Avaliação do Dano Genético em Trabalhadores de Anatomia Patológica expostos a Formaldeído

AVALIAÇÃO DO DANO GENÉTICO EM TRABALHADORES DE ANATOMIA PATOLÓGICA EXPOSTOS A FORMALDEÍDO SANDRA CRISTINA PEREIRA DE CARVALHO TESE DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR DA UNIVERSIDADE DO PORTO EM MEDICINA LEGAL M 2013 - 2 - - 3 - Sandra Cristina Pereira de Carvalho Avaliação do Dano Genético em Trabalhadores de Anatomia Patológica Expostos a Formaldeído Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador – Doutor João Paulo Fernandes Teixeira Categoria – Investigador Auxiliar Afiliação – Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge I Resumo O formaldeído (FA) é um dos mais importantes compostos químicos com uma gama de aplicações muito variada, desde a produção de resinas até à medicina. À temperatura ambiente é um gás incolor e inflamável com um odor pungente e intenso. É um composto biológico que ocorre naturalmente na maioria das células, tecidos e fluidos corporais. A exposição ao FA tem sido correlacionada com o aumento de risco de cancro nasofaríngeo e leucemia. Com base em dados epidemiológicos, a International Agency for Research on Cancer (IARC) classificou o FA como sendo carcinogénico para os humanos (grupo 1). O efeito genotóxico do FA foi confirmado numa ampla gama de sistemas experimentais desde bactérias a roedores. Apesar destes resultados positivos poderem providenciar uma base para a extrapolação para os humanos, os estudos citogenéticos em humanos têm tido resultados contraditórios. Evidências biológicas da toxicidade em local-distância, nomeadamente em linfócitos periféricos e medula óssea, ainda são insuficientes e conflituosas, sendo necessário estudos mais aprofundados. Devido ao seu uso multifacetado, um número relativamente elevado de trabalhadores está exposto ao FA. A exposição ocupacional ao FA ocorre principalmente em laboratórios de anatomia patológica, onde é utilizado ao longo dos últimos 100 anos como agente preservante de tecidos. Nos laboratórios de anatomia patológica, a exposição ao FA ocorre principalmente por inalação, afetando as vias superiores. A severidade e extensão da resposta fisiológica dependem da concentração absorvida. Estudos recentes demonstraram que os níveis do FA no ar em laboratórios de anatomia patológica excedem os critérios de exposição recomendada. A finalidade deste estudo foi avaliar o dano genético em linfócitos de sangue periférico de trabalhadores de laboratórios de anatomia-patológica expostos a FA. A avaliação da exposição ocupacional a FA foi realizada através da medição da concentração de FA no ar no posto de trabalho. Para estimar o nível de exposição do FA nos serviços de anatomia patológica durante a jornada de trabalho (TWA) recorreu-se à amostragem contínua de ar no posto de trabalho, representativa do ar inalado pelos trabalhadores. Procedeu-se também à análise de dois tipos de biomarcadores de efeito, aberrações cromossómicas e teste do cometa (pela medição da percentagem de ADN na cauda. Para o efeito foi estudada uma população de 75 profissionais de Serviços de Anatomia Patológica, expostos a FA no seu ambiente laboral e uma população de 76 indivíduos com historial de não exposição a FA a nível ocupacional, com caraterísticas sociodemográficas semelhantes ao grupo exposto. ii Para o grupo de trabalhadores estudado, tendo em conta a jornada normal de trabalho (8 horas diárias e 40 horas semanais), obteve-se um valor médio de exposição a FA de 0.41 ppm. Os resultados obtidos para os indicadores de genotoxicidade demonstraram que, em média, os trabalhadores expostos apresentam maior dano genético, comparativamente com os indivíduos do grupo controlo (P < 0.05). Foi observado no grupo exposto um aumento significativo de aberrações cromossómicas e do comprimento da cauda do cometa. Os dados obtidos reforçam assim a ideia da utilização deste tipo de biomarcadores de efeito na avaliação dos efeitos genotóxicos da exposição a FA. O conjunto de dados reunidos contribui assim para a caraterização da exposição a FA num contexto profissional específico, podendo, deste modo, revelar-se particularmente útil para reforçar a necessidade de alterar as práticas de trabalho de forma a salvaguardar a saúde dos profissionais. A informação recolhida será útil para as entidades responsáveis definirem os níveis aceitáveis para a exposição ocupacional a FA, assim como para a implementação de medidas preventivas. Estas baseiam-se principalmente em medidas de segurança e de higiene neste setor, tal como campanhas de boas práticas que podem ser cruciais para diminuir a exposição e o risco de efeitos negativos para a saúde. iii Abstract Formaldehyde (FA) is an important chemical compound with numerous applications ranging from the production of resins to medicine. At room temperature is a flammable and colorless gas with a strong pungent odor. It is also a naturally occurring biological compound present in the majority of cells, tissues and body fluids. FA exposure has been linked most consistently with increased risk of nasopharyngeal cancer (NPC) and leukemia. Based on available data, The International Agency for Research on Cancer (IARC) classified FA carcinogenic to humans (group 1). FA’s genotoxicity is confirmed in a variety of experimental systems ranging from bacteria to rodents. Although these positive findings may provide a basis for extrapolation to humans, the cytogenetic assays in humans have been conflicting with both positive and negative outcomes. Biological evidence of toxicity on distant-site such as peripheral lymphocytes and bone marrow is still insufficient and conflicting, thus remain to be more documented. Because of its widespread use, a relatively large number of workers are exposed to FA. Occupational exposure to FA occurs mainly in pathology anatomy laboratories where it is being used as a tissue preservative for around 100 years. In these settings, absorption of FA occurs mainly through inhalation. Inhaled FA primarily affects the upper airways; the severity and extent of physiological response depends on its concentration in the absorved air. Recent studies have consistently shown that the levels of airborne FA in pathology laboratories exceed recommend exposure criteria. The aim of the study was to evaluate cytogenetic damage in peripheral lymphocytes of anatomy-pathology workers exposed to FA. The assessment of the occupational exposure to FA was carried out by measuring the concentration of FA in workplace for representative working periods. It was also performed the analysis of two types of effect biomarkers to evaluate genotoxic effects, chromosomal aberrations and comet assay. The study population was comprised by 75 workers and a control group formed by 76 individuals with the same sociodemographic characteristics and without occupational exposure history to genotoxic compounds. The data obtained from both groups were compared and analyzed. The mean value of FA exposure for the exposed workers was 0.41 ppm (8 hours and 40 weekly hours). Concerning to the genotoxicity biomarkers studied, the levels of chromosomal aberrations and DNA damage, evaluated by comet assay, were significantly higher in the exposed group when compared with the control group (P < 0.05). This data emphasize the idea of the application of this type of biomarkers to assess the genotoxic effects of exposure to FA. x 3.2. AVALIAÇÃO AMBIENTAL E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA 50 3.2.1. AVALIAÇÃO AMBIENTAL E BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE ESTUDADOS.... 50 3.2.2. AVALIAÇÃO BIOLÓGICA .................................................................................... 53 3.2.2.1. Influência do género na frequência dos biomarcadores de genotoxicidade estudados 53 3.2.2.2. Influência da idade na frequência dos biomarcadores de genotoxicidade estudados 54 3.2.2.3. Influência dos hábitos tabágicos na frequência dos biomarcadores de genotoxicidade estudados 57 3.2.2.4. Influência do tempo de exposição na frequência dos biomarcadores de genotoxicidade estudados 59 3.2.2.5. Associações entre os diferentes biomarcadores de genotoxicidade estudados 61 4. DISCUSSÃO 63 5. CONCLUSÃO 69 BIBLIOGRAFIA 71 ANEXO I 85 ANEXO II 91 ANEXO III 95 xi Índice de Figuras Figura 1 - Fórmula Molecular e diagrama em 3D do FA 4 Figura 2 - Metabolismo do FA 10 Figura 3Concentração de FA no ar e efeitos na saúde 16 Figura 4 - Monitorização Ambiental e Monitorização Biológica 24 Figura 5 – Biomarcadores de dose, efeito e suscetibilidade 25 Figura 6 - SCE observada em linfócitos em metafase 31 Figura 7 - Diagrama explicativo do mecanismo de replicação das cadeias de ADN depois de incorporarem BrdU 32 Figura 8 - Micronúcleos observado em células binucleadas 33 Figura 9 - Imagens de células obtidas pelo teste do cometa 35 Figura 10 – Coletor de Ar 41 Figura 11 - Cálculo do valor de TWA para cada trabalhador numa jornada diária de trabalho de 8 horas 42 Figura 12 - Resultados obtidos referentes à influência da exposição na frequência dos indicadores gaps, quebras por célula, células aberrantes, células multiaberrantes, aneuploidias e %TADN. 52 Figura 13Gap num cromossoma 87 Figura 14 – Quebra num cromossoma 87 Figura 15 – Cromossoma em anel 88 Figura 16 – Cromossoma dicêntrico e fragmento 88 Figura 17 - Figura Homóloga 89 Figura 18 - Figura Radial 89 Figura 19 - Interchange 90 xii xiii Índice de Tabelas Tabela 1 - Propriedades físico-químicas do FA 5 Tabela 2 - Classificações do FA pelas principais Organizações Mundiais 8 Tabela 3 - Estimativa dos Valores Médios de Concentração de FA, nas várias fontes ambientais de Exposição 13 Tabela 4 - Valores limite de exposição ocupacional ao FA no ar (ppm) definidos pelas principais agências mundiais 22 Tabela 5 - Caraterísticas da população estudada 49 Tabela 6 – Valores da concentração média ponderada de FA (TWA) e dos diferentes biomarcadores estudados para o grupo controlo e o exposto 50 Tabela 7 – Efeito do género nos diferentes biomarcadores de genotoxicidade 53 Tabela 8 – Efeito da idade nos biomarcadores de genotoxicidade, no grupo controlo 54 Tabela 9 - Efeito da idade nos biomarcadores de genotoxicidade estudados, no grupo exposto 55 Tabela 10 – Efeito dos hábitos tabágicos nos diferentes biomarcadores de genotoxicidade 57 Tabela 11 – Efeito do tempo de exposição na frequência dos biomarcadores de genotoxicidade, no grupo exposto 59 Tabela 12 - Associações entre os biomarcadores de genotoxicidade estudados 61 1 1 - Introdução O mundo e a sociedade tal como os conhecemos hoje em dia, sofreram enormes transformações desde a Revolução Industrial no séc. XVIII. Até essa data toda a produção de materiais era feita manualmente, sendo que, após o início dessa revolução se assistiu a uma grande evolução na área industrial. A implementação da atividade mecanizada em grande escala influenciou o nível de vida e a quantidade de substâncias poluentes produzidas. Este acontecimento histórico levou ao aumento do uso, por vezes em elevadas quantidades, de produtos químicos que se tornaram essenciais para o bom funcionamento e bem-estar das nossas sociedades. Assim o despoletar da industrialização levou ao surgimento da poluição ao nível ambiental em larga escala, o que se traduziu em consequências a médio e longo prazo nas populações e até mesmo no próprio ambiente. Este novo modo de vida teve também um grande impacto na saúde em geral, e em especial na saúde ambiental e ocupacional. Ao longo da nossa vida estamos rodeados de diversas fontes de agressões ao nosso organismo, que incluem desde agentes físicos, como radiações ionizantes e não ionizantes, a agentes químicos, com os quais entramos em contato, por vezes de modo muito subtil, mas que, no entanto, acabam por ter efeitos, muitas vezes detetáveis no nosso