Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade

Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade Ana Catarina da Costa Gomes Relatório de estágio de Mestrado apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Biologia Celular e Molecular 2015 Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade Ana Catarina da Costa Gomes MSc FCUP 2015 2.º CICLO ! Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade Ana Catarina Costa Gomes Mestrado em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia 2015 ! ! Orientador Vasco Manuel Martins de Almeida, Professor Auxiliar Faculdade de Ciências da Universidade do Porto ! ! ! Todas as correções determinadas pelo júri, e só ! essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade III ! Agradecimentos Durante o estágio realizado no Centro de Estudos de Infertilidade e Esterilidade, tive a oportunidade de aprofundar conhecimentos na área da reprodução medicamente assistida, assim como praticar as várias técnicas realizadas nesta área. Devo, portanto, agradecer a todos os que tornaram este estágio possível. Em primeiro lugar, ao meu professor e orientador, Professor Vasco Almeida, por me proporcionar esta oportunidade que me permitiu elevar os meus conhecimentos e confirmar a minha intenção de seguir esta carreira profissional. Agradeço ainda toda a sua disponibilidade e a partilha ilimitada de conhecimentos. ! Agradeço especialmente à Doutora Isabel Damião que me transmitiu sempre confiança e me incentivou a fazer tudo cada vez melhor através da partilha dos seus conhecimentos. Obrigada pela confiança, partilha e amizade ao longo deste ano. Ao Doutor Joaquim Gonçalves e ao Doutor Jorge Braga pelas oportunidades que me deram. Também à Cristina pelo apoio e simpatia. À Margarida, pelo apoio imprescindível que me deu durante a fase inicial do meu estágio. Agradeço ainda aos meus amigos e colegas de mestrado pelo incentivo mútuo, pela força e perseverança que nos fez chegar ao fim deste ciclo. Sem esquecer a minha família e o Daniel, um agradecimento especial por tornarem tudo isto possível. Obrigada pelo incentivo constante e por me ensinarem a nunca desistir de um sonho. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade IV ! ! ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade V ! ! ! Índice Agradecimentos ............................................................................................ III Índice ............................................................................................................... V Lista de abreviaturas .................................................................................... IX Lista de Figuras ............................................................................................ XI Lista de tabelas .......................................................................................... XVII Resumo ........................................................................................................... 1 Abstract .......................................................................................................... 3 ! Capítulo 1 - Biologia da Reprodução e Infertilidade....................................5 1.1. Sistema Reprodutor Masculino .................................................................. 7 1.1.1. Espermatogénese .................................................................................... 9 1.1.2. Controlo hormonal ................................................................................. 12 1.2. Sistema Reprodutor Feminino .................................................................. 13 1.2.1. Oogénese .............................................................................................. 14 1.2.2. Desenvolvimento folicular ...................................................................... 15 1.2.3. Ciclo menstrual ...................................................................................... 17 1.3. Interação de gâmetas – Fertilização ........................................................ 22 1.4. Desenvolvimento embrionário inicial e Implantação ............................. 25 2. Infertilidade ............................................................................................ 27 2.1. Definição e termos associados ................................................................ 27 2.2. Infertilidade e Sociedade ........................................................................... 27 2.3. Infertilidade em números .......................................................................... 28 2.4. O casal infértil - níveis de acompanhamento..........................................29 2.5. Infertilidade e as suas causas .................................................................. 30 ! Capítulo 2 - Laboratório de Reprodução Assistida...................................41 3. Análise da amostra seminal ................................................................. 43 3.1. Parâmetros macroscópicos ...................................................................... 44 3.1.1. Aparência visual .................................................................................... 44 3.1.2. pH .......................................................................................................... 44 FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade VI ! ! 3.1.3. Volume ................................................................................................... 44 3.1.4. Viscosidade ........................................................................................... 44 3.1.5. Liquefação ............................................................................................. 45 ! 3.2. Parâmetros microscópicos ....................................................................... 45 3.2.1. Motilidade ..............................................................................................45 3.2.2. Vitalidade ............................................................................................... 46 3.2.3. Concentração ........................................................................................ 47 3.2.4. Morfologia .............................................................................................. 49 3.2.5. Outros tipos celulares ............................................................................ 52 3.2.6. Anticorpos anti-espermatozoides .......................................................... 53 !3.2.7. Software CASA ......................................................................................54 3.3. Valores de Referência e Terminologia ..................................................... 54 4. Recolha de gâmetas para técnicas de RHA ........................................ 56 4.1. Recolha de gâmetas masculinos ............................................................. 56 4.2. Processamento da amostra seminal para uso em RHA ......................... 58 4.3. Recolha de gâmetas femininos ................................................................ 60 4.3.1. Estimulação Ovárica .............................................................................60 4.3.2. Punção Folicular .................................................................................... 61 4.3.3. Maturidade ovocitária ............................................................................ 62 4.4. Desnudação de ovócitos ........................................................................... 63 4.5. Maturação in vitro ...................................................................................... 64 5. Avaliação da qualidade ovocitária ....................................................... 64 5.1. Maturidade nuclear .................................................................................... 65 5.2. Anomalias intracitoplasmáticas ............................................................... 65 5.3. Anomalias extracitoplasmáticas .............................................................. 67 6. Inseminação Artificial ........................................................................... 68 7. Fertilização In Vitro ............................................................................... 70 8. Técnicas de micromanipulação ........................................................... 72 8.1. Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides – ICSI ........................ 73 8.2. Equipamento de micromanipulação ........................................................ 74 8.3. Procedimento de microinjeção ................................................................. 76 ! ! ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade XIII ! Figura 19 – Ovócito gigante (direita) ao lado de um ovócito com tamanho adequado (x200). Adaptado de Rienzi et al. (2012). ! Figura 20 – Ovócitos desnudados em diferentes fases de maturação nuclear. (a) ovócito MII, com extrusão do 1º glóbulo polar (x400). (b) ovócito com vesícula germinal visível (x400). (c) ovócito em MI, sem extrusão do 1º glóbulo polar e sem VG visível (x400). Adaptado de Rienzi et al. (2012). ! Figura 21 – Ovócitos maduros que apresentam anomalias intracitoplasmáticas. (a) ovócito com citoplasma granuloso (x400), (b) ovócito com agregados de organelos no centro, (c) ovócito com corpo refráctil (x400), (d) ovócito com vacúolo de grandes dimensões (x200), (e) ovócito com AREL no centro do citoplasma (x400). Adaptado de Rienzi et al. (2012). ! Figura 22 – Ovócitos com anomalias extracitoplasmáticas. (a) ovócito com zona pelúcida mais espessa que o normal (x200). (b) ovócito com EPV aumentado e com granulosidades. (c) Ovócito com 1º glóbulo polar fragmentado. (d) ovócito com 1º glóbulo polar gigante. Adaptado de Rienzi et al (2012). ! Figura 23 – Esquema da realização de uma IIU. A – espéculo de examinação. B – cateter de inseminação. C – Seringa com amostra seminal processada e após swimup. D – cavidade uterina onde é depositada a amostra. Imagem obtida no site http://bedmed.com.br/tratamentos/inseminacao-intra-uterina/, acedido a 18/06/2015. ! Figura 24 – Microscópio invertido usado na micromanipulação de gâmetas e embriões. Equipamento propriedade do CEIE e reproduzido com permissão. ! Figura 25 – Micromanipulador que controla os movimentos da micropipeta e que permite a aspiração ou rejeição de meio e dos gâmetas. Equipamento propriedade do CEIE e reproduzido com permissão. ! Figura 26 – Pormenor do microscópio invertido, com as micropipetas colocadas: holding do lado esquerdo e ICSI do lado direito. Equipamento propriedade do CEIE e reproduzido com permissão. ! Figura 27 – Esquematização das placas de microinjeção. a) Placa com gotas de meio tamponado (laranja) onde são colocados os ovócitos e duas gotas com PVP (verde) onde são colocados os espermatozoides. b) Placa com uma gota com FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade XIV ! espermatozoides imóveis ou com polpa testicular (roxo), duas gotas de PVP (verde), uma gota com meio hipotónico (vermelho) e gotas com meio tamponado (laranja). ! Figura 28 – a) Processo de imobilização de um espermatozoide, com a pipeta a passar sobre a cauda do espermatozoide num movimento firme. b) Aspiração do espermatozoide pela cauda, após imobilização. Adaptado de Veeck (1999). ! Figura 29 – Processo de microinjeção. a) ovócito fixado pela pipeta holding com o GP às 6h e pipeta de injeção com espermatozoide na ponta. b) introdução da pipeta de injeção no ovócito, através da zona pelúcida e oolema. c) Retirada da pipeta de injeção após deposição do espermatozoide. Adaptado de Vos (2000). ! Figura 30 – Pré-zigoto, em ampliação x600, com 2 PN em posição central, justapostos de de tamanho semelhante, com CPN alinhados no local de justaposição. Glóbulos polares fragmentados no eixo longitudinal dos PN. Adaptado de Papale et al. (2012). ! Figura 31 – Pré-zigotos 1 PN. a) Pré-zigoto observado 16h após inseminação, apresenta 1 PN e 1 GP, a uma ampliação x200. b) Pré-zigoto observado 16h e 45 minutos após inseminação, a uma ampliação x400, apresenta 1 PN e 2 GP (parcialmente sobrepostos). c) Pré-zigoto com 3 PN e CPN de grande tamanho, a ampliação x400, resultado de uma ICSI num ovócito gigante. Adaptado de Papale et al. (2012). ! Figura 32 – Pré-zigotos avaliados às 17 ± 1h após inseminação. a) Pré-zigoto observado 18h após inseminação, com 2 PN centrais e justapostos com tamanho semelhante e com CPN em igual número e tamanho (x400). b) Pré-zigoto avaliado 16h após inseminação, com PN mais pequenos que o normal, não centrados (x400). c) Pré-zigoto com 2 PN de tamanhos significativamente diferentes (x200). Adaptado de Papale et al. (2012). ! Figura 33 – Pré-zigoto com PN justapostos e centrais, alinhados paralelamente ao plano dos GP. Apresenta ainda o halo em redor do citoplasma. Adaptado de Papale et al. (2012). ! Figura 34 – Pré zigoto, avaliado 18h após inseminação, com PN afastados e de diferente tamanho. Adaptado de Papale et al. (2012). ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade XV ! Figura 35 – Pré-zigoto com diferentes posições dos PN. a) Pré-zigoto observado 18h após inseminação, com PN centrais e justapostos. CPN alinhados e de diferentes tamanhos. (x400) b) Pré-zigoto avaliado 16h após inseminação, com PN sobrepostos e periféricos (x400). Adaptado de Papale et al. (2012). Figura 36 – a) Esquematização de um pré-zigoto com os PN paralelos ao plano dos GP. b) Pré-zigoto com PN justapostos, centrados e paralelos em relação ao plano dos GP (x200). Adaptado de Papale et al. (2012). Figura 37 – a) Esquematização de um pré-zigoto com os PN perpendiculares ao plano dos GP. b) Pré-zigoto com os PN justapostos, centrados e perpendiculares em relação ao plano dos GP. 2º GP fragmentado (x400). Adaptado de Papale et al. (2012). ! Figura 38 – a) Pré-zigoto com citoplasma heterogéneo e granular e com GP fragmentados (x200). b) Pré-zigoto com PN periféricos e agregados de organelos abaixo dos PN (x200). c) Pré-zigoto com PN periféricos, GP fragmentados, zona pelúcida com espessura irregular e vacúolo de grandes dimensões (x400). Adaptado de Papale et al. (2012). ! Figura 39 – a) Embrião de Dia 2 com 2 blastómeros de tamanho igual e sem fragmentação. b) Embrião de dia 2 com 4 blastómeros e sem fragmentação. c) Embrião de dia 3 com 8 blastómeros e sem fragmentação. Adaptado de Prados et al. (2012). ! Figura 40 – a) Blastocisto inicial com o blastocélio a ocupar >50% do volume do embrião. b) Blastocisto (3:1:1) com uma grande MCI e bem compactada. c) Blastocisto de boa qualidade com uma MCI grande e com a zona pelúcida mais fina. d) Blastocisto em eclosão, com uma MCI grande e compacta às 8 horas. e) Blastocisto eclodido com a zona pelúcida vazia contendo ainda alguns detritus, MCI grande e compacta na base do blastocisto e TF com bastante células e formando um epitélio coeso. Pode observer-se o aumento de diâmetro do blastocisto a partir do momento em que eclode e deixa a zona pelúcida. Adaptado de Hardarson (2012). Figura 41 – Representação esquemática da transferência embrionária que inclui a monitorização ecográfica e a introdução do cateter de transferência, transportando FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade XVI ! os embriões, na cavidade uterina. No canto superior esquerdo encontra-se uma imagem típica do monitor do ecógrafo onde é percetível a localização do cateter. Adaptado de http://reproducaohumana.blog.br/2011/04/14/transferenciaembrionaria/, acedido a 09-07-2015. ! Figura 42 – Processo de biópsia do 1º glóbulo polar em ovócito, com abertura da zona pelúcida (a) e aspiração do 1ºGP (b). Adaptado de Veeck (1999). Figura 43 – Processo de biópsia de um blastómero em embrião em fase de clivagem, com introduçãoo da pipeta de aspiraçãoo no local de abertura da zona pelúcida (a) e aspiração do blastómero enquanto a pipeta é retirada do embrião (b). Adaptado de Veeck (1999). Figura 44 – EmbryoScope® Time-lapse incubator. Figura 45 – Placa de cultura EmbryoSlide®. ! Figura 46 – Software EmbryoViewer®. ! Figura 47 – Microscópio Primo Vision com placa de cultura. ! Figura 48 – Software Primo Vision. ! Figura 49 – Software Eeva, com distinção entre embriões com alto (verde) ou baixo (amarelo) potencial de desenvolvimento. ! Figura 50 – Palhetas de vitrificação do método Cryotop® para sistema aberto, compostas por uma palheta interna (A) para carregamento dos ovócitos/embriões e uma externa (B). Retirado de http://www.kitazato-dibimed.com/ver/11/VitrificationCryotop.html, acedido a 14-07-2015. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade XVII ! Lista de tabelas ! Tabela 1 – Diferentes classes distinguidas aquando da avaliação da motilidade. Adaptado de WHO (2010) ! Tabela 2 – Fatores de diluição para avaliação da concentração, tendo em conta o número de espermatozoides observados na amostra a fresco, na ampliação x400. Adaptado de WHO (2010). ! Tabela 3 – Fatores de divisão para calculo da concentração, tendo em conta as diluições efetuadas e o número de quadrados contados. Adaptado de NAFA e ESHRE-SIGA (2002). ! Tabela 4 – Imagens das diferentes anomalias que devem ser contabilizadas aquando da avaliação morfológica dos espermatozoides. Imagens obtidas de WHO (2010). ! Tabela 5 – Limites mínimos de referência dos vários parâmetros de análise da amostra seminal. Prog – motilidade progressiva; NP – não progressivos (in situ); PR – progressivos rápidos; PL – progressivos lentos. Adaptado de WHO (2010). ! Tabela 6 – Terminologia mais comum utilizada para classificar os resultados dos vários parâmetros do espermograma. VR – Valores de referência. Adaptado de WHO (2010). ! Tabela 7 -!Classificação Z-score com descrição de cada score e imagem correspondente. Adaptado de Scott (2003). ! Tabela 8 - Sistema de classificação de pré-zigotos, segundo o consenso de Istambul. Adaptado de A.S.i.R.M. and E.S.I.G.o.E (2011). ! Tabela 9 – Momentos de observação de pré-zigotos e embriões e a fase de desenvolvimento esperado em cada momento. Adaptado de Machtinger e Racowsky (2013). ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade XVIII ! Tabela 10 – Sistema de classificação de embriões em fase de clivagem de acordo com o consenso de Istambul (2011). Adaptado de Machtinger e Racowsky (2013). ! Tabela 11 – Sistema de classificação de embriões de 4º dia. Adaptado de A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E. (2011). Imagens adaptadas de Prados et al. (2012). ! Tabela 12 – Sistema de classificação de blastocistos, de acordo com o consenso de Istambul, que combina o estado de desenvolvimento e a classificação da massa celular interna (MCI) e trofoectoderme (TF). Adaptado de A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E. (2011). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 1 ! Resumo ! A infertilidade é tida como a incapacidade de conceção após 12 meses de relações sexuais regulares e desprotegidas. Esta é considerada, pela Organização Mundial de Saúde, uma doença do sistema reprodutor que afeta 1 em cada 6 casais em todo o mundo. As suas causas podem ter origem em fatores masculinos, femininos ou idiopáticos. Os fatores masculinos, por si só ou em combinação com outros, correspondem a 50% dos casos. Cerca de 25% dos casos de infertilidade têm origem idiopática, ou seja, sem causa conhecida. O conhecimento da origem da infertilidade é um passo importante e é atingido através de um correto acompanhamento do casal. Após realizado o diagnóstico, o casal pode ser encaminhado para o tratamento da sua infertilidade, recorrendo à técnica mais adequada. Os ciclos de tratamento da infertilidade beneficiaram com os vários avanços na área da medicina da reprodução, nomeadamente com o desenvolvimento de protocolos de estimulação ovárica, punção folicular, fertilização in vitro (FIV) e injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Todos os ciclos, incluindo os de inseminação intrauterina (IIU), iniciam-se com a estimulação ovárica e incluem o processamento da amostra seminal. Dependendo do fator de infertilidade é escolhida a técnica. Os casos mais complexos incluem a punção folicular para inseminação dos ovócitos in vitro, por FIV ou ICSI. Com o desenvolvimento da ICSI tornou-se possível o tratamento de todos os casos de infertilidade masculina, incluindo a azoospermia, pelo recurso a biópsias testiculares. Após a cultura embrionária, os embriões selecionados são transferidos e os embriões excedentários são criopreservados. Estes podem ser utilizados num novo ciclo. A criopreservação é realizada não só em embriões mas também em gâmetas. A criopreservação de espermatozoides e ovócitos permite a preservação da fertilidade, assim como a criação de bancos de gâmetas, já existentes para espermatozoides e uma possível realidade futura para ovócitos. Estes bancos são especialmente úteis em ciclos que necessitam de doação de gâmetas. A reprodução assistida traz ainda vantagens quando existe o risco de transmissão de doenças genéticas ou cromossómicas. Para estes casos foi desenvolvido o diagnóstico genético pré-implantação (DGPI), que por biópsia de glóbulos polares, blastómeros ou células da trofoectoderme e posterior análise FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 2 ! genética, por PCR ou FISH, se distingue os embriões afetados dos não afetados. Os últimos podem ser transferidos. A área do tratamento da infertilidade e da reprodução humana assistida sofre evoluções constantes, sempre com o intuito de alcançar, em taxas cada vez maiores, o seu objetivo final que é o nascimento de bebés saudáveis. Palavras-chave: infertilidade, reprodução humana assistida, FIV, ICSI, IIU, criopreservação, doação, gâmetas, embriões, DGPI. