efeitos da adição de fármacos neste parâmetro. . F C U P | 35 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Figura 7 - Valores do parâmetro CBO5 nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos ao longo de toda a experiência (Valor Limite de Emissão CBO5 presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto: 40 mg/L O2). Valores na água residual inicial entre 207 e 424 mg/L. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. Na semana 1 os valores apresentados correspondem a amostras compostas de cada tratamento. As percentagens de remoção deste parâmetro relativo à água inicial são também apresentadas. O Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto estabelece o VLE de CQO para a descarga de águas residuais, de 150 mg O2/ L. No entanto os microcosmos, apesar de diminuírem consideravelmente o valor deste parâmetro, não permitiram atingir os valores necessários para descargas destas águas no meio ambiente, visto que estas águas apresentaram valores iguais ou superiores a 164 mg O2/L. Assim, para um tratamento eficaz a nível deste parâmetro seria necessário um tempo de tratamento superior (superior a 1 semana) ou uma maior área dos F C U P | 42 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos relevantes visto que removem cerca de 60% a 90% da quantidade total de azoto (Hsueh et al., 2014). A concentração de fósforo (medido como ião fosfato) nas águas residuais tratadas foi também aumentando gradualmente ao longo das semanas, tendo a percentagem de remoção diminuído de 93% para 45% na semana 14 (Figura 12), indicando mais uma vez a redução na eficiência dos sistemas. Em relação ao VLE para fósforo referido no Decreto-Lei nº236/98 de 1 de Agosto (10 mg P /L, 323  P, 323  PO43-) verifica-se que os valores observados nas águas tratadas foram sempre inferiores, mesmo na semana 14 em que já houve uma perda de eficiência dos tratamentos. Mais uma vez no geral, não houve diferenças significativas, nem nas concentrações de ião fosfato nem nas percentagens de remoção, entre tratamentos. Segundo Bhatia et al. (2013), a vegetação presente nas ZHC desempenha um papel importante na remoção de nutrientes. As plantas primeiramente absorvem os nutrientes através do sistema de raízes. Em alguns casos essa absorção ocorre através dos caules submersos. No presente estudo, verifica-se que os microcosmos apresentam um aumento da concentração de ião nitrato, ião nitrito e ião fosfato que poderá estar, como referido, associado ao declínio das plantas, impedindo que ocorra a remoção eficiente dos nutrientes referidos. F C U P | 43 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Figura 12 - Concentração de ião fosfato (PO4-) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de fósforo relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão de fósforo presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto: 10 mg/L (323 µM). Valores na água residual inicial entre 908 uM e 159 uM. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. Wi, semana i. A temperatura da água é um elemento chave para os processos de nitrificação e desnitrificação uma vez que, quando esta diminui, para temperaturas inferiores a 5ºC, os processos ficam inibidos, pois a temperatura ótima para que estes processos se F C U P | 44 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos desenvolvam situa-se entre 28ºC e os 36ºC (Hsueh et al., 2014). Efetivamente quando a temperatura aumenta as concentrações de azoto amoniacal diminuem. Esta variável, temperatura, não foi estudada nos resultados apresentados neste trabalho, sendo assim, não existem dados comparativos e seria necessário um estudo mais alargado do tema para se poder corroborar ou refutar esta teoria. Segundo Drizo et al (1997) a utilização da espécie P. australis nas ZHC, contribui para uma remoção significativa de fósforo e azoto. Segundo este autor as remoções de fósforo situaram-se entre os 98% e 100% e para o azoto amoniacal valores de remoção de 100% foram alcançados para águas residuais urbanas. No presente estudo só se conseguiu alcançar um máximo de remoção na ordem dos 90%, facto que poderá estar relacionado com a dimensão inapropriada dos microcosmos utilizados para tratar uma água residual tão problemática como são as águas residual da indústria agropecuária. Efetivamente, Meers et al (2005) observaram remoções menores, 73–83% para N e 71–92% para P, quando águas de suiniculturas foram tratadas em ZHC com fluxo subsuperficial vertical plantadas com diversas plantas, incluindo P. australis. Lee et al (2004) observaram ainda uma remoção menor, 47–59% para fósforo total e 10–24% para azoto total quando foi utilizada a planta Eichhornia crassipes para tratar este tipo de efluente numa zona construída semelhante, indicando que a espécie de planta pode ter um papel determinante. De referir ainda que no presente estudo houve uma remoção significativa de azoto e fósforo nos sistemas, remoção essa que não foi afetada pela presença dos fármacos veterinários, indicando mais uma vez que estes poluentes emergentes não afetaram a funcionalidade dos sistemas. 