sistema. Os efeitos nefastos provenientes do ambiente que nos rodeia, têm cada vez mais um papel preponderante no nosso estilo de vida. Assim, torna-se indispensável monitorizar as suas consequências para a saúde tanto a nível ocupacional como ambiental. A abordagem da ligação ambiente ocupacional/saúde implica um conhecimento adequado dos riscos profissionais relativos à exposição e das respetivas repercussões sobre a saúde dos trabalhadores, que daí podem advir. Este conhecimento adquire-se através da análise do panorama global das situações de trabalho. No contexto ocupacional, a exposição a substâncias químicas é um dos fatores com maior peso nestas possíveis situações de risco, sendo conhecidas mais que 100 000 diferentes tipos, dentre as quais cerca de 200 a 300 estão atualmente classificadas como sendo mutagénicas ou carcinogénicas (Uva e FARIA, 2000). Incluídas neste grupo estão substâncias muito diferentes em termos de propriedades, nomeadamente, o arsénio, o benzeno, o formaldeído e o plutónio (IARC, 2013). É atualmente aceite que a maioria dos cancros resulta da exposição a carcinogénicos ambientais (Uva e FARIA, 2000). A Organização Mundial de Saúde 2 (OMS) estima que entre 90 a 95% desses cancros possam estar relacionados com exposição ocupacional, fatores ambientais e fumo do tabaco (Hughes, 1996). Tendo em consideração que um indivíduo passa cerca de 1/3 da sua vida adulta no seu local de trabalho, é necessário manter esses locais nas melhores condições de salubridade possíveis de modo a reduzir o elevado número de casos de cancro resultantes da exposição ocupacional. De acordo com o reportado pela OMS em 2007, este número ronda os 200 mil casos. No contexto ocupacional, além do cuidado requerido no que respeita ao contato com agentes físicos e biológicos, a maior preocupação está centrada nos efeitos adversos que podem surgir da utilização e do manuseamento de agentes químicos potencialmente perigosos. Sendo assim, é necessário ter em conta a identificação e as propriedades de cada um, bem como os respetivos limites de exposição. Ainda de salientar a necessidade de informação acerca da duração da exposição e a suscetibilidade dos indivíduos expostos (Albertini et al., 2000). O potencial genotóxico de um composto é um dos fatores de risco mais importantes para o aparecimento de efeitos a longo prazo, como o cancro ou efeitos a nível reprodutivo (Silbergeld, 2001). Este tipo de compostos corresponde a agentes físicos ou químicos que direta ou indiretamente são capazes de danificar o ADN nuclear. A probabilidade deste dano genético originar um efeito real na saúde do indivíduo depende da natureza do dano, da capacidade da célula para reparar e amplificar esse dano, da oportunidade que a célula pode ter ou não de expressar essa alteração e ainda da capacidade do organismo de reconhecer e suprimir a multiplicação de células aberrantes (Silbergeld, 2001). A avaliação do dano no ADN dos linfócitos oferece informação acerca do possível efeito que o composto, na sua forma reativa, poderá provocar quando atinge os locais alvo nos tecidos. (Silbergeld e Davis, 1994). Esta avaliação do dano biológico ao nível genético pode ser determinada de diversas formas, das quais se destacam, numa fase mais precoce, a análise de mutações ao nível do ADN, as alterações citogenéticas, e numa fase mais tardia do processo, lesões pré-cancerígenas, apoptose e marcadores tumorais que se encontram em circulação sanguínea (Bhatt et al., 2010). Assim, torna-se essencial a realização de monitorização da exposição a compostos químicos, tendo como referência os níveis base e os níveis máximos aos quais as populações, ocupacional e ambientalmente podem estar expostas. Esta monitorização pode ser realizada recorrendo a duas abordagens diferentes e complementares, através de medição do agente químico no ar, que corresponde à monitorização ambiental e à medição dos compostos químicos e/ou seus metabolitos em 3 fluidos biológicos, assim como alterações biológicas que correspondem à monitorização biológica. A informação proveniente desta monitorização permite proceder à implementação de medidas de prevenção e controlo adequadas e constitui um processo de rotina de avaliação e interpretação de parâmetros biológicos e/ou ambientais com a finalidade de detetar possíveis efeitos nocivos para a saúde, antes que se desenvolva um processo de doença (Amorim, 2003). O formaldeído (FA) é um composto químico extensamente produzido a nível mundial e utilizado nos mais diversos setores, nomeadamente em processos industriais e procedimentos anatomopatológicos. A sua manipulação implica a libertação de vapores e consequente inalação por parte dos trabalhadores. A sintomatologia associada à exposição a FA é característica, com irritação das vias respiratórias superiores e olhos. Vários estudos epidemiológicos e experimentais associam a exposição ocupacional a FA com o desenvolvimento de cancro nasofaríngeo e leucemia (do tipo mielóide). Com base nos dados publicados, o FA foi recentemente classificado agente carcinogénio humano pelas principais agências mundiais. Face ao exposto, a utilização deste composto num ambiente ocupacional, nomeadamente nos serviços de anatomia patológica, pode vir a implicar graves consequências ao nível da saúde dos trabalhadores. 4 1.1. Formaldeído 1.1.1. Propriedades e utilização O formaldeído (FA), CAS 50-00-0 (Figura 1) também designado por aldeído fórmico, formol, formalina, metaldeído, metilaldeído, óxido de metileno, oxometano, oximetileno, é o elemento mais simples do grupo dos aldeídos. É um composto ubíquo e à temperatura ambiente é um gás inflamável, incolor, tem um odor pungente e é altamente reativo (IARC, 2006; WHO, 2010). Devido à sua elevada reatividade, não pode ser manipulado no seu estado puro, sendo portanto comercializado em solução aquosa de 30 a 50%, denominada formol ou formalina. Esta possui na sua constituição 10 a 15% de álcool metílico (metanol) ou uma menor concentração de derivados amínicos (formamina e melamina), de modo a inibir a oxidação a ácido fórmico e polimerização a paraformaldeído (NTP, 2011). Na ausência de água o gás FA é estável mas facilmente inflamável por fontes de calor, no entanto na presença de pequenas quantidades de água, tende a polimerizar-se espontaneamente, formando um sólido denominado paraformaldeído. Figura 1 - Fórmula Molecular e diagrama em 3D do FA Uma das principais questões preocupantes em termos ambientais deste composto é a sua permanência relativamente longa, em condições de elevada humidade e temperatura (WHO, 2010). As principais propriedades físico-químicas encontram-se resumidas na Tabela 1. 5 Tabela 1 - Propriedades físico-químicas do FA (IARC, 2012) Propriedade Dados Nome do IUPAC Metanal Fórmula química CH2O Peso Molecular 30.03 g/mol pH 2.8 – 4.0 Fator de Conversão (1atm, 25ºC) 1 mg/m3 = 1.23 x ppm Ponto de Fusão -19.1ºC Ponto de Ebulição -92ºC Densidade (a 25ºC) 1g/ml Pressão de Vapor 667 Pa Solubilidade Água, Etanol e Clorofórmio Limite de deteção do odor 0.8 - 1 ppm O FA é um dos aldeídos presente em maior quantidade na atmosfera e a sua produção resulta de diversos processos naturais de oxidação de hidrocarbonetos. É um dos compostos voláteis que se forma nos estágios precoces da decomposição de resíduos vegetais no solo e encontra-se naturalmente em frutos, alimentos e mesmo no corpo humano (produzido endogenamente) (NTP, 2011). Este agente químico foi descoberto em 1859, por um químico russo Aleksandr Mikhaylovich Butlerov, mas só em 1868 com Van Hoffman, químico alemão, é que surgiram as primeiras metodologias de produção a partir do metanol e foram estabelecidas as suas principais propriedades (Fox et al., 1985). A partir daí tem vindo a ser comercializado em todo o mundo, constituindo um dos compostos mais utilizados ao nível da indústria química, tendo em 1989, atingido o vigésimo terceiro lugar em volume de produção nos EUA (WHO, 1989). Encontra-se presente na constituição de diversos produtos, tais como produtos de limpeza, cosméticos e fumo do tabaco (em quantidades que variam entre 73,8 e 283,8 µg/cigarro), produtos fabricados com papel e emissão de fumos provenientes de fontes de combustão (Wong et al., 1997). Pode também encontrar-se em elevadas concentrações em alguns ambientes ocupacionais e em menores concentrações em ambientes habitacionais (IARC, 2006). Na sua forma líquida é também muito utilizado para a fixação e preservação de tecidos, pois estabiliza os detalhes estruturais mais 12 1.1.4. Exposição ocupacional e ambiental O formaldeído (FA) é um composto ubíquo no ambiente, tendo sido encontradas evidências da sua presença no ar interior e exterior, solos, água e alimentos. A população em geral pode estar exposta a FA por diversas fontes naturais de onde este se liberta para o ar ambiente, nomeadamente, da oxidação de hidrocarbonetos, decomposição de resíduos vegetais e transformação de compostos orgânicos liberados da folhagem. Outras fontes de emissão possíveis, por consequência de algumas atividades humanas, como a libertação do fumo do tabaco, gases de combustão e materiais utilizados no processo de construção, na madeira prensada utilizada no fabrico de mobiliário (Mayan et al., 1995), produtos de cosmética, produtos de limpeza e nalguns casos através de alimentos contaminados com este composto (NTP, 2011). A sua concentração no ar pode variar entre 0 e 0.1 ppm, sendo as maiores concentrações encontradas no ar interior, dependendo de parâmetros como humidade e ventilação e de componentes dos compartimentos habitacionais (materiais de construção, pavimentos e mobílias). Recentemente foi documentada a quantidade de FA a que um fumador pode estar exposto diariamente por inalação do fumo do tabaco, tendo sido obtidos valores na ordem dos 400 µg (Wang et al., 2009). Em termos alimentares, o principal fator de exposição não é a contaminação do alimento pelo composto em si, mas sim a sua inclusão como meio de preservação ou desinfetante. O efeito cumulativo de todas estas fontes de exposição e emissão podem desencadear efeitos adversos na saúde da população. Na Tabela 3 é apresentado um resumo das concentrações médias de FA a que as pessoas estão expostas nos diferentes contextos em que estão inseridos, acima mencionados, e dos níveis de exposição resultantes dessas concentrações. Estes valores baseiam-se num Guideline da Organização Mundial de Saúde (OMS) sobre a qualidade do ar interior, no qual são estimadas as concentrações médias de FA nos diferentes ambientes nos quais o ser humano passa a maior parte do seu tempo. Esses locais foram divididos assim consoante o tempo despendido em cada um (cerca de 60 a 70% no ambiente habitacional, cerca de 25% no ambiente ocupacional e cerca de 10% ao ar livre). 