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 3 ! Abstract Infertility is defined as the incapacity to conceive after 12 months of frequent and unprotected intercourse. It is considered a disease, by the World Health Organization, that afects 1 in each 6 couples worldwide. Infertility can be caused by male, female or idiopathic factos. Male factors, by itself or in combination with others, represents 50% of the infertility cases. About 25% results of unexplained infertility. The knowledge of the cause of the infertility is a key factor for its treatment and it is achieved through a correct diagnosis and accompaniment of the couple. After the diagnosis is done, the adequate technique can be chosen. The treatment of infertility benefited with the various advances in reproductive medicine field, such as the development of protocols for ovarian stimulation, oocyte retrieval, in vitro fertilization (IVF) and intracitoplasmatic sperm injection (ICSI). Every cycle starts with ovarian stimulation and processing of seminal samples, including the cases of intrauterine insemination. The more complex cases include oocyte retrieval to inseminate them in vitro, by IVF or ICSI. The treatment of every type of male infertility became possible after the development of ICSI. Even azoospermic man can become fathers resorting to testicular biopsy combining with ICSI. After embryo culture, the selected embryos are transferred and the surplus can be cryopreserved and used in another cycle of treatment. Cryopreservation is not done only in embryos but also in gametes. Cryopreservation of sperm and oocytes allows the preservation of fertility and the establishment of gamete banks, as it’s done nowadays for sperm and in a near future can be done for oocytes. These banks are especially useful for patients who need gamete donation. Assisted reproduction is also helpful when exists the risk of transmission of genetic diseases. For those cases was developed the pre-implantation genetic diagnosis (PGD) that allows the differentiation of affected embryos from those not affected, after genetic analysis by PCR or FISH. Embryos that are proven to be not affected can then be transferred. The field of assisted reproduction undergoes constant developments, always with the final aim of improving success rates and the birth of a healthy child. Keywords: infertility, assisted reproduction, IVF, ICSI, cryopreservation, gametes, donation, embryos, PGD. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 4 ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 11 ! necessária para o movimento, e microtúbulos que derivam dos centríolos e se estendem até à cauda (Silverthorn, 2013). Na cabeça encontra-se um núcleo com a cromatina muito condensada, compactação essa que se deve à substituição das histonas por proteínas específicas dos espermatozoides, as protaminas. A associação do DNA às protaminas confere-lhe maior condensação e estabilidade devido a pontes de dissulfito criadas entre protaminas (Chao et al., 2012). A revestir a cabeça, forma-se o acrossoma, uma vesícula com enzimas importantes para a fertilização (Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006). As células de Sertoli, essenciais na espermatogénese, fazem parte dos constituintes dos túbulos seminíferos, em conjunto com as células da linha germinativa nos vários estados de maturação. As células de Sertoli encontram-se ligadas entre si por tight junctions (Fox, 2011; Silverthorn, 2013) e estendem-se por toda a altura dos túbulos (Tate, 2012b), formando dois compartimentos – basal e o adluminal (Widmaier et al., 2006). No compartimento basal encontram-se as espermatogónias e à medida que se aproxima o lúmen do túbulo encontram-se células mais diferenciadas (Elder e Dale, 2003). Por estarem interligadas, as células de Sertoli constituem a barreira hematotesticular. Esta controla a passagem de moléculas do sangue e impede que haja uma ação do sistema imunológico contra os espermatozoides em desenvolvimento (Fox, 2011). Ao longo do processo de espermatogénese, as células vão-se aproximando do lúmen dos túbulos e permanecem rodeadas pelas células de Sertoli que vão quebrando e refazendo as suas ligações até que os espermatozoides são libertados para o lúmen (Fox, 2011; Silverthorn, 2013). Para além de protegerem os espermatozoides em desenvolvimento de uma resposta autoimune, as células de Sertoli são também responsáveis pela sua nutrição (Tate, 2012b). O processo de formação dos espermatozoides leva cerca de 64 dias e os espermatozoides que são libertados para o lúmen dos túbulos não estão maduros nem têm movimento (Silverthorn, 2013). É nos epidídimos que adquirem capacidade de movimento e sofrem maturação, o que os torna mais resistente à temperatura e ao pH baixo dos epidídimos e ductos deferentes. O pH é neutralizado antes da ejaculação, devido à adição dos fluidos secretados pelas glândulas anexas e nesta altura os espermatozoides tornam-se móveis (Fox, 2011). Os epidídimos são, portanto, um local de maturação e armazenamento de espermatozoides entre ejaculações (Elder e Dale, 2003; Fox, 2011). Os túbulos seminíferos são rodeados por tecido intersticial, que contém as células de Leydig. Estas células têm um papel importante na espermatogénese por serem produtoras de testosterona (Tate, 2012b). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 12 ! 1.1.2. Controlo hormonal O eixo hipotálamo-hipófise é responsável pela secreção de gonadotrofinas que regulam a atividade endócrina e espermatogénica nos testículos. A produção de gâmetas e hormonas esteroides, nos homens, é um processo contínuo após a puberdade (Elder e Dale, 2003). Desde o desenvolvimento embrionário até à puberdade, as espermatogónias só se desenvolvem até espermatócitos primários. Para completar a meiose e prosseguir a maturação, é necessária testosterona (Fox, 2011). O hipotálamo produz a Hormona Libertadora de Gonadotrofinas (GnRH) que atinge a hipófise anterior através dos vasos do sistema porta hipotálamo-hipófise (Widmaier et al., 2006) e estimula a produção das hormonas luteinizante (LH) e folículo-estimulante (FSH) (Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006). Embora estas duas hormonas sejam produzidas pelo mesmo tipo de células da hipófise, podem ser libertadas em diferentes quantidades (Widmaier et al., 2006). A LH e a FSH atuam ambas nos testículos mas em células-alvo diferentes. A FSH liga-se às células de Sertoli, estimulando-as a produzir inibina e a proteína de ligação a androgénios (ABP) (Elder e Dale, 2003; Widmaier et al., 2006) e promovendo o desenvolvimento das células espermáticas (Tate, 2012b). A LH atua nas células de Leydig e estimula-as a produzir testosterona (Silverthorn, 2013; Tate, 2012b). A testosterona, para além de funções como a indução de características sexuais secundárias e a diferenciação dos órgãos reprodutores masculinos, atua nas células de Sertoli estimulando a espermatogénese. A proteína ABP, produzida pelas células de Sertoli, liga-se à testosterona e permite manter a sua concentração dentro dos túbulos seminíferos, em níveis adequados ao desenvolvimento das células espermáticas (Fox, 2011; Widmaier et al., 2006). O controlo da segregação das hormonas envolvidas na espermatogénese é feito por feedback negativo (Tate, 2012b; Widmaier et al., 2006). Assim, a testosterona tem um papel importante nesse controlo pela inibição da secreção da LH de duas formas distintas: através da ação no hipotálamo que inibe a libertação de GnRH e por ação na hipófise que inibe diretamente a produção de LH. A inibina, segregada pelas células de Sertoli, participa também neste controlo por inibição da libertação de FSH (Tate, 2012b; Widmaier et al., 2006). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 13 ! 1.2. Sistema Reprodutor Feminino Os órgãos reprodutores femininos englobam os ovários, trompas de Falópio, útero, vagina (figura 5) e a genitália externa (Tate, 2012b). Os ovários são pequenos órgãos com cerca de 2 a 3,5 cm de comprimento e 1 a 1,5 cm de largura, associados ao útero através de ligamentos. Os ovários estão envolvidos por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso e o seu interior está dividido em duas regiões: o córtex, a parte mais externa e densa, e a medula, a parte mais interna. As trompas de Falópio são estruturas tubares com 20-25cm, com duas camadas de músculo liso e um epitélio ciliado (Silverthorn, 2013). Estas encontramse associadas a cada um dos ovários e estendem-se até ao útero (Tate, 2012b). A extremidade das trompas que se abre junto aos ovários não está fisicamente ligada a estes mas contém várias extensões, as fímbrias, que captam o ovócito na altura da ovulação (Fox, 2011). Os cílios e contrações musculares da parede das trompas promovem o transporte do ovócito em direção ao útero (Silverthorn, 2013). As trompas dividem-se em três zonas – infundíbulo, ampola e istmo. O infundíbulo é uma região em forma de funil mais próxima da extremidade com as fímbrias (Tate, 2012b). A ampola é a região mais longa da trompa e é o local onde ocorre a fecundação. O istmo é a zona mais próxima do útero que consiste numa forte camada muscular. O útero é um órgão muscular em forma de pêra (Fox, 2011) com cerca de 7,5 cm de comprimento e 5 cm de largura (Tate, 2012b). A parte superior do útero é designada por fundo, a parte principal é o corpo do útero e a parte inferior e mais estreita, com abertura na vagina, é o cérvix (Tate, 2012b). O canal cervical contém várias glândulas produtoras do muco que funciona como barreira física entre a vagina e o útero (Fox, 2011; Silverthorn, 2013; Tate, 2012b). As paredes uterinas são compostas por três camadas – o perimétrio, miométrio e endométrio. O perimetrio é a camada mais externa de tecido conjuntivo, o miométrio é a camada do meio de músculo liso e o endométrio é a camada mais interior de epitélio estratificado composto por dois estratos: basal e funcional. O estrato funcional responde ao estrogénio e progesterona. Este sofre, por isso, mudanças cíclicas e é removido durante a menstruação (Fox, 2011). A vagina é o órgão copulador feminino que permite também o fluxo menstrual e o nascimento. Este órgão é um tubo com cerca de 10cm que liga o útero ao exterior. A sua parede tem uma camada externa de músculo liso que contém também fibras elásticas, razão pela qual a vagina pode aumentar bastante de tamanho, a ponto de permitir o nascimento de uma criança. A camada FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 14 ! mais interna da parede da vagina é uma camada mucosa que intervém na sua lubrificação (Tate, 2012b). A abertura da vagina encontra-se numa posição posterior à abertura da uretra e ambas são cobertas pelos lábios maiores (mais externos) e menores (mais internos) (Fox, 2011). O clitóris é uma pequena estrutura com cerca de 2 cm, que contém vários recetores sensoriais (Tate, 2012b) e que se localiza na margem anterior dos lábios menores (Fox, 2011). Estas estruturas – lábios maiores, lábios menores e clitóris – em conjunto, constituem a genitália externa feminina, também designada por vulva (Silverthorn, 2013; Tate, 2012b). 1.2.1. Oogénese A oogénese corresponde ao desenvolvimento dos ovócitos e ocorre nos ovários. As células germinativas, também dedignadas por oogónias, começam por se multiplicar mitoticamente ainda durante a vida fetal (Tate, 2012b). Por volta do quinto mês de gestação, os ovários já contêm cerca de 6 a 7 milhões de oogónias (Fox, 2011). A partir deste momento não são criadas mais oogónias (Widmaier et al., 2006), para além disso, algumas delas degeneram por processos de apoptose (Fox, 2011; Tate, 2012b). As oogónias que permanecem viáveis iniciam a divisão meiótica e passam a ser designadas por ovócitos primários. No entanto, a primeira divisão Corpo do útero Fundo do útero Ligamento Trompa de Falópio Ampola Infundíbulo Fímbrias Ovócito Folículo Endométrio Miométrio Perimétrio Cérvix Vagina Ovário Fig. 5 - Representação esquemática dos órgãos reprodutores femininos, nomeadamente do útero, trompas de Falópio e ovários, juntamente com as estruturas que os constituem. Adaptado de Fox (2011). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 15 ! meiótica não se completa e os ovócitos primários permanecem parados em Profase I e continuam, portanto, a ser células diploides (Fox, 2011) com um núcleo característico, de grandes dimensões, designado por vesícula germinativa (Elder e Dale, 2003). Por altura do nascimento, os ovários contam com cerca de 2 milhões de ovócitos primários, envolvidos por células, formando os folículos ováricos (Fox, 2011). O número de folículos e, consequentemente, de ovócitos primários continua a diminuir sendo que a mulher atinge a puberdade com cerca de 400 mil folículos. Desses, apenas 400 ovócitos primários irão desenvolver-se até ovócitos secundários e serem expulsos do ovário por um fenómeno designado de ovulação. Mesmo antes da ovulação, os ovócitos primários completam a primeira divisão meiótica, dando origem aos ovócitos secundários (Tate, 2012b). No final desta divisão, uma das células-filhas – o ovócito secundário – retém praticamente todo o citoplasma, enquanto que a outra célula-filha, designada por 1º Glóbulo Polar, fica muito mais pequena e não funcional (Widmaier et al., 2006). Esta divisão desigual do citoplasma permite que o ovócito secundário seja suficientemente grande que possa originar um embrião (Fox, 2011) e que contenha organelos e nutrientes suficientes que o tornem viável (Tate, 2012b). O ovócito secundário inicia a segunda divisão meiótica mas também esta não se completa e fica retida em Metafase II (Fox, 2011; Tate, 2012b). Esta divisão meiótica só se completa se o ovócito for fecundado. Neste caso, a segunda divisão também termina com a divisão desigual do citoplasma, originando o 2º Glóbulo Polar (Widmaier et al., 2006). 1.2.2. Desenvolvimento folicular Durante toda a sua vida nos ovários, os ovócitos encontram-se incluídos em estruturas – os folículos – que apresentam vários estádios de desenvolvimento (figura 6). Estes começam como folículos primordiais, que consistem no ovócito primário rodeado por uma única camada de células achatadas, as células da granulosa (Widmaier et al., 2006). Com o desenvolvimento, os folículos primordiais passam a folículos primários (Tate, 2012b). Nos folículos primários, o ovócito aumenta de tamanho e as células da granulosa tornam-se cúbicas e proliferam em várias camadas (Fox, 2011; Tate, 2012b). Por esta altura, o ovócito encontra-se separado das células da granulosa pela zona pelúcida (Widmaier et al., 2006), uma camada de proteínas e polissacarídeos que forma uma barreira que só os espermatozoides capazes poderão ultrapassar (Fox, 2011). Alguns folículos primários continuam a desenvolver-se e formam várias vesículas cheias de líquido entre as células da granulosa (Tate, 2012b), assim como uma camada de células do tecido conjuntivo FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 16 ! (Widmaier et al., 2006) a envolver o folículo, designada por teca. Nesta altura, os folículos passam a chamar-se folículos secundários (Tate, 2012b). Estes continuam a aumentar de tamanho e as vesículas que se tinham formado unem-se e dão origem ao antro. O ovócito primário atinge o seu tamanho máximo e estes folículos dão pelo nome de folículo antral (Fox, 2011). Em cada ciclo menstrual, vários folículos atingem o estado de folículo antral mas, na maioria dos casos, apenas um consegue atingir a maturidade (Widmaier et al., 2006) e passa a designar-se por folículo de Graaf. Todos os outros que se começaram a desenvolver sofrem atresia, assim como aqueles que começam o seu desenvolvimento antes do início da puberdade que, por ausência das hormonas necessárias a partir desta fase, acabam por degenerar. No folículo de Graaf, o ovócito toma uma posição excêntrica e as células da granulosa formam uma massa que o sustenta, designada por cumulus oophurus. O ovócito é rodeado pela zona pelúcida e por células da granulosa, que formam a coroa radiata. É este conjunto que é expelido durante a ovulação. Pouco antes de ocorrer a ovulação, o ovócito primário completa a 1ª divisão meiótica e passa a ovócito secundário. Para além disso, o cumulus separa-se da parede do folículo, fazendo com que o ovócito flutue no antro. A ovulação ocorre quando as paredes do folículo e do ovário se rompem (Widmaier et al., 2006). Após a ovulação, as células foliculares que permanecem no ovário são transformadas no corpo lúteo ou corpo amarelo (Fox, 2011). Se ocorrer gravidez, o corpo lúteo permanece ativo durante 3 meses. Se tal não acontecer, o corpo lúteo mantém-se por 10-12 dias e depois degenera, originando o corpo albicans ou branco, que acaba por desaparecer (Tate, 2012b). Folículo Primário Ovócito primário Folículo Secundário Folículo de Graaf Antro Cumulus Oophurus Ovócito Secundário Corpo Lúteo Corpo Branco Coroa radiata Ovócito secundário Zona Pelúcida Ovulação Fig. 6 - Representação esquemática do desenvolvimento folicular e ovocitário, no interior do ovário. Adaptado de Fox (2011). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 17 ! 1.2.3. Ciclo menstrual As mulheres produzem gâmetas em ciclos mensais (Silverthorn, 2013) com uma duração típica de cerca de 28 dias (Fox, 2011; Tate, 2012b). Estes ciclos são conhecidos como ciclos menstruais por serem marcados por 3 a 7 dias de fluxo de sangue e células endometriais, designado por menstruação (Silverthorn, 2013). O primeiro dia deste ciclo corresponde ao primeiro dia de menstruação apenas pelo facto de o fluxo menstrual ser a característica mais facilmente identificável (Fox, 2011). O ciclo menstrual é caracterizado por alterações nos folículos dos ovários, constituindo o ciclo ovárico, mas também por mudanças na camada endometrial do útero, correspondendo ao ciclo uterino. Estes dois ciclos encontram-se sob o controlo de várias hormonas como a GnRH do hipotálamo, a LH e FSH da hipófise anterior e o estrogénio, progesterona e inibina produzidas pelos ovários (Silverthorn, 2013) (figura 7). O ciclo menstrual resulta na produção de ovócitos secundários e na preparação do útero para a implantação (Tate, 2012b). 1.2.3.1. Ciclo ovárico O ciclo ovárico pode ser dividido em três fases – folicular, ovulação e lútea – que traduzem as alterações provocadas nos folículos. • Fase folicular A fase folicular dura desde o 1º dia até cerca do 13º dia do ciclo, no entanto, esta fase pode ter uma duração muito variável (Fox, 2011). Durante esta fase, os folículos podem prosseguir o seu desenvolvimento para além de folículo pré-antral e antral, sendo que para isso é necessária a estimulação da hormona FSH (Widmaier et al., 2006). A FSH atua sobre as células da granulosa, estimulando-as a proliferar e a produzir estrogénios (Fox, 2011; Widmaier et al., 2006). Com o crescimento folicular, as células da granulosa vão produzindo níveis crescentes de estrogénios, principalmente estradiol. Este estradiol, em conjunto com a FSH, aumenta o número de recetores da FSH na membrana das células da granulosa. O maior número de recetores resulta numa maior sensibilidade das células à FSH e numa maior produção de estradiol, o que faz com que os folículos se continuem a desenvolver mesmo que os níveis de FSH não aumentem (Fox, 2011). Os níveis de FSH e LH diminuem devido ao feedback negativo que o estradiol exerce na hipófise (Silverthorn, 2013). Para que as células da granulosa produzam estrogénios, é FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 18 ! necessária a colaboração das células da teca. Estas são estimuladas, pela hormona LH, a transformarem colesterol em androgénios. Estes androgénios difundem-se para as células da granulosa que, por ação da aromatase, os convertem em estrogénios (Silverthorn, 2013). A FSH e o estradiol estimulam também a produção de receptores para a LH (Fox, 2011). Uma vez que os níveis de FSH começam a diminuir, a concentração desta hormona deixa de ser suficiente para impedir a atresia e a maioria dos folículos começa a degenerar. No entanto, um dos folículos – o folículo dominante – permanece em desenvolvimento pois ganhou mais sensibilidade à FSH (maior número de recetores) e também porque há células da granulosa do folículo dominante que adquiriram recetores para a LH, passando a ser estimuladas também por esta hormona (Widmaier et al., 2006). Este folículo prossegue a sua maturação e torna-se um folículo de Graaf com a cavidade antral cheia de fluido produzido pelas células da granulosa. Este fluido contém hormonas e enzimas necessárias para que ocorra a ovulação (Silverthorn, 2013). Com o folículo cada vez mais desenvolvido, os níveis de estrogénio sofrem um grande aumento, a ponto de reverter o feedback que exerciam para feedback positivo (Widmaier et al., 2006) e inicia-se o período préovulatório (Silverthorn, 2013). Como consequência, o hipotálamo aumenta a frequência dos pulsos de GnRH, enquanto que a hipófise fica mais sensível a essa GnRH, resultando no pico de LH (Fox, 2011; Widmaier et al., 2006). A FSH sofre também um aumento mas em menor escala devido à ação da inibina (Silverthorn, 2013), produzida pelas células da granulosa (Widmaier et al., 2006). Nesta altura, a grande quantidade de LH leva as células da granulosa e da teca a produzirem progesterona, mesmo antes da ovulação. A ovulação é também precedida pela finalização da 1ª divisão da meiose (Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006) dando origem ao ovócito secundário e ao 1º glóbulo polar (Silverthorn, 2013) • Ovulação O pico de LH é o principal evento que induz a ovulação (Fox, 2011; Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006) que ocorre por volta do 14º dia do ciclo (Fox, 2011). Por ação da LH, as células da granulosa produzem enzimas, como a colagenase, e prostaglandinas (Widmaier et al., 2006). A colagenase dissolve o colagénio do tecido conjuntivo que mantém as células foliculares unidas e as prostaglandinas provocam a contração do músculo liso da teca externa. Em conjunto, estes fenómenos levam à rutura do folículo. O ovócito secundário, parado em metáfase II, é então libertado e captado pelas fímbrias da trompa de Falópio. O ovócito ovulado está rodeado pela zona pelúcida e pela coroa radiata (Fox, 2011). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 19 ! • Fase lútea As grandes concentrações de LH, para além de induzirem a ovulação, estimulam reações de transformação das células da granulosa e da teca que permanecem no ovário, em células lúteas (Widmaier et al., 2006). Esta transformação inclui modificações bioquímicas e morfológicas (Silverthorn, 2013). O corpo lúteo, ou amarelo, então formado começa a segregar estradiol, progesterona e também inibina (Fox, 2011; Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006), sendo que a hormona dominante da fase lútea é a progesterona (Silverthorn, 2013). As concentrações de estrogénio e progesterona exercem um feedback negativo no hipotálamo e na hipófise anterior que resulta na inibição da produção de LH e FSH (Fox, 2011; Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006). A inibina ajuda também na inibição da FSH (Fox, 2011; Widmaier et al., 2006). Assim, durante a fase lútea as concentrações de gonadotrofinas são baixas (Widmaier et al., 2006), o que ajuda a retardar o desenvolvimento de novos folículos (Fox, 2011). Se não ocorrer gravidez, o corpo lúteo degenera ao fim de 14 dias (Widmaier et al., 2006) e origina o corpo albicans ou branco (Silverthorn, 2013). Com a regressão do corpo lúteo, as concentrações de progesterona, estrogénio e também de inibina diminuem, acabando com o feedback negativo imposto às gonadotrofinas (Fox, 2011; Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006). Consequentemente, os níveis de LH e FSH aumentam no fim da fase lútea (Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006) permitindo a seleção de um novo grupo de folículos que iniciam o seu desenvolvimento e, portanto, inicia-se também um novo ciclo (Fox, 2011; Widmaier et al., 2006). Caso ocorra gravidez, a hormona coriónica humana (hCG) produzida pela placenta mantém o corpo lúteo ativo e a produzir estrogénio e progesterona. 1.2.3.2. Ciclo uterino O ciclo uterino corresponde a alterações no endométrio provocadas pelas mudanças cíclicas das concentrações de estrogénio e progesterona (Fox, 2011). Este ciclo encontra-se dividido em três fases – proliferativa, secretora e menstrual – que se relacionam com o ciclo ovárico, uma vez que os ovários são os produtores tanto de estrogénio como de progesterona. Assim, as fases menstrual e proliferativa do ciclo uterino correspondem à fase folicular do ovário, enquanto que a fase secretora corresponde à fase lútea (Widmaier et al., 2006). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 20 ! • Fase proliferativa A fase proliferativa dura cerca de 10 dias, desde o fim da menstruação até à ovulação (Widmaier et al., 2006). Enquanto nos ovários ocorre a fase folicular, os folículos em desenvolvimento vão produzindo cada vez mais estrogénio. O consequente aumento da concentração de estrogénio tem efeito na camada endometrial do útero, estimulando a proliferação celular do estrato funcional (Fox, 2011). Nesta altura, desenvolvem-se vasos sanguíneos, designados por artérias espirais (Fox, 2011; Tate, 2012b), o que resulta num aumento do fluxo sanguíneo no endométrio. Por consequência, há uma maior quantidade de oxigénio e nutrientes a chegar a esta estrutura (Silverthorn, 2013). O estrogénio estimula ainda a produção de recetores para a progesterona nas células endometriais (Fox, 2011; Tate, 2012b; Widmaier et al., 2006), preparando desta forma o endométrio para a próxima fase (Fox, 2011). Para além disso, os estrogénios têm influencia nas glândulas mucosas do cérvix, estimulando a produção de um muco cervical mais aquoso (Fox, 2011; Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006), que permita a passagem de espermatozoides. • Fase secretora Após a ovulação ocorre a formação do corpo lúteo, que inicia a produção de progesterona (Widmaier et al., 2006). Esta hormona continua a preparação do endométrio para o caso de ocorrer gravidez e transforma-o numa estrutura secretora (Silverthorn, 2013). Nesta fase há um aumento da vascularização (Tate, 2012b; Widmaier et al., 2006) e as células endometriais produzem secreções ricas em glicogénio e lípidos (Tate, 2012b), que se acumulam no citoplasma (Silverthorn, 2013). Estas secreções encarregam-se da nutrição do embrião enquanto a placenta se desenvolve (Silverthorn, 2013). A progesterona, tal como os estrogénios, influencia também as características do muco cervical, tornando-o mais viscoso. O muco cervical forma, portanto, um bloqueio à passagem de espermatozoides e também de bactérias, protegendo assim o embrião (Silverthorn, 2013; Widmaier et al., 2006). • Fase menstrual Se não ocorrer gravidez, o corpo lúteo degenera. Consequentemente, a produção de estrogénio e progesterona diminui, o que provoca a constrição dos vasos sanguíneos do endométrio. Esta constrição das artérias espirais leva à diminuição do fornecimento de oxigénio e nutrientes, causando a morte das células do estrato funcional do endométrio (Fox, 2011). No entanto, uma fina camada de células permanece intacta e são essas que, no próximo ciclo, farão a regeneração do FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 27 ! 2. Infertilidade 2.1. Definição e termos associados O direito a procriar é uma condição inegável dos Direitos Humanos (Penzias, 2007). No entanto, não é um direito acessível a todos os casais por motivos de infertilidade, quer feminina quer masculina. A infertilidade é definida, pela Organização Mundial de Saúde (OMS), como uma doença do sistema reprodutor que leva à ausência de gravidez clinicamente comprovada após 12 meses ou mais de relações sexuais regulares e desprotegidas (Zegers-Hochschild et al., 2009). A infertilidade pode ser primária, quando nunca ocorreu conceção, ou secundária, quando pelo menos um membro do casal já obteve gravidez (Mascarenhas et al., 2012). O termo infertilidade não deve ser confundido com esterilidade. Esta última resulta de um impedimento absoluto de fecundação, por causa feminina ou masculina, e que torna impossível qualquer tipo de tratamento. No entanto, casais estéreis podem recorrer a dadores de espermatozoides ou ovócitos, à doação de embriões ou à adoção. Outro termo importante nesta área é o de fecundabilidade, que corresponde à capacidade de produzir uma gravidez clinicamente comprovada no período de um ciclo menstrual (Whitman-Elia e Baxley, 2001). 2.2. Infertilidade e Sociedade A infertilidade pode levar a problemas de stress, depressão e é motivo de discriminação em várias culturas (Cui, 2010), sendo já considerada uma questão de saúde pública (Boivin et al., 2007). Apesar do papel central da reprodução e fertilidade na sobrevivência da espécie (Bhasin, 2007), a prevenção da infertilidade e o seu tratamento são muitas vezes postos de parte, ficando para último na lista de prioridades de vários países (Cui, 2010). Esta questão agrava-se nos países em desenvolvimento pelo reduzido acesso a tratamentos médicos que previnem, por exemplo, a transmissão de doenças sexualmente transmissíveis e reduzem as suas consequências (Cui, 2010; Mascarenhas et al., 2012). Desde sempre que a reprodução é associada à prosperidade dos povos e a mulher sempre foi um símbolo de fertilidade. Portanto, recaía sobre ela toda a responsabilidade da procriação. Nas civilizações antigas, era impensável atribuir a causa de infertilidade ao homem, à exceção da civilização Egípcia, na qual a mulher FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 28 ! ocupava um lugar de destaque e de igualdade perante o homem (Silva-Carvalho e Santos, 2009). Na Grécia Antiga, Hipócrates (460-380 aC) foi um dos primeiros autores de trabalhos médicos sobre ginecologia. Também Aristóteles (384-322 aC) realizou estudos na área da reprodução, anatomia comparativa e embriologia. Na Bíblia também são feitas referências à reprodução. Naquela época, a mulher era julgada pela sua capacidade de manter uma gravidez, a infertilidade era vista como um castigo e Deus era considerado a fonte de fertilidade e infertilidade. No Renascimento, surgiram os primeiros termos ligados ao sistema reprodutor por Andreas Versalius (1514-1564) e Gabrielle Fallopio (1523-1562). Lazzaro Spallanzani (1729-1799) observou a fecundação após colocar ovócitos em contacto direto com esperma, trabalho descrito em Fecondazione Artificiale. Na Era Moderna, surgiram avanços no diagnóstico e tratamento da infertilidade que permitiram a conceção em casais com problemas antes considerados incorrigíveis. Desde a primeira Fertilização In Vitro (FIV) bem sucedida, realizada por Patrick Steptoe e Robert Edwards em 1978, calcula-se que tenham nascido mais de 5 milhões de bebés recorrendo a tecnologias de fertilização in vitro (Loendersloot et al., 2014). O ganho de conhecimentos na área da infertilidade levou ao desenvolvimento de tecnologias para o seu tratamento. No entanto, estes avanços realçaram que a infertilidade é mais do que um problema de saúde, mas levanta também problemas legais, económicos, morais e éticos (Penzias, 2007). 2.3. Infertilidade em números O estudo da prevalência da infertilidade não é algo simples de realizar. Este é influenciado pelo método de avaliação, pelos critérios de diagnóstico e pelas diferentes definições de infertilidade (Silva-Carvalho e Santos, 2009). A infertilidade é um problema que afeta 48,5 milhões de casais em todo o mundo (Mascarenhas et al., 2012). Em Portugal, cerda de 9 a 10% das mulheres sofrem infertilidade ao longo da vida, sendo que 116 630 a 121 059 dessas mulheres estão em idade reprodutora. Cerca de 57 a 61% das mulheres com infertilidade em idade reprodutora recorrem a consulta médica e 25% são tratadas recorrendo a procriação medicamente assistida (Silva-Carvalho e Santos, 2009). Em 50% dos casos, a infertilidade tem causa masculina, sendo que em 30% dos casos é a principal causa e em 20% dos casos está em conjugação com outros fatores (Poongothai et al., 2009). Quanto à infertilidade feminina, 20% dos casos deve-se a fatores tubo-peritoneal (endometriose, adesões pélvicas, problemas tubares), 5% FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 29 ! estão relacionados com fatores uterino-cervicais e 20% por disfunção ovulatória. Em 25% dos casais, a infertilidade é designada por idiopática, ou seja, sem causa conhecida ou que necessita de mais investigação (Bayer et al., 2002). Em termos de fecundabilidade, apenas 1 em cada 5 (20%) casais jovens no pico de fertilidade (25 anos) a tentar gravidez, a conseguirão num dado mês (Kamel, 2010; Whitman-Elia e Baxley, 2001). Dos restantes 80%, 85% conseguem gravidez no primeiro ano (Bayer e Alper, 2007; Whitman-Elia e Baxley, 2001). 2.4. O casal infértil – níveis de acompanhamento O estudo da infertilidade deve seguir alguns passos necessários para a obtenção de um diagnóstico correto. O casal deve ser avaliado em conjunto para determinar se o problema está relacionado com fatores masculinos, femininos ou com ambos (Bayer et al., 2002). O objetivo deverá ser distinguir casais com problemas possíveis de serem tratados, casais candidatos a técnicas de reprodução assistida, casais estéreis e que devem considerar a adoção ou a inseminação com doação de gâmetas e ainda os que exigem uma avaliação genética (Bhasin, 2007). O momento para iniciar o estudo da infertilidade deve ter em conta a história reprodutiva do casal e a sua sexualidade, o que inclui a duração da infertilidade, maternidade/paternidade anteriores, tratamentos já utilizados e a frequência das relações sexuais. A idade da mulher e a existência ou não de fatores de risco influenciam também o momento no qual deve ser iniciado o estudo da infertilidade. Assim, este deve ter início após um ano de relações sexuais regulares e desprotegidas em casais em que a mulher tem menos de 35 anos ou após 6 meses se a mulher tiver mais de 35 anos (Bayer e Alper, 2007). Em casos em que se observam fatores de risco de infertilidade, o estudo deve ser iniciado logo que o casal procure ajuda (Bayer, 2007a). O estudo do casal infértil deve passar por diferentes níveis de cuidado. Nos cuidados de saúde primários, prestados pelo médico de Saúde Geral e Familiar, deve ser feita uma avaliação pré-concepcional avaliando a história clinica da mulher e do homem e efetuando exames físicos e análises (hemograma, bioquímica, marcadores víricos para Hepatite B e C, e para VIH 1 e 2). Os cuidados de saúde secundários cabem ao ginecologista ou obstetra que avalia a mulher quanto à sua função ovulatória, fatores tubar e peritoneal e também o fator uterino. Avalia ainda o elemento masculino através de espermograma. No caso de se obterem resultados abaixo do normal no espermograma, ou se houver suspeitas de outro fator de FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 30 ! infertilidade masculina, o membro masculino do casal deverá ser encaminhado para uma consulta de andrologia. Chegados a este ponto do processo, o casal pode ser encaminhado para os cuidados de saúde terciários que englobam os Centros de Procriação Medicamente Assistida (PMA). 2.5. Infertilidade e as suas causas Existem muitos fatores conhecidos, e ainda muitos mais desconhecidos, que afetam o sistema reprodutor humano. Alguns destes fatores conhecidos podem ser contornados de forma a melhorar a possibilidade de gravidez, enquanto que outros não são ultrapassáveis (Bayer, 2007a). A infertilidade pode ser devida a fatores patológicos masculinos ou femininos, não patológicos e relacionados com o estilo de vida. As principais causas de infertilidade serão descritas nas próximas secções. 2.5.1. Fatores não patológicos Os fatores não patológicos incluem a frequência das relações sexuais e a idade materna e paterna. 2.5.1.1. Frequência das relações sexuais O timing das relações sexuais tem de ser adequado para que a fertilização ocorra. Sabe-se que o ovócito permanece viável cerca de 24h após ovulação (Tate, 2012b; Widmaier et al., 2006) e que os espermatozoides preservam a sua capacidade fertilizante até 6 dias após serem depositados no trato reprodutor feminino, no entanto, a maioria degenera 24h depois (Tate, 2012b). Posto isto, há uma maior probabilidade de ocorrer fecundação se o ato sexual ocorrer 5 dias antes e até 1 dia depois da ovulação (Tate, 2012b; Widmaier et al., 2006), sendo que a probabilidade aumenta se ocorrer 1 a 2 dias antes da ovulação (Fox, 2011; Wilcox et al., 1995). Deste modo, é aconselhável que o casal tenha relações sexuais 2 vezes por semana em intervalos regulares ou 2 a 3 vezes por mês, desde que no período fértil (Wilcox et al., 2000). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 31 ! 2.5.1.2. Idade materna e paterna A idade da mulher é um dos fatores limitativos da fertilidade, uma vez que nasce com todos os ovócitos que terá (Sharma et al., 2013). O pico de fertilidade nas mulheres é atingido aos 24/25 anos, a partir desta idade verifica-se um declínio da fertilidade. A partir dos 35 anos este declínio torna-se cada vez mais nítido e acelerado (figura 11) (Bayer, 2007a; Homan et al., 2007). O processo de atresia dos folículos é acelerado a partir dessa idade e, para além do número, também a qualidade dos folículos é afetada (Bayer, 2007a). Com o avançar da idade da mulher, aumenta a probabilidade de anomalias cromossómicas e aneuploidia, o que pode aumentar o risco de aborto (Bayer, 2007a; Garrisi et al., 2009; Sharma et al., 2013). A idade do homem tem vindo a ser negligenciada quando se fala em infertilidade, uma vez que a idade da mulher tem provado ser mais importante e limitativa da fertilidade. Nos homens não existe um limite a partir do qual a fertilidade seja visivelmente afetada, pelo contrário, a redução da fertilidade com a idade é muito subtil na maioria dos homens. No entanto, é cada vez mais claro que o relógio biológico avança também para os homens (Thacker, 2004). É preciso, por isso, ter em conta que a partir dos 40 anos a produção de testosterona vai diminuindo (Bayer, 2007a; Sharma et al., 2013), diminuem também o volume, motilidade e a percentagem de espermatozoides com morfologia normal (Bayer, 2007a; Belloc et al., 2014; Esteves et al., 2012; Kidd et al., 2001; Sharma et al., 2013), enquanto que o Idade materna (anos) Fertilidade relativa Fig. 11 - Gráfico representativo do trajeto da fertilidade feminina ao longo dos anos. Adaptado de Bayer (2007). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 32 ! risco de defeitos genéticos na descendência aumenta (Esteves et al., 2012). Com o avanço da idade, também os danos no DNA dos espermatozoides aumentam (Belloc et al., 2014; Thacker, 2004). As células germinativas sofrem vários ciclos de replicação, o que aumenta a probabilidade de novos erros entrarem na linha germinativa (Kidd et al., 2001; Thacker, 2004). Para além disso, a taxa de apoptose das células germinativas diminui com a idade, o que implica que os espermatozoides com danos no DNA não sejam eliminados (Thacker, 2004). 2.5.2. Infertilidade masculina Qualquer processo que afete a produção de espermatozoides e a sua qualidade, será potencialmente perigoso para a fertilidade masculina (Esteves et al., 2011b). Dos homens em idade reprodutiva, 8% procuram cuidados médicos devido a problemas de infertilidade e desses, 10% apresentam causas reversíveis (Esteves et al., 2011b). A infertilidade masculina de longa duração encontra-se muitas vezes associada a outros problemas, como depressão, disfunção erétil e baixa auto-estima (Kamel, 2010). Existem vários fatores que devem ser tidos em conta aquando da avaliação inicial do membro masculino do casal. Entre eles está a história reprodutiva do paciente, que inclui a frequência e o momento das relações sexuais, a duração da infertilidade e fertilidade anterior, doenças na infância e desenvolvimento, como antecedentes de criptorquidismo, doenças e cirurgias prévias, história sexual e de doenças sexualmente transmissíveis (DST) e ainda exposição a gonadotoxinas e calor (Esteves et al., 2012; Sharlip et al., 2002). A infertilidade masculina pode resultar de inúmeros problemas como a idade, maus hábitos de vida, problemas genéticos, fragmentação do DNA dos espermatozoides e varicocelo (Esteves et al., 2012). Uma das principais causas de infertilidade masculina é o varicocelo. Este está presente em 15% dos homens da população geral e em 40% dos homens com problemas de fertilidade (Bayer, 2007a; Esteves et al., 2012; Jarow, 2001; Sharlip et al., 2002). O varicocelo é uma anomalia vascular no escroto, definido pela dilatação anormal das veias testiculares (Benoff e Gilbert, 2001; Jarow, 2001). A forma como a fertilidade é afetada por esta patologia não é ainda bem conhecida. No entanto, pensa-se que a função testicular é afetada pelo aumento da temperatura testicular (Benoff e Gilbert, 2001; Jarow, 2001; Sharlip et al., 2002), que resulta do refluxo de sangue abdominal através das veias espermáticas (Jarow, 2001). Os testículos que apresentam varicocelos de grande tamanho estão associados a volume testicular reduzido, o que resulta na redução da espermatogénese (Jarow, 2001). A função das FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 33 ! células de Leydig é também reduzida em casos de varicocelo (Smit et al., 2013). O diagnóstico é feito por exame físico, através de palpação, e por ecografia em alguns casos (Esteves et al., 2012). O varicocelo pode ser tratado recorrendo, por exemplo, a cirurgia (Sharlip et al., 2002). No entanto, permanece a dúvida sobre o beneficio clínico que terá o tratamento do varicocelo, apesar de se detetarem melhorias nos parâmetros seminais (Jarow, 2001). A infertilidade masculina pode também ter origem genética, em anomalias cromossómicas, alterações genéticas ou microdeleções no cromossoma Y (Sharlip et al., 2002). A anomalia genética mais comum é a Fibrose Cística (Esteves et al., 2012). A Fibrose Cística é causada por uma mutação no gene que codifica a proteína reguladora do transporte transmembranar da fibrose cística (CFTR – Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator), localizado no braço longo do cromossoma 7 (Esteves et al., 2012). Foi demonstrada uma forte correlação entre mutações CFTR e agenesia bilateral congénita dos ductos deferentes (ABCDD) (Elia et al., 2014; Esteves et al., 2012), o que provoca azoospermia obstrutiva (Elia et al., 2014), ou seja, ausência de espermatozoides no ejaculado devido a um bloqueio dos ductos. Quanto às anomalias cromossómicas, a mais comum é a Síndrome de Klinefelter (Esteves et al., 2012), presente em 1 em cada 500 nados-vivos fenotipicamente masculinos (Fraietta et al., 2013; Levron et al., 2000; Ramakrishnan et al., 2014; Schiff et al., 2005; Widmaier et al., 2006). Esta anomalia resulta num genótipo 47, XXY e alguns indivíduos podem apresentar mosaicismo (46, XY/47, XXY) (Schiff et al., 2005). A Síndrome de Klinefelter caracteriza-se pela presença de testículos hipotróficos, níveis de FSH elevados e azoospermia (Esteves et al., 2012). O cromossoma Y contém genes necessários para o desenvolvimento sexual masculino e para a espermatogénese (Ma et al., 2000). No braço longo do cromossoma Y localizam-se fatores essenciais para a espermatogénese (Hopps et al., 2003; Quilter et al., 2003) designados por “fator de azoospermia” ou AZF (Esteves et al., 2012; Ma et al., 2000). A região AZF encontra-se dividida em 4 subregiões, designadas por AZFa, AZFb, AZFc e AZFd (Ma et al., 2000; Quilter et al., 2003). As microdeleções nestas subregiões afetam a fertilidade masculina. Microdeleções na zona AZFa, são as mais raras (Hopps et al., 2003) e encontram-se associadas ao Síndrome de Só Células de Sertoli (SCO) (Esteves et al., 2012; Ma et al., 2000; Quilter et al., 2003), que se caracteriza pela ausência total de células germinativas (Esteves et al., 2012; Ma et al., 2000). As microdeleções na região AZFb provocam o bloqueio da espermatogénese e paragem de maturação (Esteves et al., 2012; Ma et al., 2000) e encontram-se por vezes associadas a microdeleções na região AZFc (Hopps et al., 2003). Esta última encontra-se associada ao processo de maturação FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 34 ! dos espermatozoides (Ma et al., 2000). A procura de espermatozoides por biópsia testicular em casos de deleções nas regiões AZFa e b não é recomendada. No entanto, em 71% dos casos de microdeleções na região AZFc são recuperados espermatozoides (Esteves et al., 2012; Hopps et al., 2003). A fragmentação do DNA dos espermatozoides encontra-se associada a infertilidade masculina. A fragmentação pode surgir devido a defeitos na compactação do DNA, falha na apoptose de espermatozoides danificados e, principalmente, por stress oxidativo (Tremellen, 2008). Este último é provocado pelo excesso de produção de Espécies Reativas de Oxigénio (EROs), que se deve à excessiva retenção de citoplasma aquando da espermiogénese, à presença de leucócitos ou varicocelo (Wright et al., 2014). 