3.6. Metais No presente estudo foram determinados apenas os metais Cu, Zn, Fe e Mn. Os metais Cd, Pb e Ni foram analisados em algumas amostras de água residual inicial estando os seus níveis abaixo do limite de deteção da técnica analítica, não sendo portanto possível monitorizar a sua remoção durante o tratamento nos microcosmos. Em relação ao Cu as concentrações na água residual tratada encontraram-se sempre abaixo do limite de deteção (50 g/L), com exceção da semana 14 em que as F C U P | 45 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos concentrações variaram entre os valores inferiores ao limite de deteção e 90 g/L. Assim, não foi possível aferir a influência dos fármacos veterinários nos processos de remoção de cobre. De referir que as concentrações de cobre na água residual inicial da suinicultura variaram entre 0,26 e 1,36 mg/L e, portanto, as remoções foram sempre superiores a 85%, com exceção da semana 14 em que as remoções variaram entre 70 e 85%. As águas residuais tratadas apresentaram sempre valores bastante inferiores ao VLE (1 mg/L) do Decreto-Lei nº236/98 de 1 de Agosto. Relativamente a Zn, verificou-se que a percentagem de remoção deste metal ao longo das semanas variou entre 80% e 90% (Figura 13), sendo que as concentrações de Zn na água residual inicial variam entre 0,80 e 3,3 mg/L e na água residual tratada nos diferentes microcosmos variou entre valores inferiores ao limite de deteção (25 g/L) e 179 g/L. No geral não existiram diferenças significativas entre tratamentos ao longo do tempo. No entanto, nas primeiras 2 semanas as percentagens de remoção foram ligeiramente superiores nos tratamentos sem adição de fármacos veterinários e na semana 14 houve uma tendência para um decréscimo da remoção deste metal da água residual. F C U P | 46 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Figura 13 - Concentração de zinco (Zn) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de zinco relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valores na água residual inicial entre 805 ug/L e 3292 ug/L. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. * inferior ao limite de detecção. Wi, semana i. Em relação a Mn verificou-se que as concentrações presentes na água residual tratada variaram entre 90 e 240 g/L (Figura 14). Verificou-se também que a percentagem de remoção de Mn variou entre 40% e 83%. No geral não existiram diferenças significativas entre tratamentos ao longo do tempo, apresentado a concentração deste metal uma grande variabilidade entre réplicas do mesmo * * F C U P | 47 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos tratamento. As águas residuais tratadas apresentaram sempre valores bastante inferiores ao VLE (2 mg/L) no Decreto-Lei nº236/98 de 1 de Agosto. Figura 14 - Concentração de manganês (Mn) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de manganês relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão do Mn presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto= 2,0 mg/L. Valores na água residual inicial: 397 µg/L em média. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. * não determinado. Wi, semana i. Por último, em relação a Fe verifica-se que ocorreram variações significativas, quer entre tratamentos quer ao longo do tempo, nas concentrações e remoções deste metal nas águas residuais tratadas. Efetivamente, nas primeiras duas semanas nos microcosmos com água residual não dopada com fármacos veterinários (CONT) a * * F C U P | 48 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos remoção (entre 90 e 96%) deste metal foi idêntica ou ligeiramente superior às remoções observadas nos tratamentos aos quais foram adicionados os fármacos (remoções entre 68 e 89 %). Nas semanas seguintes houve um decréscimo das remoções deste metal no CONT ao longo do tempo, tornando-se praticamente inexistente na semana 14 (remoções de 1%). Porém, nos sistemas