13 Tabela 3 - Estimativa dos Valores Médios de Concentração de FA, nas várias fontes ambientais de Exposição (WHO, 2000) Fonte Concentração (mg/m3) Exposição mg/dia Ar Livre (10%) 0.001 – 0.02 0.002 – 0.04 Ar Interior Habitação (65%) Convencional 0.03 – 0.06 0.3 – 0.6 Móvel 0.1 1.0 Exposição Passiva ao Fumo do Tabaco 0.05 – 0.35 0.5 – 3.5 Local de Trabalho (25%) Sem exposiçãoa 0.03 – 0.06 0.2 – 0.5 Com Exposição 1.0 8.0 Exposição Passiva ao Fumo do Tabaco 0.05 – 0.35 0.4 – 2.8 Consumo de Tabaco (20 cigarros/dia) 60 – 130 0.9 – 2.0b a assumindo o valor normal de FA contido num edifício b concentração total de FA contida no fumo de 20 cigarros A exposição humana a FA assume particular importância a nível industrial e no setor da saúde, onde é bastante utilizado. As suas propriedades físico-químicas, aliadas ao seu baixo custo de produção, fazem do FA um químico de uso corrente e de difícil substituição. O consumo mundial era no ano 2000, de 21 mil toneladas (IARC, 2006) e estimase que na União Europeia cerca de 970 000 trabalhadores estejam expostos a concentrações entre 0.5 e 1 ppm deste composto, estando envolvidas diversas indústrias (materiais de construção, plásticos, resinas) e laboratórios de anatomia patológica e histologia (IARC, 2012). Nos serviços de anatomia patológica desenvolvem-se atividades laboratoriais que implicam a exposição dos trabalhadores ao FA através da utilização e manuseamento de formol. As principais tarefas associadas à exposição a este composto que suscitam mais preocupação em termos de risco ocupacional são a análise macroscópica das peças anatómicas, de modo a proceder à sua descrição e catalogação e ao nível do despejo das peças após essa mesma análise. Este produto é um fixador de tecidos pouco dispendioso e bastante eficiente sendo, por isso, o eleito em procedimentos de rotina anatomopatológicos. Como não provoca o endurecimento excessivo dos tecidos é 14 igualmente o meio preferencial para conservar e armazenar biópsias e peças cirúrgicas. Face ao exposto, torna-se evidente que o formol é um produto de uso corrente e frequente pelos profissionais dos serviços de anatomia patológica. A principal desvantagem apontada na utilização do formol é o facto de haver libertação de vapores durante o seu manuseamento, com consequente inalação por parte dos trabalhadores (Ferro et al., 2005). Neste contexto ocupacional a exposição pode ocorrer por inalação quando se liberta em forma de gás, por contacto com a pele ou área ocular ou até por ingestão acidental quando são manuseadas soluções de formalina. Num primeiro estudo realizado em Portugal (Porto) por Mayan et al. (1995) sobre a exposição ocupacional ao FA de profissionais de laboratórios de anatomia patológica e histologia foram registadas concentrações de FA no ar que excediam ou eram muito próximas de 1 ppm. Sendo que nesta altura este composto estava classificado pela IARC como provavelmente carcinogénico para os humanos (grupo 2A) e os níveis estabelecidos pelos diversos países estavam compreendidos entre 0.05 e 0.4 ppm (IARC, 1995). O estudo demonstrou que estes trabalhadores se encontravam em situação de risco profissional. Num estudo português posterior (Ferro et al., 2005), dentro do mesmo âmbito, foram encontradas quantidades elevadas de FA em laboratórios de anatomia patológica, tendo sido obtidos em alguns casos, principalmente nas tarefas de exame macroscópico de peças e adição de formol em recipientes contendo peças frescas, valores de FA muito superiores a 1 ppm. Estes estudos, face aos resultados obtidos, evidenciaram a necessidade de implementar medidas de prevenção para garantir a segurança dos trabalhadores. 15 1.1.5. Efeitos na saúde Dada a principal via de absorção deste químico ser a inalatória, a sintomatologia resultante de uma exposição a formaldeído (FA), está mais associada com as vias aéreas superiores. Os principais sintomas descritos em diversos estudos compreendem quadros de irritação ao nível da mucosa nasal, trato respiratório e ao nível ocular, para níveis de FA acima dos valores aceitáveis de exposição. Na Figura 3 estão descritos alguns dos efeitos possíveis da exposição a este composto, num crescente de concentrações que variam de 0.1 a 10 ppm. De acordo com a duração e a concentração associada à exposição, esta pode ser classificada de diferentes formas. Assim pode ser de dois tipos: exposição aguda, quando o indivíduo está sujeito a uma exposição de curta duração mas em quantidades de composto muito elevadas, podendo ser do tipo acidental (quando não há intenção da mesma) ou intencional (quando estamos perante atos suicidas ou mesmo homicidas); e exposição crónica, quando o individuo está sujeito a uma exposição de longa duração mas em concentrações baixas, podendo esta ser do tipo ocupacional (quando estamos num contexto laboral) ou ambiental (Takeuchi, 2009). Num cenário de exposição aguda por FA, os efeitos são geralmente transitórios e, em caso de inalação de vapores, incidem principalmente em irritação do trato respiratório e olhos mas também incluem fadiga, dificuldade de concentração, perda de memória, perturbações psicomotoras, alterações de humor. Em casos de ingestão da solução, podemos observar envenenamentos agudos (a sua severidade está diretamente relacionada com a quantidade de composto ingerida), irritação e queimaduras ao nível do trato digestivo, dor abdominal, vómitos e diarreia (Kim et al., 2011). Em casos mais graves de intoxicação aguda, após ingestão deste composto são observados sérios danos ao nível do trato digestivo, que compreendem um quadro clínico que vai desde vómitos, irritação e constrição da garganta, vertigens, diarreia, convulsões, lesão renal, coma e morte (Almeida et al., 2000). Quando há contacto direto com a solução e a pele pode provocar irritação severa. No caso de exposição crónica, há um aumento da incidência de alterações de comportamento, no que respeita à motricidade, memória, perceção, cognição e estados de humor. Estando também reportados quadros de efeitos graves e crónicos, que compreendem faringites, rinites, desordens ao nível da córnea e letargia. Uma das principais que se coloca na sensibilidade da perceção do odor e do irritação ocular é que com repetidas exposições ao longo do tempo, é a sua diminuição, devido à adaptação destes dois órgãos sensoriais. Isto pode levar assim a “exposição silenciosa” sem o trabalhador estar ciente de tal (OSHA, 2013). 16 Está também documentada em estudos experimentais em ratos com concentrações elevadas do composto, sintomatologia associada a inflamação, hiperplasia, alterações degenerativas, necrose ao nível do epitélio nasal e metaplasia escamosa (Appelman et al., 1988; Monticello et al., 1996). Figura 3Concentração de FA no ar e efeitos na saúde (Policy and Research Division, 2009) Diversos estudos reportam também a ocorrência direta de alergias ao nível dérmico. A frequência destes casos é superior nos Estados Unidos (entre 8 a 9%) em relação ao que sucede a nível europeu (entre 2 a 3%), o que em parte se pode dever a questões de legislação, dado que os valores aceitáveis de exposição são bastante diferentes, sendo mais elevados nos Estados Unidos em relação aos estabelecidos pelas organizações ao nível da Europa (Latorre et al., 2011). 17 1.1.6. Efeitos genotóxicos e citotóxicos O formaldeído (FA) é um composto genotóxico, estando documentadas evidências positivas em quase todos os indicadores genéticos da sua capacidade para alterar o ADN de diversos organismos, entre os quais, bactérias, leveduras, fungos, plantas, insetos, nemátodes e células de mamíferos em cultura. Os efeitos desta genotoxicidade têm sido seguidos muito de perto, desde a década de 80, pelas principais agências mundiais, como a International Agency for Research on Cancer (IARC), a Organização Mundial de Saúde (OMS), o National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) e a Occupational Safety and Health Administration (OSHA) tendo surgido diversos relatórios acerca deste composto. Estes têm-se centrado principalmente na frequência de aberrações cromossómicas (AC), micronúcleos linfocitários (MN), micronúcleos bucais (MNB), micronúcleos bucais com pontes citoplasmáticas e trocas entre cromatídeos irmãos (SCE - Sister Chromatid Exchanges) de trabalhadores expostos ocupacionalmente a FA, sendo que a extensão do dano está diretamente relacionada com a concentração do composto e duração da exposição. A formação de MN, MNB e pontes citoplasmáticas tem sido descrita em indivíduos expostos a FA, sendo a sua frequência superior relativamente a indivíduos controlo (Suruda et al., 1993; Ye et al., 2005; Orsière et al., 2006; Costa et al., 2008). Outra das questões abordadas é o aumento da frequência de AC em indivíduos expostos, documentado em diversos estudos (He et al., 1998; Chinelato e Froes, 2002; Orsière et al., 2006; Manikantan et al., 2010) e também de SCE (He et al., 1998; Shaham et al., 2002; Ye et al., 2005; S. Costa et al., 2008). Mais recentemente tem sido também investigada em trabalhadores expostos a este composto, a formação de aductos de proteínas e de ADN, que alguns autores defendem ser um dos eventos chave no processo de carcinogénese química (Hedberg, 2001; Shaham et al., 2002; NTP, 2011). Nas últimas três décadas têm surgido diversos estudos acerca de dano genético potenciado por FA através de uma técnica moderna e inovadora, o teste do cometa ou comet assay. Na China, surgiu um estudo que incidiu sobre trabalhadores expostos a este químico, tendo estes apresentado níveis de dano genético elevados, utilizando o teste do cometa (Tang et al., 2009). Num outro trabalho, Jiang et al. (2010) estudou o dano genético numa população de 151 trabalhadores expostos a FA e uma população controlo de 112 indivíduos sem historial de exposição, tendo determinado valores superiores de dano nos trabalhadores expostos relativamente aos controlos. No Brasil foi realizado um estudo em trabalhadores expostos a uma gama de químicos, principalmente tolueno, no qual foram encontradas diferenças significativas de aumento de dano genético por esta mesma técnica (Heuser et al., 2007). 18 Outro ponto fulcral que tem sido alvo de diversos estudos é a influência da exposição ocupacional a FA na inativação de enzimas de reparação de dano genético. Hayes et al. (1997) estudaram este efeito por avaliação da atividade da O6-Alkylguanine DNA alkyltransferase (AGT), que se sabe estar envolvida em mecanismos específicos de reparação de dano no ADN provocado por agentes alquilantes in vitro. Este estudo foi levado a cabo em estudantes embalsamadores tendo sido feitas duas colheitas de sangue, uma antes de iniciarem a sua actividade curricular e outra após decorridas nove semanas do início da mesma; foram encontrados níveis mais reduzidos de reparação de ADN nos indivíduos aquando da segunda colheita realizada, devido à diminuição da actividade enzimática da AGT. Noutro estudo foi também testada a influência nos mecanismos de reparação específicos para lesões provocadas por FA. Por exposição de células DT 40 de galinhas, com mutações em vários genes envolvidos nos mecanismos de reparação ou checkpoints do ciclo celular, foi possível avaliar as diversas respostas ao dano provocado por exposição a FA, sendo a principal conclusão que a taxa de sobrevivência era muito inferior nas células mutantes em comparação com a das células wild-type (Ridpath et al., 2007). Foram também reportados estudos de hematoxicidade que demonstram o efeito do FA ao nível das células sanguíneas, nomeadamente, na diminuição da concentração de linfócitos a nível global (Ye et al., 2005; Tang et al., 2009) e dos restantes constituintes sanguíneos (Kuo et al., 1997; Zhang et al., 2010). O FA, como referido anteriormente, está classificado como sendo carcinogénico para o ser humano, baseado numa larga gama de estudos realizados, que demonstraram uma associação entre exposição e risco de cancro, incidindo principalmente em trabalhadores industriais e trabalhadores de serviços de anatomia patológica (NTP, 2011). Os primeiros dados tornados públicos acerca dessa questão remontam a 1978, ano em que surgiram os primeiros resultados positivos do desenvolvimento de cancro nasal em ratos de laboratório, divulgados pelo Chemical Industry Institute of Toxicology (CIIT) (Mayan et al., 1995). Inicialmente a classificação deste agente estava associada principalmente com o cancro nasofaríngeo (NPC) (Coggon et al., 2003; Hauptmann, 2003). Posteriormente, com o desenvolvimento de outros estudos, obtiveram-se resultados que associaram a exposição ocupacional a FA com outros tipos de patologias oncológicas, nomeadamente, cancro nasais e paranasais (Holmstrom e Lund, 1991; Luce et al., 2002). Mais recentemente surgiram dados que apoiam também a associação da exposição ocupacional a FA com o aumento de leucemias (Zhang et al., 2010), mais concretamente de leucemias mielóides (Pinkerton, 2004; Beane Freeman et al., 2009; Dreyfuss, 2010; NTP, 2011). 