2.5.3. Infertilidade Feminina A infertilidade feminina pode ter origem em fatores tubo-peritoneal, cervical, uterino, disfunções ovulatórias, causas genéticas ou ainda maus hábitos de vida. 2.5.3.1. Disfunções ovulatórias As disfunções ovulatórias como causa de infertilidade, englobam o Síndrome do Ovário Poliquístico (SOP), a falência ovárica prematura, hiperprolactinemia, amenorreia hipotalâmica, patologias da tiroide e suprarrenal e deficiência da fase lútea (Unuane et al., 2011). No diagnóstico de casos de disfunção ovulatória deve ser feita a medição dos níveis da hormona da tiroide TSH, prolactina, estradiol, LH e FSH ao 3º dia do ciclo (Bayer e Alper, 2007). O Síndrome do Ovário Poliquístico é uma desordem comum que afeta 4 a 12% das mulheres em idade reprodutiva (Sheehan, 2003) e que, a nível hormonal, se caracteriza por concentrações elevadas de LH. O SOP, normalmente, manifesta-se por anovulação, sinais de hiperandrogenismo e ovários poliquísticos, isto é, com 12 ou mais quistos pequenos e volume aumentado, observado por ecografia (Unuane et al., 2011). Este síndrome associa-se a um aumento do risco de parto prematuro, préeclampsia1 e diabetes gestacional (Sheehan, 2003; Unuane et al., 2011). A falência ovárica prematura é definida como a descontinuação da função ovárica normal em mulheres com menos de 40 anos (Unuane et al., 2011). O doseamento da hormona FSH dá uma indicação da reserva ovárica, sendo que níveis elevados desta hormona estão associados a reserva ovárica reduzida (Abdalla e !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1!Pré-eclampsia: caracterizada por hipertensão, juntamente com eliminação de proteínas na urina (proteinúria) e retenção de líquidos (edema). Ocorre entre a 20ª semana de gravidez e a 1ª semana após o parto. Informação retirada do site http://www.manualmerck.net/?id=271&cn=1978, acedido a 21/04/2015. ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 35 ! Thum, 2004). Os sintomas incluem períodos irregulares ou ausentes e diminuição da líbido (Unuane et al., 2011). As causas podem ter origem genética, ambiental, eventos de autoimunidade (Sadeghi, 2013) e tratamentos de quimio e radioterapia que provocam a perda de folículos (Unuane et al., 2011). A hiperprolactinemia caracteriza-se por níveis elevados de prolactina (PRL). As concentrações de PRL aumentam naturalmente durante a gravidez, lactação e situações de stress. No entanto, há situações patológicas que provocam o seu aumento, como tumores da hipófise (prolactinomas), hipotiroidismo e doenças renais. A hiperprolactinemia resulta em anomalias menstruais, galactorreia2, redução da líbido e dispareunia3 (Unuane et al., 2011). As deficiências da fase lútea podem não afetar a ovulação nem a regularidade dos ciclos menstruais mas a preparação do endométrio para a implantação é comprometida devido aos níveis insuficientes de progesterona (Bayer e Alper, 2007) 2.5.3.2. Fator tubo-peritoneal Os fatores tubo-peritoneais englobam as adesões pélvicas, problemas tubares e endometriose. Uma história de gravidezes ectópicas, rutura do apêndice, uso de dispositivos intrauterinos (DIU) ou doença inflamatória pélvica (DIP) anterior são alguns dos fatores de risco que poderão levar a problemas tubares. Normalmente, é realizada uma histerossalpingografia no início da fase folicular, após o final da menstruação. Para além de ser um meio de diagnóstico, este exame tem também benefícios terapêuticos uma vez que a injeção do corante para a realização do exame pode desalojar bloqueios provocados por muco, estimular os cílios e ainda quebrar adesões intratubares (Bayer e Alper, 2007). As adesões tubares podem dificultar a ovulação, inibir a recolha do ovócito ou impedir o seu transporte (Bulletti et al., 2010). A endometriose, um dos fatores tubo-peritoneais mais comuns, é definida pela presença de tecido endometrial fora do útero, o que provoca uma reação inflamatória crónica. Os locais mais afetados são os órgãos pélvicos e o peritoneu, mas outros locais, como os pulmões, também podem ser afetados (Kennedy et al., 2005). É estimado que cerca de 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva sofram de endometriose (Stephansson et al., 2009) e, dentro das mulheres que sofrem de infertilidade, cerca de 30% é devido a endometriose (Meuleman et al., 2009). A !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 2 Galactorreia: produção de leite fora do período de lactação. Informação retirada do site http://www.manualmerck.net/?id=170&cn=558, acedido a 21/04/2015. 3!Dispareunia: dor genital ou pélvica profunda, sentida durante o ato sexual. Informação retirada do site http://www.manualmerck.net/?id=114&cn=986, acedido a 21/04/2015. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 36 ! endometriose está normalmente associada a dor pélvica crónica, dismenorreia4, dispareunia e infertilidade (Dunselman et al., 2014; Kennedy et al., 2005) podendo, no entanto, ser assintomática (Meuleman et al., 2009). Os mecanismos através dos quais afeta a fertilidade, apesar de não serem ainda bem claros, podem ser variados desde a distorção da anatomia pélvica através de adesões, obstrução das trompas e anomalias endócrinas e ovulatórias (Bulletti et al., 2010). O diagnóstico pode ser feito por laparoscopia com recolha de amostras para análise histológica. Como tratamento dos sintomas associados à dor, está indicada a prescrição de contracetivos hormonais e verifica-se que a excisão de lesões durante a laparoscopia aumenta o sucesso do tratamento de reprodução humana assistida (RHA) (Dunselman et al., 2014). Mulheres com endometriose têm maior risco de partos prematuros, préeclampsia, hemorragia durante o parto e recorrem mais vezes a cesarianas (Stephansson et al., 2009). 2.5.3.3. Fator uterino Os fatores uterinos incluem alterações na cavidade uterina que podem impedir o estabelecimento de gravidez. A avaliação da cavidade uterina deve ser feita em mulheres com fluxo menstrual anormal, anomalias observadas por histerossalpingografia ou em casos de abortos recorrentes. Nestes casos, é comum observar miomas que dificultam a passagem dos espermatozoides e a implantação (Bayer e Alper, 2007) 2.5.3.4. Fator cervical O cérvix tem um papel bastante importante na reprodução, uma vez que a possibilidade dos espermatozoides atingirem o útero e as trompas depende em grande parte das características do muco cervical. As características do muco dependem de hormonas, sendo que no período pré-ovulatório, com os níveis elevados de estrogénio, haverá produção de muco mais aquoso para permitir a passagem mais facilitada dos espermatozoides. Se os espermatozoides falharem a passagem do muco, irão degenerar em poucas horas e a gravidez não será possível. Esta falha poderá ser devida a falhas durante o coito, a espermatozoides de fraca qualidade ou ainda à produção de muco com características inadequadas. Em termos de terapêutica por técnicas de reprodução assistida, este fator de infertilidade pode ser ultrapassado através de uma inseminação intrauterina. Em relação ao diagnóstico, pode realizar-se um teste pós-coital 1 a 2 dias antes da ovulação e 2 a !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 4!Dismenorreia: é uma dor abdominal provocada pelas contrações uterinas e que surge durante a menstruação. Informação retirada do site http://www.manualmerck.net/?id=260&cn=1646&ss=dismenorreia, acedido a 21/04/2015. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 43 ! 3. Análise da amostra seminal A análise da amostra seminal é o principal método de avaliação diagnóstica do membro masculino do casal (Silverberg e Turner, 2009). No entanto, a qualidade das amostras varia ao longo do tempo, no mesmo indivíduo (Keel, 2006). Para que os resultados sejam o mais corretos possível, a análise seminal ou espermograma deve seguir alguns critérios importantes. Assim, começando pela recolha da amostra, esta deve ser feita com 2 a 5 dias de abstinência sexual (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002; Silverberg e Turner, 2009; WHO, 2010). Um período inferior a 2 dias pode afetar o volume e a concentração, enquanto que um período superior a 7 dias pode ter efeitos na motilidade (Silverberg e Turner, 2009). A colheita deve, preferencialmente, ser feita numa sala própria na clinica onde se realizará o exame e realizada por masturbação, com recolha da amostra para um frasco que deverá ser de plástico e estar identificado (WHO, 2010). Alguns homens têm dificuldade em fazer a recolha na clínica. Nestes casos, a colheita deve ser feita em casa e entregue no laboratório. Existem ainda outros casos em que o paciente tem dificuldade em obter ejaculado por masturbação e, por isso, pode recorrer-se à utilização de um preservativo especial, sem propriedades espermicidas, para recolha da amostra durante o ato sexual (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002). Em qualquer das situações em que a colheita é feita fora das instalações da clinica, a amostra deve ser entregue no laboratório na 1ª hora após ejaculada e, durante o transporte, deve ser mantida entre os 20 e os 37ºC (WHO, 2010), para tal deve ser transportada junto ao corpo. Outro requisito importante quanto à colheita da amostra é o facto de ser essencial recolher todo o ejaculado, sem perda de nenhuma fração, principalmente a primeira por ser mais rica em espermatozoides (Bjorndahl e Kvist, 2003). O coitus interruptus não é um método fiável de recolha pois, para além da probabilidade de perder a primeira fração ser maior, pode também haver contaminação celular ou bacteriológica e o pH baixo da vagina pode afetar a motilidade (Silverberg e Turner, 2009; WHO, 2010). A análise da amostra seminal inclui a observação da aparência, o cheiro, a liquefação, a viscosidade, o volume, a concentração e o número total de espermatozoides no ejaculado, a motilidade, a vitalidade, a morfologia, a aglutinação e ainda a presença de outras células que não espermatozoides (NAFA e ESHRESIGA, 2002). Estas características devem ser avaliadas no momento certo para evitar conclusões erradas. Assim, a liquefação, aparência e cheiro devem ser avaliadas entre os 20 e 25 minutos após a colheita. Quando a amostra se apresentar liquefeita, FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 44 ! devem ser avaliadas características como a viscosidade, motilidade, vitalidade, concentração e morfologia. 3.1. Parâmetros macroscópicos Quanto às características macroscópicas são avaliados o pH, o volume, o cheiro, a cor, a viscosidade e a liquefação. 3.1.1. Aparência visual Uma amostra normal e liquefeita deve apresentar uma aparência homogénea e opaca, sendo que a opacidade da amostra está relacionada com a concentração de espermatozoides. A cor deverá ser amarelo/branco grisalho mas pode ser afetada pela presença de glóbulos vermelhos (hemospermia), ficando vermelho-acastanhada, ou poderá ser amarela por influência de vitaminas, medicação ou se o paciente sofrer de icterícia (WHO, 2010). 3.1.2. pH O pH é medido com uma fita indicadora e reflete o equilíbrio entre as secreções das glândulas. Deve ser medido após liquefação, de preferência após 30 minutos pois é afetado pela perda de CO2. O valor mínimo de referencia para o pH é de 7,2 (WHO, 2010). 3.1.3. Volume A medição do volume da amostra de sémen permite calcular o número total de espermatozoides no ejaculado, depois de se obter o valor da concentração. A referência mínima estimada para o volume é de 1,5 ml. Valores abaixo deste podem indicar obstrução do ducto ejaculatório, ausência bilateral congénita dos ductos deferentes, falha na colheita, ejaculação retrógrada ou deficiência em androgénios (WHO, 2010). O volume deve ser medido com uma pipeta serológica e pode depois avaliar-se a viscosidade, recorrendo à mesma pipeta (Silverberg e Turner, 2009). 3.1.4. Viscosidade A viscosidade corresponde à tendência que a amostra liquefeita tem para formar gotas na ponta de uma pipeta. Assim, se ao expelir a amostra da pipeta, se formarem gotas que caem livremente, a amostra tem uma viscosidade normal (Silverberg e Turner, 2009), se, pelo contrário, se formarem filamentos com 2 cm, a FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 45 ! viscosidade é aumentada (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002; WHO, 2010). Amostras com viscosidade aumentada podem ser afetadas quanto à motilidade e concentração. Em amostras muito viscosas pode adicionar-se meio de cultura para facilitar a análise mas o volume deverá ser medido antes e a motilidade poderá também ser afetada (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002). 3.1.5. Liquefação A liquefação é uma alteração natural da amostra que, após ejaculação, se apresenta como um coágulo. Ao fim de alguns minutos, a amostra começa a liquefazer, ou seja, a tornar-se mais líquida e homogénea. Normalmente, a liquefação fica completa em 15-30 minutos mas pode demorar até 60 minutos (WHO, 2010). Com o decorrer deste processo, os espermatozoides são libertados e distribuídos no sémen (Silverberg e Turner, 2009), o que é possível verificar microscopicamente (WHO, 2010). A inexistência de coágulo pode indicar ausência de secreções das vesículas seminais e a liquefação inadequada pode significar deficiência nas enzimas prostáticas (Jeyendran, 2003; Silverberg e Turner, 2009). 3.2. Parâmetros microscópicos 3.2.1. Motilidade A motilidade é um dos pré-requisitos mais importantes para atingir a fertilização e gravidez, uma vez que os espermatozoides têm de percorrer uma grande distância in vivo até atingirem o ovócito e têm ainda de penetrar as barreiras da coroa radiata e zona pelúcida (Silverberg e Turner, 2009). A avaliação da motilidade deve ser feita logo após liquefação da amostra para evitar os efeitos da desidratação, alterações de temperatura ou pH (WHO, 2010). A motilidade pode ainda ser afetada pela idade, saúde, tempo de abstinência sexual, exposição ao calor e toxinas e pelo método de colheita (Silverberg e Turner, 2009). Para avaliar a motilidade deve ser preparada uma lâmina com 10!µl da amostra a fresco e bem misturada, coberta com uma lamela de 22 x 22 mm (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002). A lâmina deve ser observada ao microscópio ótico de contraste de fase com ampliação x200. A contagem deve incluir 200 espermatozoides distinguindo progressivos rápidos, progressivos lentos, móveis in situ e imóveis (tabela 1). Devem ser feitos duplicados das contagens até que a diferença ente duas não seja significativa. Os resultados são apresentados em percentagem (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002; WHO, 2010). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 46 ! Categoria Código Velocidade Progressivo rápido a ≥ 25 µm/s (ou 5x o comprimento da cabeça) Progressivo lento b 5 – 4 µm/s Móveis in situ c < 5 µm/s (ou < 1x o comprimento da cabeça) Imóveis d - 3.2.2. Vitalidade A avaliação da vitalidade pode resultar numa verificação da motilidade uma vez que a percentagem de espermatozoides mortos não deve exceder a percentagem de imóveis. No entanto, a percentagem de espermatozoides viáveis normalmente excede a de móveis. A vitalidade pode ser analisada através de corantes ou soluções hipoosmóticas. Os métodos de coloração, que incluem o teste da eosina Y, baseiam-se no princípio de que os espermatozoides com membrana plasmática danificada permitem a entrada de corantes impermeáveis. No teste da eosina Y adicionam-se 10µl do corante a 10µl da amostra, numa diluição de 1:2, e deixa-se atuar por 5 minutos. Depois é feito um esfregaço numa lâmina (figura 12) e contam-se 200 espermatozoides, distinguindo vivos e mortos ou não corados e corados, respetivamente. O teste da hipoosmolaridade presume que as membranas intactas reagem à solução hipoosmótica, após 30 minutos as formas flagelares estabilizam e pode proceder-se à contagem. Neste teste adicionam-se 10µl de amostra a 90µl de solução hipoosmótica e incuba-se a 37ºC, durante 30 minutos. Após este tempo, analisa-se uma alíquota de 10µl, contando-se 200 espermatozoides e distinguindo vivos e mortos ou reativos e não reativos, respetivamente (WHO, 2010). Os Tabela 1 – Diferentes classes distinguidas aquando da avaliação da motilidade. Adaptado de WHO (2010) ! Fig. 12 - Obtenção de um esfregaço para avaliação da vitalidade com o teste da eosina Y. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 47 ! espermatozoides viáveis podem apresentar diferentes formas flagelares como as apresentadas na figura 13. O teste da vitalidade pode ser uma forma de seleção dos espermatozoides para microinjeção por ICSI. No entanto, corantes como a eosina apresentam propriedades tóxicas se entrarem em espermatozoides ou ovócitos viáveis. O teste hipoosmótico já permite a seleção dos espermatozoides em casos de ICSI em que todos são imóveis. Outra forma de análise da vitalidade é a citometria de fluxo que se baseia no impedimento da entrada de corantes de ácidos nucleicos em células com membrana intacta (Silverberg e Turner, 2009). O limite inferior para valores de vitalidade é de 58% de espermatozoides viáveis. O teste da eosina e hipoosmótico apresentam valores semelhantes (WHO, 2010). 3.2.3. Concentração A concentração pode ser avaliada em diferentes tipos de câmaras de contagem, sendo a mais utilizada a câmara de Neubauer Improved (figura 14). Esta possui duas câmaras de contagem separadas, cada uma com uma grelha de 3x3 mm. As câmaras são cobertas por uma lamela que é suportada 0,1mm acima da superfície. Cada grelha contém 9 quadrados de 1x1 mm, cada um com 25 quadrados rodeados por linhas triplas (WHO, 2010). Fig. 13 - Representação das diferentes formas flagelares encontradas no teste hipoosmótico. a) sem alteração, espermatozoide não viável. b), c), d), e), f) e g) diferentes formas adquiridas pela cauda de espermatozoides viáveis. Adaptado de WHO (2010). Fig. 14 - Câmara de Neubauer Improved. (Marienfeld®, Alemanha) FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 48 ! A observação da amostra a fresco permite escolher a diluição mais adequada para avaliação da concentração. A diluição é feita adicionando um fixador (solução de NaHCO3 e formaldeído) à amostra, na proporção adequada (tabela 2). A diluição é importante para evitar sobreposição de espermatozoides e permitir uma contagem correta (WHO, 2010). Para minimizar ainda mais os erros, a adição da amostra ao fixador deve ser feita com uma pipeta de deslocamento positivo, que pipeta o volume exato (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002). Nº espermatozoides no campo de visão x400 Diluição Sémen (µl) Fixador (µl) < 15 1:2 (1+1) 50 50 16-100 1:5 (1+4) 50 200 > 101 1:20 (1+19) 50 950 A contagem da concentração é feita em microscópio ótico de contraste de fase, na ampliação x400 e contam-se, normalmente, 5 quadrados em cada uma das câmaras de contagem. No entanto, se forem observados 10 a 40 espermatozoides no primeiro quadrado, devem contar-se 10 quadrados, se se observarem menos de 10 espermatozoides devem ser contados os 25 quadrados, para que no final se contem, pelo menos, 200 espermatozoides. O cálculo da concentração (106/ml) tem em conta o número de espermatozoides e de quadrados contados, o fator de diluição, a profundidade e o volume da câmara. Este cálculo é traduzido pela seguinte fórmula: C=!!! 