com adição de fármacos as remoções mantiveram-se no geral idênticas entre si e ao longo do tempo só decrescendo significativamente na semana 14, embora para valores superiores aos observados no controlo (entre 50 e 60% de remoção). Como referido anteriormente, na semana 14 as plantas estavam num estado de declínio o que pode ter influenciado esta remoção. No entanto, as plantas ao longo do tempo não apresentaram diferenças fisiológicas visuais entre tratamentos. Portanto, no caso deste metal, a presença dos fármacos contribuiu para a sua remoção durante um período de tempo mais alargado. F C U P | 49 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos Figura 15 - Concentração de ferro (Fe) (média e desvio padrão, n=3) nas águas residuais de suinicultura tratadas nos diferentes microcosmos e percentagem de remoção de ferro relativa à concentração na água residual inicial ao longo de toda a experiência. Valor Limite de Emissão do Fe presente no Decreto-Lei nº 236/98 de 1 de Agosto= 2,0 mg/L. Valores na água residual inicial entre. CONT – adição de água residual sem fármacos; ENR – adição de água residual dopada com enrofloxacina; CEF – adição de água residual dopada com ceftiofur; MIX – adição de água residual dopada com uma mistura de enrofloxacina e ceftiofur. * inferior ao limite de deteção. Wi, semana i. Segundo Vymazal, (2010), as ZHC têm capacidade de remover eficientemente metais, nomeadamente Zn para o qual observou taxas de remoção que chegaram aos 94% e Cucom taxas de remoção entre 88% e 99%, em sistemas com escoamento subsuperficial na horizontal para águas residuais domésticas. No presente estudo obtiveram-se taxas de remoção entre os 79% e os 99% para Zn e 71% e os 96% para Cu, num sistema que simulava escoamento superficial vertical. Estas pequenas diferenças podem ser originadas pelo diferente design do sistema que é um dos fatores que pode influenciar significativamente as taxas de remoção de metais. Para * * F C U P | 50 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos águas de suinicultura Meers et al (2005) observaram remoções de Cu e Zn entre 79 e 92% em ZHC, níveis semelhantes aos observados no presente estudo. Estes autores concluíram que os metais Cu and Zn eram removidos eficientemente neste tipo de sistemas, sendo o processo principal de remoção associado a fenómenos de adsorção e precipitação no substrato onde se encontravam as raízes das plantas (Meers et al 2005). De referir que as plantas podem também acumular quantidades significativas de metais do meio ambiente. No entanto, Meers et al (2005) concluíram que a percentagem de metal acumulado pelas plantas teve uma contribuição minoritária na sua remoção. Relativamente a Mn e Fe foi já referido em diversos estudos que as ZHC possuem uma elevada capacidade de remoção destes metais (Vymazal, 2010). Por exemplo, foi já observado em ZHC com escoamento subsuperficial horizontal remoções elevadas de ferro e manganês de águas residuais domésticas (Vymazal, 2010). No presente estudo verificou-se que ocorrem remoções, no entanto estas foram muito variáveis e menores que as observadas para os outros metais. Nos substratos destes sistemas ocorrem diversos processos anaeróbios e anóxicos (Vymazal, 2010) que influenciam a remoção destes metais e que podem estar na origem das variabilidades observadas. Tem-se ainda de ter em consideração que, segundo Vymazal (2010), estes metais são usado pelos microorganismos como aceitadores de electrão terminal durante a respiração, sendo assim, estes metais podem mesmo ser escoados para fora do sistema. Efetivamente na semana 14 para Fe não houve remoção do metal nos microcosmos sem adição de fármacos veterinários indicando que os processos que influenciaram a concentração deste metal nas águas foram provavelmente diferentes nas semanas que antecederam a semana 14. De referir que, com exceção de Fe, não se observaram efeitos da presença dos fármacos veterinários adicionados às aguas residuais nos processos que levam à remoção de metais nos sistemas estudados. Por último, relativamente ao Mn, está comprovado que as ZHC com escoamento subsuperficial vertical, possuem uma elevada capacidade de remoção do metal referido em relação às ZHC com escoamento subsuperficial horizontal (Vymazal, 2010). F C U P | 51 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos 3.7 Fármacos veterinários A água da suinicultura foi dopada com cada um dos fármacos veterinários, Enr e Cef, individualmente ou em mistura, com uma concentração