19 Em modelos animais, estão também documentados diversos estudos que levam às mesmas conclusões. Os resultados incidem principalmente em cancros ao nível da cavidade nasal (Monticello et al., 1996) e nalguns casos também leucemias (IARC, 2012). 20 21 1.2. Avaliação da exposição Com todas estas evidências no que respeita aos efeitos da exposição a formaldeído (FA) na saúde humana, fica demonstrada a necessidade de estimar os níveis de exposição (avaliação ambiental) e conhecer os potenciais efeitos que advêm dessa mesma exposição (avaliação biológica), de forma a prevenir eventuais danos para a saúde dos trabalhadores. A avaliação ambiental e a avaliação biológica constituem assim abordagens diferentes mas complementares para a avaliação da exposição a agentes químicos, assim como para a prevenção da mesma. 1.2.1. Avaliação ambiental A monitorização ambiental corresponde a um conjunto de observações e medições de diversos parâmetros, de forma contínua ou repetida, através dos quais se procede à recolha de amostras do ar ambiente, para análise da concentração de poluentes químicos, com o objetivo de estimar a exposição e o risco para a saúde dos trabalhadores, por comparação dos resultados obtidos com um valor de referência, de modo a servirem de controlo ou forma de alarme em situações mais críticas. As respetivas colheitas podem ser efetuadas num espaço físico comum, local de trabalho, ou então num espaço individual, correspondente a cada trabalhador, através da utilização de aparelhos portáteis. O tipo de amostragem que se efetua depende sobretudo da natureza das tarefas realizadas pelo trabalhador e da sua mobilidade no espaço geográfico de exposição ao agente que se pretende dosear. Os valores máximos admissíveis (Valores Limite de Exposição, VLE; Threshold Limit Values, TLV; Permissible exposure limit, PEL; Recommended Exposure Limit, REL) representam, à luz do conhecimento científico actual, a maior concentração no ar de uma substância química a que a quase totalidade dos trabalhadores pode estar exposta, ao longo da jornada de trabalho, sem que daí resulte efeito adverso para a saúde (ACGIH, 2010). Os valores limite podem tomar duas formas (Prista e Uva, 2006): i. a concentração média ponderada (VLE-MP), durante os 5 dias de trabalho de uma semana de 40 horas, também designada como time-weighted average (TWA). ii. a concentração máxima (VLE-CM), definida como o valor que nunca deve ser excedido mesmo em curtos períodos de tempo, também identificada como Ceiling (limite de tecto). Inclui-se ainda neste âmbito, as concentrações médias ponderadas, por períodos de 15 minutos, que não devem ser ultrapassadas ao 28 Aberrações cromossómicas (AC) As AC são alterações estruturais ou numéricas que ocorrem ao nível dos cromossomas, por ação de químicos ou radiações e que podem resultar de vários mecanismos, como por exemplo, dano direto na cadeia de ADN, inibição da síntese de ADN e replicação de uma cadeia de ADN danificada. Têm como ponto de partida uma quebra dupla na cadeia de ADN o que normalmente desencadeia o início de um mecanismo de reparação, de modo a restaurar o normal funcionamento e estrutura. São “a parte microscopicamente visível de uma gama de alterações do ADN, geradas por diferentes mecanismos de reparação de DSB (Double Strand Break)”. Os locais da sua formação situam-se principalmente na cromatina ativa (estrutura mais facilmente acessível) e nas regiões sub-teloméricas (Obe et al., 2002). Podem-se classificar em diferentes tipos e como exemplos destas alterações temos gaps, quebras, anéis, cromossomas dicêntricos e fragmentos acêntricos, figuras homólogas e figuras radiais e interchanges. Esta técnica consiste na observação de células em metafase, onde é possível a visualização dos cromossomas na sua condensação máxima, e contagem da totalidade dos cromossomas (46 ± 1), com especial atenção a possíveis eventos considerados “anormais” em cada cromossoma. Esta é uma técnica validada e que tem sido amplamente utilizada em estudos de biomonitorização humana, visto que, existe uma forte evidência de que níveis elevados estão associados ao aumento do risco de cancro (Bonassi et al., 2008). As AC têm sido utilizadas ao longo dos últimos 30 anos em contexto tanto ocupacional como ambiental, como biomarcadores de efeito precoce de carcinogénios genotóxicos. Atualmente são utilizadas de modo rotineiro para avaliação da genotoxicidade in vitro (em linfócitos humanos e linhas celulares) e in vivo (na medula óssea de roedores) (Hagmar, 2004). 29 Tipos de aberrações cromossómicas (AC) As AC podem-se dividir em dois tipos, dependendo se afetam o número de cromossomas, 46, (numéricas) ou a estrutura dos mesmos (estruturais). A classificação destas últimas depende ainda da etapa do ciclo celular em que são geradas. Sendo assim, as AC numéricas correspondem a uma alteração no número normal de cromossomas (por perda ou ganho), podendo resultar da má segregação dos mesmos, o que pode originar um processo espontâneo ou por consequência de um tratamento com um aneugénico (Mateuca et al., 2006). Podemos ter assim as Aneuploidias que podem corresponder a um genótipo de 45 cromossomas ou de 47 (Albertini et al., 2000). Em relação às estruturais, podemos ter AC do tipo cromatídico (compreendem os gaps, as quebras e as figuras homólogas e figuras radiais); e AC do tipo cromossómico (compreendem os gaps duplos, as quebras duplas, os anéis e os cromossomas dicêntricos) (Savage, 1975). Sabe-se também que estes dois tipos de AC se formam em diferentes fases do ciclo celular. Assim, as AC do tipo cromatídico originam-se nas Fases S/G2 e as do tipo cromossómico originam-se nas Fases G0/G1 do ciclo celular (Albertini et al., 2000). As AC que afetam a estrutura do cromossoma propriamente dita, resultam de rearranjos sofridos por erros ocorridos no processo normal de recombinação (crossing-over) que, numa situação normal, asseguram a variabilidade genética (Mateuca et al., 2006). Os gaps (Figura 13) são pequenas regiões alinhadas não coradas nos cromossomas ou nos cromatídeos (sendo estes últimos as mais frequentes) que podem ter diferentes posições e aspetos, variando desde pequenas regiões quase impercetíveis até regiões mais nítidas de descontinuidade delimitadas (Savage, 1975). Este tipo de AC é menosprezado pela maioria dos autores, mas existem outros que os consideram como um fenómeno precedente de uma quebra e pode, corresponder a um dano recente no material genético (Lander et al., 2000; Paz-y-Miño et al., 2002). Uma quebra (Figura 14) corresponde a uma descontinuidade num cromatídeo ou num cromossoma que pode dar origem a um fragmento acêntrico, neste último caso, sendo que geralmente não se encontra no mesmo alinhamento do cromossoma. Semelhante às quebras pode ocorrer outro tipo de AC designado por minutos, que surgem por lesão e posterior remoção das extremidades de dois braços do cromossoma por uma lesão (Savage, 1975). 30 Os anéis (Figura 15) resultam de lesões em locais opostos dos cromatídeos de um único cromossoma, com formação de um fragmento acêntrico, (por quebra das extremidades) que por vezes se pode perder durante a divisão celular. As duas lesões são colocadas num plano proximal por um loop que contém o centrómero e daí resulta a estrutura circular (Savage, 1975). São fenómenos pouco comuns, mas que podem ocorrer em qualquer um dos cromossomas. Os cromossomas dicêntricos (Figura 16) resultam de lesões ocorridas nos braços de diferentes cromossomas, homólogos ou não homólogos, que resultam num único cromossoma com dois centrómeros, acompanhado por um fragmento acêntrico, que por vezes se perde no meio do processo (cerca de 40-50% dos casos) tendo sido formado a partir das porções terminais dos cromossomas envolvidos. Em casos extremos pode ocorrer a formação de cromossomas policêntricos, sendo compostos por mais que dois centrómeros (Savage, 1975). As Figuras Homólogas (Figura 17) e as Figuras Radiais (Figura 18) têm a mesma origem de formação, diferindo apenas na natureza dos cromossomas intervenientes, se homólogos ou não homólogos, respetivamente. Assim, formam-se por consequência de duas lesões em cromatídeos de diferentes cromossomas, seguido de uma troca de material genético entre os mesmos, resultando uma figura simétrica ou assimétrica. Ocasionalmente ocorrem também outro tipo de figuras, as Interchanges (Figura 19) que têm a mesma origem de formação, diferindo apenas no fato de os cromossomas se rearranjarem em forma de X e não em forma de U (Savage, 1975). Algumas aberrações cromossómicas são estáveis, sendo por isso capazes de passar inalteradas ao longo de diversas divisões celulares mitóticas e meióticas, enquanto outras são instáveis mas muito mais raras que as primeiras (anéis, cromossomas dicêntricos), podendo, na sua presença comprometer o destino da própria célula. A estabilidade cromossómica é definida assim pela presença de um centrómero funcional e dois telómeros intactos (Natarajan, 2002). As AC são biomarcadores validados da existência de risco acrescido de cancro (Stefano Bonassi et al., 1995; Natarajan, 2002). Há evidência de que muitos tipos de cancros humanos estão associados a aberrações cromossómicas de tipo específico ou não (Carrano e Natarajan, 1988), existindo uma correlação positiva entre a frequência de AC e o risco de ocorrência futura de cancro (Lars Hagmar et al., 1998; Boffetta et al., 2006). 31 Trocas entre cromatídeos irmãos (SCE - Sister Chromatid Exchanges) As trocas entre cromatídeos irmãos (SCE) são translocações recíprocas de material genético entre as duas cadeias de ADN de ambos os cromatídeos de um mesmo cromossoma (Figura 6). A técnica utilizada para a identificação de SCE é semelhante à das AC, diferindo apenas no fato de nas SCE haver uma diferenciação dos dois cromatídeos, sendo esta obtida em células que incorporam 5-bromodeoxiuridina (BrdU), análogo da timina, em dois ciclos de replicação consecutivos (Figura 7). Durante estes ciclos não há tempo para que ocorra reparação do ADN que foi lesado (quebrado) in vivo (Rooney e Czepulkowski, 1996). A adição, na fase da coloração da técnica, do fluorocromo Hoescht, torna visível a distinção das duas cadeias, uma vez que apenas a cadeia que tem a BrdU incorporado adquire fluorescência. Sabe-se que as SCE são induzidas por substâncias que formam adutos de ADN ou que interferem com o processo de reparação de ADN (Carrano e Natarajan, 1988). Vários estudos in vitro demonstraram um aumento na frequência de SCE em células de animais e de populações humanas, expostos a agentes reconhecidamente mutagénios e carcinogénios (Carrano e Natarajan, 1988), por isso, este é um teste útil para monitorizar a exposição a este tipo de compostos. Figura 6 - SCE observada em linfócitos em metafase (1250X) (primeira fotografia apresenta as cores reais e a segunda sofreu tratamento para aumentar a distinção das cores) (Costa et al., 2008) 32 Figura 7 - Diagrama explicativo do mecanismo de replicação das cadeias de ADN depois de incorporarem BrdU (Wojcik, 2007) Fases do Ciclo Celular Cadeia molde de ADN sem BrdU Cadeia nova de ADN com BrdU Centrómero Cadeia molde de ADN sem BrdU Cadeia nova de ADN com BrdU Centrómero 33 Micronúcleos (MN) Os micronúcleos (Figura 8) são pequenos corpos extranucleares revestidos de membrana que resultam de um evento ocorrido durante a divisão celular, mais especificamente durante a fase de anafase (Mateuca et al., 2006). Podem-se formar quando um cromossoma ou um fragmento acêntrico, por algum erro que ocorreu no aparelho do fuso acromático, nos centrómeros, alteração na condensação cromossómica, dano nos cromossomas, disrupção mecânica ou hipometilação do ADN centromérico, demora mais tempo a ser segregado que o resto do material