25!quadrados nº!quadrados!contados x!fator!de!diluição!x!profundidade!x!volume!x!nº!espermatozoides!contados! Uma vez que a área e a profundidade da câmara são constantes, estão tabelados fatores de conversão que levam em conta o número de quadrados contados e a diluição (tabela 3). Assim, o cálculo da concentração é feito dividindo a soma das contagens das duas câmaras pelo fator adequado. Tabela 2 – Fatores de diluição para avaliação da concentração, tendo em conta o número de espermatozoides observados na amostra a fresco, na ampliação x400. Adaptado de WHO (2010). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 49 ! Os valores mínimos de referência para a concentração é de 15 x 106 espermatozoides/ml. O número total de espermatozoides (106/ejaculado) é calculado multiplicando o volume de ejaculado pela concentração e tem um valor mínimo de 39 x 106 espermatozoides/ejaculado (NAFA e ESHRE-SIGA, 2002; WHO, 2010). Valores mais baixos podem indicar criptozoospermia e azoospermia. O termo azoospermia só deve ser utilizado se não se encontrarem espermatozoides no sedimento após a amostra ser centrifugada (WHO, 2010). Nestes casos, os parâmetros macroscópicos são na mesma avaliados, a amostra é centrifugada e faz-se o esfregaço para a morfologia. 3.2.4. Morfologia A análise da morfologia é dificultada pela grande variabilidade morfológica dos espermatozoides humanos e está relacionada com o potencial de fertilização e taxa de gravidez. Estas evidências advêm da observação dos espermatozoides presentes no muco cervical (após o coito) e na superfície da zona pelúcida (Silverberg e Turner, 2009; WHO, 2010). O teste da morfologia pode ser feito de várias maneiras mas a mais utilizada baseia-se no critério de Kruger (Silverberg e Turner, 2009). Segundo este método, é feito um esfregaço numa lâmina que seca à temperatura ambiente. Depois de seco, o esfregaço é fixado com metanol e corado com corante Papanicolau e Shorr. As lâminas são depois observadas a ampliação x1000 com óleo de imersão. O método recomendado implica a distinção entre espermatozoides normais e anormais, com indicação da localização do defeito, assim como a indicação da presença de leucócitos e células espermáticas imaturas (WHO, 2010). Para uma correta avaliação da morfologia, deve ter-se presente as características de um espermatozoide considerado normal. Assim, um espermatozoide típico deve apresentar: Nº quadrados contados Diluição 25 10 5 1:2 100 40 20 1:5 40 16 8 1:10 20 8 4 1:20 10 4 2 Tabela 3 – Fatores de divisão para calculo da concentração, tendo em conta as diluições efetuadas e o número de quadrados contados. Adaptado de NAFA e ESHRE-SIGA (2002). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 50 ! Cabeça – oval, com contorno regular e distinção de zona pós-acrossómica e acrossómica, na qual o acrossoma deverá corresponder de 40 a 70% da área da cabeça sem apresentar nenhum vacúolo grande e até dois vacúolos pequenos. Peça intermédia – regular, inserida axialmente na cabeça e deve ser mais espessa que a cauda. Não deve conter restos citoplasmáticos que excedam 1/3 do tamanho da cabeça. Cauda – deve ser única, sem enrolamentos nem dobras, mais fina que a peça intermédia e com cerca de 45 µm de comprimento (Mortimer e Menkveld, 2001; WHO, 2010). Os espermatozoides que não apresentem estas características devem ser analisados como anormais (tabela 4) Localização Anomalia Cabeça Redonda Afunilada Piriforme Amorfa Tabela 4 – Imagens das diferentes anomalias que devem ser contabilizadas aquando da avaliação morfológica dos espermatozoides. Imagens obtidas de WHO (2010). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 51 ! Vacuolizada Acrossoma pequeno Acrossoma grande Peça Intermédia Espessa Irregular Dobrada Assimétrica FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 52 ! Cauda Dupla Dobrada Enrolada Restos citoplasmáticos 3.2.5. Outros tipos celulares Na observação de uma lâmina com a amostra seminal a fresco, podem encontrar-se outras células que não espermatozoides, como células endoteliais, epiteliais, células espermáticas imaturas e leucócitos (Silverberg e Turner, 2009). A presença de mais de 1 milhão de leucócitos/ml pode ser indicador de uma infeção na uretra ou glândulas acessórias (Silverberg e Turner, 2009) e afeta a motilidade, assim como pode afetar a interação espermatozoide-ovócito (Domes et al., 2012) devido à produção de espécies reativas de oxigénio (Jeyendran, 2003). A presença de células imaturas da linha espermática (espermátides e espermatócitos) deve apresentar-se em valores inferiores a 3 por cada 100 espermatozoides. Se os valores forem superiores indicam má função testicular. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 59 ! amostra ou em amostras de boa qualidade utilizadas para inseminação intrauterina, justifica-se a preparação de dois tubos de gradientes. Nesses casos, o pellet é transferido para um terceiro tubo, ao qual se adicionam os 2ml de meio de incubação. O novo tubo é centrifugado novamente durante 10 minutos (figura 15c). O sobrenadante é, mais uma vez, descartado e adiciona-se até 0,5ml de meio de cultura, sem perturbar o pellet. O volume de meio adicionado nesta fase depende do tamanho do pellet e da técnica para o qual está a ser preparado. A próxima fase designa-se por swim up e deve decorrer numa estufa a 37ºC e 6% de CO2 e colocada numa ângulo de 45º com a tampa aberta para permitir as trocas gasosas (figura 15d). A amostra fica em incubação durante pelo menos 30 minutos, dando tempo para que os espermatozoides se desloquem para o topo do meio (WHO, 2010) que é depois aspirado e utilizado nas técnicas de RHA. A incubação não deve exceder as 2 horas pois com o tempo aumenta a percentagem de espermatozoides anormais no meio (Elder e Dale, 2003). (a) (b) (c) (d) Fig. 15 – Vários passos do processamento da amostra seminal. (a) Tubo com os gradientes de concentração e a amostra seminal no topo. (b) Tubo após centrifugação durante 25 minutos a 1200 rpm. (c) Tubo após segunda centrifugação durante 10 minutos a 1200 rpm, 1 – plasma seminal, 2 – espermatozoides imóveis e restos celulares, 3 – pellet com espermatozoides móveis. (d) Tubo na estufa a 37ºC, 5% de O2 e 6% de CO2, durante o swim-up. 1 2 3 FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 60 ! 4.3. Recolha de gâmetas femininos 4.3.1. Estimulação ovárica A indução da ovulação é um passo importante uma vez que a taxa de sucesso de um ciclo está relacionada com o número de ovócitos recolhidos que, por sua vez, está relacionado com o número de embriões disponíveis para transferência (Alper, 2007). Inicialmente, a ovulação era induzida recorrendo ao citrato de clomifeno (CC). O CC é um análogo do estradiol que se liga aos seus recetores no hipotálamo (Oskowitz, 2007). A administração de CC é seguida pela libertação de gonadotrofinas pela hipófise, o que resulta no recrutamento e desenvolvimento folicular. Tal acontece pois o CC reduz o feedback negativo dos estrogénios endógenos ao impedir a sua ligação aos recetores. Este tratamento é indicado em casos de anovulação e também para pacientes com oligomenorreia5 ou amenorreia6 (Shoham e Howles, 2009). A administraçãoo de CC deve ser diária durante 5 dias, começando no quinto dia após o início da menstruação espontânea ou induzida por progesterona (Oskowitz, 2007). No caso do tratamento com CC falhar, pode recorrer-se à própria FSH. No início da sua utilização, a FSH era retirada da urina e purificada, mais recentemente passou a ser utilizada FSH recombinante que evita contaminações víricas, é ilimitada e apresenta elevada pureza e especificidade (Hugues e Cédrin-Durnerin, 2009). A estimulação ovárica recorrendo à FSH implica a superovulação. Este termo é utilizado quando o objetivo é a estimulação do crescimento de múltiplos folículos (Oskowitz, 2007). Um dos problemas da estimulação ovárica era que a ovulação ocorresse antes da realização da punção folicular, o que impediria a recolha dos ovócitos. Este problema é ultrapassado com a administração de agonistas ou antagonistas da GnRH que inibem o pico de LH, inibindo também assim a ovulação prematura e diminuindo o número de ciclos cancelados (Schoemaker et al., 1999). Os agonistas de GnRH são análogos dessa hormona que se ligam aos seus recetores na hipófise. Inicialmente, os agonistas de GnRH tinham o objetivo de tratar casos de anovulação até ser descoberta a sua capacidade de inibir a função reprodutiva. A partir deste momento, a sua principal aplicação clínica passou a ser a inibição do pico de LH. A administração de agonistas induz uma grande libertação de !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 5 Oligomenorreia: Menstruação anormalmente pouco abundante ou que se produz com intervalos anormalmente longos. Informação retirada do site http://medicosdeportugal.sapo.pt/glossario/oligomenorreia, acedido a 02/06/2015. 6!Amenorreia: ausência de menstruação, numa mulher não grávida e em idade reprodutiva. Informação retirada do site http://medicosdeportugal.sapo.pt/glossario/amenorreia, acedido a 02/06/2015. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 61 ! FSH e LH até ocorrer dessensibilização da hipófise. Atingido este ponto, a secreção de FSH e LH é inibida (Weissman e Shoham, 1999). Os antagonistas de GnRH são também análogos desta hormona que provocam um efeito inibitório direto na secreção de gonadotrofinas por competirem pela ligação aos recetores da GnRH na hipófise e bloqueando assim o acesso da GnRH endógena (Huirne e Schats, 2009; Ludwig, 2009; Weissman e Shoham, 1999). Desta forma, a secreção de FSH e LH sofrem inibição imediata. Em relação aos agonistas, os antagonistas de GnRH apresentam algumas vantagens, incluindo o tempo de administração mais curto e o menor risco de ocorrência do Síndrome de Hiperestimulação Ovárica7 (SHO) (Ludwig, 2009). A estimulação ovárica deve ser monitorizada por ultrassonografia vaginal e assim que pelo menos 1 folículo apresente 17mm de diâmetro ou mais, é dada uma injeção de hCG (Alper, 2007). A hCG reconhece e ativa os mesmo recetores que a LH e irá induzir a ovulação (Loumaye et al., 1999). 4.3.2. Punção Folicular A ovulação ocorre 36 a 40h após administração de hCG, sendo que a punção folicular deve ocorrer 36h depois permitindo a recolha do maior número de folículos e dando também tempo para que a maturação ovocitária se conclua. A injeção de hCG provoca o recomeço da meiose, parada em Profase I, fazendo com que a vesícula germinal desapareça e se forme o 1º glóbulo polar. A meiose volta a ser interrompida em Metafase II (Shoham e Howles, 2009). O processo de punção folicular é guiado por ecografia vaginal e sob anestesia geral (Alper, 2007). Depois de localizados os folículos, uma agulha, que se encontra ligada ao aspirador folicular, é acoplada ao espéculo usado na ecografia e direcionada para os folículos através da parede da vagina. O fluido folicular é aspirado para tubos de poliestireno pré-aquecidos num bloco metálico de suporte de tubos. Todos os folículos dos dois ovários são aspirados (Alper, 2007) e os tubos são levados para o laboratório para pesquisa dos ovócitos puncionados. Esta pesquisa é feita numa placa de Petri, para a qual foi transferido o fluido aspirado, que é observada ao estereomicroscópio e mantida em superfície aquecida. Os ovócitos encontrados são lavados para remoção de vestígios de sangue e fragmentos e transferidos para meio de incubação de ovócitos, pré-aquecido a 37ºC. Os ovócitos são depois incubados em estufa a 37ºC, 5% de O2 e 6% de CO2. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 7!Síndrome da Hiperestimulação Ovárica: é uma situação clínica provocada pelo desenvolvimento de quistos nos ovários após administraçãoo de hCG. Pode provocar sintomas como distensão abdominal, complicações respiratórias, entre outros sintomas que podem inclusive levar à morte (Alper, 2007). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 62 ! 4.3.3. Maturidade ovocitária Quando um complexo cumulus-ovócito (CCO) é encontrado, deve ser avaliado o seu estado de maturidade (Elder e Dale, 2003). A avaliação do CCO é inicialmente feita tendo em conta a apresentação das células do cumulus e da coroa radiata (Rienzi et al., 2012). É também feita uma avaliação da maturidade nuclear, se possível. Assim, podem ser encontrados CCO em diferentes estados de maturação (figura 16): • CCO imaturo – células do cúmulos não expandidas e compactadas em volta do ovócito. O ovócito pode estar ainda bastante imaturo, em fase de vesícula germinal (VG) (núcleo de grandes dimensões), parado em Profase I (Rienzi et al., 2012). Os ovócitos nos quais não se verifique a presença de vesícula germinal mas também não esteja presente o 1º glóbulo polar, encontram-se em Metafase I e são considerados imaturos. Os CCO imaturos podem ser mantidos em cultura para que a maturação ocorra in vitro (Elder e Dale, 2003). • CCO maduro – 34 a 38h após desencadeada a ovulação, os CCO deverão estar num estado maduro pré-ovulatório, o qual é ideal para o sucesso da fertilização. Estes CCO apresentam células da coroa radiata expandida rodeada por uma massa solta com aspeto de “nuvem” de células do cumulus. O ovócito maduro deverá ter o 1º glóbulo polar no espaço perivitelino, indicando que se encontra em Metafase II (MII) (Elder e Dale, 2003; Rienzi et al., 2012).! (c) (a) (b) Fig. 16 - (a) CCO em fase de vesícula germinal. Adaptado de Rienzi et al. (2012). (b) CCO imaturo em Metafase I; (c) CCO maduro em Metafase II. Adaptado de Veeck (1999). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 63 ! 4.4. Desnudação de ovócitos Após punção folicular, todos os ovócitos são avaliados quanto à sua qualidade baseando-se no aspeto das células do cumulus e coroa radiata (Rienzi e Ubaldi, 2009). No entanto, para tratamentos com técnicas como a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI), é necessário remover as células que rodeiam o ovócito, por um processo designado por desnudação. Este processo permite uma melhor visualização do ovócito, assim como permite avaliar a qualidade ovocitária tendo também em conta a morfologia do citoplasma e os aspeto das estruturas extracitoplasmáticas (zona pelúcida, glóbulo polar e espaço perivitelino) (Rienzi e Ubaldi, 2009). Na desnudação são utilizados os métodos enzimático e mecânico. No método enzimático é utilizada a enzima hialuronidase, uma vez que a massa de células do cumulus é maioritariamente composta por ácido hialurónico. Para este procedimento, é preparada uma placa de quatro poços com um poço com uma gota de hialuronidase (concentração de 80 IU/ml) e três poços com meio tamponado, todos cobertos com óleo e colocados na estufa para aquecimento dos meios a 37ºC (Granot e Dekel, 2009). Os CCO são transferidos para a gota de hialuronidase, onde permanecem durante 10 a 15 segundos, sofrendo aspirações sucessivas (Mansour, 1998). Nesta altura, as células do cumulus começam a dissociar-se e os ovócitos são transferidos para um poço com meio tamponado, onde se realiza a desnudação mecânica, recorrendo as aspirações repetidas até não haver células a envolver o ovócito e a enzima ter sido lavada (figura 17). As aspirações devem ser feitas com cuidado para não danificar o ovócito (Granot e Dekel, 2009). Os ovócitos são então avaliados quanto à presença do 1º Glóbulo polar, indicador de que se encontra maduro (em Metafase II). Os ovócitos maduros são incubados em meio de incubação a 37ºC, 5% de O2 e 6% de CO2 até à realização da microinjeção. Os ovócitos não maduros são incubados para induzir a maturação in vitro. Fig. 17 - Processo de desnudação nas diferentes fases. (a) CCO antes da desnudação, rodeado por células do cumulus (x100), (b) Ovócito rodeado pelas células da coroa radiata durante o tratamento enzimático com hialuronidase, com células do cumulus ainda presentes (x200); (c) Ovócito desnudado, após desnudação mecânica, com 1ºGlóbulo polar visível no espaço perivitelino (x200). Adaptado de Rienzi et al. (2012). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 64 ! 4.5. Maturação in vitro Os ovócitos recolhidos após estimulação ovárica controlada não se encontram todos maduros, principalmente os obtidos de folículos entre os 6 e os 14 mm, que não completaram o seu crescimento e maturação final (Nogueira et al., 2009). Estes ovócitos imaturos podem completar a sua maturação in vitro. Os ovócitos em fase de vesícula germinal permanecem em meio de incubação de ovócitos numa estufa de CO2 a 37ºC, durante 24horas. Enquanto que ovócitos em Metafase I são incubados nas mesmas condições durante 12 horas (Elder e Dale, 2003). Depois da incubação, os ovócitos são novamente avaliados e microinjetados, caso já se encontrem maduros. 5. Avaliação da qualidade ovocitária A maturidade nuclear não é suficiente para determinar a qualidade do ovócito. A maturidade nuclear e citoplasmática devem estar completas para assegurar as condições ótimas de fertilização (Rienzi et al., 2012). Em casos de tratamento recorrendo à técnica de ICSI, os ovócitos são desnudados, o que permite a avaliação do citoplasma e das estruturas extracitoplasmáticas (Rienzi e Ubaldi, 2009). Em condições ideais, o ovócito deve encontrar-se em fase MII, com uma estrutura esférica (diâmetro entre 120 e 150µm) rodeada por uma zona pelúcida uniforme (espessura de 15 a 20µm), com um citoplasma translúcido e sem inclusões, enquanto que o 1º glóbulo polar deve ter o tamanho adequado (figura 18) (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). O tamanho do ovócito também é importante uma vez que ovócitos gigantes têm uma grande probabilidade de serem tetraploides (figura 19). Estes ovócitos não devem ser microinjetados (Rienzi et al., 2012). Ovócitos com forma oval também não devem ser utilizados por estarem relacionados com atrasos no desenvolvimento. Fig. 19 - Ovócito gigante (direita) ao lado de um ovócito com tamanho adequado (x200). Adaptado de Rienzi et al. (2012). Fig. 18 - Ovócito desnudado com o 1ºglóbulo polar visível, forma esférica, citoplasma translúcido e rodeado por uma zona pelúcida uniforme (x400). Adaptado de Rienzi et al. (2012). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 65 ! 5.1. Maturidade nuclear A maturidade nuclear é determinada pela presença do 1º glóbulo polar e pela ausência da vesícula germinal, indicando que o ovócito se encontra em metafase II (Rienzi e Ubaldi, 2009). Verifica-se que 85% dos ovócitos recolhidos após estimulação ovárica e após desnudação apresentam o 1º glóbulo polar e são classificados como MII, 10% dos ovócitos encontram-se em fase de vesícula germinal e apenas 5% se encontram metafase I, ou seja, sem VG e sem 1º glóbulo polar (figura 20) (Rienzi et al., 2012; Rienzi e Ubaldi, 2009).!! 5.2. Anomalias intracitoplasmáticas A maioria dos ovócitos recolhidos apresenta algumas alterações às características morfológicas consideradas ideais. Essas alterações podem traduzir-se em anomalias intra ou extracitoplasmáticas. Apesar de ser normal uma ligeira heterogeneidade do citoplasma (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011), os dismorfismos severos na sua textura afetam o potencial de desenvolvimento embrionário e implantação (figura 21a) (Rienzi et al., 2012). As granulosidades do citoplasma devem ser distinguidas dos agregados de organelos (figura 21b). As granulosidades estão associadas a baixa taxa de fecundação e desenvolvimento embrionário, enquanto os agregados de organelos estão relacionados com menor taxa de implantação. Os corpos refrácteis são vesículas de lipofuscina, associados a baixa taxa de fecundação e desenvolvimento embrionário (figura 21c). A presença de vacúolos entre 5 a 10 µm e em pouca quantidade, não apresentam consequências biológicas. No entanto, vacúolos com diâmetro superior a 14 µm estão relacionados com falhas de fertilização uma vez que podem provocar a deslocação do fuso meiótico (figura 21d). No caso destes ovócitos fecundarem, o vacúolo pode interferir com os planos de clivagem, o que resulta numa menor taxa de (a) (b) (c) Fig. 20 - Ovócitos desnudados em diferentes fases de maturação nuclear. (a) ovócito MII, com extrusão do 1º glóbulo polar (x400). (b) ovócito com vesícula germinal visível (x400). (c) ovócito em MI, sem extrusão do 1º glóbulo polar e sem VG visível (x400). Adaptado de Rienzi et al. (2012). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 66 ! embriões que atingem a fase de blastocisto (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011; Rienzi et al., 2012). A viscosidade aumentada do citoplasma pode também ser sinónimo de baixas taxas de fecundação e desenvolvimento embrionário, uma vez que dificulta a movimentação dos organelos e pronúcleos. Uma das anomalias intracitoplasmáticas mais importantes são os agregados de retículo endoplasmático liso tubular (AREL), que são estruturas translúcidas, semelhantes a vacúolos (figura 21e). Os embriões que derivam de ovócitos com AREL apresentam anomalias graves (Rienzi et al., 2012). Estes ovócitos não devem ser microinjetados no caso de apresentarem múltiplos AREL ou um maior que 18 µm (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011).!! Fig. 21 – Ovócitos maduros que apresentam anomalias intracitoplasmáticas. (a) ovócito com citoplasma granuloso (x400), (b) ovócito com agregados de organelos no centro, (c) ovócito com corpo refráctil (x400), (d) ovócito com vacúolo de grandes dimensões (x200), (e) ovócito com AREL no centro do citoplasma (x400). Adaptado de Rienzi et al. (2012). (b) (c) (d) (e) (a) FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 67 ! 