de 100 g/L de cada. Após tratamento nos diferentes microcosmos nenhum dos fármacos foi detetado na fração solúvel da água residual tratada nos diferentes microcosmos, estando as concentrações inferiores ao limite de deteção (0.2 µg/L para Enr e 0.6 µg/L para Cef) indicando que os microcosmos foram eficientes na remoção destes poluentes (remoções superiores a 90%). Existem estudos recentes que comprovam que diversos fármacos podem ser removidos eficientemente pelas ZHC. Efetivamente, existem diversos estudos que indicam que estes sistemas podem ser um tratamento complementar eficiente às estações de tratamento de águas convencionais contribuindo para a remoção de diversos poluentes emergentes de águas residuais urbanas (Garcia-Rodriguez et al., 2014), (Verlicchi & Zambello, 2014). A aplicação destes sistemas de ZHC à remoção de fármacos de águas residuais da indústria agropecuária é ainda limitada com um número escasso de estudos sobre o assunto (Carvalho et al 2013). Efetivamente, o tratamento deste tipo de efluentes é mais complicado uma vez que a matriz é muito complexa, com concentrações muito mais elevadas, por exemplo, de matéria orgânica e de nutrientes relativamente às águas residuais urbanas. No entanto, os resultados obtidos são promissores. Um dos estudos, indica por exemplo, que a percentagem de remoção de dois antibióticos veterinários (tetraciclina e Enr) presentes em águas residuais de suinicultura atingiu os 94% e 98% utilizando a planta P. australis (Carvalho et al., 2013). De referir que neste tipo de sistema, diferentes mecanismos estão envolvidos na remoção de poluentes, incluindo os poluentes emergentes, maioritariamente degradação, adsorção ao substrato, acumulação pela planta e também fotodegradação quando as águas estão expostas à superfície do substrato do sistema (Verlicchi & Zambello, 2014). No presente estudo foram também observadas remoções elevadas dos dois fármacos testados, sendo essa remoção eficaz quer quando os fármacos foram adicionados individualmente quer quando foram adicionados em mistura. F C U P | 58 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos F C U P | 59 Potencialidades da remediação biológica para a remoção de poluentes de ambientes aquáticos 5. Referências Bibliográficas Almeida, M. M. P. d. (s/d). Validação de Métodos Analíticos por Espectrofotometria de Absorção Atómica. Instituto Politécnico de Tomar-Escola Superior de Tecnologia de Tomar. Barros, L. S. S., Amaral, L. A., & Júnior, J. L. (2003). Ocorrência das formas de azoto nas águas residuais de suinicultura e em três tipos de solos. Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. Botequilha, J. R. M. (2013). Avaliação do Desempenho das Zonas Húmidas Construídas: Estudo de Caso Barroca D'Alva Březinová, T., & Vymazal, J. (2014). Competition of Phragmites australis and Phalaris arundinacea in constructed wetlands with horizontal subsurface flow – does it affect BOD5, COD and TSS removal? 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Envolve uma fase móvel, ou seja, um líquido que se distribui ao longo da fase estacionária numa direção definida. Os compostos que ficam retidos pelo sorbente da fase estacionária distribuemse rapidamente ao longo do enchimento, enquanto os que estabelecem interações mais fortes com a fase estacionária saem lentamente, ocorrendo a separação completa dos componentes de uma mistura. Designa-se por eluição o processo de escoamento dos compostos que são conduzidos pela fase móvel ao longo da coluna até à saída. Posteriormente, o detetor regista o resultado na forma de um cromatograma, que representa a concentração de analito no efluente em função do tempo ou do volume de eluição (Gomes, 2010). Um sistema de HPLC possui cinco componentes principais (Figura X): uma bomba, um sistema de injeção, uma coluna de separação e um detetor, estando todos ligados numa instalação resistente a altas pressões (Samanidou & Karageorgou, 2010). A técnica de HPLC revelou-se um dos métodos cromatográficos mais eficientes, pois permite a injeção de volumes de amostra cada vez mais pequenos e reprodutíveis e a deteção de quantidades de analito cada vez menores (Gomes, 2010). A técnica de HPLC é, provavelmente, o procedimento analítico mais universal, tendo alcançado esta posição como resultado da constante evolução dos equipamentos para proporcionar uma maior eficiência no tempo de análise, ou seja, houve uma necessidade constante de incorporação de novas colunas (Samanidou & Karageorgou, 2010).