genético, não ficando incluído nos núcleos das células filhas, na fase de telofase. O que acontece é que, à semelhança dos núcleos principais, este material genético também é envolvido por membrana nuclear, dando origem a um MN, com uma estrutura tipicamente arredondada e com morfologia igual à dos núcleos principais mas apenas com um tamanho inferior, característica a partir da qual recebem a sua designação (Fenech, 2000). Este teste consiste na observação de células em interfase onde são detetados MN resultantes de danos genéticos induzidos por agentes tóxicos. O MN é um biomarcador muito importante em estudos de biomonitorização humana, tendo sido largamente utilizado no estudo de populações expostas a substâncias genotóxicas (Fenech, 1993). Este é um teste validado como indicador de efeito precoce de risco de cancro uma vez que se observou em populações humanas que a frequência de MN correlaciona-se positivamente com o risco de desenvolvimento da patologia oncológica (Bonassi et al., 2007) e é extensamente utilizado em testes de avaliação de dano genético em estudos de epidemiológicos (Fenech, 1993). a) b) c) Figura 8 - Micronúcleos observado em células binucleadas (1250X) (a.célula binucleada com dois micronúcleos; b), c) células binucleadas com um micronúcleo (Costa et al., 2008) 34 Teste do cometa ou comet assay As técnicas anteriormente referidas são técnicas de citogenética clássica, mas nas últimas décadas, surgiu uma técnica inovadora de deteção de dano genético a nível do ADN em células individualizadas, o teste do cometa ou comet assay (também designado por single cell gel eletrophoresis). Esta é uma técnica rápida, simples, sensível e versátil que permite detetar danos no ADN em células eucarióticas (Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999; Collins, 2004) resultantes da exposição a genotóxicos e que tem vindo a ser extensamente utilizada em estudos de biomonitorização humana (Kassie, 2000). Foi pela primeira vez introduzida por Östling e Johanson em 1984, como um método microeletroforético de visualização direta de dano no ADN em células individuais. As imagens obtidas, dada a sua forma, foram designadas “cometas” e eram medidos de modo a determinar a extensão de dano genético. Em 1988, surgiu uma versão alcalina da técnica, apresentada por Singh e seus colegas (Olive et al., 1990). Ao longo dos últimos anos têm surgido diversas variações deste método, com alterações ao nível do pH, coloração, e análise de diversos parâmetros dos cometas (Fairbairn et al., 1995). Estas variantes compreendem, entre as mais comuns, a versão alcalina (caudas dos cometas mais definidas e pronunciadas), a versão neutral (diminui a sensibilidade da técnica mas aumenta a gama de aplicações da técnica) e a versão modificada com recurso a enzimas específicas de locais de lesão (de modo a identificar tipos específicos de dano genético) (Collins, 2004). Sucintamente, a técnica consiste na lise de células que foram previamente suspensas num gel de agarose (agarose de baixo ponto de fusão, LMP – low melting point) e colocadas sobre lâminas que continham previamente uma camada de gel de agarose (agarose de ponto de fusão normal, NMP – Normal Melting Point). Durante a electroforese, o ADN danificado migra dando a aparência de uma cauda, pois há um relaxamento (unwiding) das cadeias, ficando as quebras livres para migrar ao longo do campo elétrico ao qual estão submetidas. As lâminas são depois lavadas e procede-se à coloração recorrendo a um corante fluorescente de ligação ao ADN, para a análise das imagens por microscopia de fluorescência (Fairbairn, 1995). O nome do teste deve-se ao facto das células com ADN danificado terem um aspeto similar a um cometa com a cabeça intensamente brilhante e uma cauda cujo comprimento e intensidade se relaciona com o dano; as células não danificadas apresentam-se sem cauda, tal como pode ser observado na Figura 9. Esta técnica permite a deteção de vários tipos de dano no ADN de células individuais, nomeadamente: quebras na cadeia do ADN, simples ou dupla, ligações cruzadas do tipo ADN-proteína, regiões alcali-lábeis [regiões no ADN que sofreram 35 adição de grupos alquilo (metil ou etil) e que podem levar a alterações no emparelhamento de bases e a perdas de bases; e quando são sujeitas a condições de pH elevado, estas regiões resultam na separação da cadeia polinucleotídica (Maluf, 2004)] e incomplete excision repair sites [locais no ADN onde o processo de reparação por excisão ficou incompleto (Collins, 2004)]. O dano avaliado pelo teste do cometa pode ser analisado por avaliação visual com categorização do dano em 4 classes ou avaliação automática recorrendo a software específico. Neste último caso, os parâmetros mais utilizados para avaliar o dano são o comprimento da cauda do cometa (TL), a percentagem (%) de ADN na cauda e o Olive tail moment, (Faust et al., 2004; Kumaravel e Jha, 2006). O TL, ou tail length, está diretamente relacionado com o tamanho dos fragmentos de ADN e com o tamanho da cauda do cometa. A percentagem de ADN na cauda (%TADN) expressa a percentagem de material genético que migrou. O Olive tail moment, originalmente definido por Olive et al. (1990), é o produto entre a percentagem de ADN na cauda e a distância média de migração (distância entre os centros de gravidade da cabeça e da cauda) (Kumaravel e Jha, 2006). Figura 9 - Imagens de células obtidas pelo teste do cometa (a, b, c, d, e, diferentes graus de dano observados) (Costa, 2008) A sensibilidade e especificidade da técnica pode ser potenciada se forem incubadas as moléculas de ADN com endonucleases bacterianas de reparação que reconhecem locais específicos de dano no ADN e convertem lesões em DSB, aumentando a quantidade de ADN na cauda do cometa (Kumaravel et al., 2007). a b c d e 36 Esta técnica é maioritariamente utilizada em células animais (em cultura ou isoladas do organismo, por exemplo, linfócitos), no entanto foram desenvolvidas novas variantes, de modo a que esta técnica possa ser aplicada a outros tipos de células, como as vegetais. As principais aplicações desta técnica estão direcionadas para novos químicos no que respeita às suas propriedades genotóxicas, monitorização de contaminação ambiental por substâncias genotóxicas, biomonitorização ocupacional humana de exposição a químicos ou radiações, estudos nutricionais, relacionados com os efeitos que nutrientes e micronutrientes possam desencadear ao nível de dano genético em humanos, epidemiologia molecular e investigação fundamental de diagnósticos em dano e reparação de ADN (Collins, 2004). 37 1.3. Objetivo do trabalho O objetivo deste estudo foi avaliar o dano genético em trabalhadores potencialmente expostos a formaldeído (FA) em laboratórios de anatomia patológica. Para o efeito foram definidas as seguintes tarefas:  Avaliar a exposição ocupacional a FA através da determinação dos níveis de FA no local de trabalho;  Analisar a frequência de diferentes tipos de aberrações cromossómicas (AC) e dano genético (teste do cometa) como biomarcadores de efeito;  Compreender a possível influência de fatores individuais como a idade, género e hábitos tabágicos nos resultados obtidos. 44 do material biológico. Adicionou-se ao pellet algumas gotas de solução fixadora gelada [ácido acético : metanol (1:4)], agitando-se no vórtex e de seguida completou-se o volume até aos 4 ml. Centrifugou-se novamente a 1500 rpm durante 5 minutos e desprezou-se o sobrenadante. Procedeu-se a mais duas lavagens com a solução fixadora, de modo a que o sobrenadante se tornasse límpido. Removeu-se o sobrenadante e centrifugou-se a 1500 rpm durante 5 minutos. A seguir ressuspenderam-se as células num pequeno volume de solução fixadora. Após este processo, espalharam-se 3 gotas da suspensão de células com o auxílio de uma pipeta de Pasteur sobre lâminas cobertas com um filme de água. Deixaram-se secar ao ar na horizontal durante cerca de 3 dias. Uma vez bem secas, procedeu-se à coloração das lâminas em tinas com Giemsa 4% em tampão fosfato de sódio pH 6.8 durante 8 minutos e à lavagem das mesmas com água corrente deixando-se secar ao ar. Depois de secas fez-se a montagem de lamelas sobre as lâminas com Entellan e deixaram-se secar. Para a observação das lâminas foi usado o Microscópio Nikon Eclipse E400. Para cada indivíduo foram contabilizadas 100 metafases, utilizando uma ampliação total de 1250x, tendo cada uma delas a totalidade dos seus cromossomas bem condensados e individualizados e adequadamente corados. Todas as lâminas foram codificadas e as contagens foram feitas por um só técnico, sem que este tivesse acesso aos dados dos indivíduos. Na identificação de AC foram consideradas metafases com 46 ± 1 cromossomas. Foram registadas aberrações do tipo cromossómico e cromatídico que incluem quebras num só cromatídeo ou em ambos, fragmentos acêntricos, cromossomas dicêntricos, cromossomas em forma de anel, gaps e aneuploidias de acordo com os critérios de classificação de Savage (1975). Teste do Cometa O Teste do Cometa foi realizado de acordo com o método desenvolvido por Singh et al. (1988) com algumas alterações. No dia anterior à técnica foi estendida uma camada homogénea de agarose de ponto de fusão normal (NMP - Normal Melting Point) a 1%, nas lâminas a utilizar, sendo depois colocadas a secar na horizontal. Para todas as amostras, foram preparadas duas lâminas (amostras em duplicado). Para a realização desta técnica procedeu-se ao isolamento dos linfócitos a partir das amostras de sangue colhido (5 ml de sangue, 2.5 ml por cada réplica). O isolamento dos linfócitos foi feito por meio de um gradiente de densidade de Ficol Histopaque durante 30 minutos a 2000 rpm (1080g). O anel linfocitário resultante foi extraído e as 45 células foram lavadas 3x durante 10 minutos a 1000 rpm (270g), com tampão fosfato gelado a pH 7.2, com temperatura inferior a 4ºC. Os linfócitos isolados de cada uma das amostras foram depois colocados em microtubos, previamente identificados, contendo 1 ml de tampão fosfato a pH 7.4. Foram realizadas diluições de cada amostra para se obter o número de células esperado, cerca de 100 000 células por cada lâmina. Estas diluições foram baseadas em contagens efetuadas numa câmara de Neubauer, tendo em conta o número de células pretendido e o número de células contabilizado, segundo a fórmula: em que Z corresponde ao volume necessário em µl, Y corresponde ao número de células pretendido (cerca de 100000 células) e X que corresponde ao número de células contabilizado na câmara. A viabilidade celular foi avaliada mediante a técnica de exclusão com azul de metileno (Trypan blue). Durante 2 minutos, 10 μl de linfócitos foram adicionados a 5 μl de solução Trypan blue. Ao término deste período foram analisadas 100 células (na câmara de Neubauer) e o número de células viáveis (que não incorporaram o corante) foi contabilizado. Em todas as amostras analisadas a viabilidade celular foi superior a 90%. Os linfócitos colocados em microtubos foram depois recuperados por centrifugação a 9000 rpm (7500g) durante 3 minutos. Desprezou-se o sobrenadante. Em seguida as células, cuidadosamente ressuspendidas em 100 µL de agarose de baixo ponto de fusão (LMP - Low Melting Point) a 0.6% (em tampão fosfato a pH 7.4) previamente aquecida e mantida em banho maria a 37ºC, foram espalhadas sobre a primeira camada de agarose e cobriram-se com lamela. As lâminas foram depois colocadas durante 4 minutos sobre o gelo. Retirou-se cuidadosamente a lamela e as preparações foram submersas em solução de lise (NaCl 2.5 M, Na2EDTA 100 mM, TrisBase, 10 mM NaOH 10 M, pH 10 e 1% de Triton X-100, adicionado pouco antes da submersão das lâminas) durante 1 hora a 4 ºC. A partir deste ponto o processo foi todo realizado no escuro para prevenir qualquer dano adicional no ADN. Depois da lise, as lâminas