5.3. Anomalias extracitoplasmáticas As anomalias extracitoplasmáticas incluem dismorfismos relacionados com a zona pelúcida, espaço perivitelino (EPV) e o 1º glóbulo polar (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). As alterações na aparência da zona pelúcida podem resultar de problemas na secreção e organização da matriz de glicoproteínas (Rienzi et al., 2012). Esta pode apresentar-se mais espessa, deformada e até com ruturas. A completa ausência de zona pelúcida é muito rara. Uma vez que a variabilidade na aparência da zona pelúcida entre pacientes é muito grande, apenas se consideram anómalas zonas pelúcidas com cor ou espessura excecionais (figura 22a)(A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). O espaço perivitelino pode apresentar-se aumentado, o que se relaciona negativamente com a fecundação e qualidade embrionária e pode ser uma consequência da extrusão excessiva de citoplasma aquando da formação do 1º glóbulo polar. O EPV pode também conter granulosidades que se pode dever à fragmentação do glóbulo polar (figura 22b)(Rienzi et al., 2012). A morfologia do 1º glóbulo polar é preditiva da fecundação e da qualidade embrionária (Rienzi e Ubaldi, 2009). Este pode encontrar-se fragmentado (figura 22c), o que é indicador de pósmaturidade, uma vez que o glóbulo polar vai-se fragmentando ao longo do tempo. O tamanho do glóbulo polar é também importante. Assim, glóbulos polares pequenos podem indicar perda de cromossomas e glóbulos polares maiores do que o normal aumentam o risco de aneuploidias (figura 22d) (Rienzi et al., 2012).! (a) (b) (c) (d) Fig. 22 – Ovócitos com anomalias extracitoplasmáticas. (a) ovócito com zona pelúcida mais espessa que o normal (x200). (b) ovócito com EPV aumentado e com granulosidades. (c) Ovócito com 1º glóbulo polar fragmentado. (d) ovócito com 1º glóbulo polar gigante. Adaptado de Rienzi et al (2012). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 68 ! 6. Inseminação Artificial A inseminação artificial é uma técnica que implica a inseminação da amostra de sémen no trato reprodutor feminino, mais frequentemente na cavidade uterina, designando-se por Inseminação Intrauterina (IIU). A IIU foi implementada há mais de 50 anos e é um dos tratamentos de infertilidade mais utilizados (Bayer, 2007b). Ao longo do tempo, a IIU sofreu vários melhoramentos como a preparação de sémen, a monitorização do período pré-ovulatório e a indução da ovulação com hCG (ESHRE, 2009). Embora não seja considerada uma técnica de reprodução assistida8 (ICMART e WHO, 2009), a IIU pode ser utilizada em vários casos, como situações de infertilidade devido ao fator cervical, casos não muito graves de infertilidade masculina, disfunções ejaculatórias e infertilidade idiopática. É ainda indicada para casos de inseminação com recurso a sémen de dador (Bayer, 2007b). Por outro lado, a IIU é contraindicada em casos de mulheres com cervicite (inflamação do cérvix), endometriose ou obstrução tubar bilateral (ESHRE, 2009). O objetivo de IIU é aumentar a taxa de conceção ao potenciar o número de espermatozoides viáveis que atingem o local de fertilização (ESHRE, 2009). Os bons resultados obtidos com a IIU podem dever-se aos seguintes fatores: • a lavagem do sémen durante a preparação da amostra elimina toxinas ou bactérias do plasma seminal e induz a reação acrossómica, ativando os espermatozoides • permite ultrapassar a barreira de muco cervical • aumenta o número de espermatozoides móveis que atingem a cavidade uterina • ultrapassa falhas no coito, por parte do casal (Bayer, 2007b) A IIU pode ser realizada num ciclo natural ou ser combinada com estimulação ovárica (Bayer, 2007b) com CC ou gonadotrofinas (ESHRE, 2009). Nos casos de IIU com recurso a estimulação ovárica, corre-se o risco de se desenvolverem múltiplos folículos, o que aumenta a probabilidade de ocorrerem gravidezes múltiplas e aumenta o risco de Síndrome de Hiperestimulação Ovárica (ESHRE, 2009). Por isso, deve ser feita a monitorização do nível de estradiol e do número e tamanho dos folículos (Bayer, 2007b). Quando os folículos apresentam o tamanho adequado, é administrada hCG para induzir a ovulação. Normalmente, a inseminação é feita 32 a 36h após a administração de hCG (ESHRE, 2009). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 8!Técnicas de reprodução assistida implica a manipulação de ambos os gâmetas humanos (ovócitos e espermatozoides) ou de embriões, de forma a obter gravidez (ICMART and WHO, 2009) FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 75 ! deve estar numa bancada fixa à parede e num suporte que absorva vibrações (Elder e Dale, 2003; Mansour, 1998). No procedimento de ICSI são utilizados dois tipos de micropipetas: a de sustentação ou holding e a de microinjeção ou ICSI. A qualidade e características das pipetas são importantes para evitar danos nos gâmetas. A pipeta holding deve ter um diâmetro interno entre 18 e 25 µm e externo entre 80 a 150 µm, permitindo fixar o ovócito aplicando uma pequena sucção na zona pelúcida. A pipeta ICSI deve ter um diâmetro interno de 4,8 a 5,6 µm e externo de 6,8 a 7,8 µm (Elder e Dale, 2003). A pipeta holding deve ser colocada à esquerda e a pipeta ICSI à direita (figura 26). Os respetivos microinjetores encontram-se no lado oposto. As pipetas fazem um ângulo de 30º na sua extremidade, para que fiquem paralelas ao fundo da placa, permitindo uma melhor focagem (Barnes, 2009). Fig. 24 - Microscópio invertido usado na micromanipulação de gâmetas e embriões. Equipamento propriedade do CEIE e reproduzido com permissão. Fig. 26 - Pormenor do microscópio invertido, com as micropipetas colocadas: holding do lado esquerdo e ICSI do lado direito. Equipamento propriedade do CEIE e reproduzido com permissão. Fig. 25 - Micromanipulador que controla os movimentos da micropipeta e que permite a aspiração ou rejeição de meio e dos gâmetas. Equipamento propriedade do CEIE e reproduzido com permissão. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 76 ! 8.3. Procedimento de microinjeção Um ciclo de ICSI depende da estimulação ovárica, à semelhança da FIV. No caso da ICSI, os ovócitos recolhidos têm de ser desnudados antes da microinjeção. Este passo permite que apenas os ovócitos MII e morfologicamente normais sejam selecionados para microinjeção (Vos, 2000). A desnudação deve ser feita 3h após a punção. Este tempo de incubação permite que os ovócitos completem a maturação citoplasmática (Rienzi e Ubaldi, 2009). A desnudação é feita com a enzima hialuronidase e por processos mecânicos, como descrito na secção 4.4. Enquanto os ovócitos são mantidos em estufa a 37ºC, 5% O2 e 6% CO2, a amostra seminal é recolhida. A amostra é observada ao microscópio para avaliar a concentração, morfologia e motilidade, de modo a confirmar a indicação para tratamento por ICSI. A amostra de sémen deve ser depois processada como descrito na secção 4.2. Apesar da taxa de sucesso não ser afetada pela concentração, morfologia e presença de anticorpos anti-espermatozoides, a injeção de espermatozoides imóveis diminui a taxa de fertilização (Mansour, 1998). Assim, em casos nos quais não são encontrados espermatozoides móveis, o pellet é ressuspendido e se não forem detetados movimentos de cauda em meio sem PVP, essa amostra deve ser submetida a um teste de hipoosmolaridade. Este teste avalia a capacidade de osmoregulação e integridade funcional das membranas (Elder e Dale, 2003). No caso de espermatozoides obtidos dos testículos ou epidídimos, se não se encontrarem espermatozoides móveis, também devem ser sujeitos ao teste de hipoosmolaridade. Cerca de 20 minutos antes da microinjeção, deve preparar-se a placa na qual esta irá ocorrer (figura 27). Numa placa de Petri, são feitas pequenas gotas (5-10 µl) de meio tamponado, pré-equilibrado a 37ºC, do lado direito da placa. Do lado esquerdo deve preparar-se duas gotas de PVP espalhadas. No fim da sua preparação, a placa é coberta com óleo para evitar flutuações de temperatura durante a microinjeção. Fig. 27 - Esquematização das placas de microinjeção. a) Placa com gotas de meio tamponado (laranja) onde são colocados os ovócitos e duas gotas com PVP (verde) onde são colocados os espermatozoides. b) Placa com uma gota com espermatozoides imóveis ou com polpa testicular (roxo), duas gotas de PVP (verde), uma gota com meio hipotónico (vermelho) e gotas com meio tamponado (laranja). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 77 ! Imediatamente antes da microinjeção, coloca-se a amostra seminal na gota de PVP localizada mais à esquerda. O PVP, sendo um meio viscoso, permite que os espermatozoides abrandem o seu movimento para ser mais fácil avalia-los (Palermo et al., 2012) e impede que adiram à pipeta (Mansour, 1998). Adicionam-se também os ovócitos à placa, um em cada microgota. Ao iniciar a microinjeção foca-se a gota de PVP com os espermatozoides e seleciona-se um, de preferência que esteja já na periferia da gota (Palermo et al., 2009a) e morfologicamente normal. O espermatozoide selecionado é aspirado e transferido para a segunda gota de PVP. Nesta gota é feita a imobilização do espermatozoide, colocando-o perpendicularmente à pipeta ICSI que passa por cima da cauda num movimento firme (figura 28a) (Joris et al., 1998) quebrando-a abaixo da peça intermédia (Vos, 2000). A imobilização dos espermatozoides é importante pois liberta fatores citosólicos que atuam na ativação do ovócito (Mansour, 1998; Vos, 2000) e melhora a taxa de fertilização (Palermo et al., 2009a). Após imobilização, o espermatozoide é aspirado pela cauda (figura 28b) e transportado para a gota que contém o ovócito. O ovócito é fixado com recurso a uma ligeira sucção produzida pela pipeta holding e deve ser mantido com o glóbulo polar às 6h, para evitar danos no fuso meiótico(Vos, 2000). Antes de microinjetar deve confirmar-se que a holding, o ovócito e a ponta da pipeta ICSI estão focados, indicando que estão no plano equatorial do ovócito (figura 29a). Com o espermatozoide na ponta, a pipeta de injeção é posicionada às 3h e introduzida no ovócito através da zona pelúcida, de encontro ao oolema (figura 29b). A oolema oferece alguma resistência e normalmente só quebra quando a pipeta atinge o centro do ovócito, ocorrendo um fluxo de citoplasma súbito (Palermo et al., 2009a). Após a quebra do oolema, é aspirada uma pequena quantidade de citoplasma que é devolvido ao ovócito juntamente com o espermatozoide. A aspiração do citoplasma é mais um estímulo para a sua ativação (Mansour, 1998) e permite incorporar melhor o espermatozoide (Palermo et al., 2009a). Para terminar, a pipeta de ICSI deve ser retirada lentamente e o ovócito deve ser libertado com a) b) Fig. 28 -!a) Processo de imobilização de um espermatozoide, com a pipeta a passar sobre a cauda do espermatozoide num movimento firme. b) Aspiração do espermatozoide pela cauda, após imobilização. Adaptado de Veeck (1999). ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 78 ! cuidado, evitando a perda do espermatozoide (figura 29c) (Mansour, 1998). As pipetas são então subidas, retirando-as da placa. Com o fim do procedimento, a placa de microinjeção volta para a bancada aquecida do estereomicroscópio para guardar os ovócitos. Estes são lavados em meio pré-equilibrado e transferido para a placa com meio de incubação coberto com óleo. Esta placa é mantida na estufa a 37ºC, 5% O2 e 6% CO2 até se avaliar a fertilização. A avaliação da fertilização ocorre 16 a 18h após microinjeção e é avaliado o número e aspeto dos glóbulos polares (GP) e pronúcleos (PN). Em ovócitos normalmente fertilizados devem observar-se 2 GP e 2 PN. Pode ocorrer uma fertilização anormal e observar-se apenas 1 PN ou 3 PN. Estes pré-zigotos mantêm o potencial para o desenvolvimento embrionário, tal como os pré-zigotos 2 PN. Daí a necessidade de confirmar a normal fertilização. Após 24h da microinjeção, é avaliada a clivagem, observando-se o número e tamanho dos blastómeros e a presença de fragmentos (Vos, 2000). a)! b)! c)! Fig. 29 - Processo de microinjeção. a) ovócito fixado pela pipeta holding com o GP às 6h e pipeta de injeção com espermatozoide na ponta. b) introdução da pipeta de injeção no ovócito, através da zona pelúcida e oolema. c) Retirada da pipeta de injeção após deposição do espermatozoide. Adaptado de Vos (2000). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 79 ! 9. Avaliação da fertilização As condições de avaliação da fertilização e do desenvolvimento embrionário têm sido alvo de várias discussões, nomeadamente no consenso de Istambul (2011), devido à necessidade de uniformizar os momentos de observação. Deste modo, a fertilização deve ser confirmada 17 ± 1h após inseminação. Neste momento, os prézigotos devem ser avaliados quanto a alguns fatores: pronúcleos (PN), corpos precursores de nucléolos (CPN), glóbulos polares (GP) e presença de halo no citoplasma (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). No caso de uma fertilização normal, formam-se 2 PN e 2 GP. Aquando da formação dos pronúcleos, os CPN tornam-se evidentes e começam a sua migração para se fundirem e formarem o nucléolo. Não constituem um nucléolo ativo durante a fase de zigoto mas são uma medida indireta da localização e do grau de condensação do DNA dos PN. Para além disso, os nucléolos são locais de síntese de pré-RNA, essencial no processo de tradução quando o genoma embrionário se torna ativo (Papale et al., 2012). A classificação dos PN pode ser um fator importante na previsão da competência embrionária e é especialmente útil em países cuja legislação obriga à seleção dos embriões a transferir durante a fase de zigoto (Papale et al., 2012). Em condições ideais, os 2 PN devem encontrar-se no centro do ovócito, justapostos e com membranas distintas. Cada PN deve ainda ter CPN em número e tamanho iguais, de preferência alinhados no local de justaposição dos PN (figura 30) (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). Fig. 30Pré-zigoto, em ampliação x600, com 2 PN em posição central, justapostos de de tamanho semelhante, com CPN alinhados no local de justaposição. Glóbulos polares fragmentados no eixo longitudinal dos PN. Adaptado de Papale et al. (2012). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 80 ! Para facilitar e uniformizar a avaliação, existe um sistema de classificação denominado Z-score (tabela 7) (Scott, 2003). Neste sistema são avaliados a simetria e alinhamento dos PN, assim como o número e posição dos CPN. ! Após o consenso de Istambul, foi estabelecido um sistema mais simples com três categorias: simétrico, assimétrico e anormal (tabela 8). O valor preditivo da competência embrionária dado pela avaliação do PN é ainda controverso (Scott et al., 2007). Tabela 7 -!Classificação Z-score com descrição de cada score e imagem correspondente. Adaptado de Scott (2003). Score Descrição Z1 CPN iguais e alinhados (máx. 6) Z2 CPN iguais mas não alinhados (máx. 6) Z3-1 CPN em nº, tamanho e alinhamento diferente Z3-2 CPN alinhados num PN e não alinhados noutro Z3-3 CPN em nº desigual (diferença >2) Z3-4 CPN pequenos e difusos Z4-1 PN separados Z4-2 PN de diferentes tamanhos Z4-3 PN na periferia do ovócito Classificação Descrição Simétrico CPN em igual nº e tamanho, alinhados ou dispersos (equivalente a Z1 e Z2) Assimétrico Todos os outros padrões, incluindo PN na periferia Anormal PN com um ou nenhum CPN Tabela 8 - Sistema de classificação de pré-zigotos, segundo o consenso de Istambul. Adaptado de A.S.i.R.M. and E.S.I.G.o.E (2011). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 81 ! Se ocorrerem falhas na fertilização, podem ser observados pré-zigotos com 1, 3 ou mais PN. Os pré-zigotos com 1 PN podem ter origem partenogénica e nesse caso apresentam normalmente 1 GP e são haploides (figura 31a). Podem também ser resultado da assincronia da formação dos PN ou da sua fusão. Estes pré-zigotos têm, normalmente, 2 GP e são diploides (figura 31b). Os embriões resultantes destes pré-zigotos têm uma maior incidência de aneuploidias. Pré-zigotos com 3 PN podem resultar de casos de polispermia, não extrusão do segundo GP ou inseminação de ovócitos gigantes, associados a diploidia (figura 31c) (Papale et al., 2012). 9.1. Avaliação dos pronúcleos O tamanho dos pronúcleos é uma das características observadas no momento da verificação da fertilização e depende de fatores relacionados com os gâmetas. Um passo importante da fertilização é a descondensação da cromatina altamente condensada dos espermatozoides, substituindo as protaminas por histonas. Assim, o tamanho do PN masculino depende da estrutura nuclear do espermatozoide e da capacidade do ovócito de induzir a descondensação, através da libertação de níveis adequados de glutationa. Normalmente, os PN têm tamanhos semelhantes, embora o pronúcleo feminino possa ser um pouco menor (figura 32a). O tamanho depende do momento de observação. Assim, se às 17h após inseminação forem observados PN a) b) Fig. 31 –Pré-zigotos 1 PN. a) Pré-zigoto observado 16h após inseminação, apresenta 1 PN e 1 GP, a uma ampliação x200. b) Pré-zigoto observado 16h e 45 minutos após inseminação, a uma ampliação x400, apresenta 1 PN e 2 GP (parcialmente sobrepostos). c) Pré-zigoto com 3 PN e CPN de grande tamanho, a ampliação x400, resultado de uma ICSI num ovócito gigante. Adaptado de Papale et al. (2012). c) FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 82 ! com diâmetro inferior ao normal, pode ser um caso de atraso na fertilização causado por imaturidade dos ovócitos ou defeitos nos gâmetas (figura 32b). A transferência destes zigotos pode resultar em implantação. Se forem observados PN com diferença de tamanho superior a 4µm (figura 32c), micronúcleos ou fragmentados, o pré-zigoto é considerado anormal, estando estes casos associados a anomalias cromossómicas e perda de potencial de desenvolvimento. Deve ser evitada a transferência destes zigotos (Papale et al., 2012). Os microtúbulos, organizados pelos centrossomas dos espermatozoides, controlam a aposição dos PN, definindo o plano da primeira divisão. Movimentações e rotações adicionais dos pronúcleos favorecem a distribuição das mitocôndrias e alinhamento da cromatina, podendo levar à formação do halo no citoplasma (zona cortical translúcida) (figura 33). Quando os PN se encontram separados (figura 34), ocorre atraso ou paragem do desenvolvimento em 80% desses casos (Papale et al., 2012).! a) b) c) Fig. 32 – Pré-zigotos avaliados às 17 ± 1h após inseminação. a) Pré-zigoto observado 18h após inseminação, com 2 PN centrais e justapostos com tamanho semelhante e com CPN em igual número e tamanho (x400). b) Pré-zigoto avaliado 16h após inseminação, com PN mais pequenos que o normal, não centrados (x400). c) Pré-zigoto com 2 PN de tamanhos significativamente diferentes (x200). Adaptado de Papale et al. (2012). Fig. 33 – Pré-zigoto com PN justapostos e centrais, alinhados paralelamente ao plano dos GP. Apresenta ainda o halo em redor do citoplasma. Adaptado de Papale et al. (2012). Fig. 34 – Pré zigoto, avaliado 18h após inseminação, com PN afastados e de diferente tamanho. Adaptado de Papale et al. (2012). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 83 ! A posição dos PN é importante pois influencia o plano de clivagem (Papale et al., 2012; Scott, 2003) e, sendo um processo dinâmico, sofre alterações ao longo do tempo (Papale et al., 2012). Na maioria dos zigotos com PN no centro do citoplasma, a primeira clivagem ocorre normalmente (figura 35a). Casos de PN na periferia do citoplasma resultam em morfologia e clivagem anormal, assim como paragem do desenvolvimento (figura 35b). No entanto, a implantação pode ocorrer como resultado da transferência destes zigotos (Papale et al., 2012).! Os PN sofrem rotações, de forma a ficarem frente-a-frente, com o centrossoma localizado no sulco entre os dois e de forma a que o eixo longitudinal dos PN fique paralelo ao plano dos GP (figura 36). Com a ocorrência de mais rotações, os PN passam a definir um eixo perpendicular ao dos GP (figura 37). Se o estado final não resultar em PN justapostos, centrais e alinhados com os GP, podem ocorrer alterações no desenvolvimento provocadas por falhar na fertilização e clivagem anormal (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011; Papale et al., 2012). Um grande afastamento entre os GP é preditivo de fraco desenvolvimento embrionário, devido à incorreta orientação dos PN, gerando agitação no citoplasma que provoca clivagem desigual ou fragmentação (Papale et al., 2012).! a) b) Fig. 35 – Pré-zigoto com diferentes posições dos PN. a) Pré-zigoto observado 18h após inseminação, com PN centrais e justapostos. CPN alinhados e de diferentes tamanhos. (x400) b) Pré-zigoto avaliado 16h após inseminação, com PN sobrepostos e periféricos (x400). Adaptado de Papale et al. (2012). Fig. 36 – a) Esquematização de um pré-zigoto com os PN paralelos ao plano dos GP. b) Pré-zigoto com PN justapostos, centrados e paralelos em relação ao plano dos GP (x200). Adaptado de Papale et al. (2012). a) b) Fig. 37 – a) Esquematização de um pré-zigoto com os PN perpendiculares ao plano dos GP. b) Pré-zigoto com os PN justapostos, centrados e perpendiculares em relação ao plano dos GP. 2º GP fragmentado (x400). Adaptado de Papale et al. (2012). a) b) FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 84 ! 