foram colocadas sobre um suporte e lavadas 2x com água bidestilada gelada; sendo que na última lavagem as lâminas permaneceram cobertas com água durante 15 minutos. Foram em seguida distribuídas numa tina de electroforese arrefecida a uma temperatura constante de cerca de 4ºC, e cobertas com solução de tampão de electroforese (Na2EDTA 200mM e NaOH 10 mM) durante 20 minutos, para permitir o desenrolamento do ADN e a expressão das 46 regiões alcali-lábeis. De seguida levou-se a cabo a electroforese durante 20 minutos a 300 mA e 30 V (1V/cm). Após a electroforese as lâminas foram lavadas com 1 ml de solução de tampão de neutralização (TrisBase 0.4 M, pH 7.5) durante 10 minutos. Depois de retirado o excesso de solução, as preparações foram coradas durante 20 minutos com 100 µL de uma solução de brometo de etídeo (20 µg/ml) e cobertas com lamela. Uma vez coradas foilhes retirada a lamela e lavadas com água bidestilada gelada durante 20 minutos. Depois de retirado o excesso de água as lâminas foram montadas novamente com lamela. Foram posteriormente observadas num período máximo de 48 horas e guardadas sem lamela a 4ºC numa caixa protegida da luz, humedecida e selada para manter a hidratação do gel. As lâminas foram observadas ao Microscópio Nikon Eclipse E400 com corpo para epifluorescência com lâmpada de mercúrio e filtro 6-2A (Nikon C-SA61), com uma ampliação de 500x (ocular, 12.5x; objetiva, 40x). A contagem das células foi efetuada através do programa Comet IV (Perspective Instruments) o que permitiu medir em tempo real, célula a célula, a quantidade de ADN na cauda, expressa em percentagem (%TADN). Por cada amostra foram contabilizadas aleatoriamente 100 células, 50 por cada réplica. Os dados apresentados são a média dos valores obtidos para as 100 células. Com vista a correlacionar os diferentes biomarcadores estudados e avaliar a exposição a FA procedeu-se ao tratamento estatístico dos resultados obtidos. 3. Análise estatística Na análise estatística dos resultados foi utilizado a versão 21.0 do programa SPSS para Windows. Foram consideradas como variáveis dependentes os diferentes tipos de AC [gaps, quebras por célula, células aberrantes, células multi-aberrantes e aneuploidias (45 e 47 cromossomas)]. As quebras por célula, equivalem à quantidade de quebras por cada indivíduo (número de quebras por cada 100 metafases), as células aberrantes, correspondem às células que contêm apenas uma quebra (seja cromatídica ou cromossómica) (Khalil, 1995, Ishidate et al., 1998), as células multi-aberrantes correspondem às células que contêm mais do que uma quebra (dizem respeito às figuras homólogas e radiais, cromossomas dicêntricos, anéis e células que contenham pelo menos duas quebras cromatídicas ou cromossómicas) (Castella et al., 2011) e %TADN, que corresponde à percentagem de ADN na cauda dos cometas. 47 Como variáveis independentes consideraram-se os valores de formaldeído (FA) no ar, o género, a idade, os hábitos tabágicos e duração do tempo de exposição. Quando necessário, estabeleceram-se diferentes classes, tendo em conta a amplitude e a homogeneidade do número de elementos. O pressuposto da normalidade foi testado através do teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando as variáveis estudadas obedeciam a uma distribuição normal (gaps e %TADN) foi utilizado o teste de t-Student para testar a influência das variáveis independentes sobre as referidas e One-Way Anova (com Bonferroni para correções) para a comparação de médias entre os grupos. Quando a distribuição das variáveis se desviava significativamente da distribuição normal (quebras, quebras por célula, células aberrantes, células multi-aberrantes e aneuploidias) foram aplicados testes não paramétricos (Mann-Whitney e Kruskal-Wallis). As associações entre duas variáveis foram testadas com a correlação de Pearson’s ou Spearman (conforme fossem variáveis de distribuição normal ou não, respetivamente). Foram consideradas diferenças estatisticamente significativas com um intervalo de confiança de 95% (P < 0.05). 48 49 3. Resultados 3.1. Caraterização da população A população em estudo foi constituída por um conjunto de 75 profissionais dos serviços hospitalares de anatomia patológica dos distritos do Porto e Aveiro. Foi também constituída uma população controlo, formada por 76 indivíduos do setor terciário da área da educação e dos sistemas multimédia com um historial ocupacional de não exposição a formaldeído (FA) e com caraterísticas semelhantes às do grupo exposto. As principais caraterísticas dos dois grupos estudados, nomeadamente, sexo, idade, hábitos tabágicos e tempo de exposição, estão descriminadas na Tabela 5. Tabela 5 - Caraterísticas da população estudada a média ± desvio padrão (intervalo) Grupo Controlo N = 76 Grupo Exposto N = 75 Número de indivíduos por género 54 Mulheres (71%) 22 Homens (29%) 55 Mulheres (73%) 20 Homens (27%) Idade (em anos) a 37.59 ± 9.99 (23 – 61) 37.91 ± 9.40 (23 – 60) Tempo de exposição (em anos) a 10.88 ± 8.23 (1 – 36) Hábitos tabágicos Não fumadores 59 (78%) 59 (79%) Fumadores 17 (22%) 16 (21%) Nº cigarros/dia a 12.41 ± 7.87 (1 – 30) 11.63 ± 4.82 (4 – 20) Nº Anos Fumador a 20.82 ± 12.59 (3 – 51) 16.25 ± 8.79 (3 – 35) 50 3.2. Avaliação ambiental e Avaliação biológica 3.2.1. Avaliação ambiental e biomarcadores de genotoxicidade estudados Na Tabela 6 são apresentados os valores referentes à concentração média ponderada no tempo (TWA) de exposição a formaldeído (FA) e dos biomarcadores de genotoxicidade estudados, nomeadamente, os diferentes tipos de aberrações cromossómicas (AC) e %TADN (avaliado pelo teste do cometa). A concentração média ponderada de FA obtida para os trabalhadores dos serviços de anatomia patológica estudados, tendo em conta a sua jornada laboral normal, foi de 0.41 ppm (variando entre 0.06 e 1.58 ppm). Tabela 6 – Valores da concentração média ponderada de FA (TWA) e dos diferentes biomarcadores estudados para o grupo controlo e o exposto Grupo Controlo (N=76) Grupo Exposto (N=75) FA (ppm) a _____ 0.41 ± 0.04 (0.06 - 1.58) Gaps a 4.66 ± 0.36 (0 – 14) 6.48 ± 0.32 * (1 - 13) Quebras por Célula a 0.028 ± 0.003 (0 – 0.13) 0.061 ± 0.003 * (0.01 – 0.22) Células Aberrantes a 2.47 ± 0.20 (0 - 9) 4.01 ± 0.24 * (0 – 10) Células Multi-Aberrantes a 0.17 ± 0.05 (0 – 2) 0.75 ± 0.10 * (0 - 3) Aneuploidias a 2.66 ± 0.20 (0 – 7) 3.56 ± 0.19 * (0 – 7) %TADN a 7.82 ± 0.47 (0.9 – 24.4) 11.19 ± 0.56 * (2.9 – 24.9) a média ±erro padrão média (intervalo) * P < 0.001, em relação ao grupo controlo 51 Após a análise dos resultados obtidos para os indicadores de dano genético, verificou-se que as frequências de todos os tipos de AC estudados são significativamente superiores no grupo exposto em relação ao grupo controlo (P < 0.001). Para o indicador de dano no ADN, avaliado pelo teste do cometa (%TADN), obtiveram-se também valores significativamente superiores no grupo exposto relativamente ao grupo controlo (P < 0.001). Para uma melhor visualização das diferenças relativas aos dados apresentados na tabela anterior, os mesmos estão também representados sob a forma de gráfico na Figura 12. 52 Figura 12 - Resultados obtidos referentes à influência da exposição na frequência dos indicadores gaps, quebras por célula, células aberrantes, células multi-aberrantes, aneuploidias e %TADN. (* P < 0.001, quando comparado com o grupo controlo) 0 1 2 3 4 5 6 7 Controlos Expostos Frequência de Gaps 0 0,02 0,04 0,06 0,08 Controlos Expostos Freq. de Quebras por Célula 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Controlos Expostos Freq. de Células Aberrantes 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Controlos Expostos Freq. de Células MultiAberrantes 0 1 2 3 4 Controlos Expostos Freq. de Aneuploidias 0 2 4 6 8 10 12 14 Controlos Expostos % de ADN na cauda * * * * * * 53 3.2.2. Avaliação biológica 3.2.2.1. Influência do género na frequência dos biomarcadores de genotoxicidade estudados Analisando o efeito do género nos biomarcadores de dano genético verificou-se a existência de diferenças estatisticamente significativas (P < 0.001) nas aberrações cromossómicas do tipo células multi-aberrantes no grupo exposto. Nesse grupo, as mulheres apresentam, em média, uma frequência superior de células multi-aberrantes quando comparadas com os homens. No grupo controlo não se observaram diferenças em nenhum dos indicadores estudados. Os valores obtidos para cada um dos biomarcadores encontram-se discriminados na Tabela 7. Tabela 7 – Efeito do género nos diferentes biomarcadores de genotoxicidade Controlos Expostos Feminino Masculino Feminino Masculino (N=54) (N=22) (N=55) (N=20) Gaps a 4.69 ± 0.42 (0 – 14) 4.59 ± 0.69 (0 – 10) 6.40 ± 0.39 (1 - 13) 6.70 ± 0.60 (2 - 11) Quebras por Célula a 0.031 ± 0.003 (0 – 0.13) 0.021 ± 0.004 (0 – 0.08) 0.063 ± 0.004 (0.01 – 0.14) 0.054 ± 0.007 (0.01 – 0.13) Células Aberrantes a 2.65 ± 0.25 (0 – 9) 2.05 ± 0.35 (0 – 6) 3.98 ± 0.27 (0 – 10) 4.10 ± 0.51 (1 – 8) Células Multi-Aberrantes a 0.22 ± 0.06 (0 – 2) 0.05 ± 0.05 (0 – 1) 0.95 ± 0.11 * (0 – 3) 0.20 ± 0.09 (0 – 1) Aneuploidias a 2.85 ± 0.22 (0 – 6) 2.18 ± 0.43 (0 – 7) 3.56 ± 0.23 (0 – 7) 3.55 ± 0.37 (0 – 7) %TADN a 7.89 ± 0.60 (0.9 – 24.4) 7.67 ± 0.69 (2.8 – 15.9) 11.10 ± 0.65 (4.2 – 24.9) 11.43 ± 1.20 (2.9 – 22.1) a média ± erro padrão média (intervalo) *P < 0.001, em relação aos homens do grupo exposto 60 por célula como nas células multi-aberrantes, os valores mais elevados foram registados em indivíduos com maior tempo de exposição. No que se refere aos outros indicadores, não se observaram diferenças estatisticamente significativas mas, de um modo geral, verificou-se uma tendência de aumento dos seus valores médios com o aumento da duração da exposição. 61 3.2.2.5. Associações entre os diferentes biomarcadores de genotoxicidade estudados De modo a explorar as associações entre as variáveis em estudo, analisámos as associações existentes entre elas, através da correlação de Pearson’s ou Spearman. Em relação a todos os biomarcadores de genotoxicidade estudados no que diz respeito aos diferentes tipos de aberrações cromossómicas (AC) e %TADN, observaram-se associações significativas (Tabela 12). Tabela 12 - Associações entre os biomarcadores de genotoxicidade estudados Gaps Quebras por célula Células aberrantes Células multiaberrantes Aneuploidias %TADN r = 0.302 P <0.001 r = 0.319 P <0.001 r = 0.229 P = 0.005 r = 0.218 P = 0.007 r = 0.176 P = 0.031 Pelos dados observados na tabela anterior, pode-se verificar que todos os diferentes tipos de AC estudados se correlacionam significativamente (P < 0.05) com a %TADN. Estas associações são no entanto relativamente fracas do ponto de vista estatístico. 62 63 4. Discussão O formaldeído (FA) é um agente químico carcinogénico produzido em larga escala a nível mundial, o que suscita diversas questões relacionadas com a sua utilização. A sua importância comercial é substancialmente elevada, tendo em conta o seu baixo custo de produção, aliado ao uso multifacetado em diferentes aplicações. São largamente conhecidas as suas propriedades de desinfeção e preservação, sendo por isso frequentemente utilizado em laboratórios de anatomia patológica, na manutenção e conservação de tecidos. Diversos estudos apontam estes locais de trabalho como locais de risco elevado de exposição a FA (Shaham et al., 2002; Ferro et al., 2005; Jakab et al., 2010; Costa et al., 2011), por apresentarem valores de concentração de FA acima dos limites estabelecidos. Estes estudos revelam ainda que a principal sintomatologia associada à exposição a FA se manifesta ao nível das vias respiratórias superiores e oculares (por efeito irritante ao nível desses órgãos), sendo a severidade dos sintomas dependente da concentração de composto no ar que atinge os locais alvo. Tendo em conta que o objetivo do estudo foi avaliar o dano genotóxico que resulta da exposição ocupacional dos trabalhadores de laboratórios de anatomia patológica a FA, procedeu-se à estimativa da exposição pelo cálculo da concentração média ponderada (TWA) para cada um dos indivíduos expostos, tendo-se constatado que o valor médio de exposição para a população estudada foi de 0.41 ppm. Verificou-se no grupo exposto (n=75) que 61% dos trabalhadores estavam expostos a valores abaixo de 0.3 ppm e 39% estavam expostos a valores acima de 0.3 ppm. Destes últimos, constatou-se que 28% dos indivíduos estava exposto a valores médios de FA entre 0.3 e 0.4 ppm, 13% estavam expostos a valores médios entre 0.4 ppm e 0.5 ppm e 59% estavam expostos a valores médios superiores a 0.5 ppm. Os níveis mais elevados de exposição foram obtidos durante o exame macroscópico das peças conservadas em FA e durante o despejo das peças e respetivas soluções, tal como já havia sido observado por outros autores (Orsière et al., 2006; Viegas et al., 2010). Os valores sugerem uma situação de risco profissional, uma vez que os valores obtidos indicam que os trabalhadores poderão estar expostos a valores acima do recomendado (IPQ, 2007; SCOEL, 2008). Estes dados estão de acordo com os resultados reportados por vários autores em estudos anteriormente realizados, que observaram níveis de exposição a FA superiores aos estabelecidos pelas normas em vigor (Viegas e Prista, 2009; Costa et al., 2011). A biomonitorização humana em ambiente ocupacional ganha cada vez mais importância, dada a elevada proporção de agentes químicos atualmente utilizados nas 64 mais variadas áreas laborais e dos potenciais efeitos na saúde pública, em particular, em termos de incidência ou aumento de risco de cancro. Ao longo dos anos têm surgido diversos estudos que apontam para uma associação entre a exposição a agentes químicos genotóxicos e o aumento de risco de cancro, sendo os biomarcadores de efeito uma ferramenta útil no estudo de alterações precoces que ocorrem antes do desenvolvimento da doença. Estes incidem principalmente em biomarcadores de genotoxicidade, nomeadamente, as aberrações cromossómicas (AC), micronúcleos (MN), trocas entre cromatídeos irmãos (SCE) e teste do cometa. Existem diversos estudos relativamente ao uso destes biomarcadores na avaliação da exposição a outros agentes químicos, por aplicação dessas mesmas técnicas, nomeadamente, ao tolueno (Heuser et al., 2007; Manikantan et al., 2010), a pesticidas (Carbonell et al., 1995; Costa et al., 2006) e ao estireno (Anwar, 1994; Teixeira et al., 2004). Em termos de exposição ocupacional a FA, existem diversos trabalhos que utilizam estes mesmos biomarcadores, como forma de avaliar o potencial genotóxico do FA, nomeadamente, AC (Jakab et al., 2010; Santovito et al., 2011), SCE (Shaham et al., 2002), MN (Orsière et al., 2006; Costa et al., 2008) e teste do cometa (Costa et al., 2011). No que respeita aos biomarcadores de genotoxicidade utilizados neste trabalho para avaliar o dano genético (AC e teste do cometa), verificou-se que os indivíduos ocupacionalmente expostos a FA (concentração média de 0.41 ppm), apresentam níveis de dano genético significativamente superiores (P < 0.05), quando comparados com os do grupo controlo. As AC são um biomarcador extensamente utilizado em estudos de biomonitorização humana, no entanto, existem poucos estudos que utilizam este biomarcador na monitorização biológica da exposição a FA (Santovito et al., 2011). Isto deve-se ao fato de existirem diversas limitações da técnica, nomeadamente, custo e intensivo tempo de análise, necessidade de pessoal treinado e especializado para realizar a técnica e necessidade de cultura celular (European Comission, 2009). Da análise dos resultados obtidos no que respeita ao dano cromossómico, avaliado pela frequência dos diferentes tipos de AC, podemos verificar que este parâmetro é influenciado significativamente pela exposição a FA, sendo que os indivíduos do grupo exposto apresentam um dano superior aos do grupo controlo (P < 0.05). O mesmo resultado foi obtido por Jakab et al. (2010), quando estudaram a frequência de diferentes tipos de AC (gaps, aneuploidias, AC cromatídicas, AC cromossómicas e AC totais) num grupo de profissionais de serviços de anatomia patológica (n=37) expostos a FA (0.73 ppm), quando comparados com um grupo controlo (n=37). Todavia, outros autores referem não terem observado uma associação entre exposição a FA e o dano cromossómico (Thomson et al., 1984; Pala et al., 2008). 65 No que diz respeito à avaliação do dano genético por exposição a FA, foi utilizado neste estudo um dos parâmetros mais utilizados no teste do cometa, a %TADN. Verificou-se existirem diferenças estatisticamente significativas (P < 0.05) entre os indivíduos do grupo exposto e os do grupo controlo; sendo que os valores mais elevados de dano se observaram no grupo exposto. Isto significa que estes indivíduos apresentam, em média, uma percentagem de ADN na cauda do cometa superior à dos elementos do grupo controlo. Estes resultados estão de acordo com um estudo de Yu et al. (2005) no qual é documentado um aumento significativo no comprimento da cauda do cometa em linfócitos de indivíduos ocupacionalmente expostos a FA (n=151) a concentrações médias compreendidas entre 0.08 e 6.4 ppm, relativamente a um grupo controlo (n=112). Mais recentemente, o mesmo foi observado noutro estudo, num grupo de profissionais de laboratórios de anatomia patológica (n=48) por comparação com um grupo controlo (n=50), no qual se obteve um aumento de dano genético, avaliado pelo teste do cometa (%TADN) nos trabalhadores expostos comparativamente ao grupo controlo (Costa et al, 2011). O teste do cometa, apesar de ser uma técnica simples e rápida e já ter sido desenvolvida há cerca de três décadas, apenas nos últimos anos se verificou um maior desenvolvimento, aperfeiçoamento e aumento da sua aplicação. Existem atualmente poucos estudos ao nível de exposição ocupacional a FA, no entanto, este biomarcador foi já aplicado em vários estudos de exposição a agentes químicos, nomeadamente pesticidas (Zeljezic, 2001), estireno (Laffon et al., 2002), gases anestésicos (Chandrasekhar et al., 2006) e arsénio (Vuyyuri et al., 2006). Existem também alguns estudos in vitro que demonstraram a elevada sensibilidade e aplicabilidade deste biomarcador na avaliação do efeito genotóxico do FA (Frenzilli et al., 2000; Im et al., 2006; Liu et al., 2006; Sul et al., 2007). No presente estudo, foi obtida uma correlação estatisticamente significativa (P < 0.05) entre os diferentes tipos de AC e a %TADN. Estudos anteriores suportam esta relação entre os dois biomarcadores de dano genético estudados, nomeadamente, Zeljezic e Garaj-Vrhovac (2001) que utilizaram o teste das AC (quebras cromatídicas e cromossómicas, fragmentos acêntricos, cromossomas dicêntricos, figuras e AC totais) e o teste do cometa para avaliar o dano numa população exposta a pesticidas. Ao longo dos últimos anos têm surgido diversos estudos que remetem para a complementaridade de resultados obtidos entre estas duas técnicas (Giannotti, 2002; Hartmann et al., 2003). Está largamente demonstrado em estudos de biomonitorização humana que caraterísticas como a idade, género e hábitos tabágicos são importantes, uma vez que podem constituir fatores de confundimento para os parâmetros avaliados (Maluf, 2004; Vodicka et al., 2004; Iarmarcovai et al., 2007). Por conseguinte, tendo em conta as 66 caraterísticas da população em estudo procedeu-se à análise do efeito destes mesmos fatores e tempo de exposição nos indicadores biológicos estudados. No que respeita à influência do género nos diferentes tipos de AC e %TADN estudados, obtiveram-se diferenças estatisticamente significativas apenas em relação às células multi-aberrantes no grupo exposto. Os valores mais elevados foram observados nas mulheres, quando comparadas com os homens desse grupo. No que respeita ao grupo controlo, observou-se que as mulheres têm, em média, maior dano genético que os homens, apesar de não ser estatisticamente significativo. Os resultados obtidos estão de acordo com Hedner et al. (1982) que observaram, num grupo de 100 indivíduos, diferenças significativas entre os dois géneros, sendo que as mulheres apresentaram maior dano que os homens. Mais recentemente, Musak et al. (2013) realizaram um estudo que incidiu sobre trabalhadores de equipas médicas (n=601) expostos a anestésicos, drogas anti-neoplásicas e FA, tendo chegado à conclusão que as mulheres se encontram em maior risco, tendo frequências de AC (AC cromatídicas, AC cromossómicas – anéis, cromossomas dicêntricos e figurase AC totais) superiores comparativamente com as frequências obtidas para os homens. Estes dados podem ser explicados por aumento de AC em mulheres que tomam contracetivos orais (Hedner et al., 1982) ou também devido a flutuações verificadas ao nível de diferentes taxas de AC durante o ciclo menstrual, possivelmente devido a oscilações hormonais (Landi e Barale, 1999). Relativamente ao teste do cometa, neste trabalho não se verificou influência do fator género, tal como reportado por outros autores (Moller, 2006; Angerer et al., 2007). Com o aumento da idade, o organismo vai acumulando dano genético, resultante da natural perda de função dos mecanismos de reparação, replicação (Bolognesi et al., 1997) e da diminuição da atividade da enzima telomerase, principal responsável pela regeneração dos telómeros (Aubert e Lansdorp, 2008). Estes são alguns dos principais fatores responsáveis pela estabilidade cromossómica, sendo que na sua ausência ou quando se verifica a diminuição da sua atividade, podem resultar instabilidades cromossómicas. No que diz respeito à influência do fator idade nos biomarcadores de genotoxicidade estudados, verificou-se existirem diferenças estatisticamente significativas (P < 0.05) no grupo exposto e nas variáveis quebras por célula e células multi-aberrantes. Estas diferenças observaram-se entre as classes 5 (> 50 anos) e 1 (23 - 29 anos) e entre as classes 5 (> 50 anos) e 2 (30-34 anos), ou seja, com o aumento da idade observou-se um aumento do dano cromossómico no grupo exposto. As AC estão relacionadas com a diminuição da eficácia dos mecanismos de reparação e, assim, com o aumento da idade surgem estruturas cromossómicas mais 67 complexas, relacionadas com os erros ocorridos durante o processo normal de funcionamento do ciclo celular (Wojda e Witt, 2003). Em relação ao grupo controlo, não se verificaram diferenças estatisticamente significativas em nenhuma das variáveis estudadas, no entanto, pode-se observar um aumento das suas frequências com o aumento da idade. O aumento de AC com o aumento da idade é um facto referenciado por vários autores (Hedner et al., 1982; Ramsey et al., 1995; Vodicka et al., 2004). Relativamente ao teste do cometa, os dados obtidos estão em concordância com outros autores, que indicam não haver influência da idade no dano genético avaliado por este teste (Laffon et al., 2006; Singh et al., 2010). O fumo do tabaco possui uma larga gama de agentes químicos potencialmente perigosos para a saúde (Wong et al., 1997). Este fator traduz-se numa exposição prolongada a esses químicos em pequenas quantidades. Existem diversos estudos que apontam para a influência dos hábitos tabágicos na frequência de dano genético (DeMarini, 2004; Ergene et al., 2007). No que respeita à influência dos hábitos tabágicos, verificámos diferenças significativas entre não fumadores e fumadores apenas no grupo controlo, em dois tipos diferentes de AC, gaps e aneuploidias. Os valores mais elevados obtiveram-se em indivíduos não fumadores desse grupo comparativamente com os fumadores. Almeida et al. (2005), também verificaram um aumento de gaps e aneuploidias entre não fumadores e fumadores, sendo superiores nos não fumadores, não tendo no entanto, atingido a