9.2. Avaliação dos Corpos Percursores do Nucléolo ! Os CPN encontram-se ligados à cromatina e alinham com esta. Deste modo, se houver uma polarização correta da cromatina, os CPN vão aparecer também alinhados. Por ser um mecanismo dinâmico, verifica-se que o seu padrão se altera em pouco tempo. Durante o ciclo celular, os CPN mudam em tamanho, número e distribuição (Papale et al., 2012), devido à sua fusão para formação do nucléolo (Scott, 2003). Antes da singamia e do início da primeira clivagem, os CPN desaparecem (Papale et al., 2012). Assim, os CPN tendem a aumentar de tamanho e diminuir o seu número durante o seu alinhamento. Deste modo, a presença de CPN pequenos e de tamanhos variáveis são indicativos de defeitos funcionais no nucléolo e, por consequência, da menor ou ineficaz síntese de rRNA. Contudo, se forem observados em igual número mas não alinhados nos dois PN, não tem consequências negativas no desenvolvimento (Papale et al., 2012). A observação dos CPN dos dois PN como preditiva do potencial de desenvolvimento embrionário, deve incluir o seu número, tamanho e distribuição. Deve ter-se em conta que a morfologia do CPN é influenciada pela idade da paciente e as alterações temporais que sofrem dependem também da técnica que foi utilizada (FIV ou ICSI). Deste modo, a classificação dos PN e CPN deve ter em atenção a técnica usada, as características da paciente e a hora de inseminação (Papale et al., 2012). 9.3. Avaliação do citoplasma Tal como nos ovócitos, nos zigotos é esperado um citoplasma homogéneo mas o significado que alguma heterogeneidade do citoplasma possa ter no desenvolvimento embrionário é desconhecido (figura 38a). Ainda assim, alguns estudos revelam que anomalias severas no citoplasma influenciam o desenvolvimento e implantação do embrião (Papale et al., 2012). Algumas alterações menores no zigoto como a presença de halo, detritos no espaço perivitelino e corpos refrácteis não foram ainda relacionadas com um prognóstico negativo. A presença de agregados de organelos nos ovócitos baixam o pH e diminuem o conteúdo em ATP, o que pode ser herdado pelo zigoto e tem consequências negativas na implantação e gravidez, apesar de não afetar a clivagem embrionária (figura 38b). É também importante observar a presença de AREL FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 91 ! 10.3. Avaliação de embriões em fase de blastocisto – Dia 5 Ao quinto dia o embrião deve atingir o estado de blastocisto e este pode encontrar-se em diferentes fases – inicial, em expansão, expandido e em eclosão/eclodido (figura 40) (Machtinger e Racowsky, 2013). Para se considerar um blastocisto de boa qualidade, este deve apresentar uma massa celular interna (MCI) proeminente, com muitas células e bem compactadas. Deve ainda ter uma trofoectoderme (TF) com bastantes células, formando um epitélio coeso. A MCI tem um elevado valor preditivo do potencial de implantação e desenvolvimento fetal (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011) uma vez que dará origem ao embrião (Cockburn e Rossant, 2010). No entanto, uma TF funcional é também essencial (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). Com a extensão da cultura de embriões até à fase de blastocisto, foi necessário criar sistemas de classificação. Dokras criou o primeiro sistema em 1991, que incluía três categorias diferentes, de acordo com o desenvolvimento e morfologia. No entanto, o sistema mais utilizado é o de Gardner e Schoolcraft que tem em conta o volume ocupado pelo blastocélio, o número e organização das células da MCI e da TF. Em relação ao sistema de Dokras, o sistema de Gardner e Schoolcraft permite uma melhor seleção do blastocisto com melhor potencial de implantação (Machtinger e Racowsky, 2013). O sistema de classificação elaborado no consenso de Istambul tem por base o de Gardner e Schoolcraft. Neste sistema é classificado o estado de desenvolvimento do blastocisto tendo em conta o grau de expansão, assim como o número e organização das células da MCI e TF (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). Desta forma, o blastocisto é classificado tendo em conta o estado de desenvolvimento (de 1 a 4), seguido da MCI (de 1 a 3) e da TF (de 1 a 3), como demonstrado na tabela 12. Assim, um blastocisto de boa qualidade, bem expandido e com a MCI e TF de boa qualidade tem a classificação 3:1:1. Se o blastocisto se encontrar colapsado deve ser avaliado passado 1 ou 2h, uma vez que é normal ocorrerem ciclos de colapso e reexpansão nos blastocistos (A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E., 2011). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 92 ! Grau Classificação Descrição Estado de desenvolvimento 1 Inicial 2 Em expansão 3 Expandido 4 Em eclosão/eclodido MCI 1 Boa Proeminente, facilmente distinguível, várias células compactadas e aderentes 2 Razoável Facilmente distinguível, com muitas células mas pouco compactadas 3 Má Difícil de distinguir e com poucas células TF 1 Boa Muitas células formando um epitélio coeso 2 Razoável Poucas células formando um epitélio pouco coeso 3 Má Muito poucas células Tabela 12 – Sistema de classificação de blastocistos, de acordo com o consenso de Istambul, que combina o estado de desenvolvimento e a classificação da massa celular interna (MCI) e trofoectoderme (TF). Adaptado de A.S.i.R.M. e E.S.I.G.o.E. (2011). a) b) c) d) e) Fig. 40 – a) Blastocisto inicial com o blastocélio a ocupar >50% do volume do embrião. b) Blastocisto (3:1:1) com uma grande MCI e bem compactada. c) Blastocisto de boa qualidade com uma MCI grande e com a zona pelúcida mais fina. d) Blastocisto em eclosão, com uma MCI grande e compacta às 8 horas. e) Blastocisto eclodido com a zona pelúcida vazia contendo ainda alguns detritos, MCI grande e compacta na base do blastocisto e TF com bastantes células e formando um epitélio coeso. Pode observar-se o aumento de diâmetro do blastocisto a partir do momento em que eclode e deixa a zona pelúcida. Adaptado de Hardarson (2012). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 93 ! 11. Cultura embrionária A cultura embrionária está longe de ser um procedimento simples, necessitando de embriologistas treinados e de estufas que mantenham o ambiente o mais estável possível. Para além disso, hoje em dia há uma grande variedade de meios de cultura disponíveis para escolha e deve ainda tomar-se a decisão quanto à fase na qual o embrião deve ser transferido, uma vez que é possível manter os embriões em cultura até à fase de blastocisto. Todos estes fatores influenciam tanto a cultura e desenvolvimento dos embriões, como o resultado final da transferência. A transferência de embriões de segundo dia (4 células) ou terceiro dia (8 células) é globalmente aceite, mas deve ter-se em conta que in vivo estes embriões ainda estariam nas trompas de Falópio e não no útero (Gardner e Lane, 1997). Apesar de ser mais dispendiosa e delicada, a possibilidade de cultura de embriões até à fase de blastocisto aumentou as taxas de implantação e gravidez, enquanto diminuiu a necessidade de transferência de múltiplos embriões e, por consequência, diminuiu a incidência de gravidezes múltiplas (Hardarson et al., 2012). As razões pelas quais a transferência de blastocistos apresenta bons resultados derivam da melhor sincronização com o ciclo da mulher, permitindo que o endométrio esteja preparado para a implantação, e também pelo facto das contrações uterinas, que são ainda fortes no segundo e terceiro dias após recolha dos ovócitos, diminuírem de intensidade e tornarem-se quase impercetíveis ao quinto dia, evitando a expulsão do embrião (Gardner e Lane, 2009). A cultura prolongada permite também uma melhor avaliação da viabilidade embrionária antes da transferência. Este último fator resulta do facto de a cultura prolongada permitir ir além do momento de ativação do genoma embrionário, que ocorre durante a fase de 4 a 8 células (Palermo et al., 2012). A partir deste momento pode avaliar-se a fisiologia do embrião, que antes da ativação do seu genoma refletia a fisiologia do ovócito (Gardner e Lane, 1997). Outra vantagem dos blastocistos em comparação com os embriões em fase de clivagem é que os primeiros são menos susceptíveis ao stress, uma vez que antes da compactação o embrião não tem capacidade de responder ao stress a nível molecular (Gardner e Lane, 2009). Apesar das duas vantagens, a cultura de blastocistos aumenta o risco de erros epigenéticos e de nascimentos prematuros (Machtinger e Racowsky, 2013) assim como a possibilidade de nenhum embrião originar um blastocisto viável e ocorrer o cancelamento da transferência (Gardner e Lane, 2009). Também a reduzida taxa de sobrevivência dos blastocistos após congelação lenta pareceu ser um entrave à utilização de embriões nesta fase, mas a FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 94 ! introdução da vitrificação permitiu melhorar as taxas de sobrevivência após descongelação (Elder e Dale, 2003) Existem dois tipos de cultura – a cultura sequencial e a monocultura. A monocultura baseia-se no princípio de deixar o embrião escolher aquilo que necessita durante o desenvolvimento. O sistema sequencial foi desenvolvido para fornecer os nutrientes necessários a cada momento e tentar imitar o ambiente no trato feminino, que corresponde a um gradiente de nutrientes à medida que passa das trompas para o útero (Gardner e Lane, 2009). Apesar de ter sido a partir do desenvolvimento de meios sequenciais que a cultura até à fase de blastocisto se tornou possível, recentemente têm sido lançados meios para o mercado que permitem uma cultura contínua, ou seja, que não implica a mudança de meio ao terceiro dia de desenvolvimento, e que mesmo assim permite a obtenção de blastocistos de qualidade. Sistema de cultura sequencial Para realizar a cultura de embriões no sistema sequencial, no dia da punção folicular prepara-se uma placa de quatro poços com o meio de cultura coberto com óleo para os quais serão transferidos os pré-zigotos após confirmação da fertilização. Em cada poço são colocados no máximo 5 pré-zigotos para facilitar o seu acompanhamento e a placa é mantida em incubação a 37ºC, 5% O2 e 6% de CO2. A placa volta a ser retirada da estufa aquando da avaliação da singamia ou da divisão precoce, 23 horas após a inseminação. Os embriões devem ser avaliados todos os dias nos momentos certos (como resumido na tabela 9), de forma breve para evitar que permaneçam muito tempo fora da estufa. Ao terceiro dia de desenvolvimento, os embriões que continuarão a sua cultura in vitro, são transferidos para outro meio de cultura, pré-equilibrado a 37ºC, que satisfaz as suas necessidades nutricionais e metabólicas. Esta nova placa é também incubada a 37ºC, 5% O2 e 6% CO2 e assim permanece até ao dia da transferência. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 95 ! 12. Transferência de embriões A transferência pode ser feita a partir do segundo dia de desenvolvimento embrionário. Em Portugal, não há um limite legal quanto ao número máximo de embriões que se pode transferir, no entanto, o Conselho Nacional de Procriação Medicamente Assistida (CNPMA) recomenda a transferência de um ou dois embriões e no máximo 3 em casos especiais e justificados. O dia mais adequado para a transferência assim como o número de embriões a transferir estão dependentes de fatores como o número de tentativas anteriores, a idade da paciente, o número de embriões de boa qualidade disponíveis e a recetividade do endométrio (Florensa et al., 2008). Em casos de pacientes com bom prognóstico tem-se obtido bons resultados com a transferência de apenas um blastocisto, sendo que a transferência de mais blastocistos aumenta significativamente o risco de gestação múltipla. Em pacientes com mau prognóstico pode correr-se o risco de nenhum embrião se desenvolver até blastocisto (A.S.R.M e S.A.R.T., 2013). A transferência deve começar a ser preparada antecipadamente, ou seja, na noite após a punção folicular é administrada progesterona à paciente de modo a preparar o endométrio com as secreções necessárias para que ocorra a implantação e gravidez (Florensa et al., 2008). A técnica mais utilizada é a transferência intrauterina por via vaginal (Florensa et al., 2008) usando um cateter de transferência. Estes cateteres são constituídos por duas partes: a interna e a externa. A interna transporta os embriões e deve ser suave e ter um diâmetro suficiente para que não os danifique (Bongso, 1999). Antes da transferência, no dia anterior ou pelo menos cinco horas antes, deve ser preparada a placa de transferência que corresponde a uma placa de 4 poços, um com meio de carregamento do cateter e outro com meio de cultura para lavagem do cateter. Este meio de cultura depende da fase de desenvolvimento do embrião a transferir. Os embriões são colocados no meio de carregamento que é uma espécie de “cola” que pretende facilitar a implantação, e permanecem neste meio durante 15 minutos. Os restantes embriões podem ser criopreservados, se houver consentimento do casal. Após 15 minutos, o cateter interior é lavado com meio de cultura, recorrendo a uma seringa incorporada no cateter. De modo a carregar o cateter, coloca-se a sua ponta no poço com os embriões e aspira-se um pouco de meio, seguido de um pouco de ar, de seguida aspira-se o meio com os embriões, mais um pouco de ar e outra porção de meio. O cateter com a parte interna inserida FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 96 ! no cateter externo e com a seringa incorporada é levado até à sala de transferência onde a paciente já se encontra deitada e cujo útero é visualizado por monitorização ecográfica. É então inserido o cateter e depositam-se os embriões no útero (figura 41). O cateter é de novo levado para o laboratório onde se confirma que os embriões foram todos transferidos. Ao fim de 15 dias confirma-se a implantação através de um teste de gravidez, pela medição da hCG. Fig. 41 – Representação esquemática da transferência embrionária que inclui a monitorização ecográfica e a introdução do cateter de transferência, transportando os embriões, na cavidade uterina. No canto superior esquerdo encontra-se uma imagem típica do monitor do ecógrafo onde é percetível a localização do cateter. Adaptado de http://reproducaohumana.blog.br/2011/04/14/transferencia-embrionaria/, acedido a 09-07-2015. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 97 ! 13. Eclosão assistida O embrião, tal como o ovócito, encontra-se envolvido pela zona pelúcida que, aquando da fertilização, sofre um endurecimento devido à reação zonal. Este fenómeno bloqueia a polispermia assim como protege o embrião durante o seu transporte pelo trato feminino até ao útero. Uma vez no útero, o blastocisto tem de se libertar da zona pelúcida, num processo designado por eclosão (Veiga et al., 2009). A eclosão do embrião permite que a implantação ocorra (Petersen, 2005) pois as células da trofoectoderme podem entrar em contacto com as células endometriais (Veiga et al., 2009). O processo natural e espontâneo de eclosão ocorre pela intervenção de lisinas embrionárias ou uterinas, que diminuem a espessura da zona pelúcida, e por ciclos de colapso e expansão física do embrião que provoca a rutura da zona pelúcida (Veiga et al., 2009). Tem vindo a ser proposto que uma das razões que leva à falha de implantação é a incapacidade do embrião eclodir (Petersen, 2005). Por este motivo, torna-se benéfico para alguns pacientes que a eclosão seja promovida através de vários métodos, antes da transferência, num procedimento designado por eclosão assistida (EA). A eclosão assistida consiste na diminuição da espessura da zona pelúcida ou pela sua abertura recorrendo a métodos químicos, mecânicos ou por laser (A.S.R.M e S.A.R.T., 2014) e deve ser realizada quando as células começam a aderir em embriões em fase de clivagem ou em blastocistos (Veiga et al., 2009). As técnicas de PZD (partial zona dissection) e ZD (zona drilling) com solução Tyrode foram aplicada na EA. No entanto, são técnicas demoradas e com alguns riscos para o embrião. A técnica de EA por laser é considerada mais segura, eficaz e simples de realizar (Hammadeh et al., 2011). O laser provoca a fotoablação da zona pelúcida num local escolhido e com o diâmetro desejado (Veiga et al., 2009). Verifica-se que a eclosão acaba por ocorrer pela zona que foi enfraquecida. A EA não deve ser realizada em todos os casos mas verifica-se que é benéfica em pacientes com mau prognóstico (A.S.R.M e S.A.R.T., 2014), com falha de implantação anterior e em ciclos de embriões criopreservados (Veiga et al., 2009). Uma das consequências que pode derivar da EA é a ocorrência de gravidez de gémeos monozigóticos (Hammadeh et al., 2011). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 98 ! 14. Diagnóstico Genético Pré-implantação O Diagnóstico Genético Pré-implantação (DGPI) é uma forma de diagnóstico pré-natal in vitro e no qual, após investigação genética, os embriões não afetados são transferidos para o útero materno (Teles, 2011). O DGPI foi desenvolvido no fim da década de 90 com o objetivo de ajudar casais em risco de transmitir uma doença para a descendência (Elder e Dale, 2003). Um outro tipo de diagnóstico pré-natal é a amniocentese, mas este tem a desvantagem de, obtendo-se o resultado de que o feto está afetado, o casal ter de decidir se termina a gravidez. Por sua vez, o DGPI tem a vantagem de ser realizado pré-implantação e assim só os embriões não afetados são transferidos (Elder e Dale, 2003). Em Portugal, o DGPI é destinado “a pessoas provenientes de famílias com alterações que causam a morte precoce ou doença grave, quando existe risco elevado de transmissão à sua descendência” (artigo 29º da lei nº 32/2006). O DGPI está também indicado em casos de idade materna avançada (>35 anos), falhas repetidas de implantação, abortos de repetição e em casos de infertilidade masculina severa (Hens et al., 2013). O DGPI está incluído em ciclos de fertilização in vitro que se inicia como qualquer outro: estimulação ovárica seguida de punção folicular, fertilização in vitro e cultura embrionária. A técnica de fertilização recomendada é a ICSI por evitar a contaminação com DNA de espermatozoides e de células da granulosa. O DGPI engloba a biópsia embrionária, que deve ser feita por um embriologista experiente, e o diagnóstico genético que deve ser realizado por um geneticista (Elder e Dale, 2003). O diagnóstico pode ser realizado em três fases de desenvolvimento: • Ovócito/zigoto – biópsia de glóbulos polares • Embriões em fase de clivagem – biópsia de um a dois blastómeros • Embriões em fase de blastocisto – biópsia de células da trofoectoderme (Elder e Dale, 2003; Teles, 2011). Para realizar a biópsia, é necessário criar uma abertura na zona pelúcida que pode ser conseguida por métodos mecânicos, químicos ou por laser, tal como na eclosão assistida (Teles, 2011) e é realizada utilizando o equipamento de micromanipulação (Elder e Dale, 2003). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 99 ! A biópsia dos glóbulos polares pode ser realizada em ovócitos (1º GP) (figura 42) ou em zigotos (1º e/ou 2º GP). Este tipo de biópsia ultrapassa objeções éticas à biópsia embrionária pois pode ser realizada pré-conceção (ovócito) e não retira nenhuma célula ao embrião. No entanto, só permite obter informações sobre o genoma materno (Teles, 2011). A biópsia dos GP tem sido utilizada para diagnósticos de aneuploidias em casos de idade avançada e em que a paciente seja portadora de anomalias cromossómicas (Elder e Dale, 2003). A biópsia mais utilizada é a de um ou dois blastómeros de embriões em fase de clivagem (figura 43) (Teles, 2011). O embrião é fixado com recurso a uma pipeta holding e, após abertura da zona pelúcida, uma pipeta aspira um blastómero com recurso a uma pequena sucção. Esta técnica deve ser realizada quando o embrião apresenta 6 a 10 células e pouco antes da compactação pois após esta ocorrer é difícil retirar apenas um blastómero (Elder e Dale, 2003). Um dos problemas com que se depara esta técnica é o mosaicismo que pode ocorrer, ou seja, a presença de blastómeros normais e anormais (euploides e aneuploides) no mesmo embrião. Por este motivo, podem ser retirados dois blastómeros, para evitar falsos positivos. A biópsia de células da trofoectoderme de blastocistos é outra possibilidade no DGPI. Nesta técnica, o blastocisto é fixado e é feita uma incisão na zona pelúcida, do lado oposto à massa celular interna. O embrião é deixado em repouso durante 6 a 24h até que a trofoectoderme comece a emergir da excisão feita. Neste momento, é excisada uma parte de trofoectoderme (Elder e Dale, 2003). Este tipo de biópsia tem a vantagem de não perturbar a massa celular interna e não comprometer a viabilidade do embrião. No entanto, muitos embriões não conseguem chegar à fase de blastocisto in vitro, mas poderiam tê-lo conseguido já no útero (Hens et al., 2013). Outra desvantagem são os elevados valores de mosaicismo cromossomal e o facto de células anormais serem encaminhadas para a trofoectoderme durante o desenvolvimento (Elder e Dale, 2003). Para além disso, a biópsia da trofoectoderme de blastocistos implica sempre a criopreservação dos embriões (Teles, 2011) uma vez que é necessário esperar pelos resultados da análise genética. Este deixou de ser um entrave a esta técnica após a introdução da vitrificação, que permite manter os embriões enquanto se aguarda pelos resultados na análise genética e se discute os mesmos com o casal, sem comprometer a viabilidade embrionária (Hens et al., 2013). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 100 ! Após a biópsia, as células recolhidas são submetidas a análise genética. Esta pode ser feita por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou pela hibridização in situ de sondas fluorescentes (FISH). A técnica de PCR é usada em casos de defeitos num único gene, repetição de tripletos e determinação do sexo do embrião. As duas principais desvantagens são a possibilidade de contaminação e o alelle dropout, ou seja, a amplificação preferencial de um alelo em detrimento do outro (Elder e Dale, 2003; Teles, 2011). A técnica de FISH é usada para deteção de anomalias cromossómicas. Nesta técnica, todos os núcleos podem ser analisados mas o número de cromossomas visualizados em simultâneo é limitado. Pode ser usadas sondas para os cromossomas X e Y para determinação do sexo do embrião em doenças ligadas ao cromossoma X, sondas para os cromossomas envolvidos em anomalias estruturais e sondas para os cromossomas 13, 18, 21, X, Y, 16 e 22 para a deteção de aneuploidias (Elder e Dale, 2003). Mais recentemente, foram surgindo técnicas baseadas em arrays de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) e hibridação genómica comparativa (Harper e Harton, 2010). Após a análise genética, são transferidos os embriões que não sejam afetados por doenças e que se mantenham viáveis em cultura, no caso de embriões biopsados em fase de clivagem, ou após desvitrificação, em caso de embriões biopsados em fase de blastocisto. Fig. 42 – Processo de biópsia do 1º glóbulo polar em ovócito, com abertura da zona pelúcida (a) e aspiração do 1ºGP (b). Adaptado de Veeck (1999). a) b) Fig. 43 – Processo de biópsia de um blastómero em embrião em fase de clivagem, com introduçãoo da pipeta de aspiraçãoo no local de abertura da zona pelúcida (a) e aspiração do blastómero enquanto a pipeta é retirada do embrião (b). Adaptado de Veeck (1999). a) b) FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 107 ! contaminado e comprometer o material biológico. Hoje em dia, este sistema começa a ganhar força e a ser implementado em Portugal. O sistema Cryotop® (Kitazato, Dibimed) é adequado à vitrificação de ovócitos e apresenta taxas de sobrevivência após desvitrificação de 90%. Além disso, é um processo simples e seguro (Cryotop). Para proceder à vitrificação, os ovócitos devem ser previamente desnudados e deve colocar-se a bancada e as soluções necessárias à temperatura ambiente. Antes de iniciar o processo, prepara-se uma placa com 20µl de BS (basic solution) no primeiro poço, 300µl de VS (vitrification solution) no segundo e mais 300µl de VS no terceiro poço. Inicialmente, os ovócitos passam por um processo de equilíbrio, no qual são colocados no primeiro poço com 20µl de BS, ao qual são acrescentados 20µl de ES (equilibration solution) durante 3 minutos. Adicionam-se mais 20 µl de ES durante 3 minutos e mais 240µl de ES durante 6 a 9 minutos, após os quais termina o passo de equilíbrio dos ovócitos. No passo de vitrificação, os ovócitos são colocados no segundo poço, com 300µl de VS durante 30 segundos, no qual são lavados para retirar resíduos do meio anterior. São depois transferidos para o terceiro poço também com 300µl de VS por 30 segundos. Terminado este tempo, carrega-se a palheta com os ovócitos (figura 50), transferindo o mínimo de volume possível. A palheta com os ovócitos é colocada em azoto líquido e agitada, para promover um rápido arrefecimento. A palheta é fechada e está pronta para o armazenamento em azoto líquido. Para realizar a desvitrificação deve aquecer-se uma placa de Petri e o meio TS (thawing solution) a 37ºC durante pelo menos 90 minutos. Os meios DS (diluente solution) e WS (washing solution) devem ser mantidos à temperatura ambiente. Prepara-se uma placa com um poço com 300µl de DS, outro com 300µl de WS e um terceiro poço com 300µl de WS. Deve retirar-se a placa de Petri da estufa aquecida a 37ºC e preenche-la com o meio TS. A palheta é retirada do azoto líquido e mergulhada no meio TS de forma a libertar os ovócitos que permanecem nesse meio por 60 segundos. São depois transferidos para o meio DS por 3 minutos, seguido do primeiro poço de WS por 5 minutos e mais 1 minuto no último poço de WS. Os ovócitos são depois lavados em meio de cultura, no qual permanecem a 37ºC durante, pelo menos, 120 minutos. Fig. 50 – Palhetas de vitrificação do método Cryotop® para sistema aberto, compostas por uma palheta interna (A) para carregamento dos ovócitos/embriões e uma externa (B). Retirado de http://www.kitazatodibimed.com/ver/11/Vitrification-Cryotop.html, acedido a 14-07-2015. A A B FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 108 ! 16.2. Criopreservação de espermatozoides A criopreservação de gâmetas masculinos foi introduzida em 1960 e permitiu ultrapassar limitações impostas pelo espaço e tempo, sendo que faz já parte das técnicas de reprodução assistida (Di Santo et al., 2012). A criopreservação de espermatozoides revelou-se extremamente útil em casos de pacientes que necessitam de passar por tratamentos de quimio e radioterapia que poderão levar a falhas da função testicular e disfunção ejaculatória. Assim como em casos de doenças como diabetes e doenças autoimunes. Em casos de doação de gâmetas masculinos, a congelação tem também um papel importante por conceder tempo para a avaliação dos dadores quanto a agentes infeciosos, como vírus da imunodeficiência humana (VIH) e vírus da hepatite B, antes de serem utilizados para doação (Di Santo et al., 2012). Em pacientes azoospérmicos que realizaram TESE ou PESA, a criopreservação é útil para evitar a repetição de biópsias ou aspirações (Desai et al., 2012; Di Santo et al., 2012). Também em pacientes que vão começar ciclos de tratamento de reprodução assistida pode ser útil recorrer à criopreservação de espermatozoides de modo a evitar falhas na colheita no dia da inseminação (Di Santo et al., 2012) quer por razões emocionais ou por o paciente não poder comparecer no dia da inseminação. Os espermatozoides parecem ser menos sensíveis do que outras células, devido à fluidez da sua membrana e ao baixo conteúdo em água. Contudo, a criopreservação pode originar alterações na estrutura e função (Di Santo et al., 2012). Criopreservação A amostra seminal, após recolha por masturbação, é incubada a 37ºC para que ocorra a liquefação. Entretanto, deve retirar-se a solução de crioproteção do frigorífico e coloca-la à temperatura ambiente. Quando a amostra apresenta a liquefação completa é processada com recurso a gradientes de densidade descontínuos, como descrito na secção 4.2. A amostra é submetida ao swim-up durante meia hora, após este tempo é adicionada a solução crioprotetora. Desta solução é adicionado o volume correspondente a 1/3 do volume de meio obtido com o swim-up e deve adicionar-se gota a gota, agitando o tubo a cada adição, para evitar o choque osmótico. Antes do carregamento das palhetas de congelação, procede-se à identificação das mesmas com o código do dador ou o nome do paciente e a data de congelação. Deve também ser escolhido e registado a localização das palhetas no contentor de armazenamento. Para carregar as palhetas, homogeneiza-se a amostra que é aspirada para a palheta, e esta é selada por calor FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 109 ! na extremidade. Todas as palhetas carregadas são colocadas no frigorifico a 5ºC durante meia hora, sendo depois transferidas para um recipiente com azoto líquido onde permanecem a alguma distância do mesmo, de modo a estarem expostas apenas ao vapor do azoto, cuja temperatura ronda os -80ºC. As palhetas são mantidas em vapor de azoto líquido por mais 30 minutos, após os quais são mergulhadas no mesmo e transferidas para o contentor de armazenamento. Nos casos em que as amostras são obtidas do epidídimo ou testículo, o método de congelação não deve ser o mesmo pois estas amostras contêm muito poucos gâmetas, com baixa motilidade e estão ainda contaminadas por hematócitos e resíduos celulares (Desai et al., 2012). Para estes casos têm sido desenvolvidos novos métodos que utilizam um volume reduzido de meio mas para todos esses métodos são ainda necessários mais estudos (Abdelhafez et al., 2009). Na descongelação, as palhetas são retiradas do contentor onde se encontram armazenadas e mantidas à temperatura ambiente até descongelar. A amostra é então colocada num tubo, ao cortar as extremidades da palheta. Uma vez que a amostra se encontra dentro do tubo, é adicionado, lentamente e entre agitações, o meio de incubação pré-aquecido a 37ºC. A amostra é então centrifugada por 15 minutos a 1000 rpm, a 35ºC. O sobrenadante resultante é descartado e adiciona-se meio de incubação ao pellet que é incubado na estufa a 37ºC para que ocorra o swim-up, após o qual a amostra está pronta a ser utilizada. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 110 ! 17. Doação de gâmetas ! De acordo com a lei nº 32/2006, em Portugal pode “recorrer-se à dádiva de ovócitos, de espermatozoides ou de embriões quando, face aos conhecimentos medico-científicos objetivamente disponíveis, não possa obter-se gravidez através do recurso a qualquer outra técnica que utilize os gâmetas dos beneficiários” e “os dadores não podem ser havidos como progenitores da criança que vai nascer”. Apesar de não ser legal a venda de gâmetas, estão previstas compensações monetárias aos dadores de gâmetas, pelos incómodos que o deslocamento possa causar. 17.1. Dadoras de ovócitos As dadoras de ovócitos passam por uma entrevista para obter informações sobre a sua história clínica e características físicas. As candidatas a dadoras devem ter entre 18 a 35 anos de idade. São também agendadas análises ao sangue incluindo marcadores víricos e uma avaliação do cariótipo. Se todos os resultados se revelarem normais, as candidatas passam a constar da lista de dadoras disponíveis até se encontrar um casal compatível com o grupo sanguíneo e o fenótipo da dadora. Neste momento, a dadora inicia a estimulação ovárica e é realizada a punção folicular. A preparação do endométrio da paciente recetora deve estar sincronizado com o ciclo da dadora, uma vez que as dádivas de ovócitos são realizadas a fresco. Cada dadora pode realizar 3 dádivas, com um intervalo mínimo de 6 meses. A doação de ovócitos é uma oportunidade para que pacientes com falência ovárica prematura, idade avançada, doenças genéticas graves ou que passaram por tratamentos de cancro, consigam a conceção. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 111 ! 17.2. Dadores de espermatozoides Os possíveis dadores masculinos começam o processo de doação com uma colheita para realização de um espermograma. Os candidatos que tenham entre 18 e 40 anos e uma amostra seminal dentro dos valores de referencia, podem avançar no processo de doação. O passo seguinte será o de uma entrevista para obtenção de informações sobre a sua história clínica, características físicas, assim como a história e hábitos sexuais. É também realizada uma primeira análise sanguínea que inclui marcadores víricos e uma avaliação do cariótipo. Uma vez recebidos os resultados das análises e cariótipo e caso todos se revelem normais, o dador entra no programa de doação. Neste programa são realizadas cinco a seis colheitas e em cada uma avaliam-se parâmetros de motilidade e concentração. Todas as dádivas são criopreservadas após processamento da amostra por gradientes de densidade descontínuos e swim-up. As palhetas criopreservadas passam por um período de quarentena de 180 dias, no fim do qual são realizadas novas análises sanguíneas com marcadores víricos para despistagem de doenças víricas. Se os resultados se revelarem negativos para todos os marcadores víricos e as análises sanguíneas se mantiverem normais, o candidato passa a dador efetivo. Neste momento, as palhetas ciopreservadas pertencentes a este dador, podem ser utilizadas em tratamentos de reprodução assistida. A doação de espermatozoides é particularmente útil em pacientes azoospermicos, quando não se recolhem espermatozoides nem espermátides após biópsia testicular, ou que tenham doenças genéticas graves. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 112 ! 18. Criopreservação de embriões Com a introdução da estimulação do desenvolvimento de vários folículos como parte do ciclo de tratamento de reprodução assistida, aumentou também o número de ovócitos inseminados, assim como o número de embriões de boa qualidade. A criopreservação de embriões ganhou assim importância por permitir o armazenamento dos embriões excedentários (Loutradi et al., 2008). É também útil quando a paciente não tem o endométrio pronto para a transferência, em casos de dessincronização entre dadora e recetora e permite adiar a transferência em pacientes com alto risco de desenvolver síndrome de hiperestimulação ovárica (Loutradi et al., 2008). Elimina ainda a necessidade de uma nova estimulação em caso de falha do ciclo anterior. A criopreservação de embriões apresenta alguns entraves impostos pela perda de viabilidade dos embriões, que resulta principalmente da formação de cristais de gelo intracelulares. De forma a ultrapassar este problema, foram sendo desenvolvidos protocolos de congelação lenta e vitrificação, assim como diferentes tipos de soluções crioprotetoras (Loutradi et al., 2008). Atualmente, a técnica mais adotada nos laboratórios de reprodução assistida é a vitrificação uma vez que esta, comparada com a congelação lenta, apresenta melhores taxas de sobrevivência e de gravidez clínica (Herrero e Meseguer, 2013). Além disso, a vitrificação é mais rápida, não requer equipamento caro e é necessário o gasto de pouco azoto líquido (Loutradi et al., 2008). A congelação lenta consiste na congelação das células a uma taxa controlada e com uma baixa concentração de crioprotetores, de forma a evitar a formação de gelo intracelular. Os crioprotetores passam a membrana celular e substituem a água. No entanto, a excessiva desidratação leva a um aumento da concentração de crioprotetores dentro da célula até níveis tóxicos. A vitrificação solidifica as células até um ponto vítreo, impedindo assim a formação de cristais de gelo. Para tal, combina elevadas concentrações de crioprotetores com taxas de arrefecimento muito rápidas (Loutradi et al., 2008). FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 113 ! Vitrificação A vitrificação pode ser realizada em embriões em fase de clivagem e de blastocisto. O protocolo é basicamente o mesmo tanto para embriões em fase de clivagem como para blastocistos. Uma das diferenças é que antes da vitrificação de blastocistos, estes devem ser sujeitos a um colapso provocado por um disparo de laser, para aumentar a sua sobrevivência. O disparo de laser deve ser dado do lado oposto ao da massa celular interna, de modo a não danifica-la (Desai et al., 2013). Segundo o método Rapid-i™ (Vitrolife, Suécia), antes da vitrificação deve ser preparada uma placa de 4 poços com cada um dos três meios que compõem as soluções de vitrificação de embriões em fase de clivagem e blastocistos (RapidVit Cleave™ e RapidVit Blast™, respetivamente). A placa deve ser incubada a 37ºC, durante pelo menos 20 minutos. Os embriões selecionados para vitrificação são então colocados no primeiro poço com o primeiro meio durante 5 minutos, sendo depois transferidos para o segundo no qual permanece por 2 minutos. Por fim, são transferidos para o ultimo meio por 30 segundos para embriões em fase de clivagem, ou 45 segundos para blastocistos. Após este tempo, são carregados na palheta de vitrificação, no máximo de dois embriões por palheta e com o mínimo de meio possível. A palheta carregada é colocada no interior de uma palheta exterior que entretanto foi colocada em azoto líquido. Este sistema é um sistema fechado, pois os embriões não entram em contacto direto com o azoto líquido. Finalmente, a palheta é selada na extremidade e armazenada em contentores de azoto liquido. Para a desvitrificação, é preparada uma placa com os meios de aquecimento (RapidWarm Cleave™ e RapidWarm Blast™). As palhetas são retiradas do azoto líquido e imersas no primeiro meio para libertar os embriões e no qual permanecem por 10 segundos (embriões em fase de clivagem) ou por 2 minutos (embriões em fase de blastocisto). São depois transferidos para o segundo meio por 1 minuto (embriões em fase de clivagem) ou por 3 minutos (embriões em fase de blastocisto) e para o terceiro meio por 2 minutos (embriões em fase de clivagem) ou 5 a 10 minutos (embriões em fase de blastocisto). No caso dos embriões em fase de clivagem, existe um quarto meio, no qual os embriões permanecem por 5 minutos. No fim, os embriões são lavados e incubados em meio de cultura até à transferência. Os embriões em fase de clivagem desvitrificados podem ser transferidos ou podem continuar em cultura até à fase de blastocisto. Os blastocistos devem ser transferidos após 2 horas de incubação a 37ºC, 5% de O2 e 6% de CO2 (Desai et al., 2013). Os embriões devem ser observados ao microscópio e avaliados quanto à sua qualidade, antes da transferência. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 114 ! ! FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 115 ! Conclusão O presente ano letivo decorreu no Centro de Estudos de Infertilidade e Esterilidade (CEIE) para realização de um estágio curricular na área de reprodução assistida. Este estágio teve o objetivo de promover o contacto com a rotina de um laboratório de reprodução assistida e com tudo o que isso envolve, como o contacto com os pacientes e a sua assistência. Neste estágio, realizei a análise de amostras seminais e dos parâmetros que nela se incluem, de forma autónoma, assim como o processamento de amostras para utilização nas diversas técnicas de reprodução assistida, como IIU, FIV e ICSI. Efetuei também a criopreservação de amostras seminais de pacientes e ainda a sua descongelação para utilização em técnicas de reprodução assistida. Ainda no laboratório de andrologia, tive contacto com a gerência do banco de dadores masculinos, propriedade do CEIE, efetuando o processamento das amostras de sémen para a sua congelação, os testes de descongelação e a descongelação e preparação para uso em ciclos de tratamento com recurso a dador, incluindo a escolha do dador mais adequado. Assisti também à descongelação de amostras obtidas por TESE. Ainda no âmbito deste estágio, auxiliei em punções foliculares e na procura dos ovócitos. Tive também a oportunidade de realizar a desnudação dos ovócitos e avaliar o seu estado de maturidade, para utilização em ICSI. No caso das diferentes técnicas de reprodução in vitro, fui capaz de realizar inseminação dos ovócitos por FIV e, recorrendo a ovócitos e espermatozoides excedentários, pude treinar o processo de ICSI. Após inseminação, acompanhei o desenvolvimento embrionário e a sua classificação, desde a avaliação da fertilização até à fase de blastocisto. Aquando da transferência, pude assistir à seleção dos embriões e treinar o carregamento do cateter. Com os embriões excedentários, treinei várias vezes a vitrificação de embriões em fase de clivagem e blastocistos, até que surgiu a oportunidade vitrificar blastocistos, e desvitrifica-los, que foram realmente transferidos e que resultou em gravidez. Assisti ainda à vitrificação de ovócitos, uma técnica que começa agora a ganhar importância nos laboratórios de reprodução assistida. Durante este estágio familiarizei-me ainda com a gestão do laboratório, com a preparação de meios, a manutenção dos stocks de material e anotação dos respetivos lotes e também o contacto com os pacientes. Houve ainda oportunidade de assistir a uma biópsia de blastómeros para realização de DGPI. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 116 ! Este ano letivo e com a realização deste estágio contactei com a realidade do trabalho nesta área, com todas as alegrias que esta nos proporciona mas também com os desafios que nos apresenta. Acabo este estágio com uma maior convicção de que é realmente o meu desejo desenvolver uma carreira como embriologista e aprofundar cada vez mais as minhas capacidades técnicas, algo que se impõe nesta profissão. Acima de tudo, termino com a vontade de ajudar cada vez mais casais a realizar o seu sonho de paternidade. FCUP Dos gâmetas à gravidez: laboratório para o tratamento da infertilidade 123 ! Hammadeh, M.E., Fischer-Hammadeh, C., e Ali, K.R. (2011). Assisted hatching in assisted reproduction: a state of the art. Journal of assisted reproduction and genetics 28, 119-128. Hammoud, A.O., Wilde, N., Gibson, M., Parks, A., Carrell, D.T., e Meikle, A.W. (2008). Male obesity and alteration in sperm parameters. Fertility and sterility 90, 2222-2225. Hardarson, T., Landuyt, L.V., e Jones, G. (2012). 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