significância. Estes dados poderão ser explicados pela ocorrência de processos de adaptação nos mecanismos de reparação do organismo, face à exposição contínua a agentes genotóxicos (Costa et al., 2008). Esta capacidade de adaptação dos mecanismos de reparação é um facto já largamente estudado. Wolff et al. (1988) observaram que o organismo pode, após exposição continuada a pequenas doses de agentes químicos ou até mesmo de radiação ionizante, tornar-se menos suscetível ao seu efeito, não se verificando um aumento de dano por doses mais elevadas e prolongadas do mesmo agente. No grupo exposto e relativamente aos hábitos tabágicos não se verificaram diferenças estatisticamente significativas em nenhum dos biomarcadores estudados. No que respeita à influência dos hábitos tabágicos na %TADN, não se verificaram diferenças significativas, o que vem igualmente de acordo com estudos de outros autores (Angerer et al., 2007; Moller, 2006). Em relação à influência do tempo de exposição (grupo exposto) nos biomarcadores de genotoxicidade estudados, verificaram-se diferenças estatisticamente 68 significativas (P < 0.05). Essas diferenças foram obtidas relativamente às variáveis quebras por célula entre as classes II (10 – 19 anos) e I (1 – 9 anos) e as classes III (20 – 36 anos) e I (1 – 9 anos) e também às células multi-aberrantes, entre as classes II (10 – 19 anos) e I (1 – 9 anos), sendo o dano significativamente (P < 0.05) mais elevado nas classes com maior tempo de exposição. Estes valores estão de acordo com os obtidos por outros autores para a influência do tempo de exposição, utilizando as AC (AC totais e aneuploidias), MN e teste do cometa (Roma-Torres et al., 2006). Celik et al. (2007) estudaram o dano genotóxico num grupo de trabalhadores de uma mina de carvão e observaram um aumento de dano cromossómico (diferentes tipos de AC - quebras cromatídicas e cromossómicas, cromossomas dicêntricos, figuras e células aberrantes) com o aumento do tempo de exposição. Num outro estudo, Costa et al. (2006) investigaram os efeitos citogenéticos e moleculares da exposição a pesticidas num grupo de agricultores. Em termos de AC (quebras cromatídicas e cromossómicas, aneuploidias e AC totais), obtiveram um aumento do dano cromossómico com o aumento do tempo de exposição. No que respeita à %TADN, não se verificou influência do tempo de exposição, o que está de acordo com estudos de outros autores (Costa et al., 2011). 69 5. Conclusão Neste trabalho foi estimada a exposição ocupacional a formaldeído (FA) de um grupo de profissionais dos serviços de anatomia patológica e estudado o dano genético induzido pela exposição a este composto. O nível médio de exposição a FA obtido nos serviços de anatomia patológica estudados indica que os profissionais destes laboratórios estão expostos a FA, o que indicia uma situação de risco profissional. Relativamente aos biomarcadores de efeito analisados, aberrações cromossómicas (AC) e teste do cometa, observou-se que os indivíduos expostos apresentavam níveis de dano genético significativamente mais elevados quando comparados com os do grupo controlo. Estes resultados confirmam a situação de risco profissional. Tendo em consideração os resultados obtidos, devem-se desenvolver ações corretivas para a diminuição da exposição a FA. A situação ideal seria a substituição do FA, por outro composto químico com propriedades semelhantes e menos tóxico para a saúde humana. Na impossibilidade dessa substituição, devem adoptar-se medidas, que reduzam ao mínimo o risco de exposição ocupacional, de modo a salvaguardar a saúde dos trabalhadores e o ambiente que os rodeia. Uma das principais medidas assenta na instalação de equipamentos de ventilação eficientes e complementados com sistema de exaustão, assim como a utilização adequada de material de proteção individual que não interfira com as tarefas do trabalhador. Ao nível do armazenamento dos reagentes o ideal seria possuir armários com ventilação e exaustão direta para o exterior. Se possível a tarefa de eliminação de peças com as respetivas soluções deverá ser realizada por empresas especializadas na eliminação de resíduos hospitalares. Torna-se assim evidente que as principais medidas assentam na prevenção e minimização dos riscos da exposição a FA. Estas acções preventivas e/ou correctivas podem ser colocadas em prática através da sensibilização dos trabalhadores para os riscos do seu manuseamento, implementação de boas práticas de trabalho, monitorização periódica do ar ambiente no local de trabalho e vigilância médica regular de modo a salvaguardar a saúde dos trabalhadores. 76 Holmstrom, M., Lund, V. J. (1991). Malignant melanomas of the nasal cavity after occupational exposure to formaldehyde. British journal of industrial medicine, 48(1), 9–11. Hughes, W. W. (1996). Essentials of environmental toxicology: the effects of environmentally hazardous substances on human health. Washington, DC: Taylor & Francis. IARC. (1995). IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans . Vol. 62 (Vol. Vol. 62). International Agency for Research on Cancer. IARC. (2006). IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, volume 88, Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol: this publication represents the views and expert opinions of an IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, which met in Lyon, 2 - 9 June 2004. Lyon: IARC. IARC. (2012). A review of human carcinogens. International Agency for Research on Cancer. Iarmarcovai, G., Bonassi, S., Sari-Minodier, I., Baciuchka-Palmaro, M., Botta, A., Orsière, T. (2007). Exposure to genotoxic agents, host factors, and lifestyle influence the number of centromeric signals in micronuclei: a pooled re-analysis. Mutation research, 615(1-2), 18–27. doi:10.1016/j.mrfmmm.2006.09.005 Im, H., Oh, E., Mun, J., Khim, J.-Y., Lee, E., Kang, H.-S., Sul, D. (2006). Evaluation of Toxicological Monitoring Markers Using Proteomic Analysis in Rats Exposed to Formaldehyde. 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Fui ainda informado que: 1Os dados que fornecer, bem como os resultados das análises que forem efetuadas sobre as amostras do meu sangue, urina e esfregaço bucal serão estritamente confidenciais. Assim que os procedimentos do estudo o permitam esses dados e resultados serão tornados anónimos, isto é, deixarão de poder ser relacionados com a minha identificação; 2Todos os investigadores e técnicos envolvidos neste estudo e que utilizam esses dados são afetos ao Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, I.P. (INSA, I.P.) pelo que de acordo com a política da Qualidade, Ambiente e Segurança do INSA, I.P. estão obrigados a manter a confidencialidade das informações a que tem acesso no âmbito da sua atividade. Nestas condições, declaro que aceito participar no estudo, disponibilizando-me para: 1Ser entrevistado e prestar informações sobre vários aspetos respeitantes a condições de saúde bem como a algumas características sóciodemográficas relevantes; 2Permitir a colheita de uma amostra de sangue, urina e esfregaço bucal para posterior análise laboratorial. Data:_____/______/______ Nome do participante:____________________________________________________ Assinatura:____________________________________________________________ CÓDIGO DE IDENTIFICAÇÃO: _____________ 94 95 ANEXO III Questionário 96 Avaliação de Risco da Exposição ao Formaldeído. Análise do dano genético e suscetibilidade genética em Profissionais de Anatomia Patológica. 97 CÓDIGO DE IDENTIFICAÇÃO: ______________________ Amostra recolhida por:__________________________ Data:_____/_____/___ Hora:____________ A) Caraterização sociodemográfica: 1. Data de Nascimento : _____/_____/______ (Idade=_________anos) 2. Sexo: M  F  3. Altura: ________ Peso: _________ 4.Naturalidade:________________ Localidade onde reside:_____________________ B) Atividade Profissional: 5. Atividade profissional: _________________________________________________ 6.1 Posto de trabalho: ______________________ 6.2 Há quanto tempo a exerce: __________ 7. Em que consiste:_____________________________________________________ _____________________________________________________________________ 8. Usa algum tipo de equipamento de proteção individual? SIM  NÃO  8.1 Qual? 9. Exerce a sua atividade profissional noutro local: SIM  NÃO  9.1 Quantas horas por semana? ___________________________________________ 10. Profissões anteriores: Período: Avaliação de Risco da Exposição ao Formaldeído. Análise do dano genético e suscetibilidade genética em Profissionais de Anatomia Patológica. 98 C) CARATERIZAÇÃO DE ESTILO DE VIDA E SAÚDE: C1) Consumo de Álcool 11. Consumo .............................................. Que quantidade de álcool consome em média, por dia?___________________________ Que tipo de bebida alcoólica bebe habitualmente? _______________________________ 12. Não consumo .............................................. C2) Hábitos Tabágicos 13. É atualmente fumador? SIM  NÃO  14. Alguma vez fumou? SIM  NÃO  15. Se é fumador passivo: Tem contato regular durante 2 ou mais horas com fumadores? Em casa SIM  NÃO  No trabalho SIM  NÃO  No café ou similar SIM  NÃO  C3) Historial Clínico 16. Sofre de alergias respiratórias? SIM  NÃO  Se é fumador: Com que idade começou a fumar?_______anos Quantos cigarros fuma por dia?_____________ Se é ex-fumador: Com que idade começou a fumar?______anos Com que idade deixou de fumar?________anos Avaliação de Risco da Exposição ao Formaldeído. Análise do dano genético e suscetibilidade genética em Profissionais de Anatomia Patológica. 99 Se respondeu SIM : 16.1. Só desde que comecei a exercer a minha atual função........... 16.2. Sempre sofri.......... Se sempre sofreu, sente que houve um agravamento desde que começou a exercer a sua atual atividade profissinal ? SIM  NÃO  17. Costuma sentir alguma da sintomatologia seguinte? 17.1. Irritação na garganta........................ 17.2. Irritação no nariz............................. 17.3. Irritação nos olhos........................... 17.4. Aumento do lacrimejar.................... 17.5. Outros.............................................. Qual/Quais ?_______________________ Se assinalou algum sintoma, pode especificar a altura do dia ou da semana em que sente mais? _______________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 18. No último ano fez algum tipo de Exame radiológico (Raios X)? SIM  NÃO  Qual?________________________________________________________________ 19. Nos últimos 2 meses teve algum problema de saúde? SIM  NÃO  Qual?________________________________________________________________ 20. No último ano foi submetido(a) a alguma intervenção cirúrgica? SIM  NÃO  Qual?________________________________________________________________ 21. Toma algum tipo de medicação? SIM  NÃO  Qual/Quais? ___________________________________________________________ Avaliação de Risco da Exposição ao Formaldeído. Análise do dano genético e suscetibilidade genética em Profissionais de Anatomia Patológica. 100 22. Alguma vez tomou ou toma pílula contracetiva ou faz terapêutica hormonal de substituição? SIM  NÃO  Há quanto tempo? ______________________________________________________ 23. Tomou alguma vacina nos últimos 12 meses? SIM  NÃO  Qual?________________________________________________________________ C4) Hábitos Alimentares 24.1. Consumo de chá......................... NÃO  SIM  Frequência _____________ 24.2. Consumo de café......................... NÃO  SIM  Frequência _____________ 24.3. Consumo de fruta........................ NÃO  SIM  Frequência _____________ 24.4. Consumo de vegetais................... NÃO  SIM  Frequência _____________ 24.5. Consumo de peixe e carne (por semana) ...... peixe ________ carne _________ 24.5. Consumo de suplementos vitamínicos...NÃO  SIM  Frequência_____